KR100508338B1

KR100508338B1 - 악액질 치료제

Info

Publication number: KR100508338B1
Application number: KR10-1999-7010572A
Authority: KR
Inventors: 사토코; 쓰네나리도시아키; 이시이기미에
Original assignee: 츄가이 세이야꾸 가부시키가이샤
Priority date: 1997-05-15
Filing date: 1998-05-13
Publication date: 2005-08-17
Also published as: WO1998051329A1; TR199902800T2; ES2285769T3; EP1004313A1; EP1004313A4; ATE361099T1; US7468184B2; UA74130C2; PL193575B1; SK155799A3; DE69837707D1; PL336797A1; AU750021C; CN1255858A; BR9809629A; EP1004313B1; AU7236998A; US20020165363A1; CN1329080C; TWI227140B

Abstract

부갑상선 호르몬 관련 펩티드와 그 수용체와의 결합을 저해하는 물질을 유효성분으로 함유하는 악액질 치료제.

Description

악액질 치료제{Cachexia Remedy}

본 발명은 부갑상선 호르몬 관련 펩티드(parathyroid hormone related protein(PTHrP))와 그 수용체와의 결합을 저해하는 물질을 유효성분으로 함유하는 악액질(cachexia) 치료제에 관한 것이다.

말기 암환자에게 나타나는 악액질은 악성종양의 수반성증후군 중 하나로서, 식욕부진, 체중감소, 빈혈, 수전해질의 이상, 면역이상 등을 주증상으로 하는 전신상태의 불량을 초래한다. 암환자에 있어 악액질의 발병은 생명을 위협하는 종말기증상을 초래할 뿐 아니라, 환자의 QOL(quality of life)를 현저히 해치며, 환자자신은 물론, 가족이나 주위사람들에게 강한 정신적, 신체적, 사회적 영향을 미친다.

최근 암악액질의 원인물질로 여겨져 왔던 카켁틴(cachectin)이 종양괴사인자(TNF)와 동일인자임이 밝혀졌다. 그 후 인터루킨1(interleukin(IL-1)) 이나 IL-6, LIF, IFN 등의 사이토카인(cytokine)에서도 동일한 작용이 밝혀져, 암악액질은 복수인자에 의하여 복합적으로 작용하는 병태임이 밝혀졌다.

인간구강저암유래 OCC-1 세포주는 이러한 암악액질에 관련되는 다양한 액성인자를 생산하는 것으로 알려져 있어, OOC-1 세포를 누드마우스(nude mouse)에 이식하면 악액질 등의 모든 증상을 일으킨다(참조: Kajimura N. et al., Cancer Chemother. Pharmacol., 1996, 38 Suppl. pS48-52; Tanaka R. et al., Jpn. J. Clin. Oncology Apr. 1996, 26 (2) p88-94). 이는 누드마우스에 이식된 OCC-1 세포주가 증식과 함께 여러 종류의 사이토카인(G-CSF, IL-6, LIF, IL-11, PTHrP 등)을 생산하여, 이들 인자가 복합적으로 작용하여 상기 증상들을 발생시키는 것으로 여겨진다.

이와 같이 OCC-1 세포주를 이식한 누드마우스의 증상은 인간말기암환자의 증상과 매우 공통점이 많다고 볼 수 있다. 그러나, 현재에 이르기까지 이러한 악액질에 대한 약제에 관한 보고는 알려져있지 않다.

[발명의 개시]

본 발명은 PTHrP와 그 수용체와의 결합을 저해하는 물질을 유효성분으로 함유하는 악액질에 대한 치료제를 제공하는 것을 목적으로 한다.

본 발명자들은 관련 치료제를 제공하기 위해 예의연구를 거듭한 결과, 부갑상선 호르몬 관련 펩티드와 그 수용체와의 결합을 저해하는 물질에 의해, 목적이 달성됨을 발견하고, 본 발명을 완성하기에 이르렀다.

결국, 본 발명은 부갑상선 호르몬 관련 펩티드와 그 수용체와의 결합을 저해하는 물질을 유효성분으로 함유하는 악액질 치료제를 제공한다.

상기 악액질로는 암유래의 것을 예로 들수 있다.

도 1는, 항PTHrP 항체의 악액질에 대한 치료효과를 나타내는 그래프이다.

도 2는, 항PTHrP 항체의 악액질에 대한 치료효과를 나타내는 그래프이다.

도 3는, 항PTHrP 항체의 악액질에 대한 치료효과를 나타내는 그래프이다.

도 4는, 항PTHrP 항체의 악액질에 대한 치료효과를 나타내는 그래프이다.

도 5는, 항체 결합활성의 측정결과를 나타내는 그래프이다.

도 6는, 항체 결합활성의 측정결과를 나타내는 그래프이다.

도 7는, 항체 결합활성의 측정결과를 나타내는 그래프이다.

도 8는, 항체 결합활성의 측정결과를 나타내는 그래프이다.

도 9는, 항체 결합활성의 측정결과를 나타내는 그래프이다.

도 10는, 항체 결합활성의 측정결과를 나타내는 그래프이다.

도 11는, 항체 결합활성의 측정결과를 나타내는 그래프이다.

도 12는, 항체 결합활성의 측정결과를 나타내는 그래프이다.

도 13는, 인간형화항체의 중화활성을 나타내는 그래프이다.

도 14는, 인간형화항체의 중화활성을 나타내는 그래프이다.

도 15는, 인간형화항체의 중화활성을 나타내는 그래프이다.

도 16는, 인간형화항체의 악액질에 대한 치료효과를 나타내는 그래프이다.

도 17는, 인간형화항체의 악액질에 대한 치료효과를 나타내는 그래프이다.

도 18는, 인간형화항체의 악액질에 대한 치료효과를 나타내는 그래프이다.

도 19는, 인간형화항체의 악액질에 대한 치료효과를 나타내는 그래프이다.

본 발명은 부갑상선 호르몬 관련 펩티드(parathyroid hormone related protein: PTHrP)와 그 수용체(PTHrP 수용체)와의 결합을 저해하는 물질을 유효성분으로 함유하는 악액질 치료제이다.

본 명세서 중 「PTHrP 수용체」란, 예를 들면 특표평 6-506598호에 기재되어 있는 PTHrP과 결합하는 수용체를 가리키며, 표적기관상(예를 들어, 뼈나 신장)에 존재하는 PTHrP 수용체인지의 여부를 문제삼지 않는다.

또한, 「PTHrP와 PTHrP 수용체와의 결합을 저해하는 물질」이란 PTHrP에 결합함으로써 PTHrP가 PTHrP 수용체와 결합하는 것을 저해하는 물질(예를 들면, 항PTHrP 항체) 및 PTHrP 수용체에 결합함으로써 PTHrP가 PTHrP 수용체와 결합하는 것을 저해하는 물질(예를 들면, PTHrP 수용체에 대한 길항제(antagonist)(PTHrP 길항제라고도 함), 구체적으로는 PTHrP 펩티드의 적어도 한 개의 아미노산을 치환, 결실된 것이나 PTHrP 펩티드의 부분서열 등을 가리킨다) 중 어느 한 쪽 혹은 양쪽을 가리킨다.

항 PTHrP 항체로는, 예를 들면 인간형화항체, 인간항체(참조: WO96/33735) 또는 키메라(chimera) 항체(참조: 특표평 4-228089) 등의 공지된 항체 외에, 본 발명에 있어서의 항체(#23-57-137-1 항체) 등을 예로 들 수 있다. 또한, 항체는 폴리클로날(polyclonal) 항체라도 상관 없으나, 모노클로날(monoclonal) 항체가 바람직하다. 또한, PTHrP 길항제로는, 폴리펩티드(polypeptide)나 저분자를 함유하는데, 예를 들면 PTHrP에 대하여 길항적으로 PTHrP 수용체에 결합하는 물질, 예를 들면 [특개평 7-165790호, Peptides (UNITED STATES) 1995, 16 (6) 1031-1037; Biochemistry (UNITED STATES) Apr.281992, 31 (16) 4026-4033; 특표평 5-509098호]에 기재된 PTHrP 길항제 활성을 갖는 폴리펩티드를 예로 들 수 있다. 또한, 상기 예시한 폴리펩티드 중, 적어도 한 개의 아미노산이 결실, 치환, 부가, 삽입된 폴리펩티드로 동등한 PTHrP 길항제 활성을 갖는 것도 본 발명의 PTHrP 길항제에 포함된다.

본 발명에서는 「PTHrP와 PTHrP 수용체와의 결합을 저해하는 물질」로서 항PTHrP 항체를 예로 설명한다.

1. 항PTHrP 항체

본 발명에서 사용되는 항PTHrP 항체는, 악액질의 치유효과를 갖는 것이라면, 그 유래, 종류(모노클로날, 폴리클로날) 및 형상을 문제삼지 않는다.

본 발명에서 사용되는 항PTHrP 항체는, 공지의 수단을 이용하여 폴리클로날 혹은 모노클로날 항체로서 얻을 수 있다. 본 발명에서 사용되는 항PTHrP 항체로서 특히 포유동물 유래의 모노클로날 항체가 바람직하다. 포유동물 유래의 모노클로날 항체는 하이브리도마(hybridoma)로 생산되는 것 및 유전자공학적 수법에 의해 항체유전자를 함유하는 발현 벡터(vector)로 형질전환한 숙주로 생산되는 것을 포함한다. 이 항체는 PTHrP와 결합함으로써, PTHrP가 PTH/PTHrP 수용체로 결합하는 것을 저해하여 PTHrP의 시그날(signal) 전달을 차단하여, PTHrP의 생물학적 활성을 저해하는 항체이다.

이와 같은 항체로는 하이브리도마 클론(hybridoma clone) #23-57-137-1에 의해 생산되는 #23-57-137-1 항체를 예로 들 수 있다.

또한, 하이브리도마 클론 #23-57-137-1 은 mouse-mouse hybridoma #23-57-137-1 로서, 공업기술원 생명공학공업기술연구소(1-3, Higashi 1-chome, Tsukuba-shi, Ibaraki, Japan)에 평성 8년(1996년) 8월 15일자로 FERM BP-5631로서 부다페스트조약에 근거하여 국제기탁되어 있다.

2. 항체생산 하이브리도마

모노클로날 항체생산 하이브리도마는 기본적으로는 공지기술을 사용하여 이하와 같은 방법으로 제작할 수 있다. 즉, PTHrP를 감작항원으로 사용하여 이를 통상의 면역방법에 따라 면역하여, 얻어지는 면역세포를 통상의 세포융합법에 따라 공지의 친세포와 유합시켜, 통상의 스크리닝(screening)법에 의하여 모노클로날 항체생산세포를 스크리닝함으로써 제작 가능하다.

구체적으로는, 모노클로날 항체를 생산하려면 다음과 같이 하면 된다.

먼저, 항체취득의 감작항원으로 사용되는 인간 PTHrP를 [Suva, L. J. et al., Science (1987) 237, 893] 에 개시된 PTHrP 유전자/아미노산 서열을 발현하여 얻는다. 즉, PTHrP를 코딩하는 유전자 서열을 공지의 발현 벡터계에 삽입하여 적당한 숙주세포를 형질전환시킨 후, 그 숙주세포 중 혹은 배양상청 중에서 목적의 PTHrP 단백질을 공지의 방법으로 정제한다.

다음으로, 이 정제 PTHrP 단백질을 감작항원으로 사용하거나, 또는 PTHrP의 N 말단의 34개의 펩티드에 관해, 화학합성에 의해 제작할 수도 있으며, 이것을 감작항원으로서 사용할 수도 있다.

감작항원으로 면역되는 포유동물로는, 특별히 한정되는 것은 아니나, 세포융합에 사용하는 친세포와의 적합성을 고려하여 선택하는 것이 바람직하며, 일반적으로는 설치류 동물(예를 들면, 생쥐, 집쥐, 햄스터, 혹은 토끼), 원숭이 등이 사용된다.

감작항원을 동물에 면역하려면 공지의 방법에 따라 행해진다. 예를 들면, 일반적 방법으로서, 감작항원을 포유동물의 복강내 혹은 피하에 주사함으로써 행해진다. 구체적으로는 감작항원을 PBS (phosphate-buffered saline)나 생리식염수 등으로 적당량 희석, 현탁한 것을 희망하는 대로 통상의 어쥬번트(adjuvant), 예를 들면, 프로인트(Freund's) 완전 어쥬번트를 적량 혼합하여 유화시킨 후, 포유동물에 4-21일마다 수회 투여한다. 또한, 감작항원 면역시 적당한 담체를 사용할 수도 있다.

이와 같이 면역하고, 혈청 중에 희망하는 항체레벨이 상승하는 것을 확인한 후, 포유동물로부터 면역세포를 채취하여 세포융합에 첨가되어지나, 바람직한 면역세포로는 특히 허벅지 세포를 예로 들 수 있다.

전기 면역세포와 융합되는 다른 쪽의 친세포로서, 포유동물의 미엘로마(myeloma) 세포를 이용한다. 이 미엘로마 세포는 공지의 다양한 세포주, 예를 들면, P3 (P3x63Ag8.653) (참조: J. Immunol. (1979) 123, 1548-1550); P3x63Ag8U.1 (Current Topics in Microbiology and Immunology (1978) 81, 1-7); NS (Kohler. G. and Milstein, C. Eur. J. Immunol. (1976) 6, 511-519); MPC-11 (Margulies. D. H. et al., Cell (1976) 8, 405-415); SP2/0 (Shulman, M. et al., Nature (1978) 276, 269-270); FO (de St. Groth, S. F. et al., J. Immunol. Methods (1980) 35, 1-21); S194 (Trowbridge, I. S. J. Exp. Med. (1978) 148, 313-323); R210 (Galfre, G. et al., Nature (1979) 277, 131-133) 등이 적절히 사용된다.

전기 면역세포와 미엘로마 세포와의 세포융합은 기본적으로는 공지의 방법, 예를 들면, 밀스테인(Milstein) 등의 방법(참조: Kohler. G. and Milstein, C., Methods Enzymol. (1981) 73, 3-46) 등에 준하여 행할 수 있다.

좀 더 구체적으로는, 전기 세포융합은, 예를 들면, 세포융합 촉진제의 존재하에 통상의 영양배양액 중에서 실시된다. 융합촉진제로는, 예를 들면, 폴리에틸렌 글리콜(polyethylene glycol)(PEG), 센다이 바이러스(Sendai virus)(HVJ) 등이 사용되며, 또한 희망에 따라 융합배율을 높이기 위하여 다이메틸 설폭사이드(dimethyl sulfoxide) 등의 보조제를 첨가사용할 수도 있다.

면역세포와 미엘로마 세포와의 사용비율은 임의로 설정할 수 있다. 예를 들면, 미엘로마 세포에 대하여 면역세포를 1-10배로 하는 것이 바람직하다. 전기 세포융합에 이용하는 배양액으로는, 예를 들면, 전기 미엘로마 세포주의 증식에 알맞는 RPMI1640 배양액, MEM 배양액, 기타, 이 종류의 세포배양에 사용되는 통상의 배양액이 사용가능하며, 또한 소 태아혈청(FCS) 등의 혈청보액을 병용할 수도 있다.

세포융합은 전기 면역세포와 미엘로마 세포의 소정량을 전기배양액 중에서 잘 혼합하여, 미리 37℃ 정도로 가온한 PEG 용액(예를 들어, 평균분자량 1000-6000 정도)를 통상 30-60% (w/v)의 농도로 첨가하여 혼합함으로써 목적으로 하는 융합세포(하이브리도마)를 형성한다. 계속하여, 적당한 배양액을 차례로 첨가하고 원심하여 상청을 제거하는 조작을 반복함으로써 하이브리도마의 생육에 부적합한 세포융합제 등을 제거한다.

이렇게 하여 얻어진 하이브리도마는 통상의 선택배양액, 예를 들면, HAT 배양액(하이포잔틴(hypoxanthine), 아미노프테린(aminopterin) 및 티미딘(thymidine)을 함유하는 배양액)으로 배양함으로써 선택된다. 상기 HAT 배양액에서의 배양은 목적으로 하는 하이브리도마 이외의 세포(비융합세포)가 사멸하기에 충분한 시간(통상, 수일∼수주간) 계속된다. 계속하여, 통상의 한계희석법을 실시하여 목적으로 하는 항체를 생산하는 하이브리도마의 스크리닝 및 단크리닝을 행한다.

또한, 인간이외의 동물에 항원을 면역하여 상기 하이브리도마를 얻는 외에, 인간임파구를 시험관내에서 PTHrP로 감작하고, 감작 임파구를 인간유래의 영구분열 능력을 갖는 미엘로마 세포와 융합시켜 PTHrP로의 결합활성을 갖는 희망하는 인간항체를 얻을 수도 있다(참조: 특공평 1-59878호). 또한, 모든 인간항체 유전자의 레퍼토리(repertories)를 갖는 형질전이 동물(transgenic animal)에 항원이 되는 PTHrP을 투여하여 항PTHrP 항체 생산세포를 취득하여, 이를 불사화시킨 세포로부터 PTHrP에 대한 인간항체를 취득해도 된다(참조: 국제특허출원공개 WO 94/25585; WO 93/12227; WO 92/03918; WO 94/02602).

이렇게 제작되는 모노클로날 항체를 생산하는 하이브리도마는 통상의 배양액 중에서 계대배양할 수 있으며, 또한 액체질소 중에 장기보존할 수 있다.

해당 하이브리도마로부터 모노클로날 항체를 취득하려면, 해당 하이브리도마를 통상의 방법에 따라 배양하고 그 배양상청으로서 얻는 방법, 혹은 하이브리도마를 이와 적합성이 있는 포유동물에 투여하여 증식시켜, 그 복수로서 얻는 방법 등이 채용된다. 전자의 방법은 고순도의 항체를 얻는데 적합하고, 후자의 방법은 항체의 대량생산에 적합하다.

3. 재조합형 항체

본 발명에서는 모노클로날 항체로서 항체 유전자를 하이브리도마로부터 클로닝(cloning)하고, 적당한 벡터로 조합하여 이를 숙주에 도입, 유전자 재조합 기술을 이용하여 생산시킨 재조합형 항체를 이용할 수 있다(참조: Vandamme, A. M. et al., Eur. J. Biochem. (1990) 192, 767-775, 199).

구체적으로는, 항PTHrP 항체를 생산하는 하이브리도마로부터 항PTHrP 항체의 가변(V) 영역을 코딩하는 mRNA를 단리한다. mRNA의 단리는 공지의 방법, 예를 들면, 구아니듐(guanidium) 초원심법(참조: Chirgwin, J. M. et al., Biochemistry (1979) 18, 5294-5299) AGPC법(참조: Chomczynski, P. et al., Anal. Biochem. (1987) 162, 156-159) 등에 의해 행하여 전 RNA를 조제하고, mRNA Purification Kit(Pharmacia제) 등을 사용하여 목적의 mRNA를 조제한다. 또한, QuickPrep mRNA Purification Kit(Pharmacia제)를 이용함으로써 mRNA를 직접 조제할 수 있다.

얻어진 mRNA로부터 역전사 효소를 이용하여 항체 V영역의 cDNA를 합성한다. cDNA의 합성은 AMV Reverse Transcriptase First-strand cDNA Synthesis Kit(생화학공업사제) 등을 이용하여 행한다. 또한, cDNA의 합성 및 증폭을 행하려면, 5'-Ampli FINDER RACE Kit(Clontech제) 및 PCR를 이용한 5'-RACE 법(참조: Frohman, A. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1998) 85, 8998-9002; Belyavsky, A. et al.; Nucleic Acids Res. (1989) 17, 2919-2932) 등을 사용할 수 있다. 얻어진 PCR 산물로부터 목적으로 하는 DNA 단편을 정제하여 벡터 DNA와 연결한다. 또한, 이로부터 재조합 벡터를 제작하고, 대장균 등에 도입하여 콜로니(colony)를 선택하여 희망하는 재조합 벡터를 조제한다. 그리고, 목적으로 하는 DNA의 염기서열을 공지의 방법, 예를 들면, 디데옥시뉴클레오타이드 체인 터미네이션(dideoxynucleotide chain termination)법에 의해 확인한다.

목적으로 하는 항PTHrP 항체의 V영역을 코딩하는 DNA를 얻은 후, 이를 희망하는 항체 정상영역(C영역)을 코딩하는 DNA를 함유하는 발현 벡터로 조합한다.

본 발명에서 사용되는 항PTHrP 항체를 제조하려면, 항체 유전자를 발현 제어영역, 예를 들면, 인핸서(enhancer), 프로모터(promoter)의 제어하에서 발현하도록 발현 벡터에 조합한다. 다음으로, 이 발현 벡터에 의해 숙주세포를 형질전환하여 항체를 발현시킨다.

항체 유전자의 발현은 항체중쇄(H쇄) 혹은 경쇄(L쇄)를 코딩하는 DNA를 따로따로 발현 벡터에 조합하여 숙주세포를 동시형질전환시켜도 되며, 혹은 H쇄 및 L쇄를 코딩하는 DNA를 단일의 발현 벡터에 조합하여 숙주세포를 형질전환시켜도 된다(참조: WO 94/11523).

또한, 재조합형 항체의 생산에는 상기 숙주세포뿐만 아니라 형질전이 동물을 사용할 수도 있다. 예를 들면, 항체 유전자를 유즙 중에 고유하게 생산되는 단백질(염소 β-카세인(casein) 등)을 코딩하는 유전자의 도중에 삽입하여 융합 유전자로서 조제한다. 항체 유전자가 삽입된 융합 유전자를 함유하는 DNA 단자를 염소의 배자에 주입하고, 이 배자를 암컷 염소에 도입한다. 배자를 수용한 염소으로부터 생기는 형질전이 염소 혹은 그 자손이 생산하는 유즙으로부터 희망하는 항체를 얻는다. 또한, 형질전이 염소으로부터 생산되는 희망하는 항체를 함유하는 유즙량을 증가시키기 위하여, 적절한 호르몬을 형질전이 염소에 사용해도 된다(참조: Ebert, K.M. et al., Bio/Technology (1994) 12, 699-702).

4. 개변항체

본 발명에서는 상기 항체외에 인간에 대한 이종항원성을 저하시키는 것 등을 목적으로 인위적으로 개변한 유전자 재조합형 항체, 예를 들면, 키메라 항체, 인간형화(humanized) 항체를 사용할 수 있다. 이들 개변항체는 기지의 방법을 이용하여 제조할 수 있다.

키메라 항체는 전기와 같이 하여 얻은 항체 V영역을 코딩하는 DNA를 인간항체 C영역을 코딩하는 DNA와 연결하고, 이를 발현 벡터로 조합하여 숙주에 주입, 생산시킴으로써 얻어진다. 이 기지의 방법을 이용하여, 본 발명에 유용한 키메라 항체를 얻을 수 있다.

인간형화 항체는 재구성(reshaped) 인간항체라고도 불리워지며, 이는 인간이외의 포유동물, 예를 들면, 마우스 항체의 상보성 결정영역(CDR; complementarity determining region)을 인간항체의 상보성 결정영역으로 이식한 것으로, 그 일반적인 유전자 재조합법도 알려져 있다(참조: 유럽특허출원공개번호 EP 125023; WO 96/02576).

구체적으로는, 마우스 항체의 CDR과 인간항체의 프레임워크 영역(framework region; FR)을 연결하도록 설계한 DNA 서열을 CDR 및 FR 양방의 말단영역에 오버랩되는(overlapping) 부분을 갖도록 제작한 여러개의 올리고뉴클레오타이드(oligonucleotide)를 프라이머(primer)로서 사용하여 PCR법에 의해 합성한다. 얻어진 DNA를 인간항체 C영역을 코딩하는 DNA와 연결하고, 계속하여 발현 벡터에 조합하여 이를 숙주에 도입, 생산시킴으로써 인간형화 항체가 얻어진다(참조: EP 239400; WO 96/02576).

CDR을 끼워 연결하는 인간항체의 프레임워크 영역은 상보성 결정영역이 양호한 항원결합부위를 형성하는 것이 선택되어진다. 필요에 따라 재구성 인간항체의 상보성 결정영역이 적절한 항원결합부위를 형성하도록 항체의 가변영역이 있어서의 프레임워크 영역의 아미노산을 치환해도 된다(참조: Sato, K. et al., Cancer Res. (1993) 53, 851-856). 키메라 항체 및 인간형화 항체의 C영역에는 인간항체의 것이 사용되어, 예를 들면, H쇄에서는 C1, C2, C3, C4를, L쇄에서는 Cκ, C를 사용할 수 있다. 또한, 항체 혹은 그 생산의 안정성을 개선하기 위해, 인간항체 C영역을 수식해도 된다.

키메라 항체는 인간 이외의 포유동물유래 항체의 가변영역과 인간항체유래의 정상영역으로부터 이루어진다. 한편, 인간형화 항체는 인간이외의 포유동물유래 항체의 상보성 결정영역과 인간항체유래의 프레임워크 영역 및 C영역으로부터 이루어진다. 인간형화 항체는 인간 체내에 있어서 항원성이 저하되어 있기 때문에, 본 발명의 치료제의 유효성분으로서 유용하다. 본 발명에 사용할 수 있는 인간형화 항체로는 인간형화 #23-57-137-1 항체를 예로 들 수 있다. 인간형화 #23-57-137-1 항체는 마우스 유래의 #23-57-137-1 항체의 상보성 결정영역을, L쇄에 관하여는 인간항체 HSU03868(참조: GEN-BANK, Deftos M 등, Scand. J. Immunol., 39, 95-103, 1994) 유래의 3개의 FR 단편(FR1, FR2 및 FR3) 및 인간항체 S25755(NBRF-PDB) 유래의 FR 단편(FR4)에 연결한 것으로, H쇄에 관하여는 인간항체 S31679(참조: NBRF-PDB, Cuisinier AM 등, Eur. J. Immunol., 23, 110-118, 1993)의 프레임워크 영역과 연결하여, 항원결합활성을 갖도록 프레임워크 영역의 아미노산 잔여를 일부 치환한 것이다.

또한, 인간형화 #23-57-137-1 항체의 L쇄 혹은 H쇄를 코딩하는 DNA를 함유하는 플라스미드(plasmid)를 갖는 대장균은 공업기술원 생명공학공업기술연구소(1-3, Higashi 1-chome, Tsukuba-shi, Ibaraki-Ken, Japan)에 평성 8년(1996년) 8월 15일자로 FERM BP-5629로, L쇄를 코딩하는 DNA를 함유하는 플라스미드를 갖는 대장균인 Escherichia coli JM109(hMBC1HcDNA/pUC19)에 관하여는 공업기술원 생명공학공업기술연구소(1-3, Higashi 1-chome, Tsukuba-shi, Ibaraki-Ken, Japan)에 평성 8년(1996년) 8월 15일자로 FERM BP-5630으로 부다페스트 조약에 근거하여 각각 국제기탁되어 있다.

5. 항체수식물

본 발명에서 사용되는 항체는 PTHrP에 결합하여, PTHrP의 활성을 저해하는 한, 항체의 단편 혹은 그 수식물이면 된다. 예를 들면, 항체의 단편으로는, Fab, F(ab')₂,Fv, 또은 H쇄 또는 L쇄의 Fv를 적당한 링커(linker)로 연결시킨 싱글체인(single chain) Fv(scFv) 를 예로 들 수 있다. 구체적으로는, 항체를 효소, 예를 들면, 파파인(papain), 펩신(pepsin)으로 처리하여 항체단편을 생성시키든지, 또은 이들 항체단편을 코딩하는 유전자를 구축하여 이것을 발현 벡터에 도입한 후, 적당한 숙주세포에서 발현시킨다(예를 들면, Co, M.S. et al., J. Immunol. (1994) 152, 2968-2976; Better, M. & Horwitz, A. H. Methods in Enzymology (1989) 178, 476-496, Academic Press, Inc.; Plueckthun, A. & Skerra, A. Methods in Enzymology (1989) 178, 476-496 Academic Press, Inc.; Lamoyi, E. Methods in Enzymology (1989) 121, 652-663; Rousseaux, J. et al. Methods in Enzymology (1989) 121, 663-669; Bird, R. E. et al. TIBTECH (1991) 9, 132-137 ).

scFv는 항체의 H쇄 V영역과 L쇄 V영역을 연결함으로써 얻어진다. 이 scFv에 있어서, H쇄 V영역과 L쇄 V영역은 링커, 가능하면 펩티드링커를 끼워 연결된다(참조: Huston, J. S. et al. Proc. Natl. Acad. Sci., U.S.A. (1988) 85, 5879-5883). scFv에 있어서의 H쇄 V영역 및 L쇄 V영역은 본 명세서에 항체로서 기재된 것 중 어느 유래라도 좋다. V영역을 연결하는 펩티드링커로는, 예를 들면, 아미노산 12-19 잔기로 이루어지는 임의의 한줄쇄 펩티드가 이용된다.

scFv를 코딩하는 DNA는 전기 항체의 H쇄 혹은 H쇄 V영역을 코딩하는 DNA, 및 L쇄 혹은 L쇄 V영역을 코딩하는 DNA 중, 그들의 서열 중의 전부 또는 희망하는 아미노산서열을 코딩하는 DNA부분을 주형으로, 그 양단을 규정하는 프라이머 쌍을 이용하여 PCR법에 의하여 증폭하고, 계속하여 펩티드링커 부분을 코딩하는 DNA, 및 그 양단이 각각 H쇄, L쇄와 연결되도록 규정하는 프라이머 쌍을 조합하여 증폭함으로써 얻어진다.

또한, 일단 scFv를 코딩하는 DNA가 제작되면, 그것들을 함유하는 발현 벡터 및 이 발현 벡터에 의해 형질전환된 숙주를 통상의 방법에 따라 얻을 수 있으며, 또한 그 숙주를 이용하여 통상의 방법에 따라 scFv를 얻을 수 있다.

이들 항체의 단편은 전기와 같은 방법으로, 그 유전자를 취득하고 발현시켜 숙주에 의하여 생산할 수 있다. 본 발명에 있어서의 「항체」에는 이들 항체의 단편도 포함된다.

항체의 수식물로서, 폴리에틸렌 글리콜(polyethylene glycol)(PEG) 등의 각종분자와 결합한 항PTHrP 항체를 사용할 수도 있다. 본 발명에 있어서의 「항체」에는 이들 항체수식물도 포함된다. 이와 같은 항체수식물은 얻어진 항체에 화학적인 수식을 행함으로써 얻을 수 있다. 또한, 항체의 수식방법은 이 분야에 있어서 이미 확립되어 있다.

6. 재조합형 항체 또는 개변항체의 발현 및 생산

전기와 같이 구축한 항체 유전자는 공지의 방법에 의해 발현시켜 취득할 수 있다. 포유류 세포의 경우, 상용되는 유용한 프로모터(promoter), 발현시키는 항체유전자, 그 3'측 하류에 폴리 A 시그날(poly A signal)을 기능적으로 결합시켜 발현시킬 수 있다. 예를 들면, 프로모터/인핸서로는 인간 사이토메갈로바이러스 전기 프로모터/인핸서(human cytomegalovirus immediate early promoter/enhancer)를 예로 들 수 있다.

또한, 그 밖에 본 발명에서 사용되는 항체발현에 사용 가능한 프로모터/인핸서로서(promoter/enhancer system), 레트로바이러스(retrovirus), 폴리오마바이러스(polyoma virus), 아데노바이러스(adenovirus), 시미안바이러스 40(simian virus 40)(SV40) 등의 바이러스 프로모터/인핸서, 또는 인간 엘롱게이션 팩터(elongation factor)1α(HEF1α) 등의 포유류세포 유래의 프로모터/인핸서 등을 예로 들 수 있다,

SV 40 프로모터/인핸서를 사용할 경우에는 멀리간(Mulligan) 등의 방법(참조: Nature (1979) 277, 108)에 의해, 혹은 HEF1α프로모터/인핸서를 사용할 경우에는 미즈시마(Mizushima) 등의 방법(참조: Nucleic Acids Res. (1990) 18, 5322)에 의해 용이하게 유전자 발현을 행할 수 있다.

대장균의 경우, 상용되는 유용한 프로모터, 항체분비를 위한 시그날 서열 및 발현시키는 항체 유전자를 기능적으로 결합시켜, 해당 유전자를 발현시킬 수 있다. 프로모터는, 예를 들면, lacz 프로모터, araB 프로모터를 예로 들 수 있다. lacz 프로모터를 사용하는 경우에는 워드(Ward) 등의 방법(참조: Nature (1098) 341, 544-546; FASEB J. (1992) 6, 2422-2427)에 의하여, 혹은 araB 프로모터를 사용하는 경우에는 베터(Better) 등의 방법(참조: Science (1988) 240, 1041-1043)에 의하여 발현할 수 있다.

항체 분비를 위한 시그날 서열로는, 대장균의 페리플라즘(periplasm)으로 생산할 경우, pelB 시그날서열(Lei, S. P. et al., J. Bacteriol. (1987) 169, 4379)을 사용하면 된다. 그리고, 페리플라즘으로 생산된 항체를 분리한 후, 항체의 구조를 적절히 재조합하여(refold) 사용한다.

복제기원으로는, SV 40, 폴리오마 바이러스, 오데노 바이러스, 소 파필로마 바이러스(bovine papilloma virus)(BPV) 등의 유래의 것도 사용할 수 있으며, 또한, 숙주세포계로 유전자 복제수 증폭을 위해, 발현 벡터는 선택 마커(marker gene)로서, 아미노글리코시드 포스포트랜스퍼라제 (aminoglycoside phosphotransferase)(APH) 유전자, 티미딘 키나제(thymidine kinase)(TK) 유전자, 대장균 잔틴구아닌포스포리보실트랜스퍼라제(xanthineguanine phosphoribosyltransferase)(Ecogpt) 유전자, 디하이드로 엽산 환원효소(dihydrofolate reductase)(dhfr) 유전자 등을 함유할 수 있다.

본 발명에서 사용되는 항체의 제조를 위하여, 임의의 발현계, 예를 들면, 진핵세포 혹은 원핵세포계를 사용할 수 있다. 진핵세포로는, 예를 들면, 수립된 포유류 세포계, 곤충세포계, 진사상균세포 및 효모세포 등의 동물세포 등을 들 수 있으며, 원핵세포로는, 예를 들면, 대장균 세포 등의 세균세포를 예로 들 수 있다.

바람직하게는, 본 발명에서 사용되는 항체는 포유류 세포, 예를 들면, CHO, COS, 미엘로마, BHK, Vero, HeLa 세포 중에서 발현된다.

다음으로, 형질전환된 숙주세포를 시험관 내 혹은 생체 내에서 배양하여 목적으로 하는 항체를 생산시킨다. 숙주세포의 배양은 공지의 방법에 따라 행한다. 예를 들면, 배양액으로서, DMEM, MEM, PRMI1640, IMDM을 사용할 수 있으며, 소 태아혈청(FCS) 등의 혈청보액을 병용할 수도 있다.

7. 항체의 분리, 정제

전기와 같이 발현, 생산된 항체는 세포, 숙주동물로부터 분리하여 균일하게 정제할 수 있다. 본 발명에서 사용되는 항체의 분리, 정제는 친화성 칼럼(affinity column)을 이용하여 행할 수 있다. 예를 들면, 프로틴 A 칼럼을 이용한 칼럼으로 Hyper D, POROS, Sepharose F.F.(Pharmacia제) 등을 예로 들 수 있다. 그 밖에, 통상의 단백질에서 사용되고 있는 분리, 정제방법을 사용하면 되며, 전혀 한정되는 것은 아니다. 예를 들면, 상기 친화성 칼럼 이외의 크로마토그래피 칼럼(chromatography column), 여과(filtration), 한외여과, 염석, 투석 등을 적절히 선택, 조합함으로써 항체를 분리, 정제할 수 있다(참조: Antibodies A Laboratory Manual, Ed. Harlow, David Lane, Cold Spring Harbor Laboratory, 1998).

8. 항체의 활성의 확인

본 발명에서 사용되는 항체의 항원결합활성(참조: Antibodies A Laboratory Manual, Ed. Harlow, David Lane, Cold Spring Harbor Laboratory, 1998), 리건드 리셉터(ligand receptor) 결합저해활성(참조: Harada, A. et al., International Immunology (1993) 5, 681-690)의 측정에는 공지의 수단을 사용할 수 있다.

본 발명에서 사용되는 항PTHrP 항체의 항원결합활성을 측정하는 방법으로서, ELISA(효소결합 면역흡착 검정법), EIA(효소면역 측정법), RIA(방사면역 측정법) 혹은 형광 항체법을 이용할 수 있다. 예를 들면, 효소면역 측정법을 이용하는 경우, PTHrP(1-34)를 코팅한 플레이트(plate)에 항PTHrP 항체를 함유하는 시료, 예를 들면, 항PTHrP 항체 생산세포의 배양상청이나 정제항체를 첨가한다. 알칼린 포스파타제(alkaline phosphatase) 등의 효소로 표식한 이차 항체를 첨가하고 플레이트를 인큐베이터에 넣고 세정한 후, p-니트로페닐 인산(p-nitrophenylphosphoric acid) 등의 효소기질을 첨가하여 흡광도를 측정함으로써 항원결합활성을 평가할 수 있다.

본 발명에서 사용되는 항체의 활성을 확인하려면 항PTHrP 항체의 중화활성을 측정한다.

9. 투여방법 및 제제

본 발명의 치료제는 악액질에 대한 치료 또는 개선을 목적으로 사용된다. 또한, 악액질의 종류는 암유래의 것인지의 여부를 문제삼지 않는다. 예를 들면, 암유래의 것으로, [J. Urol. (UNITED STATES) Mar 1995, 153 (3 Pt 1) p854-857; Langenbecks Arch. Chir. Suppl Ⅱ Verch Dtsch Ges Chir(Germany) 1990, p261-265; Oncology(SWITZERLAND) 1990, 47 (1) p87-91, Int. J. Pancreatol. (UNITED STATES) Aug-Nov 1990, 7(1-3) p141-150; J. Natl. Cancer Inst. (UNITED STATES) Dec 19, 1990,82 (24) p1922-1926] 등에 기재된 악액질을 예로 들 수 있다.

또한, 암유래가 아닌 것으로, [JPEN J. Parenter. Enteral Nutr. (UNITED STATES) Nov-Dec 1990, 14 (6) p605-609; Chest (UNITED STATES) Nov 1990, 98 (5) p1091-1094; Bone Marrow Transplant. (ENGLAND) Jul 1990, 6 (1) p53-57] 등에 기재된 악액질을 예로 들 수 있다.

본 발명의 항PTHrP 항체를 유효성분으로 함유하는 치료제는 경구, 비경구투여 중 어느 쪽도 가능하나, 가능하면 비경구투여로, 구체적으로는 경폐제형(예를 들면, 네뷸라이저(nebulizer) 등의 기구를 이용한 경폐투여제), 경비투여제형, 경피투여제형(예를 들면, 연고, 크림제), 주사제형 등을 예로 들 수 있다. 주사제형의 예로는, 예를 들면, 링겔 등의 정맥내 주사, 근육내 주사, 복강내 주사, 피하주사 등에 의하여 전신 또는 국부적으로 투여할 수 있다. 또한, 환자의 연령, 증상에 따라 적절한 투여방법을 선택할 수 있다. 유효투여량은, 1회에 체중 1kg 당 0.001㎎ 에서 1000㎎의 범위에서 선택하거나, 환자당 0.01~100000㎎/body의 투여량을 선택할 수 있다. 그러나, 본 발명의 항PTHrP 항체를 함유하는 치료제는 이들의 투여량에 제한되는 것이 아니다.

또한, 투여기간은 악액질이 생기는 전후를 막론하고 투여해도 되고, 또는 체중감소가 예측될 때 투여해도 된다.

본 발명의 항PTHrP 항체를 유효성분으로 함유하는 치료제는 통상적인 방법에 따라 제제화할 수 있으며(참조: Remington's Pharmaceutical Science, latest edition, Mark Publishing Company, Easton, U.S.A.), 의학적으로 허용되는 담체나 첨가물을 함께 함유하는 것이라도 상관없다.

이러한 담체 및 의약첨가물의 예로, 물, 의약적으로 허용되는 유기용제, 콜라겐(collagen), 폴리비닐알콜(polyvinyl alcohol), 폴리비닐 피롤리돈(polyvinyl pyrrolidone), 카복시비닐 폴리머(carboxyvinyl polymer), 소디움 카복시메틸 셀룰로스 나트륨(sodium carboxymethyl cellulose), 폴리아크릴산 나트륨(poly(sodium acrylate)), 아르긴산 나트륨(sodium arginate), 수용성 덱스트란(water soluble dextran), 카복시메틸 스타치 나트륨(sodium carboxymethyl starch), 펙틴(pectin), 메틸 셀룰로스(methyl cellulose), 에틸 셀룰로스(ethyl cellulose), 잔탄 검(xanthane gum), 아라비아 고무(gum arabic), 카세인(casein), 한천(agar), 폴리에틸렌 글리콜(polyethylene glycol), 다이글리세린(diglycerin), 글리세린(glycerin), 프로필렌 글리콜(propylene glycol), 바세린(vaseline), 파라핀(paraffin), 스테아릴 알콜(stearyl alcohol), 스테아릭 산(stearic acid), 인간혈청 알부민(human serum albumin)(HSA), 만니톨(mannitol), (솔비톨)sorbitol, 락토스(lactose), 의약첨가물로서 허용되는 계면 활성제 등을 예로 들 수 있다.

실제의 첨가물은, 본 발명 치료제의 제형에 따라 상기 중에서 단독으로 혹은 적절히 조합하여 선택되어지나, 물론 이들에 한정되어지는 것은 아니다. 예를 들면, 주사용 제제로서 사용하는 경우, 정제된 항PTHrP 항체를 용제, 예를 들면, 생리식염수, 완충액, 포도당용액 등에 용해하고, 이것에 흡착방지제, 예를 들면, Tween80, Tween 20, 젤라틴, 인간혈청 알부민 등을 첨가한 것을 사용할 수 있다.

또는, 사용전에 용해재구성하는 제형으로 하기 위해서 동결건조한 것이어도 되며, 동결건조를 위한 부형제로는, 예를 들면, 만니톨, 포도당 등의 당 알콜이나 당류를 사용할 수 있다.

[발명을 실시하기 위한 최적의 형태]

이하, 참고예 및 실시예에 의해 본 발명을 더욱 구체적으로 설명한다. 단, 본 발명은 이들 실시예 등에 그 기술적 범위가 한정되지는 않는다.

실시예 1: 악액질 모델동물에서의 약효실험

인간종양-누드마우스 이식계의 악액질 모델동물을 이용하여, PTHrP에 대한 마우스 모노클로날 항체의 악액질에 대한 치료효과를 검토하였다.

모델동물로 인간구강저암 OCC-1((재)실험동물중앙연구소로부터 구입)을 이식한 누드마우스를 이용하였다. 인간구강저암 OCC-1을 이식받은 누드마우스는 종양의 증가에 수반하여, 혈중 칼슘농도가 상승하여, 체중감소나 운동량 저하 등의 악액질 증상을 일으킨다. 인간구강저암 OCC-1에 의하여 발병되는 악액질 증상을 마우스 모노클로날 항체가 개선하는 것을, 혈중 칼슘농도, 체중 및 수명연장효과를 지표로 하여 평가하였다.

인간구강저암 OCC-1 의 계대(passaged)는 BALB/c-nu/nu 누드마우스(일본 CLEA Co., Inc.)를 이용하여 생체 내에서 행하였다. 약효평가를 위하여, 6주된 웅성 BALB//c-nu/nu 누드마우스(일본 CLEA Co., Inc.)를 구입하여 1주간 길들인 후, 7주된 동물을 사용하였다.

악액질 모델동물의 제작 및 무리분류는, 이하와 같이 행하였다. 즉, 계대하고 있는 인간구강저암 OCC-1을 적출하여 3 mm 큐브 블럭에 세심히 새긴 종양덩어리를 마우스의 옆구리 피하에 한마리당 1개씩 이식하였다. 종양덩어리 이식후 10일째에 종양체적이 충분히 커졌음을 확인한 후, 혈중 칼슘농도, 체중 및 종양체적을 지표로 하여 각 지표가 평균화되도록 무리분류하여 악액질 모델동물로 하였다.

악액질에 대한 치료효과의 검토는 이하와 같이 행하였다.

(1) 생존기간의 관찰

수명연장효과의 검토에서는, 마우스 모노클로날 항체를 주 2회 투여하여 생존기간의 관찰을 행하였다. 또한, 이미 고칼슘혈증 치료약으로서 처방되고 있는 파미드로네이트(아레디아)(pamidronate; Aredia)를 15㎎/Kg의 용량으로 꼬리 정맥내에 한 번 투여하였다. 대조적으로, 인산 완충용액(buffered) 생리식염수(PBS)를 0.2㎖/mouse로 꼬리 정맥내에 주 2회 투여하였다. 그 결과를 도 1에 나타내었다.

(2) 혈중 칼슘농도의 관찰

상기에서 제작, 무리분류한 악액질 모델동물에, 마우스 한마리당 10㎍ 혹은 100㎍의 PTHrP에 대한 마우스 모노클로날 항체를 꼬리 정맥내에 2일 간격으로 2회 투여하였다. 또한, 이미 고칼슘혈증 치료약로서 처방되고 있는 파미드로네이트 (아레디아)를 15㎎/Kg의 용량으로 꼬리 정맥내에 한 번 투여하였다. 대조적으로, 인산 완충용액 생리식염수(PBS)를 0.2㎖/mouse로 꼬리 정맥내에 2일 간격으로 2회 투여하였다.

(3) 혈중칼슘의 측정

마우스 모노클로날 항체투여 후, 1일 및 4일째에 혈중 칼슘농도를 측정하고, 각 항체의 약효평가를 행하였다. 혈중 칼슘농도는 안와(orbit)를 통하여 헤마토크릿 관(hematocrit tube)으로 채혈하고, 643 자동 Ca/pH 분석기(CIBA-CORNING)을 이용하여 전혈이온화 칼슘농도로 측정하였다. 체중은 항체투여 후 4일째까지 매일 측정하였다. 그 결과를 도 2 및 도 3에 나타내었다.

(4) 종양중량의 측정

종양체적은 항체투여 후 4일째에 종양의 장경(a ㎜) 및 단경(b ㎜)을 측정하여, 갈란트의 계산식(Galant's equation) ab²/2 에 의하여 종양체적으로서 산출하였다. 그 결과를 도 4에 나타내었다.

이상의 결과로부터 혈중 칼슘농도에 관하여는, 항체농도 10㎍에서는 파미드로네이트 투여군과 차이가 없음에도 불구하고, 악성종양에 수반되는 체중감소를 파미드로네이트 투여군 또는 대조군에 비해 억제하였다. 항체농도 100㎍을 투여한 무리에서는 혈중 칼슘농도의 상승을 파미드로네이트 투여군 또는 대조군에 비해 억제하고, 체중감소도 파미드로네이트 투여군 또는 대조군에 비해 억제하였다. 또한 항PTHrP 중화항체 100㎍을 주 2회 투여한 군에서는 파미드로네이트 투여군 또는 대조군에 비해 의미 있는 생존기간의 연장(p=0.0003: Log Rank test)이 인정되었다. 이로부터 PTHrP에 대한 중화 마우스 클로날 항체는 체중감소 억제, 생존기간의 연장 등 기존의 고칼슘혈증 치료약에는 없는 효과를 갖는다. 따라서, 본 항체의 악성종양에 수반되는 악액질의 치료약으로서 유용성이 나타났다.

실시예 2: 고칼슘혈증 및 악액질 모델동물에서의 약효시험

인간종양 누드마우스 이식계의 악액질 모델동물을 이용하여, PTHrP에 대한 인간형화항체 버젼q의 악액질에 대한 치료효과를 검토하였다.

모델동물로서 인간구강저암 OCC-1((재)실험동물중앙연구소로부터 구입)을 이식한 누드마우스를 이용하였다. 인간구강저암 OCC-1을 이식받은 누드마우스는 종양의 증가에 수반하여 혈중칼슘농도가 상승하고, 체중감소나 운동량 저하 등의 악액질 증상을 일으킨다. 인간구강저암 OCC-1에 의하여 발병되는 악액질 증상을 인간형화항체 버젼q가 개선하는 것을, 혈중 칼슘농도, 체중 및 수명연장효과를 지표로 하여 평가하였다.

인간구강저암 OCC-1 의 계대는 BALB/c-nu/nu 누드마우스(일본 CLEA Co., Inc.)를 이용하여 생체 내에서 행하였다. 효과평가를 위하여, 6주된 웅성 BALB//c-nu/nu 누드마우스(일본 CLEA Co., Inc.)를 구입하여 1주간 길들인 후, 7주된 동물을 사용하였다.

악액질에 대한 치료효과의 검토는 이하와 같이 행하였다.

(1) 생존기간의 관찰

연장효과의 검토에서는, 인간형화항체 버젼q를 주 2회 꼬리 정맥내에 투여하여 생존기간의 관찰을 행하였다. 대조적으로, 인산 완충용액(buffered) 생리식염수(PBS)를 0.1㎖/mouse로 꼬리 정맥내에 주 2회 투여하였다. 그 결과를 도 16에 나타내었다.

(2) 혈중 칼슘농도의 관찰

상기에서 제작, 무리분류한 악액질 모델동물에, 마우스 한마리당 10㎍ 혹은 100㎍의 인간형화항체 버젼q를 꼬리 정맥내에 2일 간격으로 2회 투여하였다. 대조적으로, 인산 완충용액 생리식염수(PBS)를 0.1㎖/mouse로 같은 방법을 사용하여 투여하였다.

(3) 혈중칼슘의 측정

인간형화항체 버젼q 첫 회 투여 후, 1일 및 4일째에 혈중 칼슘농도를 측정하고, 각 항체의 약효평가를 행하였다. 혈중 칼슘농도는 안와(orbit)를 통하여 헤마토크릿 관(hematocrit tube)으로 채혈하고, 643 자동 Ca/pH 분석기(CIBA-CORNING)을 이용하여 전혈이온화 칼슘농도로 측정하였다. 체중은 4일째까지 매일 측정하였다. 그 결과를 도 17 및 도 18에 나타내었다.

(4) 종양중량의 측정

종양체적은 첫 회 투여시 및 4일째에 종양의 장경(a ㎜) 및 단경(b ㎜)을 측정하여, 갈란트의 계산식(Galant's equation) ab²/2 에 의하여 산출하였다. 그 결과를 도 19에 나타내었다.

이상의 결과와 같이, 인간형화항체 버젼q를 10㎍ 혹은 100㎍을 투여함으로써 악성종양에 수반되는 혈중 칼슘농도의 상승 및 체중의 감소는 대조군에 비해 억제되었다. 또한, 인간형화항체 버젼q를 100㎍, 주 2회 투여한 경우, 대조군에 비해 의미 있는 생존기간의 연장(p=0.0108: Log Rank test)가 인정되었다. 이번 인간형화항체 버젼q의 악성종양에 수반되는 악액질 모델동물에 대한 효과는 이미 보고한 마우스 모노클로날 항체의 효과와 동일한 것이었다. 따라서, 본 항체의 악성종양에 수반되는 고칼슘혈증 및 악액질의 치료약으로서 유용성이 나타났다.

[참고예 1] 항PTHrP(1-34) 마우스 모노클로날 항체생산 하이브리도마의 제작

인간PTHrP(1-34)(서열번호 75)에 대한 모노클로날 항체생산 하이브리도마 #23-57-154 및 #23-57-137-1을 사토우칸지 등에 의해 제작되었다(참조: Sato, K. et al., J. Bone Miner. Res. 8, 849-860, 1993).

면역원으로서 사용하기 위해, PTHrP(1-34)(Peninsula제)와 캐리어 프로틴(carrier protein)인 티로글로불린(thyroglobulin)을 카보디이미드(carbodiimide)(Dojinn)을 이용하여 결합하였다. 티로글로불린과 결합한 PTHrP(1-34)를 투석하여, 단백농도로서 2㎍/㎎이 되도록 조제한 후, 프로인트 어쥬번트(Difco)와 1:1로 혼합하여 에멀전(emulsion) 제작 후, 16마리의 자성 BALB/C 마우스의 등부위 피하 또는 복강내에 동물당 100㎍을 11 회 면역하였다. 첫 회 면역은 프로인트 완전 어쥬번트를 이용하여 2 회째 이후의 추가면역에는 프로인트 불완전 어쥬번트를 사용하였다.

면역한 마우스의 혈청 중의 항체가의 측정은 이하의 방법으로 행하였다. 즉, 마우스 꼬리정맥으로부터 채혈하고, 혈청분리 후, RIA 완충용액으로 희석한 항혈청과 125I 표식 PTHrP(1-34)를 혼합하여 결합활성을 측정하였다. 항체가가 상승한 마우스의 복강에 캐리어 프로틴을 결합하고 있지 않은 PTHrP(1-34)를 동물당 50㎍을 최종 면역하였다.

최종 면역 3일째에 마우스를 도살하고 비장을 적출한 후, 비장세포와 마우스 미엘로마 세포주 P3x63Ag8U.1를 50% 폴리에틸렌 글리콜 4000을 이용하는 통상의 방법에 따라 세포융합하였다. 세포융합한 세포를 2×10⁴/well의 세포수로 85장의 96구멍의 플레이트에 접종하였다. 하이브리도마의 선별은 HAT배지를 이용하여 행하였다.

하이브리도마의 스크리닝은 HAT배지 중에서 생육이 인정된 구멍의 배양상청을 코팅 RIA법으로 PTHrP 인식항체의 유무를 측정, 선택하여 행하였다. 항체와의 결합능력을 인정받은 구멍에서 하이브리도마를 회수하고, 15%FCS를 함유하는 RPMI-1640 배지에 OPI-supplement(Sigma)를 첨가한 배지에 현탁하여 한계희석법으로 하이브리도마의 단일화를 실시하였다. PTHrP(1-34)와의 결합능력이 강한 클론 #23-57-154 및 #23-57-137-1을 얻었다.

또한, 하이브리도마 클론 #23-57-137-1은 mouse-mouse hybridoma #23-57-137-1로서 공업기술원 생명공학공업기술연구소(1-3, Higashi 1-chome, Tsukuba-shi, Ibaraki-Ken, Japan)에 평성 8년(1996년) 8월 15일자로 FERM BP-5631로서 부다페스트조약에 근거하여 국제기탁되어 있다.

[참고예 2] 인간PTHrP(1-34)에 대한 마우스 모노클로날 항체의 V영역을 코딩하는 DNA의 클로닝

인간PTHrP(1-34)에 대한 마우스 모노클로날 항체 #23-57-137-1의 가변영역을 코딩하는 DNA를 다음과 같이 클로닝하였다.

(1) mRNA의 조제

하이브리도마 #23-57-137-1로부터의 mRNA를 Quick Prep mRNA Purification Kit(Pharmacia Biotech 사)를 이용하여 조제하였다. 하이브리도마 #23-57-137-1의 세포를 추출용 완충용액으로 완전히 균질화(homogenized)하고, 키트 첨부의 처방에 따라 oligo(dT)-Cellulose Spun Column에서 mRNA를 정제하여 에탄올 침전을 행하였다. mRNA 침전물을 용출용 완출용액에서 용해하였다.

(2) 마우스 H쇄 V영역을 코딩하는 유전자의 cDNA의 제작 및 증폭

(ⅰ) #23-57-137-1 항체 H쇄 V영역 cDNA의 클로닝

인간PHTrP에 대한 마우스 모노클로날 항체의 H쇄 V영역을 코딩하는 유전자의 클로닝은, 5' -RACE법(참조: Frohman, M. A. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 85, 8998-9002, 1988; Belyavsky, A. et al. Nucleic Acids Res. 17, 2919-2932, 1989)에 의하여 행하였다. 5' -RACE법에는 5' -Ampli FINDER RACE Kit(CLONETECH사)를 이용하고, 조작은 키트 첨부의 처방에 따라 행하였다. cDNA 합성에 사용하는 프라이머는 마우스 H쇄 정상영역(C영역)과 혼성화하는하는 MHC2 프라이머(서열번호 1)을 이용하였다. 전기와 같이 하여 조제한 mRNA 약 2㎍을 주형으로 MHC2 프라이머 10pmole을 첨가, 역전사효소와 52℃, 30분간 반응시킴으로써 cDNA로의 역전사를 행하였다.

6N NaOH로 RNA를 가수분해(65℃, 30분간)한 후, 에탄올 침전에 의해 cDNA를 정제하였다. T4RNA 리가제로 37℃에서 6시간, 실온에서 16시간 반응함으로써, 합성한 cDNA의 5' 말단에 Ampli FINDER Anchor(서열번호 42)를 연결하였다. 이것을 주형으로 PCR에 의하여 증폭하기 위한 프라이머로서 Anchor 프라이머(서열번호 2) 및 MHC-G1 프라이머(서열번호 3)(참조: S.T.Jones, et al., Biotechnology, 9, 88, 1991)를 사용하였다.

PCR용액은 그 50㎕중에 10mM Tris-HCl(pH 8.3), 50mM KCl, 0.25mM dNTPs(dATP, dGTP, dCTP, dTTP), 1.5mM MgCl₂, 2.5 유니트(unit)의 TaKaRa Taq(옥주조), 10pmole의 앵커 프라이머, MHC-G1 프라이머 및 Ampli FINDER Anchor를 연결한 cDNA의 반응합성물 1㎕을 함유한다. 이 용액에 50㎕의 광유를 상층시키고, PCR은 Thermal Cycler Mode 1480J(Perkin Elmer)를 이용하여, 94℃에서 45초간, 60℃에서 45초간, 72℃에서 2분간의 온도사이클로 30회 행하였다.

(ⅱ) #23-57-137-1 항체 L쇄 V영역의 cDNA의 클로닝

인간PTHrP에 대한 마우스 모노클로날 항체의 L쇄 V영역을 코딩하는 유전자의 클로닝은, 5' -RACE법(참조: Frohman, M. A. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 85, 8998-9002, 1988; Belyavsky, A. et al., Nucleic Acids Res. 17, 2919-2932, 1989)에 의하여 행하였다. 5' -RACE법에는 5' -Ampli Finder RACE Kit(Clonetech)를 이용하고, 조작은 첨부의 처방에 따랐다. cDNA 합성에 사용하는 프라이머는, oligo-dT 프라이머를 이용하였다. 전기와 같이 조제한 mRNA 약 2㎍을 주형으로 oligooligo-dT 프라이머를 추가하여 역전사효소와 52℃, 30분간 반응시켜 cDNA로의 역전사를 행하였다. 6N NaOH로 RNA를 가수분해(65℃, 30분간)한 후, 에탄올 침전에 의해 cDNA를 정제하였다. 합성한 cDNA의 5' 말단에 전기 Ampli FINDER Anchor를 T4RNA 리가제로 37℃에서 6시간, 실온에서 16시간 반응시킴으로써 연결하였다.

마우스 L쇄쇄 정상영역의 보존서열로부터 PCR 프라이머 MLC(서열번호 4)를 설계하고, 394 DNA/RNA 합성기(ABI사)를 이용하여 합성하였다. PCR 용액은 그 100㎕중에 10 mM Tris-HCl(pH 8.3), 50mM KCl.25mM dNTPs(dATP, dGTP, dCTP, dTTP), 1.5mM MgCl₂, 2.5 유니트의 AmpliTaq(PERKIN ELMER), 50pmole의 Anchor 프라이머(서열번호 2), MLC(서열번호 4) 및 Ampli FINDER Anchor를 연결한 cDNA의 반응혼합물 1㎕를 함유한다. 이 용액에 50㎕의 광유를 상층시키고, PCR은 Thermal Cycler Model1480J(PERKIN ELMER)를 이용하여, 94℃에서 45초간, 60℃에서 45초간, 72℃에서 2분간의 온도사이클로 35회 행하였다.

(3) PCR 생성물의 정제 및 단편화

전기와 같이 하여, PCR법에 의하여 증폭한 DNA 단편을 3% Nu Sieve GTG 아가로스(agarose)(FMC Bio. Products)를 이용한 아가로스 젤(gel) 전기영동에 의하여 분리하였다. H쇄 V영역으로서 약 550bp 장, L쇄 V영역으로서 약 550bp 장의 DNA 단편을 함유하는 아가로스편을 절취하고, GENECLEANⅡ Kit(BI0101)을 이용하여 키트 첨부의 처방에 따라 DNA단편을 정제하였다. 정제한 DNA를 메탄올에서 침전시킨 후, 10mM Tris-HCl(pH 7.4), 1mM EDTA 용액 20㎕에 용해하였다. 얻어진 DNA용액 1㎕를 제한효소 XmaI(New England Biolabs)에 의해 37℃에서 1시간 소화하고, 계속해서 제한효소 EcoRI(옥주조)에 의하여 37℃에서 1시간 소화하였다. 이 소화혼합물을 페놀(phenol) 및 클로로포름(chloroform)으로 추출, 에탄올 침전에 의해 DNA를 회수하였다.

이렇게 하여, 5' -말단에 EcoRI 인식서열을 갖고, 3' -말단에 XmaI 인식서열을 갖는 마우스 H쇄 V영역 및 L쇄 V영역을 코딩하는 유전자를 함유하는 DNA단편을 얻었다.

상기와 같이 하여 조제한 마우스 H쇄 V영역 및 L쇄 V영역을 코딩하는 유전자를 함유하는 EcoRI-XmaI DNA단편과 EcoRI 및 XmaI로 소화하여 제조한 pUC19 벡터를 DNA 라이게이션 키트(ligation kit) ver. 2(옥주조)를 이용하여, 첨부의 처방에 따라 16℃에서 1시간 반응시켜 연결하였다. 다음으로 10㎕의 상기 연결혼합물을 대장균 JM109 경쟁세포(competent cells)(Nippon Gene Co., Ltd.) 100㎕에 첨가하고, 이 세포를 빙상에서 15분간, 42℃에서 1분간, 다시 빙상에서 1분간 정치하였다. 이어서, 300㎕의 SOC배지(참조: Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Sambrook, et al., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)를 첨가하고 37℃에서 30분간 인큐베이터에 넣은 후, 100㎕/㎖ 또는 50㎕/㎖의 암피실린(ampicillin), 0.1㎖의 IPTG, 20㎕/㎖의 X-gal을 함유하는 LB 한천배지 또는 2×YT 한천배지(Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Sambrook, et al., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)상에 이 대장균을 접종하고, 37℃에서 하룻밤 인큐베이터에 저장하여 대장균 형질전환체를 얻었다.

이 형질전환체를 100㎕/㎖ 또는 50㎕/㎖의 암피실린을 함유하는 LB 배지 또는 2×YT배지 2㎖에서 37℃에서 하룻밤 배양하여, 균체의 일부분(cell fraction)에서 플라스미드 추출기(plasmid extractor) PI-100Σ(Kurabo Industries, Ltd.) 또는 QIAprep Spin Plasmid Kit(QIAGEN)을 이용하여 플라스미드 DNA를 조제, 염기서열의 결정을 행하였다.

(4) 마우스 항체 V영역을 코딩하는 유전자의 염기서열 결정

전기의 플라스미드 중의 cDNA 코드영역의 염기서열을 Dye Terminator Cycle sequencing kit(PERKIN ELMER)을 이용하여, DNA Sequencer 373A(ABI사 PERKIN ELMER)에 의하여 결정하였다. 서열결정용 프라이머로서 M13 Primer M4(옥주조)(서열번호 5) 및 M13 Primer RV(옥주조)(서열번호 6)을 이용하여, 양방향의 염기서열을 확인함으로써 서열을 결정하였다.

이렇게 하여 얻어진 하이브리도마 #23-57-137-1에 유래하는 마우스 H쇄 V영역을 코딩하는 유전자를 함유하는 플라스미드를 MBC1H04, L쇄 V영역을 코딩하는 유전자를 함유하는 플라스미드를 MBC1L24라 명명하였다. 플라스미드 MBC1H04 및 MBC1L24에 함유되는 마우스 #23-57-137-1 항체의 H쇄 V영역 및 L쇄 V영역을 코딩하는 유전자의 염기서열(대응하는 아미노산 서열을 함유한다)을 각각 서열번호 57, 65에 나타낸다. H쇄 V영역 및 L쇄 V영역 단편의 폴리펩티드는, 함께 서열번호 57, 65에 표시되는 염기서열의 제 58번째(글루타민(glutamine)을 코딩한다)부터 개시되어 있다. 이들 아미노산 서열을 H쇄 V영역의 단편에 대하여 서열번호 46, L쇄 V영역의 단편에 대하여는 서열번호 45에 나타낸다.

또한, 전기 플라스미드 MBC1H04 및 MBC1L24를 갖는 대장균은 Escherichia coli JM109(MBC1H04) 및 Escherichia coli JM109(MBC1L24)로서, 공업기술원 생명공학공업기술연구소(1-3, Higashi 1-chome, Tsukuba-shi, Ibaraki, Japan)에, 평성 8년(1996년) 8월 15일자로 Escherichia coli JM109(MBC1H04)에 관해서는 FERM BP-5628, Escherichia coli JM109(MBC1L24)에 관해서는 FERM BP-5627로 부다페스트 조약에 근거하여 국제기탁되어 있다.

(5) 인간PHrP에 대한 마우스 모노클로날 항체 #23-57-137-1의 CDR의 결정

H쇄 V영역 및 L쇄 V영역의 전반적 구조는, 상호 유사성을 갖고 있으며, 각각 4개의 프레임워크 부분이 3개의 초가변영역, 즉 상보성 결정영역(CDR)에 의해 연결되어 있다. 프레임워크의 서열예는 비교적 잘 보존되어 있으나, 한편 CDR영역의 아미노산 서열의 변이성은 매우 높다(참조: 카밭(Kabat), E. A. et al., 「Sequence of Proteins of Immunological Interest」US Dept. Health and Human services, 1983). 이와 같은 사실에 근거하여, 인간 PTHrP에 대한 마우스 모노클로날 항체의 가변영역의 아미노산 서열을 카밭(Kabat) 등에 의해 작성된 항체의 아미노산 서열의 데이터베이스에 적용하여, 상동성(homology)을 조사함으로써 CDR 영역을 표 1에 나타낸 것과 같이 결정하였다.

또한, L쇄 V영역의 CDR1∼3의 아미노산 서열에 관해서는 각각 서열번호 59∼61에 나타내고, H쇄 V영역의 CDR1∼3의 아미노산 서열에 관하여는 각각 서열번호 62∼64에 나타내었다.

V영역	서열번호	CDR1	CDR2	CDR3
H쇄V영역	57	31-35	50-66	99-107
L쇄V영역	65	23-34	50-60	93-105

[참고예 3] 키메라 항체의 구축

(1) 키메라 항체 H쇄의 구축

(ⅰ) H쇄 V영역의 구축

인간 H쇄 C영역 C1의 게놈 DNA(genomic DNA)를 함유하는 발현 벡터에 연결하기 위하여, 클로닝한 마우스 H쇄 V영역을 PCR법에 의해 수식하였다. 후방 프라이머 MBC1-S1(서열번호 7)은 V영역의 리더서열의 5' -측을 코딩하는 DNA에 혼성화하고, 코작(Kozak)의 콘센서스 서열(consensus sequence)(참조: 코작(Kozak), M. et al., J. Mol. Biol., 196, 947-950, 1987) 및 제한효소 Hind Ⅲ의 인식서열을 갖도록 설계하였다. 전방 프라이머 MBC1-a(서열번호 8)은 J영역의 3' -측을 코딩하는 DNA서열에 혼성화하고, 또한 도너 스플라이스 서열(donor splice sequence) 및 제한효소 BamHI의 인식서열을 갖도록 설계하였다. PCR은, TaKaRa Ex Taq(옥주조)를 이용하여, 50㎕의 반응혼합액에 주형 DNA로서 0.07㎕의 플라스미드 MBC1H04, 프라이머로서 MBC1-a 및 MBC-S1을 각각 50pmole, 2.5U의 TaKaRa Ex Taq, 0.25mM의 dNTP를 함유하는 조건에서 첨부 완충액을 사용하여 50㎕의 광유를 상층시켜, 94℃에서 1분간, 55℃에서 1분간, 72℃에서 2분간의 온도사이클로 30회 행하였다. PCR법에 의하여 증폭한 DNA단편을 3% Nu Sieve GTG 아가로스(FMC Bio. Products)를 이용한 아가로스 젤 전기영동에 의해 분리하였다.

437bp 장의 DNA단편을 함유하는 아가로스편을 절취하고, GENECLEANⅡ Kit(BI0101)을 이용하여 키트 첨부의 처방에 따라 DNA 단편을 정제하였다. 정제한 DNA를 에탄올 침전에서 회수한 후, 10mM Tris-HCl(pH 7.4), 1mM EDTA 용액 20㎕에 용해하였다. 얻어진 DNA용액 1㎖를 제한효소 BamHI, HindⅢ(옥주조)에 의해 37℃ 1시간 소화하였다. 이 소화 혼합물을 페놀 및 클로로포름으로 추출, 에탄올 침전에 의해 DNA를 회수하였다.

상기와 같이 하여 조제한 마우스 H쇄 V영역을 코딩하는 유전자를 포함하는 Hind Ⅲ BamHI DNA 단편을 Hind Ⅲ 및 BamHI 로 소화하여 조제한 pUC19 벡터에 서브클로닝(subcloned)하였다. 이 플라스미드의 염기서열을 확인하기 위해 프라이머 M13 Primer M4 및 M13 Primer RV를 프라이머로써, Dye Terminator Cycle Sequencing kit(PERKIN ELMER)를 이용하여 DNA Sequencer 373A(PERKIN ELMER)에 의하여 염기서열을 결정하였다. 올바른 염기서열을 갖는 하이브리도마 #23-57-137-1에 유래하는 마우스 H쇄 V영역을 코딩하는 유전자를 함유하고, 5' -측에 HindⅢ인식서열 및 코작(Kozak) 서열, 3' -측에 BamHI 인식서열을 갖는 플라스미드를 MBC1H/pUC19라 명명하였다.

(ⅱ) cDNA타입의 마우스-인간 키메라 H쇄의 제작을 위한 H쇄 V영역의 구축

인간 H쇄C영역C1의 cDNA와 연결하기 위하여, 상기와 같이 하여 구축한 마우스 H쇄 V영역을 PCR법에 의하여 수식하였다. H쇄 V영역을 위한 후방 프라이머 MBC1HVS2(서열번호 9)는 V영역의 리더서열의 최초를 코딩하는 서열의 2번의 아스파라긴(asparagine)을 글리신으로 전환하고, 여기에 코작(Kozak) 콘센서스 서열(참조: Kozak, M. et al., J. Mol. Biol., 196, 947-950, 1987), Hind Ⅲ 및 EcoRI 인식서열을 갖도록 설계하였다. H쇄 V영역을 위한 전방 프라이머 MBC1HVR2(서열번호 10)은 J영역의 3' -측을 코딩하는 DNA 서열에 혼성화하고, C영역의 5' -측의 서열을 코딩하여 ApaⅠ 및 SmaⅠ 인식서열을 갖도록 설계하였다.

PCR은, TaKaRa Ex Taq(옥주조)를 이용하여, 50㎕의 반응혼합액에 주형 DNA로서 0.06㎍의 플라스미드 MBC1H/pUC19, 프라이머로서 MBC1HVS2 및 MBC1HVR2을 각각 50pmole, TaKaRa Ex Taq를 2.5U, 0.25mM의 dNTP를 함유하는 조건에서 첨부 완충액을 사용하여 50㎕의 광유를 상층시켜, 94℃에서 1분간, 55℃에서 1분간, 72℃에서 1분간의 온도사이클로 30회 행하였다. PCR법에 의하여 증폭한 DNA단편을 1% Sea Kem GTG 아가로스(FMC Bio. Products)를 이용한 아가로스 젤 전기영동에 의해 분리하였다. 456bp 장의 DNA단편을 함유하는 아가로스편을 절취하고, GENECLEANⅡ Kit(BI0101)을 이용하여 키트 첨부의 처방에 따라 DNA 단편을 정제하였다. 정제한 DNA를 에탄올 침전시킨 후, 10mM Tris-HCl(pH 7.4), 1mM EDTA 용액 20㎕에 용해하였다.

얻어진 DNA 용액 1㎕를 제한효소 EcoRI 및 SmaI(옥주조)에 의하여 37℃에서 1시간 소화하였다. 이 소화혼합물을 페놀 및 클로로포름으로 추출하고, 에탄올 침전에 의하여 DNA를 회수하였다. 상기와 같이 하여 조제한 마우스 H쇄 V영역을 코딩하는 유전자를 포함하는 EcoRI-SmaI DNA 단편을 EcoRI 및 SmaI로 소화하여 조제한 pUC19 벡터에 서브클로닝하였다. 이 플라스미드의 염기서열을 확인하기 위해 프라이머 M13 Primer M4 및 M13 Primer RV를 프라이머로서, Dye Terminator Cycle Sequencing kit(PERKIN ELMER)를 이용하여 DNA Sequencer 373A(PERKIN ELMER)에 의하여 염기서열을 결정하였다. 올바른 염기서열을 갖는 하이브리도마 #23-57-137-1에 유래하는 마우스 H쇄 V영역을 코딩하는 유전자를 함유하고, 5' -측에 EcoRI, HindⅢ 인식서열 및 코작(Kozak) 서열, 3' -측에 ApaI 및 SmaI 인식서열을 갖는 플라스미드를 MBC1Hv/pUC19라 명명하였다.

(ⅲ) 키메라 항체 H쇄의 발현 벡터의 구축

인간항체 H쇄 C영역 C1을 함유하는 cDNA는 이하와 같이 하여 조제하였다. 즉, 인간형화 PM1 항체 H쇄 V영역 및 인간항체 H쇄 C영역 IgG1의 게놈 DNA(참조: N. Takahashi, et al., Cell 29, 671-679, 1982)를 코딩하는 발현 벡터 DHFR-△E-RVh-PM-1-f(참조: WO92/19759)와 인간형화 PM1 항체 L쇄 V영역 및 인간항체 L쇄 κ쇄 C영역의 게놈 DNA를 코딩하는 발현벡터 RV1-PM1a(참조: WO92/19759)를 도입한 CHO세포로부터 mRNA를 조제, RT-PCR법으로 인간형화 PM1항체 H쇄 V영역 및 인간항체 C영역 C1을 함유하는 cDNA를 클로닝하여, pUC19의 HindⅢ와 BamHI 부위에 서브클로닝하였다. 염기서열을 확인한 후, 올바른 서열을 갖는 플라스미드를 pRVh-PM1f-c DNA라 명명하였다.

DHFR-△E-RVh-PM-1-f상의 SV40 프로모터와 DHFR 유전자 사이에 있는 HindⅢ 부위 및 EF-1α프로모터와 인간형화 PM1 항체 H쇄 V영역 사이에 있는 EcoRI 부위를 결실한 발현 벡터를 제작하고, 인간형화 PM1 항체 H쇄 V영역 및 인간항체 C영역 C1을 함유하는 cDNA의 발현 벡터의 구축을 위해 사용하였다.

pRVh-PM1f-cDNA를 BamHI로 소화한 후, 클레노우(Klenow) 단편(fragment)으로 평활화하고 HindⅢ로 소화하여 HindⅢ-BamHI 평활화단편을 조제하였다. 이 HindⅢ-BamHI 평활화단편을 상기의 HindⅢ 및 EcoRI 부위가 결실한 DHFR-△E-RVh-PM-1-f를 HindⅢ 및 SmaI로 소화하여 조제한 발현 벡터에 연결하고, 인간형화 PM1 항체 H쇄 V영역 및 인간항체 C영역 C1을 코딩하는 cDNA를 함유하는 발현벡터 RVh-PM1f-cDNA를 구축하였다.

인간형화 PM1 항체 H쇄 V영역 및 인간항체 C영역 C1을 코딩하는 cDNA를 함유하는 발현 벡터 RVh-PM1f-cDNA를 ApaI 및 BamHI로 소화한 후, H쇄 C영역을 함유하는 DNA 단편을 회수하고, ApaI 및 BamHI로 소화하여 조제한 MBC1Hv/pUC19에 도입하였다. 이렇게 하여 제작한 플라스미드를 MBC1HcDNA/pUC19라 명명하였다. 이 플라스미드는 마우스 항체의 H쇄 V영역 및 인간항체 C영역 C1을 코딩하는 cDNA를 함유하며, 5'-말단에 EcoRI 및 HindⅢ 인식서열, 3'-말단에 BamHI 인식서열을 갖는다.

플라스미드 MBC1HcDNA/pUC19를 EcoRI 및 BamHI로 소화하고, 얻어진 키메라 항체의 H쇄를 코딩하는 염기서열을 갖는 DNA 단편을 EcoRI 및 BamHI로 소화하여 조제한 발현 벡터 pCOS1에 도입하였다. 이렇게 하여 얻어진 키메라 항체의 발현 플라스미드를 MBC1HcDNA/pCOS1이라 명명하였다. 또한, 발현 벡터 pCOS1은 HEF-PMh-g1(참조: WO92/19759)로부터 EcoRI 및 SmaI 소화에 의하여 항체 유전자를 삭제하고, EcoRI-NotI-BamI Adaptor(옥주조)를 연결함으로써 구축하였다.

또한, CHO 세포에서의 발현에 이용하기 위한 플라스미드를 제작하기 위하여 플라스미드 MBC1HcDNA/pUC19를 EcoRI 및 BamHI로 소화하고, 얻어진 키메라 항체 H쇄서열을 함유하는 DNA 단편을 EcoRI 및 BamHI로 소화하여 조제한 발현 플라스미드 pCHO1에 도입하였다. 이렇게 얻어진 키메라 항체의 발현 플라스미드를 MBC1HcDNA/pCHO1라 명명하였다. 또한, 발현 벡터 pCHO1는 DHFR-△E-RVh-PM-1-f(참조: WO92/19759)에서, EcoRI 및 SmaI 소화에 의하여 항체 유전자를 삭제하고, EcoRI-NotI-BamI Adaptor(옥주조)를 연결함으로써 구축하였다.

(2) 인간 L쇄 정상영역의 구축

(ⅰ) 클로닝 벡터의 제작

인간 H쇄 정상영역을 함유하는 pUC19 벡터를 구축하기 위하여, HindⅢ 부위 결실 pUC19 벡터를 제작하였다. pUC19 벡터 2㎕를 20mM Tris-HCl(pH 8.5), 10mM MgCl₂, 1mM DTT, 100mM KCl, 8U의 HindⅢ(옥주조)를 함유하는 반응혼합액 20㎕중 37℃에서 1시간 소화하였다. 소화혼합액을 페놀 및 클로로포름으로 추출하고, DNA를 에탄올침전에 의하여 회수하였다.

회수한 DNA를 50mM Tris-HCl(pH 7.5), 10mM MgCl₂, 1mM DTT, 100mM NaCl, 0.5mM dNTP, 6U의 클레노우(Klenow) 단편(GIBCO BRL)을 함유하는 50㎕의 반응혼합액 중 실온에서 20분간 반응시켜, 말단을 평활화하였다. 반응혼합액을 페놀 및 클로로포름으로 추출하고, 벡터 DNA를 에탄올 침전에 의하여 회수하였다.

회수한 벡터 DNA를 50mM Tris-HCl(pH 7.6), 10mM MgCl₂, 1mM ATP, 1mM DTT, 5%(v/v) 폴리에틸렌 글리콜 8000, 0.5U의 T4 DNA 리가제(GIBCO BRL)를 함유하는 반응혼합액 10㎕중에서 16℃에서 2시간 반응시켜 자기연결시켰다. 반응혼합액 5㎕를 대장균 JM109 경쟁세포(Nippon Gene Co., Ltd.) 100㎕에 첨가하고, 빙상에서 30분간 정치한 후, 42℃에서 1분간, 다시 빙상에서 1분간 정치하였다. SOC배지 500㎕를 첨가하고 37℃에서 1시간 인큐베이터에 넣은 후, X-gal과 IPTG를 표면에 칠한 2×YT 한천배지(50㎕/㎖의 암피실린 함유)(참조: Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Sambrook, et al., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)에 접종하고, 37℃에서 하룻밤 배양하여 형질전환체를 얻었다.

이 형질전환체를 50㎕/㎖의 암피실린을 함유하는 2×YT배지 20㎖에서 37℃에서 하룻밤 배양하여, 균체의 일부분(cell fraction)에서 플라스미드 추출기(plasmid extractor) PI-100Σ(Kurabo Industries, Ltd.) 또는 QIAprep Spin Mini Kit(QIAGEN)을 이용하여, 첨부의 처방에 따라 플라스미드 DNA를 정제하였다. 정제한 플라스미드를 HindⅢ로 소화하고, HindⅢ 부위가 결실되어 있음을 확인한 플라스미드를 pUC19△HindⅢ라 명명하였다.

(ⅱ) 인간 L쇄 쇄 정상영역을 코딩하는 유전자의 구축

인간L쇄 쇄 영역은, Mcg+ Ke+ Oz-, Mcg- Ke- Oz- , Mcg- Ke- Oz+ , Mcg- Ke+ Oz- 의 적어도 4종류의 아이소타입(isotype)이 알려져 있다(참조: P. Dariavach, et al., Proc. natl. Acad. Sci. U.S.A., 84, 9074-9078, 1987). #23-57-137-1 마우스 L쇄 쇄 C영역과 상보성을 갖는 인간항체 L쇄 쇄 C영역을 EMBL 데이타베이스로 검색한 결과, 아이소타입이 Mcg+ Ke+ Oz- (accession No.X57819)(참조: P. Dariavach, et al., Proc. Natl. Acad. Sci., U.S.A., 84, 9074-9078, 1987)의 인간항체 L쇄 쇄가 가장 높은 상보성을 보이며, #23-57-137-1 마우스 L쇄 쇄 C영역과의 상보성은 아미노산 서열에서 64.4%, 염기서열에서 73.4%였다.

그래서, 이 인간항체 L쇄 쇄 C영역을 코딩하는 유전자의 구축을 PCR법을 이용하여 행하였다. 각 프라이머의 합성은 394 DNA/RNA 합성기(ABI사)를 이용하여 행하였다. HLAMB1(서열번호 11) 및 HLAMB3(서열번호 13)은 센스(sense) DNA서열을 가지며, HLAMB2(서열번호 12) 및 HLAMB4(서열번호 14)는 안티센스(antisense) DNA서열을 갖고, 각각의 프라이머의 양단에 20부터 23bp의 상보적 서열을 갖는다.

외부 프라이머 HLAMBS(서열번호 15) 및 HLAMBR(서열번호 16)은 HLAMB1, HLAMB4와 각각 상동의 서열을 갖고 있으며, 또한, HLAMBS은 EcoRI, HindⅢ, BlnI 인식서열을, HLAMBR은 EcoRI 인식서열을 각각 함유하고 있다. 제 1PCR에서 HLAMB1-HLAMB2와 HLAMB3-HLAMB4의 반응을 행하였다. 반응 후, 그것들을 등량혼합하고, 제 2PCR에서 어셈블리(assembly)를 행하였다. 또한, 외부 프라이머 HLAMBS 및 HLAMBR을 추가하고, 제 3PCR에 의하여 전장 DNA를 증폭시켰다.

PCR은, TaKaRa Ex Taq(옥주조)를 이용하여, 첨부의 처방에 따라 행하였다.

제 1PCR에서는 5pmole의 HLAMB1 및 0.5pmole의 HLAMB2과 5U의 TaKaRa Ex Taq(옥주조)를 함유하는 100㎕의 반응혼합액, 또는 0.5pmole의 HLAMB3 및 5pmole의 HLAMB4와 5U의 TaKaRa Ex Taq(옥주조)를 함유하는 100㎕의 반응혼합액을 이용하여, 50㎕의 광유를 상층시켜, 94℃에서 1분간, 60℃에서 1분간, 72℃에서 1분간의 온도사이클로 5회 행하였다.

제 2PCR은, 반응액을 50㎕씩 혼합하고, 50㎕의 광유를 상층시켜 94℃에서 1분간, 60℃에서 1분간, 72℃에서 1분간의 온도사이클로 3회 행하였다.

제 3PCR은, 반응액에 외부 프라이머 HLAMBS 및 HLAMBR을 각 50pmole씩 첨가하여, 94℃에서 1분간, 60℃에서 1분간, 72℃에서 1분간의 온도사이클로 30회 행하였다.

제 3PCR 산물의 DNA단편을 3% 저융점 아가로스 젤(NuSieve GTG Agaros, FMC) 로 전기영동한 후, GENECLEANⅡ Kit(BI0101)을 이용하여 키트 첨부의 처방에 따라 젤로부터 회수, 정제하였다.

얻어진 DNA 단편을 50mM Tris-HCl(pH 7.5), 10mM MgCl₂, 1mM DTT, 100mM NaCl, 8U의 EcoRI(옥주조)를 함유하는 20㎕의 반응혼합액 중 37℃에서 1시간 소화하였다. 소화혼합액을 페놀 및 클로로포름으로 추출하고, DNA를 에탄올침전에 의하여 회수한 후, 10mM Tris-HCl(pH 7.4), 1mM EDTA 용액 8㎍에 용해하였다.

플라스미드 pUC19 △HindⅢ 0.8㎕를 동일한 방법으로 EcoRI에서 소화하고, 페놀 및 클로로포름으로 추출하고, 에탄올침전에 의하여 회수하였다. 소화한 플라스미드 pUC19 △HindⅢ를 50mM Tris-HCl(pH 9.0), 1mM MgCl₂, 알칼린 포스파타제(alkaline phosphatase) (E. coli C75, 옥주조)를 함유하는 반응혼합액 50㎕중 37℃에서 30분간 반응시켜 탈인산처리(BAP처리)하였다. 반응액을 페놀 및 클로로포름으로 추출하고, DNA를 에탄올침전에 의하여 회수한 후, 10mM Tris-HCl(pH 7.4), 1mM EDTA 용액 10㎕에 용해하였다.

상기 BAP처리한 플라스미드 pUC19 △HindⅢ와 앞의 PCR산물 4㎕를 DNA Ligation Kit Ver.2(옥주조)를 이용하여 연결하고, 대장균 JM109 경쟁세포로 형질전환하였다. 얻어진 형질전환체를 50㎍/㎖ 암피실린을 함유하는 2×YT 배지 2㎖에서 하룻밤 배양하고, 균체의 일부분에서 QIAprep Spin Plasmid Kit(QIAGEN)을 이용하여 플라스미드를 정제하였다.

상기 플라스미드에 관하여, 클로닝된 DNA의 염기서열의 확인을 하였다. 염기서열의 결정에는 373A DNA sequencer(ABI사)를 이용하고, 프라이머에는 M13 Primer M4 및 M13 Pricer RV(옥주조)를 이용하였다. 그 결과, 클로닝된 DNA의 내부에 12bp의 결실이 있음이 판명되었다. 이 DNA를 함유하는 플라스미드를 C△/pUC19라 명명하였다. 그래서, 그 부분을 보충하기 위한 프라이머 HCLMS(서열번호 17), HCLMR(서열번호 18)을 새로이 합성하고, PCR에서 다시 한번 올바를 DNA를 구축하였다.

제 1PCR에서 결실 DNA를 함유하는 플라스미드 C△/pUC19를 주형으로 하여, 프라이머 HCLMS와 HCLMR, HCLMS와 HLAMB4에서 반응을 행하였다. PCR 산물을 각각 정제하고, 제 2PCR에서 어셈블리를 행하였다. 또한, 외부 프라이머 HLAMBS 및 HLAMB4를 첨가하고, 제 3PCR에 의하여 전장 DNA를 증폭시켰다.

제 1PCR에서는 주형으로서 C△/pUC19 0.1㎍, 프라이머 HCLMS 및 HCLMR 각 50pmole, 또는 HCLMS 및 HLAMB4 각 50pmole, 5U의 TaKaRa Ex Taq(옥주조)를 함유하는 100㎕의 반응혼합액 이용하여, 50㎕의 광유를 상층시켜, 94℃에서 1분간, 60℃에서 1분간, 72℃에서 1분간의 온도사이클로 30회 행하였다.

PCR 산물 HLAMBS-HCLMR(236bp), HCLMS-HLAMB4(147bp)를 각각 3% 저융점 아가로스 젤에서 전기영동한 후, GENECLEANⅡ Kit(BI0101)을 이용하여 젤로부터 회수, 정제하였다.

제 2PCR에서는, 정제 DNA 단편 각 40ng, 1U의 TaKaRa Ex Taq(옥주조)를 함유하는 20㎕의 반응혼합액 이용하여, 25㎕의 광유를 상층시켜, 94℃에서 1분간, 60℃에서 1분간, 72℃에서 1분간의 온도사이클로 5회 행하였다.

제 3PCR에서는, 제 2PCR 반응액 2㎕, 외부 프라이머 HLAMBS, HLAMB4을 각 50pmole, 5U의 TaKaRa Ex Taq(옥주조)를 함유하는 100㎕의 반응혼합액을 이용하여, 50㎕의 광유를 상층시켰다. PCR은 94℃에서 1분간, 60℃에서 1분간, 72℃에서 1분간의 온도사이클로 30회 행하였다.

제 3PCR 산물인 DNA 단편을 3% 저융점 아가로스 젤에서 전기영동한 후, GENECLEANⅡ Kit(BI0101)을 이용하여 젤로부터 회수, 정제하였다.

얻어진 DNA 단편 0.1㎍을 EcoRI에서 소화한 후, BAP처리한 플라스미드 pUC19 △HindⅢ에 서브클로닝하였다. 대장균 JM109 경쟁세포로 형질전환하고, 50㎍/㎖ 암피실린을 함유하는 2×YT 배지 2㎖에서 하룻밤 배양하고, 균체의 일부분에서 QIAprep Spin Plasmid Kit(QIAGEN)을 이용하여 플라스미드를 정제하였다.

정제한 플라스미드에 관하여 염기서열을 M13 Primer M4, M13 Primer RV(옥주조)를 이용하고, 373A DNA sequencer(ABI사)에서 결정하였다. 결실이 없는 올바를 염기서열을 갖고 있음이 확인된 플라스미드를 C/pUC19로 하였다.

(ⅲ) 인간 L쇄 κ쇄영역을 코딩하는 유전자의 구축

플라스미드 HEF-PM1k-gk(WO92/19759)로부터 L쇄 κ쇄 C영역을 코딩하는 DNA 단편을 PCR법을 이용하여 클로닝하였다. 394 DNA/RNA 합성기(ABI사)를 이용하여 합성한 전방 프라이머 HKAPS(서열번호 19)는 EcoRI, HindⅢ, BlnI 인식서열을, 후방 프라이머 HKAPA(서열번호 20)는 EcoRI 인식서열을 갖도록 설계하였다.

주형이 되는 플라스미드 HEF-PM1k-gk 0.1㎍, 프라이머 HKAPS, HKAPA 각 50pmole, 5U의 TaKaRa Ex Taq(옥주조)를 함유하는 100㎕의 반응혼합액을 이용하여, 50㎕의 광유를 상층시켰다. 94℃에서 1분간, 60℃에서 1분간, 72℃에서 1분간의 온도사이클로 30회 행하였다. 360bp의 PCR 산물을 3% 저융점 아가로스 젤에서 전기영동한 후, GENECLEANⅡ Kit(BI0101)을 이용하여 젤로부터 회수, 정제하였다.

얻어진 DNA 단편을 EcoRI에서 소화한 후, BAP처리한 플라스미드 pUC19 △HindⅢ에 서브클로닝하였다. 대장균 JM109 경쟁세포로 형질전환하고, 50㎍/㎖ 암피실린을 함유하는 2×YT 배지 2㎖에서 하룻밤 배양하고, 균체의 일부분에서 QIAprep Spin Plasmid Kit(QIAGEN)을 이용하여 플라스미드를 정제하였다.

정제한 플라스미드의 염기서열을 M13 Primer M4, M13 Primer RV(옥주조)를 이용하고, 373A DNA sequencer(ABI사)에서 결정하였다. 올바를 염기서열을 갖고 있음이 확인된 플라스미드를 Cκ/pUC19로 하였다.

(3) 키메라항체 L쇄 발현 벡터의 구축

키메라 #23-57-137-1항체 L쇄 발현 벡터를 구축하였다. 플라스미드 C/pUC19, Cκ/pUC19의 인간항체 정상영역의 직전에 있는 HindⅢ, BlnI부위에 #23-57-137-1 L쇄 V영역을 코딩하는 유전자를 연결함으로써, 각각 키메라#23-57-137-1 항체 L쇄 V영역 및 L쇄 쇄 또는 L쇄 κ쇄 정상영역을 코딩하는 pUC19벡터를 제작하였다. EcoRI 소화에 의하여 키메라 항체 L쇄 유전자를 잘라내고, HEF 발현 벡터로 서브클로닝하였다.

즉, 플라스미드 MBC1L24로부터 #23-57-137-1 항체 L쇄 V영역을 PCR법을 이용하여 클로닝하였다. 각 프라이머의 합성은 394 DNA/RNA 합성기(ABI사)를 이용하여 행하였다. 후방 프라이머 MBCCHL1(서열번호 21)은 Hind Ⅲ 인식서열과 코작(Kozak) 서열(Kozak, M. et al., J. Mol. Biol., 196, 947-950, 1987)을, 전방 프라이머 MBCCHL3(서열번호 22)는 Bg1II, EcoPI 인식서열을 갖도록 설계하였다.

PCR은 10mM Tris-HCl(pH 8.3), 50mM KCl, 1.5mM MgCl₂, 0.2mM dNTP, 0.1㎍의 MBC1L24, 프라이머로 MCCHL1 및 MBCCHL3을 각 50pmole, 1㎕의 AmpliTaq(PERKIN ELMER)를 함유하는 100㎕의 반응혼합액을 이용하여, 50㎕의 광유를 상층시켜, 94℃에서 45초간, 60℃에서 45초간, 72℃에서 2분간의 온도사이클로 30회 행하였다.

444bp의 PCR 산물을 3% 저융점 아가로스 젤에서 전기영동한 후, GENECLEANⅡ Kit(BI0101)을 이용하여 젤로부터 회수, 정제하고, 10mM Tris-HCl(pH 7.4), 1mM EDTA용액 20㎕에 용해하였다. PCR 산물 1㎕를 각각 10mM Tris-HCl(pH 7.5), 10mM MgCl₂, 1mM DTT, 50mM NaCl, 8U의 HindⅢ(옥주조) 및 8U의 EcoRI(옥주조) 를 함유하는 반응혼합액 20㎕중 37℃에서 1시간 소화하였다. 소화혼합액을 페놀 및 클로로포름으로 추출하고, DNA를 에탄올 침전에 의하여 회수한 후, 10mM Tris-HCl(pH 7.4), 1mM EDTA 용액 8㎕에 용해하였다.

플라스미드 pUC19 1㎍를 동일한 방법으로 HindⅢ 및 EcoRI에서 소화하고, 페놀 및 클로로포름으로 추출하고, 에탄올 침전에 의하여 회수하여 알칼린 포스파타제(E. coli C75, 옥주조)에서 BAP처리하였다. 반응액을 페놀 및 클로로포름으로 추출하고, DNA를 에탄올침전에 의하여 회수한 후, 10mM Tris-HCl(pH 7.4), 1mM EDTA 용액 10㎕에 용해하였다.

BAP처리한 플라스미드 pUC19 1㎕와 앞의 PCR산물 4㎕를 DNA Ligation Kit Ver.2(옥주조)를 이용하여 연결하고, 대장균 JM109 경쟁세포(Nippon Gene Co., Ltd.)로 전기와 같은 방법으로 형질전환하였다. 이것을 50㎍/㎖ 암피실린을 함유하는 2 x YT 한천배지에 접종하여, 37℃에서 하룻밤 배양하였다. 얻어진 형질전환체를 50㎍/㎖ 암피실린을 함유하는 2 x YT 배지 2㎖ 중, 37℃에서 하룻밤 배양하였다. 균체의 일부분에서 QIAprep Spin Plasmid Kit(QIAGEN)을 이용하여 플라스미드를 정제하였다. 염기서열을 결정 후, 올바른 염기서열을 갖는 플라스미드를 CHL/pUC19로 하였다.

플라스미드C/pUC19, Cк/pUC19 각 1㎍을 각각 20mM Tris-HCl(pH 8.5), 10mM MgCl₂, 1mM DTT, 100mM KCl, 8U의 HindⅢ(옥주조) 및 2U의 BlnI(옥조주)를 함유하는 반응혼합액 20㎕중 37℃에서 1시간 소화하였다. 소화혼합액을 페놀 및 클로로포름으로 추출하고, DNA를 에탄올침전에 의하여 회수한 후, 37℃에서 30분간 BAP처리를 행하였다. 반응액을 페놀 및 클로로포름으로 추출하고, DNA를 에탄올침전에 의하여 회수한 후, 10mM Tris-HCl(pH 7.4), 1mM EDTA 용액 10㎕에 용해하였다.

#23-57-137-1 L쇄 V영역을 함유하는 플라스미드 CHL/pUC19로부터 8㎍을 동일한 방법으로 HindⅢ 및 BlnI에서 소화하였다. 얻어진 409bp의 DNA 단편을 3% 저융점 아가로스 젤에서 전기영동한 후, GENECLEANⅡ Kit(BI0101)을 이용하여 젤로부터 회수, 정제하고, 10mM Tris-HCl(pH 7.4), 1mM EDTA용액 10㎕에 용해하였다.

이 L쇄 V영역 DNA 4㎕를 BAP처리한 플라스미드 C/pUC19 또는 Cк/pUC19 각 1㎕에 서브클로닝하고, 대장균 JM109 경쟁세포로 형질전환하였다. 50㎍/㎖ 암피실린을 함유하는 2 x YT 배지 3㎖에서 하룻밤 배양하고, 균체의 일부분에서 QIAprep Spin Plasmid Kit(QIAGEN)을 이용하여 플라스미드를 정제하였다. 이들을 각각 플라스미드 MBC1L()/pUC19, MBC1L(к)/pUC19로 하였다.

플라스미드 MBC1L()/pUC19 및 MBC1L(к)/pUC19를 각각 EcoRI에서 소화하고, 3% 저융점 아가로스 젤에서 전기영동한 후, 743bp의 DNA 단편을 GENECLEANⅡ Kit(BI0101)을 이용하여 젤로부터 회수, 정제하고, 10mM Tris-HCl(pH 7.4), 1mM EDTA용액 10㎕에 용해하였다.

발현 벡터로서 플라스미드 HEF-PM1k-gk 2.7㎍을 EcoRI에서 소화하고, 페놀 및 클로로포름으로 추출, DNA를 에탄올 침전에 의하여 회수하였다. 회수한 DNA단편을 BAP처리한 후, 1% 저융점 아가로스 젤에서 전기영동한 후, 6561bp의 DNA단편을 GENECLEANⅡ Kit(BI0101)을 이용하여 젤로부터 회수, 정제하고, 10mM Tris-HCl(pH 7.4), 1mM EDTA용액 10㎕에 용해하였다.

BAP처리한 HEF 벡터 2㎕를 상기 플라스미드 MBC1L() 또는 MBC1L(к) EcoRI 단편 각 3㎕와 연결하고, 대장균 JM109 경쟁세포로 전기와 같은 방법으로 형질전환하였다. 이것을 50㎍/㎖ 암피실린을 함유하는 2 x YT 배지 2㎖에서 배양하고, 균체의 일부분에서 QIAprep Spin Plasmid Kit(QIAGEN)을 이용하여 플라스미드를 정제하였다.

정제한 플라스미드를 20mM Tris-HCl(pH 8.5), 10mM MgCl₂, 1mM DTT, 100mM KCl, 8U의 HindⅢ(옥주조) 및 2U의 PvuI(옥조주)를 함유하는 반응혼합액 20㎕중 37℃에서 1시간 소화하였다. 단편이 올바른 방향으로 삽입되어 있으면 5104/2195bp, 역방향으로 삽입되어 있으면 4378/2926bp의 소화단편이 생겨, 올바른 방향으로 삽입되어 있던 플라스미드를 각각 MBC1L()neo, MBC1L(к)/neo로 하였다.

(4) COS-7 세포의 트랜스팩션(transfection)

키메라 항체의 항원결합활성 및 중화활성을 평가하기 위하여, 전기 발현 플라스미드를 COS-7 세포에서 일과성으로 발현시켰다.

즉, 키메라항체의 일과성 발현은 플라스미드 MBC1HcDNA/pCOS1과 MBC1L()neo 또는 MBC1HcDNA/pCOS1과 MBC1L(к)/neo의 조합으로, GenePulser장치(BioRad)를 이용하여 일렉트로포레이션(electroporation)에 의하여 COS-7 세포에 동시형질도입하였다. PBS(-) 중에 1×10⁷세포/㎖의 세포농도로 현탁되어 있는 COS-7 세포 0.8㎖에 각 플라스미드 DNA 10㎍을 첨가하여, 1,500V, 25㎌의 정전용량에서 펄스(pulse)를 주었다. 실온에서 10분간의 회복기간 후, 일렉트로포레이션 처리된 세포를 2%의 Ultra Low IgG 소 태아혈청(GIBCO)을 함유하는 DMEM 배지(GIBCO)에 현탁하고, 10cm 배양접시를 이용하여 CO₂인큐베이터에서 배양하였다. 72시간의 배양 후, 배양상청을 채집하여 원심분리에 의하여 세포 파편을 제거하고, ELISA의 시료에 이용하였다. 또한, COS-7 세포의 배양상청으로부터의 키메라 항체의 정제는, AffiGel Protein A MAPSⅡ Kit(BioRad)를 이용하여 키트 첨부의 처방에 따라 행하였다.

(5) ELISA

(ⅰ) 항체농도의 측정

항체농도측정을 위한 ELISA 플레이트를 다음과 같이 조제하였다. ELISA용 96구멍 플레이트(Maxisorp, NUNC)의 각 구멍을 코팅 완충용액(0.1M NaHCO₃, 0.02% NaN₃)으로 1㎍/㎖의 농도로 조제한 염소 항인간 IgG항체(TAGO) 100㎕로 코팅하고, 200㎕의 희석 완충용액(50mM Tris-HCl, 1mM MgCl₂, 0.1M NaCl, 0.05% Tween20, 0.02% NaN₃, 1% 소혈청 알부민(BSA), pH 7.2)으로 블록킹(block)한 후, 키메라 항체를 발현시킨 COS세포의 배양상청 또는 정제 키메라 항체를 단계희석하여 각 구멍에 추가하였다. 1시간동안 실온에서 인큐베이터 보관하고 PBS-Tween20으로 세척 후, 알칼린포스타제 결합 염소 항인간IgG항체(TAGO) 100㎕를 추가하였다. 1시간동안 실온에서 인큐베이터 보관하고 PBS-Tween20으로 세척 후, 1㎎/㎖의 기질용액(Sigma104, p-니트로페닐 인산, SIGMA)를 추가하고, 다음으로 405nm에서의 흡광도를 마이크로플레이트 리더(microplate reader)(Bio Rad)로 측정하였다. 농도측정의 기준으로서, Hu IgG1 Purified(The Binding Site)를 이용하였다.

(ⅱ) 항원결합능력의 측정

항체결합능력측정을 위한 ELISA 플레이트는 다음과 같이 조제하였다. ELISA용 96구멍 플레이트의 각 구멍을 코팅 완충용액으로 1㎍/㎖의 농도로 조제한 인간 PTHrP(1-34)(펩티드연구소) 100㎕로 코팅하였다. 200㎕의 희석 완충용액으로 블록킹한 후, 키메라 항체를 발현시킨 COS세포의 배양상청 또는 정제 키메라 항체를 단계희석하여 각 구멍에 추가하였다. 실온에서 인큐베이터 보관하고 PBS-Tween20으로 세척 후, 알칼린포스타제 결합 염소 항인간 IgG항체(TAGO) 100㎕를 추가하였다. 실온에서 인큐베이터 보관하고 PBS-Tween20으로 세척 후, 1㎎/㎖의 기질용액(Sigma104, p-니트로페닐 인산, SIGMA)를 추가하고, 다음으로 405nm에서의 흡광도를 마이크로플레이트 리더(Bio Rad)로 측정하였다.

그 결과, 키메라항체는 인간 PTHrP(1-34)에 대한 결합능력을 갖고 있으며, 클로닝한 마우스 항체 V영역의 올바른 구조를 가지는 것으로 나타났다(도 5). 또한, 키메라 항체에 있어 L쇄 C영역이 쇄 또는 κ쇄라도 항체의 PTHrP(1-34)에 대한 결합능력은 변하지 않으므로, 인간형화항체의 L쇄 C영역은 인간형화항체 L쇄 쇄를 이용하여 구축하였다.

(6) CHO 안정생산세포주의 수립

키메라 항체의 안정생산세포주를 수립하기 위하여, 전기 발현 플라스미드를 CHO세포(DXB11)에 도입하였다.

즉, 키메라 항체의 안정생산세포주의 수립은 CHO세포 발현 플라스미드 MBC1HcDNA/pCHO1과 MBC1L()/neo 또는 MBC1HcDNA/pCHO1과 MBC1L(κ)/neo의 조합으로, GenePulser장치(BioRad)를 이용하여 일렉트로포레이션에 의하여 CHO세포에 동시형질전도하였다. 각각의 발현벡터를 제한효소 PvuI로 절단하여 직쇄 DNA로 하여, 페놀 및 클로로포름 추출 후, 에탄올 침전으로 회수하여 일렉트로포레이션으로 이용하였다. PBS(-) 중에 1×10⁷세포/㎖의 세포농도에서 현탁되어 있는 CHO세포 0.8㎖에 각 플라스미드 DNA 10㎍를 추가하여, 1,500 V, 25㎌의 정전용량에서 펄스를 주었다. 실온에서 10분간의 회복기간 후, 일렉트로포레이션 처리된 세포를 10% 소 태아혈청(GIBCO)을 첨가한 MEM-α배지(GIBCO)에 현탁하고, 3장의 96구멍 플레이트(Falcon)을 이용, Co₂ 인큐베이터에서 배양하였다. 배양개시 전날에, 10% 소 태아혈청(GIBCO) 및 500㎎/㎖의 GENE TICIN(G418Sulfate, GIBCO)첨가, 리보누클레오사이드(ribonucleoside) 및 디옥시리보누클레오사이드(deoxyribonucleoside) 불포함 MEM-α배지(GIBCO)의 선택배지를 교환하고, 항체 유전자가 도입된 세포를 선택하였다. 선택배지 교환 후, 2주간 전후에 현미경으로 세포를 관찰하여 순조로운 세포증식이 인정된 후에 상기 항체농도측정 ELISA로 항체생산량을 측정하고, 항체생산량이 많은 세포를 선별하였다.

수립한 항체의 안정생산세포주의 배양을 확대하여, 롤러보틀(roller bottle)에서 2%의 Ultra Low IgG 소 태아혈청을 첨가, 리보누클레오사이드 및 디옥시리보누클레오사이드 불포함 MEM-α배지를 이용하여, 대량배양을 행하였다. 배양 3 내지 4일째에 배양상청을 회수하고, 0.2㎛의 필터(Millipore)에 의하여 세포 파편을 제거하였다.

CHO 세포의 배양상청으로부터의 키메라항체의 정제는 POROS 프로틴 A 칼럼(PerSeptive Biosystems)을 이용하여, ConSep LC100(Millipore)에서 첨부의 처방에 따라 행하고 중화활성의 측정 및 고칼슘혈증 모델동물의 약효시험에 이용하였다. 얻어진 정제 키메라 항체의 농도 및 항원결합활성은 상기 ELISA계로 측정하였다.

[참고예 4] 인간형화항체의 구축

(1) 인간형화항체 H쇄의 구축

(ⅰ) 인간형화 H쇄 V영역의 구축

인간형화 #23-57-137-1 항체 H쇄를, PCR법에 의한 CDR-이식에 의해 제작하였다. 인간항체 S31679(참조: NBRF-PDB, Cuisinier A. M. 등, Eur. J. Immunol., 23, 110-118, 1993)유래의 FR을 갖는 인간형화 #23-57-137-1 항체 H쇄(버젼"a")의 제작을 위하여 6개의 PCR 프라이머를 사용하였다. CDR-이식프라이머 MBC1HGP1(서열번호 23) 및 MBC1HGP3(서열번호 24)는 센스 DNA서열을 갖고, CDR-이식프라이머 MBC1HGP2(서열번호 25) 및 MBC1HGP4(서열번호 26)는 안티센스 DNA서열을 가져, 각각 프라이머의 양단에 15부터 21bp의 상보적 서열을 갖는다. 외부 프라이머 MBC1HVS1(서열번호 27) 및 MBC1HVR1(서열번호 28)은 CDR-이식프라이머 MBC1HGP1 및 MBC1HGP4와 상동성을 갖는다.

CDR-이식프라이머 MBC1HGP1, MBC1HGP2, MBC1HGP3 및 MBC1HGP4는 요소변성 폴리아크릴아미드 젤로 분리하고(참조: Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Sambrook 등, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989), 젤에서의 추출은 크러쉬와 속(Crush and Soak)의 방법(참조: Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Sambrook 등, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)으로 행하였다.

즉, 각각 1nmole의 CDR-이식프라이머를 6% 변성폴리아크릴아미드 젤로 분리하고, 목적으로 하는 크기의 DNA단편의 동정을 실리카 젤(silica gel) 얇은 플레이트 위에서 자외선을 조사하여 행하고, 크러쉬와 속(Crush and Soak)의 방법으로 젤로부터 회수하여 20㎕의 10㎖ Tris-HCl(pH 7.4), 1mM EDTA 용액에 용해하였다. PCR은 TaKaRa Ex Taq(옥주조)를 이용하여, 100㎕의 반응혼합액에 상기와 같이 조제한 CDR-이식프라이머 MBC1HGP1, MBC1HGP2, MBC1HGP3 및 MBC1HGP4를 각각 1㎕, 0.25mM의 dNTP, 2.5U의 TaKaRa Ex Taq를 함유하는 조건으로 첨부완충액을 사용하여 94℃에서 1분간, 55℃에서 1분간, 72℃에서 1분간의 온도사이클로 5회 행하고, 50pmole의 외부 프라이머 MBC1HVS1 및 MBC1HVR1를 추가하여 동일 온도사이클을 30회 행하였다. PCR법에 의하여 증폭한 DNA단편을 4% Nu Sieve GTG 아가로스(FMC Bio. Products)를 이용한 아가로스 젤 전기영동에 의해 분리하였다.

421bp장의 DNA 단편을 함유하는 아가로스편을 절취하고, GENECLEANⅡ Kit(BIO101)을 이용하여 키트첨부의 처방에 따라 DNA 단편을 정제하였다. 정제한 DNA를 에탄올에서 침전시킨 후, 10mM Tris-HCl(pH 7.4), 1mM EDTA 용액 20㎕에 용해하였다. 얻어진 PCR 반응혼합물을 BamHI 및 HindⅢ에서 소화함으로써 조제한 pCU19로 서브클로닝하여, 염기서열을 결정하였다. 올바른 서열을 갖는 플라스미드를 hMBCHv/pUC19라 명명하였다.

(ⅱ) 인간형화 H쇄 cDNA를 위한 H쇄 V영역의 구축

인간 H쇄 C영역 C1의 cDNA와 연결하기 위하여, 상기와 같이 구축한 인간형화 H쇄 V영역을 PCR법에 의하여 수식하였다. 후방 프라이머 MBC1HVS2는 V영역의 리더서열의 5' -측을 코딩하는 서열과 혼성화하고, 코작(Kozak) 콘센서스 서열(코작(Kozak), M, 등, J. Mol. Biol. 196, 947-950, 1987), HindⅢ 및 EcoRI 인식서열을 갖도록 설계하였다. H쇄 V영역을 위한 전방 프라이머 MBC1HVR2는 J영역의 3' -측을 코딩하는 DNA 서열에 혼성화하고, C영역의 5' -측의 서열을 코딩하고 ApaI 및 SmaI 인식서열을 갖도록 설계하였다.

PCR은 TaKaRa Ex Taq(옥주조)를 이용하여, 주형 DNA로서 0.4㎍의 hMBCHv/pUC19를 이용하여, 프라이머로서 MBC1HVS2 및 MBC1HVR2를 각각 50pmole, 2.5U의 TaKaRa Ex Taq 0.25mM의 dNTD를 함유하는 조건에서 첨부완충액을 사용하여, 94℃에서 1분간, 55℃에서 1분간, 72℃에서 1분간의 온도사이클로 30회 행하였다. PCR법에 의하여 증폭한 DNA 단편을 3% NuSieveGTG 아가로스(FMC Bio. Products)를 이용한 아가로스 젤 전기영동에 의하여 분리하였다.

456bp장의 DNA 단편을 함유하는 아가로스편을 절취하고, GENECLEANⅡ Kit(BIO101)을 이용하여 키트첨부의 처방에 따라 DNA 단편을 정제하였다. 정제한 DNA를 에탄올에서 침전시킨 후, 10mM Tris-HCl(pH 7.4), 1mM EDTA 용액 20㎕에 용해하였다. 얻어진 PCR반응혼합물을 EcoRI 및 SmaI에서 소화하여 정제한 pCU19로 서브클로닝하여, 염기서열을 결정하였다. 이렇게 얻어진 하이브리도마 #23-57-137-1에 유래하는 마우스 H쇄 V영역을 코딩하는 유전자를 함유하고, 5' -측에 EcoRI 및 HindⅢ 인식서열 및 코작(Kozak) 서열, 3' -측에 ApaI 및 SmaI 인식서열을 갖는 플라스미드를 hMBC1Hv/pUC19라 명명하였다.

(2) 인간형화 항체 H쇄의 발현벡터의 구축

hPM1항체 H쇄 cDNA의 서열을 함유하는 플라스미드 RVh-PM1f-cDNA를 ApaI 및 BamHI에서 소화하고, H쇄 C영역을 함유하는 DNA 단편을 회수하여, ApaⅠ 및 BamHⅠ에서 소화함으로써 정제한 hMBC1Hv/pUC19로 도입하였다. 이렇게 하여 제작한 플라스미드를 hMBC1HcDNA/pUC19라 명명하였다. 이 플라스미드는 인간형화 #23-57-137-1 항체의 H쇄 V영역 및 인 간H쇄 C영역 C1을 함유하며, 5' -말단에 EcoRI 및 HindⅢ 인식서열, 3' -말단에 BamHI 인식서열을 갖는다. 플라스미드 hMBC1Hv/pUC19에 함유되는 인간형화 H쇄 버젼"a"의 염기서열 및 대응하는 아미노산 서열을 서열번호 58에 나타낸다. 또한, 버전a의 아미노산 서열을 서열번호 56에 나타낸다.

hMBC1HcDNA/pUC19를 EcoRI 및 BamHI에서 소화하고, 얻어진 H쇄 서열을 함유하는 DNA 단편을 EcoRI 및 BamHI에서 소화함으로써 조제한 발현 플라스미드 pCOS1에 도입하였다. 이렇게 얻어진 인간형화항체의 발현 플라스미드를 hMBC1HcDNA/pCOS1이라 명명하였다.

또한, CHO세포에서의 발현에 이용하기 위한 플라스미드를 제작하기 위하여 hMBC1HcDNA/pUC19를 EcoRI 및 BamHI에서 소화하고, 얻어진 H쇄 서열을 함유하는 DNA단편을 EcoRI 및 BamHI에서 소화함으로써 조제한 발현 플라스미드 pCHO1에 도입하였다. 이렇게 얻어진 인간형화항체의 발현 플라스미드를 hMBC1HcDNA/pCHO1이라 명명하였다.

(3) L쇄 하이브리드(hybrid) 가변영역의 구축

(ⅰ) FR1, 2/FR3, 4하이브리드 항체의 제작

인간형화항체와 마우스(키메라)항체의 FR영역을 재조합한 L쇄 유전자를 구축하고, 인간형화를 위한 각 영역의 평가를 행하였다. CDR2 내에 있는 제한효소 AflⅡ 절단부위를 이용함으로써, FR1 및 2는 인간항체 유래, FR3 및 4는 마우스 항체 유래로 하는 하이브리드 항체를 제작하였다.

플라스미드 MBC1L()/neo 및 hMBC1L()/neo 각 10㎍을 10mM Tris-HCl(pH 7.5), 10mM MgCl₂, 1mM DTT, 50mM NaCl, 0.01%(w/v) BSA, AflⅡ(옥주조) 10U를 함유하는 반응혼합액 100㎕ 중에서 37℃에서 1시간 소화하였다. 반응액을 2% 저융점 아가로스 젤에서 전기영동한 후, 플라스미드 MBC1L()/neo로부터 6282bp의 단편(c1으로 한다) 및 1022bp의 단편(h1로 한다), 플라스미드 hMBC1L()/neo로부터 6282bp의 단편(h1으로 한다) 및 1022bp의 단편(h2로 한다)을 GENECLEANⅡ Kit(BI0101)을 이용하여 젤로부터 회수, 정제하였다.

회수한 c1, h1 단편 각 1㎍에 대하여 BAP처리를 하였다. DNA를 페놀 및 에탄올로 추출, 에탄올 침전으로 회수한 후, 10mM Tris-HCl(pH 7.4), 1mM EDTA 용액 10㎕에 용해하였다.

BAP처리한 c1 및 h1 단편 1㎕를 각각 h2, c2 단편 4㎕에 연결하고(4℃, 하룻밤), 대장균 JM109 경쟁세포로 형질전환하였다. 50㎍/㎖ 암피실린을 함유하는 2 x YT 배지 2㎖에서 배양하고, 균체의 일부분에서 QIAprep Spin Plasmid Kit(QIAGEN)을 이용하여 플라스미드를 정제하였다.

정제한 플라스미드를 10mM Tris-HCl(pH 7.5), 10mM MgCl₂, 1mM DTT, ApaLI(옥주조) 2U, 또는 BamH1(옥주조) 8U, HindⅢ(옥주조) 8U를 함유하는 반응혼합액 20㎕중 37℃에서 1시간 소화하였다. c1-h2가 올바르게 연결되어 있으면, ApaLI에서 5560/1246/498bp, BamH1/HindⅢ에서 7134/269bp의 소화단편이 생기는 것에 의하여, 플라스미드를 확인하였다.

이것을 인간 FR1, 2/마우스FR3, 4하이브리드 항체 L쇄를 코딩하는 발현 벡터를 h/mMBC1L()/neo로 하였다. 한편, h1-c2의 클론을 얻을 수 없었으므로, pUC벡터상에서 재조합하고 나서 HEF벡터로 클로닝하였다. 그때, 아미노산이 없는 인간형화항체 L쇄 V영역을 함유하는 플라스미드 hMBC1La/pCU19, 및 FR3 내의 91위치(카밭(Kabat)의 규정에 의한 아미노산 번호 87위치)의 티로신(tyrosine)을 이소루신(isoleucine)으로 치환한 인간형화항체 L쇄 V영역을 함유하는 플라스미드 hMBC1Ld/pCU19를 주형으로 이용하였다.

플라스미드 MBC1L()/pCU19, hMBC1La/pCU19 및 MBC1Ld/pCU19의 각 10㎍을 10mM Tris-HCl(pH 7.5), 10mM MgCl₂, 1mM DTT, 50mM NaCl, 0.01%(w/v) BSA, HindⅢ 16U, AflⅡ 4U를 함유하는 반응혼합액 30㎕ 중에서 37℃에서 1시간 소화하였다. 반응액을 2% 저융점 아가로스 젤에서 전기영동한 후, 플라스미드 MBC1L()/pCU19로부터 215bp(c2'), 플라스미드 hMBC1La/pCU19 및 hMBC1Ld/pCU19로부터 각각 3218bp(ha1', hd1')의 DNA 단편을 GENECLEANⅡ Kit(BI0101)을 이용하여 젤로부터 회수, 정제하였다.

ha1', hd1' 단편을 각각 c2' 단편에 연결하고, 대장균 JM109 경쟁세포로 형질전환하였다. 50㎍/㎖ 암피실린을 함유하는 2 x YT 배지 2㎖에서 배양하고, 균체의 일부분에서 QIAprep Spin Plasmid Kit(QIAGEN)을 이용하여 플라스미드를 정제하였다. 이것들을 각각 플라스미드 m/h MBC1La/pCU19, hMBC1Ld/pCU19로 하였다.

얻어진 플라스미드 m/h MBC1La/pCU19, hMBC1Ld/pCU19를 EcoRI에서 소화하였다. 각각 743bp의 DNA 단편을 2% 저융점 아가로스 젤에서 전기영동한 후, GENECLEANⅡ Kit(BI0101)을 이용하여 젤로부터 회수, 정제하고 10mM Tris-HCl(pH 7.4), 1mM EDTA 용액 10㎕에 용해하였다.

각 DNA단편 4㎕를 전술의 BAP처리한 HEF 벡터 1㎕에 연결하고, 대장균 JM109 경쟁세포로 형질전환하였다. 50㎕/㎖ 암피실린을 함유하는 2 x YT 배지 2㎖에서 배양하고, 균체의 일부분에서 QIAprep Spin Plasmid Kit(QIAGEN)을 이용하여 플라스미드를 정제하였다.

정제한 플라스미드를 20mM Tris-HCl(pH 8.5), 10mM MgCl₂, 1mM DTT, 100mM KCl, HindⅢ(옥주조) 8U, PvuI(옥조주) 2U를 함유하는 반응혼합액 20㎕중 37℃에서 1시간 소화하였다. 단편이 올바른 방향으로 삽입되어 있으면 5104/2195bp, 역방향으로 삽입되어 있으면 4378/2926bp의 소화단편이 생기는 것에 의하여 플라스미드를 확인하였다. 이들을 각각 마우스 FR1, 2/인간FR3, 4 하이브리드 항체 L쇄를 코딩하는 발현 벡터를 m/hMBC1La/neo, m/hMBC1Ld/neo로 하였다.

(ⅱ) FR1/FR2 하이브리드항체의 제작

CDR1 내에 있는 SnaBI 절단부위를 이용함으로써, 동일한 방법으로 FR1와 FR2의 하이브리드 항체를 제작하였다.

플라스미드 MBC1L()/neo 및 h/mMBC1L()/neo의 각10㎍을 10mM Tris-HCl(pH 7.9), 10mM MgCl₂, 1mM DTT, 50mM NaCl, 0.01%(w/v) BSA, SnaBI(옥주조) 6U, 를 함유하는 반응혼합액 20㎕ 중에서 37℃에서 1시간 소화하였다. 다음으로 20mM Tris-HCl(pH 8.5), 10mM MgCl₂, 1mM DTT, 100mM KCl, 0.01%(w/v) BSA, Pvu 16U, 를 함유하는 반응혼합액 50㎕ 중에서 37℃에서 1시간 소화하였다.

반응액을 1.5% 저융점 아가로스 젤에서 전기영동한 후, 플라스미드 h/mMBC1L()/neo로부터 4955bp(m1) 및 2349bp(m2), 플라스미드 h/mMBC1L()/neo로부터 4955bp(hm1) 및 2349bp(hm2)의 각 DNA 단편을 GENECLEANⅡ Kit(BI0101)을 이용하여 젤로부터 회수, 정제하고, 10mM Tris-HCl(pH 7.4), 1mM EDTA 용액 40㎕에 용해하였다.

m1, hm1 단편 1㎖를 각각 hm2, m2 단편 4㎕에 연결하고, 대장균 JM109 경쟁세포로 형질전환하였다. 50㎕/㎖ 암피실린을 함유하는 2 x YT 배지 2㎖에서 배양하고, 균체의 일부분에서 QIAprep Spin Plasmid Kit(QIAGEN)을 이용하여 플라스미드를 정제하였다.

정제한 각 플라스미드를 10mM Tris-HCl(pH 7.5), 10mM MgCl₂, 1mM DTT, ApaI(옥주조) 8U, 또는 ApaLI(옥주조) 2U를 함유하는 반응혼합액 20㎕중 37℃에서 1시간 소화하였다.

각 단편이 올바른 방향으로 연결되어 있으면 ApaI에서 7304bp, ApaLI에서 5560/1246/498bp(m1-hm2), ApaI에서 6538/766bp, ApaLI에서 3535/2025/1246/498bp(hm1-m2)의 소화단편이 생기는 것에 의하여 플라스미드를 확인하였다. 이들을 각각 인간 FR1/마우스 FR1, 2, 3, 4 하이브리드 항체 L쇄를 코딩하는 발현 터를 hmmMBC1L()/neo, 마우스 FR1/인간 FR2/마우스 FR3, 4 하이브리드 항체 L쇄를 코딩하는 발현 벡터를 mhmMBC1L()/neo로 하였다.

(4) 인간형화항체 L쇄의 구축

인간형화 #23-57-137-1 항체 L쇄를, PCR법에 의한 CDR-이식에 의해 제작하였다. 인간항체 HSU03868(참조: GEN-BANK, Deftos M 등, Scand. J. Immunol., 39, 95-103, 1994)유래의 FR1, FR2, FR3 및 인간항체 S25755(NBRF-PDB) 유래의 FR4를 갖는 인간형화 #23-57-137-1 항체 L쇄(버젼"a")의 제작을 위하여 6개의 PCR프라이머를 사용하였다.

CDR-이식프라이머 MBC1HGP1(서열번호 29) 및 MBC1LGP3(서열번호 30)는 센스 DNA 서열을 갖고, CDR-이식프라이머 MBC1LGP2(서열번호 31) 및 MBC1LGP4(서열번호 32)는 안티센스 DNA 서열을 가지며, 각각 프라이머의 양단에 15에서 21bp의 상보적 서열을 갖져, 각각 프라이머의 양단에 15부터 21bp의 상보적 서열을 갖는다. 외부프라이머 MBC1LVS(서열번호 33) 및 MBC1LVR1(서열번호 34)는 CDR-이식프라이머 MBC1LGP1 및 MBC1LGP4와 상동성을 갖는다.

CDR-이식프라이머 MBC1LGP1, MBC1LGP2, MBC1LGP3 및 MBC1LGP4는 요소변성 폴리아크릴아미드 젤로 분리하고(참조: Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Sambrook 등, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989), 젤에서의 추출은 크러쉬와 속(Crush and Soak)의 방법(참조: Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Sambrook 등, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)으로 행하였다.

즉, 각각 1nmole의 CDR-이식프라이머를 6% 변성 폴리아크릴아미드 젤로 분리하고, 목적으로 하는 크기의 DNA 단편의 동정을 실리카 젤 얇은 플레이트 위에서 자외선을 조사하여 행하고, 크러쉬와 속(Crush and Soak)의 방법으로 젤로부터 회수하여 20㎕의 10㎖ Tris-HCl(pH 7.4), 1mM EDTA 용액에 용해하였다.

PCR은 TaKaRa Ex Taq(옥주조)를 이용하여, 100㎕의 반응혼합액에 상기와 같이 조제한 CDR-이식프라이머 MBC1LGP1, MBC1LGP2, MBC1LGP3 및 MBC1LGP4를 각각 1㎕, 0.25mM의 dNTP, 2.5U의 TaKaRa Ex Taq를 함유하는 조건에서 첨부완충액을 사용하여 94℃에서 1분간, 55℃에서 1분간, 72℃에서 1분간의 온도사이클로 5회 행하고, 이 반응혼합액에 50pmole의 외부 프라이머 MBC1LVS1 및 MBC1LVR1를 추가하여 동일 온도사이클로 30회 반응시켰다. PCR법에 의하여 증폭한 DNA단편을 3% Nu Sieve GTG 아가로스(FMC Bio. Products)를 이용한 아가로스 젤 전기영동에 의해 분리하였다.

421bp장의 DNA 단편을 함유하는 아가로스편을 절취하고, GENECLEANⅡ Kit(BIO101)을 이용하여 키트 첨부의 처방에 따라 DNA 단편을 정제하였다. 얻어진 PCR 반응혼합물을 BamHI 및 HindⅢ에서 소화함으로써 정제한 pCU19로 서브클로닝하여, 염기서열을 결정하였다. 이렇게 얻어진 플라스미드를 hMBCL/pUC19라 명명하였다. 그러나, CDR4의 104위치(카밭(Kabat)의 규정에 따른 아미노산 번호 96위치)의 아미노산이 아르기닌(arginine)이 되어 있으므로, 이를 티로신으로 수정하기 위한 수정 프라이머 MBC1LGP10R(서열번호 35)를 설계하여 합성하였다. PCR은 TaKaRa Ex Taq(옥주조)를 이용하여, 100㎕의 반응혼합액에 주형 DNA로서 0.6㎍의 플라스미드 hMBCL/pUC19, 프라이머로서 MBC1LVS1 및 MBC1LGP10R을 각각 50pmole, 2.5U의 TaKaRa Ex Taq(옥주조) 0.25mM의 dNTP를 함유하는 조건에서 첨부의 완충액을 사용, 50㎕의 광유를 상층시켜 94℃에서 1분간, 55℃에서 1분간, 72℃에서 1분간의 온도사이클로 30회 행하였다. PCR법에 의하여 증폭시킨 DNA 단편을 3% Nu Sieve GTG 아가로스(FMC Bio. Products) 젤 전기영동에 의하여 분리하였다.

421bp장의 DNA단편을 함유하는 아가로스편을 절취하고, GENECLEANⅡ Kit(BIO101)을 이용하여 키트첨부의 처방에 따라 DNA 단편을 정제하였다. 얻어진 PCR 반응혼합물을 BamHI 및 HindⅢ에서 소화함으로써 조제한 pCU19로 서브클로닝하였다.

M13 Primer M4 프라이머 및 M13 Primer RV 프라이머를 이용하여 염기서열을 결정한 결과, 올바른 서열을 얻을 수 있었으므로 이 플라스미드를 HindⅢ 및 BlnI에서 소화하고, 416bp의 단편을 1% 아가로스 젤에서 전기영동에 의해 분리하였다. GENECLEANⅡ Kit(BIO101)을 이용하여 키트첨부의 처방에 따라 DNA 단편을 정제하였다. 얻어진 PCR 반응혼합물을 HindⅢ 및 BlnI에서 소화함으로써 조제한 플라스미드 C/pUC19에 도입하고, 플라스미드를 hMBC1La/pUC19라 명명하였다. 이 플라스미드를 EcoRI 소화하고, 인간형화 L쇄를 코딩하는 서열을 함유하는 서열을 플라스미드 pCOS1에 도입하여, EF1α프로모터의 하류에 인간형화 L쇄의 개시 코돈(codon)이 위치하도록 하였다. 이렇게 얻어진 플라스미드를 hMBC1La/pCOS1이라 명명하였다. 인간형화 L쇄 버젼"a"의 염기서열(대응하는 아미노산을 함유한다)을 서열번호 66에 나타낸다. 또한, 버젼a의 아미노산 서열을 서열번호 47에 나타낸다.

버젼"b"를 PCR법에 의한 변이도입을 이용하여 제작하였다. 버젼"b"에서는 43위치(카밭(Kabat)의 규정에 따른 아미노산 번호 43위치)의 글리신을 프롤린(proline)으로, 49위치(카밭(Kabat)의 규정에 따른 아미노산 번호 49위치)의 리신(lysine)을 아스파라긴산으로 변경하도록 설계하였다. 변이원 프라이머 MBC1LGP5R(서열번호 36)와 프라이머 MBC1LVS1에 의하여 플라스미드 hMBC1La/pUC19를 주형으로 PCR을 행하고, 얻어진 DNA 단편을 BamHI 및 HindⅢ에서 소화하여 pUC19의 BamHI, HindⅢ 부위로 서브클로닝하였다. 염기서열 결정 후, 제한효소 HindⅢ 및 AflⅡ에서 소화하고, HindⅢ 및 AflⅡ에서 소화한 hMBC1La/pUC19와 연결하였다.

이렇게 얻어진 플라스미드를 hMBC1Lb/pUC19로 하여, 이 플라스미드를 EcoRI에서 소화, 인간형화 L쇄를 코딩하는 DNA를 함유하는 단편을 플라스미드 pCOS1에 도입하여, EF1α프로모터의 하류에 인간형화 L쇄의 개시 코돈(codon)이 위치하도록 하였다. 이렇게 얻어진 플라스미드를 hMBC1Lb/pCOS1이라 명명하였다.

버젼"c"를 PCR법에 의한 변이도입을 이용하여 제작하였다. 버젼"c"에서는 84위치(카밭(Kabat)의 규정에 따른 아미노산 번호80위치)의 세린(serine)을 프롤린(proline)으로 변경하도록 설계하였다. 변이원 프라이머 MBC1LGP6S(서열번호37)와 프라이머 M13 Primer RV에 의하여 플라스미드 hMBC1La/pUC19를 주형으로 PCR을 행하고, 얻어진 DNA 단편을 BamHI 및 HindⅢ에서 소화하고 BamHI, HindⅢ에서 소화하여 조제한 pUC19로 서브클로닝하였다.

염기서열 결정 후, 제한효소 BstPI 및 Aor51HI에서 소화하고, BstPI 및 Aor51HI에서 소화한 hMBC1La/pUC19와 연결하였다. 이렇게 얻어진 플라스미드를 hMBC1Lc/pUC19로 하여, 이 플라스미드를 제한효소 EcoRI부위에서 소화, 인간형화 L쇄를 코딩하는 서열을 함유하는 서열을 플라스미드 pCOS1의 EcoRI부위에 도입하여, EF1α프로모터의 하류에 인간형화 L쇄의 개시 코돈(codon)이 위치하도록 하였다. 이렇게 얻어진 플라스미드를 hMBC1Lc/pCOS1이라 명명하였다.

버젼"d", "e" 및 "f"를 PCR법에 의한 변이도입을 이용하여 제작하였다. 각 버젼에서 모두 순서대로 "a", "b", "c"버젼의 91위치(카밭(Kabat)의 규정에 따른 아미노산 번호87위치)의 티로신을 이소루신으로 변경하도록 설계하였다. 변이원 프라이머 MBC1LGP11R(서열번호 38)와 프라이머 M-S1(서열번호 44)에 의하여 각각 hMBC1La/pCOS1, hMBC1Lb/pCOS1, hMBC1Lc/pCOS1를 주형으로 PCR을 행하고, 얻어진 DNA 단편을 BamHI 및 HindⅢ에서 소화하고 BamHI 및 HindⅢ에서 소화하여 조제한 pUC19로 서브클로닝하였다. 염기서열 결정 후, HindⅢ 및 BlnI에서 소화하고, HindⅢ 및 BlnI에서 소화하여 제조한 C/pUC19와 연결하였다.

이렇게 얻어진 플라스미드를 순서대로 hMBC1Ld/pUC19, hMBC1Le/pUC19, hMBC1Lf/pUC19로 하였다. 이들 플라스미드를 EcoRI부위에서 소화, 인간형화 L쇄를 코딩하는 서열을 함유하는 서열을 플라스미드 pCOS1의 EcoRI부위에 도입하여, EF1α프로모터의 하류에 인간형화 L쇄의 개시 코돈(codon)이 위치하도록 하였다. 이렇게 얻어진 플라스미드를 각각 순서대로 hMBC1Ld/pUC19, hMBC1Le/pUC19, hMBC1Lf/pUC19라 명명하였다.

버젼"g" 및 "h"를 PCR법에 의한 변이도입을 이용하여 제작하였다. 각 버젼에서 모두 순서대로 "a", "d"버젼의 36위치(카밭(Kabat)의 규정에 따른 아미노산 번호36위치)의 히스티딘(histidine)을 티로신으로 변경하도록 설계하였다. 변이원 프라이머 MBC1LGP9R(서열번호 39) 및 M13 Primer RV를 프라이머로서 사용하여, hMBC1La/pUC19를 주형으로 PCR을 행하였다. 얻어진 DNA 단편을 HindⅢ 및 BlnI에서 소화하고 HindⅢ 및 BlnI에서 소화하여 조제한 C/pUC19로 서브클로닝하였다. 이 플라스미드를 주형으로 하여, 프라이머 MBC1LGP13R(서열번호 40) 과 MBC1LVS1을 프라이머로 한 PCR을 행하였다. 얻어진 PCR 단편을 ApaI 및 HindⅢ에서 소화하고, ApaI 및 HindⅢ에서 소화한 플라스미드 hMBC1La/pUC19 및 hMBC1Ld/pUC19에 도입하였다. 염기서열을 결정하고, 올바른 서열을 함유하는 플라스미드를 순서대로 hMBC1Lg/pUC19 및 hMBC1Lh/pUC19로 하여 이들 플라스미드를 제한효소 EcoRI소화하고, 인간형화 L쇄를 코딩하는 서열을 함유하는 서열을 플라스미드 pCOS1의 EcoRI부위에 도입하여, EF1α프로모터의 하류에 인간형화 L쇄의 개시 코돈(codon)이 위치하도록 하였다. 이렇게 얻어진 플라스미드를 각각 순서대로 hMBC1Lg/pCOS1 및 hMBC1Lh/pCOS1이라 명명하였다.

버젼"i", "j", "k", "l", "m", "n" 및 "o"를 PCR법에 의한 변이도입을 이용하여 제작하였다. 변이원 프라이머 MBC1LGP14S(서열번호 41)와 프라이머 V1RV()(서열번호 43)에 의하여 플라스미드 hMBC1La/pUC19를 주형으로 PCR을 행하고, 얻어진 DNA 단편을 ApaI 및 BlnI에서 소화하고 ApaI 및 BlnI에서 소화하여 조제한 플라스미드 hMBC1Lg/pUC19로 서브클로닝하였다. 염기서열을 결정하고, 각각의 버젼에 대응한 변이가 도입된 클론을 선택하였다. 이렇게 얻어진 플라스미드를 hMBC1Lx/pUC19(x=i, j, k, l, m, n, o)로 하여 이 플라스미드를 EcoRI소화하고, 인간형화 L쇄를 코딩하는 서열을 함유하는 서열을 플라스미드 pCOS1의 EcoRI부위에 도입하여, EF1α프로모터의 하류에 인간형화 L쇄의 개시 코돈(codon)이 위치하도록 하였다. 이렇게 얻어진 플라스미드를 hMBC1Lx/pCOS1(x=i, j, k, l, m, n, o)라 명명하였다. 버젼 "j", "l", "m" 및 "o"의 염기서열(대응하는 아미노산을 포함한다)을 각각 서열번호 67, 68, 69, 70에 나타낸다. 또한, 이들 각 버젼의 아미노산 서열서열각 서열번호 48, 49, 50, 51에 나타낸다.

버젼 "p', "q", "r", "s" 및 "t"는 버젼 "i", "j", "m", "l" 또는 "o"의 아미노산 서열의 87위치의 티로신을 이소루신으로 치환한 버젼으로, FR3 내에 있는 제한효소 Aor51MI 절단부위를 이용하여 버젼 "h"를 각 버젼 "i", "j", "m", "l" 또는 "o"와 연결, 치환하여 제작한 것이다. 즉, 발현 플라스미드 hMBC1Lx/pCOS1(x=i, j, l, m, o) 중, CDR3 및 FR3의 일부 및 FR4를 함유하는 Aor51HI 단편 514bp를 제외하고, 여기에 발현 플라스미드 hMBC1Lh/pCOS1 중, CDR3 및 FR3의 일부 및 FR4를 함유하는 Aor51HI 단편 514bp를 연결함으로써, 91위치(카밭(Kabat)의 규정에 의한 아미노산 번호 87위치)의 티로신이 이소루신이 되도록 하였다. 염기서열을 결정한 후, 각 버젼 "i", "j", "m", "l" 및 "o"의 91위치(카밭(Kabat)의 규정에 의한 아미노산 번호 87위치)의 티로신이 이소루신으로 치환된 클론을 선택하여, 얻어진 플라스미드를 hMBC1Lx/pCOS1(x=p, q, s, r, t)라 명명하였다. 버젼 "q", "r", "s", "r" 및 "t"의 염기서열(대응하는 아미노산을 포함한다)을 각각 서열번호 71, 72, 73, 74에 나타낸다. 또한, 이들 각 버젼의 아미노산 서열을 각각 서열번호 52, 53, 54, 55에 나타낸다.

플라스미드 hMBC1Lq/pCOS1를 HindⅢ 및 EcoRI에서 소화하고, HindⅢ 및 EcoRI에서 소화한 플라스미드 pUC19로 서브클로닝하고 플라스미드 hMBC1Lq/pUC19라 명명하였다.

인간형화 L쇄의 각 버젼에 있어서의 치환 아미노산의 위치를 표 2에 나타내었다.

서열표에 있어서의 치환 아미노산의 위치(카밭(Kabat)의 규정에 의한 아미노산 번호)

버젼	36	43	45	47	49	80	87
a
b		P			D
c						P
d							I
e		P			D		I
f						P	I
g	Y
h	Y						I
i	Y		K
j	Y		K		D
k	Y		K	V
l	Y		K	V	D
m	Y				D
n	Y			V
o	Y			V	D
p	Y		K				I
q	Y		K		D		I
r	Y				D		I
s	Y		K	V	D		I
t	Y			V	D		I

상기 표 중에서, Y는 티로신, P는 프롤린, K는 리신, V는 발린(valine), D는 아스파라긴산, I는 이소루신을 나타낸다.

또한, 전기 플라스미드 hMBC1HcDNA/pUC19 및 MBC1Lq/pUC19를 갖는 대장균은 Escherichia coli JM109(hMBC1HcDNA/pUC19) 및 Escherichia coli JM109(hMBC1Lq/pUC19)로서, 공업기술원 생명공학공업기술연구소(1-3, Higashi 1-chome, Tsukuba-shi, Ibaraki, Japan)에 평성 8년(1996년) 8월 15일자로 Escherichia coli JM109(hMBC1HcDNA/pUC19)에 관하여는 FERM BP-5629, Escherichia coli JM109(hMBC1Lq/pUC19)에 관하여는 FERM BP-5630으로 부다페스트 조약에 근거하여 국제기탁되어 있다.

(5) COS-7세포로의 트랜스팩션

하이브리드항체 및 인간형화 #23-57-137-1 항체의 항원결합활성 및 중화활성을 평가하기 위하여, 전기 발현 플라스미드를 COS-7 세포에서 일과성으로 발현시켰다.

즉, L쇄 하이브리드항체의 일과성 발현은 플라스미드 hMBC1HcDNA/pCOS1과 h/mMBC1L()neo, hMBC1HcDNA/pCOS1과 m/hMBC1La/neo, hMBC1HcDNA/pCOS1과 m/hMBC1Ld/neo, hMBC1HcDNA/pCOS1과 hmmMBC1L()neo, 또는 hMBC1HcDNA/pCOS1과 mhmMBC1L()neo와의 조합을, GenePulser장치(BioRad)를 이용하여 일렉트로포레이션(electroporation)에 의하여 COS-7 세포에 동시형질도입하였다. PBS(-) 중에 1×10⁷세포/㎖의 세포농도로 현탁되어 있는 COS-7 세포 0.8㎖에 각 플라스미드 DNA 10㎍을 첨가하여, 1,500V, 25㎌의 정전용량에서 펄스(pulse)를 주었다. 실온에서 10분간의 회복기간 후, 일렉트로포레이션 처리된 세포를 2%의 Ultra Low IgG 소 태아혈청(GIBCO)을 함유하는 DMEM 배양액(GIBCO)에 현탁하고, 10cm 배양접시를 이용하여 CO₂인큐베이터에서 배양하였다. 72시간의 배양 후, 배양상청을 채집하여 원심분리에 의하여 세포파편을 제거하고, ELISA의 시료에 이용하였다.

인간형화 #23-57-137-1 항체의 일과성 발현에서는, 플라스미드 hMBCHcDNA/pCOS1과 hMBC1Lx/pCOS1(x=a∼t) 중 어느 조합을 GenePulser 장치(BioRad)를 이용하여, 전기 하이브리드 항체의 경우와 동일한 방법에 의하여 COS-7세포로 트랜스팩션하고, 얻어진 배양상청을 ELISA에 이용하였다.

또한, COS-7 세포의 배양상청으로부터의 하이브리드 항체 또는 인간형화항체의 정제는, AffiGel Protein A MAPSⅡ키트(BioRad)를 이용하여 키트첨부의 처방에 따라 행하였다.

(6) ELISA

(ⅰ) 항체농도의 측정

항체농도측정을 위한 ELISA 플레이트를 다음과 같이 조제하였다. ELISA용 96구멍 플레이트(Maxisorp, NUNC)의 각 구멍을 코팅 완충용액(0.1M NaHCO₃, 0.02% NaN₃)으로 1㎍/㎖의 농도로 조제한 염소 항 인간 IgG항체(TAGO) 100㎕로 코팅하고, 200㎕의 희석 완충용액(50mM Tris-HCl, 1mM MgCl₂, 0.1M NaCl, 0.05% Tween20, 0.02% NaN₃, 1% 소혈청 알부민(BSA), pH 7.2)으로 블록킹(block)한 후, 하이브리드 항체 또는 인간형화항체를 발현시킨 COS-7 세포의 배양상청 또는 정제 하이브리드 항체 또는 인간형화항체를 단계희석하여 각 구멍에 추가하였다. 1시간동안 실온에서 인큐베이터 보관하고 PBS-Tween20으로 세척 후, 알칼린포스타제 결합 염소 항인간 IgG 항체(TAGO) 100㎕를 추가하였다. 1시간동안 실온에서 인큐베이터 보관하고 PBS-Tween20으로 세척 후, 1㎎/㎖의 기질용액(Sigma104, p-니트로페닐 인산, SIGMA)를 추가하고, 다음으로 405nm에서의 흡광도를 마이크로플레이트 리더(microplate reader)(Bio Rad)로 측정하였다. 농도측정의 기준으로서, Hu IgG1 Purified(The Binding Site)를 이용하였다.

(ⅱ) 항원결합능력의 측정

항체결합능력측정을 위한 ELISA 플레이트는 다음과 같이 조제하였다. ELISA용 96구멍 플레이트의 각 구멍을 코팅 완충용액으로 1㎍/㎖의 농도로 조제한 인간 PTHrP(1-34) 100㎕로 코팅하였다. 200㎕의 희석 완충용액으로 블록킹(block)한 후, 하이브리드 항체 또는 인간형화항체를 발현시킨 COS-7 세포의 배양상청 또는 정제 하이브리드 항체 또는 인간형화항체를 단계희석하여 각 구멍에 추가하였다. 실온에서 인큐베이터 보관하고 PBS-Tween20으로 세척 후, 알칼린포스타제 결합 염소 항인간 IgG항체(TAGO) 100㎕를 추가하였다. 실온에서 인큐베이터 보관하고 PBS-Tween20으로 세척 후, 1㎎/㎖의 기질용액(Sigma104, p-니트로페닐 인산, SIGMA)를 추가하고, 다음으로 405nm에서의 흡광도를 마이크로플레이트 리더(microplate reader)(Bio Rad)로 측정하였다.

(7) 활성확인

(ⅰ) 인간형화 H쇄의 평가

인간형화 H쇄 버젼 "a"와 키메라 L쇄를 조합시킨 항체는 키메라항체와 PTHrP 결합능력이 동등하였다(도 6). 이 결과는 H쇄 V영역의 인간형화는 버젼 "a"로 충분함을 나타낸다. 이하, 인간형화 H쇄 버젼 "a"를 인간형화 항체의 H쇄로서 제공하였다.

(ⅱ) 하이브리드항체의 활성

(ⅱ-a) FR1, 2/FR3, 4 하이브리드항체

L쇄가 h/mMBC1L()인 경우, 활성은 전혀 인정되지 않았으나, m/hMBC1La 또는 m/hMBC1Ld인 경우에는 모두 키메라 #23-57-137-1 항체와 동등한 결합활성을 나타냈다(도 7). 이들 결과는 FR3, 4는 인간형화항체로서 문제가 없으나, FR1, 2내에 치환되야 하는 아미노산 잔기가 존재함을 시사한다.

(ⅲ) 인간형화항체의 활성

L쇄로서 버젼 "a"부터 "t"의 각각 하나를 이용한 인간형화항체에 대하여, 항원결합활성을 측정하였다. 그 결과, L쇄 버젼 "j", "l", "m", "o", "q", "r", "s", "t"를 갖는 인간형화항체는 키메라항체와 동등한 PTHrP 결합능력을 나타냈다(도 9∼12).

(8) CHO안정 생산세포주의 수립

인간형화항체의 안정생산세포주를 수립하기 위하여, 전기 발현 플라스미드를 CHO세포(DXB11)에 도입하였다.

즉, 인간형화항체의 안정 생산세포주의 수립은 CHO 세포 발현 플라스미드 MBC1HcDNA/pCHO1과 hMBC1Lm/pCOS1 또는 hMBC1HcDNA/pCHO1과 hMBC1Lq/pCOS1 또는 hMBC1HcDNA/pCHO1과 hMBC1Lr/pCOS1의 조합으로, GenePulser장치(BioRad)를 이용하여 일렉트로포레이션에 의하여 CHO세포에 동시형질도입하였다. 각각의 발현 벡터를 제한효소 PvuI로 절단하여 직쇄 DNA로 하여, 페놀 및 클로로포름 추출 후, 에탄올 침전으로 회수하여 일렉트로포레이션으로 이용하였다. PBS(-) 중에 1×10⁷세포/㎖의 세포농도에서 현탁되어 있는 CHO세포 0.8㎖에 각 플라스미드 DNA 10㎖를 추가하여, 1,500 V, 25㎌의 정전용량에서 펄스를 주었다. 실온에서 10분간의 회복기간 후, 일렉트로포레이션 처리된 세포를 10% 소 태아혈청(GIBCO)를 첨가한 MEM-α배지(GIBCO)에 현탁하고, 96구멍 플레이트(Falcon)을 이용, Co₂ 인큐베이터에서 배양하였다. 배양개시 전날에, 10% 소 태아혈청(GIBCO) 및 500㎎/㎖의 GENE TICIN(G418Sulfate, GIBCO)첨가, 리보누클레오사이드(ribonucleoside) 및 디옥시리보누클레오사이드(deoxyribonucleoside) 불포함 MEM-α배지(GIBCO)의 선택배지를 교환하고, 항체 유전자가 도입된 세포를 선택하였다. 선택배지 교환 후, 2주간 전후에 현미경으로 세포를 관찰하여 순조로운 세포증식이 인정된 후에 상기 항체농도측정 ELISA로 항체생산량을 측정하고, 항체생산량이 많은 세포를 선별하였다.

수립한 항체의 안정생산세포주의 배양을 확대하여, 롤러보틀(roller bottle)에서 2%의 Ultra Low IgG 소 태아혈청 첨가, 리보누클레오사이드 및 디옥시리보누클레오사이드 불포함 MEM-α배지를 이용하여, 대량배양을 행하였다. 배양 3 내지 4일째에 배양상청을 회수하고, 0.2㎛의 여과(Millipore)에 의하여 세포파편을 제거하였다. CHO 세포의 배양상청으로부터의 인간형화항체의 정제는 POROS 프로틴A칼럼(PerSeptive Biosystems)을 이용하여, ConSep LC100(Millipore)에서 첨부의 처방에 따라 행하고 중화활성의 측정 및 고칼슘혈증 모델동물의 약효시험에 이용하였다. 얻어진 정제 인간형화항체의 농도 및 항원결합활성은 상기 ELISA계로 측정하였다.

[참고예 5] 중화활성의 측정

마우스항체, 키메라항체 및 인간형화항체의 중화활성의 측정은, 집쥐 골육종 세포주 ROS17/2.8-5 세포를 이용하여 행하였다. 즉, ROS17/2.8-5세포를, 10% 소 태아혈청(GIBCO)을 함유하는 Ham'S F-12 배지(GIBCO) 중, CO₂인큐베이터에서 배양하였다. ROS17/2.8-5 세포를 96구멍 플레이트에서 10⁴세포/100㎕/구멍으로 접종하여 1일간 배양하고, 4mM의 하이드로콜티손(hydrocortisone)과 10% 소 태아혈청을 함유하는 Ham'S F-12 배지(GIBCO)로 교환한다. 다시 3 내지 4일간 배양한 후, 260㎕의 Ham'S F-12 배지(GIBCO)로 세척하고, 1mM의 이소부틸-1-메틸잔틴(IBMX, SIGMA) 및 10%의 소 태아혈청과 10mM의 HEPES를 함유하는 80㎕의 Ham'S F-12를 첨가하여 30분간 37℃에서 인큐베이터 보관하였다.

중화활성을 측정하는 마우스항체, 키메라 항체 또는 인간형화항체를 사전에 10㎍/㎖, 3.3㎍/㎖, 1.1㎍/㎖ 및 0.37㎍/㎖의 군, 10㎍/㎖, 2㎍/㎖, 0.5㎍/㎖ 및 0.01㎍/㎖의 군, 또는 10㎍/㎖, 5㎍/㎖, 1.25㎍/㎖, 0.63㎍/㎖ 및 0.31㎍/㎖의 군에서 단계희석하고, 4ng/㎖에서 조제한 PTHrP(1-34)와 동등혼합하여 각 항체와 PTHrP(1-34)의 혼합액 80㎕를 각 구멍에 첨가하였다. 각 항체의 최종농도는 상기 항체농도의 4분의 1이 되며, PTHrP(1-34)의 농도는 1ng/㎖가 된다. 10분간 실온에서 처리하고 나서, 배양상청을 버리고 PBS로 3회 세척한 후, 100㎕의 0.3% 염산 95% 에탄올로 세포내의 cAMP를 추출한다. 수류 아스피레이터(water jet aspirator)로 염산에탄올을 증발시켜, cAMP EIA kit(CAYMANCHEMICAL'S) 부속의 EIA 완충용액 120㎕를 첨가하여 cAMP를 추출 후, cAMP EIA kit(CAYMANCHEMICAL'S) 첨부의 처방에 따라 cAMP를 측정하였다. 그 결과, 키메라 항체와 동등한 항원결합을 갖는 L쇄 버젼 중, 91위치의 티로신을 이소루신으로 치환한 버젼 "q", "r", "s", "t"를 갖는 인간형화항체가 키메라 항체에 가까운 중화능력을 나타내며, 그 중에서도 버젼 "q"가 가장 강한 중화능력을 나타냈다(도 13∼15).

본 발명에 의하여 부갑상선 호르몬 관련 펩티드와 그 수용체와의 결합을 저해하는 물질을 유효성분으로 함유하는 악액질 치료제가 제공된다. 상기 물질은 악액질 모델동물의 약효시험에 있어서, 체중감소를 대조 및 비교하여 억제하고, 또한 생존기간의 연장효과도 있으므로 악액질 치료제로서 유용하다.

<110> Chugai Seiyaku Kabusikikaisha <120> Therapeutic Agent for Cachexia <150> JP 9/125505 <151> 1997-05-15 <150> JP 9/194445 <151> 1997-07-18 <160> 75 <170> KOPATIN 1.5 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic DNA <400> 1 aaatagccct tgaccaggca 20 <210> 2 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic DNA <400> 2 ctggttcggc ccacctctga aggttccaga atcgatag 38 <210> 3 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic DNA <400> 3 ggatcccggg ccagtggata gacagatg 28 <210> 4 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic DNA <400> 4 ggatcccggg tcagrggaag gtggraaca 29 <210> 5 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic DNA <400> 5 gttttcccag tcacgac 17 <210> 6 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic DNA <400> 6 caggaaacag ctatgac 17 <210> 7 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic DNA <400> 7 gtctaagctt ccaccatgaa acttcgggct c 31 <210> 8 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic DNA <400> 8 tgttggatcc ctgcagagac agtgaccaga 30 <210> 9 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic DNA <400> 9 gtctgaattc aagcttccac catggggttt gggctg 36 <210> 10 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic DNA <400> 10 tttcccgggc ccttggtgga ggctgaggag acggtgacca g 41 <210> 11 <211> 110 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic DNA <400> 11 ggtttggtgg tctccactcc cgccttgacg gggctgccat ctgccttcca ggccactgtc 60 acagctcccg ggtagaagtc actgatcaga cacactagtg tggccttgtt 110 <210> 12 <211> 109 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic DNA <400> 12 gtctgaattc aagcttagta cttggccagc ccaaggccaa ccccacggtc accctgttcc 60 cgccctcctc tgaggagctc caagccaaca aggccacact agtgtgtct 109 <210> 13 <211> 98 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic DNA <400> 13 ggagtggaga ccaccaaacc ctccaaacag agcaacaaca agtacgcggc cagcagctac 60 ctgagcctga 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mRNA <400> 58 atggggtttg ggctgagctg ggttttcctc gttgctcttt taagaggtgt ccagtgtcag 60 gtgcagctgg tggagtctgg gggaggcgtg gtccagcctg ggaggtccct gagactctcc 120 tgtgcagcct ctggattcac cttcagtagc tatggcatgt cttgggtccg ccaggctcca 180 ggcaaggggc tggagtgggt ggcaaccatt agtagtggtg gtagttacac ctactatcca 240 gacagtgtga aggggcgatt caccatctcc agagacaatt ccaagaacac gctgtatctg 300 caaatgaaca gcctgagagc tgaggacacg gctgtgtatt actgtgcgag acagactact 360 atgacttact ttgcttactg gggccaggga accctggtca ccgtctcctc a 411 <210> 59 <211> 11 <212> PRT <213> Mouse <400> 59 Lys Ala Ser Gln Asp Val Asn Thr Ala Val Ala 1 5 10 <210> 60 <211> 7 <212> PRT <213> Mouse <400> 60 Ser Ala Ser Asn Arg Tyr Thr 1 5 <210> 61 <211> 9 <212> PRT <213> Mouse <400> 61 Gln Gln His Tyr Ser Thr Pro Phe Thr 1 5 <210> 62 <211> 5 <212> PRT <213> Mouse <400> 62 Pro Tyr Trp Met Gln 1 5 <210> 63 <211> 16 <212> PRT <213> Mouse <400> 63 Ser Ile Phe Gly Asp Gly Asp Thr Arg Tyr Ser Gln Lys Phe Lys Gly 1 5 10 15 <210> 64 <211> 11 <212> PRT <213> Mouse <400> 64 Gly Leu Arg Arg Gly Gly Tyr Tyr Phe Asp Tyr 1 5 10 <210> 65 <211> 411 <212> DNA-RNA <213> Mouse <220> <223> cDNA to mRNA <400> 65 atggcctgga ctcctctctt cttcttcttt gttcttcatt gctcaggttc tttctcccaa 60 cttgtgctca ctcagtcatc ttcagcctct ttctccctgg gagcctcagc aaaactcacg 120 tgcaccttga gtagtcagca cagtacgtac accattgaat ggtatcagca acagccactc 180 aagcctccta agtatgtgat ggatcttaag caagatggaa gccacagcac aggtgatggg 240 attcctgatc gcttctctgg atccagctct ggtgctgatc gctaccttag catttccaac 300 atccagccag aagatgaagc aatgtacatc tgtggtgtgg gtgatacaat taaggaacaa 360 tttgtgtatg ttttcggcgg tgggaccaag gtcactgtcc taggtcagcc c 411 <210> 66 <211> 405 <212> DNA-RNA <213> Human and mouse <220> <223> cDNA to mRNA <400> 66 atggcctgga ctcctctctt cttcttcttt gttcttcatt gctcaggttc tttctcccag 60 cttgtgctga ctcaatcgcc ctctgcctct gcctccctgg gagcctcggt caagctcacc 120 tgcaccttga gtagtcagca cagtacgtac accattgaat ggcatcagca gcagccagag 180 aagggccctc ggtacttgat gaaacttaag caagatggaa gccacagcac aggtgatggg 240 attcctgatc gcttctcagg ctccagctct ggggctgagc gctacctcac catctccagc 300 ctccagtctg aggatgaggc tgactattac tgtggtgtgg gtgatacaat taaggaacaa 360 tttgtgtacg tgttcggcgg agggaccaaa ctgaccgtcc taggt 405 <210> 67 <211> 411 <212> DNA-RNA <213> Human and mouse <220> <223> cDNA to mRNA <400> 67 atggcctgga ctcctctctt cttcttcttt gttcttcatt gctcaggttc tttctcccag 60 cttgtgctga ctcaatcgcc ctctgcctct gcctccctgg gagcctcggt caagctcacc 120 tgcaccttga gtagtcagca cagtacgtac accattgaat ggtatcagca gcagccagag 180 aagggcccta agtacctgat ggatcttaag caagatggaa gccacagcac aggtgatggg 240 attcctgatc gcttctcagg ctccagctct ggggctgagc gctacctcac catctccagc 300 ctccagtctg aggatgaggc tgactattac tgtggtgtgg gtgatacaat taaggaacaa 360 tttgtgtacg tgttcggcgg agggaccaaa ctgaccgtcc taggccagcc c 411 <210> 68 <211> 411 <212> DNA-RNA <213> Human and mouse <220> <223> cDNA to mRNA <400> 68 atggcctgga ctcctctctt cttcttcttt gttcttcatt gctcaggttc tttctcccag 60 cttgtgctga ctcaatcgcc ctctgcctct gcctccctgg gagcctcggt caagctcacc 120 tgcaccttga gtagtcagca cagtacgtac accattgaat ggtatcagca gcagccagag 180 aagggcccta agtacgtgat ggatcttaag caagatggaa gccacagcac aggtgatggg 240 attcctgatc gcttctcagg ctccagctct ggggctgagc gctacctcac catctccagc 300 ctccagtctg aggatgaggc tgactattac tgtggtgtgg gtgatacaat taaggaacaa 360 tttgtgtacg tgttcggcgg agggaccaaa ctgaccgtcc taggccagcc c 411 <210> 69 <211> 411 <212> DNA-RNA <213> Human and mouse <220> <223> cDNA to mRNA <400> 69 atggcctgga ctcctctctt cttcttcttt gttcttcatt gctcaggttc tttctcccag 60 cttgtgctga ctcaatcgcc ctctgcctct gcctccctgg gagcctcggt caagctcacc 120 tgcaccttga gtagtcagca cagtacgtac accattgaat ggtatcagca gcagccagag 180 aagggcccta ggtacctgat ggatcttaag caagatggaa gccacagcac aggtgatggg 240 attcctgatc gcttctcagg ctccagctct ggggctgagc gctacctcac catctccagc 300 ctccagtctg aggatgaggc tgactattac tgtggtgtgg gtgatacaat taaggaacaa 360 tttgtgtacg tgttcggcgg agggaccaaa ctgaccgtcc taggccagcc c 411 <210> 70 <211> 411 <212> DNA-RNA <213> Human and mouse <220> <223> cDNA to mRNA <400> 70 atggcctgga ctcctctctt cttcttcttt gttcttcatt gctcaggttc tttctcccag 60 cttgtgctga ctcaatcgcc ctctgcctct gcctccctgg gagcctcggt caagctcacc 120 tgcaccttga gtagtcagca cagtacgtac accattgaat ggtatcagca gcagccagag 180 aagggcccta ggtacgtgat ggatcttaag caagatggaa gccacagcac aggtgatggg 240 attcctgatc gcttctcagg ctccagctct ggggctgagc gctacctcac catctccagc 300 ctccagtctg aggatgaggc tgactattac tgtggtgtgg gtgatacaat taaggaacaa 360 tttgtgtacg tgttcggcgg agggaccaaa ctgaccgtcc taggccagcc c 411 <210> 71 <211> 411 <212> DNA-RNA <213> Human and mouse <220> <223> cDNA to mRNA <400> 71 atggcctgga ctcctctctt cttcttcttt gttcttcatt gctcaggttc tttctcccag 60 cttgtgctga ctcaatcgcc ctctgcctct gcctccctgg gagcctcggt caagctcacc 120 tgcaccttga gtagtcagca cagtacgtac accattgaat ggtatcagca gcagccagag 180 aagggcccta agtacctgat ggatcttaag caagatggaa gccacagcac aggtgatggg 240 attcctgatc gcttctcagg ctccagctct ggggctgagc gctacctcac catctccagc 300 ctccagtctg aggatgaggc tgactatatc tgtggtgtgg gtgatacaat taaggaacaa 360 tttgtgtacg tgttcggcgg agggaccaaa ctgaccgtcc taggccagcc c 411 <210> 72 <211> 411 <212> DNA-RNA <213> Human and mouse <220> <223> cDNA to mRNA <400> 72 atggcctgga ctcctctctt cttcttcttt gttcttcatt gctcaggttc tttctcccag 60 cttgtgctga ctcaatcgcc ctctgcctct gcctccctgg gagcctcggt caagctcacc 120 tgcaccttga gtagtcagca cagtacgtac accattgaat ggtatcagca gcagccagag 180 aagggcccta ggtacctgat ggatcttaag caagatggaa gccacagcac aggtgatggg 240 attcctgatc gcttctcagg ctccagctct ggggctgagc gctacctcac catctccagc 300 ctccagtctg aggatgaggc tgactatatc tgtggtgtgg gtgatacaat taaggaacaa 360 tttgtgtacg tgttcggcgg agggaccaaa ctgaccgtcc taggccagcc c 411 <210> 73 <211> 411 <212> DNA-RNA <213> Human and mouse <220> <223> cDNA to mRNA <400> 73 atggcctgga ctcctctctt cttcttcttt gttcttcatt gctcaggttc tttctcccag 60 cttgtgctga ctcaatcgcc ctctgcctct gcctccctgg gagcctcggt caagctcacc 120 tgcaccttga gtagtcagca cagtacgtac accattgaat ggtatcagca gcagccagag 180 aagggcccta agtacgtgat ggatcttaag caagatggaa gccacagcac aggtgatggg 240 attcctgatc gcttctcagg ctccagctct ggggctgagc gctacctcac catctccagc 300 ctccagtctg aggatgaggc tgactatatc tgtggtgtgg gtgatacaat taaggaacaa 360 tttgtgtacg tgttcggcgg agggaccaaa ctgaccgtcc taggccagcc c 411 <210> 74 <211> 411 <212> DNA-RNA <213> Human and mouse <220> <223> cDNA to mRNA <400> 74 atggcctgga ctcctctctt cttcttcttt gttcttcatt gctcaggttc tttctcccag 60 cttgtgctga ctcaatcgcc ctctgcctct gcctccctgg gagcctcggt caagctcacc 120 tgcaccttga gtagtcagca cagtacgtac accattgaat ggtatcagca gcagccagag 180 aagggcccta ggtacgtgat ggatcttaag caagatggaa gccacagcac aggtgatggg 240 attcctgatc gcttctcagg ctccagctct ggggctgagc gctacctcac catctccagc 300 ctccagtctg aggatgaggc tgactatatc tgtggtgtgg gtgatacaat taaggaacaa 360 tttgtgtacg tgttcggcgg agggaccaaa ctgaccgtcc taggccagcc c 411 <210> 75 <211> 34 <212> PRT <213> Human <400> 75 Ala Val Ser Glu His Gln Leu Leu His Asp Lys Gly Lys Ser Ile Gln 1 5 10 15 Asp Leu Arg Arg Arg Phe Phe Leu His His Leu Ile Ala Glu Ile His 20 25 30 Thr Ala

Claims

항부갑상선 호르몬 관련 펩티드 항체를 유효성분으로 함유하는 악액질 치료제.
삭제
삭제
항부갑상선 호르몬 관련 펩티드 항체의 단편 및/또는 그 수식물을 유효성분으로 함유하는 악액질 치료제.
제 1항 또는 제 4항에 있어서,

항체가 인간형화 또는 키메라화된 것을 특징으로 하는

악액질 치료제.
제 5항에 있어서,

인간형화 항체가 인간형화 #23-57-137-1 항체인 것을 특징으로 하는

악액질 치료제.
제 1항 또는 제 4항에 있어서,

항체가 모노클로날 항체인 것을 특징으로 하는

악액질 치료제.
제 1항 또는 제 4항 내지 제 7항 중 어느 한 항에 있어서,

악액질이 암으로부터 유래한 것을 특징으로 하는

악액질 치료제.
제 1항에 있어서,

항부갑상선 호르몬 관련 펩티드 항체는, (a) 악액질의 예방 또는 치료 에 활성을 가지며, (b) 인간구강저암 OCC-1의 세포성장을 억제하는 활 성을 갖지 않는 것을 특징으로 하는

악액질 치료제.