CZ106299A3 - Protilátky proti proteinu příbuznému s lidským parathyroidálním hormonem - Google Patents

Protilátky proti proteinu příbuznému s lidským parathyroidálním hormonem Download PDF

Info

Publication number
CZ106299A3
CZ106299A3 CZ991062A CZ106299A CZ106299A3 CZ 106299 A3 CZ106299 A3 CZ 106299A3 CZ 991062 A CZ991062 A CZ 991062A CZ 106299 A CZ106299 A CZ 106299A CZ 106299 A3 CZ106299 A3 CZ 106299A3
Authority
CZ
Czechia
Prior art keywords
chain
antibody
region
dna
human
Prior art date
Application number
CZ991062A
Other languages
English (en)
Inventor
Koh Sato
Yuji Wakahara
Naohiro Yabuta
Original Assignee
Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha filed Critical Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha
Publication of CZ106299A3 publication Critical patent/CZ106299A3/cs

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/26—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against hormones ; against hormone releasing or inhibiting factors
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/24—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin containing regions, domains or residues from different species, e.g. chimeric, humanized or veneered
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/76—Antagonist effect on antigen, e.g. neutralization or inhibition of binding
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Description

Protilátky proti proteinu příbuznému parathyroidálnim hormonem
Oblast techniky
Předkládaný vynález se týká lidské/myši chimérické protilátky obsahující variabilní region (V region) myší monoklonální protilátky proti proteinu příbuznému s parathyroidálnim hormonem a konstantní region (C region) lidské protilátky, humanizované protilátky, ve které jsou komplementaritu určující regiony lehkého řetězce (L řetězce) a těžkého řetězce (H řetězce) V regionů myší monoklonální protilátky proti proteinu příbuznému s parathyroidálnim hormonem (PTHrP) přeneseny na lidškou protilátku, L a H řetězců uvedené protilátky, stejně jako polypeptidu obsahujícího V region tvořící L nebo H řetězec uvedené protilátky.
Předkládaný vynález se také týká DNA obsahující sekvenci baží kódující výše uvedenou protilátku, zejména její V region, a DNA kódující L nebo H řetězec obsahující V region. Dále se předkládaný vynález týká rekombinantního vektoru obsahujícího uvedenou DNA a hostitele transformovaného uvedeným vektorem.
Dále se předkládaný vynález týká způsobů pro přípravu chimérických a humanizovaných protilátek proti PTHrP. Ještě dále se předkládaný vynález týká farmaceutického prostředku, a činidel potlačujících hyperkalcemii nebo zlepšujících hypofosfatemii, která obsahují protilátku proti PTHrP jako účinnou složku.
Dosavadní stav techniky ··*·
Hyperkalcemie spojená s maligními nádory je vážnou komplikací, která se vyskytuje u 5 až 20% všech pacientů s maligními nádory a je považována za terminální příznak maligního nádoru, protože vede jistě ke smrti, pokud není léčena. Kontrola hyperkalcemie může příznivě ovlivnit prognosu a QOL (kvalitu života) pacienta; proto bude mít klinický význam.
Obecně, hyperkalcemie u pacientů s maligními nádory je obecně dělena na HHM (humorální hyperkalcemie u malignit), která vzniká v důsledku tumorem produkovaných humorálních faktorů pro resorpci kosti, a LOH (lokální osteolytická hyperkalcemie), která vzniká v důsledku lokálního účinku nádoru disseminovaného do kosti nebo infiltrujícího kost. U HHM se soudí, že kostní resorpce nebo osteolýza způsobuje zvýšený výdej vápníku a způsobuje hyperkalcemii společně se sníženou schopností ledvin vylučovat vápník (S. Wada and N. Nagata, Internal Medicine, 69: 644 - 648).
Hyperkalcemie se projevuje, pokud koncentrace vápníku v séru překročí 12 mg/dl; jako její příznaky jsou v časném stadiu u pacientů s maligním nádorem nespecificky pozorovány anorexie (nechutenství), nause a emese (zvracení). Při zhoršení anorexie vede redukce koncentrační schopnosti ledvin, která je způsobena lézí distálních tubulů, k hyperurese (polyurii) a anorexie a nausea jsou doprovázeny dehydratací způsobenou nedostatečným zpětných vychytáváním vody.
Jako humorálni faktory způsobující HHM u pacientů s hyperkalcemii spojenou s maligními nádory identifikoval Moseley, J.M. et al. protein příbuzný s paratyroidálním hormonem (zde dále označován jako PTHrP) , což je substance podobná paratyroidálnímu hormonu (PTH): Proč. Nati. Acad. Sci. USA (1987) 84: 5048 - 5052.
Potom byl izolován gen kódující pTHrP (Sůva, L.J. et al., Science (1987) 237: 893) a při jeho analýze bylo zjištěno, že existují tři druhy lidského PTHrP mající 139, 141 a 173 aminokyselin, což je způsobeno alternativním sestřihem genu, a že v krvi jsou přítomné různé fragmenty, což je způsobeno omezenou degradací PTHrp (1-139) majícího úplnou strukturu: Baba, H. Clinical Calcium (1995) 5: 229 - 223. V PTHrP je 8 aminokyselin z N-koncových 13 aminokyselin identických s aminokyselinami PTH a je odvozeno, že aminokyselinové místo v pozici 14 až 34 má sterickou strukturu také stejnou jako PTH; proto se PTHrP a PTH váží na společný PTH/PTHrP receptor alespoň v N-koncovém regionu: Jueppner, H. et al., Science (1991) 254: 1024 - 1026; Abou-Samra, A-B. et al., Proč. Nati. Acad. Sci. USA (1992) 89: 2732 - 2736.
Je popsána produkce PTHrP v mnoha nádorových tkáních a byl zjištěn i mimo nádory, například v různých normálních tkáních plodů až dospělých jedinců, včetně kůže, centrálního nervového systému, dělohy, placenty, prsní žlázy v laktaci, štítné žlázy, příštitných tělísek, nadledvinek, jater, ledvin a močového měchýře: Burtis, W.J. Clin. Chem. (1992) 38: 2171 - 2183;
Stewart, A.F. and Broadus, A.E. J. Clin. Endocrinol. (1991) 71: 1410 - 1414. Dále, soudí se, že PTHrP má významnou úlohu v regulaci metabolismu vápníku, který je udržován na vyšší koncentraci ve fetálním až novorozeneckém období, než je u matky.
V současnosti je známo, že PTH/PTHrP receptory jsou přítomny zejména v kostech a ledvinách (C. Shigeno, Clinical Calcium (1995) 5: 355 - 359) a že aktivují po vazbě PTHrP na receptory mnoho intracelulárních systémů přenosu signálu. Jedním z nich je adenylatcyklasa a jiným je fosfolipasa C. Aktivace adenylatcyklasy zvyšuje koncentraci intracelulárního cAMP pro aktivaci protein kinasy A. Fosfolipasa C způsobuje rozklad fosfatidylinositol-4,5-bisfosfonatu za vzniku inositol-1,4,5trifosfonatu a diacylglycerolu. V těchto systémech přenosu signálu je obsažen G-protein: Coleman, D.T et al., Biochemical Mechanisms of parathyroid hormone action, v The parathyroids (Bilezikian J.P. et al., Raven Press, New York (1994), strana
239.
Prostřednictvím těchto systémů přenosu signálu způsobuje PTHrP hyperkalcemii, hypofosfatemii, snižuje renální schopnost resorpce fosfátů, zvyšuje renální exkreci cAMP a podobné jevy, které jsou pozorovány u HHM.
Tak bylo zjištěno, že PTHrP těsně souvisí s hyperkalcemii spojenou s maligními nádory. V léčbě hyperkalcemie spojené s maligními nádory se používá kalcitonin, steroidní přípravky, indomethacin, anorganické fosfátové soli, bisfosfonaty a podobně, stejně jako dodávání tekutin. Nicméně, tato činidla mohou mít redukovaný účinek po opakovaném podání, mohou mít některé závažné nežádoucí účinky nebo mohou mít pomalý nástup farmakologického účinku; v souladu s tím je žádoucí použití činidel nebo léčiv, která mají vyšší terapeutický účinek a méně nežádoucích účinků.
Na druhou stranu, jako nový pokus o léčbu hyperkalcemie spojené s maligními nádory popisuje Kukreja, S.C. et al., že při podání neutralizačního antiséra proti PTHrP athymickým myším, kterým byly pro vyvolání hyperkalcemie transplantovány lidské buňky nádoru plic nebo laryngu, byly koncentrace vápníku v krvi a koncentrace cAMP v moči redukovány: J. Clin. Invest.
« · ·· ···· ·» (1988;
82:
1798 - 1802. Kanji Sáto et al. popisují, že při podání protilátky proti PTHrP(1-34) holým myším, kterým byl transplantován lidský nádor produkující PTHrP, byla hyperkalcemie redukována a doba života myší byla značně prodloužena: J Bone and Mine. Res. (1993) 8: 849 - 860. Dále, Japonská otevřená patentová přihláška č. 4-228089 popisuje myší/lidské chimérické protilátky proti lidskému PTHrP(l-34).
Myší monoklonální protilátky jsou vysoce imunogenní (někdy se též používá výraz antigenní) u lidí, což omezuje terapeutickou hodnotu myších monoklonálních protilátek u lidí. Například, myší protilátka může být metabolizována jako cizorodá látka při podání lidem; proto je poločas myší protilátky relativně krátký u lidí a nevykazuje předpokládané účinky. Dále, lidské anti-myší protilátky (HAMA) namířené proti podané myší protilátce mohou vyvolávat imunitní odpovědi, které jsou nepříjemné a nebezpečné pro pacienty, jako je sérová nemoc nebo jiné alergické reakce. V souladu s tím nemohou být myší monoklonální protilátky podávány lidem často.
Pro řešení těchto problémů byly vyvinuty metody pro redukci imunogeniclty non-lidských protilátek, například myších monoklonálních protilátek. Jednou z těchto metod je výroba chimérické protilátky, ve které je variabilní region (V region) odvozen z myší monoklonální protilátky a konstantní region (C region) je odvozen z vhodné lidské protilátky.
Jelikož má výsledná chimérická protilátka intaktní variabilní region původní myší protilátky, je možno očekávat, že se chimérická protilátka bude vázat na antigen se stejnou specificitou jako původní myší protilátka. Dále, taková chimérická protilátka má významně redukovanou část aminokyselinové sekvence odvozené od jiného živočicha než ·· 9·9· • · ·« ► · · • · · · • · · · · · · • ···· · ·· · • · ·· ··· ··· • · · · · • · · · · · · · · člověka; proto se předpokládá, že bude mít nižší imunogenicitu ve srovnání s původní myší protilátkou. Ačkoliv se chimérická protilátka váže na antigen ekvivalentně k původní myší protilátce a zároveň vykazuje nižší imunogenicitu, mohou být stále ještě vyvolány nějaké imunitní odpovědi proti myšímu variabilnímu regionu: LoBuglio, A.F. et al., Proč. Nati. Acad. Sci. USA 86: 4220 - 4224, 1989.
Druhý způsob pro redukci imunogenicity myších protilátek je ještě složitější, ale očekává se u něj vyšší redukce potenciální imunogenicity myších protilátek. V tomto způsobu jsou na lidský variabilní region přeneseny pouze komplementaritu určující regiony (CDR) variabilního regionu myší protilátky a je vytvořen přetvořený lidský variabilní region. Poud je to žádoucí, může být částečná aminokyselinová sekvence regionu pracovního rámce (FR) nesoucí CDR ve variabilním regionu myší protilátky přenesena na lidský variabilní region, aby byla struktura CDR v přetvořeném lidském variabilním regionu bžší struktuře původní myší protilátky.
Potom jsou tyto humanizované, přetvořené variabilní regiony kombinovány s lidskými konstantními regiony. V konečně přetvořené, humanizované protilátce jsou částmi odvozenými z non-lidských aminokyselinových sekvencí pouze CDR a velmi malé části FR. CDR jsou složeny z hypervariabilni aminokyselinové sekvence a nevykazují žádné druhově specifické sekvence. Proto nebude mít humanizovaná protilátka obsahující myší CDR žádnou silnější imunogenicitu, než přirozená lidská protilátka obsahující lidské CDR.
Další odkazy na humanizované protilátky jsou v Riechmann, L. et al., Nátuře, 332: 323 - 327, 1988; Verhoeye, M. et al., Science, 239: 1534 - 1536, 1988; Kettleborough, C.A. et al., • · ··
Protein Engng., 4: 773 - 783, 1991; Maeda, H. et al., Human
Antibodies and Hybridoma, 2: 124 - 134, 1991; Gorman, S.D. et al., Proč. Nati. Acad. Sci. USA 88: 4181 - 4185, 1991; Tempest
P.R. et al., Bio/Technology 9: 266 - 271, 1991; Co, M.S. et al., Proč. Nati. Acad. Sci. USA 88: 2869 - 2873, 1991; Carter,
P. et al., Proč. Nati. Acad. Sci. USA 89: 4285 - 4289, 1992; C,
M.S. et al., J. Immunol. 148: 1149 - 1154, 1992; a Sáto, K. et al., Cancer Res. 53: 851 - 856, 1993.
Ačkoliv se očekává, že humanizované protilátky jsou použitelné pro výše uvedené účely, není ve výše uvedených odkazech uvedena ani naznačena žádná humanizovaná protilátka proti PTHrP. Dále, neexistuji žádné standardizované prostředky obecně použitelné na jakékoliv protilátky v procesu pro přípravu humanizovaných protilátek; různé prostředky a způsoby jsou nutné pro výrobu humanizované protilátky vykazující dostatečnou vazbu, neutralizační aktivitu pro specifický antigen: viz například Sáto, K. et al., Cancer Res., 53: 851 856, 1993.
Podstata vynálezu
Předmětem předkládaného vynálezu je lidská/myší chimérická protilátka obsahující variabilní region (V region) myší monoklonální protilátky proti PTHrP a konstantní region (C region) lidské protilátky, humanizované protilátky, ve které jsou komplementaritu určující regiony lehkého řetězce (L řetězce) a těžkého řetězce (H řetězce) V regionů myší monoklonální protilátky proti PTHrP přeneseny na lidskou protilátku, L a H řetězců uvedené protilátky, stejně jako polypeptidu obsahujícího V region tvořící L nebo H řetězec uvedené protilátky.
·· ·»*· • ··· · · · · · · · · · • · · · · · · ··«· ·· 4· ··· ·· ··
Jiným předmětem předkládaného vynálezu je DNA obsahujíc! sekvenci bázi kódující výše uvedenou protilátku, zejména její V region, a DNA kódující L a H řetězec obsahující polypeptid obsahující V region. Ještě jiným předmětem předkládaného vynálezu je rekombinantní vektor obsahující uvedenou DNA a hostitel transformovaný uvedeným vektorem. Dále, předmětem předkládaného vynálezu je způsob pro přípravu chimérických a humanizovaných protilátek proti PTHrP. Ještě dalším předmětem předkládaného vynálezu je protilátka proti PTHrP mající vysokou neutralizační aktivitu. Ještě dalším předmětem předkládaného vynálezu je farmaceutický prostředek a hyperkalcemii potlačující, hypofosfatemii zmírňující nebo alkalosu zmírňující činidlo obsahující protilátku nebo humanizovanou protilátku proti PTHrP jako účinnou složku.
V důsledku důkladného studia výše uvedených předmětů vynálezci úspěšně získali protilátku, ve které je imunogenicita myší monoklonální protilátky proti PTHrP redukována u lidí; tak byl učiněn předkládaný vynález.
Předkládaný vynález je zaměřen na chimérický L řetězec obsahující C region L řetězce lidské protilátky a V region L řetězce myší monoklonální protilátky proti PTHrP. V region L řetězce zahrnuje jeden z regionů obsahujících aminokyselinovou sekvenci podle SEQ ID NO: 45 a C region L řetězce zahrnuje θλ region.
Předkládaný vynález je také zaměřen na chimérický H řetězec obsahující C region H řetězce lidské protilátky a V region H řetězce myší monoklonální protilátky proti PTHrP. V region H řetězce zahrnuje jeden z regionů obsahujících aminokyselinovou sekvenci podle SEQ ID NO: 46 a C region L řetězce zahrnuje Cyl region.
4
4 4
4 4 ♦♦ 444· ♦ 4
4 4 4 4 4 · 4 4 4 4444 * 4 4 4 4 4
4 4 4 4
4444 4· 4 4 444
Dále se předkládaný vynález týká chimérické monoklonální protilátky proti PTHrP obsahující uvedený chimérický L řetězec a uvedený chimérický H řetězec.
Ještě dále předkládaný vynález zahrnuje polypeptid obsahující V region L řetězce humanizované protilátky obsahující regiony pracovních rámců 1 až 4 V regionu L řetězce lidské protilátky a komplementaritu určující regiony 1 až 3 V regionu L řetězce myší monoklonální protilátky proti PTHrP. Komplementaritu určující regiony 1 až 3 zahrnují ty, které obsahují aminokyselinovou sekvenci podle SEQ ID NO: 59 - 61, v příslušném pořadí; regiony pracovních rámců 1 až 3 zahrnují ty regiony, které jsou odvozeny od regionů pracovních rámců 1 až 3 lidské protilátky HSU03868, v příslušném pořadí a region pracovního rámce 4 zahrnuje ty regiony, které jsou odvozeny od regionu pracovního rámce 4 lidské protilátky S25755; nebo regiony pracovních rámců 1 až 3 zahrnují ty regiony, které jsou v podstatě identické s regiony pracovních rámců 1 až 3 lidské protilátky HSU03868, v příslušném pořadí a region pracovního rámce 4 zahrnuje takový region, který je v podstatě identický s regionem pracovního rámce 4 lidské protilátky S25755.
Termín v podstatě identický, jak je zde použit, znamená, že regiony pracovních rámců lidské protilátky použité v humanizované protilátce mohou mít delece, náhrady a/nebo adice aminokyselin nutných pro tvorbu komplementaritu určujících regionů myší monoklonální protilátky tak, že humanizovaná protilátka bude mít aktivitu ekvivalentní aktivitě myší monoklonální protilátky.
Tak je předkládaný vynález zaměřen na polypeptid obsahující V region L řetězce humanizované protilátky, kde v regionech • · ·· · · ·· · · 9 · 9 9
9 9 9 9 9 9 9 9 9
9 99 9 9 999 9 9 9 9
99999999999999 9 9 9 9 9 9 9 9
999 9 99 99 999 99 99 pracovních rámců jsou na 36. a 49. aminokyselinové pozici podle Kabata (Kabat, E.A., US Dept. Health and Human Services, US Government Printing Offices, 1991) tyrosin a kyselina asparagová, v příslušném pořadí.
Předkládaný vynález je také zaměřen na polypeptid obsahující
V region L řetězce humanizované protilátky obsahující aminokyselinovou sekvenci uvedenou v jakékoliv ze SEQ ID NO: 48 - 51.
Dále je předkládaný vynález zaměřen na polypeptid obsahující
V region L řetězce humanizované protilátky, kde v regionech pracovních rámců jsou na 45. a 87. aminokyselinové pozici podle Kabata lysin a isoleuciri, v příslušném pořadí.
Ještě dále je předkládaný vynález zaměřen na polypeptid obsahující V region L řetězce humanizované protilátky obsahující aminokyselinovou sekvenci uvedenou v jakékoliv ze SEQ ID NO: 52 - 55.
Předkládaný vynález také zahrnuje polypeptid obsahující V region H řetězce humanizované protilátky obsahující regiony pracovních rámců 1 až 4 V regionu H řetězce lidské protilátky a komplementaritu určující regiony 1 až 3 V regionu H řetězce myší monoklonální protilátky proti PTHrP. Komplementaritu určující regiony 1 až 3 zahrnují ty, které obsahují aminokyselinovou sekvenci podle SEQ ID NO: 62 - 64, v příslušném pořadí; regiony pracovních rámců 1 až 4 zahrnují ty regiony, které jsou odvozeny od regionů pracovních rámců 1 až 4 lidské protilátky patřící do lidské podskupiny III (Human Subgroup III (HSG III), Kabat, E.A. et al., US Dept. Health and Human Services, US Government Printing Offices, 1991), přesněji
4* · /
4444 • 4 44 4444 44 44 * 444 4 4 4 · *44 4 · ·44 4 4 · · • ·4· 4 44 *4**4* 4 4 ** 4 4 4
4* 4* 4 4 4 4* 44 ty regiony, které jsou odvozeny od regionů pracovních rámců 1 až 4 lidské protilátky S31679, v příslušném pořadí nebo regiony, které jsou v podstatě identické s regiony pracovního rámce 1-4 lidské protilátky S31679, v příslušném pořadí.
Dále je předkládaný vynález zaměřen na polypeptid obsahující V region H řetězce humanizované protilátky obsahující aminokyselinovou sekvenci uvedenou v SEQ ID NO: 56.
Předkládaný vynález také zahrnuje L řetězec humanizované protilátky proti lidskému PTHrP obsahující polypeptid obsahující V region L řetězce uvedené humanizované protilátky a polypeptid obsahující C region L řetězce lidské protilátky. C region obsahuje Ολ region, regiony pracovních rámců 1 až 3 zahrnují ty regiony, které jsou v podstatě identické s regiony pracovních rámců 1 až 3 lidské protilátky HSU03868, v příslušném pořadí, region pracovního rámce 4 zahrnuje ten region, který je v podstatě identický s regionem pracovního rámce 4 lidské protilátky S25755 a aminokyselinové sekvence komplementaritu určujících regionů 1 až 3 zahrnují ty, které jsou uvedeny v SEQ ID NO: 59 - 61, v příslušném pořadí.
Dále, předkládaný vynález také zahrnuje H řetězec humanizované protilátky proti lidskému PTHrP obsahující polypeptid obsahující C region H řetězce a V region H řetězce uvedené humanizované protilátky. C region obsahuje Cyl region, regiony pracovních rámců 1 až 4 zahrnují ty regiony, které jsou v podstatě odvozené od regionů pracovních rámců 1 až 4 lidské protilátky patřící k HSGIII; komplementaritu určující regiony 1 až 3 zahrnují ty, které obsahují aminokyselinovou sekvenci uvedenou v SEQ ID NO: 62 - 64, v příslušném pořadí.
«· ·· • ·· • · · · • to toto to · · «· to · to· ·· totototo • to • ··· «· ·· • ·· to • · · to • · · to · · • · to · ··
Ještě dále se předkládaný vynález také týká anti-PTHrP protilátky se slabou antigenicitou a vysokou neutralizační aktivitou. Protilátky proti PTHrP zahrnují lidské protilátky, humanizované protilátky, chimérické protilátky a primatizované protilátky, které mohou být použity v léčbě lidských onemocnění. Dále, protilátka podle předkládaného vynálezu má vysokou neutralizační aktivitu v důsledku nízké disociační konstanty a proto může být použita pro léčbu lidských onemocnění.
Protilátka podle předkládaného vynálezu má disociační konstantu 1,86 x 10~7 (M) nebo nižší, disociační rychlostní konstantu 1,22 x 10-1 (1/s) nebo nižší a asociační rychlostní konstantu 6,55 x 104 (1/M.s) nebo vyšší. Tyto konstanty mohou být měřeny Scatchardovou analýzou pomocí Rl značených ligandů nebo za použití sensoru povrchové plasmonové rezonance.
Předkládaný vynález je také zaměřen na DNA obsahující sekvenci baží kódující V region L řetězce nebo V region H řetězce myší monoklonální protilátky proti lidskému PTHrP. V region L řetězce a V region H řetězce zahrnují ty, které obsahují aminokyselinovou sekvenci podle SEQ ID NO: 45-46, v příslušném pořadí, DNA obsahující sekvenci baží kódující V region L řetězce zahrnuje, například, DNA podle SEQ ID NO: 65 a DNA obsahující sekvenci baží kódující V region H řetězce zahrnuje, například, DN71 podle SEQ ID NO: 57.
Dále se předkládaný vynález také týká DNA kódující uvedené chimérické L a H řetězce. DNA kódující uvedený L řetězec zahrnuje, například, DNA obsahující sekvenci baží podle SEQ ID NO: 65 a DNA kódující uvedený H řetězec zahrnuje, například, DNA obsahující sekvenci baží podle SEQ ID NO: 57.
• to· · ··· ·· ··«· • to • · • · to··· ··
Ještě dále je předkládaný vynález také zaměřen na DNA obsahující sekvenci baží kódující V region L řetězce nebo V region H řetězce uvedené humanizované protilátky. DNA obsahující sekvenci baží kódující V region L řetězce zahrnuje, například, DNA obsahující sekvenci baží podle jakékoliv ze SEQ ID NO: 66 - 74 a DNA obsahující sekvenci baží kódující V region H řetězce zahrnuje, například, DNA podle SEQ ID NO: 58.
Předkládaný vynález se také týká DNA pro V region L řetězce humanizované protilátky obsahující sekvenci baží kódující aminokyselinovou sekvenci podle jakékoliv ze SEQ ID NO: 47 55. Uvedená DNA zahrnuje DNA obsahující sekvenci baží podle jakékoliv ze SEQ ID NO: 66 - 74.
Ještě dále se předkládaný vynález také týká DNA pro V region H řetězce humanizované protilátky obsahující sekvenci baží kódující aminokyselinovou sekvenci podle SEQ ID NO: 56. Uvedená DNA zahrnuje DNA obsahující sekvenci baží podle SEQ ID NO: 58.
Předkládaný vynález se také týká rekombinantního vektoru obsahujícího jakoukoliv z uvedených DNA.
Předkládaný vynález se také týká transformantů transformovaných uvedeným rekombinantním vektorem.
Předkládaný vynález se také týká způsobu pro přípravu chimérické nebo humanizované protilátky proti lidskému proteinu příbuznému s parathyroidálním hormonem, který obsahuje kultivaci uvedeného transformantů a odběr chimérické nebo humanizované protilátky proti lidskému proteinu příbuznému s parathyroidálním hormonem z výsledné kultury.
·· 4Φ 9 9 9
9 99 9 9 9 9
9 9 • 999 99 ·· *··· • · • ··« • · • · ··
99
99
9 9 ·
9 9 9
999 999 • 9 • 9 99
Ještě dále se předkládaný vynález také týká farmaceutického prostředku a hyperkalcemii potlačujícího, hypofosfatemii zmírňujícího činidla obsahujícího uvedenou protilátku jako účinnou složku. Hyperkalcemie je způsobena maligním nádorem a hypofosfatemie je často pozorována u pacientů trpících hyperkalcemii spojenou s maligními nádory. Tak může být protilátka podle předkládaného vynálezu použita při léčbě maligních nádorů nebo pro zlepšení příznaků hyperkalcemie nebo hypofosfatemie. Maligní nádory zahrnují, ale nejsou omezeny na, nádory vybrané se skupiny skládající se z nádorů slinivky břišní, plic, hltanu, hrtanu, jazyka, dásně, jícnu, žaludku, žlučových cest, prsu, ledvin, močového měchýře, dělohy a prostaty a maligních lymfomů. Činidlo potlačující hyperkalcemii podle předkládaného vynálezu je použitelné pro jakýkoliv nádor, který způsobuje hyperkalcemii.
Předkládaný vynález bude popsán podrobněji dále.
1. Produkce myších monoklonálních protilátek proti lidskému PTHrP
Myší monoklonální protilátky proti PTHrP mohou být připraveny pomocí hybridomů vzniklých fúzí buněk mezi myelomovými buňkami a buňkami produkujícími protilátky, které jsou získány od zvířat imunizovaných antigenem a selekcí klonů produkujících protilátky specificky inhibující aktivitu PTHrP z vzniklých hybridomů.
(1) Příprava antigenů
PTHrP použitý pro imunizaci zvířat zahrnuje peptidy mající celou nebo část aminokyselinové sekvence PTHrP připraveného rekombinantní DNA technologií nebo chemickou syntesou, a PTHrP ·· <0 • 0 0000
000 000 0000 0 000 0 0 000 0 0 0 0
000 0 00 000 000 00000 0 0 0
0000 00 00 000 00 00 získaný ze supernatantů nádorových buněk způsobujících hyperkalcemii. Například, peptid PTHrP(1-34) obsahující 1. až 34. aminokyselinu známého PTHrP (Kemp, B.E. et al., Science (1987) 238: 1568 - 1570) může být použit jako antigen. Lidský PTHrP(1-34) má aminokyselinovou sekvenci uvedenou v SEQ ID NO: 75.
Vzniklý PTHrP je navázán na proteinový nosič jako je thyreoglobulin a potom následuje přidáni pomocného činidla. Může být přidáno jakékoliv pomocné činidlo, včetně Freundova kompletního a inkompletního adjuvans.
(2) Imunizace a získání buněk produkujících protilátku
Získaný antigen se podá savci, jako je například myš, krysa, kůň, opice, králík, koza nebo ovce. Imunizace může být provedena jakoukoliv známou technikou, včetně intravenosní, subkutánní a intraperitoneální injekce. Intervaly mezi injekcemi pro imunizaci nejsou přesně určeny a mohou být od několika dnů do několika týdnů, výhodně jsou 4 až 21 dnů.
Dva až tři dny po konečné imunizaci se získají buňky produkující protilátky. Buňky produkující protilátky zahrnují buňky sleziny, lymfatických uzlin a krve; obyčejně se použijí buňky sleziny. Jednotlivá dávka antigenu, která je použita pro imunizaci, je 100 pg na myš.
(3) Určení titrů protilátek
Pro určení hladin imunitní odpovědi u imunizovaných zvířat a hybridomů vybraných z buněk, které byly podrobeny fúzi, se měří titr protilátky v krvi imunizovaných zvířat nebo titr protilátky v supernatantu buněk produkujících protilátku.
9 1 1
111 • ♦ « · » · • · ··
Způsoby pro detekci protilátek jsou známé a zahrnuji EIA (Enzymový imunotest), RIA (radioaktivně značený imunotest) a ELISA (enzymový imunosorbentni test).
(4) Fúze buněk
Myelomové buňky použité pro fúzi s buňkami produkujícími protilátky zahrnují buněčné linie, které jsou získány od různých živočichů jako jsou myši, krysy nebo lidé a jsou obyčejně odborníkům v oboru známé. Vhodnými buněčnými liniemi jsou ty linie, které mají lékovou resistenci, které nejsou životaschopné v selektivním mediu jako je HAT medium v nefuzovaném stavu a které jsou životaschopné pouze ve fúzovaném stavu. Obyčejně jsou použity buněčné linie resistentní na 8azaguanin, kterým chybí hypoxantin-guaninfosfororibosyltransferasa a nejsou schopné růstu v hypoxantinaminopterin-thymidinovém (HAT) mediu.
Vhodné myelomové buňky zahrnují různé buněčné linie, jako je P3 (P3x63Ag8.653) (J. Immunol. (1979) 123: 1548 - 1550);
P3x63Ag8U.l (Current Topics in Microbiology and Immunology (1978) 81: 1 - 7); NS-1 (Kohler, G. a Milstein, C., Eur. J.
Immunol. (1976) 6: 511 - 519); MPC-11 (Margulies, D.H. et al.,
Cell (197) 8: 405 - 415); SP2/0 (Shulman, M. et al., Nátuře (1978) 276: 269 - 270); FO (de St. Groth, S:F. et al., J.
Immunol. Methods (1980) 35: 1 - 21); S194 (Trowbridge, I.S., J. Exp. Med. (1978) 148: 313 - 323); a R210 (Galfre, G. et al. ,
Nátuře (1979) 277: 131 - 133).
Buňky produkující protilátky mohou být získány z buněk sleziny, buněk lymfatických uzlin a podobně. To znamená, slezina nebo lymfatická uzlina a podobně je odstraněna nebo
90 «··· ·· ·· • · 9 * 0000 009 9 0000 0 00 9 0 900 0 00 900 000 9 0 0 0 0 0 9
99 999 09 99 odebrána z jakéhokoli z výše uvedených zvířat a tkáň je rozrušena. Vzniklý rozrušený materiál se suspenduje v mediu nebo pufru, jako je PBS, DMEM nebo RPMI1640, filtruje se přes ocelové síto nebo podobný prostředek a centrifuguje se ro přípravu požadovaných buněk produkujících protilátky.
Potom se uvedené myelomové buňky a buňky produkující protilátky podrobí buněčné fúzi.
Fúze buněk může být provedena kontaktváním myeomových a protilátku-produkujících buněk v poměru 1:1 až 1:10 v mediu pro kultivaci zvířecích buněk, jako je MEM, DMEM nebo RPME-1640, v přítomnosti fúzního acelerátoru při 30 - 37 °C na dobu 1 až 15 minut. Pro akceleraci fúze může být použit fúzní akcelerátor nebo virus, jako je polyethylenglykol s průměrnou molekulovou hmotností 1000 až 6000, polyvinylalkohol nebo Sendai virus. Fúze buněk produkujících protilátku a myelomových buněk může být také provedena v komerčně dostupném přístroji pro fúzi buněk, který využívá eletrické stimulace jako je elektroporace.
(5) Selekce a klonování hybridomů
Požadovaná hybridomy se selektují z buněk po buněčné fúzi, například technikou využívající selektivní růst buněk v selektivním mediu.
To znamená, že suspenze buněk se ředí vhodným mediem a inokuluje se na mikrotitrační plotnu. Selektivní medium, jako je HAT medium, se přidá do každé jamky a provede se inkubace za správné výměny čerstvého selektivního media.
Rostoucí buňky jsou odebrány jako hybridomy.
• 9 ·· »V «« ♦··· ·· • · · · « « ♦ · · · ···· · · · · · · · · · ·· ··« 9 · · ······ ···*·· · · ««·· ·« ·· ·♦· ·· ··
Tyto hybrídomi se potom vyšetřují limitním ředěním, fluorescencí aktivovaným tříděním nebo jiným způsobem. Nakonec se získají hybridomy produkující monoklonálni protilátku.
(6) Odběr monoklonálních protilátek
Způsoby pro odběr monoklonálních protilátek ze získaných hybridomů zahrnují běžné techniky kultivace buněk a tvorby ascitu.
V technice kultivace buněk se hybridomy kultivují v mediu pro kultivaci zvířecích buněk, jako je RPMI-1640 medium obsahující 10 až 20% fetální hovězí sérum, MEM medium nebo bezsérové medium, za běžných podmínek (např. 37 °C, 5% CO2) po dobu 2 až 14 dnů a protilátky se získají ze supernatantu.
Při tvorbě ascitu se hybridomy inokulují intraperitoneálně stejnému druhu savce, který je zdrojem myelomových buněk, takže hybridomy rostou v nadměrném množství. Po 1 až 4 týdnech se odebere ascites nebo sérum.
Pokud je v těchto technikách nezbytné přečištění protilátek, tak se vyberou známé techniky jako je vysrážení síranem amonným, iontoměničová chromatografie a afinitní chromatografie, nebo se kombinují.
2. Konstrukce chimérických protilátek (1) Klonování DNA obsahující sekvenci baží kódující V region myší monoklonální. protilátky proti lidskému PTHrP (i) Příprava mRNA ·· ·· ·· ···· ·· ··· · · · · ·· · • ··« · · ··· · · · · • t · » · · · · ··· ··· ····· · · · Ο·Φ· 99 99 999 99 Λ·
Pro klonování DNA obsahující sekvenci baží kódující V region myší monoklonální protilátky proti lidskému PTHrP se získané hybridomy zpracují běžným způsobem, například guanidinovou ultracentrífugací (Chirgwin, J.M. et al., Biochemistry (1979) 18: 5294 - 5299), nebo AGCP technikou (Chomzynski, P. et al., Anaytical Biochemistry (1987) 162: 156 - 159), pro přípravu celkové RNA, ze které se připraví mRNA například pomocí Oligo(dT)-celulosové překlenovací kolony připojené na mRNA Purification Kit (Pharmacia). Quick Prep mRNA Purification Kit (Pharmacia AB) může být také použit pro přípravu mRNA bez nutnosti extrakce celkové RNA.
(ii) Příprava a amplifikace cDNA
Z mRNA získané v kroku (i), výše, se syntetizuje každá cDNA ve V regionech L a H řetězců pomocí reversní transkriptasy. V syntese cDNA může být použit Oligo-dT primer nebo jiný vhodný primer, který hybridizuje na C region L nebo H řetězce, například MHC2 primer mající sekvenci baží podle SEQ ID NO: 1.
Při synteze cDNA se uvedená mRNA a primer smísí a reakce se provede za přítomnosti reversní transkriptasy, například při 52 °C během 30 minut.
Amplifikace cDNA pro L a H řetězce může být provedena PCR (polymerasovou řetězovou reakcí) podle 5'-RACE metody (Frohman, M.A. et al., Proč. Nati. Acad. Sci. USA 85: 8998 - 9002, 1988; Belyavsky, A. et al., Nucleic Acids Res., 17: 2919 - 2932, 1989) pomocí 5'-Ampli FINDER RACE kitu (Clontech lne.). Tak je Ampli FINDER Anchor (SEQ ID NO: 42) navázána na 5'-konec cDNA syntetizované výše a PCR se provede pro DNA obsahující sekvence baží kódující C regiony L a H řetězců. (Zde je DNA obsahující sekvenci baží kódující V region L řetězce někdy označena ·· ·· » · · • · ·· jednoduše jako DNA pro V region L řetězce nebo DNA kódující V region L řetězce. Toto platí také pro V region H řetězce, C region a atd.).
Primer, který může být použit pro amplifikaci DNA pro V region L řetězce může být například Anchor primer (SEQ ID NO: 2) a primery navržené pro konzervované sekvence v konstantním regionu LÁ řetězce (C λ region) myších protilátek jako je MLC primer mající sekvenci baží SEQ ID NO: 4. Primer pro amplifikaci DNA pro V region H řetěce může být například Anchor primer (SEQ ID NO: 2) a MHC-G1 primer (SEQ ID NO: 3) (S.T. Jones et al., Biotechnology, 9, 88, 1991).
(iii) Přečištění DNA a určení sekvence baží
Produkty PCR se podrobí elektroforese na agarosovém gelu podle běžných technik pro excisi požadovaných DNA fragmentů, které se potom odeberou, přečistí a ligují na vektorovou DNA.
Přečištění DNA může být provedeno pomocí komerčně dostupných kitů jako je GENECLEAN II; BIO101. Vhodná vektorová DNA pro tyto DNA fragmenty je například pUC19 nebo Bluescript.
Uvedená DNA a vektorová DNA se ligují pomocí známých ligačních kitů (Takara Shuzo) za vzniku rekombinantního vektoru. Vzniklý rekombinantní vektor se vloží do například Escherichia coli JM109 a selektují se kolonie resistentní na ampicilin; tak je vektorová DNA připravena známou technikou: J. Sambrook et al., Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989. Po trávení vektorové DNA restrikčními enzymy je sekvence baží požadované DNA určena známou technikou jako je dideoxy technika: J. Sambrook et al., Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory Press,
1989. V • · · · ·· 44
4·· 444 4 4 4 4 ···· 4 44·· 4 44 4
444 4 44 444444
44444 4 4 4
4444 44 44 444 44 44 předkládaném vynálezu může být použit automatický přístroj pro určení sekvence baží (DNA Sequencer 373A; ABI lne.).
(iv) Komplementaritu určující region
V regiony H a L řetězce tvoří vazebné místo pro antigen a jejich úplné struktury mají určitou vzájemnou podobnost. To znamená, že čtyři regiony pracovních rámců (FR) jsou vázány pomocí třech hypervariabilních regionů, nebo komplementaritu určujících regionů (CDR). Aminokyselinová sekvence v FR je relativně dobře konzervovaná, zatímco variabilita aminokyselinové sekvence v CDR regionu je velmi vysoká: Kabat,
E.A. et al., Sequence of Proteins of Immunological Interest,
U.S. Dept. Health and Human Services, 1983.
Mnoho částí čtyř FR má strukturu β-listu a v důsledku toho tvoří tři CDR smyčku. CDR může někdy tvořit část struktury βlistu. Proto jsou tři CDR stericky drženy ve velmi blízkých vzájemných pozicích FR, což vytváří vazebné místo pro antigen spolu se třemi CDR v párových regionech.
Ve světle těchto skutečnosti mohou být CDR regiony zjištěny srovnáním aminokyselinové sekvence ve variabilním regionu myší monoklonální protilátky proti lidskému PTHrP a databazí aminokyselinových sekvencí pro protilátky, kterou připravil Kabat, E.A. et al., (Sequence of Proteins of Immunological Interest, U.S. Dept. Health and Human Services, 1983) pro výzkum homologie mezi těmito sekvencemi.
(2) Konstrukce expresního vektoru chimérické protilátky
Po klonování DNA fragmentů kódujících V regiony L a H řetězců myší monoklonální protilátky (zde může být dále L a H • · • · · ·
řetězec protilátky označován jako myší L řetězec atd. pro myší protilátky a lidský H řetězec atd. pro lidské protilátky) jsou DNA kódující myší V regiony a DNA kódující konstantní regiony lidské protilátky ligovány a exprivovány za zisku chimérických protilátek proti lidskému PTHrP.
Standartní technika pro přípravu chimérických protilátek obsahuje ligaci myší vedoucí sekvence a sekvence V regionu přítomné v klonované cDNA do sekvence kódující C region lidské protilátky, která je již přítomná v expresním vektoru savčí buňky. Alternativně jsou myší vedoucí sekvence a sekvence V regionu přítomná v klonované DNA ligovány do sekvence kódující C region lidské protilátky a potom následuje ligace na expresní vektor savčí buňky.
Polypeptid obsahující C region lidské protilátky může být jakýkoliv z C regionů H nebo L řetězce lidské protilátky, včetně, například, Cyl, Cy2, Cy3 nebo Cy4 pro lidské H řetězce a Ολ nebo Ck pro L řetězce.
Pro přípravu chimérické protilátky jsou nejprve vyrobeny dva expresní vektory; to znamená, je konstruován expresní vektor obsahující DNA kódující V region myšího L řetězce a C region lidského L řetězce pod kontrolou regionu pro kontrolu exprese jako je systém zesilovač/promotor, a expresní vektor obsahující DNA kódující V region myšího H řetězce a C region lidského H řetězce pod kontrolou regionu pro kontrolu exprese jako je systém zesilovač/promotor. Potom jsou hostitelské buňky jako jsou savčí buňky současně transformovány těmito expresními vektory a transformované buňky jsou kultivovány in vitro nebo in vivo za produkce chimérické protilátky; viz například WO91/16928.
• 4 • ··
9999 9 99 · • · O · · · · ··· · · · · ·· 999 9 9 9 9
Alternativně jsou myší vedoucí sekvence přítomná v klonované DNA a DNA kódující V region myšího L řetězce a C region lidského L řetězce, stejně jako myší vedoucí sekvence a DNA kódující V region myšího H řetězce a C region lidského H řetězce vloženy do jediného expresního vektoru (viz například WO94/11523) a uvedený vektor se použije pro transformaci hostitelských buněk; potom se transformovaná hostitelská buňka kultivuje in vitro nebo in vivo za zisku požadované chimérické protilátky.
(i) Produkce H řetězce chimérické protilátky
Vektor pro expresi H řetězce chimérické protilátky může být získán vložením cDNA obsahující sekvenci baží kódující V region myšího H řetězce (zde také označované jako cDNA pro V region H řetězce) do vhodného expresního vektoru obsahujícího genomovou DNA obsahující sekvenci baží kódující C region H řetězce lidské protilátky (zde také označovanou jako genomová DNA pro C region H řetězce) nebo cDNA kódující uvedený region (zde také označovanou jako cDNA pro C region H řetězce) . C region H řetězce zahrnuje, například, Cyl, Cy2, Cy3 nebo Cy4 regiony.
(i-a) Konstrukce expresního vektoru pro chimérický H řetězec, který obsahuje genomovou DNA kódující C region H řetězce
Expresní vektory obsahující genomovou DNA kódující C region H řetězce, zejména ty vektory, které kódují Cyl region, zahrnují, například, HEF-PMh-gyl (WO 92/19759) a DHFR-Δ E-RVhPMl-f (WO 92/19759).
Po inserci cDNA kódující V region myšího H řetězce do těchto expresních vektorů, může být vhodná sekvence baží vložena do
• 9 99 9 9
999 99 99 uvedené cDNA pomocí PCR techniky. Například, PCR může být provedena pomocí PCR primerů, který je navržen tak, že uvedená cDNA má rozpoznávací sekvenci pro vhodný restrikční enzym a její 5'- konec a Kozákovu konsensuální sekvenci bezprostředně před jejím iniciačním kodonem takovou, že je zlepšena účinnost transkripce, stejně jako pomocí PCR primerů, který je navržen tak, že uvedená cDNA má rozpoznávací sekvenci pro vhodný restrikční enzym a její 3'- konec a donorové místo pro sestřih pro řádný sestřih primárních produktů transkripce genomové DNA za vzniku mRNA, pro vložení těchto vhodných sekvencí baží do expresního vektoru.
Potom je takto vyrobená cDNA kódující V region myšího H řetězce zpracována vhodným restrikčním enzymem a je insertována do uvedeného expresního vektoru pro výrobu expresního vektoru pro chimérický H řetězec, který obsahuje genomovou DNA kódující C region H řetězce (Cyl region).
(i-b) Konstrukce expresního vektoru pro chimérický H řetězec, který obsahuje cDNA obsahující sekvenci baží kódující C region H řetězce
Expresní vektory obsahující cDNA kódující C region H řetězce, jako je Cyl region,mohou být vyrobeny následujícím způsobem: mRNA se připraví z CHO buněk, do kterých byly vloženy expresní vektor DHFR-AE-RVh-PMl-f (viz WO 92/19759) obsahující DNA kódující V region H řetězce humanizované PM1 protilátky a genomová DNA pro C region CylH řetězce lidské protilátky (N. Takahashí et al., Cell, 29: 671 - 679 (1982)) a expresní vektor RVl-PMla (viz WO 92/19759) obsahující genomovou DNA kódující V region L řetězce humanizované PM1 protilátky a genomovou DNA C regionu Lk řetězce lidské protilátky, a cDNA kódující V region H řetězce humanizované PM1 protilátky a cDNA kódující C region • · · ·· «« ·« ···· ·· ··· · · · ··· ···· · · ··· · · · ·· · · · « · · · · · • · · · · 9 · 9
9999 ·· ·· ··· ·· ·· (Cyl) H řetězce lidské protilátky se klonuji RT-PCR technikou a ligují se na expresní vektor pro expresi v živočišných buňkách, který se zpracuje vhodným restrikčním enzymem, za vzniku požadovaného expresního vektoru.
Pokud je cDNA kódující V region myšího H řetězce přímo ligována na cDNA kódující C region Cyl H řetězce lidské protilátky, pak může být vhodná sekvence baží vložena do fragmentu obsahujícího cDNA kódující V region H řetězce pomocí PCR. Například, PCR může být provedena pomocí PCR primeru, který je navržen tak, že uvedená cDNA má rozpoznávací sekvenci pro vhodný restrikční enzym a její 5'- konec a Kozákovu konsensuální sekvenci bezprostředně před jejím iniciačním kodonem takovou, že je zlepšena účinnost transkripce, stejně jako pomocí PCR primeru, který je navržen tak, že uvedená cDNA má rozpoznávací sekvenci pro vhodný restrikční enzym a její 3'konec pro přímou ligaci C regionu Cyl H řetězce, pro vložení těchto vhodných sekvencí baží do uvedené cDNA.
Potom je takto vyrobená cDNA kódující V region myšího H řetězce zpracována vhodným restrikčním enzymem, je ligována na cDNA kódující uvedený C region Cyl H řetězce a je insertována do expresního vektoru jako je pCOSl nebo pCHOl pro výrobu expresního vektoru, který obsahuje cDNA kódující chimérický H řetězec.
(ii) Produkce L řetězce chimérické protilátky
Vektor pro expresi L řetězce chimérické protilátky může být získán ligaci cDNA kódující V region myšího L řetězce a genomové DNA nebo cDNA kódující C region L řetězce lidské protilátky a jejich vložením do vhodného expresního vektoru. C region L řetězce zahrnuje, například, κ nebo λ řetězec.
4 • 44 η ···· (ii-a) Konstrukce expresního vektoru, který obsahuje cDNA kódující chimérický IA řetězec
Po konstrukci expresního vektoru obsahujícího cDNA kódující V region myšího L řetězce, může být vhodná sekvence baží vložena do uvedeného expresního vektoru pomocí PCR techniky. Například, PCR může být provedena pomocí PCR primeru, který je navržen tak, že uvedená cDNA má rozpoznávací sekvenci pro vhodný restrikční enzym a její 5'- konec a Kozákovu konsensuální sekvenci, takže je zlepšena účinnost transkripce, stejně jako pomocí PCR primeru, který je navržen tak, že uvedená cDNA má rozpoznávací sekvenci pro vhodný restrikční enzym a její 3'- konec, pro vložení těchto vhodných sekvencí baží do uvedené cDNA.
Úplná sekvence baží cDNA kódující C region lidského IA řetězce může být syntetizována na DNA syntezátoru a vyrobena pomocí PCR. Je známo, že C region lidského iA řetězce má alespoň 4 různé izotypy a že každý izotyp může být použit pro konstrukci expresního vektoru. Například, na základě vyhledávání homologie s C regiony IA řetězce klonovaných myších monoklonálních protilátek může být vybrán izotyp Mcg+Ke+Ozfragmentu C regionu lidského IA řetězce (přírůstkové č. X57819) (P. Dariavach et al., Proč. Nati. Acad. Sci. USA 84: 9074 9078) a může být použit pro konstrukci expresního vektoru. Pro konstrukci cDNA pro známé C regiony lidských IA řetězců jako je Mcg+Ke+Οζ-, například, mohou být použity následující čtyři primery, jak jsou uvedeny v SEQ ID NO: 11 - 14: Primery
MBC1HPG1 (SEQ ID NO: 11) a MBC1HGP3 (SEQ ID NO: 14) mají sense DNA sekvence a primery MBC1HPG2 (SEQ ID NO: 12) a MBC1HGP4 (SEQ ID NO: 14) mají antisense DNA sekvence, kdy ··· ··· to · ···· to··· · ···· • to ··· · ·· ····· · · · ···· ·· ·· ··· ·· ·· každý primer má 20 - 23 bp komplementární sekvence s dalšími primery.
MBC1HGPS (SEQ ID NO: 15) a MBC1HGPR (SEQ ID NO: 16) se nazývají externí primery a mají sekvence homologní s MBC1HGP1 a MBC1HGP4, v příslušném pořadí, a každý má rozpoznávací sekvenci pro vhodný restrikční enzym. V PCR technice jsou čtyři primery sestaveny tak, aby byla syntetizována úplná cDNA a externí primery se přidají pro amplifikaci cDNA.
Sestavení pomocí PCR znamená, že MBC1HGP1 a MBC1HGP2 nebo MBC1HGP3 a MBC1HGP4 jsou tepelně zpracovány přes jejich komplementární sekvence, což vede k syntese MBC1HGP1- MBC1HGP2 fragmentu a MBC1HGP3- MBC1HGP4 fragmentu a každý fragment je znovu tepelně zpracován přes jejich komplementární sekvence, což vede k syntese cDNA kódující úplný C region lidského Ι,λ řetězce.
Takto konstruovaná cDNA kódující C region lidského Ι,λ řetězce a dříve konstruovaná cDNA kódující V region myšího L řetězce mohou být ligovány mezi vhodná místa pro restrikční enzym a mohou být insertovány do expresního vektoru jako je pCOSl nebo pCHOl za vzniku expresního vektoru, který obsahuje cDNA kódující LZ řetězec chimérické protilátky.
(ii—fo) Konstrukce expresního vektoru, který obsahuje cDNA kódující chimérický Lk řetězec
Po konstrukci expresního vektoru obsahujícího cDNA kódující V region myšího L řetězce, může být vhodná sekvence baží vložena do uvedeného expresního vektoru pomocí PCR techniky. Například, PCR může být provedena pomocí PCR primeru, který je navržen tak, že uvedená cDNA má rozpoznávací sekvenci pro ·♦ ····
Β · · · · Β ·
Β ΒΒΒΒ Β ΒΒ Β • Β ΒΒ ·♦»···
ΒΒΒ Β Β ·· ΒΒΒ ΒΒ ΒΒ vhodný restrikční enzym a její 5' - konec a Kozákovu konsensuální sekvenci, takže je zlepšena účinnost transkripce, a pomocí PCR primem, který je navržen tak, že uvedená cDNA má rozpoznávací sekvenci pro vhodný restrikční enzym a její 3'konec, pro vložení těchto vhodných sekvencí baží do uvedené cDNA.
DNA kódující C region lidského Lk řetězce, která má být ligována do DNA kódující V region myšího L řetězce, může být konstruována například z HEF-PMlk-gk obsahujícího genomovou DNA (viz WO 92/19759).
Rozpoznávací sekvence pro vhodné restrikční enzymy mohou být vloženy, pomocí PCR techniky, do 5'- a 3'- konců DNA kódující C region Lk řetězce a DNA kódující V region myšího L řetězce jak byly konstruovány výše a DNA kódující C region Lk řetězce může být ligována na kteroukoliv z nich a může být insertována do expresního vektoru jako je pCOSl nebo pCHOl pro konstrukci expresního vektoru, který obsahuje cDNA kódující Lk řetězec chimérické protilátky.
3. Produkce humanizovaných protilátek (1) Vyhledávání homologie s lidskými protilátkami
Při výrobě humanizované protilátky, ve které je CDR myší monoklonální protilátky přenesen na lidskou protilátku, je žádoucí, aby zde existovala vysoká homologie mezi FR myší monoklonální protilátky a FR lidské protilátky. V souladu s tím je provedeno srovnání mezi V regiony H a L řetězců myší monoklonální protilátky proti lidskému PTHrP a V regiony všech známých protilátek, jejichž struktura byla vyhodnocena pomocí Protein Data Bank. Dále jsou simultáně srovnávány s •9 9999
9 9 9 9 9 9 9 9 9
9 99 9 9 99 9 9 9 9 9
999 9 99 999 999
9 9 9 9 9 9 9
9999 99 99 999 99 99 podskupinami lidských protilátek (HSG: Human subgroup) klasifikovanými podle Kabat et al., podle délky FR protilátky, podle homologie aminokyselin a podobně. Kabat, E.A., US Dept. Health and Human Services, US Government Printing Offices,
1991.
V regiony lidského H řetězce mohou být zařazeny do HSG I až III podle HSG klasifikace podle Kabat et al., a V regiony H řetězce myší monoklonální protilátky proti lidskému PTHrP mají homologii 82,7% s konvenční sekvencí HSG III. Na druhé straně,
V regiony lidského LX řetězce mohou být zařazeny do HSG I až IV podle HSG klasifikace podle Kabat et al., a V regiony LX řetězce myší monoklonální protilátky proti lidskému PTHrP nemají vysokou homologii s konvenčními sekvencemi V regionů lidského LX řetězce, které náleží do jakékoliv podskupiny.
Pokud má být monoklonální protilátka proti lidskému PTHrP humanizovaná, je žádoucí, aby byl použit V region lidského H řetězce, který náleží do HSG III a má nejvyšší homologii, nebo
V region lidského H řetězce, který má FR strukturu s odpovídající konvenční strukturou (Chothia C., et al., J. Mol.
Biol. 196: 901 - 917, 1987) jako má V region lidského H řetězce, pro konstrukci humanizované protilátky. Dále, protože neexistuje konvenční sekvence s vysokou homologii v podskupinách V regionů lidského LX řetězce, je žádoucí, aby byl při konstrukci humanizované protilátky použit V region LX řetězce lidské protilátky s nejvyšší homologii, který je registrován v Protein Data Bank.
(2) Vývoj DNA kódující V region humanizované protilátky
4444 ·· « · · • 444 4 4 4 4
44 • · · 4 4 • 4 4 4 4 4 4 • · 444 444 • 4 4 • 4· 4 4 4 4
Prvním krokem pro vývoj DNA kódující V region humanizované protilátky je výběr V regionu lidské protilátky, který je základem pro tento vývoj.
V předkládaném vynálezu může být v humanizované protilátce použit FR V regionu lidské protilátky mající homologii vyšší než 80% s FR V regionu myši protilátky. FR V regionu H řetězce jako fragment v podstatě identického FR může zahrnovat FR odvozený z regionů náležících do podskupiny III, jako je S31679: NBRF-PDB, Cuisinier A.M. et al., Eur. J. Immunol., 23: 110 - 118, 1993. Dále, FR V regionu L řetězce jako fragment v podstatě identického FR může zahrnovat například FR1, FR2 a FR3 odvozené z lidské protilátky HSU03868 (GEN-BANK, Deftos M. et al., Scand. J. Immunol., 39: 95 - 103, 1994) a FR4 odvozený z lidské protilátky S25755 (NBRF-PDB).
Lidská protilátka S31679 byla klonována z cDNA knihovny lidských fetálních jater, zatímco lidská protilátka HSU03868 byla klonována jako nový gen pro V region LÁ řetězce.
(3) Příprava polypeptidu obsahujících V region humanizované protilátky
V humanizované protilátce podle předkládaného vynálezu pocházejí C region a region pracovního rámce (FR) V regionu uvedené protilátky od lidí a komplementaritu určující regiony (CDR) V regionu jsou myšího původu (obr. 1). Polypeptid obsahující V region humanizované protilátky podle předkládaného vynálezu může být vyroben technikou nazývanou CDR-přenos pomocí PCR, pokud bude dostupný DNA fragment lidské protilátky jako templat. CDR-přenos označuje techniku, ve které je vyroben DNA fragment kódující myší CDR a je nahrazen za CDR lidské protilátky, která je templatem.
• 0 00 0000 00 ·· · · 0 0000
000 0 0 000 0 0 · 0
000 0 00 000000
0 0 0 0 · ·
00 000 0· ··
Pokud není DNA fragment lidské protilátky, který má být použit jako templát, dostupný, pak může být na DNA syntezátoru syntetizována sekvence baží registrovaná v databazi a DNA pro V region humanizované protilátky může být vyrobena pomocí PCR.
Dále, pokud je v databazi registrována pouze aminokyselinová sekvence, pak může být celá sekvence baží odvozena z aminokyselinové sekvence na základě znalostí využití kodonů v protilátkách, jak je popisuje Kabat, E.A., US Dept. Health and Human Services, US Government Printing Offices, 1991. Tato sekvence baží se syntetizuje na DNA syntezátoru a DNA pro V region humanizované protilátky může být připravena PCR technikou a může být vložena do vhodného hostitele a potom následuje její exprese za produkce požadovaného polypeptidu.
Dále jsou popsány obecné postupy pro CDR-přenos pomocí PCR techniky, za situace, že je dostupný DNA fragment ldské protilátky jako templát.
(i) CDR-přenos
Předpokládá se, že DNA kódující V region zahrnuje DNA kódující FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 a FR4, které jsou na sebe navázány v tomto pořadí, jak ukazuje obr. 2.
Nej rve se syntetizují myší DNA fragmenty odpovídající příslušným CDR. CDR1 až 3 se syntetizují na základě sekvence baží dříve klonovaných V regionů H a L řetězců. Primery pro přenos B a E se syntetizují tak, že primer B by měl obsahovat sekvenci hybridizujíeí s myším CDR1 a FR2 lidské protilátky v sense směru a primer E by měl obsahovat sekvenci hybridizujíeí s myším CDR1 a FR2 lidské protilátky v antisense směru (obr. 2 (1)). Podobně jsou syntetizovány
4
• 4 · · · • 4 · « ·4·4 44 • 4 4
4 4 primery pro přenos C a F a primery D a G. Dále jsou také syntetizovány vhodné primery, nazývané externí primery, odpovídající A a H na obr. 2 (1), které mohou hybridizovat na regiony upstream od FR1 a downstream od FR4, v příslušném pořadí. Izolace a extrakce primerů pro přenos může být provedena za použití známých technik: Sambrook et al.,
Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989.
Potom se provede první PCR za použití primerů pro přenos E a externího primerů A, primerů pro přenos B a F, primerů pro přenos C a G, stejně jako primerů pro přenos D a externího primerů H, což vede ke vzniku fragmentů A-E, B-F, C-Ga D-H, v příslušném pořadí (Obr. 2 (2)).
Protože upstream region primerů pro přenos B a část downstream primerů pro přenos E jsou navrženy tak, aby se překrývaly (což platí také pro primery pro přenos C a F, stejně jako D a G) , mohou být tyto fragmenty tepelně zpracovány s příslušnými komplementárními sekvencemi v reakci za vhodné teploty a tak může být pomocí PCR sestavena DNA mající délku od A do H. Po získání DNA fragmentu kódujícího V region mohou být přidány externí primery A a H a může být provedena druhá PCR, za zisku DNA kódující V region humanizované protilátky, ve které jsou FR 1 až 4 lidského původu a CDR 1 až 3 myšího původu. Potom může být vložena do vhodného hostitele pro expresi za zisku požadovaného polypeptidu (obr. 2 (3)).
(ii) Konstrukce DNA a expresního vektoru kódujícího V region humanizovaného H řetězce
V předkládaném vynálezu může být celá sekvence baží DNA kódující V region H řetězce lidské protilátky, která má být • 0 09 0009 90 09 «90 0000
909 · 0 090 0 00 9
0«0 9 09 009 999 9 0 0 0 9 0 9
90 999 09 99 použita jako templat pro humanizovanou protilátku, syntetizována pomocí DNA syntezátoru a konstruována PCR technikou, pokud není uvedená DNA dostupná z přirozených zdrojů.
V region H řetězce myší monoklonální protilátky proti lidskému PTHrP má vysokou homologii s S31679, která náleží do lidské podskupiny III. Při použití této lidské protilátky jako templatu pro konstrukci DNA kódující V region humanizovaného H řetězce jsou použity například čtyři primery, které jsou uvedeny v SEQ ID NO: 23 - 26. Primery MBC1HGP1 (SEQ ID NO: 23) a MBC1HGP3 (SEQ ID NO: 24) mají sense DNA sekvence a primery MBC1HGP2 (SEQ ID NO: 25) a MBC1HGP4 (SEQ ID NO: 26) mají antisense DNA sekvence. Jsou navrženy tak, aby měl každý na svém konci 15 až 21 bp komplementárních sekvencí.
Externí primery MBC1HVS1 (SEQ ID NO: 27) a MBC1HVR1 (SEQ ID NO: 28) mají homologní sekvence s MBC1HGP1 a MBC1HGP4, v příslušném pořadí, a každý obsahuje rozpoznávací sekvenci pro příslušný vhodný restrikční enzym. Čtyři primery jsou sestraveny pomocí PCR, což vede k syntese kompletní cDNA a externí primery se přidají pro amplifikaci DNA. Sestavení pomocí PCR znamená, že MBC1HGP1 a MBC1HGP2 nebo MBC1HGP3 a MBC1HGP4 jsou tepelně zpracovány přes jejich komplementární sekvence, což vede k syntese MBC1HGP1- MBC1HGP2 fragmentu a MBC1HGP3- MBC1HGP4 fragmentu a fragmenty jsou znovu tepelně zpracovány přes jejich komplementární sekvence, což vede k syntese kompletní DNA pro V region humanizovaného H řetězce.
C region H řetězce lidské protilátky může být jakýkoliv C region lidského H řetězce, jako je například Cyl, Cy2, Cy3 nebo Cy4 lidského H řetězce.
• 4 44 • 4 4 ♦ · 4444 9· 44 • 4 · · 4 4 4 • 4 »44 4 4 4 4
4· · ·· ··· ···
4*4 44
444 44 44
DNA pro V region H řetězce humanizované protilátky konstruovaná výše může být ligována na DNA pro jakýkoliv C region H řetězce lidské protilátky, například na DNA pro Cyl region lidského H řetězce. Jak je uvedeno v oddíle Produkce H řetězce chimérické protilátky, může být DNA pro V region H řetězce zpracována vhodným restrikčním enzymem a může být ligována na DNA kódující C region lidského H řetězce pod kontrolou regionu pro kontrolu exprese, jako je systém zesilovač/promotor, za vzniku expresního vektoru, který obsahuje DNA pro V region humanizovaného H řetězce a C region lidského H řetězce.
(iii) Konstrukce DNA a expresního vektoru kódujícího V region humanizovaného L řetězce
V předkládaném vynálezu může být celá sekvence baží DNA kódující V region L řetězce lidské protilátky, která má být použita jako templat pro humanizovanou protilátku, syntetizována pomocí DNA syntezátoru a konstruována PCR technikou, pokud není DNA pro V region L řetězce dostupná, jak je tomu v případě DNA kódující V region H řetězce.
Pro konstrukci DNA pro V region humanizovaného L řetězce pomocí lidské protilátky SU03868 mající nejvyšší homologii s V regionem L řetězce myší monoklonální protilátky proti lidskému PTHrP jsou použity například čtyři primery, které jsou uvedeny v SEQ ID NO: 29 - 32. Primery MBC1LGP1 (SEQ ID NO: 29) a MBC1LGP3 (SEQ ID NO: 30) mají sense DNA sekvence a primery MBC1LGP2 (SEQ ID NO: 31) a MBC1LGP4 (SEQ ID NO: 32) mají antisense DNA sekvence. Jsou navrženy tak, aby měl každý na svém konci 15 až 21 bp komplementárních sekvencí.
0000 00
Externí primery MBC1LVS1 (SEQ ID NO: 33) a MBC1LVR1 (SEQ ID NO: 34) mají homologní sekvence s MBC1LGP1 a MBC1LGP4, v příslušném pořadí, a každý obsahuje rozpoznávací sekvenci pro příslušný vhodný restrikční enzym. Čtyři primery jsou sestraveny pomocí PCR, což vede k syntese kompletní cDNA a externí primery se přidají pro amplifikaci DNA. Sestavení pomocí PCR znamená, že MBC1LGP1 a MBC1LGP3 nebo MBC1LGP2 a MBC1LGP4 jsou tepelně zpracovány přes jejich komplementární sekvence, což vede k syntese MBC1LGP1- MBC1LGP3 fragmentu a MBC1LGP2- MBC1LGP4 fragmentu a fragmenty jsou znovu tepelně zpracovány přes jejich komplementární sekvence, což vede k syntese kompletní DNA pro V region humanizovaného L řetězce.
C region L řetězce lidské protilátky může být jakýkoliv C region lidského L řetězce, jako je například CX nebo Ck lidského L řetězce.
DNA pro V region L řetězce humanizované protilátky konstruovaná výše může být ligována na DNA pro jakýkoliv C region L řetězce lidské protilátky, například na DNA pro CX region lidského L řetězce. DNA pro V region L řetězce může být zpracována vhodným restrikčním enzymem a může být ligována na DNA kódující C region lidského LX řetězce pod kontrolou regionu pro kontrolu exprese, jako je systém zesilovač/promotor, za vzniku expresního vektoru, který obsahuje DNA pro V region humanizovaného L řetězce a C region lidského LX řetězce.
I když může být polypeptid obsahující V region humanizované protilátky produkován způsobem popsaným výše, není jasné, zda bude mít polypeptid stejné aktivity jako protilátka, jako je například vazba a neutralizační aktivita proti jejímu antigenu. Toto platí zejména v případě L řetězce, protože V region L řetězce myší monoklonální protilátky proti lidskému PTHrP je • · · ·· ·· • · · • ·♦· • · · · • · · ···· ·· ·» ··*· • · • · · · • · • · · • · · ··· • · ·· ·· »·· odvozen z velmi vzácného νλχ genu a proto je nutné testovat přítomnost nebo nepřítomnost aktivity pomocí jeho kombinování s humanizovaným H řetězcem a exprese ve zvířecích buňkách, jako jsou COS-7.
Jako metoda pro hodnocení toho, který FR ve V regionu humanizované protilátky může způsobovat vazbu a neutralizační aktivitu humanizované protilátky může být použita konstrukce hybridního V regionu (Ohtomo, T. et al., Molecular Immunology 32: 407 - 416, 1995). Pro vyhodnocení toho, která aminokyselina ve V regionu L řetězce humanizované protilátky podle předkládaného vynálezu by měla být mutována pro získání aktivní protilátky je DNA, ve které je fragment FR regionu humanizované protilátky rekombinován s fragmentem FR regionu myšího původu a každý region je testován na humanizaci.
Jak ukazuje obr. 3, je vyrobena protilátka obsahující polypeptid obsahující rekombinantní V region, ve kterém jsou FR1 a FR2 odvozeny od lidské protilátky a FR3 a FR4 jsou odvozeny od myší protilátky rekombinantní fragment je
Taková protilátka obsahující oznacovana j ako ''hybridní protilátka), hybridní protilátka, ve které je pouze FR1 lidského původu a hybridní protilátka, ve které je pouze FR2 lidského původu. Každá DNA kódující tyto hybridní protilátky je vložena do expresního vektoru a humanizované protilátky jsou přechodně exprivovány a je testována přítomnost aktivity u protilátek.
Pomocí této techniky testovali vynálezci polypeptidy obsahující V regiony L řetězce na vazbu antigenu a na neutralizační aktivity a zjistili, že některé aminokyseliny v FR2 a FR3 by měly být nahrazeny.
3Ί
4» 44 4444 4* 44 • 4 · · 4 4 4444
4444 4 4444 4 44 ·
4 444 4 44 4 4 4 4 4 4 • 4444 4 4 4
4444 44 44 444 44 44
Po zjištění, že aminokyseliny způsobující aktivitu existují v FR2 a FR3 regionech vynálezci zjistili, že 36., 45. a 49 aminokyselina v FR2 regionu a 87. aminokyselina v FR3 regionu (číslováni aminokyselin protilátek bylo určeno v Kabat, E.A. et al., US Dept. Health and Human Services, US Government Printing Offices, 1991) způsobují aktivitu protilátky.
Tak je v předkládaném vynálezu vyroben polypeptid obsahující V region, ve kterém jsou uvedené aminokyseliny mutovány (například nahrazeny).
Nejprve je připraven výše uvedenou technikou VDR-přenosu polypeptid obsahující V region mající aminokyselinovou sekvenci, který je základem pro vkládání mutací aminokyselin.
Tento základní polypeptid obsahuje aminokyselinovou sekvenci podle SEQ ID NO: 47 a je označován jako verze a (a v tabulce 1) ·
Potom jsou z verze a jako základu připraveny různé variantní fragmenty, ve kterých je jedna nebo více aminokyselin z FR mutována.
Vloženi mutace může být provedeno pomocí vývoje oligonukleotidového primeru (mutageního primeru) kódujícího aminokyselinu, která má být vložena jako požadovaná mutace a provedením PCR za použití uvedeného primeru.
Tak jsou vyrobeny polypeptidy obsahující V regiony (verze b až t) , ve kterých jsou určité aminokyseliny v FR2 a FR3 mutovány (b až t v tabulce 1).
ι»
4 4 4 ·
4« ···* • 4 4
4 « 4 4
4 4
4 4
4 4 44
4« 44
4 4 4 • 4 4 4 » 4 4 4 4
4 • 4 44 <ú Λί <—Η 3 Λ ίϋ Η
CX LO ΟΟ — co
L—J Ο χτ οε S
co Ο < ο
Ol >- >- >-
τ—< 00 03
LÍ3 Ο ο O
^ί bX
ΟΟ > 3^ 8-
03 ΟΟ 00 00
4—1 ο ο o
C0 ο ΟΟ 00 I <Ο Ο Ο- -< CX
cn Ο- (Λ- 1 03 >- >-
ΟΟ ρ- Ρ- 1 00 >- >- >-
Γ- ίχ 1 Ο- Ρ- 3Χ P~
ΟΟ ο Ο 1 CO >* >-
ΙΪΟ ΟΟ 00 1 U0 00 ΟΟ oo
•ŠJ-* < <c 1 χτ ο ο o
co < 1 CO ο ο o
OJ ο ο 1 03 *χ CO >- oo
00 ΟΟ 1 Ctí 03 00 00 oo
03 Ο ο 1 Q ·— ►—< ►—< *—<
Ο Ξ -χ CX 1 Ο U0 Ο ρ- > c—
ΟΟ ,_3 Ο 1
ι— ΟΟ 00 1
ΟΟ Ο -X- CX 1
ιο ο Ο 1
Ύ?·1 CX 1 03 < 1
co 2 -X- ο 1 00 >- 1
03 1 Γ— 3= 1
„J -X 1 CD U3 LX) 1
,_, Ο ο * ο 1 U0 —1 —) 1
03 ο ο 1 χτ CX -χ Ο 1
ΟΟ ο ο 1 co rx !
L— οο 00 1 03 ο X 00 1
03 (X Cd 1 --- CX tx 1
ΙΟ 3> 3> 1 έΡ ο t— -χ <c I
-Ο 1 03 ο o 1
,__ C0 5 ο 1 03 00 CX CÍ 1
CX ΟΙ > 3> 1 CX Γ— >—1 -X 3> 1
Lx •X ο 1 Lx CO 1
CL φ
C„· 1 “ CO Ó
Ο — C3
CO C0 Ξ£
ZF ω X
C.
ω
Ω_ Ο.
Cd ο_
V. ο> ι co ο Ο — 02 co CO (S)
co xť
03 CO
.-1 >
o t—
—· 03 >
oo _)
o- e-
co o
uo o
CX o
CX co =ε
03 >-
-—1 <
«< U-
o o >~
—< 03 f-
CO 00 s:
CX Γ- í—
o co H-
o LO o-
CX
co <.
Ol o
>-
o u_ *
03 s -X
00 <
03 Γ— ί-
í£3 ο
LO o
co -X
CO *
O
co co
c co *
03 s
4—i o
O _)
03 >~
OO
00 Γ- t-
O z
LO
< -X
co z
03 o
r—t o
O co
03 )—(
co oo ř—
CX Γ— Cx.
Lx r- co O
οο ρ8
Ο >Cx >—
Ο ΡΟ S Οί ρ00 ΡCO Ο
CČ.
<c ο
>>>
<
ρο
U-) <χ tx
ΟΟ ο
ΟΟ
Q
Ctí
ΟΟ
α.
ω
CX QOJ
CX 22
-ρ 1
Ο ο — co co ω
ΟΟ JS ·» ·· • · · •··· « · « • >· · ·· «« ··«· • · ♦ • * ··· • « · • · · ·· ··» ·· ··
I · ♦ 9 k · · 9
999 9 99 «»
co o Q
LO o O
Q {—
o x co
co 7Ό ^1—
<c co co
o o
OJ co o X
X OJ o co
O .-1 2:
O X o X X
Q-i o * X
00 s
X > * X
LO >M >-
uo X * X
X X
C0 X * o
OJ X X
—I X * X
XT o X X
σ> o o
co o o
CX) o- o o
cn CD >- * X
X io Sc
X <
co >—1
OJ É— ·<
_1 >- >-
CO o ř— X
cn co X
oo 70 -r-
c o o
r—l co X
X LO co X
o X X X
o to E— E~
co X o
OJ F- c—
,—. X X
Od o X X
CD <0 * >
co co X
t- <c <
LO o o
to X
-<o co X
oo X -X- <
OJ co X
—- <c
,—- o 1 1
cn co X
co x * X
{-' co X
LO o o
LO E— F-
X X
.—i co >
x OJ __3 X
x — c? Cfr
X
Ε— >X
I
I >
I
X
I
I
I
Q
I >l
I
I
I
I
I
I o
J >· >- >>I >- >t i >1 >- >I i o
l
I
I ixí
I
I
I
I
I
I
I
I >I
Q
I
I
I >- >>I
CL ω
X X
X X
X X X
X l
X co —-«
o o
X X X
X X
3? 7Σ7 jr
CO X o Ό φ G-. ÓĎ az ·· ·· ··*· » · · » · ··· » · · · » · · φ· ··· • ··· » · φ ·· ·· • · · · • · · · ··· *·· ·«>· ·· ·« ··
,—> O
--1 Cu
co O
r- O
< _!
cc
LQ £**—
>
co
co fr-
r—( O
o o O
OC r—< cn O
Cl. co ÍI_
í'- >
LQ >-
O >
O tu
CO c? O
< CO OJ
to (—(
•ťr ►—< o »—<
co ř— ί-
co co O O ο
ac ,—< O 3= o
o cr> o > í—1 >
o σ> o O o
co
co o o
1-1 * >-
LQ >- >-
LQ * o
<0 -<
co CO co
co a o
.-1 co co
o (X * oo
o o o
00 1-1 _)
o- xO * oo
<x> 00 00
LQ Η-H t—<
-RT* 00 * E—
CO _)
co >- >-
.—. oc ac
o o -x- co
o c
00 o o
f- oo 00
LQ 00 00
LQ oo 00
xr o o
co oo 00
co O- Cl
—» co co
o Q o
o r> Ο-
oo --1 Ι-—1
t- o o
£Χ
OJ o
co co o
co co o
CO
CL ω
c.
o
CQ <tí _Q <J ~Ό ω 4- bo_£2 • φ φ · ΦΦ φφφφ ΦΦ ·· • · · φ · φφφφ φφφφ φ φφφφ φ ΦΦ ·
ΦΦ ΦΦΦ φ ΦΦ ΦΦΦ ΦΦΦ ·Φ·Φ· φ φ φ
ΦΦΦ ΦΦ ·Φ ΦΦΦ ΦΦ ··
DNA kódující každou verzi V regionu L řetězce humanizované protilátky konstruovaná výše může být ligována na DNA pro jakýkoliv C region L řetězce lidské protilátky, například na DNA pro CÁ region lidského L řetězce. DNA může být zpracována vhodným restrikčním enzymem a může být ligována na DNA kódující C region lidského lA řetězce pod kontrolou regionu pro kontrolu exprese, jako je systém zesilovač/promotor, za vzniku expresního vektoru, který obsahuje DNA kódující každou verzi V regionu humanizovaného L řetězce a DNA kódující C region humanizovaného L% řetězce.
DNA kódující V region H řetězce humanizované protilátky a C region lidského H řetězce jak byla konstruována výše a DNA kódující V region humanizovaného L řetězce a C region lidského • · • 4 44 • 4 · • 444 4 «·«« « ·· *
4 444 4 ·· 444444 ·«·«· · · · 4444 44 44 444 44 44
L řetězce mohou být také vloženy do jediného expresního vektoru, jako je vektor popsaný ve WO 94/611523, uvedený vektor může být použit pro transformaci hostitelské buňky a transformovaný hostitel může být kultivován in vitro nebo in vivo za produkce požadované humanizované protilátky.
4. Produkce chimérické protilátky a humanizované protilátky
Pro produkci chimérické a humanizované protilátky by měly být připraveny dva výše uvedené expresní vektory. Tak jsou pro chimérickou protilátku připraveny expresní vektor obsahující DNA kódující V region myšího H řetězce a C region lidského H řetězce pod kontrolou regionu pro kontrolu exprese jako je systém zesilovač/promotor a expresní vektor obsahující DNA kódující V region myšího L řetězce a C region lidského L řetězce pod kontrolou regionu pro kontrolu exprese jako je systém zesilovač/promotor. Pro humanizovanou protilátku jsou připraveny expresní vektor obsahující DNA kódující V region humanizovaného H řetězce a C region lidského H řetězce pod kontrolou regionu pro kontrolu exprese jako je systém zesilovač/promotor a expresní vektor obsahující DNA kódující V region humanizovaného L řetězce a C region lidského L řetězce pod kontrolou regionu pro kontrolu exprese jako je systém zesilovač/promotor.
Potom je hostitelská buňka, jako je například savčí buňka, současně transformována těmito expresními vektory a vzniklá transformovaná buňka je kultivována in vitro nebo in vivo za produkce chimérické nebo humanizované protilátky (viz například WO 91/16928).
Alternativně mohou být DNA kódující V a C regiony H řetězce a DNA kódující V a C regiony L řetězce ligovány do jediného
4 44 4 4 ··* · · · 4444
4444 4 4444 4 44 4 • · · · · 4 44 444 444
44444 4 4 4 • 444 44 44 444 44 44 vektoru a mohou být transformovány do vhodné hostitelské buňky za produkce protilátky. Tak jsou při expresi chimérické protilátky DNA kódující myší vedoucí sekvenci přítomná v klonované cDNA, V region myšího H řetězce a C region lidského H řetězce, stejně jako DNA kódující myší vedoucí sekvenci, V region myšího L řetězce a C region lidského L řetězce vloženy do jediného expresního vektoru, jako je například vektor, který je popsán v WO 94/11523. Při expresi humanizované protilátky jsou DNA kódující V region humanizovaného H řetězce a C region lidského H řetězce a DNA kódující V region humanizovaného L řetězce a C region lidského L řetězce řetězce vloženy do jediného expresního vektoru, jako je například vektor, který je popsán v WO 94/11523. Takový vektor je použit pro transformaci hostitelské buňky a vzniklá transformovaná hostitelská buňka je kultivována in vitro nebo in vivo za produkce požadované chimérické nebo humanizované protilátky.
Požadovaná chimérická nebo humanizovaná protilátka, která je takto produkována kultivací transformantů transformovaných DNA kódující uvedenou chimérickou nebo humanizovanou protilátku může být izolována z vnějšího nebo vnitřního prostředí buněk a může být přečištěna do homogenity.
Izolace a přečištění požadovaných chimérických nebo humanizovaných protilátek podle předkládaného vynálezu může být provedeno například za použití kolony obsahující protein A agarosu, ale může být také provedeno pomocí jakýchkoliv technik používaných při izolaci a přečištění běžných proteinů. Například mohou být pro izolaci a přečištění chimérické nebo humanizované protilátky použity techniky volitelně vybrané z chromatografických, ultrafiltračních, vysolovacích a dialyzačních technik.
t • · « · • · · · · · , . ΛΛ ·········· ··♦··· ·· • · * · · * ···· ·· «9 ··· «· ♦ ·
Jakýkoliv expresní systém může být použit pro produkci chimérické nebo humanizované protilátky proti lidskému PTHrP podle předkládaného vynálezu. Například, eukaryotické buňky zahrnují živočišné buňky jako jsou zavedené savčí buněčné linie, buňky plísní nebo hub, a kvasinky; prokaryotické buňky zahrnují bakteriální buňky jako jsou Escherichia coli. Výhodně je chimérická nebo humanizovaná protilátka podle předkládaného vynálezu exprivována v savčích buňkách, jako jsou například COS nebo CHO buňky.
Mohou být použity jakékoliv běžné promotory použitelné pro expresi v savčích buňkách. Například, výhodně je použit bezprostřední časný promotor lidského cytomegaloviru (HCMV).
Příklady expresních vektorů obsahujících HCMV zahrnují HCMV-VHHCyl a HCMV-VL-HCK, které jsou odvozeny od pSV2neo (WO 92/19759).
Dále, promotory pro genovou expresi v savčích buňkách, které mohou být použity v předkládaném vynálezu, zahrnují virové promotory, jako jsou promotory retrovirové, polyomavirové, adenovirové a simian virus (SV) 40, a promotory ze savčích buněk, jako je elongační faktor - la lidských polypeptidových řetězců (HEF-la). Například, SV40 promotor může být snadno použit technikou podle Mulligan et al., (Nátuře 27: 108, 1979);
technika podle Mízushima, S. et al., (Nucleic Acids Research 18: 5322, 1990) může být snadno použita s HEF-la promotorem.
Mezi elementy rozpoznávající počátek replikace, které mohou být použity v předkládaném vynálezu, patří elementy odvozené od SV40, polyoma viru, adenoviru nebo hovězího papilomaviru (BPV).
Dále, expresní vektor může obsahovat gen pro fosfotransferasu
APH(3') II nebo I (neo), thymidin kinasu (TK), E. coli xanthinnebo guanin-fos foribosyltransferasu (Ecogpt) • · ·· ·· ···· · ···· é ·· · • · · · · · · · ······ ······ ·· ···· ·· ·· ··· ·· ·· dihydrofolatreduktasu (DHFR) jako selektivní markér pro zvýšení počtu kopií genu v hostitelském systému.
5. Hodnocení vazby na antigen a neutralizační aktivity chimérických a humanizovaných protilátek (1) Stanovení koncentrace protilátky
Koncentrace vzniklé přečištěné protilátky může být stanovena ELISA.
ELISA plotny pro určení koncentrace protilátky jsou připraveny následujícím způsobem: 100 μg kozí protilátky proti lidskému IgG připravené v koncentraci například 1 μg/ml se imobilizuje v každé jamce 96-jamkové plotny pro ELISA (například Maxisorp, NUNC). Po blokování 200 μΐ pufru pro ředění (například 50 mM Tris-HCl, 1 mM MgCl2, 0,1 M NaCl, 0,05% Tween20, 0, 02% NaN3, 1% hovězí sérový albumin (BSA) , pH 7,2), do každé jamky se přidá postupně ředěný supernatant COS-7 nebo CHO buněk, ve kterých byla exprivována chimérická, hybridní nebo humanizovaná protilátka, nebo přečištěná chimérická, hybridní nebo humanizovaná protilátka, přidá se 100 μΐ kozí protilátky proti lidskému IgG konjugované s alkalickou fosfatasou a potom se přidá 1 mg/ml substrátového roztoku (Sigma 104, kyselina p-nitrofenylfosforečná, SIGMA) a potom se měří absorbance při 405 nm pomocí čtečky mikroploten (BioRad).
Hu IgGIÁ Purified (The Binding Site) může být použita jako standard pro určení koncentrací.
(2) Určení schopnosti vazby na antigen
ELISA plotny pro určení schopnosti vazby na antigen jsou připraveny následujícím způsobem: 100 Rg lidského PTHrP(1-34) «« 00 • 0 0
0 0 0
0
0 0
0000 00 • 0
0 0« 0
0 0 připraveného v koncentraci 1 Hg/ml se imobilizuje v každé jamce 96-jamkové plotny pro ELISA. Po blokování 200 μΐ pufru pro ředění se do každé jamky přidá postupně ředěný supernatant COS-7 nebo CHO buněk, ve kterých byla exprivována chimérická, hybridní nebo humanizovaná protilátka, nebo přečištěná chimérická, hybridní nebo humanizovaná protilátka, přidá se 100 μΐ kozí protilátky proti lidskému IgG konjugované s alkalickou fosfatasou a potom se přidá 1 mg/ml substrátového roztoku (Sigma 104, kyselina p-nitrofenylfosforečná, SIGMA) a potom se měří absorbance při 405 nm pomocí čtečky mikroploten (BioRad).
(3) Určení neutralizační aktivity
Určení neutralizační aktivity myších, chimérických a humanizovaných protilátek se provede, například, pomocí buněčné linie krysího osteosarkomu ROS17/2.8-5 (Sáto, K. et al., Acta Endocrinology 116: 113 - 120, 1987). ROS17/2.8-5 buňky se stimulují 4 mM hydrokortisonu pro indukci receptoru pro PTH/PTHrP. Degradační enzym pro cAMP je inhibován 1 mM isobutyl-l-methylxantinu (IBMX, SIGMA). Myší, chimérická nebo humanizovaná protilátka, u které má být určena neutralizační aktivita, je smísena se stejným množstvím PTHrP(1-34) a vzniklá směs každé protilátky a PTHrP(1-34) se přidá do každé jamky. Neutralizační schopnost myší, chimérické nebo humanizované protilátky může být testována měřením množství cAMP produkovaného buňkami buněčné linie krysího osteosarkomu ROS17/2.8-5 v průběhu stimulace PTHrP.
(4) Kinetické analýzy interakcí mezi PTHrP a protilátkou proti PTHrP
V předkládaném vynálezu mohou být kinetiky interakcí mezi PTHrP a anti-PTHrP analyzovány různými prostředky a technikami.
I • · • · ···· · · ·· • · · · ♦ ·
Konkrétně, disociační konstanty, konstanty disociační rychlosti a konstanty asociační rychlosti mohou být měřeny Scatchardovou analýzou a sensorem povrchové plasmonové resonance nazývaným BIACORE (který byl vyvinut a je prodáván Pharmacia Biotech). Analýza za použití sensoru povrchové plasmonové resonance nazývaného BIACORE bude popsána dále jako jeden z příkladů.
Základní struktura BIACORE obsahuje optický zdroj, hranol, detektor a mikrokanál. V praxi je ligand imobilizován na konci sensoru ve tvaru kazety a analyt se injikuje do této kazety. Pokud mezi nimi existuje jakákoliv afinita, pak je opticky detekována úroveň vazby.
Principem detekce je fenome nazývaný povrchová plasmonová resonance. Tak, při dopadu světla na prostor mezi skleněným a kovovým filmem, při kterém může dojít k úplnému odrazu, je světla dopadajícího pod určitým úhlem použito pro excitaci povrchového plasmonu a světlo je utlumeno. Úhel se liší podle změny v koncentraci rozpouštědla, které je v kontaktu s kovovým filmem (sensorem). BIACORE detekuje tuto změnu.
Při použití BIACORE se tato změna nazývá resonanční signál (SPR signál) a změna 0,1 stupně je 1000 RU (rezonančních jednotek) . 1000 RU odpovídá změně vazby přibližně o 1 ng proteinu na tenký zlatý sensor o povrchu 1 mm2. Pro protein může být plně detekována změna přibližně 50 RU (50 pg).
Detekční signály se převedou na křivku vazby, které se nazývá sensorgram pomocí počítače, který je připojen na BIACORE, a tato křivka se přenáší na obrazovku v reálném čase: Natsume, T. et al., (1995) Experimental Medicine 13: 563 - 569; Karlsson, R. et al., (1991) J. Immunol. Methods 145: 229 - 240.
• · * 4 · · » 4 4 • · · · • ·
4 4 4
4 4 4 · • 4 «
4 44
Kinetické parametry, t.j. disociační konstanta (KD) , disociační rychlostní konstanta (Kdiss) a asociační rychlostní konstanta (Kass) protilátek proti PTHrP podle předkládaného vynálezu, mohou být měřeny pomocí výše uvedené BIACORE.
Protilátky proti PTHrP podle předkládaného vynálezu mají výhodně tak malou disociační konstantu (hodnotu KD) , jak je možné s ohledem na neutralizační aktivitu. Výhodně mají protilátky proti PTHrP podle předkládaného vynálezu KD hodnotu 1,86 x 10”' nebo menší, lépe 1,86 χ 10-8 nebo menší a nejlépe 3,58 x 10“K) nebo menší.
KD hodnota je určena ze dvou parametrů, disociačních rychlostníh konstant (Kdiss) a asociačních rychlostních konstant (Kass) (KD = Kdiss/Kass). Je proto jasné, že hodnoty KD jsou nižší, pokud jsou hodnoty Kdiss nižší a Kass vyšší.
Přesněji, hodnoty Kdiss pro protilátky proti PTHrP podle předkládaného vynálezu mohou být 1,22 x 10_1 (1/sj nebo nižší. Výhodně jsou hodnoty Kdiss 1,22 x 10~2 nebo nižší, lépe 3,16 x 10-4 nebo nižší a nejlépe 2,32 x 10-4 (1/s) nebo nižší.
Na druhé straně mohou být hodnoty Kass 6, 55 x 104 (1/M.s)
nebo vyšší. Výhodně jsou Kass hodnoty 6,55 χ 105 nebo vyšší,
ůépe 0, 883 x 10*' nebo vyšší, nejlépe jsou 1,03 x 106 (1/M.s)
nebo vyšší.
Dále / také jsou výhodné protilátky proti PTHrP podle
předkládaného vynálezu mající hodnotu Kdiss 1,22 x 10_1 (1/s) a
Kass 6,55 χ 104 (1/M.s) nebo vyšší.
Ještě přesněji, protilátky proti PTHrP podle předkládaného vynálezu mají hodnotu KD v rozmezí 1,02 x 10 11 až 1,86 x 10 • · «,»·· ·· • ·
91 (M), lépe 1,02 χ 10 10až 1,86χ 10 8 (Μ), ještě lépe 1,34 χ 10 10 až 3,58 χ ΙΟ10 (Μ), nejlépe 2,25 χ ΙΟ“10 až 3,58 χ 10“1θ (Μ).
Hodnoty Kdiss j sou v rozmezí 7,38 X 10’6 až 1,22 χ 10“1
(1/s), lépe 7,38 x 10~5 až 1,22 χ 102 (1/s) , ještě lépe 1,66 x
10“'’ až 3,16 χ ΙΟ“'1 (1/s), nej lépe 1,66 X 10“4 až 2, 32 χ 10“4
(1/s).
Hodnoty Kass jsou v rozmezí 6,55 X 104 až 1,24 χ 107
(1/M.s), lépe 6,55 χ ΙΟ5 až 1,24 χ ΙΟ6 (1/M.s), ještě lépe 7,23 χ 10ÍJ až 1,03 χ 106 (1/M.s), nejlépe 0, 883 χ 106 až 1,03 χ 106 (1/M.s).
Tyto hodnoty KD, Kdiss a Kass mohou být získány Scatchardovou analýzou nebo sensorem povrchové plasmonové resonance jako je BIACORE, výhodně pomocí BIACORE.
6. Farmaceutické prostředky a činidla potlačující hyperkalcemii obsahující humanizovanou protilátku proti PTHrP jako účinou složku
Terapeutický účinek humanizované protilátky na PTHrP může být potvrzen podáním protilátky proti PTHrP nebo humanizované protilátky zvířeti s hyperkalcemii a měřením indexu pro hyperkalcemii. U zvířat s hyperkalcemii a u pacientů s hyperkalcemii je často pozorována hypofosfatémie; protilátky podle předkládaného vynálezu mohou být také použity pro léčbu hypofosfatemie.
Protilátkou použitou v předkládaném vynálezu je protilátka proti PTHrP zahrnující lidskou, chimérickou a primatizovanou protilátku nebo humanizovanou protilátku proti PTHrP mající disociační konstantu, disociační rychlostní konstantu a • · φ · · · φ ·
ΦΦΦ·
ΦΦ φ· • φ ·
ΦΦΦ· • φ • · ·
ΦΦΦφ φ* • · φ
ΦΦ ΦΦ φ φ φ φ • φ φ φ • * ΦΦΦ ΦΦΦ « φ φ φ φ φ · asociační rychlostní konstantu. Protilátka bude neutralizovat aktivitu PTHrP vazbou na PTHrP a výhodně zahrnuje humanizovanou #23-57-137-1 protilátku. Způsob pro produkci humanizované protilátky #23-57-137-1 bude popsán v příkladech 1 až 3.
Protilátka použitá v předkládaném vynálezu může být přečištěna na vysokou čistotu jakoukoliv kombinací běžných technik přečištění, včetně vysolování, gelové filtrace za použití HPLC atd., a afinitní chromatografie za použití protein kolony atd. Rozpoznávání PTHrP protilátkou může být imunologickými technikami, enzymový imunotest (EIA, analýza.
takovou přečištěnou jakýmikoliv běžnými radioimunotest (RIA), potvrzeno jako je
ELISA) nebo imunofluorescenční
Zvířata s hyperkalcemií, která mohou být použita, zahrnují zvířecí model připravený transplantováním nádorových buněk produkujících PTHrP pokusnému zvířeti s redukovanou nebo zrušenou funkcí imunitního systému. Transplantovanými nádorovými buňkami jsou výhodně lidské nádorové buňky, například buňky karcinomu slinivky břišní PAN-7. Ke zvířatům s redukovanou nebo zrušenou funkcí imunitního systému, kterým jsou nádorové buňky transplantovány, patří holé myši a SCID myši .
Suprese hyperkalcemie může být hodnocena pozorováním koncentrací vápníku v krvi, zaznamenáváním redukce tělesné hmotnosti nebo redukce rozsahu pohybů po určitém intervalu a určením stupně zlepšení.
Farmaceutické prostředky a činidla potlačující hyperkalcemií obsahující protilátku nebo humanizovanou protilátku proti PTHrP jako účinnou složku podle předkládaného vynálezu mohou být • «
parenterálně podány systémově nebo lokálně. Například, může být použita parenterální injekce včetně infuse, intramuskulární injekce, intraperitoneální injekce nebo subkutání injekce. Způsob podání bude vybrán podle věku pacienta a onemocnění. Jednotlivá účinná dávka může být v rozmezí 0,01 až 1000 mg na kg tělesné hmotnosti. Alternativně může být dávka 5 až 10000 rag/pacienta, lépe 50 až 1000 mg/pacienta.
Farmaceutické prostředky a činidla potlačující hyperkalcemii obsahující protilátku nebo humanizovanou protilátku proti PTHrP jako účinnou složku podle předkládaného vynálezu mohou dále obsahovat farmaceuticky přijatelný nosič a/nebo pomocné činidlo, v závislosti na způsobu podání. Příklady takových nosičů a pomocných činidel zahrnují vodu, farmaceuticky přijatelná organická rozpouštědla, kolagen, polyvinylalkohol, polyvinylpyrrolidon, karboxyvinylpolymer, karboxymethylcelulosu sodnou, poly(akrylat sodný), arginat sodný, dextran rozpustný ve vodě, karboxymethyl škrob sodný, pektin, methylcelulosu, ethylcelulosu, xantanovou gumu, arabskou klovatinu, kasein, želatinu, agar, diglycerin, glycerin, propylenglykol, polyethylenglykol, vaselinu, parafin, stearylalkohol, kyselinu stearovou, lidský sérový albumin (HSA), manitol, sorbitol, laktosu, a povrchově aktivní činidla jako farmaceutická pomocná činidla. Použitá pomocná činidla mohou být vhodně vybrána z výše uvedených činidel buď samostatně, nebo v kombinaci, ale nejsou omezena na výše uvedená činidla.
Protilátka podle předkládaného vynálezu může být použita obecně pro léčbu hyperkalcemie spojené s různými maligními nádory. Tyto maligní nádory nejsou nijak přesně omezeny a zahrnují nejen jediný nádor, ale také multiplicitní nádory. Mezi tyto nádory patří například nádory slinivky břišní, plic, hrtanu, hltanu, mandle, dásně, jícnu, žaludku, žlučových cest, prsu, ledvin, močového měchýře, dělohy a prostaty, a maligní lymfomy.
Popis obrázků na připojených výkresech
Obr. 1 je schematické znázornění protilátky podle předkládaného vynálezu;
Obr. 2 je schematické znázornění CDR-přenosu;
Obr. 3 znázorňuje určení FR a CDR V regionu;
Obr. 4 je graf ukazující výsledky měření vazebné aktivity
protilátek pro antigen;
Obr. 5 je graf ukazující výsledky měření vazebné aktivity
protilátek pro antigen;
Obr. 6 je graf ukazující výsledky měření vazebné aktivity
protilátek pro antigen;
Obr. 7 je graf ukazující výsledky měření vazebné aktivity
protilátek pro antigen;
Obr. 8 je graf ukazující výsledky měření vazebné aktivity
protilátek pro antigen;
Obr. 9 je graf ukazující výsledky měření vazebné aktivity
protilátek pro antigen;
Obr. 10 je graf ukazující výsledky měření vazebné aktivity
protilátek pro antigen;
Obr. 11 je graf ukazující výsledky měření vazebné aktivity
protilátek pro antigen;
Obr. 12 je graf i ukazuj ící neutralizační aktivitu
humanizovaných protilátek;
Obr. 13 je graf humanizovaných protilátek; ukazuj ící neutralizační aktivitu
Obr. 14 je graf ukazuj ící neutralizační aktivitu
humanizovaných protilátek;
• 4 ·· * 4 4
4 44
4
4 4 »444 44 • · 4 4 4 4 • 4
444
9 9 » 4 4
444
44
4 4 4 • 4 4 4
444 444
4
44
9 9
Obr. 15 jsou grafy znázorňující účinnost protilátek podle předkládaného vynálezu proti hyperkalcemii ve zvířecím modelu;
Obr. 16 jsou grafy znázorňující účinnost protilátek podle předkládaného vynálezu proti hyperkalcemii ve zvířecím modelu;
Obr. 17 jsou grafy znázorňující účinnost protilátek podle předkládaného vynálezu proti hyperkalcemii ve zvířecím modelu;
Obr. 18 jsou grafy znázorňující účinnost protilátek podle předkládaného vynálezu proti hyperkalcemii ve zvířecím modelu;
Obr. 19 je sensorgram ilustrující imobilizaci PTHrP na vrcholu sensoru;
Obr. 20 je graf ukazující výsledky kinetické analýzy protilátky podle předkládaného vynálezu;
Obr. 21 je graf ukazující výsledky kinetické analýzy protilátky podle předkládaného vynálezu;
Obr. 22 je graf ukazující výsledky kinetické analýzy protilátky podle předkládaného vynálezu;
Obr. 23 je graf ukazující výsledky kinetické analýzy protilátky podle předkládaného vynálezu;
Obr. 24 je graf ukazující výsledky kinetické analýzy protilátky podle předkládaného vynálezu;
Obr. 25 je graf ukazující výsledky testu vlivu humanizované protilátky podle předkládaného vynálezu na frakcionované vylučování fosfátů;
Obr. 26 je graf ukazující výsledky testu vlivu humanizované protilátky podle předkládaného vynálezu na koncentraci fosforu v plasmě;
Obr. 27. je fotografie ukazující viditelné klinické příznaky hyperkaicemie na myším modelu, které se vyvinuly po podání protilátky proti PTHrP podle předkládaného vynálezu (morfologie živého zvířete);
Obr. 28. je fotografie ukazující viditelné klinické příznaky hyperkaicemie na myším modelu, které se vyvinuly po podání
44··
4 ♦ 444
999 • 4 • 444 • 9 ·
• 9
9
9
999
99 · 4 4
4 4 4
444 444
4
4· 44 protilátky proti PTHrP podle předkládaného vynálezu (morfologie živého zvířete);
Obr. 29 je graf ukazující změnu spoutání aktivity ve zvířecím modelu hyperkalcemie v čase po podání protilátky proti PTHrP podle předkládaného vynálezu ve srovnání se změnou v kontrolním zvířecím modelu po podání fyziologického roztoku;
Obr. 30 je graf ukazující změnu tělesné teploty ve zvířecím modelu hyperkalcemie v čase po podání protilátky proti PTHrP podle předkládaného vynálezu ve srovnání se změnou v kontrolním zvířecím modelu po podání fyziologického roztoku;
Příklady provedení vynálezu
Předkládaný vynález bude dále popsán podrobněji v následujících příkladech, které neomezují rozsah předkládaného vynálezu.
Odkazy k příkladu 1
Příprava hybridomu produkujícího myší monoklonální protilátku proti PTHrP(1-34)
Hybridomy schopné produkce monoklonální protilátky proti lidskému PTHrP(1-34), #23-57-154 a #23-57-137-1,se připraví technikou, kterou popsal Kanj i Sáto et al., (Sáto, K. et al., J. Bone Miner. Res. 8: 849 - 860, 1993).
Použitým imunogenem byl PTHrP(1-34) (Penisula), na který byl konjugován proteinový nosič, thyreoglobulin, pomocí karbodiimidu (Dojinn). PTHrP(l~34) konjugovaný na thyreoglobulin byl dialyzován za zisku roztoku s koncentrací proteinu 2 pg/ml. Výsledný roztok se smísil s Freundovým • 4
4 4 • 4 44 • 4 4
4 4
4444 44
4444
4 4
4 444
4 4 4
4 4
444
44
4 4 4
4« 4
444 444
4
44 karbodiimidu (Dojinn). PTHrP(1-34) konjugovaný na thyreoglobulin byl dialyzován za zisku roztoku s koncentrací proteinu 2 pg/ml. Výsledný roztok se smísil s Freundovým adjuvans (Difco) v poměru 1:1 za zisku emulse. Tato emulse byla injikována 16 samicím BALB/C myší subkutáně v oblasti hřbetu nebo intraperitoneálně v dávce 100 pg/myš pro imunizaci myší. Injekce byla podána 11-krát. S ohledem na adjuvans bylo Freundovo kompletní adjuvans použito pro injekci při první imunizaci a Freundovo nekompletní adjuvans bylo použito při injekcích pro následující imunizace.
U každé imunizované myši byly určeny titry protilátky v séru následujícím způsobem:
Každé myši byla odebrána krev z ocasní žíly a krev bya centrifugována za zisku séra. Sérum bylo ředěno RIA pufrem, bylo smíseno s 125I značeným PTHrP(1-34) a určila se jeho vazebná aktivita. Myším, u kterých byly zjištěny dostatečně vysoké titry protilátky, byla podána intraperitoneální injekce PTHrP(1-34) bez proteinového nosiče v dávce 50 pg/myš pro konečnou imunizaci.
Tři dny po poslední imunizaci byly myši utraceny a byly jim odebrány sleziny. Potom byly buňky sleziny podrobeny fúzi s myší myelomovou buněčnou linií P3x63Ag8U.l, podle běžné techniky za použití 50% polyethylenglykolu 4000. Takto připravené fúzní buňky byly inokulovány do 85 jamek 96-'jamkové plotny v množství 2 x 10'1 jamku. Vyšetřování požadovaných hybridomů bylo provedeno za použití HAT media následujícím způsobem.
Vyšetřování hybridomů bylo provedeno určením přítomnosti protilátek rozpoznávajících PTHrP v supernatantu kultur v
4 4
4
• 4 • 4 •444 44
4444
4 4 • 4 4 4 4
4 4 #
4 4
44
4 4 4
4 4 4
444 444
4
44 jamkách, ve kterých byl pozorován růst buněk v HAT mediu pomocí techniky RIA na solidní fázi. Hybridomy byly získány z jamek, ve kterých byla potvrzena vazebná schopnost protilátky rozpoznávající PTHrP. Takto získané hybridomy byly suspendovány do RPMI-1640 media obsahujícího 15% FCS a doplněného OPIdoplňkem (Sigma) a potom následovala unifikace hybridomů za použití techniky postupného ředění a tímto způsobem se získaly dva typy hybridomních klonů, #23-57-154 a #23-57-137-1, které vykazovaly oba silnou vazebnou schopnost pro PTHrP(1-34).
Hybridomní klon #23-57-137-1, který byl označen myší-myší hybridom #23-57-137-1, byl uložen podle Budapešťské smlouvy 15.8.1996 v National Institute of Bioscience and Human Technology, Agency of Industrial Science and Technology, Japan (1-3, Higashi 1-chome, Tsukuba-shi, Ibaragi-ken, Japan) pod přírůstkovým číslem FERM BP-5631.
Příklad 1: Klonování DNA kódující V region myší monoklonální protilátky proti lidskému PTHrP(1-34)
Klonování DNA kódující V region myší monoklonální protilátky proti lidskému PTHrP(1-34) získané výše, #23-57-137-1, se provedlo následujícím způsobem.
(1) Příprava mRNA mRNA se připravila z hybridomů #23-57-137-1 pomocí Quick Prep mRNA Purification Kit (Pharmacia Biotech) následujícím způsobem.
Buňky hybridomů #23-57-137-1 získaného výše se plně homogenizovaly s extrakčním pufrem a mRNA byla z něj extrahována za použití oligo(dT)-Cellulose Spun Column podle
Α· »··« • A
9 99
ΑΑ 99
9 9
999 ·
A A • AAA A A
A
A
A A
A A
A A
AAA
A A A A A A A A
A A A A
AAA AAA
A A
A A AA návodu výrobce kitu. Extrakční roztok se sráze ethanolem za zisku mRNA jako sraženiny. Sraženina mRNA se rozpustila v elučním pufru.
(2) Příprava myšího H řetězce a amplifikace cDNA genu kódujícího V region (i) Klonování cDNA pro V region H řetězce protilátky #23-57137-1
DNA kódující V region H řetězce myší monoklonální protilátky proti lidskému PTHrP byla klonována 5'-RACE technikou (Frohman, M.A. et al., Proč. Nati. Acad. Sci. USA 85: 8998 - 9002, 1988; Belyavsky, A: et al., Nucleic Acids Res. 17: 2919 - 2932,
1989). Tato technika byla provedena za použití 5'-Ampli FINDER RACE Kit (CLONTECH) podle návodu výrobce. V této technice byl primer použitý pro syntézu cDNA MHC2 primer (SEQ ID NO: 1) , který hybridizuje s C regionem myšího H řetězce. Přibližně 2 gg mRNA získané výše, která byla templátem pro syntézu cDNA, se smísilo s 10 pmoly primeru MHC2. Vzniklá směs reagovala s reversní transkriptasou při 52 °C po dobu 30 minut za zisku cDNA, která byla komplementární k mRNA.
Vzniklá směs se smísila s 6N NaOH pro hydrolýzu mRNA zde přítomné (při 65 °C po dobu 30 minut) a potom se provedlo srážení ethanolem pro izolaci cDNA jako sraženiny. Takto izolovaná cDNA byla ligována na Ampli FINDER Anchor (SEQ ID NO: 42) na její 5'-konec reakcí s T4 RNA ligasou při 37 °C po dobu 6 hodin a dále při pokojové teplotě po dobu 16 hodin. Jako primery pro amplifikaci cDNA technikou PCR byly použity Anchor primer (SEQ ID NO: 2) a MHC-G1 primer (SEQ ID NO: 3) (S.T.
Jones et al., Biotechnology, 9: 88, 1991).
»ο· • 0 0 · • 0 0 0
0 0 0 0 0 ·
00
PCR roztok (50 μΐ) použitý v této technice obsahoval 10 mM Tris-HCl (pH 8,3), 50 mM Kel, 0,25 mM dNTP (dATP, dGTP, dCTP, dTTP), 1,5 mM MgCl2, 2,5 jednotek TaKaRa Taq (Takara Shuzo) , 10 pmol Anchor primeru a 1 μΐ reakční směsi cDNA, na kterou byly ligovány MHC-G1 primer a Ampli FINDER Anchor primer, která byla převrstvena 50 μΐ minerálního oleje. Třicet cyklů PCR reakce bylo provedeno za použití Thermal Cycler Model 480J (Perkin Elmer) a teplotních cyklů 94 °C, 45 sekund; 60 °C, 45 sekund; a 72 °C, 2 minuty.
(ii) Klonování cDNA pro V region L řetězce protilátky #2357-137-1
DNA kódující V region L řetězce myší monoklonální protilátky proti lidskému PTHrP byla klonována 5'-RACE technikou (Frohman, M.A. et al., Proč. Nati. Acad. Sci. USA 85: 8998 - 9002, 1988; Belyavsky, A: et al., Nucleic Acids Res. 17: 2919 - 2932, 1989). Tato technika byla provedena za použití 5'-Ampli FINDER RACE Kit (CLONTECH) podle návodu výrobce. V této technice byl oligo-dT primer použit jako primer pro syntézu cDNA. Přibližně 2 μg mRNA získané výše, která byla templátem pro syntézu cDNA, se smísilo s oligo-dT primerem. Vzniklá směs reagovala s reversní transkriptasou při 52 °C po dobu 30 minut za zisku cDNA. Vzniklá směs se smísila s 6N NaOH pro hydrolýzu RNA zde přítomné (při 65 1;C po dobu 30 minut) . Potom se provedlo srážení ethanolem pro izolaci cDNA jako sraženiny. Takto izolovaná cDNA byla ligována na Ampli FINDER Anchor na její 5'konec reakcí s T4 RNA ligasou při 37 lJC po dobu 6 hodin a dále při pokojové teplotě po dobu 16 hodin.
PCR primer MLC (SEQ ID NO: 4) byl navržen na základě konzervované sekvence pro C region myšího LX řetězce a byl syntetizován za použití 394 DNA/RNA Synthesizer (ABI). PCR
59 • to «to • to * • « · · • · · · • · to to·· · ·· toto toto·· ·· « · • to · · · · ·
to · • · « · www v a « 9 to · «toto · · · • ·· ··· ·« ··
roztok (100 μΐ) použitý pro syntézu primerů obsahoval 10 mM
Tris-HCl (pH 8,3; l , 50 mM Kel, 0,25 mM dNTP (dATP, dGTP, dCTP,
dTTP), 1,5 mM MgCl2, 2,5 jednotek AmpliTaq (Perkin Elmer) , 50 pmol Anchor primerů (SEQ ID NO: 2) a 1 μΐ reakční směsi cDNA, na kterou byly ligovány MLC (SEQ ID NO: 4) a Ampli FINDER Anchor, která byla převrstvena 50 μΐ minerálního oleje. Třicet cyklů PCR reakce bylo provedeno za použití Thermal Cycler Model 480J (Perkin Elmer) a teplotních cyklů 94 °C, 45 sekund; 60 °C, 45 sekund; a 72 °C, 2 minuty.
(3) Přečištění a fragmentace produktu PCR
Každý z DNA fragmentů amplifikováných PCR technikou popsanou výše byl separován agarosovou gelovou elektroforesou za použití 3% NuSieve GTG agarosy (EMC Bio. Products) . Pro V region H řetězce a V region L řetězce byla v příslušném pořadí z gelu excidována frakce obsahující DNA fragment délky přibližně 550 bp. Každá získaná frakce gelu byla přečištěna za zisku DNA pomocí GENECLEAN II Kitu (BIO101) podle návodu výrobce. Přečištěná DNA byla vysrážena z roztoku ethanolem a byla rozpuštěna ve 20 μΐ roztoku obsahujícího 10 mM Tris-HCl (pH 7,4) a 1 mM EDTA. 1 μΐ takto připraveného roztoku DNA byl tráven restrikčním enzymem Xmal (New England Biolabs) při 37 ()C po dobu 1 hodiny a dále restrikčním enzymem EcoRl (Takara Shuzo) při 37 l,C po dobu 1 hodiny. Trávená směs byla podrobena extrakci fenolem a chloroformem a potom srážení ethanolem pro odběr DNA.
Tímto způsobem byly získány DNA kódující V region myšího H řetězce a DNA kódující V region myšího L řetězce, které měly obě na 5'-konci sekvenci rozpoznávající EcoRl a na 3'-konci sekvenci rozpoznávající Xmal.
0» »»«· • 0 · • · «·♦
9 9 « 9 » • 90
0
9 9
Každý z EcoRI-Xmal DNA fragmentů obsahujících DNA kódující V region myšího H řetězce a DNA kódující V region myšího L řetězce, v příslušném pořadí, reagoval s pUC19 vektorem, který byl tráven EcoRI a Xmal, při 16 °C po dobu 1 hodiny za použití DNA Ligation Kit verse 2 (Takara Shuzo) podle návodu výrobce pro vzájemnou ligaci. Takto získaná ligační směs (10 μΐ) se přidala ke 100 μΐ roztoku obsahujícího kompetentní buňky E. coli, JM 109 (Nippon Gene). Směs buněk se nechala stát po dobu 15 minut na ledu, dále při 42 °C po dobu 1 minuty a dále po dobu 1 minuty na ledu. Výsledná směs se smísila s 300 μΐ SOC kultivačního media (Sambrook et al., Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989) a potom se provedla inkubace při 37 °C po dobu 30 minut. Vzniklý roztok buněk se kultivoval na LB nebo 2xYT agarovém mediu (Sambrook et al., Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989) doplněném 100 nebo 50 pg/ml ampicilinu, 0,1 mM IPTG a 20 μg/ml X-gal a potom se provedla inkubace při 37 °C přes noc. Tímto způsobem se připravily transformanty E. coli.
Transformanty se kultivovaly přes noc ve 2 ml LB nebo 2xYT media obsahujícího 100 nebo 50 pg/ml ampicilinu při 37 °C a potom se z buněčné frakce připravila plasmidová DNA pomocí Plasmid Extracter ΡΙ-100Σ (Kurabou) nebo QIAPrep Spin Plasmid Kitu (QIAGEN). U takto získaných plasmidových DNA byly určeny její DNA sekvence.
(4) Sekvencování cDNA kódující V region myší protilátky
Sekvence cDNA kódující region nesený na plasmidu byla určena za použití DNA Sequencer 373A (ABI; Perkin-Elmer) za použití Dye terminátor Cycle Sequencing Kitu (Perkin Elmer). Tato DNA sekvence byla určena potvrzením sekvence baží v obou ·« φφφφ
ΦΦ ΦΦ
Φ * · · • Φ Φ Φ
ΦΦΦ ΦΦΦ
Φ Φ
ΦΦ ΦΦ • Φ ΦΦ • φ φ • ΦΦ» • φ · » • φ ·
ΦΦΦ · ··
Φ 9 * • ΦΦΦΦ • « Φ Φ
Φ Φ Φ
Φ· ··· orientacích za použití primeru M13 Primer M4 (Takara Shuzo) (SEQ ID NO: 5) a M13 Primer RV (Takara Shuzo) (SEQ ID NO: 6).
Takto získané plasmidy, které obsahovaly cDNA kódující V region myšího H řetězce a cDNA kódující V region myšího L řetězce odvozené od hybridomu #23-57-137-1 byly označeny MBC1H04 a MBC1L24, v příslušném pořadí. Sekvence (včetně odpovídajících aminokyselinových sekvencí) DNA kódující V region H řetězce a DNA kódující V region L řetězce myší protilátky #23-57-137-1 (v příslušném pořadí nesené na plasmidech MBC1H04 a MBC1H24) jsou uvedeny v SEQ ID NO: 57 a SEQ ID NO: 65, v příslušném pořadí. Oba polypeptidy pro fragment V regionu H řetězce a pro fragment V regionu L řetězce byly translatovány od 58. baze (která kóduje glutamin) v DNA sekvenci uvedené v SEQ ID NO: 57 a SEQ ID NO: 65.
Aminokyselinové sekvence pro V region H řetězce a V region L řetězce jsou uvedeny v SEQ ID NO: 46 a SEQ ID NO: 45, v příslušném pořadí.
E. coli nesoucí plasmid MBC1H04 a E. coli nesoucí plasmid MBC1L24 byly označeny Escherichia coli JM109 (MBC1H04) a
Escherichia coli JM109 (MBC1L24), v příslušném pořadí. Tyto kmeny E. coli byly uloženy podle Budapešťské smlouvy 15.8.1996 v National Institute of Bioscience and Human Technology, Agency of Industrial Science and Technology, Japan (1-3, Higashi 1chome, Tsukuba-shi, Ibaragi-ken, Japan) pod přírůstkovým číslem FERM BP-5628 pro Escherichia coli JM109 (MBC1H04) a FERM BP5627 pro Escherichia coli JM109 (MBC1L24), v příslušném pořadí.
(5) Určení CDR myší monoklonální protilátky #23-57-137-1 proti lidskému PTHrP
4444
4 4
4 444 • t 44 • 4 4
4444 44
4 4 ·
444
·
4 4 4
Obecné struktury V regionu H řetězce a V regionu L řetězce jsou navzájem podobné. To znamená, obě struktury mají čtyři regiony pracovních rámců spojené třemi hypervariabilními regiony (t.j. komplementaritu určujícími regiony (CDR)). Aminokyselinové sekvence regionů pracovních rámců jsou relativně dobře konzervované, zatímco aminokyselinové sekvence CDR regionů vykazují extrémně vysokou mutagenicitu (Kabat, E.A. et al., Sequence of Proteins of Immunological Interest, U.S. Dept. Health and Human Services, 1983).
Na základě výše uvedených skutečností byly určeny CDR určeny vyhledáváním homologie aminokyselinových sekvencí V regionu maší monoklonální protilátky v Data Base aminokyselinových sekvencí pro protilátky, kterou určil Kabat et al.
Aminokyseinové sekvence CDR 1-3 ve V regionu L řetězce jsou uvedeny v SEQ ID NO: 59 - 61, v příslušném pořadí, a aminokyseinové sekvence CDR 1-3 ve V regionu H řetězce jsou uvedeny v SEQ ID NO: 62 - 64, v příslušném pořadí.
Tabulka 2
V region SEQ ID NO: CDR1 CDR2 CDR3
v region H řetězce 5'7 31-35 50-66 99-107
v region L řetězce 65 23-34 50-60 93-105
Příklad 2: Konstrukce chimérické protilátky (1) Konstrukce H řetězce chimérické protilátky (i) Konstrukce V regionu H řetězce • 4 44
9 9 · • 4 · 4
Klonovaná cDNA kódující V region myšího H řetězce byla modifikována PCR metodou pro její ligaci do expresního vektoru nesoucího genomovou DNA pro C region Cyl lidského H řetězce. Použitý downstream primer MBC1-S1 (SEQ ID NO: 7) byl navržen tak, aby mohl hybridizovat na DNA kódující 5'-koncový region vedoucí sekvence V regionu a aby měl obě Kozákovi konvenční sekvence (Kozák, M. et al., J. Mol. Biol. 196: 947 - 950, 1987) a sekvenci rozpoznávající HindlII. Použitý upstream primer MBCl-a (SEQ ID NO: 8) byl navržen tak, aby mohl hybridizovat na DNA kódující 3'-koncový region J regionu a aby měl obě sestřihové donorové sekvence a sekvenci rozpoznávající BamHI. PCR reakce byla provedena za použití TaKaRa Ex Taq (Takara Shuzo) a náležitého pufru. PCR roztok (50 μΐ) použitý v této technice obsahoval 0,07 gg plasmidu MBC1H04 jako templatové DNA, 50 pmol MBCl-a a 50 pmol MBC1-S1 jako primerů, 2,5 jednotek TaKaRa Ex Taq a 0,25 mM dNTP v pufru, který byl převrstven 50 μΐ minerálního oleje. Třicet cyklů PCR reakce bylo provedeno za použití teplotních cyklů 94 °C, 1 minuta; 55 °C, 1 minuta; a 72 °C, 2 minuty. Takto amplifikované DNA fragmenty byly separovány agarosovou gelovou elektroforesou za použití 3% Nu Sieve GTG Agarosy (FMC Bio. Products).
Potom byly fragmenty agarosového gelu obsahující DNA fragment délky 437 bp excidovány a DNA fragment byl přečištěn pomocí GENECLEAN II Kitu (BIO101) podle návodu výrobce. Přečištěná DNA byla vysrážena z roztoku ethanolem a byla rozpuštěna ve 20 μΐ roztoku obsahujícího 10 mM Tris-HCl (pH 7,4) a 1 mM EDTA. 1 μΐ takto připraveného roztoku DNA byl tráven restrikčnimi enzymy BamHI a HindlII (Takara Shuzo) při 37 °C po dobu 1 hodiny. Trávená směs byla podrobena extrakci fenolem a chloroformem a potom srážení ethanolem pro odběr DNA.
• · • ·
Získaný HindiIΙ-BamHI fragment obsahující DNA kódující V region myšího H řetězce byl subklonován do pUC19 vektoru, který byl tráven HindlII a BamHI. Výsledný plasmid byl sekvencován pomocí DNA Sequencer 373A (Perkin Elmer) za použití M13 Primer M4 a M13 Primer RV jako primerů a Dye Terminátor Cycle Sequencing Kitu (Perkin Elmer). Plasmid obsahoval DNA se správnou sekvencí baží kódující V region myšího H řetězce odvozený od hybridomu #23-57-137-1 a měl rozpoznávací sekvenci pro HindlII a Kozákovu sekvenci na svém 5'-koncovém regionu a rozpoznávací sekvenci pro BamHI na svém 3'-koncovém regionu a byl označen MBClH/pUC19.
(ii) Konstrukce V regionu H řetězce, který je použit pro přípravu cDNA pro myší-lidský chimérický H řetězec
DNA kódující V region myšího H řetězce konstruovaná výše byla modifikována PCR metodou pro její ligaci na cDNA pro C region cyl lidského H řetězce. Zpětný primer, MBC1HVS2 (SEQ ID NO: 9) použitý pro modifikaci V regionu H řetězce, byl navržen tak, aby nahradil druhou aminokyselinu (t.j. asparagin) sekvence kódující prvou část vedoucí sekvence V regionu glycinem a aby měl Kozákovu konvenční sekvenci . (Kozák, M. et al., J. Mol. Biol. 196: 947 - 950, 1987) a rozpoznávací místo pro HindlII a EcoRI. Sense primer MBC1HVR2 (SEQ ID NO: 10) použitý pro modifikaci V regionu H řetězce byl navržen tak, aby mohl hybridizovat na DNA kódující 3'-koncový region J regionu, na 5'-koncový region C regionu a aby měl sekvenci rozpoznávající Apal a Smál.
PCR reakce byla provedena za použití TaKaRa Ex Taq (Takara Shuzo) a náležitého pufru. PCR roztok (50 μΐ) použitý v této technice obsahoval 0,6 μg plasmidu MBClH/pUC19 jako templatové DNA, 50 pmol MBC1HVS2 a 50 pmol MBC1HVR2 jako primerů, 2,5 • ·
0 0 0 0 0 0 • · · · · · · · ···· ·· ·· 000 00 00 jednotek TaKaRa Ex Taq a 0,25 mM dNTP v pufru, který byl převrstven 50 μΐ minerálního oleje. Třicet cyklů PCR reakce bylo provedeno za použití teplotních cyklů 94 °C, 1 minuta; 55 °C, 1 minuta; a 72 °C, 1 minuta. DNA fragmenty amplifikované v
PCR reakci byly separovány agarosovou gelovou elektroforesou za použití 1% Sea Kem GTG Agarosy (EMC Bio. Products). Potom byly fragmenty agarosového gelu obsahující DNA fragment délky 456 bp excidovány a DNA fragment byl přečištěn pomocí GENECLEAN II
Kitu (BIO101) podle návodu výrobce. Přečištěné DNA fragmenty byly vysrážena ethanolem a potom byly rozpuštěny ve 20 μΐ roztoku obsahujícího 10 mM Tris-HCl (pH 7,4) a 1 mM EDTA.
μΐ takto připraveného roztoku DNA byl tráven restrikčními enzymy EcoRl a Smál (Takara Shuzo) při 37 °C po dobu 1 hodiny.
Trávená směs byla podrobena extrakci fenolem a chloroformem a potom srážení ethanolem pro odběr DNA. Získané EcoRI-Smal DNA fragmenty obsahující DNA kódující V region myšího H řetězce byly subklonovány do pUC19 vektoru, který byl připraven trávením plasmidu EcoRl a Smál. Výsledný plasmid byl sekvencován pomocí DNA Sequencer 373A (Perkin Elmer) za použití M13 Primer M4 a M13 Primer RV jako primerů a Dye Terminátor Cycle Sequencing Kitu (Perkin Elmer). Plasmid obsahoval DNA se správnou sekvencí baží kódující V region myšího H řetězce odvozený od hybridomů #23-57-137-1 a měl rozpoznávací sekvenci pro HindlII a Kozákovu sekvenci na svém 5'-koncovém regionu a rozpoznávací sekvenci pro Apal a Smál na svém 3'-koncovém regionu a byl označen MBClHv/pUC19.
(iii) Konstrukce expresního vektoru pro H řetězec chimérické protilátky cDNA obsahující C region Cyl H řetězce lidské protilátky byla připravena následujícím způsobem.
• · k · » · • · · · · · mRNA byla připravena z CHO buněk, do kterých byl vložen expresní vektor DHFR-AE-RVh-PM-l-f (viz WO 92/19759) kódující genomové DNA V regionu H řetězce humanizované protilátky PM1 a C region H řetězce lidské protilátky IgGl a expresní vektor RVl-PMla (viz WO 92/19759) kódující genomové DNA V regionu L řetězce humanizované protilátky PM1 a C region κ řetězce L řetězce lidské protilátky. Za použití získané mRNA byla klonována cDNA obsahující V region H řetězce humanizované protilátky PM1 a C region Cyl lidské protilátky technikou RTPCR a potom byla subklonována do plasmidu pUC19 v HindlII-BamHI místě. U subklonovaného plasmidu byla určena jeho DNA sekvence a plasmid se správnou sekvencí baží byl označen pRVh-PMlfcDNA.
Expresní vektor DHFR-AE-RVh-PM-l-f, který měl delece HindlII místa mezi SV40 promotorem a DHFR genem a EcoRI místa mezi EFla promotorem a V regionem H řetězce humanizované protilátky PM1 byl připraven pro konstrukci expresního vektoru pro cDNA obsahující a V region H řetězce humanizované protilátky PM1 a C region Cyl lidské protilátky.
Získaný plasmid pRVh-PMlf-cDNA byl tráven BamHI, tupě zakončen Klenow fragmentem a byl dále tráven HindlII za zisku tupě zakončeného HinlII-BamHI fragmentu. Tento tupě zakončený HindlIΙ-BamHI fragment byl ligován do výše uvedeného expresního vektoru s deletovaným HindlII místem a EcoRI místem DHFR-AERVh-PM-l-f, který byl tráven HindlII a BamHI za konstrukce expresního vektoru RVh-PMlf-cDNA obsahujícího cDNA kódující V region H řetězce humanizované protilátky PM1 a C region Cyl lidské protilátky, v příslušném pořadí.
tttt • · • · · • · · · · · • · · · · · · · · • · · · · · · · · · ···· ·· · · · · ·
Expresní vektor RVh-PMlf-cDNA obsahující cDNA kódující V region H řetězce humanizované protilátky PM1 a C region Cyl lidské protilátky byl tráven Apal a BamHI a byl z něj získán DNA fragment obsahující C region H řetězce. Výsledný DNA fragment byl vložen do výše uvedeného plasmidu MBClHv/pUC19, který byl tráven Apal a BamHI. Takto připravený plasmid byl označen MBClHcDNA/pUC19. Tento plasmid je plasmid obsahující cDNA kódující V region H řetězce myší protilátky a C region Cyl lidské protilátky, v příslušném pořadí, který má rozpoznávací sekvence pro EcoRI a HindlII na svém 5'-konci a rozpoznávací sekvenci pro BamHI na svém 3'-konci.
Plasmid MBCIHcDNA/pUCl9 byl tráven EcoRI a BamHI za zisku DNA kódující H řetězec chimérické protilátky. Vzniklý DNA fragment byl vložen do expresního vektoru pCOSl, který byl tráven EcoRI a BamHI. Takto získaný expresní vektor pro chimérickou protilátku byl označen MBCIHcDNA/pCOSI. Zde byl expresní vektor pCOSl konstruován za použití HEF-PMh-gyl (viz WO 92/19759) pomocí jeho delece z genu pro protilátku pomocí trávení EcoRI a Smál a potom jeho ligací na EcoRI-Notl-BamHI Adaptor (Takara Shuzo).
Pro přípravu plasmidu pro expresi v CHO buňkách byl plasmid MBCIHcDNA/pUCl9 tráven EcoRI a BamHI za zisku DNA kódující H řetězec chimérické protilátky, která byla potom vložena do expresního plasmidu pCHOl, který byl tráven EcoRI a BamHI. Takto získaný expresní plasmid pro chimérickou protilátku byl označen MBCIHcDNA/pCHOl. Zde byl expresní vektor pCHOl konstruován za použití DHFR-AE-rvH-PMl-f (viz WO 92/19759) pomocí jeho delece z genu pro protilátku pomocí trávení EcoRI a Smál a potom jeho ligací na EcoRI-Notl-BamHI Adaptor (Takara Shuzo).
· • 4 • · • •44 4 »444 4 · · 4 #4 444 4 »4 44444» »4444 4 4 4 • 444 44 «4 444 44 44 (2) Konstrukce C regionu lidského H řetězce (i) Příprava klonovacího vektoru
Pro konstrukci pUC19 vektoru obsahujícího C region lidského L řetězce byl připraven vektor pUC19 s deletovaným HindlII místem. 2 pg pUC19 vektoru byly tráveny ve 20 μΐ reakčního roztoku, který obsahoval 20 mM Tris-HCl (pH 8,5), 10 mM MgCl2, mM DTT, 100 mM KCl, 8 U HindlII (Takara Shuzo) při 37 °C po dobu 1 hodiny. Výsledný trávený roztok byl podroben extrakci fenolem a chloroformem a potom srážení ethanolem pro získání požadované DNA.
Takto získaná DNA reagovala v 50 μΐ reakčního roztoku obsahujícího 50 mM Tris-HCl (pH 7,5), 10 mM MgCl2, 1 mM DTT,
100 mM NaCl, 0,5 mM dNTP a 6 U Klenow fragmentu (GIBCO BRL) při pokojové teplotě po dobu 20 minut, což způsobilo tupé zakončení konců DNA. Tato reakční směs byla podrobena extrakci fenolem a chloroformem a potom srážení ethanolem pro získání vektorové DNA.
Takto získaná vektorová DNA reagovala v 10 μΐ reakčního roztoku obsahujícího 50 mM Tris-HCl (pH 7,6), 10 mM MgCl2, 1 mM ATP, 1 mM DTT, 5% (obj./obj.) polyethylenglykol-8000 a 0,5 U T4 DNA ligasy (GIBCO-BRL) při 16 °C po dobu 2 hodin, čímž bylo dosaženo samoligace vektorové DNA. 5 μΐ reakčního roztoku se přidalo ke 100 μΐ roztoku obsahujícího kompetentní buňky E. coli, JM 109 (Nippon Gene) a výsledný roztok se nechal stát po dobu 30 minut na ledu, dále při 42 °C po dobu 1 minuty a dále po dobu 1 minuty na ledu. Do reakčního roztoku se přidalo 300 μΐ SOC kultivačního media a potom se provedla inkubace při 37 °C po dobu 1 hodiny. Vzniklý roztok buněk se kultivoval na 2xYT agarovém mediu (obsahujícím 50 pg/ml ampicilinu), které mělo na svém povrchu IPTG a X-gal (Sambrook et al., Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989) a potom se provedla inkubace při 37 °C přes noc za zisku transformantů.
Transformanty se kultivovaly přes noc na 2xYT mediu obsahujícím 50 pg/ml ampicilinu při 37 °C. Z buněčné frakce kultivačního media se přečistila plasmidová DNA pomocí Plasmid Mini Křtu (QIAGEN) podle návodu výrobce. Přečištěný plasmid byl tráven HindlII. Plasmid, u kterého byla potvrzena delece HindlII místa byl označen pUC19 ÁHindlII.
(ií) Konstrukce DNA kódující C region λ řetězce L řetězce
Je známo, že C region lidského λ řetězce L řetězce má alespoň 4 různé izotypy zahrnující Mcg+Ke'Oz~ , Mcg”Ke’Oz“ , Mcg” Ke'Oz* a Mcg-Ke^Oz (P. Dariavach et al., Proč. Nati. Acad. Sci. USA 84: 9074 - 9078, 1987). Bylo provedeno vyhledávání C regionů λύθίέζοθ L řetězce lidské protilátky homologních k C regionu λ řetězce L řetězce #23-57-137-1 v EMBL databázy. V tomto vyhledávání bylo zjištěno, že izotyp Mcg+Ke+Oz“ (přírůstkové č. X57819) (P. Dariavach et al., Proč. Nati. Acad. Sci. USA 84: 9074 - 9078, 1987) λ řetězce L řetězce lidské protilátky vykazuje nejvyšší homologii s C regionem λ řetězce myššího L řetězce a má 64,4% homologii aminokyselinové sekvence a 73,4% homologii DNA sekvence.
Potom byla provedena konstrukce DNA kódující C region λ řetězce L řetězce lidské protilátky pomocí PCR. Za použití 394 DNA/RNA Synthetizer (ABI) byl syntetizován každý z následujících primerů. Syntetizovanými primery byly HLAMB1 (SEQ ID NO: 11) a HLAMB3 (SEQ ID NO: 13), které měly oba sense DNA sekvence a HLAMB2 (SEQ ID NO: 12) a HLAMB4 (SEQ ID NO: 14),
99 • 9 9 9 9 9 9 9 9
9 99 9 9 9 9 9 9 9 9 ·
999 9 99 999999
9 9 9 9 9 9 « ···· 99 99 999 99 99 které měly oba antisense DNA sekvence, kde každý primer obsahoval na obou koncích komplementární sekvenci délky 20 - 23 bp.
Externí primery HLAMBS (SEQ ID NO: 15) a HLAMBR (SEQ ID NO:
16) mají sekvenci komplementární k primerům HLAMB1 a HLAMB4, v příslušném pořadí, a obsahují rozpoznávací sekvence pro EcoRI,
HindlII a Blnl a rozpoznávací sekvenci pro EcoRI, v příslušném pořadí. V první PCR reakci byla provedena reakce HLAMB1-HLAMB2 a HLAMB3-HLAMB4. Po dokončení reakcí byly obě výsledné směsi smíseny ve stejných množstvích a byly sestaveny v druhé PCR reakci. Ke vzniklé reakční směsi byly přidány externí primery HLAMBS a HLAMBR. Na této reakční směsi byla provedena třetí PCR reakce pro amplifikaci kompletní DNA.
PCR reakce byly provedeny za použití TaKaRa Ex Taq (Takara Shuzo) podle návodu výrobce. V první PCR reakci bylo použito 100 μΐ buď reakčního roztoku obsahujícího 5 pmol HLAMB1, 0,5 pmol HLAMB2 a 5U TaKaRa Ex Taq (Takara Shuzo), nebo obsahoval reakční roztok 0,5 pmol HLAMB3, 5 pmol HLAMB4 a 5U TaKaRa Ex Taq (Takara Shuzo), který byl převrstven 50 μΐ minerálního oleje a pět cyklů PCR reakce bylo provedeno za použití teplotních cyklů 94 °C, 1 minuta; 60 °C, 1 minuta; a 72 °C, 1 minuta. Ve druhé PCR reakci byla použita směs 50 μΐ každého z reakčních roztoků, které byly převrstveny 50 μΐ minerálního oleje a tři cyklů PCR reakce byly provedeny za použití teplotních cyklů 94 °C, 1 minuta; 60 °C, 1 minuta; a 72 'JC, 1 minuta. Ve třetí PCR reakci byl použit reakční roztok, do kterého bylo přidáno 50 pmol každého z externích primerů HLAMBS a HLAMBR a třicet cyklů PCR reakce bylo provedeno za použití teplotních cyklů 94 °C, 1 minuta; 60 °C, 1 minuta; a 72 °C, 1 minuta.
·« • ·· ···· • · ···· ·· ·· • · · 9 9 9 9
9 9 99 9 9 9 · • · · · · ······ • · · · · • 4 ··· ·· ··
DNA fragment získaný ve třetí PCR reakci byl separ -ř CT C agarosovou gelovou elektroforesou za použití 3% agaroso,^..^ gelu s nízkou teplotou tání (Nu Sieve GTG Agarosa, EMC) a potom byly odebrán a přečištěn pomocí GENECLEAN II Kitu (BI0101) podle návodu výrobce.
Takto získaný DNA fragment byl tráven ve 20 μΐ reakčního roztoku obsahujícího 10 mM Tris-HCl (pH 7,5), 10 mM MgCl2, 1 mM DTT, 100 mM NaCl a 8 U EcoRI (Takara Shuzo) při teplotě 37 °C po dobu 1 hodiny. Trávený roztok byl extrahován fenolem a chloroformem a potom srážen ethanolem za zisku DNA. DNA byla odebrána a rozpuštěna v 8 μΐ roztoku obsahujícího 10 mM TrisHCl (pH 7,4) a 1 mM EDTA.
0,8 μμ plasmidu pUC19 AHindlII bylo tráveno EcoRI způsobem popsaným výše. Trávený roztok byl extrahován fenolem a chloroformem a potom byl vysrážen ethanolem, za zisku tráveného plasmidu pUC19 ÁHindlII. Takto získaný trávený plasmid reagoval v 50 μΐ reakčního roztoku obsahujícího 50 mM Tris-HCl (pH 9,0), 1 mM MgCl2 a alkalickou fosfatasu (E. coli C75; Takara Shuzo) při 37 °C po dobu 30 minut pro def osforylaci plasmidu (t.j. BAP~zpracování) . Reakční roztok byl extrahován fenolem a chloroformem a potom srážen ethanolem za zisku DNA. Takto získaná DNA byla rozpuštěna v 10 μΐ roztoku obsahujícího 10 mM Tris-HCl (pH 7,4) a 1 mM EDTA.
μΐ takto získaného plasmidu pUC19 ÁHindlII zpracovaného BAP byl smísen s 4 μΐ DNA získané ve výše uvedené PCR reakci pro vzájemnou ligaci za použití DNA Ligation Kit ver. 2 (Takara Shuzo). Vzniklý plasmid byl vložen do kompetentních buněk E. coli JM109 za vzniku transformantů. Transformanty byly kultivovány přes noc ve 2 ml 2xYT media obsahujícího 50 μg/ml • 4 MM • · · · · · 4 4 4 4 • 444 4 4 4 · · 4 44 4 •4 4 · · · 44 4·· 4·4
444·· 4 4 4 ···« ·· ·« ··· ·· 44 ampicilinu. Z buněk byl plasmid přečištěn za použití QIAprep
Spin Plasmid Kitu (QIAGEN).
U plasmidu popsaného výše byla určena sekvence klonované DNA. Pro určení sekvence DNA byl použit 373A DNA Sequencer (ABI) a primery M13 Primer M4 a M13 Primer RV (Takara Shuzo). Bylo zjištěno, že klonovaná DNA má deletovanou část 12 bp. Plasmid obsahující DNA byl označen cXA/pUC19. Potom byly pro výrobu deletované části nově syntetizovány primery HCLMS (SEQ ID NO: 17) a HCLMR (SEQ ID NO: 18) a správná DNA byla rekonstruována PCR metodou.
Byla provedena první PCR reakce, za použití plasmidu CÁÁ/pUCl9 obsahujícího deletovanou DNA jako templát a primerů HLAMBS a HCLMS nebo primerů HCLMS a HLAMB4. Každý produkt PCR reakce byl příslušným způsobem přečištěn. Ve druhé PCR reakci byly produkty PCR sestaveny dohromady. Ke vzniklému produktu byly přidány externí primery HLAMBS a HLAMB4 a potom následoval a třetí PCR reakce pro amplifikaci kompletní DNA.
V první PCR reakci bylo použito 100 μΐ reakčních roztoků obsahujících 0,1 pg CÁA/pUC19 jako templát, buď 50 pmol každého z primerů HLAMBS nebo HCLMR nebo 50 pmol každého z primerů HCLMS a HLAMB4 a 5U TaKaRa Ex Taq (Takara Shuzo) , které byly převrstveny 50 μΐ minerálního oleje a třicet cyklů PCR reakce bylo provedeno za použití teplotních cyklů 94 °C, 1 minuta; 60 °C, 1 minuta; a 72 °C, 1 minuta.
Produkty PCR, HLAMBS-HCLMR (236 bp) a HCLMS-HLAMB4 (147 bp) byly podrobeny elektroforese za použití 3% agarosového gelu s nízkou teplotou tání pro izolaci DNA fragmentu. DNA fragment byl potom odebrán a přečištěn pomocí GENECLEAN II Kitu (BIO101). Ve druhé PCR reakci bylo použito 20 μΐ reakčního • 4 4444 • 4 · 4 4 · · · · ·
4 4 4 4 4 4 4· · · · «
4 · · · · · · 444 444
4 4 4 4 4 ··
4444 44 ·· ··· 44 44 roztoku obsahujícího 40 ng přečištěných DNA fragmentů a 1 U
TaKaRa Ex Taq (Takara Shuzo), který byl převrstven 25 μΐ minerálního oleje a bylo prodedeno pět cyklů PCR reakce za použití teplotních cyklů 94 °C, 1 minuta; 60 °C, 1 minuta; a 72 °C, 1 minuta.
Ve třetí PCR reakci bylo použito 100 μΐ reakčního roztoku obsahujícího 2 μΐ reakčního roztoku získaného ve druhé PCR reakci, 50 pmol každého z externích primerů HLAMBS a HLAMB4 a 5 U TaKaRa Ex Taq (Takara Shuzo), který byl převrstven 50 μΐ minerálního oleje, a třicet cyklů PCR reakce bylo provedeno za použití teplotních cyklů 94 °C, 1 minuta; 60 °C, 1 minuta; a 72 °C, 1 minuta, za zisku DNA fragmentu délky 357 bp (produkt třetí PCR). DNA fragment byl podroben elektroforese za použití 3% agarosového gelu s nízkou teplotou tání pro izolaci DNA fragmentu. DNA fragment byl potom odebrán a přečištěn pomocí GENECLEAN II Kitu (BIO101).
0,1 μς takto získaného DNA fragmentu bylo potom tráveno EcoRI a výsledný produkt byl potom subklonován do plasmidu pUC19ÁHindIII, který byl zpracován BAP. Vzniklý plasmid byl vložen do kompeténtních buněk E. coli JM109 za vzniku transformantů. Takto připravené transformanty byly kultivovány přes noc ve 2 ml 2xYT media obsahujícího 50 μg/ml ampicilinu. Z buněk byl plasmid přečištěn za použití QIAprep Spin Plasmid Kitu (QIAGEN).
DNA sekvence takto získaného plasmidu byla potvrzena pomocí M13 Primer M4 a M13 Primer RV (Takara Shuzo) a za použití 373A DNA Sequencer (ABI). Plasmid s potvrzenou správnou sekvencí DNA bez jakékoliv delece byl označen VÁ/pUC19.
·· »·
9 9
999
9 9
9 9
9999 99
AA AAAA * 9
9 99
99
9 9 9
A A A • A·· AAA
A A
A A AA
9 9
9 9
9 99 (iii) Konstrukce DNA kódující C region κ řetězce lidského L řetězce
DNA fragment kódující C region κ řetězce L řetězce byl klonován z plasmidu HEF-PMl-gk (WO 92/19759) technikou PCR. Sense primer HKAPS (SEQ ID NO: 19) byl navržen tak, aby obsahoval EcoRI, HindiII a Blnl rozpoznávací sekvence a antisense primer HKAPA (SEQ ID NO: 20) byl navržen tak, aby obsahovalEcoRI-rozpoznávací sekvenci, a oba byly syntetizovány za použití 394 DNA/RNA Synthetizer (ABI).
PCR reakce byla provedena za použití 100 μΐ reakčního roztoku obsahujícího 0,1 gg plasmidu HEF-PMlk-gk jako templát, 50 pmol každého z primerů HKAPS a HKAPA a 5U TaKaRa Ex Taq (Takara Shuzo), který byl převrstven 50 gl minerálního oleje. Třicet cyklů PCR reakce bylo provedeno za použití teplotních cyklů 94 °C, 1 minuta; 60 °C, 1 minuta; a 72 °C, 1 minuta, za zisku DNA fragmentu délky 360 bp. DNA fragment byl izolován elektroforesou za použití 3% agarosy s nízkou teplotou tání a potom byl odebrán a přečištěn pomocí GENECLEAN II Kitu (BIO101).
Takto získaný DNA fragment byl potom tráven EcoRI a výsledný produkt byl klonován do plasmidu pUC19AHindIII, který byl zpracován BAP. Vzniklý plasmid byl vložen do kompetentních buněk E. coli JM109 za vzniku transformantů. Takto připravené transformanty byly kultivovány přes noc ve 2 ml 2xYT media obsahujícího 50 gg/ml ampicilinu. Z buněčné frakce byl plasmid přečištěn za použití QIAprep Spin Plasmid Kitu (QIAGEN).
DNA sekvence takto získaného plasmidu byla potvrzena pomocí M13 Primer M4 a M13 Primer RV (Takara Shuzo) a za použití 373A *0
0 0
0 0
000 000
0
00 ·* ·· ··»· • 0 0 0 · 0 •♦»· 0 0000 0 0 0 0 0 0 0
0 0 0 0 0
0000 00 00 000
DNA Sequencer (ABI). Plasmid s potvrzenou správnou sekvencí DNA bez jakékoliv delece byl označen CK/pUC19.
(3) Konstrukce expresního vektoru pro L řetězec chimérické protilátky
Byl konstruován expresní vektor pro L řetězec chimérické protilátky #23-57-137-1. DNA kódující V region L řetězce #2357-137-1 byla ligována do HindlII a Blnl míst, přítomných těsně před C regionem lidské protilátky každého z plasmidů CX/pUCl9 a CK/pUC19, za zisku pUC19 vektorů, které obsahovaly DNA kódující V region L řetězce chimérické protilátky #23-57-137-1 a C region λ nebo κ řetězce L řetězce. Každý z vzniklých vektorů byl potom tráven EcoRI pro excisi DNA kódující L řetězec chimérické protilátky a DNA byla subklonována do HEF expresního vektoru.
DNA kódující V region L řetězce protilátky #23-57-137-1 byla klonována z plasmidů MBC1L24 pomocí PCR techniky. Primery byly individuálně syntetizovány pomocí 394 DNA/RNA Synthetizer (ABI) . Použitý antisense primer MBCCHL1 (SEQ ID NO: 21) byl navržen tak, aby obsahoval rozpoznávací sekvenci pro HindlII a Kozákovu sekvenci (Kozák, M. et al., J. Mol. Biol. 196: 947 950, 1987) a sense primer MBCCHL3 (SEQ ID NO: 22) byl navržen tak, aby obsahoval rozpoznávací sekvence pro BglII a RcoRI.
PCR reakce byla provedena za použití 100 μΐ reakčního roztoku obsahujícího 10 mM Tris-HCl (pH 8,3), 50 mM Kel, 1,5 mM MgCl2, 0,2 mM dNTP, 0,1 [iq MBC1L24, 50 pmol každého z primerů MBCCHL1 a MBCCHL3 a 1 μΐ AmpliTaq (PERKIN ELMER), který byl převrstven 50 μΐ minerálního oleje. Třicet cyklů PCR reakce • 9 09
0 0
0 90
9 4
0 4
9090 99
9900
99 ♦· • 0 0 · • · · ·
900 900
9
99 bylo provedeno za použití teplotních cyklů 94 °C, 45 sekund; 60 °C, 45 sekund; a 72 °C, 2 minuty.
DNA fragment byl izolován elektroforesou za použití 3% agarosového gelu s nízkou teplotou tání a potom byl odebrán a přečištěn pomocí GENECLEAN II Kitu (BIO101).
Přečištěný DNA fragment délky 444 bp byl rozpuštěn ve 20 μΐ reakčního roztoku obsahujícího 10 mM Tris-HCl (pH 7,4) a 1 mM EDTA. 1 μΐ produktu PCR byl tráven ve 20 μΐ reakčního roztoku obsahujícího 10 mM Tris-HCl (pH 7,5), 10 mM MgCl2, 1 mM DTT, 50 mM NaCl a 8 U HindlII (Takara Shuzo) a 8 U EcoRI (Takara Shuzo) při teplotě 37 °C po dobu 1 hodiny. Trávený roztok byl extrahován fenolem a chloroformem a potom srážen ethanolem za zisku DNA jako sraženiny. Takto získaná DNA byla rozpuštěna v 8 μΐ roztoku obsahujícího 10 mM Tris-HCl (pH 7,4) a 1 mM EDTA.
pg plasmidu pUC19 byl tráven HindlII a EcoRI způsobem popsaným výše a potom byl extrahován fenolem a chloroformem a potom byl vysrážen ethanolem, za zisku tráveného plasmidu. Takto získaný trávený plasmid byl zpracován BAP (t.j. alkalickou fosfatasou (E. coli C75; Takara Shuzo)) a byl extrahován fenolem a chloroformem a potom srážen ethanolem za zisku DNA. Takto získaná DNA byla rozpuštěna v 10 μΐ roztoku obsahujícího 10 mM Tris-HCl (pH 7,4) a 1 mM EDTA.
μΐ takto získaného plasmidu pUC19 zpracovaného BAP byl smísen s 4 μΐ výše uvedeného produktu PCR reakce pro vzájemnou ligaci za použití DNA Ligation Kit ver. 2 (Takara Shuzo). Vzniklý plasmid byl vložen do kompetentních buněk E. coli JM109 (Nippon Gene), stejným způsobem, jako je uvedeno výše, za vzniku transformantů. Transformanty byly kultivovány přes noc ve 2 ml 2xYT agarového media obsahujícího 50 pg/ml ampicilinu • to toto • · to · ···· • to toto • ·
• · • · · *·· to·· to · • to ·· při 37 °C. Vzniklé transformanty byly kultivovány přes noc ve 2 ml 2xYT media obsahujícího 50 μς/πιΐ ampicilinu při 37 °C. Z buněk byl plasmid přečištěn za použití QIAprep Spin Plasmid Kitu (QIAGEN). Po určení DNA sekvence byl plasmid s potvrzenou správnou sekvencí označen CHL/pUC19.
μg každého z plasmidů CX/pUC19 a CK/pUC19 byl tráven ve 20 μΐ reakčního roztoku obsahujícího 20 mM Tris-HCl (pH 8,5), 10 mM MgCl2, 1 mM DTT, 100 mM KC1, 8 U HindlII (Takara Shuzo) a 2 U Blnl (Takara Shuzo) při teplotě 37 °C po dobu 1 hodiny. Trávený roztok byl extrahován fenolem a chloroformem a potom srážen ethanolem za zisku DNA jako sraženiny. DNA byla zpracována BAP při 37 °C po dobu 30 minut a potom byla extrahována fenolem a chloroformem a srážena ethanolem. Takto získaná DNA byla rozpuštěna v 10 μΐ roztoku obsahujícího 10 mM Tris-HCl (pH 7,4) a 1 mM EDTA.
ng plasmidů CHL/pUC19, který obsahoval DNA kódující V region L řetězce #23-57-137-1, byl tráven HindlII a Blnl způsobem popsaným výše. Takto získaný DNA fragment délky 409 bp byl izolován elektroforesou za použití 3% agarosového gelu s nízkou teplotou tání a potom byl z gelu odebrán a přečištěn pomocí GENECLEAN II Kitu (BIO101). DNA fragment byl rozpuštěn v 10 μΐ reakčního roztoku obsahujícího 10 mM Tris-HCl (pH 7,4) a 1 mM EDTA.
μΐ DNA pro V region L řetězce byly subklonovány do 1 μΐ každého z plasmidů cX/pUC19 a CK/pUCl9 a potom byly vloženy do kompetentních buněk E. coli JM109 za vzniku transformantů. Transformanty byly kultivovány přes noc ve 3 ml 2xYT media obsahujícího 50 μ9/πι1 ampicilinu. Z buněk byl plasmid přečištěn za použití QIAprep Spin Plasmid Kitu (QIAGEN). Takto připravené • 4 4444 plasmidy byly označeny MBC1L (λ) /pUC19 a MBC1L (k) /pUC19, v příslušném pořadí.
Každý z plasmidů MBC1L(λ)/pUC19 a MBC1L(k)/pUC19 byl tráven EcoRI a potom byl podroben elektroforese za použití 3% agarosového gelu s nízkou teplotou tání. DNA fragment délky 743 bp byl izolován a přečištěn pomocí GENECLEAN II Kitu (BIO101) a byl rozpuštěn v 10 μΐ roztoku obsahujícího 10 mM Tris-HCl (pH 7,4) a 1 mM EDTA.
2,7 μg expresního vektoru, plasmidu HEF-PMIK-gk, bylo tráveno EcoRI a potom se provedla extrakce fenolem a chloroformem, po které následovalo srážení ethanolem, za zisku DNA fragmentu. DNA fragment byl zpracován BAP a a potom byl podroben elektroforese za použití 1% agarosového gelu s nízkou teplotou tání. DNA fragment délky 6561 bp byl z gelu izolován a přečištěn pomocí GENECLEAN II Kitu (BIO101). DNA fragment byl rozpuštěn v 10 μΐ roztoku obsahujícího 10 mM Tris-HCl (pH 7,4) a 1 mM EDTA.
Takto připravený HEF vektor byl zpracován BAP a 2 μΐ HEF vektoru zpracovaného BAP byly smíseny s 3 μΐ EcoRI fragmentů plasmidů MBC1L(λ)pUC19 nebo MBC1L(k)/pUC19, pro vzájemnou ligaci. Produkt ligace byl vložen do kompetentních buněk E. coli JM109 za vzniku transformantů. Transformanty byly kultivovány přes noc ve 2 ml 2xYT agarového media obsahujícího 50 μg/ml ampicilinu. Z buněčné frakce byl plasmid přečištěn za použití QIAprep Spin Plasmid Kitu (QIAGEN).
Takto přečištěná plasmidová DNA byla trávena ve 20 μΐ reakčního roztoku obsahujícího 20 mM Tris-HCl (pH 8,5), 10 mM MgCl2, 1 mM DTT, 100 mM KC1, 8 U HindlII (Takara Shuzo) a 2 U ·· »000 • · * • 0 0 0 • · • · • 00» • 0 0
Pvul (Takara Shuzo) při teplotě 37 °C po dobu 1 hodiny. V tomto trávení se předpokládalo, že pokud byl výše uvedený DNA fragment insertován do vektoru ve správné orientaci, tak bude získán trávený fragment 5104/2195 bp, zatímco pokud byl výše uvedený DNA fragment insertován do vektoru v opačné orientaci, tak bude získán trávený fragment 4387/2926 bp. Na základě tohoto předpokladu byly plasmidy, ve kterých byl fragment insertován ve správné orientaci, označeny MBC1L(λ)/neo a MBC1L(k)/neo, v příslušném pořadí.
(4) Transfekce COS-7 buněk
Expresní plasmidy připravené výše byly dočasně exprivovány za použití COS-7 buněk pro hodnocení vazby chimérické protilátky na antigen a neutralizační aktivity chimérické protilátky proti antigenu.
Přechodná exprese chimérické protilátky byla provedena za použití kombinace buď plasmidu MBCIHcDNA/pCOS a MBC1L(λ)/neo, nebo MBCIHcDNA/pCOS a MBC1L(k)/neo, pomocí elektroporace za použití Gene Pulser (BioRad) pro současnou transfekcí každé z těchto kombinací plasmidových DNA do COS-7 buněk. To znamená, že do 0,8 ml buněčné suspenze, ve které byly suspendovány COS-7 buňky v PBS(-) v koncentraci 1 x 10z buněk/ml, se přidalo 10 pg každé plasmidové DNA. Do vzniklého roztoku se aplikovaly pulsy s elektrostatickou kapacitou 1500 V a 2 μΕ, pro provedení elektroporace. Po 10 minutách zotavovací periody při pokojové teplotě byly buňky suspendovány v DMEM mediu obsahujícím 2% Ultra Low IgG fetální telecí sérum (GIBCO) a provedla se inkubace za použití 10 cm kultivačních ploten v CO2 inkubátoru. Po kultivaci po dobu 72 hodin byl supernatant kultury odebrán a centrifugován pro odstranění buněčné drti a byl použit jako vzorek pro ELISA test.
·· 4» ·♦·* 44 ·· • · · 4 4 4 « · « 4
4444 4 4 444 4 «4 4 *44 4 44 444444
44444 » 4 4
4444 44 44 444 »4 44
V tomto postupu bylo přečištění chimérických protilátek ze supernatantu kultury COS-7 buněk provedeno pomocí AffiGel Protein A MAPSII Kitu (BioRad) podle návodu výrobce křtu.
(5) ELISA test (i) Určení koncentrace protilátky
ELISA plotna pro určení koncentrace protilátky byla připravená následujícím způsobem. Každá jamka 96-jamkové plotny pro ELISA (Maxisorp, NUNC) byla potažena 100 μΐ roztoku, který obsahoval kozí protilátku proti lidskému IgG (TÁGO) a který byl připraven v potahovacím pufru (0,1 M NaHCO3, 0,02% NaN3) v koncentraci 1 pg/ml a potom bylo provedeno blokování 200 μΐ pufru pro ředění (50 mM Tris-HCl, 1 mM MgCl2, 0, 1 M NaCl, 0,05% Tween20, 0,02% NaN3, 1% hovězí sérový albumin (BSA); pH 7,2). Do každé jamky se přidal supernatant kultury COS-7 buněk, ve kterých byly exprivovány chimérické protilátky nebo přečištěné chimérické protilátky, v postupném ředění. Po inkubaci při pokojové teplotě po dobu 1 hodiny a po promytí PBS-Tween20 se do každé jamky přidalo 100 pg roztoku kozí protilátky proti lidskému IgG s konjugovanou alkalickou fosfatasou (TÁGO). Po inkubaci při pokojové teplotě po dobu 1 hodiny a po promytí PBS-Tween20 se do každé jamky přidal roztok substrátu v koncentraci 1 mg/ml (Sigma 104, kyselina pnitrofenylfosforečná, SIGMA). Absorbance roztoku se měřila při 405 nm za použití Microplate Reader (Bio Rad) . Jako standard pro toto měření se použil Hu IgGl/ Purified (The Binding Site).
(ii) Určení vazebné schopnosti pro antigen ···* • · • *44 ·· 99 • · · • · >4 4· • *4 • ··» * · · • 4 4 ···· 4» • 4 9 • · 4 • ··· «4 ·
444
ELISA plotna pro určeni vazebné schopnosti pro antigen byla připravena následujícím způsobem. Každá jamka 96-jamkové plotny pro ELISA (Maxisorp, NUNC) byla potažena 100 μΐ roztoku, který obsahoval lidský PTHrP(1-34) (Peptide Research Institute) a který byl připraven v potahovacím pufru v koncentraci 1 pg/ml a potom bylo provedeno blokování 200 μΐ pufru pro ředění. Do každé jamky se přidal supernatant kultury COS-7 buněk, ve kterých byly exprivovány chimérické protilátky nebo přečištěné chimérické protilátky, v postupném ředění. Po inkubaci při pokojové teplotě po dobu 1 hodiny a po promytí PBS-Tween20 se do každé jamky přidalo 100 pg roztoku kozí protilátky proti lidskému IgG s konjugovanou alkalickou fosfatasou (TÁGO). Po inkubaci při pokojové teplotě po dobu 1 hodiny a po promytí PBS-Tween20 se do každé jamky přidal roztok substrátu v koncentraci 1 mg/ml (Sigma 104, kyselina pnitrofenylfosforečná, SIGMA). Absorbance roztoku se měřila při 405 nm za použití Microplate Reader (Bio Rad).
Bylo zjištěno, že chimérická protilátka má vazebnou schopnost pro lidský PTHrP(1-34) a že také má správnou strukturu klonovaného V regionu myší protilátky (obr. 4). Také bylo zjištěno, že neexistuje rozdíl ve vazebné schopnosti pro PTHrP(1-34) mezi chimérickou protilátkou, ve které má C region L řetězce λ řetězec a tou protilátkou, ve které má C region L řetězce κ řetězec. Proto byl C region L řetězce humanizované protilátky konstruován za použití λ řetězce L řetězce humanizované protilátky.
(6) Vytvoření stabilně transformované CHO buněčné linie
Pro vytvoření stabilních transformantů pro chimérickou protilátku byl výše uvedený expresní plasmid vložen do CHO buněk (DXB11).
• ♦ · · · · • · · · · · toto·· ···· « ···· · ·« to ♦« ··· · ·· ······ ···♦♦ · · · ···· ·· ·· ··· ·· ··
Vytvoření stabilních transformantů pro chimérickou protilátku bylo provedeno za použití kombinace expresních plasmidu pro CHO buňky, MBCIHcDNA/pCHOl a MBC1L(λ)/neo, nebo expresních plasmidů pro CHO buňky MBCIHcDNA/pCHOl a MBC1L(k)/neo. Tyto kombinace plasmidů byly jednotlivě současně transfektovány do CHO buněk pomocí elektroporace za použití Gene Pulser (BioRad). Každý expresní vektor byl štěpen restrikčním enzymem Pvul za zisku lineární DNA. Vzniklá DNA byla získána extrakcí fenolem a chloroformem a následným srážením ethanolem. Takto připravené plasmidové DNA byly elektroporovány. 10 μg každé plasmidové DNA bylo přidáno do
0,8 ml buněčné suspenze obsahující CHO buňky v PBS(-) v koncentraci 1 x 10z buněk/ml. Do vzniklé směsi se aplikovaly pulsy s elektrostatickou kapacitou 1500 V a 2 μΕ. Po 10 minutách zotavovací periody při pokojové teplotě byly buňky suspendovány v MEM-α mediu (GIBCO) doplněném 10% fetálním telecím sérem. Vzniklá suspenze byla inkubována za použití 96jamkových ploten v CO2 inkubátoru. Po jednom dni kultivace bylo medium nahrazeno selektivním mediem (MEM-a medium doplněné 10% fetálním telecím sérem (GIBCO) a 500 mg/ml GENETICINu (G418 Sufate; Gibco) bez ribonukleosidu či deoxyribonukleosidu). Z kultivačního media byly selektovány buňky, do kterých byl vložen gen pro protilátku. Po nahrazení selektivního media za čerstvé, před a po dvou týdnech kultivace, byly buňky zkoumány pod mikroskopem. Pokud byl pozorován buněčný růst, bylo výše uvedeným ELISA testem určeno množství protilátek produkovaných buňkami. Byly vybrány ty buňky, které produkovaly nejvíce protilátek.
Rozšíření kultury stabilních transformantů pro stanovení protilátek bylo provedeno ve válcové nádobě za použití MEM media doplněného 2% Ultra Low IgG fetálním telecím sérem bez ·· · · · · · <
• · « ) · · · · • · »· • · • · · · ribonukleosidu či deoxyribonukleosidu. V den 3 a v den 4 kultivace byl odebrán supernatant kultury a byl filtrován za použití filtru majícího velikost pórů 0,2 pm (Millipore), aby se provedlo odstranění buněčné drti ze supernatantu.
Potom bylo přečištění chimérických protilátek ze supernatantů kultur CHO buněk provedeno za použití POROS Protein A kolony (PerSeptive Biosystems) na ConSep LC100 (Millipore) podle návodu výrobce. Přečištěné chimérické protilátky byly použity jako vzorky pro určení neutralizační aktivity a pro vyšetření účinosti ve zvířecích modelech hyperkalcemie. Koncentrace a vazebná aktivita přečištěných chimérických protilátek proti antigenu byly určeny stejným ELISA testem.
Příklad 3: Konstrukce humanizované protilátky (1) Konstrukce H řetězce humanizované protilátky (i) Konstrukce V regionu humanizovaného H řetězce
Humanizovaný H řetězec protilátky #23-57-137-1 byl připraven technikou přenosu CDR za použití PCR metody. Pro přípravu H řetězce humanizované protilátky #23-57-137-1 (verse a) mající FR odvozené od lidské protilátky S31679 (NMRF-PDB, Cuisinier A.M. et al., Eur. J. Immunol., 23: 110 - 118, 1993) bylo použito následujících šest typů PCR primerů: primery pro přenos CDR: MBC1HGP1 (SEQ ID NO: 23) a MBC1HGP3 (SEQ ID NO: 24) (oba obsahující sense DNA sekvenci) a MBC1HGP2 (SEQ ID NO: 25) a MBC1HGP4 (SEQ ID NO: 26) (oba obsahující antisense DNA sekvenci, kde všechny primery měly na svých koncích 15 - 21 bp komplementární sekvence; a externí primery: MBC1HVS1 (SEQ ID NO: 27) a MBC1HVR1 (SEQ ID NO: 28), které měly oba homologii s « * · · · · • · • · · · · ···· • · ·· · ···· · · · « • · · · · · · « ······ • · · · · · · ···· ····· · · ·· primery pro přenos CDR MBC1HGP1 a MBC1HGP4, v příslušném pořadí.
Primery pro přenos CDR MBC1HGP1, MBC1HGP2, MBC1HGP3,
MBC1HGP4 byly izolovány za použití polyakrylamidového gelu denaturovaného močovinou (Molecular Cloning, Sambrook et al.,
Cold Spring Barbor Laboratory Press, 1989) a z frakce gelu byly extrahovány technikou rozdrcení a namáčení (Molecular Cloning, Sambrook et al., Cold Spring Harbor Laboratory Press,
1989) následujícím způsobem.
nmol každého primeru pro přenos CDR byl izolován pomocí 6% denaturovaného polyakrylamidového gelu za zisku DNA fragmentů.
Z výsledných DNA fragmentů byly fragmenty požadované délky identifikovány na tenké silikagelové plotně pomocí UV záření a z nich byly primery získány technikou rozdrcení a namáčení.
Výsledné fragmenty byly rozpuštěny ve 20 μΐ roztoku obsahujícího 10 mM Tris-HCl (pH 7,4) a 1 mM EDTA. PCR reakce byla provedena za použití TaKaRa Ex Taq (Takara Shuzo). Reakční roztok (100 μΐ) použitý v PCR reakci obsahoval 1 μΐ kažého z výše uvedených primerů pro přenos CDR MBC1HGP1, MBC1HGP2,
MBC1HGP3 a MBC1HGP4, 0,25 mM dNTP a 2,5 jednotek TaKaRa Ex Taq v pufru. Pět cyklů PCR reakce bylo provedeno za použití teplotního cyklu 94 °C, 1 minuta; 55 UC, 1 minuta; a 72 °C, 1 minuta. Do vzniklé reakční směsi byly přidány oba externí primery MBC1HVS1 a MBC1HVR1, oba v množství 50 pmol. Takto amplifikované DNA fragmenty byly separovány elektroforesou ne agarosovém gelu za použití 4% Nu Sieve GTG Agarosy (EMC Bio.
Products).
Fragment agarosového gelu obsahující DNA fragment délky 421 bp byl excidován a DNA fragment byl přečištěn pomocí GENECLEAN II Kitu (BIO101) podle návodu výrobce. Takto přečištěný DNA • · · · · · • · · · · · Β · BBBBBB ····· Β Β Β
ΒΒΒΒ ΒΒ ΒΒ «»· « « fragment byl vysrážen z roztoku ethanolem a potom byl rozpuštěn ve 20 μΐ roztoku obsahujícího 10 mM Tris-HCl (pH 7,4) a 1 mM
EDTA. Získaná PCR reakční směs byla použita pro subklonování
DNA fragmentu do plasmidu pUC19, který byl připraven trávením plasmidu BamHI a HindlII; potom byla určena sekvence baží výsledného plasmidu. Plasmid obsahující správnou sekvenci byl označen hMBCHv/pUCl9.
(ii) Konstrukce V regionu H řetězce pro cDNA humanizovaného H řetězce
Pro ligací cDNA C regionu Cyl humanizovaného H řetězce byla DNA V regionu humanizovaného H řetězce konstruovaná ve výše uvedeném kroku modifikována PCR. V této metodě byl použitý antisense primer, MBC1HVS2 navržen tak, aby hybridizoval na sekvenci kódující 5'-koncový region vedoucí sekvence V regionu a aby měl Kozákovu konvenční sekvenci (Kozák, M. et al., J. Mol. Biol. 196: 947 - 950, 1987) a rozpoznávací místo pro HindlII a EcoRI. Sense primer MBC1HVR2 použitý pro modifikaci DNA pro V region H řetězce byl navržen tak, aby mohl hybridizovat na DNA kódující 3'-koncový region J regionu a na DNA sekvenci kódující 5'-koncový region C regionu a aby měl sekvenci rozpoznávájící Apal a Sami.
PCR reakce byla provedena za použití TaKaRa Ex Taq (Takara Shuzo) a náležitého pufru. PCR roztok použitý v této PCR reakci obsahoval 0,4 μρ hMBCHv/pUCl9 jako templatové DNA, 50 pmol MBC1HVS2 a 50 pmol MBC1HVR2 jako primerů, 2,5 jednotek TaKaRa Ex Taq a 0,25 mM dNTP v pufru. Třicet cyklů PCR reakce bylo provedeno za použití teplotních cyklů 94 °C, 1 minuta; 55 °C, 1 minuta; a 72 ,JC, 1 minuta. DNA fragmenty amplifikované v PCR reakci byly separovány elektroforesou na agarosovém gelu za použití 3% Nu Sieve GTG agarosy (EMC Bio. Products).
·· ·· ·· ···· ·· ·· • · · · 9 » · · · · ···· 9 9 9 9 9 · · · · « · 9 · · · ·· ··· ··· • · · 9 9 9 9 · «··· ·* ·· ··· ·· ··
DNA fragment délky 456 bp byl excidován a DNA fragment byl přečištěn pomocí GENECLEAN II Kitu (BIO101) podle návodu výrobce. Takto přečištěný DNA fragment byl vysrážen z roztoku ethanolem a potom byl rozpuštěn ve 20 μΐ roztoku obsahujícího 10 mM Tris-HCl (pH 7,4) a 1 mM EDTA. Takto získaná PCR reakční směs byla použita pro subklonování DNA fragmentu do plasmidu pUCl9, který byl připraven trávením plasmidu EcoRI a Smál; potom byla určena sekvence baží výsledného plasmidu. Takto připravený plasmid obsahující DNA kódující V region myšího H řetězce odvozený od hybridomů #23-57-137-1 a rozpoznávací sekvence pro EcoRI a HindlII a Kozákovu sekvenci na 5'-konci a rozpoznávací sekvence pro Apal a Smál na 3'-konci byl označen hMBClHv/pUC19.
(2) Konstrukce expresního vektoru pro H řetězec humanizované protilátky
Expresní vektor RVh-PMlf-cDNA obsahující cDNA kódující H řetězec humanizované protilátky PM1 byl tráven Apal a BamHI a byl z něj získán DNA fragment obsahující sekvenci baží pro C region H řetězce. Výsledný DNA fragment byl vložen do plasmidu hMBClHv/pUCl9, který byl připraven trávením Apal a BamHI. Takto připravený plasmid byl označen hMBClHcDNA/pUCl9. Tento plasmid je plasmid obsahující DNA kódující V region H řetězce humanizované protilátky #23-57-137-1 a DNA kódující C region Cyl lidské protilátky a má rozpoznávací sekvence pro EcoRI a HindlII na svém 5'-konci a rozpoznávací sekvenci pro BamHI na svém 3'-konci. Sekvence baží a odpovídající aminokyselinová sekvence verze a humanizovaného H řetězce obsažené v plasmidu hMBClHcDNA/pUC19 jsou uvedeny v SEQ ID NO: 58 a SEQ ID NO: 56, v příslušném pořadí.
• 1 · · • · « · * · · · · · • ··· · ···· · · · · • · · · · · · · · · · · · · • · · · * · · · ···· t» 99 999 99 99
Plasmid hMBClHcDNA/pUCl9 byl tráven EcoRI a BamHI za zisku DNA fragmentu obsahujícího sekvenci baží kódující H řetězec.
Vzniklý DNA fragment byl vložen do expresního plasmidu pCOSl, který byl připraven trávením plasmidu EcoRI a BamHI. Takto získaný expresní plasmid pro humanizovanou protilátku byl označen hMBCIHcDNA/pCOSI.
Pro přípravu plasmidu pro expresi v CHO buňkách byl plasmid hMBClHcDNA/pUCl9 tráven EcoRI a BamHI za zisku DNA fragmentu obsahujícího DNA kódující H řetězec. DNA fragment byl potom vložen do expresního vektoru pCHOl, který byl připraven trávením plasmidu EcoRI a BamHI. Takto získaný expresní plasmid pro humanizovanou protilátku byl označen hMBCIHcDNA/pCHOl.
(3) Konstrukce hybridního variabilního regionu L řetězce (i) Příprava FR1,2/FR3,4 hybridní protilátky
Byla konstruována DNA kódující L řetězec, ve kterém se kombinují FR regiony z humanizované protilátky a myší (chimérické) protilátky a byly hodnoceny její regiony na vhodnost pro humanizaci. V tomto kroku byla připravena hybridní protilátka obsahující FR1 a FR2 z lidské protilátky a FR3 a FR4 z myší protilátky, za použití AflII restrikčního místa přítomného v CDR2.
pg každého z plasmidu MBClL(Xj/neo a hMBCIL(λ)/neo bylo tráveno ve 100 μΐ reakčního roztoku obsahujícího 10 mM Tris-HCl (pH 7,5), 10 mM MgCl2, 1 mM DTT, 50 mM NaCl, 0,01% (hmot./obj.)
BSA a 10 U AflII (Takara Shuzo) při teplotě 37 °C po dobu 1 hodiny. Reakční roztok byl podroben elektroforese za použití 2% agarosového gelu s nízkou teplotou tání a DNA fragmenty délky 6282 bp (označený jako cl) a 1022 bp (označený jako hl) •4 44 4 · ···· 44 44 • · · 4·· 4440
44«· · ·«·· 4 «« · ·· · · « · · · ······ «··«· · · « 4 · · » 44 «· 4«· «4 44 byly z gelu odebrány a přečištěny pomocí GENECLEAN II Kitu (BIOIOI).
gg každého ze získaných cl a hl fragmentů byl zpracován BAP. DNA fragment byl extrahován fenolem a chloroformem, srážen ethanolem, rozpuštěn v 10 μΐ roztoku obsahujícího 10 mM TrisHC1 (pH 7,4) a 1 mM EDTA.
μΐ každého z cl a hl DNA fragmentů zpracovaných BAP byl smí sen s 4 μΐ h2 a c2 DNA fragmentů, v příslušném pořadí, pro vzájemnou ligaci (při 4 °C přes noc). Produkt ligace byl vložen do kompetentních buněk E. coli JM109 za vzniku transformantů. Transformanty byly kultivovány přes noc ve 2 ml 2xYT media obsahujícího 50 pg/ml ampicilinu. Z buněčné frakce byl plasmid přečištěn za použití QIAprep Spin Plasmid Kitu (QIAGEN).
Přečištěná plasmidová DNA byla trávena ve 20 μΐ reakčního roztoku obsahujícího 10 mM Tris-HCl (pH 7,5), 10 mM MgCl2, 1 mM DTT, 2 U ApaLI (Takara Shuzo) a 8U BamHI (Takara Shuzo) při teplotě 37 °C po dobu 1 hodiny. V tomto kroku byl plasmid identifikován na základě předpokladu, že pokud je cl-h2 fragment správně ligován v plasmidu, povede tato ligace při trávení Apal ke vzniku fragmentu 5560/1246/498 bp, nebo při trávení BamHI/HindlII ke vzniku fragmentu 7134/269 bp.
Expresní vektor kódující L řetězec hybridní protilátky lidský FRl,2/myší FR3,4 byl označen h/mMBCIL(λ)/neo. Na druhou stranu, klon pro hl-cl nemohl být získán. Proto byla provedena rekombinace na pUC vektoru, po které následovalo klonování HEF vektoru. Zde byly jako templáty použity plasmid hMBClLaÁ/pUC19, který obsahoval DNA kódující V region L řetězce humanizované protilátky bez aminokyselinové substituce a • 4 44 44 4444 44 44 • 4 4 · · · 4444 • 444 4 4444 4 44 4
444 4 44 444444
44444 4 4 4
4444 44 «4 444 44 44 plasmid hMBClLdX/pUC19, který obsahoval DNA kódující V region L řetězce humanizované protilátky s aminokyselinovou substitucí v
91. aminokyselinové pozici (t.j. v aminokyselině 87 podle
Kabatovi definice), t.j. substituci isoleucinu za tyrosin.
μς každého z plasmidu MBC1L(λ)/pUC19, hMBClLaÁ/pUCl9 a hMBClLdX/pUC19 bylo tráveno ve 30 μΐ reakčního roztoku obsahujícího 10 mM Tris-HCl (pH 7,5), 10 mM MgCl2, 1 mM DTT, 50 mM NaCl, 0,01% (hmot./obj.) BSA, 16 U HindlII a 4 U AflII při teplotě 37 °C po dobu 1 hodiny. Reakční roztok byl podroben elektroforese za použití 2% agarosového gelu s nízkou teplotou tání a potom byly z gelu odebrány a přečištěny pomocí GENECLEAN II Kitu (Β1Ό101) následující DNA fragmenty: DNA fragment délky 215 bp z plasmidu MBC1L(λ)/pUCl9 (označený jako c2') nebo DNA fragment délky 3218 bp z každého z plasmidů hMBCILaX/pUCl9 a hMBCILdX/pUCl9MBC (označené jako hal' a hdl', v příslušném pořadí).
Každý z halg a hdlg a hdl' fragmentů byl jednotlivě ligován na c2' fragment a potom byl vložen do kompetentních buněk E. coli JM109 za vzniku transformantů. Transformanty byly kultivovány přes noc ve 2 ml 2xYT media obsahujícího 50 pg/ml ampicilinu. Z buněčné frakce byl plasmid přečištěn za použití QIAprep Spin Plasmid Kitu (QIAGEN). Vzniklé plasmidové DNA obsahující hal' fragment a hdl' fragment byly označeny m/hMBClLaX/pUC19 a m/hMBCl LdÁ/pUCl 9, v příslušném pořadí.
Každý z plasmidů m/hMBClLaX/pUC19 a m/hMBClLdX/pUC19 byl tráven EcoRI. DNA fragment délky 743 bp byl podroben elektroforese za použití 2% agarosového gelu s nízkou teplotou tání a byl z gelu odebrán a přečištěn pomocí GENECLEAN II Kitu • · A A · A • · · · · · AAAA
A · AA » · · · · A · · A ·· · · · A A AAAAAA
A A A · · A A · • •AA AA A· ··· AA A· (BIO101). Vzniklý fragment byl rozpuštěn ve 20 μΐ roztoku obsahujícího 10 mM Tris-HCl (pH 7,4) a 1 mM EDTA.
gl získaného DNA fragmentu byly smíseny s 1 gl výše uvedeného HEF vektoru zpracovaného BAP pro vzájemnou ligaci.
Produkt ligace byl vložen do kompetentních buněk E. coli JM109 za vzniku transformantů. Transformanty byly kultivovány přes noc ve 2 ml 2xYT media obsahujícího 50 gg/ml ampicilinu. Z buněčné frakce byl plasmid přečištěn za použití QIAprep Spin Plasmid Kitu (QIAGEN).
Přečištěná plasmidová DNA byla trávena ve 20 gl reakčního roztoku obsahujícího 20 mM Tris-HCl (pH 8,5), 10 mM MgCl2, 1 mM DTT, 100 mM Kel, 8 U HindlII (Takara Shuzo) a 2U Pvul (Takara Shuzo) při teplotě 37 °C po dobu 1 hodiny. V tomto kroku byl plasmid identifikován na základě předpokladu, že pokud je DNA fragment ligován v plasmidu ve správné orientaci, povede toto trávení ke vzniku fragmentu 5104/2195 bp, zatímco pokud je DNA fragment insertován v plasmidu v opačné orientaci, povede toto trávení ke vzniku fragmentu 4378/2926 bp. Takto získané plasmidy byly expresní vektory kódující L řetězec hybridní protilátky myší FRl,2/lidský FR3,4 a byly označeny jako expresní vektory m/hMBCILaX/neo a m/hMBClLdX/neo, v příslušném pořadí.
(ii) Příprava FR1/FR2 hybridní protilátky
FR1/FR2 hybridní protilátka byla připravena stejným způsobem, jako je uveden výše, za použití SnaBI restrikčního místa přítomného v CDR.
gg každého z plasmidu MBClL(K)/neo a hMBCIL(λ)/neo bylo tráveno ve 20 gl reakčního roztoku obsahujícího 10 mM Tris-HCl • 000
00 • 0 0 0
0 0 « • ·
0 000 000 (pH 7,9), 10 mM MgCl2, 1 mM DTT, 50 mM NaCI, 0,01% (hmot./obj.) BSA a 6 U SnaBI (Takara Shuzo) při teplotě 37 °C po dobu 1 hodiny. Vzniklý reakční roztok byl dále tráven v 50 μΐ reakčního roztoku obsahujícího 20 mM Tris-HCl (pH 8,5), 10 mM
MgCl2, 1 mM DTT, 100 mM KCI, 0,01% (hmot./obj.) BSA a 6 U Pvul při teplotě 37 °C po dobu 1 hodiny.
Vzniklý reakční roztok byl podroben elektroforese za použití 1,5% agarosového gelu s nízkou teplotou tání a potom byly DNA fragmenty délky 4955 bp a 2349 bp z gelu odebrány a přečištěny pomocí GENECLEAN II Kitu (BIO101) . DNA fragmenty získané z plasmidů MBClL(X)/neo byly označeny ml (4955 bp) a m2 (2349 bp) a DNA fragmenty získané z plasmidů h/mMBCIL(λ)/neo byly označeny hml (4 955 bp) a hm2 (234 9 bp) . Každý ze získaných
DNA fragmentů byl rozpuštěn ve 40 μΐ roztoku obsahujícího 10 mM Tris-HCl (pH 7,4) a 1 mM EDTA.
μΐ každého z ml a hml fragmentů byl ligován se 4 μΐ každého z hm2 a m2 fragmentů, v příslušném pořadí, a potom byl vložen do kompetentních buněk E. coli JM109 za vzniku transformantů. Transformanty byly kultivovány přes noc ve 2 ml 2xYT media obsahujícího 50 μg/ml ampicilinu. Z buněčné frakce byl plasmid přečištěn za použití QIAprep Spin Plasmid Kitu (QIAGEN).
Přečištěná plasmidová DNA byla trávena ve 20 μΐ reakčního roztoku obsahujícího 10 mM Tris-HCl· (pH 7,5), 10 mM MgCl2, 1 mM DTT, a buď 8 U Apal (Takara Shuzo) , nebo 2U Apall (Takara Shuzo) při teplotě 37 C po dobu 1 hodiny.
Takto připravené plasmidy (ml-hm2 a hml-m2) byly identifikovány na základě předpokladu, že pokud je DNA fragment ligován v plasmidů ve správné orientaci, povede trávení ·* »··9 ·· «· * · « * · ·· • · • · • · · » · · plasmidu (ml-hm2) Apal a ApaLI ke vzniku fragmentu 7304 bp a fragmentů 5560/1246/498, v příslušném pořadí, a trávení plasmidu (hml-m2) Apal a ApaLI povede ke vzniku fragmentů 6538/766 bp a fragmentů 3535/2025/498, v příslušném pořadí.
Expresní vektor kódující L řetězec hybridní protilátky lidský FRl/myší FR2,3,4 byl označen jako expresní vektor hmmMBClL(λ)/neo a expresní vektor kódující L řetězec hybridní protilátky myší FRl/lidský FR2/myší FR3,4 byl označen jako expresní vektor mhmMBCIL (λ)/neo.
(4) Konstrukce L řetězce humanizované protilátky
Humanizovaný L řetězec protilátky #23-57-137-1 byl připraven technikou přenosu CDR za použití PCR metody. To znamená, že byl připraven L řetězec humanizované protilátky #23-57-137-1 (verse a) mající FR1, FR2 a FR3 odvozené od lidské protilátky HSU03868 (GEN-BANK, Deftos M. et al., Scand. J. Immunol. 39: 95-103, 1994) a FR4 odvozený od lidské protilátky S25755 (NMRF-PDB) za použití následujícícch šesti typů PCR primerů:
Primery pro přenos CDR, MBC1LGP1 (SEQ ID NO: 29) a MBC1LGP3 (SEQ ID NO: 30) (oba obsahující sense DNA sekvenci) a MBC1LGP2 (SEQ ID NO: 31) a MBC1LGP4 (SEQ ID NO: 32) (oba obsahující antisense DNA sekvenci, kde všechny primery měly na svých koncích 15 - 21 bp komplementární sekvence; a externí primery: MBC1LVS1 (SEQ ID NO: 33) a MBC1LVR1 (SEQ ID NO: 34), které měly oba homologii s primery pro přenos CDR MBC1LGP1 a MBC1LGP4, v příslušném pořadí.
Primery pro přenos CDR MBC1LGP1, MBC1LGP2, MBC1LGP3, MBC1LGP4 byly izolovány za použití polyakrylamidového gelu denaturovaného močovinou (Molecular Cloning, Sambrook et al., ”, >♦·· • · · · • · · • » *♦ · · · to v • · *· e «
·· • to ·· • to · • · · » • · » • · · • » · · · ·
Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989) a z frakce gelu byly extrahovány technikou rozdrcení a namáčení (Molecular Cloning, Sambrook et al., Cold Spring Harbor Laboratory Press,
1989) .
nmol každého primerů pro přenos CDR byl izolován pomocí 6% denaturovaného polyakrylamidového gelu. Z výsledných DNA fragmentů byly fragmenty požadované délky identifikovány na tenké silikagelové plotně pomocí UV záření a z nich byly fragmenty získány technikou rozdrcení a namáčení. Výsledné fragmenty byly rozpuštěny ve 20 μΐ roztoku obsahujícího 10 mM Tris-HCl (pH 7,4) a 1 mM EDTA.
PCR reakce byla provedena za použití TaKaRa Ex Taq (Takara Shuzo) s pufrem. Reakční roztok (100 μΐ) použitý v PCR reakci obsahoval 1 μΐ každého z výše uvedených primerů pro přenos CDR MBC1LGP1, MBC1LGP2, MBC1LGP3 a MBC1LGP4, 0,25 mM dNTP a 2,5 jednotek TaKaRa Ex Taq v pufru. Pět cyklů PCR reakce bylo provedeno za použití teplotního cyklu 94 °C, 1 minuta; 55 °C, 1 minuta; a 72 °C, 1 minuta. Do vzniklé reakční směsi byly přidány oba externí primery MBC1LVS1 a MBC1LVR1, oba v množství 50 pmol. Za použití stejné reakční směsi bylo provedeno dalších třicet cyklů PCR reakce za použití stejného teplotního cyklu. Takto amplifikovaný DNA fragment byl izolován elektroforesou na agarosovém gelu za použití 3% Nu Sieve GTG Agarosy (EMC Bio. Products) .
Fragment agarosového gelu obsahující DNA fragment délky 421 bp byl excidován a DNA fragment byl přečištěn pomocí GENECLEAN II Kitu (BIO101) podle návodu výrobce. Takto získaná PCR reakční směs byla použita pro subklonování DNA fragmentu do plasmidů pUC19, který byl připraven trávením plasmidů BamHI a HindlII. Potom byla určena sekvence DNA výsledného plasmidů.
Takto připravený plasmid byl označen hMBCL/pUC19. V tomto plasmidu bylo nicméně zjištěno, že aminokyselina v pozici 104 (aminokyselina číslo 96 podle Kabatova značení) CDR4 byla nahrazena argininem. Pro opravu této aminokyseliny na tyrosin byl navržen a syntetizován primer MBC1LGP10R (SEQ ID NO: 35) . Potom byla PCR reakce provedena za použití TaKaRa Ex Taq (Takara Shuzo) s pufrem. Reakční roztok (100 μΐ) použitý v PCR reakci obsahoval 0, 6 μΐ plasmidu hMBCL/pUC19 jako templátové DNA, 50 pmol každého z primerů MBC1LVS1 a MBC1LGP10R, 0,25 mM dNTP a 2,5 jednotek TaKaRa Ex Taq v pufru, přes který byl převrtven minerální olej. Třicet cyklů PCR reakce bylo provedeno za použití teplotního cyklu 94 °C, 1 minuta; 55 °C, 1 minuta; a 72 °C, 1 minuta. Takto amplifikovaný DNA fragment byl izolován elektroforesou na agarosovém gelu za použití 3% Nu Sieve GTG Agarosy (FMC Bio. Products).
Fragment agarosového gelu obsahující DNA fragment délky 421 bp byl excidován a DNA fragment byl přečištěn pomocí GENECLEAN II Křtu (Β1Ό101) podle návodu výrobce. Takto získaná PCR reakční směs byla použita pro subklonování DNA fragmentu do plasmidu pUC19, který byl připraven trávením plasmidu BamHI a HindlII.
Potom byla určena sekvence DNA výsledného plasmidu za použití M13 Primer M4 a M13 Primer RV. Bylo potvrzeno, že plasmid má správnou sekvenci. Plasmid byl potom tráven HindlII a Blnl a DNA fragment délky 416 bp byl izolován elektroforesou za použití 1% agarosového gelu. Plasmid byl potom tráven HindlII a Blnl a DNA fragment délky 416 bp byl izolován elektroforesou za použití 1% agarosového gelu. DNA fragment byl přečištěn pomocí GENECLEAN II Křtu (BIO101) podle návodu výrobce a potom byl vložen do plasmidu Ολ/pUC, který byl připraven trávením plasmidu HindlII a Blnl. Výsledný plasmid ··«* byl označen hMBClLaÁ/pUC19. Tento plasmid byl tráven EcoRI za zisku DNA fragmentu kódujícího humanizovaný L řetězec. DNA fragment byl vložen do plasmidu pCOSl tak, že iniciační kodon pro humanizovaný L řetězec byl umístěn downstream od EFla promotoru. Takto získaný plasmid byl označen hMBClLaX/pCOSl. DNA sekvence (včetně odpovídající aminokyselinové sekvence) verze a humanizovaného L řetězce je uvedena v SEQ ID NO: 66. Sekvence aminokyselin verze a je uvedena v SEQ ID NO: 47.
Verze b byla připravena za použití techniky mutagenese pomocí PCR metody. Verze b byla navržena tak, aby byla aminokyselina v pozici 43 - glycin (aminokyselina 43 podle Kabatova číslování) nahrazena prolinem a aminokyselina v pozici 49 - lysin (aminokyselina 49 podle Kabatova číslování) nahrazena kyselinou asparagovou. PCR reakce byla provedena za použití plasmidu hMBClLa//pUC19 jako templátu s mutagenním primerem MBC1LGP5R (SEQ ID NO: 36) a primerem MBC1LVS1. Získaný DNA fragment byl tráven BamHI a HindlII a trávený fragment byl subklonován do BamHI-HindlII místa pUC19. Po sekvencování byla získaná plasmidová DNA trávena HindlII a AflII a výsledný fragment byl ligován do plasmidu hMBClLa//pUC19, který byl připraven trávením plasmidu HindlII a AflII.
Výsledný plasmid byl označen hMBClLbk/pUC19. Tato plasmidová DNA byla trávena EcoRI za zisku DNA fragmentu obsahujícího DNA kódující humanizovaný L řetězec. DNA fragment byl vložen do plasmidu pCOSl tak, že iniciační kodon pro humanizovaný L řetězec byl umístěn downstream od EFla promotoru. Takto získaný plasmid byl označen hMBCILbÁ/pCOSI.
Verze c byla připravena za použití techniky mutagenese pomocí PCR metody. Verze c byla navržena tak, aby byla • 0 ·000 * · • 0 0 0 ··
0* ·
0» 0
000 000
4
40
0 0 00
0· 00 0 aminokyselina v pozici 84 - serin (aminokyselina číslo 80 podle Kabatova číslování) nahrazena prolinem. PCR reakce byla provedena za použití plasmidu hMBClLaÁ/pUC19 jako templátu s mutagenním primerem MBC1LGP6S (SEQ ID NO: 37) a primerem M13 Primer RV. Získaný DNA fragment byl tráven BamHI a HindlII a trávený fragment byl subklonován do pUC19, který byl připraven trávením plasmidu BamHI a HindlII. Po sekvencován! byla získaná plasmidové DNA trávena BstPI a AorSÍHI a výsledný fragment byl ligován do plasmidu hMBClLaX/pUC19, který byl připraven trávením plasmidu BstPI a Aor51HI. Výsledný plasmid byl označen hMBClLcX/pUC19. Tato plasmidová DNA byla trávena EcoRl za zisku sekvence obsahující sekvenci kódující humanizovaný L řetězec. Sekvence byla vložena do EcoRl místa plasmidu pCOSl tak, že iniciační kodon pro humanizovaný L řetězec byl umístěn downstream od EFla promotoru. Takto získaný plasmid byl označen hMBCILcX/pCOSI.
Verze d, e a f byly také připraveny za použití techniky mutagenese pomocí PCR metody. Každá z verzí d, e a f byla navržena tak, aby byla aminokyselina v pozici 91 - tyrosin (aminokyselina číslo 87 podle Kabatova číslování) nahrazena isoleucinem ve verzích a, b a c, v příslušném pořadí. Pro každou z verzí d, e a f byla PCR reakce provedena za použití každého z plasmidů hMBCILaX/pCOSI (pro verzi d) , hMBClLbX/pCOSl (pro verzi e) a hMBCILcX/pCOSl (pro verzi f) jako templátu s mutagenním primerem MBC1LGP11R (SEQ ID NO: 38) a primerem M-Sl (SEQ ID NO: 44). Takto získaný DNA fragment byl tráven BamHI a HindlII a trávený fragment byl subklonován do pUCl9, který byl připraven trávením plasmidu BamHI a HindlII. Po sekvencování byl plasmid tráven HindlII a Blnl a výsledný fragment byl ligován do plasmidu CÁ/pUC19, který byl připraven trávením plasmidu HindlII a Blnl.
ΦΦ φφφφ φφφ φ φ » « · · φ • · Φ· · · · * · 4 ·· · •Φ φφφφ φφ φφφ φφφ ΦΦΦΦ· Φ Φ ο φφφφ φφ φφ φφφ φφ φφ
Výsledné plasmidy byly v příslušném pořadí označeny hMBClLdX/pUC19, hMBClLeX/pUC19 a hMBClLfX/pUC19. Každý z těchto plasmidů byl tráven EcoRI za zisku DNA fragmentu obsahujícího DNA kódující humanizovaný L řetězec. DNA fragment byl vložen do EcoRI místa plasmidů pCOSl tak, že iniciační kodon pro humanizovaný L řetězec byl umístěn downstream od EFla promotoru. Takto získané plasmidy byly v příslušném pořadí označeny hMBCILdX/pCOSI, hMBCILeÁ/pCOSI a hMBCILfX/pCOSI.
Verze g a h byly také připraveny za použití techniky mutagenese pomocí PCR metody. Každá z verzí g, a h byla navržena tak, aby byla aminokyselina v pozici 36 - histidin (aminokyselina číslo 36 podle Kabatova číslování) nahrazena tyrosinem ve verzích a, a d, v příslušném pořadí. PCR reakce byla provedena za použití plasmidů hMBClLaÁ/pUC19 jako templátu s mutagenním primerem MBC1LGP9R (SEQ ID NO: 39) a M13 Primer RV. Produkt PCR byl podroben další PCR reakci za použití M13 Primer M4 jako primeru a plasmidů hMBCILaZ/pUCl9 jako templátu. Takto získaný DNA fragment byl tráven HindlII a Blnl a trávený fragment byl subklonován do plasmidů CÁ/pUC19, který byl připraven trávením plasmidů HindlII a Blnl. Za použití tohoto plasmidů jako templátu byla provedena PCR reakce s primery MBC1LGP13R (SEQ ID NO: 40) a MBC1LVS1. Získaný PCR fragment byl tráven Apal a HindlII a trávený fragment byl potom vložen do každého z plasmidů hMBClLaX/pUC19 a hMBClLdÁ/pUC19, které byly připraveny trávením obou plasmidů Apal a HindlII. Potom byly určeny DNA sekvence plasmidů. Plasmidy, u kterých byla potvrzena správná sekvence, byly označeny hMBClLgX/pUC19 a hMBClLhX/pUC19, v příslušném pořadí. Každý z těchto plasmidů byl tráven EcoRI za zisku DNA fragmentu obsahujícího DNA • to totototo • · • to · · to·· • · ·· ·· toto » · · • · · · totototo toto to · to to· • to • « ··· to to r toto versí j, 1 ~ kódující humanizovaný L řetězec. DNA fragment byl vložen do EcoRI místa plasmidu pCOSl tak, že iniciační kodon pro humanizovaný L řetězec byl umístěn downstream od EFla promotoru. Takto získané plasmidy byly v příslušném pořadí označeny hMBCILgX/pCOSI a hMBCILhX/pCOSI.
Verze i, j, k, 1, m, n a o byly také připraveny za použití techniky mutagenese pomocí PCR metody. PCR reakce byla provedena za použití plasmidu hMBClLaK/pUC19 jako templátu s mutagenním primerem MBC1LGP14S (SEQ ID NO: 41) a primerem V1RV(Á) (SEQ ID NO: 43). Takto získaný DNA fragment byl tráven Apal a Blnl a potom byl subklonován do plasmidu hMBClLgA/pUC19, který byl připraven trávením plasmidu Apal a Blnl. U takto získaného plasmidu byla určena sekvence baží a byl selektován klon, do kterého byla vložena mutace odpovídající každé z verzí. Výsledný plasmid byl označen hMBClLxX/pUC19 (x=i, j, k, 1, m, n nebo o). Tento plasmid byl tráven EcoRI za zisku DNA fragmentu obsahujícího DNA kódující humanizovaný L řetězec. DNA fragment byl vložen do EcoRI místa plasmidu pCOSl tak, že iniciační kodon pro humanizovaný L řetězec byl umístěn downstream od EFla promotoru. Takto získaný plasmid byl označen hMBCILxA/pCOSI (x=i, j, k, 1, m, n nebo o) . DNA sekvence (včetně odpovídajících aminokyselinových sekvencí) 1, m a o jsou uvedeny v SEQ ID NO: 67, SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO: 69 a SEQ ID NO: 70, v příslušném pořadí. Sekvence aminokyselin těchto verzí jsou uvedeny v SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 50 a SEQ ID NO: 51, v příslušném pořadí.
s a t jsou modifikované formy verzí 1 a o, v příslušném pořadí, ve kterých je aminokyselina v pozici 87 - tyrosin - nahrazena isoleucinem.
Verze p, q, r, n · tt rr · tt
-1- t J tt^tt m ,
BB BB
Β · · • BBB
BBB • Β · ΒΒΒΒ ΒΒ
ΒΒ ΒΒΒΒ
Β Β
ΒΒΒΒ
ΒΒΒ
ΒΒ
BBB
ΒΒΒ
Β
ΒΒ
Tyto verze byly připraveny za použití Aor51MI restrikčního místa FR3 pro nahrazení verze h verzí i, j, m, 1 a o následujícím způsobem. Z expresního plasmidu hMBCILxX/pCOSI (x=i,j,m, 1 nebo o), byl deletován Aor51HI restrikční fragment (514 bp) obsahující CDR3, část FR3 a celý FR4. K deletované části expresního plasmidu byl ligován Aor51HI restrikční fragment (514 bp) obsahující CDR3 a část FR3 a celý FR4 tak, že aminokyselina v pozici 91 - tyrosin (aminokyselina číslo 87 podle Kabatova číslování) byla nahrazena isoleucinem. U výsledných plasmidu byla určena jejich DNA sekvence a byl selektován klon každé z verzí i, j, m, 1 a o, ve kterém byla aminokyselina v pozici 91 - tyrosin (aminokyselina číslo 87 podle Kabatova číslování) nahrazena isoleucinem. Verze odpovídající verzím i, j, m, 1 a o byly označeny jako verze p, q, s, r a t, v příslušném pořadí a plasmidy pro tyto verze byly označeny hMBClLxX/pCOSl (x=p, q, s, r nebo t). DNA sekvence (včetně odpovídajících aminokyselinových sekvencí) versí q, r, s a t jsou uvedeny v SEQ ID NO: 71, SEQ ID NO: 72, SEQ ID NO: 73 a SEQ ID NO: 74, v příslušném pořadí. Sekvence aminokyselin těchto verzí jsou uvedeny v SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 53, SEQ ID NO: 54 a SEQ ID NO: 55, v příslušném pořadí.
Plasmid hMBCILqX/pCOSI byl tráven HindlII a EcoRI a potom byl subklonován do plasmidu pUC19, který byl tráven HindlII a EcoRI. Takto získaný plasmid byl označen hMBCILqX/pUCl9.
Pozice nahrazených aminokyselin v každé verzi humanizovaného L řetězce je uvedena v tabulce 3, dále.
·· Φφφφ * φ φ ΦΦΦ «· φ φ φ φ φφ φ «
φφ φ ♦ φ φ
ΦΦΦ φ
• Φ
100 • Φ φφ • « · · φφφφ φ φ · ΦΦΦ • ΦΦΦ φφφφ φφ
Tabulka 3: Pozice nahrazených aminokyselin v seznamu sekvencí (číslování aminokyselin podle Kabatova číslování)
Verze 36 43 45 47 49 80 87
a
b P D
c P
d I
e P D I
f P I
g Y
h Y I
i Y K
j Y K D
k Y K V
1 Y K V D
m Y D
n Y V
o Y V D
P Y K I
q Y K D I
r Y D I
s Y K V D I
t Y V D I
V tabulce 3 , výše, znamenají velká písmena následující
aminokyseliny: Y: tyrosin ; P: prolin ; K: lysin; V: valin; D:
kyselina asparagová; a I: isoleucin.
1Λ1 ··· 4 · 4 4 4 4 4 lvi 4 4·· 4 4 444 4 4 4 4 ··· 4 44 444 444
4 · 4 4 4 4 «
4444 44 «4 444 4· 44
Kmen E. coli obsahující plasmid hMBClHcDNA/pUCl9 a kmen E. coli obsahující plasmid hMBClLqX/pUC19 byly označeny Escherichia coli UM109 (hMBClHcDNA/pUC19) a Escherichia coli JM109 (hMBClLqX/pUC19), v příslušném pořadí, a byly uloženy podle Budapešťské smlouvy 15.8.1996 v National Institute of Bioscience and Human Technology, Agency of Industrial Science and Technology, Japan (1-3, Higashi 1-chome, Tsukuba-shi, Ib'aragi-ken, Japan) pod přírůstkovým číslem FERM BP-5629 pro Escherichia coli JM109 (hMBClHcDNA/pUC19) a FERM BP-5630 pro Escherichia coli JM109 (hMBClLqX/pUC19).
(5) Transfekce do COS-7 buněk
Pro určení vazebné aktivity na antigen a neutralizační aktivity hybridní protilátky a humanizované protilátky #23-57137-1 byly výše uvedené expresní plasmidy přechodně exprivovány v COS-7 buňkách. Pro přechodnou expresi L řetězce hybridní protilátky byla každá z následujících kombinací plasmidů současně transfektována do COS-7 buněk pomocí elektroporace za použití Gene Pulser (BioRad):
hMBClHcDNA/pCOSl a h/mMBCIL(λ)/neo; hMBCIHcDNA/pCOSI a m/hMBCILaX/neo; hMBCIHcDNA/pCOSI a h/mMBClLdX/neo; hMBCIHcDNA/pCOSI a hmmMBCIL(λ)/neo; a hMBCIHcDNA/pCOSI a mhmMBCIL(λ)/neo. To znamená, že do 0,8 ml buněčné suspenze, ve které byly suspendovány COS-7 buňky v PBS(-) v koncentraci 1 x 107 buněk/ml, se přidalo 10 ng každé plasmidové DNA. Do vzniklého roztoku se aplikovaly pulsy s elektrostatickou kapacitou 1500 V a 2 μΓ. Po 10 minutách zotavovací periody při pokojové teplotě byly buňky suspendovány v DMEM mediu doplněném 2% Ultra Low IgG fetálním telecím sérem (GIBCO) a provedla se kultivace za použití 10 cm kultivačních ploten v CO2 inkubátoru. Po kultivaci po dobu 72 hodin byl supernatant
I ·· *··· « · * • · · · · • · · • 9 9
102 • · ·
• · • · · · · · • ♦ ·· ·· kultury odebrán a centrifugován pro odstranění buněčné drti. Roztok byl použit jako vzorek pro ELISA test.
Pro dočasnou expresi humanizované protilátky #23-57-137-1 byla kombinace plasmidu buď hMBCIHcDNA/pCOSi nebo hMBCILxX/pCOSI (x= a - t) transfektována do COS-7 buněk za použití Gene Pulser (Bio Rad) stejným způsobem, jako byl uveden výše. Získaný supernatant kultury byl použit jako vzorek pro ELISA test.
V tomto postupu bylo přečištění hybridní protilátky nebo humanizované protilátky ze supernatantu kultury COS-7 buněk provedeno pomocí AffiGei Protein A MAPSII Kitu (BioRad) podle návodu výrobce kitu.
(6) ELISA test (i) Určení koncentrace protilátky
ELISA plotna pro určení koncentrace protilátky byla připravená následujícím způsobem. Každá jamka 96-jamkové plotny pro ELISA (Maxisorp, NUNC) byla potažena 100 μΐ roztoku, který obsahoval kozí protilátku proti lidskému IgG (TÁGO) a který byl připraven v potahovacím pufru (0,1 M NaHCO3, 0,02% NaN3) v koncentraci 1 pg/ml a potom bylo provedeno blokování 200 μΐ pufru pro ředění (50 mM Tris-HCl, 1 mM MgCl2, 0, 1 M NaCl, 0,05% Tween20, 0,02% NaNj, 1% hovězí sérový albumin (BSA); pH 7,2). Do každé jamky se přidal supernatant kultury COS-7 buněk, ve kterých byla exprivována hybridní protilátka nebo humanizovaná protilátka, nebo roztok přečištěné hybridní protilátky nebo humanizované protilátky v postupném ředění. Po inkubaci při pokojové teplotě po dobu 1 hodiny a po promytí PBS-Tween20 se do každé jamky přidalo 100 pg roztoku kozí protilátky proti »··· • 4 4
4 4 4 4
4 4
444 444
103
4 4
4
4« 444 lidskému IgG s konjugovanou alkalickou fosfatasou (TÁGO). Po inkubaci při pokojové teplotě po dobu 1 hodiny a po promyti PBS-Tween20 se do každé jamky přidal roztok substrátu v koncentraci 1 mg/ml (Sigma 104, kyselina pnitrofenylfosforečná, SIGMA). Absorbance roztoku se měřila při 405 nm za použití Microplate Reader (Bio Rad) . Jako standard pro toto měření se použil Hu IgGlX Purified (The Binding Site).
(ii) Určení vazebné schopnosti pro antigen
ELISA plotna pro určení vazebné schopnosti pro antigen byla připravena následujícím způsobem. Každá jamka 96-jamkové plotny pro ELISA (Maxisorp, NUNC) byla potažena 100 μΐ roztoku, který obsahoval lidský PTHrP(1-34) a který byl připraven v potahovacím pufru v koncentraci 1 pg/ml a potom bylo provedeno blokování 200 μΐ pufru pro ředění. Potom se do každé jamky přidal supernatant kultury COS-7 buněk, ve kterých byla exprivována hybridní protilátka nebo humanizovaná protilátka, nebo roztok přečištěné hybridní protilátky nebo humanizované protilátky, v postupném ředění. Po inkubaci při pokojové teplotě po dobu 1 hodiny a po promytí PBS-Tween20 se do každé jamky přidalo 100 pg roztoku kozí protilátky proti lidskému IgG s konjugovanou alkalickou fosfatasou (TÁGO). Po inkubaci při pokojové teplotě po dobu 1 hodiny a po promytí PBS-Tween20 se do každé jamky přidal roztok substrátu v koncentraci 1 mg/ml (Sigma 104, kyselina p-nitrofenylfosforečná, SIGMA). Absorbance roztoku se měřila při 405 nm za použití Microplate Reader (Bio Rad).
(7) Potvrzení aktivit (i) Hodnocení humanizovaného H řetězce
4 4 4
4 4 4
444 444
4
44
104
4« • 4 « » 444 4 4
4
4444 44 »4 4444 • 4 * ··· «·
Bylo zjištěno, že protilátka obsahující verzi a humanizovaného H řetězce a chimérický L řetězce vykazuje stejnou hladinu vazebné aktivity pro PTHrP jako chimérická protilátka (viz obr. 5). Tyto výsledky ukazují, že humanizace V regionu H řetězce je uspokojivá ve verzi a. Proto byla verze a humanizovaného H řetězce použita jako H řetězec humanizované protilátky v následujících pokusech.
(ii) Aktivita hybridní protilátky (ii-a) FR1,2/FR3,4 hybridní protilátka
Pokud byl L řetězec h/mMBCILd(λ), tak nevykazovala protilátka žádnou vazebnou aktivitu pro antigen. Nicméně, pokud byl L řetězec hybridní protilátky buď m/hMBCILaX nebo m/hMBCILdX, tak vykazovala protilátka stejnou úroveň vazebné aktivity pro antigen jako chimérická protilátka #23-57-137-1 (obr. 6). Tyto výsledky ukazují, že FR3 a FR4 jsou vhodné pro humanizovanou protilátku, ale že existuje aminokyselinový zbytek (zbytky), které musí být nahrazeny v FR1 a FR2.
(ii-b) FR1/FR2 hybridní protilátka
Pokud byl L řetězec mhmMBClL(L), tak nevykazovala protilátka žádnou vazebnou aktivitu pro antigen. Nicméně, pokud byl L řetězec hybridní protilátky hmmMBClL(λ), tak vykazovala protilátka stejnou úroveň vazebné aktivity pro antigen jako chimérická protilátka #23-57-137-1 (obr. 7). Tyto výsledky ukazují, že FR1 je vhodný pro humanizovanou protilátku, ale že existuje aminokyselinový zbytek (zbytky), které musí být nahrazeny v FR2.
105
• · • · ···* • 99
9 ·* ··<* • · · • · · · ·
(iii) Aktivita humanizované protilátky
Byla určena vazebná aktivita pro antigen pro humanizované protilátky, ve kterých byla každá z verzí a až t použita jako L řetězec. Bylo zjištěno, že humanizované protilátky
vykazovaly stejnou hladinu vazebné aktivity pro PTHrP jako chimérická protilátka (obr. 8 až 11).
(8) Vytvoření stabilně transformované CHO buněčné linie
Pro vytvoření stabilních transformantů pro humanizovanou protilátku byl výše uvedený expresní plasmid vložen do CHO buněk (DXB11).
Vytvoření stabilních transformantů pro humanizovanou protilátku bylo provedeno za použití každé z následujících kombinaci plasmidů jako expresních vektorů pro CHO buňky: hMBClHcDNA/pCHOl a MBCILmX/pCOSI; hMBCIHcDNA/pCHOl a MBCILqÁ/pCOSI; a hMBCIHcDNA/pCHOl a MBCILrX/pCOSI. Plasmidy byly současně transfektovány do CHO buněk pomocí elektroporace za použití Gene Pulser (BioRad). Potom byl každý expresní vektor štěpen restrikčním enzymem Pvul za zisku lineární DNA. Vzniklá DNA byla extrahována fenolem a chloroformem a následně vysrážena ethanolem. Takto připravené plasmidové DNA byly elektroporovány následujícím způsobem. 10 gg každé plasmidové DNA bylo přidáno do 0,8 ml buněčné suspenze obsahující CHO buňky v PBS(-) v koncentraci 1 x 107 buněk/ml. Do vzniklé směsi se aplikovaly pulsy s elektrostatickou kapacitou 1500 V a 2 gF. Po 10 minutách zotavovací periody při pokojové teplotě byly buňky suspendovány v MEM-α mediu (GIBCO) doplněném 10% fetálnim telecím sérem (GIBCO) a potom byla provedena kultivace za použití 96-jamkových ploten (Falcon) v CO2 inkubátoru. Po
106 ·· ·· · · • ··· • · · · e · φ ···· φφ ·· ···· • φ • ···
ΦΦ ΦΦ • ΦΦ φ φ φ φ φ φ φ φ φφφ φφφ φ φ >Φ ΦΦ jednom dni kultivace bylo medium nahrazeno selektivním mediem (MEM-a medium doplněné 10% fetálním telecím sérem (GIBCO) a 500 mg/ml GENETICINu (G418 Sufate; Gibco) bez ribonukleosidu či deoxyribonukleosidu). Z kultivačního media byly selektovány buňky, do kterých byl vložen gen pro protilátku. Po nahrazení selektivního media za čerstvé, před a po dvou týdnech kultivace, byly buňky zkoumány pod mikroskopem. Pokud byl pozorován uspokojivý buněčný růst, bylo výše uvedeným ELISA testem běžně používaným pro určení koncentrace protilátek určeno množství protilátek produkovaných buňkami. Byly vybrány ty buňky, které produkovaly nejvíce protilátek.
Rozšíření kultury stabilních transformantů pro stanovení protilátek bylo provedeno ve válcové nádobě za použití MEM-a media doplněného 2% Ultra Low IgG fetálním telecím sérem bez ribonukleosidu či deoxyribonukleosidu. V den 3 a v den 4 kultivace byl odebrán supernatant kultury a byl filtrován za použití filtru majícího velikost pórů 0,2 pm (Millipore), aby se provedlo odstranění buněčné drti ze supernatantu. Přečištění humanizovaných protilátek ze supernatantu kultur CHO buněk bylo provedeno za použití POROS Protein A kolony (PerSeptive Biosystems) na ConSep LC100 (Millipore) podle návodu výrobce. Humanizované protilátky byly použity jako vzorky pro určení neutralizační aktivity a pro vyšetření účinosti ve zvířecích modelech hyperkalcemie. Koncentrace a vazebná aktivita přečištěných humanizovaných protilátek proti antigenu byly určeny ELISA testem, jak je popsán výše.
Příklad 4
Určení neutralizační aktivity
Určení neutralizační aktivity myší protilátky, chimérické protilátky a humanizované protilátky bylo provedeno za použití buněk krysí myelomové buněčné linie ROS17/2.8-5. ROS17/2.8-5 • * 44 4 4
107
4 4 ·
4 4 · · · 4 4 4 4
4 4 4 4 4444 · 44 4
444 4 44 444444
44·44 4 4 4
4444 44 · 4 444 44 44 buňky byly kultivovány v Hanu' S F12 mediu (GIBCO) doplněném 10% fetálním telecím sérem (GIBCO) v CO2 inkubátoru. ROS17/2.8-5 buňky byly inokulovány do každé jamky 96-jamkové plotny v koncentraci 104 buněk/100 μΐ/jamku a byla provedena kultivace po dobu 1 dne. Kultivační medium bylo nahrazeno Ham' S F-12 mediem (GIBCO) doplněným 4 mM hydrokortizonu a 10% fetálním telecím sérem. Po kultivaci po dobu 3 až 4 dnů byly kultivované buňky promyty 260 μΐ Ham'S F-12 media (GIBCO) a potom 80 μΐ
Ham'S F-12 media doplněného 1 mM isobutyl-l-methylxanthinem (IBMX, SIGMA), s přidaným 10% fetálním telecím sérem a 10 mM
HEPES. Vzniklá směs byla inkubována při 37 °C po dobu 30 minut.
Myší protilátka, chimérická protilátka a humanizovaná protilátka, u kterých byla testována neutralizační aktivita, byly postupně ředěny následujícím způsobem: (10 gg/ml, 2 μg/ml,
0,5 μg/ml a 0,01 pg/ml) a (10 μg/ml, 5 μg/ml/ 1,25 pg/ml, 0,63 μg/ml a 0,31 μg/ml). Každý roztok ředěné protilátky byl smísen s ekvivalentním množstvím 4 ng/ml PTHrP(1-34). 8 μΐ výsledného roztoku se přidalo do každé jamky. Konečná koncentrace každé protilátky byla čtvrtinou koncentrace výše uvedené protilátky a proto byla koncentrace PTHrP(1-34) 1 ng/ml. 10 minut po inkubaci při pokojové teplotě byl supernatant odstraněn a zbytek byl třikrát promyt PBS. Z vzniklého vzorku byl cAMP v buňkách extrahován 10 μΐ 0,3% HCl-95% ethanolu a potom bylo provedeno odpaření pomocí vodního tryskového aspirátoru pro odstranění Hcl-ethanolu. Zbytek byl rozpuštěn ve 120 μΐ EIA pufru připojeného k cAMP EIA Kitu (CAYMAN CHEMICAL's) pro extrakci cAMP ze zbytku. Koncentrace cAMP byla určena za použití cAMP EIA Kitu (CAYMAN CHEMICAL's) podle návodu výrobce.
Bylo zjištěno, že z humanizovaných protilátek majících verze L řetězce vykazující stejné úrovně vazebné schopnosti pro antigen jako chimérická protilátka mají ty protilátky, které mají verze ·· ····
108 ··· · · · · · · ·
q, r, s a t L řetězce, ve kterých byl tyrosin v pozici 91 nahrazen isoleucinem, neutralizační aktivitu nejvíce podobnou neutralizační aktivitě chimérické protilátky, a nejsilnější neutralizační aktivitu vykazují protilátky mající verzi q L řetězce (obr. 12 až 14).
Příklad 5: Hodnocení farmakologické účinnosti na zvířecím modelu hyperkalcemie (1)
Za použití zvířecího modelu hyperkalcemie (lidský nádor transplantovaný holým myším) byla vyšetřována terapeutická účinnost chimérické protilátky a humanizované protilátky proti PTHrP mající verze m, r a q L řetězce na hyperkalcemii.
Jako zvířecí model hyperkalcemie byly použity holé myši, kterým byl transplantován lidský karcinom pankreasu PAN-7 (získaný od Central Institute for Experimental Animals). Je známo, že u holých myší, kterým byl transplantován lidský karcinom pankreasu PAN-7, dochází ke zvyšování koncentrace vápníku v krvi se zvětšováním objemu nádoru a dochází k vývoji hyperkalcemie, které je spojena, například, se snížením tělesné hmotnosti a spontánní aktivity. V tomto příkladu byl vyšetřován terapeutický účinek chimérické protilátky a humanizované protilátky podle předkládaného vynálezu na hyperkalcemii indukovanou lidským karcinomem pankreasu PAN-7 pomocí měření tělesné hmotnosti a koncentrace vápníku v krvi testovaných zvířat.
Pasáž buněk lidského karcinomu slinivky břišní PAN-7 byla provedena za použití BALB/c-nu/nu holých myší (Nippon Charles River) in vivo. Pro hodnocení farmakologické účinnosti byly zakoupeny 5-týdnů staří samci BALB/c-nu/nu holých myší (Nippon Charles River) a nechaly se aklimatizovat po dobu 1 týdne a •0 ·♦·« ·
0 0 0 0
000 0 0 · 0
0 000 000
109 takto připravené myší stáří 6 týdnů byly použity pro test. Myší modely hyperkalcemie byly připraveny a byly rozděleny do skupin následujícím způsobem. Pasážované buňky lidského karcinomu pankreasu PAN-7 byly excidovány a nařezány na 3 mm bločky. Vzniklé bločky nádoru byly transplantovány subkutáně do kožního záhybu myší v počtu jeden bloček na myš. Dva až tři týdny po transplantaci, když bylo potvrzeno, že objem tumoru u každé myši je dostatečně velký, byly myši rozděleny do skupin a byl vypočítán průměr objemu nádoru, koncentrace vápníku v krvi a tělesné hmotnosti pro myši jednotlivých skupin a myši byly použity jako zvířecí model hyperkalcemie.
Stanovení terapeutické účinnosti na hyperkalcemii bylo provedeno následujícím způsobem. Jedna dávka chimérické protilátky nebo humanizované protilátky proti PTHrP mající verzi m, nebo r L řetězce byla podána každému z výše uvedených myších modelů hyperkalcemie ocasní vénou v dávce 10 nebo 30 μς na myš. Jedna dávka humanizované protilátky proti PTHrP mající verzi q L řetězce byla podána každému z výše uvedených myších modelů hyperkalcemie ocasní vénou v dávce 20 nebo 60 μς na myš. V den 1, den 4, den 7 a den 11 po podání byla u každé myši měřena koncentrace vápníku v krvi a tělesná hmotnost, pro hodnocení, f armakologické účinosti protilátky. Objem nádoru byl stanoven měřením většího průměru (a mm) a menšího průměru (b mm) nádoru a výpočtem za použití Galantovi rovnice (abz/2) . Koncentrace vápníku v krvi byla určena jako koncentrace ionizovaného vápníku v krvi odebrané od každé myši z orbity za použití hematokritové kapiláry, které byla vložena do 64 3 Automatic Ca+7pH Analyzer (CIBA-CORNING) .
Bylo zjištěno, že podání chimérické protilátky a humanizovaných protilátek majících verze m, r a q L řetězce vede k rychlému zlepšení tělesné hmotnosti a koncentrace ·· ···* • ·
110 ·· ·· • · · • · · · • · · · • · · « · · · · · vápníku v krvi a k zachování tohoto zlepšení po delší dobu. Tento výsledek ukazuje, že chimérická protilátka a humanizované protilátky podle předkládaného vynálezu jsou použitelné pro léčbu hyperkalcemie spojené s maligními nádory (viz obr. 15 a 16) .
Příklad 6: Hodnocení farmakologické účinnosti na zvířecím modelu hyperkalcemie (2)
Za použití zvířecího modelu hyperkalcemie (lidský nádor transplantovaný holým myším) byla vyšetřována terapeutická účinnost chimérické protilátky a humanizované protilátky proti PTHrP mající verzi q L řetězce na hyperkalcemii.
Stanovení terapeutické účinnosti na hyperkalcemii bylo provedeno následujícím způsobem. Jedna dávka chimérické protilátky nebo humanizované protilátky proti PTHrP mající verzi q L řetězce byla podána každému z výše uvedených myších modelů hyperkalcemie ocasní vénou v dávce 10 nebo 30 μρ na myš. V den 1, den 4, den 7 a den 11 po podání byla u každé myši měřena koncentrace vápníku v krvi a tělesná hmotnost, pro hodnocení farmakologické účinnosti protilátky. Koncentrace vápníku v krvi byla určena jako koncentrace ionizovaného vápníku v krvi odebrané od každé myši z orbity za použití hematokritové kapiláry, které byla vložena do 643 Automatic Ca'7pH Analyzer (CIBA-CORNING) .
Bylo zjištěno, že ve zvířecím modelu hyperkalcemie nesoucím lidský karcinom slinivky břišní PAN-7 vede podání chimérické protilátky a humanizované protilátky mající verzi q L řetězce k rychlému zlepšení tělesné hmotnosti a koncentrace vápníku v krvi a k zachování tohoto zlepšení po delší dobu. Tento výsledek ukazuje, že chimérická protilátka a humanizovaná
19
11 1
9 1 1
119 119
1
111 ·» ·» • · · · · · • ··· · ···· • * 111 · • t · ·
911» ·· ·» 119 ···· protilátka podle předkládaného vynálezu jsou použitelné pro léčbu hyperkalcemie spojené s maligními nádory (viz obr. 17).
Příklad 7: Hodnocení farmakologické účinnosti na zvířecím modelu hyperkalcemie (3)
Za použití zvířecího modelu hyperkalcemie (lidský plicní nádor LC-6 transplantovaný holým myším) byla vyšetřována terapeutická účinnost chimérické protilátky a humanizované protilátky proti PTHrP mající verzi q L řetězce na hyperkalcemii.
Jako zvířecí model hyperkalcemie byly použity holé myši, kterým byl transplantován lidský karcinom plic LC-6 (získaný od Central Institute for Experimental Animals). Je známo, že u holých myší, kterým byl transplantován lidský karcinom plic LC6, dochází ke zvyšování koncentrace vápníku v krvi se zvětšováním objemu nádoru a dochází k vývoji hyperkalcemie, které je spojena, například, se snížením tělesné hmotnosti a spontánní aktivity.
V tomto příkladu byl vyšetřován terapeutický účinek chimérické protilátky a humanizované protilátky podle předkládaného vynálezu na hyperkalcemii indukovanou lidským karcinomem plic LC-6 pomocí měření tělesné hmotnosti a koncentrace vápníku v krvi testovaných zvířat.
Pasáž buněk lidského karcinomu plic LC-6 byla provedena za použití BALB/c-nu/nu holých myší (Nippon Charles River) in vivo. Pro hodnocení farmakologické účinnosti byly zakoupeny 5týdnů staří samci BALB/c-nu/nu holých myší (Nippon Charles River) a nechaly se aklimatizovat po dobu 1 týdne a takto připravené myší stáří 6 týdnů byly použity pro test.
90
9 0 9
9 9 9
900 099
99 • » · · · ·
112
00 • · · • · 0 · ·
9 ·
9
0 0 00
Myší modely hyperkalcemie byly připraveny a byly rozděleny do skupin následujícím způsobem. Pásážované buňky lidského karcinomu plic LC-6 byly excidovány a nařezány na 3 mm bločky. Vzniklé bločky nádoru byly transplantovány subkutáně do kožního záhybu myší v počtu jeden bloček na myš. Dva až tři týdny po transplantaci, když bylo potvrzeno, že objem tumoru u každé myši je dostatečně velký, byly myši rozděleny do skupin a byl vypočítán průměr objemu nádoru, koncentrace vápníku v krvi a tělesné hmotnosti pro myši jednotlivých skupin a myši byly použity jako zvířecí model hyperkalcemie.
Stanovení terapeutické účinnosti na hyperkalcemii bylo provedeno následujícím způsobem. Jedna dávka chimérické protilátky nebo humanizované protilátky proti PTHrP mající verzi q L řetězce byla podána každému z výše uvedených myších modelů hyperkalcemie ocasní vénou v dávce 10 nebo 30 pg na myš. V den 1, den 3, den 6 a den 10 po podání byla u každé myši měřena koncentrace vápníku v krvi a tělesná hmotnost, pro hodnocení farmakologické účinnosti protilátky. Koncentrace vápníku v krvi byla určena jako koncentrace ionizovaného vápníku v krvi odebrané od každé myši z orbity za použití hematokritové kapiláry, které byla vložena do 643 Automatic Ca/pH Analyzer (CIBA-CORNING).
Bylo zjištěno, že ve zvířecím modelu hyperkalcemie nesoucím lidský karcinom plic LC-6 vede podání chimérické protilátky a humanizované protilátky mající verzi q L řetězce k rychlému zlepšení tělesné hmotnosti a koncentrace vápníku v krvi a k zachování tohoto zlepšení po delší dobu. Tento výsledek ukazuje, že chimérická protilátka a humanizovaná protilátka podle předkládaného vynálezu jsou použitelné pro léčbu hyperkalcemie spojené s maligními nádory (viz obr. 18) .
113 • * 4 4 4 4 4
4444 4 4444 4 44 4
444 4 44 444444
44444 4 4 4
4444 4 4 4 4 <44 44 4*
Příklad 8: Kinetická analýza interakcí mezi PTHrP a protilátkou proti PTHrP za použití BIACORE
V tomto příkladu byla provedena kinetická analýza interakcí antigen-protilátka za použití BIACORE. PTHrP(1-34+Cys) byl použit jako antigen a byl adsorbován na vrchol sensoru specificky pro C-konce. Přečištěné protilátky různých koncentrací byly použity jako analyt. Ze získaného sensorgramu byly vypočítány kinetické parametry (vazebná rychlostní konstanta kass a disociační rychlostní konstanta kdiss) .
Odkazy ke kinetické analýze lze najít v Kinetic analysis of monoclonal antibody-antigen interaction with new biosensor based analytical systém, Karlsson, R. et al., (1991), J.
Immunol. Methods 145, str. 229 - 240).
(1) Imobilizace PTHrP(1-34+C) na vrchol sensoru
PTHrP(1-34+C) byl adsorbován na vrchol sensoru CM5 (Pharmacia).
Jako výplachový pufr byl použit HBS (10 mM HEPES, pH 7,4;
0,15 M NaCl; 3,4 mM EDTA; 0,005% Surfactant P20) s průtokem 5 μΐ/min. Karboxymethylové skupiny karboxymethyldextranu na vrcholu sensoru CM5 byly aktivovány injekcí 100 μΐ 0,05 Μ Nhydroxysukcimidu (NHS)/ 0,2 M N-ethyl-N'-(3dimethylaminopropyl)karbodiimidhydrochloridu (EDC) a injekcí 100 μΐ 80 mM 2-(2-pyridinyldithio)ethanamin (PDEA)/0,l M boritanového pufru (pH 8,5) a další injekcí 10 μΐ 5 pg/ml PTHrP(1-34+C)/10 mM pufru octanu sodného (pH 5,0) pro adsorpci na C-konce PTHrP(1-34+C) specifickou pro Cys zbytky. Potom byla provedena injekce 100 μΐ pufru obsahujícího 50 mM (L)cystein/ΙΜ NaCl/0,1 M mravenčnan sodný (pH 4,3) pro blokování
114
44 44 4444 44 ·· • 44 4 · 4 4444
4444 · 4444 · 44 4
444 4 44 444444 *4444 4 4 · • 444 44 44 ··· ·· ·· nadměrně aktivovaných skupin. Potom byla provedena injekce 10 μΐ pufru obsahujícího 0,1 M glycin-HCl (pH 2,5) a 10 μΐ 10 mM
HCl pro vymytí substancí s nekovalentní vazbou. Množství takto imobilizováného PTHrP(1-34+C) bylo 226,4 RU (rezonančních jednotek) (obr. 19).
(2) Interakce mezi imobilizováným PTHrP(1-34+C) a přečištěnou myší protilátkou proti PTHrP
Jako výplachový pufr byl použit HBS s průtokem 20 μΐ/min. Hybridomy produkující protilátku byly injikovány do dutiny břišní Balb/c myší a dvou týdnech byl odebrán ascites a byl aplikován do protein A kolony pro přečištění protilátek. Přečištěná protilátka #23-57-137-1 byla označena MBC a přečištěná protilátka 3F5 byla označena 3F5. Tyto protilátky byly ředěny v HBS v sérii koncentrací 1,25, 2,5, 5, 10 a 20 pg/ml.
V analýze bylo 40 μΐ roztoku protilátky injikováno na dobu 2 minuty pro vazebnou fázi a potom byl injikován HBS na dobu 2 minuty pro určení disociační fáze. Po dokončení disociace bylo injikováno 10 μΐ 10 mM HCl pro obnovení vrcholu sensoru.
Analýza byla provedena za použití tohoto cyklu vazba-disociaceobnovení a injikování různých roztoků protilátky pro získání sensorgramu.
(3) Interakce mezi imobilizovaným PTHrP(1-34+C) a přečištěnou humanizovanou protilátkou proti PTHrP
Jako výplachový pufr byl použit HBS s průtokem 20 μΐ/min. Protilátka byla produkována v CHO buňkách a byla přečištěna pomocí protein A kolony. Přečištěná chimérická protilátka byla
115 β*· · · * ···· · · · · 9 9 9 · · · · • · · · é · · · ····»· • · · · · · · · •··C ·· ·· ··« ·· 9 9 označena chMBC a verze m a q přečištěných humanizovaných protilátek byly označeny hMBCm a hMBCq, v příslušném pořadí.
Tyto protilátky byly ředěny v HBS v sérii koncentrací 1,25,
2,5, 5, 10 a 20 Rg/ml.
V analýze bylo 40 μΐ roztoku protilátky injikováno na dobu 2 minuty pro vazebnou fázi a potom byl injikován HBS na dobu 2 minuty pro určení disociační fáze. Po dokončení disociace bylo injikováno 10 μΐ 10 mM HC1 pro obnovení vrcholu sensoru.
Analýza byla provedena za použití tohoto cyklu vazba-disociaceobnovení a injikování různých roztoků protilátky pro získání sensorgramu.
(4) Kinetická analýza interakce
Byla získána požadovaná data a bylo provedeno srovnání charakteru reakcí pomocí překrývání požadovaných reakčních regionů (obr. 20-24). Na každém z obrázků 20 - 24 křivky postupně zhora ukazují data pro koncentraci protilátky 1,25,
2,5, 5, 10 a 20 Rg/ml. Dále byla kinetická analýza interakcí provedena za použití softwaru pro analýzu BIAevaluation 2.1 specificky navrženého pro BIACORE, který je schopen vypočítat kinetické parametry (vazebnou rychlostní konstantu kass a disociační rychlostní konstantu kdiss) z křivek (tabulka 4 a 5) .
Tabulka 4: Kinetické parametry MBC a 3F3
MBC * 6
3F5
Kdiss (1/s) Kass (1/Ms)
7,38 x 10’5 1,22 x 10“2
6, 55x 105
7,23 x 10J :·
Φ ·φ« φ φ ·
ΦΦΦ ΦΦΦ
KD (Μ)
116
1,02 χ 10
-ίο
1,86 χ 10’
Tabulka 5: Kinetické parametry chimérických a humanizovaných protilátek
chH-chX hMBCm hMBCq
Kdiss (1/s) (x 10’4) 1,66 3,16 2,32
Kass (1/Ms) (χ 106 * * *) 1,24 0, 883 1,03
KD (M) (xlO’10) 1,34 3, 58 2,25
V tomto pokusu byl pro určení vazebné rychlostní konstanty použit model 4 pro analýzu (BIAevaluation 2,1 Software Handbook, A1-A5) .
Příklad 9: Potlačení vylučování fosforu v modelu hyperkalcemie spojené s maligními nádory
Hyperkalcemie spojené s maligními nádory (HHM) je onemocnění způsobené přítomností PTHrP a je známo, že PTHrP akceleruje resorpci kosti a resorpci vápníku v ledvinách a renálních tubulech, což vede k vývoji hyperkalcemie. Na druhou stranu, z hlediska fosforu, PTHrP potlačuje resorpci fosforu v ledvinách a v renálních tubulech, což vede k zvýšenému vylučování a proto se u pacientů s klinickou HHM často vyvíjí hypofosfatemie. V tomto příkladu byl vyšetřován účinek humanizované protilátky proti PTHrP na vylučování fosforu v ledvinách za použití krysího modelu hyperkalcemie spojeném s maligními nádory.
117 > · to to · ·· •to·v · · ► »··· * i··· • ·· v · » · · · ·· toto ► ·· to ► ·· · to·· ··· *· ·♦
Jako zvířecí model byly použity holé krysy, kterým byl transplantován lidský karcinom plic LC-6 (získaný od Central Institute for Experimental Animals). Je známo, že u holých krys, kterým byl transplantován lidský karcinom plic LC-6, dochází ke zvyšování koncentrace vápníku v krvi se zvětšováním objemu nádoru a dochází k vývoji hyperkalcemie, které je spojena, například, se snížením tělesné hmotnosti a spontánní aktivity. Za použití tohoto modelu byl vyšetřován účinek humanizované protilátky proti PTHrP podle předkládaného vynálezu na vylučování fosfátů v ledvinách pomocí metody ledvině klírens založené na dále uvedené frakční exkreci fosfátů.
Pasáž buněk lidského karcinomu plic LC-6 byla provedena za použití BALB/c-nu/nu holých myší (Nippon Kurea) in vivo. Pro hodnocení farmakologické účinnosti byly zakoupeny 5-týdnů staří samci F344N/Jcl-rnu holých krys (Nippon Kurea) a nechaly se aklimatizovat po dobu 1 týdne a takto připravené myší stáří 6 týdnů byly použity pro test.
Zvířecí modely hyperkalcemie spojené s maligními nádory byly připraveny následujícím způsobem. Pasážované buňky lidského karcinomu plic LC-6 byly excidovány a nařezány na 3 mm bločky. Vzniklé bločky nádoru byly transplantovány subkutáně do kožního záhybu krys v počtu jeden bloček na krysu. Přibližně tři dny po transplantaci, když bylo potvrzeno, že objem tumoru u každé krysy je dostatečně velký (3000 mm3), byly krysy použity jako zvířecí model hyperkalcemie spojené s maligními nádory, na základě koncentrace vápníku v krvi a tělesné hmotnosti.
Stanovení vylučování fosfátů technikou renální klírens bylo provedeno následujícím způsobem.
99
9 9 9
9 9 9
999 999
9
99
118 ·· ·« • 9 9
999 9 9 9 9
9 9
9999 99
9 9
99 9 (1) Technika renální klírens
Modelová zvířata pro hyperkalcemii spojenou s maligními nádory byla anestezována pentobarbitalem (Nembutal, Dainippon Pharmaceutical CO., Ltd.), byla fixována v poloze na hřbetu v inkubačním boxu s teplotou 37 °C a byla jim zavedena kanyla (polyethylenová kanyla, PE50,Nippon Becton Dickinson) do močového měchýře pro odběr moči. Potom byla zvířecímu modelu zavedena kanyla pro infusi (polyethylenová kanyla, PE10, Nippon Becton Dickinson) do femorální vény, kterou byla potom modelovým zvířatům podána infuse (0,7% inulin, 5% manitol, 0,2% pentobarbital a 0,9% chlorid sodný) rychlostí 2 ml/hod. za použití infusní pumpy (Terufusion syringe pump; STC-525; TERUMO). Po ustanovení rovnováhy během 50 minut byla z kanyly pětkrát odebírána moč ve 20 minutových intervalech (t.j. od periody 1 do periody 5) za zisku vzorků moče. Uprostřed každého odběru moče bylo z pravé krční vény každého zvířete odebráno 0,25 ml krve za použití injekční stříkačky ošetřené heparinem.
(2) Podání protilátky
V průběhu výše uvedeného testu klírens byla v době zahájení 2. období odběru moči podána intravenosně zvířeti humanizovaná protilátka proti PTHrP v dávce 1 mg/ml/kg.
(3) Určení koncentrace inulínu a fosforu v moči a v krvi
Byl měřen objem vzorků moči získaných v období 1 až 5 a byla v nich určena koncentrace inulínu a fosforu. Vzorky krve získané výše byly také zpracovány centrifugací za ochlazování pro získání vzorku plasmy, který byl použit pro určení koncentrace inulínu a fosforu. Stanovení inulínu bylo provedeno ♦ r··
I1’·.
4 • 44
4 **ϊ
119 ♦ · * * • ♦·» 4 * · 9 » · a 4 » 4
4449 94
Antrone-sulfatovou technikou (Roe, L. et al., J. Biol. Chem. 178: 839 - 845, 1949) a určení koncentrace fosforu bylo provedeno za použití Hitachi Automatic Analyzer 7170 a činidel pro stanovení anorganického fosforu, Autosera IP (Daiichi Pure Chemicals) podle návodu výrobce (Physke-Sabarohova metoda).
(4) Výpočet klírens inulinu, klírens fosforu a frakčního vylučování fosforu
Klírens inulinu (Cin), klírens fosforu (Cp) a frakční vylučování fosforu (Fep) byly vypočítány podle následujících rovnic.
Výpočet klírens inulinu (Cin):
Cin = Uin V/Pin kde Cin je klírens inulinu (ml/kg/min); Uin je koncentrace inulinu v moči (mg/ml) ; V je objem moči za jednotku času (ml/kg/min); a Pin je koncentrace inulinu v krvi (mg/ml).
Výpočet klírens fosforu (Cp):
Cp = Up V/Pp
kde Cp je klírens fosforu (ml/kg/min); Up je koncentrace
fosforu v moči (mg/ml); V je objem moči za jednotku času
(ml/kg/min); a Pp je koncentrace fosforu v krvi (mg/ml).
Výpočet frakčního vylučování fosforu (Fep):
Fep = Cp/Cin
120 • ·
• 4 ··«
•·ι · 4 kde Fep je frakční vylučování fosforu; Cín je klírens inulínu; a Cp je klírens fosforu. Stanovení bylo provedeno za použití čtyř zvířat. Výsledky jsou určeny jako průměrná hodnota ± standardní odchylka.
Výsledky frakčního vylučování fosforu a koncentrace fosforu v krvi jsou uvedeny na obr. 25 a 26.
Obr. 25 je graf ilustrující vztah mezi frakčním vylučováním fosforu (= klírens fosforu/klírens inulínu) vs. periody klírens (1 perioda = 20 minut). Humanizovaná protilátka proti PTHrP (1 mg/ml) byla podána (i.v.) v době zahájení periody 2.
Obr. 26 je graf ilustrující vztah mezi koncentrací fosforu v plasmě vs. periody klírens (1 perioda = 20 minut). Humanizovaná protilátka proti PTHrP (1 mg/ml) byla podána (i.v.) v době zahájení periody 2.
Z těchto výsledků bylo zjištěno, že frakční vylučování fosforu bylo po podání protilátky (t.j. od periody 2 do periody 5) potlačeno ve srovnání s vylučováním před podáním protilátky (t.j. perioda 1). Jinými slovy, bylo zjištěno, že podání neutralizační protilátky subjektu, u kterého se vyvíjí hypofosfatemie, která je způsobená akcelerací vylučování fosforu (Fep > 0,2), vede k obnovení resorpce fosforu u subjektu na přibližně normální úroveň (frakční resorpce fosfátů = 1-Fep > 0,8%) a v důsledku toho byl pozorován trend k normalizaci koncentrace fosforu v krvi subjektu. Tyto výsledky také ukazují na použitelnost protilátek podle předkládaného vynálezu jako činidel pro léčbu akcelerovaného vylučování fosforu a hypofosfatemie způsobené PTHrP.
121
*000 0« 00 «00 • 0 ··
0 0 0 • 0 0 0
000 000 « 0
00
PTHrP je substrátem způsobujícím hyperkalcemii spojenou s maligními nádory a proto se předpokládá možnost zvýšení vylučování fosforu a snížení množství vysoce energetického organického fosforu v tkáních působením PTHrP. V souladu s tím, různá onemocnění spojená s hypofosfatemií, jako je hypofosfatemická rachitis a hypofosfatemická vitamid Dresistentni rachitis jsou způsobená hlavně zvýšeným vylučováním fosforu močí a proto jsou protilátky podle předkládaného vynálezu také užitečné pro léčbu takových onemocnění.
Příklad 10: Zlepšení různých hyperkalcemie spojené s maligními nádory klinických příznaků
Je známo, že hyperkalcemie spojená s maligními nádory je způsobena přítomností PTHrP a že PTHrP akceleruje resorpci kosti a resorpci vápníku v ledvinách a ledviných tubulech, což vede k rozvoji hyperkalcemie. Dále je u pacientů trpících hyperkalcemii pozorováno zhoršení klinických příznaků, jako je špatný performance status, obluzené vědomí, neklid, hydrodipsie, nevolnost a zvracení (anorexie). Účinek protilátky proti PTHrP na takové klinické příznaky byl vyšetřován za použití zvířecích modelů hyperkalcemie, t.j. holých myší s transplantovanými lidskými nádory a holých krys s transplantovanými lidskými nádory.
Jako zvířecí model hyperkalcemie byly použity holé myši a holé krysy, kterým byl transplantován lidský karcinom plic LC-6 (získaný od Central Institute for Experimental Animals). U holých myší a u holých krys, kterým byl transplantován lidský karcinom plic LC-6, dochází ke zvyšování koncentrace vápníku v krvi se zvětšováním objemu nádoru a dochází k vývoji hyperkalcemie, které je spojena, například, se snížením tělesné teploty a tělesné hmotnosti.
122 « 9 · 9 * 9 9-99 09 • 00 999 9 00
9900 0 0900 « 09
90« 0 00 «00
90000 0 0 9
0000 00 90 900 9« 00
900
Terapeutický účinek myší protilátky proti PTHrP na klinické příznaky hyperkalcemie spojené s maligními nádory byl vyšetřován za použití holých myší s transplantovaným karcinomem plic LC-6 a výsledky jsou znázorněny na fotografiích. Účinek protilátky na zlepšení spontánní aktivity, tělesné teploty a anorexie byl vyšetřován za použití holých myší s transplantovaným karcinomem plic LC-6.
1. Zlepšení viditelných klinických příznaků spojených s hyperkalcemii
Pasáž buněk lidského karcinomu plic LC-6 byla provedena za použití BALB/c-nu/nu holých myší (Nippon Charles River) in vivo. Pro hodnocení farmakologické účinnosti byly zakoupeny 5týdnů staří samci BALB/c-nu/nu holých myší (Nippon Charles River) a nechaly se aklimatizovat po dobu 1 týdne a takto připravené myší stáří 6 týdnů byly použity pro test.
Myší modely hyperkalcemie byly připraveny a byly rozděleny do skupin následujícím způsobem. Pasážované buňky lidského karcinomu plic LC-6 byly excidovány a nařezány na 3 mm bločky. Vzniklé bločky nádoru byly transplantovány subkutáně do kožního záhybu myší v počtu jeden bloček na myš. Dvacet sedm dní po transplantaci, když bylo potvrzeno, že objem tumoru u každé myši je dostatečně velký, byly myši rozděleny do skupin a byl vypočítán průměr objemu nádoru, koncentrace vápníku v krvi a tělesné hmotnosti pro myši jednotlivých skupin a myši byly použity jako zvířecí model hyperkalcemie.
Objem nádoru byl stanoven měřením většího průměru (a mm) a menšího průměru (b mm) nádoru a výpočtem za použití Galantovi rovnice (ab2/2) .
•9 ···· ♦ · • ···
123 • · • « »· • ·· ·· ·· • · · · • · * · • ··· ··· • · »· ··
Koncentrace vápníku v krvi byla určena jako koncentrace ionizovaného vápníku v krvi odebrané od každé myši z orbity za použití hematokritové kapiláry, které byla vložena do 643 Automatic Ca4+/pH Analyzer (CIBA-CORNING).
Stanovení terapeutické účinnosti na hyperkalcemii bylo provedeno následujícím způsobem. Myší protilátka proti PTHrP byla podána každému z výše uvedených myších modelů hyperkalcemie ocasní vénou v den 27, 30, 34 a 37 po transplantaci v dávce 100 pg na myš. Pro kontrolu byl místo protilátky podán fosfátem pufrovaný fyziologický roztok stejným způsobem. V den 41 po transplantaci nádoru byla z každé skupiny (kontrolní a s podáním protilátky) vybrána typická myš a byla udělána její fotografie spolu s normální myší.
Výsledkem bylo, že u zvířecích modelů hyperkalcemie s tranplantovaným lidským karcinomem plic LC-6 (ukázaným v centru každého z obrázků 27 a 28), došlo k vývoji stejných nádorových hmot jako u kontrolních myší (napravo na obr. 27 a 28), ale měly stejné chování jako normální myši (nalevo na obr. 27 a 28). Tento výsledek naznačuje, že podání protilátky proti PTHrP zlepšuje viditelné klinické příznaky (obr. 27 a 28) .
2. Zlepšení snížené spontánní aktivity spojené s hyperkalcemii
Pasáž buněk lidského karcinomu plic LC-6 byla provedena za použití BALB/c-nu/nu holých myší (Nippon Kurea) in vivo. Pro hodnocení farmakologické účinnosti byly zakoupeny 5-týdnů staří samci F344N/Jcl-rnu holých krys (Nippon Kurea) a nechaly se aklimatizovat po dobu 1 týdne a takto připravené myší stáří 6 týdnů byly použity pro test.
•0 0···
124
00· 000 0000 0000 0 0000 0 00 0 00 000 0 00 000 000 00000 0 0 0 0000 00 00 000 00 00
Myší modely hyperkalcemie byly připraveny následujícím způsobem. Pasážované buňky lidského karcinomu plic LC-6 byly excidovány' a nařezány na 3 mm bločky. Vzniklé bločky nádoru byly transplantovány subkutáně do kožního záhybu myší v počtu jeden bloček na myš. Asi třicet dní po transplantaci, když bylo potvrzeno, že objem tumoru u každé myši je dostatečně velký, byly myši rozděleny do skupin a byl vypočítán průměr objemu nádoru, koncentrace vápníku v krvi a tělesné hmotnosti pro myši jednotlivých skupin a myši byly použity jako zvířecí model hyperkalcemie.
Koncentrace vápníku v krvi byla určena jako koncentrace ionizovaného vápníku v krvi odebrané od každé myší z orbity za použití hematokritové kapiláry, které byla vložena do 643 Automatic Ca'7pH Analyzer (CIBA-CORNING).
(1) Způsob určení spontánní aktivity
Určení spontánní aktivity bylo provedeno za použití ANIMEX měřiče aktivity typu SE (FARAD, Electronics, Sweden), který byl umístěn v předem určené poloze v polyethylenovém boxu, ve kterém byla jednotlivě umístěna modelová zvířata (za krmení a napájení). Tento přístroj byl navržen pro měření pohyblivosti každé krysy. Za použití tohoto přístroje byla pohyblivost zaznamenávána jako počet pohybů za jednotku času. Měření bylo prováděno po dobu 13 hodin (od 19:00 do 8:00 dalšího dne) a výsledky jsou uvedeny jako počet pohybů za hodinu.
(2) Podání protilátky
Humanizovaná protilátka proti PTHrP byla podána každé z výše uvedených krys, u kterých byla rozvinuta hyperkalcemie, ocasní
BB Β·Β·
125
BB BB • * ♦ · ♦ · Β 9 Β Β
Β ··· 9 Β ΒΒΒ Β 9 9 9
9 ΒΒΒ Β ΒΒ ΒΒΒ ΒΒΒ
9 9 9 9 9 Β Β
ΒΒΒΒ ΒΒ ΒΒ ΒΒΒ ΒΒ Β<
vénou v dávce 5 mg/0,5 ml/kg. Každé kryse další skupiny byl podán fyziologický roztok. Měření bylo provedeno se záměnou kontrolní krysy a krysy, které byla podána protilátka.
Měření bylo provedeno v den 0 (t.j. den před podáním), den 2, 4, 7 a 14 pro krysy, kterým byla podána protilátka a v den 1, 3, 5, 8 a 15 pro kontrolní krysy.
Výsledkem bylo, že kontrolní krysy nevykazovaly žádnou změnu nebo snížení spontánní aktivity v průběhu testu, zatímco krysy s podanou protilátkou vykazovaly zvýšení spontánní aktivity v a po dni 4 podání (obr. 29).
3. Zlepšení snížené tělesné teploty spojeného s hyperkalcemií
Pasáž buněk lidského karcinomu plic LC-6 a příprava modelových zvířat hyperkalcemie spojené s maligními nádory byla provedena stejně jako v kroku 2, výše.
(1) Měření tělesné teploty bylo provedeno za použití digitálního teploměru za anestezie zvířat pentobarbitalem (Nembutal, Dainippon Pharmaceutical Co., Ltd.) a vložení teplotního sensoru do jejich rekta.
(2) Podání protilátky
Humanizovaná protilátka proti PTHrP byla podána každé z výše uvedených modelových krys s hyperkalcemií ocasní vénou v dávce 1 mg/ ml/kg. Jiným modelovým krysám byl podán pro kontrolu fyziologický roztok. Dále byla měřena tělesná teplota normálních krys, kterým nebyla podána žádná protilátka. Měření bylo provedeno u krys v den 0 (t.j. den před podáním), den 1, 2 ····
126 to* ♦ · • •to · to · · to · to ···· · to··· · ·· · ·· · · · · ·· ·· to to · · ····· · to · • to·· to· to· ··· ·· ·· a 3 pro krysy s podánou protilátkou, pro kontrolní krysy a pro normální krysy.
Výsledkem bylo, že normální krysy nevykazovaly žádnou změnu tělesné teploty (34,2 - 34,4 °C) v průběhu testu, zatímco modelové krysy hyperkalcemii spojené s maligními nádory vykazovaly snížení tělesné teploty o přibližně 2 °C. Když byla humanizovaná protilátka proti PTHrP podána modelovým krysám bylo potvrzeno, že po třech dnech po podání dochází u těchto krys k nárůstu jejich snížené tělesné teploty na stejnou úroveň, jako mají normální krysy.
Tyto výsledky ukazují, že humanizovaná protilátka proti PTHrP podle předkládaného vynálezu je účinná pro zvýšení snížené tělesné teploty modelových zvířat s hyperkalcemii spojenou s maligními nádory (obr. 30).
4. Zlepšení indukovaného snížení příjmu potravy
Pasáž buněk lidského karcinomu plic LC-β a příprava modelových zvířat hyperkalcemie spojené s maligními nádory byla provedena stejně jako v kroku 2, výše. Připravené zvířecí modely byly rozděleny do skupin a byla vypočítána průměrná koncentrace vápníku v krvi a tělesná hmotnost pro myši jednotlivých skupin a myši byly použity v pokusu uvedeném dále.
(1) Měření příjmu potravy
V průběhu testu byly krysy jednotlivě umístěny do metabolického boxu a byly napájeny vodou a krmeny. Pro každou krysu byl příjem potravy určen jako množství (g) za 24 hodin (od 9:00 do 9:00 dalšího dne). Měření bylo provedeno měřením
AA AAAA
127
A A AA
AAA A A A AAAA
A A A A A A A A« A AA A
A A AAA A AA AAAAAA
AAAAA A A A • AAA A· AA »<· AA AA celkové hmotnosti zásobníku s potravou v 9:00 prvního dne (t.j. tára) a v 9:00 dalšího dne a výpočtem rozdílu hmotnosti.
(2) Podání protilátky
Humanizovaná protilátka proti PTHrP byla podána každé z výše uvedených modelových krys s hyperkalcemií (HHM krys) popsaných výše ocasní vénou v dávce 5 mg/ 0,5 ml/kg. Každé kryse kontrolní skupiny byl ocasní vénou podán pro kontrolu fyziologický roztok. Normálním krysám byl také podán stejným způsobem ocasní vénou fyziologický roztok. Proo krysy s podánou protilátkou, pro kontrolní krysy a pro normální krysy bylo určení příjmu potravy provedeno v den 0 (t.j. ode dne před podáním do dne podání), den 1 (t.j. od dne podání do dalšího dne), den 3 (t.j. od třetího dne po podání do dalšího dne) a den 5 (t.j. od pátého dne po podání do dalšího dne).
Před podáním protilátky byl příjem potravy pro modelovou hyperkalcemickou krysu (5-9 krys) průměrně 8,11 g, zatímco pro normální krysu byl průměrně 12,06 g, což ukazuje výrazné snížení příjmu potravy pro modelové hyperkalcemické krysy. Při podání humanizované protilátky proti PTHrP modelovým krysám, v den a po dni podání protilátky, stoupl příjem potravy u krys s podanou protilátkou na stejnozu úroveň jako byl příjem normální krys, i když u kontrolních krys nebyla pozorována změna v příjmu potravy. Tyto výsledky ukazují, že humanizovaná protilátka proti PTHrP podle předkládaného vynálezu je účinná pro zvýšení sníženého příjmu potravy u modelových zvířat s hyperkalcemií spojenou s maligními nádory (tabulka 6).
·· • 4 «4 4444
128
4« • 4 ·
444 4 4
4
44·4 44 « · 4 4 4 · 4 • 4 ··· 4 4 4 4 • 4 4 · 4 · 4 ·»4 • 4 4 4 4
444 ·4 44
Tabulka 6: Vliv na příjem potravy
Zvíře Jedinec č. Podání* Příjem potravy jedince (g) den 4
den 0 den 1 den 3
Normální 1 Fyz. roztok 13,7 16,7 18,63 18,71
krysa 2 Fyz. roztok 14,27 15, 3 19, 55 19,39
3 Fyz. roztok 9, 83 15, 5 20, 72 19, 88
4 Fyz. roztok 10,42 15, 04 20,28 22,03
HHM krysa 5 Fyz. roztok 10,77 14,24 12, 66 11, 82
6 Fyz. roztok 6, 99 8, 92 2,59 14, 8
HHM krysa 7 Anti-PTHrP 7,46 17, 65 22,52 17, 99
protilátka
8 Anti-PTHrP 12 12,38 20, 94 23, 1
protilátka
9 Anti-PTHrP 3,35 16, 65 20,36 21, 89
protilátka
* Podání fyziologického roztoku: 0,5 ml/kg cestou ocasní vény; a podání protilátky: 5 mg/0,5 ml/kg cestou ocasní vény.
Výše uvedené výsledky ukazují, že chimérické protilátky a humanizované protilátky podle předkládaného vynálezu jsou použitelné jako činidla pro zlepšení různých klinických příznaků hyperkalcemie spojené s maligními nádory.
5. Zlepšení sníženého pH krve indukovaného hyperkalcemii
Pasáž buněk lidského karcinomu plic LC-6 a příprava modelových zvířat hyperkalcemie spojené s maligními nádory byla t
•4 ···· • · • 444
44
4 4 4 · 4 4
4·· 444
4
44 provedena stejně jako v kroku 2, výše modely byly rozděleny do skupin a byla koncentrace vápníku v krvi a tělesná jednotlivých skupin.
Připravené zvířecí vypočítána průměrná hmotnost pro myši
129 ·· • 4 4 • ··· • · 4
4 4
9999 44 •
4 *
(1) Určení pH krve
Krev byla debírána od každého z testovaných zvířat za použití heparinem ošetřené injekční stříkačky technikou odběru kardiální krve a potom byl výsledný vzorek krve aplikován do 643 Automatic Ca^/pH Analyzer (CIBA-CORNING) pro určení pH vzorku krve.
(2) Podání protilátky
Humanizovaná protilátka proti PTHrP byla podána každé z výše uvedených modelových krys s hyperkalcemií (HHM krys) popsaných výše ocasní vénou v dávce 5 mg/ 0,5 ml/kg (n = 3). Každé kryse kontrolní skupiny byl ocasní vénou podán stejným způsobem fyziologický roztok. Pro krysy s podánou protilátkou a pro kontrolní krysy bylo určení pH krve provedeno v den 0 (t.j. den podáním), den 1 a den 7. Výsledky jsou uvedeny jako průměr získaných hodnot pH.
Před podáním protilátky bylo pH krve modelové hyperkalcemické krysy přibližně 7,49 (zatímco pro normální krysu bylo přibližně 7,40 ± 0,02), což znamená, že u modelové krysy dochází k rozvoji metabolické alkalosy. Při podání humanizované protilátky proti PTHrP modelovým krysám se u nich sedm dní po podání protilátky zvýšilo pH krve na hodnoty blízké hodnotám pH normálních krys, i když u kontrolních krys nebyla pozorována změna pH krve. Jako jeden z klinických příznaků hyperkalcemie spojené s maligními nádory (HHM) byla popsána
44
4 44 4
4 4 4 •44 444 ·
44
130 ·· ·· 4v 4444 • · · 4 · 4 • ··· 4 4 444 • · · · · · 4 • · · · · · •444 44 44 444 metabolická alkalosa, o které je známo, že je indukována (HCO3 ) v ledvinách. Podání PTHrP podle předkládaného inhibici vylučování bikarbonatu humanizované protilátky proti vynálezu normalizuje pH krve u modelových hyperkalcemických zvířat a proto se předpokládá, že protilátka může zlepšit metabolickou alkalosu, která se vyskytuje HHM (obr. 31).
Výše uvedené výsledky ukazují, že chimérické protilátky a humanizované protilátky podle předkládaného vynálezu jsou použitelné jako činidla pro zlepšení různých klinických příznaků hyperkalcemie spojené s maligními nádory.
Průmyslové využití
Předkládaný vynález obsahuje chimérickou protilátku a humanizovanou protilátku proti PTHrP. Tyto protilátky mají nízkou antigenicitu pro člověka a proto jsou použitelné jako činidla pro léčbu hyperkalcemie, hypofosfatemie a podobně.
» ·· • · • · · * • · ·
131
Seznam sekvencí (2) Informace pro SEQ ID NO: 1:
(i) Charakteristika sekvence:
(A) Délka: 20 párů baží (B) Typ: nukleová kyselina (C) Řetězec: jednoduchý (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: jiná nukleová kyselina (A) Popis: /popis = syntetická DNA (ix) Popis sekvence: SEQ ID NO: 1:
AAATAGCCCT TGACCAGGCA (2) Informace pro SEQ ID NO: 2:
(i) Charakteristika sekvence:
(A) Délka: 38 párů baží (B) Typ: nukleová kyselina (C) Řetězec: jednoduchý (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: jiná nukleová kyselina (A) Popis: /popis - syntetická DNA (ix) Popis sekvence: SEQ ID NO: 2:
CTGGITCGGC CCACCTCTGA AGGITCCAGA ATCGATAG ; 38 (2) Informace pro SEQ ID NO: 3: (i) Charakteristika sekvence:
132 • to · · · · · · · · ···· · to to to to · to· · ·· · · · · ·· ··· ··· · ···· · · · • ••to ·· ·· <·ο · to toto (A) Délka: 28 párů baží (B) Typ: nukleová kyselina (C) Řetězec: jednoduchý (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: jiná nukleová kyselina (A) Popis: /popis = syntetická DNA (ix) Popis sekvence: SEQ ID NO: 3:
GGATCCCGGG CCAGTGGATA GACAGATG 28 (2) Informace pro SEQ ID NO: 4:
(i) Charakteristika sekvence:
(A) Délka: 29 párů baží (B) Typ: nukleová kyselina (C) Řetězec: jednoduchý (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: jiná nukleová kyselina (A) Popis: /popis = syntetická DNA (ix) Popis sekvence: SEQ ID NO: 4:
GGATCCCGGG TCAGRGGAAG GTGGRAACAd 29 (2) Informace pro SEQ ID NO: 5:
(i) Charakteristika sekvence:
(A) Délka: 17 párů baží (B) Typ: nukleová kyselina (C) Řetězec: jednoduchý (D) Topologie: lineární , · ··· · · ··· · · · · χ i i JLda ·· · · · · ·· ······ ····· · · · ···· ·· ·· ··· ·· ·· (ii) Typ molekuly: jiná nukleová kyselina (A) Popis: /popis = syntetická DNA (ix) Popis sekvence: SEQ ID NO: 5:
GTTTTCCCAG TCACGAC 17 (2) Informace pro SEQ ID NO: 6:
(i) Charakteristika sekvence:
(A) Délka: 17 párů baží (B) Typ: nukleová kyselina (C) Řetězec: jednoduchý (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: jiná nukleová kyselina (A) Popis: /popis = syntetická DNA (ix) Popis sekvence: SEQ ID NO: 6:
CAGGAAACAC. CTAIGAC 17 (2) Informace pro SEQ ID NO: 7:
(i) Charakteristika sekvence:
(A) Délka: 31 párů baží (B) Typ: nukleová kyselina (C) Řetězec: jednoduchý (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: jiná nukleová kyselina (A) Popis: /popis = syntetická DNA” (ix) Popis sekvence: SEQ ID NO: 7:
GTCTAAGC1T CCACCATGAA ACTrCGGGCT C 3 /
134
0000 0 0000 0 00 0
0 000 0 00 000 000
00000 0 0 0
0000 00 99 999 «· 0 0 (2) Informace pro SEQ ID NO: 8:
(i) Charakteristika sekvence:
(A) Délka: 30 párů baží (B) Typ: nukleová kyselina (C) Řetězec: jednoduchý (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: jiná nukleová kyselina (A) Popis: /popis = syntetická DNA (ix) Popis sekvence: SEQ ID NO: 8:
TGTI'GGA1CC CTGCAGAGAC AGTGACCAGA 30 (2) Informace pro SEQ ID NO: 9:
(i) Charakteristika sekvence:
(A) Délka: 36 párů baží (B) Typ: nukleová kyselina (C) Řetězec: jednoduchý (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: jiná nukleová kyselina (A) Popis: /popis = syntetická DNA (ix) Popis sekvence: SEQ ID NO: 9:
GTCTGAATVC AAGCTTCCAC CATGGGGTIT GGGCIG 3 6 (2) Informace pro SEQ ID NO: 10:
(i) Charakteristika sekvence:
(A) Délka: 41 párů baží ·· ·· • · · · · · · · · ···· · ···· · ·· · • · · · · · ·· ······ • *· · · · · · ··· ·· ·· ··· ·· · ·
135 (B) Typ: nukleová kyselina (C) Řetězec: jednoduchý (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: jiná nukleová kyselina (A) Popis: /popis = syntetická DNA (ix) Popis sekvence: SEQ ID NO: 10:
-rrrcccGca: ccttggtgga ggctgaggag acggigacca g (2) Informace pro SEQ ID NO: 11:
(i) Charakteristika sekvence:
(A) Délka: 109 párů baží (B) Typ: nukleová kyselina (C) Řetězec: jednoduchý (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: jiná nukleová kyselina (A) Popis: /popis = syntetická DNA (ix) Popis sekvence: SEQ ID NO: 11:
GTCTGAAITC AAGCTTAGTA CITGCCCAGC CCAAGGCCAA CCCCACCGTC ACCCTGTTCC 60
CGCCCTCCTC TGAGGAGCTC CAAGCCAACA AGGCCACACT AGTGTGTCT 109 (2) Informace pro SEQ ID NO: 12:
(i) Charakteristika sekvence:
(A) Délka: 110 párů baží (B) Typ: nukleová kyselina (C) Řetězec: jednoduchý (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: jiná nukleová kyselina • · ····
136 • · · · · · · · · · ···· · ···· · · · · • · ··· · ·· ······ • · · · · · · · ···· ·· ·· ··· «· ·« (A) Popis: /popis = syntetická DNA (ix) Popis sekvence: SEQ ID NO: 12:
GGTITGGTGG TCTCCACTCC CGCCTTGACG GGGCTGCCAT CTGCCTTCCA GGCCACIGTC 60 ACAGCTCCCG GGTAGAAGTC ACTGATCAGA CACACTAGTG TGGCCTTGTT 110 (2) Informace pro SEQ ID NO: 13:
(i) Charakteristika sekvence:
(A) Délka: 98 párů baží (B) Typ: nukleová kyselina (C) Řetězec: jednoduchý (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: jiná nukleová kyselina (A) Popis: /popis = syntetická DNA (ix) Popis sekvence: SEQ ID NO: 13:
(í;agt(x;a(;a ccacgaaacc ctccaaacag aggaacaaca agtacgcggc cagcagciac co
(.'IGAGCCTCA CGCCCGAGCA GTGGAAGTCC CACAGAAC. 98 (2) Informace pro SEQ ID NO: 14:
(i) Charakteristika sekvence:
(A) Délka: 106 párů baží (B) Typ: nukleová kyselina (C) Řetězec: jednoduchý (D) Topologie: lineární (ii) * * * * (ii) Typ molekuly: jiná nukleová kyselina (A) Popis: /popis = syntetická DNA (ix) Popis sekvence: SEQ ID NO: 14:
TGHGAATTC TTACTATGAA CATTCTGTAG GGGCCACTGT CTTCTCCACG GTGCTCCCTT 60
CATGCGTGAC CTGGCAGCTG TAGCITCTGT GGGACTTCCA CTCCTC i06
0 0 0
0 0
0 0 0 · <
9«
0090 00
000 090
137 •0 0000
0 90 0 (2) Informace pro SEQ ID NO: 15:
(i) Charakteristika sekvence:
(A) Délka: 43 párů baží (B) Typ: nukleová kyselina (C) Řetězec: jednoduchý (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: jiná nukleová kyselina (A) Popis: /popis = syntetická DNA (ix) Popis sekvence: SEQ ID NO: 15:
GTCTGMriC AAGCTTAGTA CTTGGCCAGC CCAACACCAA CCC (2) Informace pro SEQ ID NO: 16:
(i) Charakteristika sekvence:
(A) Délka: 20 párů baží (B) Typ: nukleová kyselina (C) Řetězec: jednoduchý (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: jiná nukleová kyselina (A) Popis: /popis = syntetická DNA (ix) Popis sekvence: SEQ ID NO: 16:
TG1TGMTTC TTACTATGAA (2) Informace pro SEQ ID NO: 17: (i) Charakteristika sekvence:
(A) Délka: 39 párů baží (B) Typ: nukleová kyselina • 9 4 4 4 4 9 9 4 4 ·« 44
4 4 · * 9 · 4 4 ·
4 9 4 · 444« 4 44 4
494 4 44 944444
94944 4 4 4
4444 44 99 444 9· ··
138 (C) Řetězec: jednoduchý (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: jiná nukleová kyselina (A) Popis: /popis = syntetická DNA (ix) Popis sekvence: SEQ ID NO: 17:
CAACAAfTAC GCGGCCAGCA GCTACCTGAG CCTGACGCC 39 (2) Informace pro SEQ ID NO: 18:
(i) Charakteristika sekvence:
(A) Délka: 39 párů baží (B) Typ: nukleová kyselina (C) Řetězec: jednoduchý (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: jiná nukleová kyselina (A) Popis: /popis = syntetická DNA (ix) Popis sekvence: SEQ ID NO: 18:
GTAGCTGCTC GCCGCGTACT TGTTCITGCr CTGriTGGA (2) Informace pro SEQ ID NO: 19:
(i) Charakteristika sekvence:
(A) Délka: 46 párů baží (B) Typ: nukleová kyselina (C) Řetězec: jednoduchý (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: jiná nukleová kyselina (A) Popis: /popis = syntetická DNA
44
4 4 4 • 4 4 4
444 444
4
44
139 • · ► 4 · 4 4 4
4444 4 4444
4 4 4 4 4 4
4 4 4 4 4 »444 44 44 444 (ix) Popis sekvence: SEQ ID NO: 19:
GTCTGMTTC AAGCTTAGTC CTAGGTCGAA CTGTGGCTGC ACCATC (2) Informace pro SEQ ID NO: 20:
(i) Charakteristika sekvence:
(A) Délka: 34 párů baží (B) Typ: nukleová kyselina (C) Řetězec: jednoduchý (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: jiná nukleová kyselina (A) Popis: /popis = syntetická DNA (ix) Popis sekvence: SEQ ID NO: 20:
TGTTGAATTC 'ITACTAACAC TCTCCCCTGT TGAA 34 (2) Informace pro SEQ ID NO: 21:
(i) Charakteristika sekvence:
(A) Délka: 35 párů baží (B) Typ: nukleová kyselina (C) Řetězec: jednoduchý (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: jiná nukleová kyselina (A) Popis: /popis = syntetická DNA (ix) Popis sekvence: SEQ ID NO: 21:
GTCTAAGCTT CCACCATGGC CTGGACTCCT CTCTT
140 • · · • · · · » · • · ··
MM · · ·· ···· (2) Informace pro SEQ ID NO: 22: (i) Charakteristika sekvence:
(A) Délka: 48 párů baží (B) Typ: nukleová kyselina (C) Řetězec: jednoduchý (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: jiná nukleová kyselina (A) Popis: /popis = syntetická DNA (ix) Popis sekvence: SEQ ID NO: 22:
TGTTGAATTC AGATCTMCT ACITACCTAG GACACTGACC TTGGTCCC (2) Informace pro SEQ ID NO: 23:
(i) Charakteristika sekvence:
(A) Délka: 128 párů baží (B) Typ: nukleová kyselina (C) Řetězec: jednoduchý (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: jiná nukleová kyselina (A) Popis: /popis = syntetická DNA (ix) Popis sekvence: SEQ ID NO: 23:
GTCTAAGCTT CCACCATGGG GITKXXXTG AGCTGGCTTT TCCTCGTTGC TCTTTTAAGA 60 GGTGTCCAGT G1CAGGTGCA C.CTGGTGGAG ICIXXXXXIAG GCGTGGTCCA GCCTGGGAGG 120 TCCCTGAG 128 (2) Informace pro SEQ ID NO: 24: (i) Charakteristika sekvence:
141
00 4 0 0
444 • 00 • 40
0 0 0 0 0
• 40 4 «4 0 «« 40 0
00 • ·· 4 • 0 0 0
00· 000 • 0 • 0 40 (A) Délka: 125 párů baží (B) Typ: nukleová kyselina (C) Řetězec: jednoduchý (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: jiná nukleová kyselina (A) Popis: /popis = syntetická DNA (ix) Popis sekvence: SEQ ID NO: 24:
ACCATTAGTA GTGGTGGTAG TTACACCTAC TATCCAGACA GTGTGAAGGG GCGAITCACC 60 ATCTCCAGAG ACAATTCCAA GAACACGCTG TATCTGCAAA TGAACAGCCT GAGAGCTGAG 120 GACAC 125 (2) Informace pro SEQ ID NO: 25:
(i) Charakteristika sekvence:
(A) Délka: 132 párů baží (B) Typ: nukleová kyselina (C) Řetězec: jednoduchý (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: jiná nukleová kyselina (A) Popis: /popis = syntetická DNA (ix) Popis sekvence: SEQ ID NO: 25:
CTACCACCAC TACTAATGGT TGCCACCCAC TCCAGCCCCT TGCCTGGAGC CTGGCGGACC 60 CAAGACATGC CATAGCTACT GAAGGTGAAT CCAGAGGCTG CACAGGAGAG TCTCAGGGAC 120 CTCCCAGGCT GG 132 (2) Informace pro SEQ ID NO: 26:
(i) Charakteristika sekvence:
(A) Délka: 110 párů baží • to ·· • ·· · to «to · ··· ··· • · ♦ to toto··
142 ·· ·· ··· ··· ···· * «··· to· · * · · to » to «· totototo ·· ·· ··· (B) Typ: nukleová kyselina (C) Řetězec: jednoduchý (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: jiná nukleová kyselina <. (A) Popis: /popis = syntetická DNA (ix) Popis sekvence: SEQ ID NO: 26:
TGITGGATCC CIGAGGAGAC GGTGACCAGG GTTCCCTGGC CCCAGTAAGC AAAGTAAGTC 60
ATAGTAGTCT GTCTCGCACA GTAATACACA GCCGTGTCCT CAGCTCTCAG 110 (2) Informace pro SEQ ID NO: 27:
(i) Charakteristika sekvence:
Ía) Délka: 30 párů baží (B) Typ: nukleová kyselina (C) Řetězec: jednoduchý (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: jiná nukleová kyselina (A) Popis: /popis = syntetická DNA (ix) Popis sekvence: SEQ ID NO: 27:
GTCTAAGCIT CCACCATGGG GTITGGGCTG (2) Informace pro SEQ ID NO: 28: (i) Charakteristika sekvence:
(A) Délka: 30 párů baží (B) Typ: nukleová kyselina (C) Řetězec: jednoduchý (D) Topologie: lineární
AA A A • A A A
A A A A •AA AAA
A A
A · A A
143
AA ·· ♦♦ • · A · A A
A AAA A AAA·
A A AAA «
AAA·· (ii) Typ molekuly: jiná nukleová kyselina (A) Popis: /popis = syntetická DNA (ix) Popis sekvence: SEQ ID NO: 28:
TGTTGGATCC CTGAGGAGAC GGTGACCAGG (2) Informace pro SEQ ID NO: 29:
(i) Charakteristika sekvence:
(A) Délka: 133 párů baží (B) Typ: nukleová kyselina (C) Řetězec: jednoduchý (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: jiná nukleová kyselina (A) Popis: /popis = syntetická DNA (ix) Popis sekvence: SEQ ID NO: 29:
ACAAAGCITC CACCATGGCC TGGACTCCTC TCTTCTTCTT CTTTGTTCTT CATTGCTCAG 60
GTTcrrrcTC ccagcttgtg ctgactcaat cgccctctgc CTCTGCCTCC CTGGGAGCCT 120
CGGTCAAGCT.CAC 133 (2) Informace pro SEQ ID NO: 30:
(i) Charakteristika sekvence:
(A) Délka: 118 párů baží (B) Typ: nukleová kyselina (C) Řetězec: jednoduchý (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: jiná nukleová kyselina t
44
444 4
144
4» 44 ♦ * 4 »4 44 • · ·
4«
4444 44 • 4 » «444 » 4 4
4· 4 »4 *44
4» i :
• 4 4 (A) Popis: /popis = syntetická DNA (ix) Popis sekvence: SEQ ID NO: 30:
AGCAAGATGG AAGCCACAGC ACAGGTGATG GGATTCCTGA TCGCTTCTCA GGCTCCAGCT 60 CTGGGGCTGA GCGCTACCTC ACCATCTCCA GCCTCCAGTC TCAGGATGAG GCTGACTA 118 (2) Informace pro SEQ ID NO: 31:
(i) Charakteristika sekvence:
(A) Délka: 128 párů baží (B) Typ: nukleová kyselina (C) Řetězec: jednoduchý (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: jiná nukleová kyselina (A) Popis: /popis = syntetická DNA (ix) Popis sekvence: SEQ ID NO: 31:
CIC,l\.C!’1'H CAT(TI'GCTT AACITICATC AAGTACCGAG GGCCCTfCTC TCGCTGCTGC 60
TCATGí.CATi CAATGGIGTA (GIACTGIGC TGACTACTCA AGGTGCAGGT GAGCTTCACC 120
GAGGCTCC 128 (2) Informace pro SEQ ID NO: 32:
(i) Charakteristika sekvence:
(A) Délka: 114 párů baží (B) Typ: nukleová kyselina (C) Řetězec: jednoduchý (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: jiná nukleová kyselina (A) Popis: /popis = syntetická DNA
145 ♦ · • · · • · ·« • · · · • · ♦ ·«·« ·· ·· ··· · • · · • · 999 • 9 9 • 9 9 ·99
9· 99
9 9 9
9 9 · • · 9 · · 9 · • *
9 99 (ix) Popis sekvence: SEQ ID NO: 32:
CTTGGAICCG GGCTGACCTA GGACGGTCAG TTTGGTCCCT CCGCCGAACA CCCTCACAAA 60 1 ttgttcctta attgtatcac ccacaccaca gtaatagtca GCCTCATGCT CAGA 114 (2) Informace pro SEQ ID NO: 33:
(i) Charakteristika sekvence:
(A) Délka: 17 párů baží (B) Typ: nukleová kyselina (C) Řetězec: jednoduchý (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: jiná nukleová kyselina (A) Popis: /popis = syntetická DNA (ix) Popis sekvence: SEQ ID NO: 33:
ACAAAGCTťG CACCATG (2) Informace pro SEQ ID NO: 34:
(i) Charakteristika sekvence:
(A) Délka: 19 párů baží (B) Typ: nukleová kyselina (C) Řetězec: jednoduchý (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: jiná nukleová kyselina (A) Popis: /popis = syntetická DNA (ix) Popis sekvence: SEQ ID NO: 34:
cttggatccg gggtg;
44
4 4
4 4
444 444
4
44
146
4 44
4 4 4
4 44 4
4 4 4 4
4 4 4
4444 44
4« 4444
4 4 44 4 4 4 4
4
4*4 (2) Informace pro SEQ ID NO: 35:
(i) Charakteristika sekvence:
(A) Délka: 75 párů baží (B) Typ: nukleová kyselina , (C) Řetězec: jednoduchý (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: jiná nukleová kyselina (A) Popis: /popis - syntetická DNA (ix) Popis sekvence: SEQ ID NO: 35:
CTTGGATCCG GGCTGACCTA GGACGGTCAG ITTGGTCCCT CCGCCGAACA CGTACACAAA 60 ITGTTCCTTA ATFGT 75 (2) Informace pro SEQ ID NO: 36:
(i) Charakteristika sekvence:
(A) Délka: 43 párů baží (B) Typ: nukleová kyselina (C) Řetězec: jednoduchý (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: jiná nukleová kyselina (A) Popis: /popis = syntetická DNA (ix) Popis sekvence: SEQ ID NO: 36:
AAAGGATCCT TAAGATCCAT CAAGTACCGA GGGGGCTTCT CTG •4 44·4
147
44
444 44* 4444
4444 4 4444 4 44 4
444 4 44 444 444
4 · · · 4 4 4
4*44 44 44 444 44 44 (2) Informace pro SEQ ID NO: 37:
(i) Charakteristika sekvence:
(A) Délka: 46 párů bázi (B) Typ: nukleová kyselina (C) Řetězec: jednoduchý (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: jiná nukleová kyselina (A) Popis: /popis = syntetická DNA (ix) Popis sekvence: SEQ ID NO: 37:
ACAAAGCTTA GCGCTACCTC ACCATCTCCA GCCTCCAGCC TGAGGA (2) Informace pro SEQ ID NO: 38:
(i) Charakteristika sekvence:
(A) Délka: 111 párů baží (B) Typ: nukleová kyselina (C) Řetězec: jednoduchý (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: jiná nukleová kyselina (A) Popis: /popis = syntetická DNA (ix) Popis sekvence: SEQ ID NO: 38:
CTTGGATCCG GGCTGACCTA GGACGGTCAG nTGGTCCCT CCGCCGAACA CGTACACAAA 60 ITGITCCTIA AITGTATCAC CCACACCACA GAIAIAGTCA GCCICAICCI 11]
148
44 4« *444 44 44
444 4*4 4444 ··· 4 4 444 4 44 4
444444 44 444 444
44444 4 4 4
4444 44 44 Μ· 44 94 (2) Informace pro SEQ ID NO: 39:
(i) Charakteristika sekvence:
(A) Délka: 42 párů baží (B) Typ: nukleová kyselina (C) Řetězec: jednoduchý (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: jiná nukleová kyselina (A) Popis: /popis = syntetická DNA (ix) Popis sekvence: SEQ ID NO: 39:
CTTCTCTGGC TGCTGCTGAT ACCATTCAAT GGTGTACGTA CT (2) Informace pro SEQ ID NO: 40:
(i) Charakteristika sekvence:
(A) Délka: 26 párů baží (B) Typ: nukleová kyselina (C) Řetězec: jednoduchý (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: jiná nukleová kyselina (A) Popis: /popis = syntetická DNA (ix) Popis sekvence: SEQ ID NO: 40:
cgagggccct tctcigg(ct ctgctg (2) Informace pro SEQ ID NO: 41:
0000
149
0 0 · · · · · · 0
000 0 0 000 0 0 0 0
0 «00 0 00 000 000
0 0 0 0 0 0 «
0000 00 00 000 0 0 00 (i) Charakteristika sekvence:
(A) Délka: 35 párů baží (B) Typ: nukleová kyselina (C) Řetězec: jednoduchý (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: jiná nukleová kyselina (A) Popis: /popis = syntetická DNA (ix) Popis sekvence: SEQ ID NO: 41:
GAGAAGGGCC CTARGTACST GATGRAWCTT AAGCA 35 (2) Informace pro SEQ ID NO: 42:
(i) Charakteristika sekvence:
(A) Délka: 35 párů baží (B) Typ: nukleová kyselina (C) Řetězec: jednoduchý (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: jiná nukleová kyselina (A) Popis: /popis = syntetická DNA (ix) Popis sekvence: SEQ ID NO: 42:
Ό C.
cacgaatvca (TATCGA-ITC tggaaccítc agagg (2) Informace pro SEQ ID NO: 43: (i) Charakteristika sekvence:
(A) Délka: 18 párů baží (B) Typ: nukleová kyselina
150 ·· *» t « · · « · · v « • · · · ··*· ·· ··«· ·« ··
9 · * ♦ · ···· 9 99 9
9 9 99 9 999
9 9 9
999 99 99 (C) Řetězec: jednoduchý (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: jiná nukleová kyselina (A) Popis: /popis = syntetická DNA (ix) Popis sekvence: SEQ ID NO: 43:
GGCTTGGAGC tcctcaga (2) Informace pro SEQ ID NO: 44:
(i) Charakteristika sekvence:
(A) Délka: 20 párů baží (B) Typ: nukleová kyselina (C) Řetězec: jednoduchý (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: jiná nukleová kyselina (A) Popis: /popis = syntetická DNA (ix) Popis sekvence: SEQ ID NO: 44:
GACAGTGG1T ΟΛΛΛΟίΤΠΤ (2) Informace pro SEQ ID NO: 45:
(i) Charakteristika sekvence:
(A) Délka: 118 aminokyselin (B) Typ: aminokyselinová (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: protein
151 ·· ·· ·· ···· ·· ·· • · · · to · · · « · • ··· to · ··· · · · « ·* · · · · ·· ·«· ··· ····· · · · ···· ·· ·· ··· ·· ··
(ix ) Popis , sek vence: : SEQ ID NO : 4 5:
Gin Leu Val Leu Thr Gin Ser Ser Sei' Ala Ser Phe Ser Leu Gly
1 5 10 15
Ala Ser Ala l.ys Leu Thr Cys Thr Leu Sď Ser Gin His Ser litr
20 25 30
Tyr Thr Ile Glu Trp Tyj· Gin Gin Gin Pro Leu Lys Pro Pro Lys
35 40 45
Tyr Val Met Asp Leu Lys Gin Asp Gly Ser His Ser Thr Gly Asp
50 55 60
Gly Ile Pro Asp Arp, Phe Ser Gly Ser Ser Ser Gly Ala Asp Arg
65 70 75
lyr Leu Ser 1le Ser Asii 1 le Gin Pro Glu Asp Glu Ala Met Tvr
80 85 90
1 le Cys Gly Val Gly Asp Ihr Ile Lys Glu G1 n Phe Val Tyr Val
95 100 105
Phe Gly G1 y Glv Thr Lys Val Tin- Val Leu Gly Gin Pro
110 115
(2) Informace pro SEQ ID NO: 46:
(i) Charakteristika sekvence:
(A) Délka: 118 aminokyselin (B) Typ: aminokyselinová (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: protein (ix) Popis sekvence: SEQ ID NO: 46:
·· • · • · »♦·
152
Glu Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Asp Leu Val Lys Pro Gly
1 5 10 15
Gly Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser
20 25 30
Ser Tyr Gly Met Ser Trp Ile Arg Gin Thr Pro Asp Lys Arg Leu
35 40 45
Glu Trp Val Ala Thr Ile Ser Ser Gly Gly Ser Tyr Thr Tyr Tyr
50 55 60
I’ro Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala • · · • ··· • φ · ΦΦΦ «··« φφ ·· ···» • · « • ♦ ·· φ • » • · ·· ··· «·* a
··
6!)
Lys Asn Thr Len Tyr Leu Gin Met Ser Ser Leu Lys St?i Glu Asp
85 90
Thr Ala Met Phe Tyr Cys Ala Arg Gin Thr Thr Met Thr Tyr Phe
100 105
Ala Tyr Trp Gly Gin Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala
110 115 (2) Informace pro SEQ ID NO: 47:
(i) Charakteristika sekvence:
(A) Délka: 116 aminokyselin (B) Typ: aminokyselinová (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: protein (ix) Popis sekvence: SEQ ID NO: 47:
Gin Leu Val Leu Thr Gin Ser Pro Ser Ala Ser Ala Ser Leu Cly ' 5 JO 15
Ala Ser Val Lys Leu Thr Cys Thr Leu Ser Ser Gin His Ser Thr
153 ·· ·· ·· ···· ·· ·· ··· ··· ···· • ··· · * ··· · · · · ·· ··· · ·· ··· ··· ····· · · · ···· ·· ·· ··· «» ··
Tyr Thr lle Glu Trp His Gin Gin Gin Pro Glu Lys Gly Pro Arg
Tyr Leu 35 Met Lys Leu 50 Pro Asp Arg Lys Phe 40 45 Gly Asp 60 Glu Arg
Gin Asp Gly Ser His Ser Thr
Ser Gly Ser 55 Ser Ser Gly Ala
Gly lle
65 70 75
Tyr 1 eu Thr lh> Ser Ser Leu Gin Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr
80 85 90
Tyr tys Gly Va! Gly Asp Thr lle Lys Glu Gin Phe Val Tyr Val
05 100 105
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly
110 115 (2) Informace pro SEQ ID NO: 48:
(i) Charakteristika sekvence:
(A) Délka: 118 aminokyselin (B) Typ: aminokyselinová (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: protein (ix) Popis sekvence: SEQ ID NO: 48:
Gin Leu Val Leu Thr Gin Ser Pro Ser Ala Ser Ala Ser Leu Gly
5 10 15
Ala Ser Val Ly> 1 eu Thr Cys Thr Leu Ser Ser Gin His Ser Thr
4 4 4 4 4 • · • ·
4
4 4 4
9 4 4
444 444
4
4 9 4 • ·
4 4 9
154
Tyr Thr Ile Glu Trp Tyr Gin Gin Gin Pro Glu Lys Gly Pro Lys
35 40 45
Tyr Leu Met Asp Leu Lys Gin Asp Gly Ser His Ser Thr Gly Asp
50 55 60
Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Ser Ser Gly Ala Glu Arg
65 70 75
Tyr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gin Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr
80 85 90
Tyr Cys Gly Val Gly Asp Thr Ue Lys G1 u G1 n Phe Val Tyr Val
05 100 105
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Gin Pro
110 115
(2) Informace pro SEQ ID NO: 49:
(i) Charakteristika sekvence:
(A) Délka: 118 aminokyselin (B) Typ: aminokyselinová (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: protein
(: ix) Pc ipis i sekv ence: SE Q I D NO: 49 •
Gin Leu Val Leu Thr Gin Ser Pro Ser Ala Ser Ala Ser Leu Gly
1 5 10 15
Ala Ser Val Lys Leu Thr Cys Thr Leu Ser Ser G1 n His Ser Thr
20 25 30
Tyr Thr Ile Glu Trp Tyr Gin Gin Gin Pro Glu Lys Gly Pro Lys
35 40 45
Tyr Val Met Asp Leu Lys Gin Asp Gly Ser His Ser Thr Gly Asp
50 55 60
Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Ser Ser Gly Ala Glu Arg • 4 · ·
155 • •4 · · · 4444 ••44 4 4··« · ·· « ·· 444 4 44 444 444 •44··· ·· *4·· ·· ·· ··· ·· ··
65 70 75
Tyr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gin Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr
80 85 90
Tyr Cys Gly Val Gly Asp Thr Ile Lys Glu Gin Phe Val Tyr Val
95 100 105
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Gin Pro
110 115
(2) Informace pro SEQ ID NO: 50:
(i) Charakteristika sekvence:
(A) Délka: 118 aminokyselin (B) Typ: aminokyselinová (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: protein (ix) Popis sekvence: SEQ ID NO: 50:
Gin Leu Val Leu Thr Gin Ser Pro Ser Ala Ser Ala Ser Leu Gly
1 5 10 15
Ala Scr Val Lys Leu Thr Cys Thr Leu Ser Ser Gin Ih s Ser Thr
20 25 30
Tyr Thr Ile G1 u Trp Tyr Gin Gln Gin Pro Glu Lys Gly Pro Arg
35 40 45
Tyr Leu Met Asp Leu Lys Gin Asp Gly Ser His Ser Thr Gly Asp
50 55 60
Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Ser Ser Gly Ala Glu Arg
156 ·· ···· · 0 00 000 000 0000 ···· · 0000 0 00 0 0 0 000 0 00 000 000 00000 0 0 0 0000 00 00 000 00 00
65 70 75
Tyr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gin Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr
80 85 90
Tyr Cys Gly Val Gly Asp Thr Ile l.ys Glu Gin Phe Val Tyr Val
95 100 105
Phe Gly Gly Gly Thr l.ys Leu Thr Val Leu Gly Gin Pro
110 115
(2) Informace pro SEQ ID NO: 51:
(i) Charakteristika sekvence:
(A) Délka: 118 aminokyselin (B) Typ: aminokyselinová (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: protein
(ix) Po piš sekv ence: SE' 0 I D NO: 51 •
Gin leu Val Leu Thr Gin Ser Pro Ser Ala Ser Ala Ser leu Gly
1 5 10 15
Ala Ser Val Lys Leu Thr Cys Thr Leu Ser Ser Gin His Ser Thr
20 25 30
Tyr Thr Ile Glu Trp Tyr Gin Gin Gin Pro Glu Lys Gly Pro Arg
35 40 45
Tyr Val Met Asp Leu Lys Gin Asp Gly Ser His Ser Thr Gly Asp
50 55 60
Gly 11c Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Ser Ser Gly Ala Glu Arg • · • · • ·
157 ··· ··· · · · · ···· · ···· · · · · • · · · · · · · ······ ····· · · · «··· «· ·· ··· ·· ·»
65 70 75
ly; Leu Thr lle Ser Ser Leu Gin Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr
80 85 90
lyi Cys G1 y Val Gly Asp Thr lle l.ys Glu Gin Phe Val Tyr Val
95 100 105
Phe Gly Gly Gly Thr l.ys Leu Tlir Val Leu Gly G1 n Pro
110 115
(2) Informace pro SEQ ID NO: 52:
(i) Charakteristika sekvence:
(A) Délka: 118 aminokyselin (B) Typ: aminokyselinová (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: protein (ix) Popis sekvence: SEQ ID NO: 52:
Gin Leu Val Leu Thr Gin Ser Pro Ser Ala Ser Ala Ser Leu Gly
1 5 10 15
Ala Ser Va í l.ys Leu Thr Cys Thr Leu Ser Ser Gin His Ser Thr
20 25 30
Tyr Thr lle Glu Trp Tyr Gin Gin Gin Pro Glu Lys Gly Pro Lys
35 40 45
Tyr Leu Met Asp Leu l.ys Gin Asp Gly Ser His Ser Thr Gly Asp
50 55 60
Giy líc Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Ser Ser Gly Ala Glu Arg ·· • · • · • · · • to ·· · · • · • · • · · ·
158 • · to· ··· • ·
70 75
Tyr Leu Thr J Je Ser Ser Leu Gin Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr
85 90
Je Cys Gly Val Gly Asp Thr Ile Lys Glu Gin Phe Val Tyr Vat
100 105
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Gin Pro
110 115 (2) Informace pro SEQ ID NO: 53:
(i) Charakteristika sekvence:
(A) Délka: 118 aminokyselin (B) Typ: aminokyselinová (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: protein
Popis SG ikvence: SEQ ID N 0: 53:
Gin Leu Val Leu Thr Gin Ser Pro Ser Ala Ser Ala Ser Leu Gly
1 5 10 15
Ala Ser Vai Lys Leu Thr Cys Thr Leu Ser Ser Gin His Ser Thr
20 25 30
Tyr Thr Ile Glu Trp Tyr Gin Gin Gin Pro Glu Lys Gly Pro Arg
35 40 45
Tyr Leu Mel Asp Leu Lys Gin Asp Gly Ser His Ser Thr Gly Asp
50 55 60
Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Ser Ser Gly Ala Glu Arg
159 • · · · * · ···· ···· · · ··· · 9 9 9
999 9 99 999999
9 9 9 9 9 9 9
9999 99 99 999 99 99
65 70 75
Tyr Leu lhr lle Ser Ser Leu Glu Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr
80 85 90
lle Cys Gly Va) Gly Asp Thr lle Lys Glu Gin Phe Val Tyr Val
95 100 105
Phe Gly Glv Gly lhr Lys Leu Thr Val Leu Gly Gin Pro
110 115
(2) Informace pro SEQ ID NO: 54:
(i) Charakteristika sekvence:
(A) Délka: 118 aminokyselin (B) Typ: aminokyselinová (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: protein (ix) Popis sekvence: SEQ ID NO: 54:
Gin Leu Val Leu Thr Gin Ser Pro Ser Ala Ser Ala Ser Leu Gly
1 5 10 15
Ala Ser Val Lys Ía.iÍ Thr Cys Thr Leu Ser Ser Gin His Ser Thr
20 25 30
Tyr Thr lle Glu Irp Tyr Gin Gin Gin Pro Glu Lys Gly Pro Lys
35 40 45
Tyr Val Mel. Asp Leu Lys Gin Asp Gly Ser His Ser Thr Gly Asp
50 55 60
Gly lle Pro Asp Arg Plic Ser Gly Ser Ser Ser Gly Ala Glu Arg ·· a· • a ·
160 • a · a aa a a a a a a · · · • a · · · ·· ·» • · · · « a
65 70 75
Tyr Leu Thr lle Ser Ser Leu Gin Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr
80 85 90
lle Cys Gly Val Gly Asp Thr lle Lys Glu Gin Phe Val Tyr Val
95 100 105
Phe Gly Gly Gly Thr l.ys Leu Thr· Val Leu Gly Gin Pro
110 115
(2) Informace pro SEQ ID NO: 55:
(i) Charakteristika sekvence:
(A) Délka: 118 aminokyselin (B) Typ: aminokyselinová (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: protein (ix) Popis sekvence: SEQ ID NO: 55:
Gin Leu Val Leu Thr Gin Ser Pro Ser Ala Ser Ala Ser Leu Gly
1 5 10 15
Ala Ser Val l.ys Leu Thr Cys litr Leu Ser Ser Gin His Ser Thr
20 25 30
Tyr Thr lle Glu Trp lyr Gin Gin Gin Pro Glu Lys Gly Pro Arg
35 40 45
Tyr Val Met. Asp Leu Lys Gin Asp Gly Ser His Ser Thr Gly Asp
50 55 60
Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Ser Ser Gly Ala Glu Arg
161 • 99 9 9 · 9 · 9 9 • 999 · 9 9 9 9 4 · · ·
9 ··· · 9 9 999 999 · · 9 4 * 9 9 • 99* 99 «9 999 99 9 *
65 70 75
Tyr Len Thr Ile Ser Ser Leu Gin Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr
80 85 90
Ile (,’ys Gly Val Gly Asp Thr Ile Lys Glu Gin Phe Val Tyr Val
95 100 105
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Gin Pro
110 115
(2) Informace pro SEQ ID NO: 56:
(i) Charakteristika sekvence:
(A) Délka: 118 aminokyselin (B) Typ: aminokyselinová (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: protein (ix) Popis sekvence: SEQ ID NO: 56:
Gin Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gin Pro Gly
1 5 10 15
Arg Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser
20 25 30
Ser Tyr Gl y Met. Ser Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu
35 40 45
Glu Trp Val Ala Thr Ile Ser Ser Gly Gly Ser Tyr Thr Tyr Tyr
50 55 60
Pro Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser
162 • φ ·· φ · φφφφ φ
ΦΦΦ · φφ ΦΦΦ φ φ φ ΦΦΦ
70 75
Lys Asn Ihr Leu lyr Leu Gin Mel Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp
85 90
Ihr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Gin Thr Thr Met Thr Tyr Phe
100 105
Ala Tyr Trp Gly Gin Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
110 115 (2) Informace pro SEQ ID NO: 57:
(i) Charakteristika sekvence:
(A) Délka: 411 párů baží (B) Typ: nukleová kyselina (C) Řetězec: dvojitý (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: cDNA k mRNA (ix) Popis sekvence: SEQ ID NO: 57:
ATG AAC TCC GGG CTC AGC rre ΛΤΓ TTC CIT GCC CTC ATT TTA AAA 45
Met Asn Phe Gly Leu Ser Leu Ile Phe Leu Ala Leu lk> Leu Lys
15 10 -5
(x;t GTC CAG TGT GAG GTG CAA CTG GTG GAG TCT GGG GGA GAC TTA 90
G1 y Val Gin Cys G1 u Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Asp Leu
1 5 10
GTG AAG (XT GGA GGG TCC CTG AAA CTC TCC TGT GCA GCC TCT GGA 135
Val Lys Pro Gly Gly Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly
163 ·· · · 0 · · · · · · · 0 0 0 0 0 0 · · ···· · · · · · ·» ·· * ·
15 20 25
TTC ACT JTC AGT AGC ΤΛΤ GGC ATG TCT IGG ΛΠ OGC CAG ACT CCA 180
Phe Thr Phe Ser Se r Ί yr Gly Met Ser Trp lle Arg Gin Thr Pro
30 35 40
GAC AAG AGG CTG GAG IGG GTC GCA ACC ATT AGT AGT GGT GGT AGT 225
Asp Lys Arg Leu Glu Trp Val Ala Thr lle Ser Ser Gly G1 y Ser
45 50 55
TAC ACC TAC ΤΛΤ CCA GAC AGT GTG AAG GGG CGA rrc ACC ATC TCC 270
Tyr Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr lle Ser
60 65 70
AGA GAC ΛΛΤ GCC AAG AAC ACC CTA TAC CTG CAA ATG AGC AGT CTG 315
Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gin Met Ser Ser Leu
75 80 85
AAG TCT GAG GAC ACA GCC ATG TTT TAC TGT GCA AGA CAG ACT ACT 360
l.ys Ser Glu Asp Thr Ala Met Phe Tyr Cys Ala Arg Gin Thr Thr
90 95 100
ATG ACT TAC ΤΓΓ GCT TAC TGC GGC CAA GGG ACT CTG GTC ACT GTC 405
Met Thr Tyr Phe Ala Tyr Trp GT y Gin G1 y Thr Leu Val Thr Val
105 110 115
TCT GCA 411
Ser Ala (2) Informace pro SEQ ID NO: 58:
(i) Charakteristika sekvence:
(A) Délka: 411 párů baží (B) Typ: nukleová kyselina (C) Řetězec: dvojitý (D) Topologie: lineární • t ·♦* ·
164 • · · • · · · • · • · ···· ·· • · · ♦ « · ···· · ·· · • · · ··· ··· • · · · ** · ·· ·· ·· (ii) Typ molekuly: cDNA k mRNA (ix) Popis sekvence: SEQ ID NO: 58
ATG GGG ΤΓΓ GGG (TG AGC TGC GTT ITC CTC GTT GCT □Τ TTA AGA 45
Mu Gly í'ť Gly Leu Ser Trp Val Phe Leu Val Ala Leu Leu Arg
15 -10 -5
GGT GTC CAG TG'!' CAG GTG CAG CTG GTG GAG TCT GGG GGA GGC GTG 90
Giy Val G1 n Cys G1 n Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val
t 5 10
GTG CAG CGT (xx; AGG TCC CTG AGA CTC TCC TGT GCA GGC TCT GGA 135
Val ýln Pro Gly Arg Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly
16 20 25
ITC ACC ITC AGT AGC TAT GGC ATG TCT TGG GTC CGC CAG GCT CCA 180
Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Gly Met Ser Trp Val Arg Gin Ala Pro
30 35 40
GGG AAG GGG (TG GAG TGC GTG GCA ACC ATT AGT AGT GCT GGT AGT 225
G1 y Lys Gly leu Glu Trp Val Ala Thr Ile Ser Ser Gly Gly Ser
45 50 55
TAC ACC TAC ΤΛΤ CCA GAC AGT GTG AAG GGG CGA TTC ACC ATC TGC 270
Ty >- Thr Tyt Tyr Pro Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr (Ie Ser
60 65 70
AGA GAG ΛΑΤ TCC AAG AAG ACG CTG TAT CTG CAA ATG AAC AGC CTG 315
Arg Asp Asn Ser l.ys Asn Thr Leu Tyr Leu Gin Met Asn Ser Leu
75 80 85
AGA GGT GAG GAC ACG GCT GTG TAT TAC TGT GCG AGA CAG ACT ACT 360
Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Gin Thr Thr
0000
165 • 0 «00 0000 0000 0 0·00 0 00 0 0 0 000 0 00 000 000 » 0 0 0 0 0 0
90 95 100 0000 00 0» ··· 0» 00
ATG ACT 1AC ΊΤΓ GCT TAC TGG GGC CAG GGA ACC CTG GTC ACC GTC 405
Met Thr Tyr Phe Ala Tyr Trp Gly Gin Gly Thr Leu Val Thr Val
105 110 115
το: tca ·] 11
Ser Ser (2) Informace pro SEQ ID NO: 59:
(i) Charakteristika sekvence:
(A) Délka: 11 aminokyselin (B) Typ: aminokyselinová (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: peptid (ix) Popis sekvence: SEQ ID NO: 59:
tys Ala Ser Gin Asp Val Asn Thr Ala Va] Ala 1 5 10 (2) Informace pro SEQ ID NO: 60:
(i) Charakteristika sekvence:
(A) Délka: 7 aminokyselin (B) Typ: aminokyselinová (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: peptid (ix) Popis sekvence: SEQ ID NO: 60:
Ser Ala Ser Asn Arg lyj Thr
5 (2) Informace pro SEQ ID NO: 61:
(i) Charakteristika sekvence:
(A) Délka: 9 aminokyselin
A A A A A*
166
AA AA
AA AAA AAAA
AAAA A AAAA A AA A
AAAAAA AA AAA AAA
AAAAA A A A
AAAA» aaaaa A* AA (B) Typ: aminokyselinová (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: peptid (ix) Popis sekvence: SEQ ID NO: 61:
Gin Gin His Tyr Ser Thr Pro Phe Thr
5 (2) Informace pro SEQ ID NO: 62:
(i) Charakteristika sekvence:
(A) Délka: 5 aminokyselin (B) Typ: aminokyselinová (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: peptid (ix) Popis sekvence: SEQ ID NO: 62:
Pro Tyr Trp Met Gin 1 5 (2) Informace pro SEQ ID NO: 63:
(i) Charakteristika sekvence:
(A) Délka: 16 aminokyselin (B) Typ: aminokyselinová (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: peptid (ix) Popis sekvence: SEQ ID NO: 63:
Ser Ile Phe Gly,Asp Gly Asp Thr Arg Tyr Ser Gig Lys Phe Lys Gly
10 15 (2) Informace pro SEQ ID NO: 64 ··· *
167 toto · · · * «« ··· ··· • ••toto · to · to··· ·· toto «to· ·· toto (i) Charakteristika sekvence:
(A) Délka: 11 aminokyselin (B) Typ: aminokyselinová (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: peptid (ix) Popis sekvence: SEQ ID NO: 64:
Cly Leu Arg Arg Gly Gly Tyr Tyr Phe Asp Tyr f 5 10 (2) Informace pro SEQ ID NO: 65:
(i) Charakteristika sekvence:
(A) Délka: 411 párů baží (B) Typ: nukleová kyselina (C) Řetězec: dvojitý (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: cDNA k mRNA (ix) Popis sekvence: SEQ ID NO: 65:
ATG GCC TGG ACT CCT CTC TTC TTC 'rrc ttt GTT CTI’ CAT TGC TCA
Mel Ala Trp Thr Pro Leu Phe Phe Phe Phe Val Leu His Cys Ser
15 -10 -5
GGT TCT rrc rcc caa CTT GTG CTC ACT CAG TCA TCT TCA GCC TCT
Gly Ser Phe Ser Gin Leu Val Leu Thr Gin Ser Ser Ser Ala Ser
1 5 10
TTC TCC CTG GGA GCC TCA GCA AAA CTC ACG TGC ACC TTG AGT AGT
Phe Ser Leu Gly Ala Ser Ala Lys Leu Thr Cys Thr Leu Ser Ser
·· ···* • · • ··· ·· • · • · ··» ·«
168 ··· • · »· * » • · · · · * • · « · · ♦ ··· ·· ♦♦ «« • · • · ·♦·
CAG CAC AGT ACG TAC ACC ATI GAA TGG TAT
Gin His Ser Thr Tyr Thr Ile Glu Trp Tyr
30 35
AAG CCT CCT AAG ΤΛΤ GTG ATG GAT CTT AAG
lys Pro Pro tys Tyr Val Met Asp Leu Lys
45 50
AGC ACA GGT GAT GGG ATT CCT GAT CGC TTC
Ser Thr Gly Asp Gly Ile Pro Asp Arg Phe
60 65
GCT GCT GAT CGC TAC CIT AGC ATT TCC AAC
Gly Ala Asp Arg Tyr Leu Ser Ile Ser Asn
75 80
GAA GCA ATG TAC ATC TGT GGT GTG GGT GAT
Glu Ala Met Tyr Ile Cys Gly Val Gly Asp
95 'ΠΤ G'l(i TAT GTT ITC GGC GGT GGG ACC AAG
Phe Val Tyr Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys
105 110
CAG CCC 411
Gin Pro
CAG CAA CAG CCA CTC i 80
Gin Gin Gin Pro Leu
40
CAA GAT GGA AGC CAC 225
Gin Asp Gly Ser His
55
TCT GGA TCC AGC TCT 270
Ser Gly Ser Ser Ser
70
ATC CAG CCA GAA GAT 315
Ile Gin Pro Glu Asp
85
ACA ATT AAG GAA CAA 360
Thr Ile Lys Glu Gin
100
GTC ACT GTC CTA GGT 405
Val Thr Val Leu Gly
115
(2) Informace pro SEQ ID NO: 66: (i) Charakteristika sekvence:
(A) Délka: 405 párů baží (B) Typ: nukleová kyselina (C) Řetězec: dvojitý (D) Topologie: lineární
169 •4 ·· ·4 ···· 44 44 • · 4 444 4 4 4 4
4444 4 · 4 44 4 44 4
444 4 44 444444
4444« 4 4 β
4444 44 44 «44 ♦· 44 (ii) Typ molekuly: cDNA k mRNA (ix) Popis sekvence: SEQ ID NO: 66:
ATG GCC TGG ACT CCT CTC TTC ITC TTC TTT GTT CTT CAT TGC TCA 45
Met Ala Trp Thr Hro Leu Hhe Phe Hhe Hhe Val Leu His Cys Ser
-15 -10 -5
GGT TCT ITC TCC CAG CTT GTG CTG ACT CAA TCG CCC TCT GCC TCT 90
Gly Ser Plic Ser Gin Leu Val Leu Thr Gin Ser Pro Ser Ala Ser
1 5 10
GCC TCC CTG GGA GCC TCG GTC AAG CTC ACC TGC ACC TIG AGT AGT 135
Ala Ser Leu G1 y Ala Ser Val Lys Leu Thr Cys Thr Leu Ser Ser
15 20 25
CAG CAC AGT ACG TAC ACC ATT GAA TGG CAT CAG CAG CAG CCA GAG 180
Gin His Ser Thr Tyr Thr lle Glu Trp His Gin Gin Gin Hro Glu
30 35 40
AAG GGC cct CGG TAC TIG ATG AAA Cil AAG CAA GAT gga AGC CAC 225
l.ys Gly Hro Arg Tyr Leu Met Lys Leu Lys Gin Asp Gly Ser His
45 50 55
AGC ACA GGT GAT GGG ΑΊΤ CCT GAT CGC TTC TCA GGC TCC AGC TCT 270
Ser Thr G1 y Asp Gly lle Pro Asp Arg Hhe Ser Gly Ser Ser Ser
00 65 70
ggg GCT GAG αχ; TAC CTC ACC ATC TCC AGC CTC CAG TCT GAG GAT 315
G1 y AJa Glu Arg Tyr Leu Thr lle Ser Ser Leu Gin Ser Glu Asp
75 80 85
GAG GCT GAC ΤΛΤ TAC TGT GGT GTG GGT GAT ACA ATT AAG GAA CAA 360
Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gly Val Gly Asp Thr lle Lys Glu Gin ·· ♦·* ·
170 • · ♦ · · A » · » • ••A A AAAA A AA A
A A AAA A AA AAAAAA
AAAAAA A A
AAAA AA AA AAA ·· AA
95 100
TTT GIG TAC CTG ITC CCC GGA GGG ACG AAA GTG ACC GTC CTA (CT 405
Phe Val Tví· Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys hen Thr Val Leu Gly
105 110 115 (2) Informace pro SEQ ID NO: 67:
(i) Charakteristika sekvence:
(A) Délka: 411 párů baží (B) Typ: nukleová kyselina (C) Řetězec: dvojitý (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: cDNA k mRNA (ix) Popis sekvence: SEQ ID NO: 67:
ATG GCC TGG ACT CCT CTC ITC TTC ITC ΊΤΤ GIT CTT CAT TGC TCA
Met Ala Trp Thr Pro Leu Phe Phe Phe Phe Val Leu His Cys Ser
15 10 -5
GGT TCT TTC TCC CAG CTT GTG CTG ACT CAA TCG CCC TCT GCC TCT
Gly Ser Phe Ser Gin Leu Va) Leu Ihr Gin Ser Pro Ser Ala Ser
1 5 10
GCC TCC (TG (CA GCC TCG GTC AAG CTC ACC TGC ACC TIG AGT AGT
Ala Ser Leu Gly Ala Ser Val Lys Leu Thr Cys Thr Leu Ser Ser
15 20 25
CAG CAC AGT ACG TAC ACC ATI' GAA ra; ΤΛΤ CAG CAG CAG CCA GAG
Gin His Ser Thr Tyr Ihr Ile Glu Trp Tyr Gin Gin Gin Pro Glu • to ·· · ·
171 • to· to · to ···· ···· · >··· to toto · ·· ··· · ·· ······ to···· · · · • ••to ·· *· ··· ·· toto
30 35 40
AAG GGC CCT AAG TAC CTG ATG GAT CTT AAG CAA GAT GGA AGC CAC 225
Lys G1 v Pro Lys Tyr Leu Met Asp Leu Lys Gin Asp Gly Ser His
45 50 55
AGC ACA GGT GAT GGG ATT CCT GAT CGC ITC TCA GGC TCC AGC TCT 270
Ser Thr Gly Asp Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Ser Ser
60 65 70
GGG GCT GAG CGC TAC CTC ACC ATC TCC AGC CTC CAG TCT GAG GAT 315
Gly Ala Glu Arg Tyr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gin Ser Glu Asp
75 80 85
GAG GCT GAC TAT TAC TGT GGT GTG GGT GAT ACA ATT AAG GAA CAA 360
Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gly Val Gly Asp Thr Ile Lys Glu Gin
90 95 100
TTT GTG TAC GTG TTC GGC GGA GGG ACC AAA CTG ACC GTC CTA GGC 405
Phe Val Tyr Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly
105 110 115
CAG CCC 411
Gin Pro (2) Informace pro SEQ ID NO: 68: (i) Charakteristika sekvence:
(A) Délka: 411 párů baží (B) Typ: nukleová kyselina (C) Řetězec: dvojitý (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: cDNA k mRNA ··»·
172
44 • · * 4 4 4 4 4 4 4
4 4 4 4 4 · 4 4 · ·· 4 • 4 4 4 4 4 44 444444
44444 4 4 4
4444 44 44 «44 44 44 (ix) Popis sekvence: SEQ ID NO: 68:
ATG GCC TGG ACT CCT crc TTC rrc TTC πτ GIT CTT CAT TGC TCA 45
Met Ala Trp Thr Pro Leu Phe Phe Phe Phe Val Leu His Cys Ser
-15 -10 -5
GGT TCT TTC TCC CAG CTT GTG CTG ACT CAA TCG CCC TCT GCC TCT 90
Gly Ser Phe Ser Gin Leu Val Leu Thr Gin Ser Pro Ser Ala Ser
1 5 10
GCC TCC CTG GGA GCC TCG GTC AAG CTC ACC TGC ACC 1TG AGT AGT 135
Ala Ser Leu Gly Ala Ser Val Lys Leu Thr Cys Thr Leu Ser Ser
15 20 25
CAG CAC AGT ACG TAC ACC ATT GAA TGG TAT CAG CAG CAG CCA GAG 180
Gin His Ser Thr Tyr Thr Ile Glu Trp Tyr Gin Gin Gin Pro Glu
30 35 40
AAG GGC CCT AAG TAC GTG ATG GAT CTT AAG CAA GAT GGA AGC CAC 225
Lys Gly Pro Lys Tyr Val Met Asp Leu Lys Gin Asp Gly Ser His
45 50 55
AGC ACA GGT GAT GGG ATT CCT GAT CGC ITC TCA GGC TCC AGC TCT 270
Ser Thr Gly Asp Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Ser Ser
60 65 70
GGG GCT GAG CGC TAC CTC ACC ATC TCC AGC CTC CAG TCT GAG GAT 315
Gly Ala Glu Arg Tyr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gin Ser Glu Asp
75 80 85
GAG GCT GAC TAT TAC TGT GGT GTG GGT GAT ACA ATT AAG GAA CAA 360
Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gly Val Gly Asp Thr Ile Lys Glu Gin
90 95 100
ΓΓΓ GTG TAC GTG TTC GGC GGA GGG ACC AAA CTG ACC GTC CTA GGC 405
Phe Val lyr Va! Plic Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly 105 Π0 115 f
CAG CCC 411
Gin Pro
9999
173
99
9 9 9 9 9 9 9 9 9
9 99 9 9 9 99 9 9 9 9
9 9 9 9 9 9 9 999999
9 9 9 9 9 9 9
9999 99 99 999 99 99 (2) Informace pro SEQ ID NO: 69:
(i) Charakteristika sekvence:
(A) Délka: 411 párů baží (B) Typ: nukleová kyselina (C) Řetězec: dvojitý (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: cDNA k mRNA (ix) Popis sekvence: SEQ ID NO: 69:
ATG GCC TGG ACT CCT CTC TTC TTC 1TC ITT CTT CTT CAT TGC TCA 45
Met. Ala Trp Thr Pro Leu Phe Phe Phe Phe Val Leu His Cys Ser
-15 -10 -5
GGT TCT HC TCC CAG CTT GTG CTG ACT CAA TCG CCC TCT GCC tct 90
G) y Ser Phe Ser Gin Leu Val Leu Thr Gin Ser Pro Ser Ala Ser
1 5 10
gcc; TCC CTG GGA GCC TCG GTC AAG CTC ACC τα: ACC TTG AGT AGT 135
Ala Ser Leu Gly Ala Ser Val Lys Leu Thr Cys Thr Leu Ser Ser
15 20 25
CAG CAC AGT ACC TAC ACC ΛΤΓ GAA TGG ΤΛΤ CAC CAG CAG CCA GAG 180
Gin His Ser Thr Tyr Thr Ile G1 u Trp Tyr Gin Gin Gin Pro Glu
35 40
AAG GGC (XT AGG L-V' (TG ATG GAT CTT AAG CAA GAT GGA AGC CAC 225
l.ys Gly Pro Arp lvi Leu Met Asp Leu Lys Gin Asp Giy Ser His
50 55
AGC ACA GGT GAT GGG ATT CCT GAT CGC 1TC TCA (XiC TCC AGC TCT 270
4444
174
Ser Thr Gly Asp Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly
60 65
GGG GCT GAG CGC TAC CTC ACC ATC TCC AGC CTC CAG
Gly Ala G1 u Arg Tyr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gin
75 80
GAG GCT GAC TAT TAC TGT GGT GTG GGT GAT ACA ATI'
G1 u A1 a Asp Tyr Tyr Cys Gly Val Gly Asp Thr Ile
90 95
ΤΙ'Γ GTG TAC GTG TTC GGC GGA GGG ACC AAA CTG ACC
Phe Val Tyr Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr
105 110
··* » · . *·»· 4 4·· 4 444« 4 44 4 ·· *44 « 44 444444 • 4 4 4 4 4 4 4 >444 44 44 444 44 44
Ser Ser Ser
TCT GAG GAT 315
Ser Glu Asp
AAG GAA CAA 360
Lys Glu Gin
100
GTC CLA GGC 405
Val Leu Gly
CAG CCC 411
Glri Pro (2) Informace pro SEQ ID NO: 70:
(i) Charakteristika sekvence:
(A) Délka: 411 párů baží (B) Typ: nukleová kyselina (C) Řetězec: dvojitý (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: cDNA k mRNA (ix) Popis sekvence: SEQ ID NO: 70:
4« ·Ι|3 44 91 « 4 4 4 4 4
4 4·4 4 44 4
4 4« 444444
4 4 4 4
444 44 44 «4
175 * ::..
• 4 9
4 4 ···* 4*
ATG GCC TGG ALT CCT CTC TTC TTC TTC TIT GIT CTI CAT TGC TCA 45
Met Ala Trp Thr Pro Leu Phe Phe Phe Phe Val Leu His Cys Ser
-15 -10 -5
(Kil TCP TTC TCC CAG CTT GTG CTG ACT CAA TCG CCC TCT GCC TCT 90
Gly Ser Phe Ser Gin Leu Val Leu Thr Gin Ser Pro Ser Ala Ser
1 5 10
GCC ICC CTG GGA GCC TCG GTC AAG CTC ACC TGC ACC 1TG AGT AGT 135
Ala Ser Leu Gly Ala Ser Val Lys Leu Thr Cys Thr Leu Ser Ser
15 20 25
CAG CAC AGT ACG TAC ACC ATT GAA TGG ΤΛΤ CAG CAG CAG CCA GAG 180
Gin His Ser Thr Tyr Thr lle Glu Trp Tyr Gin Gin Gin Pro Glu
30 35 40
AAG GGC CCT AGG TAC GTG ATG GAT CTT AAG CAA GAT GGA AGC CAC 225
Lys Gly Pro Arg Tyr Val Met Asp Leu Lys G1 n Asp Gly Ser His
45 50 55
AGC ACA (iGT GAT GGG ΑΠ' CCT GAT CGC TTC TCA GGC TCC AGC TCT 270
Ser Thr Gly Asp Gly lle Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Ser Ser
60 65 70
GGG GCI GAG CGC TAC CTC ACC ATC TCC AGC CTC CAG TCT GAG GAT 315
Gl y A i a Glu Arg Tyr Leu Thr ]1e Ser Ser Len G1 n Ser Glu Asp
75 80 85
GAG GCT GAC ΤΛΤ TAC Ί6Τ GGT GTG GGT GAT ACA ΛΤΓ AAG GAA CAA 360
Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gly Val Gly Asp Thr lle Lys Glu Gin
90 95 100
rrr GTG TAC GTG TTC gcc GGA GGG ACC ΛΑΑ CTG ACC GTC CTA GGC 405
Phe Val lyr Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly
105 110 115
GAG CCG lil
Glu Pro
176
• 44 • 44 4 • 4444 • 44 4 4 44 4 4
• 444 4 • ··· 4 4 4 4
• • • · • • 4 444 444
• • • • 4 4 4
4 4· 44 444 44 44
(2) Informace pro SEQ ID NO: 71:
(i) Charakteristika sekvence:
(A) Délka: 411 párů baží (B) Typ: nukleová kyselina (C) Řetězec: dvojitý (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: cDNA k mRNA (ix) Popis sekvence: SEQ ID NO: 71:
ATG GCC TGG ACT CCT CTC TTC 1TC TTC TTT G'IT CTT CAT TGC TCA
Met. Ala Trp Thr Pro Leu Phe Phe Phe Phe Val Leu His Cys Ser
-15 -10 -5
GGT TCT TTC TCC CAG CTT GTG CTG ACT CAA TCG CCC TCT GCC TCT
Gly Ser Phe Ser Gin Leu Val Leu Thr Gin Ser Pro Ser Ala Ser
5 10
GCC TCC CTG GGA GCC TCG GTC AAG CTC ACC TGC ACC TTG AGT AGT 135
Ala Ser Leu Gly Ala Ser Val Lys Leu Thr Cys Thr Leu Ser Ser
15 20 25
CAG CAC AGT ACG TAC ACC ATT GAA TGG TAT CAG CAG CAG CCA GAG 180
Gin His Ser Thr Tyr Thr Ile Glu Trp Tyr Gin Gin Gin Pro Glu
0U 00 40
AAG GGC CCT AAG TAC CTG ATG GAT CTT AAG CAA GAT GGA AGC CAC 225
Lys Gly Pro Lys Tyr Leu Met Asp Leu Lys Gin Asp Gly Ser His
45 50 55
AGC ACA GGT GAT GGG ATT CCT GAT CGC TTC TCA GGC TCC AGC TCT 270
« ·
177 ···· · * · · · · · · · • · · · · 9 99 999999
9 9 9 9 9 9 ·
9999 99 99 999 99 99
Ser Thr Gly Asp Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Ser Ser
60 65 70
GGG GCT GAG CGC TAC CTC ACC ATC TCC AGC CTC CAG TCT GAG GAT 315
Gly Ala Glu Arg Tyr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gin Ser Glu Asp
75 80 85
GAG GCT GAC ΤΛΤ ATC TGT GGT GTG GGT GAT ACA ATT AAG GAA CAA 360
Gin Ala Asp Tyr Ile Cys Gly Val Gly Asp Thr Ile Lys Glu Gin
90 95 100
ITT GTG TAC GTG rrc GGC GGA GGG ACC AAA CTG ACC GTC CTA GGC 405
Phe Val Tyr Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly
105 110 115
CAG CCC 1 11
Gin Pro (2) Informace pro SEQ ID NO: 72:
(i) Charakteristika sekvence:
(A) Délka: 411 párů baží (B) Typ: nukleová kyselina (C) Řetězec: dvojitý (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: cDNA k mRNA (ix) Popis sekvence: SEQ ID NO: 72
178
ATG GCC IGG ACT CCT CTC TTC TLC TLC ΤΓΓ GIT
Met. Ala Trp Thr Pro Leu Phe Phe Phe Phe Val
15 -10
GGT TCT T)C TCC CAG CTT GTG CTG ACT CAA TCG
Gly Ser Phe Ser Gin Leu Val Leu Thr Gin Ser
1 5
GCC TCC CTG GGA GCC TCG GTC AAG CTC ACC TGC
Ala Ser Leu Gly Ala Ser Val Lys Leu Thr Cys
15 20
CAG CAC AGT ACG TAC ACC ATT GAA TGG TAT CAG
Gin His Ser Thr Tyr Thr Ile Glu Trp Tyr Gin
30 35
AAG GGC CCT AGG TAC CTG ATG GAT CTT AAG CAA
Lys Gly Pro Arg Tyr Leu Met Asp Leu Lys Gin
45 50
AGC ACA GGT GA1 GGG ATI' CCT GAT CGC TLC TCA
Ser Thr Gly Asp Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser
60 65
GGG GCT GAG CGC TAC CTC ACC ATC TCC AGC CTC
Gly Ala G1 u Arg Tyr Leu Thr Ile Ser Ser Leu
75 80
GAG GCT GAC TAT ATC TCT GGT GTG GGT GAT ACA
G1 u Ala Asp Tyr Ile Cys Gly Val Gly Asp Thr
90 95
ΊΊΤ GTG IAC G IG TLC ggc GCA GGG ACC ΑΛΑ CTG
·· ·· · · ···· · · ·· • · · · · · · · · · • · · · · ···· · · · · • · · · · · ·· ······ • · · · · · · · ···· ·* ·· ··· ·· ·«
CTT CAT TGC TCA 45
Leu His Cys Ser
-5
CCC TCT GCC TCT 90
Pro Ser Ala Ser
10
ACC TTG AGT AGT 135
Thr Leu Ser Ser
25
CAG CAG CCA GAG 180
Gin Gin Pro Glu
40
GAT GGA AGC CAC 225
Asp Gly Ser His
55
GGC TCC AGC TCT 270
Gly Ser Ser Ser
70
CAG TCT GAG GAT 315
Gin Ser Glu Asp
85
ΑΊΤ AAG GAA CAA 360
Ile Lys Glu Gin
100
ACC GTC CTA GGC 405
Phe Val Tyr Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val l.eu Gly 105 110 115
CAG CCC 41I
Gin Pru • · • · · ·
179 (2) Informace pro SEQ ID NO: 73:
(i) Charakteristika sekvence:
(A) Délka: 411 párů baží (B) Typ: nukleová kyselina (C) Řetězec: dvojitý (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: cDNA k mRNA (ix) Popis sekvence: SEQ ID NO: 73:
atg GCC TGG ACT l (T (TG 1TC TTC 1TC ITT CIT CIT CAT TGC TCA Ί5
Met Ala Trp Thr Pro Leu Phe Phe Phe Phe Val Leu His Cys Ser
-15 -10 -5
GG 1 ÍCÍ TTC TCC CAG CTI' GTG CIG ACT CAA TCC CCC tct GCC TCT 90
Gly Sn- Phe Ser Gin Leu Val Leu Thr Gin Ser Pro Ser Ala Ser
1 5 10
GCC ICC CIG (XjA GCC ICC GTC AAG CTC ACC TGC ACC TIG AGT AGT 135
Ala Ser Leu Gly Ala Ser Val Lys Leu Thr Cys Thr Leu Ser Ser
15 20 25
CAG CAC AGT ACG TAC ACC ATI' GAA TGG ΤΛΤ CAG CAG CAG CCA GAG 180
Gin His Ser Tln- Tyr Thr lle Glu Trp Tyr G1 n Gin Gin Pro Glu
IO 35 40
AAG cgc (XT AAG IAC GIG ATG GAT CIT AAG CAA GAT GGA AGC CAC 225
Lys Gly Pro Lys Tyr Val Met. Asp Leu Lys G1 n Asp Gly Ser His
Ί5 50 55
AGC ACA ccr GAT (XXI ΑΊΤ ccr GAT CGC UČ TCA GGC TCC AGC TCT 270
Ser Tin- Gly Asp Gly 11e Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Ser Ser
GO 65 70
αχ; ccr gag cgc iac ctc acc atc tcc agc ne cag tct gag. gat 315 • φ • φ • · φ φ
180
Φ » · · » · · · · · • φ·· φ φφφφ φ φ φ φ φ φ φ · φφφφ φ· φφ ΦΦΦ φφ » · Φ <
► Φ Φ «
ΦΦΦ Φ Φ «
Φ 4
ΦΦ #·
Gly Ala Glu Arg Tyr Leu The Ile Ser Ser Leu Gin Ser Glu Asp
80 85
GAG GCT GAC TAT ATC TGT (XT GTG GGT GAT ACA ΑΤΓ AAG GAA CAA 360
Glu Ala Asp Tyr Ile Cys Gly Val Gly Asp Thr Ile Lys Glu Gin
95 100 TTT GTG TAC GTG TTC GGC GGA GGG ACC AAA CTG ACC GTC CTA GGC 405
Phe Val Tyr Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly
105 110 115
CAG CCC 411 rl„ p,·,.
(2) Informace pro SEQ ID NO: 74: (í) Charakteristika sekvence:
(A) Délka: 411 párů baží (B) Typ: nukleová kyselina (C) Řetězec: dvojitý (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: cDNA k mRNA
(ix) Popis sekv gnce: SEQ i: D N O: 74 •
ATG GCC TCG ACT GCT CTG rre rre TLC TIT GIT (ΊΤ CAT TGC TCA
Met Ala Trp Tin' Pro Leu Phe Phe Phe Phe Val Leu His Cys Ser
15 -10 -5
GGT TCT TTC TCG CAG CIT GTG CTG ACT CAA TCG CCC TCT GCC TCT
Gly Ser Phe Ser Gin Leu Val Leu Thr Gin Ser Pro Ser Ala Ser
10
GCC TCC CTG GGA GCC TCG GTC AAG CTC ACC TGC ACC 1TG AGT AGT
Ala Ser Leu Gly Ala Ser Val Lys Leu Thr Cys Thr Leu Ser Ser
15 20 25
CAG CAC AGT ACG TAC ACC ATI' GAA TGG TAT CAG CAG CAG CCA GAG
• to
181 i · to to « • · • · • toto • · · · to · <
• · « ···· ·· » · · · i ·· · φ · · · · ······ • · · · · • · ··· ·· ··
Gin His Ser Thr Tyr Thr Ile Glu Trp Tyr Gin Gin Gin Pro Glu
30 35 40
MG GGC CCT AGG TAC GTG ATG GAT CTI’ MG CM GAT GGA AGC CAC 225
Lys Gly Pro Arg Tyr Val Met Asp Leu Lys Gin Asp Gly Ser His
45 50 55
AGC ACA GGT GAT GGG ATT CCT GAT CGC TTC TCA GGC TCC AGC TCT 270
Ser Thr Gly Asp Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Ser Ser
60 65 70
GGG GCT GAG CGC TAC CTC ACC ATC TCC AGC CTC CAG TCT GAG GAT 315
Gly Ala Glu Arg 'lyr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gin Ser Glu Asp
75 80 85
GAG GCT CAC TAT ATC TGT GGT GTG GGT GAT ACA ATT AAG GM CM 360
Gin Ala Asp Tyr Ile Cys Gly Val Gly Asp Thr Ile Lys Glu Gin
90 95 100
TIT GTG TAC GTG TIC GGC GGA GGG ACC ΜΛ CTG ACC GTC CTA GGC 405
Plic Val Tyi Val Plic Gly Gly Gly Thr l.ys Leu Thr Val Leu Gly
105 110 115
CAG CCC Ί i 1
Gin Pro • · · · > · · · » · · · • 99 · · · • · • · · ·
182 (2) Informace pro SEQ ID NO: 75:
(i) Charakteristika sekvence:
(A) Délka: 34 aminokyselin (B) Typ: aminokyselinová (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: peptid (ix) Popis sekvence: SEQ ID NO: 75:

Claims (32)

1. Chimérický L řetězec obsahující C region L řetězce lidské protilátky a V region L řetězce myší monoklonální protilátky proti lidskému proteinu příbuznému s paratyroidálním hormonem.
2. Chimérický L řetězec podle nároku 1, kde V region L řetězce obsahuje aminokyselinovou sekvenci uvedenou v SEQ ID NO: 45.
3. Chimérický L řetězec podle nároku 1, kde C region je CÁ řetězec.
4. Chimérický H řetězec obsahující C region H řetězce lidské protilátky a V region H řetězce myší monoklonální protilátky proti lidskému proteinu příbuznému s paratyroidálním hormonem.
5. Chimérický H řetězec podle nároku 4, kde V region H řetězce obsahuje aminokyselinovou sekvenci uvedenou v SEQ ID NO: 46.
6. Chimérický H řetězec podle nároku 4, kde C region je Cyl řetězec.
7. Chimérická monoklonální protilátka proti lidskému proteinu příbuznému s paratyroidálním hormonem obsahující chimérický L řetězec podle jakéhokoliv z nároků 1 až 3 a chimérický H řetězec podle jakéhokoliv z nároků 4 až 6.
8. Polypeptid obsahující V region L řetězce humanizované protilátky obsahující regiony pracovních rámců 1 až 4 V regionu L řetězce lidské protilátky a komplementaritu určující regiony • 0 • 0 · ·
184
0 0 0 0 · 0 · 0 · · 00 0
0 0 000 0 00 000 000
0 0 0 0 0 0 0
0000 00000 00 00
1 až 3 V regionu L řetězce myší monoklonální protilátky proti lidskému proteinu příbuznému s paratyroidálním hormonem.
9. Polypeptid podle nároku 8, kde komplementaritu určující regiony 1 až 3 obsahují aminokyselinové sekvence uvedené v SEQ ID NO: 59 - 61, v příslušném pořadí.
10. Polypeptid podle nároku 8, kde uvedené regiony pracovních rámců 1 až 3 jsou odvozeny z regionů pracovních rámců 1 až 3 lidské protilátky HSU03868, v příslušném pořadí, a uvedený region pracovního rámce 4 je region pracovního rámce 4 lidské protilátky S25755.
11. Polypeptid podle nároku 8, kde uvedené regiony pracovních rámců 1 až 3 jsou v podstatě identické s regiony pracovních rámců 1 až 3 lidské protilátky HSU03868, v příslušném pořadí, a uvedený region pracovního rámce 4 je v podstatě identický s regionem pracovního rámce 4 lidské protilátky S25755.
12. Polypeptid podle nároku 8, ve kterém jsou aminokyseliny 36 a 49 regionů pracovních rámců podle Kabatovi definice tyrosin a kyselina asparagová, v příslušném pořadí.
13. Polypeptid podle nároku 12 obsahující aminokyselinovou sekvenci uvedenou v jakékoliv ze sekvencí SEQ ID NO: 48 - 51.
14. Polypeptid podle nároku 8, ve kterém jsou aminokyseliny 45 a 87 regionů pracovních rámců podle Kabatovi definice lysin a isoleucin, v příslušném pořadí.
15. Polypeptid podle nároku 14 obsahující aminokyselinovou sekvenci uvedenou v jakékoliv ze sekvencí SEQ ID NO: 52 - 55.
185 • 4 • · 4 · 4 • 444 · · 4 4 4 »4 · · 4 4 4 4
16. Polypeptid obsahující V region H řetězce humanizované protilátky obsahující regiony pracovních rámců 1 až 4 V regionu H řetězce lidské protilátky a komplementaritu určující regiony 1 až 3 V regionu H řetězce myší monoklonální protilátky proti lidskému proteinu příbuznému s paratyroidálním hormonem.
17. Polypeptid podle nároku 16, kde komplementaritu určující regiony 1 až 3 obsahují aminokyselinové sekvence uvedené v SEQ ID NO: 62 - 64, v příslušném pořadí.
18. Polypeptid podle nároku 16, kde uvedené regiony pracovních rámců 1 až 4 jsou odvozeny od regionů pracovních rámců 1 až 4 lidské protilátky náležící k lidské podskupině III.
19. Polypeptid podle nároku 16, kde uvedené regiony pracovních rámců 1 až 4 jsou odvozeny od regionů pracovních rámců 1 až 4 lidské protilátky S31679, v příslušném pořadí.
20. Polypeptid podle nároku 16, kde uvedené regiony pracovních rámců 1 až 4 jsou v podstatě identické s regiony pracovních rámců 1 až 4 lidské protilátky S31679, v příslušném pořadí.
21. Polypeptid obsahující V region H řetězce humanizované protilátky obsahující aminokyselinovou sekvenci uvedenou v SEQ ID NO: 56.
22. L řetězec humanizované protilátky proti lidskému proteinu příbuznému s paratyroidálním hormonem obsahující polypeptid obsahující C region L řetězce lidské protilátky a polypeptid podle jakéhokoliv z nároků 8 až 15.
23. L řetězec humanizované protilátky podle nároku 22, kde C region je C% řetězec, uvedené regiony pracovních rámců 1 až 3 • to ·· » · · • · to· toto «toto· to· ·« i ·« to i ·· · to « · · to · • · ·· ·«
186 jsou v podstatě identické s regiony pracovních rámců 1 až 3 lidské protilátky HSU03868, v příslušném pořadí, a uvedený region pracovního rámce 4 je v podstatě identický s regionem pracovního rámce 4 lidské protilátky S25755 a komplementaritu určující regiony 1 až 3 obsahují aminokyselinové sekvence uvedené v SEQ ID NO: 59 - 61, v příslušném pořadí.
24. H řetězec humanizované protilátky proti lidskému proteinu příbuznému s paratyroidálním hormonem obsahující polypeptid obsahující C region H řetězce lidské protilátky a polypeptid podle jakéhokoliv z nároků 16·až 21.
25. H řetězec humanizované protilátky podle nároku 24, kde C region je Ολί řetězec, uvedené regiony pracovních rámců 1 až 4 jsou odvozeny od regionů pracovních rámců 1 až 4 lidské protilátky HSGIII a komplementaritu určující regiony 1 až 3 obsahují aminokyselinové sekvence uvedené v SEQ ID NO: 62 - 64, v příslušném pořadí.
26. Humanizovaná protilátka proti lidskému proteinu příbuznému s paratyroidálním hormonem obsahující L řetězec humanizované protilátky podle nároků 22 nebo 23 a H řetězec humanizované protilátky podle nároků 24 nebo 25.
27. Protilátka proti lidskému proteinu příbuznému s paratyroidálním hormonem mající disociační konstantu 1,86 x 10'' (M) nebo nižší.
28. Protilátka proti lidskému proteinu příbuznému s paratyroidálním hormonem mající disociační rychlostní konstantu 1,22 x 10“1 (1/s) nebo nižší.
9 9 9
I · « » · · · ·
187
999 999
29. Protilátka proti lidskému proteinu příbuznému s paratyroidálním hormonem mající asociační rychlostní konstantu 6,55 x 104 (1/M.s) nebo vyšší.
30. Protilátka proti lidskému proteinu příbuznému s paratyroidálním hormonem mající disociační rychlostní konstantu 1,22 x 101 (1/s) nebo nižší a asociační rychlostní konstantu 6,55 x 104 (1/M.s) nebo vyšší.
31. Protilátka podle nároku 27, kde disociační konstanta je měřena sensorem povrchové plasmonové rezonance.
32. Protilátka podle nároku 28 nebo 30, kde disociační rychlostní konstanta je měřena sensorem povrchové plasmonové rezonance.
33. Protilátka podle nároku 29 nebo 30, kde asociační rychlostní konstanta je měřena sensorem povrchové plasmonové rezonance.
34. Protilátka podle nároku 27, kde disociační konstanta je 1, 02 x 10'11 až 1,86 x ΙΟ7 (M) • 35. Protilátka podle nároku 27, kde disociační konstanta je 1,02 x 10~10 až 1,86 x 10-8 (M) • 36. Protilátka podle nároku 27, kde disociační konstanta je 1,34 x 10'10 až 3,58 x 10_1(J (M) • 37 . Protilátka podle nároku 28, kde disociační rychlostní konstanta je 7,38 x 10 i 6 až 1, 22 x 10~x (1/s).
• · · ·
188 • · • · · ·· ···· 19 11 • 1 9 111
1911 · 19 1
1 11 111 111 11 11
9 1 111 11 9 9
38. Protilátka podle nároku 28, kde disociační rychlostní konstanta je 7, 38 χ 10‘5 až 1,22 χ 10“2 (1/s) . 39. Protilátka podle nároku 28, kde disociační rychlostní konstanta je 1, 66 χ 104 až 3,16 χ 10“4 (1/s) . 40. Protilátka podle nároku 28, kde disociační rychlostní konstanta je 2, 32 χ 10'4 (1/s) . 41. Protilátka podle nároku 29, kde asociační rychlostní konstanta je 6, 55 χ 104 až 1,24 χ 107 (1/M.s). 42. Protilátka podle nároku 29, kde asociační rychlostní konstanta je 6, 55 χ 105 až 1,24 χ 106 (1/M.s) . 43. Protilátka podle nároku 29, kde asociační rychlostní konstanta je 7, 23 χ 105 až 1,03 χ 106 (1/M.s). 44. Protilátka podle nároku 29, kde asociační rychlostní konstanta je 1, 03 χ 106 (1/M.s).
45. Protilátka proti lidskému proteinu příbuznému s paratyroidálním hormonem mající disociační rychlostní konstantu 2,32 χ 10“4 až 3,16 x 10“4 (1/s) a asociační rychlostní konstantu 0,883 χ 106 až 1,03 x 10e (1/M.s).
46. Protilátka podle jakéhokoliv z nároků 27 až 45, kde protilátka je lidská, humanizovaná, chimérická nebo primatizovaná protilátka.
47. DNA obsahující sekvenci baží kódující V region L řetězce myší monoklonální protilátky proti lidskému proteinu příbuznému s paratyroidálním hormonem.
189
44 4· ·♦ 4444 44 44
444 444 4444
4 444 4 4 444 4 4« 4
44 444 4 4» 444444
44444 4 4 4
4444 44 44 444 44 44
48. DNA podle nároku 47, kde V region L řetězce obsahuje aminokyselinovou sekvenci uvedenou v SEQ ID NO: 45.
49. DNA podle nároku 47, kde sekvence baží kódující V region L řetězce je uvedena v SEQ ID NO: 65.
50. DNA obsahující sekvenci baží kódující V region H řetězce myší monoklonální protilátky proti lidskému proteinu příbuznému s paratyroidálním hormonem.
51. DNA podle nároku 50, kde V region H řetězce obsahuje aminokyselinovou sekvenci uvedenou v SEQ ID NO: 46.
52. DNA podle nároku 50, kde sekvence baží kódující V region H řetězce je uvedena v SEQ ID NO: 57.
53. DNA kódující chimérický L řetězec podle jakéhokoliv z nároků 1 až 3.
54. DNA podle nároku 53, kde DNA kódující chimérický L řetězec obsahuje sekvenci baží uvedenou v SEQ ID NO: 65.
55. DNA kódující chimérický H řetězec podle jakéhokoliv z nároků 4 až 6.
56. DNA podle nároku 55, kde DNA kódující chimérický H řetězec obsahuje sekvenci baží uvedenou v SEQ ID NO: 57.
57. DNA obsahující sekvenci baží kódující polypeptid podle jakéhokoliv z nároků 8 až 15.
• * • ··♦ • · ·
190 ·· ·· ♦ · · • ··· • · · • · ·
58. DNA podle nároku 57 obsahující obsahující sekvenci baží uvedenou v jakékoliv ze SEQ ID NO: 66-74.
59. DNA obsahující sekvenci baží kódující polypeptid podle jakéhokoliv z nároků 16 až 21.
60. DNA podle nároku 59 obsahující obsahující sekvenci baží uvedenou v SEQ ID NO: 58.
61. DNA kódující L řetězec humanizované protilátky podle nároků 22 nebo 23.
62. DNA pro L řetězec humanizované protilátky obsahující sekvenci baží kódující aminokyselinovou sekvenci uvedenou v jakékoliv ze SEQ ID NO: 47-55.
63. DNA podle nároku 62, kde DNA pro L řetězec humanizované protilátky obsahuje sekvenci bázi jak je uvedena v jakékoliv ze SEQ ID NO: 66-74.
64. DNA kódující H řetězec humanizované protilátky podle nároků 24 nebo 25.
65. DNA pro H řetězec humanizované protilátky obsahující sekvenci bázi kódující aminokyselinovou sekvenci uvedenou v SEQ ID NO: 56.
66. DNA podle nároku 65, kde DNA pro H řetězec humanizované protilátky obsahuje sekvenci baží jak je uvedena v SEQ ID NO: 58.
67. Rekombinantní vektor obsahující DNA podle jakéhokoliv z nároků 47-66.
*· ·· ·* ··*· ·· ·· • · * · · · · · · · • 999 9 9 999 9 9 9 9 • · ··· 9 99 999999
9 9 9 9 9 9 9 9
9999 99 99 999 99 99 vektorem podle proti lidskému
191
68. Transformant transformovaný rekombinantním nároku 67.
69. Způsob pro přípravu chimérické protilátky proteinu příbuznému s paratyroidálním hormonem vyznačující se tím, že obsahuje kultivaci transformantu transformovaného expresním vektorem obsahujícím DNA podle jakéhokoliv z nároků 47 až 49, 53 a 54 a expresním vektorem obsahujícím DNA podle jakéhokoliv z nároků 50 až 52, 55 a 56 a získání chimérické protilátky proti lidskému proteinu příbuznému s paratyroidálním hormonem z výsledné kultury.
70. Způsob pro přípravu humanizované protilátky proti lidskému proteinu příbuznému s paratyroidálním hormonem vyznačující se tím, že obsahuje kultivaci transformantu transformovaného expresním vektorem obsahujícím DNA podle jakéhokoliv z nároků 57, 58 a 61 až 63 a expresním vektorem obsahujícím DNA podle jakéhokoliv z nároků 59, 60 a 64 až 65 a získání humanizované protilátky proti lidskému proteinu příbuznému s paratyroidálním hormonem z výsledné kultury.
71. Farmaceutický prostředek vyznačující se tím, že obsahuje humanizovanou protilátku proti lidskému proteinu příbuznému s paratyroidálním hormonem jako účinnou složku.
72. Činidlo pro potlačení hyperkalcemie vyznačuj ící se t í m, že obsahuje humanizovanou protilátku proti lidskému proteinu příbuznému s paratyroidálním hormonem jako účinnou složku.
73. Činidlo pro potlačení hyperkalcemie spojené s maligním nádorem vyznačující se tím, že obsahuje
192 »· 0000 00 00 * · · 0 0 0 0
0 0000 0 00 0
00 00 000 000 • •0 00 •0 000 00 0» humanizovanou protilátku proti lidskému proteinu příbuznému s paratyroidálním hormonem jako účinnou složku.
74. Činidlo pro potlačení hyperkalcemie podle nároku 73 vyznačující se tím, že maligní nádor je vybrán ze skupiny skládající se z nádorů slinivky břišní, plic, hltanu, hrtanu, jazyka, dásně, jícnu, žaludku, žlučových cest, prsu, ledvin, močového měchýře, dělohy a prostaty a maligních lymfomů.
75. Farmaceutický prostředek vyznačující se tím, že obsahuje protilátku podle jakéhokoliv z nároků 27 až 46 jako účinnou složku.
76. Činidlo pro potlačení hyperkalcemie vyznačuj ící se t i m, že obsahuje protilátku podle jakéhokoliv z nároků 27 až 46 jako účinnou složku.
77. Činidlo pro potlačení hyperkalcemie spojené s maligním nádorem vyznačující se tím, že obsahuje protilátku podle jakéhokoliv z nároků 27 až 46 jako účinnou složku.
78; Činidlo pro potlačení hyperkalcemie podle nároku 77 vyznačující se tím, že maligní nádor je vybrán ze skupiny skládající se z nádorů slinivky břišní, plic, hltanu, hrtanu, jazyka, dásně, jícnu, žaludku, žlučových cest, prsu, ledvin, močového měchýře, dělohy a prostaty a maligních lymfomů.
79. Činidlo pro zlepšení hypofosfatemie vyznačuj ící se t i m, že obsahuje humanizovanou protilátku proti lidskému
193
44 »· ·4 44»· ·4 44 • · · * 4 4 · · « ·
444« 4 4444 4 4» 4
4 ’ · 444 4 44 444 444
44444 4 4 4 • 444 4« «4 ··· «4 44 proteinu příbuznému s paratyroidálním hormonem jako účinnou složku.
80. Činidlo pro zlepšení hypofosfatemie podle nároku 79 vyznačující se tím, že hypofosfatemie je hypofosfatemická rachitis.
81. Činidlo pro zlepšení hypofosfatemie podle nároku 79 vyznačující se t ím, že hypofosfatemie je hypofosfatemická vitamin D-resistentní rachitis.
82. Činidlo pro zlepšení hypofosfatemie vyznačuj ící se t í m, že obsahuje protilátku podle jakéhokoliv z nároků 27 až 46 jako účinnou složku.
83. Činidlo pro zlepšení hypofosfatemie podle nároku 82 vyznačující se tím, že hypofosfatemie je hypofosfatemická rachitis.
84. Činidlo pro zlepšení hypofosfatemie podle nároku 82 vyznačující se tím, že hypofosfatemie je hypofosfatemická vitamin D-resistentní rachitis.
CZ991062A 1996-09-26 1997-09-24 Protilátky proti proteinu příbuznému s lidským parathyroidálním hormonem CZ106299A3 (cs)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP25519696 1996-09-26
JP21416897 1997-07-24
PCT/JP1997/003382 WO1998013388A1 (fr) 1996-09-26 1997-09-24 Anticorps contre les peptides lies a la parathormone humaine

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CZ106299A3 true CZ106299A3 (cs) 1999-08-11

Family

ID=26520176

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CZ991062A CZ106299A3 (cs) 1996-09-26 1997-09-24 Protilátky proti proteinu příbuznému s lidským parathyroidálním hormonem

Country Status (16)

Country Link
US (3) US6903194B1 (cs)
EP (1) EP0962467A4 (cs)
KR (1) KR100847441B1 (cs)
CN (1) CN100335501C (cs)
AU (1) AU744146B2 (cs)
BR (1) BR9713294A (cs)
CA (1) CA2266332C (cs)
CZ (1) CZ106299A3 (cs)
HU (1) HUP9904177A3 (cs)
IL (1) IL129164A (cs)
NO (1) NO991449L (cs)
RU (1) RU2198220C2 (cs)
SK (1) SK40599A3 (cs)
TR (1) TR199900666T2 (cs)
TW (1) TW509697B (cs)
WO (1) WO1998013388A1 (cs)

Families Citing this family (108)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CZ106299A3 (cs) 1996-09-26 1999-08-11 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Protilátky proti proteinu příbuznému s lidským parathyroidálním hormonem
IL132896A0 (en) 1997-05-15 2001-03-19 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Cachexia remedy
HK1039454B (zh) * 1998-06-26 2005-10-21 中外制药株式会社 高钙血症危象治疗剂
EP1176194B1 (en) * 1999-05-10 2005-07-20 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Method of cell cultivation
TWI255718B (en) * 1999-07-02 2006-06-01 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Ameliorative agent for low vasopressin concentration
EP1197225A4 (en) * 1999-07-02 2006-02-22 Chugai Pharmaceutical Co Ltd AGENTS FOR DISEASES CAUSED BY PTH OR PTHrH
HK1046235A1 (en) * 1999-07-06 2003-01-03 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Remedies for drug-resistant hypercalcemia
IL148980A0 (en) 1999-10-01 2002-11-10 Chugai Pharmaceutical Co Ltd An antibody to human tissue factor and experimental animals having inserted cells with the gene encoding human tissue factor
US20030124119A1 (en) * 1999-12-28 2003-07-03 Tadao Yamazaki Stable antibody compositions and injection preparations
WO2001054725A1 (fr) * 2000-01-25 2001-08-02 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Remèdes et agents prophylactiques pour maladies dentaires
WO2001064249A1 (en) * 2000-02-28 2001-09-07 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Tissue decomposition inhibitor
ATE420661T1 (de) * 2000-04-28 2009-01-15 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Zellproliferation-inhibitoren
JP5485489B2 (ja) 2000-08-11 2014-05-07 中外製薬株式会社 抗体含有安定化製剤
US20040067231A1 (en) * 2000-08-16 2004-04-08 Hideki Yoshikawa Agents for ameliorating symtoms caused by joint diseases
US20060063152A1 (en) 2000-12-22 2006-03-23 Osamu Ohara Novel gene and protein encoded by the gene
WO2002072615A1 (fr) * 2001-03-09 2002-09-19 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Methode de purification de proteines
US20040213788A1 (en) * 2001-05-18 2004-10-28 Sweet Raymond W. Anti-rank ligand monoclonal antibodies useful in treatment of rank ligand mediated disorders
EP1440412A2 (en) * 2001-11-02 2004-07-28 Siemens Medical Solutions USA, Inc. Patient data mining for cardiology screening
US8949082B2 (en) 2001-11-02 2015-02-03 Siemens Medical Solutions Usa, Inc. Healthcare information technology system for predicting or preventing readmissions
US7457731B2 (en) 2001-12-14 2008-11-25 Siemens Medical Solutions Usa, Inc. Early detection of disease outbreak using electronic patient data to reduce public health threat from bio-terrorism
EP1475100B1 (en) 2002-02-14 2015-05-06 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Use of acetic acid for suppressing Fe ion induced problems in formulations of anti-HM1.24 or anti-IL6R antibodies
FR2841788B1 (fr) * 2002-07-05 2006-01-27 Univ Pasteur Utilisation d'antagonistes de la pthrp pour traiter le carcinome a cellules renales
EP1541165A4 (en) 2002-08-27 2009-06-24 Chugai Pharmaceutical Co Ltd METHOD FOR STABILIZING PROTEIN PREPARATION
WO2004022595A1 (ja) 2002-09-04 2004-03-18 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha MRL/lprマウスを用いた抗体の作製
US7680086B2 (en) * 2002-09-09 2010-03-16 Siemens Canada Limited Wireless local area network with clients having extended freedom of movement
US8420789B2 (en) 2002-09-11 2013-04-16 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Method for removing DNA contaminants from a protein-containing sample
ES2648046T3 (es) * 2002-11-12 2017-12-28 The Brigham And Women's Hospital, Inc. Vacuna de polisacárido para infecciones estafilocócicas
US7794711B2 (en) * 2002-11-18 2010-09-14 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Agent for treating chondroma and chondrosarcoma
US20080153104A1 (en) 2003-08-08 2008-06-26 Hiroyuki Aburantai Gene Overexpressed in Cancer
CN101001874B (zh) 2004-04-21 2012-12-19 布赖汉姆妇女医院 聚-n-乙酰葡萄糖胺(pnag/dpnag)结合肽及其应用方法
NZ579543A (en) 2004-07-09 2011-07-29 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Anti-glypican 3 antibody
KR101374454B1 (ko) 2005-03-31 2014-03-17 추가이 세이야쿠 가부시키가이샤 회합제어에 의한 폴리펩티드 제조방법
US20080275731A1 (en) * 2005-05-18 2008-11-06 Rao R Bharat Patient data mining improvements
EP1900814A4 (en) 2005-06-10 2010-07-21 Chugai Pharmaceutical Co Ltd SCREED SC (FV) 2-MUTANTE
CN101262885B (zh) 2005-06-10 2015-04-01 中外制药株式会社 含有sc(Fv)2的药物组合物
CN101237890A (zh) * 2005-06-10 2008-08-06 中外制药株式会社 含有葡甲胺的蛋白质制剂的稳定剂及其利用
JP2008546716A (ja) * 2005-06-17 2008-12-25 バイオジェン・アイデック・エムエイ・インコーポレイテッド 抗ＧＦＲα３抗体
EP1945772B1 (en) * 2005-10-06 2015-11-18 Advanced Accelerator Applications S.A. Novel selection system
WO2007046439A1 (ja) 2005-10-18 2007-04-26 National Institute Of Agrobiological Sciences 抗体を産生するトランスジェニックカイコとその製造方法
DOP2006000277A (es) 2005-12-12 2007-08-31 Bayer Pharmaceuticals Corp Anticuerpos anti mn y métodos para su utilización
WO2007074880A1 (ja) 2005-12-28 2007-07-05 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha 抗体含有安定化製剤
JP5624276B2 (ja) 2006-03-31 2014-11-12 中外製薬株式会社 抗体の血中動態を制御する方法
EP4218801A3 (en) 2006-03-31 2023-08-23 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Antibody modification method for purifying bispecific antibody
US20090220524A1 (en) 2006-04-25 2009-09-03 The University Of Tokyo Therapeutic agents for alzheimer's disease and cancer
US20100040600A1 (en) 2006-06-14 2010-02-18 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Agents for Promoting the Growth of Hematopoietic Stem Cells
WO2008047914A1 (fr) 2006-10-20 2008-04-24 Forerunner Pharma Research Co., Ltd. Agent anticancéreux comprenant un anticorps anti-hb-egf en tant qu'ingrédient actif
CA2666559A1 (en) 2006-10-20 2008-04-24 Forerunner Pharma Research Co., Ltd. Pharmaceutical composition comprising anti-hb-egf antibody as active ingredient
ATE504647T1 (de) 2007-01-30 2011-04-15 Forerunner Pharma Res Co Ltd Chimärer fc gamma rezeptor und verfahren zur bestimmung von adcc-aktivität unter verwendung des rezeptors
US8501929B2 (en) * 2007-08-17 2013-08-06 Biochrom Pharma Inc. PTHrP, its isoforms and antagonist thereto in the diagnosis and treatment of disease
US7897139B2 (en) * 2007-08-17 2011-03-01 Biochrom Pharma, Inc. PTHrP, its isoforms and antagonist thereto in the diagnosis and treatment of disease
HUE029635T2 (en) 2007-09-26 2017-03-28 Chugai Pharmaceutical Co Ltd A method for modifying an isoelectric point of an antibody by amino acid substitution in CDR
EP2196541B1 (en) 2007-09-28 2012-11-07 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Anti-glypican-3 antibody having improved kinetics in plasma
BRPI0821110B8 (pt) 2007-12-05 2021-05-25 Chugai Pharmaceutical Co Ltd anticorpo de neutralização de anti-nr10/il31ra, composição farmacêutica compreendendo o referido anticorpo e uso do mesmo
PE20091174A1 (es) 2007-12-27 2009-08-03 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Formulacion liquida con contenido de alta concentracion de anticuerpo
TWI564021B (zh) 2008-04-11 2017-01-01 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Repeated binding of antigen to antigen binding molecules
EP3312158A1 (en) 2008-07-21 2018-04-25 The Brigham and Women's Hospital, Inc. Methods and compositions relating to synthetic beta-1,6 glucosamine oligosaccharides
WO2010055950A1 (ja) 2008-11-17 2010-05-20 財団法人ヒューマンサイエンス振興財団 癌間質の構成因子に対して特異的結合能を有する物質と抗腫瘍性化合物との複合体による新規の癌ターゲティング治療
JP2010210772A (ja) 2009-03-13 2010-09-24 Dainippon Screen Mfg Co Ltd 液晶表示装置の製造方法
SG176074A1 (en) 2009-05-15 2011-12-29 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Anti-axl antibody
EP2468771A4 (en) 2009-08-17 2013-06-05 Forerunner Pharma Res Co Ltd PHARMACEUTICAL COMPOSITION WITH AN ANTIBODY TO HB-EGF AS AN ACTIVE SUBSTANCE
US8751495B2 (en) * 2009-09-29 2014-06-10 Siemens Medical Solutions Usa, Inc. Automated patient/document identification and categorization for medical data
AR080428A1 (es) 2010-01-20 2012-04-11 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Formulaciones liquidas estabilizadas contentivas de anticuerpos
US20110184761A1 (en) * 2010-01-25 2011-07-28 Siemens Medical Solutions Usa, Inc. Method and Apparatus for Estimating Patient Populations
EP4501956A2 (en) 2010-03-30 2025-02-05 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Antigen-binding molecules that promote antigen clearance
TWI667257B (zh) 2010-03-30 2019-08-01 中外製藥股份有限公司 促進抗原消失之具有經修飾的ＦｃＲｎ親和力之抗體
US10943676B2 (en) 2010-06-08 2021-03-09 Cerner Innovation, Inc. Healthcare information technology system for predicting or preventing readmissions
MX344595B (es) * 2010-12-31 2016-12-20 Bioatla Llc Humanizacion rapida de anticuerpos.
CA2823913C (en) 2011-01-10 2023-10-03 The Regents Of The University Of Michigan Stem cell factor inhibitor
US20150018408A1 (en) 2013-07-10 2015-01-15 The Regents Of The University Of Michigan Therapeutic antibodies and uses thereof
EP2735315B1 (en) 2011-07-19 2019-10-02 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Stable protein-containing preparation containing argininamide or valinamide
MY182178A (en) 2011-09-01 2021-01-18 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Method for preparing a composition comprising highly concentrated antibodies by ultrafiltration
WO2013035824A1 (ja) 2011-09-07 2013-03-14 ファーマロジカルズ・リサーチ プライベート リミテッド 癌幹細胞の分離
TW201817744A (zh) 2011-09-30 2018-05-16 日商中外製藥股份有限公司 具有促進抗原清除之ＦｃＲｎ結合域的治療性抗原結合分子
WO2013047748A1 (ja) 2011-09-30 2013-04-04 中外製薬株式会社 複数の生理活性を有する抗原の消失を促進する抗原結合分子
EP3603671A3 (en) 2011-10-28 2020-07-29 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Cancer stem cell-specific molecule
WO2013065708A1 (ja) 2011-10-31 2013-05-10 中外製薬株式会社 重鎖と軽鎖の会合が制御された抗原結合分子
AU2013253581B2 (en) 2012-04-23 2019-05-16 Genefrontier Corporation Anti-human CD69 antibody, and use thereof for medical purposes
US10689705B2 (en) 2012-09-27 2020-06-23 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha FGFR3 fusion gene and pharmaceutical drug targeting same
US10318635B2 (en) 2012-09-28 2019-06-11 Cerner Innovation, Inc. Automated mapping of service codes in healthcare systems
US10565315B2 (en) 2012-09-28 2020-02-18 Cerner Innovation, Inc. Automated mapping of service codes in healthcare systems
US10403391B2 (en) 2012-09-28 2019-09-03 Cerner Health Services, Inc. Automated mapping of service codes in healthcare systems
EP3473718A1 (en) 2012-11-09 2019-04-24 GeneFrontier Corporation Anti-adam28 antibody for treating cancer
US10540448B2 (en) 2013-07-15 2020-01-21 Cerner Innovation, Inc. Gap in care determination using a generic repository for healthcare
SG10201803449VA (en) 2013-09-27 2018-05-30 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Method for producing polypeptide heteromultimer
RS65724B1 (sr) 2013-10-15 2024-08-30 Genefrontier Corp Humano antitelo protiv adamts vrste tipa agrekanaze za terapeutike bolesti povezanih sa agrekanazom
TW201609093A (zh) 2013-12-27 2016-03-16 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Ｆｇｆｒ門控蛋白變異基因及以其爲標的之醫藥
AU2014370873B2 (en) 2013-12-27 2020-06-11 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Method for purifying antibody having low isoelectric point
SG10201808565QA (en) 2014-03-31 2018-11-29 Debiopharm Int Sa Fgfr fusions
US20170362304A1 (en) 2014-08-20 2017-12-21 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Method for measuring viscosity of protein solution
MA40764A (fr) 2014-09-26 2017-08-01 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Agent thérapeutique induisant une cytotoxicité
EP3816179A3 (en) 2015-02-05 2021-08-04 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Fc region variant comprising a modified fcrn-binding domain
KR20250016474A (ko) 2015-09-18 2025-02-03 추가이 세이야쿠 가부시키가이샤 Il-8에 결합하는 항체 및 그의 사용
HUE070521T2 (hu) 2015-10-08 2025-06-28 Zymeworks Bc Inc Kappa és lambda könnyû láncokat tartalmazó antigénkötõ polipeptid szerkezetek és azok felhasználása
CN111201244A (zh) 2017-10-12 2020-05-26 学校法人庆应义塾 特异性结合到水通道蛋白3(aqp3)的细胞外域的抗aqp3单克隆抗体及其用途
WO2019225568A1 (ja) 2018-05-21 2019-11-28 中外製薬株式会社 ガラス容器に封入された凍結乾燥製剤
EP3805112A4 (en) 2018-05-28 2022-03-09 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Filling nozzle
CN112368383A (zh) 2018-05-31 2021-02-12 盐野义制药株式会社 Nav1.7单克隆抗体
KR20210108996A (ko) 2018-12-27 2021-09-03 시오노기세이야쿠가부시키가이샤 신규 항 ccr8 항체
WO2020163512A1 (en) 2019-02-05 2020-08-13 The Brigham And Women's Hospital, Inc. Polysaccharide compositions for use in treating filariasis
WO2020213084A1 (en) 2019-04-17 2020-10-22 Keio University Anti aqp3 monoclonal antibody specifically binding to extracellular domain of aquaporin 3 (aqp3) and use thereof
EP4173636A4 (en) 2020-06-30 2024-08-28 Shionogi & Co., Ltd Combined use of anti-ccr8 antibody and chemotherapeutic agent
WO2023058723A1 (ja) 2021-10-08 2023-04-13 中外製薬株式会社 プレフィルドシリンジ製剤の調製方法
TWI867354B (zh) 2021-11-01 2024-12-21 日商塩野義製藥股份有限公司 新穎Nav1.7單株抗體
CN115466331B (zh) 2021-11-18 2023-05-30 合源生物科技(天津)有限公司 靶向bcma的嵌合抗原受体及其应用
AU2023262861A1 (en) 2022-04-26 2024-11-07 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Pharmaceutical-preparation-containing syringe equipped with filter
WO2023234406A1 (ja) 2022-06-03 2023-12-07 塩野義製薬株式会社 カンナビノイド１型受容体に結合する抗体
CN115109161B (zh) * 2022-06-28 2023-08-11 广东赛尔生物科技有限公司 含有间充质干细胞的减肥药物组合物
IL321344A (en) * 2022-12-05 2025-08-01 Biogate Prec Medicine Corp Recombinant antibody, preparation containing it and uses thereof for cancer treatment

Family Cites Families (47)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4816567A (en) * 1983-04-08 1989-03-28 Genentech, Inc. Recombinant immunoglobin preparations
US5618920A (en) * 1985-11-01 1997-04-08 Xoma Corporation Modular assembly of antibody genes, antibodies prepared thereby and use
JP2598801B2 (ja) * 1986-07-18 1997-04-09 ザ ユニバーシティー オブ メルボルン 悪性‐ＰＴＨｒＰの液性過カルシウム血症において活性なタンパク
US5001223A (en) 1987-05-26 1991-03-19 Merck & Co., Inc. Parathyroid hormone antagonists with enhanced metabolic properties
US4771124A (en) 1987-05-26 1988-09-13 Merck & Co., Inc. Parathyroid hormone antagonists with simplified synthetic methodology
EP0293130A3 (en) 1987-05-26 1990-06-13 Merck & Co. Inc. Dimers of parathyroid hormone antagonists
EP0293158A3 (en) 1987-05-26 1990-05-09 Merck & Co. Inc. Parathyroid hormone antagonists
DE68908175T2 (de) 1988-05-27 1994-03-03 Centocor Inc Gefriergetrocknete formulierung für antikörperprodukte.
EP0417191B1 (en) 1988-05-27 1993-03-10 Centocor, Inc. Formulation for antibody reagents
IL162181A (en) 1988-12-28 2006-04-10 Pdl Biopharma Inc A method of producing humanized immunoglubulin, and polynucleotides encoding the same
US5530101A (en) * 1988-12-28 1996-06-25 Protein Design Labs, Inc. Humanized immunoglobulins
US5217896A (en) 1988-12-30 1993-06-08 Oncogene Science, Inc. Monoclonal antibodies recognizing parathyroid hormone-like protein
JPH02207099A (ja) 1989-02-07 1990-08-16 Tonen Corp ＰＴＨｒＰ関連ペプチド、その製造法及び用途
CA2035179C (en) 1990-01-31 2001-08-14 Gerald S. Brenner Pharmaceutical compositions containing insoluble salts of bisphosphonic acids
GB9009548D0 (en) 1990-04-27 1990-06-20 Celltech Ltd Chimeric antibody and method
JPH04228089A (ja) 1990-05-15 1992-08-18 Kanegafuchi Chem Ind Co Ltd 高カルシウム血症治療・予防剤
CA2087190A1 (en) 1990-07-13 1992-01-14 Fred E. Cohen Parathyroid hormone analogues modified at positions
DE4034612A1 (de) * 1990-10-31 1992-05-07 Huels Chemische Werke Ag Verfahren zur herstellung von methacryloxy- oder acryloxygruppen enthaltenden organosilanen
ATE287898T1 (de) 1991-04-05 2005-02-15 Gen Hospital Corp Parathyroid-hormon-rezeptor und seine kodierende dna
TW205553B (cs) 1991-04-25 1993-05-11 Chugai Pharmaceutical Co Ltd
DE4137744C2 (de) * 1991-11-15 1996-10-31 Kuesters Eduard Maschf Verfahren zum Herstellen eines Schichtwerkstoffs unter Wiederverwendung von Kunststoffabfällen und eigensteifer, Kunstsoffabfälle enthaltender Schichtwerkstoff
KR100240159B1 (ko) 1991-12-20 2000-01-15 킨 캐리 당단백질 gpiib/iiia와 반응성인 사람화된 면역글로불린
US5993617A (en) 1991-12-26 1999-11-30 Asahi Glass Company Ltd. Functional product
US5648267A (en) 1992-11-13 1997-07-15 Idec Pharmaceuticals Corporation Impaired dominant selectable marker sequence and intronic insertion strategies for enhancement of expression of gene product and expression vector systems comprising same
US5849695A (en) 1993-01-13 1998-12-15 The Regents Of The University Of California Parathyroid hormone analogues useful for treatment of osteoporosis and disorders of calcium meatabolism in mammals
JP3504697B2 (ja) 1993-09-30 2004-03-08 株式会社先端生命科学研究所 ＰＴＨｒＰアンタゴニスト活性を有するポリペプチド及びそれを含むカルシウム代謝治療薬
JPH07316195A (ja) 1994-05-25 1995-12-05 Nippon Kayaku Co Ltd 新規なＰＴＨｒＰ関連ペプチド及びその用途
CO4410206A1 (es) 1994-07-28 1997-01-09 Sandoz Ag DERIVADOS DE PTH o PTHrP, SU PREPARACION Y COMPOSICIONES FARMACEUTICAS QUE LAS COMPRENDEN
US5626845A (en) 1995-01-23 1997-05-06 Xenotech Incorporated Method to ameliorate osteolysis and metastasis
US5993817A (en) 1995-01-23 1999-11-30 Xenotech Method to ameliorate osteolysis and metastasis
PT813423E (pt) * 1995-01-23 2002-11-29 Xenotech Inc Composicao para inibir osteolise e metastese
US6787518B1 (en) 1995-02-20 2004-09-07 Yukio Kato Therapeutics of osteoarthritis and inflammatory joint disease
CA2214341A1 (en) 1995-03-01 1996-09-06 Creative Biomolecules, Inc. Morphogen-induced dentine regeneration
KR100654645B1 (ko) 1995-04-27 2007-04-04 아브게닉스, 인크. 면역화된 제노마우스 유래의 인간 항체
US5660826A (en) 1995-06-06 1997-08-26 The Regents Of The University Of California Therapeutic sepsis treatment using antagonists to PTHrP
EP0871883A1 (en) 1995-07-20 1998-10-21 Icn Pharmaceuticals Compounds and methods related to parathyroid hormone-like protein
DE69713485T2 (de) 1996-02-01 2003-01-30 Chugai Seiyaku K.K., Tokio/Tokyo Medikamente für die Behandlung oder Vorbeugung von Thrombocytopenie
AU734090B2 (en) 1996-09-10 2001-06-07 Millennium Pharmaceuticals, Inc. CXCR3 chemokine receptor, antibodies, nucleic acids, and methods of use
CZ106299A3 (cs) 1996-09-26 1999-08-11 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Protilátky proti proteinu příbuznému s lidským parathyroidálním hormonem
JP4228089B2 (ja) 1997-03-11 2009-02-25 株式会社ニコン 過電流検知機構およびそれを用いた電子閃光装置
IL132896A0 (en) 1997-05-15 2001-03-19 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Cachexia remedy
JP4372240B2 (ja) 1997-05-15 2009-11-25 中外製薬株式会社 悪液質治療剤
JP3791863B2 (ja) 1997-07-04 2006-06-28 株式会社フジタ 鉄筋コンクリート系建物の制震構造
JP4414494B2 (ja) 1998-02-03 2010-02-10 旭化成ファーマ株式会社 白血球減少症の予防剤および治療剤
PL344645A1 (en) 1998-05-05 2001-11-19 Sod Conseils Rech Applic Pth2 receptor selective compounds
JP2000080100A (ja) 1998-06-17 2000-03-21 Japan Tobacco Inc 副甲状腺ホルモン関連タンパクに対するヒトモノクローナル抗体
HK1039454B (zh) 1998-06-26 2005-10-21 中外制药株式会社 高钙血症危象治疗剂

Also Published As

Publication number Publication date
CA2266332C (en) 2012-01-03
WO1998013388A1 (fr) 1998-04-02
TW509697B (en) 2002-11-11
US7842790B2 (en) 2010-11-30
US7358355B2 (en) 2008-04-15
SK40599A3 (en) 2000-06-12
AU4397297A (en) 1998-04-17
RU2198220C2 (ru) 2003-02-10
HUP9904177A2 (hu) 2000-03-28
IL129164A (en) 2007-05-15
AU744146B2 (en) 2002-02-14
KR100847441B1 (ko) 2008-07-21
BR9713294A (pt) 2000-10-17
HK1096974A1 (en) 2007-06-15
NO991449L (no) 1999-05-25
US20080095772A1 (en) 2008-04-24
US6903194B1 (en) 2005-06-07
NO991449D0 (no) 1999-03-25
US20050136057A1 (en) 2005-06-23
IL129164A0 (en) 2000-02-17
TR199900666T2 (xx) 1999-06-21
CN100335501C (zh) 2007-09-05
KR20060006981A (ko) 2006-01-20
EP0962467A1 (en) 1999-12-08
CA2266332A1 (en) 1998-04-02
EP0962467A4 (en) 2002-10-30
HUP9904177A3 (en) 2001-10-29
CN1237983A (zh) 1999-12-08

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CZ106299A3 (cs) Protilátky proti proteinu příbuznému s lidským parathyroidálním hormonem
EP1004313B1 (en) Cachexia remedy
EP1254666A1 (en) Stable antibody compositions and injection preparations
AU753131B2 (en) Remedies for hypercalcemic crisis
JP3416035B2 (ja) ヒト副甲状腺ホルモン関連ペプチドに対する抗体
RU2322453C2 (ru) Антитела против белка, родственного паращитовидному гормону человека
US7655227B1 (en) Agents for ameliorating low vasopressin level
JP4078164B2 (ja) ヒト副甲状腺ホルモン関連ペプチドに対する抗体
EP1312378A1 (en) Agents for ameliorating symptoms caused by joint diseases
HK1023351A (en) Antibody against human parathormone related peptides
AU3824702A (en) Antibody against human parathormone related peptides
HK1035857A (en) Remedies for hypercalcemic crisis
PL190351B1 (pl) Chimeryczny łańcuch L, chimeryczny łańcuch H, chimeryczne przeciwciało monoklonalne, polipeptyd, łańcuch L humanizowanego przeciwciała, łańcuch H humanizowanego przeciwciała, humanizowane przeciwciało, DNA, rekombinowany wektor, komórka gospodarza, sposób wytwarzania przeciwciała chimerycznego, sposób wytwarzania przeciwciała humanizowanego, kompozycja farmaceutyczna, czynnik
HK1096974B (en) Antibody against human parathormone related peptides
EP1195164A1 (en) Remedies for drug-resistant hypercalcemia
CZ398499A3 (cs) Léčivo proti kachexii

Legal Events

Date Code Title Description
PD00 Pending as of 2000-06-30 in czech republic