ES2756175T3

ES2756175T3 - Genes mutantes guardián de fgfr y fármacos que se dirigen a los mismos

Info

Publication number: ES2756175T3
Application number: ES14873761T
Authority: ES
Inventors: Yoshito Nakanishi; Nukinori Akiyama; Kenji Morikami
Original assignee: Chugai Pharmaceutical Co Ltd
Current assignee: Chugai Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 2013-12-27
Filing date: 2014-12-26
Publication date: 2020-04-27
Anticipated expiration: 2034-12-26
Also published as: JPWO2015099127A1; JP6514645B2; DK3087986T3; EP3087986A4; WO2015099127A1; US20190358205A1; US20160317499A1; EP3087986A1; EP3087986B1; US10391081B2; TW201609093A; EP3581179A1

Abstract

Una composición farmacéutica para su uso en un método para el tratamiento del cáncer que comprende, como principio activo, el compuesto representado por la Fórmula (I) siguiente o una sal del mismo farmacéuticamente aceptable, en donde la composición farmacéutica para el tratamiento del cáncer se caracteriza por que se utiliza administrándola a un paciente que expresa un polipéptido mutante de FGFR que comprende una sustitución de valina por fenilalanina en el 7º aminoácido a partir del extremo N y/o una sustitución de valina por leucina en el 5º aminoácido a partir del extremo N en la secuencia de aminoácidos parcial descrita en la SEQ ID NO: 53 o 54 en un polipéptido de FGFR, o que tiene un polinucleótido que codifica dicho polipéptido mutante, en donde las mutaciones son causantes de la adquisición de resistencia a inhibidores de FGFR pero son sensibles al compuesto representado por la siguiente Fórmula (I):**Fórmula** en donde R1, R2, R3, y R4 cada uno representa independientemente el grupo enumerado a continuación: R1 representa hidrógeno, hidroxi, halógeno, ciano, nitro, haloalquilo C1-4, alquilo C1-6, alquenilo C2-6, alquinilo C2-6, cicloalquilo C3-7, aril C6-10alquilo C1-4, -OR5, -NR6R7, -(CR8R9)nZ1, -C(O)NR12R13, -SR14, -SOR15, -SO2R16, - NR17SO2R18, COOH, arilo C6-10 que está opcionalmente sustituido por uno o más grupos seleccionados independientemente entre el grupo P, heteroarilo de 5 a 10 o heterociclilo de 3 a 10 miembros que está opcionalmente sustituido por uno o más grupos seleccionados independientemente entre el grupo Q, -COR19, - COOR20, -OC(O)R21, -NR22C(O)R23, -NR24C(S)R25, -C(S)NR26R27, -SO2NR28R29, -OSO2R30, -SO3R31 o -Si(R32)3; R2 representa hidrógeno, hidroxi, halógeno, ciano, nitro, haloalquilo C1-4, alquilo C1-6, alquenilo C2-6, alquinilo C2-6, cicloalquilo C3-7, aril C6-10alquilo C1-4, -OR5, -NR6R7, -(CR8R9)nZ1, -C(O)NR12R13, -SR14, -SOR15, -SO2R16, - NR17SO2R18, COOH, arilo C6-10 que está opcionalmente sustituido por uno o más grupos seleccionados independientemente entre el grupo P, heteroarilo de 5 a 10 o heterociclilo de 3 a 10 miembros que está opcionalmente sustituido por uno o más grupos seleccionados independientemente entre el grupo Q, -COR19, - COOR20, -OC(O)R21, -NR22C(O)R23, NR24C(S)R25, -C(S)NR26R27, -SO2NR28R29, -OSO2R30, -SO3R31 o -Si(R32)3; o R1 y R2, junto con un átomo unido a ellos, forman un heterociclilo de 3 a 10 miembros o heteroarilo de 5 a 10 miembros, en donde el heterociclilo o heteroarilo está opcionalmente sustituido por halógeno; R3 representa metilo; R4 representa hidrógeno; A es indol; R5 representa alquilo C1-5, cicloalquilo C3-7, cicloalquil C3-7alquilo C1-3, alquenilo C2-6, alquinilo C2-6, haloalquilo C1- 4, alcoxi C1-3alquilo C1-4, alcoxi C1-3alcoxi C1-4alquilo C1-4, aldehído C1-4, alquilamino C1-4alquilo C1-4, di(alquil C1- 4)amino alquilo C1-4, arilo C6-10, aril C6-10alquilo C1-3 o heterociclilalquilo C1-3 de 3 a 10 miembros, heterociclilo de 3 a 10 miembros, heteroarilo de 5 a 10 miembros, heteroarilalquilo C1-3 de 5 a 10 miembros, monohidroxi alquilo C1- 6, dihidroxi alquilo C1-6 o trihidroxi alquilo C1-6 el cual está opcionalmente sustituido por uno o más grupos seleccionados independientemente entre el grupo Q; R6 y R7, que pueden ser iguales o diferentes, cada uno representa hidrógeno, alquilo C1-4, alquenilo C2-6, alquinilo C2-6, haloalquilo C1-4, alcoxi C1-3alquilo C1-4, aril C6-10alquilo C1-3, heterociclilalquilo C1-3 de 3 a 10 miembros, heteroarilalquilo C1-3 de 5 a 10 miembros, monohidroxi alquilo C1-6, dihidroxi alquilo C1-6, trihidroxi alquilo C1-6, heterociclilo de 3 a 10 miembros, aldehído C1-4, alquilamino C1-4alquilo C1-4, di(alquil C1-4)amino alquilo C1-4 o ciano(alquilo C1-3); o como alternativa R6 y R7, junto con un átomo de nitrógeno unido a ellos, forman heterociclilo de 3 a 10 miembros o heteroarilo de 5 a 10 miembros; n representa 1 a 3; R8 y R9, que pueden ser iguales o diferentes, cada uno representa hidrógeno, alquilo C1-4 o halógeno; o como alternativa R8 y R9, junto con un átomo de carbono unido a ellos, forman un anillo cicloalifático; Z1 representa hidrógeno, NR10R11, -OH o heterociclilo de 3 a 10 miembros heterociclilo o heteroarilo de 5 a 10 miembros que está opcionalmente sustituido por uno o más grupos seleccionados independientemente entre el grupo Q; R10 y R11, que pueden ser iguales o diferentes, cada uno representa alquilo C1-4, alquenilo C2-6, alquinilo C2-6, haloalquilo C1-4, alcoxi C1-3alquilo C1-4, ciano(alquilo C1-3) o alquilsulfonil C1-3alquilo C1-4; o como alternativa R10 y R11, junto con un átomo de nitrógeno unido a ellos, forman un heterociclilo de 3 a 10 miembros o un heteroarilo de 5 a 10 miembros; R12 y R13, que pueden ser iguales o diferentes, cada uno representa hidrógeno, alquilo C1-4, alquenilo C2-6, alquinilo C2-6, haloalquilo C1-4, alcoxi C1-3alquilo C1-4, arilo C6-10, heteroarilo de 5 a 10 miembros, heterociclilo de 3 a 10 miembros, aril C6-10alquilo C1-4, heterociclilalquilo C1-3 de 3 a 10 miembros, 5 heteroarilalquilo C1-3 de 5 a 10 miembros, ciano(alquilo C1-3), alquilsulfonil C1-3 alquilo C1-4, anillo cicloalifático de 3 a 10 miembros, heteroarilo de 5 a 10 miembros o heterociclilo de 3 a 10 miembros; o como alternativa R12 y R13, junto con un átomo de nitrógeno unido a ellos, forman heterociclilo de 3 a 10 miembros o heteroarilo de 5 a 10 miembros que está opcionalmente sustituido por uno o más grupos seleccionados independientemente entre el grupo Q; R14 representa alquilo C1-4, alquenilo C2-6, alquinilo C2-6, haloalquilo C1-4, arilo C6-10 que está opcionalmente sustituido por uno o más grupos seleccionados independientemente entre el grupo P, o heteroarilo de 5 a 10 miembros o heterociclilo de 3 a 10 miembros que está opcionalmente sustituido por uno o más grupos seleccionados independientemente entre el grupo Q; R15 representa alquilo C1-4, alquenilo C2-6, alquinilo C2-6, haloalquilo C1-4, arilo C6-10 que está opcionalmente sustituido por uno o más grupos seleccionados independientemente entre el grupo P, o heteroarilo de 5 a 10 miembros o heterociclilo de 3 a 10 miembros que está opcionalmente sustituido por uno o más grupos seleccionados independientemente entre el grupo Q; R16 representa alquilo C1-4, alquenilo C2-6, alquinilo C2-6, haloalquilo C1-4, arilo C6-10 que está opcionalmente sustituido por uno o más grupos seleccionados independientemente entre el grupo P, o heteroarilo de 5 a 10 miembros o heterociclilo de 3 a 10 miembros que está opcionalmente sustituido por uno o más grupos seleccionados independientemente entre el grupo Q; R17 representa hidrógeno o alquilo C1-4; R18 representa alquilo C1-4, alquenilo C2-6, alquinilo C2-6, haloalquilo C1-4, arilo C6-10 que está opcionalmente sustituido por uno o más grupos seleccionados independientemente entre el grupo P, o heteroarilo de 5 a 10 miembros o heterociclilo de 3 a 10 miembros que está opcionalmente sustituido por uno o más grupos seleccionados independientemente entre el grupo Q; R19 representa hidrógeno, alquilo C1-4, cicloalquilo C3-7, haloalquilo C1-4, arilo C6-10 o heteroarilo de 5 a 10 miembros o heterociclilo de 3 a 10 miembros que está opcionalmente sustituido por uno o más grupos seleccionados independientemente entre el grupo Q; R20 representa alquilo C1-4, cicloalquilo C3-7, haloalquilo C1-4, arilo C6-10, heteroarilo de 5 a 10 miembros o heterociclilo de 3 a 10 miembros; R21 representa alquilo C1-4, cicloalquilo C3-7, haloalquilo C1-4, arilo C6-10, heteroarilo de 5 a 10 miembros o heterociclilo de 3 a 10 miembros; R22 representa hidrógeno, alquilo C1-4 o haloalquilo C1-4; R23 representa hidrógeno, alquilo C1-4, cicloalquilo C3-7, haloalquilo C1-4, arilo C6-10, heteroarilo de 5 a 10 miembros o heterociclilo de 3 a 10 miembros; R24 representa hidrógeno, alquilo C1-4 o haloalquilo C1-4; R25 representa alquilo C1-4, cicloalquilo C3-7, haloalquilo C1-4, arilo C6-10, heteroarilo de 5 a 10 miembros o heterociclilo de 3 a 10 miembros; R26 y R27, que pueden ser iguales o diferentes, cada uno representa hidrógeno, alquilo C1-4, alquenilo C2-6, alquinilo C2-6, haloalquilo C1-4, alcoxil C1-3alquilo C1-4, arilo C6-10, heteroarilo de 5 a 10 miembros, heterociclilo de 3 a 10 miembros, aril C6-10alquilo C1-4, heterociclilalquilo C1-3 de 3 a 10 miembros, heteroarilalquilo C1-3 de 5 a 10 miembros, ciano(alquilo C1-3), alquilsulfonil C1-3alquilo C1-4 o un anillo cicloalifático de 3 a 10 miembros; o como alternativa R26 y R27, junto con un átomo de nitrógeno unido a ellos, forman un heterociclilo de 3 a 10 miembros o un heteroarilo de 5 a 10 miembros; R28 y R29, que pueden ser iguales o diferentes, cada uno representa hidrógeno, alquilo C1-4, alquenilo C2-6, alquinilo C2-6, haloalquilo C1-4, alcoxil C1-3alquilo C1-4, arilo C6-10, heteroarilo de 5 a 10 miembros, heterociclilo de 3 a 10 miembros, aril C6-10alquilo C1-4, heterociclilalquilo C1-3 de 3 a 10 miembros, heteroarilalquilo C1-3 de 5 a 10 miembros, ciano(alquilo C1-3), alquilsulfonil C1-3alquilo C1-4 o un anillo cicloalifático de 3 a 10 miembros; o como alternativa R28 y R29, junto con un átomo de nitrógeno unido a ellos, forman un heterociclilo de 3 a 10 miembros o un heteroarilo de 5 a 10 miembros; R30 representa alquilo C1-4, cicloalquilo C3-7, haloalquilo C1-4, arilo C6-10, heteroarilo de 5 a 10 miembros o heterociclilo de 3 a 10 miembros; R31 representa alquilo C1-4, cicloalquilo C3-7, haloalquilo C1-4, arilo C6-10, heteroarilo de 5 a 10 miembros o heterociclilo de 3 a 10 miembros; R32 representa alquilo C1-4 o arilo C6-10; <grupo P> halógeno, alquilo C1-4, haloalquilo C1-4, -OH, alcoxi C1-3, haloalcoxi C1-3, heterociclilamino de 3 a 10 miembros, - SO2R16, -CN, -NO2 y heterociclilo de 3 a 10 miembros; <grupo Q> halógeno, alquilo C1-4, haloalquilo C1-4, -OH, alcoxi C1-3, monohidroxi alquilo C1-6, dihidroxi alquilo C1-6, trihidroxi alquilo C1-6, heterociclil amina 3 a 10 miembros, -SO2R16, -CN, -NO2, cicloalquilo C3-7, -COR19 y heterociclilo de 3 a 10 miembros que está opcionalmente sustituido por alquilo C1-4.

Description

DESCRIPCIÓN

Genes mutantes guardián de fgfr y fármacos que se dirigen a los mismos

Campo técnico

La presente invención se refiere a polipéptidos mutantes que comprenden nuevas mutaciones guardianes; a polinucleótidos que codifican los polipéptidos; a vectores que comprenden los polinucleótidos; a células que comprenden los vectores; a métodos y kits para detectar los polinucleótidos o polipéptidos mutantes; a métodos para seleccionar pacientes con cáncer, a los que se les puede aplicar un inhibidor de FGFR; a composiciones farmacéuticas para su uso en el tratamiento del cáncer, en donde los compuestos que tienen actividad inhibidora de FGFR, o sales farmacéuticamente aceptables de los mismos, se usan para la administración a pacientes que expresan los polipéptidos mutantes o que portan los polinucleótidos.

Antecedentes de la técnica

El cáncer puede desarrollarse en cualquier órgano o tejido, y es muy refractario y letal. No hace falta decir que el cáncer es una enfermedad muy difícil. Datos estadísticos recientes muestran que una de cada dos personas es diagnosticada con cáncer durante su vida, y uno de cada cuatro hombres y una de cada seis mujeres mueren de cáncer. Por tanto, el cáncer sigue siendo una enfermedad extremadamente grave.

Los receptores del factor de crecimiento de fibroblastos (FGFR, siglas del inglés fibroblast growth factor receptor) son cinasas que pertenecen a la familia de receptores de tirosina cinasa. FGFR1, FGFR2, FGFR3 y FGFR4 constituyen la familia de FGFR. El ligando es el factor de crecimiento de fibroblastos (FGF, siglas del inglés fibroblast growth factor), y 22 tipos de proteínas estructuralmente similares forman la familia.

Las señales transmitidas a través del FGFR se transportan a la ruta MAPK o a la ruta PI3K/AKT. Se ha informado que en el cáncer, la transducción de señales está involucrada en el crecimiento celular, angiogénesis, migración celular, invasión, metástasis, etc.; y que el FGFR se activa como resultado de la sobreexpresión, hiperamplificación génica, mutación o translocación (documento no de patente 1). Por ejemplo, se sabe que para el FGFR3, se observa translocación genética en mieloma múltiple (documento no patente 2); se observa mutación génica en cáncer de vejiga (documento no patentado 3); y se observa sobreexpresión en cáncer de ovario, en carcinoma pulmonar no microcítico y en carcinoma hepatocelular.

Los hallazgos descritos anteriormente sugieren una conexión entre el FGFR y el cáncer. Por tanto, se han realizado intentos para desarrollar compuestos antineoplásicos con actividad inhibidora de FGFR (documentos no de patente 4 y 5).

En la actualidad, en el mercado se dispone de varios fármacos dirigidos a moléculas, específicos para diversos tipos de cinasas. Sin embargo, determinadas mutaciones de aminoácidos en la tirosina cinasa del EGFR (receptor del factor de crecimiento epidérmico), que es una molécula diana de gefitinib, erlotinib, y moléculas similares, se han convertido en la principal causa de adquisición de resistencia a gefitinib, erlotinib y moléculas similares. Dichas mutaciones se denominan mutaciones guardián (GK, siglas del inglés gatekeeper), y también ha habido informes sobre mutaciones GK en FGFR2 (documento no de patente 6).

Documentos de la técnica anterior

[Documentos no de patente]

[Documento 1 no de patente] Cytokine & Growth Factor Reviews, 2005, 16: 139-149

[Documento 2 no de patente] Blood, 2003, 101: 4569-4575

[Documento 3 no de patente] Nature Genetics, septiembre de 1999., 23(1): 18-20

[Documento 4 no de patente] Cancer Research, 2012, 72: 2045-2056

[Documento 5 no de patente] J. Med. Chem., 2011, 54: 7066-7083

[Documento 6 no de patente] Neoplasia (2013), 15(8), 975-988

Sumario de la invención

[Problemas a resolver por la invención]

Los presentes inventores identificaron nuevas mutaciones guardián en el gen de FGFR, y también descubrieron que inhibidores específicos del FGFR tenían una actividad inhibidora sobre el FGFR portador de esas mutaciones, cuya actividad es equivalente a la del FGFR no portador de las mutaciones.

En otras palabras, un objetivo de la presente invención es proporcionar nuevos agentes antitumorales que tengan altos efectos antineoplásicos incluso para cánceres con un FGFR que ha adquirido resistencia a otros inhibidores de FGFR como resultado de la adquisición de las mutaciones mencionadas anteriormente.

[Medios para resolver los problemas]

Para resolver los problemas mencionados anteriormente, los presentes inventores realizaron investigaciones especializadas sobre genes mutantes que podían causar mutaciones guardián de diversos FGFR, realizando análisis de estructura cristalina en los FGFR. Como resultado, los inventores identificaron nuevas mutaciones GK (por ejemplo, la mutación V564F en la SEQ ID NO: 1) y mutaciones correspondientes a las mutaciones GK mencionadas anteriormente (por ejemplo, la mutación V562L en la SEQ ID NO: 1) y descubrieron que los FGFR portadores de estas mutaciones demostraban resistencia a inhibidores de FGFR conocidos, tales como AZD4547 y, al mismo tiempo, demostraban sensibilidad al Compuesto A, y por tanto dieron por terminada la presente invención.

En decir, la presente invención se refiere específicamente a: un polipéptido mutante de FGFR, que comprende una nueva mutación guardián; un polinucleótido que codifica el polipéptido mutante; un vector comprende el polinucleótido; una célula que comprende el vector; un método y un kit para detectar el polinucleótido; una composición farmacéutica para su uso en el tratamiento del cáncer, caracterizada por que se utilizada administrándola a un paciente que expresa el polipéptido mutante; un método para seleccionar un paciente al que se le puede aplicar la composición farmacéutica.

A continuación se enumeran las características básicas y las diversas realizaciones de la presente invención: La presente invención se refiere a una composición farmacéutica para su uso en un método para el tratamiento del cáncer que comprende, como principio activo, el compuesto representado por la Fórmula (I) siguiente o una sal del mismo farmacéuticamente aceptable, en donde la composición farmacéutica para el tratamiento del cáncer se caracteriza por que se utiliza administrándola a un paciente que expresa un polipéptido mutante de FGFR que comprende una sustitución de valina por fenilalanina en el 7° aminoácido a partir del extremo N y/o una sustitución de valina por leucina en el 5° aminoácido a partir del extremo N en la secuencia de aminoácidos parcial descrita en la SEQ ID NO: 53 o 54 en un polipéptido de FGFR, o que tiene un polinucleótido que codifica dicho polipéptido mutante, en donde las mutaciones son causantes de la adquisición de resistencia a inhibidores de FGFR pero son sensibles al compuesto representado por la siguiente Fórmula (I):

en donde Rⁱ, R², R³, y R⁴cada uno representa independientemente el grupo enumerado a continuación:

Rⁱrepresenta hidrógeno, hidroxi, halógeno, ciano, nitro, haloalquilo C^1-4, alquilo C^1-6, alquenilo C^2-6, alquinilo C^2-6, cicloalquilo C^3-7, aril C^6-1oalquilo C^1-4, -OR⁵, -NR⁶R⁷, -(CR⁸R⁹)ⁿZ¹, -C(O)NR¹²R¹³, -SR¹⁴, -SOR¹⁵, -SO²R¹⁶, -NR¹⁷SO²R⁸, COOH, arilo C^6-10que está opcionalmente sustituido por uno o más grupos seleccionados independientemente entre el grupo P, heteroarilo de 5 a 10 o heterociclilo de 3 a 10 miembros que está opcionalmente sustituido por uno o más grupos seleccionados independientemente entre el grupo Q, -COR¹⁹, -COOR²⁰, -OC(O)R²¹, -NR²²C(O)R²³, -NR²⁴C(S)R²⁵, -C(S)NR²⁶R²⁷, -SO²NR²⁸R²⁹, -OSO²R³⁰, -SO³R³¹o -Si(R³²)³; R²representa hidrógeno, hidroxi, halógeno, ciano, nitro, haloalquilo C^1-4, alquilo C^1-6, alquenilo C^2-6, alquinilo C^2-6, cicloalquilo C^3-7, aril C^6-10alquilo C^1-4, -OR⁵, -NR⁶R⁷, -(CR⁸R⁹)ⁿZ¹, -C(O)NR¹²R¹³, -SR¹⁴, -SOR¹⁵, -SO²R¹⁶, -NR¹⁷SO²R⁸, COOH, arilo C^6-10que está opcionalmente sustituido por uno o más grupos seleccionados independientemente entre el grupo P, heteroarilo de 5 a 10 o heterociclilo de 3 a 10 miembros que está opcionalmente sustituido por uno o más grupos seleccionados independientemente entre el grupo Q, -COR¹⁹, -COOR²⁰, -OC(O)R²¹, -NR²²C(O)R²³, -NR²⁴C(S)R²⁵, -C(S)NR²⁶R²⁷, -SO²NR²⁸R²⁹, -OSO²R³⁰, -SO³R³¹o -Si(R³²)³; o R¹y R², junto con un átomo unido a ellos, forman un heterociclilo de 3 a 10 miembros o heteroarilo de 5 a 10 miembros, en donde el heterociclilo o heteroarilo está opcionalmente sustituido por halógeno;

R³representa metilo;

R⁴representa hidrógeno;

A es indol;

R⁵representa alquilo C^1-5, cicloalquilo C^3-7, cicloalquil C^3-7alquilo C^1-3, alquenilo C^2-6, alquinilo C^2-6, haloalquilo C^1-4, alcoxi C^1-3alquilo C^1-4, alcoxi C^1-3alcoxi C^1-4alquilo C^1-4, aldehido C^1-4, alquilamino C^1-4alquilo C^1-4, di(alquil C^1- ⁴)amino alquilo C^1-4, arilo C^6-10, aril C^{6- io}alquilo C^1-3o heterociclilalquilo C^1-3de 3 a 10 miembros, heterociclilo de 3 a 10 miembros, heteroarilo de 5 a 10 miembros, heteroarilalquilo C^1-3de 5 a 10 miembros, monohidroxi alquilo C ^i-6, dihidroxi alquilo C^1-6o trihidroxi alquilo C^1-6el cual está opcionalmente sustituido por uno o más grupos seleccionados independientemente entre el grupo Q;

R⁶y R⁷, que pueden ser iguales o diferentes, cada uno representa hidrógeno, alquilo C^1-4, alquenilo C^2-6, alquinilo C^2-6, haloalquilo C^1-4, alcoxi C^1-3alquilo C^1-4, aril C^6-10alquilo C^1-3, heterociclilalquilo C^1-3de 3 a 10 miembros, heteroarilalquilo C^1-3de 5 a 10 miembros, monohidroxi alquilo C^1-6, dihidroxi alquilo C^1-6, trihidroxi alquilo C^1-6, heterociclilo de 3 a 10 miembros, aldehído C^1-4, alquilamino C^1-4alquilo C^1-4, di(alquil C^1-4)amino alquilo C^1-4o ciano(alquilo C^1-3); o como alternativa R⁶y R⁷, junto con un átomo de nitrógeno unido a ellos, forman un heterociclilo de 3 a 10 miembros o un heteroarilo de 5 a 10 miembros;

n representa 1 a 3;

R⁸y R⁹, que pueden ser iguales o diferentes, cada uno representa hidrógeno, alquilo C^1-4o halógeno; o como alternativa R⁸y R⁹, junto con un átomo de carbono unido a ellos, forman un anillo cicloalifático; Z¹representa hidrógeno, NR¹⁰R¹¹, -OH o heterociclilo de 3 a 10 miembros heterociclilo o heteroarilo de 5 a 10 miembros que está opcionalmente sustituido por uno o más grupos seleccionados independientemente entre el grupo Q;

R¹⁰y R¹¹, que pueden ser iguales o diferentes, cada uno representa alquilo C^1-4, alquenilo C^2-6, alquinilo C^2-6, haloalquilo C^1-4, alcoxi C^1-3alquilo C^1-4, ciano(alquilo C^1-3) o alquilsulfonil C^1-3alquilo C^1-4; o como alternativa R¹⁰y R¹¹, junto con un átomo de nitrógeno unido a ellos, forman un heterociclilo de 3 a 10 miembros o un heteroarilo de 5 a 10 miembros;

R¹²y R¹³, que pueden ser iguales o diferentes, cada uno representa hidrógeno, alquilo C^1-4, alquenilo C^2-6, alquinilo C^2-6, haloalquilo C^1-4, alcoxi C^1-3alquilo C^1-4, arilo C^6-10, heteroarilo de 5 a 10 miembros, heterociclilo de 3 a 10 miembros, aril C^6-10alquilo C^1-4, heterociclilalquilo C^1-3de 3 a 10 miembros, heteroarilalquilo C^1-3de 5 a 10 miembros, ciano(alquilo C^1-3), alquilsulfonil C^1-3alquilo C^1-4, anillo cicloalifático de 3 a 10 miembros, heteroarilo de 5 a 10 miembros o heterociclilo de 3 a 10 miembros; o como alternativa R¹²y R¹³, junto con un átomo de nitrógeno unido a ellos, forman un heterociclilo de 3 a 10 miembros o un heteroarilo de 5 a 10 miembros que está opcionalmente sustituido por uno o más grupos seleccionados independientemente entre el grupo Q; R¹⁴representa alquilo C^1-4, alquenilo C^2-6, alquinilo C^2-6, haloalquilo C^1-4, arilo C^6-10que está opcionalmente sustituido por uno o más grupos seleccionados independientemente entre el grupo P, o heteroarilo de 5 a 10 miembros o heterociclilo de 3 a 10 miembros que está opcionalmente sustituido por uno o más grupos seleccionados independientemente entre el grupo Q;

R¹⁵representa alquilo C^1-4, alquenilo C^2-6, alquinilo C^2-6, haloalquilo C^1-4, arilo C^6-10que está opcionalmente sustituido por uno o más grupos seleccionados independientemente entre el grupo P, o heteroarilo de 5 a 10 miembros o heterociclilo de 3 a 10 miembros que está opcionalmente sustituido por uno o más grupos seleccionados independientemente entre el grupo Q;

R¹⁶representa alquilo C^1-4, alquenilo C^2-6, alquinilo C^2-6, haloalquilo C^1-4, arilo C^6-10que está opcionalmente sustituido por uno o más grupos seleccionados independientemente entre el grupo P, o heteroarilo de 5 a 10 miembros o heterociclilo de 3 a 10 miembros que está opcionalmente sustituido por uno o más grupos seleccionados independientemente entre el grupo Q;

R¹⁷representa hidrógeno o alquilo C^1-4;

R¹⁸representa alquilo C^1-4, alquenilo C^2-6, alquinilo C^2-6, haloalquilo C^1-4, arilo C^6-10que está opcionalmente sustituido por uno o más grupos seleccionados independientemente entre el grupo P, o heteroarilo de 5 a 10 miembros o heterociclilo de 3 a 10 miembros que está opcionalmente sustituido por uno o más grupos seleccionados independientemente entre el grupo Q;

R¹⁹representa hidrógeno, alquilo C^1-4, cicloalquilo C^3-7, haloalquilo C^1-4, arilo C^6-10o heteroarilo de 5 a 10 miembros o heterociclilo de 3 a 10 miembros que está opcionalmente sustituido por uno o más grupos seleccionados independientemente entre el grupo Q;

R²⁰representa alquilo C^1-4, cicloalquilo C^3-7, haloalquilo C^1-4, arilo C^6-10, heteroarilo de 5 a 10 miembros o heterociclilo de 3 a 10 miembros;

R²¹representa alquilo C^1-4, cicloalquilo C^3-7, haloalquilo C^1-4, arilo C^6-10, heteroarilo de 5 a 10 miembros o heterociclilo de 3 a 10 miembros;

R²²representa hidrógeno, alquilo C^1-4o haloalquilo C^1-4;

R²³representa hidrógeno, alquilo C^1-4, cicloalquilo C^3-7, haloalquilo C^1-4, arilo C^6-10, heteroarilo de 5 a 10 miembros o heterociclilo de 3 a 10 miembros;

R²⁴representa hidrógeno, alquilo C^1-4o haloalquilo C^1-4;

R²⁵representa alquilo C^1-4, cicloalquilo C^3-7, haloalquilo C^1-4, arilo C^6-10, heteroarilo de 5 a 10 miembros o heterociclilo de 3 a 10 miembros;

R²⁶y R²⁷, que pueden ser iguales o diferentes, cada uno representa hidrógeno, alquilo C^1-4, alquenilo C^2-6, alquinilo C^2-6, haloalquilo C^1-4, alcoxil C^1-3alquilo C^1-4, arilo C^6-10, heteroarilo de 5 a 10 miembros, heterociclilo de 3 a 10 miembros, aril C^6-10alquilo C^1-4, heterociclilalquilo C^1-3de 3 a 10 miembros, heteroarilalquilo C^1-3de 5 a 10 miembros, ciano(alquilo C^1-3), alquilsulfonil C^1-3alquilo C^1-4o un anillo cicloalifático de 3 a 10 miembros; o como alternativa R²⁶y R²⁷, junto con un átomo de nitrógeno unido a ellos, forman un heterociclilo de 3 a 10 miembros o un heteroarilo de 5 a 10 miembros;

R²⁸y R²⁹, que pueden ser iguales o diferentes, cada uno representa hidrógeno, alquilo C^1-4, alquenilo C^2-6, alquinilo C^2-6, haloalquilo C^1-4, alcoxil C^1-3alquilo C^1-4, arilo C^6-10, heteroarilo de 5 a 10 miembros, heterociclilo de 3 a 10 miembros, aril C^6-10alquilo C^1-4, heterociclilalquilo C^1-3de 3 a 10 miembros, heteroarilalquilo C^1-3de 5 a 10 miembros, ciano(alquilo C^1-3), alquilsulfonil C^1-3alquilo C^1-4o un anillo cicloalifático de 3 a 10 miembros; o como alternativa R²⁸y R²⁹, junto con un átomo de nitrógeno unido a ellos, forman un heterociclilo de 3 a 10 miembros o un heteroarilo de 5 a 10 miembros;

R³⁰representa alquilo C^1-4, cicloalquilo C^3-7, haloalquilo C^1-4, arilo C^6-10, heteroarilo de 5 a 10 miembros o heterociclilo de 3 a 10 miembros;

R³¹representa alquilo C^1-4, cicloalquilo C^3-7, haloalquilo C^1-4, arilo C^6-10, heteroarilo de 5 a 10 miembros o heterociclilo de 3 a 10 miembros;

R³²representa alquilo C^1-4o arilo C^6-10;

halógeno, alquilo C^1-4, haloalquilo C^1-4, -OH, alcoxi C^1-3, haloalcoxi C^1-3, heterociclilamino de 3 a 10 miembros, -SO²R¹⁶, -CN, -NO²y heterociclilo de 3 a 10 miembros;

halógeno, alquilo C^1-4, haloalquilo C^1-4, -OH, alcoxi C^1-3, monohidroxi alquilo C^1-6, dihidroxi alquilo C^1-6, trihidroxi alquilo C^1-6, heterociclil amina 3 a 10 miembros, -SO²R¹⁶, -CN, -NO², cicloalquilo C^3-7, -COR¹⁹y heterociclilo de 3 a 10 miembros que está opcionalmente sustituido por alquilo C^1-4.

Otras realizaciones de la invención se especifican en las reivindicaciones.

Se divulga lo siguiente:

[1] Una composición farmacéutica para el tratamiento del cáncer que comprende como principio activo el compuesto representado por la Fórmula (I) a continuación o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, en donde la composición farmacéutica para el tratamiento del cáncer se caracteriza por usarse administrándola a un paciente que expresa un polipéptido mutante FGFR que comprende una sustitución de valina por fenilalanina en el 7° aminoácido del extremo N y/o una sustitución de valina por leucina en el 5° aminoácido del extremo N en la secuencia de aminoácidos parcial descrita en la SEC ID No.: 53 o 54 en un polipéptido FGFR o que tiene un polinucleótido que codifica dicho polipéptido mutante:

R¹representa hidrógeno, hidroxi, halógeno, ciano, nitro, haloalquilo C^1-4, alquilo C^1-6, alquenilo C^2-6, alquinilo C^2-6, cicloalquilo C^3-7, aril C^6-10alquilo C^1-4, -OR⁵, -NR⁶R⁷, -(CR⁸R⁹)ⁿZ¹, -C(O)NR¹²R¹³, -SR¹⁴, -SOR¹⁵, -SO²R¹⁶, -NR¹⁷SO²R⁸, COOH, arilo C^6-10que está opcionalmente sustituido por uno o más grupos seleccionados independientemente entre el grupo P, heteroarilo de 5 a 10 o heterociclilo de 3 a 10 miembros que está opcionalmente sustituido por uno o más grupos seleccionados independientemente entre el grupo Q, -COR¹⁹, -COOR²⁰, -OC(O)R²¹, -NR²²C(O)R²³, -NR²⁴C(S)R²⁵, -C(S)NR²⁶R²⁷, -SO²NR²⁸R²⁹, -OSO²R³⁰, -SO³R³¹o -Si(R³²)³;

R²representa hidrógeno, hidroxi, halógeno, ciano, nitro, haloalquilo C^1-4, alquilo C^1-6, alquenilo C^2-6, alquinilo C^2-6, cicloalquilo C^3-7, aril C^6-10alquilo C^1-4, -OR⁵, -NR⁶R⁷, -(CR⁸R⁹)ⁿZ¹, -C(O)NR¹²R¹³, -SR¹⁴, -SOR¹⁵, -SO²R¹⁶, -NR¹⁷SO²R¹⁸, COOH, arilo C^6-10que está opcionalmente sustituido por uno o más grupos seleccionados independientemente entre el grupo P, heteroarilo de 5 a 10 o heterociclilo de 3 a 10 miembros que está opcionalmente sustituido por uno o más grupos seleccionados independientemente entre el grupo Q, -COR¹⁹, -COOR²⁰, -OC(O)R²¹, -NR²²C(O)R²³, -NR²⁴C(S)R²⁵, -C(S)NR²⁶R²⁷, -SO²NR²⁸R²⁹, -OSO²R³⁰, -SO³R³¹o -Si(R³²)³; o

R¹y R², junto con un átomo unido a ellos, forman un heterociclilo de 3 a 10 miembros o heteroarilo de 5 a 10 miembros, en donde el heterociclilo o heteroarilo está opcionalmente sustituido por halógeno;

R³representa metilo;

R⁴representa hidrógeno;

A es indol;

R⁵representa alquilo C^1-5, cicloalquilo C^3-7, cicloalquil C^3-7alquilo C^1-3, alquenilo C^2-6, alquinilo C^2-6, haloalquilo C^1-4, alcoxi C^1-3alquilo C^1-4, alcoxi C^1-3alcoxi C^1-4alquilo C^1-4, aldehído C^1-4, alquilamino C^1-4alquilo C^1-4, di(alquil C^1-4)amino alquilo C^1-4, arilo C^6-10, aril C^6-10alquilo C^1-3o heterociclilalquilo C^1-3de 3 a 10 miembros, heterociclilo de 3 a 10 miembros, heteroarilo de 5 a 10 miembros, heteroarilalquilo C^1-3de 5 a 10 miembros, monohidroxi alquilo C^1-6, dihidroxi alquilo C^1-6o trihidroxi alquilo C^1-6el cual está opcionalmente sustituido por uno o más grupos seleccionados independientemente entre el grupo Q;

R⁶y R⁷, que pueden ser iguales o diferentes, cada uno representa hidrógeno, alquilo C^1-4, alquenilo C^2-6, alquinilo C^2-6, haloalquilo C^1-4, alcoxi C^1-3alquilo C^1-4, aril C^6-10alquilo C^1-3, heterociclilalquilo C^1-3de 3 a 10 miembros, heteroarilalquilo C^1-3de 5 a 10 miembros, monohidroxi alquilo C^1-4, dihidroxi alquilo C^1-4, trihidroxi alquilo C^1-4, heterociclilo de 3 a 10 miembros, aldehído C^1-4, alquilamino C^1-4alquilo C^1-4, di(alquil C^1-4)amino alquilo C^1-4o ciano(alquilo C^1-3); o como alternativa R⁶y R⁷, junto con un átomo de nitrógeno unido a ellos, forman un heterociclilo de 3 a 10 miembros o un heteroarilo de 5 a 10 miembros; n representa 1 a 3;

R⁸y R⁹, que pueden ser iguales o diferentes, cada uno representa hidrógeno, alquilo C^1-4o halógeno; o como alternativa R⁸y R⁹, junto con un átomo de carbono unido a ellos, forman un anillo cicloalifático; Z¹representa hidrógeno, NR¹⁰R¹¹, -OH o heterociclilo de 3 a 10 miembros heterociclilo o heteroarilo de 5 a 10 miembros que está opcionalmente sustituido por uno o más grupos seleccionados independientemente entre el grupo Q; R¹⁰y R¹¹, que pueden ser iguales o diferentes, cada uno representa alquilo C^1-4, alquenilo C^2-6, alquinilo C^2-6, haloalquilo C^1-4, alcoxi C^1-3alquilo C^1-4, ciano(alquilo C^1-3) o alquilsulfonil C^1-3alquilo C^1-4; o como alternativa R¹⁰y R¹¹, junto con un átomo de nitrógeno unido a ellos, forman un heterociclilo de 3 a 10 miembros o un heteroarilo de 5 a 10 miembros;

R¹⁷representa hidrógeno o alquilo C^1-4;

R¹⁸representa alquilo C^1-4, alquenilo C^2-6, alquinilo C^2-6, haloalquilo, arilo C^6-10que está opcionalmente sustituido por uno o más grupos seleccionados independientemente entre el grupo P, o heteroarilo de 5 a 10 miembros o heterociclilo de 3 a 10 miembros que está opcionalmente sustituido por uno o más grupos seleccionados independientemente entre el grupo Q;

R²²representa hidrógeno, alquilo C^1-4o haloalquilo C^1-4;

R²⁴representa hidrógeno, alquilo C^1-4o haloalquilo C^1-4;

R²⁸y R²⁹, que pueden ser iguales o diferentes, cada uno representa hidrógeno, alquilo C^1-4, alquenilo C^2-6, alquinilo C^2-6, haloalquilo C^1-4, alcoxil C^{i -3}alquilo C^1-4, arilo C^{a - io}, heteroarilo de 5 a 10 miembros, heterociclilo de 3 a 10 miembros, aril C^6-10alquilo C^1-4, heterociclilalquilo C^1-3de 3 a 10 miembros, heteroarilalquilo C^1-3de 5 a 10 miembros, ciano(alquilo C^1-3), alquilsulfonil C^1-3alquilo C^1-4o un anillo cicloalifático de 3 a 10 miembros; o como alternativa R²⁸y R²⁹, junto con un átomo de nitrógeno unido a ellos, forman un heterociclilo de 3 a 10 miembros o un heteroarilo de 5 a 10 miembros;

R³²representa alquilo C^1-4o arilo C^6-10;

halógeno, alquilo C^1-4, haloalquilo C^1-4, -OH, alcoxi C^1-3, monohidroxi alquilo C^1-4, dihidroxi alquilo C^1-4, trihidroxi alquilo C^1-4, heterociclil amina 3 a 10 miembros, -SO²R¹⁶, -CN, -NO², cicloalquilo C^3-7, -COR¹⁹y heterociclilo de 3 a 10 miembros que está opcionalmente sustituido por alquilo C^1-4;

[2] la composición farmacéutica de [1], que comprende como principio activo el compuesto representado por la fórmula a continuación o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo:

[3] un polipéptido mutante de FGFR que comprende una sustitución de valina por fenilalanina en el 7° aminoácido a partir del extremo N y/o una sustitución de valina por leucina en el 5° aminoácido a partir del extremo N en la secuencia de aminoácidos parcial descrita en la SEQ ID NO: 53 o 54 en un polipéptido de FGFR;

[4] un polinucleótido que codifica el polipéptido mutante de [3];

[5] un vector que comprende el polinucleótido de [4];

[6] una célula recombinante que comprende el vector de [5].

Se desvela:

[7] un anticuerpo, o fragmento de unión a antígeno del mismo, que se une específicamente al polipéptido mutante de [3];

[8] un par de cebadores oligonucleotídicos o una o más sondas oligonucleotídicas que comprenden uno o más oligonucleótidos que se hibridan específicamente con un polinucleótido que codifica el polipéptido mutante de [3] para detectar o amplificar el polinucleótido;

[9] un oligonucleótido que se une a un polinucleótido de ARNm que codifica el polipéptido mutante de

[3] y que tiene una actividad para inhibir la traducción del polinucleótido de ARNm en proteína;

[10] el oligonucleótido de [9], que es un ARNip que escinde el polinucleótido de ARNm;

[11] un método para detectar un polipéptido mutante de FGFR, que comprende la etapa de detectar el polipéptido mutante en una muestra aislada de un sujeto utilizando un anticuerpo, o fragmento de unión a antígeno del mismo, que se une específicamente al polipéptido mutante de [3];

[12] un método para detectar un polinucleótido que codifica un polipéptido mutante FGFR, que comprende la etapa de detectar un polinucleótido que codifica el polipéptido mutante en una muestra aislada de un sujeto utilizando un par de cebadores oligonucleotídicos o una o más sondas oligonucleotídicas que comprenden uno o más oligonucleótidos que se hibridan específicamente con un polinucleótido que codifica el polipéptido mutante de [3] para detectar o amplificar el polinucleótido. La presente invención se refiere a:

[13] un kit para detectar un polinucleótido que codifica un polipéptido mutante de FGFR, que comprende un par de cebadores de oligonucleótidos o una o más sondas oligonucleotídicas que comprenden uno o más oligonucleótidos que se hibridan específicamente con un polinucleótido que codifica el polipéptido mutante de [3] para detectar o amplificar el polinucleótido;

Se desvela:

[14] un kit para detectar un polipéptido mutante de FGFR, que comprende un anticuerpo, o fragmento de unión a antígeno del mismo, que se une específicamente al polipéptido mutante de [3];

[15] un método para tratar cáncer, que comprende determinar la presencia o ausencia del polipéptido mutante de [3] o de un polinucleótido que codifica el polipéptido mutante, en una muestra aislada de un sujeto y administrar al sujeto la composición farmacéutica de [1] o [2] cuando se detecta el polipéptido mutante o el polinucleótido;

[16] el método de [15], en donde el cáncer es cáncer de vejiga, tumor cerebral, carcinoma epidermoide de cabeza y cuello, cáncer de pulmón, adenocarcinoma de pulmón, carcinoma epidermoide de pulmón, melanoma cutáneo, cáncer de endometrio, cáncer de mama, cáncer de próstata, cáncer de colon, cáncer de esófago, cáncer gástrico, cáncer del conducto colédoco, cáncer de las vías biliares o cáncer de hígado; La presente invención se refiere a:

[17] un método para seleccionar un paciente al que se le puede aplicar la composición farmacéutica de [1] o [2], que comprende las etapas de:

(a) determinar la presencia o ausencia del polipéptido mutante de [3] en una muestra aislada de un sujeto; y (b) seleccionar un sujeto que demuestra tener el polipéptido mutante, como un paciente al que se le puede aplicar la composición farmacéutica;

[18] un método para seleccionar un paciente al que se le puede aplicar la composición farmacéutica de [1] o [2], que comprende las etapas de:

(a) determinar la presencia o ausencia de un polinucleótido que codifica el polipéptido mutante de [3] en una muestra aislada de un sujeto; y

(b) seleccionar un sujeto que demuestra tener un polinucleótido que codifica el polipéptido mutante, como un paciente al que se le puede aplicar la composición farmacéutica;

[19] el método de [18], en donde el cáncer es cáncer de vejiga, tumor cerebral, carcinoma epidermoide de cabeza y cuello, cáncer de pulmón, adenocarcinoma de pulmón, carcinoma epidermoide de pulmón, melanoma cutáneo, cáncer de endometrio, cáncer de mama, cáncer de próstata, cáncer de colon, cáncer de esófago, cáncer gástrico, cáncer del conducto colédoco, cáncer de las vías biliares o cáncer de hígado; Se desvela:

[20] el compuesto definido en [1] o [2] o una sal del mismo farmacéuticamente aceptable, para su uso en el tratamiento del cáncer en un paciente que expresa el polipéptido mutante de [3] o que tiene un polinucleótido que codifica el polipéptido mutante;

[21] el compuesto de [20] o una sal del mismo farmacéuticamente aceptable, en donde el cáncer es cáncer de vejiga, tumor cerebral, cáncer epidermoide de cabeza y cuello, cáncer de pulmón, adenocarcinoma de pulmón, carcinoma epidermoide de pulmón, melanoma cutáneo, cáncer de endometrio, cáncer de mama, cáncer de próstata, cáncer de colon, cáncer de esófago, cáncer gástrico, cáncer del conducto colédoco, cáncer de las vías biliares o cáncer de hígado;

[22] una composición farmacéutica para el tratamiento del cáncer que comprende, como principio activo, el compuesto representado por la fórmula siguiente o una sal del mismo farmacéuticamente aceptable, en donde el cáncer expresa un polipéptido mutante de FGFR que comprende una sustitución de valina por fenilalanina en el 7° aminoácido a partir del extremo N y/o una sustitución de valina por leucina en el 5° aminoácido a partir del extremo N en la secuencia de aminoácidos parcial descrita en la SEQ ID NO: 53 o 54 en un polipéptido de FGFR:

[23] una composición farmacéutica para el tratamiento del cáncer que comprende, como principio activo, una sustancia que inhibe la función o expresión de un polipéptido mutante de FGFr , que comprende una sustitución de valina por fenilalanina en el 7°aminoácido a partir del extremo N y/o una sustitución de valina por leucina en el 5° aminoácido a partir del extremo N en la secuencia de aminoácidos parcial descrita en la SEQ ID NO: 53 o 54 en un polipéptido de FGFR;

[24] uso del compuesto definido en los apartados [1] o [2] mencionados anteriormente o una sal del mismo farmacéuticamente aceptable en la fabricación de una composición farmacéutica para el tratamiento o la prevención del cáncer, que se administrará a un paciente que expresa el polipéptido mutante de [ 3] o que tiene un polinucleótido que codifica el polipéptido mutante;

[25] un método para detectar resistencia a un inhibidor de FGFR seleccionado del grupo que consiste en PD173074, AZD4547, BGJ398 y AZD2171, que comprende las etapas de:

(a) determinar la presencia o ausencia del polipéptido mutante de [3] o un polinucleótido que codifica el polipéptido mutante en una muestra aislada de un sujeto; y

(b) determinar que el sujeto que demuestra tener el polipéptido mutante o el polinucleótido, tiene resistencia al inhibidor de FGFR;

[26] el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo de [7], o los cebadores oligonudeotídicos o la sonda o sondas oligonucleotídicas de [8] para su uso en la detección de la resistencia a un inhibidor de FGFR seleccionado del grupo que consiste en PD173074, AZD4547, BGJ398 y AZD2171;

[27] uso del anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo de [7], o de los cebadores oligonucleotídicos o la sonda o sondas oligonucleotídicas de [8] para detectar resistencia a un inhibidor de FGFR seleccionado del grupo que consiste en PD173074, AZD4547, BGJ398 y AZD2171;

[28] un método para predecir la respuesta de un paciente con cáncer al tratamiento con un inhibidor de FGFR seleccionado del grupo que consiste en PD173074, AZD4547, BGJ398 y AZD2171, que comprende las etapas de:

(a) determinar la presencia o ausencia del polipéptido mutante de [3] o de un polinucleótido que codifica el polipéptido mutante, en una muestra aislada del paciente; y

(b) determinar que el paciente que demuestra tener el polipéptido mutante o el polinucleótido, tiene baja sensibilidad al inhibidor de FGFR;

[29] el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo de [7], o los cebadores oligonucleotídicos o la sonda o sondas oligonucleotídicas de [8] para su uso en la predicción de la respuesta de un paciente con cáncer al tratamiento con un inhibidor de FGFR seleccionado del grupo que consiste en PD173074, AZD4547, BGJ398 y AZD2171;

[30] uso del anticuerpo o fragmento de unión al antígeno del mismo de [7], o de los cebadores oligonucleotídicos o de la sonda o sondas oligonucleotídicas de [8] para predecir la respuesta de un paciente con cáncer al tratamiento con un inhibidor de FGFR seleccionado del grupo que consiste en PD 173074, AZD4547, BGJ398 y AZD2171;

[31] un kit para predecir el efecto de un inhibidor de FGFR en el tratamiento del cáncer, que comprende el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo de [7], o los cebadores oligonucleotídicos o la sonda o sondas oligonucleotídicas de [8]; y

[32] El kit de [31], en donde el inhibidor de FGFR se selecciona del grupo que consiste en PD173074, AZD4547, BGJ398 y AZD2171.

[Efectos de la invención]

La presente invención puede proporcionar nuevos agentes antitumorales que tienen altos efectos antineoplásicos sobre cánceres con un FGFR que ha adquirido resistencia a otros inhibidores de FGFR.

Breve descripción de los dibujos

La figura 1 muestra los efectos de los Compuestos A y C sobre la fosforilación de tirosina de FGFR en células fabricadas para expresar el FGFR2 de tipo silvestre, el mutante V564F de FGFR2 o el mutante V562L de FGFR2. La Fig. 2 muestra gráficos que indican los efectos inhibidores de los Compuestos A, B y C sobre la proliferación de células fabricadas para expresar el FGFR2 de tipo silvestre, el mutante V564F de FGFR2 o el mutante V562L de FGFR2.

La Fig. 3 muestra gráficos que indican los efectos inhibidores de los Compuestos A, B, C, D y E sobre la proliferación de células fabricadas para expresar el FGFR2 de tipo silvestre fusionado con TEL o el mutante V564F de FGFR2 fusionado con TEL.

La Fig. 4 muestra gráficos que indican los efectos inhibidores de los Compuestos A y C sobre la proliferación tumoral en ratones portadores de células tumorales que expresan el FGFR2 de tipo silvestre fusionado con TEL o el mutante V564F de FGFR2 fusionado con TEL.

La Fig. 5 muestra gráficos que indican los efectos inhibidores del Compuesto A o C sobre la fosforilación en tumores en ratones portadores de células tumorales que expresan el FGFR2 de tipo silvestre fusionado con TEL o el mutante V564F de FGFR2 fusionado con TEL.

Modo para llevar a cabo la invención

La presente invención es una invención descrita en las reivindicaciones y proporciona: un polipéptido mutante de FGFR, que comprende una nueva mutación guardián; un polinucleótido que codifica el polipéptido mutante; un vector comprende el polinucleótido; una célula que comprende el vector; un método y un kit para detectar el polipéptido mutante o el polinucleótido; una composición farmacéutica para su uso en el tratamiento del cáncer caracterizada por que se utiliza administrándola a un paciente que expresa el polipéptido mutante; un método para seleccionar un paciente al que se le puede aplicar la composición farmacéutica; un compuesto que tiene actividad inhibidora de FGFR o una sal del mismo farmacéuticamente aceptable para su uso en el tratamiento del cáncer en un paciente que expresa el polipéptido mutante.

En la presente invención, "FGFR" se refiere a cualquier FGFR perteneciente a la familia de FGFR que comprende FGFR1, FGFR2, FGFR3 y FGFR4, que son receptores del factor de crecimiento de fibroblastos (FGFR) que pertenecen a la familia de receptores de tirosina cinasa (Cytokine & Growth Factor Reviews, 2005, 16: 139-149). Los FGFR pueden ser de cualquier origen, y son, preferentemente, FGFR procedentes de mamíferos (seres humanos, ratones, ratas, cobayas, conejos, ovejas, monos, cabras, burros, bovinos, caballos, cerdos, etc.), más preferentemente FGFR humanos, y aún más preferentemente, FGFR2, FGFR1 y FGFR3 humanos, sabiendo que cada uno de ellos tiene muchas isoformas.

En la presente invención, El "FGFR2 humano" es un polipéptido de FGFR2 humano de tipo silvestre que consiste en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1, 2, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43 o 44 (número de registro de GenBank: NP_000132.3, NP_075259.4, NP_001138385.1, NP_001138386.1, NP_001138387.1, NP_001138388.1, NP_001138389.1, NP_001138390.1, NP_001138391.1 o NP_075418.1, respectivamente), o un polipéptido mutante con uno o más (preferentemente de uno a diez, y en particular, preferentemente de uno a cinco) aminoácidos sustituidos, delecionados o insertados en el polipéptido de tipo silvestre.

En la presente invención, El "FGFR1 humano" es un polipéptido de FGFR1 humano de tipo silvestre que consiste en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 21, 45, 46, 47, 48, 49 o 50 (número de registro de GenBank: NP_001167538.1, NP_001167534.1, NP_001167535.1, NP_001167536.1, NP_001167537.1, NP_075594.1 o NP_075598.2, respectivamente), o un polipéptido mutante con uno o más (preferentemente de uno a diez, y en particular, preferentemente de uno a cinco) aminoácidos sustituidos, delecionados o insertados en el polipéptido de tipo silvestre.

En la presente invención, "FGFR3 humano" es un polipéptido de FGFR3 humano de tipo silvestre que consiste en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 22, 51 o 52 (número de registro de GenBank: NP_000133.1, NP_001156685.1 o NP_075254.1, respectivamente), o un polipéptido mutante con uno o más (preferentemente de uno a diez, y en particular, preferentemente de uno a cinco) aminoácidos sustituidos, delecionados o insertados en el polipéptido de tipo silvestre. Los polipéptidos mutantes también incluyen polipéptidos que tienen una homología de 70% o mayor, preferentemente polipéptidos que tienen una homología de 80 % o mayor, más preferentemente polipéptidos que tienen una homología de 90 % o mayor, e incluso más preferentemente, polipéptidos que tienen una homología de 95 % o mayor, con la secuencia de aminoácidos del polipéptido de tipo silvestre.

La identidad de secuencia de aminoácidos (o secuencia de nucleótidos) puede determinarse usando el algoritmo BLAST de Karlin y Altschul (Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1993) 90, 5873-7). Basándose en este algoritmo, se desarrollaron programas tales como BLASTN y BLASTX (Altschul et al., J. Mol. Biol. (1990) 215, 403-10). Para analizar secuencias de nucleótidos según el programa BLASTN basado en BLAST, los parámetros se establecen, por ejemplo, para una puntuación = 100 y una longitud de palabra = 12. Por otro lado, los parámetros usados para el análisis de secuencias de aminoácidos mediante BLASTX basado en BLAST incluyen, por ejemplo, puntuación = 50 y longitud de palabra = 3. Los parámetros por defecto de cada programa se usan cuando se usan los programas BLAST y Gapped BLAST. En la materia se conocen técnicas específicas para dichos análisis (se puede consultar información en la página web del National Center for Biotechnology Information (NCBI), Basic Local Alignment Search Tool (BLAST, herramienta básica de búsqueda de alineamiento local)).

En la presente invención, la expresión "polipéptido mutante", se refiere a un polipéptido mutante de FGFR que contiene una sustitución de valina por fenilalanina en el 7° aminoácido a partir del extremo N y/o una sustitución de valina por leucina en el 5° aminoácido a partir del extremo N en la secuencia de aminoácidos parcial descrita en la SEQ ID NO: 53 o 54 en el polipéptido de FGFR, y también puede denominarse como un polipéptido que contiene una mutación de la presente invención.

El polipéptido mutante de la presente invención no está limitado a un polipéptido mutante de FGFR que consiste en una secuencia de aminoácidos en la que se introducen las mutaciones mencionadas anteriormente en la secuencia de aminoácidos del polipéptido FGFR de tipo silvestre que consiste en la secuencia de aminoácidos de longitud completa mencionada anteriormente, siempre que sea un polipéptido mutante de FGFR portador de al menos una de las dos mutaciones descritas anteriormente. Además, el polipéptido mutante incluye fragmentos peptídicos del mismo que contienen las mutaciones, y polipéptidos fusionados formados fusionando dichos polipéptidos mutantes de FGFR, o fragmentos peptídicos, con otros péptidos, y el polipéptido mutante también puede tener una o más (preferentemente de una a diez, y en particular, preferentemente de una a cinco) sustituciones, deleciones, adiciones o inserciones de aminoácidos en posiciones diferentes a las posiciones de las mutaciones mencionadas anteriormente.

Los "otros péptidos" que constituyen los polipéptidos de fusión con los polipéptidos mutantes de FGFR o fragmentos peptídicos de los mismos, incluyen el polipéptido TEL (también denominado ETV6; véase Cancer Research, 2001,61: 8371-8374 y Blood, 2005, 105(5): 2115-2123) (un polipéptido de tipo silvestre que consiste en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 33 o polipéptidos mutantes con uno o más aminoácidos sustituidos, delecionados, añadidos o insertados en el polipéptido de tipo silvestre, o fragmentos peptídicos del mismo), el polipéptido BAIA2P2L1 (un polipéptido de tipo silvestre que consiste en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 31 o polipéptidos mutantes con uno o más aminoácidos sustituidos, delecionados, añadidos o insertados en el polipéptido de tipo silvestre, o fragmentos peptídicos del mismo) y el polipéptido TACC3 (un polipéptido de tipo silvestre que consiste en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 32 o polipéptidos mutantes con uno o más aminoácidos sustituidos, delecionados, añadidos o insertados en el polipéptido de tipo silvestre, o fragmentos peptídicos del mismo). También se conocen diversos polipéptidos de fusión de FGFR distintos (véase, Cancer Discovery 2013; 3: 636-647), y en los polipéptidos mutantes de la presente invención, también se incluyen polipéptidos de fusión de FGFR producidos introduciendo las mutaciones de la presente invención en estos polipéptidos de fusión.

Preferentemente, los polipéptidos mutantes de la presente invención se refieren a los polipéptidos mutantes de FGFR seleccionados de

(1) a (20) mostrados a continuación, fragmentos peptídicos de (1) a (20) que contienen esas mutaciones, o polipéptidos de fusión formados fusionando los polipéptidos mutantes de FGFR de (1) a (20) o fragmentos peptídicos de los mismos, con otros péptidos:

(1) un polipéptido mutante de FGFR2 que contiene al menos las mutaciones V564F y/o V562L en la secuencia de aminoácidos del polipéptido FGFR2 de tipo silvestre mencionado anteriormente (SEQ ID NO: 1);

(2) un polipéptido mutante de FGFR2 que contiene al menos las mutaciones V565F y/o V563L en la secuencia de aminoácidos del polipéptido FGFR2 de tipo silvestre mencionado anteriormente (SEQ ID NO: 2);

(3) un polipéptido mutante de FGFR2 que contiene al menos las mutaciones V565F y/o V563L en la secuencia de aminoácidos del polipéptido FGFR2 de tipo silvestre mencionado anteriormente (SEQ ID NO: 37);

(4) un polipéptido mutante de FGFR2 que contiene al menos las mutaciones V452F y/o V450L en la secuencia de aminoácidos del polipéptido FGFR2 de tipo silvestre mencionado anteriormente (SEQ ID NO: 38);

(5) un polipéptido mutante de FGFR2 que contiene al menos las mutaciones V475F y/o V473L en la secuencia de aminoácidos del polipéptido FGFR2 de tipo silvestre mencionado anteriormente (SEQ ID NO: 39);

(6) un polipéptido mutante de FGFR2 que contiene al menos las mutaciones V449F y/o V447L en la secuencia de aminoácidos del polipéptido FGFR2 de tipo silvestre mencionado anteriormente (SEQ ID NO: 40);

(7) un polipéptido mutante de FGFR2 que contiene al menos las mutaciones V448F y/o V446L en la secuencia de aminoácidos del polipéptido FGFR2 de tipo silvestre mencionado anteriormente (SEQ ID NO: 41);

(8) un polipéptido mutante de FGFR2 que contiene al menos las mutaciones V447F y/o V445L en la secuencia de aminoácidos del polipéptido FGFR2 de tipo silvestre mencionado anteriormente (SEQ ID NO: 42);

(9) un polipéptido mutante de FGFR2 que contiene al menos las mutaciones V476F y/o V474L en la secuencia de aminoácidos del polipéptido FGFR2 de tipo silvestre mencionado anteriormente (SEQ ID NO: 43);

(10) un polipéptido mutante de FGFR2 que contiene al menos las mutaciones V475F y/o V473L en la secuencia de aminoácidos del polipéptido FGFR2 de tipo silvestre mencionado anteriormente (SEQ ID NO: 44);

(11) un polipéptido mutante de FGFR1 que contiene al menos las mutaciones V559F y/o V557L en la secuencia de aminoácidos del polipéptido FGFR1 de tipo silvestre mencionado anteriormente (SEQ ID NO: 21);

(12) un polipéptido mutante de FGFR1 que contiene al menos las mutaciones V559F y/o V557L en la secuencia de aminoácidos del polipéptido FGFR1 de tipo silvestre mencionado anteriormente (SEQ ID NO: 45);

(13) un polipéptido mutante de FGFR1 que contiene al menos las mutaciones V551F y/o V549L en la secuencia de aminoácidos del polipéptido FGFR1 de tipo silvestre mencionado anteriormente (SEQ ID NO: 46);

(14) un polipéptido mutante de FGFR1 que contiene al menos las mutaciones V559F y/o V557L en la secuencia de aminoácidos del polipéptido FGFR1 de tipo silvestre mencionado anteriormente (SEQ ID NO: 47);

(15) un polipéptido mutante de FGFR1 que contiene al menos las mutaciones V472F y/o V470L en la secuencia de aminoácidos del polipéptido FGFR1 de tipo silvestre mencionado anteriormente (SEQ ID NO: 48);

(16) un polipéptido mutante de FGFR1 que contiene al menos las mutaciones V470F y/o V468L en la secuencia de aminoácidos del polipéptido FGFR1 de tipo silvestre mencionado anteriormente (SEQ ID NO: 49);

(17) un polipéptido mutante de FGFR1 que contiene al menos las mutaciones V561F y/o V559L en la secuencia de aminoácidos del polipéptido FGFR1 de tipo silvestre mencionado anteriormente (SEQ ID NO: 50);

(18) un polipéptido mutante de FGFR3 que contiene al menos las mutaciones V555F y/o V553L en la secuencia de aminoácidos del polipéptido FGFR3 de tipo silvestre mencionado anteriormente (SEQ ID NO: 22);

(19) un polipéptido mutante de FGFR3 que contiene al menos las mutaciones V557F y/o V555L en la secuencia de aminoácidos del polipéptido FGFR3 de tipo silvestre mencionado anteriormente (SEQ ID NO: 51); o

(20) un polipéptido mutante de FGFR3 que contiene al menos las mutaciones V443F y/o V441L en la secuencia de aminoácidos del polipéptido FGFR3 de tipo silvestre mencionado anteriormente (SEQ ID NO: 52).

En particular, preferentemente, los polipéptidos mutantes de FGFR de la presente invención son, por ejemplo, un polipéptido mutante de FGFR2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 9, 10, 29 o 30; un polipéptido mutante de FGFR1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 25 o 26; y un polipéptido mutante de FGFR3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 27 o 28; así como un polipéptido mutante de FGFR2 fusionado con TEL que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 35 o 36.

Preferentemente, los polipéptidos mutantes de FGFR de la presente invención conservan las actividades biológicas (por ejemplo, actividad de fosforilación de tirosina en el dominio intracelular de FGFR, actividad de proliferación celular, actividad angiogénica, actividad de migración celular, actividad de infiltración celular y actividad de transferencia celular, preferentemente actividad de proliferación celular) que son iguales en grado o más fuertes que las del polipéptido FGFR de tipo silvestre. Mediante métodos de ensayo conocidos por los expertos en la materia (por ejemplo, mediante los métodos descritos en los siguientes ejemplos), puede determinarse si el polipéptido mutante de FGFR de la presente invención tiene dichas actividades biológicas.

Los polinucleótidos de la presente invención incluyen polinucleótidos que codifican un polipéptido mutante de FGFR de la presente invención descrito anteriormente, que incluyen cualquier polinucleótido que pueda codificar un polipéptido mutante de FGFR de la presente invención. Los polinucleótidos incluyen ADN genómicos y ADNc. Los ADN genómicos incluyen exones e intrones. Asimismo, los ADNc pueden incluir secuencias de ácidos nucleicos procedentes de una parte de una secuencia de intrones que codifica la secuencia de aminoácidos.

Los polinucleótidos también incluyen polinucleótidos degenerados constituidos con cualquier codón siempre que el codón codifique los mismos aminoácidos.

Los polinucleótidos de la presente invención también incluyen polinucleótidos que codifican polipéptidos mutantes procedentes de mamíferos. En una realización preferida, los polinucleótidos de la presente invención incluyen polinucleótidos que codifican polipéptidos mutantes procedentes de seres humanos.

Los polinucleótidos de la presente invención se pueden obtener mediante cualquier método. Los polinucleótidos de la presente invención incluyen, por ejemplo, todos los ADN complementarios (ADNc) preparados a partir de ARNm, ADN preparados a partir de ADN genómico, ADN obtenidos por síntesis química, ADN obtenidos mediante amplificación por PCR usando, como molde, ARN o ADN y ADN construidos combinando adecuadamente estos métodos.

Los polinucleótidos que codifican los polipéptidos mutantes de la presente invención se pueden obtener utilizando métodos habituales clonando ADNc a partir de ARNm que codifica un polipéptido mutante de la presente invención o aislando ADN genómico y sometiéndolo a un tratamiento de corte y empalme, o mediante síntesis química.

Por ejemplo, en un método que clona ADNc a partir de ARNm que codifica un polipéptido mutante de la presente invención, primero, según métodos habituales, se prepara ARNm que codifica un polipéptido mutante de la presente invención a partir de células o tejidos arbitrarios que expresan y producen el polipéptido mutante de la presente invención. Esto se puede realizar, por ejemplo, preparando ARN total utilizando un método tal como el método de guanidina-tiocianato, método de fenol caliente, o método AGPC, y tratando el ARN total con cromatografía de afinidad utilizando oligo(dT) celulosa, poli U-Sepharose, o similar.

Después, la síntesis de la cadena de ADNc se lleva a cabo utilizando el ARNm preparado como molde mediante un método conocido que utiliza, por ejemplo, transcriptasa inversa (Mol. Cell. Biol., Vol.2, pág. 161, 1982; Mol. Cell. Biol., Vol.3, pág. 280, 1983; Gene, Vol.25, pág. 263, 1983]. El ADNc se convierte en ADNc bicatenario y se inserta en un vector de plásmidos, vector de fagos, vector de cósmidos, o similar. Para preparar una biblioteca de ADNc, el vector resultante se transforma en E. coli, o se transfecta en E. coli, después del empaquetado in vitro.

La presente invención también se refiere a vectores (vectores recombinantes) portadores del polinucleótido descrito anteriormente que codifica un polipéptido mutante de la presente invención.

Los vectores de la presente invención no están particularmente limitados siempre que puedan replicarse y conservarse o autopropagarse como hospedador en diversas células procariotas y/o eucariotas. Los vectores de la presente invención incluyen vectores de plásmidos y vectores de fagos.

Los vectores de clonación incluyen, por ejemplo, pUC19, Agt10 y Agt11. Cuando se aíslan células hospedadoras capaces de expresar un polipéptido mutante de la presente invención, el vector es, preferentemente, uno que tiene un promotor que permite la expresión del polinucleótido de la presente invención.

Los vectores recombinantes de la presente invención pueden prepararse usando métodos habituales, simplemente ligando un polinucleótido que codifica un polipéptido mutante de la presente invención con un vector recombinante disponible en la técnica (a Dn plasmídico y ADN bacteriófago).

Los vectores recombinantes para su uso en la presente invención incluyen, por ejemplo, plásmidos procedentes de E. coli (pBR322, pBR325, pUC12, pUC13, pUC19, etc.), plásmidos procedentes de levaduras (pSH19, pSH15, etc.) y plásmidos procedentes de Bacillus subtilis (pUBl 10, pTP5, pC194, etc.).

Son ejemplos de fagos, bacteriófagos tales como el fago A, y virus de animales o insectos (pVL1393, Invitrogen) tales como retrovirus, virus de la variolovacuna, virus de la poliedrosis nuclear y lentivirus.

Los vectores de expresión son útiles para el propósito de producir un polipéptido mutante de la presente invención, expresando un polinucleótido que codifica el polipéptido mutante de la presente invención. Como hospedadores, los vectores de expresión no están particularmente limitados siempre que tengan la función de producir los polipéptidos mutantes de la presente invención expresando los polinucleótidos que codifican los polipéptidos en diversas células procariotas y/o eucariotas.

Dichos vectores de expresión incluyen, por ejemplo, pMAL C2, pEF-BOS (Nucleic Acid Research, Vol.18, 1990, pág.

5322) y pME18S (Jikken Igaku Bessatsu (Experimental Medicine: SUPPLEMENT), "Idenshi Kougaku Handbook (Handbook of Genetic Engineering)" (1992)).

Como alternativa, los polipéptidos mutantes de la presente invención pueden producirse como proteínas de fusión con otras proteínas. Por ejemplo, cuando se prepara como una proteína de fusión con glutatión S-transferasa (GST), el ADNc que codifica un polipéptido mutante de la presente invención, se puede subclonar, por ejemplo, en el plásmido pGEX4T1 (Pharmacia). Células DH5a de E. coli se transforman con el plásmido resultante, y los transformantes se cultivan para preparar la proteína de fusión.

Como alternativa, los polipéptidos de fusión de la presente invención pueden producirse como fusiones con la hemaglutinina (HA) del virus de la gripe, la región constante de inmunoglobulina, la p-galactosidasa, la proteína de unión a maltosa (MBP, maltose-binding protein) o similares. Asimismo, los polipéptidos de fusión de la presente invención pueden producirse como fusiones con péptidos conocidos, por ejemplo, FLAG (Hopp, T. P. et al., BioTechnology (1988) 6, 1204-1210), 6x His que consiste en 6 restos de histidina (His), 10x His, hemaglutinina (HA) del virus de la gripe, fragmentos de c-myc humano, fragmentos de VSV-GP, fragmentos de p18HIV, etiqueta de T7, etiqueta de VHS (virus del herpes simple), etiqueta de E, fragmentos de antígeno T de SV40 (virus del simio 40), etiqueta de lck, fragmentos de a-tubulina, etiqueta de B, fragmentos de proteína C, etiqueta de S, etiqueta de Estrep y etiqueta de halo.

Cuando como célula hospedadora se usan bacterias, en particular E. coli, los vectores de la presente invención contienen preferentemente al menos una región promotora-operadora, un codón de inicio, un polinucleótido que codifica un polipéptido mutante de la presente invención, un codón finalizador, una región terminadora y un replicón.

Cuando como células hospedadoras se utilizan células de levadura, de animales o de insecto, los vectores de expresión contienen preferentemente un promotor, un codón de inicio, un polinucleótido que codifica un polipéptido mutante de la presente invención, y un codón finalizador.

Los vectores también pueden contener ADN que codifica un péptido señal, una secuencia potenciadora, regiones 5' y 3' no traducidas del gen que codifica una proteína de la presente invención, zonas de unión de corte y empalme, sitios de poliadenilación, una región de marcador de selección, un replicón, y similares.

Asimismo, si fuese necesario, los vectores pueden contener genes marcadores (genes para amplificación génica, genes de resistencia a fármacos, etc.) que permiten la selección de hospedadores transformados u hospedadores con amplificación génica.

Los genes marcadores incluyen, por ejemplo, el gen de dihidrofolato reductasa (DHFR), gen de timidina cinasa (TK), gen de resistencia a neomicina, gen de glutamato sintasa, gen de adenosina desaminasa, gen de ornitina descarboxilasa, gen de higromicina-B-fosfotransferasa y gen de aspartato transcarbamilasa.

Una región promotora-operadora para expresar el polipéptido mutante de la presente invención en bacterias comprende un promotor, un operador y una secuencia Shine-Dalgarno (SD) (por ejemplo, AAGG).

Por ejemplo, cuando el hospedador es del género Escherichia, este comprende, por ejemplo, el promotor de Trp, promotor de lac, promotor de recA, promotor de APL, promotor de lpp, promotor de tac, o promotores similares.

Son ejemplos de un promotor para expresar el polipéptido mutante de la presente invención en levaduras, el promotor de PH05, promotor de PGK, promotor de GAP, promotor de ADH y promotores similares.

Cuando el hospedador es del género Bacillus, los ejemplos son, el promotor de SL01, promotor de SP02, promotor de penP y promotores similares.

Cuando el hospedador es una célula eucariota, tal como una célula de mamífero, los ejemplos son un promotor procedente de SV40, un promotor de retrovirus, un promotor de choque térmico y similares; y se prefiere el promotor de SV40 y de retrovirus. No obstante, el promotor no está limitado a los ejemplos anteriores. Además, el uso de un potenciador es eficaz para la expresión.

Un codón de inicio preferible es, por ejemplo, un codón de metionina (ATG). Un codón de terminación habitualmente utilizado (por ejemplo, TAG, TAA, t Ga ) se ilustra como un codón de terminación. Los terminadores naturales o sintéticos habitualmente se utilizan como una región terminadora.

Un replicón se refiere a un ADN capaz de replicar toda la secuencia de ADN en células hospedadoras, e incluye un plásmido natural, un plásmido modificado artificialmente (fragmento de ADN preparado a partir de un plásmido natural), un plásmido sintético, y plásmidos similares. Son ejemplos de plásmidos preferibles para E. coli el plásmido pBR322 o sus derivados artificiales (fragmento de ADN obtenido tratando el plásmido pBR322 con enzimas de restricción apropiadas), prefiriéndose para levaduras el plásmido 2 p de levadura o ADN cromosómico de levadura y pRSVneo ATCC 37198, y prefiriéndose para células de mamífero el plásmido pSV2dhfr ATCC 37145, el plásmido pdBPV-MMTneo ATCC 37224, el plásmido pSV2neo ATCC 37149, y plásmidos similares.

También puede utilizarse una secuencia potenciadora, un sitio de poliadenilación y una zona de unión de corte y empalme, generalmente utilizados en la técnica, tales como los procedentes de SV40.

El vector de expresión de la presente invención puede prepararse ligando, de manera continuada y circular, al menos el promotor, el codón de inicio, el polinucleótido que codifica el polipéptido mutante de la presente invención, el codón de terminación y la región terminadora, mencionados anteriormente, con un replicón apropiado. Si se desea, pueden utilizarse fragmentos de ADN apropiados (por ejemplo, enlazadores, sitios de restricción, y similares) mediante un método habitual, tal como digestión con enzimas de restricción o ligamiento utilizando ADN ligasa de T4.

La presente invención también se refiere a células recombinantes transformadas con los vectores de la presente invención mencionados anteriormente, y las células recombinantes de la presente invención pueden prepararse introduciendo el vector de expresión mencionado anteriormente en células hospedadoras.

Las células hospedadoras utilizadas en la presente invención no están particularmente limitadas siempre que sean compatibles con un vector de expresión mencionado anteriormente y puedan transformarse. Como ejemplos de los mismos se incluyen diversas células, tales como células de tipo silvestre o células recombinantes establecidas artificialmente, que se utilizan habitualmente en el campo técnico de la presente invención (por ejemplo, bacterias (de los géneros Escherichia y Bacillus), levaduras (del género Saccharomyces, del género Pichia, y similares), células de animales o células de insectos).

Se prefieren células de animales o de E. coli. Son ejemplos específicos células de E. coli (DH5a, TB1, HB101, y similares), células procedentes de ratón (COP, L, Cl27, Sp2/0, NS-1, NIH3T3, y similares), células procedentes de rata (PC12, PC12h), células procedentes de hámster (BHK, CHO, y similares), células procedentes de mono (COSI, COS3, COS7, CV1, Velo, y similares), y células procedentes de seres humanos (Hela, células procedentes de fibroblastos diploides, células de mieloma, HepG2, y similares).

Se puede introducir un vector de expresión (transformado (transfectado)) en células hospedadoras según métodos habituales. [cuando el hospedador es E. coli, Bacillus subtilis, o similares]: Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Vol.69, pág.

2110 (1972); Mol. Gen. Genet., Vol.168, pág. 111 (1979); J. Mol. Biol., Vol.56, pág. 209 (1971);

[cuando el hospedador es Saccharomyces cerevisiae]: Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Vol.75, pág.1927 (1978); J. Bacteriol., Vol.153, pág. 163 (1983);

[cuando el hospedador es una célula animal]: Virology, Vol.52, pág.456 (1973);

[cuando el hospedador es una célula de insecto]: Mol. Cell. Biol., Vol.3, págs. 2156-2165 (1983).

Los polipéptidos mutantes de la presente invención pueden producirse cultivando células recombinantes transformadas (en adelante, el término también se refiere a cuerpos de inclusión) que comprenden un vector de expresión preparado en medios nutritivos según métodos habituales, como se describió anteriormente.

Los polipéptidos mutantes de la presente invención pueden producirse cultivando las células recombinantes descritas anteriormente, en particular, células animales, y dejando que secreten en sobrenadantes de cultivo.

El cultivo resultante se filtra o se centrifuga para obtener un filtrado de cultivo (sobrenadante). Los polipéptidos mutantes de la presente invención se purifican y aíslan del filtrado de cultivo mediante métodos habituales comúnmente utilizados para purificar y aislar proteínas naturales o sintéticas. Son ejemplos de un método de aislamiento y purificación los métodos que utilizan la solubilidad, tales como los métodos de desestabilización salina y precipitación con disolvente; métodos, tales como diálisis, que utilizan diferencias de peso molecular, ultrafiltración, filtración en gel y electroforesis en gel de poliacrilamida con dodecilsulfato sódico; métodos, tales como cromatografía de intercambio iónico y cromatografía de hidroxilapatita, que utilizan carga; métodos, tales como cromatografía en columna de afinidad, que utilizan afinidad específica; métodos, tales como cromatografía líquida de alto rendimiento en fase inversa, que utilizan diferencias de hidrofobicidad; y métodos, tales como isoelectroenfoque, que utilizan diferencias de punto isoeléctrico.

Mientras tanto, cuando un polipéptido mutante de la presente invención está en el periplasma o citoplasma de células recombinantes cultivadas (tales como E. coli), las células se recogen mediante métodos habituales, tales como filtración y centrifugación del cultivo, y después se suspenden en un tampón apropiado. Después de alterar la pared celular y/o la membrana celular de las células usando métodos tales como tratamiento con ultrasonidos, lisozimas y criolisis, se obtiene una fracción de membrana que contiene la proteína de la presente invención usando métodos tales como centrifugación y filtración. La fracción de membrana se disuelve con un detergente, tal como Triton-XlOO, para obtener la solución en bruto. Después, la proteína de la presente invención puede aislarse y purificarse de la solución en bruto usando métodos habituales, tales como los ilustrados anteriormente.

La presente divulgación también se refiere a oligonucleótidos arbitrarios que se hibridan con polinucleótidos (ADNc y ADN genómicos) que codifican los polipéptidos mutantes de la presente invención descritos anteriormente.

Los oligonucleótidos de la presente divulgación tienen secuencias de nucleótidos que son complementarias a secuencias de nucleótidos parciales arbitrarias de los ADNc y ADN genómicos, y que son útiles en la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) como un par de cebadores oligonucleotídicos que consisten en cebadores de sentido y antisentido. La secuencia de nucleótidos completa de un polinucleótido que codifica un polipéptido mutante de la presente invención o una parte arbitraria de la secuencia de nucleótidos, puede amplificarse por PCR usando el par de cebadores oligonucleotídicos.

Los cebadores oligonucleotídicos de la presente divulgación incluyen oligonucleótidos de cualquier longitud que son complementarios a la secuencia de nucleótidos de un polinucleótido de la presente invención. Los cebadores oligonucleotídicos de la presente divulgación incluyen, preferentemente, aquellos que tienen una secuencia de al menos 12 nucleótidos consecutivos, preferentemente de 12 a 50 nucleótidos y, aún más preferentemente, de 12 a 20 nucleótidos.

Los oligonucleótidos de la presente divulgación también son útiles como una sonda cuando se utiliza la hibridación de ADN o ARN. Cuando se utilizan como una sonda, los ADN incluyen una secuencia de nucleótidos parcial de 15 o más nucleótidos consecutivos, preferentemente una secuencia de nucleótidos parcial de 50 o más nucleótidos consecutivos, más preferentemente una secuencia de nucleótidos parcial de 100 o más nucleótidos consecutivos, incluso más preferentemente una secuencia de nucleótidos parcial de 200 o más nucleótidos consecutivos, y aún más preferentemente una secuencia de nucleótidos parcial de 300 o más nucleótidos consecutivos, que se hibrida con un polinucleótido de la presente invención.

La presente divulgación también se refiere a oligonucleótidos que se unen a polinucleótidos de ARNm que codifican polipéptidos mutantes de la presente invención y que tienen una actividad de inhibición de la traducción de los ARNm en proteínas. Es particularmente preferible que los oligonucleótidos incluyan los ARNip que escindan los ARNm uniéndose a los polinucleótidos de ARNm que codifican los polipéptidos mutantes de la presente invención.

Los oligonucleótidos se refieren a aquellos que se unen a los ARNm que codifican polipéptidos mutantes de la presente invención y, por lo tanto, inhiben su expresión e incluyen, por ejemplo, oligonucleótidos antisentido, ribozimas y ARN de interferencia pequeños (ARNip). Estos unen a los ARNm y después inhiben su traducción en proteínas.

Un oligonucleótido antisentido se refiere a un oligonucleótido que se hibrida específicamente con ADN genómico y/o ARNm, e inhibe su expresión de proteínas al inhibir la transcripción y/o traducción.

La unión a un polinucleótido diana (ARNm, etc.) puede ser el resultado de una complementariedad habitual de pares de bases. Como alternativa, cuando un oligonucleótido antisentido se une, por ejemplo, a un ADN bicatenario, la unión puede ser el resultado de una interacción específica en los surcos principales en la doble hélice. Los sitios diana para un oligonucleótido antisentido incluyen el extremo 5' de un ARNm, por ejemplo, secuencias no traducidas 5' hasta el codón de inicio AUG o inclusive, y secuencias no traducidas 3' de un ARNm, así como secuencias de regiones codificantes.

Cuando se usan como un oligonucleótido antisentido de la presente divulgación, los oligonucleótidos antisentido incluyen secuencias de nucleótidos parciales de 5 a 100 nucleótidos consecutivos, preferentemente secuencias de nucleótidos parciales de 5 a 70 nucleótidos consecutivos, más preferentemente secuencias de nucleótidos parciales de 5 a 50 nucleótidos consecutivos, y aún más preferentemente secuencias de nucleótidos parciales de 5 a 30 nucleótidos consecutivos.

Asimismo, los oligonucleótidos antisentido de la presente divulgación pueden modificarse parcialmente mediante modificación química para prolongar su semivida en sangre (para estabilizarlos) o aumentar la permeabilidad de su membrana intracelular cuando se administran a pacientes, o para mejorar su resistencia a la degradación o absorción en los órganos digestivos. en administración oral. Dicha modificación química incluye, por ejemplo, modificación química de un enlace de fosfato, ribosa, nucleobase, fracción de azúcar en oligonucleótidos, y de extremos 3' y/o 5' de oligonucleótidos.

La modificación de enlaces fosfato incluye, por ejemplo, la conversión de uno o más de los enlaces a enlaces fosfodiéster (D-oligo), enlaces fosforotioato, enlaces fosforoditioato (S-oligo), metilfosfonato (MP-oligo), enlaces fosforoamidato, enlaces no fosfato y enlaces metilfosforotioato, y combinaciones de los mismos. La modificación de ribosa incluye, por ejemplo, la conversión a 2'-fluororibosa o 2'-O-metilribosa. La modificación de la base de nucleótidos incluye, por ejemplo, la conversión a 5-propiniluracilo o 2-aminoadenina.

La ribozima se refiere a oligonucleótidos que tienen una actividad catalítica de escisión de ARNm. En general, las ribozimas tienen actividad endonucleasa, ligasa o polimerasa. Las ribozimas incluyen diversos tipos de ribozimas que actúan en trans, por ejemplo, ribozimas de cabeza de martillo y ribozimas de horquilla.

ARNip se refiere a oligonucleótidos bicatenarios capaces de realizar interferencia de ARN (por ejemplo, Bass, 2001, Nature, 411.428-429; Elbashir et al., 2001, Nature, 411.494-498).

El ARNip escinde el ARNm de una manera específica de secuencia y, como resultado, inhibe la traducción del ARNm en la proteína. El ARNip incluye ARN bicatenarios con una longitud de 20 a 25 pares de bases y comprende una secuencia complementaria a la secuencia de polinucleótidos diana. Los ARNip de la presente divulgación también incluyen oligonucleótidos que comprenden nucleótidos y no nucleótidos modificados químicamente.

La presente divulgación también se refiere a anticuerpos que se unen al polipéptido mutante de la presente invención descrito anteriormente, y a fragmentos de unión a antígeno de los mismos.

Los anticuerpos de la presente divulgación no están limitados por su origen, forma, función, etc. Los anticuerpos de la presente divulgación pueden ser cualquier anticuerpo, anticuerpos monoclonales o policlonales. Sin embargo, los anticuerpos preferidos de la presente divulgación son anticuerpos monoclonales. Los anticuerpos de la presente divulgación pueden ser anticuerpos procedentes de cualquier animal, tales como anticuerpos humanos, anticuerpos de ratón y anticuerpos de rata. Los anticuerpos de la presente divulgación también pueden ser anticuerpos recombinantes tales como anticuerpos quiméricos y anticuerpos humanizados. Los anticuerpos preferidos de la presente divulgación incluyen anticuerpos quiméricos, anticuerpos humanos y anticuerpos humanizados.

Los anticuerpos humanizados de la presente divulgación se pueden preparar mediante métodos conocidos por los expertos en la materia. Por lo general, la región variable de un anticuerpo está compuesta por tres regiones determinantes de complementariedad (CDR, complementarity-determining regions) intercaladas por cuatro regiones marco (FR, framework regions). Las CDR determinan prácticamente la especificidad de unión de un anticuerpo. Las secuencias de aminoácidos de las CDR son muy diversas. Por otro lado, a menudo, las secuencias de aminoácidos que constituyen las FR muestran alta homología entre los anticuerpos que tienen diferentes especificidades de unión. Por lo tanto, se dice que, en general, la especificidad de unión de un anticuerpo se puede trasplantar en un anticuerpo diferente injertando las CDR.

Los anticuerpos humanizados también se conocen como anticuerpos humanos remodelados, y se preparan transfiriendo las CDR de un anticuerpo procedente de un mamífero no humano, tal como un ratón, a las regiones determinantes de complementariedad de un anticuerpo humano. También se conocen técnicas generales de recombinación genética para su preparación (véase la publicación de solicitud de patente europea n° 125023 y el documento WO 96/02576).

Específicamente, por ejemplo, cuando las CDR proceden de un anticuerpo de ratón, se diseña una secuencia de ADN de tal manera que las Cd R del anticuerpo de ratón están ligadas con las regiones marco (FR, framework regions) de un anticuerpo humano, y se sintetiza por PCR usando, como cebadores, diversos oligonucleótidos que tienen partes que se superponen a los extremos de las CDR y de las FR (véase el método descrito en el documento WO 98/13388). Después, el ADN resultante se liga a un ADN que codifica una región constante de anticuerpo humano, se inserta en un vector de expresión y se introduce en un hospedador para producir el anticuerpo (véase la publicación de solicitud de patente europea n° Ep 239400 y la publicación de solicitud de patente internacional n° WO 96/02576).

Las regiones marco del anticuerpo humano que se van a ligar con las CDR, se seleccionan de modo que las regiones determinantes de complementariedad formen un sitio de unión a antígeno favorable. Si fuera necesario, en una región variable del anticuerpo, los aminoácidos de la región marco pueden sustituirse, delecionarse, añadirse y/o insertarse de modo que las regiones determinantes de complementariedad del anticuerpo humano remodelado, formen un sitio de unión a antígeno apropiado. Por ejemplo, pueden introducirse mutaciones en la secuencia de aminoácidos de la FR aplicando el método de PCR utilizado para injertar las CDR de ratón en las FR humanas. Específicamente, pueden introducirse mutaciones en una parte de las secuencias de nucleótidos de los cebadores que se emparejan con las FR. Las mutaciones se introducen en las FR sintetizadas utilizando dichos cebadores. Las secuencias mutantes de la región marco, FR, que tienen propiedades deseadas, pueden seleccionarse evaluando y determinando la actividad de unión a antígeno de los anticuerpos mutantes con aminoácidos sustituidos mediante el método descrito anteriormente (Sato, K. et al., Cancer Res. (1993) 53, 851-856).

En general, las regiones constantes de los anticuerpos humanos se usan para las de los anticuerpos humanizados.

No hay limitaciones particulares para las regiones constantes de los anticuerpos humanos que se usarán en la presente divulgación; y, por ejemplo, cuando se usa una región constante de cadena pesada, esta puede ser una región constante de IgG1 humana, una región constante de IgG2 humana, una región constante de IgG3 humana, una región constante de IgG4 humana, o una región constante de IgM, IgA, IgE o IgD humana. Como alternativa, cuando se usa una región constante de cadena ligera, esta puede ser una región constante de cadena k humana o una región constante de cadena A humana. Asimismo, las regiones constantes procedentes de un anticuerpo humano pueden tener una secuencia natural o pueden ser una región constante que tiene una secuencia con modificación (sustitución, deleción, adición y/o inserción) de uno o más aminoácidos en la secuencia natural.

Por otra parte, después de preparar un anticuerpo humanizado, los aminoácidos de la región variable (por ejemplo, CDR y Fr ) y de la región constante del anticuerpo humanizado pueden delecionarse, añadirse, insertarse y/o sustituirse por otros aminoácidos. Los anticuerpos humanizados de la presente divulgación también incluyen dichos anticuerpos humanizados con sustituciones de aminoácidos y similares.

El origen de las CDR de un anticuerpo humanizado no está particularmente limitado, y puede ser de cualquier animal. Por ejemplo, es posible usar secuencias de anticuerpos de ratón, anticuerpos de rata, anticuerpos de conejo, anticuerpos de camello, y similares. Se prefieren las secuencias CDR de anticuerpos de ratón.

Cuando se administran a seres humanos con fines terapéuticos, los anticuerpos humanizados son útiles porque su inmunogenicidad se reduce en el cuerpo humano.

Los anticuerpos quiméricos comprenden, por ejemplo, regiones constantes de cadena pesada y ligera de un anticuerpo humano, y regiones variables de cadena pesada y ligera de un anticuerpo de un mamífero no humano, tal como un ratón. Los anticuerpos quiméricos se pueden preparar usando métodos conocidos. Por ejemplo, los anticuerpos se pueden producir clonando un gen de anticuerpo a partir de hibridomas, insertándolo en un vector apropiado e introduciendo la construcción en hospedadores (véase, por ejemplo, Carl, A. K. Borrebaeck, James, W. Larrick, THERAPEUTIC MONOCLONAL ANTIBODIES, publicado en el Reino Unido por MACMILLAN PUBLISHERS LTD, 1990). Específicamente, los ADNc de las regiones variables (regiones V) de un anticuerpo se sintetizan a partir de los ARNm de hibridoma usando transcriptasa inversa. Una vez que se obtienen los ADN que codifican las regiones V de un anticuerpo de interés, se ligan con los ADN que codifican las regiones constantes (regiones C) de un anticuerpo ^{humano deseado. Las construcciones resultantes se insertan en vectores de expresión. Como alternativa, los}aDn que codifican las regiones V de un anticuerpo pueden insertarse en un vector de expresión que comprende los ADN que codifican las regiones C de un anticuerpo humano. Los ADN se insertan en un vector de expresión para que se expresen bajo la regulación de regiones reguladoras de expresión, por ejemplo, potenciadores y promotores. En la etapa siguiente, las células hospedadoras pueden transformarse con el vector de expresión para permitir la expresión de anticuerpos quiméricos.

Los anticuerpos humanos pueden obtenerse usando métodos conocidos por los expertos en la materia. Por ejemplo, los anticuerpos humanos deseados con actividad de unión a antígeno, pueden obtenerse in vitro sensibilizando linfocitos humanos con un antígeno de interés o con células que expresan un antígeno de interés; y fusionando los linfocitos sensibilizados con células de mieloma humano, tales como U266 (véase la publicación de solicitud de patente japonesa de Kokoku No. (JP-B) H01-59878 (solicitud de patente japonesa aprobada y examinada para oposición)). Como alternativa, el anticuerpo humano deseado también se puede obtener inmunizando un animal transgénico que tiene un repertorio completo de genes de anticuerpos humanos con un antígeno deseado (véanse las publicaciones de solicitud de patente internacional Nos. WO 93/12227, WO 92/03918, WO 94/02602, WO 94/25585, WO 96/34096 y WO 96/33735).

Como alternativa, las células B que expresan anticuerpos, que tienen actividad de unión a antígeno, se aíslan de un grupo de linfocitos humanos mediante citometría de flujo, matriz celular, o técnicas similares. Los genes de anticuerpos de las células B seleccionadas se pueden analizar y las secuencias de ADN de los anticuerpos humanos que se unen al antígeno se pueden determinar (Jin, A. et al., Nature Medicine (2009) 15, 1088-92; Scheid, J.F. et al., Nature (2009) 458, 636-640; Wrammert, J. et al., Nature (2008) 453, 667-672; Tiller, T. et al., Journal of Immunological Methods (2008) 329, 112-124). Cuando las secuencias de ADN de los anticuerpos de unión a antígeno se revelan, pueden prepararse anticuerpos humanos construyendo vectores de expresión apropiados portadores de las secuencias. Dichos métodos se conocen y como referencias pueden usarse los documentos WO 92/01047, WO 92/20791, WO 93/06213, WO 93/11236, WO 93/19172, WO 95/01438 y WO 95/15388.

Asimismo, se conocen técnicas para obtener anticuerpos humanos mediante selección (panning) con una fagoteca de anticuerpos humanos. Por ejemplo, uasndo un método de presentación en fagos, la región variable de un anticuerpo humano se expresa como un anticuerpo monocatenario (scFv, del inglés single chain Fv) en la superficie del fago y se pueden seleccionar fagos que se unan al antígeno. Analizando los genes de los fagos seleccionados, pueden determinarse las secuencias de ADN que codifican las regiones variables de los anticuerpos humanos que se unen al antígeno. Si se identifican las secuencias de ADN de los scFv que se unen al antígeno, pueden construirse vectores de expresión apropiados que comprenden estas secuencias para obtener anticuerpos humanos. Dichos métodos son ^{muy conocidos. Se puede hacer referencia a los documentos WO 92/01047,}Wo ^{92/20791, WO 93/06213, WO}93/11236, WO 93/19172, WO 95/01438, WO 95/15388, y similares.

Los anticuerpos de la presente divulgación no solo incluyen anticuerpos divalentes como los representados por IgG, sino también anticuerpos monovalentes, anticuerpos multivalentes como los representados por IgM. Además, los anticuerpos de la presente divulgación también incluyen anticuerpos biespecíficos capaces de unirse a diferentes antígenos.

Los anticuerpos de la presente divulgación no solo incluyen moléculas de anticuerpo completas, sino también cualquier fragmento de unión a antígeno, tal como anticuerpos de bajo peso molecular.

Los anticuerpos de la presente divulgación también incluyen anticuerpos modificados que están unidos a sustancias citotóxicas. Los anticuerpos de la presente divulgación también incluyen anticuerpos con cadenas glucídicas alteradas.

Los anticuerpos de bajo peso molecular (minicuerpos) incluidos en los fragmentos de unión a antígeno de la presente divulgación son anticuerpos que comprenden un fragmento de anticuerpo que carece de parte de un anticuerpo completo (por ejemplo, IgG completa, etc.). Los minicuerpos no están particularmente limitados, siempre que tengan la actividad de unirse a un polipéptido mutante de la presente invención.

Los minicuerpos de la presente divulgación no están particularmente limitados, siempre que comprendan una parte de un anticuerpo completo. Sin embargo, es preferible que los minicuerpos comprendan un dominio de unión a antígeno. En general, el dominio de unión a antígeno es la CDR del anticuerpo, siendo preferentemente las seis CDR de un anticuerpo. Por tanto, los dominios de unión a antígeno preferidos incluyen, por ejemplo, las seis CDR de un anticuerpo y las regiones variables del anticuerpo (regiones variables de cadena pesada y/o cadena ligera).

Preferentemente, los minicuerpos de la presente divulgación tienen un peso molecular más pequeño que el de los anticuerpos completos. Sin embargo, los minicuerpos pueden formar multímeros, por ejemplo, dímeros, trímeros o tetrámeros y, por lo tanto, sus pesos moleculares pueden ser mayores que los de los anticuerpos completos.

Otros ejemplos específicos de los fragmentos de moléculas de unión a antígeno incluyen, por ejemplo, Fab, Fab', F(ab')2 y Fv. Mientras tanto, los ejemplos específicos de anticuerpos de bajo peso molecular incluyen, por ejemplo, Fab, Fab', F(ab')2, Fv, scFv (Fv monocatenario), diacuerpos y sc(Fv)2 ((Fv)2 monocatenario). Los multímeros (por ejemplo, dímeros, trímeros, tetrámeros y polímeros) de estos anticuerpos también se incluyen en los anticuerpos de bajo peso molecular de la presente divulgación.

Se pueden obtener fragmentos de unión a antígeno, por ejemplo, tratando los anticuerpos con enzimas para producir fragmentos de anticuerpos. Las enzimas que se sabe que generan fragmentos de anticuerpos incluyen, por ejemplo, papaína, pepsina y plasmina. Como alternativa, se puede construir un gen que codifique dicho fragmento de anticuerpo, introducirse en un vector de expresión y expresarse en células hospedadoras apropiadas (véase, por ejemplo, Co, M.S. et al., J. Immunol. (1994) 152, 2968-2976; Better, M. y Horwitz, A. H. Methods in Enzymology (1989) 178, 476-496; Plueckthun, A. y Skerra, A. Methods in Enzymology (1989) 178, 476-496; Lamoyi, E., Methods in Enzymology (1989) 121,652-663; Rousseaux, J. et al., Methods in Enzymology(1989) 121,663-669; Bird, R. E. et al., TIBTECH (1991) 9, 132-137).

Las enzimas digestivas escinden en un sitio específico en un fragmento de anticuerpo, produciendo fragmentos de anticuerpos de estructuras específicas mostrados más adelante. Para delecionar una parte arbitraria del anticuerpo, se pueden aplicar técnicas de ingeniería genética a dichos fragmentos de anticuerpo obtenidos enzimáticamente.

Los fragmentos de anticuerpos obtenidos usando las enzimas digestivas descritas anteriormente son los siguientes:

Digestión con papaína: F(ab)2 o Fab

Digestión con pepsina: F(ab')2 o Fab'

Digestión con plasmina: Facb

Los minicuerpos de la presente divulgación incluyen fragmentos de anticuerpo que carecen de una región arbitraria, siempre que tengan la actividad de unirse a un polipéptido mutante de la presente invención.

"Diacuerpo" se refiere a un fragmento de anticuerpo bivalente construido por fusión génica (Holliger P et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 6444-6448 (1993); EP 404 097; WO 93/11161, etc.). Los diacuerpos son dímeros compuestos por dos cadenas polipeptídicas. En cada una de las cadenas polipeptídicas que forman un dímero, generalmente una VL y una VH están unidas en la misma cadena mediante un enlazador. En general, en un diacuerpo, el enlazador es lo suficientemente corto como para que la VL y la VH no puedan unirse entre sí. Específicamente, el número de restos de aminoácidos que constituyen el enlazador es, por ejemplo, de aproximadamente cinco restos. Por tanto, las VL y VH codificadas en el mismo polipéptido, no pueden formar un fragmento monocatenario de región variable y formarán un dímero con otro fragmento monocatenario de región variable. Como resultado, el diacuerpo tiene dos sitios de unión a antígeno.

Los anticuerpos scFv son polipéptidos monocatenarios producidos ligando una región variable de cadena pesada ([VH]) con una región variable de cadena ligera ([VL]) mediante un enlazador o similar (Huston, J. S. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. (1988) 85, 5879-5883; Plickthun "The Pharmacology of Monoclonal Antibodies" Vol. 113, eds., Resenburg y Moore, Springer Verlag, Nueva York, págs. 269-315, (1994)). La región V de la cadena H (pesada) y la región V de la cadena L (ligera) de un scFv pueden proceder de cualquier anticuerpo descrito en este documento. El péptido enlazador para ligar las regiones V, no está particularmente limitado. Por ejemplo, como enlazador puede usarse un péptido monocatenario arbitrario que contenga de 3 a 25 restos aproximadamente. Específicamente, es posible usar los péptidos enlazadores o similares descritos más adelante.

Las regiones V de ambas cadenas se pueden ligar, por ejemplo, mediante PCR como se ha descrito anteriormente. En primer lugar, para ligar las regiones V mediante PCR, como molde se usa un ADN, de los ADN mostrados más adelante, que codifica una secuencia de aminoácidos completa o parcial deseada:

secuencia de ADN que codifica una cadena H o una región V de la cadena H de un anticuerpo, y

secuencia de ADN que codifica una cadena L o una región V de la cadena L de un anticuerpo.

Los ADN que codifican las regiones V de la cadena H y de la cadena L, se amplifican por PCR usando un par de cebadores que tienen secuencias correspondientes a secuencias en ambos extremos del ADN a amplificar. Después, se prepara un ADN que codifique la parte del péptido enlazador. El ADN que codifica el péptido enlazador también se puede sintetizar por PCR. En este caso, las secuencias de nucleótidos que pueden ligarse a los productos de amplificación de las regiones V sintetizadas por separado, se añaden al extremo 5' de los cebadores que se utilizarán. Después, la PCR se lleva a cabo utilizando cada uno de los siguientes ADN: [ADN de la región V de la cadena H] -[ADN del péptido enlazador] -[ADN de la región V de la cadena L], y el conjunto de cebadores de la PCR.

El conjunto de cebadores de la PCR está compuesto por una combinación de un cebador que se empareja con el extremo 5' del [ADN de la región V de la cadena H] y un cebador que se empareja con el extremo 3' del [ADN de la región V de la cadena L]. En otras palabras, el conjunto de cebadores de la PCR es un grupo de cebadores que se puede usar para amplificar el ADN que codifica la secuencia de longitud completa de un scFv que se va a sintetizar. Mientras tanto, las secuencias de nucleótidos que pueden ligarse a los ADN de la región V, se han añadido al [ADN del péptido enlazador]. Por tanto, estos ADN están ligados entre sí, y después, el scFv completo, se genera finalmente como un producto de amplificación gracias al conjunto de cebadores de la PCR. Una vez que se generan los ADN que codifican los scFv, a través de métodos convencionales, se pueden obtener los vectores de expresión portadores de estos ADN y las células recombinantes transformadas con estos vectores de expresión. Asimismo, el scFv puede obtenerse cultivando las células recombinantes resultantes para expresar los ADN que codifican los scFv.

El orden de las regiones variables de la cadena pesada y la cadena ligera que van a ligarse entre sí, no está particularmente limitado y estas se pueden disponer en cualquier orden. A continuación se enumeran ejemplos de la disposición.

[VH] enlazador [VL]

[VL] enlazador [VH]

Un sc(Fv)2 es un anticuerpo monocatenario de bajo peso molecular producido ligando dos VH y dos VL utilizando enlazadores y similares (Hudson et al., J Immunol. Methods 1999; 231: 177-189). Por ejemplo, un sc(Fv)2 se puede producir ligando los scFv mediante un enlazador.

Se prefieren anticuerpos en los que dos VH y dos VL se disponen en el orden de VH, VL, VH y VL ([VH] enlazador [VL] enlazador [VH] enlazador [VL]) a partir del extremo N del polipéptido monocatenario. Sin embargo, el orden de las dos VH y las dos VL no se limita a la disposición anterior, y se pueden disponer en cualquier orden. A continuación se enumeran ejemplos de la disposición:

[VL] enlazador [VH] enlazador [VH] enlazador [VL]

[VH] enlazador [VL] enlazador [VL] enlazador [VH]

[v h ] enlazador [VH] enlazador [VL] enlazador [Vl ]

[VL] enlazador [VL] enlazador [Vh ] enlazador [Vh ]

[v l ] enlazador [VH] enlazador [Vl ] enlazador [Vh ]

La secuencia de aminoácidos de la región variable de la cadena pesada o de la región variable de la cadena ligera en un anticuerpo de bajo peso molecular, puede contener una sustitución, deleción, adición y/o inserción. Asimismo, la región variable de la cadena pesada y la región variable de la cadena ligera también pueden carecer de algunas partes o pueden añadirse a otros polipéptidos, siempre que tengan capacidad de unión al antígeno cuando se ligan entre sí. Como alternativa, las regiones variables pueden ser regiones quimerizadas o humanizadas.

En la presente divulgación, los enlazadores que unen las regiones variables del anticuerpo incluyen péptidos enlazadores arbitrarios que pueden introducirse usando ingeniería genética, o enlazadores sintéticos, tales como los desvelados en Protein Engineering, 9(3), 299-305, 1996.

Los enlazadores preferidos son péptidos enlazadores. La longitud de los péptidos enlazadores no está particularmente limitada, y los expertos en la materia pueden seleccionar apropiadamente la longitud dependiendo de su finalidad. Una longitud típica es una que varía de 1 a 100 aminoácidos, preferentemente de 3 a 50 aminoácidos, más preferentemente de 5 a 30 aminoácidos, y en particular, preferentemente de 12 a 18 aminoácidos (por ejemplo, 15 aminoácidos).

Las secuencias de aminoácidos de dichos péptidos enlazadores incluyen, por ejemplo:

Ser;

GlySer;

G lyG lySer;

SerG lyG ly;

G lyG lyG lyS er (SEQ ID NO: 13);

S erG lyG lyG ly (SEQ ID NO: 14);

G lyG lyG lyG lyS e r (SEQ ID NO: 15);

S e rG lyG lyG lyG ly (SEQ ID NO: 16);

G lyG lyG lyG lyG lyS e r (SEQ ID NO: 17);

S e rG lyG lyG lyG lyG ly (SEQ ID NO: 18);

G lyG lyG lyG lyG lyG lyS e r (SEQ ID NO: 19);

SerGIyGlyGlyGlyGlyGly (SEQ ID NO: 20);

(G lyG lyG lyG ly Ser (SEQ ID NO: 15))n; y

(S e rG lyG lyG lyG ly (SEQ ID NO: 16))n,

donde n es un número entero de 1 o mayor.

La secuencia de aminoácidos de un péptido enlazador puede seleccionarla apropiadamente un experto en la materia en función de su finalidad. Por ejemplo, la "n" mencionada anteriormente, que determina la longitud del péptido enlazador, varia generalmente de 1 a 5, preferentemente de 1 a 3 y, más preferentemente, de 1 o 2.

Los enlazadores sintéticos (reticulantes químicos) incluyen reticulantes que se usan habitualmente para la reticulación de péptidos, por ejemplo, N-hidroxisuccinimida (NHS), disuccinimidil suberato (DSS), bis(sulfosuccinimidil) suberato (BS3), ditiobis(succinimidil propionato) (DSP), ditiobis(sulfosuccinimidil propionato) (DTSSP), etilenglicol bis(succinimidil succinato) (EGS), etilenglicol bis(sulfosuccinimidil succinato) (sulfo-EGS), disuccinimidil tartrato (DST), disulfosuccinimidil tartrato (sulfo-DST), bis[2- (succinimidoxicarboniloxi)etil] sulfona (BSOCOES) y bis[2-(sulfosuccinimidoxicarboniloxi)etil] sulfona (sulfo-BSOCOES). Estos reticulantes están disponibles en el mercado.

Cuando cuatro regiones variables de anticuerpo están unidas, generalmente se requieren tres enlazadores. Dichos enlazadores múltiples pueden ser iguales o diferentes.

Los anticuerpos de la presente divulgación incluyen anticuerpos en los que se han añadido uno o más restos de aminoácidos a la secuencia de aminoácidos de un anticuerpo de la presente divulgación. Adicionalmente, En la divulgación se incluyen proteínas de fusión resultantes de una fusión entre uno de los anticuerpos anteriores y un segundo péptido o proteína. Las proteínas de fusión se pueden preparar ligando en marco un polinucleótido que codifica un anticuerpo de la presente divulgación con un polinucleótido que codifica un segundo péptido o polipéptido, insertando este en un vector de expresión y expresando la construcción de fusión en un hospedador. Para esta finalidad, se dispone de algunas técnicas conocidas por los expertos en la materia. El péptido o polipéptido compañero que se va a fusionar con un anticuerpo de la presente divulgación puede ser un péptido conocido, por ejemplo, FLAG (Hopp, T. P. et al., BioTechnology 6, 1204-1210 (1988)), 6x His que consiste en seis restos de His (histidina), 10x His, hemaglutinina (HA) del virus de la gripe, fragmento de c-myc humano, fragmento de VSV-GP, fragmento de p18HIV, etiqueta de T7, etiqueta de VHS, etiqueta de E, fragmento de antígeno T de SV40, etiqueta de lck, fragmento de atubulina, etiqueta de B, fragmento de proteína C, etiqueta de S, etiqueta de Estrep, etiqueta de halo. Otros polipéptidos compañeros para fusionarse con los anticuerpos de la presente divulgación incluyen, por ejemplo, GST = (glutatión-S-transferasa), HA (hemaglutinina del virus de la gripe), la región constante de inmunoglobulina, p-galactosidasa y MBP (proteína de unión a maltosa, siglas del inglés maltose binding protein). Un polinucleótido que codifica uno de estos péptidos o polipéptidos, disponibles en el mercado, puede fusionarse con un polinucleótido que codifica un anticuerpo de la presente divulgación. El polipéptido de fusión se puede preparar expresando la construcción de fusión.

Asimismo, los anticuerpos de la presente divulgación pueden ser anticuerpos conjugados que están ligados a cualquiera de diversas moléculas, incluyendo sustancias poliméricas tales como polietilenglicol (PEG) y ácido hialurónico, sustancias radioactivas, sustancias fluorescentes, sustancias luminiscentes, enzimas y toxinas. Dichos anticuerpos modificados pueden obtenerse modificando químicamente los anticuerpos obtenidos. En este campo, se han establecido métodos para modificar anticuerpos (véanse, por ejemplo, los documentos US 5057313 y US 5156840). Los "anticuerpos" de la presente divulgación también incluyen dichos anticuerpos conjugados.

Asimismo, los anticuerpos usados en la presente divulgación pueden ser anticuerpos biespecíficos. El anticuerpo biespecífico se refiere a un anticuerpo que tiene regiones variables que reconocen diferentes epítopos en la misma molécula de anticuerpo. En la presente divulgación, los anticuerpos biespecíficos pueden reconocer diferentes epítopos en la molécula de polipéptido mutante de la presente divulgación, o reconocer el polipéptido mutante de la presente divulgación con un sitio de unión a antígeno y una sustancia diferente con el otro sitio de unión a antígeno.

Se conocen métodos para producir anticuerpos biespecíficos. Se pueden preparar anticuerpos biespecíficos, por ejemplo, ligando dos anticuerpos que reconozcan antígenos diferentes. Los anticuerpos que se van a ligar pueden ser moléculas divididas en dos partes, conteniendo cada una de ellas una cadena H y una cadena L, o pueden ser moléculas divididas en cuatro partes que consisten en una sola cadena H. Como alternativa, los hibridomas que producen diferentes anticuerpos monoclonales pueden fusionarse para producir una célula fusionada que produce anticuerpos biespecíficos. Asimismo, los anticuerpos biespecíficos se pueden producir mediante técnicas de ingeniería genética.

Los anticuerpos de la presente divulgación pueden diferir en la secuencia de aminoácidos, peso molecular, punto isoeléctrico, presencia/ausencia de cadenas glucídicas y conformación dependiendo de la célula o del hospedador que produce el anticuerpo o del método de purificación como se describe a continuación. Sin embargo, en la presente divulgación se incluye un anticuerpo resultante, siempre que sea funcionalmente equivalente a un anticuerpo de la presente divulgación. Por ejemplo, cuando un anticuerpo de la presente divulgación se expresa en células procariotas, por ejemplo, E. coli, se añadirá un resto de metionina al extremo N terminal de la secuencia de aminoácidos del anticuerpo original. Dichos anticuerpos están incluidos en la presente divulgación.

Los anticuerpos de la presente divulgación pueden ser anticuerpos con cadenas glucídicas alteradas. Los expertos en la materia conocen métodos para modificar cadenas glucídicas de anticuerpos, e incluyen, por ejemplo, métodos para mejorar la CCDA (citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos) modificando la glucosilación del anticuerpo, métodos para ajustar la CCDA determinando la presencia o ausencia de fucosa en las cadenas glucídicas del anticuerpo, métodos para preparar anticuerpos que tengan cadenas glucídicas que no contengan fucosa de núcleo a-16 produciendo anticuerpos en células YB2/0, y métodos para añadir cadenas glucídicas que tengan GIcNAc bisectante (véanse los documentos WO 99/54342; WO 00/61739; WO 02/31140; WO 02/79255, etc.).

Los anticuerpos de la presente divulgación se pueden producir mediante métodos conocidos usando como inmunógeno un polipéptido mutante de la presente invención (procedente de mamíferos tales como seres humanos y ratones) o un fragmento del mismo. Específicamente, los mamíferos no humanos se inmunizan mediante un método de inmunización conocido, usando, como antígeno sensibilizante, un antígeno deseado o células que expresen un antígeno deseado. Las células inmunitarias preparadas a partir de los animales inmunizados, se fusionan con células parentales conocidas mediante un método general de fusión celular. Las células resultantes productoras de anticuerpos monoclonales (hibridomas) se clasifican mediante métodos de exploración generales, y los anticuerpos monoclonales se preparan cultivando las células.

Los mamíferos no humanos a inmunizar incluyen, por ejemplo, animales tales como ratones, ratas, conejos, ovejas, monos, cabras, burros, vacas, caballos y cerdos. El antígeno se puede preparar usando un polinucleótido que codifica el polipéptido mutante de la presente invención según métodos conocidos, por ejemplo, mediante métodos que usan baculovirus (véase, por ejemplo, el documento WO 98/46777) o similares.

Se pueden preparar hibridomas, por ejemplo, según el método de Milstein et al. (Kohler, G. y Milstein, C., Methods Enzymol. (1981) 73: 3-46) o métodos similares. Cuando la inmunogenicidad de un antígeno es baja, la inmunización puede realizarse después de ligar el antígeno con una macromolécula que tenga inmunogenicidad, tal como albúmina.

En una divulgación, los anticuerpos que se unen a los polipéptidos mutantes de la presente invención, incluyen anticuerpos monoclonales que se unen a los polipéptidos mutantes de la presente invención. Los inmunógenos para preparar anticuerpos monoclonales que tengan actividad de unión con un polipéptido mutante de la presente invención, no están particularmente limitados, siempre que se puedan preparar anticuerpos que tengan actividad de unión con el polipéptido mutante de la presente invención.

Mientras tanto, la actividad de un anticuerpo para unirse a un polipéptido mutante de la presente invención, se puede analizar mediante métodos conocidos por los expertos en la materia.

Mientras tanto, los anticuerpos monoclonales también se pueden obtener mediante inmunización con ADN. La inmunización con ADN es un método en el que un ADN vector, construido de tal manera que un gen que codifica la proteína antigénica pueda expresarse en un animal a inmunizar, se administra al animal, y el inmunógeno se expresa en el cuerpo del animal para proporcionar inmunoestimulación. En comparación con los métodos de inmunización habituales basados en la administración de antígenos proteicos, se espera que la inmunización con ADN sea ventajosa por que:

- permite la inmunoestimulación mientras conserva la estructura de una proteína de membrana; y

- no es preciso purificar el inmunógeno.

Para obtener anticuerpos monoclonales mediante inmunización con ADN, en primer lugar, un polinucleótido que codifica un polipéptido mutante de la presente invención se administra a un animal que se va a inmunizar. El polinucleótido que codifica un polipéptido mutante de la presente invención, puede sintetizarse según un método descrito anteriormente mediante técnicas conocidas, tal como PCR. El ADN resultante (polinucleótido) se inserta en un vector de expresión apropiado y después se administra a un animal que se va a inmunizar. El vector de expresión incluye cualquiera de los vectores descritos anteriormente (por ejemplo, vectores de expresión disponibles en el mercado, tal como pcDNA3.1). Los vectores pueden administrarse a un organismo vivo mediante métodos habitualmente usados. Por ejemplo, se puede realizar inmunización con ADN, usando, por ejemplo, una pistola de genes para inyectar en las células partículas de oro inmovilizadas con un vector de expresión. Un método preferido para obtener anticuerpos monoclonales es realizar una inmunización de refuerzo con células que expresan el polipéptido mutante de la presente invención después de la inmunización con ADN.

Una vez que el mamífero se inmuniza como se describió anteriormente y que se demuestra que el nivel sérico de un anticuerpo deseado aumenta, se recogen las células inmunitarias del mamífero y se someten a fusión celular. En particular, las células inmunitarias preferidas son esplenocitos.

Las células de mieloma de mamífero se usan para la fusión con las células inmunitarias anteriores. Se prefiere que, para la exploración, las células de mieloma tengan marcadores de selección apropiados. El marcador de selección se refiere a un fenotipo que permite (o no permite) la supervivencia en condiciones de cultivo particulares. Los marcadores de selección conocidos incluyen, deficiencia de hipoxantina-guanina-fosforribosil-transferasa (en lo sucesivo abreviada como "deficiencia de HGPRT" (por las siglas del inglés hypoxanthine-guanine-phosphoribosyltransferase)) y deficiencia de timidina cinasa (en lo sucesivo abreviada como"deficiencia de TK" (por las siglas del inglés thymidine kinase)). Las células deficientes en HGPRT o TK, presentan sensibilidad a hipoxantina-aminopterina-timidina (en lo sucesivo abreviada como "sensibilidad a HAT" (por las siglas del inglés hypoxanthine-aminopterin-thymidine)). En el medio de selección HAT, las células sensibles a HAT no pueden sintetizar ADN y, por lo tanto, morirán. Sin embargo, cuando se fusionan con células normales, pueden continuar sintetizando ADN mediante la ruta de recuperación de las células normales y, por lo tanto, pueden crecer incluso en el medio de selección HAT.

Las células deficientes en HGPRT o TK se pueden seleccionar usando un medio que contenga 6-tioguanina, 8-azaguanina (en lo sucesivo abreviada como "8AG") o 5'-bromodesoxiuridina. Si bien las células normales se destruyen debido a la incorporación de estos análogos de pirimidina en el ADN, las células que carecen de estas enzimas pueden sobrevivir en el medio de selección porque no pueden incorporar estos análogos de pirimidina. Otro marcador de selección denominado resistencia a G418 confiere resistencia a los antibióticos de 2-desoxiestreptamina (análogos de gentamicina) debido al gen de resistencia a la neomicina. Se conocen diversas células de mieloma adecuadas para la fusión celular.

La fusión celular entre células inmunitarias y células de mieloma se puede llevar a cabo esencialmente según métodos conocidos, por ejemplo, el método de Kohler y Milstein et al. (Kohler. G. y Milstein, C., Methods Enzymol. (1981) 73, 3-46).

Más específicamente, la fusión celular puede llevarse a cabo, por ejemplo, en un medio de cultivo habitual en presencia de un agente promotor de fusión celular. El agente promotor de fusión incluye, por ejemplo, polietilenglicol (PEG) y virus Sendai (HVJ). Si se requiere, para mejorar la eficiencia de la fusión también se puede añadir un agente auxiliar, tal como dimetilsulfóxido.

Las células inmunitarias y las células de mieloma pueden usarse en una proporción determinada arbitrariamente. Por ejemplo, la proporción de células inmunitarias con respecto a células de mieloma es, preferentemente, de 1 a 10. Los medios de cultivo que se utilizarán para la fusión celular incluyen, por ejemplo, medios, tales como RPMI1640 y MEM, que son adecuados para el crecimiento celular de líneas de células de mieloma, y otros medios de cultivo habituales utilizados para este tipo de cultivo celular. Además, los medios de cultivo también pueden complementarse con un complemento de suero tal como suero bovino fetal (FCS, siglas del inglés fetal ca lf serum).

Cantidades predeterminadas de células inmunitarias y de células de mieloma se mezclan bien en el medio de cultivo, y después se mezclan con una solución de PEG precalentada a aproximadamente 37 °C para producir células fusionadas (hibridomas). En el método de fusión celular, por ejemplo, a las células se las puede añadir PEG con un peso molecular medio de aproximadamente 1000 a 6 000, por lo general, a una concentración que varia de un 30 % a un 60 % (p/v). Después, la adición sucesiva del medio de cultivo apropiado mencionado anteriormente y la retirada del sobrenadante por centrifugación se repiten para eliminar el agente de fusión celular y sustancias similares, que son desfavorables para el crecimiento de hibridomas.

Los hibridomas resultantes pueden explorarse usando un medio de selección según el marcador de selección que poseen las células de mieloma usadas en la fusión celular. Por ejemplo, las células deficientes en HGPRT o TK pueden explorarse cultivándolas en un medio HAT (un medio que contiene hipoxantina, aminopterina y timidina). Específicamente, cuando en la fusión celular se usan células de mieloma sensibles a HAT, las células fusionadas satisfactoriamente con células normales pueden crecer selectivamente en el medio HAT. El cultivo celular que usa el medio HAT anterior, continúa durante un período de tiempo suficiente para permitir que mueran todas las células excepto los hibridomas deseados (células no fusionadas). Específicamente, en general, los hibridomas deseados pueden seleccionarse cultivando las células durante varios días a varias semanas. Después, la exploración y la clonación individual de hibridomas que producen un anticuerpo de interés, se pueden llevar a cabo realizando métodos corrientes de dilución limitante.

La exploración y la clonación individual de un anticuerpo de interés se pueden llevar a cabo adecuadamente mediante métodos de exploración conocidos basados en la reacción de antígeno-anticuerpo. Por ejemplo, un antígeno que está unido a un transportador, tal como perlas fabricadas de poliestireno o similares y placas de microtitulación de 96 pocillos disponibles en el mercado, reacciona después con el sobrenadante de cultivo del hibridoma. A continuación, el transportador se lava y después se hace reaccionar con un anticuerpo secundario marcado con enzima o un marcador similar. Cuando el sobrenadante de cultivo contiene un anticuerpo de interés reactivo contra el antígeno sensibilizante, el anticuerpo secundario se une al transportador mediante este anticuerpo. Finalmente, el anticuerpo secundario unido al transportador se detecta para determinar si el sobrenadante de cultivo contiene el anticuerpo de interés. Los hibridomas que producen un anticuerpo deseado capaz de unirse al antígeno, pueden clonarse mediante el método de dilución limitante o un método similar.

Además del método descrito anteriormente para preparar hibridomas a través de la inmunización de un animal no humano con un antígeno, también se pueden obtener anticuerpos de interés sensibilizando linfocitos humanos con un antígeno. Específicamente, en primer lugar, los linfocitos humanos se sensibilizan in vitro con el polipéptido mutante de la presente invención. Después, los linfocitos sensibilizados se fusionan con un compañero de fusión apropiado.

Por ejemplo, como compañero de fusión pueden usarse células de mieloma procedentes de ser humano con capacidad de dividirse permanentemente (véase la publicación JP-B (Kokoku) H01-59878). Los anticuerpos obtenidos mediante este método son anticuerpos humanos que tienen una actividad de unión al polipéptido mutante de la presente invención.

La secuencia de nucleótidos codifica un anticuerpo que se une al polipéptido mutante de la presente invención obtenido por el método descrito anteriormente o similar, y su secuencia de aminoácidos puede obtenerse mediante métodos conocidos por los expertos en la materia.

Basándose en la secuencia obtenida del anticuerpo que se une al polipéptido mutante de la presente invención, el anticuerpo que se une al polipéptido mutante de la presente invención puede prepararse mediante técnicas de recombinación genética conocidas por los expertos en la materia. Específicamente, se puede construir un polinucleótido que codifique un anticuerpo basándose en la secuencia del anticuerpo que reconoce los polipéptidos mutantes de la presente invención, insertada en un vector de expresión, y después expresada en células hospedadoras apropiadas (véase, por ejemplo, Co, M. S. et al., J. Immunol. (1994) 152, 2968-2976; Better, M. y Horwitz, A. H., Methods Enzymol. (1989) 178, 476-496; Pluckthun, A. y Skerra, A., Methods Enzymol. (1989) 178, 497 515; Lamoyi, E., Methods Enzymol. (1986) 121, 652-663; Rousseaux, J. et al., Methods Enzymol. (1986) 121, 663 669; Bird, R. E. y Walker, B. W., Trends Biotechnol. (1991) 9, 132-137).

Los vectores incluyen vectores M13, vectores pUC, pBR322, pBluescript y pCR-Script. Como alternativa, cuando se busca subclonar y escindir ADNc, los vectores incluyen, por ejemplo, pGEM-T, pDIRECT y pT7, además de los vectores descritos anteriormente. Los vectores de expresión son particularmente útiles cuando se usan vectores para producir los anticuerpos de la presente divulgación. Por ejemplo, cuando se busca la expresión en E.coli, tal como JM109, DH5a, HB101 y XL1-Blue, los vectores de expresión no solo tienen las características anteriores que permiten la amplificación del vector en E. coli, sino también deben portar un promotor que permita la expresión eficaz en E. coli, por ejemplo, el promotor lacZ (Ward et al., Nature (1989) 341: 544-546; FASEB J. (1992) 6: 2422-2427), el promotor araB (Better et al., Science (1988) 240: 1041-1043), el promotor T7 o similares. Dichos vectores incluyen pGEX-5X-1 (Pharmacia), el "sistema QIAexpress" (Qiagen), pEGFP o pET (en este caso, el hospedador es preferentemente BL21 que expresa la ARN polimerasa de T7) además de los vectores descritos anteriormente.

Los vectores de expresión de plásmido pueden contener secuencias señal para la secreción de anticuerpos. Como secuencia señal para la secreción de anticuerpos, cuando una proteína se secreta en el periplasma de E. coli, se puede usar una secuencia señal pelB (Lei, S. P. et al J. Bacteriol. (1987) 169, 4379). El vector se puede introducir en células hospedadoras, por ejemplo, mediante los métodos de cloruro de calcio o electroporación.

Además de los vectores para E. coli, los vectores para producir los anticuerpos de la presente divulgación, incluyen vectores de expresión de mamíferos (por ejemplo, pcDNA3 (Invitrogen), pEF-BOS (Nucleic Acids. Res. 1990, 18(17), p5322), pEF y pCDM8), vectores de expresión procedentes de células de insecto (por ejemplo, el "sistema de expresión de baculovirus Bac-to-BAC" (Gibco-BRL) y pBacPAK8), vectores de expresión procedentes de plantas (por ejemplo, pMH1 y pMH2), vectores de expresión procedentes de virus de animales (por ejemplo, pHSV, pMV y pAdexLcw), vectores de expresión de retrovirus (por ejemplo, pZIPneo), vectores de expresión de levaduras (por ejemplo, el "kit de expresión en Pichia" (Invitrogen), pNV11 y SP-Q01), y vectores de expresión en Bacillus subtilis (por ejemplo, pPL608 y pKTH50), por ejemplo.

Cuando se busca la expresión en células animales, tales como células CHO, COS y NIH3T3, los vectores de expresión deben tener un promotor esencial para la expresión en células, por ejemplo, el promotor de SV40 (Mulligan et al., Nature (1979) 277, 108), el promotor de LTR (long terminal repeat, repetición terminal larga) del VLMM (virus de la leucemia murina de Moloney), el promotor de EF1a (Mizushima et al., Nucleic Acids Res. (1990) 18: 5322) y el promotor de CMV (citomegalovirus), y más preferentemente, tienen un gen para seleccionar células transformadas (por ejemplo, un gen de resistencia a fármacos que permite la evaluación usando un agente (neomicina, G418 o similar)). Como vectores con dichas características se incluyen pMAM, pDR2, pBK-RSV, pBK-CMV, pOPRSV y pOP13, por ejemplo.

Además, para la expresión de genes estable y la amplificación de genes en las células, se puede usar el siguiente método: Células CHO deficientes en una ruta de síntesis de ácido nucleico se introducen con un vector (por ejemplo, pSV2-dhfr ("Molecular Cloning 2a edición", Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)) que porta un gen de DHFR que compensa la deficiencia, y el vector se amplifica usando metotrexato (MTX). Como alternativa, para la expresión transitoria de genes se puede usar el siguiente método: células COS, con un gen que expresa el antígeno T de SV40 en su cromosoma, se transforman con un vector (pcD y similar) con un origen de replicación de SV40. También se pueden usar orígenes de replicación procedentes de poliomavirus, adenovirus, virus del papiloma bovino (VPB) y similares. Para amplificar el número de copias de genes en las células hospedadoras, los vectores de expresión pueden portar adicionalmente marcadores de selección, tales como el gen de la aminoglucósidotransferasa (APH), el gen de la timidina cinasa (TK), el gen de E. coli de xantina-guanina fosforribosiltransferasa (Ecogpt) y el gen de la dihidrofolato reductasa (dhfr).

Los anticuerpos de la presente divulgación obtenidos por los métodos descritos anteriormente, se pueden aislar del interior de las células hospedadoras o del exterior de las células (el medio o similar) y purificarlos hasta la homogeneidad. Los anticuerpos se pueden aislar y purificar mediante métodos habitualmente usados para el aislamiento y la purificación de anticuerpos, y el tipo de método no está limitado. Por ejemplo, los anticuerpos se pueden aislar y purificar mediante selección y combinación apropiada de columna de cromatografía, filtración, ultrafiltración, desestabilización salina, precipitación con disolvente, extracción con disolvente, destilación, inmunoprecipitación, electroforesis en gel de poliacrilamida con SDS, isoelectroenfoque, diálisis, recristalización y métodos similares.

Las cromatografías incluyen, por ejemplo, cromatografía de afinidad, cromatografía de intercambio iónico, cromatografía hidrófoba, filtración en gel, cromatografía de fase inversa y cromatografía de adsorción (Strategies for Protein Purification and Characterization: A Laboratory Course Manual. Ed Daniel R. Marshak et al., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1996). Los métodos cromatográficos descritos anteriormente se pueden llevar a cabo usando cromatografía de líquidos, por ejemplo, HPLC y FPLC. Las columnas que se pueden usar para la cromatografía de afinidad incluyen columnas de proteína A y columnas de proteína G. Las columnas que usan proteína A incluyen, por ejemplo, Hyper D, POROS y Sepharose FF (GE Amersham Biosciences). La presente divulgación incluye anticuerpos que están muy purificados usando estos métodos de purificación.

La actividad de unión al polipéptido mutante de los anticuerpos obtenidos de la presente invención, se puede determinar mediante métodos conocidos por los expertos en la materia. Los métodos para determinar la actividad de unión a antígeno de un anticuerpo incluyen, por ejemplo, ELISA (enzimoinmunoanálisis de adsorción), EIA (enzimoinmunoanálisis), RIA (radioinmunoanálisis) y método de anticuerpos fluorescentes. Por ejemplo, cuando se usa enzimoinmunoanálisis, se añaden muestras que contienen anticuerpos, tales como anticuerpos purificados y sobrenadantes de cultivo de células productoras de anticuerpos, a placas recubiertas de antígeno. Se añade un anticuerpo secundario marcado con una enzima, tal como fosfatasa alcalina y las placas se incuban. Después del lavado, se añade un sustrato enzimático, tal como fosfato de p-nitrofenilo y para evaluar la actividad de unión al antígeno se mide la absorbancia.

En la presente invención, "cáncer" generalmente se refiere a neoplasia maligna que puede ser metastásica o no metastásica. Por ejemplo, como ejemplos no limitantes de cáncer que se desarrolla a partir de tejidos epiteliales, tales como el tubo digestivo y la piel, se incluyen tumor cerebral, cáncer de piel, cáncer de cabeza y cuello, cáncer de esófago, cáncer de pulmón, cáncer gástrico, cáncer duodenal, cáncer de mama, cáncer de próstata, cáncer de cuello uterino, cáncer de cuerpo uterino, cáncer de páncreas, cáncer de hígado, cáncer colorrectal, cáncer de colon, cáncer de vejiga y cáncer de ovario. Mientras tanto, como ejemplos no limitantes de sarcoma que se desarrolla a partir de tejidos no epiteliales (estroma), tales como los músculos, se incluyen osteosarcoma, condrosarcoma, rabdomiosarcoma, leiomiosarcoma, liposarcoma y angiosarcoma. Asimismo, como ejemplos no limitantes de cáncer hematológico derivado de órganos hematopoyéticos se incluyen linfoma maligno, incluido linfoma de Hodgkin y linfoma no Hodgkin, leucemia, incluyendo leucemia mielocítica aguda, leucemia mielocítica crónica, leucemia linfática aguda y leucemia linfática crónica, y mieloma múltiple.

En la presente invención, el cáncer incluye cualquier tumor de tejido patológico recientemente desarrollado (neoplasia). En la presente invención, la neoplasia conduce a la formación de un tumor que se caracteriza por una neovascularización parcial. La neoplasia puede ser benigna, por ejemplo, angioma, glioma y teratoma, o maligna, por ejemplo, cáncer, sarcoma, tumor glial, astrocitoma, neuroblastoma y retinoblastoma.

En la presente invención, como ejemplos preferidos de cáncer se incluyen cáncer de vejiga, tumor cerebral, carcinoma epidermoide de cabeza y cuello, cáncer de pulmón, adenocarcinoma de pulmón, carcinoma epidermoide de pulmón, melanoma cutáneo, cáncer de endometrio, cáncer de mama, cáncer de próstata, cáncer de colon, cáncer de esófago, cáncer gástrico, cáncer del conducto colédoco, cáncer de la vías biliares y cáncer de hígado.

En la presente invención, "tejido canceroso" se refiere a un tejido que contiene al menos una célula cancerosa. Por ejemplo, como los tejidos cancerosos contienen células cancerosas y vasos sanguíneos, tejido canceroso se refiere a todos los tipos de células que contribuyen a la formación de masa tumoral que contiene células cancerosas y células endoteliales. En el presente documento, masa tumoral se refiere a focos de tejido tumoral. El término "tumor" se usa generalmente para referirse a neoplasia benigna o maligna.

La presente divulgación se refiere a composiciones farmacéuticas que comprenden un anticuerpo descrito anteriormente o un fragmento de unión a antígeno del mismo, oligonucleótidos, o un compuesto.

En la presente invención, generalmente, la composición farmacéutica se refiere a un agente farmacéutico para su uso en el tratamiento de enfermedades.

Las composiciones farmacéuticas para el uso de la presente invención pueden formularse mediante métodos conocidos por los expertos en la materia. Por ejemplo, estas composiciones pueden usarse por vía parenteral, en forma de soluciones o suspensiones estériles inyectables que incluyen agua u otro líquido farmacéuticamente aceptable. Por ejemplo, dichas composiciones pueden formularse mezclando, en una forma de dosis unitaria requerida por la práctica de fabricación farmacéutica generalmente aprobada, combinando apropiadamente con transportadores o medios farmacológicamente aceptables, específicamente agua estéril, solución salina fisiológica, aceite vegetal, un agente emulsionante, de suspensión, tensioactivo, estabilizante, aromatizante, excipiente, vehículo, conservante, aglutinante, o similares. La cantidad de principio activo en dichas formulaciones se ajusta para que se pueda obtener una cantidad apropiada dentro de un intervalo especificado.

Las composiciones estériles para inyección pueden formularse según la práctica general de formulación usando vehículos tales como agua destilada para inyección. Como soluciones acuosas para inyección se incluyen, por ejemplo, solución salina fisiológica y soluciones isotónicas que contienen glucosa u otros adyuvantes (por ejemplo, D-sorbitol, D-manosa, D-manitol y cloruro de sodio). Estas pueden usarse en combinación con solubilizadores apropiados, por ejemplo, alcohol (etanol, etc.), polialcohol (propilenglicol, polietilenglicol, etc.) y detergentes no iónicos (Polysorbate 80™, HCO-50, etc.).

Como aceites se incluyen aceite de sésamo y aceites de soja. El benzoato de bencilo y/o el alcohol bencílico se pueden usar en combinación como solubilizantes. También es posible combinar tampones (por ejemplo, tampón de fosfato y tampón de acetato de sodio), calmantes (por ejemplo, clorhidrato de procaína), estabilizantes (por ejemplo, alcohol bencílico y fenol) y/o antioxidantes. Las ampollas apropiadas se cargan con las inyecciones preparadas.

Las composiciones farmacéuticas para su uso de la presente invención se administran preferentemente por vía parenteral. Por ejemplo, las composiciones se administran en una forma inyectable, o en una forma para administración transnasal, administración transpulmonar o administración transdérmica. Por ejemplo, pueden administrarse por vía sistémica o local por inyección intravenosa, inyección intramuscular, inyección intraperitoneal, inyección subcutánea, o similar.

Los métodos de administración se pueden seleccionar de manera apropiada en función de la edad y los síntomas del paciente. La dosis de una composición farmacéutica que contiene una molécula de unión a antígeno puede ser, por ejemplo, de 0,0001 mg a 1000 mg/kg en cada administración. Como alternativa, la dosis puede ser, por ejemplo, de 0,001 a 100 000 mg por paciente. Sin embargo, la presente invención no está limitada a los valores numéricos descritos anteriormente. La dosificación y el método de administración varían en función del peso, la edad, síntomas y factores similares del paciente. Teniendo en cuenta los factores descritos anteriormente, los expertos en la materia pueden establecer una dosificación y un método de administración apropiados.

Los aminoácidos en las secuencias de aminoácidos descritas en el presente documento, pueden modificarse después de la traducción (por ejemplo, los expertos en la materia conocen bien la modificación de la glutamina N-terminal en ácido piroglutámico mediante piroglutamilación). Naturalmente, dichos aminoácidos modificados postraduccionalmente también se incluyen en las secuencias de aminoácidos de la presente invención.

La presente divulgación también se refiere a métodos para detectar un polipéptido mutante de la presente invención descrito anteriormente o la presente invención se refiere a métodos para detectar un polinucleótido que codifica el polipéptido mutante en muestras de sujetos (incluidos pacientes con cáncer y personas sanas).

La presencia o ausencia de un polipéptido mutante de la presente invención en una muestra de un sujeto, puede analizarse y determinarse, por ejemplo, usando una reacción de antígeno-anticuerpo que se realiza poniendo en contacto un anticuerpo descrito anteriormente o un fragmento de unión a antígeno del mismo que se une a un polipéptido mutante de la presente invención, con una muestra (tejido tumoral, tejido normal y diversas muestras biológicas de líquidos corporales que contienen células cancerosas o normales (sangre, suero, orina, saliva, ascitis, derrame pleural, etc.)) recogida de un sujeto (paciente con cáncer, persona que puede verse afectada por cáncer, persona en riesgo de contraer cáncer o persona sana; sin embargo, no está limitado a seres humanos).

En una reacción antígeno-anticuerpo, el antígeno (es decir, un polipéptido mutante de la presente invención), puede detectarse, por ejemplo, usando un inmunoensayo convencional.

En la presente divulgación, inmunoensayo se refiere a un método para detectar un polipéptido mutante de la presente invención en una muestra (tejido tumoral, tejido normal y diversas muestras biológicas de líquidos corporales que contienen células cancerosas o normales (sangre, suero, orina, saliva, ascitis, derrame pleural, etc.)) basándose en el mecanismo de reacción entre un antígeno (es decir, un polipéptido mutante de la presente invención) y un anticuerpo que se une al antígeno o fragmento de unión a antígeno del mismo. En la presente divulgación se incluye cualquier inmunoensayo siempre que éste sea un método que pueda detectar los polipéptidos de fusión de la presente divulgación.

En la presente divulgación, en el inmunoensayo, pueden aplicarse los principios de diversos métodos tales como los descritos en "Kouso Men-eki Sokutei Hou (inmunoensayo enzimático)" (3a ed., eds., Eiji Ishikawa et al., Igakushoin, 1987). Específicamente, estos diversos métodos pueden llevarse a cabo utilizando uno o más anticuerpos que se unen a un antígeno de interés para capturar (atrapar) el antígeno que se va a detectar en una muestra.

Los principios que pueden aplicarse incluyen, preferentemente, por ejemplo, métodos en fase sólida de un anticuerpo sencillo, métodos en fase líquida de un anticuerpo doble, métodos en fase sólida de un anticuerpo doble, métodos de tipo sándwich y métodos de un solo proceso, tales como los descritos en la publicación JP-B (Kokoku) H02-39747. Mientras tanto, los ensayos basados en la reacción de antígeno-anticuerpo, también incluyen la técnica de enzimoinmunoensayo multiplicado (EMIT, siglas del inglés enzyme multiplied immunoassay technique), enzimoinmunoensayo de canalización, enzimoinmunoensayo mediado con modulador enzimático (EMMIA, por las siglas del inglés enzyme modulator mediated enzyme immunoassay), enzimoinmunoensayo con inhibidor, ensayo inmunoenzimométrico, enzimoinmunoensayo mejorado e inmunoensayo de enlace proximal.

En la presente divulgación, dependiendo del objetivo del ensayo, es posible seleccionar y utilizar cualquiera de los principios de inmunoensayo apropiados, tales como los descritos anteriormente.

Los inmunoensayos de la presente divulgación también incluyen métodos de tipo sándwich que usan un anticuerpo marcado con biotina o enzimas, y placas de microtitulación con múltiples pocillos que tienen diversos pocillos, incluida una microplaca de 96 pocillos, así como métodos de un solo proceso que utilizan perlas y anticuerpos marcados con biotina o enzimas tales como peroxidasa.

Como se ha descrito anteriormente, los anticuerpos que se unen a un polipéptido mutante de la presente invención o fragmentos de unión a antígeno del mismo, que se usan en los inmunoensayos de la presente divulgación, puede marcarse con una sustancia marcadora que puede proporcionar una señal detectable por sí misma o al reaccionar con otras sustancias.

Dichas sustancias marcadoras incluyen, por ejemplo, enzimas, sustancias fluorescentes, sustancias quimioluminiscentes, biotina, avidina y radioisótopos. Más específicamente, las sustancias incluyen enzimas tales como peroxidasa (por ejemplo, peroxidasa de rábano picante), fosfatasa alcalina, p-D-galactosidasa, glucosa oxidasa, glucosa-6-fosfato deshidrogenasa, alcohol deshidrogenasa, malato deshidrogenasa, penicilinasa, catalasa, apoglucosaoxidasa, ureasa, luciferasa y acetilcolinesterasa; sustancias fluorescentes tales como isotiocianato de fluoresceína, ficobiliproteína, quelatos de metales de tierras raras, cloruro de dansilo e isotiocianato de tetrametilrodamina; radioisótopos, tales como 3H, 14C, 125I y 131I; biotina; avidina; y sustancias quimioluminiscentes.

Dichos radioisótopos y sustancias fluorescentes pueden proporcionar una señal detectable por sí mismos.

Mientras tanto, las enzimas, las sustancias quimioluminiscentes, la biotina y la avidina, no pueden proporcionar ninguna señal detectable por sí mismas, aunque proporcionan una señal detectable cuando reaccionan con una o más sustancias diferentes.

Por ejemplo, cuando se usa una enzima, se necesita al menos un sustrato. Se usan diversos sustratos según el tipo de método de ensayo de actividad enzimática (ensayo colorimétrico, ensayo fluorescente, ensayo bioluminiscente, ensayo quimioluminiscente, etc.). Por ejemplo, el peróxido de hidrógeno se usa como sustrato para la peroxidasa. Mientras tanto, la biotina generalmente reacciona con al menos avidina o avidina modificada con enzimas, peros los sustratos no están limitados a estos. Si fuera necesario, también es posible utilizar diversas sustancias cromogénicas según los sustratos.

La presencia o ausencia de un polinucleótido que codifica un polipéptido mutante de la presente invención en una muestra de un sujeto, puede analizarse y determinarse, por ejemplo, según métodos habituales que utilizan diversos oligonucleótidos (un par de cebadores oligonucleotídicos, sondas oligonucleotídicas, etc.) de la presente divulgación descritos anteriormente, y ARNm, ADNc preparado usando, como molde, ARNm, ADN genómico, o similar, en una muestra (tejido tumoral, tejido normal y diversas muestras biológicas de líquidos corporales que contienen células cancerosas o normales (sangre, suero, orina, saliva, ascitis, derrame pleural, etc.)) recogida de un sujeto (paciente con cáncer, persona que puede verse afectada por cáncer, persona en riesgo de contraer cáncer o persona sana; sin embargo, no se limita a seres humanos) usando diversos métodos de análisis de genes. Dichos métodos de análisis de genes incluyen, por ejemplo, transferencia Northern, reacción en cadena de la polimerasa (PCR, polymerase chain reaction), transferencia Southern, reacción en cadena de la ligasa (LCR, ligase chain reaction), amplificación por desplazamiento de cadena (SDA, strand displacement amplificaron), amplificación basada en secuencias de ácidos nucleicos (NASBA, nucleic acid sequence-based amplification), amplificación isotérmica y quimérica iniciada por cebador de ácidos nucleicos (ICAN, isothermal and chimeric primer-initiated amplification o f nucleic acids), amplificación isotérmica mediada por bucle (LAMP, loop-mediated isothermal amplification), método de TMA (sistema TMA de Gen-Probe), micromatriz y método de secuenciación de nueva generación.

Estos ensayos utilizan la hibridación de los oligonucleótidos de la presente divulgación con un polinucleótido procedente de una muestra que codifica un polipéptido mutante de la presente invención. Las condiciones rigurosas deseadas para dicha hibridación incluyen, por ejemplo, las condiciones de urea 6 M, SDS al 0,4 %, 0,5x SSC y una temperatura de 37 °C; y condiciones de hibridación de rigurosidad equivalente. Dependiendo del objetivo, es posible usar condiciones más rigurosas, por ejemplo, urea 6 M, SDS al 0,4 % y 0,1x SSC y una temperatura de 42 °C.

La presente invención también se refiere a k ts para detectar, en muestras de sujetos descritos anteriormente (incluidos pacientes con cáncer y personas sanas), un polinucleótido descrito anteriormente que codifica el polipéptido mutante.

Específicamente, los kits de detección de la presente divulgación pueden contener un anticuerpo, o fragmento de unión a antígeno, descrito anteriormente, que se une a un polipéptido mutante de la presente invención (incluidos anticuerpos, o fragmentos de unión a antígeno de los mismos, marcados con diversas sustancias marcadoras descritas anteriormente). Dependiendo del objetivo de cada inmunoensayo descrito anteriormente, los kits también pueden contener diversos reactivos de detección (enzimas, sustratos, etc.) y manuales de instrucciones.

Específicamente, los kits de detección de la presente invención, pueden contener diversos oligonucleótidos de la presente divulgación descritos anteriormente (un par de cebadores oligonucleotídicos, sondas oligonucleotídicas, etc.) que hibridan con ARNm procedente de un polinucleótido que codifica un polipéptido mutante de la presente invención descrito anteriormente, ADNc preparado usando, como molde, ARNm, o ADN genómico. Según el objetivo de cada análisis de genes, los kits también pueden contener diversos reactivos (enzimas, otros oligonucleótidos, ácido nucleico, tampón de reacción, etc.) y manuales de instrucciones.

La presente invención también se refiere a métodos de ensayo para determinar la presencia o ausencia de resistencia a diversos inhibidores de FGFR, para predecir la respuesta de un sujeto al tratamiento con inhibidores de FGFR, o predecir los efectos de los inhibidores de FGFR en el tratamiento del cáncer, basándose en la presencia o ausencia de polipéptidos mutantes de la presente invención o polinucleótidos que codifican esos polipéptidos mutantes, en muestras aisladas de los sujetos.

Específicamente, los métodos de la presente invención son, por ejemplo, métodos de ensayo y de determinación de la presencia o ausencia de polipéptidos mutantes de la presente invención en muestras (tejidos tumorales, tejidos normales o diversos líquidos corporales (tales como sangre, suero, orina y saliva) que contienen células cancerosas o células normales) recogidas de sujetos (pacientes con cáncer, que pueden tener cáncer, aquellos en riesgo de tener cáncer, o personas sanas, sin limitarse a seres humanos), usando los métodos descritos anteriormente y kits para detectar la presencia de los polipéptidos mutantes de la presente invención y, por lo tanto, ensayar para detectar la presencia o ausencia de resistencia a diversos inhibidores de FGFR, predecir la respuesta de los sujetos al tratamiento con inhibidores de FGFR, o predecir los efectos de los inhibidores de FGFR en el tratamiento del cáncer, basándose en los criterios de que la presencia del polipéptido mutante indica la presencia de resistencia a diversos inhibidores de FGFR.

Asimismo, los métodos de la presente invención son, por ejemplo, métodos de ensayo y de determinación de la presencia o ausencia de polinucleótidos que codifican los polipéptidos mutantes de la presente invención en muestras (tejidos tumorales, tejidos normales o diversos líquidos corporales (tales como sangre, suero, orina y saliva) que contienen células cancerosas o células normales) recogidas de sujetos (pacientes con cáncer, que pueden tener cáncer, aquellos en riesgo de tener cáncer, o personas sanas, sin limitarse a seres humanos) usando los métodos descritos anteriormente y kits para detectar polinucleótidos que codifican los polipéptidos mutantes de la presente invención y, por lo tanto, ensayar la presencia o ausencia de resistencia a diversos inhibidores de FGFR, predecir la respuesta de los sujetos al tratamiento con inhibidores de FGFR, o predecir los efectos de los inhibidores de FGFR en el tratamiento del cáncer, basándose en los criterios de que la presencia del polipéptido mutante indica la presencia de resistencia a diversos inhibidores de FGFR.

La presente invención también se refiere a métodos para seleccionar un paciente al que se le puede aplicar un antineoplásico (como se describe a continuación) que contiene un compuesto que tiene actividad inhibidora de FGFR, basándose en la presencia o ausencia de polipéptidos mutantes de la presente invención o polinucleótidos que codifican los polipéptidos mutantes en muestras aisladas de sujetos.

Específicamente, los métodos de la presente invención son, por ejemplo, métodos de ensayo y de determinación de la presencia o ausencia de polipéptidos mutantes de la presente invención en muestras (tejidos tumorales, tejidos normales o diversos líquidos corporales (tales como sangre, suero, orina y saliva) que contienen células cancerosas o células normales) recogidas de sujetos (pacientes con cáncer o que pueden tener cáncer, sin limitarse a seres humanos) usando los métodos y kits descritos anteriormente para detectar polipéptidos mutantes de la presente invención, y cuando se detectan los polipéptidos mutantes, seleccionar al sujeto como un paciente al que se le puede aplicar un antineoplásico (o una composición farmacéutica para el tratamiento del cáncer, como se describe a continuación), que contiene un compuesto que tiene actividad inhibidora de FGFR. En este caso, se prefiere el compuesto de fórmula (I) como el compuesto que tiene actividad inhibidora de FGFR. Asimismo, los métodos de la presente invención son, por ejemplo, métodos de ensayo y de determinación de la presencia o ausencia de polinucleótidos que codifican los polipéptidos mutantes de la presente invención en muestras (tejidos tumorales, tejidos normales o diversos líquidos corporales (tales como sangre, suero, orina y saliva) que contienen células cancerosas o células normales) recogidas de sujetos (pacientes con cáncer o que pueden tener cáncer, sin limitarse a los seres humanos) usando los métodos descritos anteriormente y kits para detectar los polinucleótidos que codifican los polipéptidos mutantes de la presente invención, y cuando se detectan los polinucleótidos que codifican los polipéptidos mutantes, seleccionar al sujeto como un paciente al que se le puede aplicar un antineoplásico (como se describe más adelante) que contiene un compuesto que tiene actividad inhibidora de FGFR. En este caso, se prefiere el compuesto de fórmula (I) como el compuesto que tiene actividad inhibidora de FGFR.

En la presente invención, las expresiones "inhibidor de FGFR" y "compuesto que tiene actividad inhibidora de FGFR" se usan indistintamente, y se refieren a un compuesto que tiene la actividad de inhibir la actividad del FGFR mencionado anteriormente, Específicamente, uno o más FGFR arbitrarios pertenecientes a la familia de FGFR que comprende FGFR1, FGFR2, FGFR3 y FGFR4, que son receptores del factor de crecimiento de fibroblastos (FGFR) que pertenecen a la familia de receptores de tirosina cinasa. Preferentemente, se refieren a un compuesto que tiene la actividad de inhibir la actividad del FGFR humano, y más preferentemente, a un compuesto que tiene la actividad de inhibir la actividad del FGFR3 humano que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 o 2 (secuencias de ADNc, SEQ ID NO: 3 y 4, respectivamente/números de registro de GenBank NM_000141.4 y NM_022970.3, respectivamente).

Cualquier inhibidor de FGFR se incluye en los inhibidores de FGFR siempre que los compuestos tengan la actividad de inhibir la actividad de FGFR.

Específicamente, los inhibidores de FGFR incluyen cualquiera de los compuestos, anticuerpos, productos farmacéuticos de ácido nucleico (ARNip, ácidos nucleicos de antisentido, ribozimas y similares) que tienen un mecanismo de acción de:

(1) inhibición de la actividad de FGFR cinasa;

(2) inhibición de la dimerización entre FGFR, TACC3 y BAIAP2L1;

(3) inhibición de la señalización mediada por FGFR (ruta MAPK y ruta PI3K / AKT) (por ejemplo, inhibidores de MEK, inhibidores de RAF, inhibidores de ERK, inhibidores de PI3K, inhibidores de mTOR, inhibidores de AKT, inhibidores de PDK, inhibidores de S6K, etc.); o

(4) inhibición de la expresión de FGFR (por ejemplo, inhibidores de ARNip, HSP90, etc.).

Los anticuerpos que tienen la actividad de inhibir la actividad de FGFR, que se incluyen como inhibidores de FGFR, comprenden anticuerpos identificados con los siguientes nombres de código: RG7444, FP-1039, AV370 y PRO-001.

Como compuestos de bajo peso molecular, que tienen la actividad de inhibir la actividad de FGFR, que se incluyen como inhibidores de FGFR, se incluyen, por ejemplo:

(1) los compuestos desvelados en el siguiente documento de patente y en los documentos no de patente: Cancer Research, 2012, 72: 2045-2056; J. Med. Chem., 2011, 54: 7066-7083; publicaciones internacional WO 2011/016528;

(2) los compuestos identificados con los siguientes nombres genéricos o nombres de código: AZD-4547 (compuesto C de la Tabla 1 que se describe más adelante), BGJ-398 (compuesto D de la Tabla 1 que se describe más adelante), LY-2874455, cediranib (AZD2171; compuesto E de la Tabla 1 que se describe más adelante), PD173074 (compuesto B de la Tabla 1 que se describe más adelante), regorafenib, ponatinib, orantinib, nintedanib, masitinib, lenvatinib, dovitinib (TKI258), brivanib, volasertib, golvatinib, ENMD-2076, E-3810, XL-999, XL-228, ARQ087, tivozanib, motesanib y regorafenib; y

(3) los compuestos ilustrados más adelante; sin embargo, los inhibidores de FGFR no están limitados a los mismos:

[Compuesto 1]

Rⁱrepresenta hidrógeno, hidroxi, halógeno, ciano, nitro, haloalquilo C^1-4, alquilo C^1-4, alquenilo C^2-6, alquinilo C^2-6, cicloalquilo C^3-7, aril C^{6- io}alquilo C^1-4, -OR⁵, -NR⁶R⁷, -(CR⁸R⁹)ⁿZ ⁱ, -C(O)NR^{i 2}R^{i 3}, -SR¹⁴, -SOR¹⁵, -SO²R¹⁶, -NR¹⁷SO²R¹⁸, COOH, arilo C^6-10que está opcionalmente sustituido por uno o más grupos seleccionados independientemente entre el grupo P, heteroarilo de 5 a 10 o heterociclilo de 3 a 10 miembros que está opcionalmente sustituido por uno o más grupos seleccionados independientemente entre el grupo Q, -COR¹⁹, -COOR²⁰, -OC(O)R²¹, -NR²²C(O)R²³, -NR²⁴C(S)R²⁵, -C(S)NR²⁶R²⁷, -SO²NR²⁸R²⁹, -OSO²R³⁰, -SO³R³¹o -Si(R³²)³;

R²representa hidrógeno, hidroxi, halógeno, ciano, nitro, haloalquilo C^1-4, alquilo C^1-4, alquenilo C^2-6, alquinilo C^2-6, cicloalquilo C^3-7, aril C^6-i0alquilo C^1-4, -OR⁵, -NR⁶R⁷, -(CR⁸R⁹)ⁿZ ⁱ, -C(O)NR^{i 2}R^{i 3}, -SR¹⁴, -SOR¹⁵, -SO²R¹⁶, -NR¹⁷SO²R¹⁸, COOH, arilo C^6-10que está opcionalmente sustituido por uno o más grupos seleccionados independientemente entre el grupo P, heteroarilo de 5 a 10 o heterociclilo de 3 a 10 miembros que está opcionalmente sustituido por uno o más grupos seleccionados independientemente entre el grupo Q, -COR¹⁹, -COOR²⁰, -OC(O)R²¹, -NR²²C(O)R²³, -NR²⁴C(S)R²⁵, -C(S)NR²⁶R²⁷, -SO²NR²⁸R²⁹, -OSO²R³⁰, -SO³R³¹o -Si(R³²)³; o

Rⁱy R², junto con un átomo unido a ellos, forman un heterociclilo de 3 a 10 miembros o heteroarilo de 5 a 10 miembros, en donde el heterociclilo o heteroarilo está opcionalmente sustituido por halógeno;

R³representa metilo;

R⁴representa hidrógeno;

A es indol;

R⁵representa alquilo C^1-5, cicloalquilo C^3-7, cicloalquil C^3-7alquilo C^1-3, alquenilo C^2-6, alquinilo C^2-6, haloalquilo C^1-4, alcoxi C^{i -3}alquilo C^1-4, alcoxi C^{i -3}alcoxi C^{i -4}alquilo C^1-4, aldehído C^1-4, alquilamino C^{i -4}alquilo C^1-4, di(alquil C^{i -4})amino alquilo C^1-4, arilo C^6-10, aril C^6-i0alquilo C^1-3o heterociclilalquilo C^1-3de 3 a 10 miembros, heterociclilo de 3 a 10 miembros, heteroarilo de 5 a 10 miembros, heteroarilalquilo C^1-3de 5 a 10 miembros, monohidroxi alquilo C^1-4, dihidroxi alquilo C^1-4o trihidroxi alquilo C^1-4el cual está opcionalmente sustituido por uno o más grupos seleccionados independientemente entre el grupo Q;

R⁶y R⁷, que pueden ser iguales o diferentes, cada uno representa hidrógeno, alquilo C^1-4, alquenilo C^2-6, alquinilo C^2-6, haloalquilo C^1-4, alcoxi C^{i -3}alquilo C^1-4, aril C^{6 -i0}alquilo C^1-3, heterociclilalquilo C^1-3de 3 a 10 miembros, heteroarilalquilo C^1-3de 5 a 10 miembros, monohidroxi alquilo C^1-4, dihidroxi alquilo C^1-4, trihidroxi alquilo C^1-4, heterociclilo de 3 a 10 miembros, aldehído C^1-4, alquilamino C^{i -4}alquilo C^1-4, di(alquil C^{i -4})amino alquilo C^1-4o ciano(alquilo C^1-3); o como alternativa R⁶y R⁷, junto con un átomo de nitrógeno unido a ellos, forman un heterociclilo de 3 a 10 miembros o un heteroarilo de 5 a 10 miembros; n representa 1 a 3;

R⁸y R⁹, que pueden ser iguales o diferentes, cada uno representa hidrógeno, alquilo C^1-4o halógeno; o como alternativa R⁸y R⁹, junto con un átomo de carbono unido a ellos, forman un anillo cicloalifático; Z ⁱrepresenta hidrógeno, NR¹⁰R¹¹, -OH o heterociclilo de 3 a 10 miembros heterociclilo o heteroarilo de 5 a 10 miembros que está opcionalmente sustituido por uno o más grupos seleccionados independientemente entre el grupo Q; R¹⁰y R¹¹, que pueden ser iguales o diferentes, cada uno representa alquilo C^1-4, alquenilo C^2-6, alquinilo C^2-6, haloalquilo C^1-4, alcoxi C^{i -3}alquilo C^1-4, ciano(alquilo C^1-3) o alquilsulfonil C^{i -3}alquilo C^1-4; o como alternativa R¹⁰y R¹¹, junto con un átomo de nitrógeno unido a ellos, forman un heterociclilo de 3 a 10 miembros o un heteroarilo de 5 a 10 miembros;

R¹²y R¹³, que pueden ser iguales o diferentes, cada uno representa hidrógeno, alquilo C^1-4, alquenilo C^2-6, alquinilo C^2-6, haloalquilo C^1-4, alcoxi C^{i -3}alquilo C^1-4, arilo C^6-10, heteroarilo de 5 a 10 miembros, heterociclilo de 3 a 10 miembros, aril C^{6 -i0}alquilo C^1-4, heterociclilalquilo C^1-3de 3 a 10 miembros, heteroarilalquilo C^1-3de 5 a 10 miembros, ciano(alquilo C^1-3), alquilsulfonil C^1-3alquilo C^1-4, anillo cicloalifático de 3 a 10 miembros, heteroarilo de 5 a 10 miembros o heterociclilo de 3 a 10 miembros; o como alternativa R¹²y R¹³, junto con un átomo de nitrógeno unido a ellos, forman un heterociclilo de 3 a 10 miembros o un heteroarilo de 5 a 10 miembros que está opcionalmente sustituido por uno o más grupos seleccionados independientemente entre el grupo Q; R¹⁴representa alquilo C^1-4, alquenilo C^2-6, alquinilo C^2-6, haloalquilo C^1-4, arilo C^6-10que está opcionalmente sustituido por uno o más grupos seleccionados independientemente entre el grupo P, o heteroarilo de 5 a 10 miembros o heterociclilo de 3 a 10 miembros que está opcionalmente sustituido por uno o más grupos seleccionados independientemente entre el grupo Q;

R^{i 6}representa alquilo C^1-4, alquenilo C^2-6, alquinilo C^2-6, haloalquilo C^1-4, arilo C^6-10que está opcionalmente sustituido por uno o más grupos seleccionados independientemente entre el grupo P, o heteroarilo de 5 a 10 miembros o heterociclilo de 3 a 10 miembros que está opcionalmente sustituido por uno o más grupos seleccionados independientemente entre el grupo Q;

R¹⁷representa hidrógeno o alquilo C^1-4;

R^{i 8}representa alquilo C^1-4, alquenilo C^2-6, alquinilo C^2-6, haloalquilo C^1-4, arilo C^6-10que está opcionalmente sustituido por uno o más grupos seleccionados independientemente entre el grupo P, o heteroarilo de 5 a 10 miembros o heterociclilo de 3 a 10 miembros que está opcionalmente sustituido por uno o más grupos seleccionados independientemente entre el grupo Q;

R²²representa hidrógeno, alquilo C^1-4o haloalquilo C^1-4;

R²⁴representa hidrógeno, alquilo C^1-4o haloalquilo C^1-4;

R³²representa alquilo C^1-4o arilo C^6-10;

halógeno, alquilo C^1-4, haloalquilo C^1-4, -OH, alcoxi C^1-3, monohidroxi alquilo C^1-4, dihidroxi alquilo C^1-4, trihidroxi alquilo C^1-4, heterociclil amina 3 a 10 miembros, -SO²R¹⁶, -CN, -NO², cicloalquilo C^3-7, -COR¹⁹y heterociclilo de 3 a 10 miembros que está opcionalmente sustituido por alquilo C^1-4.

[Compuesto 2]

[Compuesto 3]

, o

[Compuesto 6]

En el presente documento, el "alquilo" se refiere a un grupo monovalente obtenido a partir de un hidrocarburo alifático retirando un átomo de hidrógeno arbitrario. No contiene heteroátomos ni enlaces carbono-carbono insaturados en la cadena principal, y tiene un subconjunto de estructuras de grupos hidrocarbilo o hidrocarburos que contienen átomos de hidrógeno y carbono. El grupo alquilo incluye estructuras lineales y ramificadas. Los grupos alquilo preferidos incluyen grupos alquilo con uno o a seis átomos de carbono (C^1-6; a partir de ahora en este documento, "C^p-q" significa que el número de átomos de carbono es de p a q), grupos alquilo C^1-5, grupos alquilo C^1-4y grupos alquilo C^1-3. De manera específica, el alquilo incluye, por ejemplo, grupo metilo, grupo etilo, grupo n-propilo, grupo isopropilo, grupo n-butilo, grupo isobutilo, grupo s-butilo, grupo t-butilo, grupo pentilo, grupo isopentilo, grupo 2,3-dimetilpropilo, grupo 3,3-dimetilbutilo y grupo hexilo.

En el presente documento, "alquenilo" se refiere a un grupo hidrocarburo monovalente que tiene al menos un doble enlace (dos átomos de carbono SP2 adyacentes) e incluye los de formas lineales y ramificadas. Dependiendo de la configuración del doble enlace y los sustituyentes (si los hay), la geometría del doble enlace puede ser entgegen (E) o zusammen (Z), o configuración cis o trans. Los grupos alquenilo preferidos incluyen grupos alquenilo C^2-6.

De manera específica, el alquenilo incluye, por ejemplo, grupo vinilo, grupo alilo, grupo 1-propenilo, grupo 2-propenilo, grupo 1-butenilo, grupo 2-butenilo (que incluye cis y trans), grupo 3-butenilo, grupo pentenilo y grupo hexenilo. En el presente documento, "alquinilo" se refiere a un grupo hidrocarburo monovalente que tiene al menos un triple enlace (dos átomos de carbono SP adyacentes) e incluye los de formas lineales y ramificadas. Los grupos alquinilo preferidos incluyen grupos alquinilo C^2-6.

De manera específica, el alquinilo incluye, por ejemplo, grupo etinilo, grupo 1-propinilo, grupo propargilo, grupo 3-butinilo, grupo pentinilo y grupo hexinilo.

El alquenilo y alquinilo cada uno pueden tener uno, dos o más dobles enlaces o triples enlaces.

En el presente documento, "cicloalquilo" se refiere a un grupo hidrocarburo alifático, monovalente, cíclico, saturado o parcialmente saturado e incluye grupos monocíclicos, anillos biciclo y anillos espiro. Los cicloalquilo preferidos incluyen grupos cicloalquilo C^3-7. De manera específica, el grupo cicloalquilo incluye, por ejemplo, grupo ciclopropilo, grupo ciclobutilo, grupo ciclopentilo, grupo ciclohexilo y grupo cicloheptilo.

En el presente documento, "cicloalquilalquilo" se refiere a un grupo en el cual un átomo de hidrógeno arbitrario de un "alquilo" definido anteriormente está sustituido con un "cicloalquilo" definido anteriormente. Los grupos cicloalquilalquilo preferidos incluyen cicloalquil C^3-7alquilo C^1-3, y específicamente incluyen, por ejemplo, grupo ciclopropilmetilo y grupo ciclopropiletilo.

En el presente documento, "heteroátomo" se refiere a un átomo de nitrógeno (N), átomos de oxígeno (O) o átomo de azufre (S).

En el presente documento, "halógeno" se refiere a un átomo de flúor, átomo de cloro, átomo de bromo o átomo de yodo.

En el presente documento, "haloalquilo" se refiere a un grupo en el cual preferentemente de uno a nueve, más preferentemente de uno a cinco "átomos de halógeno" idénticos o diferentes, definidos anteriormente se unen a un "alquilo" definido anteriormente.

De manera específica, el haloalquilo incluye, por ejemplo, grupo clorometilo, grupo diclorometilo, grupo triclorometilo, grupo fluorometilo, grupo difluorometilo, grupo perfluoroalquilo (tal como grupo trifluorometilo y -CF²CF³) y grupo 2,2,2-trifluoroetilo.

En el presente documento, "alcoxi" se refiere a un grupo oxi unido con un "alquilo" definido anteriormente. Los alcoxi preferidos incluyen grupos alcoxi C^1-4y grupos alcoxi C^1-3. De manera específica, alcoxi incluye, por ejemplo, grupo metoxi, grupo etoxi, grupo 1-propoxi, grupo 2-propoxi, grupo n-butoxi, grupo i-butoxi, grupo sec-butoxi y grupo tercbutoxi.

En el presente documento, "haloalcoxi" se refiere a un grupo en el cual preferentemente de uno a nueve, más preferentemente de uno a cinco átomos de halógeno idénticos o diferentes definidos anteriormente, se unen a un "alcoxi" definido anteriormente.

De manera específica, el haloalcoxi incluye, por ejemplo, grupo clorometoxi, grupo triclorometoxi y grupo trifluorometoxi.

En el presente documento, "arilo" se refiere a un anillo hidrocarburo aromático monovalente. El arilo incluye preferentemente arilo C^6-10. De manera específica, el arilo incluye, por ejemplo, grupo fenilo y grupos naftilo (por ejemplo, grupo 1-naftilo y grupo 2-naftilo).

En el presente documento, "anillo alicíclico" se refiere a un anillo de hidrocarburo no aromático, monovalente. El anillo alicíclico puede tener enlaces insaturados dentro de su anillo, y puede ser un grupo multicíclico que tiene dos o más anillos. Los átomos de carbono que constituyen el anillo pueden oxidarse para formar un carbonilo. El número de átomos que constituyen un anillo alicíclico varía preferentemente de tres a diez (anillo alifático de 3 a 10 miembros). El anillo alicíclico incluye, por ejemplo, anillo cicloalquilo, anillos cicloalquenilo y anillos cicloalquinilo.

En el presente documento, "heteroarilo" se refiere a un grupo heterocíclico aromático monovalente en el cual los átomos que constituyen el anillo incluyen preferentemente de uno a cinco heteroátomos. El heteroarilo puede estar parcialmente saturado y puede ser un anillo monocíclico o condensado (por ejemplo, un heteroarilo bicíclico condensado con un anillo de benceno o un anillo heteroarilo monocíclico). El número de átomos que constituyen el anillo varía preferentemente de cinco a diez (heteroarilo de 5 a 10 miembros).

De manera específica, el heteroarilo incluye, por ejemplo, grupo furilo, grupo tienilo, grupo pirrolilo, grupo imidazolilo, grupo pirazolilo, grupo tiazolilo, grupo isotiazolilo, grupo oxazolilo, grupo isooxazolilo, grupo oxadiazolilo, grupo tiadiazolilo, grupo triazolilo, grupo tetrazolilo, grupo piridilo, grupo pirimidilo, grupo piridazinilo, grupo pirazinilo, grupo triazinilo, grupo benzofuranilo, grupo benzotienilo, grupo benzotiadiazolilo, grupo benzotiazolilo, grupo benzoxazolilo, grupo benzoxadiazolilo, grupo benzoimidazolilo, grupo indolilo, grupo isoindolilo, grupo azaindolilo, grupo indazolilo, grupo quinolilo, grupo isoquinolilo, grupo cinnolinilo, grupo quinazolinilo, grupo quinoxalinilo, grupo benzodioxolilo, grupo indolidinilo y grupo imidazopiridilo.

En el presente documento, "heterociclilo" se refiere a un grupo heterocíclico monovalente no aromático en el cual los átomos que forman el anillo incluyen preferentemente de uno a cinco heteroátomos. El heterociclilo puede contener dobles o triples enlaces en su anillo. Los átomos de carbono pueden oxidarse para formar carbonilo. El anillo puede ser un anillo monocíclico o condensado. El número de átomos que constituyen el anillo varía preferentemente de tres a diez (heterociclilo de 3 a 10 miembros).

De manera específica, el heterociclilo incluye, por ejemplo, grupo oxetanilo, grupo dihidrofurilo, grupo tetrahidrofurilo, grupo dihidropiranilo, grupo tetrahidropiranilo, grupo tetrahidropiridilo, grupo morfolinilo, grupo tiomorfolinilo, grupo pirrolidinilo, grupo piperidinilo, grupo piperazinilo, grupo pirazolidinilo, grupo imidazolinilo, grupo imidazolidinilo, grupo oxazolidinilo, grupo isooxazolidinilo, grupo tiazolidinilo, grupo isotiazolidinilo, grupo tiadiazolidinilo, grupo azetidinilo, grupo oxazolidona, grupo benzodioxanilo, grupo benzoxazolilo, grupo dioxolanilo y grupo dioxanilo.

En el presente documento, "arilalquilo" se refiere a un grupo en el cual un átomo de hidrógeno arbitrario en un "alquilo" definido anteriormente está sustituido con un "arilo" definido anteriormente. El arilalquilo incluye preferentemente aril C6-10alquilo C1-4 y aril C6-10alquilo C1-3. De manera específica, el arilalquilo incluye, por ejemplo, grupo bencilo, grupo fenetilo y grupo naftilmetilo.

En el presente documento, "heteroarilalquilo" se refiere a un grupo en el cual un átomo de hidrógeno arbitrario en un alquilo definido anteriormente está sustituido con un "heteroarilo" definido anteriormente. El heteroarilalquilo incluye preferentemente heteroarilalquilo C1-3 de 5 a 10 miembros. De manera específica, el heteroarilalquilo incluye, por ejemplo, grupo pirrolilmetilo, grupo imidazolilmetilo, grupo tienilmetilo, grupo piridilmetilo, grupo pirimidilmetilo, grupo quinolilmetilo y grupo piridiletilo.

En el presente documento, "heterociclilalquilo" se refiere a un grupo en el cual un átomo de hidrógeno arbitrario en un "alquilo" definido anteriormente está sustituido con un "heterociclilo" definido anteriormente. El heterociclilalquilo incluye preferentemente heterociclilalquilo C1-3de 3 a 10 miembros. De manera específica, el heterociclilalquilo incluye, por ejemplo, grupo morfolinilmetilo, grupo morfoliniletilo, grupo tiomorfolinilmetilo, grupo pirrolidinilmetilo, grupo piperidinilmetilo, grupo piperazinilmetilo, grupo piperaziniletilo y grupo oxetanilmetilo.

En el presente documento, "monohidroxialquilo" se refiere a un grupo en el cual un átomo de hidrógeno arbitrario en un "alquilo" definido anteriormente está sustituido con un grupo hidroxilo. El monohidroxialquilo incluye preferentemente monohidroxialquilo C1-6 y monohidroxialquilo C2-6. De manera específica, el monohidroxialquilo incluye, por ejemplo, grupo hidroximetilo, grupo 1-hidroxietilo y grupo 2-hidroxietilo.

En el presente documento, "dihidroxialquilo" se refiere a un grupo en el cual dos átomos de hidrógeno arbitrarios en un "alquilo" definido anteriormente están sustituidos con dos grupos hidroxilo. El dihidroxialquilo incluye preferentemente dihidroxialquilo C1-6 y dihidroxialquilo C2-6. De manera específica, el dihidroxialquilo incluye, por ejemplo, grupo 1,2-dihidroxietilo, grupo 1,2-dihidroxipropilo y grupo 1,3-dihidroxipropilo.

En el presente documento, "trihidroxialquilo" se refiere a un grupo en el cual tres átomos de hidrógeno arbitrarios en un "alquilo" definido anteriormente están sustituidos con tres grupos hidroxilo. El trihidroxialquilo incluye preferentemente trihidroxialquilo C1-6 y trihidroxialquilo C2-6.

En el presente documento, "alcoxialquilo" se refiere a un grupo en el cual un átomo de hidrógeno arbitrario en un "alquilo" definido anteriormente está sustituido con u "alcoxi" definido anteriormente. El alcoxialquilo incluye preferentemente alcoxi C1-3alquilo C1-4 y alcoxi C1-3alquilo C2-4. De manera específica, el alcoxialquilo incluye, por ejemplo, metoxietilo.

En el presente documento, "alcoxialcoxialquilo" se refiere a un grupo en el cual un átomo de hidrógeno arbitrario en el alquilo terminal de un "alcoxialquilo" definido anteriormente está sustituido con un "alcoxi" definido anteriormente. El alcoxialcoxialquilo incluye preferentemente alcoxi C1-3 alcoxi C1-4alquilo C1-4 y alcoxi C1-3alcoxi C2-4alquilo C2-4.

En el presente documento, "aminoalquilo" se refiere a un grupo en el cual un átomo de hidrógeno arbitrario en un "alquilo" definido anteriormente está sustituido con un grupo amino. El grupo aminoalquilo incluye preferentemente aminoalquilo C1-4 y aminoalquilo C2-4.

En el presente documento, "alquilamino" se refiere a un grupo amino unido con un "alquilo" definido anteriormente. El alquilamino incluye preferentemente alquilamino C1-4.

En el presente documento, "dialquilamino" se refiere a un grupo amino unido con dos "alquilos" definidos anteriormente. Los dos grupos alquilo pueden ser los mismos o diferentes. El dialquilamino incluye preferentemente di(alquil C1-4)amino.

En el presente documento, "alquilaminoalquilo" se refiere a un grupo en el cual un átomo de hidrógeno arbitrario en un "alquilo" definido anteriormente está sustituido con un "alquilamino" definido anteriormente. El alquilaminoalquilo incluye preferentemente alquilamino C1-4 alquilo C1-4 y alquilamino C1-4alquilo C2-4.

En el presente documento, "dialquilaminoalquilo" se refiere a un grupo en el cual un átomo de hidrógeno arbitrario en un "alquilo" definido anteriormente está sustituido con un "dialquilamino" definido anteriormente. El dialquilaminoalquilo incluye preferentemente di(alquil C1-4)amino alquilo C1-4 y di(alquil C1-4)amino alquilo C2-4.

En el presente documento, "heterociclilamino" se refiere a un grupo amino unido con un "heterociclilo" definido anteriormente. El heterociclilamino incluye preferentemente heterociclilamino de 3 a 10 miembros.

En el presente documento, "cianoalquilo" se refiere a un grupo en el cual un átomo de hidrógeno arbitrario en un "alquilo" definido anteriormente está sustituido con un grupo ciano. El cianoalquilo incluye preferentemente ciano(alquilo C^1-3).

En el presente documento, "alquilsulfonilo" se refiere a un grupo sulfonilo unido con un "alquilo" definido anteriormente (es decir alquil-SO²-). El alquilsulfonilo incluye preferentemente alquilsulfonilo C^1-3. De manera específica, el alquilsulfonilo incluye metilsulfonilo, etilsulfonilo, n-propilsulfonilo e i-propilsulfonilo.

En el presente documento, "alquilsulfonilalquilo" se refiere a un grupo en el cual un átomo de hidrógeno arbitrario en un "alquilo" definido anteriormente está sustituido con un "alquilsulfonilo" definido anteriormente. El alquilsulfonilalquilo incluye preferentemente alquilsulfonil C^1-3alquilo C^1-4y alquilsulfonil C^1-3alquilo C^2-4.

Preferentemente, los compuestos representados por la fórmula (I) mostrada anteriormente son como sigue a continuación:

R¹mostrado anteriormente, representa preferentemente hidrógeno, hidroxi, halógeno, ciano, nitro, haloalquilo C^1-4, alquilo C^1-6, alquenilo C^2-6, alquinilo C^2-6, cicloalquilo C^3-7, aril C^6-10alquilo C^1-4, -OR⁵,-NP⁶R⁷, -(CR⁸R^g)ⁿZ¹, -C(O)NR¹²R¹³, -SR¹⁴, -SOR¹⁵, -SO²R¹⁶, -NR¹⁷SO²R¹⁸, COOH, arilo C^6-10que está opcionalmente sustituido con uno o más grupos seleccionados independientemente entre el grupo P, heteroarilo de 5 a 10 miembros o heterociclilo de 3 a 10 miembros cada uno de los cuales está opcionalmente sustituido con uno o más grupos seleccionados independientemente entre el grupo Q, -COR¹⁹, -COOR²⁰,-OC(O)R²¹, -NR²²C(O)R²³, -NR²⁴C(S)R²⁵, -C(S)NR²⁶R²⁷, -SO²NR²⁸R²⁹, -OSO²R³⁰, -SO³R³¹o -Si(R³²)³.

R¹mostrado anteriormente, representa más preferentemente hidrógeno, hidroxi, halógeno, ciano, haloalquilo C^1-4, alquilo C^1-6, alquinilo C^2-6, cicloalquilo C^3-7, aril C^6-10alquilo C^1-4, -OR⁵, -NR⁶R⁷, -(CR⁸R⁹)ⁿZ¹, -C(O)NR¹²R¹³, -SR¹⁴, -SO²R¹⁶, -NR¹⁷SO²R¹⁸, COOH, arilo C^6-10el cual está opcionalmente sustituido con uno o más grupos seleccionados independientemente entre el grupo P, o heteroarilo de 5 a 10 miembros o heterociclilo de o 3 a 10 miembros cada uno de los cuales está opcionalmente sustituido con uno o más grupos seleccionados independientemente entre el grupo Q. De manera específica, el anterior heteroarilo de 5 a 10 miembros es de manera particular, preferentemente un grupo imidazolilo, grupo tienilo, grupo piridilo, grupo piridazinilo o grupo pirazolilo. El anterior heterociclilo de 3 a 10 miembros es de manera particular, preferentemente un grupo morfolinilo, grupo tetrahidropiridilo o grupo piperidinilo.

R²mostrado anteriormente, representa preferentemente hidrógeno, hidroxi, halógeno, ciano, nitro, haloalquilo C^1-4, alquilo C^1-6, alquenilo C^2-6, alquinilo C^2-6, cicloalquilo C^3-7, aril C^6-10alquilo C^1-4, -OR⁵, -NR⁶R⁷, -(CR⁸R⁹)ⁿZ¹, -C(O)NR¹²R¹³, -SR¹⁴, -SOR¹⁵, -SO²R¹⁶, -NR¹⁷SO²R¹⁸, COOH, arilo C^6-10que está opcionalmente sustituido con uno o más grupos seleccionados independientemente entre el grupo P, heteroarilo de 5 a 10 miembros o heterociclilo de 3 a 10 miembros cada uno de los cuales está opcionalmente sustituido con uno o más grupos seleccionados independientemente entre el grupo Q, -COR¹⁹, -COOR²⁰,-OC(O)R²¹, -NR²²C(O)R²³, -NR²⁴C(S)R²⁵, -C(S)NR²⁶R²⁷, -SO²NR²⁸R²⁹, -OSO²R³⁰, -SO³R³¹o -Si(R³²)³.

R²mostrado anteriormente, representa más preferentemente hidrógeno, halógeno, haloalquilo C^1-4, alquilo C^1-6, -OR⁵, arilo C^6-10el cual está opcionalmente sustituido con uno o más grupos seleccionados independientemente entre el grupo P, o heteroarilo de 5 a 10 miembros que está opcionalmente sustituido con uno o más grupos seleccionados independientemente entre el grupo Q. De manera específica, este heteroarilo de 5 a 10 miembros es de manera particular, preferentemente un grupo piridilo.

R¹y R²mostrados anteriormente se pueden tomar preferentemente junto con los átomos a los que están unidos para formar heterociclilo de 3 a 10 miembros o heteroarilo de 5 a 10 miembros. El heterociclilo o heteroarilo pueden tener un átomo de halógeno como sustituyente. De manera específica, el heterociclilo de 3 a 10 miembros formado junto con los átomos a los cuales R¹y R²están unidos, es de manera particular, preferentemente un grupo dioxolanilo o grupo dioxanilo.

R³mostrado anteriormente, representa preferentemente hidrógeno, alquilo C^1-5, aril C^6-10alquilo C^1-6o haloalquilo C^1-4, más preferentemente hidrógeno, alquilo C^1-4, aril C^6-10alquilo C^1-4o perfluoroalquilo C^1-3y de manera particular, preferentemente alquilo C¹.

R⁴mostrado anteriormente, representa preferentemente hidrógeno, halógeno, alquilo C^1-3, haloalquilo C^1-4, hidroxi, ciano, nitro, alcoxi C^1-4, -(CH²)ⁿZ¹, -NR⁶R⁷, -OR⁵, -C(O)NR¹²R¹³, -SR¹⁴, -SOR¹⁵,-SO²R¹⁶, NR¹⁷SO²R¹⁸, COOH, -COR¹⁹, -COOR²⁰, -OC(O)R²¹, -NR²²C(O)R²³, -NR²⁴C(S)R²⁵, -C(S)NR²⁶R²⁷, -SO²NR²⁸R²⁹, -OSO²R³⁰-SO³R³¹o -Si(R³²)³.

R⁴mostrado anteriormente, representa más preferentemente hidrógeno, halógeno, alquilo C^1-3, perfluoroalquilo C^1-3, ciano, metanosulfonilo, hidroxilo, alcoxi o amino, y de manera particular, preferentemente hidrógeno o halógeno. El anillo A mencionado anteriormente es preferentemente un anillo heteroarilo de 5 a 10 miembros o un anillo arilo C^6-10, más preferentemente benceno, indol, azaindol, benzofurano, benzotiofeno, benzotiazol, quinolina o pirrol, y de manera particular, preferentemente indol o pirrol.

R⁵mostrado anteriormente representa preferentemente alquilo C^1-5, cicloalquilo C^3-7, cicloalquil C^3-7alquilo C^1-3, alquenilo C^2-6, alquinilo C^2-6, haloalquilo C^1-4, alcoxi C^1-3alquilo C^1-4, alcoxi C^1-3alcoxi C^1-4alquilo C^1-4, aminoalquilo C^1-4, alquilamino C^1-4alquilo C^1-4, di(alquil C^1-4)amino alquilo C^1-4, arilo C^6-10, aril C^6-10alquilo C^1-3o heterociclilalquilo C^1-3de 3 a 10 miembros, heterociclilo de 3 a 10 miembros, heteroarilo de 5 a 10 miembros o heteroarilalquilo C^1-3 de 5 a 10 miembros, cada uno de los cuales está opcionalmente sustituido con uno o más grupos seleccionados independientemente entre el grupo Q, monohidroxialquilo C^1-6, dihidroxialquilo C^1-6o trihidroxialquilo C^1-6.

R⁵mostrado anteriormente representa más preferentemente alquilo C^1-5, cicloalquil C^3-7alquilo C^1-3, haloalquilo C^1-4, alcoxi C^1-3alquilo C^1-4, arilo C^6-10, aril C^6-10alquilo C^1-3, o heterociclilalquilo C^1-3de 3 a 10 miembros o heterociclilo de 3 a 10 miembros cada uno de los cuales está opcionalmente sustituido con uno o más grupos seleccionados independientemente entre el grupo Q. De manera específica, el anterior heterociclilalquilo de 3 a 10 miembros es de manera particular, preferentemente un grupo piperaziniletilo, grupo oxetanilmetilo o grupo morfoliniletilo. El anterior heterociclilo de 3 a 10 miembros es de manera particular, preferentemente un grupo oxetanilo o grupo tetrahidropiranilo.

R⁶y R⁷mostrados anteriormente pueden ser iguales o diferentes, y cada uno preferentemente representa hidrógeno, alquilo C^1-4, alquenilo C^2-6, alquinilo C^2-6, haloalquilo C^1-4, alcoxi C^1-3alquilo C^2-4, aril C^6-10alquilo C^1-3, heterociclilalquilo C^1-3de 3 a 10 miembros, heteroarilalquilo C^1-3de 5 a 10 miembros, monohidroxialquilo C^1-6, dihidroxialquilo C^1-6, trihidroxialquilo C^1-6, heterociclilo de 3 a 10 miembros, aldehído C^1-4, alquilamino C^1-4alquilo C^1-4, di(alquil C^1-4)amino alquilo C^1-4o ciano(alquilo C^1-3).

R⁶y R⁷mostrados anteriormente representan más preferentemente, cada uno independientemente hidrógeno, alcoxi C^1-3alquilo C^1-4, heterociclilalquilo C^1-3de 3 a 10 miembros, heteroarilalquilo C^1-3de 5 a 10 miembros o dihidroxialquilo C^1-6. De manera específica, el heterociclilalquilo de 3 a 10 miembros es de manera particular, preferentemente un grupo morfoliniletilo y el heteroarilalquilo de 5 a 10 miembros es de manera particular, preferentemente un grupo piridiletilo.

Como alternativa, R⁶y R⁷mostrados anteriormente se pueden tomar preferentemente junto con los átomos de nitrógeno a los que están unidos para formar heterociclilo de 3 a 10 miembros o heteroarilo de 5 a 10 miembros.

"n" mostrado anteriormente representa un número entero de 1 a 3. Preferentemente, n es 1.

R⁸y R⁹mostrados anteriormente, de manera preferente, pueden ser iguales o diferentes, y cada uno representa hidrógeno, alquilo C^1-4o halógeno y más preferentemente hidrógeno.

Como alternativa, R⁸y R⁹mostrados anteriormente se pueden tomar preferentemente junto con los átomos de carbono a los que están unidos para formar un anillo alicíclico.

Z¹mostrado anteriormente, de manera preferente, representa hidrógeno, NR¹⁰R¹¹, -OH o heterociclilo de 3 a 10 miembros o heteroarilo de 5 a 10 miembros cada uno de los cuales está opcionalmente sustituido con uno o más grupos seleccionados independientemente entre el grupo Q, más preferentemente NR¹⁰R¹¹u -OH, o heterociclilo de 3 a 10 miembros que está opcionalmente sustituido con uno o más grupos seleccionados independientemente entre el grupo Q. De manera específica, el anterior heterociclilo de 3 a 10 miembros es de manera particular, preferentemente un grupo pirrolidinilo, grupo piperazinilo, grupo piperidinilo o grupo morfolinilo.

R¹⁰y R¹¹mostrados anteriormente, de manera preferente, pueden ser iguales o diferentes, y cada uno representa preferentemente alquilo C^1-4, alquenilo C^2-6, alquinilo C^2-6, haloalquilo C^1-4, alcoxi C^1-3alquilo C^1-4, ciano(alquilo C^1-3) o alquilsulfonil C^1-3alquilo C^1-4, más preferentemente alquilo C^1-4, alquinilo C^2-6o alcoxi C^1-3alquilo C^2-4.

Como alternativa, R¹⁰y R¹¹mostrados anteriormente se pueden tomar preferentemente junto con los átomos de nitrógeno a los que están unidos para formar heterociclilo de 3 a 10 miembros o heteroarilo de 5 a 10 miembros.

R¹²y R¹³mostrados anteriormente, de manera preferente, pueden ser iguales o diferentes, y cada uno representa hidrógeno, alquilo C^1-4, alquenilo C^2-6, alquinilo C^2-6, haloalquilo C^1-4, alcoxi C^1-3alquilo C^1-4, arilo C^6-10, heteroarilo de 5 a 10 miembros, heterociclilo de 3 a 10 miembros, aril C^6-10alquilo C^1-4, heterociclilalquilo C^1-3de 3 a 10 miembros, heteroarilalquilo C^1-3de 5 a 10 miembros, ciano(alquilo C^1-3), alquilsulfonil C^1-3alquilo C^1-4o anillo alicíclico de 3 a 10 miembros, más preferentemente hidrógeno, alquilo C^1-4o haloalquilo C^1-4.

Como alternativa, R¹²y R¹³mostrados anteriormente, preferentemente pueden tomarse junto con los átomos de nitrógeno a los que están unidos para formar heterociclilo de 3 a 10 miembros o heteroarilo de 5 a 10 miembros, cada uno de los cuales está opcionalmente sustituido con uno o más grupos seleccionados independientemente del grupo Q, y de manera particular, preferentemente heterociclilalquilo de 3 a 10 miembros. De manera específica, son más preferidos el grupo piperazinilo, grupo morfolinilo, grupo pirrolidinilo y el grupo piperidinilo.

R¹⁴mostrado anteriormente representa preferentemente alquilo C^1-4, alquenilo C^2-6, alquinilo C^2-6, haloalquilo C^1-4, arilo C^6-10que está opcionalmente sustituido con uno o más grupos seleccionados independientemente entre el grupo P, o heteroarilo de 5 a 10 miembros o heterociclilo de 3 a 10 miembros cada uno de los cuales está opcionalmente sustituido con uno o más grupos seleccionados independientemente entre el grupo Q y más preferentemente representa alquilo C^1-4o haloalquilo C^1-4.

R¹⁵mostrado anteriormente representa preferentemente alquilo C^1-4, alquenilo C^2-6, alquinilo C^2-6, haloalquilo C^1-4, arilo C^6-10que está opcionalmente sustituido con uno o más grupos seleccionados independientemente entre el grupo P, o heteroarilo de 5 a 10 miembros heteroarilo o heterociclilo de 3 a 10 miembros cada uno de los cuales está opcionalmente sustituido con uno o más grupos seleccionados independientemente entre el grupo Q.

R^{i 6}mostrado anteriormente representa preferentemente alquilo C^1-4, alquenilo C^2-6, alquinilo C^2-6, haloalquilo C^1-4, arilo C^6-10que está opcionalmente sustituido con uno o más grupos seleccionados independientemente entre el grupo P, o heteroarilo de 5 a 10 miembros o heterociclilo de 3 a 10 miembros cada uno de los cuales está opcionalmente sustituido con uno o más grupos seleccionados independientemente entre el grupo Q y más preferentemente representa alquilo C^1-4.

R¹⁷mostrado anteriormente, de manera preferente, representa hidrógeno o alquilo C^1-4y más preferentemente hidrógeno.

R¹⁸mostrado anteriormente representa preferentemente alquilo C^1-4, alquenilo C^2-6, alquinilo C^2-6, haloalquilo C^1-4, arilo C^6-10que está opcionalmente sustituido con uno o más grupos seleccionados independientemente entre el grupo P, o heteroarilo de 5 a 10 miembros o heterociclilo de 3 a 10 miembros cada uno de los cuales está opcionalmente sustituido con uno o más grupos seleccionados independientemente entre el grupo Q y más preferentemente representa alquilo C^1-4.

R¹⁹mostrado anteriormente, representa preferentemente hidrógeno, alquilo C^1-4, cicloalquilo C^3-7, haloalquilo C^1-4, arilo C^6-10, o heteroarilo de 5 a 10 miembros o heterociclilo de 3 a 10 miembros cada uno de los cuales está opcionalmente sustituido con uno o más grupos seleccionados independientemente entre el grupo Q, y más preferentemente representa hidrógeno, o heteroarilo de 5 a 10 miembros o heterociclilo de 3 a 10 miembros cada uno de los cuales está opcionalmente sustituido con uno o más grupos seleccionados independientemente entre el grupo Q. De manera específica, este heterociclilo de 3 a 10 miembros es más preferentemente un grupo piperazinilo, grupo morfolinilo, grupo pirrolidinilo o grupo piperidinilo.

R²⁰mostrado anteriormente representa preferentemente alquilo C^1-4, cicloalquilo C^3-7, haloalquilo C^1-4, arilo C^6-10, heteroarilo de 5 a 10 miembros o heterociclilo de 3 a 10 miembros.

R²¹mostrado anteriormente representa preferentemente alquilo C^1-4, cicloalquilo C^3-7, haloalquilo C^1-4, arilo C^6-10, heteroarilo de 5 a 10 miembros o heterociclilo de 3 a 10 miembros.

R²²mostrado anteriormente, representa preferentemente hidrógeno, alquilo C^1-4o haloalquilo C^1-4.

R²³mostrado anteriormente, representa preferentemente hidrógeno, alquilo C^1-4, cicloalquilo C^3-7, haloalquilo C^1-4, arilo C^6-10, heteroarilo de 5 a 10 miembros o heterociclilo de 3 a 10 miembros.

R²⁴mostrado anteriormente, representa preferentemente hidrógeno, alquilo C^1-4o haloalquilo C^1-4.

R²⁵mostrado anteriormente representa preferentemente alquilo C^1-4, cicloalquilo C^3-7, haloalquilo C^1-4, arilo C^6-10, heteroarilo de 5 a 10 miembros o heterociclilo de 3 a 10 miembros.

R²⁶y R²⁷mostrados anteriormente, de manera preferente, pueden ser iguales o diferentes, y cada uno representa hidrógeno, alquilo C^1-4, alquenilo C^2-6, alquinilo C^2-6, haloalquilo C^1-4, alcoxi C^1-3alquilo C^1-4, arilo C^6-10, heteroarilo de 5 a 10 miembros, heterociclilo de 3 a 10 miembros, aril C^6-10alquilo C^1-4, heterociclilalquilo C^1-3de 3 a 10 miembros, heteroarilalquilo C^1-3de 5 a 10 miembros, ciano(alquilo C^1-3), alquilsulfonil C^1-3alquilo C^1-4o un anillo alicíclico de 3 a 10 miembros.

Como alternativa, R²⁶y R²⁷mostrados anteriormente se pueden tomar preferentemente junto con los átomos de nitrógeno a los que están unidos para formar heterociclilo de 3 a 10 miembros o heteroarilo de 5 a 10 miembros. R²⁸y R²⁹mostrados anteriormente, de manera preferente, pueden ser iguales o diferentes, y cada uno representa hidrógeno, alquilo C^1-4, alquenilo C^2-6, alquinilo C^2-6, haloalquilo C^1-4, alcoxi C^1-3alquilo C^1-4, arilo C^6-10, heteroarilo de 5 a 10 miembros, heterociclilo de 3 a 10 miembros, aril C^6-10alquilo C^1-4, heterociclilalquilo C^1-3de 3 a 10 miembros, heteroarilalquilo C^1-3de 5 a 10 miembros, ciano(alquilo C^1-3), alquilsulfonil C^1-3alquilo C^1-4o un anillo alicíclico de 3 a 10 miembros.

Como alternativa, R²⁸y R²⁹mostrados anteriormente, preferentemente pueden tomarse junto con los átomos de nitrógeno a los que están unidos para formar heterociclilo de 3 a 10 miembros o heteroarilo de 5 a 10 miembros. R³⁰mostrado anteriormente representa preferentemente alquilo C^1-4, cicloalquilo C^3-7, haloalquilo C^1-4, arilo C^6-10, heteroarilo de 5 a 10 miembros o heterociclilo de 3 a 10 miembros.

R³¹mostrado anteriormente representa preferentemente alquilo C^1-4, cicloalquilo C^3-7, haloalquilo C^1-4, arilo C^6-10, heteroarilo de 5 a 10 miembros o heterociclilo de 3 a 10 miembros.

R³²mostrado anteriormente, de manera preferente representa alquilo C^1-4o arilo C^6-10.

Los sustituyentes preferidos incluidos en el grupo P definido anteriormente son halógeno, alquilo C^1-4, haloalquilo C^i-4, -OH, alcoxi C^1-3, haloalcoxi C^1-3, heterociclilamino de 3 a 10 miembros, -SO²R, -CN, -NO²y heterociclilo de 3 a 10 miembros; y más preferentemente halógeno, haloalquilo C^1-4, alcoxi C^1-3, haloalcoxi C^1-3y heterociclilo de 3 a 10 miembros. De manera específica, este heterociclilo de 3 a 10 miembros es de manera particular, preferentemente un grupo morfolinilo.

Los sustituyentes preferidos incluidos en el grupo Q definido anteriormente son halógeno, alquilo C^1-4, haloalquilo C^1-4, -OH, alcoxi C^1-3, monohidroxialquilo C^1-6, dihidroxialquilo C^1-6, trihidroxialquilo C^1-6, heterociclilamino de 3 a 10 miembros, -SO²R, -CN, -NO², cicloalquilo C³-⁷, -COR¹⁹y heterociclilo de 3 a 10 miembros que está opcionalmente sustituido con alquilo C^1-4; y más preferentemente halógeno, alquilo C^1-4, haloalquilo C^1-4, -OH, alcoxi C^1-3, monohidroxialquilo C^1-6, -SO²R¹⁶, cicloalquilo C³-⁷, -COR¹⁹y heterociclilo de 3 a 10 miembros que está opcionalmente sustituido con alquilo C^1-4. De manera específica, este heterociclilo de 3 a 10 miembros es más preferentemente un grupo piperazinilo, grupo piperidinilo o grupo morfolinilo.

Los ejemplos específicos de los compuestos incluyen:

(1) [5-amino-1-(2-metil-1H-benzoimidazol-5-il)-1H-pirazol-4-il]-(1H-indol-2-il)-metanona;

(2) [5-amino-1-(2-metil-1H-benzoimidazol-5-il)-1H-pirazol-4-il]-(6-pirrolidin-1-ilmetil-1H-indol-2-il)-metanona;

(3) [5-amino-1-(2-metil-1H-benzoimidazol-5-il)-1H-pirazol-4-il]-[6-(4-hidroxi-piperidin-1-ilmetil)-1H-indol-2-il]-metanona;

(4) [5-amino-1-(2-metil-1H-benzoimidazol-5-il)-1H-pirazol-4-il]-(1H-pirrolo[3,2-c]piridin-2-il)-metanona;

(5) [5-amino-1-(2-metil-1H-benzoimidazol-5-il)-1H-pirazol-4-il]-(6-piperazin-1-ilmetil-1H-indol-2-il)-metanona; (6) [5-amino-1-(2-metil-1H-benzoimidazol-5-il)-1H-pirazol-4-il]-[6-(2-morfolin-4-il-etoxi)-1H-indol-2-il]-metanona; (7) [5-amino-1-(2-metil-1H-benzoimidazol-5-il)-1H-pirazol-4-il]-[6-(tetrahidro-piran-4-iloxi)-1H-indol-2-il]-metanona; (8) [5-amino-1-(2-metil-1H-benzoimidazol-5-il)-1H-pirazol-4-il]-(4-cloro-1H-indol-2-il)-metanona;

(9) [5-amino-1-(2-metil-1H-benzoimidazol-5-il)-1H-pirazol-4-il]-(5-bromo-1H-indol-2-il)-metanona;

(10) [5-amino-1-(2-metil-1H-benzoimidazol-5-il)-1H-pirazol-4-il]-(4-yodo-1H-indol-2-il)-metanona;

(11) 2-[5-amino-1-(2-metil-1H-benzoimidazol-5-il)-1 H-pirazol-4-carbonil]-1 H-indolo-5-carbonitrilo;

(12) [5-amino-1-(2-metil-1H-benzoimidazol-5-il)-1H-pirazo1-4-il]-(6-bromo-5-fluoro-1H-indol-2-il)-metanona;

(13) [5-amino-1-(2-metil-1H-benzoimidazol-5-il)-1H-pirazo1-4-il]-(5-etinil-1H-indol-2-il)-metanona;

(14) [5-amino-1-(2-metil-1H-benzoimidazol-5-il)-1H-pirazol-4-il]-[6-(2-fluoro-fenil)-1H-indol-2-il]-metanona;

(15) [5-amino-1-(2-metil-1H-benzoimidazol-5-il)-1H-pirazol-4-il]-[6-(3-fluoro-fenil)-1H-indol-2-il]-metanona;

(16) [5-amino-1-(2-metil-1H-benzoimidazol-5-il)-1H-pirazol-4-il]-[6-(4-fluoro-fenil)-1H-indol-2-il]-metanona;

(17) [5 -amino-1-(2-metil-1H-benzoimidazol-5-il)-1H-pirazol-4-il]-[6-(2-cloro-fenil)-1H-indol-2-il]-metanona;

(18) [5-amino-1-(2-metil-1H-benzoimidazol-5-il)-1H-pirazol-4-il]-[6-(3-cloro-fenil)-1H-indol-2-il]-metanona;

(19) [5 -amino-1-(2-metil-1H-benzoimidazol-5-il)-1H-pirazol-4-il]-[6-(4-cloro-fenil)-1H-indol-2-il]-metanona;

(20) [5-amino-1-(2-metil-1H-benzoimidazol-5-il)-1H-pirazol-4-il]-[6-(2-trifluorometil-fenil)-1H-indol-2-il]-metanona; (21) [5-amino-1-(2-metil-1H-benzoimidazol-5-il)-1H-pirazol-4-il]-[6-(3-trifluorometil-fenil)-1H-indol-2-il]-metanona; (22) [5-amino-1-(2-metil-1H-benzoimidazol-5-il)-1H-pirazol-4-il]-[6-(4-trifluorometil-fenil)-1H-indol-2-il]-metanona; (23) [5-amino-1-(2-metil-1H-benzoimidazol-5-il)-1H-pirazol-4-il]-(4-bromo-1H-indol-2-il)-metanona;

(24) [5-amino-1-(2-metil-1H-benzoimidazol-5-il)-1H-pirazol-4-il]-[6-(3-fluoro-piridin-2-il)-1H-indol-2-il]-metanona; (25) [5-amino-1-(2-metil-1H-benzoimidazol-5-il)-1H-pirazol-4-il]-(6-metil-1H-indol-2-il)-metanona;

(26) [5-amino-1-(2-metil-1H-benzoimidazol-5-il)-1H-pirazol-4-il]-[5-(4,4-difluoro-piperidin-1-carbonil)-1H-indol-2-il]-metanona;

(27) [5-amino-1-(2-metil-1H-benzoimidazol-5-il)-1H-pirazol-4-il]-[5-(3,3-difluoro-piperidin-1-carbonil)-1H-indol-2-il]-metanona;

(28) (2,2,2-trifluoro-etil)-amida del ácido 2-[5-amino-1-(2-metil-1H-benzoimidazol-5-il)-1H-pirazo-le-4-carbonil]-1H-indolo-5-carboxílico;

(29) [5-amino-1-(2-metil-1H-benzoimidazol-5-il)-1H-pirazol-4-il]-[6-(5-trifluorometil-piridin-2-il)-1 H-indol-2-il]-metanona;

(30) [5-amino-1-(2-metil-1H-benzoimidazol-5-il)-1H-pirazol-4-il]-[6-(6-trifluorometil-piridin-2-il)-1H-indo1-2-il]-metanona;

(31) [5-amino-1-(2-metil-1H-benzoimidazol-5-il)-1H-pirazol-4-il]-[6-(5-cloro-piridin-2-il)-1H-indol-2-il]-metanona; (32) [5-amino-1-(2-metil-1H-benzoimidazol-5-il)-1H-pirazol-4-il]-[6-(4-metil-piridin-2-il)-1H-indol-2-il]metanona; (33) [5-amino-1-(2-metil-1H-benzoimidazol-5-il)-1H-pirazol-4-il]-[6-(3-cloro-4-fluoro-fenil)-1H-indol-2-il]-metanona; (34) [5-amino-1-(2-metil-1H-benzoimidazol-5-il)-1H-pirazol-4-il]-[6-(3-trifluorometil-piridin-2-il)-1 H-indol-2-il]-metanona;

(35) [5-amino-1-(2-metil-1H-benzoimidazol-5-il)-1H-pirazol-4-il]-[6-(4-trifluorometil-piridin-2-il)-1 H-indol-2-il] metanona;

(36) [5-amino-1-(6-fluoro-2-metil-1H-benzoimidazol-5-il)-1H-pirazol-4-il]-(1H-indol-2-il)-metanona;

(37) ácido 2-[5-amino-1-(2-metil-1H-benzoimidazol-5-il)-1H-pirazol-4-carbonil]-1H-indolo-6-carboxílico;

(38) [5-amino-1-(2-metil-1H-benzoimidazol-5-il)-1H-pirazol-4-il]-(6-hidroximetil-1H-indol-2-il)-metanona;

(39) [5-amino-1-(2-metil-1H-benzoimidazol-5-il)-1H-pirazol-4-il]-{6-[2-(4-metil-piperazin-1-il)-etoxi]-1H-indol-2-il}-metanona;

(40) [5-amino-1-(2-metil-1H-benzoimidazol-5-il)-1H-pirazol-4-il]-[6-(3-metil-oxetan-3-ilmetoxi)-1H-indol-2-il] metanona;

(41) [5-amino-1-(2-metil-1H-benzoimidazol-5-il)-1H-pirazol-4-il]-[6-(3-fluoro-piperidin-1-ilmetil)-1H-indol-2-il]-metanona;

(42) [5-amino-1-(2-metil-1H-benzoimidazol-5-il)-1H-pirazol-4-il]-(6-{[bis(2-metoxi-etil)-amino]-metil}-1H-indol-2-il)-metanona;

(43) [5-amino-1-(2-metil-1H-benzoimidazol-5-il)-1H-pirazol-4-il]-{6-[(metil-prop-2-inil-amino)-metil]-1H-indol-2-il}-metanona;

(44) [5-amino-1-(2-metil-1H-benzoimidazol-5-il)-1H-pirazol-4-il]-[6-(3,3-difluoro-pirrolidin-1-ilmetil)-1H-indol-2-il]-metanona;

(45) [5-amino-1-(2-metil-1H-benzoimidazol-5-il)-1H-pirazol-4-il]-[6-(2,5-dimetil-pirrolidin-1-ilmetil)-1H-indol-2-il]-metanona;

(46) [5-amino-1-(2-metil-1H-benzoimidazol-5-il)-1H-pirazol-4-il]-[6-(3,3-difluoro-piperidin-1-ilmetil)-1H-indol-2-il]-metanona;

(47) [5-amino-1-(2-metil-1H-benzoimidazol-5-il)-1H-pirazol-4-il]-[6-((S)-3-metil-morfolin-4-ilmetil)-1H-indol-2-il]-metanona;

(48) [5-amino-1-(2-metil-1H-benzoimidazol-5-il)-1H-pirazol-4-il]-(6-bromo-1H-indol-2-il)-metanona;

(49) [5-amino-1-(2-metil-1H-benzoimidazol-5-il)-1H-pirazol-4-il]-(5-yodo-1H-indo1-2-il)-metanona;

(50) [5-amino-1-(2-metil-1H-benzoimidazol-5-il)-1H-pirazol-4-il]-(1H-pirrolo[3,2-b]piridin-2-il)-metanona;

(51) [5-amino-1-(2-metil-1H-benzoimidazol-5-il)-1H-pirazol-4-il]-(5-bromo-6-trifluorometil-1H-indol-2-il)-metanona; (52) [5-amino-1-(2-metil-1H-benzoimidazol-5-il)-1H-pirazol-4-il]-(6-yodo-1H-indol-2-il)-metanona;

(53) [5-amino-1-(2-metil-1H-benzoimidazol-5-il)-1H-pirazol-4-il]-(4-metil-1H-indo1-2-il)-metanona;

(54) [5-amino-1-(2-metil-1H-benzoimidazol-5-il)-1H-pirazol-4-il]-(4-isopropil-1H-indol-2-il)-metanona;

(55) [5-amino-1-(2-metil-1H-benzoimidazol-5-il)-1H-pirazol-4-il]-[5-(2-fluoro-fenil)-1H-indol-2-il]-metanona;

(56) [5-amino-1-(2-metil-1H-benzoimidazol-5-il)-1H-pirazol-4-il]-(5-bencil-1H-indol-2-il)-metanona;

(57) [5-amino-1-(2-metil-1H-benzoimidazol-5-il)-1H-pirazol-4-il]-[5-(2-trifluorometil-fenil)-1H-indol-2-il]-metanona; (58) [5-amino-1-(2-metil-1H-benzoimidazol-5-il)-1H-pirazol-4-il]-[5-(3-fluorofenil)-1H-indol-2-il]-metanona;

(59) [5-amino-1-(2-metil-1H-benzoimidazol-5-il)-1H-pirazol-4-il]-[5-(3-trifluorometil-fenil)-1H-indol-2-il]-metanona; (60) [5-amino-1-(2-metil-1H-benzoimidazol-5-il)-1H-pirazol-4-il]-(4-etinil-1H-indol-2-il)-metanona;

(61) [5-amino-1-(2-metil-1H-benzoimidazol-5-il)-1H-pirazol-4-il]-(5H-[1,3]dioxolo[4,5-f]indol-6-il)-metanona;

(62) [5-amino-1-(7-fluoro-2-metil-1H-benzoimidazol-5-il)-1H-pirazol-4-il]-(1H-indol-2-il)-metanona;

(63) [5-amino-1-(2-metil-1H-benzoimidazol-5-il)-1H-pirazol-4-il]-[5-(4-trifluorometil-fenil)-1H-indol-2-il]-metanona; (64) [5-amino-1-(2-metil-1H-benzoimidazol-5-il)-1H-pirazol-4-il]-(5-butoxi-1H-indol-2-il)-metanona;

(65) [5-amino-1-(2-metil-1H-benzoimidazol-5-il)-1H-pirazol-4-il]-[5-(1-metil-piperidin-4-il)-1H-indol-2-il] metanona; (66) N-{2-[5-amino-1-(2-metil-1H-benzoimidazol-5-il)-1H-pirazol-4-carbonil]-1H-indo1-6-il}-metanosulfonamida; (67) [5-amino-1-(2-metil-1H-benzoimidazol-5-il)-1H-pirazol-4-il]-[6-(6-morfolin-4-il-piridin-3-il)-1 H-indol-2-il]-metanona;

(68) [5-amino-1-(2-metil-1H-benzoimidazol-5-il)-1H-pirazol-4-il]-(6-butil-1H-indol-2-il)-metanona;

(69) [5-amino-1-(2-metil-1H-benzoimidazol-5-il)-1H-pirazol-4-il]-[6-(1-metil-1H-pirazol-4-il)-1H-indol-2-il]-metanona; (70) [5-amino-1-(2-metil-1H-benzoimidazol-5-il)-1H-pirazol-4-il]-[6-(5-metoxi-piridin-3-il)-1H-indol-2-il]-metanona; (71) [5-amino-1-(2-metil-1H-benzoimidazol-5-il)-1H-pirazol-4-il]-[6-(2-metoxi-piridin-3-il)-1H-indol-2-il]-metanona; (72) [5-amino-1-(2-metil-1H-benzoimidazol-5-il)-1H-pirazol-4-il]-(6-cidopropil-1H-indol-2-il)-metanona;

(73) [5-amino-1-(2-metil-1H-benzoimidazol-5-il)-1H-pirazol-4-il]-[6-(2-metoxi-fenil)-1H-indol-2-il]-metanona;

(74) [5-amino-1-(2-metil-1H-benzoimidazol-5-il)-1H-pirazol-4-il]-(6-fenil-1H-indol-2-il)-metanona;

(75) [5-amino-1-(2-metil-1H-benzoimidazol-5-il)-1 H-pirazol-4-il]-[6-(5-metanosulfonil-piridin-3-il)-1 H-indol-2-il]-metanona;

(76) [5-amino-1-(2-metil-1H-benzoimidazol-5-il)-1H-pirazol-4-il]-(6-isopropil-1H-indol-2-il)-metanona;

(77) [5-amino-1-(2-metil-1H-benzoimidazol-5-il)-1H-pirazol-4-il]-(6-piridin-2-il-1H-indol-2-il)-metanona;

(78) [5-amino-1-(2-metil-1H-benzoimidazol-5-il)-1H-pirazol-4-il]-(5-cidopropil-1H-indol-2-il)-metanona;

(79) [5-amino-1-(2-metil-1H-benzoimidazol-5-il)-1H-pirazol-4-il]-(6-piridazin-3-il-1H-indol-2-il)-metanona;

(80) [5-amino-1-(2-metil-1H-benzoimidazol-5-il)-1H-pirazol-4-il]-(5-isopropoxi-1H-indol-2-il)-metanona;

(81) [5-amino-1-(2-metil-1H-benzoimidazol-5-il)-1H-pirazol-4-il]-[5-(2-metoxi-etoxi)-1H-indol-2-il]-metanona;

(82) [5-amino-1-(2-metil-1H-benzoimidazo1-5-il)-1H-pirazol-4-il]-(5-cidopropilmetoxi-1H-indol-2-il)-metanona; (83) [5-amino-1-(2-metil-1H-benzoimidazol-5-il)-1H-pirazol-4-il]-(2,2-difluoro-5H-[1,3]dioxolo[4,5-f]indol-6- il)-metanona;

(84) [5-amino-1-(2-metil-1H-benzoimidazol-5-il)-1H-pirazol-4-il]-[6-(3-doro-piridin-2-il)-1H-indol-2-il]-metanona; (85) [5-amino-1-(2-metil-1H-benzoimidazol-5-il)-1H-pirazol-4-il]-[6-(5-fluoro-piridin-2-il)-1H-indol-2-il]-metanona; (86) [5-amino-1-(2-metil-1H-benzoimidazol-5-il)-1H-pirazol-4-il]-[6-(6-morfolin-4-il-piridazin-3-il)-1H-indol-2-il]-metanona;

(87) [5-amino-1-(2-metil-1H-benzoimidazol-5-il)-1H-pirazol-4-il]-(5-cloro-6-ciclopropilmetoxi-1H-indol-2- il)-metanona;

(88) [5-amino-1-(2-metil-1H-benzoimidazol-5-il)-1H-pirazol-4-il]-[6-(2,4-difluoro-fenil)-1H-indol-2-il]-metanona; (89) [5-amino-1-(2-metil-1H-benzoimidazol-5-il)-1H-pirazol-4-il]-(6-piridazin-4-il-1H-indol-2-il)-metanona;

(90) [5-amino-1-(2-metil-1H-benzoimidazol-5-il)-1H-pirazol-4-il]-(3-fluoro-1H-indol-2-il)-metanona;

(91) [5-amino-1-(2-metil-1H-benzoimidazol-5-il)-1H-pirazol-4-il]-[5-(1-isopropil-piperidin-4-il)-6-trifluorometil- 1H-indol-2-il]-metanona;

(92) 2-[5-amino-1-(2-metil-1H-benzoimidazo1-5-il)-1H-pirazol-4-carbonil]-1H-indolo-6-carbonitrilo;

(93) [5-amino-1-(2-metil-1H-benzoimidazol-5-il)-1H-pirazo1-4-il]-[5-(1,2,3,6-tetrahidro-piridin-4-il)-1H-indol-2-il]-metanona;

(94) [5-amino-1-(2-metil-1H-benzoimidazol-5-il)-1H-pirazol-4-il]-(5-piperidin-4-il-1H-indol-2-il)-metanona;

(95) [5-amino-1-(2-metil-1H-benzoimidazol-5-il)-1H-pirazol-4-il]-[5-((R)-3-fluoro-pirrolidin-1-ilmetil)-1H-indol-2-il]-metanona;

(96) [5-amino-1-(2-metil-1H-benzoimidazol-5-il)-1H-pirazol-4-il]-(6-fluoro-5-piperidin-4-il-1H-indol-2-il)-metanona; (97) [5-amino-1-(2-metil-1H-benzoimidazol-5-il)-1H-pirazol-4-il]-[6-fluoro-5-(1-metil-piperidin-4-il)-1H-indol-2-il]-metanona;

(98) [5-amino-1-(2-metil-1H-benzoimidazol-5-il)-1H-pirazol-4-il]-[5-(1-isopropil-piperidin-4-il)-1H-indol-2-il]-metanona;

(99) [5-amino-1-(2-metil-1H-benzoimidazol-5-il)-1H-pirazol-4-il]-[6-fluoro-5-(1-isopropil-piperidin-4-il)-1H-indol-2-il]-metanona;

(100) [5-amino-1-(2-metil-1H-benzoimidazol-5-il)-1H-pirazol-4-il]-(6-piridin-3-il-1H-indol-2-il)-metanona;

(101) [5-amino-1-(2-metil-1H-benzoimidazol-5-il)-1H-pirazol-4-il]-[5-(6-morfolin-4-il-piridin-3-il)-1H-indol-2-il]-metanona;

(102) [5-amino-1-(2-metil-1H-benzoimidazol-5-il)-1H-pirazol-4-il]-(5-piridin-3-il-1H-indol-2-il)-metanona;

(103) [5-amino-1-(2-metil-1H-benzoimidazol-5-il)-1H-pirazol-4-il]-[5-(6-piperazin-1-il-piridin-3-il)-1H-indol-2-il]-metanona;

(104) [5-amino-1-(2-metil-1H-benzoimidazol-5-il)-1H-pirazol-4-il]-[5-(6-hidroxi-piridin-3-il)-1H-indol-2-il]-metanona; (105) [5-amino-1-(2-metil-1H-benzoimidazol-5-il)-1H-pirazol-4-il]-[6-fluoro-5-(4-metil-piperazin-1-ilmetil)-1H-indol-2-il]-metanona;

(106) [5-amino-1-(2-metil-1H-benzoimidazol-5-il)-1H-pirazol-4-il]-(6-fluoro-5-pirrolidin-1-ilmetil-1H-indol-2- il)-metanona;

(107) [5-amino-1-(2-metil-1H-benzoimidazol-5-il)-1H-pirazol-4-il]-[6-(1-metil-piperidin-4-il)-1H-indol-2-il]-metanona; (108) [5-amino-1-(2-metil-1H-benzoimidazol-5-il)-1H-pirazol-4-il]-[6-(4-morfolin-4-il-fenil)-1H-indol-2-il]-metanona; (109) [5-amino-1-(2-metil-1H-benzoimidazol-5-il)-1H-pirazol-4-il]-[6-(3,4,5,6-tetrahidro-2H-[1,2']bipiridin-5'-il)- 1H-indol-2-il]-metanona;

(110) [5-amino-1-(2-metil-1H-benzoimidazol-5-il)-1H-pirazol-4-il]-[6-(6-piperazin-1-il-piridin-3-il)-1H-indol-2-il]-metanona;

(111) [5-amino-1-(2-metil-1H-benzoimidazol-5-il)-1 H-pirazol-4-il]-[5-(6-metoxi-piridin-3-il)-1 H-indol-2-il]-metanona; (112) [5-amino-1-(2-metil-1H-benzoimidazol-5-il)-1H-pirazol-4-il]-[5-((S)-3-metil-morfolin-4-ilmetil)-1H-indol-2-il]-metanona;

(113) [5-amino-1-(2-metil-1H-benzoimidazol-5-il)-1H-pirazol-4-il]-[6-((R)-3-fluoro-pirrolidin-1-ilmetil)-1H-indol-2-il]-metanona;

(114) [5-amino-1-(2-metil-1H-benzoimidazol-5-il)-1H-pirazol-4-il]-[5-(2,5-dimetil-pirrolidin-1-ilmetil)-1H-indol-2-il]-metanona;

(115) [5-amino-1-(2-metil-1H-benzoimidazol-5-il)-1H-pirazol-4-il]-[5-(3-fluoro-piperidin-1-ilmetil)-1H-indol-2-il]-metanona;

(116) [5-amino-1-(2-metil-1H-benzoimidazol-5-il)-1H-pirazol-4-il]-[5-(3,3-difluoro-piperidin-1-ilmetil)-1H-indol-2-il]-metanona;

(117) [5-amino-1-(2-metil-1H-benzoimidazol-5-il)-1H-pirazol-4-il]-{6-[2-(4-metil-piperazin-1-il)piridin-4-il]-1H-indol-2-il}-metanona;

(118) [5-amino-1-(2-metil-1H-benzoimidazol-5-il)-1H-pirazol-4-il]-(6-piridin-4-il-1H-indol-2-il)-metanona;

(119) [5-amino-1-(2-metil-1H-benzoimidazol-5-il)-1H-pirazol-4-il]-[5-(4-fluoropiperidin-1-ilmetil)-1H-indol-2-il]-metanona;

(120) [5-amino-1-(2-metil-1H-benzoimidazol-5-il)-1H-pirazol-4-il]-[5-(4,4-difluoro-piperidin-1-ilmetil)-1H-indol-2-il]-metanona;

(121) [5-amino-1-(2-difluorometil-1H-benzoimidazol-5-il)-1H-pirazol-4-il]-[5-(1-metil-piperidin-4-il)-1H-indol-2-il]-metanona;

(122) [5 -amino-1-(2-difluorometil-1H-benzoimidazol-5-il)-1H-pirazol-4-il]-(1H-indol-2-il)-metanona;

(123) [5-amino-1-(2-metil-1H-benzoimidazol-5-il)-1H-pirazol-4-il]-[5-(3,3-difluoro-pirrolidin-1-ilmetil)-1H-indol-2-il]-metanona;

(124) [5-amino-1-(2-metil-1H-benzoimidazol-5-il)-1H-pirazol-4-il]-[5-(1-ciclopentil-piperidin-4-il)-1H-indol-2-il]-metanona;

(125) [5-amino-1-(2-metil-1H-benzoimidazol-5-il)-1H-pirazol-4-il]-[5-(1-ciclohexil-piperidin-4-il)-1H-indol-2-il]-metanona;

(126) [5-amino-1-(2-metil-1H-benzoimidazol-5-il)-1H-pirazol-4-il]-(4-bromo-1H-pirrol-2-il)-metanona;

(127) [5-amino-1-(2-metil-1H-benzoimidazol-5-il)-1H-pirazol-4-il]-(1H-pirrol-2-il)-metanona;

(128) [5-amino-1-(2-metil-1H-benzoimidazol-5-il)-1H-pirazol-4-il]-(4-fenil-1H-pirrol-2-il)-metanona;

(129) [5-amino-1-(2-metil-1H-benzoimidazol-5-il)-1H-pirazol-4-il]-[4-(3-cloro-fenil)-1H-pirrol-2-il]-metanona;

(130) [5-amino-1-(2-metil-1H-benzoimidazol-5-il)-1H-pirazol-4-il]-[4-(4-fluoro-fenil)-1H-pirrol-2-il]-metanona;

(131) [5-amino-1-(2-metil-1H-benzoimidazo1-5-il)-1H-pirazol-4-il]-[4-(3-fluoro-fenil)-1H-pirrol-2-il]-metanona; (132) [5-amino-1-(2-metil-1H-benzoimidazol-5-il)-1H-pirazol-4-il]-(6-morfolin-4-ilmetil-1H-indol-2-il)-metanona; (133) [5-amino-1-(2-metil-1H-benzoimidazol-5-il)-1H-pirazol-4-il]-[4-(2-morfolin-4-il-etilamino)-1H-indol-2-il]-metanona;

(134) [5-amino-1-(2-metil-1H-benzoimidazol-5-il)-1H-pirazol-4-il]-[5-(4-metil-piperazin-1-carbonil)-1H-indol-2-il]-metanona;

(135) [5-amino-1-(2-metil-1H-benzoimidazol-5-il)-1H-pirazol-4-il]-[6-(2-morfolin-4-il-etilamino)-1H-indol-2-il]-metanona;

(136) [5-amino-1-(2-metil-1H-benzoimidazol-5-il)-1H-pirazol-4-il]-[5-(piperazin-1-carbonil)-1H-indol-2-il]-metanona; (137) [5-amino-1-(2-metil-1H-benzoimidazol-5-il)-1H-pirazol-4-il]-[4-(2-metoxi-etilamino)-1H-indol-2-il]-metanona; (138) [5-amino-1-(2-metiMH-benzoiiTiidazol-5-N)-1H-pirazol-4-NH4-(2-hidroxM-hidroxiiTietN-etNaiTiino)- 1H-indol-2-il]-metanona;

(139) [5-amino-1-(2-metil-1H-benzoimidazol-5-il)-1H-pirazol-4-il]-[4-(2-piridin-4-il-etilamino)-1H-indol-2-il]-metanona;

(140) [5-amino-1-(2-metil-1H-benzoimidazol-5-il)-1H-pirazol-4-il]-[6-(2-metoxi-etilamino)-1H-indol-2-il]-metanona; (141) [5-amino-1-(2-metil-1H-benzoimidazol-5-il)-1H-pirazol-4-il]-(6-morfolin-4-il-1H-indo l-2-il)-metanona;

(142) [5-amino-1-(2-metil-1H-benzoimidazol-5-il)-1H-pirazol-4-il]-(4-morfolin-4-il-1H-indol-2-il)-metanona;

(143) [5-amino-1-(2-metil-1H-benzoimidazol-5-il)-1H-pirazol-4-il]-(4-morfolin-4-ilmetil-1H-indol-2-il)-metanona; (144) [5-amino-1-(2-metil-1H-benzoimidazol-5-il)-1H-pirazol-4-il]-(5-morfolin-4-ilmetil-1H-indol-2-il)-metanona; (145) [5-amino-1-(2-metil-1H-benzoimidazol-5-il)-1H-pirazol-4-il]-[5-(morfolina-4-carbonil)-1H-indol-2-il]-metanona; (146) [5-amino-1-(2-isopropil-1H-benzoimidazol-5-il)-1H-pirazol-4-il]-(1H-indol-2-il)-metanona;

(147) [5-amino-1-(2-propil-1H-benzoimidazol-5-il)-1H-pirazol-4-il]-(1H-indol-2-il)-metanona;

(148) [5-amino-1-(1H-benzoimidazol-5-il)-1H-pirazol-4-il]-(1H-indol-2-il)-metanona;

(149) [5-amino-1-(2-trifluorometil-1H-benzoimidazol-5-il)-1H-pirazol-4-il]-(1H-indol-2-il)-metanona;

(150) [5-amino-1-(2-etil-1H-benzoimidazol-5-il)-1H-pirazol-4-il]-(1H-indol-2-il)-metanona;

(151) [5-amino-1-(2-bencil-1H-benzoimidazol-5-il)-1H-pirazol-4-il]-(1H-indol-2-il)metanona;

(152) 1-(4-{2-[5-amino-1-(2-metil-1H-benzoimidazol-5-il)-1H-pirazol-4-carbonil]-1H-indol-5-ilmetil}-piperazin-1-il)-etanona;

(153) [5-amino-1-(2-metil-1H-benzoimidazol-5-il)-1H-pirazol-4-il]-[5-(4-metanosulfonil-piperazin-1-ilmetil)-1H-indol-2-il]-metanona;

(154) [5-amino-1-(2-metil-1H-benzoimidazol-5-il)-1H-pirazol-4-il]-(5-piperazin-1-ilmetil-1H-indol-2-il)-metanona; (155) 1-(4-{2-[5-amino-1-(2-metil-1H-benzoimidazol-5-il)-1H-pirazol-4-carbonil]-1H-indol-6-ilmetil}-piperazin-1-il)-etanona;

(156) [5-amino-1-(2-metil-1H-benzoimidazol-5-il)-1H-pirazol-4-il]-[6-(4-metil-piperazin-1-ilmetil)-1H-indol-2-il]-metanona;

(157) [5-amino-1-(2-metil-1H-benzoimidazol-5-il)-1H-pirazol-4-il]-[5-(4-metil-piperazin-1-ilmetil)-1H-indol-2-il]-metanona;

(158) [5-amino-1-(2-metil-1H-benzoimidazol-5-il)-1H-pirazol-4-il]-(5-pirrolidin-1-ilmetil-1H-indol-2-il)-metanona; (159) [5-amino-1-(2-metil-1H-benzoimidazol-5-il)-1H-pirazol-4-il]-(4-fluoro-1H-indol-2-il)-metanona;

(160) [5-amino-1-(2-metil-1H-benzoimidazol-5-il)-1H-pirazol-4-il]-(5-fluoro-1H-indol-2-il)-metanona;

(161) [5-amino-1-(2-metil-1H-benzoimidazol-5-il)-1H-pirazol-4-il]-(6-fluoro-1H-indol-2-il)-metanona;

(162) [5-amino-1-(2-metil-1H-benzoimidazol-5-il)-1H-pirazol-4-il]-(1H-pirrolo[2,3-b]piridin-2-il)-metanona;

(163) [5-amino-1-(2-metil-1H-benzoimidazol-5-il)-1H-pirazol-4-il]-(5-fluoro-6-morfolin-4-ilmetil-1H-indol-2- il)-metanona;

(164) ácido 2-[5-amino-1-(2-metil-1H-benzoimidazol-5-il)-1H-pirazol-4-carbonil]-1H-indolo-5-carboxílico;

(165) [5-amino-1-(2-metil-1H-benzoimidazol-5-il)-1H-pirazol-4-il]-(5-metoxi-1H-indol-2-il)-metanona;

(166) [5-amino-1-(2-metil-1H-benzoimidazol-5-il)-1H-pirazol-4-il]-(4,6-dimetoxi-1H-indol-2-il)-metanona;

(167) [5-amino-1-(2-metil-1H-benzoimidazol-5-il)-1H-pirazol-4-il]-(4-metoxi-1H-indol-2-il)-metanona;

(168) [5-amino-1-(2-metil-1H-benzoimidazol-5-il)-1H-pirazol-4-il]-(6-metoxi-1H-indol-2-il)-metanona;

(169) [5-amino-1-(2-metil-1H-benzoimidazol-5-il)-1H-pirazol-4-il]-(4,6-dimetil-1H-indol-2-il)-metanona;

(170) [5-amino-1-(2-metil-1H-benzoimidazol-5-il)-1H-pirazol-4-il]-(5-terc-butil-1H-indol-2-il)-metanona;

(171) [5-amino-1-(2-metil-1H-benzoimidazol-5-il)-1H-pirazol-4-il]-(5-isopropil-1H-indol-2-il)-metanona;

(172) [5-amino-1-(2-metil-1H-benzoimidazol-5-il)-1H-pirazol-4-il]-(5-benciloxi-1H-indol-2-il)-metanona;

(173) [5-amino-1-(2-metil-1H-benzoimidazol-5-il)-1H-pirazol-4-il]-(4-benciloxi-1H-indol-2-il)-metanona;

(174) [5-amino-1-(2-metil-1H-benzoimidazol-5-il)-1H-pirazol-4-il]-(5,6-dimetoxi-1H-indol-2-il)-metanona;

(175) [5-amino-1-(2-metil-1H-benzoimidazol-5-il)-1H-pirazol-4-il]-(6-terc-butil-1H-indol-2-il)-metanona;

(176) [5-amino-1-(2-metil-1H-benzoimidazol-5-il)-1H-pirazol-4-il]-(5-fluoro-4-trifluorometil-1H-indol-2-il)-metanona; (177) [5-amino-1-(2-metil-1H-benzoimidazol-5-il)-1H-pirazol-4-il]-(5-fenoxi-1H-indol-2-il)-metanona;

(178) [5-amino-1-(2-metil-1H-benzoimidazol-5-il)-1H-pirazol-4-il]-(6-metilsulfanil-1H-indol-2-il)-metanona;

(179) [5-amino-1-(2-metil-1H-benzoimidazol-5-il)-1H-pirazol-4-il]-(4-terc-butil-1H-indol-2-il)-metanona;

(180) [5-amino-1-(2-metil-1H-benzoimidazol-5-il)-1H-pirazol-4-il]-(5-metil-1H-indol-2-il)-metanona;

(181) [5-amino-1-(2-metil-1H-benzoimidazol-5-il)-1 H-pirazol-4-il]-(5-etil-1H-indol-2-il)-metanona;

(182) [5-amino-1-(2-metil-1H-benzoimidazol-5-il)-1H-pirazol-4-il]-(5-fluoro-6-trifluorometil-1H-indol-2-il)-metanona; (183) [5-amino-1-(2-metil-1H-benzoimidazol-5-il)-1H-pirazol-4-il]-(6-fluoro-5-metoxi-1H-indol-2-il)-metanona; (184) [5-amino-1-(2-metil-1H-benzoimidazol-5-il)-1H-pirazol-4-il]-(6-cloro-5-metoxi-1H-indol-2-il)-metanona;

(185) [5-amino-1-(2-metil-1H-benzoimidazol-5-il)-1H-pirazol-4-il]-(5-cloro-6-metoxi-1H-indol-2-il)-metanona;

(186) [5-amino-1-(2-metil-1H-benzoimidazol-5-il)-1H-pirazol-4-il]-(6-isopropoxi-1H-indol-2-il)-metanona;

(187) [5-amino-1-(2-metil-1H-benzoimidazol-5-il)-1H-pirazol-4-il]-(6-benciloxi-1H-indol-2-il)-metanona;

(188) [5-amino-1-(2-metil-1H-benzoimidazol-5-il)-1H-pirazol-4-il]-(4-isopropoxi-1H-indol-2-il)-metanona;

(189) [5-amino-1-(2-metil-1H-benzoimidazol-5-il)-1H-pirazol-4-il]-(2,3-dihidro-6H-[1,4]dioxino[2,3-f]indol-7- il) metanona;

(190) [5-amino-1-(2-metil-1H-benzoimidazol-5-il)-1H-pirazol-4-il]-(4,6-di-terc-butil-1H-indol-2-il)-metanona;

(191) 2-[5-amino-1-(2-metil-1 H-benzoimidazol-5-il)-lH-pirazol-4-carbonil]-1 H-indolo-4-carbonitrilo;

(192) [5-amino-1-(2-metil-1H-benzoimidazol-5-il)-1H-pirazol-4-il]-(5-imidazol-1-il-1H-indol-2-il)-metanona;

(193) [5-amino-1-(2-metil-1H-benzoimidazol-5-il)-1H-pirazol-4-il]-(5-trifluorometilsulfanil-1H-indol-2-il)-metanona; (194) [5-amino-1-(2-metil-1H-benzoimidazol-5-il)-1H-pirazol-4-il]-(5-metilsulfanil-1H-indol-2-il)-metanona;

(195) [5-amino-1-(2-metil-1H-benzoimidazol-5-il)-1H-pirazol-4-il]-(5-metanosulfonil-1H-indol-2-il)-metanona; (196) [5-amino-1-(2-metil-1H-benzoimidazol-5-il)-1H-pirazol-4-il]-[6-(4,4-difluoro-piperidin-1-ilmetil)-1H-indol-2-il]-metanona;

(197) [5-amino-1-(2-metil-1H-benzoimidazol-5-il)-1H-pirazol-4-il]-[6-(4-fluoro-piperidin-1-ilmetil)-1H-indol-2-il]-metanona;

(198) [5-amino-1-(2-metil-1H-benzoimidazol-5-il)-1H-pirazol-4-il]-[6-(oxetan-3-iloxi)-1H-indol-2-il]-metanona; (199) [5-amino-1-(2-metil-1H-benzoimidazol-5-il)-1H-pirazol-4-il]-(6-hidroxi-1H-indol-2-il)-metanona;

(200) [5-amino-1-(2-metil-1H-benzoimidazol-5-il)-1H-pirazol-4-il]-(6-metanosulfonil-1H-indol-2-il)-metanona; (201) [5-amino-1-(2-metil-1H-benzoimidazol-5-il)-1H-pirazol-4-il]-(4,5-dibromo-1H-pirrol-2-il)-metanona;

(202) [5-amino-1-(2-metil-1H-benzoimidazol-5-il)-1H-pirazol-4-il]-(4,5-difenil-1H-pirrol-2-il)-metanona; y (203) [5-amino-1-(2-metil-1H-benzoimidazol-5-il)-1H-pirazol-4-il]-(4,5-dipiridin-3-il-1H-pirrol-2-il)-metanona.

(204) [5-amino-1-(2-metil-3H-benzoimidazol-5-il)-1H-pirazol-4-il]-(6-doro-1H-indol-2-il)-metanona;

(205) [5-amino-1-(2-metil-1H-benzoimidazol-5-il)-1H-pirazol-4-il]-(5-doro-1H-indol-2-il)-metanona;

(206) [5-amino-1-(2-metil-1H-benzoimidazol-5-il)-1H-pirazol-4-il]-(1H-indol-3-il)-metanona;

(207) [5-amino-1-(2-metil-1H-benzoimidazol-5-il)-1H-pirazol-4-il]-(1H-indol-6-il)-metanona;

(208) [5-amino-1-(2-metil-1H-benzoimidazol-5-il)-1H-pirazol-4-il]-(5-bromo-6-fluoro-1H-indol-2-il)-metanona; (209) [5-amino-1-(2-etil-1H-benzoimidazol-5-il)-1H-pirazol-4-il]-(5-bromo-6-fluoro-1H-indol-2-il)-metanona;

(210) [5-amino-1-(2-metil-1H-benzoimidazol-5-il)-1H-pirazol-4-il]-(5-trifluorometil-1H-indol-2-il)-metanona;

(211) [5-amino-1-(2-metil-1H-benzoimidazol-5-il)-1H-pirazol-4-il]-(5-trifluorometoxi-1H-indol-2-il)-metanona;

(212) [5-amino-1-(2-metil-1H-benzoimidazol-5-il)-1H-pirazol-4-il]-(4,6-didoro-1H-indol-2-il)-metanona;

(213) [5-amino-1-(2-metil-1H-benzoimidazol-5-il)-1H-pirazol-4-il]-(6-bromo-4-fluoro-1H-indol-2-il)-metanona; (214) [5-amino-1-(2-metil-1H-benzoimidazol-5-il)-1H-pirazol-4-il]-(6-trifluorometoxi-1H-indol-2-il)-metanona;

(215) [5-amino-1-(2-etil-1H-benzoimidazol-5-il)-1H-pirazol-4-il]-(5-trifluorometoxi-1H-indol-2-il)-metanona;

(216) [5-amino-1-(2-etil-1H-benzoimidazol-5-il)-1H-pirazol-4-il]-(5-trifluorometil-1H-indol-2-il)-metanona;

(217) [5-amino-1-(2-metil-1H-benzoimidazol-5-il)-1H-pirazol-4-il]-(5,6-didoro-1H-indol-2-il)-metanona;

(218) [5-amino-1-(2-etil-1H-benzoimidazol-5-il)-1H-pirazol-4-il]-(6-bromo-5-fluoro-1H-indol-2-il)-metanona;

(219) [5-amino-1-(2-metil-1H-benzoimidazol-5-il)-1H-pirazol-4-il]-(4,5-didoro-1H-indol-2-il)- metanona;

(220) [5-amino-1-(2-metil-1H-benzoimidazol-5-il)-1H-pirazol-4-il]-(4,6-difluoro-1H-indol-2-il)-metanona;

(221) [5-amino-1-(2-metil-1H-benzoimidazol-5-il)-1H-pirazol-4-il]-[6-(3-doro-piridin-4-il)-1H-indol-2-il]-metanona; (222) [5-amino-1-(2-metil-1H-benzoimidazol-5-il)-1H-pirazol-4-il]-[6-(6-metil-piridin-3-il)-1H-indol-2-il]-metanona; (223) [5-amino-1-(2-metil-1H-benzoimidazol-5-il)-1H-pirazol-4-il]-[6-(5-fluoro-piridin-3-il)-1H-indol-2-il]-metanona; (224) [5-amino-1-(2-metil-1H-benzoimidazol-5-il)-1H-pirazol-4-il]-[6-(2-trifluorometil-piridin-3-il)-1H-indol-2-il]-metanona;

(225) [5-amino-1-(2-metil-1H-benzoimidazol-5-il)-1H-pirazol-4-il]-[6-(5-doro-2-metoxi-piridin-3-il)-1H-indol-2-il]-metanona;

(226) [5-amino-1-(2-metil-1H-benzoimidazol-5-il)-1H-pirazol-4-il]-[6-(5-doro-piridin-3-il)-1H-indol-2-il]-metanona; (227) [5-amino-1-(2-metil-1H-benzoimidazol-5-il)-1H-pirazol-4-il]-(6-tiofen-3-il-1H-indol-2-il)-metanona;

(228) [5-amino-1-(2-metil-1H-benzoimidazol-5-il)-1H-pirazol-4-il]-[6-(4-doropiridin-3-il)-1H-indol-2-il]-metanona; (229) [5-amino-1-(2-metil-1H-benzoimidazol-5-il)-1H-pirazol-4-il]-(6-tiofen-2-il-1H-indol-2-il)-metanona;

(230) [5-amino-1-(2-metil-1H-benzoimidazol-5-il)-1H-pirazol-4-il]-[6-(3-fluoro-piridin-4-il)-1H-indol-2-il]-metanona; (231) [5-amino-1-(2-metil-1H-benzoimidazol-5-il)-1H-pirazol-4-il]-[6-(2-trifluorometil-piridin-4-il)-1H-indol-2-il]-metanona;

(232) [5-amino-1-(2-metil-1H-benzoimidazol-5-il)-1H-pirazol-4-il]-[5-(3,3-difluoro-pirrolidin-1-carbonil)-1H-indol-2-il]-metanona;

(233) [5-amino-1-(2-metil-1 H-benzoimidazol-5-il)-1H-pirazol-4-il]-[5-(2,6-dimetil-morfolina-4-carbonil)-1 H-indol-2-il]-metanona;

(234) [5-amino-1-(2-metil-1H-benzoimidazol-5-il)-1H-pirazol-4-il]-[5-([1,4']bipiperidinil-1'-carbonil)-1H-indol-2-il]-metanona;

(235) [5-amino-1-(2-metil-1H-benzoimidazol-5-il)-1H-pirazol-4-il]-{5-[4-(2,2,2-trifluoro-etil)-piperazin-1-carbonil]-1H-indol-2-il}-metanona;

(236) [5-amino-1-(2-metil-1H-benzoimidazol-5-il)-1H-pirazol-4-il]-{5-[4-(2-hidroxi-etil)-piperazin-1-carbonil]-1H-indol-2-il}-metanona;

(237) [5-amino-1-(2-metil-1H-benzoimidazol-5-il)-1H-pirazol-4-il]-[5-(3,3,4,4-tetrafluoro-pirrolidin-1-carbonil)- 1H-indol-2-il]-metanona;

(238) [5-amino-1-(2-metil-1H-benzoimidazol-5-il)-1H-pirazol-4-il]-[5-((R)-3-fluoro-pirrolidin-1-carbonil)-1H-indol-2-il]-metanona;

(239) [5-amino-1-(2-metil-1H-benzoimidazol-5-il)-1H-pirazol-4-il]-[5-((S)-3-fluroro-pirrolidin-1-carbonil)-1H-indol-2-il]-metanona;

(240) [5-amino-1-(2-metil-1H-benzoimidazol-5-il)-1H-pirazol-4-il]-[4-(4-metoxi-fenil)-1H-pirrol-2-il]-metanona; (241) [5-amino-1-(2-metil-1H-benzoimidazol-5-il)-1H-pirazol-4-il]-[4-(3-metoxi-fenil)-1H-pirrol-2-il]-metanona; (242) [5-amino-1-(2-metil-1H-benzoimidazol-5-il)-1H-pirazol-4-il]-[4,5-bis-(3-fluoro-fenil)-1H-pirrol-2-il]-metanona; (243) [5-amino-1-(2-metil-1H-benzoimidazol-5-il)-1H-pirazol-4-il]-[4,5-bis-(4-metoxi-fenil)-1H-pirrol-2-il]-metanona; (244) [5-amino-1-(2-metil-1H-benzoimidazol-5-il)-1H-pirazol-4-il]-[4-(2,4-difluoro-fenil)-1H-pirrol-2-il]-metanona; (245) [5-amino-1-(2-metil-1H-benzoimidazol-5-il)-1H-pirazol-4-il]-[4-(4-trifluorometoxifenil)-1H-pirrol-2-il]-metanona;

(246) [5-amino-1-(2-metil-1H-benzoimidazol-5-il)-1H-pirazol-4-il]-[4,5-bis-(3-metoxifenil)-1H-pirrol-2-il]-metanona; (247) [5-amino-1-(2-metiMH-benzoimidazol-5-il)-1H-pirazol-4-il]-benzofuran-2-il-metanona;

(248) [5-amino-1-(2-metiMH-benzoimidazol-5-il)-1H-pirazol-4-il]-benzo[b]tiofen-2-il-metanona;

(249) [5-amino-1-(2-metil-1H-benzoimidazol-5-il)-1H-pirazol-4-il]-benzotiazol-2-il-metanona;

(250) [5-amino-1-(2-metil-1H-benzoimidazol-5-il)-1H-pirazol-4-il]-(4-fluoro-fenil)-metanona;

(251) [5-amino-1-(2-metil-1H-benzoimidazol-5-il)-1H-pirazol-4-il]-(3-cloro-fenil)-metanona;

(252) [5-amino-1-(2-metiMH-benzoimidazol-5-il)-1H-pirazol-4-il]-quinolin-3-il-metanona;

(253) [5-amino-1-(2-metil-1H-benzoimidazo1-5-il)-1H-pirazol-4-il]-quinolin-7-il-metanona; y

(254) [5-amino-1-(2-metil-1H-benzoimidazol-5-il)-1H-pirazol-4-il]-quinolin-6-il-metanona.

Los ejemplos más específicos incluyen compuestos en los cuales A es indol, R3 es metilo y R4 es hidrógeno en la fórmula (I) descrita anteriormente y los compuestos mostrados en la Tabla 1 pueden incluirse como ejemplos.

Los compuestos mencionados anteriormente se pueden producir según el método de producción descrito en la publicación internacional WO 2011/016528.

En la presente invención, los compuestos que tienen actividad inhibidora de FGFR, como los descritos anteriormente, no solo incluyen formas libres sino también sales de los mismos farmacéuticamente aceptables.

Dichas "sales" incluyen, por ejemplo, sales de ácidos inorgánicos, sales orgánicas, sales de bases inorgánicas, sales básicas orgánicas y sales de aminoácidos ácidos o básicos.

Como sales de ácidos inorgánicos preferidas se incluyen, por ejemplo, clorhidrato, bromhidrato, sulfato, nitrato y fosfato. Como sales orgánicas preferidas se incluyen, por ejemplo, acetato, succinato, fumarato, maleato, tartrato, citrato, lactato, malato, estearato, benzoato, metanosulfonato y p-toluenosulfonato. Una sal particularmente preferida en la presente invención es el malato.

Como sales de bases inorgánicas preferidas se incluyen, por ejemplo, sales de metales alcalinos, tales como sales de sodio y sales de potasio; sales de metales alcalinotérreos, tales como sales de calcio y sales de magnesio; sales de aluminio; y sales de amonio. Como sales de bases orgánicas preferidas se incluyen, por ejemplo, sales de dietilamina, sales de dietanolamina, sales de meglumina y sales de N,N-dibenciletilendiamina.

Como sales de aminoácidos ácidos preferidas se incluyen, por ejemplo, aspartato y glutamato. Como sales de aminoácidos básicos preferidas se incluyen, por ejemplo, sales de arginina, sales de lisina y sales de ornitina.

En la presente invención, los compuestos que tienen actividad inhibidora de FGFR también incluyen hidratos de los mismos. Asimismo, en la presente invención, los compuestos que tienen actividad inhibidora de FGFR pueden absorber algún tipo de solventes para formar solvatos. Dichos solvatos también están incluidos.

Además, los compuestos que tienen actividad inhibidora de FGFR en la presente invención, incluyen todos los isómeros estructurales posibles (isómeros geométricos, isómeros ópticos, estereoisómeros, tautómeros, etc.), y mezclas de isómeros.

Los compuestos que tienen actividad inhibidora de FGFR en la presente invención también, incluyen cualquier polimorfismo cristalino de los mismos.

En la presente invención, los compuestos que tienen actividad inhibidora de FGFR también incluyen profármacos de los mismos. "Profármaco" se refiere a derivados de los compuestos que tienen un grupo que puede degradarse química o metabólicamente y que después de su administración en un organismo vivo, revertirá a los compuestos originales y mostrará la eficacia del fármaco original. Los profármacos incluyen complejos y sales no covalentes.

En la presente invención, los compuestos que tienen actividad inhibidora de FGFR incluyen aquellos en los que uno o más átomos dentro de la molécula han sido reemplazados por isótopos. En el presente documento, "isótopo" se refiere a un átomo que tiene el mismo número atómico (número de protones) pero diferente número de masa (suma de protones y neutrones). Los átomos diana que se reemplazarán con un isótopo en los compuestos incluyen, por ejemplo, un átomo de hidrógeno, un átomo de carbono, un átomo de nitrógeno, un átomo de oxígeno, un átomo de fósforo, un átomo de azufre, un átomo de flúor y un átomo de cloro. Sus isótopos incluyen 2H, 3H, 13C, 14C, 15N, 17O, 18O, 31P, 32P, 35S, 18F y 36Cl. En particular, los radioisótopos, tales como 3H y 14C, que emiten radiación y se desintegran, son útiles en estudios de distribución tisular in vivo o similares, de productos o compuestos farmacéuticos. Los isótopos estables no se desintegran y, por lo tanto, su cantidad rara vez cambia; y como no hay emisión de radiación, los isótopos estables se pueden utilizar de forma segura. Los compuestos de la presente invención se pueden transformar en compuestos sustituidos con isótopos según métodos habituales, reemplazando los reactivos usados en la síntesis con reactivos que contienen los isótopos correspondientes.

En el presente documento, las expresiones "antineoplásico" o "composición farmacéutica para tratar el cáncer" que comprende un inhibidor de FGFR, se usan indistintamente, y se refieren a una composición terapéutica contra el cáncer que comprende un compuesto descrito anteriormente que tiene actividad inhibidora de FGFR y transportadores farmacéuticamente aceptables.

Los compuestos que tienen actividad inhibidora de FGFR de la presente invención pueden formularse en comprimidos, polvos, gránulos finos, gránulos, comprimidos recubiertos, cápsulas, jarabes, trociscos, inhalantes, supositorios, inyecciones, pomadas, pomadas oculares, colirios, gotas nasales, gotas óticas, cataplasmas, lociones, y similares, mediante métodos habituales. Para la formulación, se pueden usar excipientes, aglutinantes, lubricantes, colorantes, aromatizantes y, si fuera necesario, estabilizantes, emulsionantes, absorbentes, tensioactivos, ajustadores de pH, conservantes, antioxidantes y similares. Los compuestos de la presente invención se formulan usando métodos habituales, combinando ingredientes que generalmente se usan como materiales para preparaciones farmacéuticas.

Por ejemplo, para producir formulaciones orales, los compuestos de la presente invención, o sus sales farmacológicamente aceptables, se combinan con excipientes y, si fuera necesario, con aglutinantes, disgregantes, lubricantes, colorantes, aromatizantes y similares; y después se formulan en polvos, gránulos finos, gránulos, comprimidos, comprimidos recubiertos, cápsulas, y similares, mediante métodos habituales.

Los ingredientes incluyen, por ejemplo, aceites animales y vegetales, tales como aceites de soja, sebo de ternera y glicéridos sintéticos; hidrocarburos, tales como parafina líquida, escualano y parafina sólida; aceites de éster, tales como miristato de octildodecilo y miristato de isopropilo; alcoholes superiores, tales como alcohol cetoestearílico y alcohol behenílico; resinas de silicio; aceites de silicio; tensioactivos, tales como ésteres de ácidos grasos de polioxietileno, ésteres de ácidos grasos de sorbitán, ésteres de ácidos grasos de glicerina, ésteres de ácidos grasos polioxietileno y sorbitán, aceites de ricino hidrogenados polioxietilenados y copolímeros de bloque de polioxietileno/polioxipropileno; polímeros solubles en agua, tales como hidroxietilcelulosa, ácidos poliacrílicos, polímeros de carboxivinilo, polietilenglicol, polivinilpirrolidona y metilcelulosa; alcoholes inferiores, tales como etanol e isopropanol; polialcoholes tales como glicerina, propilenglicol, dipropilenglicol y sorbitol; sacáridos, tales como glucosa y sacarosa; polvos inorgánicos, tales como anhídrido silícico, silicato de aluminio y magnesio, y silicato de aluminio; y agua purificada.

Los excipientes incluyen, por ejemplo, lactosa, almidón de maíz, sacarosa, glucosa, manitol, sorbitol, celulosa cristalina y dióxido de silicio.

Los aglutinantes incluyen, por ejemplo, alcohol polivinílico, éter polivinílico, metilcelulosa, etilcelulosa, goma arábiga, tragacanto, gelatina, goma laca, hidroxipropilmetilcelulosa, hidroxipropilcelulosa, polivinilpirrolidona, polímero de bloque de polipropilenglicol/polioxietileno, y meglumina.

Los disgregantes incluyen, por ejemplo, almidón, agar, gelatina en polvo, celulosa cristalina, carbonato de calcio, bicarbonato de sodio, citrato de calcio, dextrano, pectina y carboximetilcelulosa de calcio.

Los lubricantes incluyen, por ejemplo, estearato de magnesio, talco, polietilenglicol, sílice y aceite vegetal endurecido.

Como aditivos para productos farmacéuticos se utilizan colorantes de uso autorizado. Los aromatizantes utilizados incluyen, por ejemplo, cacao en polvo, mentol, polvo aromático, aceite de menta, borneol y canela en polvo.

Por supuesto, estos comprimidos y gránulos pueden estar recubiertos con azúcar, o si fuera necesario, con otros recubrimientos apropiados. Como alternativa, cuando se producen preparaciones líquidas, tales como jarabes e inyecciones, los compuestos de la presente invención o sus sales farmacológicamente aceptables, se combinan con ajustadores de pH, solubilizantes, isotonizantes, o similares, y si fuera necesario, solubilizantes, estabilizantes, y similares, y después se formulan utilizando métodos habituales.

Los métodos para producir preparaciones externas no están limitados, y pueden producirse por métodos convencionales. Como materiales de base en la producción pueden utilizarse diversos materiales convencionales para productos farmacéuticos, parafarmacéuticos, cosméticos, y similares. Específicamente, como materiales de base utilizados se incluyen, por ejemplo, aceites animales y vegetales, aceites minerales, aceites de éster, ceras, alcoholes superiores, ácidos grasos, aceites de silicio, tensioactivos, fosfolípidos, alcoholes, polialcoholes, polímeros solubles en agua, minerales arcillosos y agua purificada. Asimismo, según sea necesario, es posible añadir ajustadores de pH, antioxidantes, quelantes, conservantes, colorantes, aromatizantes y similares. Sin embargo, los materiales de base para las preparaciones externas de la presente invención, no están limitados a los mismos.

Asimismo, si fuera necesario, las preparaciones pueden combinarse con componentes que tienen una actividad de inducir la diferenciación, o con componentes tales como mejoradores del flujo sanguíneo, antimicrobianos, antiflogísticos, activadores celulares, vitaminas, aminoácidos, humectantes y queratolíticos. La cantidad de materiales de base añadidos descritos anteriormente, es una cantidad que proporciona una concentración por lo general seleccionada en la producción de preparaciones externas.

Los antineoplásicos (composiciones farmacéuticas granulares para tratar el cáncer) para administrar un compuesto que tiene actividad inhibidora de FGFR en la presente invención, no están particularmente limitados en cuanto a su forma de dosificación; y los agentes pueden administrarse por vía oral o parenteral mediante métodos comúnmente utilizados. Estos se pueden formular y administrar, por ejemplo, en forma de comprimidos, polvos, gránulos, cápsulas, jarabes, trociscos, inhalantes, supositorios, inyecciones, pomadas, pomadas oculares, colirios, gotas nasales, gotas óticas, cataplasmas, lociones, etc.

En la presente invención, la dosis de un inhibidor de FGFR contenida en un antineoplásico o en una composición farmacéutica para su uso en el tratamiento del cáncer se puede seleccionar adecuadamente según la gravedad de los síntomas, la edad, el sexo, el peso, la forma farmacéutica, el tipo de sal, el tipo de enfermedad específica, y similares.

La dosificación varía considerablemente dependiendo del tipo de enfermedad del paciente, de la gravedad de los síntomas, de la edad, el sexo, la sensibilidad al agente, y factores similares. Por lo general, el agente se administra a un adulto una o varias veces al día, a una dosis diaria de aproximadamente 0,03 a 1000 mg, preferentemente de 0,1 a 500 mg, y más preferentemente de 0,1 a 100 mg. Las composiciones para su uso en la presente invención se administran una o varias veces al día. Cuando se usa una inyección, la dosis diaria es generalmente de aproximadamente 1 pg/kg a 3000 pg/kg, y preferentemente de aproximadamente 3 pg/kg a 1000 pg/kg. La presente divulgación también se refiere a composiciones farmacéuticas para tratar el cáncer que comprenden un compuesto descrito anteriormente que tiene actividad inhibidora de FGFR, y se caracterizan por que se usan para administrarse a pacientes que expresan un polipéptido mutante de la presente invención o que son portadores de un polinucleótido que codifica el polipéptido mutante.

En una realización, la presente invención se refiere a una composición farmacéutica para su uso en un método para el tratamiento del cáncer que comprende, como principio activo, el compuesto representado por la fórmula siguiente o una sal del mismo farmacéuticamente aceptable, en donde el cáncer expresa un polipéptido mutante de FGFR que comprende una sustitución de valina por fenilalanina en el 7° aminoácido a partir del extremo N y/o una sustitución de valina por leucina en el 5° aminoácido a partir del extremo N en la secuencia de aminoácidos parcial descrita en la SEQ ID NO: 53 o 54 en un polipéptido de FGFR, en donde las mutaciones son causantes de la adquisición de resistencia a inhibidores de FGFR pero son sensibles al compuesto representado por la siguiente fórmula:

En otra realización, la presente invención se refiere a una composición farmacéutica para su uso en un método para el tratamiento del cáncer que comprende, como principio activo, una sustancia que inhibe la función o expresión de un polipéptido mutante de FGFR que comprende una sustitución de valina por fenilalanina en el 7° aminoácido a partir del extremo N y/o una sustitución de valina por leucina en el 5° aminoácido a partir del extremo N en la secuencia de aminoácidos parcial descrita en la SEQ ID NO: 53 o 54 en un polipéptido de FGFR, en donde las mutaciones son causantes de la adquisición de resistencia a inhibidores de FGFR pero son sensibles al compuesto representado por la siguiente fórmula:

La presente divulgación se refiere además a métodos para tratar o prevenir el cáncer, que comprenden administrar una cantidad eficaz de los compuestos mencionados anteriormente que tienen actividad inhibidora de FGFR o sales farmacéuticamente aceptables de los mismos, a pacientes que expresan los polipéptidos mutantes o que portan los polinucleótidos; al uso de compuestos que tienen actividad inhibidora de FGFR o sales farmacéuticamente aceptables de los mismos, en la producción de composiciones farmacéuticas para el tratamiento del cáncer para la administración a pacientes que expresan los polipéptidos de fusión o que portan los polinucleótidos; a compuestos que tienen actividad inhibidora de FGFR o sales farmacéuticamente aceptables de los mismos para su uso en el tratamiento o prevención de pacientes que expresan los polipéptidos mutantes o que portan los polinucleótidos; y similares.

Específicamente, el uso de las composiciones farmacéuticas para tratar el cáncer se caracteriza por que se analiza si un paciente expresa el polipéptido mutante o es portador de un polinucleótido que codifica el polipéptido mutante usando, como biomarcador, un polipéptido mutante de la presente invención antes de que se administre al paciente un antineoplásico descrito anteriormente que comprende un inhibidor de FGFR, y el antineoplásico que contiene un inhibidor de FGFR se administra al paciente solo si el paciente expresa el polipéptido mutante o es portador de un polinucleótido que codifica el polipéptido mutante. Esto permite evitar el desarrollo de efectos secundarios en las terapias que usan el agente y controlar la afección terapéutica para producir el mejor efecto terapéutico, permitiendo así un medicamento personalizado.

Usando los métodos de la presente divulgación descritos anteriormente, se puede analizar si un paciente expresa un polipéptido mutante de la presente invención o si es portador de un polinucleótido que codifica el polipéptido mutante.

La presente divulgación también se refiere a métodos para identificar compuestos que tienen actividad inhibidora de FGFR.

Específicamente, los métodos para identificar compuestos que tienen actividad inhibidora de FGFR en la presente descripción incluyen métodos que comprenden las siguientes etapas:

(a) cultivar células que expresan un polipéptido mutante de la presente invención descrito anteriormente en presencia o ausencia de un compuesto de prueba y determinar el nivel de proliferación celular;

(b) comparar el nivel de proliferación de la célula cultivada en presencia y ausencia del compuesto de ensayo; y (c) dictaminar que, cuando el nivel de proliferación de la célula cultivada en presencia del compuesto de ensayo es menor que el de la célula cultivada en ausencia del compuesto de ensayo, el compuesto de ensayo tiene actividad inhibidora de FGFR.

Las células utilizadas para el método anterior pueden ser células primarias cultivadas, líneas celulares establecidas, o células recombinantes, siempre que expresen un polipéptido mutante de la presente invención. Dichas células recombinantes incluyen las introducidas con un vector descrito anteriormente portador de un polinucleótido que codifica un polipéptido mutante de la presente invención.

Mientras tanto, las células primarias cultivadas incluyen células recogidas de pacientes con cáncer. Las líneas celulares establecidas incluyen líneas de células cancerosas establecidas a partir de células cancerosas recogidas de pacientes con cáncer.

En la presente invención, el cáncer incluye cualquier cáncer descrito anteriormente.

Los métodos para identificar compuestos que tienen actividad inhibidora de FGFR en la presente divulgación también incluyen los que comprenden las siguientes etapas:

(a) administrar un compuesto de ensayo a un mamífero no humano al que se le han trasplantado células que expresan un polipéptido mutante de la presente invención descrito anteriormente y determinar el nivel de proliferación de las células;

(b) comparar el nivel de proliferación celular determinado en la etapa (a) con el determinado usando un mamífero no humano al que se la han trasplantado las células pero al que no se la ha administrado el compuesto de ensayo; y

(c) dictaminar que, cuando el nivel de proliferación celular determinado en la etapa (a), es menor que el determinado usando un mamífero no humano al que se le han trasplantado las células pero al que no se le ha administrado el compuesto de ensayo, el compuesto de ensayo tiene actividad inhibidora de FGFR.

En los métodos de la presente divulgación, el nivel de proliferación celular puede analizarse según métodos habituales, por ejemplo, mediante métodos colorimétricos que miden la actividad enzimática de reducción de un colorante (MTT, XTT, MTS, WST, etc.) en colorante formazán (púrpura).

Cuando las células descritas anteriormente son células cancerosas, el nivel de proliferación celular también se puede determinar midiendo el volumen o el peso del tumor formado como resultado de la proliferación celular.

En la presente divulgación, los métodos para identificar compuestos que tienen actividad inhibidora de FGFR, también comprenden realizaciones que usan ensayos con genes indicadores.

Los genes indicadores incluyen genes usados habitualmente que codifican proteínas fluorescentes arbitrarias, por ejemplo, la proteína verde fluorescente (GFP, del inglés green fluorescent protein) procedente de Aequorea coerulescens, luciferasa procedente de Renilla reniformis o similar, proteínas fluorescentes de arrecifes de coral (RCFP, del inglés reef coral fluorescent proteins) procedentes de coral hermatípico, proteínas fluorescentes de frutas, y variantes de las mismas.

En la presente divulgación, se puede llevar a cabo el ensayo con un gen indicador, por ejemplo, del siguiente modo.

Las células recombinantes se preparan transformando células que, por lo general, se usan para producir proteínas recombinantes con un vector de expresión insertado con un polinucleótido que codifica el polipéptido mutante de la presente invención y un gen que codifica una proteína indicadora, de modo que el gen que codifica la proteína indicadora se transcribe en ARNm dependiendo de la señal que transcribe el polinucleótido que codifica el polipéptido mutante en ARNm. Un compuesto de ensayo se pone en contacto con las células transformadas obtenidas. Si el compuesto afecta a la expresión del polipéptido mutante, se analiza indirectamente determinando el nivel de expresión del polipéptido mutante, que depende de la actividad del compuesto, midiendo la intensidad de fluorescencia emitida por la proteína indicadora expresada simultáneamente con el polipéptido mutante (por ejemplo, patente de Estados Unidos N° 5436 128; patente de Estados Unidos N° 5401 629).

La identificación de los compuestos usando el ensayo descrito anteriormente se puede realizar manualmente; sin embargo, también se puede realizar fácilmente y de una forma simple mediante la denominada "exploración de alto rendimiento" utilizando mecánica robótica (Soshiki Baiyou Kougaku (The Tissue Culture Engineering), Vol. 23, No.13, págs. 521-524; patente de Estados Unidos N° 5670 l13).

A continuación, en el presente documento, la presente invención se describe específicamente usando los ejemplos.

A menos que se especifique otra cosa, cada etapa de ensayo se puede realizar de acuerdo con métodos conocidos.

Mientras tanto, cuando se usan reactivos, kits, o similares, disponibles en el mercado, los ensayos se pueden realizar según los manuales incluidos en los productos comerciales.

Ejemplos

[Ejemplo 1] Examen del mutante V564F y del mutante V562L de FGFR2

(1) Evaluación de las acciones inhibidoras de fosforilación por inhibidores de FGFR

Mediante un método de mutagénesis dirigida basado en PCR, el polinucleótido (SEQ ID NO: 6) que codifica el mutante V564F de FGFR2 (SEQ ID NO: 9) y el polinucleótido (SEQ ID NO: 7) que codifica el mutante V562L de FGFR2 (SEQ ID NO: 10) se prepararon a partir del polinucleótido ORF ( SEQ ID NO: 5) de FGFR2 de tipo silvestre (SEQ ID NO: 8). El polinucleótido ORF de FGFR2 de tipo silvestre y un polinucleótido que codifica el mutante V564F de FGFR2 o el mutante V562L de FGFR2, se subclonaron en el vector pCXND3 (Kaketsuken) para preparar vectores para expresar cada uno de los polipéptidos. Cada uno de los vectores preparados se introdujo en células de adenocarcinoma de colon humano HCT 116 (ATCC) usando un reactivo de transfección FuGENE® HD (Promega) para expresar de manera transitoria el polipéptido FGFR2 de tipo silvestre (SEC ID NO: 8), el polipéptido mutante V564F de FGFR2 ( SEQ ID NO: 9), y el polipéptido mutante V562L de FGFR2 (SEQ ID NO: 10), respectivamente. Se hizo que el Compuesto A o el Compuesto C actuaran sobre cada una de las células en presencia de DMSO al 0,1 %, y después, los lisados celulares de cada una de las células se recogieron usando tampón de lisis celular (Cell Signaling Technology). El análisis de cada uno de los lisados celulares mediante transferencia Western usando el anticuerpo anti Fosfo-Receptor de FGF (Tyr653/654) (Cell Signaling Technology) o el anticuerpo anti FGFR-2 (Sigma), reveló que los efectos inhibidores de la fosforilación de cada compuesto sobre el polipéptido mutante V564F de FGFR2 y el polipéptido mutante V562L de FGFR2, mostraron una gran reducción con el Compuesto C, mientras que los efectos no se redujeron mucho con el Compuesto A, en comparación con los efectos inhibidores de fosforilación sobre el polipéptido FGFR2 de tipo silvestre, como se muestra en la Fig. 1.

(2) Evaluación de los efectos inhibidores de la proliferación celular in vitro por inhibidores de FGFR

Cada vector de expresión de polipéptido para el FGFR2 de tipo silvestre, el mutante V564F o el mutante V562L de FGFR2 preparado en el apartado (1) del Ejemplo 1, se introdujo mediante electroporación en células pro-B de ratón Ba/F3 (Riken) dependientes de IL-3, las células se cultivaron en ausencia de IL-3 en condiciones en las que se añadió marcador de selección G-418 (Life Technology, FGF1 (Sigma) y heparina (Sigma), y después se estableció una cepa Ba/F3 que podía expresar de manera estable el polipéptido FGFR2 de tipo silvestre, el polipéptido mutante V564F de FGFR2 o el polipéptido mutante V562L de FGFR2 y que podía proliferar independientemente de IL-3. Cada una de las cepas sembradas en placas de 96 pocillos se añadió con cada compuesto (Compuesto A, B o C) convertida en una serie de dilución cuádruple de nueve etapas con la concentración máxima de 20 pM, o DMSO (utilizado como control), y se cultivó durante cuatro días. La proliferación celular después de cultivar durante cuatro días se midió utilizando WST-8 (Dojindo Laboratories). La actividad inhibidora de la proliferación celular de cada compuesto en cada célula se calculó utilizando la ecuación (1- T/C) x 100 (%), donde T es el valor de absorbancia a 450 nM para un pocillo en el que las células se añadieron con el compuesto de cada concentración y se cultivaron, y C es el valor de absorbancia a 450 nM en el que las células se añadieron con DMSO y se cultivaron, y se calculó la CI50 por el método de mínimos cuadrados. Como resultado, las actividades inhibidoras de la proliferación celular de cada uno de los compuestos sobre la cepa que expresaba de manera estable el polipéptido mutante V564F de FGFR2 o el polipéptido mutante V562L de FGFR2, se debilitaron enormemente con el Compuesto B y el Compuesto C, mientras que las actividades apenas mostraron cambios con el Compuesto A, en comparación con sus actividades inhibidoras de proliferación celular sobre la cepa que expresaba de manera estable el polipéptido FGFR2 de tipo silvestre, como se muestra en la Fig. 2 y en la Tabla 2.

T l 21

[Ejemplo 2] Examen del mutante V564F de FGFR2 fusionado con TEL

(1) Evaluación de los efectos inhibidores de la proliferación celular in vitro por inhibidores de FGFR

Mediante un método de mutagénesis dirigida basado en PCR, un polinucleótido que codifica el dominio de dimerización de TEL de tipo silvestre (SEQ ID NO: 33) y un polinucleótido que codifica el dominio intracelular de FGFR2 de tipo silvestre (SEQ ID NO: 1), se fusionaron para producir un polinucleótido (SEQ ID NO: 11) que codifica el FGFR2 de tipo silvestre fusionado con TEL (SEQ ID NO: 34). Usando como molde el polinucleótido que codifica el FGFR2 de tipo silvestre fusionado con TEL, se preparó un polinucleótido (SEQ ID NO: 12) que codificaba el mutante V564F de FGFR2 fusionado con TEL (SEQ ID NO: 35) mediante un método de mutagénesis dirigida basado en PCR. Los polinucleótidos que codifican el FGFR2 de tipo silvestre fusionado con TEL y el mutante V564F de FGFR2 fusionado con TEL, se subclonaron en un vector pCXND3 (Kaketsuken) para preparar vectores para expresar cada uno de los polipéptidos. Cada vector de expresión de polipéptido para el FGFR2 de tipo silvestre fusionado con TEL o el mutante V564F de FGFR2 fusionado con TEL, se introdujo mediante electroporación en células pro-B de ratón Ba/F3 dependientes de IL-3, y las células se cultivaron en ausencia de IL -3 con la adición del marcador de selección G-418 para establecer una cepa Ba/F3 que podía expresar de manera estable el polipéptido FGFR2 de tipo silvestre fusionado con TEL o el polipéptido mutante V564F de FGFR2 fusionado con TEL y que podía proliferar independientemente de IL-3. Cada una de las cepas sembradas en placas de 96 pocillos se añadió con cada compuesto (Compuesto A, B, C o E) convertido en una serie de dilución cuádruple de 18 etapas con la concentración máxima de 50 j M, un compuesto (Compuesto D) convertido en una serie de dilución cuádruple de 18 etapas con la concentración máxima de 10 j M, o DMSO (usado como control), y se cultivó durante cuatro días. La proliferación celular después de cultivar durante cuatro días se midió utilizando WST-8 (Dojindo Laboratories). La actividad inhibidora de la proliferación celular de cada compuesto sobre cada célula se calculó usando la ecuación (1-T/C) x 100 (%), donde T es el valor de absorbancia a 450 nM para un pozo en el que las células se añadieron con el compuesto de cada concentración y se cultivaron, y C es el valor de absorbancia a 450 nM en el que las células se añadieron con DMSO y se cultivaron. Como resultado, las actividades inhibidoras de la proliferación celular de cada uno de los compuestos sobre la cepa que expresaba de manera estable el polipéptido mutante V564F de FGFR2 fusionado con TEL, se debilitaron enormemente con los Compuestos B, C, D y E, mientras que las actividades apenas mostraron cambios con el Compuesto A, en comparación con sus actividades inhibidoras de la proliferación celular sobre la cepa que expresaba de manera estable el polipéptido FGFR2 de tipo silvestre fusionado con TEL, como se muestra en la Fig. 3.

(2) Evaluación de los efectos inhibidores del aumento tumoral in vivo por inhibidores de FGFR

La cepa Ba/F3 establecida en el apartado (1) del Ejemplo 2 que podía expresar de manera estable el polipéptido FGFR2 de tipo silvestre fusionado con TEL o el polipéptido mutante V564F de FGFR2 fusionado con TEL y que podía proliferar independientemente de IL-3, se inoculó por vía subcutánea en la región inguinal de ratones lampiños BALB/c (Japan Charles River) con 5,0 x 106 a 5,2 x 106 células por inoculación. Nueve días después de la inoculación, el Compuesto A o el Compuesto C se suspendió en una solución que contenía DMSO al 10 %, Cremophor EL al 10 %, PEG400 al 15 % y HPCd al 15 %, y se administró a los ratones por vía oral una vez al día a una concentración de 20 ml/kg. Como se muestra en la Fig. 4, las actividades inhibidoras de la proliferación tumoral de cada uno de los compuestos en los ratones portadores de células tumorales que expresan el polipéptido mutante V564F de FGFR2 fusionado con TEL, mostraron una gran reducción con el Compuesto C, mientras que las actividades apenas mostraron cambios con el Compuesto A, en comparación con las actividades en ratones portadores de células tumorales que expresan el polipéptido FGFR2 de tipo silvestre fusionado con TEL.

Asimismo, se recogieron los lisados tumorales de las muestras tumorales que se habían analizado, usando un tampón de lisis celular (Cell Signaling Technology), y se analizó cada uno de los lisados tumorales mediante transferencia Western usando el anticuerpo anti Fosfo-Receptor de FGF (Tyr653/654) (Cell Signaling Technology) o el anticuerpo anti FGFR-2 (Sigma). Como se muestra en la Fig. 5, los efectos inhibidores de cada uno de los compuestos sobre la fosforilación en tumores en ratones portadores de células tumorales que expresaban el polipéptido mutante V564F de FGFR2 fusionado con TEL, mostraron una gran reducción con el Compuesto C, mientras que las actividades apenas mostraron cambios con el Compuesto A, en comparación con las actividades en ratones portadores de células tumorales que expresan el polipéptido FGFR2 de tipo silvestre fusionado con TEL.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Una composición farmacéutica para su uso en un método para el tratamiento del cáncer que comprende, como principio activo, el compuesto representado por la Fórmula (I) siguiente o una sal del mismo farmacéuticamente aceptable, en donde la composición farmacéutica para el tratamiento del cáncer se caracteriza por que se utiliza administrándola a un paciente que expresa un polipéptido mutante de FGFR que comprende una sustitución de valina por fenilalanina en el 7° aminoácido a partir del extremo N y/o una sustitución de valina por leucina en el 5° aminoácido a partir del extremo N en la secuencia de aminoácidos parcial descrita en la SEQ ID NO: 53 o 54 en un polipéptido de FGFR, o que tiene un polinucleótido que codifica dicho polipéptido mutante, en donde las mutaciones son causantes de la adquisición de resistencia a inhibidores de FGFR pero son sensibles al compuesto representado por la siguiente Fórmula (I):

Rⁱrepresenta hidrógeno, hidroxi, halógeno, ciano, nitro, haloalquilo C^1-4, alquilo C^1-6, alquenilo C^2-6, alquinilo C^2-6, cicloalquilo C^3-7, aril C^{6- io}alquilo C^1-4, -OR⁵, -NR⁶R⁷, -(CR⁸R⁹)ⁿZ ⁱ, -C(O)NR^{i 2}R^{i 3}, -SR¹⁴, -SOR¹⁵, -SO²R¹⁶, -NR¹⁷SO²R¹⁸, COOH, arilo C^6-10que está opcionalmente sustituido por uno o más grupos seleccionados independientemente entre el grupo P, heteroarilo de 5 a 10 o heterociclilo de 3 a 10 miembros que está opcionalmente sustituido por uno o más grupos seleccionados independientemente entre el grupo Q, -COR¹⁹, -COOR²⁰, -OC(O)R²¹, -NR²²C(O)R²³, -NR²⁴C(S)R²⁵, -C(S)NR²⁶R²⁷, -SO²NR²⁸R²⁹, -OSO²R³⁰, -SO³R³¹o -Si(R³²)³j R²representa hidrógeno, hidroxi, halógeno, ciano, nitro, haloalquilo C^1-4, alquilo C^1-6, alquenilo C^2-6, alquinilo C^2-6, cicloalquilo C^3-7, aril C^6-i0alquilo C^1-4, -OR⁵, -NR⁶R⁷, -(CR⁸R⁹)ⁿZ ⁱ, -C(O)NR^{i 2}R^{i 3}, -SR¹⁴, -SOR¹⁵, -SO²R¹⁶, -NR¹⁷SO²R¹⁸, COOH, arilo C^6-10que está opcionalmente sustituido por uno o más grupos seleccionados independientemente entre el grupo P, heteroarilo de 5 a 10 o heterociclilo de 3 a 10 miembros que está opcionalmente sustituido por uno o más grupos seleccionados independientemente entre el grupo Q, -COR¹⁹, -COOR²⁰, -OC(O)R²¹, -NR²²C(O)R²³, NR²⁴C(S)R²⁵, -C(S)NR²⁶R²⁷, -SO²NR²⁸R²⁹, -OSO²R³⁰, -SO³R³¹o -Si(R³²)³j o Rⁱy R², junto con un átomo unido a ellos, forman un heterociclilo de 3 a 10 miembros o heteroarilo de 5 a 10 miembros, en donde el heterociclilo o heteroarilo está opcionalmente sustituido por halógeno;

R³representa metilo;

R⁴representa hidrógeno;

A es indol;

R⁵representa alquilo C^1-5, cicloalquilo C^3-7, cicloalquil C^3-7alquilo C^1-3, alquenilo C^2-6, alquinilo C^2-6, haloalquilo C^i-4, alcoxi C^{i -3}alquilo C^1-4, alcoxi C^{i -3}alcoxi C^{i -4}alquilo C^1-4, aldehido C^1-4, alquilamino C^{i -4}alquilo C^1-4, di(alquil C^i-4)amino alquilo C^1-4, arilo C^6-10, aril C^{6 -i0}alquilo C^1-3o heterociclilalquilo C^1-3de 3 a 10 miembros, heterociclilo de 3 a 10 miembros, heteroarilo de 5 a 10 miembros, heteroarilalquilo C^1-3de 5 a 10 miembros, monohidroxi alquilo C ^i-6, dihidroxi alquilo C^1-6o trihidroxi alquilo C^1-6el cual está opcionalmente sustituido por uno o más grupos seleccionados independientemente entre el grupo Q;

R⁶y R⁷, que pueden ser iguales o diferentes, cada uno representa hidrógeno, alquilo C^1-4, alquenilo C^2-6, alquinilo C^2-6, haloalquilo C^1-4, alcoxi C^{i -3}alquilo C^1-4, aril C^6-i0alquilo C^1-3, heterociclilalquilo C^1-3de 3 a 10 miembros, heteroarilalquilo C^1-3de 5 a 10 miembros, monohidroxi alquilo C^1-6, dihidroxi alquilo C^1-6, trihidroxi alquilo C^1-6, heterociclilo de 3 a 10 miembros, aldehido C^1-4, alquilamino C^{i -4}alquilo C^1-4, di(alquil C^{i -4})amino alquilo C^1-4o ciano(alquilo C^1-3); o como alternativa R⁶y R⁷, junto con un átomo de nitrógeno unido a ellos, forman heterociclilo de 3 a i0 miembros o heteroarilo de 5 a 10 miembros;

n representa 1 a 3;

R⁸y R⁹, que pueden ser iguales o diferentes, cada uno representa hidrógeno, alquilo C^1-4o halógeno; o como alternativa R⁸y R⁹, junto con un átomo de carbono unido a ellos, forman un anillo cicloalifático;

Z ⁱrepresenta hidrógeno, NR¹⁰R¹¹, -OH o heterociclilo de 3 a 10 miembros heterociclilo o heteroarilo de 5 a 10 miembros que está opcionalmente sustituido por uno o más grupos seleccionados independientemente entre el grupo Q;

R¹⁰y R¹¹, que pueden ser iguales o diferentes, cada uno representa alquilo C^1-4, alquenilo C^2-6, alquinilo C^2-6, haloalquilo C^1-4, alcoxi C^{i -3}alquilo C^1-4, ciano(alquilo C^1-3) o alquilsulfonil C^{i -3}alquilo C^1-4; o como alternativa R¹⁰y R¹¹, junto con un átomo de nitrógeno unido a ellos, forman un heterociclilo de 3 a 10 miembros o un heteroarilo de 5 a 10 miembros;

R¹²y R¹³, que pueden ser iguales o diferentes, cada uno representa hidrógeno, alquilo C^1-4, alquenilo C^2-6, alquinilo C^2-6, haloalquilo C^1-4, alcoxi C^1-3alquilo C^1-4, arilo C^6-10, heteroarilo de 5 a 10 miembros, heterociclilo de 3 a 10 miembros, aril C^6-10alquilo C^1-4, heterociclilalquilo C^1-3de 3 a 10 miembros, heteroarilalquilo C^1-3de 5 a 10 miembros, ciano(alquilo C^1-3), alquilsulfonil C^1-3alquilo C^1-4, anillo cicloalifático de 3 a 10 miembros, heteroarilo de 5 a 10 miembros o heterociclilo de 3 a 10 miembros; o como alternativa R¹²y R¹³, junto con un átomo de nitrógeno unido a ellos, forman heterociclilo de 3 a 10 miembros o heteroarilo de 5 a 10 miembros que está opcionalmente sustituido por uno o más grupos seleccionados independientemente entre el grupo Q;

R¹⁴representa alquilo C^1-4, alquenilo C^2-6, alquinilo C^2-6, haloalquilo C^1-4, arilo C^6-10que está opcionalmente sustituido por uno o más grupos seleccionados independientemente entre el grupo P, o heteroarilo de 5 a 10 miembros o heterociclilo de 3 a 10 miembros que está opcionalmente sustituido por uno o más grupos seleccionados independientemente entre el grupo Q;

R¹⁷representa hidrógeno o alquilo C^1-4;

R²²representa hidrógeno, alquilo C^1-4o haloalquilo C^1-4;

R²⁴representa hidrógeno, alquilo C^1-4o haloalquilo C^1-4;

R³²representa alquilo C^1-4o arilo C^6-10;

2. La composición farmacéutica para su uso según la reivindicación 1, que comprende, como principio activo, el compuesto representado por la fórmula siguiente o una sal del mismo farmacéuticamente aceptable:

3. Un polipéptido mutante de FGFR que comprende una sustitución de valina por fenilalanina en el 7° aminoácido a partir del extremo N y/o una sustitución de valina por leucina en el 5° aminoácido a partir del extremo N en la secuencia de aminoácidos parcial descrita en la SEC ID NO: 53 o 54 en un polipéptido de FGFR, o

un polinucleótido que codifica dicho polipéptido mutante, o un vector que comprende dicho polinucleótido, o una célula recombinante que comprende dicho vector.

4. Un método para detectar un polinucleótido que codifica un polipéptido mutante de FGFR, que comprende la etapa de detectar un polinucleótido que codifica el polipéptido mutante en una muestra aislada de un sujeto usando un par de cebadores oligonucleotídicos o una o más sondas oligonucleotídicas que comprende uno o más oligonucleótidos que se hibridan específicamente con un polinucleótido que codifica el polipéptido mutante de la reivindicación 3 para detectar o amplificar el polinucleótido.

5. Un kit para detectar un polinucleótido que codifica un polipéptido mutante de FGFR, que comprende un par de cebadores oligonucleotídicos o una o más sondas oligonucleotídicas que comprenden uno o más oligonucleótidos que se hibridan específicamente con un polinucleótido que codifica el polipéptido mutante de la reivindicación 3 para detectar o amplificar el polinucleótido.

6. La composición farmacéutica de la reivindicación 1 o 2 para su uso en un método para el tratamiento del cáncer, que comprende determinar la presencia o ausencia del polipéptido mutante de la reivindicación 3 o de un polinucleótido que codifica el polipéptido mutante en una muestra aislada de un sujeto y administrar la composición farmacéutica de la reivindicación 1 o 2 al sujeto cuando se detecta el polipéptido mutante o el polinucleótido, en particular, en donde el cáncer es cáncer de vejiga, tumor cerebral, carcinoma epidermoide de cabeza y cuello, cáncer de pulmón, adenocarcinoma de pulmón, carcinoma epidermoide de pulmón, melanoma cutáneo, cáncer de endometrio, cáncer de mama, cáncer de próstata, cáncer de colon, cáncer de esófago, cáncer gástrico, cáncer del conducto colédoco, cáncer de las vías biliares o cáncer de hígado.

7. Un método para seleccionar un paciente al que se le puede aplicar la composición farmacéutica de la reivindicación 1 o 2, que comprende las etapas de:

(a) determinar la presencia o ausencia del polipéptido mutante de la reivindicación 3 en una muestra aislada de un sujeto; y

(b) seleccionar un sujeto que demuestra tener el polipéptido mutante, como un paciente al que se le puede aplicar la composición farmacéutica.

8. Un método para seleccionar un paciente al que se le puede aplicar la composición farmacéutica de la reivindicación 1 o 2, que comprende las etapas de:

(a) determinar la presencia o ausencia de un polinucleótido que codifica el polipéptido mutante de la reivindicación 3 en una muestra aislada de un sujeto; y

(b) seleccionar un sujeto que demuestra tener un polinucleótido que codifica el polipéptido mutante, como un paciente al que se le puede aplicar la composición farmacéutica,

en particular, en donde el cáncer es cáncer de vejiga, tumor cerebral, carcinoma epidermoide de cabeza y cuello, cáncer de pulmón, adenocarcinoma de pulmón, carcinoma epidermoide de pulmón, melanoma cutáneo, cáncer de endometrio, cáncer de mama, cáncer de próstata, cáncer de colon, cáncer de esófago, cáncer gástrico, cáncer del conducto colédoco, cáncer de las vías biliares o cáncer de hígado.

9. El compuesto definido en la reivindicación 1 o 2, o una sal del mismo farmacéuticamente aceptable, para su uso en un método para el tratamiento de cáncer en un paciente que expresa el polipéptido mutante de la reivindicación 3 o que tiene un polinucleótido que codifica el polipéptido mutante, en particular, en donde el cáncer es cáncer de vejiga, tumor cerebral, cáncer epidermoide de cabeza y cuello, cáncer de pulmón, adenocarcinoma de pulmón, carcinoma epidermoide de pulmón, melanoma cutáneo, cáncer de endometrio, cáncer de mama, cáncer de próstata, cáncer de colon, cáncer de esófago, cáncer gástrico, cáncer del conducto colédoco, cáncer de las vías biliares o cáncer de hígado.

10. Una composición farmacéutica para su uso en un método para el tratamiento del cáncer que comprende, como principio activo, el compuesto representado por la fórmula siguiente o una sal del mismo farmacéuticamente aceptable, en donde el cáncer expresa un polipéptido mutante de FGFR que comprende una sustitución de valina por fenilalanina en el 7° aminoácido a partir del extremo N y/o una sustitución de valina por leucina en el 5° aminoácido a partir del extremo N en la secuencia de aminoácidos parcial descrita en la SEQ ID NO: 53 o 54 en un polipéptido de FGFR, en donde las mutaciones son causantes de la adquisición de resistencia a inhibidores de FGFR pero son sensibles al compuesto representado por la siguiente fórmula:

11. Una composición farmacéutica para su uso según la reivindicación 1, en donde el compuesto de fórmula (I) inhibe la función o expresión de un polipéptido mutante de FGFR que comprende una sustitución de valina por fenilalanina en el 7° aminoácido a partir del extremo N y/o una sustitución de valina por leucina en el 5° aminoácido a partir del extremo N en la secuencia de aminoácidos parcial descrita en la SEQ ID NO: 53 o 54 en un polipéptido de FGFR, en donde las mutaciones son causantes de la adquisición de resistencia a inhibidores de FGFR pero son sensibles al compuesto representado por la siguiente fórmula: