UA74130C2 - ЗАСТОСУВАННЯ АНТИТІЛА ПРОТИ БІЛКА, СПОРІДНЕНОГО З ПАРАТИРЕОЇДНИМ ГОРМОНОМ (PTHrP), АБО ЙОГО ФУНКЦІОНАЛЬНО АКТИВНОГО ФРАГМЕНТА І/АБО ЙОГО МОДИФІКОВАНОГО ФРАГМЕНТА ДЛЯ ВИРОБНИЦТВА ЛІКАРСЬКОГО ЗАСОБУ ДЛЯ ПРОФІЛАКТИКИ АБО ЛІКУВАННЯ КАХЕКСІЇ - Google Patents
ЗАСТОСУВАННЯ АНТИТІЛА ПРОТИ БІЛКА, СПОРІДНЕНОГО З ПАРАТИРЕОЇДНИМ ГОРМОНОМ (PTHrP), АБО ЙОГО ФУНКЦІОНАЛЬНО АКТИВНОГО ФРАГМЕНТА І/АБО ЙОГО МОДИФІКОВАНОГО ФРАГМЕНТА ДЛЯ ВИРОБНИЦТВА ЛІКАРСЬКОГО ЗАСОБУ ДЛЯ ПРОФІЛАКТИКИ АБО ЛІКУВАННЯ КАХЕКСІЇ Download PDFInfo
- Publication number
- UA74130C2 UA74130C2 UA99126675A UA99126675A UA74130C2 UA 74130 C2 UA74130 C2 UA 74130C2 UA 99126675 A UA99126675 A UA 99126675A UA 99126675 A UA99126675 A UA 99126675A UA 74130 C2 UA74130 C2 UA 74130C2
- Authority
- UA
- Ukraine
- Prior art keywords
- antibody
- chain
- beg
- dna
- plasmid
- Prior art date
Links
- 206010006895 Cachexia Diseases 0.000 title claims abstract description 58
- 239000003814 drug Substances 0.000 title abstract description 20
- 229940079593 drug Drugs 0.000 title abstract 2
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims abstract description 163
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 85
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims abstract description 26
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims abstract description 19
- 102000003982 Parathyroid hormone Human genes 0.000 claims abstract description 3
- 108090000445 Parathyroid hormone Proteins 0.000 claims abstract description 3
- 239000000199 parathyroid hormone Substances 0.000 claims abstract description 3
- 229960001319 parathyroid hormone Drugs 0.000 claims abstract description 3
- 210000004408 hybridoma Anatomy 0.000 claims description 35
- 239000000126 substance Substances 0.000 claims description 18
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 claims description 10
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 claims description 7
- 230000012010 growth Effects 0.000 claims description 6
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 5
- 229940126601 medicinal product Drugs 0.000 claims description 2
- 230000002265 prevention Effects 0.000 claims 2
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 claims 1
- 108700020797 Parathyroid Hormone-Related Proteins 0.000 abstract 1
- 102000043299 Parathyroid hormone-related Human genes 0.000 abstract 1
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 267
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 207
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 118
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 106
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 102
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 100
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 100
- 238000000034 method Methods 0.000 description 78
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 75
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 69
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 68
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 60
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 59
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 58
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 54
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 47
- 230000027455 binding Effects 0.000 description 45
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 43
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 37
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 37
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 37
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 37
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 34
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N Phenol Chemical compound OC1=CC=CC=C1 ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 34
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 33
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 28
- 244000068988 Glycine max Species 0.000 description 27
- 235000010469 Glycine max Nutrition 0.000 description 27
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 27
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 25
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 24
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 22
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 description 22
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 22
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 22
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 22
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 22
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 22
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 22
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 21
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 21
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 21
- 239000000047 product Substances 0.000 description 21
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 20
- 239000011575 calcium Substances 0.000 description 20
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 20
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 20
- OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N Calcium Chemical compound [Ca] OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 19
- 229910052791 calcium Inorganic materials 0.000 description 19
- 229940124597 therapeutic agent Drugs 0.000 description 19
- 102000002260 Alkaline Phosphatase Human genes 0.000 description 18
- 108020004774 Alkaline Phosphatase Proteins 0.000 description 18
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 18
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 18
- 239000012228 culture supernatant Substances 0.000 description 17
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 17
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 17
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 16
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 16
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 16
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 16
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 15
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 15
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 15
- 210000004978 chinese hamster ovary cell Anatomy 0.000 description 15
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 15
- 230000003472 neutralizing effect Effects 0.000 description 15
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 14
- 238000012869 ethanol precipitation Methods 0.000 description 14
- 229940126619 mouse monoclonal antibody Drugs 0.000 description 14
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 13
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 12
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 12
- 239000012894 fetal calf serum Substances 0.000 description 12
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 12
- 238000002844 melting Methods 0.000 description 12
- 239000002480 mineral oil Substances 0.000 description 12
- 235000010446 mineral oil Nutrition 0.000 description 12
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 12
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 12
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 12
- 206010035226 Plasma cell myeloma Diseases 0.000 description 11
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 11
- 201000000050 myeloid neoplasm Diseases 0.000 description 11
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 11
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 11
- 238000002054 transplantation Methods 0.000 description 11
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 10
- 201000009030 Carcinoma Diseases 0.000 description 10
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 10
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 10
- 230000007910 cell fusion Effects 0.000 description 10
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 10
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 10
- 238000006138 lithiation reaction Methods 0.000 description 10
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 10
- 210000000214 mouth Anatomy 0.000 description 10
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 9
- OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N L-tyrosine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 9
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 9
- 230000001235 sensitizing effect Effects 0.000 description 9
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 9
- 210000003462 vein Anatomy 0.000 description 9
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 8
- NFGXHKASABOEEW-UHFFFAOYSA-N 1-methylethyl 11-methoxy-3,7,11-trimethyl-2,4-dodecadienoate Chemical compound COC(C)(C)CCCC(C)CC=CC(C)=CC(=O)OC(C)C NFGXHKASABOEEW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 description 8
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 8
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 8
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 8
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 8
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 8
- 230000000144 pharmacologic effect Effects 0.000 description 8
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 8
- OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N tyrosine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 208000016261 weight loss Diseases 0.000 description 8
- 230000004580 weight loss Effects 0.000 description 8
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 7
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 7
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 7
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 7
- 229960000310 isoleucine Drugs 0.000 description 7
- WRUUGTRCQOWXEG-UHFFFAOYSA-N pamidronate Chemical compound NCCC(O)(P(O)(O)=O)P(O)(O)=O WRUUGTRCQOWXEG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 7
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 7
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 description 7
- 208000037147 Hypercalcaemia Diseases 0.000 description 6
- 102000008394 Immunoglobulin Fragments Human genes 0.000 description 6
- 108010021625 Immunoglobulin Fragments Proteins 0.000 description 6
- AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N L-isoleucine Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 6
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 6
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 6
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 6
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 6
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 description 6
- 230000000148 hypercalcaemia Effects 0.000 description 6
- 208000030915 hypercalcemia disease Diseases 0.000 description 6
- AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N isoleucine Natural products CCC(C)C(N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 6
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 6
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 5
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 5
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 5
- 230000037396 body weight Effects 0.000 description 5
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 5
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 5
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 5
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 5
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 5
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 5
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 5
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 5
- 229940046231 pamidronate Drugs 0.000 description 5
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 5
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 5
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 5
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 5
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 5
- 230000009261 transgenic effect Effects 0.000 description 5
- XZKIHKMTEMTJQX-UHFFFAOYSA-N 4-Nitrophenyl Phosphate Chemical compound OP(O)(=O)OC1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 XZKIHKMTEMTJQX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 4
- 241000786798 Atya Species 0.000 description 4
- 241000283725 Bos Species 0.000 description 4
- IVOMOUWHDPKRLL-KQYNXXCUSA-N Cyclic adenosine monophosphate Chemical compound C([C@H]1O2)OP(O)(=O)O[C@H]1[C@@H](O)[C@@H]2N1C(N=CN=C2N)=C2N=C1 IVOMOUWHDPKRLL-KQYNXXCUSA-N 0.000 description 4
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- NYHBQMYGNKIUIF-UUOKFMHZSA-N Guanosine Chemical compound C1=NC=2C(=O)NC(N)=NC=2N1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@H]1O NYHBQMYGNKIUIF-UUOKFMHZSA-N 0.000 description 4
- 102100034343 Integrase Human genes 0.000 description 4
- 108010092799 RNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 4
- 206010070834 Sensitisation Diseases 0.000 description 4
- IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N Thymidine Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)C1 IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N 0.000 description 4
- 108060008682 Tumor Necrosis Factor Proteins 0.000 description 4
- 230000000996 additive effect Effects 0.000 description 4
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 4
- 235000010419 agar Nutrition 0.000 description 4
- 239000005557 antagonist Substances 0.000 description 4
- 238000010804 cDNA synthesis Methods 0.000 description 4
- 239000005549 deoxyribonucleoside Substances 0.000 description 4
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 4
- 239000000839 emulsion Substances 0.000 description 4
- 238000000227 grinding Methods 0.000 description 4
- 210000002837 heart atrium Anatomy 0.000 description 4
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 description 4
- 231100000219 mutagenic Toxicity 0.000 description 4
- 230000003505 mutagenic effect Effects 0.000 description 4
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 4
- 238000003127 radioimmunoassay Methods 0.000 description 4
- 238000003259 recombinant expression Methods 0.000 description 4
- 239000002342 ribonucleoside Substances 0.000 description 4
- 230000008313 sensitization Effects 0.000 description 4
- 238000002791 soaking Methods 0.000 description 4
- 101001135770 Homo sapiens Parathyroid hormone Proteins 0.000 description 3
- 101001135995 Homo sapiens Probable peptidyl-tRNA hydrolase Proteins 0.000 description 3
- 108091006905 Human Serum Albumin Proteins 0.000 description 3
- 102000008100 Human Serum Albumin Human genes 0.000 description 3
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 description 3
- DNIAPMSPPWPWGF-UHFFFAOYSA-N Propylene glycol Chemical compound CC(O)CO DNIAPMSPPWPWGF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 3
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 3
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 3
- 101150059448 cdk7 gene Proteins 0.000 description 3
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 3
- 125000004122 cyclic group Chemical group 0.000 description 3
- 238000011161 development Methods 0.000 description 3
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 3
- 239000002552 dosage form Substances 0.000 description 3
- 150000003278 haem Chemical class 0.000 description 3
- 102000058004 human PTH Human genes 0.000 description 3
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 3
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 3
- 210000001161 mammalian embryo Anatomy 0.000 description 3
- 235000013336 milk Nutrition 0.000 description 3
- 239000008267 milk Substances 0.000 description 3
- 210000004080 milk Anatomy 0.000 description 3
- 238000011330 nucleic acid test Methods 0.000 description 3
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 3
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 3
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 3
- 239000006152 selective media Substances 0.000 description 3
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 3
- 229940104230 thymidine Drugs 0.000 description 3
- LHMQDVIHBXWNII-UHFFFAOYSA-N 3-amino-4-methoxy-n-phenylbenzamide Chemical compound C1=C(N)C(OC)=CC=C1C(=O)NC1=CC=CC=C1 LHMQDVIHBXWNII-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108020004491 Antisense DNA Proteins 0.000 description 2
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 2
- DWRXFEITVBNRMK-UHFFFAOYSA-N Beta-D-1-Arabinofuranosylthymine Natural products O=C1NC(=O)C(C)=CN1C1C(O)C(O)C(CO)O1 DWRXFEITVBNRMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000701822 Bovine papillomavirus Species 0.000 description 2
- 102100025248 C-X-C motif chemokine 10 Human genes 0.000 description 2
- 102000014914 Carrier Proteins Human genes 0.000 description 2
- 108010078791 Carrier Proteins Proteins 0.000 description 2
- 241000282693 Cercopithecidae Species 0.000 description 2
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 2
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 2
- FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N D-Mannitol Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N 0.000 description 2
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 101100184531 Drosophila melanogaster Mo25 gene Proteins 0.000 description 2
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 2
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 2
- ZRALSGWEFCBTJO-UHFFFAOYSA-N Guanidine Chemical compound NC(N)=N ZRALSGWEFCBTJO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010025815 Kanamycin Kinase Proteins 0.000 description 2
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 description 2
- 101150104182 MOB2 gene Proteins 0.000 description 2
- 229930195725 Mannitol Natural products 0.000 description 2
- 101100494453 Mus musculus Cab39 gene Proteins 0.000 description 2
- 244000004005 Nypa fruticans Species 0.000 description 2
- 235000005305 Nypa fruticans Nutrition 0.000 description 2
- 241001505332 Polyomavirus sp. Species 0.000 description 2
- ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N Proline Natural products OC(=O)C1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 101710086015 RNA ligase Proteins 0.000 description 2
- 101100222379 Rattus norvegicus Cxcl10 gene Proteins 0.000 description 2
- 101100018694 Rattus norvegicus Il24 gene Proteins 0.000 description 2
- 229910019567 Re Re Inorganic materials 0.000 description 2
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000009843 Thyroglobulin Human genes 0.000 description 2
- 108010034949 Thyroglobulin Proteins 0.000 description 2
- 102000000852 Tumor Necrosis Factor-alpha Human genes 0.000 description 2
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 2
- 230000009471 action Effects 0.000 description 2
- 238000001261 affinity purification Methods 0.000 description 2
- 101150092006 agaB gene Proteins 0.000 description 2
- 102000006646 aminoglycoside phosphotransferase Human genes 0.000 description 2
- 230000003042 antagnostic effect Effects 0.000 description 2
- 239000003816 antisense DNA Substances 0.000 description 2
- IQFYYKKMVGJFEH-UHFFFAOYSA-N beta-L-thymidine Natural products O=C1NC(=O)C(C)=CN1C1OC(CO)C(O)C1 IQFYYKKMVGJFEH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000005018 casein Substances 0.000 description 2
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 2
- 238000007385 chemical modification Methods 0.000 description 2
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 2
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 2
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 2
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 description 2
- 239000000945 filler Substances 0.000 description 2
- 239000012737 fresh medium Substances 0.000 description 2
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 2
- 238000005534 hematocrit Methods 0.000 description 2
- JYGXADMDTFJGBT-VWUMJDOOSA-N hydrocortisone Chemical compound O=C1CC[C@]2(C)[C@H]3[C@@H](O)C[C@](C)([C@@](CC4)(O)C(=O)CO)[C@@H]4[C@@H]3CCC2=C1 JYGXADMDTFJGBT-VWUMJDOOSA-N 0.000 description 2
- 238000002513 implantation Methods 0.000 description 2
- 102000003898 interleukin-24 Human genes 0.000 description 2
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 2
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 description 2
- 239000000594 mannitol Substances 0.000 description 2
- 235000010355 mannitol Nutrition 0.000 description 2
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 2
- HOEFWOBLOGZQIQ-UHFFFAOYSA-N morpholin-4-yl morpholine-4-carbodithioate Chemical compound C1COCCN1C(=S)SN1CCOCC1 HOEFWOBLOGZQIQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 210000004279 orbit Anatomy 0.000 description 2
- 210000001322 periplasm Anatomy 0.000 description 2
- -1 poly(sodium acrylate) Polymers 0.000 description 2
- 239000011148 porous material Substances 0.000 description 2
- 210000001236 prokaryotic cell Anatomy 0.000 description 2
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 2
- 238000011160 research Methods 0.000 description 2
- 238000010839 reverse transcription Methods 0.000 description 2
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 2
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 2
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 2
- 239000000741 silica gel Substances 0.000 description 2
- 229910002027 silica gel Inorganic materials 0.000 description 2
- 210000004989 spleen cell Anatomy 0.000 description 2
- 239000007929 subcutaneous injection Substances 0.000 description 2
- 238000010254 subcutaneous injection Methods 0.000 description 2
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 2
- 230000001629 suppression Effects 0.000 description 2
- 230000009885 systemic effect Effects 0.000 description 2
- 229960002175 thyroglobulin Drugs 0.000 description 2
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 2
- 102000003390 tumor necrosis factor Human genes 0.000 description 2
- 241000701161 unidentified adenovirus Species 0.000 description 2
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- LNAZSHAWQACDHT-XIYTZBAFSA-N (2r,3r,4s,5r,6s)-4,5-dimethoxy-2-(methoxymethyl)-3-[(2s,3r,4s,5r,6r)-3,4,5-trimethoxy-6-(methoxymethyl)oxan-2-yl]oxy-6-[(2r,3r,4s,5r,6r)-4,5,6-trimethoxy-2-(methoxymethyl)oxan-3-yl]oxyoxane Chemical compound CO[C@@H]1[C@@H](OC)[C@H](OC)[C@@H](COC)O[C@H]1O[C@H]1[C@H](OC)[C@@H](OC)[C@H](O[C@H]2[C@@H]([C@@H](OC)[C@H](OC)O[C@@H]2COC)OC)O[C@@H]1COC LNAZSHAWQACDHT-XIYTZBAFSA-N 0.000 description 1
- DYUUGILMVYJEHY-UHFFFAOYSA-N 1-$l^{1}-oxidanyl-4,4,5,5-tetramethyl-3-oxido-2-phenylimidazol-3-ium Chemical compound CC1(C)C(C)(C)N([O])C(C=2C=CC=CC=2)=[N+]1[O-] DYUUGILMVYJEHY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- CNZNXTZACZSGHV-UHFFFAOYSA-N 3,7-dihydropurine-2,6-dione;guanidine Chemical compound NC(N)=N.O=C1NC(=O)NC2=C1NC=N2 CNZNXTZACZSGHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ZCYVEMRRCGMTRW-UHFFFAOYSA-N 7553-56-2 Chemical compound [I] ZCYVEMRRCGMTRW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 244000215068 Acacia senegal Species 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N Alpha-Lactose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)O[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N 0.000 description 1
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 description 1
- 206010003445 Ascites Diseases 0.000 description 1
- DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N Asparagine Natural products OC(=O)C(N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000132092 Aster Species 0.000 description 1
- 229930182670 Astin Natural products 0.000 description 1
- 108091028026 C-DNA Proteins 0.000 description 1
- 101100366935 Caenorhabditis elegans sto-2 gene Proteins 0.000 description 1
- 102000008186 Collagen Human genes 0.000 description 1
- 108010035532 Collagen Proteins 0.000 description 1
- 241000699800 Cricetinae Species 0.000 description 1
- 241000699802 Cricetulus griseus Species 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N D-Glucitol Natural products OC[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-JGWLITMVSA-N D-glucitol Chemical compound OC[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-JGWLITMVSA-N 0.000 description 1
- 102000012410 DNA Ligases Human genes 0.000 description 1
- 108010061982 DNA Ligases Proteins 0.000 description 1
- 229920002307 Dextran Polymers 0.000 description 1
- 206010014418 Electrolyte imbalance Diseases 0.000 description 1
- 239000001856 Ethyl cellulose Substances 0.000 description 1
- ZZSNKZQZMQGXPY-UHFFFAOYSA-N Ethyl cellulose Chemical compound CCOCC1OC(OC)C(OCC)C(OCC)C1OC1C(O)C(O)C(OC)C(CO)O1 ZZSNKZQZMQGXPY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000233866 Fungi Species 0.000 description 1
- 241000867624 Galinsoga mosaic virus Species 0.000 description 1
- 108010010803 Gelatin Proteins 0.000 description 1
- 229920000084 Gum arabic Polymers 0.000 description 1
- 108091060210 Heavy strand Proteins 0.000 description 1
- 241000008028 Hebius Species 0.000 description 1
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 description 1
- 101000650344 Homo sapiens RecQ-mediated genome instability protein 1 Proteins 0.000 description 1
- 241000701024 Human betaherpesvirus 5 Species 0.000 description 1
- 102000015696 Interleukins Human genes 0.000 description 1
- 108010063738 Interleukins Proteins 0.000 description 1
- DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N L-asparagine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N L-aspartic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N Lactose Natural products OC[C@H]1O[C@@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)C(O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N 0.000 description 1
- 206010061523 Lip and/or oral cavity cancer Diseases 0.000 description 1
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102100032587 MOB-like protein phocein Human genes 0.000 description 1
- 101710168500 MOB-like protein phocein Proteins 0.000 description 1
- 241000829100 Macaca mulatta polyomavirus 1 Species 0.000 description 1
- 229910016006 MoSi Inorganic materials 0.000 description 1
- 101150091136 Mob4 gene Proteins 0.000 description 1
- 241000711408 Murine respirovirus Species 0.000 description 1
- CHJJGSNFBQVOTG-UHFFFAOYSA-N N-methyl-guanidine Natural products CNC(N)=N CHJJGSNFBQVOTG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108091007491 NSP3 Papain-like protease domains Proteins 0.000 description 1
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 1
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 1
- 240000007594 Oryza sativa Species 0.000 description 1
- 235000007164 Oryza sativa Nutrition 0.000 description 1
- 108090000526 Papain Proteins 0.000 description 1
- 102000057297 Pepsin A Human genes 0.000 description 1
- 108090000284 Pepsin A Proteins 0.000 description 1
- 102000002508 Peptide Elongation Factors Human genes 0.000 description 1
- 108010068204 Peptide Elongation Factors Proteins 0.000 description 1
- 239000004264 Petrolatum Substances 0.000 description 1
- 102000004160 Phosphoric Monoester Hydrolases Human genes 0.000 description 1
- 108090000608 Phosphoric Monoester Hydrolases Proteins 0.000 description 1
- 229920002594 Polyethylene Glycol 8000 Polymers 0.000 description 1
- 239000004353 Polyethylene glycol 8000 Substances 0.000 description 1
- 239000004372 Polyvinyl alcohol Substances 0.000 description 1
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 1
- 108091034057 RNA (poly(A)) Proteins 0.000 description 1
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 1
- 102100027431 RecQ-mediated genome instability protein 1 Human genes 0.000 description 1
- 241000283984 Rodentia Species 0.000 description 1
- 241000956335 Rysops Species 0.000 description 1
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 1
- 229940125377 Selective β-Amyloid-Lowering Agent Drugs 0.000 description 1
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 229920002125 Sokalan® Polymers 0.000 description 1
- 229920002472 Starch Polymers 0.000 description 1
- 108091081024 Start codon Proteins 0.000 description 1
- 235000021355 Stearic acid Nutrition 0.000 description 1
- 108010022394 Threonine synthase Proteins 0.000 description 1
- 108020004440 Thymidine kinase Proteins 0.000 description 1
- 241000838698 Togo Species 0.000 description 1
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000010489 acacia gum Nutrition 0.000 description 1
- 239000000205 acacia gum Substances 0.000 description 1
- DPXJVFZANSGRMM-UHFFFAOYSA-N acetic acid;2,3,4,5,6-pentahydroxyhexanal;sodium Chemical compound [Na].CC(O)=O.OCC(O)C(O)C(O)C(O)C=O DPXJVFZANSGRMM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 1
- 238000012197 amplification kit Methods 0.000 description 1
- 208000007502 anemia Diseases 0.000 description 1
- 210000004102 animal cell Anatomy 0.000 description 1
- 208000022531 anorexia Diseases 0.000 description 1
- 230000008485 antagonism Effects 0.000 description 1
- 230000000692 anti-sense effect Effects 0.000 description 1
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960001230 asparagine Drugs 0.000 description 1
- 235000009582 asparagine Nutrition 0.000 description 1
- 235000003704 aspartic acid Nutrition 0.000 description 1
- RYXHOMYVWAEKHL-UHFFFAOYSA-N astatine atom Chemical compound [At] RYXHOMYVWAEKHL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000027697 autoimmune lymphoproliferative syndrome due to CTLA4 haploinsuffiency Diseases 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 1
- OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N beta-carboxyaspartic acid Natural products OC(=O)C(N)C(C(O)=O)C(O)=O OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 1
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 1
- 210000000988 bone and bone Anatomy 0.000 description 1
- 238000010805 cDNA synthesis kit Methods 0.000 description 1
- 244000309466 calf Species 0.000 description 1
- 150000001718 carbodiimides Chemical class 0.000 description 1
- 239000001768 carboxy methyl cellulose Substances 0.000 description 1
- 231100000504 carcinogenesis Toxicity 0.000 description 1
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 1
- BECPQYXYKAMYBN-UHFFFAOYSA-N casein, tech. Chemical compound NCCCCC(C(O)=O)N=C(O)C(CC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CC(C)C)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(CC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(C(C)O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(COP(O)(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(N)CC1=CC=CC=C1 BECPQYXYKAMYBN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000021240 caseins Nutrition 0.000 description 1
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 1
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 1
- 239000001913 cellulose Substances 0.000 description 1
- 229920002678 cellulose Polymers 0.000 description 1
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 description 1
- 239000013599 cloning vector Substances 0.000 description 1
- 229920001436 collagen Polymers 0.000 description 1
- 238000004891 communication Methods 0.000 description 1
- 238000012790 confirmation Methods 0.000 description 1
- 239000006071 cream Substances 0.000 description 1
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 1
- 230000034994 death Effects 0.000 description 1
- 206010061428 decreased appetite Diseases 0.000 description 1
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 description 1
- 239000005546 dideoxynucleotide Substances 0.000 description 1
- GPLRAVKSCUXZTP-UHFFFAOYSA-N diglycerol Chemical compound OCC(O)COCC(O)CO GPLRAVKSCUXZTP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000004419 dihydrofolate reductase Human genes 0.000 description 1
- 239000013024 dilution buffer Substances 0.000 description 1
- SWSQBOPZIKWTGO-UHFFFAOYSA-N dimethylaminoamidine Natural products CN(C)C(N)=N SWSQBOPZIKWTGO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000035475 disorder Diseases 0.000 description 1
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 description 1
- 239000012149 elution buffer Substances 0.000 description 1
- 235000019325 ethyl cellulose Nutrition 0.000 description 1
- 229920001249 ethyl cellulose Polymers 0.000 description 1
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 239000011536 extraction buffer Substances 0.000 description 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 1
- 238000013467 fragmentation Methods 0.000 description 1
- 238000006062 fragmentation reaction Methods 0.000 description 1
- 239000008273 gelatin Substances 0.000 description 1
- 229920000159 gelatin Polymers 0.000 description 1
- 235000019322 gelatine Nutrition 0.000 description 1
- 235000011852 gelatine desserts Nutrition 0.000 description 1
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 1
- ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N glutamine Natural products OC(=O)C(N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000011187 glycerol Nutrition 0.000 description 1
- 235000020251 goat milk Nutrition 0.000 description 1
- 230000003067 hemagglutinative effect Effects 0.000 description 1
- HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N histidine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940088597 hormone Drugs 0.000 description 1
- 239000005556 hormone Substances 0.000 description 1
- 229960000890 hydrocortisone Drugs 0.000 description 1
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 1
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 1
- 230000036737 immune function Effects 0.000 description 1
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 1
- 230000001771 impaired effect Effects 0.000 description 1
- 229940102223 injectable solution Drugs 0.000 description 1
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 1
- 239000002054 inoculum Substances 0.000 description 1
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 1
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 1
- 238000007918 intramuscular administration Methods 0.000 description 1
- 239000007927 intramuscular injection Substances 0.000 description 1
- 238000007912 intraperitoneal administration Methods 0.000 description 1
- 239000007928 intraperitoneal injection Substances 0.000 description 1
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 description 1
- 238000010253 intravenous injection Methods 0.000 description 1
- 239000011630 iodine Substances 0.000 description 1
- 229910052740 iodine Inorganic materials 0.000 description 1
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 description 1
- 239000008101 lactose Substances 0.000 description 1
- 231100000518 lethal Toxicity 0.000 description 1
- 230000001665 lethal effect Effects 0.000 description 1
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 1
- 208000012987 lip and oral cavity carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 230000002934 lysing effect Effects 0.000 description 1
- 238000012423 maintenance Methods 0.000 description 1
- 230000036210 malignancy Effects 0.000 description 1
- 230000003211 malignant effect Effects 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 230000008018 melting Effects 0.000 description 1
- 229920000609 methyl cellulose Polymers 0.000 description 1
- 239000001923 methylcellulose Substances 0.000 description 1
- 235000010981 methylcellulose Nutrition 0.000 description 1
- 239000011259 mixed solution Substances 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 102000051367 mu Opioid Receptors Human genes 0.000 description 1
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 1
- 210000002445 nipple Anatomy 0.000 description 1
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 1
- GLDOVTGHNKAZLK-UHFFFAOYSA-N octadecan-1-ol Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCCCCO GLDOVTGHNKAZLK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QIQXTHQIDYTFRH-UHFFFAOYSA-N octadecanoic acid Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCCCC(O)=O QIQXTHQIDYTFRH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OQCDKBAXFALNLD-UHFFFAOYSA-N octadecanoic acid Natural products CCCCCCCC(C)CCCCCCCCC(O)=O OQCDKBAXFALNLD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000002674 ointment Substances 0.000 description 1
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 1
- 239000003960 organic solvent Substances 0.000 description 1
- 210000001672 ovary Anatomy 0.000 description 1
- 239000005022 packaging material Substances 0.000 description 1
- 229940055729 papain Drugs 0.000 description 1
- 235000019834 papain Nutrition 0.000 description 1
- 239000012188 paraffin wax Substances 0.000 description 1
- 208000012111 paraneoplastic syndrome Diseases 0.000 description 1
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 description 1
- 239000001814 pectin Substances 0.000 description 1
- 235000010987 pectin Nutrition 0.000 description 1
- 229920001277 pectin Polymers 0.000 description 1
- 229940111202 pepsin Drugs 0.000 description 1
- 235000019271 petrolatum Nutrition 0.000 description 1
- 229940066842 petrolatum Drugs 0.000 description 1
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 description 1
- 239000000825 pharmaceutical preparation Substances 0.000 description 1
- 229920001495 poly(sodium acrylate) polymer Polymers 0.000 description 1
- 229940057838 polyethylene glycol 4000 Drugs 0.000 description 1
- 229940085678 polyethylene glycol 8000 Drugs 0.000 description 1
- 235000019446 polyethylene glycol 8000 Nutrition 0.000 description 1
- 235000010482 polyoxyethylene sorbitan monooleate Nutrition 0.000 description 1
- 229920000053 polysorbate 80 Polymers 0.000 description 1
- 229920002451 polyvinyl alcohol Polymers 0.000 description 1
- 229920000036 polyvinylpyrrolidone Polymers 0.000 description 1
- 239000001267 polyvinylpyrrolidone Substances 0.000 description 1
- 235000013855 polyvinylpyrrolidone Nutrition 0.000 description 1
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 235000013772 propylene glycol Nutrition 0.000 description 1
- 239000012264 purified product Substances 0.000 description 1
- 235000008001 rakum palm Nutrition 0.000 description 1
- 239000002464 receptor antagonist Substances 0.000 description 1
- 229940044551 receptor antagonist Drugs 0.000 description 1
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 1
- 235000009566 rice Nutrition 0.000 description 1
- 238000005185 salting out Methods 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 230000019491 signal transduction Effects 0.000 description 1
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 1
- 229910052708 sodium Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019812 sodium carboxymethyl cellulose Nutrition 0.000 description 1
- 229920001027 sodium carboxymethylcellulose Polymers 0.000 description 1
- YFGAFXCSLUUJRG-WCCKRBBISA-M sodium;(2s)-2-amino-5-(diaminomethylideneamino)pentanoate Chemical compound [Na+].[O-]C(=O)[C@@H](N)CCCN=C(N)N YFGAFXCSLUUJRG-WCCKRBBISA-M 0.000 description 1
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 1
- 239000000600 sorbitol Substances 0.000 description 1
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 1
- 210000000952 spleen Anatomy 0.000 description 1
- 235000019698 starch Nutrition 0.000 description 1
- 239000008107 starch Substances 0.000 description 1
- 239000008117 stearic acid Substances 0.000 description 1
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 1
- 150000005846 sugar alcohols Chemical class 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 239000004094 surface-active agent Substances 0.000 description 1
- 208000011580 syndromic disease Diseases 0.000 description 1
- 229940126585 therapeutic drug Drugs 0.000 description 1
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 description 1
- 238000005199 ultracentrifugation Methods 0.000 description 1
- 241001430294 unidentified retrovirus Species 0.000 description 1
- 239000004474 valine Substances 0.000 description 1
- 239000000230 xanthan gum Substances 0.000 description 1
- 229920001285 xanthan gum Polymers 0.000 description 1
- 235000010493 xanthan gum Nutrition 0.000 description 1
- 229940082509 xanthan gum Drugs 0.000 description 1
- 108020001612 μ-opioid receptors Proteins 0.000 description 1
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
- A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- A61K38/22—Hormones
- A61K38/29—Parathyroid hormone, i.e. parathormone; Parathyroid hormone-related peptides
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/575—Hormones
- C07K14/635—Parathyroid hormone, i.e. parathormone; Parathyroid hormone-related peptides
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
- C07K16/26—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against hormones ; against hormone releasing or inhibiting factors
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
- C07K2317/24—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin containing regions, domains or residues from different species, e.g. chimeric, humanized or veneered
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Endocrinology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Public Health (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Confectionery (AREA)
- Valve Device For Special Equipments (AREA)
- Massaging Devices (AREA)
- Medicines Containing Plant Substances (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Polymerisation Methods In General (AREA)
- Acyclic And Carbocyclic Compounds In Medicinal Compositions (AREA)
Abstract
Застосування антитіла проти білка, спорідненого з паратиреоїдним гормоном (PTHrP), або його функціонально активного фрагмента і/або його модифікованого фрагмента, що має таку саму активність по відношенню до білка, для виробництва лікарського засобу для профілактики або лікування кахексії.
Description
Опис винаходу
Даний винахід відноситься до терапевтичного агента для лікування кахексії, що містить в якості активного 2 інгредієнта речовину, здатну інгібувати зв'язування між білком, спорідненим паращитовидному гормону людини, (РТНГР) і його рецептором.
Кахексія, що виявляється у суб'єктів з кінцевою стадією рака, є одним з типових паранеопластичних синдромів розвитку злоякісного захворювання і характеризується такими системними порушеннями, як анорексія, втрата у вазі, анемія, електролітний дисбаланс і порушення імунної функції. Розвиток кахексії у 70 ракових хворих веде до появи летальних і термінальних симптомів, погіршує якість життя (001) і чинить сильний психологічний, фізичний і соціальний вплив на хворих, їх сім'ю і оточуючих людей.
Дослідження останніх років дозволили встановити, що кахектин, який, як вважають, є причиною виникнення ракової кахексії, ідентичний фактору некрозу пухлин (ТМЕ). Крім того, виявлено, що цитокіни (наприклад, інтерлейкін (13-1, 1/-6, ПІР, ІЕМ) чинять таку ж дію, що і кахектин, і таким чином причиною виникнення 75 кахексії є комплексна дія декількох факторів.
Відомо, що лінія кліток ОСС-1, виділена з карциноми ротової порожнини людини, продукує різні типи рідких факторів, що викликають ракову кахексію. У "голої" миші, якій імплантовані клітки ОСС-1, розвиваються різні синдроми, включаючи кахексію |Каїтига М. еї аі., Сапсег СпетоїПпег. РІагтасої., 1996, 38 Зиррі., реа8-52;
Тапака К. еї аї.,, Орп. 9. Сій. Опсоіоду Арг. 1996, 26 (2), р.88-94)ї. Вважається, що лінія кліток ОСС-1, імплантована "голій" миші, в процесі зростання продукує різні цитокіни (наприклад, 5-С5Е, 1-6, ГІР, 1-11,
РТНГР), і ці фактори чинять комплексну дію на голу мишу, викликаючи такі симптоми.
Симптоми, виявлені у "голої" миші, якій імплантована лінія кліток ОСС-1, вельми схожі з симптомами, що виявляються у пацієнтів в кінцевій стадії рака. Однак досі не описувалися лікувальні препарати або засоби проти кахексії. с 29 Метою даного винаходу є створення терапевтичного агента проти кахексії, що містить в якості активного Ге) інгредієнта речовину, здатну інгібувати зв'язування між білком, спорідненим паращитовидному гормону людини, (РТНГР) і його рецептором.
Автори даного винаходу провели всебічні і глибокі дослідження з метою відкриття такого терапевтичного агента. В результаті вони виявили речовину, яка дозволяє інгібувати зв'язування між РТНГР і його рецептором, о тобто змогли досягнути поставленої мети. Ці дослідження привели до результатів, описаних в даній заявці. со
Даний винахід відноситься до терапевтичного агента проти кахексії, що містить в якості активного інгредієнта речовину, здатну інгібувати зв'язування між РТНГР і його рецептором. --
У даному винаході термін "кахексія" означає загальне виснаження, викликане раком. «І
Даний винахід відноситься до терапевтичного агента проти кахексії, що містить в якості активного 3о інгредієнта речовину, здатну інгібувати зв'язування між білком, спорідненим паращитовидному гормону людини, в (далі визначається як "РТНГР") і його рецептором (далі визначається як "рецептор РТНГР").
У значенні, що використовується тут, термін "рецептор РТНГР" означає будь-який рецептор, який зв'язується з РТНГР (наприклад описуваний в публікації відкритої заявки, що розглядається на національному рівні на « патент Японії Моб-506598), незалежно від того, присутній або відсутній рецептор РТНІР в органі-мішені - 50 (наприклад, в кістках, нирках). с У значенні, що використовується тут, термін "речовина, здатна інгібувати зв'язування між РТНГР і його
Із» рецептором (рецептором РТНГР)" означає будь-яку речовину, яка може зв'язуватися з РТНГР, перешкоджаючи зв'язуванню РТНГР з рецептором РТНГР, наприклад, антитіло проти РТНгГР; будь-яка речовина, яка може зв'язуватися з рецептором РТНГР, перешкоджаючи зв'язуванню рецептора РТНГР з РТНГР, наприклад, антагоніст рецептора РТНГР (антагоніст РТНГР), зокрема пептид із заміною або делецією принаймні одного амінокислотного це. залишку в пептиді РТНГР або частковій послідовності пептиду РТНГР; або їх комбінацію. «» Антитіло проти РТНГР включає антитіла будь-яких відомих типів, зокрема олюднене антитіло, антитіло людини (МО 96/33735) або химерне антитіло (відкрита заявка на патент Японії Мо4-228089) і антитіло, що - використовується як приклад в даному винаході (антитіло Мо23-57-137-1). Таке антитіло може відноситися до
Ге) 20 поліклонального або моноклонального типу, але переважним є антитіло моноклонального типу. Антагоніст
РТНгГР включає поліпептид або низькомолекулярну речовину. Антагоністом РТНГР є речовина, яка зв'язується з мк рецептором РТНгГР, викликаючи антагонізм до РТНгР, наприклад, поліпептид, що володіє антагоністичною активністю проти РТНГР, який описується у відкритій заявці на патент Японії Мо7-165790; Реріїдез (ОМІТЕЮ
ЗТАТЕЗ5), 1995, 16(6) 1031-1037; Віоспетівігу (0МІТЕО ЗТАТЕ5), Арг. 281992, 31(16) 4026-4033; і у відкритій 29 заявці, що розглядається на національному рівні на патент Японії Мо5-509098. Ці поліпептиди можуть мати
ГФ) делецію, заміну, аддитивий сегмент або вставку принаймні одного амінокислотного залишку, якщо вони виявляють еквівалентну антагоністичну активність проти РТНГР, і всі вищезгадані модифікації також входять в о обсяг антагоністів РТНГР за даним винаходом.
Нижче приведений докладний опис даного винаходу з використанням типового антитіла проти РТН"ГР в якості 60 "речовини, здатної інгібувати зв.'язування між РТНГР і рецептором РТНГгР ". 1. Антитіло проти РТНГР
Антитіло проти РТНГР, що використовується в даному винаході, може бути будь-яким антитілом, якщо воно надає лікувальну дію проти кахексії незалежно від джерела його походження, типу (моноклонального або поліклонального) і конфігурації. бо Антитіло проти РТНГР, що використовується в даному винаході, може бути отримане будь-яким відомим способом у вигляді поліклонального або моноклонального антитіла. Антитіло проти РТНІР переважно є моноклональним антитілом, виділеним у ссавця. Моноклональне антитіло ссавця включає антитіла, отримані з гібридоми, і антитіла, отримані за допомогою методик генної інженерії з хазяїна, трансформованого рекомбінатним експресуючим вектором, що несе ген для цього антитіла. Антитіло, що використовується в даному винаході, є антитілом, яке може зв'язуватися з РТНГР, перешкоджаючи зв'язуванню РТНГгР з рецептором
РТН/РТНГР, внаслідок чого блокується трансдукція сигналу РТНГР і як наслідок цього придушується біологічна активність РТНГР.
Типовим прикладом такого антитіла є антитіло Мо23-57-137-14, яке можна продукувати за допомогою 70 гібридомного клону Мо23-57-137-1.
Гібридомний клон Мо23-57-137-1 отримав назву "г'ібридома типу "миша-миша" Мо23-57-137-1" і депонований відповідно до положень Будапештського Договору від 15 серпня 1996бр, в колекції Національного інституту біонауки і людської технології, агентство промислової науки і технології, Японія (1-3, Нідавзпі 1-споте,
ТвиКиба-зпПі, Ібагакі, дарап) під номером доступу РЕКМ ВР-5631. 2. Антитілопродукуюча гібридома
Гібридому, продукуючу моноклональне антитіло, можна отримати будь-яким відомим способом. Тобто РТНГР використовують в якості антигена для імунізації відповідно до відомого способу імунізації. Отримані імуноцити піддають злиттю з відомими батьківськими клітками за допомогою відомого способу злиття кліток, після чого клітки, продукуючі моноклональні антитіла, відділяють від злитих кліток відомим способом скринінгу.
Зокрема, клітки, продукуючі моноклональні антитіла, можна отримати таким чином.
Спочатку отримують РТНІР людини, яку використовують в якості сенсибілізуючого антигена для продукування антитіла, для чого ген РТНГР і амінокислотну послідовність експресують у відповідності зі способом, описаним Зима, І. 9. еї аІ., Зсіепсе (1987) 237, 893. Тобто нуклеотидну послідовність, що кодує
РТНгГР, вводять в будь-який відомий експресуючий вектор і прийнятну клітку-хазяїна трансформують цим сч ов експресуючим вектором. Білок РТНГР виділяють і очищають будь-яким відомим способом з трансформованої клітки-хазяїна або культурального супернатанту трансформованої клітки-хазяїна. і)
Потім очищений білок РТНГР використовують в якості сенсибілізуючого антигена. Альтернативно в якості сенсибілізуючого антигена можна використати пептид М-кінцевої області, що складається з 34 амінокислот
РТНГР, який можна синтезувати хімічним шляхом. о зо Ссавець, призначений для імунізації сенсибілізуючим антигеном, може відноситися до будь-якого виду.
Однак ссавця переважно вибирають з урахуванням сумісності батьківської клітки, що використовується для о злиття кліток. Як правило, можна використати гризуна (наприклад, мишу, пацюка, хом'ячка, кролика) або мавпу. «-
Імунізацію ссавця сенсибілізуючим антигеном можна виконувати у відповідності з будь-яким відомим способом, наприклад, шляхом введення сенсибілізуючого антигена ссавцю у вигляді внутришньочеревинної або - підшкірної ін'єкції. Зокрема сенсибілізуючий антиген розводять і суспензують у фізіологічному розчині з ї- фосфатним буфером (РВ5) або в звичайному фізіологічному розчині, після чого отриману суспензію змішують з необхідною кількістю ад'юванту (наприклад, повного ад'юванту Фрейнда) для отримання емульсії. Емульсію ін'єкують ссавцю декілька разів з інтервалами в 4-21 день. Призначений для імунізації сенсибілізуючий антиген може бути приєднаний до прийнятного носія. «
Після імунізації контролюють рівень сироваткових антитіл. Після підтвердження того, що кількість з с сироваткових антитіл досягла необхідного рівня, у ссавця виділяють імуноцити і піддають їх злиттю з клітками.
Переважним імуноцитом є клітка селезінки. з Батьківська клітка, що використовується для злиття кліток (тобто клітка, що піддається злиттю з імуноцитом), є мієломною кліткою, отриманою у ссавця. Мієломна клітка може відноситися до будь-якої відомої
Лінії кліток, наприклад, РЗ (РЗХбЗА98.653) (У. Іттої. (1979) 123, 1548-1550), РЗ3ХвЗА980.1 (Сипепі Торісв іп -І Місгоріоїюду апа Іттипоіоду (1978) 81, 1-7), М5-1 (Копіег, б. апа Міївїеіпй, С. Еицг. У. Іттипої. (1976) 6, 511-519), МРО-11 (Магоцшіієевз, О. п. ей аї. Се (1976) 8, 405-415), 5Р2/О (Зпцітап, М. еї аї., Машге (1978) о 276, 269-270), РО (де 5. Ого, 5. Р. еї аїЇ., У. Іттипої. Меїйодз (1980) 35, 1-21), 5194 (Ттом/ргідде, !. 5., - У. Ехр. Мед. (1978) 148, 313-323) або К210 (Сайге, 0. еї аі., Мафшге (1979) 277, 131-133).
Клітинне злиття імуноциту з мієломною кліткою, як правило, здійснюють відповідно до будь-якого відомого і способу, наприклад, можна переважно використати спосіб, описаний Міївівїп еї аї. (Копіег, б. апа Міївівїп, С, о Меїподз Епгутої. (1981) 73, 3-46).
Зокрема злиття кліток здійснюють в звичайному поживному культуральному середовищі в присутності промотору злиття кліток. Промотором злиття кліток може бути поліетиленгліколь (РЕС) або вірус Сендай (гемагглютинуючий вірус з Японії, НМ)) . При бажанні з метою підвищення ефективності злиття можна також використати таку добавку, як диметилсульфоксид.
Ф) Співвідношення між імуноцитами і мієломними клітками, що використовуються для клітинного злиття, може ка бути будь-яким. Наприклад, кількість імуноцитів може в 1-10 раз перевищувати кількість мієломних кліток. В якості культурального середовища для злиття кліток, можна використати, наприклад, середовище КРМІ 1640 во або МЕМ, придатне для зростання лінії мієломних кліток, або інше середовище, що звичайно застосовується для культивування таких кліток. При бажанні в культуральне середовище можна додати сироватку, наприклад, плідну телячу сироватку (ЕС5).
Для здійснення злиття кліток імуноцити добре змішують з мієломними клітками в заздалегідь визначених кількостях в культуральному середовищі, додають розчин РЕС (наприклад, з середньою молекулярною масою 65 біля 1000-6000) (який заздалегідь був нагрітий приблизно до 37 С) звичайно в концентрації 30-60905 (у відношенні ваги до об'єму) і отриманий розчин ретельно перемішують з утворенням злитих кліток (гібридом).
Потім в культуральний розчин вводять відповідне культуральне середовище і центрифугують для видалення супернатанту. Цю процедуру повторюють декілька разів, щоб видалити промотор злиття кліток або подібну речовину, присутність якої небажана під час вирощування гібридом в культуральному середовищі.
Отримані гібридоми можна виділити, проводячи культивування в звичайному селективному середовищі, такому як гіпоксантин-аміноптерин-тимідинове (НАТ) середовище. Гібридоми культивують в НАТ-середовищі протягом періоду часу, достатнього для загибелі всіх кліток, крім цільових гібридом (тобто всіх незлитих кліток), який звичайно складає від декількох днів до декількох тижнів. Потім за допомогою відомого способу обмеженого розведення проводять скринінг і моноклонування гібридом, які секретують необхідне антитіло. 70 Альтернативно антитіло людини, що володіє зв'язуючою активністю проти РТНГР, можна отримати шляхом сенсибілізації лімфоциту людини за допомогою РТНГР іп міо, після чого сенсибілізований лімфоцит піддають злиттю з виділеною у людини мієломною кліткою, здатною до нескінченного росту (публікація патенту Японії
Мо1-59878). Альтернативно антитіло людини проти РТНГР можна отримати шляхом ін'єкування РТНГР в якості антигена трансгенній тварині, що має повний спектр генів антитіла людини, для отримання клітки, продукуючої /5 антитіло проти РТНГР, та іморталізації цих кліток, внаслідок чого антитіло людини може бути отримане з іморталізованої клітки (публікація міжнародних патентів МоМо УМО 94/25585, УМО 93/12227, МО 92/03918 ії УМО 94/02602).
Отриману вище гібридому, продукуючу моноклональне антитіло, можна субкультивувати в звичайному культуральному середовищі і зберігати під шаром рідкого азоту протягом тривалого періоду часу.
Для отримання моноклонального антитіла з гібридоми можна використати спосіб, який включає культивування гібридоми відомим способом і збір моноклонального антитіла з культурального супернатанту, або спосіб, який включає ін'єковані гібридоми ссавцю, сумісному з даною гібридомою, для вирощування гібридоми в тілі ссавця і збір гібридоми з асцитів цього ссавця. Перший спосіб придатний для продукування антитіла з високою мірою чистоти, в той час як другий спосіб придатний для продукування антитіла у великій кількості. с 3. Рекомбінантне антитіло
При здійсненні даного винаходу можна також використати моноклональне антитіло рекомбінантного типу, яке і) можна отримати шляхом клонування гена антитіла з гібридоми, інтеграції гена антитіла в прийнятний вектор, введення цього вектора в хазяїна і отримання антитіла з хазяїна відповідно до звичайної технології генетичної рекомбінації (див., наприклад, Мапдатте, А. М. еї а!., Ешиг. У. Віоспет. (1990) 192, 767-775). о зо Зокрема мРНК, що кодує варіабельну (М) область антитіла проти РТНГР, виділяють з гібридоми, продукуючої антитіло проти РТНГР. Щоб виділити мРНК, спочатку отримують повну РНК будь-яким відомим способом, о наприклад, ультрацентрифугуванням гуанідину (СпПігом/іп, 9. М. еї аї., Віоспетівігу (1979) 18, 5294-5299) і «- способом АСРС (Спотсгупвекі, Р. Еї а!., Апа!. Віоспет. (1987)162, 156-159), після чого з повної РНК отримують необхідну мРНК, використовуючи набір для очищення мРНК (РПагтасіа), або подібним способом. «
Альтернативно, мРНК можна відразу ж отримати за допомогою набору для очищення мРНК ОпісКкРгер ї- (Рпагтасіа).
Потім з мРНК за допомогою зворотної транскриптази синтезують кКДНК для М-області антитіла. КДНК синтезують, використовуючи набір для синтезу одноланцюжкової кКДНК за допомогою зворотної транскриптази
АММ (Зеїкадаки Согрогайоп) або подібний набір. Крім того, КДНК можна синтезувати або ампліфікувати за « способом 5-КАСЕ (Ргоптап, М.А. еї аїЇ., Ргос. Май. Асай. Зсі. ОБА (1988) 85, 8998-9002; ВеїуахузКу, А. ей нт) с аІ.,, Мисівїс Асіаз Кевз. (1989) 17, 2919-2932), використовуючи набір для ампліфікації 5'-кнця РІМОЕК КАСЕ (Сіопіесі) в поєднанні з полімеразною реакцією синтезу ланцюга або подібний набір. ;» Цікавлячий фрагмент ДНК виділяють, очищають від продукту полімеразної реакції синтезу ланцюга (РСК) і лігують у вектор ДНК для отримання рекомбінантного вектора. Цей рекомбінантний вектор вводять в хазяїна, такого як Б. сої, і відбирають колонію, що містить необхідний рекомбінантний вектор. Нуклеотидну -І послідовність цікавлячої ДНК в рекомбінантному векторі підтверджують, наприклад, способом термінації дидезоксинуклеотидного ланцюга. ве Отриману ДНК, що кодує М-область антитіла проти РТНГР, вводять в експресуючий вектор, що містить ДНК, - який кодує константну (С) область антитіла.
Щоб отримати антитіло проти РТНГР, що використовується в даному винаході, ген антитіла інтегрують в о експресуючий вектор так, щоб ген антитіла можна було експресувати під контролем контролюючих експресію о областей (наприклад, енхансер, промотор). Клітку-хазяїна трансформують експресуючим вектором для експресії антитіла.
Під час експресії гена антитіла, ДНК, що кодує важкий (Н) ланцюг, і ДНК, що кодує легкий (І) ланцюг дв антитіла, можна інтегрувати в окремі експресуючі вектори, і тоді клітку-хазяїна котрансформують отриманими рекомбінантними експресуючими векторами. Альтернативно, як ДНК, що кодує Н-ланцюг, так і ДНК, що кодує
Ф) Ї-ланцюг антитіла можна разом інтегрувати в одиничний експресуючий вектор і трансформувати клітку-хазяїна ка отриманим рекомбінантним експресуючим вектором (УМО 94,11523).
Для отримання рекомбінантного антитіла окрім вищезгаданих кліток-хазяїв в якості хазяїна можна також бор використати трансгенну тварину. Наприклад, ген антитіла вводять в заздалегідь визначений сайт гена, що кодує білок, який утворюється в молоці тварини (наприклад, р-казеїн козячого молока), для отримання злитого гена.
Фрагмент ДНК, що містить злитий ген, введений в ген антитіла, ін'єкують в ембріон кози і вводять цей ембріон козі. Коза, якій був введений вказаний ембріон, виношує трансгенну козу. Цікавляче антитіло секретується в молоці трансгенної кози або її потомства. Щоб збільшити кількість молока, що містить необхідне антитіло, б5 трансгенній козі можна ввести відповідний гормон (Ербегі, К. М. еї а/!., Віо/Гесппоіоду (1994) 12, 699-702). 4. Модифіковане антитіло
Для зменшення гетерогенного впливу на організм людини або інших ссавців при здійсненні даного винаходу можна використати штучно модифіковане рекомбінантне антитіло, включаючи химерне і олюднене антитіла. Ці модифіковані антитіла можна отримати будь-яким відомим способом.
Химерне антитіло, придатне для використання в даному винаході, можна отримати шляхом літування отриманої вище ДНК, що кодує М-область антитіла, з ДНК, що кодує С-область антитіла людини, інтеграції продукту літування в експресуючий вектор і введення отриманого рекомбінантного експресуючого вектора в хазяїна для продукування химерного антитіла.
Олюднене антитіло визначається також як "реконструйоване антитіло людини", в якому гіперваріабельні 7/0 дільниці (СОК) антитіла ссавця, що не є людиною, (наприклад, мавпи) прищеплюють до аналогічних дільниць антитіла людини. Загальна процедура генетичної рекомбінації, що використовується для отримання такого олюдненого антитіла, також відома (патенти ЕР Мо125023; МО 96/02576).
Зокрема, з цією метою конструюють послідовність ДНК, в якій гіперваріабельні дільниці антитіла миші лігують за допомогою каркасних областей (ЕК) і синтезують за способом РСК, використовуючи як затравки /5 декілька олігонуклеотидів, в яких є області, що перекривають кінцеві області гіперваріабельних дільниць і каркасних областей. Отриману ДНК лігують з ДНК, що кодує С-область антитіла людини, і продукт літування інтегрують в експресуючий вектор. Отриманий рекомбінантний експресуючий вектор вводять в хазяїна, отримуючи таким чином олюднене антитіло (патенти ЕР 239044, М/О 96/02576).
Каркасні області, ліговані за допомогою гіперваріабельних дільниць, вибирають так, щоб гіперваріабельні дільниці могли утворювати прийнятний сайт зв'язування антигена. При необхідності одну або декілька амінокислот в каркасних областях М-області антитіла можна замінити так, щоб гіперваріабельні дільниці реконструйованого антитіла людини могли утворювати необхідний сайт зв'язування антитіла (За, К. еї аї.,
Сапсег Кезв. (1993) 53, 851-856).
С-область химерного або олюдненого антитіла може бути будь-якою С-областю антитіла людини, такою с р ЯК Суї, Суг2, Суз або Суд для Н-ланцюга і Ск або Су, для І-ланцюга. С-область антитіла людини можна модифікувати з метою підвищення стабільності антитіла або забезпечення стабільного продукування цього о антитіла.
Химерне антитіло складається з М-областей, виділених з антитіла ссавця, що не є людиною, і С-областей, виділених з антитіла людини. Олюднене антитіло складається з гіперваріабельних дільниць, виділених з Га»)
Зо антитіла ссавця, що не є людиною, і каркасних областей і С-областей, виділених з антитіла людини. Олюднене антитіло особливо придатне для використання в якості активного інгредієнта лікувального засобу за даним о винаходом завдяки більш слабкій антигенності цього антитіла до організму людини. «--
Типовим прикладом олюдненого антитіла, що використовується в даному винаході, є олюднене антитіло
Мо23-57-137-1, в якому гіперваріабельні дільниці виділені з антитіла миші Мо23-57-137-1; | -ланцюг складається з в Гіперваріабельних дільниць, лігованих за допомогою трьох каркасних областей (РК1, РК2 і ЕКЗ), виділених з вк. антитіла людини НО 03868 (ЗЕМ-ВАМК, ЮОепов, М. еї. аїЇ., Зсапа. 9. Іттипої. 39, 95-103, 1994), і каркасної області (ЕК4), виділеної з антитіла людини 525755 (МВКЕ-РОВ) ; і Н-ланцюг складається з гіперваріабельних дільниць, лігованих за допомогою каркасних областей, виділених з антитіла людини 531679 (МВАКБЕ-РОВ,
Сиїзіпіег, А. М. еї аїЇ.,, Еиг. У. ІтіпипоЇї. 23, 110-118, 1993), в якій частина амінокислотних залишків в « каркасних областях замінена таким чином, щоб реконструйоване олюднене антитіло могло виявляти 8 с антигензв'язуючу активність. й Штами Е. соїї, що містять плазміди з ДНК, кодуючої відповідно Н-ланцюг і | -ланцюг олюдненого антитіла «» Мо23-57-137-1, були відповідно названі ЕвзсПегіспіа соїї 9УМ109 (пМВвСлІкДднкК/рисС19) (для Н-ланцюга) і
Евспегіспіа соїї 9УМ109 (пМВСІах/рОсС19) (для І-ланцюга). Ці штами депоновані відповідно до положень
Будапештського договору від 15 серпня 1996бр. в колекції Національного інституту біонауки і людської -| технології, агентство промислової науки і технології, Японія (1-3, Нідазпі 1-споте, ТвиКибра-5Пі, Ірагакі, їз Уарап) під номером доступу РЕКМ ВР-5629 для Езспегіспіа соїї УМ109 (МВС «кДнк/рист19) і під номером доступу РЕКМ ВР-5630 для Езспегіспіа соїї УМ109 (НМВСІЇ 4ау/рОС19). - 5. Варіанти антитіл о 20 Антитіло, що використовується в даному винаході, може являти собою будь-який його фрагмент або модифікований продукт цього фрагмента, якщо воно здатне зв'язуватися з РТНГІРІі придушувати активність (зе) РТНГгР. Наприклад, таким фрагментом антитіла може бути. Раб, Р(аб)», Ем або одиночний ланцюг Ем (зсЕУ), Що включає Еу-фрагмент Н-ланцюга або Ем-фрагмент І -ланцюга, пов'язаний один з одним прийнятним лінкером.
Зокрема, такі фрагменти антитіла можна отримати шляхом розщеплення антитіла ферментом (наприклад, папаїном, пепсіном) на фрагменти антитіла або конструювання гена, що кодує фрагмент антитіла, вставки цього о гена в експресуючий вектор і введення отриманого рекомбінантного експресуючого вектора в прийнятну клітку-хазяїна, забезпечуючи таким чином експресію фрагмента антитіла (див., наприклад. Со, М. 5. еї аї.,.. ко Іттлипої. - (1994), 152, 2968-2976; ВеЦег, М. б Нопмй», А. Н., Меїйодз іп Епгутоіоду (1989), 178, 476-496,
Асадетіс Ргезв, Іпс., РішесК(пип, А. 5 ЗКеїта, А., Меїйодз іп Епгутоіоду (1989) 178, 476-496, Асадетіс Ргезв, 60 |пс.; Гатоуї, Е., Меїйодз іп Епгутоіоду (1989) 121, 652-663; Коиззеаих, у. еї аЇ., Меїйодз іп Епгутоіоду (1989) 121, 663-669; і Віга, Кк. Е. ЕєаІ., ТІВТЕСН (1991) 9, 132-137). зсЕМм можна отримати, лігуючи М-область Н-ланцюга з М-областю І-ланцюга за допомогою лінкера, переважно пептидного лінкера (Низвіоп, У. З. еї аїЇ.,, Ргос. Май. Асай. Зсі. ОБА (1986) 85, 5879-5883) .
М-область Н-ланцюга і М-область І-ланцюга в 5сЕбм можна виділити з будь-якого описаного тут антитіла. б5 Пептидний лінкер, який зв'язує М-області, може бути будь-яким пептидом з одиночним ланцюгом, наприклад, маючим 12-19 амінокислотних залишків.
ДНК, що кодує зсеЕм, можна отримати шляхом роздільної ампліфікації ДНК, що кодує М-область Н-ланцюга, і
ДНК, що кодує М-область І -ланцюга антитіла з використанням в якості матриці фрагмента ДНК, що кодує всю область Н-ланцюга або його частину, яка включає М-область, і фрагмента ДНК, що кодує всю область І -ланцюга або його частину, яка включає М-область, і пари затравок, що визначають кінцеві області фрагментів ДНК; і подальшої ампліфікації ДНК, що кодує пептидний лінкер, з використанням в якості матриці фрагмента ДНК, що кодує пептидний лінкер, і пари затравок, що визначає кінцеві області фрагмента ДНК, так, щоб кожна кінцева область пептидного лінкера була лігована відповідно з М-областю Н-ланцюга і М-областю І -ланцюга.
Отримавши ДНК, що кодує зсЕм, можна відомими способами отримати експресуючий вектор, що несе цю 7/0 ДНК, ії хазяїна, трансформованого цим експресуючим вектором. зсгм можна отримати з трансформованого хазяїна будь-яким відомим способом.
Фрагменти антитіла, що використовуються в даному винаході, можна отримати шляхом отримання генів для вказаних фрагментів і експресування цих генів в прийнятних хазяїнах, як це описувалося вище. Ці фрагменти антитіла також входять у визначення "антитіла" за даним винаходом.
В якості модифікованої форми вищезгаданих антитіл можна використати, наприклад, антитіло проти РТНГР, кон'юговане з будь-якою молекулою (наприклад, з поліетиленгліколем). Такі модифіковані антитіла також охоплюються поняттям "антитіло" в даному винаході. Модифіковані антитіла можна отримати шляхом хімічних модифікацій антитіл. Методи хімічної модифікації, придатні для досягнення вказаної мети, відомі в цій області. 6. Експресія і продукування рекомбінантного антитіла або модифікованого антитіла
Ген антитіла, сконструйований, як описувалося вище, можна продукувати і експресувати відомими способами. Для експресії в клітці ссавця активно зв'язують придатний промотор, експрессуємий ген антитіла і полі(А) сигнал (розташований нижче 3'-кінця гена антитіла). Наприклад, в якості системи придатний промотор/енхансер можна використати систему швидкодіючий промотор цитомегаловіруса людини/енхансер.
Крім того, для експресії антитіла за даним винаходом можна використати інші системи промотор/енхансер, сч ов Зокрема виділені з вірусів (наприклад, ретровірус, вірус поліоми, аденовірус і вірус мавп 40 (5М40)) та з кліток ссавців (наприклад, фактор елонгації людини 19, (НЕЕ1о)). і)
При використанні системи промотор 5М40, енхансер генів можна, легко експресувати за способом Миїїдап еї аІ. (Майте (1979) 277, 108). При використанні системи промотор НЕЕТо/енхансер ген можна легко експресувати за способом Мігизпіта еї аї. (Мисієїс Асідз Кезв. (1990) ІБ, 5322). о
Для експресії в Е. сої можна активно зв'язувати відповідний для використання промотор, сигнальну послідовність для секреції цікавлячого антитіла і ген антитіла. У якості промотору можна використати промотор о
Іас7 або агаВ. При використанні промотору Іас7 ген можна експресувати за способом Умага еї. а). (Маїге (1098) -" пе 341, 544-546; РГАБВЕ 4). (1992) 6, 2422-2427), а при використанні промотору агаВ ген можна експресувати за способом Вецег еї. а!. (ВебНег еї. аі., Зсіепсе (1988) 240, 1041-1043). З
Що стосується сигнальної послідовності для секреції антитіла, то в тому випадку, коли цікавляче антитіло ч- повинно бути секретованим в периплазматичному просторі Е. соїї, можна використати сигнальну послідовність ре1В (Іеї, 5. Р. еї аї., 9. Васіегіої. (1987) 169, 4379). Антитіло, секретоване в периплазматичному просторі, виділяють і знову укладають так, щоб антитіло придбало необхідну конфігурацію. «
Можна використати реплікатор, виділений з вірусів (наприклад, ЗМ40, вірус поліоми, аденовірус, вірус папіломи великої рогатої худоби (ВРМ)), або тому подібний. Щоб збільшити кількість копій гена в системі щ- с кліток-хазяїв, експресуючий вектор може далі містити ген селективного маркера, такий як ген ц аміноглікозид-фосфотрансферази (АРН), ген тимідинкінази (тю, ген "» ксантингуанідин-фосфорибозилтрансферази (Есоодру) Е. сої і ген дигідрофолат-редуктази (ант).
Для продукування антитіла за даним винаходом можна використати будь-яку експресуючу систему, включаючи системи еукаріотичних і прокаріотичних кліток. Еукаріотичні клітки включають відомі лінії кліток -І тваринних наприклад, ссавців, комах, плісняви, грибів і дріжджів). Прокаріотичні клітки включають бактеріальні клітки, такі як клітки Е. сої. т Антитіло, що використовується в даному винаході, бажано експресувати в клітці ссавця, такій як яєчник - китайського хом'ячка (СНО), СО, мієлома, ВНК, клітка Мего і Не! а.
Потім трансформовану клітку-хазяїна культивують іп мійго або іп мімо для продукування цікавлячого
Мамі антитіла. Клітку-хазяїна можна культивувати будь-яким відомим способом. В якості культурального середовища с можна використати середовище ОМЕМ, МЕМ, КРМІ 1640 або ІМОМ. Культуральне середовище може містити додаткову сироватку, таку як плідна теляча сироватка (ЕС5). 7. Виділення і очищення антитіла
Антитіло, експресоване і продуковане, як описувалося вище, можна виділити з кліток або з організму тварини-хазяїна і очистити до однорідного стану. Антитіло, що використовується в даному винаході, можна о виділити і очистити на колонці для афінного очищення. Прикладами колонки з білком А є Нурег О, РОКОЗ і ко БЗерпагозе Р.Р. (Ріпагтасіа). Крім того, можна використати інші способи, що звичайно застосовуються для виділення і очищення антитіла; таким чином, не існує яких-небудь обмежень відносно способу, що бо використовується. Наприклад, для виділення і очищення необхідного антитіла можна окремо або в поєднанні використати різні хроматографи з колонками, включаючи вищезгадану колонку для афінного очищення, фільтрацію, ультрафільтрацію, висолювання і діаліз (Апіїбодіез А І арогаїогу Мапиаї. Ед. Нагіож, Оамід І апе,
Соа Зргіпд Нагбог І арогаюгу, 1988). 8. Визначення активності антитіла 65 Антигензв'язуючу активність (Апіїродіез А І арогаїогу МапиаїЇ. Еа. Нагіож, Юамій Гапе, Соїд Зргіпд Нагрог
І арогаїюгу, 1988) або інгібуючу активність антитіла за даним, винаходом проти рецептора ліганду (Нагада, А.
еї аї., Іпіегпайопаї! Іттипоіоду (1993) 5, 681-690) можна визначити будь-якими відомими способами.
Як спосіб для визначення антигензв'язуючої активності антитіла проти РТНГР за даним винаходом можна використати такі способи, як ЕІ ІЗА (твердофазний імуноферментний аналіз), ЕІА (імуноферментний аналіз), КІА (радисімуноаналіз) або флуоресцентний аналіз антитіл. Наприклад, при виконанні імуноферментного аналізу розчин, що містить антитіло проти РТНГР (наприклад, культуральний супернатант кліток, продукуючих антитіло проти РТНГР, або саме антитіло проти РТНГР в очищеному вигляді), вміщують в чашку, стінки якої заздалегідь покривають РТНгГР (1-34). У ту ж чашку вводять друге антитіло, мічене ферментом (наприклад, лужною фосфатазою). Чашку інкубують і промивають. У чашку додають субстрат для ферменту (наприклад, 7/0 п-нітрофенілфосфорну кислоту) і вимірюють оптичну щільність розчину в чашці для визначення антигензв'язуючої активності антитіла.
Для підтвердження активності антитіла, що використовується в даному винаході, визначають нейтралізуючу активність антитіла (наприклад, антитіла проти РТНГгР). 9. Способи введення і фармацевтичні препарати
Терапевтичний агент за даним винаходом можна використати . для лікування або придушення кахексії.
Підлягаюча лікуванню або придушенню кахексія за даним винаходом може відноситися до будь-якого типу, включаючи ракову кахексію. Приклади ракової кахексії описані в журналах |У. ОгоЇ. (ОМІТЕО ЗТАТЕ5) Маг 1995, 153 (3 РІ 1) р.854-857; І апдепресКве Агсй. Сі, Зиррі І Мегь Оівспй Севз Спіг (ЗЕКМАМУ) 1990, р.261-265;
Опсоіоду (ЗУМІТ2ЕКІГАМО) 1990, 47 (1) р.87-91; Іпї. у. Рапсгеаю!(ОМІТЕО ЗТАТЕ5) Ацо-Мом 1990, 7 (1-3) 20. р.141-150; 3). Май). Сапсег Іпві. (ОМІТЕО ЗТАТЕЗ) Оес 19, 1990, 82 (24) р.1922-19261.
Приклади інших типів кахексії що не є раковою кахексією, описані в журналах ЮРЕМ 3. Рагепіег. Епіегаї!
Миші. (0МІТЕО ЗТАТЕ5) Мому-Юес 1990, 14 (6) р.605-609; Спеві (0ОМІТЕЮО ЗТАТЕ5) Мом 1990, 98 (5) р.1091-1094;
Вопе Маїтом Тгаперіапі. (ЕМО АМО) Уці 1990, 6 (1) р. 53-57.
Терапевтичний агент, що містить антитіло проти РТНГР в якості активного інгредієнта за даним винаходом, сч ов Можна вводити перорально або парентерально, переважно парентерально. Цей терапевтичний агент може являти собою будь-яку лікарську форму, зокрема транслегеневий засіб (наприклад, засіб, що вводиться за і) допомогою такого пристрою, як інгалятор), носошлунковий засіб, черезшкірний засіб (наприклад, мазь, крем) або ін'єкційний розчин. Приклади ін'єкційних розчинів включають розчин для внутрішньовенних ін'єкцій (наприклад, розчин для капельниці), розчини для внутрішньом'язових, внутрішньочеревинних і підшкірних ін'єкцій, о зо призначені для системного або місцевого застосування. Спосіб введення може бути вибраний в залежності від віку потребуючого суб'єкта і важкості захворювання. Ефективна однократна доза може складати від 0,001 до о 100Омг/кг маси тіла. Альтернативно, доза, що вводиться суб'єкту, може знаходитися в межах від 0,01 до «- 10000Омг/кг маси тіла. Однак доза терапевтичного агента, що містить антитіло проти РТНГР за даним винаходом, не обмежується вищезгаданими межами. -
Цей терапевтичний агент можна вводити суб'єкту на будь-якій стадії, в тому числі до або після розвитку ча кахексії. Альтернативно, цей терапевтичний агент можна вводити на стадії хвороби, коли можна прогнозувати у пацієнта подальшу втрату у вазі.
Терапевтичний агент, що містить антитіло проти РТНГР в якості активного інгредієнта за даним винаходом, можна отримати будь-яким відомим способом (Кетіпдіоп'з РНагтасеціїсаІ! Зсіепсе, Іафезі еййоп, Магк «
Рибіївпіпу Сотрапу, Еазіоп, ОЗА). Лікарський препарат може далі "містити фармацевтично прийнятні носії і з с добавки. . Прикладами таких носіїв і добавок є вода, фармацевтично прийнятні органічні розчинники, колаген, и?» полівініловий спирт, полівінілпіролідон, карбоксивінільний полімер, натрій-карбоксиметил-целюлоза, полі(акрилат натрію), аргінат натрію, водорозчинний декстран, натрій-карбоксиметиловий крохмаль, пектин,
Метилцелюлоза, етилцелюлоза, ксантанова камедь, аравійська камедь, казеїн, агар, поліетиленгліколь, -І дигліцерин, гліцерин, пропіленгліколь, вазелін, парафін, стеариновий спирт, стеаринова кислота, сироватковий альбумін людини (НЗА), манітол, сорбітол, лактоза і сурфактанти, придатні для використання в якості о фармацевтичних добавок. - На практиці добавку вибирають з вищезгаданих речовин окремо або в комплексі в залежності від лікарської форми, що використовується, але не обмежуються ними. Наприклад, можна використати ін'єкційний розчин, який о отримують, розчиняючи очищене антитіло проти РТНГР в розчиннику (наприклад, звичайний фізіологічний о розчин, буфер, розчин глюкози) і додаючи засіб, що запобігає адсорбції, (наприклад, твин-80, твин-20, желатин, сироватковий альбумін людини).
Терапевтичний агент за даним винаходом може являти собою відновлювану, висушену виморожуванням ов речовину, яку розчиняють перед використанням. Для отримання висушеної виморожуванням лікарської форми можна використати такий наповнювач, як цукровий спирт (наприклад, манітол, глюкозу) і цукор.
Ф) На Фіг.1 дана графічна ілюстрація лікувальної дії антитіла проти РТН"ГР при кахексії. ка На Фіг.2 дана графічна ілюстрація лікувальної дії антитіла проти РТН"ГР при кахексії.
На Фіг.3З дана графічна ілюстрація лікувальної дії антитіла проти РТН"ГР при кахексії. во На Фіг.4 дана графічна ілюстрація лікувальної дії антитіла проти РТН"ГР при кахексії.
На Фіг.5 дана графічна ілюстрація результатів вимірювання антигензв'язуючої активності.
На Фіг.6 дана графічна ілюстрація результатів вимірювання антигензв'язуючої активності.
На Фіг.7 дана графічна ілюстрація результатів вимірювання антигензв'язуючої активності.
На Фіг.8 дана графічна ілюстрація результатів вимірювання антигензв'язуючої активності. 65 На Фіг.9 дана графічна ілюстрація результатів вимірювання антигензв'язуючої активності.
На Фіг.10 дана графічна ілюстрація результатів вимірювання антигензв'язуючої активності.
На Фіг.11 дана графічна ілюстрація результатів вимірювання антигензв'язуючої активності.
На Фіг.12 дана графічна ілюстрація результатів вимірювання антигензв'язуючої активності.
На Фіг.13 дана графічна ілюстрація нейтралізуючої активності олюдненого антитіла.
На Фіг.14 дана графічна ілюстрація нейтралізуючої активності олюдненого антитіла. щ
На Фіг.15 дана графічна ілюстрація нейтралізуючої активності олюдненого антитіла.
На Фіг.16 дана графічна ілюстрація лікувальної дії олюдненого антитіла проти кахексії.
На Фіг.17 дана графічна ілюстрація лікувальної дії олюдненого антитіла проти кахексії.
На Фіг.18 дана графічна ілюстрація лікувальної дії олюдненого антитіла проти кахексії. 70 На Фіг.19 дана графічна ілюстрація лікувальної дії олюдненого антитіла проти кахексії.
Далі даний винахід детально описується з посиланням на нижченаведені конкретні і посилальні приклади, які не повинні обмежувати технічний обсяг даного винаходу.
ІПриклад 11
Фармакологічне випробування з використанням тваринної моделі кахексії
Терапевтичний агент проти кахексії моноклонального антитіла миші проти РТНгР досліджували з використанням тваринної моделі кахексії ("гола" миша, якій імплантована пухлина людини).
В якості тваринної моделі кахексії використали "голу" мишу, якій була імплантована карцинома ОСС-1 ротової порожнини людини Іпіддослідні миші були придбані в Центральному інституті експериментальних тварин). Відомо, що у "голої" миші, якій імплантована карцинома ОСС-1 ротової порожнини людини, підвищується концентрація кальцію в крові по мірі збільшення обсягу пухлини і з'являються симптоми кахексії, такі як втрата у вазі і зменшення рухливості. При виконанні цього випробування придушення моноклональним антитілом миші симптомів кахексії, викликаної карциномою ОСС-1 ротової порожнини людини, оцінювали на основі концентрації кальцію в крові, ваги тіла і впливу на збільшення часу виживання.
Карциному ОСС-1 ротової порожнини людини пасирували іп мімо, використовуючи "голих" мишей су ВАЇ В/с-пишпи (дарап СІЕА Со., Іпс.). Для оцінки фармакологічної дії були придбані б-тижневі самці "голих" мишей ВАЇ В/с-пи/пи (Чарап СІ ЕА. Со., Іпс.); піддослідних мишей акліматизували протягом 1 тижня, внаслідок о чого були отримані 7-тижневі миші, яких використали у випробуванні.
Мишей використали для отримання тваринної моделі кахексії і ділили на групи таким чином. Пасировану карциному ОСС-1 ротової порожнини людини видаляли у "голої" миші і акуратно розрізали на Змм кубічні зрізи. «3
Кожній миші підшкірно імплантували по одному зрізу пухлини в бокову частину тіла. Через десять днів після імплантації, коли було підтверджено, що обсяг пухлини у всіх мишей значно збільшився, мишей розподіляли по о групах з урахуванням середніх показників концентрації кальцію в крові, маси тіла і обсягу пухлини і «ч- використовували їх як тваринну модель кахексії.
Терапевтичний агент при кахексії досліджували таким чином. М (1) Спостереження за часом виживання -
При дослідженні впливу на збільшення часу виживання мишам однієї випробуваної групи двічі на тиждень вводили моноклональне антитіло миші і визначали час виживання мишей. Мишам іншої випробуваної групи одноразово вводили вв хвостову вену відомий засіб для придушення гіперкальціємії, памідронат « (динатрійпамідронат; Агедіа), в дозі 15мг/кг. В якості контрольного випробування мишам контрольної групи двічі на тиждень вводили в хвостову вену фізіологічний розчин з фосфатним буфером (РВ5) в дозі О0,2мл/миша. й с Результати показані на Фіг.1. ц (2) Спостереження за концентрацією кальцію в'юєрові Моноклональне антитіло миші проти РТНгГР двічі "» вводили в хвостову вену мишам, що використовуються в якості тваринної моделі кахексії, з інтервалом в два дні в дозі 1Омкг або 100мкг/мишу при кржному введенні. Існуючий засіб для придушення гіперкальціємії, памідронат (динатрійпамідронат, Агедіа) вводили однократно в хвостову вену мишам іншої випробуваної групи в дозі -І 15мг/кг. В якості контрольного випробування мишам контрольної групи. двічі вводили в хвостову вену фізіологічний розчин з фосфатним буфером (РВ5) з інтервалом в два дні в дозі О0,2мл/мишу при кожному ть введенні. - (3) Визначення концентрації кальцію в крові
Через один і чотири дні після введення моноклонального антитіла миші у всіх мишей визначали концентрацію о кальцію в крові з метою оцінки фармакологічної ефективності антитіла. Концентрацію кальцію в крові визначали о на основі концентрації іонізованого кальцію в суцільній крові, для чого у всіх мишей брали кров через очну ямку за допомогою гематокритної трубки і аналізували в автоматичному аналізаторі 64 З Са/рн (СІВА-СОКМІМО). Всіх мишей щодня зважували протягом чотирьох днів після введення антитіла. Результати показані на Фіг.2 і 3. 4) Визначення об'єму пухлини
Ф, Об'єм пухлини визначали через чотири дні після введення антитіла, для чого вимірювали найбільшу вісь (а іме) мм) і найменшу вісь (Б мм) пухлини і отримані результати вводили в рівняння Таланта (аб 7/2). Результати показані на Фіг.4. 60 Отримані результати ясно показують, що незважаючи на те, що при введенні мишам антитіла в дозі 1Омкг концентрація кальцію в крові аналогічна цьому показнику у мишей, яким вводили памідромат, у мишей, яким вводили вводили памідронат, у мишей, яким вводили антитіло в дозі 10Омкг, не відбувалося збільшення концентрації кальцію в кров і втрата у вазі була менше в порівнянні з мишами, яким вводили памідронат, і з контрольними мишами. У мишей, яким вводили нейтралізуюче антитіло проти РТНГР в дозі 10Омкг двічі на 65 тиждень, спостерігалося значне збільшення часу виживання в порівнянні з мишами, яким вводили памідронат, і з контрольними мишами (р-0,0003: логарифмічний розподіл). Внаслідок цього встановлено, що нейтралізуюче моноклональне антитіло миші проти РТНгГР володіє прекрасними властивостями, які відсутні у всіх існуючих засобів для придушення гіперкальціємії, такими як запобігання втраті у вазі і збільшення «часу виживання. Ці результати показують, що антитіло, використане в цьому випробуванні, є ефективним засобом при лікуванні кахексії, зумовленої злоякісною пухлиною.
ІПриклад 21
Фармакологічне випробування з використанням тваринних моделей гіперкальціємії і кахексії
Лікувальну дію при кахексії олюдненого антитіла варіанту "4 проти РТНГР досліджували з використанням тваринної моделі кахексії ("гола" миша, якій імплантована пухлина людини). 70 В якості тваринної моделі використали "голу мишу, якій була імплантована карцинома ОСС-1 ротової порожнини людини (піддослідні миші були придбані в Центральному інституті експериментальних тварині.
Відомо, що у "голої" миші, якій імплантована карцинома ОСС-1 ротової порожнини людини, підвищується концентрація кальцію в крові по мірі збільшення обсягу пухлини і з'являються симптоми кахексії, такі як втрата у вазі і зменшення рухливості. При виконанні цього випробування придушення олюдненим антитілом /5 варіанту "4" симптомів кахексії, викликаної карценомою ОСС-1 ротової порожнини людини, оцінювали на основі концентрації кальцію в крові, втрати у вазі і впливу на збільшення часу виживання.
Субкультуру карциноми ОСС-1 ротової порожнини людини отримували іп мімо, використовуючи "голих" мишей ВАЇ В/с-пи/пи (дарап СІ ЕА Со., Іпс.). Для оцінки фармакологічної дії були придбані б-тижневі самці "голих" мишей ВАЇ В/с-пи/пи (дарап СІ ЕА сСо., Іпс.); піддослідних мишей акліматизували протягом 1 тижня, 2о внаслідок чого були отримані 7-тижневі миші, яких використали у випробуванні.
Мишей використали для отримання тваринної моделі кахексії і ділили на групи таким чином. Пасировану карциному ОСС-1 ротової порожнини людини видаляли у "голої" миші і акуратно розрізали на Змм кубічні зрізи.
Кожній миші підшкірно імплантували по одному зрізу пухлини в бокову частину тіла. Через десять днів після імплантації, коли було підтверджено, що обсяг пухлини у всіх мишей значно збільшився, мишей розподіляли по сч ов Групах з урахуванням середніх показників концентрації кальцію в крові, маси тіла і обсягу пухлини і о використовували їх як тваринну модель кахексії.
Лікувальну дію проти кахексії досліджували таким чином. (1) Спостереження за часом виживання
При дослідженні впливу на збільшення часу виживання мишам випробуваної групи двічі на тиждень вводили о зо олюднене антитіло варіанту "д'Її визначали час виживання миші. Як контрольне випробування мишам контрольної групи двічі на тиждень вводили в хвостову вену фізіологічний розчин з фосфатним буфером (РВ5) в о дозі О,1мл/мишу. Результати показані на Фіг.16. «- (2) Спостереження за концентрацією кальцію в крові Олюднене антитіло варіанту "д" двічі вводили в хвостову вену мишам, що використовуються як тваринна модель кахексії, з інтервалом в два дні в дозі 1Омкг або « 10О0мкг/мишу при кожному введенні. Як контрольне випробування мишам контрольної групи двічі вводили в ї- хвостову вену фізіологічний розчин з фосфатним буфером (РВ5) з інтервалом в два дні в дозі О,1мл/мишу при кожному введенні. (3) Визначення концентрації кальцію в крові
Через один і чотири дні після першого введення олюдненого антитіла варіанту "д" у всіх мишей визначали «
Концентрацію кальцію в крові з метою оцінки фармакологічної ефективності антитіла. Концентрацію кальцію в 0) с крові визначали на основі концентрації іонізованого кальцію в суцільній крові, для чого у всіх мишей брали кров через очну ямку за допомогою гематокритної трубки і аналізували в автоматичному аналізаторі 643 Са/рН ;» (СІВА-СОКМІМО). Всіх мишей щодня зважували протягом чотирьох днів після введення антитіла. Результати показані на Фіг.17 і 18. (4) Визначення обсягу пухлини -І Обсяг пухлини визначали через чотири дні після першого введення антитіла, для чого вимірювали найбільшу вісь (а мм) і найменшу вісь (Б мм) пухлини і отримані результати вводили в рівняння Таланта (аб 2/2. е Результати показані на Фіг.19. - Отримані результати ясно показують, що у мишей, яким . вводили олюднене антитіло варіанту "д" в дозі ЛОмкг або 10Омкг, не відбувалося збільшення концентрації кальцію в крові і втрата у вазі була меншою, ніж у о контрольних мишей. У мишей, яким вводили олюднене антитіло варіанту "д" в дозі 10Омкг двічі на тиждень, о спостерігалося значне збільшення часу виживання в порівнянні з контрольними мишами (р-0,0108:логарифмічний розподіл). Олюднене антитіло варіанту "д" впливає таким же чином на тваринні моделі ракової кахексії, що і досліджене вище моноклональне антитіло миші. Ці результати показують, що антитіло, вИиКОристане в цьому випробуванні, є корисним лікувальним засобом проти кахексії, зумовленої злоякісною пухлиною.
Ф, ІПосилальний приклад 1) ко Отримання гібридом, продукуючих моноклональне антитіло миші проти РТНгР (1-34)
Гібридоми, здатні продукувати моноклональне антитіло проти РТНІР людини (1-34) (5ЕО І Мо75), бо Мо23-57-154 і Мо23-57-137-1, отримують у відповідності зі способом, описаним Капії Заю еї аї. (Ззаю, К. еї а|., У. Вопе Міпег. Кез. 8, 849-860, 1993).
В якості імуногена використовують РТНгГР (1-34) (Репіпзціа), з яким за допомогою карбодіїміду (ЮОоііпп) кон'югують білок-носій тироглобуліну. Кон'югований з тироглобуліном РТНгР. (1-34) діалізують для отримання розчину з концентрацією білка 2мкг/мл. Отриманий . розчин змішують з ад'ювантом Фрейнда (Оіїсо) у відношенні 65 111 для отримання емульсії. Цю емульсію вводять 16 самицям мишей ВАЇ'В/З у вигляді дорсально-підшкірних або внутрішньочеревинних ін'єкцій в дозі 1Т0О0мкг/мишу для кожної ін'єкції з метою імунізації мишей, повторюючи цю процедуру 11 разів. Для початкової імунізації використовують повний ад'ювант Фрейнда і для повторної імунізації використовують неповний ад'ювант Фрейнда.
У всіх імунізованих мишей визначають титри антитіл в сироватці таким чином. Для цього у всіх мишей беруть
Кров з хвостової вени і відділяють антисироватку від крові. Антисироватку розводять буфером для радіоїмунного аналізу (ВІА) і змішують з РТНгГР (1-34), меченим "29І, для визначення зв'язуючої активності. Мишам, у яких підтверджено значне збільшення титру, внутрішньочеревинно ін'єкують РТНГР (1-34) без білка-носія в дозі 5Омкг/миша для остаточної імунізації.
Через три дні після остаточної імунізації мишей умертвляють і видаляють у них селезінку. Потім проводять 70 злиття кліток селезінки з лінією мієломних кліток миші РЗ3ХхбЗАдвВи.| відповідно до будь-якого відомого способу, використовуючи 50905 поліетиленгліколь 4000. Отримані таким чином злиті клітки висівають в ямки 9б-ямкових планшетів (85 планшетів) в кількості 2х104/ямку. Гібридоми досліджують в НАТ-середовищі таким чином.
Гібридоми досліджують за допомогою твердофазного радіоіїмуноаналізу (КІА) на наявність РТНгР-впізнаючих антитіл в культуральному супернатанті тієї ямки, де спостерігається зростання кліток в НАТ-середовищі. 75 Гібридоми збирають з ямки, в якій підтверджена здатність зв'язування з РТНгР-впізнаючими антитілами.
Отримані гібридоми суспендують в середовищі КРМІ-1640, що містить 15956 РС5 і ОРІ-добавку (Зідта) з подальшою уніфікацією гібридів за допомогою способу, що обмежує розведення. Таким чином отримують два типи, гібридомних клонів Мо23-57-154 і Мо23-57-137-1, кожний з яких володіє сильною здатністю зв'язування з
РТНГгР (1-34).
Гібридомний клон Мо23-57-137-1, що отримав призначення "гібридома типу "миша-миша" Мо23-57-137-1", депонований відповідно до положень Будапештського договору від 15 серпня 1996р. в колекції Національного інституту біонауки і людської технології, агентство промислової науки і технології, Японія (1-3, Нідавзнпі 1-споте, ТвиКкибва-впі, Ірагакі, дхарап) під номером доступу РЕКМ ВР-5631.
ІПосилальний приклад 21 Ге
Клонування ДНК, що кодує М-область моноклонального антитіла миші проти РТНГР людини (1-34) о
Клонування ДНК, що кодує М-область моноклонального антитіла миші проти РТНгР (1-34) людини
Мо23-57-137-1, виконують таким чином. (1) Отримання меРнкК
МРНК отримують з гібридоми Мо23-57-137-1, використовуючи набір для очищення мРНК ОпціскРгер (Рпагтасіа «З Віоїесі). Для цього клітки гібридоми Мо23-57-137-1 повністю гомогенізують екстракціонним буфером, після чого
МРНК виділяють і очищають від буфера на колонці з олігос(тимідин) целюлозним наповнювачем відповідно до о інструкцій, прикладених до колонки. мРНК отримують у вигляді осаду, проводячи осадження отриманого розчину (че етанолом. Осад мРНК розчиняють в буфері для елюювання. (2) Отримання і ампліфікація кКДНК для гена, що кодує М-область Н-ланцюга миші т (Ї) Клонування кДНК для М-області Н-ланцюга антитіла Мо23-57-137-1 ї-
Ген, що кодує М-область Н-ланцюга моноклонального антитіла миші проти РТНГР людини, клонують за способом 5-КАСЕ (Ггоптап, М.А. еї аІЇ., Ргос. Май. Асад. Зсі. ОБА, 85, 8 998-9002, 1988; ВеїуаузКу, А. еї а!І., Мисівіс Асідз Кевз. 17, 2919-2932, 1989). Спосіб 5-КАСЕ виконують, використовуючи набір 5'-Атрії РІМОЕК «
КАСЕ (СІОМЕТЕСН) відповідно до прикладених до нього інструкцій. При здійсненні цього способу 470 використовують затравку для синтезу КДНК, зокрема затравку МНСОС2 (ЗЕО ІЮ Мої), яка здатна гібридизувати з - с С-областю Н-ланцюга миші. Отриману вище мРНК (приблизно 2мкг), яка є матрицею для синтезу кДНК, ц змішують із затравкою МНСО2 (1Опмоль). Отриману суміш піддають взаємодії із зворотною транскриптазою при ,» температурі 522С протягом 30 хвилин для здійснення зворотної транскрипції мРНК в кДНК.
Отриманий реакційний розчин змішують з бн Масон для гідролізу РНК, що залишилася (при температурі 6520 протягом 30 хвилин), після чого його осаджують етанолом для виділення і очищення кДНК у вигляді осаду. - Очищену кДНК лігують з Атрії РІМОЕК Апспог (ЗЕО ІЮ Мо42) у 5-кінця внаслідок взаємодії з РНК-лігазою Т4 при їз температурі 372С протягом 6 годин і додатково при кімнатній температурі протягом 16 годин. В якості затравки для ампліфікації КДНК за способом РОК використовують затравку Апспог (ЗЕО ІЮ Мо2) і затравку МНО-О1 (ЗЕО - ІОЮО МоЗ3) (5.7. Удопев, еї аї., ВіоФесппоіоду, 9, 88, 1991). Розчин для полімеразної реакції синтезу ланцюга (на с 20 БОмкл) містить 1Т0ММ трис-НСЇ (рН 8,3), 5ХОмММ КСІ, 0,25мМ амМмтР (аАтР, астрР, асте, аттрР), 1,5мМ Масі», 2,5 одиниці ТаКаКа Тад (Такага Зпйиго Со., (а), 10 пмолей "якірної" затравки Апспог і їмкл реакційної суміші «2 КДНК, лігованої із затравками МНО-О1 і Атрії РІМОЕК Апспог, понад якого вміщують мінеральне масло (5О0мкл).
У термоциклізаторі моделі 480.) (Регкіп ЕІтег) виконують ЗО циклів полімеразної реакції синтезу ланцюга при наступних умовах: 942С протягом 45 секунд; 602С протягом 45 секунд і 722С протягом 2 хвилин. 59 (ї) Клонування кКДНК для М-області І -ланцюга антитіла Мо23-57-137-1
ГФ) Ген, що кодує М-область І -ланцюга моноклонального антитіла миші проти РТНІР людини, клонують.за способом 5-КАСЕ (Ргоптап, М.А. еї аЇ., Ргос. Май. Асад. Зсі. ОБА, 85, 8998-9002, 1988; ВеїуаузКу, А. еї де аІ.,, Мисівїс Асідз Кев. 17, 2919-2932, 1989). Спосіб 5-КАСЕ виконують, використовуючи набір 5-Атрії Ріпдег
РАСЕ (Сіопеїесі) відповідно до прикладених до нього інструкцій. При здійсненні цього способу в якості 60 затравки для синтезу КДНК використовують оліго(тимідинову) затравку. Отриману вище мРНК (приблизно 2мкКг), яка є матрицею для синтезу кДНК, змішують з олиготимідиновою затравкою. Отриману суміш піддають взаємодії із зворотною транскриптазою при температурі 522С протягом 30 хвилин для здійснення зворотної транскрипції
МРНК в кДНК. Отриманий реакційний розчин змішують з бн Маон для гідролізу будь-якої РНК, що залишилася (при температурі 659 протягом 30 хвилин). Отриманий розчин осаджують етанолом з метою виділення і бо очищення кКДНК у вигляді осаду. Синтезовану таким чином кДНК лігують з Атрії РІМОЕК Апспог у 5-кінця внаслідок взаємодії з РНК-лігазою Т4 при температурі 372С протягом 6 годин і потім при кімнатній температурі протягом 16 годин.
Затравку МІ С (5ЕО ІО Мо4) для полімеразної реакції синтезу ланцюга конструюють на основі консервативної послідовності С-області у-ланцюга І -ланцюга миші і синтезують в синтезаторі 394 ДНК/РНК (АВІ). Розчин для полімеразної реакції синтезу ланцюга (на 10Омкл) містить ТММ трис-НСЇІ (рН 8,3), 50ММ КСІ, 0,25мМ амМтР (ДАТР, астР, астеР, аттр) , 1,тт Мосі», 2,5 одиниці Атріїтад (РЕККІМ ЕІ МЕК), 5Опмолей затравки Апспог (ЗЕО ІО Мо2) і 1Імкл реакційної суміші кКДНК, лігованої із затравками МІ С (ЗЕО ІЮО Мо4) і Атрії РІМОЕК Апспог, понад якого вміщують 50мкл мінерального масла. У термоциклізаторі моделі 480) (Регкіп ЕІтег) виконують 35 70 циклів полімеразної реакції синтезу ланцюга в наступних умовах: 942 протягом 45 секунд, 602 протягом 45 секунд і 722С протягом 2 хвилин. (3) Очищення і фрагментація продуктів полімеразної реакції синтезу ланцюга.
Всі фрагменти ДНК, ампліфіковані вищеописаними полімеразними реакціями синтезу ланцюга, розділяють за допомогою електрофорезу в агарозному гелі з використанням Зо агарози Ми Зіеме СТО (ЕМО Віо. Ргодисів). 75 Для кожної М-області Н-ланцюга і М-області | -ланцюга з гелю вирізають фракцію агарозного гелю, що містить фрагмент ДНК довжиною біля 550 пар основ. У всіх отриманих гель-фракціях очищають цікавлячу ДНК, використовуючи набір ЗЕМЕСІ ЕАМ Ії (ВІО101) відповідно до прикладених до нього інструкцій. Очищену ДНК осаджують етанолом і осад ДНК розчиняють в 2 і мкл розчину, що містить Т0мММ трис-НСЇ (рН 7,4) і 1МмМ ЕОТА.
Порцію (Імкл) розчину ДНК розщеплюють рестрикційним ферментом Хта! (Мем Еподіапа Віоїарв) при температурі 372С протягом 1 години і рестрикційним ферментом Есокі (Такага Зп!йг2о Со., Ца.) при температурі 372С протягом ще 1 години. Гідролізований "розщеплений" розчин екстрагують фенолом і хлороформом і збирають ДНК, проводячи осадження етанолом.
Аналогічним чином отримують два фрагменти ДНК, що містять відповідно ген, що кодує М-область Н-ланцюга миші, і ген, кодуючий М-область І-ланцюга миші, які мають ЕсоКі-впізнаючу послідовність у 5'-кінця і с 259 Хтаї-впізнаючу послідовність у 3'-кінця. Ге)
Фрагменти ДНК ЕсокіІ-Хтаї, що містять відповідно ген, що кодує М-область Н-ланцюга миші, і ген, що кодує
М-область І-ланцюга миші, окремо лігують з вектором риС19, який був приготований розщепленням ферментами Есокі і Хтаї, при температурі 162С протягом 1 години з використанням набору для літування ДНК, варіант 2 (ТаКкага Зпиго Зі. а.) відповідно до прикладених до нього інструкцій. Порцію лігованої суміші о (10мкл) додають до 100мкл розчину, що містить компетентні клітки Е. соїї, УМ 109 (Мірроп Сепе Со., ца). с
Суміш кліток залишають вистоюватися на льоду протягом 15 хвилин, потім при температурі 42 «С протягом 1 хвилини і знов на льоду протягом ще 1 хвилини. Отриману суміш кліток змішують з ЗОбмкл 5ОС-середовища -- (Моїесшіаг Сіопіпд: А Гарогаїгу Мапиа), ЗатргооК, еї аї., Сої4 Зргіпд Нагрог ІГарогаїгу Ргевзв, 1989) та «Ж інкубують при температурі 3723 протягом 30 хвилин. Отриманий розчин кліток вміщують на агарове середовище 32 |В або 2хут (МоІесшаг Сіопіпд: А І арогаїогу Мапиаї, ЗатьгоокК, еї аїЇ., Соїд Зргіпд Нагрог І арогаїогу Ргезв, т 1989), утримуюче 100 або 5Омкг/мл ампіциліну, О0,1мММ ІРТО і 20мкг/мл Х-адаї, та інкубують при температурі 372С протягом ночі. Аналогічним чином отримують трансформанти Е. сої.
Трансформанти культивують протягом ночі при температурі 372С в 2мл середовища І В або 2ХУТ, що містить « 20 100 або 5Омкг/мл ампіциліну. З клітинної фракції отримують плазмідну ДНК в плазмідному екстракторі РІ-100У -в с (Кигабро Іпдизігіеєв, 4.) або за допомогою набору для виділення плазмід ОІАргер (ОІАСЕМ). Отриману таким чином плазмідну ДНК секвенують. :з» (4) Секвенування гена, що кодує М-область антитіла миші Нуклеотидну послідовність КДНК, що кодує область плазміди, визначають в секвенаторі ДНК 37ЗА (АВІ; Регкіп-Еітег), використовуючи набір для циклічного 75 Секвенування з фарбуванням термінатора (Регкіп-Еітег). Для секвенування використовують затравки М13 Ргітег -І МА (ТаКага 5п!иго Со., а.) (5ЕО ІЮ Моб) і М1З3 Ргітег КМ (ТаКкага 5п!иго Со., а.) (ЗЕО ІЮО Моб) і нуклеотидну послідовність підтверджують в обох напрямах. ї- Плазміда, що містить ген, кодучий М-область Н-ланцюга миші, виділений з гібридоми Мо23-57-137-1, названа - "МВСтНОг", і плазміда, що містить ген, кодучий М-область І -ланцюга миші, виділений з гібридоми Мо23-57-137-1, названа "МВС11І 24". Нуклеотидні послідовності (включаючи відповідні амінокислотні послідовності) ДНК, що і95) кодує М-область Н-ланцюга антитіла миші Мо23-57-137-1 в плазміді МВС1НО4, і ген, що кодує М-область оз Ї-ланцюга антитіла миші Мо23-57-137-1 в плазміді МВС1Н24, показані відповідно в ЗЕО ІЮ МоМо 57 і 65. Обидва поліпептиди для фрагмента М-області Н-ланцюга і фрагмента М-області |-ланцюга починаються з 58-го нуклеотиду (кодуючого глутамін) в послідовностях ДНК, показаних відповідно в ЕС І МоМо 57 і 65.
Амінокислотні послідовності поліпептидів для М-області Н-ланцюга і М-області І-ланцюга також показані відповідно в ЗЕО ІЮ МоМо 46 і 45. (Ф; Штам Б. соїї, що містить плазміду МВС1НО4, і штам Е. соїї, що містить плазміду МВСІЇ 24, названі
ГІ відповідно "ЕвсПегіспіа соїї ХМ109 (МВС1НОЗ4) і Езспегіспіа соїї ХМ109 (МВС1І1243". Ці штами Е. соїї депоновані відповідно до положень Будапештського договору від 15 серпня 1996бр. в колекції Національного інституту во біонауки і людської технології, агентство промислової науки і технології, Японія (1-3, Нідавзпі 1-споте,
ТвиКиба-зпПі, Ірагакі, Японія), під номерами доступу РЕКМ ВР-5628 для Езспегіснпіа соїї "УМ109 (МВСІНО4) і ГЕКМ
ВР-5627 для Езспегіспіа соїї УМ109 (МВС11 24). (5) Визначення гіперваріабельних дільниць моноклонального антитіла миші Мо23-57-137-1 проти РТНгР людини 65 М-область Н-ланцюга і М-область І -ланцюга мають спільні структури, що володіють значною схожістю, які складаються з чотирьох каркасних областей (ЕК), лігованих за допомогою трьох гіперваріабельних дільниць
(тобто, СОК). Амінокислотні послідовності каркасних областей є досить консервативними, в той час як амінокислотні послідовності гіперваріабельних дільниць характеризуються надзвичайно високою варіабельністью (Караї, Е. А. еї аїЇ., "Зедоепсе ої Ргоїеіпв ої. Іттипоіодіса! Іпіегезї?, ОБ ЮОері. Неайй апа
Нитап Зегмісез, 1983). З урахуванням цих чинників гомологію амінокислот між М-областями моноклонального антитіла миші проти РТНІР людини визначають з посиланням на базу даних по структурі амінокислотних послідовностей для антитіл, створеної Кабатом та інш. Так визначені гіперваріабельні дільниці М-областей, показані в таблиці 1.
Амінокислотні послідовності для гіперваріабельних дільниць 1-3 М-області | -ланцюга показані відповідно в 70 ЗЕО ІО МоМо59-61, і амінокислотні послідовності для гіперваріабельних дільниць 1-3 М-області Н-ланцюга показані відповідно в ЗЕО ІЮ МоМоб2-64. ів
ІПосилальний приклад З)
Конструювання химерного антитіла (1) Конструювання Н-ланцюга химерного антитіла (Ї) Конструювання М-області Н-ланцюга
Щоб провести літування з експресуючим вектором, що несе геномну ДНК для С у1 С-області Н-ланцюга людини, клоновану ДНК, що кодує М-область Н-ланцюга миші, модифікують за способом РСК. Нижню затравку
МВ8С1-51 (5ЕО ІЮ Мо7) конструюють таким чином, щоб вона гібридизувала з послідовністю ДНК, що кодує сч ре 5-кінцеву область лидерної послідовності М-області, і мала узгоджену послідовність Козака (Козак, М. еї аї.,
У. Мої. Віоі., 196, 947-950, 1987) і НіпаП-впізнаючу послідовність. Верхню затравку МВС1-а (5ЕО ІЮО Мов8) (о) конструюють таким чином, щоб вона гібридизувала з послідовністю ДНК, що кодує 3'-кінцеву область .)-області, і мала донорську послідовність сплайсованого фрагмента і ВатнНі-впізнаючу послідовність. Полімеразну реакцію синтезу ланцюга здійснюють з використанням ТаКаКа Ех Тад (Такага Зп!иго Со., ца.) і відповідного буфера. о 20 Розчин для полімеразної реакції синтезу ланцюга (на 5Омкл) містить О0,07мкг плазміди МСВІ1НО4 в якості матричної ДНК, ХоОпмолей МВС1-а і Хопмолей МВС1-51 в якості затравки, 2,5 одиниці ТаКакКа Ех Тад і 0,25мММ со амтР в буфері, понад якого вміщують 5Омкл мінерального масла. Виконують 30 циклів полімеразної реакції «- синтезу ланцюга в наступних умовах: 9427 протягом 1 хвилини, 5592 протягом 1 хвилини, 722С протягом 2 хвилин. Фрагменти ДНК, ампліфіковані за способом РСК, розділяють електрофорезом в агарозному гелі з « з5 Використанням Зо агарози Ми біеме СТО (ЕМО Віо. Ргодисів). чн
Потім вирізають дільницю агарозного гелю, що містить фрагмент ДНК довжиною 437 пар основ, і очищають цей фрагмент ДНК за допомогою набору СЕМЕСІЕАМ ІІ (ВІО 101) відповідно до прикладених до нього інструкцій. Очищену ДНК збирають, осаджуючи її етанолом, і розчиняють в 20мкл розчину, що містить 10ММ трис-КСІ (рН 7,4) і їММ ЕОТА. Порцію (мкл) отриманого розчину ДНК розщеплюють рестрикційними « 20 ферментами Ватні і Ніпаї!ї (Такага Зпиго Со., Ца.) при температурі 372С протягом 1 години. "Розщеплену суміш 3 с екстрагують фенолом і хлороформом і збирають цікавлячу ДНК, проводячи осадження етанолом.
Отриманий фрагмент ДНК Ніпаї-Ватні, який містить ген, що кодує М-область Н-ланцюга миші, субклонують :з» у векторі рОС19, який, був приготований шляхом розщеплення ферментами Ніпай| і ВатНі. Отриману плазміду секвенують в секвенаторі ДНК 37ЗА (РегкКкіп-ЕІтег), використовуючи затравки М1З Ргітег МА і МІЗ Ргітег ЕМ і набір для циклічного секвенування з фарбуванням термінатора (Регкіп-ЕІтег). В результаті отримують плазміду, -І що несе ген правильної нуклеотидної послідовності, кодуючий М-область Н-ланцюга миші, виділену з гібридоми
Мо23-57-137-1, і маючу м. НіпаП-впізнаючу послідовність, послідовність Козака в 5-кінцевій області і ве ВатнНі-впізнаючу послідовність в 3'-кінцевій області, яка названа "МВСІН/рОсСт19", - (ї) Конструювання М-області Н-ланцюга для кКДНК химерного Н-ланцюга типу "миша - людина"
Щоб зробити літування з кКДНК для С у1 С-області Н-ланцюга людини, сконструйовану вище ДНК, кодучу о М-область Н-ланцюга миші, модифікують за способом РСК. Нижню затравку МВС1НМ52 (5ЕО ІЮО Ме9) для о М-області Н-ланцюга конструюють таким чином, щоб, замінити гліцином другу амінокислоту (аспарагин) послідовності, що кодує передню частину лідерної послідовності М-області Н-ланцюга, і отримати узгоджену послідовність Козака (Когак, М. еї аїЇ., У. Мої. ВіоІ., 196, 947-950, 1987) і Ніпаїй- та ЕсоКіІ-впізнаючі в послідовності. Верхню затравку МВСТНМК2 (ЗЕО ІЮ Мо10) для М-облаеті Н-ланцюга конструюють таким чином, щоб вона гібридизувала з послідовністю ДНК, що кодує 3'-кінцеву область -області, і з послідовністю ДНК, що
Ф) кодує 5'-кінцеву область С-області, і мала Араї!- і Зта!І-впізнаючі послідовності. ко Полімеразну реакцію синтезу ланцюга здійснюють з використанням ТаКакКа Ех Тад (ТаКага Зп!иго Со., Ца.) і відповідного буфера. Розчин для полімеразної реакції синтезу ланцюга (на 5Омкл) містить О,бмкг плазміди бо МВвСтН/рист19 в якості матричної ДНК, 5Опмолей МВСТНМУ5З2 і бопмолей МВСТНМУКО в якості затравки, 2,5 одиниці ТаКакКа Ех Тад і 0,25мМ амте в буфері, понад якого вміщують 50мкл мінерального масла. Виконують 30 циклів полімеразної реакції синтезу ланцюга в наступних умовах: 942 протягом 1 хвилини; 5592; протягом 1 хвилини; 722 протягом 1 хвилини, фрагменти ДНК, ампліфіковані внаслідок виконання полімеразної реакції синтезу ланцюга, виділяють електрофорезом в агарозному гелі з використанням 190 агарози Зеа Кегпп СТО (ЕМО 65 Віо. Ргодисів). Потім вирізають дільницю агарозного гелю, що містить фрагмент ДНК довжиною 456 пар основ, і очищають вказаний фрагмент ДНК за допомогою набору СЕМЕСІ ЕАМ 1! (ВІО101) у відповідності з прикладеними до нього інструкціями. Очищену ДНК осаджують етанолом і розчиняють в 20мкл розчину, що містить 10ММ трис-НСЇІ (рН 7,4) і мМ ЕОТА.
Отриманий розчин ДНК (мкг) розщеплюють рестрикційними ферментами Есокі і Зтаї! (ТаКага 5п!иго Со., ца.) при температурі 372 протягом 1 години. "Розщеплений" розчин екстрагують фенолом і хлороформом і збирають ДНК, проводячи осадження етанолом. Отриманий фрагмент ДНК ЕсокіІ-Зтаї, який містить ген, що кодує М-область Н-ланцюга миші, субклонують у векторі рОС19, який був приготований шляхом розщеплення ферментами ЕсоКіІ і ЗтаЇ. Отриману плазміду секвенують секвенатором ДНК З37ЗА (РегкКіп-ЕІтег), використовуючи затравки М13 Ргітег МА і М13 Ргітег КМ і набір для циклічного секвенування з фарбуванням 7/0 термінатора (Регкіп-ЕІтег). В результаті отримують плазміду, що містить ген, кодуючий М-область Н-ланцюга миші, виділену з гібридоми Мо23-57-137-1 з правильною нуклеотидною послідовністю, і маючу Есокі- і
Ніпапі-впізнаючі послідовності, послідовність Козака в 5'-кінцевій області Араі- і Зтвваі-впізнаючі послідовності в З3'-кінцевій області, яка названа "МВС1Нм/рОС19", (ії) Конструювання експресуючого вектора для Н-ланцюга химерного антитіла
КДНК, що містить ДНК для СуУ1 С-області Н-ланцюга антитіла людини, отримують таким чином. Спочатку отримують мРНК з клітки яєчника китайського хом'ячка, в яку заздалегідь був введений експресуючий вектор
ОНЕК-АЕ-КМП-РМ-Ї (див. УМО 92/19759), кодуючий геномні ДНК М-області Н-ланцюга олюдненого антитіла РМІ і
Ід! С-області Н-ланцюга антитіла людини (М. ТаКапназвні еї аї., Сей 29, 671-679, 1982), і експресуючий вектор
ЕМІ-РМІа (див. УУО 92/19759), кодуючий геномні ДНК М-області | -ланцюга олюдненого антитіла РМІ1 і
С-область к-ланцюга І -ланцюга антитіла людини. Отриману мРНК використовують у відповідності зі способом
КТ-РСК для клонування кКДНК, що містить М-область Н-ланцюга олюдненого антитіла РМІ і С у1 С-області антитіла людини, яку потім субклонують в сайті Ніпап-Ватні плазміди рОС19. Після секвенування отримують плазміду, що має правильну нуклеотидну послідовність, яка названа "рЕМА-РМІИ-КДНК".
Отримують експресуючий вектор ОНЕВ-ЛЕ-КЕМП-РМ-1-ї з делецією сайта НіпайШ між промотором ЗМ40ігеномї ЄМ 29 ОНЕК і сайта ЕсокК!І між промотором ЕБЕ-19, і геном М-області Н-ланцюга олюдненого антитіла РМІ, який Ге) використовують для конструювання експресуючого вектора для кКДНК, що містить ген М-області Н-ланцюга олюдненого антитіла РМІ і ген СуУ1 С-області антитіла людини.
Отриману плазміду (РрАМА-РМІ-КДНК) розщеплюють Ватні, дефосфорилюють фрагментом Кленова і ще раз розщеплюють Ніпаїй з отриманням дефосфорилованого Фрагмента Ніпаїй-ВатнНі. Цей дефосфорилований о фрагмент Ніпап-Ватні лігують з експресуючим вектором ОНЕК-ДЕ-КМпП-РМ-1-ї, в якому видалені сайти Ніпагі со і ЕсокІ. Таким чином конструюють експресуючий вектор КМП-РМІ-КДНК, що містить кКДНК, що кодує М-область
Н-ланцюга олюдненого антитіла РМІ і СуУ1 С-області антитіла людини. -
Експресуючий вектор КМА-РМІ-КДНК, що містить кКДНК, кодуючу М-область Н-ланцюга олюдненого антитіла «Ж
РМІ ї Суї С-області антитіла людини, розщеплюють Араї і ВатНі, внаслідок чого отримують фрагмент ДНК, що м містить С-область Н-ланцюга. Отриманий фрагмент ДНК вводять у вищезгадану плазміду МВСТНУ/рисІе, яка була приготована шляхом розщеплення Ара! і Ватні. Отримана таким чином плазміда названа "МВСТ1НкДНК/рОст19". Ця плазміда містить КДНК, що кодує М-область Н-ланцюга антитіла миші і Су! С-області антитіла людини і має ЕсоКіІ- і НіпаПП-впізнаючі послідовності в 5'-кінцевій області і ВатнНі-впізнаючу « 20 послідовність в 3'-кінцевій області. ш-в с Плазміду МВСТНКДНК/рОС19 розщеплюють ЕсокК!І і Ватні з отриманням фрагмента ДНК, що містить нуклеотидну послідовність, кодуючу Н-ланцюг химерного антитіла. Отриманий фрагмент ДНК вводять в :з» експресуючий вектор рСО51, який був приготований шляхом розщеплення Есокі і ВатНі, внаслідок чого отримують експресуючий вектор для химерного антитіла, який названий "МВСТНКДНКЮ/рСо51". Експресуючий
Вектор рОСОЗ1 конструюють з використанням НЕР-РМН-9у1 (див. УУО 92/19759), для чого з нього видаляють гени -І антитіла шляхом розщеплення Есокі і Зіпаї і лігують з адаптером ЕсокІ-Мо-Ватні (ТаКага 5п!иго Со., Ца.).
Щоб отримати плазміду для експресії в клітці яєчника китайського хом'ячка, плазміду МВСЯНнНКДНКЮрОС19 ве розщеплюють Есої! і Ватні з отриманням фрагмента ДНК, що містить ген для Н-ланцюга химерного антитіла. - Потім фрагмент ДНК вводять в експресуючу плазміду рРСНОЇ, приготовану шляхом розщеплення Есокі і Ватні, що дозволяє отримати експресуючу плазміду для химерного антитіла, яка названа "УВСТНКкДНнНЮрснОТ". і Експресуючий вектор рСНОЇ конструюють з використанням ОНЕК-АТ-гН-РМІ-ї (див. УМО 92/19759), для чого з о нього видаляють ген антитіла шляхом розщеплення Есокі і З5таї і лігують з адаптером ЕсокІ-Моїі-Ватні (Такага
Зпиго Со., ЦО). (2) Конструювання С-області | -ланцюга людини () Отримання клонуючого вектора
Щоб сконструювати вектор риС19, який містить ген для С-області І -ланцюга людини, отримують вектор
Ф) рист19. з делецією сайта НіпаїІї. Вектор рОС19 (2мкг) розщеплюють в 20мкл реакційного розчину, що містить ко 20ММ трис-НСЇІ (рН 8,5), 10ММ МосіІ», мМ ОТ, 100мММ КСІ, 8 одиниць Ніпаїй (Такага Зпиго Со., Ца), при температурі 372С протягом 1 години. Отриманий "розщеплений" розчин екстрагують фенолом і хлороформом і бо Збирають цікавлячу ДНК, проводячи осадження етанолом.
Зібрану ДНК піддають взаємодії в 5бОмкл реакційного розчину, що містить 50ММ трис-НСЇ (рн 7,5), 10МммМ
Масі», мМ ОТТ, 100мМ Масі 0,5ммМ амтР і б одиниць фрагмента Кленова (СІВСО ВК), при кімнатній температурі протягом 20 хвилин, внаслідок чого відбувається дефосфорилування кінцевих областей ДНК. Цю реакційну суміш екстрагують фенолом і хлороформом і збирають векторну ДНК, проводячи осадження в5 етанолом.
Зібрану векторну ДНК піддають взаємодії в 1Омкл реакційного розчину, що містить 5ОММ трис-НСЇ (рН 7,6),
10мММ Масі», їмММ ОТ, 595 (об'ємному відношенні) поліетиленгліколю-8000 і 0,5 одиниці ДНК-лігази Т4 (СІВСО
ВК), при температурі 1690 протягом 2 годин, внаслідок чого відбувається аутолігування векторної ДНК.
Реакційний розчин (5мкл) додають до 100мкл розчину, що містить компетентні клітки штама 2УМ109 Е. соїї (Мірроп (Зепе Со., ЦЯ), і отриманий розчин залишають вистоюватися на льоду протягом ЗО хвилин, потім при температурі 422 протягом 1 хвилини і знов на льоду протягом 1 хвилини. До реакційного розчину додають культуральне середовище 5ОС (500мкл) та інкубують при температурі 372С протягом 1 години. Отриманий розчин вміщують в агарове середовище 2ХУТ (утримуючу 50мкг/мл ампіциліну), на поверхню якого заздалегідь нанесені Х-да! та ІРТО (Моіесцшіаг Сіопіпд. А Іарогаїгу Мапиа), ЗатьгооК, еї. аїЇ., Соїй Зргіпд Нагрог 70 ІГаброгаїгу Ргевзв, 1989), і культивують при температурі 372С протягом ночі, отримуючи таким чином трансформант.
Цей трансформант культивують на середовищі 2ХУТ (20мл), що містить ампіцилін (5Омкг/мл), при температурі 372 протягом ночі. З клітинної фракції культурального середовища виділяють плазмідну ДНК і очищають за допомогою минінабору для очищення плазмід (ОІАСЕМ) відповідно до прикладених до нього інструкцій. Очищену плазміду розщеплюють Ніпа. Ця плазміда з підтвердженою делецією сайта Ніпайїї названа. "рОсС19 АНіпан". (ї) Конструювання ДНК, що кодує С-область ;-ланцюга І -ланцюга людини.
Відомо, що С-область у-ланцюга І -ланцюга антитіла людини має принаймні чотири ізотипи, що включають
Мсд'"Ке"О27, Мсо-Ке-0О2-, Мсд-Ке-О2, 1987). У базі даних ЕМВІ. зроблений пошук С-області у-ланцюга І -ланцюга антитіла людини, яка гомологічна С-областям Х-ланцюга І-ланцюга миші Мо23-57-137-1. Внаслідок цього встановлено, що ізотип Мсд'Ке"О52- х-ланцюга І -ланцюга антитіла людини (Ме доступу Х5 7819) (Р. Оагіамаси, єї а!І., Ргос. Май). Асайд. Зсі. ОБА, 84, 9074-9078, 1987) в найбільшій мірі гомологічний С-області х-ланцюга І-ланцюга миші Мо23-57-137-1, характеризуючись 64,495 гомологією відносно амінокислотної послідовності і 73490 с р; гомологією відносно нуклеотидної послідовності.
Потім за способом РСК конструюють ген, що кодує С-область у-ланцюга І-ланцюга антитіла людини. і)
Затравку для полімеразної реакції синтезу ланцюга синтезують за допомогою синтезатора ДНК/РНК 394 (АВІ).
Синтезують затравки НІГ АМВ1 (5ЕО ІО Мо11) і НЕ АМВЗ (5ЕО ІЮО Мо13), які містять смислову послідовність ДНК, і затравки НГ АМВ2 (5ЕО ІЮО Мо12) і НІ АМВ4 (5ЕО ІЮ Мо12)4, які містять антисмислову послідовність ДНК, при (ав)
Цьому всі затравки мають з обох кінців комплементарну послідовність довжиною 20-23 пари основ.
Зовнішні затравки НІАМВЗ (ЗЕБЕО ІЮО Мо15) і НГІАМВК (5ЕБО ІС Мо16) мають послідовності, гомологічні о відповідно затравкам НІГАМВІ і НІАМВ4. Затравка НІАМВЗ містить Есокі-, Ніпай- їі В'пі-впізнаючі ч послідовності, і затравка НГ АМВК містить ЕсоКіІ-впізнаючу послідовність. Під час першої полімеразної реакції синтезу ланцюга відбувається взаємодія між НІ АМВ1 і НІГ АМВАЗ2 і між НІГ АМВЗ і НІГ АМВА4. Після завершення З вищезгаданих реакцій обидва отримані продукти РСК змішують в еквівалентних кількостях і при здійсненні ї- другої полімеразної реакції синтезу ланцюга проводять їх збирання. До реакційного розчину додають зовнішні затравки НІ АМВ5 і НІ АМВК. Цю реакційну суміш піддають третій полімеразній реакції синтезу ланцюга для ампліфікації повнорозмірної ДНК. «
Полімеразні. реакції синтезу ланцюга виконують за допомогою ТаКаКа Ех Тад (ТаКага 5п!иго Со., Ца) у 70 відповідності з прикладеними до набору інструкціями. При здійсненні першої полімеразної реакції синтезу - с ланцюга використовують 100мкл реакційного розчину, що містить бпмолей НІ АМВ1, О,5пмоля НІ АМВ?2 і 5 а одиниць ТаКакКа Ех Тад (ТаКага Зпи2о Со., Ца.), або реакційний розчин, що містить О0,5пмоля НІ АМВ3З, 5 пмолей "» НІГАМВА і 5 одиниць ТаКакКа Ех Тад (ТаКага 5п!й2о Со., Ца.), понад якого вміщують 50мкл мінерального масла.
Виконують 5 циклів полімеразної реакції синтезу ланцюга в наступних умовах: 942 протягом 1 хвилини, 6092 протягом 1 хвилини і 722С протягом 1 хвилини. - Під час другої полімеразної реакції синтезу ланцюга використовують суміш, що містить обидва реакційних їз розчини (по 50мкл), понад якою вміщують 5О0мкл мінерального масла. Виконують З цикли полімеразної реакції синтезу ланцюга у наступних умовах: 942 протягом 1 хвилини, 602 протягом 1 хвилини і 722 протягом 1 - хвилини. со 20 Під час третьої полімеразної реакції синтезу ланцюга використовують реакційний розчин, до якого додають зовнішні затравки НІ АМВ5 і НІГ АМВК (по 5Опмолей кожної). Виконують 30 циклів полімеразної реакції синтезу с ланцюга в наступних умовах: 942С протягом 1 хвилини, 602 протягом 1 хвилини і 722С протягом 1 хвилини.
Фрагмент ДНК, отриманий внаслідок третьої полімеразної реакції синтезу ланцюга, піддають електрофорезу в 396 низькоплавкому агарозному гелі (МибЗіеме СТО Адагозе, ЕМС), після чого його виділяють і очищають від гелю за допомогою набору СЕМЕСІ ЕАМ 1 (ВІО101) відповідно до прикладених до нього інструкцій.
ГФ) Отриманий фрагмент ДНК розщеплюють в реакційному розчині (20мкл), що містить 5ОММ трис-НСЇ (рН 7,5), 10мММ Масі», їмМ ОТТ, 100мМ Масі і 8 одиниць Есокі (ТаКага 5пиго Со., Ца.), при температурі 3723 протягом 1 о години. "Розщеплений" розчин екстрагують фенолом і хлороформом і збирають ДНК, проводячи осадження етанолом. Отриману ДНК розчиняють в розчині (мкл), що містить 10мММ трис-НСЇ (рН 7,4) і мМ ЕОТА. 60 Плазміду рисСІЗ АНіпайй (О0,8мкг) розщеплюють ЕсоКіІ аналогічно вищеописаній процедурі. "Розщеплений" розчин екстрагують фенолом/хлороформом і осаджують етанолом, внаслідок чого отримують розщеплену плазміду рОС19 АНіпа. Розщеплену плазміду піддають взаємодії в реакційному розчині (5Омкл), що містить 5ОММ трис-НСЇ (рН 9,0), 1мМ Масі» і лужну фосфатазу (Е. соїї С75; ТаКага 5п!й2о Со., Ца), при температурі 3720 б протягом 30 хвилин, щоб дефосфорилувати плазміду (тобто обробляють лужною фосфатазою бактерій).
Реакційний розчин екстрагують фенолом/хлороформом і збирають з нього ДНК, проводячи осадження етанолом.
Отриману таким чином ДНК розчиняють в розчині (1Омкл), що містить Т0мММ трис-НСЇ (рН 74) і 1МмМ ЕОТА.
Оброблену фосфатазою бактерій плазміду рОС19 АнНіпай (Імкл) лігують з отриманим вище продуктом полімеразної реакції синтезу ланцюга (4мкл), використовуючи набір для літування ДНК, варіант 2 (ТаКага Зпйи2о
Со., Ца). Отриману плазміду вводять в компетентну клітку Е. соїї, УМ109, для утворення трансформанту.
Трансформант культивують протягом ночі в середовищі 2ХУТ (2мл), що містить 50Омкг/мл ампіциліну. Плазміду виділяють з цієї клітинної фракції за допомогою набору для очищення плазмід ОІАргер (ОІАСЕМ).
Отриману плазміду секвенують для визначення клонованої ДНК. Секвенування здійснюють в секвенаторі
ДНК З37ЗА (АВІ), використовуючи затравки М13 Ргітег МА і М13 Ргітег КМ (Такага Зп!й2о Со., Ца.). Це дозволяє 7/0 встановити, що клонована ДНК має делецію довжиною 12 пар основ. Ця плазміда названа "схл/рОсС197". Потім для отримання видаленої частини знову синтезують затравки НСІ М5 (5ЕО ІЮ Мо17) і НСІ МК (ЗЕО ІО Мо18) і за допомогою цих затравок реконструюють правильну ДНК за способом РОК.
Першу полімеразну реакцію синтезу ланцюга здійснюють, використовуючи в якості матриці плазміду схл/рОС19 з делецією ДНК і набори затравок НІАМВ5 і НСІМ5 або НСІМ5 і Н ГАМВ 4. Всі продукти 75 полімеразної реакції синтезу ланцюга очищають окремо. При здійсненні другої полімеразної реакції синтезу ланцюга проводять збирання продуктів полімеразної реакції синтезу ланцюга. Під час третьої полімеразної реакції синтезу ланцюга до продукту другої полімеразної реакції синтезу ланцюга додають зовнішні затравки
НІГАМВЗ5 і НГ АМВА і проводять ампліфікації для отримання повнорозмірної ДНК.
Під час першої полімеразної реакції синтезу ланцюга використовують реакційний розчин (1ООмкл), 20 утримуючий О,їмкг схл/рОС19 в якості матриці, по бХоОпмолей затравок НІАМВ5 і НСІ МК або по 5Опмолей затравок НСІ М5 і НІ АМВА і 5 одиниць ТаКаКа Ех Таяд (ТаКкага 5п!иго Со., Ца.), понад якого вміщують 5Омкл мінерального масла. Виконують ЗО циклів полімеразної реакції синтезу ланцюга в наступних умовах: 942С протягом 1 хвилини і 722 протягом 1 хвилини.
Продукти першої полімеразної реакції синтезу ланцюга, НІ АМВ5-НСІ МЕ (236 пар основ) і НСІМ5-НІАМВА М 25 (147 пар основ) по окремості піддають електрофорезу в 395 низькоплавкому агарозному гелі, щоб виділити ге) фрагменти ДНК. Фрагменти ДНК збирають і очищають від гелів за допомогою набору ЗЕМЕСІ ЕАМ 1І (ВІО1О01).
Під час другої полімеразної реакції синтезу ланцюга використовують 20мкл реакційного розчину, що містить по 4Онг очищених фрагментів ДНК і 1 одиницю ТаКакКа Ех Тад (ТаКага 5п!иг2о Со., Ца.), понад якого вміщують 25мМкл мінерального масла. Виконують 5 циклів полімеразної реакції синтезу ланцюга в наступних умовах: 9490 о 30 протягом 1 хвилини, 602С протягом 1 хвилини і 722С протягом 1 хвилини. с
Під час третьої полімеразної реакції синтезу ланцюга використовують 1ООмкл реакційного розчину, що містить 2мкл реакційного розчину, отриманого при виконанні другої полімеразної реакції синтезу ланцюга, по -- 5Опмолей зовнішніх затравок НІ АМВ5 і НІ АМВА і 5 одиниць ТаКака Ех Тад (ТаКага Зп!йго Со. 4.) понадякого /-«ф вміщують 5О0мкл мінерального масла. Виконують 30 циклів полімеразної реакції синтезу ланцюга в наступних 3о умовах: 942С протягом 1 хвилини, 602С протягом 1 хвилини і 722 протягом 1 хвилини, внаслідок чого отримують в фрагмент ДНК довжиною 357 пар основ (продукт третьої полімеразної реакції синтезу ланцюга). Цей фрагмент
ДНК піддають електрофорезу в 395 низькоплавкому агарозному гелі для виділення фрагмента ДНК. Отриманий фрагмент ДНК збирають і очищають за допомогою набору ЗЕМЕСІ ЕАМ (ВІО1О01). «
Частину (0,їмкг) отриманого таким чином фрагмента ДНК розщеплюють ЕсокКі! і субклонують в плазміді З7З рОст19 Анігпаїй|, яку заздалегідь обробляють лужною фосфатазою бактерій (ВАР). Отриману плазміду вводять в с компетентну клітку Е. соїї, "УМ109, для утворення трансформанту. Трансформант культивують протягом ночі в "з 2мл середовища 2ХУТ, що містить 50мкг/мл ампіциліну. Плазміду виділяють з клітинної фракції і очищають за допомогою набору для очищення плазмід ОІАргер (ОІАСЕМ).
Очищену плазміду секвенують в секвенаторі ДНК 37ЗА (АВІ), використовуючи затравки М13 Ргітег МА і МІ1З
Ргітег КМ (Такага Зйп!иго Со., Ц4.). Плазміда, в якій підтверджена наявність правильної нуклеотидної і послідовності без будь-якого поділу, названа "СХ/русС19", т» (ії) Конструювання гена, що кодує С-область к-ланцюга І -ланцюга людини - Фрагмент ДНК, що кодує С-область к-ланцюга І -ланцюга, клонують з плазміди НЕР-РМІК-ЯК (МУО 92/19759) за способом РСК. Верхню затравку НКАРЗ (5ЕО ІЮ Мо19) конструюють таким чином, щоб вона містила Есокі-, (95) 50 Ніпайі- і ВіІпі-впізнаючі послідовності, і нижню затравку НКАРА (ЗЕО ІЮО Мо20) конструюють таким чином, щоб о вона містила ЕсоКіІ-впізнаючу послідовність. Ці затравки синтезують в синтезаторі ДНК/РНК З394(АВІ).
Полімеразну реакцію синтезу ланцюга здійснюють, використовуючи 100мкл реакційного розчину, що містить
О,1мкг плазміди НЕР-РМІК-ЯК в якості матриці, по бХопмолей кожної з затравок НКАРЗ і НКАРА і 5 одиниць
ТаКака Ех Тад (Такага 5пйизо Со., ЦЯ), понад якого вміщують 5Омкл мінерального масла. Виконують 30 полімеразних циклів полімеразної реакції синтезу ланцюга в наступних умовах: 942С протягом 1 хвилини, 602С (Ф) протягом 1 хвилини і 722С протягом 1 хвилини, внаслідок чого отримують продукт полімеразної реакції синтезу
ГІ ланцюга довжиною 360 пар основ. Цей фрагмент ДНК виділяють і очищають електрофорезом в 390 низькоплавкому агарозному гелі, а потім збирають і очищають за допомогою набору ЗЕМЕСІ ЕАМ 11 (ВІО101). во Отриманий таким чином фрагмент ДНК розщеплюють ЕсокКі!І і клонують в плазміді рОС19 АнНіпаї, яку заздалегідь обробляють лужною фосфатазою бактерій (ВАР). Отриману плазміду вводять в компетентну клітку
Е. сої і, УМ109, для утворення тарнсформанту. Трансформант культивують протягом ночі в 2мл середовища 2ХУТ, що містить 50мкг/мл ампіциліну. Виділену з клітинної фракції плазміду очищають за допомогою набору для очищення плазмід ОІАргер (ОІАСЕМ). 65 Очищену плазміду секвенують в секвенаторі ДНК 37ЗА (АВІ), використовуючи затравки М13 Ргітег МА і МІ1З
Ргітег КМ (ТаКага 5пйилго Со., (4). Плазміда, у якої підтверджена наявність правильної нуклеотидної послідовності, названа "Ск/русС19", (3) Конструювання експресуючого вектора І -ланцюга химерного антитіла
Конструюють експресуючий вектор І-ланцюга химерного антитіла Мо23-57-137-1. Ген, що кодує М-область
І-ланцюга Мо23-57-137-1, лігують з сайтом Ніпа!П-Віпі (розташованими безпосередньо перед С-областю антитіла людини) обох плазмід СХ/рисСт19 і Ск/руОсС19, внаслідок чого отримують вектори риОС19, що містять ДНК, кодуючу
М-область І-ланцюга химерного антитіла Мо23-57-137-1 і С-область у-ланцюга І-ланцюга або С-область к-ланцюга І -ланцюга відповідно. Кожний отриманий вектор потім розщеплюють ЕсокКіІ, щоб виділити ген для
Ї-ланцюга химерного антитіла. Цей ген субклонують в експресуючому векторі НЕР.
Фрагмент ДНК, що кодує М-область І-ланцюга антитіла Мо23-57-137-1, клонують з плазміди МВС11724 за способом РСК. Затравки, що використовуються в цьому способі, синтезують окремо за допомогою синтезатора
ДНЮ/РНК 394 (АВІ). Нижню затравку МВССНІ1 (5ЕО ІЮ Мо21) конструюють таким чином, щоб вона містила
НіпанП-впізнаючу послідовність і послідовність Козака (Когак, М. еї аїЇ., 9У. Мої. Віої. 196, 947-950, 1987), і верхню затравку МВССНІ З (ЗЕО ІЮ Мо22) конструюють таким чином, щоб вона містила Ваїй- і КсокКіІ-впізнаючі 75 послідовності.
Полімеразну реакцію синтезу ланцюга здійснюють, використовуючи 100мкл реакційного розчину, що містить 10мМ трис-НСЇ (рН 8,3), 5ОММ КСІ, 1,5мММ Мосі», 0,2мМ акмтР, 0,1мкг МВС11І 24, по ХОопмолей затравок МВССНІ 1 ії МВОСНІЗ і Імкл АтріїТад (РЕККІМ ЕЇ МЕК), понад якого вміщують 50мкл мінерального масла. Виконують 30 циклів полімеразної реакції синтезу ланцюга в наступних умовах: 942С протягом 45 секунд і 602 протягом 45 секунд і 722С протягом 2 хвилин.
Продукт полімеразної реакції синтезу ланцюга довжиною 444 пари основ піддають електрофорезу в 390 низькоплавкому. агарозному гелі, збирають і очищають за допомогою набору ЗЕМЕСІ ЕАМ ІІ (ВІО101). Очищений продукт полімеразної реакції синтезу ланцюга розчиняють в 20мкл розчину, що містить Т0мММ трис-НСЇ (рн 74) і 1мММ ЕОТА. Продукт полімеразної реакції синтезу ланцюга (1мкл) розщеплюють в 20мкл реакційного розчину, що СМ містить 10мММ трис-НСЇ (рН 7,5), 1мММ Мосі» мМ ОТТ, 50мМ Масі 8 одиниць Ніпайї (ТаКкага Зпйиг2о Со., Ца..) і о 8 одиниць ЕсокіІ (Такага Зпйиго Со., Ца.), при температурі 372С протягом 1 години. "Розщеплений" розчин екстрагують фенолом і хлороформом і цікавлячу ДНК збирають, проводячи осадження етанолом. ДНК розчиняють в мкл розчину, що містить 10мМ трис-НСЇ (рН 7,4) і мМ ЕОТА.
Аналогічним чином плазміду рОС19 (Імкл) розщеплюють Ніпай! і ЕсоКіІ, екстрагують фенолом/хлороформом о і осаджують етанолом. Отриману розщеплену плазміду обробляють лужною фосфатазою бактерій (Е. соїї С75; со
Такага Зп!иг2о Со., Ца.). Отриманий реакційний розчин екстрагують фенолом і хлороформом і збирають з нього
ДНК, проводячи осадження етанолом. ДНК розчиняють в 1Омкл розчину, що містить 10мММ трис-НСЇ (рН 7,4) і -- 1ММ ЕОТА. «
Плазміду риС19 (мкл), оброблену лужною фосфатазою бактерій, лігують з отриманим вище продуктом
Зо полімеразної реакції синтезу ланцюга (4мкл), використовуючи набір для літування ДНК, варіант 2 (ТаКага Зпийг2о в.
Со., Ца). Отриману плазміду вводять в компетентну клітку Е. Соїї, УМ109 (Мірроп Сепе Со., Цеа.), як описувалося вище, для утворення тарнсформанту. Трансформант вміщують на агарове середовище 2ХУТ, що містить 5Омкг/мл ампіциліну, і культивують протягом ночі при температурі 372С. Потім отриманий трансформант « культивують протягом ночі при температурі 379С в 2мл середовища 2ХУТ, що містить 5Омкг/мл ампіциліну.
Виділену з клітинної фракції плазміду очищають за допомогою набору для очищення плазмід ОІАргер (ОІАСЕМ). З с Після визначення нуклеотидної послідовності плазміда, в якій підтверджена наявність правильної нуклеотидної
Із» послідовності, названа "СНІ /рИОсС19".
Плазміди СХ/рОСт19 ії Ск/рисС19 (по мкг кожної) розщеплюють в 20мкл реакційного розчину, що містить 20МмМ трис-НСІ (рН 8,5), 10мММ Масі», мМ ОТТ, 100мММ КСІ, 8 одиниць Ніпай (Такага 5пйиго Со., Ца.) і 2 одиниці 75 Вп (Такага Зпйиго Со., Ца.), при температурі 372 протягом 1 години. "Розщеплений" розчин екстрагують їх фенолом і хлороформом і збирають з нього ДНК, проводячи осадження етанолом. ДНК обробляють лужною т» фосфатазою бактерій при температурі 372С протягом 30 хвилин. Реакційний розчин екстрагують фенолом і - хлороформом і збирають з нього ДНК, проводячи осадження етанолом. ДНК розчиняють в 10мкл розчину, що 50 містить 10мММ трис-НСЇ (рН 7,4) і ММ ЕОТА. (95) Плазміду СН У/рОсСт5, яка містить ДНК, що кодує М-область І -ланцюга Мо23-57-137-1 (Вмкг), розщеплюють о Ніпагй!! ії Віп!І так, як це описано вище, з отриманням фрагмента ДНК довжиною 409 пар основ. Цей фрагмент ДНК піддають електрофорезу в 395 низькоплавкому агарозному гелі, а потім збирають і очищають від гелю за допомогою набору СЕМЕСІ ЕАМ ІІ (ВІО101). ДНК розчиняють в 1Омкл розчину, що містить 1Омм трис-НСЇІ (рН 7,4) і 1ММ ЕОТА.
ДНК для ДНК М-області І -ланцюга (4мкл) субклонують в їмкл плазмід СХрисС19 або Ск/рисС19, оброблених (Ф) лужною фосфатазою бактерій, і вводять в компетентну клітку Е. соїї, УМ109, для утворення тарнсформанту.
ГІ Трансформант культивують протягом ночі в Змл середовища 2ХУТ, що містить 50мкг/мл ампіциліну. Виділену з клітинної фракції плазміду очищають за допомогою набору для очищення плазмід ОІАргер (ОІАСЕМ). Отримані бо Таким чином дві плазміди відповідно названі "ЖМВС1 )у/рост1те" ії "мМвВсС1ЦкурОст1о9",
Кожну з плазмід МВС1| (5)/рОС19 ії МВС курисС19 розщеплюють ЕсокіІ і піддають електрофорезу в 390 низькоплавкому агарозному гелі. Фрагмент ДНК довжиною 743 пари основ виділяють і очищають від гелю за допомогою набору СЕМЕСІ ЕАМ 1! (ВІО1О1), а потім розчиняють в 1Омкл розчину, що містить 10мММ трис-НСЇІ (рн 7,4) і 1ММ ЕОТА. 65 Експресуючий вектор (плазміда НЕР-РМІК-ЯК) (2,7мкг) розщеплюють ЕсокКіІ, екстрагують фенолом і хлороформом і збирають ДНК, проводячи осадження етанолом. Фрагмент ДНК обробляють лужною фосфатазою бактерій і піддають електрофорезу в 195 низькоплавкому агарозному гелі. Фрагмент ДНК довжиною 6561 пара основ виділяють і очищають від гелю за допомогою набору ЗЕМЕСІ ЕАМ І (ВІО101). Очищений
Фрагмент ДНК розчиняють в 1Омкл розчину, що містить Т0мММ трис-НСЇ (рН 7,4) і 1МмМ ЕОТА.
Вектор НЕБЕ (2мкл), оброблений лужною фосфатазою бактерій, лігують з Фрагментом Есокі (Змкл) кожної з плазмід МВС1(Х)/рОсС19 і МВС (курОсС19. Продукт літування вводять в компетентну клітку Е. соїї, УМ109, для утворення тарнсформанту. Трансформант культивують в 2мл середовища 2ХУТ, що містить 5Омкг/мл ампіциліну. Виділену з клітинної фракції плазміду очищають за допомогою набору для очищення плазмід
ОПІАргер (ОІАСЕМ). 70 Очищену плазміду розщепляють в 20мкл реакційного розчину, що містить 20мММ трис-НСІ (рН 8,5), 10мММ
МасІ», їмМ ОТТ, 100мММ КС, 8 одиниць Ніпаїїї (Такага Зпйиго Со., Це) ії 2 одиниці Руці (ТаКага 5п!иг2о Со.,
Ца)), при температурі 372 протягом 1 години. У результаті виконання цієї реакції отримують розщеплені фрагменти довжиною 5104/2195 пар основ, якщо фрагмент введений з правильною орієнтацією, і розщеплені фрагменти довжиною 4378/2926 пар основ, якщо фрагмент введений із зворотною орієнтацією. Плазміда, у якої 75 підтверджена наявність фрагмента з правильною орієнтацією, названа "МВСТ1І( Хупео" для плазміди
МВС1Ц0)рОст19 або "МВС (к)/пео" для плазміди МВС1І ()/рОст19. (4) Трансфекція клітки СО5-7
Щоб визначити антигензв'язуючу і нейтралізуючу активність химерних антитіл, отримані вище експресуючі плазміди окремо тимчасово експресують в клітці СО5-7.
Тимчасову експресію химерних антитіл здійснюють, використовуючи комбінації плазмід МВСТЯНнКДНК/рсСо51 і
МВС (дупео і плазмід МВСТНнкКДНнК/рСоІ і МВС (ку/пео, шляхом котрансфекції клітки СО5-7 плазмідами електропорацією за допомогою електроїмпульсного пристрою Сепе Риїзег (Віо Кай). Для цього плазміди (по 10мкг кожні) додають до суспензії кліток СО5-7 (0,вмл; 1х107кліток/мл) в РВ5(-). Отриманий розчин піддають впливу імпульсів при електростатичній місткості 15008 і силі струму 2мкф, щоб викликати електропорацію. ЄМ 259 Електропоровані клітки витримують протягом 10 хвилин при кімнатній температурі, суспендують в Ге) модифікованому за способом Дульбекко середовищі Голка (ОМЕМ), що містить 295 плідну телячу сироватку з ультранизьким вмістом дС (СІВСО), і культивують в 10см чашці в інкубаторі з СО». Після культивування протягом 72 годин культуральний супернатант збирають, центрифугують для видалення клітинного дебрису і використовують як зразок для подальшого твердофазного імуноферментного аналізу (ЕГІЗА). При виконанні цієї о процедури очищення химерного антитіла від культурального супернатанту кліток СО5-7 проводять за со допомогою набору Айіде! Ргоївіп А МАРЗІЇ! (ВІО Кад) відповідно до прикладених до нього інструкцій. (5) Твердофазний імуноферментний аналіз (ЕП ІЗА) -- (Ї) Визначення концентрації антитіл «
Планшет для ЕЇІЗА, призначений для визначення концентрації антитіл, готують таким чином. Всі ямки
Зо 9б-ямкового планшета для ЕГ ІЗА (Махізогр, МОМС) покриває 100мкл буфера для сенсибілізації поверхонь (001М в. розчин Мансоз, 0,0295 МаНз), що містить Імкг/мл антитіла кози проти (ДО людини (ТАСО), і блокують 200мкл буфера для розведення |(ХОММ трис-НСІ, 1ММ МОасІ 5, 0,1М Масі, 0,0595 твину-20, 0,0295 Мам», 1906 бичачого сироваткового альбуміну (ВЗА); рН 7,21. У всі ямки додають серійні титри культурального супернатанту кліток «
Со5-7, у яких були експресовані химерні антитіла, або серійні титри самих химерних антитіл в очищеному вигляді. Вміст ямок інкубують при кімнатній температурі протягом 1 години і промивають сумішшю РВ5 твин-20. о) с У кожну ямку додають 100мкл розчину кон'югованих з лужною фосфатазою антитіл кози проти ЇДО людини "» (ТАСО). Вміст планшета інкубують при кімнатній температурі протягом 1 години, промивають сумішшю РВ5 " твин-20 і в кожну ямку додають мг/мл розчину субстрат ("Зідта104", п-нітрофенілфосфорна кислота, ЗІЗМА).
Щоб визначити концентрацію антитіл, у отриманого розчину вимірюють оптичну щільність при 4О5нм, використовуючи апарат для прочитання мікропланшетів (ВІО Кай). В якості еталону при виконанні цього - вимірювання використовують очищений Ни дос, (сайт зв'язування). їз (і) Визначення антигензв'язуючої здатності
Планшет для ЕГІ5А, для визначення антигензв'язуючої здатності, готують таким чином. Всі ямки 9б-ямкового - планшета для ЕГІЗА покривають 10О0мкл буфера для сенсибілізації поверхонь, що містить 1Імкг/мл РТНгР
Га 20 людини (1-34) (Реріїде Резеагсп Іпвійціє), і блокують 200мкл буфера для розведення. У всі ямки додають серійні титри культурального супернатанту кліток СО5-7, в яких були експресовані химерні антитіла, або о серійні титри самих химерних антитіл в очищеному вигляді. Вміст ямок інкубують при кімнатній температурі і промивають сумішшю РВЗ і твину-20, після чого в кожну ямку додають 100мкл розчину кон'югованих з лужною фосфатазою антитіл кози проти їдб людини (ТАСО). Вміст планшета інкубують при кімнатній температурі, промивають сумішшю РВЗ і твину-20 і в кожну ямку додають мг/мл розчину субстрату ("Зідта104",
ГФ) п-нітрофенмлфосфорна кислота, БІОМА). У отриманого розчину вимірюють оптичну щільність при 4О5нм, використовуючи апарат для прочитування мікропланшетів (ВІО Кад). ді Результати цього аналізу показують, що химерні антитіла володіють здатністю зв'язування з РТНГР людини (1-34), і М-області клонованого антитіла миші мають правильні структури (Фіг.5). Крім того, встановлено, що 60 не існує відмінностей відносно здатності зв'язування з РТНГР (1-3 4) між химерним антитілом, що має
С-область у-ланцюга І -ланцюга, і химерним антитілом, що має С-область к-ланцюга І -ланцюга. Тому С-область
І-ланцюга олюдненого антитіла конструюють з використанням ;-ланцюга І -ланцюга олюдненого антитіла. (6) Створення лінії кліток СНО, здатної стабільно продукувати химерні антитіла.
Щоб створити лінію кліток, здатну стабільно продукувати химерні антитіла, отримані вище експресуючі бо плазміди вводять в клітки СНО (ОХВ 11).
Для отримання лінії кліток, здатної стабільно продукувати химерні антитіла, можна використати будь-яку з наступних комбінацій експресуючих плазмід для кліток СНО: МВСІНКкДнНкК/рсСнНОї і МВС Хупео; і
МВСТНКДнНКреСнНОТ і МВС (к)у/пео. Ці плазміди котрансфеціюють в клітці СНО електропорацією за допомогою електроїмпульсного пристрою Сепе РиїЇзег (ВІО Кай). Всі експресуючі вектори по окремості розщеплюють рестрикційним ферментом Руцші для отримання лінійної ДНК. Отриману ДНК екстрагують фенолом і хлороформом і збирають, проводячи осадження етанолом. Отримані таким чином плазмідні ДНК піддають електропорації. Для цього плазмідні ДНК (по 1Омкг кожної) додають до 0,8мл суспензії кліток СНО в РВО(-) (110 "кліток/мл). Отриманий розчин піддають впливу імпульсів при електростатичній місткості 15008 і силі 70 струму 25мкф. Електропоровані клітки витримують при кімнатній температурі протягом 10 хвилин і суспендують в середовищі МЕМ-о (БІВСО), що містить 1095 фетальну телячу сироватку (БІВСО). Отриману суспензію культивують на трьох 9б-ямкових планшетах (Раісоп) в інкубаторі з СО 5. Наступного дня після початку культивування це середовище замінюють селективним середовищем |середовище МЕМ-о, без рибонуклеозиду або дезоксирибонуклеозиду (СІВСО), що містить 1095 фетальну телячу сироватку (СІВСО) і 5ООмг/мл 19 СЕМЕТІСІМ (54185101ае; СІВСО)). З культурального середовища відбирають клітки, в які був введений ген антитіла. Селективне середовище замінюють свіжим середовищем. Через два тижні після заміни середовища клітки досліджують під мікроскопом. У клітках, що характеризуються задовільним ростом, визначають кількість продукованих антитіл вищеописаним способом ЕГІЗА. Досліджують клітки, продукуючі найбільшу кількість антитіл.
Підвищення рівня культури отриманої лінії кліток, здатної стабільно продукувати антитіла, проводять у флаконі, що обертається, з використанням мінімального підтримуючого середовища (МЕМ) без рибонуклеозиду або дезоксирибонуклеозиду, що містить 295 плідну телячу сироватку з ультранизьким вмістом до. На З-ий і 4-ий день культивування культуральний супернатант збирають і фільтрують через фільтр з розміром пор 0,2мкм (МіШіроге), щоб видалити клітинний дебрис. с
Химерні антитіла очищають від культурального супернатанту кліток СНО в колонці РОКО5, заповненій (3 білком А (Регзеріїме Віозузіетев), на СопЗер І С100 (Мійіроге) відповідно до прикладених інструкцій. Очищені химерні антитіла використовують як зразки для визначення нейтралізуючої активності і для дослідження лікувальної дії на тваринних моделях гіперкальціємії. Концентрацію і антигензв'язуючу активність очищених химерних антитіл визначають за допомогою аналогічної системи ЕГ ІЗА, як це описувалося вище. о
ІПосилальний приклад 41 со
Конструювання олюдненого антитіла (1) Конструювання Н-ланцюга олюдненого антитіла -- (Ї) Конструювання олюдненої М-області Н-ланцюга «Її
Н-ланцюг олюдненого антитіла Мо23-57-137-1 отримують шляхом трансплантації гіперваріабельної дільниці за способом РСВ. Щоб отримати Н-ланцюг олюдненого антитіла Мо23-57-137-1 (варіант "а"), що має каркасні - області, виділені з антитіла людини 531679 (МВКЕ-РОВ; Сиізіпіег, А.М. еї аІ., Еиг. 9. Іттипої., 23, 110-118, 1993), використовують наступні шість типів затравок для полімеразної реакції синтезу ланцюга: затравки для трансплантації гіперваріабельних дільниць МВСТНОР1 (5ЕО ІО Мо23) Її МВСТНОРЗ (5ЕО ІЮ Мо24) (обидві містять « смислову послідовність ДНК) ії МВСІТНОР2 (ЗЕБЕО І Мо255 їі МВСІНОРА (5ЕБО І Мо26) (обидві містять З 70 антисмислову послідовність ДНК), які з обох кінців мають комплементарну послідовність довжиною 15-21 пар с основ; зовнішні затравки МВСТНМ51 (5ЕБЕО ІЮ Мо27) і МВСІНМКІ (5ЕО ІЮ Мо28), які відповідно гомологічні з» затравкам для трансплантації гіперваріабельних дільниць МВСТНОРІ і МВСТНО Рі.
Затравки для трансплантації гіперваріабельних дільниць МВСТНОРІ, МВСІТНОР2, МВСЯТНОРЗ і МВСЯ1НО РА виділяють за допомогою денатурованого сечовиною поліакриламідного гелю (МоїЇесціаг Сіопіпд: А І арогагу
Мапиаї, ЗатрьгоокК, еї аІ.,, Со Зргіпд Нагрог І арогаїогу Ргезз, 1989) і екстрагують способом подрібнення і і вимочування (Моіесціаг Сіопіпд: А І арогаїогу Мапиа!Ї, ЗатргоокК, еї аїЇ., Соїй Зргіпд Нагброг І арогаїогу Ргезв, «г» 1989) таким чином. з Кожну із затравок для трансплантації гіперваріабельних дільниць (1 нмоль) виділяють на 69о денатурованому поліакриламідному гелі з отриманням фрагментів ДНК. З отриманих фрагментів ДНК вибирають фрагмент оз 20 необхідної довжини, який ідентифікують на тонкій пластині силікагелю, що опромінюється ультрафіолетом, і виділяють його способом подрібнення і вимочування. Отриману ДНК розчиняють в 20мкл розчину, що містить с 10мММ трис-НСЇ (рН 7,4) і 1мМ ЕОТА. Полімеразну реакцію синтезу ланцюга здійснюють з використанням ТаКакКа
ЕХ Тад (Такага Зп!йг2о Со., Ца,). Реакційний розчин (10Омкл) для полімеразної реакції синтезу ланцюга містить по їмкл вищезгаданих затравок для трансплантації гіперваріабельних дільниць МВСІНОРІ, МВС1ТНОР, 25 МВСІНОРЗі МВСТНОРА, 0,25мМ амте і 2,5 одиниці ТаКаКа Ех Тая в буфері. Виконують 5 циклів полімеразної
ГФ) реакції синтезу ланцюга в наступних умовах: 942 протягом 1 хвилини, 552С протягом 1 хвилини і 7222 протягом т 1 хвилини. До отриманого реакційного розчину додають зовнішні затравки МВСЯІНМ51 і МВСЯНМКІ1 (по
БОпмолей кожної). Використовуючи цю реакційну суміш, виконують ще 30 циклів полімеразної реакції синтезу ланцюга в тих же умовах. Ампліфікований таким чином фрагмент ДНК виділяють електрофорезом в агарозному 60 геліз використанням 495 агарози Ми Біеме СТО (ЕМО Віо. Ргодисів).
Потім вирізають дільницю агарози, що містить фрагмент ДНК довжиною 421 пара основ, і очищають вказаний фрагмент ДНК за допомогою набору СЕМЕСІ ЕАМІ! (ВІО101) відповідно до прикладених до нього інструкцій.
Очищений фрагмент ДНК осаджують етанолом і розчиняють в 20мкл розчину, що містить 10мММ трис-НСЇ (рН 74) ії мМ ЕОТА. Реакційну суміш для полімеразної реакції синтезу ланцюга використовують для субклонування бо цього фрагмента ДНК в плазміді рОС19, яка була приготована шляхом розщеплення Ватні і Ніпаї, після чого визначають нуклеотидну послідовність отриманої плазміди. Плазміда що має правильну нуклеотидну послідовність, названа "иМВСНмУ/руст19", (ї) Конструювання М-області Н-ланцюга для кКДНК олюдненого Н-ланцюга. Щоб зробити літування з кКДНК для олюдненої Су1 С-області Н-ланцюга, ДНК для олюдненої М-області Н-ланцюга, сконструйовану на попередньому етапі, модифікують за способом РСК. Для цього конструюють нижню затравку МВСІ1НМ52 таким чином, щоб вона гібридизувала з послідовністю, що кодує 5'-кінцеву область лидерної послідовності М-області, мала узгоджену послідовність Козака (Когак еї аї., 9. Мої. Віої. 196, 947-950, 1987) і Ніпай- ЄЕсокКіІ-впізнаючі послідовності. Верхню затравку МВСТНМУКО конструюють таким чином, щоб вона гібридизувала з послідовністю 7/0 ДНК, що кодує 3'-кінцеву область .--області, і з послідовністю ДНК, що кодує 5-кінцеву область С-області, і мала АїЇаї!- і Заті-впізнаючі послідовності.
Полімеразну реакцію синтезу ланцюга виконують з використанням ТаКаКа Ех Тад (Такага Зп!иг2о Со., Це.) і відповідного буфера. Реакційний розчин для полімеразної реакції синтезу ланцюга містить 0,4мкг яМВсСНУрисСт9 в якості матриці ДНК, по 5опмолей затравок МВСТНМУЗ2 і МВСТНУК, 2,5 одиниці ТаКакКа Ех 7/5 Тад і 025мМ амМтТР в буфері. Виконують 30 циклів полімеразної реакції синтезу ланцюга в наступних умовах: 942С протягом 1 хвилини, 559 протягом 1 хвилини і 722С протягом 1 хвилини.
Ампліфікований таким чином фрагмент ДНК виділяють електрофорезом в агарозному гелі з використанням
З9о агарози Ми Зіеме СТО (ЕМС Віо. Ргодисів).
Вирізають дільницю гелю, що містить фрагмент ДНК довжиною 456 пар основ, і очищають вказаний фрагмент від гелю за допомогою набору ЗЕМЕСІЕАМІІ (ВІО 101) відповідно до прикладених до нього інструкцій.
Очищений фрагмент ДНК осаджують етанолом і розчиняють в 20мкл розчину, що містить 10мММ трис-НСЇ (рН 74) і їмММ ЕОТА. Реакційну суміш, отриману внаслідок здійснення полімеразної реакції синтезу ланцюга, використовують для субклонування фрагмента ДНК в плазміді рОС19, яка була приготована шляхом розщеплення ЕсоКіІ і Зтаї, після чого отриману плазміду секвенують. У результаті отримують плазміду, що Ге містить ДНК, що кодує М-область Н-ланцюга миші, виділену з гібридоми Мо23-57-137-1, і маючу Есокі- і о
Ніпапі-впізнаючі послідовності, послідовність Козака в 5-кінцевій області і АраІ- і Зтвваі-впізнаючі послідовності в З3'-кінцевій області, яка названа "иМВС1Нм/руст19", (2) Конструювання експресуючого вектора для Н-ланцюга олюдненого антитіла
Плазміду КМп-РМІКДНК, що містить послідовність КДНК Н-ланцюга антитіла ПРМІ, розщеплюють Ара! і Ватні «(з з отриманням фрагмента ДНК, що містить ДНК, кодуючу С-область Н-ланцюга. Цей фрагмент ДНК вводять в плазміду ЯМВСТНм/риС19, яка була приготування шляхом розщеплення Араї і ВатНі. Отримана плазміда о названа "иИМВСЯТНКкДНК/рисСт19". Ця плазміда містить ДНК, що кодує М-область Н-ланцюга олюдненого антитіла че мо23-57-137-1, і ДНК, що кодує Су! С-області Н-ланцюга людини, має Есокі- і НіпаП-впізнаючі послідовності в 5-кінцевій області і ВатнНі-впізнаючу послідовність в 3'-кінцевій області. Нуклеотидна послідовність і ч відповідна амінокислотна послідовність олюдненого Н-ланцюга варіанту "а", АМВСЯТНкКДнкК/рОсС19, що є в ї- плазміді, показані відповідно в зЕО ІЮ Мо58 і БЕО І Мо56.
Плазміду НМВСТНКДНК/риС19 розщеплюють Есокі і Ватні з отриманням фрагмента ДНК, що містить ДНК, кодуючу Н-ланцюг. Цей фрагмент ДНК вводять в експресуючу плазміду РСО51, яка була приготована шляхом « розщеплення ЕсокКіІ і ВатНіІ. У результаті отримують експресуючу плазміду для олюдненого антитіла, яка названа "иИМВСТнКкДНнНК/рСо51". - с Щоб отримати плазміду для експресії в клітці СНО, плазміду АЯМВСТНКДНК/риС19 розщеплюють Есокі і и Ватні з отриманням фрагмента ДНК, що містить ДНК, кодучу Н-ланцюг. Цей фрагмент ДНК вводять в є» експресуючий вектор рСНОЇ, який був приготований шляхом розщеплення Есокі і ВатнНі. У результаті отримують експресуючу плазміду для олюдненого антитіла, яка названа "ЛМВСТ1нкДнНкК/рсСнОТ". (3) Конструювання гібридної М-області І -ланцюга -і (Ї) Отримання гібридного антитіла ЕК1,2/ЕКЗ, 4 їх Конструюють ген для гібридного І -ланцюга каркасної області, що містить як каркасні області з олюдненого антитіла, так і каркасні області з (химерного) антитіла миші, і оцінюють вказані області відносно їх -- придатності для олюднення. На цьому етапі отримують гібридне антитіло, що містить ЕК1 і ЕК2, виділені з сю 50 антитіла людини, і ЕКЗ і ЕК4, виділені з антитіла миші, використовуючи сайт рестрикції АТІЇ, розташований в
Ссока. 62 Плазміди МВС1І (Х)/пео і МВС (Х)/пео (по 1Омкг кожної) окремо розщеплюють в 10Омкл реакційного розчину, що містить 10мММ трис-НСЇ (рН 7,5), 10мММ Мосі», їмМ ОТТ, 50мМ Масі, 0,0195 (у відношенні ваги до об'єму) бичачого сироваткового альбуміну і 10 одиниць АЙЇЇ (Такага Зййиго Со., Ца.), при температурі 3720 22 протягом 1 години. Реакційні розчини піддають електрофорезу в 295 низькоплавкому агарозному гелі з
ГФ! отриманням фрагментів ДНК довжиною 6282 пари основ (визначаються як "с1") ії довжиною 1022 пари основ (визначаються як "с2") з плазміди МВС! (Х)/пео або фрагменти ДНК довжиною 6282 пари основ, (визначаються ді як "п1") ї 1022 пари основ (визначаються як "п2") з плазміди АМВСТІ( Х)/пео. Ці фрагменти ДНК збирають і очищають від гелю за допомогою набору ЗЕМЕСІ ЕАМІ! (ВІО101). 60 Всі фрагменти с1 і п1 (мкг) обробляють лужною фосфатазою бактерій (ВАР). Фрагмент ДНК екстрагують фенолом і хлороформом, осаджують етанолом і розчиняють в 1Омкл розчину, що містить Т0мММ трис-НСЇ (рН 7,4) і 1ММ ЕОТА.
Фрагменти ДНК ст їі п1 (по їмкл кожного), оброблені лужною фосфатазою бактерій, лігують відповідно з фрагментами ДНК йп2 і с2 (по 4мкл кожного) (при температурі 49С протягом ночі). Всі продукти літування бо вводять в компетентну клітку Е. соїї, УМ109, для утворення тарнсформанту. Трансформант культивують в 2мл середовища 2ХУТ, що містить 5Омкг/мл ампіциліну. Виділену з клітинної фракції плазміду очищають за допомогою набору для очищення плазмід ОІАргер (ОІАСЕМ).
Очищену плазміду розщеплюють в 20мкл реакційного розчину, що містить Л0ММ трис-НСЇІ (рН 7,5), 10ММ
Масі», 1мм ТТ, і або 2 одиниці Араї!! (Такага Зпиго Со., Ца.) або 8 одиниць Ватні (ТаКага 5пиго Со., Це) і Ніпан (Такага 5п!йиго Со., Ца.), при температурі 372С протягом 1 години. Якщо фрагмент сі-п2 був лігований правильно, внаслідок цієї реакції розщеплення повинні бути отримані фрагменти довжиною 5560/1246/498 пар основ (розщеплення Араї! І) або фрагменти довжиною 7134/269 пар основ (розщеплення Ватні/ніпайї). На основі цього припущення ідентифікують необхідні плазміди. 70 Експресуючий вектор, що кодує І-ланцюг гібридного антитіла людини ЕКіІ2миші ЕКЗ, 4, названий "п/тТМВСт11І (Х)/пео". З іншого боку, не можна отримати клон для п1-с1. Тому проводять рекомбінацію на векторі рис і отриманий рекомбінантний продукт клонують у векторі НЕР. В якості матриць використовують плазмі ду
МВС аурист19, яка містить ДНК, що кодує М-область І -ланцюга олюдненого антитіла без заміни амінокислот, і плазміду ЯМВСЛТІ 45/рисС19, яка містить ДНК, що кодує М-область І -ланцюга олюдненого антитіла із заміною 75 амінокислоти в положенні 91 каркасної області ЕКЗ, тирозину (амінокислота Мо87 відповідно до визначення
Кабата), ізолейцином.
Плазміди МВС! (5)урОсС19, ЯМВСлІ ах/рОС19 ії МВС ах/рОсС19 (по 1Омкл кожної) окремо розщеплюють в
ЗОмкл реакційного розчину, що містить 1Л0мММ трис-НСІ (рН 7,5), 10мММ Масі», мМ ОТТ, 50мММ Масі, 0,0196 (у відношенні ваги до об'єму) бичачого сироваткового альбуміну, 16 одиниць Ніпаїй ії 4 одиниці АЙ, при температурі 372С протягом 1 години. Реакційні розчини по окремості піддають електрофорезу в 290 низькоплавкому агарозному гелі з отриманням фрагмента ДНК довжиною 215 пар основ з плазміди
МВС 0)у/рОст19 (визначається як "с2") і фрагмента ДНК довжиною 3218 пар основ з кожної з плазмід
МВС ахрист19 ї ЯМВет11 45/р0С19 (визначаються відповідно як "паї" і "на!" Ці фрагменти ДНК збирають і очищають за допомогою набору ЗСЗЕМЕСІ ЕАМІ! (ВІО101). с 29 Фрагменти Ппаг ої па лігують з фрагментом с2 і вводять в компетентну клітку Е. соїї, УМ109, для Ге) утворення тарнсформанту. Трансформант культивують в 2мл середовища 2ХУТ, що містить 5Омкг/мл ампіциліну.
Виділену з клітинної фракції плазміду очищають за допомогою набору для очищення плазмід ОІАргер (ОІАСЕМ).
Плазміда, що містить фрагмент йпа!, названа "тп/пМВСліІ ах/рОС19", і плазміда, що містить фрагмент паї, названа "т/пМВеСт11І ах/руст19", о
Плазміди т/пМВе11І ах/рОС19 і т/пмМВСт1 4у/рОС19 розщеплюють ЕсоКІ. Фрагмент ДНК довжиною 743 пари СО основ обробляють електрофорезом в 295 низькоплавкому агарозному гелі, збирають і очищають від гелю за «- допомогою набору СЕМЕСІ ЕАМІЇ (ВІО101). Отриманий фрагмент ДНК розчиняють в 20мкл розчину, що містить 10мМ трис-НСЇ (рН 7,4) і 1мММ ЕОТА. «
Фрагменти ДНК (по 4мкл кожного) лігують з вищезгаданим вектором НЕРЕ (мкл), обробленим лужною чн фосфатазою бактерій. Продукт літування вводять в компетентну клітку Е. соїї, /М109, для утворення тарнсформанту. Трансформант культивують в 2мл середовища 2ХУТ, що містить 5Омкг/мл ампіциліну. Виділену з клітинної фракції плазміду очищають за допомогою набору для очищення плазмід ОІіІАргер (ОІАСЕМ).
Кожну з очищених плазмід розщеплюють в 20мкл реакційного розчину, що містить 20мММ трис-НСЇ (рН 8,5), « 20 10мММ Масіо, їмМ ОТТ, 100мММ КС, 8 одиниць Ніпай (Такага 5п!йиг2о Со., Це.) і 2 одиниці Руці (ТаКага Зпи2о з с Со., Ца.), при температурі 372С протягом 1 години. Плазмідну ДНК ідентифікують, виходячи з припущення про те, що, якщо фрагмент ДНК введений в плазміду з правильною орієнтацією, то внаслідок розщеплення буде :з» отриманий розщеплений фрагмент довжиною 5104/2195 пар основ, і якщо фрагмент ДНК введений в плазміду із зворотною орієнтацією, то внаслідок розщеплення буде отриманий розщеплений фрагмент довжиною 4378/2926 пар основ. Отримані таким чином плазміди є експресуючими векторами, що кодують І-ланцюг гібридного -І антитіла миші РМ,2/людини ЕКЗ, 4, отримані експресуючі вектори були викликані відповідно "тп/пМВеСл1 ах/пео" і "ФТ/АМВСТІ ах/пео". е (ї) Отримання гібридного антитіла ЕКТ/ЕК2 - Гібридне антитіло ЕКТ/ЕК2 отримують так само, як описано вище, використовуючи сайт рестрикції Зпаві, розташований в СОК1. о Плазміди МВС (Х)/пео і п/тМВсС11(5)/пео (по 1Омкг кожні) окремо розщеплюють в 2Омкл реакційного 2 розчину, що містить 10мММ трис-НСЇ (рН 7,9), 10ММ Мосі», їмМ ОТТ, 50мМ Масі, 0,0195 (у відношенні ваги до об'єму) бичачого сироваткового альбуміну і 6 одиниць ЗпавВі (Такага Зп!иго Со., а), при температурі 372 протягом 1 години. Отримані реакційні розчини далі розщеплюють в 5Омкл реакційного розчину, що містить 20ММ трис-НСІ (рН 8,5), 10ММ МосСі», їмМ ОТТ, 100мММ КСІ, 0,0195 (у відношенні ваги до об'єму) бичачого о сироваткового альбуміну і 6 одиниць Рмиї, при температурі 372С протягом 1 години.
Отримані реакційні розчини по окремості піддають електрофорезу в 1,595 низькоплавкому агарозному гелі, іме) внаслідок чого отримують фрагменти ДНК довжиною 4955 пар основ (т1) і 2349 пар основ (т2) з плазміди
МВСІ(2)/пео і фрагментами ДНК довжиною 4955 пар основ (пті) і 2349 пар основ (пт2) з плазміди 60 п/тМВС11І(Х)/пео. Ці фрагменти ДНК збирають і очищають від гелів за допомогою набору ЗЕМЕСІ ЕАМІЇ (ВІО101). Всі отримані фрагменти ДНК розчиняють в 40мкл розчину, що містить 10мММ трис-НСЇ (рН 7,4) і 1мММ
ЕОТА.
Фрагменти ті і пт (по Тмкл кожні) лігують відповідно з фрагментами пта2 і т2 (по 4мкл кожні). Отримані продукти літування вводять в компетентну клітку Е. соїї, /М109, для утворення тарнсформанту. Отриманий бо трансформант культивують в 2мл середовища 2хУТ, що містить 5Омкг/мл ампіциліну. Виділену з клітинної фракції плазміду очищають за допомогою набору для очищення плазмід ОІАргер (ОІАСЕМ).
Усі очищені плазміди розщеплюють в 20мкл реакційного розчину, що містить 10мММ трис-НСЇ (рН 7,5), 10МмМ
Масі», 1мМ ОТ ії 8 одиниць Араї (Такага Зп!иго Со., Ца.) або 2 одиниці Араї! (Такага Зп!иго Со., Ца.), при температурі 372С протягом 1 години.
Якщо фрагменти ліговані правильно, то внаслідок розщеплення повинен бути отриманий фрагмент довжиною 7304 пари основ (розщеплення Араї) або фрагменти довжиною 5560/1246/498 пар основ (розщеплення Араї! І) для т!1-пт2, і отримані фрагменти довжиною 6538/7666 пар основ (розщеплення Араї) або фрагменти довжиною 3535/2025/1246/498 пар основ (розщеплення Араї! І) для пПті-т2. Плазміди ідентифіковані /о на основі цього припущення. У результаті отримують експресуючий вектор, що кодує І-ланцюг гібридного антитіла людини ЕКіІ/миші ЕКЗ, 3, 4 (названий "нтт МВС (Х3)/пео"), і експресуючий вектор, що кодує І-ланцюг гібридного антитіла миші ЕКТ1/людини ЕК2/миші ЕКЗ, 4 (названий "пптМВвет11І (Х)/пео"). (4) Конструювання І -ланцюга олюдненого антитіла
Ї-ланцюг олюдненого антитіла Мо23-57-137-1 отримують шляхом трансплантації гіперваріабельної дільниці 75 за способом РСК. Для отримання І-ланцюга олюдненого антитіла Мо23-57-137-1 (варіант "а"), який містить області ЕК, ЕКЗ і ЕКЗ, виділені з антитіла людини НЗООЗ868 (ЗЕМ-ВАМК, Оейозв, М. еї аї!., Зсапа. .. Ітіацйпої, 39, 95-103, 1994), і область ЕК4, виділену з антитіла людини 525755 (МВКЕ-РОВ), використовують шість затравок для РОК.
Цими шістьма затравками є: затравки для трансплантації гіперваріабельних дільниць МВСТІ ОРІ (ЗЕО ІЮ Мо29) і МВСЛІ ОРЗ (5ЕБО ОО Мо30), що містять смислову послідовність ДНК, затравки для трансплантації гіперваріабельних дільниць МВСТІ ОР2 (ЗЕО ІЮО Мо31) і МВСЛІ РА (5ЕО ІЮ Мо32), що містять антисмислову послідовність ДНК, які мають з обох кінців комплементарну послідовність довжиною 15-21 пара основ; і зовнішні затравки МВС1І М51 (ЗЕО ІЮ Мо33) ії МВСЛІ МК (ЗЕО ІО Мо34), які гомологічні затравкам для трансплантації гіперваріабельних дільниць МВСЛІ ОРІ ії МВСЛІ ОРА відповідно. Ге
Затравки для трансплантації гіперваріабельних дільниць МВСТІ РІ, МВСТІ ЗР2, МВСЛІ ОРЗ Її МВСЛІ РА о виділяють за допомогою денатурованого сечовиною поліакриламідного гелю (МоїЇесціаг Сіопіпд: А І арогагу
МапиаїЇ, ЗатбгооК еї аї., Со бргіпд Нагрог І арогаїогу Ргезв, 198 9) і екстрагують способом подрібнення і вимочування (Моїіесціаг Сіопіпд: А І арогаїюгу Мапиаї, затьгоок еї а!., Соїа Зргіпд Нагброг І арогаїогу Ргезз, 1989).
Всі затравки для трансплантації гіперваріабельних дільниць (Інмоль) виділяють за допомогою 690 (ав) денатурованого поліакриламідного гелю. Фрагменти, ДНК необхідної довжини ідентифікують на тонкій пластині силікагелю, що опромінюється ультрафіолетом. Необхідний фрагмент ДНК збирають з гелю способом о подрібнення і вимочування. Зібраний фрагмент ДНК розчиняють в 20мкл розчину, що містить 10мМ трис-НСЇІ (рн ч-- 7,4) і 1ММ ЕОТА.
Полімеразну реакцію синтезу ланцюга здійснюють, використовуючи ТаКакКа Ех Таяд (ТаКага Зп!иго Со., Ца.) і З відповідний буфер. Реакційний розчин для полімеразної реакції синтезу ланцюга (на 10Омкл) містить по Тмкл ї- затравок для трансплантації гіперваріабельних дільниць МВСТЛІ ОРІ, МВСЛІ ОР, МВСТІ СРЗ ії МВСЛІ Ра, 0,25мМ амтР і 2,5 одиниці ТаКакКа Ех Тад в буфері. Виконують 5 циклів полімеразної реакції синтезу ланцюга в наступних умовах: 942 протягом 1 хвилини, 55923 протягом 1 хвилини і 722С протягом 1 хвилини. У отриману « реакційну суміш додають по Б5Опмолей зовнішніх затравок МВС1І/М51 і МВСТЛІМК1. Використовуючи цю реакційну суміш, виконують ще 30 циклів полімеразної реакції синтезу ланцюга в тих же умовах. Ампліфікований - с фрагмент ДНК виділяють електрофорезом в агарозному гелі з використанням З9о агарози Ми Зіеме СТО (ЕМО и Віо. Ргодисів). є» Вирізають дільницю агарози, що містить фрагмент ДНК довжиною 421 пари основ, і очищають вказаний фрагмент ДНК за допомогою набору СЕМЕСІ ЕАМІЇ (ВІО101) відповідно до прикладених до нього інструкцій.
Отриману таким чином реакційну суміш для полімеразної реакції синтезу ланцюга використовують для -і субклонування цього фрагмента ДНК в плазміді рОС19, яка була приготована" шляхом розщеплення Ватні і їх Ніпаїїї. Отриману плазміду секвенують. Вказана плазміда названа "яиМВСІ/рОсС19". Однак в цій плазміді амінокислота в положенні 104 (амінокислота Ме96 відповідно до визначення Кабата) гіперваріабельної дільниці - СОКа4 замінена аргініном. Щоб замінити цю амінокислоту тирозином, конструюють і синтезують коректуючий сю 50 затравку МВСТЛІ СРІТОК (5ЕО ІЮ Мо35). Потім здійснюють полімеразну реакцію синтезу ланцюга, використовуючи
ТаКаКа Ех Тад (Такага Зп!иго Со., а.) і відповідний буфер. Реакційний розчин для полімеразної реакції 62 синтезу ланцюга (на 10Омкл) містить О0,бмкг плазміди АИМВСІ/рОсС19 в якості матричної ДНК, по 5Опмолей затравок МВС1І М51 і МВСЛІ СРІОК, 2,5 одиниці ТаКакКа Ех Тад (Такага Зп!й2о Со., Ца.) і 0,25мММ амктТРе в буфері, понад якого вміщують шар мінерального масла (5Омкл). Виконують 30 циклів полімеразної реакції синтезу ланцюга в наступних умовах: 942С протягом 1 хвилини, 5523 протягом 1 хвилини і 72 «С протягом 1 хвилини.
Ге! Ампліфікований фрагмент ДНК виділяють електрофорезом в агарозному гелі, використовуючи 395 агарозу Ми
Зіеме СТО (ЕМО Віо, Ргодисів). де Вирізають дільницю гелю, що містить фрагмент ДНК довжиною 421 пара основ, і очищають цей фрагмент від гелю за допомогою набору СЕМЕСІ ЕАМІЇ (ВІО101) відповідно до прикладених до нього інструкцій. Отриману 60 реакційну суміш для полімеразної реакції синтезу ланцюга використовують для субклонування фрагмента ДНК в плазміду рОС19, яка була приготована шляхом розщеплення Ватні і НіпайЇЇ.
Плазміду секвенують, використовуючи затравки М1З3 Ргітег М4 і М1З3 Ргітег КМ. Отримані результати підтверджують, що плазміда має правильну послідовність. Цю плазміду розщеплюють Ніпай і Віпі ії виділяють фрагмент ДНК довжиною 416 пар основ електрофорезом в 195 агарозному гелі. Цей фрагмент ДНК очищають за 65 допомогою набору СЕМЕСІ ЕАМІЇ! (ВІО101) відповідно до прикладених до нього інструкцій і вводять в плазміду
Сх/рОС, яка була приготована шляхом розщеплення Ніпаїйї і Віпі. Отримана плазміда названа "МВС ах/рОС19". Цю плазміду розщеплюють ЕсоК!І з отриманням фрагмента ДНК, що кодує олюднений
Ї-ланцюг. Отриманий фрагмент ДНК вводять в плазміду рСО5Б1 так, щоб ініціюючий кодон олюдненого І-ланцюга розташовувався внизу від промотору ЕЕ! о. Отримана таким чином оплазміда названа "МВС ах/рСО51". Послідовність ДНК (включаючи відповідну амінокислотну послідовність) олюдненого
Ї ланцюга (варіант "а") показана в ЗЕО ІЮ Мобб. Амінокислотна послідовність варіанту "а" показана також в ЗЕО
ІО Мо47.
Олюднений І -ланцюг варіанту "Б" отримують мутагенезом за способом РОК. Варіант "р" конструюють таким 70 чином, щоб замінити амінокислоту в положенні 43, гліцин (амінокислота Мо43 відповідно до визначення Кабата), проліном і амінокислоту в положенні 49, лізин (амінокислота Мо49 відповідно до визначення Кабата), аспарагіновою кислотою у варіанті "а". Полімеразну реакцію синтезу ланцюга здійснюють з використанням плазміди АМВСТІ алї/рОС19 в якості матриці, мутагенної затравки МВСТЛІОРБОК (ЗЕБО ІЮО Мо3б) і затравки
МВС1ІМ51. Отриманий фрагмент ДНК розщеплюють Ватні і Ніпаїй і розщеплений фрагмент субклонують в сайті Ватні-Ніпа! плазміди рОС19. Плазміду секвенують і розщеплюють Ніпай|йї і АТ, після чого отриманий розщеплений фрагмент лігують з плазмі дою ПМВС1І ал/риС19, яка була приготована шляхом розщеплення
Ніпані і АЯІЇ.
Отримана плазміда названа "НМВС11 55/рОС19". Цю плазміду розщеплюють ЕсокКіІ з отриманням фрагмента
ДНК, що містить ДНК, кодуючу олюднений І -ланцюг. Вказаний фрагмент ДНК вводять в плазміду рСО51 так, щоб ініціюючий кодон олюдненого І-ланцюга знаходився внизу від промотору ЕЕ1 я. Отримана таким чином плазміда названа "МВС 5БХ/рсоз1".
Олюднений І -ланцюг. варіанту "с" отримують мутагенезом за способом РОК. Варіант "с" конструюють таким чином, щоб замінити амінокислоту в положенні 84, серії (амінокислота Мо80 відповідно до визначення Кабата), проліном. Полімеразну реакцію синтезу ланцюга здійснюють з використанням плазміди ЯМВСЛІ а 7/рОС19 в с якості матриці, мутагенної затравки МВСТІ СРБЗ (ЗЕО ІЮ Мо37) і затравки М1З Ргітег ЕМ. Отриманий фрагмент (3
ДНК розщеплюють Ватні і Ніпай! і субклонують в плазмі ді рОС19, яка була приготована шляхом розщеплення
Ватні і Ніпагйії.
Після секвенування плазміду розщеплюють ВвіРІ і АогО1НІ і отриманий фрагмент ДНК лігують з плазмідою
МВС ах/рОсС19, яка була приготована шляхом розщеплення ВвіРІ ії Аого1НІ. Отримана плазміда названа о "МВС су/рОс19", Цю плазміду розщеплюють ЕсоКіІ з отриманням фрагмента ДНК, що містить ДНК, кодуючий -«О олюднений І-ланцюг. Цей фрагмент вводять в сайт ЕсоК!І плазміди рСО51 так, щоб ініціюючий кодон «- олюдненого І-ланцюга знаходився внизу від промотору ЕЕ1 у. Отримана таким чином плазміда названа "МВС сх/рСо51". «
Олюднений І -ланцюг варіантів "а", "е" і" також отримують мутагенезом за способом РСК. Варіанти "а Мк. "еб і конструюють шляхом заміни відповідно у варіантах "а", "р" і "с" амінокислоти в положенні 91, тирозину (амінокислота Мо87 відповідно до визначення Кабата), ізолейцином. Для отримання варіантів "а", "е" і "У" полімеразну реакцію синтезу ланцюга здійснюють з використанням в якості матриці відповідно плазмід
МВС ау/рСо51 (для варіанту "а", ЯИМВС11 5 5/рСоО51 (для варіанту "е") і РМВСЛІ с 7/рсСо51 (для варіанту « 40"), мутагенної затравки МВСЛІ СРІ1Е (ЗЕО ІЮ Мо38) і затравки М-5І (ЗЕО ІЮ Мо44). Отриманий фрагмент ДНК Ще) с розщеплюють Ватні і Ніпай ії субклонують в плазміді рОС19, яка була приготована шляхом розщеплення Ватні і ц НіпаїІї. Після секвенування цю плазміду розщеплюють Ніпайі їі ВіІпі ії розщеплений фрагмент лігують з плазмідою "» Су/рист19, яка була приготована шляхом розщеплення Ніпайі! і Віпі.
Отримані плазміди відповідно названі "ЛМВСЛ1І ах/рОС19" (для варіанту "а," МВС Гех/рОС19" (для варіанту "е") і" ЯМВСТІ б/роОст19" (для варіанту "Г). Всі ці плазміди розщеплюють ЕсокіІ з отриманням фрагмента - ДНК, що містить ДНК, кодуючу олюднений І -ланцюг. Цей фрагмент ДНК вводять в сайт ЕсокіІ плазміди рСО51 їз так, щоб ініціюючий кодон олюдненого І-ланцюга знаходився внизу від протомора ЕЕ1 у, плазміди. Отримані таким чином плазміди названі "иИМВСТІ ах/рСо51" (для варіанту "а"), "иМВСт ГГ ех/рСо51" (для варіанту "е") і - "МВС /рСоОЗІ1" (для варіанту "Г).
Ге) 20 Олюднений І -ланцюг варіантів "д" і "п" також отримують мутагенезом за способом РОК. Варіанти "ді "й" конструюють шляхом заміни відповідно у варіантах "а" і "а" амінокислоти в положенні Зб, гістидину с (амінокислота Мо3б відповідно до визначення Кабата), тирозином. Полімеразну реакцію синтезу ланцюга здійснюють з використанням мутагенної затравки МВСЛІ РОК (ЗЕО ІЮ Мо39), затравки М13 Ргітег КМ і плазміди
МВС ах/рОСт19 в якості матриці. Виконують ще одну полімеразну реакцію синтезу ланцюга, використовуючи 25 отриманий таким чином продукт РСК, затравку М1З3 Ргітег МА і плазміду АЯМВСЛІ ах/рОсС19 в якості матриці.
ГФ) Отриманий фрагмент ДНК розщеплюють НіпайїЇ ії ВіпіІ ії субклонують в плазміді СУ/рОсС19, яка була приготована з шляхом розщеплення НіпайШ і Віпі. Використовуючи цю плазміду в якості матриці, здійснюють полімеразну реакцію синтезу ланцюга із затравками МВСТІСОРІЗК (5ЕБЕО ІЮО Мо40) ії МВС1І/М51. Отриманий фрагмент во полімеразної реакції синтезу ланцюга розщеплюють Араї і НіпаїїЇ і вводять в плазміди АМВС1Г а 7/рОсСт19 і
МВС ах/рОсС19, які були приготовані шляхом розщеплення Араї і НіпаШ. Отримані плазміди секвенують.
Плазміди, в яких була підтверджена наявність правильної послідовності, названі "АЛМВСТІ д 5/рОС19" (для варіанту "д") і" ЯМВСТ11І пу/рОст19" (для варіанту "п"). Ці плазміди розщеплюють ЕсокКіІ з отриманням фрагмента
ДНК, що містить ДНК, кодучу олюднений І -ланцюг. Цей фрагмент ДНК вводять в сайт ЕсоКІ! плазміди рСО51 б5 так, щоб ініцюючий кодон олюдненого І-ланцюга знаходився внизу від промотору ЕКЕТ у. Отримані плазміди названі відповідно "иИМВСТ1І 9у/рСоО51" (для варіанту "д") і " ЯМВСЛІ пу/рСо51" (для варіанту "П").
Олюднений І-ланцюг варіантів "ії", "М "КУ М" "т", "п" Її "о" також отримують мутагенезом за способом
РСК. Полімеразну реакцію синтезу ланцюга здійснюють, використовуючи плазміду АМВСТІ алї/рОС19 в якості матриці з мутагенною затравкою МВСТЛІ СРІ145 (5ЕО ІЮ Мо41) і затравкою М1КМ(Х) (ЗЕО ІЮ Мо43). Отриманий
Фрагмент ДНК розщеплюють Араї і ВіІпі і субклонують в плазміді АМВС1І 9у/рОС19, яка була приготована шляхом розщеплення Араї і Віпі. Отриману плазміду секвенують і вибирають клон з мутацією, відповідною кожному з вказаних варіантів. Отримана таким чином плазміда названа "имМВСЛТІ ху/рОсСт19 (х-і, |, Кк, 1, т, п або 0)". Цю плазміду розщеплюють ЕсокК! з отриманням фрагмента ДНК, що містить ДНК, кодучу олюднений
Ї-ланцюг. Фрагмент ДНК вводять в сайт ЕсокКіІ плазміди рСО51 так, щоб ініціюючий кодон олюдненого І -ланцюга 70 знаходився внизу від промотору ЕЕТ у. Отримана таким чином плазміда названа "ИМВС1І ху/рсоз1" (х-їі, |, К,
І, т, п або о). Послідовності ДНК (включаючи відповідні амінокислотні послідовності) варіантів "|", "І", "т" і "о" показані відповідно в ЗЕС І МоМо 67, 68, 69 і 70. Амінокислотні послідовності цих варіантів показані відповідно в ЗЕО ІЮО Мо 48, 49, 50 і 51.
Олюднений І -ланцюг варіантів "р", "а", "г "в" | конструюють шляхом заміни амінокислоти в положенні 87 (тирозину) ізолейцином відповідно у варіантах "і" "М, "т" "ОЇ "о". Ці варіанти отримують, використовуючи сайт рестрикції Аого1МІ області ЕКЗ, який замінюють у варіантах "і", "т", "І" або "о" сайтом варіанту "п". Для чого з експресуючої плазміди ПИМВСТІх 7/рСо51 (х-ї, |, т, 1 або о) видаляють рестрикційний фрагмент Аого1НІ (514 пар основ), що містить СОКЗ, частину області ЕКЗ і всю область ЕКА4.
Рестрикційний фрагмент Аого1нНІ (514 пар основ) в експресуючій плазміді НЯМВСТ1І пХ/рсСо5, що містить СОКЗ, астину області ЕКЗ і всю область ЕРА, лігують з видаленим сайтом так, щоб замінити амінокислоту в положенні 91, тирозин (амінокислота Мо87 відповідно до визначення Кабата), ізолейцином. Отриману плазміду секвенують.
Далі вибирають клон варіантів "і", "М, "т", "І" ої "о", в якому амінокислота в положенні 91, тирозин (амінокислота Мо87 відповідно до визначення Кабата), замінена ізолейцином. Ці модифіковані варіанти, відповідні варіантам "і" "М, "т", "ої "о", названі відповідно варіантами "р" "а" "в" и. с
Отримана плазміда названа "иИМВСТІ ху/рсСо51" (х-р, а, 8, г або ). Послідовності ДНК (включаючи відповідні Ге) амінокислоти) варіантів "д", "г, "8" Ж показані відповідно в ЗЕО І Мо 71, 72, 73 і 74. Амінокислотні послідовності цих варіантів також показані відповідно в БЕО ІЮ Мо 52, 53, 54 і 55.
Плазміду АМВС1І 4у/рРСО51 розщеплюють Ніпаійй і ЕсоК!І і субклонують в плазміді рОС19, яка була приготована шляхом розщеплення Ніпаїй|! і ЕсоКіІ. Отримана таким чином плазміда названа "яИМВС1І дх/русС19". о
Положення замінених амінокислот в окремих варіантах олюдненого І|-ланцюга показано в нижченаведеній со таблиці 2. «- « щі оовайанмо | з36111143 17461741 | во |в - пил и Я ПНЯ ПОЛЯ ПОЛЯ ПОЛЯ ПО ПО в Рв ї ПО ПОН ПОН ПОН ПОН НО ОА їх я З с 7 ев нини ши п Я Я ПНЯ ПО ТО ПОН
І» в пил т ПО Я ПНЯ ПОН ПОЛОННЯ ПОН ПО ПО 15 пили и и о ПО Я ПНЯ ПОЛЯ ПО ПО - в пил зи о и о ПО Я ПНЯ ПОЛЯ ОН ПО е кв - т в пил п и о ПО ПОЛЯ ПОЛЯ ПО НО о а Кв о пил и о и о Я ПНЯ ПОЛЯ ПО ПО я Кв шили ли о и и ПО ПОЛЯ ПО: ТОНЯ ПОЛ ПО вроків о пн и и и о Я ПО: ТО ПО ПОЛО ка У таблиці 2 заголовними буквами позначені наступні амінокислоти: У-тирозин; Р-пролін; К-лізин; М-валін; р-аспарагінова кислота і І-ізолейцин. 60 Штами Е. сої), що містять плазміди НЯМВСТНкКДнНК/рОст19 і ЯиМВеСт11І 4у7/р0С19, названі відповідно "ЕвсПегіснпіа сої УМ109 (пМВСТНКДнкКрОсС19)" і "Евспегіснпіа соїї дУМ109 (МВС 4х/рОсС193)" ії депоновані відповідно до положень Будапештського договору від 15 серпня 1996р. в колекції Національного інституту біонауки і людської технології, агентство промислової науки і технології, Японія (1-3, Нідазпі 1-споте, ТвиКибра-5Пі, Ірагакі,
Японія) під номером доступу РЕКМ ВР-5629 для Езспегіспіа соїї д"М109 (пМВСт1НКДнкК/рОсСт19) ії РЕКМ ВР-5630 65 для ЕвсПегіснпіа соїї УМ109 (НМВСЛІ ду/рОст19). (5) Трансфекція в клітці СО5-7
Щоб визначити антигенз'вязуючу і нейтралізуючу активність гібридних антитіл і олюднених антитіл
Мо23-57-137-1, отримані вище експресуючі плазміди тимчасово експресують в клітках СО5-7. Для тимчасової експресії | -ланцюга гібридних антитіл нижченаведені комбінації плазмід котрансфеціюють в клітці СО5-7 шляхом електропорації з використанням електроїмпульсного пристрою Сепе Риїзег (Віо Кад): НОИМВСТНнКДНнНЮрсСОоб1 і п/тМВС11,(Х)/пео; пМВСІНКДНК/рСОБІ і т/пМВСл1іахл/пео; пМВСІНнКДНКЕрСО5І ої 0 т/пМВеС11 ах/пео; яМВСЯТНКДнНКрсСоО51 і птпМВе1І(д)/пео; і АМВСТНнКДНКрСоО51 і пттМВвс1І (Х)/пео. До суспензії кліток
СО8-7 (0,8мл) в РВ5(-) (1х10"кліток/мл) додають всі комбінації плазмідних ДНК (по 1Омкг кожної). Отриманий розчин піддають впливу імпульсів при електростатичній місткості 15008 і сиді струму 25мкф. Електропоровані 70 клітки витримують протягом 10 хвилин при кімнатній температурі, суспендують в модифікованому за способом
Дульбекко середовищі Голка, що містить 296 фетальну телячу сироватку з ультранизьким вмістом ідо (іВСО), і культивують в 10см чашці в інкубаторі з СО». Клітки культивують протягом 72 годин, після чого культуральний супернатант збирають і центрифугують для видалення клітинного дебрису. Отримані розчини використовують для виконання твердофазного імуноферментного аналізу (ЕГІ5А).
Для тимчасової експресії олюднених антитіл Мо23-57-137-1 комбінацію плазмід АМВСТНКДНКЮрсоз1 і яМВС11ху/рСо51 (х-а-Ю котрансфеціюють в клітки СО5-7 за допомогою електроїмпульсного пристрою Сепе
Риїзег (Віо Кай) аналогічно процедурі, описаній вище для гібридних анитіл. Культуральні супернатанти отримують і використовують для виконання твердофазного імуноферментного аналізу (ЕГІ5А).
Гібридні або олюднені антитіла очищають від культуральних супернатантів кліток СО5-7 за допомогою набору Айісеї! Ргоївіп А МАРЗІЇ (Віо Кад) відповідно до прикладених до нього інструкцій. (6) Твердофазний імуноферментний аналіз (ЕП ІЗА) (Ї) Визначення концентрації антитіл
Планшет для ЕЇІЗА, призначений для визначення концентрації антитіл, готують таким чином. Всі ямки 96-ямкового планшета для ЕП ІЗА (Махізогр, МОМ) покриває 100мкл буфера для сенсибілізації поверхонь (001М се розчин МаНсСо», 0,0295 Ман»), що містить 1мкг/мл антитіла кози проти (ДО людини (ТАСО), і блокують 200мкл о буфера для розведення |(ХОММ трис-НСІ, 1ММ МОасІ 5, 0,1М Масі, 0,0595 твину-20, 0,0295 Мам», 1906 бичачого сироваткового альбуміну (ВЗА); рН 7,21. У всі ямки додають серійні титри культурального супернатанту кліток
СО5, в яких були експресовані гібридні і олюднені антитіла, або додають серійні титри гібридних і олюднених антитіл в очищеному вигляді. Вміст ямки інкубують при кімнатній температурі протягом 1 години і промивають (ав) сумішшю РВБ5 і твину-20. Потім в кожну ямку додають 10О0мкл антитіла кози проти (ДО людини (ТАСО), со кон'югованого з лужною фосфатазою. Вміст планшета інкубують при кімнатній температурі протягом 1 години, промивають сумішшю РВБЗ і твину-20. Потім в кожну ямку додають 1мг/мл розчину субстрату ("Зідта 104", «- п-нітрофенілфосфорна кислота, ЗІСМА). Для визначення концентрації антитіл у розчину в кожній ямці вимірюють « оптичну щільність при 405нм, використовуючи апарат для прочитання мікропланшетів (Віо Кад). Як еталон при здійсненні цього вимірювання використовують очищений Ни дос 15, (сайт зв'язування). - (і) Визначення антигензв'язуючої здатності
Планшет для ЕГІЗА, призначений для визначення антигензв'язуючої здатності, готують таким чином. Всі ямки 96-ямкового планшета для ЕГІЗА (Махізогр, МОМС) покриває 100мкл буфера для сенсибілізації поверхонь, що « містить 1Імкг/мл РТНгГР людини (1-34), і блокують 200мкл буфера для розведення. Потім у всі ямки додають серійні титри культурального супернатанту кліток СО5-7, в яких були експресовані гібридні і олюднені З с антитіла, або серійні титри гібридних і олюднених антитіл в очищеному вигляді. Вміст планшета інкубують при "» кімнатній температурі і промивають сумішшю РВ5 і твину-20. Потім в кожну ямку додають 100мкл антитіла кози " проти Дб людини (ТАСО), кон'югованого з лужною фосфатазою. Вміст планшета інкубують при кімнатній температурі і промивають сумішшю РВЗ і твину-20. У кожну ямку додають 1мг/мл розчину субстрату ("Зідта104", п-нітрофенілфосфорна кислота, ЗІЗМА). У отриманого розчину вимірюють оптичну щільність при 405нм, і використовуючи апарат для прочитання мікропланшетів (Віо Кад). їх (7) Підтвердження активності () Оцінка олюдненого Н-ланцюга - Встановлено, що антитіло, яке містить олюднений | Н-ланцюг варіанту "а" і химерний І1-ланцюг, с 250 характеризується таким же рівнем РТНгР-зв'язуючої активності, що і химерне антитіло (див. Фіг.б). Цей результат дозволяє передбачити, що у варіанті "а" М-область Н-ланцюга олюднена в такій мірі, що можна «2 зробити оцінку олюднення. Тому олюднений Н-ланцюг варіанту "а" використаний як Н-ланцюг олюдненого антитіла в наступних експериментах. (ії) Активність гібридних антитіл 22 (і-а) Гібридне антитіло ЕК1,2/ЕКЗ, 4
ГФ! Коли І-ланцюг має структуру п/тМВс11(5), антигензв'язуюча активність відсутня. На відміну від цього, коли І-ланцюг має структуру т/пМВСІ ах, або т/пмМВвС11а45, спостерігається такий же рівень о антигензв'язуючої активності, що і у химерного антитіла Мо23-57-137-1 (Фіг.7). Ці результати дозволяють припустити, що області ЕКЗ і ЕК4 не викликають ніяких проблем, а в областях ЕК і ЕК2 є один або декілька 60 амінокислотних залишків, які необхідно замінити, щоб отримати олюднене антитіло. (іі-5) Гібридне антитіло ЕКЛ/ЕК2
Коли І -ланцюг має структуру титМВв11 (5), антигензв'язуюча активність відсутня. На відміну від цього, коли І -ланцюг має структуру пПттМВе11Х), спостерігається такий же рівень антигензв'язуючої активності, що і у химерного антитіла Мо23-57-137-1 (Фіг.8). Ці результати дозволяють припустити, що область ЕК1 не викликає бо ніяких проблем, а в області ЕК2 є один або декілька амінокислотних залишків, які необхідно замінити, щоб отримати олюднене антитіло. (ії) Активність олюднених антитіл
Антигензв'язуючу активність визначають у олюднених антитіл, що мають І -ланцюг варіантів "а"-"?. Отримані Дезультати показують, що олюднені антитіла, що мають І-ланцюг варіантів "|" "М, "т", о" ал, "в ї "Р, характеризуються таким же рівнем РТНгР-зв'язуючої активності, що і химерне антитіло (Фіг.9-12). (8) Створення лінії кліток СНО, здатної стабільно продукувати антитіло
Щоб створити лінію кліток, здатну стабільно продукувати олюднені антитіла, отримані вище експресуючі плазміди вводять в клітку СНО (ОХВ11). 70 Лінію кліток, здатну стабільно продукувати олюднене антитіло, отримують, використовуючи нижченаведені комбінації плазмід в якості експресуючих векторів для клітки СНО: НМВСЯТНКДНК/рсСНнОТ і ЯИМВСтІ т 5/рСО51;
ЯМВСІНнКДНнКрСОЗІ ії пМВсС1145у/рСОБІ; пМВСІнкДнюЮрСнНОЇ і КМВсСт1і7/рСО51. Ці плазміди котрансфецюють в клітці СНО шляхом електропорації з використанням електроїмпульсного пристрою Сепе
Риїзег (Віо Кай). Потім експресуючі вектори по окремо розщеплюють рестрикційним ферментом Руці з 75 отриманням лінійних фрагментів ДНК. Отримані фрагменти ДНК екстрагують фенолом і хлороформом і осаджують етанолом. Після чого отримані таким шляхом фрагменти ДНК піддають електропорації. Для цього фрагменти плазмідної ДНК (по 1Омкг кожної) додають до 0,8мл суспензії кліток СНО в РВ5(-) (1х10 "кліток/мл).
Отриманий розчин піддають впливу імпульсів при електростатичній ємності 15008Щ8 і силі струму 25мкф.
Оброблені клітки витримують при кімнатній температурі протягом 10 хвилин, суспендують в середовищі МЕМ-9(6ІВСО), що містить 1095 плідну телячу сироватку (СІВСО), і культивують на 9б-ямкових планшетах (Раісоп) в інкубаторі з СО». Наступного дня після початку культивування середу замінюють селективною середою МЕМ-о без рибонуклеозиду або дезоксирибонуклеозиду, що містить 10956 плодову телячу сироватку (СІВСО) і 50О0мг/мл СЕМЕТІСІМ ((34185!цафе; 5ІВСО). З культурального середовища відбирають клітки, в які введений ген антитіла. Культуральне середовище замінюють свіжим середовищем. Приблизно через два тижні ЄМ після заміни середовища клітки досліджують під мікроскопом. У клітках, що характеризуються задовільним г) ростом, визначають кількість продукованих антитіл способом ЕГІЗБА, який звичайно використовують для вимірювання концентрації антитіл, як це описувалося вище. Вивчають, збирають клітки, які продукують найбільшу кількість антитіл.
Підвищення рівня культури отриманої лінії кліток, здатної стабільно продукувати антитіла, проводять у о флаконі, що обертається, з використанням мінімального підтримуючого середовища МЕМ-о, без рибонуклеозиду с або дезоксирибонуклеозиду, що містить 295 плодову телячу сироватку з ультранизьким змістом до. На 3-й і 4-ий день культивування культуральний супернатант збирають і фільтрують через фільтр з . розміром пор -
О,2мкм (Міййроге) для видалення клітинного дебрису. Олюднені антитіла очищають від культурального «І супернатанту кліток СНО в колонці РОКО5, заповненій білком А (РегЗеріїме Віозузіетв), на СопЗер І! С100 (Міййроге) відповідно до прикладених інструкцій. Олюднені антитіла використовують для визначення - нейтралізуючої активності і дослідження фармакологічної ефективності на тваринних моделях гіперкальціємії.
Концентрацію і антигензв'язуючу активність очищених олюднених антитіл визначають за допомогою вищеописаної системи ЕЕГ ІЗА. «
ІПосилальний приклад 5)
Визначення нейтралізуючої активності не) с Нейтралізуючу активність антитіл миші, химерних і олюднених антитіл визначають з використанням лінії з» мієломних кліток пацюків КОБЗ 17/2.8-5. Клітки КОЗ 17/2.8-5 культивують в середовищі Е-12 Хема (5ІВСО), що містить 1095 плодову телячу сироватку (СІВСО), в інкубаторі з СО». Клітки КОБ5 17/2.8-5 висівають у всі ямки 9б-ямкового. планшета в кількості 10 "кліток//ООмкл/ямку і культивують протягом 1 дня. Після закінчення 75 культивування культуральне середовище замінюють середовищем Б-12 Хема (СІВСО), що містить 4ММ їв. гідрокортизону і 1095 плодову телячу сироватку. Клітки культивують протягом трьох-чотирьох днів, промивають г» 260О0мкл середовища Б-12 Хема (СБІВСО) і додають 8Омкл середовища Б-12 Хема, що містить 1мММ - ізобутил-1-метилксантину (ІВМХ, БІСМА) у 1095 плодову телячу сироватку і 10ММ НЕРЕЗ. Отриману суміш інкубують при температурі 372С протягом 30 хвилин. (95) 20 Культуральні середовища, що містять антитіла миші, химерні і олюднені антитіла, призначені для о випробування нейтралізуючої активності, заздалегідь поетапно розводять з отриманням наступних груп:
ПОмкг/мл, З,Змкг/мл, 1,їмкг/мл і 0,37мкг/мл|, (1Омкг/мл, 2мкг/мл, 0О,5мкг/мл і О,01мкг/мл|! і ТОмкг/мл,
Бмкг/мл, 1,25мкг/мл, 0,бЗмкг/мл і 0,31мкг/мл)|. Кожний розчин зразка розведеного антитіла змішують з еквівалентною кількістю 4нг/мл РТНгГР (1-34). У кожну ямку вводять 8Омкл отриманого змішаного розчину. 59 Кінцева концентрація кожного антитіла в ямці дорівнює четвертій частині початкової концентрації вищезгаданого
ГФ) антитіла, тому концентрація РТНГР (1-34) становить нг/мл. Після обробки протягом десяти хвилин при кімнатній
ГФ температурі, культуральний супернатант видаляють і залишок тричі промивають РВ5. Циклічний аденозинмонофосфат (САМР) в клітках екстрагують 100мкл 0,395 НОСІ - 9590 етанолу і випаровують за допомогою во аспіратора, що вприскує воду, для видалення НСі-етанолу. Залишок розчиняють в 120мкл буфера для імуноферментного аналізу (ЕІА), що входить в набір для імуноферментного аналізу САМР (САУМАМ
СНЕМІСАГ 5), щоб екстрагувати СсАМР. Рівень САМР визначають за допомогою вищезгаданого набору (САУМАМ
СНЕМІСАГ 5) відповідно до прикладених до нього інструкцій. Отримані результати показують, що серед олюднених антитіл, що характеризуються таким же рівнем антигензв'язуючої активності, що і химерне антитіло, олюднені антитіла, що мають І-ланцюг варіантів "д", "г "8" "С (в яких тирозин в положенні 91 замінений бо ізолейцином), володіють нейтралізуючою активністю, яка в найбільшій мірі відповідає аналогічній активності химерного антитіла, і олюднені антитіла, що мають і!-ланцюг варіанту "д", володіють найсильнішою нейтралізуючою активністю (Фіг.13-15).
Як описувалося вище, даний винахід відноситься до терапевтичного агента при кахексії, що містить в якості активного інгредієнта речовину, яка здатна інгібувати скріплення між РТНГР і його рецептором.
У випробуваннях фармакологічної ефективності з використанням тваринної моделі кахексії така речовина дозволяє запобігти втраті у вазі і збільшити час виживання випробуваних тварин в порівнянні з контрольними тваринами. Тому ця речовина є корисною для лікування кахексії. (2) Інформація для ЗЕО ІЮ Мо1: 70 (І) Характеристики послідовності: (А) Довжина: 20 пар основ (В) Тип: нуклеїнова кислота (С) Структура ланцюга: одноланцюжковий (ОБ) Топологія: лінійна (і) Тип молекули: інша нуклеїнова кислота (А) Опис/опис - "синтетична ДНК" (хі) Опис послідовності: БЕО ІЮ Мо1
АААТАОСССТ ТОАССАВОСА 20 (2) Інформація для ЗЕО ІЮ Мо2: (І) Характеристики послідовності: (А) Довжина: 38 пар основ (В) Тип: нуклеїнова кислота (С) Структура ланцюга: одноланцюжкова (ОБ) Топологія: лінійна с (і) Тип молекули: інша нуклеїнова кислота о (А) Опис/опис - "синтетична ДНК" (хі) Опис послідовності: БЕО ІЮ Мо2
СТОСТТОСоС ССАССТСТОА АССТТССАСА АТССАТАС 38 (2) Інформація для ЗЕО ІЮ МоЗ3: о (ї) Характеристики послідовності: со (А) Довжина: 28 пар основ (В) Тип: нуклеїнова кислота -- (С) Структура ланцюга: одноланцюжкова «г (ОБ) Топологія: лінійна
Зо (і) Тип молекули: інша нуклеїнова кислота ї- (А) Опис/опис - "синтетична ДНК" (хі) Опис послідовності: ЗЕО ІЮ МоЗ
СБАТСССОСО ССАСТОСАТА САСАСАТО 28 « (2) Інформація для ЗЕО ІЮ Мод: шщ с (І) Характеристики послідовності: (А) Довжина: 29 пар основ ;» (В) Тип: нуклеїнова кислота (С) Структура ланцюга: одноланцюжкова (ОБ) Топологія: лінійна -І (і) Тип молекули: інша нуклеїнова кислота (А) Опис/опис - "синтетична ДНК" ве (хі) Опис послідовності: ЗЕО ІЮ Мо4 -й ССАТССССОС ТСАСВОСААС СТОСВААСА 29 о 70 (2) Інформація для 5ЕО ІО Моб: (І) Характеристики послідовності: ме, (А) Довжина: 17 пар основ (В) Тип: нуклеїнова кислота (С) Структура ланцюга: одноланцюжкова 59 (2) Топологія: лінійна
ГФ) (і) Тип молекули: інша нуклеїнова кислота (А) Опис/опис - "синтетична ДНК" де (хі) Опис послідовності: ЗЕО ІЮ Мо5
СТТТТСССАб ТСАССАС 17 60 (2) Інформація для ЗЕС ІО Моб: (І) Характеристики послідовності: (А) Довжина: 17 пар основ (В) Тип: нуклеїнова кислота (С) Структура ланцюга: одноланцюжкова бо (ОБ) Топологія: лінійна
(і) Тип молекули: інша нуклеїнова кислота (А) Опис/опис - "синтетична ДНК" (хі) Опис послідовності: ЗЕО ІЮ Моб
САБОБАААСАС СТАТОА 17 (2) Інформація для ЗЕО ІЮ Мо7: (І) Характеристики послідовності: (А) Довжина: 31 пара основ (В) Тип: нуклеїнова кислота (С) Структура ланцюга: одноланцюжкова (ОБ) Топологія: лінійна (і) Тип молекули: інша нуклеїнова кислота (А) Опис/опис - "синтетична ДНК" (хі) Опис послідовності: ЗЕО ІЮ Мо7
СТСТААССТТ ССАССАТСАА АСТТОССССТ С 31 (2) Інформація для ЗЕО ІЮ Мов: (І) Характеристики послідовності: (А) Довжина: 30 пар основ (В) Тип: нуклеїнова кислота (С) Структура ланцюга: одноланцюжкова (ОБ) Топологія: лінійна (і) Тип молекули: інша нуклеїнова кислота (А) Опис/опис - "синтетична ДНК" (хі) Опис послідовності: ЗЕО ІЮ Мо8 с
ТСТТССАТСС СТОСАСАСАС АСТСАССАСА 30 ге) (2) Інформація для ЗЕО ІЮ Мо9: (І) Характеристики послідовності: (А) Довжина: 36 пар основ (В) Тип: нуклеїнова кислота 3о (С) Структура ланцюга: одноланцюжкова со (ОБ) Топологія: лінійна - (і) Тип молекули: інша нуклеїнова кислота (А) Опис/опис - "синтетична ДНК" «І (хі) Опис послідовності: ЗЕО ІЮ Мо9
Зо СтСтТСААТТС ААССТТССАС САТОСОСТТтТ соосто 36 - (2) Інформація для ЗЕО ІЮ Мо10: (І) Характеристики послідовності: (А) Довжина: 41 пара основ « (В) Тип: нуклеїнова кислота з 70 (С) Структура ланцюга: одноланцюжкова с (ОБ) Топологія: лінійна :з» (і) Тип молекули: інша нуклеїнова кислота (А) Опис/опис - "синтетична ДНК" (хі) Опис послідовності: БЕО ІЮ Мо10
ТІТСССбобС ССТТОСТОбА СССТСАССАС АСОСТОАССА б 41 їх (2) Інформація для ЗЕО ІЮ Мо11: т» (Ї) Характеристики послідовності: - (А) Довжина: 109 пар основ (В) Тип: нуклеїнова кислота (95) 20 (С) Структура ланцюга: одноланцюжкова о (ОБ) Топологія: лінійна (і) Тип молекули: інша нуклеїнова кислота (А) Опис/опис - "синтетична ДНК" (хі) Опис послідовності: ЗЕО ІЮ Мо 11 25 СТСТСААТТС ААОСТТАЯТА СТТОСССАСО ССААССССАА СОССАСОСТо АСОоСТеоТТоС 60 (Ф) СОСОСТОСТО ТСАССАССТС СААСССААСА АСОССАСАСТ датототТстТ 109 іме) (2) Інформація для ЗЕО ІЮ Мо12: (І) Характеристики послідовності: 60 (А) Довжина: 110 пар основ (В) Тип: нуклеїнова кислота (С) Структура ланцюга: одноланцюжкова (ОБ) Топологія: лінійна (і) Тип молекули: інша нуклеїнова кислота 65 (А) Опис/опис - "синтетична ДНК" (хі) Опис послідовності: БЕО ІЮ Мо12 сстТттТастТос ТСТОСАСТСО ССОСТТІСАСсС ССССТОССАТ СТОССТТССА ОбССАСТеТо бо
АСАССТОССо ОСТАСААСТО АСТОАТСАСА САСАСТАСТОо ТсОССТТСТТ 110 (2) Інформація для ЗЕО ІО пз 13: 95 (І) Характеристики послідовності: (А) Довжина: 98 пар основ (В) Тип: нуклеїнова кислота (С) Структура ланцюга: одноланцюжкова (ОБ) Топологія: лінійна то (і) Тип молекули: інша нуклеїнова кислота (А) Опис/опис - "синтетична ДНК" (хі) Опис послідовності: БЕО ІЮ Мо13 аАСТОПАБА ССАССАААСС СТОСАААСАС АССААСАВСА детТАСОсСОбС САбСАОСТАС бо
СТСАбОСТСА ССССССАССА СТОСААСТОС САСАСААС 98 (2) Інформація для ЗЕО ІЮ Мо14: (І) Характеристики послідовності: (А) Довжина: 106 пар основ (В) Тип: нуклеїнова кислота й (С) Структура ланцюга: одноланцюжкова (ОБ) Топологія: лінійна (і) Тип молекули: інша нуклеїнова кислота (А) Опис/опис - "синтетична ДНК" (хі) Опис послідовності: БЕО ІЮ Мо14 сч з ТСТТОААТТС ТТАСТАТОАА САТТОТОТАС СбОССАСТоТ СТІСТОСАСо стТостоостт 6о (о) сСАТОСсСТсАС СТООСАССТО ТАССТТСТсТ сОоСАСТТОСА сТеСТе 106 (2) Інформація для ЗЕО ІЮ Мо15: (І) Характеристики послідовності: о (А) Довжина: 43 пари основ со (В) Тип: нуклеїнова кислота (С) Структура ланцюга: одноланцюжкова -- (ОБ) Топологія: лінійна «Е (і) Тип молекули: інша нуклеїнова кислота
Зо (А) Опис/опис - "синтетична ДНК" ї- (хі) Опис послідовності: БЕО ІЮ Мо15
СТСТСААТТС ААОСТТАСТА СТТОСССАСС ССААСеССАА СОС 4з (2) Інформація для ЗЕО ІЮ Мо16: « (І) Характеристики послідовності: з с (А) Довжина: 20 пар основ . (В) Тип: нуклеїнова кислота и?» (С) Структура ланцюга: одноланцюжкова (ОБ) Топологія: лінійна (і) Тип молекули: інша нуклеїнова кислота -І (А) Опис/опис - "синтетична ДНК" (хі) Опис послідовності: БЕО ІЮ Мо16 ь ТСТТСААТТО ТІАСТАТОСАА 20 - (2) Інформація для ЗЕО ІЮ Мо17: о (І) Характеристики послідовності: о (А) Довжина: 39 пар основ (В) Тип: нуклеїнова кислота (С) Структура ланцюга: одноланцюжкова 5Б (ОБ) Топологія: лінійна (і) Тип молекули: інша нуклеїнова кислота
Ф) (А) Опис/опис - "синтетична ДНК" ка (хі) Опис послідовності: БЕО ІЮ. Мо17
СААСААСТАС соСоССАССА ОСТАССТОАС ССТОАСОоСО 39 6о (2) Інформація для 5ЕО ІЮ Мо18: (І) Характеристики послідовності: (А) Довжина: 39 пар основ (В) Тип: нуклеїнова кислота (С) Структура ланцюга: одноланцюжкова бо (0) Топологія: лінійна
(і) Тип молекули: інша нуклеїнова кислота (А) Опис/опис - "синтетична ДНК" (хі) Опис послідовності: БЕО ІЮ Мо18 сСТАССТОоСТо СССОССТАСТ ТСТТСТТОСТ СТОТТТОбА 39 (2) Інформація для ЗЕО ІЮ Мо19: (І) Характеристики послідовності: (А) Довжина: 46 пар основ (В) Тип: нуклеїнова кислота 70 (С) Структура ланцюга: одноланцюжкова (ОБ) Топологія: лінійна (і) Тип молекули: інша нуклеїнова кислота (А) Опис/опис - "синтетична ДНК" (хі) Опис послідовності: БЕО ІЮ Мо19
СТСТОААТТО ААССТТАСТО СТАБбСТССАА СтТОТОоОоСТОС АССАТС 46 (2) Інформація для ЗЕО ІЮ Мо20: (І) Характеристики послідовності: (А) Довжина: 34 пари основ (В) Тип: нуклеїнова кислота (С) Структура ланцюга: одноланцюжкова (ОБ) Топологія: лінійна (і) Тип молекули: інша нуклеїнова кислота (А) Опис/опис - "синтетична ДНК" (хі) Опис послідовності: БЕО ІЮ Мо20 сч 29 ТОТТІСААТТС ТТАСТААСАС ТСТОСССТОТ ТОсАА 34 Ге) (2) Інформація для ЗЕО ІЮ Мо21: (І) Характеристики послідовності: (А) Довжина: 35 пар основ (В) Тип: нуклеїнова кислота 3о (С) Структура ланцюга: одноланцюжкова со (ОБ) Топологія: лінійна (і) Тип молекули: інша нуклеїнова кислота -- (А) Опис/опис - "синтетична ДНК" «І (хі) Опис послідовності: БЕО ІЮ Мо21 м
СТСТААОСТТ ССАССАТСОС СТОСАСТОСТ СТСТТ 35 (2) Інформація для ЗЕО ІЮ Мо22: (І) Характеристики послідовності: « (А) Довжина: 48 пар основ (В) Тип: нуклеїнова кислота - с (С) Структура ланцюга: одноланцюжкова а (ОБ) Топологія: лінійна "» (і) Тип молекули: інша нуклеїнова кислота (А) Опис/опис - "синтетична ДНК" (хі) Опис послідовності: БЕО ІЮ Мо22 -і ТОТТОСААТТО АСАТСТААСТ АСТТАССТАб САСАСТАСС ТтТосТоСС 48 т» (2) Інформація для ЗЕО ІЮ Мо23: - (І) Характеристики послідовності: (А) Довжина: 128 пар основ (95) 20 (В) Тип: нуклеїнова кислота о (С) Структура ланцюга: одноланцюжкова (ОБ) Топологія: лінійна (і) Тип молекули: інша нуклеїнова кислота (А)Опис:/опис - "синтетична ДНК" (хі) Опис послідовності: БЕО ІЮ Мо23 (Ф) СТСТАЛОСТТ ССАССАТОСО сСТТТОСОСТО АССТоОосСТТТ ТОСТОСТтТос ТСТТТТААСА єо іме) (хі) Опис послідовності: БЕО ІЮ Мо23
СТСТААССТтТ ССАССАТсСосС стТтТтТосостТо достооатттТ ТостТостТТосС ТСТТТТААсА во 60 сстТотТосСАстТ стТсАсстТОосСА остостсадо тстТососсАс ссстТостТосСА состоссАсо 120 тосстоАс 128 (2)Інформація для ЗЕО ІЮО Мо24: (І) Характеристики послідовності: 65 (А) Довжина: 125 пар основ (В) Тип: нуклеїнова кислота
(С) Структура ланцюга: одноланцюжкова (ОБ) Топологія: лінійна (і) Тип молекули: інша нуклеїнова кислота (А) Опис/опис - "синтетична ДНК" (хі) Опис послідовності: БЕО ІЮ Мо24
АССАТТАСТА СТОСТОСТАС ТТАСАССТАС ТАТОСАСАСА СТОТОААОСо СССАТТСАСС 60
АТСТОСАСАС АСААТТОСАА СААСАСОСТО ТАТСТОСААА ТОААСАСССТ САСАССТСАЄ 120
САСАС 125 то (2) Інформація для ЕС 10 Мо25: (І) Характеристики послідовності: (А) Довжина: 132 пари основ (В) Тип: нуклеїнова кислота (С) Структура ланцюга: одноланцюжкова пишне (О) Топологія: лінійна (і) Тип молекули: інша нуклеїнова кислота (А) Опис/опис - "синтетична ДНК" (хі) Опис послідовності: БЕО ІЮ Мо25
СТАССАССАС ТАСТААТОСТ ТОССАСССАС ТоСАссссстТ тТесстосАсс стобсосАсс во що СААСАСАТОС САТАССТАСТ СААССТОААТ ССАСАСОСсТо САСАСсСАСАс ТоТСАСссСАЄ 120 стессьсост бе 132 (2) Інформація для ЗЕО ІЮ Мо26: (І) Характеристики послідовності: с (А) Довжина: 110 пар основ о (В) Тип: нуклеїнова кислота (С) Структура ланцюга: одноланцюжкова (ОБ) Топологія: лінійна (і) Тип молекули: інша нуклеїнова кислота о (А) Опис/опис - "синтетична ДНК" со (хі) Опис послідовності: ЗЕО ІЮ Мо26
ТСТТОСАТСС СТСАССАСАС ЗОТСАССАСо СТТСССТООС СССАСТААОС АААСТААСТО 60 --
АТАСТАСТСТ СТСТООСАСА СТААТАСАСА ссОстТстТостТ САссСТотТсАЄ 110 «І (2) Інформація для ЗЕО ІЮ Мо2 7: - (І) Характеристики послідовності: (А) Довжина: 30 пар основ (В) Тип: нуклеїнова кислота « (С) Структура ланцюга: одноланцюжкова (Юр) Топологія: лінійна - с (і) Тип молекули: інша нуклеїнова кислота а (А) Опис/опис - "синтетична ДНК" "» (хі) Опис послідовності: БЕО ІЮ Мо27
СТСТААдОСТТ ССАССАТОСЯ СТТТОосСОоСстОо Зо (2) Інформація для ЗЕО ІЮ Мо28: -І (І) Характеристики послідовності: (А) Довжина: 30 пар основ ве (В) Тип: нуклеїнова кислота - (С) Структура ланцюга: одноланцюжкова (ОБ) Топологія: лінійна о (і) Тип молекули: інша нуклеїнова кислота о (А) Опис/опис - "синтетична ДНК" (хі) Опис послідовності: БЕО ІЮ Мо28
ТСТТССАТСС СТОАССАСАС ОСТСАССАсс 30 (2) Інформація для ЗЕО ІЮ Мо29: (І) Характеристики послідовності:
Ф) (А) Довжина: 133 пари основ ка (В) Тип: нуклеїнова кислота (С) Структура ланцюга: одноланцюжкова 60 (ОБ) Топологія: лінійна (і) Тип молекули: інша нуклеїнова кислота (А) Опис/опис - "синтетична ДНК" (хі) Опис послідовності: БЕО ІЮ Мо29 б5
АСААВОСТТС САССАТООСС ТОСАСТОСТо тТотТтТСтТТотТтТ СТТТОТТСТТ САТТОосСТоСАо во сТТСТтТтТСТо ССАОСТТСТо СТОАСТОААТ соссстТотТОосСс стотосетос стасвлосст 120
СССТСАдДеСТ САС 133 й (2) Інформація для ЗЕО ІЮ Мо30: (І) Характеристики послідовності: (А) Довжина: 118 пар основ (В) Тип: нуклеїнова кислота 70 (С) Структура ланцюга: одноланцюжкова (ОБ) Топологія: лінійна (і) Тип молекули: інша нуклеїнова кислота (А) Опис/опис - "синтетична ДНК" (хі) Опис послідовності: БЕО ІЮ Мо3О0 75 ВОСААСАТОС АДАСССАСАСС АСАССТСАТО ССАТТОСТОА ТОССТТСТСА СССТОСАССТ 6о стТосссстТсА ССОСТАССТО АССАТСТОСА ОССТОСАСТС ТОАССАТСАС ОСТОАСТА 118 (2) Інформація для ЗЕО ІЮ Мо31: (І) Характеристики послідовності: (А) Довжина: 128 пар основ | . (В) Тип: нуклеїнова кислота (С) Структура ланцюга: одноланцюжкова (ОБ) Топологія: лінійна (і) Тип молекули: інша нуклеїнова кислота (А) Опис/опис - "синтетична ДНК" сч 29 (хі) Опис послідовності: БЕО ІЮ. Мо31 Го)
СТоТОоОсСсТТс САТСТТОСТТ ААСТТТСАТС ААСТАССсСЬС босостТтТсто тоостостес во
ТОАТОССАТТ СААТОСТОТА СОТАСТОТОС ТОАСТАСТСА АсотосСАсстТ сАосттодес 120 сАСоСсТоС 128 - (2) Інформація для ЗЕО ІЮ Мо32: і, (І) Характеристики послідовності: «- (А) Довжина: 114 пар основ (В) Тип: нуклеїнова кислота « (С) Структура ланцюга: одноланцюжкова ї- (ОБ) Топологія: лінійна (і) Тип молекули: інша нуклеїнова кислота (А) Опис/опис - "синтетична ДНК" (хі) Опис послідовності: БЕО ІЮ Мо32 « дю стТтсСАТОСО СОСТОАССТА ОСАССОТСАС ТТТОСТОССТ ССОСОСААСА СОСТСАСААА 60 -о с ТТСЕТССТТА АТТСТАТСАС ССВСАССАСА ОТААТАСТСА ОССТСАТОСТ САСА 114 а (2) Інформація для ЗЕО ІЮ Мо33: "» (І) Характеристики послідовності: (А) Довжина: 17 пар основ (В) Тип: нуклеїнова кислота -і (С) Структура ланцюга: одноланцюжкова їз (ОБ) Топологія: лінійна (і) Тип молекули: інша нуклеїнова кислота - (А) Опис/опис - "синтетична ДНК" с 50 (хі) Опис послідовності: БЕО ІЮ Мо3З3
АСАААССТТО САССАТО 17 62 (2) Інформація для ЗЕО ІЮ Моза: (І) Характеристики послідовності: (А) Довжина: 19 пар основ (В) Тип: нуклеїнова кислота (С) Структура ланцюга: одноланцюжкова о (ОБ) Топологія: лінійна іме) (і) Тип молекули: інша нуклеїнова кислота (А) Опис/опис - "синтетична ДНК" 60 (хі) Опис послідовності: БЕО ІЮ Мо34
СТТОбАТОСОо бОСТОАССТ 19 (2) Інформація для ЗЕО ІЮ Мо35: (І) Характеристики послідовності: (А) Довжина: 75 пар основ 65 (В) Тип: нуклеїнова кислота (С) Структура ланцюга: одноланцюжкова
(ОБ) Топологія: лінійна (і) Тип молекули: інша нуклеїнова кислота (А) Опис/опис - "синтетична ДНК" (хі) Опис послідовності: БЕО ІЮ Мо35
СТТОСАТОСО СОСТОАССТА ССАСОСТСАС ТТТССТСОСТ ССССССААСА ССТАСАСААА бо
ТТСТТССТТА АТІСТ 75 (2) Інформація для ЗЕО ІЮ Моз36б: (І) Характеристики послідовності: то (А) Довжина: 43 пари основ (В) Тип: нуклеїнова кислота (С) Структура ланцюга: одноланцюжкова (ОБ) Топологія: лінійна (і) Тип молекули: інша нуклеїнова кислота т (А) Опис/опис - "синтетична ДНК" (хі) Опис послідовності: БЕО ІЮ Мо3б
АДАСОАТОССТ ТААСАТССАТ СААСТАСССА соЗсОоСстТтІСТ сто 43 (2) Інформація для ЗЕО ІЮ Мо37: (І) Характеристики послідовності: (А) Довжина: 46 пар основ (В) Тип: нуклеїнова кислота (С) Структура ланцюга: одноланцюжкова (ОБ) Топологія: лінійна с (і) Тип молекули: інша нуклеїнова кислота о (А) Опис/опис - "синтетична ДНК" (хі) Опис послідовності: БЕО ІЮ Мо37
АСАААСОСТТА ССОСТАССТОС АССАТСТОСА БССТССАССС ТОАсСА 46 (2) Інформація для ЗЕО ІЮ Мо38: о (ї) Характеристики послідовності: со (А) Довжина: 111 пар основ (В) Тип: нуклеїнова кислота -- (С) Структура ланцюга: одноланцюжкова «г (ОБ) Топологія: лінійна
Зо (і) Тип молекули: інша нуклеїнова кислота ї- (А) Опис/опис - "синтетична ДНК" (хі) Опис послідовності: БЕО ІЮ МоЗ8
СТТОСАТССО СОСТОСАССТА ССАСССТСАС ТТТОСТОССТ ОСОСССААСА ССТАСАСААА во «
ТТСТТОССТТА АТТСТАТСАС ССАСАССАСА САТАТАСТСА СССТСАТОСТ С 111 -о с (2) Інформація для ЗЕО ІЮ Мо39: "» (І) Характеристики послідовності: " (А) Довжина: 42 пари основ (В) Тип: нуклеїнова кислота (С) Структура ланцюга: одноланцюжкова ш- (ОБ) Топологія: лінійна їх (і) Тип молекули: інша нуклеїнова кислота (А) Опис/опис - "синтетична ДНК" - (хі) Опис послідовності: БЕО ІЮ Мо39 сю 50 СТтТСтТСтТоСбС ТОСТОСТОАТ АССАТТСААТ ССТСТАССТА СТ 42 о (2) Інформація для ЗЕО ІЮ Мо40: (І) Характеристики послідовності: (А) Довжина: 26 пар основ (В) Тип: нуклеїнова кислота (С) Структура ланцюга: одноланцюжкова
ГФ) (0) Топологія: лінійна 7 (і) Тип молекули: інша нуклеїнова кислота (А) Опис/опис - "синтетична ДНК" (хі) Опис послідовності: БЕО ІЮ Мо40 60 сбАососостТ тстстоостТо стоСсто 26 (2) Інформація для ЗЕО ІЮ Мо41: (І) Характеристики послідовності: (А) Довжина: 35 пар основ (В) Тип: нуклеїнова кислота бо (С) Структура ланцюга: одноланцюжкова
(ОБ) Топологія: лінійна (і) Тип молекули: інша нуклеїнова кислота (А) Опис/опис - "синтетична ДНК" (хі) Опис послідовності: БЕО ІЮ. Мо41
САСАдСОССС СТАВСТАСОТ САТОВАЙСТТ АлОСА 35 (2) інформація для 5ЕО ІЮ Мо42: (І) Характеристики послідовності: 70 (А) Довжина: 35 пар основ (В) Тип: нуклеїнова кислота (С) Структура ланцюга: одноланцюжкова (ОБ) Топологія: лінійна (і) Тип молекули: інша нуклеїнова кислота (А) Опис/опис - "синтетична ДНК" (хі) Опис послідовності: БЕО ІЮ Мо42
САССААТТСА СТАТСОСАТТС ТОСААССТТС АСАСо 35 (2) Інформація для ЗЕО ІЮ Мо43: (І) Характеристики послідовності: (А) Довжина: 18 пар основ (В) Тип: нуклеїнова кислота (С) Структура ланцюга: одноланцюжкова (ОБ) Топологія: лінійна (і) Тип молекули: інша нуклеїнова кислота сч (А) Опис/опис - "синтетична ДНК" (хі) Опис послідовності: БЕО ІЮ Мо43 і) ассттТоспАОоо ТОСТСАСА 18 (2) Інформація для ЗЕО ІЮ Мо44: (І) Характеристики послідовності: о (А) Довжина: 20 пар основ со (В) Тип: нуклеїнова кислота (С) Структура ланцюга: одноланцюжкова -- (ОБ) Топологія: лінійна «Е (і) Тип молекули: інша нуклеїнова кислота
Зо (А) Опис/опис - "синтетична ДНК" ї- (хі) Опис послідовності: БЕО ІЮ Мо44
САСАСТОСТТ САААСТТТТТ 20 (2) Інформація для ЗЕО ІЮ Мо45: « (І) Характеристики послідовності: (А) Довжина: 118 амінокислот З с (В) Тип: амінокислота (0) Топологія: лінійна "» (ї) Тип молекули: білок " (хі) Опис послідовності: БЕО ІЮ Мо45
Сбіп без Уа! Бей Твт обі Зег 5ег бег Аа Бег Рбе бег Гец (У -1 1 5 10 15
А!а бек віа уз Бен Тг Суз Тік Гей бег бет біп Нів бет Тг е 20 25 зо - Туг Таг Тв 01 Тгр о Туг о біп Чіп біп Рго Темп Су Рто Рго Гуз оз о 35 40 45
Тук Уа! Мет Авр Гец Був біп Азр Сіу Зег Нів бег Трг Ф1Уу АБр о Бо 55 во
О1У Те Рто Азр Аге Ре бет біу бег бег бБег Шу Аа Ар Аге 65 до 75
Тут Гей бек Пе бет АбБп І1е біп Рго с1ш Абр бі Аа Меї Тут о во вв 8о їмо) П1е Сув біу Уа! біу Азр Тіг Те Буз біс Сіп Ріє Уаї Туг Уві 98 100 105 60 Рае Оку біу ФІу ТВг о Гув Уа! ТВ Уа! Теп біу бід Рго 110 5 (2) Інформація для ЗЕО ІЮ 46: (І) Характеристики послідовності: 65 (А) Довжина: 118 амінокислот" (В) Тип: амінокислота
(ОБ) Топологія: лінійна (ї) Тип молекули: білок (хі) Опис послідовності: БЕО ІЮ Мо46 бі Уа! біо Тен Уа! бів бег 0іу біу Аєр Шеи Уа! Був Рго ТУ 1 5 | 10 15
Су Бех Без Ту еп бег Су Діа Аа бет Су Рве Тбг Рре бег р) 75 30 70 5ег Тут Фу Меї бег Ттр Пе Аге біб Тіт Рго Авр ув Ате Гей 35 С 45 біо Тгр Уа! Аіо Ту Пе бег бег бу 01у бег Туг Тіг Туг ТуУг 50 55 ГО
Рго Ар Хег Уа! бує С1У Атя Ре Трг Те бег Аг Ар Авт Ав 65 70 75
Туз Авп Тйг Гей Туг Тез бл Мет бет бег Без Гуз бат ОЇ Авр 80 85 5
Тпг Ага Мет Рі Туг Сув Аа Атя бій Трт Тбт Меї ТБ Тут Ре 55 100 б
Аа Туг Ттр Сіу біл (ТУ Ти Бер Уа) Так Уа) бег Да 1 : 15 с (2) Інформація для ЗЕО ІЮ Мо47: і) (І) Характеристики послідовності: (А) Довжина: 116 амінокислот (В) Тип: амінокислота о зо (ОБ) Топологія: лінійна (ї) Тип молекули: білок о (хі) Опис послідовності: БЕО ІЮ Мо47 - біг йеш Уа! їйєц Тіт біп Зег Рго бет Аа бек А1а бег їси (1У « 1 5 юю 15
Ма Вег Уа! ув Ме Тіт був Твт їео Зет Заг бі Ніх бег Тв - 20 25 Ка
Тут Тг Пе бий Тгр Ніб біп біп біп Рго біз бує біу Рго Аг з у 45 «
Туг ви Меї Гуз 16 Гу біп Ахр (Ту Хек Нів бет Тит Фу Авр - с 5 55 60 ч» біу Пе Рго Аер Аге Рі ет (Пу бет бег бег Фу Аа Си АгЕ " 65 70 Гі 15 Тут Геш Тог Пе Зет бетг Бей бів бет бім Ар бі Дів Авр Тут -І 80 85 що
Туг бСуз 01у Уа! бу Абр Тіт Пів Був біз бій Рів Уві Тук Ма! ь 95 10 КБ -й Ре б1у Ф1у ФУ Тг Сув Те) Тс Уа! Без Фу х б по НЕ Щ (42) (2) Інформація для ЗЕО ІЮ Мо48: (І) Характеристики послідовності: (А) Довжина: 118 амінокислот (В) Тип: амінокислота
Ф) (ОБ) Топологія: лінійна ка (ї) Тип молекули: білок (хі) Опис послідовності: БЕО ІЮ Мо48 бо б5 бій Бей Уа бев Тг біп 5ег Рто бег АІа бег Аза бег їв 01У і З 10 Б діа бек Ма! уз ей Те Суз Твйт Тем бег бег біз Нія бег Тіт 70 25 30
Туг Таг Пе Сій Тер Туг біп біп біб Рго 01 Гуз Сіу Рго Туз 35 80 45 / Туг реп Меї Аер Ге Був біп А5р 01у вт Кіз бег Ті Фу Ар» 5 55 60
Фу Не Рго Ар Аге Ре бЗет Сіу бег бег бог біу діа біо АгЕ 55 о 15.
Тут Це Тіт Пе бег Бек Гей біл бег біб Авр бі ліа Авр Туг їз 8о 85 90
Туг бух Фіу Чаї Фіу єр Тіг Ме Гув бі біл Ре Ма! Тух Уаї 85 НН) 105
Рі Фу біу біу ТБт Гуз Гей Торт Уа! Ге біу Сп Рго 20 10 115 (2) Інформація для ЗЕО ІЮ Мо49: (І) Характеристики послідовності: (А) Довжина: 118 амінокислот с 25 (В) Тип: амінокислота о (ОБ) Топологія: лінійна (ї) Тип молекули: білок (хі) Опис послідовності: БЕО ІЮ Мо49 біп Тео Уві Гей ТвВг біп бег Рго бек Аіа бег А!а бег їви (Ту о 30 В 1 5 Ю 15 со діа бет Уві! Цуз Гей Тог бує ТТ Цез бвг бет бів Ні5 бег ТВг - 20 25 0 «
Тут Та Пе біш Тео Тут бід б1п біп Рго 019 ГБуб С1у Рто Був 35 85 40 4 ї-
Туг Ма! Меї Авр Гецу Суб б1п Авр Фу бег Ні бег Тіт (ФУ Авр 5 55 6
Фіу Пе Рго Авр Аг Ріе бег бІу бег бег бет Ту Ата ім АТЕ « 40 - с 65 7 75. . Тут єп Тйг ї1в бег бег Тип бій бех (1 АБр 00» Аа Авр Туг » Во 85 г
Тут Су (у Уа! біу дер Твг Ті Гу 01 біп Рве Уаї Туг Уві 100 І05 - Ре біу 0Іу Сбіу ТНг Буз Те ТВго Уа! Це 01У б1п Рго те 10 и5 - с 50 (2) Інформація для ЗЕО ІЮ Мо50: (І) Характеристики послідовності: 62 (А) Довжина: 118 амінокислот (В) Тип: амінокислота (ОБ) Топологія: лінійна 55 (ї) Тип молекули: білок о (хі) Опис послідовності: БЕО ІЮ Мо50 ко бо б5
Філ Бе Уа! Те) Того філ сет Рго Зег Аа бет Аа щег Теи ФУ 1 5 16 15 й А1в бег Уа! Цує Те Пір Суз Тит Ме бег Зег б1п Вів Зег Тс: 20 25 що
Туг Таг Пе бі Тгв Туг біп біп бій Рго 010 Бу Сіу Рго Ага 35 4 45 710 Туг Пец Меї Абр ем ув біп ср біу бвг Ніє Зег Тг С1У Авр 56 60
Фу Пе Рто Аер Ат Ре бег С1у бег бег баг О1у АВ То Атя 65 70 75 75 Туг Гей Тіг Пе зЗеу бег Тео біп бег біц Абробіш АТа Абр ТУг 80 85 що
Туг Сув С1у Ма! біу Ав Тіт Пе був бів біб Ре Уві Тут Ма! 95 . 10 нь
Ре біу Сіу біу Ті Гуз Гей ТП Уа! Ге) біу біо Рго 720 по п5 (2) Інформація для ЗЕО ІЮ Мо51: (І) Характеристики послідовності: (А) Довжина: 118 амінокислот сч 25 (В) Тип: амінокислота о (ОБ) Топологія: лінійна (ї) Тип молекули: білок (хі) Опис послідовності: БЕО ІЮ Мо51 о зо біб Теми Уа? Бен ТВг Сп бег Рго Зет Ага бег Аа Бег Ген Су
І 5 1 15 о
Аа ет Уа! ув ей Тпг Суб ТВг Тв Зег бег біп Ніб Свт ТВг -- о Кт) «
Тут Шх Пе (Бу Тгр Тус бій біл біло Рто 01и Гуз біу Руо Аге "а 35 40 45
Туг Уа! Мет Авр Теч Ту (іп 45р біу Зег Ні бег ТПіг б1у Авр 50 55 50 «
Фу Пе Рго Авр Агя Ре Зег (Пу бег Зег бег Су Аза бім Аге 85 т» 5 но) с Тут їси ТВ Пе 5ег бег Тео бів Хег їм Авр бін Ага Авр Туг "з о 85 80
Туг був Су Уа! (пу Абр Трт Пе Губ 01 б1п Рпе Ма) Тут Уаї 95 0 15 -І Рпе Шу Сіу біу Тьт Туз їви Тпг Уа! Тер Фу бів Рто мо 115 щ» - (2) Інформація для ЗЕО ІЮ Мо52: (І) Характеристики послідовності: (95) 20 (А) Довжина: 118 амінокислот о (В) Тип: амінокислота (ОБ) Топологія: лінійна (ї) Тип молекули: білок (хі) Опис послідовності: БЕО ІЮ Мо52
Ф) іме) бо б5 біп цез Уа! Мен Тву б) бек Рго бег Аа 5ег Аа Зет Гей Фу
І 5 ю 15
Аа бег Уа! Туз Гео Тк Сув ТВг Ге бег бег ія Ніб бег Тиг 9 29 25 Ко
Туг Твг Пе би Тгр Туг біп бів бій Рго біш Був Сі1у Рго був 35 49 45
Тут Бей Мет Ар Без Був біп Аср біу бет Ніз бег Тіг біу Абр
Фу Пе Рго Авр Агя Рре Зег біу бег бег бег біу АІа 014 Агу 55 70 15
Туг йви Тег Пе бег бег Тен Сп Зег бій Авр бім Аа АБр Туг во 85 50
Пе бСуз О1у Уві СІу Авр Тг Пе був бій б1п Ре Уа! Тут Ха! 85 ЦЮ 105
Ре біу бу С1у Тбг ув їев Твг Уа! Гео Сіу бів Ро по 115 (2) Інформація для ЗЕО ІЮ Мо53: (І) Характеристики послідовності: (А) Довжина: 118 амінокислот сч (В) Тип: амінокислота (ОБ) Топологія: лінійна і) (ї) Тип молекули: білок (хі) Опис послідовності: БЕО ІЮ Мо5З3
Сіп Гез Уа! Гею Твгобіп бетг Ргто бег Аа бег АІа Зет Тез 0ІУ «в 1 5 10 15 со
Аїа бЗег Уві Гуз Бей Трг Суд ТНг Тец бе бег бів Ні бег Ту 20 25 30 --
Тус ТВ Не бій Ттр Туг біп біо біп Рго біш Мув біу Руо Ате «І 35 40 - 45 чн
Туг Тен Меї Ар Те Був Сбіп й5р О1у бег НІВ бег Тк біу Азро. 50 . оо С)
ФУ Пе Рго Ар Аге Рпе Зег біу бех бег бег Оіу Аа бІш АтЕ « 65 7о 75
Тугіви Тіг Ме бег бег їв 012 Зег 015 Аєр СІ Аза Авр Тут З с во 85 Фо :з» Пе Суз біу Уві! біу Аєр Тг Лів ув бічш бій Рію Уа! Тух Уа! 95 що | 105
Рпе б1у 01у 0б1у Твг Гуз Без Тв Уа! бео Фу Сія Рго -і 110 115 т» (2) Інформація для ЗЕО ІЮ Мо54: - (ії) Характеристики послідовності: (А) Довжина: 118 амінокислот (95) 50 (В) Тип: амінокислота о (ОБ) Топологія: лінійна (ї) Тип молекули: білок (хі) Опис послідовності: БЕО ІЮ Мо54
Ф) ко бо б5 біп Сей Уа! Сем ТВі біп бег Рго ет АІа бег ліа Зет Гео б1у 1 5 Но 15
Аза бег Уаї Гуз Гей Твг о Суз Тйробем бег бег біл БПі5 бег ТВ 20 25. КЛ:
Тут Те Пе біч Тор Туг біо біп біп Рго бій Був біу Рго Гуз я г) 45
Туг Уві Мет др Там Гуз біл Азр Сіу бег Ніз бег Їйт бу Абр то 5о ше бо
С1у Пів Рго й5р Агро Рбе бег О1у бег бег бет (Ту Аза Сім Агд 65 п, 15
Туг йец ТВг Пе бет бег Те: біп бет 0Ім Авр 01: Да Авр Туг 80 85 | 90
Пе Су біу Уа! біу А5р Тат Пе ув СБ біп Рпе Ма) Тут Уа! 95 10 5
Ре Сіу Сіу 01у Тг Гуз Без Твг Уа! Тез ФУ бій Рго цо 115 (2) Інформація для ЗЕО ІЮ Мо55: (І) Характеристики послідовності: (А) Довжина: 118 амінокислот (В) Тип: амінокислота сч (ОБ) Топологія: лінійна (ї) Тип молекули: білок (о) (хі) Опис послідовності: ХЕО ІЮ Мо55 сіп о беч Уа! Ген Тр бів Зег Рго 5ег Аза 5ег лів Зег вва у 1 5 10 15 : (ав)
Аїа Зет Ма! Туз вч Тит був Тбт Тев бег бет бій Нів бет ТВг 70 25 30 Гзе)
Тут Твг Пе біх Тр Тук тп бія біо Рго біч Гу ФУ Рто АтЕ - «
Тут Уві! Меї Авр Бех Був бІп Авр 01у бег Ніз бег Тіт б1У Аве
Зо БО 55 80 в.
Фіу Пе Рго Ар Аг Ре Зет б1У бег бет ет С1У Мі8 б1ч Аге 55 70 75
Туг ви Таг Ме Зег Зег ївн С1п бег бі» Авр ІМ Аа Азр Тут « 40 о 8 що шЗ с Пе Сув б1у Ма! Сіу Ар Тит Пе ув біз Оп; Ре Уві ТУг Уві їз» 95 юю КБ
Ре Піу (1у С1у Тіг Був Тез ТВ Уа! Тео О1У біп Рео 35 по П5 -І (2) Інформація для ЗЕО ІЮ Мо56: о (І) Характеристики послідовності: - (А) Довжина: 118 амінокислот (В) Тип: амінокислота (0) Топологія: лінійна о (Ї) Тип молекули: білок о (хі) Опис послідовності: БЕО ІЮ Мо5б
Ф) ко бо б5 біп ув! (Та Теп Уа! 1 бег біу б1у Сіу Ма! Ма) бія Рто (1У 1 5 10 15
Аге бек Бе Аго ій бег був ія А1а бег С1У Ре Тв: Ре баг мл 25 К.В бет Тут Фу Меї бег Тур Уві Аге біп Аа Рго бу Буз Ф1У цей 35 40 45 біз Тгро Узі Ава ТТ Пе бег бег біу О1у бет Туг Тт Туг ТуУг то Бо 5 бо
Рго Авр Хег Уа! бує (у Аге Ріє Трт 116 бет Агро Абр Або ет 85 р Гн
Гуз Ави ТВгоїеш Тут Тез біо Ме? Ася бег Гей ага 18 Фі Ар
Во 85 80
Тьг Аа Чаї Тує Тут був Аа Агя Ф1п Те Тег Меї Тіт Туг Ре 95 10 15
Аїа Тут Тгр Фу біл обіу Тлгоїем Уа! ТвгоМа! бет 5ег 110 5 (2) Інформація для ЗЕО ІЮ Мо57: (І) Характеристики послідовності: (А) Довжина: 411 пар основ (В) Тип: нуклеїнова кислота сч (С) Структура ланцюга: дволанцкжкова (ОБ) Топологія: лінійна і) (і) Тип молекули: кКДНК - ме НК (хі) Опис послідовності: БЕО ІЮ Мо57
АТС ААС ТС 000 СТО АВС ТО АТТ ТС СТТ 00С СТО АТ ТА ААА 045 о
Ме Аєп Ре С1у Цей бег Гео Пе Рве и А1а Бей Пе Геи бух со -15 -Ю0 -5 -
С ОТС САС ТО бАю ста САХ СТО бо бас ТС 00 БА САС ТА 090
Оу Уа! Сіп був бін Уа! Стій цем Уа! бів бег б1У СІУ Авр ем т 1 5 10 - сто ААб ОСТ ОСА 00 ТОС Сто АКА СТО ТС То ОСА ОС КЛ оосА 0135
Маг Суб Рго (Ту Сіу 5ег Тем у Ге бег бух АТа Дія бег (У
ІБ 20 25 ! « 20 ТО АСТ ТС А АОС ТАТ б АТО СТ Об АТТ СОС САб АТ ССА 180 -в с Рпе Тйт Рне бет бег Тут (у Меї бвг Ттр Пе Аг (Іл Тиг Рго . 30 35 40 ,» САС ААС АСО СТО САС ТОб ОТО ОСА АОС АТТ АСТ АСТ бОТ ОСТ АСТ ОО 225
Ар уз Аге Тез Сі Тгр Уа! Аз Ту Ле бег бег б1у біу бег 45 50 55 7 ТАС АСС ТАС ТАТ СА ПАС АСТ ФО АС (06 Спа ТР АСС АТС ТО 0270 «г» Туг ТвВг Тут Тук Рто Ар бег Ма! Ту5 (Ну Аг Ре Торт Ге 5вт - 80 65 | ру
КОА САС ААТ ОСС ВАЗ АС АС СТА ТАС СТО САЛА АТО АС АСТ СТО 0315 і АтЕ Авр Аст Аіа Гу АБпоТг Тай Туг бей біп Ме? бег бег Бей о 75 80 85
АМЄБ ТСТ бАб бАС АСА Об АТО ТТ ТАС ТОЇ ОСА АСА САС АСТ АСТ 0360
Гує бег бі Аер Тит Аа Мес Ріє Тут Сув АІа Атя іп Тг Тог 29 Кі) 95 0
ГФ! АТО АСТ ТАС ТТ ОСТ ТАС тоб сбб САА бо АСТ СТО ІС АСТ СО 0405 юю Мет Тат Тут Ріє Аа Туг Тир Фіу бід Сіу ТВг Цей Уа! Тк Ха! 105 10 115 во ТСТОСА 41 5ег Ага (2) Інформація для ЗЕО ІЮ Мо58: (І) Характеристики послідовності: 65 (А) Довжина: 411 пар основ (В) Тип: нуклеїнова кислота
(С) Структура ланцюга: дволанцюжкова (ОБ) Топологія: лінійна (і) Тип молекули: кКДНК - ме НК (хі) Опис послідовності: БЕО ІЮ Мо58
Кто обо ТР боп Сто Або ТО СТІ Тс Сб ТТ ОСТ СТ ПА АбА 45.
Меї бу Рпе б3у Тер бег Тур Уа! Ре їн Уді Аа їв) їео Ате -15 -Ю -5 70 Сб тс САб ТОТ САС Сто САЄ СТО СТО бАб СТ 606 оба (ОС ОТО 090
Сіу ха! біп Су бів Уа! біп Теи Уві біш Зег б1у Фу біу Уві . о. 5 юЮ
СТО САС СОК (К АСО ТОб СТО ДОА СТО тоб ОТ ОСА ОСС ТС ОА 0135
Уаії біп Рто С1у Ате Зег Меп Ате 12и бет буз Аа Із бег (гу т І5 20 25
ТС АСС ТТ АСТ ОАЄ ТАТ 000 АТО ТТ ТО0 бТо соб САС ОСТ ОСА 0180
Рре Тіг Ре бег бег Тух біу Ме? бег гр Уа! Аг біп Аа Рго
КІ 35 40
Об ЛАЄ ОбО СТО СА ТОб СТО ОСА АОС АТ АСТ АСТ ОБГ ОСТ АСТ 895
Фу Був 01У Ген біо Тгро уз! Аза рт Пе бек бет біу б1у баг 45 50 Бо
ТАС АСС ТАС ТАТ ССА САС АЄТ ОТО ААЗ (бо ОбА ТС АФС АТС РОС 0270
Туг ТВх Туг Туг Рго Дер Зег Ма! Цує С1у Аге Рва Тіг Пе бег сч є в 7о о
АСА САС ААТ ТОС ААб ААС Або СТО ТАТ СТО САА АТО ЛА АОС СТО 0315
Ате Ар Асп бет Цуб Ав ТВ Бей Тук Гей Сіп Ме Авпобег Гео 75 80 85 о со
АСА ОСТ ОАФ САС АС ОСТ СТО ТАТ ТАС ТОТ 00О АСА СЛО АСТ АСТ 360 -
Аге А1а їм дкр Тот Аа Уа! Тут Тут Сув Аза Аге біл Тг ТОг «
Б.) 85 100 ' ї-
АТО АСТ ТАС ТТ ОСТ ТАб Коб 000 САб блА АС СТО ОТО АС СТ 005
Мес Тг Тут Рре Аїв Тут Тго С1у біп бу Того Гей Уа! Тнг Уві
Б | По 5 « тА 411 70 зег Зет як с а (2) Інформація для ЗЕО ІЮ Мо59: "» (І) Характеристики послідовності: (А) Довжина: 11 амінокислот (В) Тип: амінокислота -і (Ю) Топологія: лінійна 1» (ії) Тип молекули: пептид (хі) Опис послідовності: БЕО ІЮ Мо59 яд Бує Аїа Бек біп Авр Маї Аква Тпг Аїз Уг)ї А1а8 се 70 і 5 10 о (2) Інформація для ЗЕО ІЮ Мобо: (І) Характеристики послідовності: (А) Довжина: 7 амінокислот (В) Тип: амінокислота (0) Топологія: лінійна (ії) Тип молекули: пептид
Ф) (хі) Опис послідовності: БЕО ІЮ Мобо їмо) Зах Аіа Бех Азповхо Тух ТП во 1 5 (2) Інформація для ЗЕО ІЮ Моб1: (І) Характеристики послідовності: (А) Довжина: 9 амінокислот (В) Тип: амінокислота бо (ОБ) Топологія: лінійна
(ії) Тип молекули: пептид (хі) Опис послідовності: БЕО ІЮ Моб1 біп біп Нів тТук Бех Тут Рко Ре ТБг 9 о 5 (2) Інформація для ЗЕО ІЮ Моб2: (І) Характеристики послідовності: (А) Довжина: 5 амінокислот (В) Тип: амінокислота то (ОБ) Топологія: лінійна (ії) Тип молекули: пептид (хі) Опис послідовності: ЗЕО ІЮ Моб2
РтІо Тут Тр Меє біп т 1 5 (2) Інформація для ЗЕО ІЮ Моб3: (І) Характеристики послідовності: (А) Довжина: 16 амінокислот (В) Тип: амінокислота (ОБ) Топологія: лінійна (ії) Тип молекули: пептид (хі) Опис послідовності: БЕО ІЮ МобЗ3
Бех Іїе Рбе с1у Азр С1у Авр Трс Аку Тук бек біп був Рпе Пуз б1у с 1 5 10 15 о (2) Інформація для ЗЕО ІЮ Моба: (І) Характеристики послідовності: о зо (А) Довжина: 11 амінокислот (В) Тип: амінокислота со (ОБ) Топологія: лінійна - (ії) Тип молекули: пептид (хі) Опис послідовності: БЕО ІЮ Моб4 «І сіу це Агу Агу 51іу біу Туг Туг Рпе Авр Туг в. 1 Ко 10 (2) Інформація для ЗЕО ІЮ Моб5: (Ї) Характеристики послідовності: З с (А) Довжина: 411 пар основ "» (В) Тип: нуклеїнова кислота " (С) Структура ланцюга: дволанцкжкова (ОБ) Топологія: лінійна (ї) Тип молекули: кКДНК - мРНК ш- (хі) Опис послідовності: БЕО ІЮ Моб5 щ» з АТО бо тоб АСТ ССТ Сто Тс То ТЕ ПОСТІ СТ САТ тоб ТА 45
Мет Аа Тр Тіг Рго 18 Рів Ре Рпе Рів Уа! Гей Ні був ет ' і ---5 ие -5 (42)
Ф) іме) 60 б5
СОТ ТСТ ТС ТО САА СТ СТО СТО АСТ САС ТСА ТТ ТСА бОС СТ 090
Сбіу бек Ріе бег біб Бей Уа! Тез Те бій бек бег бег АІа бег
І 5 15
ТС тоб Сто оба 000 СА ОСА АлА СТО АСО ТОС АОС ТО АСТ АСК 135
Ріе Бех цей 01у іа бег Діа Гує Гей ТВ Суз Ту їм Бег бег 2 25
САС САС ОТ АС ТАС АОС АТ ЛА ТО ТАТ САС САА Сб ССА СС 180 70 (По Чів бет Те Тут Тбт Пе біо ТтроТуг біп Сіп бів Рго Беу
З) З 40
ААС СОТ ОСТ АЛ ТАТ СТО АТО 0АТ СТТ ААб САА САТ БА АОС САС 225
Ту Рго Рто Буз Туг Уві Меї Азр Ген Був (1п Ар біу бег Ні 15 45 5 55
АОС АСА ОБР САТ обо АТ ОСТ ОАТ СОС ТО ТТ ОА ТОБ А ТС 2
Зег Таг біу Ар біу Пе Рго А5р Агя Рре Зег біу бег бег бег ей 65 7
СОТ ОСТ САТ 0 ТАС СТІ АОС АТ ТО ААС АТО САС ССА бАА бАТ 315
Сіу Аза Авр Аге Тут Бєц Зег Пе бег Авт Пе Сіп Рго 01 Авр 75 8 85
САА ОСА АТО ТАС АТО ТТ (01 ОТО 00 САТ АСА АТ АЛ ОДА ОСАА 0960
Сію АЗа Меї Тут Пе бух Піу Уа! б)іу Ар ТБт Пе Був бі бій сч 90 95 10
ЛПОСТО ТАТ СТ ТС ОС 007 000 АОС АЛО СТО АСТ СТС СТА ОСТ 405 і9)
Ре Ма! Туг Ма! Ріє біу б1у (1у Тнг Туз Ма! т Уа! Геп бу 105 10 5 сАбсос 41 о біло Рго со (2) Інформація для ЗЕО ІЮ Мобб: - (І) Характеристики послідовності: (А) Довжина: 405 пар основ « (В) Тип: нуклеїнова кислота ї- (С) Структура ланцюга: дволанцюжкова (ОБ) Топологія: лінійна (і) Тип молекули: кКДНК - ме НК (хі) Опис послідовності: БЕО ІЮ Мобб « - с з -І т» - о 50 «2 (Ф) ко бо б5
АТО ОС тоб АСТ СТ СТО ТТ То ТС ТТ Обі СТЕ САТ ОТОС ТбА 45
Меї Аза Ткр ТвВг Рго Тео Рре Ріе Ре Ріе Уві Те) Ні був бег
І -15 -Ю0 -8
ОСТ ТІСТО ТІЄ ТОС САС СТІ Сб СТб АСТ САЛА ТО0 ССС СТ ОСС Тео
Сіу бет Рпе Бех біл Тен Ма) Те» Ті біп бек Рго баг Аа бег і Б Ю боб тосС Сто бба боб тоб сто ААЄ СТО АСС тоб АС ТО АСТ АС 155
Ма бег Сею б1у Аа бек Уа! Суб Тем Тйт був Ту Тез Зег бег
СА САС АТ АСО ТАС АСС АТР ОДА ТОб САТ САб СА СА СА САС 190 /5 Сів Нв 5ег ТВг Туг ТВг Пе 03 Тгр Нів біт (по бій Рго 01 сто)
АЛ обо ССтТ бос ТАС То АТО АКА СТР ААО САА бАТ БА АОС САС 206 ув біу Рго Агя Туг їей Мет 1ує Сен Бує біо дер біу бЗег Ні й ЕВ 55 20 АБО АСА СОК ПАТ бО0 АТ СОТ САТ СО ТС ТА ОС ТС А 020 бет Тв Сіу Або 1у Пе Рго Авр Агу Ре Зег біу бат бег 5ехг 60 65 70
Фо ост баб СО ТАС СТО АОС АТО ТОС АС СТО САб ТС бАб САТ 815 сч 25 Сіу Ага бін бге Туг Бей ТВг Те бет бег Мец бій бег бій Авр 79 80 85 і9)
САС ОСТ ПАС ТАТ ТАС ТОК ОТ СТО ОбІ САТ АСА АТТ ЛАБ САА СЛА 360 сій Аза Ар Тут Туг був Сіу Уа! б1у Ар Тіг Те Гуз бічш бід 5 55 100 (ав) 30 ТІ ІС ТАС ОТО ТІЄ бос ба боб АС АКА СТО АСС СТ СТА ОСТ 405 со
Ре Уа! Туг Ма! Рне Сіу Фу біу Ті Був Беи Тпг У! їез Оу - 105 1юЮ 115 І « (2) Інформація для ЗЕО ІЮ Моб7: 35 (І) Характеристики послідовності: - (А) Довжина: 411 пар основ (В) Тип: нуклеїнова кислота (С) Структура ланцюга: дволанцкжкова « (ОБ) Топологія: лінійна -о 70 (і) Тип молекули: кКДНК - ме НК с (хі) Опис послідовності: БЕО ІЮ Моб7 з -І т» - о 50 62
Ф) ко бо б5
АТО боб топ АСТ ОСТ СТ ТС ТС ТО т біт СИ САТ ОСС 045
Мет Аа Тгр Тнт Рго Геш Ре Рбе Ріє Ре Ма! Гео Ні був бег -15 -0. -5 сот тст тт тоб САЄ СТТ СТО СТО АСТ САА ТО 00С ТС бос ТЄТ 80
Сіу бег Ре бег й1ю Їєм Ма! Бен Ріг біп бег Рго бег Аа 5ег 1 9 10
ОСС тоб СТО оба бос тоб ото ДАЄ СТО АС ТО АОС ТТ АСТ АТО 1535 7 мів вег од (у Аіа Бет Уві Туз їй Тіт Су Твг 1о Бег Зет
ІВ 20 о
САС САС АСТ АС ТАС АОС АТ САД ТОб ТАТ САб САС САС ОСА САС О189
Сі Нів бег Ту Тут Те Пе бід Тер Тут бів біл біп Руо 01 т Зо 35 40
ААС СБС ОСТ ААб ТАС СТО АТС САТ СТТ ААС САА САТ ОСА АБС САС ОО 295 ув Ф1у Рго Гу Туг Тею Меї Абр Мем Гу б1п Абр Су бег Ні 45 Ко) Ба 720 АбСАСА ОСТ САТ ОО АТ ССТ САТ СОС ТС ТСА ОбСТОСАОСТСТ 2 бег їйе біу Азр біу Не Рго Азр Ат Ре бе О1у бе ет Вег о 85 75 боб ост сАб Сос ТА Сто СС АТС ТО АС СТО САС ТСТ СА САТ 35 с 25 ВІ Ав бів Аго Тут йец Тк Пе бек Зег Деч Фіп Зег 019 Ар о
ШЕ 40 55
САС ОСТ САС ТАТ ТАС ТОТ СОТ ОТО ОСТ ПАТ АСА АТ АС бАА САА ЗБ
Сів Афе Ар Тут Тут Сух Оу Уа! Ф1у Азр ТВ Пе Гуз Оу біл й т ї це о
ТТ СТО ТАССТО ТСОПСОбА СО АССААА СТО АСС СТО СТА бос 405 (зе)
Вре Уа! Тут Маї Ре біу б1у біу Твг бух Бен Те Уві Ге Су «- 105 п)
По ч з5 САпССС 4 -
Оп Ро (2) Інформація для ЗЕО ІЮ Моб8: (І) Характеристики послідовності: «
А) Довжина: 411 пар основ 70 (в) тип нуклеїнова кислота 7 с (С) Структура ланцюга: дволанцюжкова :з» (С) Топологія: лінійна (і) Тип молекули: кКДНК - ме НК (хі) Опис послідовності: БЕО ІЮ Моб8 і. АТО обо То АСТ ОСТ Сто ТІ то тб ТТ Об СП САТ ТО ТА 046 т Ме Аа Тгр Твг Рго 1еи Раю Ріє Ре Ре Ма) Тед Ні Суб Бет -й -5 -ю0 - сю 50 ОбІ СТ ТТ ТС сСАб СТ то СТО АСТ САА Той ббб ТТ ОСС 90 біу бет Ріє бег (іп Бей Уа) Тем Тіт (а бег Рго 5ег А!а бег с і 5 10 со ТС Сто ббА О0С тоб бТС ААб СТО АСС ТоС АС ТІб АСТ АСТ 0135
Аа бег Ген біу А1а бек Уа! Цує Тец Тлг був ТПог 16 бег бег
Ф) ко бо б5
15 Кл) 25
САС САС АСТ АС ТАС АОС АТ СА ТОО ТАТ САб САС САС ССА САС 1850
Сіл Ніз Зег Тбг Тут ТП Пе біч Тгр Туг Фо біл бів Рго 0)
Ки) Зо 43
ААб ОО ОСТ ААб ТАС СТО АТО САТ СТІ ААС САД САТ ба АОС САС ОО 205
Муз біу Рго Цув Тут Ма! Мет Авр Тем бух біл Абр (1У бег Нів 45 Бо 55 то АОС АСА ОСТ САТ 005 АТТ ОСТ САТ СОС ТТО ТСА 00С ТОС АСС СТО 2
Зег Тж (Шу Ар ФУ Пе Рго Авр Аг Ріє бЗег Сіу Зек Бег дег
І) 65 о
Об от оп 00 ТАЄ СТО АС АТС ТО АС СТО АВ ТСТ ОАЄ САТ 315
Фу Аза бю Агя Туг Ме) Тіт Бі бе бет Без біт бег Св Ар 75 80 85
САС ОСТ ОАЄ ТАТ ТАС ТОТ ОСТ 916 001 ОАТ АСА АТ ААС САА САА 300
Фіи АЇа Ар Тут Туг був біу Уа! Фу Авр ТЯГ Пе ув 010 01п 90 95 0
ТТ біо ТАС ОТО ТІ ОС оба соб АС ААА СТО АС ФС СТА 0505
Ре Уа! Туг Угі! Рпе С1у біу бІу Твг Бу Ген ТвгоУаі Бе бу 105 10 5 що 4 Ге! біп Рго о (2) Інформація для ЗЕО ІЮ Мобо: (І) Характеристики послідовності: (А) Довжина: 411 пар основ о (В) Тип: нуклеїнова кислота со (С) Структура ланцюга: дволанцюжкова (0) Топологія: лінійна -- (і) Тип молекули: кКДНК - мРНК" «г (хі) Опис послідовності: БЕО ІЮ Моб69 ч- « ші с ;» -І щ» - о 50 (42)
Ф) іме) 60 б5
АТО Об то АСТ ОТ СТО ТО ТС ТС тост СТІ САТ ОТОС ТСА 45
Мет Аза їтр Твг Рто Ген Ре Ріє Рі Рре Уві! їв Нія Сув бет -15 - -о бот ТСТ ТС тоб САЄ СТ Ото СТ АСТ бля тоб соС тСт СОС ТсТ 90
Су Зег Рре Зег Сіл лем Ма ем Твг Сіп бег Рго бег Аа Бет і 5 Ю 70 ОС ТС сто боА бос тоб сто ААб СТО СС ТоС АСС ТО АСТ АТ ОБ
Аре Зег Ме (у Аза бег Уві Гу5 бец ТВг був Тіт Бви бег бег 2 25
САС САС АСТ АС ТАС АОС АТТ ОАА ТО ТАТ САС САС САС ССА СА 180 15 бій Ні бег Тк Тут Ту Пе бів Тер Туг (о б3уп бів Рго бі 30 35 40
Ас боб ОСТ АС ТАС СТО АТО САТ СТ ААй САА САТ ОА АС САС 255
Був О1у Рго Аге Туг Тез Меї Ар Гей був біп Ав» Оу бех НіЗ
І 45 5о 55
АОС АСА 00Т САТ Об АТТ СС САТ СОС ТІЄ ТСА б0С тоб АОС тот 0970 "Зег Тв 01у Авр С1у Пе Рго дер Аге Ре Зег Су бег бег бЗег 50 85 7 в боб ост од СОС ТАС СТО АСС АТС ТО АОС СТО САС ОТСТ САб ОАТ.О 315 сч
Сіу Аа біш Аге Туг Бей Тит Пе Зег Зег йеп біп бег Ой ар о 75 80 85
САС ОСТ пАЄ ТАТ ТАС ТОЇ ОСТ ОТО 001 САТ АСА АТ ЛАВ СЛА СА ЗО біц Аіа Авр Туг Туг був (бу Уа! біу Авр Тйг Ке ув 010 біт ав ке ж 95 Не со «- « -
ТТ ото ТАС сто ТС ббб ОбА 606 АСС АХА СТО АОС СТО СТА (ОС 5
Рпе Уа! Туг Уа! Рне 01у 01у ФУ Твг Тув 160 Тфг У) їв СУ 105 10
САС 4 но ч
Сів го З с . "» (2) Інформація для ЗЕО ІЮ Мо70: " (І) Характеристики послідовності: (А) Довжина: 411 пар основ (В) Тип: нуклеїнова кислота ш- (С) Структура ланцюга: дволанцюжкова ї5» (ОБ) Топологія: лінійна (і) Тип молекули: КДНК - мРНК - (хі) Опис послідовності: БЕО ІЮ Мо70 о 50 62
Ф) ко бо б5
АТе сс тоб АСТ ОСТ СТО ТтЄ ТС ТС ТТ б СТ САТ ТС ТА 45
Меї Аа Тгр Тіт Рго Гей Ре Рпе Ріє Рпе Уа) їв. Нів Суз бег -І5 -і0 -5 сот тст тт тоб сао СТТ сто СТО АСТ САА ТОо СОС СТ боб 10 бу Зет Ре бег біт Гей Уа! Сем Тс бів бег Рго бег Афа бег 5 ю "бос тес сто ОбА ОСС ТОс СТО ААС СТО АСС ТОС АОС То АСТ АСТ ОО 155 70 ма бег єю біу Ліз Зег Уа! їуз ви Те бує Тіт Тео бег бог
ІБ 20 25
САС САС АСТ АОС ТАС АСС АТТ СА ТОО ТАТ САб САС САС ОСА САС 180 75 біп Ніз бег Трг Туг Тіт Пе б2о Тгр Тут бів Фіп бів Рго бро
КІ 35 до
ААй бос ССТ АОС ТАС СТ АТб САТ СТТ АД САА САТ бОА АБС САС 225 ух (у Ртго Атя Тут Уа! Мет Авр Тец Бу біп Авр біу Зег Нів ще 50 55 що АОС АСА СОТ САТ 005 АТТ ОСТ САТ 00 ТІ ТСА 006 ОС АбСТСТ Ю.О
Бег Тпг (у Азр Су Пе Ріо Авр Атя Рпе бет О1У бег Зег беї бо бо ЛІ сбо ОСТ САС Сб ТАС СТ АОС АТС ТОС АОС СТС СА ТСТ СА САТ ОО 315 с біу Аіа бії Аге Тут Меч Тс Те бет бег Те Сб)іп бег бій Дер І ге) 75 о 85
САС ОСТ САС ТАТ ТАС ТОТ ОТ СТО ОбТ САТ АСА АТ АС ОДА САА 0360
СТш Аа Авр Туг Туг Суб біу Ма! біу Аєр Тіт Пе Ту 01 Оп о зо 90 96 100
ТТ сто ТАС бій То 0ОС ОбА боб АС ААА СТО АСС ОТС СТА ОС ОС 405 о о Рре Уаї Туг Уа! Рве біу с!у біу Тіт Гує Тео ТТ У! Бе) С1У - 105 | 10 115 «г
СА 4
Фарю - (2) Інформація для ЗЕО ІЮ Мо71: (І) Характеристики послідовності: « (А) Довжина: 411 пар основ (В) Тип: нуклеїнова кислота - с (С) Структура ланцюга: дволанцоккова а (ОБ) Топологія: лінійна "» (і) Тип молекули: кКДНК - ме НК (хі) Опис послідовності: БЕО ІО Мо71 -І щ» - о 50 (42)
Ф) іме) бо б5
АТО То АС ОХ СО ТТ ТТ То ТТ ОТ СТ САТ ТОС ТА ОС
Мех Ме Тер Тх Рго Тем Ре Ріє Ре Ре Ма! Бей Віз Су баг -Б -Ю З
ОО ТЕ ТО; СА0 СМ б СТО АТ СА ТО ОТ СТ)
Су бег Рре баг б1в їем Уа! Тен Ти біп бег Рго бег Аа бе
І 5 10 70 ФО Сто 00 00 Тобто ААо СТО АОС ТО; А То АСТ АВТО 15
Ав бег 1 СТУ Аа баг а 1уз Тер Твг був Тіт Тв ет бег
Б г в
САС САС АСТ АС; ТАЄ АОС АТ ЛА ТО; ТАТ СА; САС САС СсА СЛОВО
Сп Ще бег Те Тут Твг Пе обо Тер Туг бів біз біп Рго бо
КО ке г
ДАО боб ОСТ Ал ТАЄ СТО АТО САТ СТІ ЛАЄ СА САТ А М САС 205
Щув (у Рго ув Туг Се Моє Авр їей Тує біп Аер СТУ бег Ні 5 | У Ко
МК АСА ОТ (АТ (бо АТ С САТ 00 ТР ТА 000 ТС АТО)
Сет Ти бу Ар біу Ме Руо Абр Ате Ре бву СТУ бог бог ду
Ф бо 70 с ж ОСТ баб (Є ТАЄ СТ АС АТС ТОС ЛОБ СТО САб ТОК б АТО 35 Ге)
СТУ Аа ба Аг Тут їви Тйг Не бег бек Тео Сів Зет От Ар
Б 8 85.
СА СТ САС ТАТ АТС ТО ОТ СТО ОТ САТ АСА АТ НАС ОА САА 960 | «в) бім Аа Авр Тут Пе Сув біу Ха! С1у Авр ТВ Пе Су Сім Сіп со у 5 10 -
ТТ ОТ ТАЄ (п ТО 00С ОбА (00 АС АД СТО М ОС СА 045
Пре Уа! Тут Уа! Рре б1у Фу б1у Тік Цув їв Пт Ха! Ге бу З
МБО По 15 -
СО 4 | -
ВИШ Я У У | шу, « (2) Інформація для ЗЕО ІЮ Мо72: (Ї) Характеристики послідовності: З с (А) Довжина: 411 пар основ "» (В) Тип: нуклеїнова кислота " (С) Структура ланцюга: дволанцюжкова (ОБ) Топологія: лінійна (ї) Тип молекули: кКДНК - мРНК ш- (хі) Опис послідовності: БЕО.ІЮ Мо72 г» - о 50 (42)
Ф) іме) 60 б5
АТО КС ТО СТ СС СТО ТТ тт ТС ОП б СТ САТ ТО ТА 55
Ме: дів Тгр Твг о Рго Бец Рйе Рпе Ре Ре Уа! Тев Ніб Суб бег -15 -0 -5 й ост ст тс тоС САб Стт ото СТО АСТ САА ТОб СОС ТС ОСТ 90
СіУ Зег Ре Хвг Сів Теп Уа! Те) ТВг бів бет Рго 5ег Ліва 5ег і 5 ю соб тос Сто СсА бос тоб Сто ААС СТЄ АОС ТОС АСС То АСТ АВТ ОО35
Аа Зет еп біу Кіз Зех Маї Був їм Тит Сув Тг Мем бет бег и 25
САС САС АСТ АСВ ТАС АОС АТІ САА ТОб ТАТ САб САб САб ОСА САС 180 бій Віз бет Твг Туг Тс Пе би Тер Туг бій біл біля Рго (фо юю 15 Зо 35
АКА СОС ОСТ АФ ТАС СТО АТО САТ СТТ ААС САА САТ ОБА АОС САС ОО 225
Гув С1у Рто Агу Тут їеп Меї Ар Тен Був біп Авр біу бег Ні 45 5 55 р АОС АСА бої САТ 006 АТТ ОСТ ст СОС ТІ ТСА 00С тоб АС СТО
Заг ТВг б1у Авр біу Пе Рго Азр Агя Ре бег СУ бег 5вг Заг 50 65 70 в Об ОТ СА Об ТАС СТО АС АТО ТО Або СТО САб ТТ САС САТ 315 см (Фу Аа бій Агя Тут Тер Тіт Пе бек бег Тео біл бег (Фу ер о
То 80 85
САС ОСТ ПАС ТАТ АТС ТОР ОТ СТ ТО САТ АБА АТІ ЛА САА САА 300 бі Аза Ар Тут Ме Суз біу Уа! бу Авр Тбг Пе Бу бі (іп (ав) що 95 10 с
ТИ ФО ТАС сто То 000 ОА 00 АС ЛАА СТО АС ОТ СТА боб о 405 «-
Рпе Уві Туг Ма! Ріє біу біу біу ТВг Гуз Тен ТБг Уа! Цен СУ 105 110 115 « сабо 4 їч-
Ста Рго Й (2) Інформація для ЗЕО ІЮ Мо73: (І) Характеристики послідовності: « дю (А) Довжина: м пар основ з (В) Тип: нуклеїнова кислота с (С) Структура ланцюга: дволанцкжкова :з» (ОБ) Топологія: лінійна (і) Тип молекули: кКДНК - ме НК 15 (хі) Опис послідовності: БЕО ІЮ Мо7З -І щ» - с 50 (42)
Ф) іме) бо б5
АТО Особ Тбо АСТ ОСТ СТО ТТ ТС ТС ТИ ОТ СТІ САТ ТС ТА 5
Меє Ага Тгр Тпг Рго Ге) Ре Ріе Ріє Ріє Уа! Пеш Нів був бет щі: ИН -юЮ -5
О0Т ТТ ТС ТО сАб СТ бо Сто АСТ САА ТОБ ОСС СТ СТО 90
Сіу бег Рре бег біп Пец Уві еп Таг біп бег Рго бЗег Аа бег 1 5 юю соб тоб Сто О0А обо тоб Сто АС Сто АС ТОС АС ТТБ ОТ АТ 135 70 Аха Хег Тем ФУ Аа баг Уа! Був Меп ТЬг був Твг Тез бег бег 2 25
САС САС АСТ АСО ТАС АОС АТ СА ТОб ТАТ СА САС СА СА бАЄ 180 (п Ні бег Тог Туг Тго Пе біб Тер Тут біо б)п біп Рго бій 15 Ки 95 40
АС ОбС ССТ ААС ТАС СТО АТО САТ СТЕ АЛ САА АТ ОА АОС САС 225
Тув Фу Рго Гуз Туг Уві Меї Азр Тез Бу біз Азр (1У бех Ні «5 Бо "ББ
ДОС АСА бат САТ Сб АТ ОСТ САТ СОС ТТо ТСА боб тоб АС ТО 0270
БЗег Тіг біу Ар біу Пе Рго Авр Аги Рре бег Сіу Бег бет бег 60 65 Що) соб бсСт сло СОС ТАС СТО АСС АТО Тос АОС Сто СА ТТ АС АТ 35 с
С1у Аїа біи Агя Туг Без Твгт Ріє его бЗег Тео біп бег біо Азр о 7 І 80 85
САС ОСТ САС ТАТ АТС ТСТ ОСТ ОТО О6Т САТ АСА АТТ ВАС бАА САА ЗБ
Січ Аа Ар Тут Пе Суб Сіу Уа! йіу Авр Тіг (12 Суб сій бія о 95 10 | «в) тт ото ТАС сто То Об оса пбо АС АЛА СТО АС СТО СТА ОС 0405
Ре Уаі Тут Уа! Ріе Сіу біу біу ТвВг Був бен ТВг Уа! Геч С1У ме) 105 1ю 115 «- сабо 4 віп Ртго то. | « (2) Інформація для ЗЕО ІЮ Мо74: - (І) Характеристики послідовності: (А) Довжина: 411 пар основ (В) Тип: нуклеїнова кислота « (С) Структура ланцюга: дволанцюжкова (Юр) Топологія: лінійна - с (і) Тип молекули: кКДНК - ме НК "з (хі) Опис послідовності: БЕО ІЮ Мо74 п -І щ» - о 50 (42)
Ф) іме) 60 б5
АТО бос тоб АСТ ОСТ Сто ТС ТО То ТТ СТ СТІ САТ ТОС ТА 45
Мет Аза Тир Тйг Рго їви Ре Рре Ре Рве У! Мей Нів був 5ег -5 І -5 9 от ст то тес сАб Стт То Сто АСТ САА ОТО ОСС НТ СТ
Фу бег Ріє бег біа ви Уа! Тем Те бір бег Рго 5ег Ага 5ег 1 5 10
СОС ТОС Сто СоА ОО ТО ТС АЛ СТО АСС ТС СС ТО ОТ МИ 155 170 Аа бегІвц (у Аа Зег Уа! Ту5 Тео Ту був Тіт Гео бег ет
І5 20 25
СА САС АСТ АСО ТАС АСС АТ бАА ТО ТАТ САС САб САС ОСА САС 190
Сіп Кіз Зег ТЬг Туг Тіт Пе біз Тур Тут біп бів бій Рго бій
Кк 35 в) 79 вАбож ост А ТАС СТО АТО САТ СТІ АЛ САЛА САТ ОСА АОС САС 225
ГЦув СТУ Рго Агд Тут Ма! Мет Авр Ге ув біп Аєр (1у бег Ніз 85 50 55 ух АС АСА Об САТ 05 АТ СОТ САТ СС ТТ ТСА обс тоб АС ТС 270
Зег Тіг Фу Авр у Це Рго Ахр Ате Ре бег Су бег бат бег 50 б5 Де)
ОО СТ САС СОС ТАС СТО АС АТО ТО АФС СТ САС ТТ САС САТ 35
СТУ Ма (Пи Атя Туг Теи Таг Пе бег бег Тез бів бег бів Авр с 29 75 | В 85 Ге)
САС ОСТ САС ТАТ АТС ТОГО ОО ОТО ОСТ САТ АСА АТТ ААО САА СЛА 360 (Ти Аа Абр Тут Пе Сув біу Уа! (Лу Авр ТВг Ме Іду СІВ бів в 95 1 о
ТП Ст ТАС ОТО ТС 000 осА ж АС АлЛА СТО АОС ОТО СТА 000 0405
Ре Уа! Туг Ма! Рів б1у б1у б1у Тіт Був бви Те Уа! Без 01у со 105 й 10 115 -
САС ОС 4 «Е біо Рго і - (2) Інформація для ЗЕО ІЮ Мо75: (І) Характеристики послідовності: (А) Довжина: 34 амінокислоти « (В) Тип: амінокислота (С) Структура ланцюга: - с (ОБ) Топологія: лінійна а (ії) Тип молекули: пептид "» (хі) Опис послідовності: БЕО ІЮ Мо75 но
Claims (6)
- Формула винаходу -І е 1. Застосування антитіла проти білка, спорідненого з паратиреоїдним гормоном (РТНгГР), або його - функціонально активного фрагмента і/або його модифікованого фрагмента, що має таку саму активність по с 50 Відношенню до білка, для виробництва лікарського засобу для профілактики або лікування кахексії.
- 2. Застосування за п. 1, відповідно до якого антитіло являє собою гуманізоване або химерне антитіло.
- о З. Застосування за п. 2, відповідно до якого гуманізоване антитіло являє собою гуманізоване антитіло, продуковане гібридомою 223-57-137-1 (ЕРЕКМ ВР-5631).
- 4. Застосування за п. 1, відповідно до якого антитіло являє собою моноклональне антитіло.
- 5. Застосування за будь-яким з пп. 1-4, відповідно до якого кахексія викликана злоякісною пухлиною.
- 6. Застосування за будь-яким з пп. 1-4, відповідно до якого речовина характеризується тим, що вона о (а) має активність у профілактиці або лікуванні кахексії і ко (Б) не має значної активності у інгібуванні росту клітин пухлини ОСС-1. бо б5
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP12550597 | 1997-05-15 | ||
| JP19444597 | 1997-07-18 | ||
| PCT/JP1998/002116 WO1998051329A1 (fr) | 1997-05-15 | 1998-05-13 | Remede contre la cachexie |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| UA74130C2 true UA74130C2 (uk) | 2005-11-15 |
Family
ID=26461935
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| UA99126675A UA74130C2 (uk) | 1997-05-15 | 1998-05-13 | ЗАСТОСУВАННЯ АНТИТІЛА ПРОТИ БІЛКА, СПОРІДНЕНОГО З ПАРАТИРЕОЇДНИМ ГОРМОНОМ (PTHrP), АБО ЙОГО ФУНКЦІОНАЛЬНО АКТИВНОГО ФРАГМЕНТА І/АБО ЙОГО МОДИФІКОВАНОГО ФРАГМЕНТА ДЛЯ ВИРОБНИЦТВА ЛІКАРСЬКОГО ЗАСОБУ ДЛЯ ПРОФІЛАКТИКИ АБО ЛІКУВАННЯ КАХЕКСІЇ |
Country Status (19)
| Country | Link |
|---|---|
| US (2) | US20020165363A1 (uk) |
| EP (1) | EP1004313B1 (uk) |
| KR (1) | KR100508338B1 (uk) |
| CN (1) | CN1329080C (uk) |
| AT (1) | ATE361099T1 (uk) |
| AU (1) | AU750021C (uk) |
| BR (1) | BR9809629A (uk) |
| CA (1) | CA2289910A1 (uk) |
| DE (1) | DE69837707T2 (uk) |
| ES (1) | ES2285769T3 (uk) |
| HK (1) | HK1029047A1 (uk) |
| IL (1) | IL132896A0 (uk) |
| NO (1) | NO995558L (uk) |
| PL (1) | PL193575B1 (uk) |
| SK (1) | SK155799A3 (uk) |
| TR (1) | TR199902800T2 (uk) |
| TW (1) | TWI227140B (uk) |
| UA (1) | UA74130C2 (uk) |
| WO (1) | WO1998051329A1 (uk) |
Families Citing this family (44)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| IL129164A (en) | 1996-09-26 | 2007-05-15 | Chugai Pharmaceutical Co Ltd | An antibody against peptides associated with human parathyroid hormone |
| US20020137890A1 (en) * | 1997-03-31 | 2002-09-26 | Genentech, Inc. | Secreted and transmembrane polypeptides and nucleic acids encoding the same |
| ES2285769T3 (es) | 1997-05-15 | 2007-11-16 | Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha | Remedio para la caquexia. |
| WO2001002011A1 (fr) * | 1999-07-02 | 2001-01-11 | Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha | REMEDES CONTRE LES MALADIES CAUSEES PAR PTH OU PTHrP |
| TWI255718B (en) | 1999-07-02 | 2006-06-01 | Chugai Pharmaceutical Co Ltd | Ameliorative agent for low vasopressin concentration |
| JP4846169B2 (ja) | 2000-04-28 | 2011-12-28 | 中外製薬株式会社 | 細胞増殖抑制剤 |
| EP1849479A1 (en) * | 2000-08-16 | 2007-10-31 | Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha | Ameliorating agent for symptoms resulting from joint diseases |
| JP2003021631A (ja) * | 2001-05-10 | 2003-01-24 | Chugai Pharmaceut Co Ltd | 骨転移抑制剤のスクリーニング方法 |
| DOP2006000277A (es) | 2005-12-12 | 2007-08-31 | Bayer Pharmaceuticals Corp | Anticuerpos anti mn y métodos para su utilización |
| US8062864B2 (en) | 2007-05-21 | 2011-11-22 | Alderbio Holdings Llc | Nucleic acids encoding antibodies to IL-6, and recombinant production of anti-IL-6 antibodies |
| US20090238825A1 (en) * | 2007-05-21 | 2009-09-24 | Kovacevich Brian R | Novel rabbit antibody humanization methods and humanized rabbit antibodies |
| US7906117B2 (en) * | 2007-05-21 | 2011-03-15 | Alderbio Holdings Llc | Antagonists of IL-6 to prevent or treat cachexia, weakness, fatigue, and/or fever |
| US9701747B2 (en) | 2007-05-21 | 2017-07-11 | Alderbio Holdings Llc | Method of improving patient survivability and quality of life by anti-IL-6 antibody administration |
| US8404235B2 (en) | 2007-05-21 | 2013-03-26 | Alderbio Holdings Llc | Antagonists of IL-6 to raise albumin and/or lower CRP |
| US8252286B2 (en) | 2007-05-21 | 2012-08-28 | Alderbio Holdings Llc | Antagonists of IL-6 to prevent or treat thrombosis |
| NZ581596A (en) | 2007-05-21 | 2012-02-24 | Alderbio Holdings Llc | Antibodies to il-6 and use thereof |
| US8178101B2 (en) | 2007-05-21 | 2012-05-15 | Alderbio Holdings Inc. | Use of anti-IL-6 antibodies having specific binding properties to treat cachexia |
| US8257684B2 (en) * | 2008-03-26 | 2012-09-04 | Neurosigma, Inc. | Methods for identifying and targeting autonomic brain regions |
| US8420089B2 (en) | 2008-11-25 | 2013-04-16 | Alderbio Holdings Llc | Antagonists of IL-6 to raise albumin and/or lower CRP |
| US9452227B2 (en) | 2008-11-25 | 2016-09-27 | Alderbio Holdings Llc | Methods of treating or diagnosing conditions associated with elevated IL-6 using anti-IL-6 antibodies or fragments |
| US8337847B2 (en) | 2008-11-25 | 2012-12-25 | Alderbio Holdings Llc | Methods of treating anemia using anti-IL-6 antibodies |
| US8323649B2 (en) * | 2008-11-25 | 2012-12-04 | Alderbio Holdings Llc | Antibodies to IL-6 and use thereof |
| US8992920B2 (en) | 2008-11-25 | 2015-03-31 | Alderbio Holdings Llc | Anti-IL-6 antibodies for the treatment of arthritis |
| US9212223B2 (en) | 2008-11-25 | 2015-12-15 | Alderbio Holdings Llc | Antagonists of IL-6 to prevent or treat thrombosis |
| US9724410B2 (en) | 2009-11-24 | 2017-08-08 | Alderbio Holdings Llc | Anti-IL-6 antibodies or fragments thereof to treat or inhibit cachexia, associated with chemotherapy toxicity |
| US9775921B2 (en) | 2009-11-24 | 2017-10-03 | Alderbio Holdings Llc | Subcutaneously administrable composition containing anti-IL-6 antibody |
| CA2789125A1 (en) | 2010-02-10 | 2011-08-18 | Novartis Ag | Methods and compounds for muscle growth |
| CA2818813C (en) | 2010-11-23 | 2020-10-06 | Alder Biopharmaceuticals, Inc. | Anti-il-6 antibodies for the treatment of oral mucositis |
| EP2671585B1 (en) | 2011-01-31 | 2016-07-13 | Toray Industries, Inc. | (-)-17-(cyclopropylmethyl)-3,14ß-dihydroxy-4,5a-epoxy-6ß-[N-methyl-trans-3-(3-furyl)acrylamido]morphinan for use in treating or preventing cancer cachexia |
| WO2013167298A1 (en) | 2012-05-11 | 2013-11-14 | Kael-Gemvax Co., Ltd. | Anti-inflammatory peptides and composition comprising the same |
| CN104661672B (zh) | 2012-05-11 | 2017-03-08 | 珍白斯凯尔有限公司 | 用于预防或治疗败血症的组合物 |
| EP2873678A4 (en) | 2012-07-11 | 2016-05-18 | Gemvax & Kael Co Ltd | PEPTIDE PENETRATING IN A CELL, CONJUGATED COMPRISING SAME, AND COMPOSITION COMPRISING SAME |
| CN105263508B (zh) | 2013-04-19 | 2019-10-25 | 珍白斯凯尔有限公司 | 治疗和预防缺血性损伤的组合物 |
| RU2677277C2 (ru) | 2013-06-07 | 2019-01-16 | Джемвакс Энд Каэл Ко., Лтд. | Биологические маркеры, которые могут быть использованы в иммунотерапии рака |
| ES2808076T3 (es) | 2013-06-21 | 2021-02-25 | Gemvax & Kael Co Ltd | Regulador de la secreción hormonal, composición que lo contiene y procedimiento para controlar la secreción hormonal mediante su uso |
| CA2926183C (en) | 2013-10-23 | 2018-07-03 | Gemvax & Kael Co., Ltd. | Composition for treating and preventing benign prostatic hyperplasia |
| US10034922B2 (en) | 2013-11-22 | 2018-07-31 | Gemvax & Kael Co., Ltd. | Peptide having angiogenesis inhibitory activity and composition containing same |
| JP6367950B2 (ja) | 2013-12-17 | 2018-08-01 | ジェムバックス アンド カエル カンパニー，リミティド | 前立腺癌治療用組成物 |
| US9937240B2 (en) | 2014-04-11 | 2018-04-10 | Gemvax & Kael Co., Ltd. | Peptide having fibrosis inhibitory activity and composition containing same |
| CN106659149B (zh) | 2014-04-30 | 2020-05-19 | 珍白斯凯尔有限公司 | 用于器官、组织或细胞移植的组合物、试剂盒和移植方法 |
| KR102413243B1 (ko) | 2014-12-23 | 2022-06-27 | 주식회사 젬백스앤카엘 | 안질환 치료 펩티드 및 이를 포함하는 안질환 치료용 조성물 |
| WO2016137162A1 (ko) | 2015-02-27 | 2016-09-01 | 주식회사 젬백스앤카엘 | 청력 손상 방어용 펩타이드 및 이를 포함하는 조성물 |
| ES2886946T3 (es) | 2015-07-02 | 2021-12-21 | Gemvax & Kael Co Ltd | Péptido con efecto antiviral y composición que lo contiene |
| US10898540B2 (en) | 2016-04-07 | 2021-01-26 | Gem Vax & KAEL Co., Ltd. | Peptide having effects of increasing telomerase activity and extending telomere, and composition containing same |
Family Cites Families (36)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4771124A (en) | 1987-05-26 | 1988-09-13 | Merck & Co., Inc. | Parathyroid hormone antagonists with simplified synthetic methodology |
| EP0293130A3 (en) * | 1987-05-26 | 1990-06-13 | Merck & Co. Inc. | Dimers of parathyroid hormone antagonists |
| EP0293158A3 (en) | 1987-05-26 | 1990-05-09 | Merck & Co. Inc. | Parathyroid hormone antagonists |
| US5001223A (en) | 1987-05-26 | 1991-03-19 | Merck & Co., Inc. | Parathyroid hormone antagonists with enhanced metabolic properties |
| JPH03504605A (ja) | 1988-05-27 | 1991-10-09 | セントカー・インコーポレーテツド | 抗体産生物の凍結乾燥した配合物 |
| JPH03504499A (ja) | 1988-05-27 | 1991-10-03 | セントカー・インコーポレーテツド | 抗体試薬のための配合物 |
| IL162181A (en) | 1988-12-28 | 2006-04-10 | Pdl Biopharma Inc | A method of producing humanized immunoglubulin, and polynucleotides encoding the same |
| US5217896A (en) * | 1988-12-30 | 1993-06-08 | Oncogene Science, Inc. | Monoclonal antibodies recognizing parathyroid hormone-like protein |
| JPH02207099A (ja) | 1989-02-07 | 1990-08-16 | Tonen Corp | ＰＴＨｒＰ関連ペプチド、その製造法及び用途 |
| CA2035179C (en) | 1990-01-31 | 2001-08-14 | Gerald S. Brenner | Pharmaceutical compositions containing insoluble salts of bisphosphonic acids |
| GB9009548D0 (en) | 1990-04-27 | 1990-06-20 | Celltech Ltd | Chimeric antibody and method |
| JPH04228089A (ja) * | 1990-05-15 | 1992-08-18 | Kanegafuchi Chem Ind Co Ltd | 高カルシウム血症治療・予防剤 |
| CA2087190A1 (en) * | 1990-07-13 | 1992-01-14 | Fred E. Cohen | Parathyroid hormone analogues modified at positions |
| DE69233472T2 (de) | 1991-04-05 | 2006-02-09 | The General Hospital Corp., Charlestown | Parathormonrezeptor und dafür codierende DNA |
| JP3370324B2 (ja) | 1991-04-25 | 2003-01-27 | 中外製薬株式会社 | ヒトインターロイキン−６受容体に対する再構成ヒト抗体 |
| ATE220100T1 (de) | 1991-12-20 | 2002-07-15 | Yamanouchi Pharma Co Ltd | Mit gp11b/iiia reaktive humane antikörper |
| US5648267A (en) | 1992-11-13 | 1997-07-15 | Idec Pharmaceuticals Corporation | Impaired dominant selectable marker sequence and intronic insertion strategies for enhancement of expression of gene product and expression vector systems comprising same |
| US5849695A (en) | 1993-01-13 | 1998-12-15 | The Regents Of The University Of California | Parathyroid hormone analogues useful for treatment of osteoporosis and disorders of calcium meatabolism in mammals |
| JP3504697B2 (ja) | 1993-09-30 | 2004-03-08 | 株式会社先端生命科学研究所 | ＰＴＨｒＰアンタゴニスト活性を有するポリペプチド及びそれを含むカルシウム代謝治療薬 |
| JPH07316195A (ja) | 1994-05-25 | 1995-12-05 | Nippon Kayaku Co Ltd | 新規なＰＴＨｒＰ関連ペプチド及びその用途 |
| CO4410206A1 (es) * | 1994-07-28 | 1997-01-09 | Sandoz Ag | DERIVADOS DE PTH o PTHrP, SU PREPARACION Y COMPOSICIONES FARMACEUTICAS QUE LAS COMPRENDEN |
| US5993817A (en) | 1995-01-23 | 1999-11-30 | Xenotech | Method to ameliorate osteolysis and metastasis |
| WO1996022790A1 (en) * | 1995-01-23 | 1996-08-01 | Xenotech Incorporated | Composition to ameliorate osteolysis and metastasis |
| US5626845A (en) * | 1995-01-23 | 1997-05-06 | Xenotech Incorporated | Method to ameliorate osteolysis and metastasis |
| US6787518B1 (en) | 1995-02-20 | 2004-09-07 | Yukio Kato | Therapeutics of osteoarthritis and inflammatory joint disease |
| EP0812207B1 (en) | 1995-03-01 | 2000-11-02 | Stryker Corporation | Morphogen-induced dentine regeneration |
| ATE390933T1 (de) | 1995-04-27 | 2008-04-15 | Amgen Fremont Inc | Aus immunisierten xenomäusen stammende menschliche antikörper gegen il-8 |
| US5660826A (en) | 1995-06-06 | 1997-08-26 | The Regents Of The University Of California | Therapeutic sepsis treatment using antagonists to PTHrP |
| US6342477B1 (en) | 1996-02-01 | 2002-01-29 | Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha | Remedies for thrombocytopenia |
| IL129164A (en) | 1996-09-26 | 2007-05-15 | Chugai Pharmaceutical Co Ltd | An antibody against peptides associated with human parathyroid hormone |
| JP4372240B2 (ja) | 1997-05-15 | 2009-11-25 | 中外製薬株式会社 | 悪液質治療剤 |
| ES2285769T3 (es) | 1997-05-15 | 2007-11-16 | Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha | Remedio para la caquexia. |
| JP4414494B2 (ja) | 1998-02-03 | 2010-02-10 | 旭化成ファーマ株式会社 | 白血球減少症の予防剤および治療剤 |
| CA2327509A1 (en) | 1998-05-05 | 1999-11-11 | Societe De Conseils De Recherches Et D'applications Scientifiques (S.C.R | Pth2 receptor selective compounds |
| JP2000080100A (ja) | 1998-06-17 | 2000-03-21 | Japan Tobacco Inc | 副甲状腺ホルモン関連タンパクに対するヒトモノクローナル抗体 |
| WO2000000219A1 (fr) | 1998-06-26 | 2000-01-06 | Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha | Remedes contre des crises d'hypercalcemie |
-
1998
- 1998-05-13 ES ES98919584T patent/ES2285769T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1998-05-13 CN CNB988050951A patent/CN1329080C/zh not_active Expired - Fee Related
- 1998-05-13 SK SK1557-99A patent/SK155799A3/sk unknown
- 1998-05-13 AT AT98919584T patent/ATE361099T1/de not_active IP Right Cessation
- 1998-05-13 TR TR1999/02800T patent/TR199902800T2/xx unknown
- 1998-05-13 CA CA002289910A patent/CA2289910A1/en not_active Abandoned
- 1998-05-13 BR BR9809629-0A patent/BR9809629A/pt not_active Application Discontinuation
- 1998-05-13 US US09/423,800 patent/US20020165363A1/en not_active Abandoned
- 1998-05-13 EP EP98919584A patent/EP1004313B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1998-05-13 AU AU72369/98A patent/AU750021C/en not_active Ceased
- 1998-05-13 WO PCT/JP1998/002116 patent/WO1998051329A1/ja active IP Right Grant
- 1998-05-13 UA UA99126675A patent/UA74130C2/uk unknown
- 1998-05-13 IL IL13289698A patent/IL132896A0/xx unknown
- 1998-05-13 KR KR10-1999-7010572A patent/KR100508338B1/ko not_active IP Right Cessation
- 1998-05-13 DE DE69837707T patent/DE69837707T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1998-05-13 PL PL336797A patent/PL193575B1/pl unknown
- 1998-05-15 TW TW087107554A patent/TWI227140B/zh not_active IP Right Cessation
-
1999
- 1999-11-12 NO NO995558A patent/NO995558L/no not_active Application Discontinuation
-
2000
- 2000-11-28 HK HK00107626A patent/HK1029047A1/xx not_active IP Right Cessation
-
2003
- 2003-01-08 US US10/337,981 patent/US7468184B2/en not_active Expired - Fee Related
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| HK1029047A1 (en) | 2001-03-23 |
| AU750021C (en) | 2003-10-16 |
| NO995558D0 (no) | 1999-11-12 |
| US20020165363A1 (en) | 2002-11-07 |
| US7468184B2 (en) | 2008-12-23 |
| IL132896A0 (en) | 2001-03-19 |
| KR20010012613A (ko) | 2001-02-15 |
| EP1004313B1 (en) | 2007-05-02 |
| TR199902800T2 (xx) | 2000-04-21 |
| PL336797A1 (en) | 2000-07-17 |
| CN1255858A (zh) | 2000-06-07 |
| SK155799A3 (en) | 2000-06-12 |
| BR9809629A (pt) | 2000-07-04 |
| WO1998051329A1 (fr) | 1998-11-19 |
| ATE361099T1 (de) | 2007-05-15 |
| DE69837707D1 (de) | 2007-06-14 |
| CA2289910A1 (en) | 1998-11-19 |
| KR100508338B1 (ko) | 2005-08-17 |
| PL193575B1 (pl) | 2007-02-28 |
| EP1004313A1 (en) | 2000-05-31 |
| AU7236998A (en) | 1998-12-08 |
| ES2285769T3 (es) | 2007-11-16 |
| AU750021B2 (en) | 2002-07-11 |
| EP1004313A4 (en) | 2005-01-19 |
| DE69837707T2 (de) | 2008-01-10 |
| US20030138424A1 (en) | 2003-07-24 |
| TWI227140B (en) | 2005-02-01 |
| CN1329080C (zh) | 2007-08-01 |
| NO995558L (no) | 2000-01-12 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| UA74130C2 (uk) | ЗАСТОСУВАННЯ АНТИТІЛА ПРОТИ БІЛКА, СПОРІДНЕНОГО З ПАРАТИРЕОЇДНИМ ГОРМОНОМ (PTHrP), АБО ЙОГО ФУНКЦІОНАЛЬНО АКТИВНОГО ФРАГМЕНТА І/АБО ЙОГО МОДИФІКОВАНОГО ФРАГМЕНТА ДЛЯ ВИРОБНИЦТВА ЛІКАРСЬКОГО ЗАСОБУ ДЛЯ ПРОФІЛАКТИКИ АБО ЛІКУВАННЯ КАХЕКСІЇ | |
| Roitelman et al. | Immunological evidence for eight spans in the membrane domain of 3-hydroxy-3-methylglutaryl coenzyme A reductase: implications for enzyme degradation in the endoplasmic reticulum | |
| Neumann et al. | An alternative amino-terminus expressed in the central nervous system converts agrin to a type II transmembrane protein | |
| JP5507242B2 (ja) | 酵素補充療法用医薬組成物 | |
| EA026129B1 (ru) | АНТИГЕНСВЯЗЫВАЮЩИЕ БЕЛКИ ЧЕЛОВЕКА, КОТОРЫЕ СВЯЗЫВАЮТСЯ С β-КЛОТО, РЕЦЕПТОРАМИ FGF И ИХ КОМПЛЕКСАМИ | |
| UA118749C2 (uk) | Конструкція антитіла до cdh19 і cd3 | |
| UA125718C2 (uk) | Композиції антитіл до ror1 і пов'язані з ними способи | |
| HU228477B1 (en) | Pd-1, a receptor for b7-4, and uses therefor | |
| CN113164589A (zh) | 用于调节单核细胞和巨噬细胞发炎表型的组合物和方法以及其免疫疗法用途 | |
| AU2024201797A1 (en) | Methods of treating lysosomal disorders | |
| UA80819C2 (en) | Phosphonate analogs of compounds inhibiting hiv proteases, pharmaceutical composition on their basis and their use | |
| UA127450C2 (uk) | Рекомбінантний поліпептид, що зв'язується з cd123 | |
| CA2587921A1 (fr) | Netrine 4 mutee, ses fragments et leur utilisation comme medicaments | |
| CN110072888B (zh) | 药剂、用途和方法 | |
| PT2620451T (pt) | Métodos para inibir a ligação da endosialina a ligandos | |
| KR20120051603A (ko) | 항카드헤린 항체 | |
| EA003187B1 (ru) | Лиганд, родственный фактору некроза опухоли | |
| CN109477114A (zh) | 治疗癌症的针对癌胚抗原相关细胞粘附分子6的car免疫细胞 | |
| CN109913422A (zh) | 一种包含肿瘤抗原识别受体的免疫细胞及其应用 | |
| PT96509A (pt) | Anticorpos recombinantes humanos anti-cd18 | |
| UA58489C2 (uk) | Модулятори функцій рецепторів fas | |
| US8440185B2 (en) | Compositions and methods for the treatment of immunologic disorders | |
| EP2402439B1 (en) | A method for preparing a hybridoma cell by transplanting breast cancer cells | |
| CN102988957A (zh) | 应用分泌型卷曲相关蛋白的药用组合物和方法 | |
| HU230373B1 (hu) | Mitogén aktivitású Bv8-nukleinsavak és polipeptidek |