EA003187B1 - Лиганд, родственный фактору некроза опухоли - Google Patents

Abstract

Описаны лиганд, родственный фактору некроза опухоли (TRELL), новый член семейства факторов некроза опухоли (TNF), модифицированный TRELL и содержащие их фармацевтические композиции.

Description

Данное изобретение относится к лиганду, родственному фактору некроза опухоли или ТВЕЬЬ, полипептиду, который является членом семейства факторов некроза опухоли. Этот белок или его рецептор могут иметь противораковые и/или иммунорегуляторные применения. Кроме того, клетки, трансфицированные геном ТКЕЬЬ, могут быть использованы в генной терапии для лечения опухолей, аутоиммунных и воспалительных заболеваний или наследственных генетических нарушений.

Изобретение, описанное здесь, было сделано частично в ходе работы по гранту № 31-

42275.94 и 32-41729.94 для 1гепе Оагаа от Швейцарского Национального Фонда. Сохраненные права описаны в параграфах № 28 и 29 законодательного акта Швейцарского Национального Фонда.

Цитокины, родственные фактору некроза опухоли (ТИР), являются медиаторами защитных сил организма и иммунорегуляции. Члены этого семейства существуют в мембраносвязанных формах, действуя локально через контакт клетки с клеткой, или в виде секретируемых белков, способных диффундировать к более отдаленным мишеням. Параллельное семейство рецепторов сигнализирует о присутствии этих молекул, приводя к инициации некроза клеток или клеточной пролиферации и дифференцировке в ткани-мишени. В настоящее время ТИРсемейство лигандов и рецепторов имеет, по меньшей мере, 9 признанных пар рецепторлиганд, в том числе: ТИР:ТИР-В; ЬТ-а:ТИР-В; ЬТ-а/в:ЬТ-в-В; РазЦРаз; СП40Ь:СП40; СБ30Ь: СБ30; СП27Ь:СЭ27; ОХ40Ь:ОХ40 и 4-1ВВЬ:41ВВ. Последовательности ДНК, кодирующие эти лиганды, имеют только от примерно 25% до примерно 30% идентичности даже в наиболее родственных случаях, хотя аминокислотное родство составляет примерно 50%.

Было найдено, что определяющим признаком этого семейства рецепторов цитокинов является обогащенный цистеином внеклеточный домен, первоначально обнаруженный молекулярным клонированием двух отличающихся рецепторов ТИР.¹ Это семейство генов кодирует гликопротеины, характерные для трансмембранных белков типа I с внеклеточным лигандсвязывающим доменом, одним проходящим через мембрану районом и цитоплазматическим районом, участвующим в активации клеточных функций. Обогащенный цистеином лигандсвязывающий район обнаруживает прочно связанный, соединенный дисульфидными связями, центральный домен (кор), который, в зависимости от конкретного члена семейства, повторяется много раз. Большинство рецепторов имеют четыре домена, хотя их может быть всего лишь три или даже шесть.

Белки в ТИР-семействе лигандов характеризуются коротким И-концевым отрезком обычно коротких гидрофильных аминокислот, часто содержащим несколько остатков лизина или аргинина, которые, как полагают, являются стоп-транспортными последовательностями. Далее следует трансмембранный район и внеклеточный район варьирующей длины, который отделяет С-концевой рецептор-связывающий домен от мембраны. Этот район иногда называют стеблем. С-концевой связывающий район содержит основную массу белка и часто, но не всегда, содержит сайты гликозилирования. Эти гены лишены классических сигнальных последовательностей, характерных для мембранных белков типа I, и являются мембранными белками типа II с С-концом, лежащим вне клетки, и коротким И-концом, находящимся в цитоплазме. В некоторых случаях, например, в случае ТИР и ЬТ -α, расщепление в районе стебля может иметь место на ранних стадиях процессинга белка, и тогда лиганд обнаруживается прежде всего в секретируемой форме. Однако большинство лигандов существует в мембраносвязанной форме, опосредуя локализованную передачу сигнала.

Структура этих лигандов была хорошо определена кристаллографическим анализом ТИР, ЬТ-α и СБ40С ТИР и лимфотоксин-α (ЬТ-α) оба имеют структуру сэндвича из двух антипараллельных β-складчатых листов с топологией _)е11у го11 (рулета с джемом) или греческого ключа.² Среднеквадратичное (гтз) отклонение между остатками Са- и β-цепей равно 0,61 С, что предполагает высокую степень сходства в их молекулярной топографии. Структурным признаком, обнаруженным из молекулярных исследований СО40Ц ТИР и ЬТ-α, является склонность к сборке в олигомерные комплексы. Присущим этой олигомерной структуре является образование сайта связывания рецептора в месте соединения между соседними субъединицами, образующими мультивалентный лиганд. Было показано, что четвертичные структуры ТИР, СБ40Б и ЬТ-α существуют в виде тримеров, согласно анализу их кристаллических структур. Многие консервативные в различных лигандах аминокислоты расположены в каркасе, имеющем β-складчатую структуру. Вероятно, эта основная складчатая сэндвич-структура сохраняется во всех этих молекулах, так как участки этих каркасных последовательностей являются консервативными в различных членах этого семейства. Четвертичная структура может быть также сохранена, так как конформация субъединиц, по-видимому, остается одинаковой.

Члены семейства ТИР можно наилучшим образом охарактеризовать как главные переключатели в иммунной системе, регулирующие как выживание, так и дифференцировку клеток. Только ТИР и ЬТ-α признаны в настоящее время в качестве секретируемых цитокинов, противопоставляемых другим преимущественно мем браносвязанным членам семейства ΤΝΡ. В то время как мембранная форма ΤΝΡ была хорошо охарактеризована и, по-видимому, играет уникальные биологические роли, секретируемый ΤΝΡ действует в качестве основного участника передачи сигнала тревоги клеткам, более отдаленным от места запускаемого события. Таким образом, секреция ΤΝΡ может усиливать явление, приводящее к хорошо описанным изменениям в выстилке сосудистой сети и воспалительному состоянию клеток. В противоположность этому, мембраносвязанные члены этого семейства посылают сигналы через ΤΝΡрецепторы типа I только к клеткам в прямом контакте. Например, Т-клетки обеспечивают опосредованную С'Э40 помощь только тем Вклеткам, с которыми осуществлен непосредственный контакт через взаимодействия с родственными Т-клеточными рецепторами (ΤΟΚ.взаимодействия). Подобные ограничения межклеточных контактов, накладываемые на способность вызывать гибель клеток, относятся к хорошо изученной Гак-системе.

Способность индуцировать запрограммированную гибель клеток является важным и хорошо изученным признаком нескольких членов семейства ΤΝΡ. Рак-опосредованный апоптоз играет, по-видимому, роль в регуляции аутореактивных лимфоцитов на периферии и, возможно, в тимусе (Сакбо е1 а1., 1996), и недавняя работа также подразумевает участие систем ΤΝΡ и СЭ30 в выживании Т-клеток и линий крупных клеток анапластической лимфомы (Лшаказга е1 а1., 1996; Сгикк е1 а1., 1994; 8у1\\п е1 а1., 1996; Ζ1κη§ е1 а1., 1995). Нами и другими показано ранее, что смерть этой линии в ответ на передачу сигнала ΤΝΡ, Рак или БРЬ-рецептором имеет черты апоптоза (АЬгеи-Магбп е1 а1., 1995; Вго\\йпд е1 а1., 1996).

По-видимому, ΤΝΡ-лиганды могут быть подразделены на три группы на основе их способности индуцировать гибель клеток (таблица III). Во-первых, ΤΝΡ, Рак-лиганд и ΤΗΛΕ могут эффективно индуцировать гибель клеток во многих линиях и их рецепторы, по-видимому, имеют определенные канонические домены гибели клеток. Предположительно лиганд к ΌΚ.-3 (ΤΗΑΜΡ/Α8Τ-1) должен также входить в эту категорию. Кроме того, имеются лиганды, которые запускают слабый сигнал гибели, ограничивающийся несколькими типами клеток, и примерами этого класса являются ΤΚΕΤΤ, лиганд СЭ30 и ΤΤα1β2. Как эта группа может запускать гибель клеток в отсутствие канонического домена смерти, является интересным вопросом и предполагает, что существует отдельный механизм передачи слабого сигнала гибели клеток. Наконец, имеются члены, которые не могут эффективно доставлять сигнал смерти клеток. Возможно, все группы могут оказывать антипролиферативное действие на некоторые типы клеток после индуцирования клеточной диффе ренцировки, например, СЭ40 (РипакокЫ е1 а1., 1994).

Семейство ΤΝΡ поразительно увеличилось в последние годы и включает в себя, по меньшей мере, 11 различных путей передачи сигнала, включающих в себя регуляцию иммунной системы. Характер экспрессии ΤΡΕΡΤ и ΤΗΛΕ указывает на то, что в этом семействе должно быть раскрыто еще большее функциональное разнообразие. Этот аспект выдвинулся особенно на первый план после недавнего обнаружения двух рецепторов, которые влияют на способность репликации вируса саркомы Рауса и вируса простого герпеса, а также исторических наблюдений, что ΤΝΡ обладает антивирусной активностью, и поксвирусы кодируют ΤΝΡрецепторы-ловушки (Вго)а1ксН е1 а1., 1996;

Мойдотегу е1 а1., 1996; 8тбб, 1994; УаккаШ, 1992). Генерирование растворимого ΤΚΕΤΤ и идентификация ΤΚΕΤΤ-рецептора должны обеспечить инструменты для выяснения биологической функции этого интересного белка.

ΤΝΡ является медиатором септического 3 шока и кахексии и участвует в регуляции развития гемопоэтических клеток.⁴ По-видимому, он играет главную роль в качестве медиатора воспаления и защиты против бактериальных, вирусных и паразитарных инфекций⁵, а также обладает противоопухолевой активностью⁶. ΤΝΡ участвует также в различных аутоиммунных заболеваниях.⁷ ΤΝΡ может продуцироваться несколькими типами клеток, в том числе макрофагами, фибробластами, Т-клетками и природными клетками-киллерами.⁸ ΤΝΡ связывается с двумя различными рецепторами, каждый из которых действует через специфические внутриклеточные молекулы передачи сигнала, приводя таким образом к различным эффектам ΤΝΡ.⁹ ΤΝΡ может существовать либо в мембраносвязанной форме, либо в виде растворимого секретируемого цитокина.¹⁰

ΤΤ-α имеет многие общие активности с ΤΝΡ, а именно связывание с ΤΝΡрецепторами¹¹, но, в противоположность ΤΝΡ, по-видимому, секретируется активированными Т-клетками и некоторыми β-лимфобластоидными опухолями.¹² Гетеромерный комплекс ΤΤ-α и ΤΤ-β является мембраносвязанным комплексом, который связывается с ЬТ-βрецептором¹³. ΤΤ-система (ΤΤ и ΗΤ-Κ.), повидимому, участвует в развитии периферических лимфоидных органов, так как генетическое разрушение ΤΤ-β приводит к дезорганизации Ти В-клеток в селезенке и отсутствию лимфатических узлов¹⁴. ΤΤ-β-система также участвует в гибели клеток некоторых аденокарциномных клеточных линий.¹⁵

Ρак-^, другой член семейства ΤΝΡ экспрессируется преимущественно на активированных Т-клетках.¹⁶ Он индуцирует гибель клеток, несущих его рецептор, в том числе опухо левых клеток и ВИЧ-инфицированных клеток, по механизму, известному как запрограммированная гибель клеток, или апоптоз.¹⁷ Кроме того, недостаточность либо Рак, либо Рак-Ь может приводить к лимфопролиферативным нарушениям, подтверждающим роль Рак-системы в регуляции иммунных ответов . Рак-система участвует также в повреждении печени, вызы19 ваемом хроническим гепатитом, и в аутоиммунитете у ВИЧ-инфицированных пациентов.²⁰ Рак-система участвует также в разрушении Тклеток у ВИЧ-инфицированных пациентов.²¹ ТК.Л1Ь, другой член этого семейства, также, повидимому, участвует в гибели большого разнообразия трансформированных клеточных линии разного происхождения.

ί.Ό40-Κ другой член семейства ΤΝΡ экспрессируется на Т-клетках и индуцирует регуляцию СИ40-несущих В-клеток.²³ Кроме того, изменения в гене СГО40-Е приводят к заболеванию, известному как Х-сцепленный гипер-1дМсиндром.²⁴ Система СИ40 участвует также в различных аутоиммунных заболеваниях²⁵, и известно, что СО40-Б обладает антивирусными свойствами.²⁶ Хотя система СИ40 участвует в спасении апоптотических В-клеток,²⁷ в неиммунных клетках она индуцирует апоптоз²⁸. Многие дополнительные лимфоцитарные члены семейства ΤΝΡ также участвуют в костимуля29 ции.

В общем, члены семейства ΤΝΡ играют фундаментальную регуляторную роль в регуляции иммунной системы и активации защитных систем хозяина. При текущем прогрессе в манипулировании членами семейства ΤΝΡ для терапевтических целей вероятным является то, что члены этого семейства могут обеспечить уникальные средства для борьбы с заболеваниями. Некоторые из лигандов этого семейства могут непосредственно индуцировать апоптотическую гибель многих трансформированных клеток, такие, например, как ЬТ, ΤΝΡ, Раклиганд и ТРЛ1Б (Иада!а, 1997). Активация Рак и, возможно, ΤΝΒ и СИ30-рецептора может индуцировать гибель клеток в нетрансформированных лимфоцитах, что может являться иммунорегуляторной функцией (А шакала е! а1., 1996; №да1а. 1997; 8у1\\п е! а1., 1996; 2йепд е! а1., 1995). Как правило, гибель запускается после агрегации доменов гибели, которые находятся на цитоплазматической стороне ΤΝΒрецепторов. Домен гибели управляет ансамблем различных компонентов передачи сигнала, которые приводят к активации каскада (Иада1а, 1997). Некоторые рецепторы лишены канонических доменов гибели, например, ΕΤ-β-рецептор и СГО30 (Вгсшпшд е! а1., 1996; Ьее е! а1., 1996), но все еще могут индуцировать гибель клеток, хотя и более слабо. Вероятно, эти рецепторы функционируют прежде всего, индуцируя дифференцировку клеток, и гибель клеток является аберрантным последствием в некоторых транс формированных клеточных линиях, хотя эта картина является неясной, так как исследования на СИ30-нуль-мыши предполагают, что гибель вызывается негативной селекцией в тимусе (Ашака^а е! а1., 1996). Наоборот, передача сигнала через другие пути, такие как СИ40, необходима для поддержания выживания клеток. Таким образом, существует необходимость в идентификации и характеристике дополнительных молекул, являющихся членами семейства ΤΝΕ и тем самым обеспечении дополнительных средств регуляции заболевания и манипулирования иммунной системы.

Таким образом, данное изобретение относится к полипептиду, лиганду, называемому ΤΡΕΡΕ·, родственному фактору некроза опухоли, который, по существу, устраняет одну или несколько проблем, обусловленных ограничениями и недостатками родственного уровня знаний. Заявитель обнаружил новый член ΤΝΕсемейства цитокинов и определил аминокислотную последовательность этого белка человека и мыши, а также последовательности ДНК, кодирующие этот белок. Заявленное изобретение может быть использовано для идентификации новых диагностических и терапевтических средств для многочисленных заболеваний и состояний, как обсуждается более детально ниже, а также для получения информации об иммунной системе и ее процессах и манипулировании ими. Кроме того, заявленное изобретение относится к индукции гибели клеток в карциноме.

Дополнительные признаки и преимущества данного изобретения будут изложены в следующем далее описании и частично будут очевидны из этого описания или могут быть обнаружены при применении на практике данного изобретения. Цели и другие преимущества данного изобретения будут также реализованы и достигнуты при помощи композиций и способов, конкретно указанных в описании и формуле изобретения, а также в прилагаемых рисунках.

Таким образом, для достижения этих и других преимуществ и в соответствии с целью данного изобретения, включенного и широко описанного здесь, данное изобретение включает в себя последовательность ДНК, кодирующую ΤΡΕΕΕ. Нуклеотидная последовательность для мышиного ΤΡΕΧΕ (ιηΤΡΕΕΕ) показана в 8ЕЦ ГО № 1 и для человеческого ΤΡΕΕΕ- (11ΤΡΕΕΕ) в 8ΕΟ ГО № 3. Конкретно, данное изобретение относится к последовательностям ДНК, которые кодируют ΤΡΕΕΕ, имеющий аминокислотную последовательность, представленную в 8ΕΟ ГО № 2 (ιηΤΡΕΕΕ) или 4 (11ΤΡΕΕΕ-). В других вариантах воплощения данное изобретение относится к последовательностям, которые имеют, по меньшей мере, 50% гомологию с ДНК, кодирующей С-концевой рецептор-связывающий домен ΤΡΕΕΕ, и гибридизуются с заявленными последовательностями ДНК или их фрагмента003187 ми и которые кодируют ТКЕЬЬ, имеющий последовательность, показанную в ЗЕО ГО № 4 или ЗЕО ГО № 2.

Данное изобретение в определенных вариантах относится, кроме того, к последовательности ДНК, кодирующей ТКЕЬЬ, где эта последовательность оперативно связана с регуляторной последовательностью экспрессии. Любая подходящая регуляторная последовательность экспрессии применима в заявленном изобретении и может быть легко выбрана специалистом в данной области.

Данное изобретение рассматривает также рекомбинантную ДНК, содержащую последовательность, кодирующую ТКЕЬЬ, или ее фрагмент, а также хозяев со стабильно интегрированными последовательностями ТКЕЬЬ, введенными в их геном, или обладающую эписомными элементами. Любой подходящий хозяин может быть применен в этом изобретении и он может быть легко выбран специалистом в данной области без чрезмерного экспериментирования.

В других вариантах данное изобретение относится к способам получения, по существу, чистого ТКЕЬЬ, включающим в себя стадию культивирования трансформированных хозяев, и к ТКЕЬЬ, по существу, не содержащему обычно связанных с ним белков животных.

Данное изобретение включает в себя ТКЕЬЬ, имеющий аминокислотную последовательность, идентифицированную в ЗЕО ГО № 4 или ЗЕО ГО № 2, а также его фрагменты или гомологи. В различных вариантах аминокислотная и/или ДНК-последовательность ТКЕЬЬ может содержать консервативные вставки, делеции и замены, описанные ниже, или может содержать фрагменты указанных последовательностей.

Данное изобретение относится в других вариантах к растворимым конструкциям ТКЕЬЬ, которые могут быть использованы для непосредственного запуска опосредованных ТКЕЬЬ фармакологических событий. Такие события могут иметь полезную терапевтическую ценность в лечении рака или в манипулировании иммунной системы для лечения иммунологических заболеваний. Растворимые формы ТКЕЬЬ могут быть генетически переконструированы для включения в них легко узнаваемого маркера с облегчением тем самым идентификации ТКЕЬЬ-рецепторов.

В других вариантах данное изобретение относится к способам генной терапии, в которых используют описанный и заявленный здесь ТКЕЬЬ.

Фармацевтические препараты данного изобретения, возможно, могут включать в себя фармацевтически приемлемые носители, адъюванты, наполнители или другие фармацевтические композиции и могут вводиться в любой из многочисленных форм или любым способом, известными в данной области.

Должно быть понятно, что как предыдущее общее описание, так и последующее подробное описание являются примерными и приведенными для объяснений и предназначены для дополнительного объяснения заявленного изобретения.

Сопутствующие рисунки включены для обеспечения дополнительного понимания данного изобретения и включены в описание и представляют собой часть данного описания, иллюстрируют некоторые варианты данного изобретения и вместе с описанием служат для объяснения принципов данного изобретения.

Краткое описание рисунков

Фиг. 1 - сравнение аминокислотных последовательностей ТКЕЬЬ человека (ЗЕО ГО N0:4) и мыши (ЗЕО ГО N0:2).

Фиг. 2А и 2В - сравнение аминокислот членов семейства Т№ человека.

Фиг. 3 - Нозерн-анализ экспрессии мРНК ТКЕЬЬ в различных мышиных клеточных линиях и тканях. Дорожки даны в двух повторностях и содержат РНК из (1) индуцированных тиогликолатом перитонеальных макрофагов, (2) костного мозга, (3) селезенки и (4) печени.

Фиг. 4 - Нозерн-анализ экспрессии мРНК ТКЕЬЬ в различных тканях человека.

Фиг. 5 - электрофорез в полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия (ДСНПААГ) рекомбинантных ΕΝΕ, ЬТ-α, и ТКЕЬЬ (обозначаемого здесь как ТХУЕАК) при восстанавливающих и невосстанавливающих условиях.

Фиг. 6 - ТКЕЬЬ является цитотоксичным для линии НТ29 аденокарциномы человека.

A. Способность Т№, ТКЕЬЬ, ЬТа/β и анти-Еак блокировать рост линии НТ29 в присутствии интерферона-γ человека. Клетки росли в течение 4 дней в присутствии различных агентов, и рост оценивали с применением МТТокрашивания.

B. Морфология клеток, подвергшихся гибели. Клетки предварительно выращивали в течение 2 дней и затем обрабатывали в течение 24 ч 80 Е/мл γ-интерферона без дополнительных добавок (А), или добавляли 100 нг/мл рекомбинантного ТКЕЬЬ (В). Клетки фиксировали этанолом и окрашивали 1 мкг/мл красителя Нос5с1Д для выявления ядер. На верхней панели показаны фазово-контрастные изображения, а на нижней панели - хроматин, окрашенный красителем Нос5с1И.

Теперь будут подробно описаны предпочтительные варианты данного изобретения. Это изобретение относится к последовательностям ДНК, которые кодируют ТКЕЬЬ человека или мыши, их фрагментам и гомологам, и к экспрессии этих последовательностей ДНК в хозяевах, трансформированных ими. Данное изобретение относится к применениям этих последовательностей ДНК и пептидов, кодируемых ими. Кроме того, данное изобретение включает в себя как человеческие, так и мышиные аминокислотные последовательности для ТКЕЬЬ или их фрагменты, а также фармацевтические композиции, содержащие их или полученные из них.

А. Определения.

Гомологичный здесь означает сходство между последовательностями сравниваемых молекул. Когда положение в обеих из сравниваемых последовательностей занято одной и той же мономерной субъединицей основания или аминокислоты, например, если положение в каждой из двух молекул ДНК занято аденином, то эти молекулы являются гомологичными в данном положении. Процент гомологии между двумя последовательностями является функцией числа совпадающих или гомологичных положений, имеющихся в обеих последовательностях, деленной на число сравниваемых положений х 100. Например, если 6 из 10 этих положений в двух последовательностях являются совместимыми или гомологичными, то эти две последовательности являются на 60% гомологичными. В качестве примера, последовательности ДНК АТТ6СС и ТАТ66С имеют 50% гомологию. Как правило, сравнение выполняют, когда две последовательности выстраивают параллельно одна другой, для получения максимальной гомологии.

Очищенный препарат или по существу очищенный препарат полипептида здесь обозначает полипептид, который был отделен от других белков, липидов и нуклеиновых кислот, с которыми он обычно встречается. Предпочтительно, этот полипептид отделен также от других веществ, например, антител, матриксов и т.д., которые используют для его очистки.

Трансформированный хозяин здесь обозначает любого хозяина со стабильно интегрированной последовательностью, т. е. последовательностью ТКЕЬЬ, введенной в его геном, или хозяина, обладающего последовательностью, например, ТЛЕТЬ, кодирующей эписомные элементы.

Обработка здесь включает в себя любую терапевтическую обработку, например, введение терапевтического агента или вещества, например, лекарственного средства.

По существу очищенная нуклеиновая кислота, например, по существу очищенная ДНК, является нуклеиновой кислотой, (1) которая является одной из нуклеиновых кислот или обеими из них: не смежной непосредственно с одной из последовательностей или с обеими последовательностями, например, кодирующими последовательностями, с которыми она является непосредственно смежной (т.е. одной на 5'-конце и другой на З'-конце) в природновстречающемся геноме организма, из которого эта нуклеиновая кислота получена; или (2) ко торая, по существу, не содержит последовательности нуклеиновой кислоты, с которой она встречается в организме, из которого эта нуклеиновая кислота получена. Этот термин включает в себя, например, рекомбинантную ДНК, которая включена в вектор, например, в автономно реплицирующиеся плазмиду или вирус, или в геномную ДНК прокариота или эукариота, или которая существует в виде отдельной молекулы (например, фрагмента кДНК или геномной ДНК, полученного при помощи ПЦР или обработкой рестриктазами), независимой от других последовательностей ДНК. По существу чистая ДНК включает в себя также рекомбинантную ДНК, которая является частью гибридного гена, кодирующего ТКЕЬЬ.

Термины пептиды, белки и полипептиды используются здесь взаимозаменяемо.

Термин биологически активный здесь означает имеющуюся ίη νίνο или ίη νίίτο активность, которая может проявляться непосредственно или опосредованно. Например, биологически активные фрагменты ТКЕЬЬ могут иметь 70% аминокислотную гомологию с активным сайтом ТВЕЬЬ. более предпочтительно, по меньшей мере, 80% и, наиболее предпочтительно, по меньшей мере, 90% гомологию. Идентичность или гомология в отношении ТКЕЬЬ определена здесь как процент аминокислотных остатков в последовательности-кандидате, которые идентичны остаткам ТКЕЬЬ в 8ЕО ГО № 2 или 4.

Применение на практике данного изобретения будет использовать, если нет других указаний, общепринятые способы биологии клеток, культуры клеток, молекулярной биологии, трансгенной биологии, микробиологии, способов рекомбинантных ДНК и иммунологии, которые находятся в рамках квалификации в данной области. Такие способы описаны в литера30 туре.

В. Последовательности ДНК данного изобретения.

Как здесь описано, один аспект данного изобретения показывает, по существу, чистую (или рекомбинантную) нуклеиновую кислоту, которая включает в себя нуклеотидную последовательность, кодирующую полипептид ТКЕЬЬ, такую как ДНК, представленная в 8ЕО ГО № 1 или 3, и/или эквиваленты таких нуклеиновых кислот. Термин нуклеиновая кислота здесь может включать в себя фрагменты и эквиваленты, такие, например, как последовательности, кодирующие функционально эквивалентные пептиды. Эквивалентные нуклеотидные последовательности могут включать в себя последовательности, которые отличаются одним или несколькими нуклеотидными заменами, добавлениями или делециями, такие как аллельные варианты, мутации и т.д., и включают в себя последовательности, которые отличаются от нуклеотидной последовательности, коди рующей ТЯЕЬЬ, показанной в 8ЕО ГО № 1 или 3, вследствие вырожденности генетического кода. Авторы изобретения секвенировали человеческую ДНК 1936 п.н., которая содержит открытую рамку считывания, кодирующую полипептид ТКЕЬЬ, имеющий последовательность из 248 аминокислот, представленную в 8ЕО ГО № 4.

Автор изобретения описывает здесь как человеческие, так и мышиные последовательности; изобретение будет описано в основном со ссылкой на человеческие последовательности, хотя специалисту в данной области будет понятно, что в изобретение включены также мышиные последовательности. Поразительным признаком ТКЕЬЬ является консервативность большой последовательности рецепторсвязывающего домена между мышью и человеком; только Еак-лиганд приближается к такому уровню консервативности. Как мышиный, так и человеческий белки ТКЕЬЬ имеют все характеристики семейства ΊΝΡ, т.е. организацию мембранного белка типа II и сохранение мотивов последовательности, участвующих в упаковке белка в антипараллельную β-складчатую структуру ΤΝΕ.

Нуклеотидная последовательность для тТЯЕЬЬ представлена в 8ЕО ГО № 1; аминокислотная последовательность для тТКЕЬЬ изображена в 8ЕО ГО № 2. Последовательность ДНК и аминокислотная последовательность для ЙТЯЕЬЬ представлены в 8ЕО ГО № 3 и 4, соответственно.

Последовательности данного изобретения могут быть использованы для получения ряда ДНК-зондов, которые применимы в скрининге многочисленных коллекций природных и синтетических ДНК на присутствие последовательностей ДНК, которые кодируют ТКЕЬЬ или его фрагменты или производные. Специалисту в данной области будет понятно, что ссылка ТКЕЬЬ, используемая здесь, относится также к его биологически активным производным, фрагментам или гомологам.

Последовательности ДНК, кодирующие ТКЕЬЬ данного изобретения могут быть использованы для получения пептидов ТКЕЬЬ экспрессией в различных прокариотических и эукариотических хозяевах, трансформированных ими. Эти пептиды ТКЕЬЬ могут быть использованы в противораковых и иммунорегуляторных приложениях. Как правило, это предусматривает стадии культивирования хозяина, трансформированного молекулой ДНК, содержащей последовательность, кодирующую ТКЕЬЬ, оперативно соединенную с регуляторной последовательностью экспрессии.

Последовательности ДНК и рекомбинантные молекулы ДНК данного изобретения могут экспрессироваться в разнообразных комбинациях хозяин-вектор. Например, применимые векторы могут состоять из сегментов хромосом ных, нехромосомных или синтетических последовательностей. Экспрессирующие векторы данного изобретения характеризуются, по меньшей мере, одной регуляторной последовательностью экспрессии, которая может быть оперативно связана с последовательностью ДНК ТКЕЬЬ, встроенной в этот вектор, для управления экспрессией и регуляции экспрессии этой последовательности ДНК.

Кроме того, в каждом экспрессирующем векторе могут быть выбраны различные сайты для встраивания последовательности ТКЕЬЬ данного изобретения. Эти сайты обычно обозначаются рестриктазой, которая их разрезает, и эти сайты и рестриктазы хорошо известны специалистам в данной области. Конечно, понятно, что экспрессирующий вектор, применимый в этом изобретении, не обязательно должен иметь сайт рестриктазы для инсерции желательного фрагмента ДНК. Вместо этого вектор может быть клонирован в этот фрагмент альтернативными способами. Экспрессирующий вектор и, в частности, сайт, выбранный в нем для встраивания выбранного фрагмента ДНК, и его оперативное связывание в нем с регуляторной последовательностью экспрессии, определяются различными факторами. Эти факторы включают в себя, но не ограничиваются ими, размер экспрессируемого белка, чувствительность желательного белка к протеолитическому расщеплению ферментами клетки-хозяина, количество сайтов, чувствительных к конкретной рестриктазе, загрязнение или связывание экспрессируемого белка белками клетки-хозяина, которые могут оказаться трудно удаляемыми во время очистки. Дополнительные факторы, которые могут учитываться, включают в себя характеристики экспрессии, такие как расположение стартового кодона и стоп-кодона относительно векторных последовательностей, и другие факторы, которые будут понятны специалистам в данной области. Выбор вектора и сайта инсерции для заявленных последовательностей ДНК определяется балансированием этих факторов, причем не все выборы одинаково эффективны для желательного приложения. Однако для специалистов в данной области анализ этих параметров и выбор подходящей системы в зависимости от конкретного применения является рутинной работой.

Специалист в данной области, может легко выполнить соответствующие модификации в регуляторных последовательностях экспрессии для получения высоких уровней экспрессии белка, т. е. путем замены кодонов или выбора кодонов для конкретных аминокислот, которые преимущественно используются конкретными организмами, для минимизации протеолиза или для изменения состава гликозилирования. Подобным образом остатки цистеина могут быть заменены на другие аминокислоты для упроще ния проблем получения, повторной укладки или стабильности.

Таким образом, не все комбинации хозяин/экспрессирующий вектор функционируют с равной эффективностью в экспрессии последовательностей ДНК данного изобретения. Однако конкретный выбор комбинации хозяин/экспрессирующий вектор может быть сделан специалистами в данной области. Факторы, которые можно учитывать, включают в себя, например, совместимость хозяина и вектора, токсичность для хозяина белков, кодируемых данной последовательностью ДНК, легкость извлечения желательного белка, характеристики экспрессии последовательностей ДНК и регуляторные последовательности экспрессии, оперативно связанные с ними, биологическая безопасность, расходы и укладка, форма или другие необходимые постэкспрессионные модификации желательного белка.

ТКЕТЕ и его гомологи, продуцируемые хозяевами, трансформированными последовательностями данного изобретения, а также нативный ТКЕТТ, очищенный способами согласно изобретению или полученный из заявленных аминокислотных последовательностей, применимы в различных композициях и способах для антираковых и иммунорегуляторных применений. Они также применимы в терапии и способах, относящихся к другим заболеваниям.

Данное изобретение относится также к применению описанных здесь последовательностей ДНК для экспрессии ТКЕТТ в аномальных состояниях, а именно в условиях генной терапии. ТКЕТТ может экспрессироваться в опухолевых клетках под контролем промоторов, пригодных для таких приложений. Такая экспрессия могла бы усиливать противораковые иммунные ответы или непосредственно влиять на выживание опухоли. Цитокины, такие как ТКЕТТ. могут также влиять на выживание трансплантата органа путем изменения локального иммунного ответа. В этом случае сам трансплантат или окружающие его клетки можно было бы модифицировать сконструированным геном ТКЕТТ.

Другой аспект данного изобретения относится к использованию выделенной нуклеиновой кислоты, кодирующей ТКЕТТ, в антисмысловой терапии. Здесь, термин антисмысловая терапия относится к введению или генерированию ίη 511и олигонуклеотидов или их производных, которые специфически гибридизуются в условиях клетки с клеточной мРНК и/или ДНК, кодирующей ТКЕТЦ ингибируя экспрессию кодируемого белка, а именно ингибированием транскрипции и/или трансляции. Это связывание может быть обусловлено обычной комплементарностью пар оснований или, например, в случае связывания с дуплексами ДНК, специфическими взаимодействиями в большой бороздке двойной спирали. Обычно термин анти смысловая терапия относится к ряду способов, обычно применяемых в данной области, и включает в себя терапию, основанную на специфическом связывании с олигонуклеотидными последовательностями.

Антисмысловая конструкция данного изобретения может быть доставлена, например, в виде экспрессирующей плазмиды, которая при транскрипции в клетке продуцирует РНК, комплементарную, по меньшей мере, части клеточной мРНК, кодирующей ТКЕТТ. Альтернативно, антисмысловая конструкция может быть олигонуклеотидным зондом, который генерируется ех νίνο. Такие олигонуклеотидные зонды являются предпочтительно модифицированными олигонуклеотидами, которые устойчивы к эндогенным нуклеазам и, следовательно, стабильны ίη νίνο. Примерами молекул нуклеиновых кислот для применения в качестве антисмысловых олигонуклеотидов являются фосфорамидаты, фосфотиоатные и метилфосфонатные аналоги ДНК (См., например, 5 176 996; 5 264 564 и 5 256 775). Кроме того, общие подходы к конструированию олигомеров, применимых в антисмысловой терапии, были описаны, например, Уап Бег Кго1 е! а1., (1988) Вю1ес11пк|ие5 6:958-976; и §1еш е! а1., (1988) Сапсег Кек 48:2659-2668, специально включенными здесь в качестве ссылки.

С. ТКЕТТ и его аминокислотные последовательности.

Белок, родственный семейству факторов некроза опухоли (ТКЕББ) согласно изобретению, рассмотренный выше, является членом семейства ТНЕ. Этот белок, его фрагменты или гомологи могут иметь широкое терапевтическое и диагностическое применение.

ТКЕББ присутствует во многих тканях, с характером распределения, относительно уникальным среди членов семейства ТНЕ. Поскольку члены семейства ΈΝΕ участвуют в регуляции гибели и выживания клеток и дифференцировки клеток, возможно, что ТКЕББ участвует также в выживании, дифференцировке и репарации клеток в различных тканях.

Хотя точная трехмерная структура ТКЕББ неизвестна, предсказывается, что как член семейства ТНЕ, он может иметь определенные общие структурные характеристики с другими членами этого семейства. Здесь описаны как мышиный, так и человеческий ТКЕББ. Мышиный ТКЕББ, расшифрованный из существующей последовательности кДНК, содержит участок, по меньшей мере, из 21 гидрофобной аминокислоты, который, предположительно, действует в качестве мембраносвязанного домена для мембранного белка типа II. Аминокислотная последовательность шТКЕББ описана в 8ЕЦ ГО № 2.

ТКЕББ человека содержит Н-концевой гидрофильный цитоплазматический домен, состоящий приблизительно из 27 аминокислот гидрофобный трансмембранный домен типа II и состоящий из 204 аминокислот внеклеточный домен. Аминокислотная последовательность ЙТКЕЬЬ описана в ЗЕЦ ГО № 4.

Фиг. 1 изображает сравнение аминокислотных последовательностей ТКЕЬЬ человека и мыши.

Хотя Ν-концевой район из 52 аминокислот может быть предсказан из открытой рамки считывания в клоне кДНК, точный стартовый метионин не может быть предсказан. Ме!-3б имеет приемлемую консенсусную последовательность Козака, которая может сделать его предпочтительным стартовым кодоном. Сравнение этой последовательности ТКЕЬЬ с другими членами семейства ΤΝΕ человека выявляет значительное структурное сходство. Например, как можно видеть из фиг. 2 А и 2В, все белки подобны мембранным белкам типа II и имеют несколько общих районов консервативной последовательности во внеклеточном домене. Районы с черточками над последовательностями указывают последовательности в ΤΝΕ и ЬТ-α, участвующие в организации β-цепи этих молекул. Предполагаемые Ν-связанные сайты гликозилирования подчеркнуты. Звездочки указывают цистеины, участвующие в дисульфидной связи в ΙΝΡ. Консервативные домены, по-видимому, участвуют в межсубъединичных взаимодействиях и организации пластинчатой структуры.

ЕЗТ-поиск выявил человеческий клон из 345 оснований, который является высокогомологичным мышиному ТКЕЬЬ. Аминокислотная последовательность ТКЕЬЬ человека представлена в ЗЕЦ ГО № 4. Открытая рамка считывания, кодируемая ЕЗТ, не содержит мотивов последовательности, которые позволили бы охарактеризовать эту последовательность как члена семейства ΊΝΕ лигандов, например, мотива, использованного Абеу е! а1 для идентификации ЕЗТ ТКЕЬЬ в существующей базе данных.

Новые полипептиды данного изобретения специфически взаимодействуют с рецептором, который до сих пор не был идентифицирован. Однако пептиды и способы, описанные здесь, не позволяют идентифицировать рецепторы, которые специфически взаимодействуют с ТКЕЬЬ или его фрагментами.

Описанное изобретение в некоторых вариантах включает в себя пептиды, произведенные из ТКЕЬЬ, которые способны связываться с ТКЕЬЬ-рецепторами. Фрагменты ТКЕЬЬ могут быть получены несколькими способами, например, рекомбинантно, при помощи ПЦР, протеолитического расщепления или химическим синтезом. Внутренние или концевые фрагменты полипептида могут быть получены удалением одного или нескольких нуклеотидов из одного конца или из обоих концов нуклеиновой кислоты, которая кодирует этот полипептид. Экспрессия мутированной ДНК продуцирует фраг менты полипептида. Расщепление отщепляющими концы эндонуклеазами может, следовательно, генерировать ДНК, которые кодируют различные фрагменты. ДНК, которые кодируют фрагменты белка, могут быть также получены случайным разрезанием, расщеплением рестриктазами или сочетанием рассмотренных выше способов.

Полипептидные фрагменты могут быть также синтезированы химически с применением способов, известных в данной области, таких как общепринятые твердофазные £-шое- и 1-Ьоеспособы Мегп-Пе1б. Например, пептиды и последовательности ДНК данного изобретения могут быть произвольно разделены на фрагменты желаемой длины без перекрывания фрагмента или разделены на перекрывающиеся фрагменты желаемой длины. Такие способы описаны более подробно ниже.

Ό. Генерирование растворимого ТКЕЬЬ.

Растворимые формы этого лиганда могут часто эффективно передавать сигнал и, следовательно, могут вводиться в виде лекарственного средства, который теперь имитирует природную мембраносвязанную форму. Возможно, что ТКЕЬЬ природно секретируется в виде растворимого цитокина, однако, если это не так, можно переконструировать этот ген для искусственного ускорения секреции. Для создания растворимой секретируемой формы ТКЕЬЬ можно было бы удалить на уровне ДНК Ν-концевые трансмембранные районы и некоторую часть района стебля и заменить их лидерной последовательностью типа I или альтернативно лидерной последовательностью типа II, что сделает возможным эффективное протеолитическое расщепление в выбранной системе экспрессии. Квалифицированный специалист мог бы варьировать величину района стебля, сохраняемую в секретируемой экспрессионной конструкции для оптимизации как рецептор-связывающих свойств, так и эффективности секреции. Например, конструкции, содержащие все возможные длины стебля, т.е. Ν-концевые усечения, могли бы быть приготовлены таким образом, чтобы получить белки, начинающиеся при аминокислотах 81-139. При помощи этого типа анализа можно было бы получить последовательность с оптимальной длиной стебля.

Е. Генерирование антител, реагирующих с ТКЕЬЬ.

Данное изобретение включает в себя также антитела, специфически реагирующие с ТКЕЬЬ или его рецептором. Антисыворотки или моноклональные антитела против белка/против пептида могут быть получены согласно стандартным протоколам (См., например. Лп1|ЬоФех: А ЬаЬотаФту Мапиа1 еб. Ьу Наботе апб Ьапе (Со1б Зртшд НагЬог Ргехх: 1988)). Млекопитающее, такое как мышь, хомяк или кролик, может быть иммунизировано иммуногенной формой этого пептида. Способы придания иммуногенности белку или пептиду включают в себя конъюгирование с носителями или другие способы, хорошо известные в данной области.

Иммуногенная часть ТКЕЬЬ или его рецептора может быть введена в присутствии адъюванта. Прогрессирование иммунизации можно наблюдать детектированием титров антител в плазме или сыворотке. Для оценки уровней антител могут быть использованы стандартный метод ЕЫ8А или другие иммуноанализы с иммуногеном в качестве антигена.

В предпочтительном варианте целевые антитела являются иммуноспецифическими в отношении антигенных детерминант ТКЕЬЬ или его рецептора, например, антигенных детерминант полипептида 8ЕО ΙΌ № 2 или 4, или близкородственного человеческого гомолога или гомолога млекопитающего не человека (например, с гомологией 70, 80 или 90%, более предпочтительно с гомологией, по меньшей мере, 95%). Еще в одном предпочтительном варианте данного изобретения антитела против ТКЕЬЬ или против ТКЕЬЬ-рецептора по существу не реагируют перекрестно (т.е. не реагируют специфически) с белком, который менее, чем на 80% гомологичен 8ЕЦ ΙΌ № 2 или 4; предпочтительно менее, чем на 90%, гомологичен 8ЕЦ ΙΌ № 2 или 4; наиболее предпочтительно менее чем на 95%, гомологичен 8ЕЦ ΙΌ № 2 или 4. Термин по существу не реагирует перекрестно обозначает, что это антитело имеет связывающую аффинность в отношении негомологичного белка менее 10%, более предпочтительно менее 5% и даже более предпочтительно менее 1% от связывающей аффинности в отношении белка 8ЕЦ ΙΌ № 2 или 4.

Термин антитело здесь включает в себя его фрагменты, которые также специфически реагируют с ТКЕЬЬ или с ТКЕЬЬ-рецептором. Антитела могут быть фрагментированы при помощи общепринятых способов, и фрагменты могут быть подвергнуты скринингу на применимость таким же образом, как описано выше для целых антител. Например, Е(аЬ')₂-фрагменты могут быть получены обработкой антитела пепсином. Полученный Е(аЬ')₂-фрагмент может быть обработан для восстановления дисульфидных мостиков с получением ЕаЬ'-фрагментов. Антитела данного изобретения включают в себя также биоспецифические и химерные молекулы, имеющие активность против ТКЕЬЬ или против ТКЕЬЬ-рецептора. Таким образом, как моноклональные, так и поликлональные антитела (АЬ) против ТКЕЬЬ и его рецептора и фрагменты антител, такие как ЕаЬ' и Е(аЬ')₂, могут быть использованы для блокирования действия ТКЕЬЬ и его рецептора.

Различные формы антител могут быть также получены при помощи стандартных способов рекомбинантных ДНК. (\Уш1ег апб Мбйеш, Ыа!иге 349:293-299 (1991), специально включенные в качестве ссылки). Например, мо гут быть сконструированы химерные антитела, в которых антигенсвязывающий домен из антитела животного связан с константной областью иммуноглобулина человека (например, СаЬШу е! а1., и.8. 4 816 567, включенный в качестве ссылки). Химерные антитела могут уменьшать наблюдаемые иммуногенные ответы, индуцируемые антителами животных при использовании их в клинке в лечении человека.

Кроме того, могут быть синтезированы рекомбинантные очеловеченные антитела, которые узнают ТКЕЬЬ или его рецептор. Очеловеченные антитела являются химерами, содержащими в основном последовательности Ι§Ο человека, в которые были встроены участки, ответственные за связывание специфического антигена. Животных иммунизируют требуемым антигеном, выделяют соответствующие антитела и часть последовательностей вариабельной области, ответственную за связывание специфического антигена, удаляют. Затем полученные из животного антиген-связывающие участки клонируют в подходящий участок генов антител человека, в которых антиген-связывающие районы были делегированы. Очеловеченные антитела минимизируют применение гетерологичных (т.е. межвидовых) последовательностей в антителах человека и, следовательно, менее вероятно, что они будут вызывать при лечении иммунные ответы у человека.

Конструирование различных классов рекомбинантных антител может быть также выполнено приготовлением химерных или очеловеченных антител, содержащих вариабельные области и константные области (СН1, СН2, СН3) человека, выделенные из различных классов иммуноглобулинов. Например, антитела с увеличенными валентностями сайта связывания антигена могут быть рекомбинантно получены клонированием антиген-связывающего сайта в векторы, несущие константные участки цепи человека. (Аги1апапбат е! а1., 1. Ехр. Меб., 177:1439-1450 (1993), включенные здесь в качестве ссылки).

Кроме того, стандартные способы рекомбинантных ДНК могут быть использованы для изменения связывающих аффинностей рекомбинантных антител с их антигенами изменением аминокислотных остатков вблизи сайтов связывания антигена. Антиген-связывающая аффинность очеловеченного антитела может быть увеличена мутагенезом, основанным на молекулярном моделировании. (Оиееп е! а1., Ргос. Νη11. Асаб. 8с1. 86:10029-33 (1989), включ. здесь в качестве ссылки)).

Е. Генерирование аналогов: получение измененных последовательностей ДНК и пептидных последовательностей.

Аналоги ТКЕЬЬ могут отличаться от природно встречающегося ТКЕЬЬ по аминокислотной последовательности или другим образом, не включающим последовательность, или и тем, и другим образом. Не включающие изменения последовательности модификации включают в себя ίη νίνο и ίη νίίτο химическую дериватизацию ТКЕЬЬ. Не включающие изменения последовательности модификации включают в себя, но не ограничиваются ими, изменения в ацетилировании, метилировании, фосфорилировании, карбоксилировании или гликозилировании.

Предпочтительные аналоги включают в себя ТКЕЬЬ или его биологически активные фрагменты, последовательности которых отличаются от последовательности, представленной в 8ЕЦ ΙΌ № 2 и 4, одной или несколькими консервативными заменами аминокислот или одной или несколькими неконсервативными заменами, делениями или вставками аминокислот, которые не уничтожают активности ТКЕЬЬ. Консервативные замены обычно включают в себя замену одной аминокислоты на другую с подобными характеристиками, например, замены в пределах следующих групп: валин, глицин; глицин, аланин; валин, изолейцин, лейцин; аспарагиновая кислота, глутаминовая кислота; аспарагин, глутамин; серин, треонин; лизин, аргинин; и фенилаланин, тирозин.

Таблица 1. Консервативные замены аминокислот

Для аминокислоты	Код	Замена любой из
Аланин	А	Э-А1а, О1у, в-А1а, Е-С'уз, Э-Суз
Аргинин	К	П-Агд,Гуз,П-Ьуз, йото-Агд, Э-йотоАгд, Ме^ 11е, Э-Ме^ Э-11е, Огп, Э-Огп
Аспарагин	N	ϋ-Азп, А8р, ϋ-Азр, О1и, Э-О1и, О1п, Э-О1п
Аспарагиновая кислота	ϋ	ϋ-Азр, ϋ-Азп, Азп, О1и, Э-О1и, О1п, Э-О1п
Цистеин	С	ϋ-Суз, 8-Ме-Суз, МеД Э-МеД Тйг, Э- Тйг
Глутамин	Ω	Э-О1п, Азп, ϋ-Азп, О1и, Э-О1и, Азр,Э- Азр
Глутаминовая кислота	Е	Э-О1и, ϋ-Азр, Азр, Азп, ϋ-Азп, О1п, Э-О1п
Глицин	О	А1а, Э-А1а, Рго, ϋ-Рго, Э-А1а, Азр
Изолейцин	I	Э-11е, ν^, Э^а1, Ьеи, ])-Геи, Меί,^-Меί
Лейцин	ь	ϋ-Ееи, Vа1, 1)-\а1, Ееи, 1)-1 уи, МеШЛЕч
Лизин	К	1)-! ,уз, .\гд,1)-.\гд, Ното-Агд, 1)йото-Агд, \1е1, 1)-\1е1, 11е, ϋ-Ие, Огп, Э-Огп
Метионин	М	1)-\кЧ,8-\[е-Суз,11е,1)-11е, Ееи,Э- ЬеиЛа1,О^а1
Фенилаланин	Е	ϋ-Рйе, Туг, ϋ-Тйг, Ь-Эора, Н1з, Э-Шз, Тгр, Э-Тгр,транс-3,4 или 5-фенилпролин, цис-3,4 или 5-5-фенилпролин
Пролин	Р	ϋ-Рго, Ь- 1-тиоазолидин-4-карбоновая кислота, ϋ-или Ь-1-оксазолидин-4карбоновая кислота
Серин	8	1)-8ег, Тйг, ϋ-Тйг, а11о-Тйг, \к1, ΏМеД Мй(О), Э-МеДЮ), Е-Суз, Э-Суз
Треонин	Т	ϋ-Тйг, 8ег, Э-8ег, а11о-Тйг, \к1, Ώ- МеД Мй(О), О-МеКО)Ла1, Э^а1
Тирозин	Υ	ϋ-Туг, Рйе, ϋ-Рйе, к-1)ора, Н1з, Э-Н1з
Валин	V	П^а1, Ееи, 1)-1.е'и, 1к,1)-1к, \к1,1)-\к1

Применимые способы мутагенеза включают в себя ПЦР-мутагенез и насыщающий мутагенез, рассматриваемые более подробно ниже. Библиотека случайных вариантов аминокислотных последовательностей может быть также образована синтезом ряда вырожденных олигонуклеотидных последовательностей.

- ПЦР-мутагенез

В ПЦР-мутагенезе может быть использована пониженная точность полимеразы Тад для введения случайных мутаций в клонированный фрагмент ДНК (Ьеипд еί а1., 1989, Теейшдие 1:11-15). Это очень мощный и относительно быстрый способ введения случайных мутаций. Район ДНК, который должен быть мутирован, может быть амплифицирован с применением полимеразной цепной реакции (ПЦР) в условиях, которые понижают точность синтеза ДНК ДНК-полимеразой Тад, например, путем использования отношения бСТР/бАТР 5 и добавления Мп²⁺ к ПЦР-реакции. Пул амплифицированных фрагментов ДНК может быть встроен в подходящие клонирующие векторы с получением библиотек случайных мутантов.

- Насыщающий мутагенез

Насыщающий мутагенез позволяет быстро вводить большое число замен одного основания в клонированные фрагменты ДНК (Мауегз еί а1., 1985, 8с1епсе 229:242). Этот способ включает в себя генерирование мутаций, например, химической обработкой или облучением одноцепочечной ДНК ίη νίίτο и синтез комплементарной цепи ДНК. Частота мутаций может быть модулирована путем модулирования тяжести обработки, и могут быть получены по существу все возможные замены оснований. Поскольку эта процедура не включает в себя отбор на мутантные фрагменты, могут быть получены как нейтральные замены, так и замены (как и в случае белка, получаемого случайным мутагенезом ДНК), которые являются заменами, изменяющими функцию. Распределение точковых мутаций не смещено в направлении консервативных элементов последовательности.

- Вырожденные олигонуклеотиды

Библиотека гомологов может быть также получена из ряда вырожденных олигонуклеотидных последовательностей. Химический синтез вырожденных последовательностей может проводиться в автоматизированном синтезаторе ДНК и синтетические гены затем лигируют в подходящий экспрессирующий вектор. Синтез вырожденных олигонуклеотидов известен в данной области³¹. Такие способы были использованы в прямом выделении других белков³².

Для обеспечения специфических последовательностей или мутаций в специфических районах могут быть использованы неслучайные или направленные способы мутагенеза. Эти способы могут быть использованы для создания вариантов, которые содержат, например, делеции, инсерции или замены остатков известной аминокислотной последовательности белка. Сайты для мутации могут быть модифицированы по отдельности или последовательно, например, (1) замещением сначала консервативных аминокислот, а затем более радикальным выбором в зависимости от полученных результатов, (2) делетированием остатка-мишени или (3) встраиванием остатков того же самого или отличающегося класса рядом с локализованным сайтом, или сочетанием возможностей выбора 1-3.

- Аланин сканирующий мутагенез

Аланин сканирующий мутагенез является ценным способом для идентификации определенных остатков или районов целевого белка, которые являются предпочтительными местоположениями или доменами для мутагенеза (Сипшпдйат апб ^е11к (8с1епсе 244:1081-1085, 1989, включ. здесь в качестве ссылки). В аланин сканирующем мутагенезе идентифицируют остаток или группу остатков-мишеней (например, заряженные остатки, такие как Агд, Акр, Ηίκ. Ьук и С1и) и заменяют нейтральной или отрицательно заряженной аминокислотой (наиболее предпочтительно аланином или полиаланином). Замена аминокислоты может влиять на взаимодействие аминокислот с окружающей водной средой в клетке или снаружи клетки. Затем домены, демонстрирующие функциональную чувствительность к этим заменам, могут быть уточнены путем введения дополнительных или других вариантов при сайтах замены или вместо сайтов замены. Таким образом, в то время как сайт для введения вариации аминокислотной последовательности предварительно определен, характер самой мутации не нуждается в предварительном определении. Например, для оптимизации выполнения мутации в конкретном сайте может быть проведен аланин сканирующий или случайный мутагенез в целевом кодоне или районе и экспрессированные субъединичные варианты целевого белка подвергают скринингу на оптимальную комбинацию желаемой активности.

- Мутагенез, опосредованный олигонуклеотидами

Мутагенез, опосредованный олигонуклеотидами, является ценным способом получения вариантов ДНК с заменами, делециями или вставками, см., например, Абе1тап е! а1., (ΌΝΑ 2:183, 1983), включ. здесь в качестве ссылки. Вкратце, целевая ДНК может быть изменена гибридизацией олигонуклеотида, кодирующего мутацию, с ДНК-матрицей, где матрица представляет собой одноцепочечную форму плазмиды или бактериофага, содержащую неизмененную или нативную последовательность ДНК целевого белка. После гибридизации используют ДНК-полимеразу для синтеза всей второй комплементарной цепи матрицы, которая будет, таким образом, включать олигонуклеотидный праймер и будет кодировать выбранное изменение в ДНК целевого белка. Как правило, используют олигонуклеотиды длиной, по меньшей мере, 25 нуклеотидов. Оптимальный олигонуклеотид будет иметь 12-15 нуклеотидов, которые полностью комплементарны матрице на любой стороне нуклеотида, кодирующего мутацию. Это гарантирует, что олигонуклеотид будет гибридизоваться правильно с одноцепочечной молекулой ДНК-матрицы. Эти олигонуклеотиды можно легко синтезировать с применением способов, хорошо известных в данной области, таких как описанные Сгеа е! а1., (Ргос. №11. Асаб. 8с1. И8А, 75:5765 [1978]), включенной здесь в качестве ссылки.

- Кассетный мутагенез

Другой способ получения вариантов, кассетный мутагенез, основан на способе, описанном ^е11к е! а1. (Оепе, 34:315 [1985]), включ. в качестве ссылки. Исходным материалом может быть плазмида (или другой вектор), которая содержит ДНК субъединицы белка, которая должна быть мутирована. Кодон (кодоны) ДНК субъединицы белка, которые должны быть мутированы, идентифицируют. На каждой стороне идентифицированного сайта (сайтов) мутации должен быть сайт уникальной рестриктазы. Если такие сайты рестрикции не существуют, они должны быть генерированы при помощи описанного выше мутагенеза, опосредуемого олигонуклеотидами, для введения их в подходящие положения в ДНК субъединицы целевого белка. После введения этих сайтов рестрикции в плазмиду, ее разрезают в этих сайгах и линеаризуют. Синтезируют двухцепочечный олигонуклеотид, кодирующий последовательность ДНК между этими сайтами рестрикции, но содержащий желательную мутацию (мутации), при помощи стандартных процедур. Две цепи синтезируют отдельно и затем гибридизуют вместе при помощи стандартных способов. Этот двухцепочечный олигонуклеотид называют кассетой. Эту кассету конструируют таким образом, чтобы она имела 3'- и 5'-концы, которые сравнимы с концами линеаризованной плазмиды, так, чтобы ее можно было непосредственно лигировать в плазмиду. Теперь эта плазмида содержит мутированную последовательность ДНК субъединицы целевого белка.

- Комбинаторный мутагенез

Комбинаторный мутагенез может также использоваться для генерирования мутантов. Например, аминокислотные последовательности для группы гомологов или других родственных белков выстраивают параллельно, предпочтительно для ускорения наивысшей возможной гомологии. Все аминокислоты, которые появляются в конкретном положении выстроенных последовательностей, могут быть выбраны для создания вырожденного набора комбинаторных последовательностей. При помощи комбинаторного мутагенеза генерируют пеструю библиотеку вариантов на уровне нуклеиновых кислот, и она кодируется этой пестрой библиотекой генов. Например, смесь синтетических олигонуклеотидов может быть ферментативно лигирована в генные последовательности таким образом, что вырожденный набор потенциаль ных последовательностей экспрессируется в виде индивидуальных пептидов или, альтернативно, в виде набора более крупных слитых белков, содержащих этот набор вырожденных последовательностей.

В этой области известны разнообразные способы для скрининга генерированных продуктов мутантных генов. Способы скрининга больших библиотек генов часто включают в себя клонирование библиотеки генов в реплицируемые экспрессирующие векторы, трансформацию подходящих клеток полученными библиотеками векторов и экспрессию генов в условиях, в которых детектирование целевой активности, например, в этом случае, связывания с ТКЕЬЬ или его рецептором, облегчает легкое выделение вектора, кодирующего ген, продукт которого был детектирован. Каждый из способов, описанных ниже, поддается анализу с высокой пропускной способностью для скрининга больших количеств созданных последовательностей, например, способами случайного мутагенеза.

Данное изобретение обеспечивает также уменьшение белок-связывающих доменов целевых полипептидов ТКЕЬЬ или их рецепторов для образования миметиков, например, пептидных или непептидных агентов. Эти пептидные миметики способны разрушать связывание ТКЕЬЬ и его рецептора. Критические остатки ТКЕЬЬ, участвующие в молекулярном узнавании рецепторного полипептида или находящегося ниже по ходу передачи сигнала внутриклеточного белка, могут быть определены и использованы для создания произведенных из ТКЕЬЬ или из его рецептора пептидомиметиков, которые конкурентно или неконкурентно ингибируют связывание ТКЕЬЬ с рецептором (см., например, Рерйбе ίηΙιίόίΙοίΈ ο£ Питан рарίΐίοιηη νίπΐδ рго1ет Ьтбтд ίο ^еί^иοЫа8ίοта деве рго1ет Еи^οреаη раίеηί арр^са^и^ ЕР-412762А анб ЕР-531,080А), специально включ. здесь в качестве ссылки.

С. Фармацевтические композиции.

Путем получения доступного очищенного и рекомбинантного ТКЕЬЬ данное изобретение обеспечивает тесты, которые могут быть использованы для скрининга предполагаемых лекарственных средств, которые являются либо агонистами, либо антагонистами нормальной функции клетки, в данном случае ТКЕЬЬ или его рецептора. В одном варианте этот тест оценивает способность соединения модулировать связывание между ТКЕЬЬ и его рецептором. Большое разнообразие форм этих тестов будет достаточным и, в свете данного изобретения, будет понятным для специалистов с квалификацией в данной области.

Во многих программах скрининга лекарственных средств, которые тестируют библиотеки соединений и природных экстрактов, желательными являются тесты с высокой пропускной способностью для максимизации числа соединений, тестируемых за конкретный период времени. Тесты, которые выполняют в бесклеточных системах, такие, которые могут быть произведены с очищенными или полуочищенными белками, часто являются предпочтительными в качестве первичных скринингов вследствие того, что они могут быть созданы для быстрого проявления и относительно легкой регистрации изменения в молекулярной мишени, которое опосредуется тест-соединением. Кроме того, эффекты клеточной токсичности и/или биодоступности тест-соединения могут обычно игнорироваться в системе ίη νίίτο, причем тест вместо этого фокусируется на действии лекарственного средства на молекулярную мишень, которое может проявляться в изменении связывающей активности с другими белками или изменении ферментативных свойств молекулярной мишени.

Фармацевтические композиции данного изобретения могут содержать терапевтически эффективное количество ТКЕЬЬ или ТКЕЬЬрецептора или их фрагментов или миметиков и, возможно, могут включать в себя фармацевтически приемлемые носители. Поэтому данное изобретение обеспечивает способы лечения рака и способы стимулирования или, в некоторых случаях, ингибирования иммунной системы или ее частей путем введения фармацевтически эффективного количества соединения данного изобретения или его фармацевтически приемлемых солей или производных. Конечно, должно быть понятно, что композиции и способы данного изобретения могут использоваться в сочетании с другими способами терапии для различных лечений.

Композиции могут быть приготовлены для различных способов введения, в том числе системного, местного или локализованного введения. Для системного введения предпочтительна инъекция, в том числе внутримышечная, внутривенная, внутрибрюшинная и подковная. Для инъекции композиции данного изобретения могут быть приготовлены в жидких растворах, предпочтительно в физиологически совместимых буферах, таких как раствор Хенкса или раствор Рингера. Кроме того, композиции могут быть приготовлены в твердой форме и, необязательно, повторно растворены или суспендированы перед использованием. Лиофилизированные формы также включены в данное изобретение.

Эти композиции могут вводиться перорально или трансмукозным или трансдермальным способом. Для трансмукозного или трансдермального введения в композиции используют смачивающие вещества, пригодные для барьера, через который они проникают. Такие смачивающие вещества известны в данной области и включают в себя, например, соли желчных кислот, производные фусидовой кислоты и детергенты. Трансмукозное введение может проводиться при помощи назальных спреев или с применением суппозиториев. Для перорального введения композиции готовят в виде общепринятых форм перорального введения, таких как капсулы, таблетки и тоники. Для топического введения композиции данного изобретения готовят в виде мазей, гелей или кремов, как известно в данной области.

Предпочтительно композиции данного изобретения должны быть в форме стандартной дозы и вводиться один или несколько раз в день. Количество активного соединения, вводимого при однократном введении или на протяжении курса лечения, будет зависеть от многих факторов, например, от возраста и размера субъекта, тяжести и протекания подлежащего лечению заболевания, способа и формы введения и мнения лечащего врача. Однако эффективная доза может быть в диапазоне от примерно 0,005 до примерно 5 мг/кг/день, предпочтительно от примерно 0,05 до примерно 0,5 мг/кг/день. Специалисту в данной области будет понятно, что могут применяться также более низкие и более высокие дозы.

Генные конструкции согласно данному изобретению могут быть также использованы как часть протокола генной терапии для доставки нуклеиновых кислот, кодирующих агонистическую или антагонистическую форму полипептида ТВЕЬЬ.

Экспрессионные конструкции ТКЕЬЬ могут быть введены в любом биологически эффективном носителе, например, в любом препарате или композиции, способных эффективно доставлять ген ТКЕЬЬ в клетки ίη νίνο. Подходы включают в себя встраивание этого гена в вирусные векторы, которые могут трансфицировать клетки непосредственно, или доставку плазмидной ДНК при помощи, например, липосом или внутриклеточных носителей, а также прямой инъекцией генной конструкции. Предпочтительны способы переноса с применением вирусного вектора.

Фармацевтический препарат конструкции для генной терапии может состоять по существу из системы доставки гена в приемлемом разбавителе или может содержать матрикс замедленного высвобождения, в который погружен носитель доставки гена. Альтернативно, если полная система доставки гена может быть получена в интактном виде из рекомбинантных клеток, например, ретровирусные векторы, то фармацетический препарат может содержать одну или несколько клеток, которые продуцируют систему доставки гена.

Кроме применения в терапии, олигомеры данного изобретения могут использоваться в качестве диагностических реагентов для обнаружения присутствия или отсутствия ДНК-, РНК-мишеней или аминокислотных последовательностей, с которыми они специфически свя зываются. В других аспектах заявленное изобретение может быть использовано для оценки химической молекулярной частицы на ее способность взаимодействовать, например, связываться или физически ассоциироваться, с полипептидом ТВЕЬЬ или его фрагментом. Этот способ предусматривает контактирование химической молекулярной частицы с полипептидом ТРЕБЬ и оценку способности этой частицы взаимодействовать с ТВЕЬЬ. Кроме того, ТКЕЬЬ согласно изобретению может использоваться в способах оценки природно-встречающихся лигандов или рецепторов ТРЕБЬ, а также для оценки химических молекулярных частиц, которые ассоциируются или связываются с рецепторами ТКЕЬЬ.

В некоторых аспектах заявленное изобретение описывает способ оценки химической молекулярной частицы на способность модулировать взаимодействие между ТРЕБЬ и его рецептором. Способ предусматривает объединение ТКЕЬЬ-рецептора и ТКЕЬЬ в условиях, в которых эта пара способна взаимодействовать, добавление оцениваемой химической молекулярной частицы и регистрацию образования или растворения комплекса. Эти модулирующие агенты могут быть затем оценены ίη νίίτο, например, тестированием активности такого агента в бесклеточной системе, и затем, возможно, введением этого соединения в клетку или в животное с оценкой его действия.

H. Примеры.

I. Выделение кДНК ТКЕЬЬ.

а) Клонирование мышиного ТКЕЬЬ.

кДНК, кодирующую тТВЕЬЬ, выделяли при помощи ПЦР из библиотеки кДНК из мышиных перитонеальных макрофагов. Аминокислотная последовательность и расположение трансмембранного района являются типичными для мембранного белка. Аминокислотная последовательность тТНЕБЬ изображена в 8Е0 ГО № 2, а последовательность ДНК изображена в 8ЕО ГО № 1.

Макрофагальные клетки получали из мышей Ва1Ь/с при помощи перитонеального лаважа, и клетки, прикрепившиеся к пластику в пределах 1 ч, лизировали и обрабатывали для экстракции РНК. Синтезировали антисмысловой олигонуклеотидный праймер 5'6ТТССА66СС А6ССТ6663' (НЕС) ГО ИО:5) из последовательности мышиного эритропоэтина. С. В. 8йоетакег апб Ь. Ό. ММоск. Мигше еги1йгоро1ебп депе: с1ошпд, ехргеззюп апб йитап депе йото1оду, Мо1. Се11. Вю1., 6, 849 (1986), включ. в качестве ссылки. Этот праймер использовали в протоколе 5'КА СЕ согласно рекомендации изготовителя (5'КАСЕ зуЗет из ВКЬ) в ассоциации со сконструированным ВКГ якорным праймером. Первую цепь кДНК получали из РНК, экстрагированной из прикрепившихся в течение 1 ч перитонеальных макрофагов. Амплификацию проводили в ДНК-термоциклере Регкт

Е1тег с ДНК-полимеразой Тад из Регкт Е1тег. После денатурации, 5 мин при 94°С, условия проведения циклов были следующими: 35 циклов при 94°С в течение 30 с, 55°С в течение 30 с и 72°С в течение 3 мин. Проводили дополнительное удлинение при 72°С и затем реакции выдерживали при 4°С. Анализ ПЦРэксперимента на агарозном геле выявил 2 амплифицированных фрагмента в 650 п.н. и 500 п.н. Эти два фрагмента вырезали из геля, встраивали в векторы рВЗ-Т и секвенировали. Эти две вставки были различными. Обе они имели при каждом конце один и тот же специфический для гена эритропоэтина олигонуклеотид, использованный в качестве праймера в ПЦР-синтезе. Нозерн-гибридизации с ³²Р-меченными случайно праймированными фрагментами показали, что они гибридизуются с двумя различными РНК, причем фрагмент 500 п.н. гибридизуется с РНК 1, 4 т.п.н. в макрофагах. Для определения ориентации этой кДНК в Нозернгибридизации использовали ³²Р-рибозонды в обоих направлениях.

Из определенных ориентации и последовательностей были получены два внутренних праймера для мРНК 1,4 т.п.н. Их использовали в 3' и 5'КАСЕ, соответственно. 3'КАСЕ-эксперимент выявил фрагмент 750 п.н., который встраивали в вектор рВЗ-Т и секвенировали. Он соответствует 3'-концу РНК 1,4 т.п.н., так как эта последовательность имеет сигнал присоединения полиА ААТААА (ЗЕО ΙΌ N0: 6) непосредственно перед полоской полиА. 5'КАСЕ не выявил какой-либо полосы. Набор для амплификации С1оп1ес11 МагаШои использовали для получения библиотеки кДНК из одночасовых прикрепленных макрофагов. Использовали ПЦР-фрагмент 1040 п.н., выделенный при помощи ПЦР со смысловым и антисмысловым олигонуклеотидными праймерами из определенной последовательности кДНК, и универсальный праймер из этого набора. Это привело к выделению фрагмента большего размера, чем исходный фрагмент 1040 п.н. Этот новый фрагмент, который секвенировали, добавлял 60 п.н. к 5'-последовательности (ЗЕО ΙΌ № 1).

РНК экстрагировали из мышиных индуцированных тиогликолатом макрофагов после 1 часа прикрепления. Гибридизацию проводили с ³²Р-меченной кДНК тТКЕЬЬ. На фиг. 3 изображен Нозерн-анализ экспрессии мРНК ТКЕЬЬ в мышиных перитонеальных макрофагах и в различных мышиных тканях.

Первые аминокислоты (21 аминокислота) соответствуют гидрофильному трансмембранному домену. В доступных базах данных не были найдены идентичные последовательности на нуклеотидном или аминокислотном уровнях. С применением программы РК0З1ТЕ и аминокислотной последовательности из 225 аминокислот было определено, что эта последовательность принадлежит к ΨΝΕ-семейству белков. Этот белок обладал также различными доменами, описанными для ЬТ-а и других членов этого семейства (1 . Вго\ушпд е1 а1., Ьутрйо1охш-а, а иоуе1 тетйег ок ТНЕ-Гатйу 1На( Гогтк а йе1еготепс сотр1ех тейй 1утр1ю1охт ои Не се11 кигГасе, Се11, 72, 847 (1993); С.Е. \\ аге е1 а1., Т1е Бдаибк аиб гесер1огк оГ Не 1утр1ю1охт кукЫп, ίη Рай^аук Гог суЮ1у818, С.М. СпкГййк аиб 1. Тксйорр (Ебк), Зрппдег-Уебад, Вегйи, Не1бе1Ьегд, р. 175-218 (1995), каждая включена в качестве ссылки). Эта последовательность является уникальной. На нуклеотидном или аминокислотном уровнях наблюдали слабую идентичность или сходство с различными членами ΨΝΕсемейства или с какими-либо последовательностями. Поиск в базах данных ЕЗТ показал, что 1 последовательность человека была явно гомологичной этой мышиной последовательности. Клон 154742,5' (СеиВаик ассеккюи №: К55379) из библиотеки молочной железы, приготовленной Зоагек, ^акЫидкои Ишуегкйу, имеет последовательность 345 п. н., на 80% гомологичную мышиному ТКЕЬЬ. Человеческая последовательность в доступных базах данных, совпадающая с доступной 5'-ДНК тТКЕЬЬ, не была найдена.

Ь) Клонирование ТКЕЬЬ человека.

1) Генерирование олигонуклеотидных зондов и ПЦР-праймеров.

Последовательность ЕЗТ К55379 человека, которая имеет гомологию с мышиным ТКЕЬЬ, использовали как основу для синтеза олигонуклеотидных праймеров. Были синтезированы два 20-мерных олигонуклеотида со смысловыми цепями:

ЫВ-065 5=-ССС ТСС ССТ ССС ТСС АСС АА (ИТ 70-89 К55379) (ЗЕО ΙΌ N0:7) ЬТВ-066 5=-ТСА ТСА ССС САА ССС ТСТ СТ (КГ 14-33 К55379) ЗЕО ΙΌ N0:8) и один антисмысловой 20-мерный олигонуклеотид: ЬТВ067 5=-АСА ССА ССС ССС СТС АСТ СА (ЦТ 251-270 К55379) (ЗЕО ΙΌ N0: 9).

ίί) Идентификация источника библиотеки мРНК и кДНК для клонирования ЙТКЕЬЬ.

ПолиА+ мРНК из печени человека (кат. № 6510-1), селезенки (кат. № 6542-1) и лимфатического узла (кат. № 6594-1) были приобретены из С1огИес11. ПолиА+ мРНК из линий клеток человека ТНР-1, И937 и ΙΙ-23 генерировали в Вюдеи, СашЬпбде, МА. Библиотеку кДНК из миндалин человека в Лямбда д110 и ДНК из библиотеки миндалин также готовили в Вюдеи.

ОФ-ПЦР (КТ-РСК) проводили на шести пробах РНК. Каждая кДНК-реакция содержала 1 мкг полиА+ мРНК, 50 мМ Трис рН 8,3, 75 мм КС1, 3 мм МдС1₂, 10 мМ ДТТ, 250 мкМ бNТР, 50 нг случайного гексамера (50 нг/мкл) и 400 единиц обратной транскриптазы Зирег-кспрШ (С1Ьсо ВКЬ кат. № 6542-1) в конечном объеме 40 мкл. Реакцию выведения цыплят осуществляли при 20°С в течение 20 мин, при 42°С в течение 50 мин, и при 99°С в течение 5 мин. Для

ПЦР-реакций использовали 1/5 каждой кДНКреакции или 100-1000 нг ДНК библиотеки кДНК. Устанавливали две ПЦР-реакции для каждой пробы, одну с парой праймеров ЬТВ066 и ЬТВ-067, которая дает ПЦР-продукт 201 п.н., и вторую реакцию с парой праймеров ЬТВ066 и ЬТВ-067, которая дает продукт 257 п.н., если транскрипт присутствует в этой пробе. ПЦР-реакции проводили в 10 мМ Трис рН 8,3, содержащем 50 мМ КС1, 1,5 мМ МдС1₂, 0,01% желатин, 10% ДМСО, 100 мкМ бНТР, 30 пмоль каждого праймера и 5 единиц Атр1Цас.| (Регкт Е1тег, кат. № 801-0060). ПЦР проводили в ДНКтермоциклере модели 480 Регкт Е1тег Се1н5. Условия циклов были 95°С 1 мин, 60°С 1 мин и 72°С 1 мин в течение 35 циклов.

Продукты точного размера получали из мРНК печени, селезенки, лимфатического узла, ТНР-1 и миндалины, но не из И937 или 11-23. Продукт ПЦР 201 п.н., полученный из печени, очищали для применения в качестве зонда для скрининга библиотеки кДНК.

ϊϊΐ) Скрининг библиотеки кДНК.

После демонстрации при помощи ПЦР того, что библиотека миндалин содержала ТКЕЬЬ, один миллион бляшкообразующих единиц (БОЕ) из библиотеки кДНК человека в Лямбда §110 высевали при плотности 1 х 10⁵ БОЕ/чашку Нипс™. Лифты в двух повторностях получали на фильтрах 20 х 20см 8сЫе1сйег апб 8сйеи11 ВА-8 85 ОрШгап™. Продукт ПЦР 201 п.н. метили ³²Р случайным праймированием (ЕешЬегд апб УодеШеш, Апа1. Вюсйет. 137:266-267, 1984, включ. здесь в качестве ссылки). Фильтры гибридизовали в течение ночи при 65°С в 400 мл буфера для скрининга бляшек (50 мМ Трис, рН 7,5, 1М НаС1, 0,1% пирофосфат натрия, 0,2% ПВП и 0,2% Фиколл), содержащего 10% декстрансульфата, 100 мкг/мл тРНК и 6 х 10⁵ имп/мин на мл зонда. Их промывали дважды буфером для скрининга бляшек и дважды 2 х 88С, 0,1% ДСН при 65°С и экспонировали на пленке при -70°С с усиливающим экраном в течение 40 ч.

Дубликатные позитивные колонии вырезали в виде цилиндров из основных чашек в 8М (100 мМ НаС1, 10 мМ Мд80₄, 50 мМ Трис, рН 7,5) плюс желатин. 12 из позитивных колоний очищали титрованием бляшек. М1шргер ДНК Лямбда из 12 очищенных кандидатов расщепляли НоП, подвергали электрофорезу на 1% агарозном геле, блоттингу по Саузерну и гибридизовали с зондом 201 п. н. Клоны с наибольшими вставками (приблизительно 2 т.п.н.), которые гибридизовались с зондом, отбирали для крупномасштабной очистки ДНК и секвенирования ДНК. Вставки из каждого из этих клонов субклонировали в сайт Но!1 рВ1иезсг1р1 8К+ (81га1адепе #212205). Последовательность ДНК получали из ДНК Лямбда и плазмидной ДНК. Клон Е1а, который имеет вставку кДНК 2006 п.н., повидимому, имел интрон в 5'-конце кодирующего района и не содержал полной открытой рамки считывания. Клон А2а, также называемый РВ133, содержал вставку кДНК 1936 п.н. Этот клон содержал 5'-нетранслируемый район 543 п.н., открытую рамку считывания из 852 п.н. и 3'-нетранслируемый район, но не содержал сигнала полиаденилирования или хвоста полиА.

Нуклеотидная последовательность, кодирующая открытую рамку считывания кДНКклона А2а ЙТКЕЬЬ, изображена в 8ЕЦ ГО № 3. Расшифрованная аминокислотная последовательность из 284 аминокислот изображена в 8ЕЦ ГО № 4. Второй метионин в положении 36 может быть с большей вероятностью стартовым сайтом трансляции, так как этот сайт более близко удовлетворяет требованиям для старта, определенным Кохак.

При помощи идентифицированных последовательностей были определены последовательности кДНК, кодирующие ТКЕЬЬ. Из последовательностей ДНК, описанных выше (например, 8ЕЦ ГО № 3), мы расшифровали аминокислотные последовательности ТКЕЬЬ (8ЕЦ ГО № 4). Должно быть ясно, что в условиях существующего состояния области конструирования белков специалист мог бы производить целенаправленные изменения, инсерции или делеции в этих аминокислотных последовательностях и получать множество молекул, имеющих по существу те же самые биологические или иммунологические активности, какими обладают молекулы, описанные здесь.

ίν) Нозерн-анализ экспрессии человеческого ТКЕЬЬ.

Фрагмент РриМГ/ВйХГ 440 п.н. кДНКклона 2а человека метили ³²Р случайным праймированием и использовали для зондирования коммерческих Нозерн-блотов, содержащих РНК из различных тканей человека. Нозерн-блоттинг показал, что фрагмент ЙТКЕЬЬ гибридизовался с отдельными видами мРНК длиной приблизительно 1,4-1,6 т.п.н. Человеческий ТКЕЬЬ экспрессируется в большинстве органов иммунной системы, т. е. в селезенке, лимфоцитах периферической крови (рЬ1), лимфатических узлах, аппендиксе, но относительно мало в тимусе, печени эмбриона (источнике предшественников лимфоцитов) и костном мозге (фиг. 4). Таким образом, органы вторичной иммунной системы первично экспрессируют ТКЕЬЬ. Экспрессия была также детектирована в яичнике, предстательной железе, тонкой кишке, ободочной кишке, сердце, мозгу, плаценте, легком, печени, скелетной мышце, почке и поджелудочной железе. Экспрессия была относительно низкой в яичке, печени, почке и тимусе. Это распределение показывает широко распространенную экспрессию, очень сходную с экспрессией ТКАГЬлиганда, за исключением того, что ТКАГЬ слабо экспрессируется в сердце и в мозгу.

с) Выделение рецептора, связывающегося с ТКЕЬЬ-лигандом.

Лиганды Т№-семейства могут быть использованы для идентификации и клонирования рецепторов. С описанной последовательностью ТКЕЬЬ можно было бы слить 5'-конец внеклеточного домена ТКЕЬЬ-лиганда, который включает в себя рецепторсвязывающую последовательность, для маркировки или мечения последовательности и затем добавить лидерную последовательность, которая будет усиливать секрецию этого лиганда в любой из ряда экспрессионных систем.

Один пример этой технологии описан Вгошипу е1 а1., (1996) (1ВС 271, 8618-8626), где лиганд ЬТ-β секретировался в таком виде. Лидерную последовательность УСАМ связывали с короткой тус-пептидной меткой и затем с внеклеточным доменом ЬТ-β. Последовательность УСАМ используют для усиления секреции обычно мембраносвязанной молекулы ЬТ-β. Секретируемый белок сохраняет тус-метку на Ν-конце, которая не нарушает способности связываться с рецептором. Такой секретируемый белок может быть экспрессирован либо во временно трансфицированных клетках СО8, либо в подобной системе, например, произведенных из ΞΒΝΑ векторах, клетке насекомого/бакуловирусе, Ρίοοίιία и т.д. Неочищенный клеточный супернатант может быть использован в качестве источника меченого лиганда.

Клетки, экспрессирующие рецептор, могут быть идентифицированы экспонированием их меченому лиганду. Клетки со связанным лигандом идентифицируют в РАС8-эксперименте (анализе с активируемой флуоресценцией) мечением тус-метки антителом против туспептида (9Е10) и затем меченым фикоэритрином (или подобной меткой) антимышиным иммуноглобулином. РАС8-позитивные клетки могут быть легко идентифицированы и могут служить источником РНК, кодирующей рецептор. Затем можно было бы приготовить экспрессионную библиотеку из этой РНК при помощи стандартных способов и разделить ее на пулы. Пулы клонов могли бы трансфицироваться в подходящие клетки-хозяева, и связывание меченого лиганда с рецептором позитивно трансфицированных клеток можно было бы определить под микроскопом после мечения связанной тус-пептидной метки меченым ферментом антимышиным 1д-реагентом, а именно, меченным галактозидазой, щелочной фосфатазой или люциферазой антителом. После идентификации позитивного пула размер пула может быть уменьшен, пока не будет идентифицирована кДНК, кодирующая рецептор. Эту процедуру можно проводить либо с мышиным, либо с человеческим ТРЕТЬ как с лигандом, который может более легко приводить к рецептору.

2. Клетки и реагенты.

Все клетки получали из Атепсап Туре Сибиге Со11ес11оп (АТСС, КоскуШе, МИ), кроме клона 13 \УЕН1 164, который получили от доктора Ка^акЫта (Сепеуа Вттеб1са1 Кекеагсй 1пб111и1е. Сепеуа, 8\уйхег1апб). Субклон НТ29 (НТ29-14) был описан ранее (Вго^шид е1 а1., 1996) и ΊΝΡ-чувствительный субклон МЕ180 получили от доктора Саг1 \Уаге. Т-клеточная гибридома 11-23 была описана (Вго^шид е1 а1., 1991). Мышей Ва1Ь/с инъецировали внутрибрюшинно за 3 дня перед умерщвлением 1,5 мл содержащего тиогликолат бульона (ЭгГсо ЬаЬ). Клетки брали из перитонеальной полости и культивировали при плотности 10⁶ клеток/мл в течение 1 ч в ЬМЕМ (С1Ьсо ЬаЬ). Неприкрепленные клетки смывали с чашек, а прикрепленные клетки, почти исключительно макрофаги, лизировали в реагенте Тп-Кеадеп1 (Мо1еси1аг Кекеагсй Сеп1ег 1пс.) и обрабатывали для экстракции РНК.

Рекомбинантные человеческие Т№, ЬТ-ос, ЬТ-с11/р2, антитела к этим белкам и слитые белки рецептор-1д были описаны ранее (Вго^шид е1 а1., 1995). Антитело 5С8 против СЬ40Ь было описано. Поликлональную антисыворотку против ЙТКЕЬЬ получали инъекцией в лимфатический узел чистого рекомбинантного ЙТКЕЬЬ в СРА, как описано ранее (Вго^шид апб КЗЬойш, 1989). После 2 месяцев наблюдали ответ в виде антител против ЙТКЕЬЬ и иммуноглобулин очищали при помощи Протеин А-Сефарозы.

Клонирование мышиного ТКЕЬЬ

Антисмысловой олигонуклеотидный праймер 5'СТТССАССССАСССТССС3' (8 ЕС) ΙΌ N0:10) из последовательности мышиного эритропоэтина использовали в протоколе 5'КАСЕ согласно рекомендации изготовителя (5'КАСЕ буЧет из ВКЬ) в ассоциации со сконструированным ВКЬ якорным праймером. Первую цепь кДНК получали из РНК, экстрагированной из прикрепившихся в течение 1 ч перитонеальных макрофагов. Амплификацию проводили в ДНК-термоциклере Регкт Е1тег с ДНК-полимеразой Тад. После денатурации 5 мин и при 94°С условия проведения циклов были следующими: 35 циклов при 94°С в течение 30 с , 55°С в течение 30 с и 72°С течение 3 мин с конечным дополнительным удлинением при 72°С. Анализ ПЦР-эксперимента на агарозном геле выявил 2 амплифицированных фрагмента 650 п.н. и 500 п.н. Эти два фрагмента вырезали из геля, встраивали в векторы рВ8-Т и секвенировали. Нозерн-гибридизации с ³²Р-мечеными случайно праймированными фрагментами показали, что фрагмент 500 п.н. гибридизуется с РНК 1,4 т.п.н. в макрофагах. Для определения ориентации этой кДНК в Нозерн-гибридизации использовали ³²Р-рибозонды в обоих направлениях. Из определенных ориентации и последовательностей были получены два внутренних праймера для мРНК 1,4 т.п.н.:

5'ТСАССТССАСТТТСАТСАСС3' (8 ЕС) ΙΌ

Ν0:11) и 5'СТ6ТСА6СТССТССТ6А63' (8ЕО ГО Ν0:12), которые использовали в 3' и 5'КАСЕРСК, соответственно. 8'КАСЕ-эксперимент выявил фрагмент 750 п.н., который встраивали в вектор рВ8-Т и секвенировали. Он соответствует 3'-концу РНК 1,4 т. п.н., так как эта последовательность имеет сигнал присоединения полиА непосредственно перед полоской полиА. 5'КАСЕ не выявил какой-либо полосы. Набор для амплификации кДНК С1оп1ес11 МагаШоп использовали для получения библиотеки кДНК из одночасовых прикрепленных макрофагов. Использовали ПЦР-фрагмент 1040 п.н., выделенный при помощи ПЦР со смысловым и антисмысловым олигонуклеотидными праймерами из определенной последовательности кДНК (8'А6СА66А6ССТТСТСА66А68' и 5'6АТС СА666А66А6СТТ6ТСС3') и универсальный праймер из этого набора. Это привело к выделению фрагмента, большего на б0 п.н. на 5'-конце, чем исходный фрагмент 1040 п.н.

Клонирование человеческого ТКЕЬЬ

Поиск в базе данных Е8Т обнаружил один человеческий клон, который был явно гомологичен мышиной последовательности. Клон 154742 (СепЬапк ассеххюп №. К55379) имеет последовательность 345 п.н., на 89% гомологичную мышиной кДНК. Для скрининга использовали два праймера, полученные из Е8Т (5'СССТ6С6СТ6ССТ66А66АА3' (8ЕО ГО Ν0:15) и 5'А6АССА666ССССТСА6Т6А3' (8ЕЦ ГО Ν0:16)) при помощи ОФ-ПЦР различных тканей и библиотек на присутствие транскриптов йТКЕЬЬ. Продукты точного размера получали из мРНК печени, селезенки, лимфатического узла, ТНР-1 и миндалины, но не из И937.

Продукт ПЦР 201 п.н. клонировали и использовали для скрининга библиотеки кДНК миндалин человека в Лямбда §410. 10^б бляшкообразующих единиц высевали при плотности 10⁵ БОЕ на чашку. Лифты в двух повторностях получали на нитроцеллюлозных фильтрах 20 х 20 см и гибридизовали с зондом, приготовленным случайным праймированием. Фильтры гибридизовали в течение ночи при б5°С в буфере для скрининга бляшек (50 мМ Трис, рН 7,5, 1 М №С1, 0,1% пирофосфат натрия, 0,2% поливинилпирролидон и 0,2% Фиколл), содержащем 10% сульфат декстрана, 100 мг/мл тРНК и б х 10⁵ имп/мин на мл зонда. Их промывали дважды буфером для скрининга блюшек и дважды 2 х 88С, 0,1% ДСН при б5°С. М1шргер ДНК Лямбда получали из позитивных колоний и клоны с наибольшими вставками отбирали для крупномасштабной очистки ДНК и секвенирования ДНК. Вставки субклонировали в сайт №4! рВ1нехспр1 8К+. Было обнаружено, что один из Е8Т человека (К55379) кодирует части последовательности ТКЕЬЬ человека.

Анализ РНК

Либо фрагмент РриМЕВхОТ 0,45 т.п.н., либо фрагмент №г1/№б 1,25 т.п.н. кДНК йТКЕЬЬ метили случайным праймированием и использовали для зондирования Нозерн-блотов человеческих и мышиных тканей, приобретенных из С1оп1ес11. Из мышиных тканей и клеток экстрагировали РНК ТКЬреагентом. Нозернанализ проводили по существу, как уже описано (СЫсйеротйсйе апб УаххаШ, 1994) с 4 мкг общей РНК и ³²Р-меченой случайно праймированной кДНК шТКЕЬЬ.

Хромосомное распределение

Панель ДНК из монохромосомных клеточных гибридов Н6МР Кехоигсе сеп!ге, Ншх4оп, СатЬпбде, ИК) использовали для амплификации при помощи ПЦР-фрагмента 340 п. н. с праймерами, выбранными в 3'-нетранслируемом районе, который не является гомологичным мышиной последовательности (5'АСТССТСС СА66СТ6СС66СТ3' (8 ЕС) ГО Ν0:17) и 5'ССТ6АА6Т6666ТСТТСТ66А3'(8ЕР ГО Ν0:18)). Амплификацию проводили в течение 40 циклов, 30 с при 94°С, 90 с при б5°С и 90 с при 72°С. Регистрацию проводили на окрашенном бромидом этидия агарозном геле.

Экспрессия рекомбинантного белка КТКЕЬЬ

Растворимую экспрессионную конструкцию, объединяющую лидерную последовательность УСАМ, тус-пептидную метку и внеклеточный домен йТКЕЬЬ, сходный с доменом, описанным для лимфотоксина-р (ссылка), получали подобно способу, описанному для ЬТ-β (Втотешпд е! а1., 199б). Были выделены следующие фрагменты ДНК, №4!/тупой фрагмент, кодирующий лидер УСАМ, и пара олигонуклеотидов, кодирующих тус-метку (5* тупой, 3' сайт РриМЦ, которые были описаны, фрагмент РриМI/ВхΐXI 0,45 т. п. н. ТКЕЬЬ и фрагмент Вх41/№П 0,б5 т. п. н. ТКЕЬЬ. Эти четыре фрагмента лигировали в вектор рВ1ие8сир4, обработанный №П/фосфатазой. Вставку №П из этого вектора переносили в вектор рРахСВаЛ (61Ьсо ВКЬ) и использовали для получения рекомбинантного бакуловируса. Растворимый ТКЕЬЬ получали инфицированием клеток насекомых Н1Р1уеТМ при множественности заражения (М0Ц 10, и среду собирали после 2 дней. К среде добавляли: буфер НЕРЕ8 до конечной концентрации 25 мМ, рН 7,4, 1 мМ АЕВ8Р (Р1егсе) и 1 мг/мл пепстатина. Среду фильтровали и концентрировали в 10 раз ультрафильтрацией на фильтре Аписов с отсечением 10 кДа. Концентрированную содержащую ТКЕЬЬ среду непосредственно нагружали на колонку 8РЗерйагохе Рах! Р1оте и промывали 25 мМ буфером НЕРЕ8, рН 7,0, содержащим 0,4М №б. ТКЕЬЬ элюировали тем же буфером с 0,бМ №С1. Для определения размера очищенный ТКЕЬЬ подвергали анализу методом гельэксклюзивной хроматографии.

Анализ секреции

Векторы для экспрессии на основе ΕΒΝΑ конструировали с применением вектора СН269, который является модифицированной версией ρΕΒΥΗΤ АВС Цпуйгодеп), в которой ген ΕΒΝΑ и гистидиновая метка удалены. Фрагмент 0,71 т.п.н. 1ΤΝΡ в векторе ρΡакΐΒас получили от докторов Р. Рексатейо и А. Со1бГе1б. Вставку 8ηаΒI/X1юI лигировали в сайт РуиП/ХНо! СН269. Геномная ΤΝΡ-вставка, содержащая делецию сайта расщепления 1-12, была подарком от доктора С. КоШак и была встроена в вектор СН269 А.

Со1бГе1б. Вставку №6 1,8 т.п.н. клона А2а 11ΤΚΕΡΕ, фрагмент №6 0,98 т.п.н., содержащий кДНК 1ιί.Ό40Ε, полученный от доктора Е. СагЬег, и вставку №6 1,46 т.п.н., содержащую 1ιΕΤη (Вгосшпд е( а1., 1995), лигировали в сайт №6 СН269. Вставку НшбШ 0,81 т.п.н., содержащую кодирующий район ΗΣΤ (3 с модифицированным стартовым сайтом (Вгосшпд е( а1., 1995), лигировали в сайт НшбШ СН269. Клетки ΕΒNА293 трансфицировали различными векторами СН269 вместе с вектором СΡΡ с применением липофектамина и либо удаляли ЗФР с 5 мМ ЭДТА для ΡАС8-анализа, либо после 2 дней эти клетки подвергали метаболическому мечению. В обеих процедурах использовали следующие антитела: ^-фракцию кроличьих поликлональных антител к 11ΤΚΕΕΕ, тАЬ 104с против 1ΤΝΡ, тАЬ АС9 против ΙιΕΤη, тАЬ В9 против ΕΤη1/ρ2 и тАЬ 5С8 против СЭ40Ь. ΡАС8-анализ проводили в среде ЯРМЕ содержащей 10% фетальную телячью сыворотку и 50 мкг/мл агрегированного нагреванием человеческого ЦС, с антителами при 5 мкг/мл. Меченные фикоэритрином антитела против мышиного или кроличьего ЦС (1асккоп ^тцпоЯекеагсй) использовали для детектирования связывания антител. СΡΡ-яркие трансфицированные клетки задерживались. Для иммунопреципитации клетки через 2 дня после трансфекции промывали ЗФР и переносили в не содержащую МеЕСук ΜΕΜ, содержащую 200 мкКи/мл Τπιη813^1 ДСЦ). После 3 ч супернатанты собирали и подвергали иммунопреципитации, как описано (Вгосшпд е( а1., 1995).

Тесты цитотоксичности

Тесты роста клеток проводили, как описано ранее (Вгосшпд апб КгЬойш, 1989). Для микроскопии клетки НТ29-14 высевали в 24луночные планшеты при плотности 200000 клеток на лунку и выращивали в течение 2 дней. Человеческий ΤΚΕΕΤ, ΤΝΡ, лимфотоксин-α1β2 (Вгосшпд е( а1., 1996) или антитела против Гак (СН11, Катауа) добавляли вместе с 80 единицами на мл человеческого γ-интерферона. После 26 ч удаляли среду, которая после обработки цитокином или антителом против Гак содержала много мертвых клеток, которые отделялись от пластика. Оставшиеся клетки фиксировали 80% этанолом и промывали в ЗФР, содержащим 1 мг/мл красителя НоексЙ. Через 2 мин краситель удаляли, клетки промывали в ЗФР и наблюдали под флуоресцентным микроскопом.

Таблица II. Сайты связывания и цитотоксические эффекты человеческого ΤΚ.ΕΕΕ на различных клеточных линиях

Клеточная линия	Тип	Связывание ΤΒΕ^^	Цитотоксичностьа
Гемопоэтические
.Тпгка!	Т-лимфома	-	-
8К\\' 6.4	В-клетка ИВУ		-
ХатаНса	Лимфома Беркита		-
К562	промиелоцитарные	+	-
ТОР-1	моноцитарный лейкоз	++
Негемопоэтические
НТ29	адренокарцинома ободочной кишки	+	++Ь
МЕ-180	рак шейки матки		-
Не1а	рак шейки матки		_б
ΜСЕ-7	аденокарцинома молочной железы		+/-
293	клетки почки эмбриона	+	не опр.
Сок	фибробласты почки	+	не опр.

«-» = отсутствие связывания/цитотоксичности «+» = наличие некоторого связывания/цитотоксичности «++» = наличие значительного связывания/цитотоксичности ^а 3-5-дневный тест пролиферации в присутствии и в отсутствие γ-интерферона человека ^Ь - итотоксичность наблюдали только в присутствии не опр. - не определяли ^б - изменения морфологии

Таблица III. Разделение на группы различных членов семейства ΤΝΡ по распределению цитотоксичности

Группа	Активация рецептора
Сильные индукторы апоптоза во многих типах клеток	ΤΝΡ, Еак, теАЙ-КД ЭК-3
Слабые индукторы только в ограниченных типах клеток	Γ.Τβ-Κ, ΤΡ.Η..Ι.-Ε СЭ30
Не могут индуцировать некроз клеток, в некоторых условиях антипрофилеративные	С1)27, С1)40, ОХ-40

^а Эти рецепторы еще не были идентифицированы

Список литературы

1. 8тйй е( а1. 1990; КоНпо е( а1 1990; Ьое(ксйег е( а1 1990; 8сНа11 е( а1 1990.

2. 8ее 1опек е( а1., 1989; Ьск е( а1., 1992.

3. К. ^асеу, ίη Штог №сгок1к Еас1огк. Τ1κ Мо1еси1ек апб Τ1Ογ Ттегдтд Ко1е ίη Мебйте, В. Вей1ег (Ε6.), Яауеп Ргекк, ΝΥ, р 255 (1992));

A. Аааде, ш Штог №сгок1к Ρасΐо^к. Τ1κ Мо1еси1ек апб Τ1Ογ Ттегдтд Ко1е т Мебкбпе. В. Вей1ег (Ε6.), Яауеп Ргекк, ΝΥ, р 275 (1992).

4. С. Ό. Яообтап, ш Штог №сгок1к Ρас1огк. Τ1κ Мо1еси1ек апб Τ1Ογ Бтегдпгд Ко1е т Мебйше. В. Вей1ег (Ε6.), Яауеп Ргекк, ΝΥ, р 117 (1992).

5. А. Ыакапе, ш Штог №сгок1к Ρасΐо^к. Τ1κ Мо1еси1ек апб Τ1Ογ Ттегдтд Ко1е т Мебсше.

B. Вей1ег (Ε6.), Яауеп Ргекк, ΝΥ. р 285 (1992); I.

A. С1агк е1 а1., ш Штог Ыесгок1к Ρасΐо^к. Τ1κ Мо1еси1ек апб Τ1Ογ Ттегдтд Ко1е т Мебсше.

B. Вей1ег (Ε6.), Яауеп Ргекк, ΝΥ, р 303 (1992);

C. Ε. Сгаи е1 а1., ш Штог №сгок1к Ρасΐо^к. Τ1κ Мо1еси1ек апб Τ1Ογ Ттегдтд Ко1е т Мебгсше.

В. Веибег (Еб.), Вауеп Рге88, ΝΥ, р 329 (1992); РР. РщиеН ίη Титог №сгоык Рас!ог8. ТНе Мо1еси1е8 апб ТНеб Етегдшд Во1е ίη Меб1С1пе. В. Веибег (Еб.), Вауеп Рге88, ΝΥ. р 341 (1992); 6. Н. Уопд е! а1., ίη Титог №сгоык РасЮгк. ТНе Мо1еси1е8 апб ТНеб Етегдшд Во1е ίη Мебане, В. Веибег (Еб.), Вауеп Рге88, ΝΥ, р 371 (1992).

6. 8. МаНк, ίπ Титог №сгоык РасСогк. ТНе Мо1еси1е8 апб ТНеб Етегдшд Во1е ш Мебане, В. Веибег (Еб.), Вауеп Рге88, ΝΥ, р 407 (1992).

7. Б. А. Рох. Ат. 1. Меб., 99, 82 (1995).

8. Б. 6оеббе1 е! а1., Со1б 8рппд Нагбог 8утрокшт Оиап! Вю1., 51, 597 (1986); 6. ТгтсЫегЕ ш Титог №сгоык ЕасСогк. ТНе Мо1еси1е8 апб ТНеб Етегдшд Во1е ш Мебане, В. Веибег (Еб.), Вауеп Рге88, ΝΥ, р 515 (1992).

9. Ь. А. Табадба е! а1., Ргос. №111. Асаб. 8сБ И8А. 88, 9292 (1991); Ь.А. Табадба апб Б. V. 6оеббе1. 1ттипо1. Тобау. 13,151 (1992).

10. В. Ьие!бд е! а1., 1. 1ттипо1., 143,4034 (1989); М. Кпед1ег е! а1., Се11, 53,45 (1988).

11. С. Р. Уаге е! а1., ш Ра!Нтеау8 Гог Су!о1у818, 6. М. СпГПб18 апб 1. Тксборр (Еб8,), 8рппдегVе^1ад, ВегНп, Не^бе1Ъе^д. р 175-218 (1995).

12. Ν. Раи1 е! а1., Апп. Веу. 1ттипо1., 6,407 (1988).

13. Р.Б. Сготее е! а1., 8аепсе, 264,707 (1994). (1. Вготешпд е! а1., Се11, 72, 847 (1993); 1. Вготешпд е! а1., 1. 1ттипо1., 154,33 (1995).

14. Р. Бе Тодш е! а1., 8аепсе, 264, 703 (1993); Т.А. Вапкк е! а1., 1. 1ттипо1., 155, 1685 (1995).

15. 1. Вготешпд апб А. ВЛобш, 1. 1ттипо1., 143, 1859 (1989): 1. Вготешпд е! а1., 1. Ехр. Меб., 183, 867 (1996).

16. Т. 8иба е! а1., 1. 1ттипо1., 154,3806 (1995) (Т. 8иба е! а1., 1. 1ттипо1., 154, 3806 (1995).

17. В.С. ТгаиЛ е! а1., 8аепсе, 245,301 (1989); 8. УоπеНа^а е! а1., 1. Ехр. Меб., 169, 1747 (1989); 8. №1§а1а апб Р. 6о1бк!еш, 8аепсе, 267, 1449 (1995); М. Н. Ра1к е! а1., В1ооб, 79, 3300 (1992).

18. Р. В1еих-Еаиса1 е! а1., 8скпсе, 268, 1347 (1995); Т. ТакабакЫ е! а1., Се11, 76, 969 (1994); В. Уа1апаЬе-Рикипада е! а1., №!иге, 356, 314 (1992).

19. Р. В. 6а11е апб а1., 1. Ехр. Меб., 182, 1223 (1995).

20. Р. 8буе81г18 апб а1., СНп. 1ттипо1. 1ттипораЛок, 75, 197 (1995).

21. Р.Б. Ка181к18 е! а1., 1. Ехр. Меб., 181, 2029 (1995); А. Б. Ваб1еу е! а1., 1. Аго1., 70, 199 (1996).

22. 8. \Убеу е! а1., 1ттипбу, 3,673 (1995).

23. 1. Р. СаисНа! е! а1., РЕВ8 Ье!!., 315, 259 (1993); 8. РипакокН е! а1., В1ооб, 83, 2787 (1994).

24. В. С. А11еп е! а1., 8скпсе, 259, 990 (1993).

25. Ь. В1апсопе е! а1., Шбпеубп!., 48, 458 (1995); С. МоНап е! а1., 1. 1ттипо1., 154,1470 (1995).

26. 1. ВиЬу апб а1., №11иге Мебкше, 1,437 (1995).

27. Ζ. Уапд е! а1., 1. 1ттипо1., 155, 3722 (1995); А. М. С1еагу апб а1., 1. 1ттипо1., 155, 3329 (1995).

28. 8. Не88 апб Н. Епде1тап, 1. Ехр. Меб., 183, 159 (1996).

29. В. 6. Сообтеш е! а1, Се11, 73,447 (1993); Сообтеш е! а1, Еиг. 1. 1ттипо1., 23, 2631 (1993);

С. А. 8111ΠΙ1 е! а1., Се11, 73, 1349 (1993).

30. 8ее, Гог ехатр1е, Мо1еси1аг С1ошпд А ЬаЬога!огу Мапиа1, 2пб Еб., еб. Ьу 8атЬгоок, Ргбксб апб Машабк (Со1б 8рппд НагЬог ЬаЬога!огу Ргекк: 1989); БНА С1ошпд, ^1итек I апб II (Б. Ν. 61оуег еб., 1985); Обдопис1еоббе 8уп1Не818 (М. I. 6аб еб., 1984); МиШк е! а1. и.8. Ра!еп! №: 4,683,195; №.1с1е1с Лаб НуЬпб1/абоп (В. Б. Натек & 8. I. Шддш8 ебк. 1984); ТгапкспрНоп Апб Тгапк1абоп (В. Б. Натек & 8. I. Шддш8 ебк. 1984); Си1!иге ОГ Ашта1 Се11к (В. I. РгекНпеу, А1ап В. ΒΪ88, Лс., 1987);

^тоЫб/еб Се11к Апб Епхутек ДВЬ Ргекк, 1986); В. РегЬа1, А Ргасбса1 Сшбе То Мо1еси1аг С1ошпд (1984); !Не !геабке. Ме!Нобк Л Епхуто1оду (Асабетк Ргекк, Лс., Ν.Υ.); 6епе ТгапкГег Vес!о^8 Рог МаттаНап Се11к (I. Н. МШег апб М. Р. Са1ок ебк., 1987, Со1б 8рппд НагЬог ЬаЬога!огу); Ме!бобк Л Епхуто1оду. ^18. 154 апб 155 (Уи е! а1. еб8.), !ттипосНет1са1 Ме!Ноб8 Л Се11 Апб Мо1еси1аг Вш1оду (Мауег апб Уа1кег, еб8., Асабетк Рге88, Ьопбоп, 1987); НапбЬоок ОГ Ехрептеп!а1 Iттиηо1оду, ^1ите8 Ην (Б. М. \Уеб апб С. С. В1асктее11, еб8., 1986); Матри1а!1пд !Не Мои8е ЕтЬгуо, (Со1б 8рппд НагЬог ЬаЬога!огу Рге88, Со1б 8рппд НагЬог, Ν.Υ., 1986).

31. 8ее Гог ехатр1е, №гапд, 8А (1983) Те!гаНебгоп 39-3: бакига е! а1. (1981)

ВесотЫпап! БНА, Ргос 3гб С1еуе1апб 8утро8, Масгото1еси1е8, еб. А6 Уа1!оп, Ат8!егбат: Е18еукг рр 273-289; бакига е! а1. (1984) Аппи. Веу. ВшсНет 53:323;

бакига е! а1. (1984) 8аепсе 198:1056; П<е е! а1. (1983) Ν^ΒΒ Ааб Ве8. 11:477.

32. 8ее, Гог ехатр1е, 8со!! е! а1. (1990) 8Аепсе 249:386-390; ВоЪеб8 е! а1. (1992) РNА8 89:2429-2433; Беубп е! а1. (1990) 8скпсе 249:404-406; Стеб1а е! а1. (1990) РNА8 87:63786382; а8 тее11 а8 и.8. Ра!еп!8 Νϋ8. 5,223,409, 5,198,346, апб 5,096,815.

33. М.Т. АЬгеи-Магбп, А. ^бпсб, Б.Н. БупсН апб 8.В. Тагдап. Б1уегдеп1 шбисбоп оГ арор1о818 апб !Ь-8 8есгебоп ш НТ-29 се118 ш ге8роп8е !о ΊΝΕ-¹' апб бдабоп оГ Ра8 Ндапб. I. типо1. 155:4147-4154,1995.

34. К. Адета!8и, Т. КоЬа!а, Р.-С. Уц-щ, Т. Nакаζатеа, К. Рики8Ыта, М. Кбабага, Т. Моб, К. 8идба, С. Мопто!о апб А. Кот1уата. СБ27/СБ70 ш!егасбоп б1гес!1у бпуе8 В се11 ЛС апб ^М 8уп1Не818. Еиг. I. Iттиηо1. 25:2825-

2829,1995.

35. В. Атакатеа. А. Накет, Т.М. Кипб1д, Т. Ма!8иуата, 1.1.Б. 81тагб, Е. Т1тт8, А. Уаке

Нат, Η.-\ν. МШгиескег, Н. Спеккег, Н. ТакимоЮ, К. 8сНт1Гк, А. 8НаЫшап, Р.8. ОНакН1, кМ. Репшпдет апб ϊ.ν. Мак. Ипрайеб педабуе §е1есбоп оГ Т се11з т Нобдкт=к бкеаке апбдеп С630беГккпГ тке. Се11 84:551-562,1996.

36. к-Ь. Вобтег, К. Вигепк, Р. 8сНпе1бег, К. НоГтапп, V. 8кшег, М. ТНоте, Т.

Вогпапб, М. НаНпе, М. 8сНгоекг, К. Вескег, А. νί^η, Ь.Е. ЕгепсН, кЬ. Вго^шпд, Н.К. Масбопа1б, апб 1. ТксНорр. ТКАМР, а поуе1 арор(окк-теб1абпд гесер(ог \тбН кес.|иепсе Ното1оду (о (итог песгокк Гас(ог гесер(ог 1 апб как (аро1/С695). ^типку 6: 79-88,1997.

37. I. Вго)а(ксН, I. №идНГоп, М.М. Ко11з, К. Ζ6ι§Κγ апб кА.Т. Уоипд. Саг1, а Т№К-ге1а!еб рго!ет к а се11и1аг гесерЮг Гог су(ора(Ню ау1ап Пеикокк-кагсота упикек апб теб1а(ек арор(окк. Се11 87:845-855,1996.

38. кЬ. Вго^шпд, М.к Апбго1е\\кх апб С.Е. Vа^е. бутрНокхт апб ап аккоаа(еб 33-кОа д1усоргокт аге ехргекеб оп (Не кигГасе оГ ап асбуа(еб Нитап Т се11 НуЬпбота. 1. ^типок 147: 1230-7,1991.

39. кЬ. Вго^шпд, К. М|а1ко\\'8П, ОА. СпГГННк, Р.К.Воигбоп, С. Неккюп, С.М. АтЬгоке апб V. Мекг. Ргерагабоп апб сНагас(епха(кп оГ ко1иЬ1е гесотЬтапГ Не(его(птегк сотр1ехек оГ Нитам 1утрНо!охтк а1рНа апб Ье(а. 1. Вю1, СНет, 271: 8618-26,1996.

40. кЕ. Сакбо, кА. Ык1тап, В.А. 1асоЬкоп, Υ. -№апд, Р.А. боре/, 8. Ηι, Р.'ЭД'. Е1пп апб Ό.6. Регктк. Еак Моби1абоп оГ арор(окк биппд педабуе ке1есбоп оГ (Нутосу(ек. Iтшишίу 5:617627,1996.

41. С.-Υ.Ά. СНеп апб А.-В. 8Нуи. АИ-бсН е1етеп(к: сНагас(епха(юп апб Ниро г(а псе ш т^А бедгабабоп. Тгепбк ш Вю1. 8ск 20:465-

470,1995.

42. Υ. СНкНерогбсНе, С. Обу апб Р. Vакка1Н. [беп(1Пса(1оп т тоике тасгорНадек оГ а пе\у 4 кЬ т^А ргекеп! т Нета(орок(к бккие \\!исН кНагек а кНоб пис1еоббе кециепсе \\'6Н егу1Нгорокбп тКТА ВюсЫт. ВюрНук. Кек. Сотт. 209:1076-1081,1995.

43. А.М. СЫппауап, К. О=Коигке, С.-б. Υυ, К.Н. буопк, М. Сагд, Ό.Κ биап, б. Хтд, К. Сеп(х, 1. Νί апб УМ. бГхН. 81дпа1 бапкбисбоп Ьу 6В3 а беаШ-ботат-сопШшпд гесерЮг ге1а(еб (о Т№К-1 апб С695. 8скпсе 274:990-992,1996.

44. Р. беТодп! е( а1. АЬпогта1 беуе1ортепГ оГ репрНега1 1утрНо1б огдапк ш тке бебскпГ ш 1утрНо!охт. 8скпсе 264:703-7,1994.

45. М.А. беВепебебе, Ν.Ρ.. СНи, К.Е. Ро11ок, I. Нибако, ν.Ε. -№абе, В.8. Клхоп апб Т.Н. Vабκ. Ко1е оГ 4-1ВВ Ндапб ш сокбти1абоп оГ Т 1утрНосу!е дгоМН апб Нк иргеди1абоп оп М12 В 1утрНотак Ьу сАМР. I. Ехр. Меб. 181:985-

992,1995.

46. М. бед11-Екрокб, Т. баук^тйН, ν.8. Όίη, Р.к 8то1ак, К.С. СообЩп апб С.А. 8тНН. Асбуабоп оГ (Не 1утрНо!охт-3 гесерЮг Ьу сгоккНпктд тбисек сНетокте ргобисбоп апб дгоМН аггек! ш А375 те1апота се11к. 1. Iшшиηо1. 158:1756-1762, 1997.

47. Т.М. Еоу, А. АгиГГо, I. Ва)ога(Н, кЕ. ВиН1тапп апб В.к №е11е. Iшшиηе геди1абоп Ьу С640 апб 11к Ндапб др39. Апп. Кеу. Iшшиηо1. 14: 591-617,1996.

48. Н.к Сгикк, Ν. Во1ат, б.Е. ’№1Шатк, К.б Агтбаде, С.А. 81т(Н апб К.С. СообЩп. Р1ею1гор1с еГГес(к оГ (Не С630 Ндапб оп С630ехргекктд се11к апб 1утрНота се11 1тек. В1ооб 83: 2045-56,1994.

49. Н.к Сгикк апб 8.К. бо^ег. Титог песгокк Гас (о г Ндапб кирегГатбу: туокетепГ ш 1Не ра(Но1оду оГ табдпапГ 1утрНотак. В1ооб 85:3378-404,1995.

50. I. Кбкоп, Т. Кауеп, Υ.-Р. бапд, Ό.ν. Соеббе1, КМ С11ек, К.-Т. Рип, С.к СппНат, К.Вгслуп апб 8.Ν. Еагготе. А беа(Н ботатсопГшшпд гесер(ог (На( теб1а(ек арор(окк. №1(иге 384:372-375,1996.

51. 8.Υ. бее, С.С. Рагк апб Υ. СНок Т се11 гесер(ог-берепбеп( се11 беа(Н оГ Т се11 НуЬпботак теб1а(еб Ьу 1Не С630 су(ор1актк ботат ίη аккос1абоп \\'НН (итог песгокк Гас(ог гесер(огаккоаакб ГасФгк. I. Ехр. Меб. 183:669-674,1996.

52. Β.Ι. МопГдотегу, М.8. ’№агпег, В.к бит апб Р.С. 8реаг. Негрек к1тр1ех у1гик-1 епбу тГо се11к теб1а(еб Ьу а поуе1 тетЬег оГ гНе ΕΝΗ/ΝΟΗ гесеркг ГатПу. Се11 87: 427-436,1996.

53. 8. №1да(а. АрорФкк Ьу беа(Н Гас(ог. Се11 88:355-365,1997.

54. К.М. РИН, 8.А. Магккгк, 8. Кирреб, С.к бопаНие, А. Мооге апб А. АкНкепахГ кбисбоп оГ арор(ок1к Ьу Аро-2 Ндапб, а пе\у тетЬег оГ гНе (итог песгокк Гас(ог су!окте ГатПу. ί. Вю1. СНет. 1996.

55. С.А. 8шНН, Т. ЕаггаН апб К.С. СообЩп. ТНе Т№ гесер(ог кирегГатбу оГ се11и1аг апб У1га1 рго(е1пк: асбуабоп, сокбти1абоп, апб беа(Н. Се11 76: 959-62,1994.

56. С.б. 8тйН Угик к(га(ед1ек Гог еуакюп оГ (Не Нок( гекропке (о Н1Гес(кп. Тгепбк ίη МкгоЬю1. 3: 81-88,1994.

57. Е. 8биеЬег апб V. 8!гоЬег. ТНе Т се11-В се11 тГегасбоп У1а ОХ40-ОХ406 к песеккагу Гог (Не Т се11 тберепбепГ Нитога1 1ттипе гекропке. к Ехр. Меб, 183: 979-989, 1996.

58. Н.-К. 8у(\\'и, К.8. б1Ь1аи апб Н.О. МсбеуНб ТНе го1ек оГ Еак/Аро-1 (С695) апб ЮТ ίη апбдепбпбисеб ргодгаттеб се11 беа(Н ίη Т се11 гесер(ог 1гапдешс писе. НтпипНу 5:17-30,1996.

59. РУаккаШ. ТНе рабюрНукккду оГ Гитог песгокк Гас(огк. Апп. Кеу. Iшшиηо1. 10: 411452,1992.

60. б. Ζ^^, С. ЕкНег, К.Е. М111ег, I. РексНоп, б.Н. бупсН апб М.1 бепагбо. [пбисНоп оГ арор(окк ίη та(иге Т се11к Ьу (итоиг песгокк ГасЮТ. Накге 377: 348-351,1995.

Список последовательностей (1) ОБЩАЯ ИНФОРМАЦИЯ (ί) ЗАЯВИТЕЛЬ: СЫсНеротйсНе, Υνек

Вго^шпд, ЛеГГгеу Ь.

(ίί) НАЗВАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ: Лиганд, родственный фактору некроза опухоли (ш) ЧИСЛО ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ: 4 (ίν) АДРЕСС ДЛЯ КОРРЕСПОНДЕНЦИИ:

(A) АДРЕСАТ:ВЮ6ЕИ, ГИС.

(B) УЛИЦА: 14 САМВΚI^6Ε СΕNΤΕΚ (C) ГОРОД: САМВΚI^6Ε (Ό) ШТАТ: МА (Е) СТРАНА: И8 (Р) ПОЧТОВЫЙ КОД: (ΖΙΡ) 02142 (ν) ФОРМА СЧИТЫВАНИЯ КОМПЬЮТЕРОМ:

(A) ТИП НОСИТЕЛЯ: Гибкий диск (B) КОМПЬЮТЕР: 1ВМ РС совместимый (C) ОПЕРАЦИОННАЯ СИСТЕМА: Р8ΌΟ8/Μ8-ΌΟ8 (Ό) ПРОГРАММНОЕ ОБЕСПЕЧЕНИЕ: Ра!епЛп Ре1еаке #1.0, Уегкюп #1.30 (νί) ДАННЫЕ НАСТОЯЩЕЙ ЗАЯВКИ:

(A) НОМЕР ЗАЯВКИ: Еще неизвестен (B) ДАТА РЕГИСТРАЦИИ: 07 мая 1997 года (C) КЛАССИФИКАЦИЯ:

(νίίί) ИНФОРМАЦИЯ О ПОВЕРЕННОМ/АГЕНТЕ:

(A) ИМЯ: ЕБ-ΥΝΝ, ΚΕΚΚΥ А.

(B) РЕГИСТРАЦИОННЫЙ ΗΟΜΕΡ: 33,693 (C) ΚΕРΕΚΕNСΕ/^ΟСΚΕΤ NυМВΕΚ: А003 РСТ (ίχ) ИНФОРМАЦИЯ ДЛЯ ТЕЛЕКОММУНИКАЦИИ:

(A) ТЕЛЕФОН: (617) 679-3583 (B) ТЕЛЕФАКС: (617) 679-2838 (2) Информация для 8Ε0 ΙΌ № 1:

(ί) Характеристики последовательности:

(A) ДЛИНА: 1168 п. н.

(B) ТИП: нуклеиновая кислота (C) КОЛИЧЕСТВО ЦЕПЕЙ: две (Ό) ТОПОЛОГИЯ: линейная (и) ТИП МОЛЕКУЛЫ. кДНК (ш) ГИПОТЕТИЧЕСКАЯ: НЕТ (ίν) АНТИСМЫСЛОВАЯ: НЕТ (νί) Исходный источник:

(А) ОРГАНИЗМ: белок, родственный семейству ΤΝΕ (ίχ) ПРИЗНАК:

(A) ИМЯ/КОД: СБ8 (B) МЕСТОПОЛОЖЕНИЕ: 2... 676 (χί) ОПИСАНИЕ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ: 8ΕΟ ΙΌ № 1:

с ото СТО АОС СТО ОСС СТО ОСО СТО ССС ТСС СТТ СОС СТС СТС СТО46

УаХ Ьеи Бег Ьеи С1у Ьеи А1а Ьеи А1а Суз Ьеи СХу Ьеи Ьеи Ьеи

1®15

ОТС ОТО ОТС АОС СТО 066 АОС ТОО ОСА АС© СТО ТСТ ОСС САС ОАО ССТ94

Уа1 Уа1 УаХ Бег Ьеи 61у Вег Тгр А1а ТЫ Ьеи Вег АХа СХп ОХ и Рго

25 -30

ТСТ САС ОАО ОАО СТО АСА ОСА ОАО САС ССС ООО ОАО ССС ССТ САА СТО142

Вег СХп С1и О1и Ьеи ТЬг А1а СХи Азр Агд Агд С1и Рго Рго О1иЬеи

4045

ААТ ССС САО АСА ОАО САА АОС САС САТ ОТО ОТА ССТ ТТС ТТС САА САК190

Азп Рго О1п ТЬг СХи СХи Зег О1п Азр УаХ νβΐ Рго РЬе Ьеи 01«С1п

5560

СТА СТС ССС ССТ ССА АСА АСТ ССТ ССТ ААА ССС ССС ААС ССС ССС ССТ238

Ьеи ν&1 Агд Рго Агд Агд Зег А1а Рго Ьуз С1у Агд Ьуз АХа АгдРго

7075

СОС ССА ОСТ АТТ ОСА ОСС САТ ТАТ ОАО СТТ САТ ССТ ССС ССА СОА САС286

Агд Агд АХа Не А1а АХа Ηίβ Туг СХи УаХ Н1з Рго Агд Рхо 61уС1л

85 9095

САТ ССА ССА САА ССА ССТ СТС САТ ООО АСА ОТО АСТ ССС ТОО ОАА ОАО334

Авр СХу А1а ОХп АХа С1у УаХ Азр О1у ТЬг Уа1 Зег СХу Тгр СХиС1и

100 105110

АСС ААА АТС ААС АСС ТСС АСС ССТ СТО ССС ТАС САС ССС САС АТТ ССС382

ТЬг Ьуз Не Азп Зег Зег Зег Рго Ьеи Агд Туг Азр Агд ОХп НеСХу

115 120125

САА ТТТ АСА СТС АТС АСС ОСТ 060 СТС ТАС ТАС СТО ТАС ТСТ САС ОТС430

01и РЬе ТЫ УаХ ХХе Агд А1а ОХу Ьеи Туг Туг Ьеи Туг Суз С1пУаХ

130 135140

СЛС ТТТ САТ ОАО ОСА ААС ОСТ ОТС ТАС СТО АА0 СТО ОАС ТТС СТО СТО478

Нхз РЬе Авр СХи СХу Ьу8 АХа УаХ Туг Ьеи Ьуя Ьеи Азр Ьеи ЬеиУа1

145 150155

ААС СОТ ОТО СТО ССС СТО СОС ТСС СТО САА ОАА ТТС ТСА ОСС АСА ОСА526

Азп СХу νβΐ Ьеи А1а Ьеи Агд Суз Ьеи СХи ОХи РЬе Вег А1а ТЬгА1а

160 165 170175

ОСА АОС ТСТ ССТ ООО ССС САО СТС СОТ ТТО ТОС САС ОТО ТСТ ООО СТО574

А1а Зег Вег Рго 01у Рго ОХп Ьеи Агд Ьеи Сув СХп УаХ Зег С1уЬеи

180 185190

ТТС ССС СТО ССС ССА ООО ТСТ ТСС СТТ СОС АТС СОС АСС СТС ССС ТОО622

Ьеи Рго Ьеи Агд Рго О1у Зег Зег Ьеи Агд 1Хе Агд ТЬг Ьеи РгоТгр

195 200205

ССТ САТ СТТ ААО ОСТ ССС ССС ТТС СТА АСС ТАС ТТТ ОСА СТС ТТТ САА670

АХа ΗΪ8 Ьеи Ьуз А1а А1а Рго РЬе Ьеи ТЬг Туг РЬе СХу Ьеи РЬеО1п

210 215220

ОТТ САС ТОАССОСССТ ТОСТСТСССА САТТССТТАА АСТТТСССТС ССТССАССАО726 ν<1 Нхв •225

САТСАССАСА ССТСССТАСС ССАСССССАС ТССТССАССС ССТСОСТССТ ССТТСЗТССА786

СТССТСТСТС ТССТСААА60 СА6ССАОА6С ТТСТТСАСАТ ОТГТССАТТС САСАОАССТА846

ТССТТССТСТ ТСТТААСАТС ССАТСССАСС АСААСТАТСС АССТСАСТАО СТСССАААОС906

СССТАСТТАТ СССТСАСТСС СССАСССАСТ САССССАССА СОТСТТТАТТ 6АСТТТСТ6С966

АССА60САСТ 6А6АТО6ОСТ ССАССТСОТС 6САО6АА6СС АОАОААССТО 60АСТА60СС1026

АОААОТТССС ААСТОТОАСО 066ААСАССТ 060САСАА0С ТССТСССТСЗ АТСССТОТОО10Вб

АТТТТСАААА САТАСТАТТТ ТТАТТАТТАТ ТСТОАСАААА ТОТТАААТ65 АТАТТАААОА 1146

ОААТАААТСА ТСАТТТСТСТ ТС1168 (2) Информация для 8Ε0 ΙΌ № 2:

(ί) Характеристика последовательности:

(A) ДЛИНА: 225 аминокислоты (B) ТИП: аминокислота (Ό) ТОПОЛОГИЯ: линейная (ίί) ТИП МОЛЕКУЛЫ: белок (χί) ОПИСАНИЕ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ: 8ΕΟ ΙΌ № 2:

УаХ Ьеи Бег Ьеи СХу Ьеи АХа Ьеи АХа Суз Ьеи С1у Ьеи ьеи Ьеи

УаХ

1

5

10

15

УаХ

Уа1

Бег

Ьеи 20

<31у

Бег

Тгр

А1а

ТЫ 25

Ьеи

Бег

АХа

СХп

С1и 30

Рго

Бег

С1п

С1и

СХи 35

Ьеи

«1Г

АХа

СХи

Авр 40

Агд

Агд

СХи

Рго

Рго 45

С1и

Ьеи

Азп

Рго

схп 50

ТЫ

СХи

СХи

Бег

СХп 55

Азр

УаХ

УаХ

Рго

РЬе 60

Ьеи

СХи

С1п

Ьеи

УаХ 65

Агд

Рго

Агд

Агд

Бег 70

А1а

Рго

Ьув

СХу

Агд 75

Ьув

А1а

Агд

Рго

Агд 80

АГ?

А1а

Не

А1а

АХа В5

Н18

Туг

СХи

УаХ

ΗΪ8 90

Рго

Агд

Рго

СХу

С1п 95

Азр

СХу

АХа

СХп

А1а 100

СХу

УаХ

Азр

СХу

ТЫ 105

Уа1

Бег

СХу Тгр

СХи 110

С1и

ТЫ

Ьуз

Не

Азп 115

Бег

Бег

Бег

Рго

Ьеи 120

Агд

Туг Азр

Агд

СХп 125

11е

С1у

С1и

РЪе

ТЫ 130

УаХ

Не

Агд

А1а

СХу 135

Ьеи

Туг

Туг

Ьеи

Туг 140

Суз

СХп

УаХ

ΗΪ5

РЬе 145

Азр

С1и

С1у Ьуз

А1а 150

УаХ

туг

Ьеи

Ьуз

Ьеи 155

Авр

Ьеи

Ьеи

Уа1

Азп 160

С1у

ν&ι

Ьеи

А1а

Ьеи 165

Агд

Су5

Ьеи

СХи

СХи 170

РЬе

Бег

А1а

ТЬг

АХа 175

АХа

Бег

Бег

Рго

С1у 180

Рго

СХи

Ьеи

Агд

Ьеи 185

Суз

СХп

УаХ

Бег

С1у 190

Ьеи

Ьеи

Рго

Ьеи

Агд 195

Рго

С1у

вег

Бег

Ьеи 200

Агд

Не

Агд

ТЫ

Ьеи 205

Рго

Тгр

А1а

ΗΪ5

Ьеи 210

Ьуз

АХа

АХа

Рго

РЬе 215

Ьеи

ТЫ

Тух

РИе

СХу 220

Ьеи

РЬе

СХп

Уа1

Н18

225 (2) Информация для 8ЕЦ ΙΌ № 3:

(ί) Характеристики последовательности:

(A) ДЛИНА: 1373 п.н.

(B) ТИП: нуклеиновая кислота (C) КОЛИЧЕСТВО ЦЕПЕЙ: две (Ό) ТОПОЛОГИЯ: линейная (ίί) ТИП МОЛЕКУЛЫ: кДНК (ίίί) ГИПОТЕТИЧЕСКАЯ: НЕТ (ίν) АНТИСМЫСЛОВАЯ: НЕТ (νί) Исходный источник:

(А) ОРГАНИЗМ: белок, родственный семейству ΤΝΕ (ίχ) ПРИЗНАК:

(A) ИМЯ/КОД: СБ8 (B) МЕСТОПОЛОЖЕНИЕ: 1... 852 (χί) ОПИСАНИЕ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ: 8ЕО ΙΌ № 3:

АТС Мес 1

ТСА ТТС

ТТА САС Ьеи Аар 5

ттт РНе

САА АТТ ТСС ССС ССС ССС СТС ССС- СТС ССС

4В

8ег

Ьеи

С1и

Не

Зег

АХа Агд 10

Агд Ьеи

Рго Ьеи Рго 15

СОА

ТСС

СТС

ССС

ТСС

ССС

САТ

ССС

ООО

ССС

СТС

АСС

САС

ССА

САЗ

ССС

96

Агд

Зег

Ьеи

01у 20

Зег

Агд

Азр

СХу

С1у 25

А1а

У»1

Агд

С1п

А1а 30

С1п

Рго

ССС

ОСС

ССС

АТС

ССС

ССС

ССТ

СОЗ

АСС

САС

АСС

ССС

АЭС

ССЗ

ССС

ССС

144

Рго

АХа

Рго 35

Мес

А1а

А1а

Агд

Агд 40

Зег

01п

Агд

Агд

Агд 45

С1у

Агд

Агд

ОСС

ОАО

ссз

ССС

АСС

ССС

СТС

СТС

ОТС

ССС

СТС

ССС

СТО

ССС

СТС

ССС

192

СХу

С1и 50

Рго

<31 у

ТЬг

А1а

Ьеи 55

Ьеи

Уа1

Рго

Ьеи

АХа 60

Ьеи

С1у

Ьеи

СХу

сто

ОСО

СТС

ССС

ТСС

СТС

ССС

СТС

СТС

СТС

ССС

СТС

СТС

АСТ

ТТС

ОСС

240

Ьеи 65

А1а

Ьеи

А1а

Суз

Ьеи 70

С1у

Ьеи

Ьеи

Ьеи

АХа 75

νβΧ

УаХ

Зег

Ьеи

СХу ВО

АСС

соо

ССА

ТСС

СТС

ТСС

ССС

САС

САС

ССТ

ССС

САС

ОАО

САС

СТС

СТС

2В8

£ег

Агд

АХа

Зег

05

Зег

АХа

С1п

СХи

Рго 90

АХа

СХп

<31 и

31и

Ьеи 95

УаХ

ОСА

ОАО

САС

САС

САС

САС

ССС

тсс

САА

СТС

ААТ

ССС

САС

АСА

ОДА

САА

336

А1а

О1и

С1и

Азр 100

ОХп

Аар

Рго

Зег

ОХи 105

Ьеи

Азп

Рго

С1п

ТЬг 110

СХи

СХи

АСС

САС

САТ

сст

ССС

ССТ

ТТС

СТС

ААС

ССА

СТА

стт

ССС

сст

ССС

АСА

364

Зег

С1л

Азр 115

Рго

АХа

Рго

рье

Ьеи 120

АЗП

Агд

Ьеи

Уа1

Агд 125

Рго

Агд

Агд

АСТ ССА Зег АХа

ССТ ААА ССС ССС

ААА АСА ССЗ ССТ СОА АСА ССС АТС ССА ОСС

432

Рго Ьуз

С1у Агд

Ьуа ТЫ Агд 135

АХа Агд

Агд 140

АХа Не А1а А1а

130

САТ

ТАТ

(ЗАД

ОТТ

САТ

ССА

СОА

ССТ

(ЗОА

САЗ

САС

ОСА

ОСС

САС

ОСА

ССТ

460

Мхе

Туг

С1и

Уа1

НХя

Рго

Агд

Рго

С1у

СХп

Азр

СХу

АХа

ОХп

АХа

СХу

145

150

155

160

СТС

САС

<330

АСА

СТС

АСТ

ССС

тсс

ОАО

САА

ОСС

АСА

АТС

ААС

АСС

ТСС

526

уа1

Аар

31у

ТЫ

УаХ

Зег

О1у Тгр

СХи

О1и

А1а

Агд

11е

Аяп

Зег

Зег

165

170

175

АСС

ССТ

СТС

ССС

ТАС

ААС

ССС

САС

АТС

ССС

САС

ТТТ

АТА

СТС

АСС

ССС

576

Зег

Рго

Ьеи

Агд

Туг

Аяп

Агд

С1п

Не

СХу

<Э1и

РЬе

Не

УаХ

ТЬг

Агд

1В0

165

190

ССТ

ССС

СТС

ТАС

ТАС

СТС

ТАС

тот

САС

СТО

САС

ТТТ

САТ

ОАО

€03

ААС

624

А1а

С1у

Ьеи

Тут

Тут

Ьеи

Туг

Суа

01п

УаХ

НХя

РЬе

Азр

С1и

С1у

Ьуз

195

200

205

ССТ

СТС

ТАС

СТС

АА<3

СТС

САС

ТТС

СТС

СТС

САТ

ССТ

СТС

СТС

ССС

сто

672

АХа

Уа1

Тут-

Ьеи

Ьув

Ьеи

Аар

Ьеи

Ьеи

Уа1

Аар

СХу

УаХ

Ьеи

А1а

Ьеи

210

215

220

ССС

ТСС

СТС

САС

САА

ТТС

ТСА

ОСС

АСТ

ОСС

ССС

АЗТ

ТСС

СТС

ССС

ссс

720

Агд

Суз

Ьеи

С1и

01«

РПе

Зег

А1а

ТЬг

АХа

А1а

Зег

Зег

Ьеи

С1у

Рго

225

230

235

240

САС

СТС

ССС

СТС

ТСС

САС

СТС

ТСТ

ССС

СТС

ТТС

ССС

ста

ссс

ССА

СОЗ

768

СХп

Ьеи

Агд

Ьеи

Суз

СХп

Уа1

Зег

С1у

Ьеи

Ьеи

АХа

Ьеи

Агд

Рго

СХу

245

250

255

ТСС

ТСС

СТС

ССС

АТС

СОС

АСС

СТС

ССС

ТОО

ОСС

САТ

СТС

ААС

ОСТ

ССС

616

Зег

Зег

Ьеи

Агд

Не

Агд

ТЬг

Ьеи

Рго

Тгр

АХа

ΗΪ8

Ьеи

Ьуз

АХа

АХа

260

265

270

ССС

ТТС

СТС

АСС

ТАС

ТТС

СОА

СТС

ТТС

САС

СТТ

САС

ТОАССССССС

862

Рго

РЬе

Ьеи

ТЫ

Туг

РПе

О1у

Ьеи

РЪе

СХп

УаХ

Н13

275 260

ТССТСТСССС АСАСТССТСС САЗЗСТСССС ССТССССТС6 АСАОСТСТСТ ССЗСАСССС6 922

ТССССТСТСС СССАСССТСА СССССТСТТТ ЗСТССАСАСС ТСССССТССС ТСТАСАСССТ 962

СССТССОССТ СТТСАССТСТ ТТГССАТССС АСАТАААТАС АСТАТТСССА СТСТТАТСТТ 1042

АСААСТСССС САССССССАС ТСТССАССТС АСТАССТССС СААТСССТЗА СССТТТСАЗЗ 1102

СССССАСТОА ТСТССАСТСС ССССТ66ССА САОАСССССА ЗСССАТТСТС ТТСАСТЗТАС 1162

ТСТСТССССА АОСАТСССТС САСААОАССС САСТТСАССС АСТААСАСОС ССТССАССТО 1222 (ЗСОССАОСАА СССАААСАЕА СТЗСЗССТАО СССА6САСТТ СССАААТСТО АССССССАСА 1262

ААСААОАСАА ССТССТСССТ ТОАСААТТСС СТ6Т36АТТТ ТТААААСА6А ТАТГАТТТТТ 1342

АТТАТТАТТО ТСАСААААТО ТТСАТАААТС С 1373 (2) Информация для 8ЕЦ ΙΌ № 4: (ί) Характеристика последовательности:

(A) ДЛИНА: 284 аминокислоты (B) ТИП: аминокислота (Ό) ТОПОЛОГИЯ; линейная (ίί) ТИП МОЛЕКУЛЫ: белок (χί) ОПИСАНИЕ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ: 8ЕО Ш № 4:

Мес 1

Бег Ьеи

Ьеи Авр 5

РЬе СХи Не Бег А1а Агд Агд Ьеи Рго Ьеи Рго

10

15

Агд

Бег

Ьеи

СХу 20

Бег

Агд

Авр

СХу

<31у 25

АХа

Уа1

Агд

СХп

А1а 30

СХп

Рго

Рго

А1а

Рго 35

Мес

АХа

А1а

Агд

Агд 40

Бег

СХп

Агд

Агд

Агд 45

СХу

Агд

Агд

С1у

СХи 50

₽ГО

<31у

ТЬг

АХа

Ьеи 55

Ьеи

Уа1

Рго

Ьеи

АХа 60

Ьеи

С1у

Ьеи

С1у

Ьеи 65

А1а

Ьеи

АХа

Су в

Ьеи 70

С1у

Ьеи

Ьеи

Ьеи

АХа 75

УаХ

УаХ

Бег

Ьеи

С1у 80

Бег

Агд

А1а

Бег

Ьеи 85

Зег

А1а

СХп

СХи

Рго 90

АХа

СХп

С1и

СХи

Ьеи 95

Уа1

А1а

31и

ОХи

Авр 100

СХп

Азр

Рго

Бег

С1и 105

Ьеи

Авп

Рго

С1п

ТЬг 110

СХи

С1и

Бег

31п

Авр 115

Рго

АХа

Рго

РЬе

Ьеи 120

Авп

Агд

Ьеи

Уа1

Агд 125

Рго

Агд

Агд

Бег

А1а 130

Рго

Ьуз

СХу Агд

Ьув 135

ТЬг

Агд

АХа

Агд

Агд 140

АХа

Не

АХа

А1а

НХБ 145

Туг

СХи

Уа1

Н15

Рго 150

Агд

Рго

С1у

СХп

Авр 155

С1у

А1а

С1п

АХа

С1у 160

Уа1

Авр

<31 у

ТЫ

УаХ 165

Зег

С1у

тгр

СХи

СХи 170

АХа

Агд

Не

Авп

Бег 175

Бег

8ег Рго Ьеи Агд Туг Ави Агд С1п Не СХу С1и РЬе 11е Уа1 ТЬг Агд 180 185190

АХа СХу Ьеи Туг Туг Ьеи Туг Сув СХп УаХ Ηΐβ РЬе Авр 01и <31у Ьув 195 200205

АХа ХГа! Туг Ьеи Ьуз Ьеи Азр Ьеи Ьеи УаХ Азр СХу УаХ Ьеи АХа Ьеи 210 215220

Агд Суз Ьеи С1и Э1и РЬе бег АХа ТЬг АХа А1а бег Зег Ьеи СХу Рго 225 230 235240

СХп Ьеи Агд Ьеи Суз СХи УаХ 8ег СХу Ьеи Ьеи АХа Ьеи Агд Рго СХу 245 250255

Зег Зег Ьеи Агд Не Агд ТЬг Ьеи Рго Тгр АХа Шв Ьеи Ьуз А1а АХа 230 265270

Рго РЬе Ьеи ТЬг Туг РЬе С1у Ьеи РЬе СХп Уа1 Н£в

275280

Claims (53)

1. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

   1. Последовательность ДНК, кодирующая лиганд, родственный фактору некроза опухоли, причем указанная последовательность состоит, по существу, из 8ЕЦ ГО № 1.
2. 2. Последовательность ДНК, кодирующая лиганд, родственный фактору некроза опухоли, причем указанная последовательность состоит, по существу, из 8ЕЦ ГО № 3.
3. 3. Молекула ДНК, кодирующая полипептид, где указанный полипептид содержит аминокислотную последовательность, которая, по меньшей мере, на 50% гомологична активному сайту лиганда, родственного фактору некроза опухоли, причем указанная молекула ДНК гибридизуется с ДНК-зондом, содержащим, по меньшей мере, 20 последовательных нуклеотидов последовательности 8ЕЦ ГО № 1.
4. 4. Молекула ДНК, кодирующая полипептид, где указанный полипептид содержит аминокислотную последовательность, которая, по меньшей мере, на 50% гомологична активному сайту лиганда, родственного фактору некроза опухоли, причем указанная молекула ДНК гибридизуется с ДНК-зондом, содержащим, по меньшей мере, 20 последовательных нуклеотидов последовательности 8ЕЦ ГО № 3.
5. 5. Последовательность ДНК, кодирующая лиганд, родственный фактору некроза опухоли, где кодируемый лиганд, родственный фактору некроза опухоли, содержит аминокислотную последовательность 8ЕЦ ГО № 2, причем указанная аминокислотная последовательность может содержать консервативные замены, изменения или делеции.
6. 6. Последовательность ДНК, кодирующая лиганд, родственный фактору некроза опухоли, где кодируемый лиганд, родственный фактору некроза опухоли, содержит аминокислотную последовательность 8ЕЦ ГО № 4, причем указанная аминокислотная последовательность может содержать консервативные замены, изменения или делеции.
7. 7. Рекомбинантная молекула ДНК, содержащая последовательность ДНК по п.1, причем указанная последовательность оперативно связана с последовательностью, регулирующей экспрессию.
8. 8. Рекомбинантная молекула ДНК, содержащая последовательность ДНК по п.2, причем указанная последовательность оперативно связана с последовательностью, регулирующей экспрессию.
9. 9. Линия рекомбинантных клеток, содержащих молекулу ДНК по п.1 или 7, для экспрессии лиганда, родственного фактору некроза опухоли, причем указанные клетки выбраны из клеток ΕΒΝΑ293 и клеток ΗφΙιΕίνο¹™.
10. 10. Линия рекомбинантных клеток, содержащих молекулу ДНК по п.2 или 8, для экспрессии лиганда, родственного фактору некроза опухоли, причем указанные клетки выбраны из клеток ΕΒΝΑ293 и клеток ΗφΙιΕίνο¹™.
11. 11. Лиганд, родственный фактору некроза опухоли, содержащий биологически функциональную последовательность, содержащую аминокислотную последовательность 8ЕЦ ГО № 2.
12. 12. Лиганд, родственный фактору некроза опухоли, содержащий биологически функциональную последовательность, содержащую аминокислотную 8ЕЦ ГО № 4.
13. 13. Способ получения лиганда по п.11, который предусматривает культивирование клеток-хозяев по п.9, в условиях, при которых клетка-хозяин продуцирует лиганд, и выделение указанного лиганда.
14. 14. Способ получения лиганда по п.12, который предусматривает культивирование клеток-хозяев по п.10, в условиях, при которых клетка-хозяин продуцирует лиганд, и выделение указанного лиганда.
15. 15. Лиганд, родственный фактору некроза опухоли, содержащий последовательность 8ЕЦ ГО № 2, получаемый способом по п.13, причем указанный лиганд, полученный таким способом, затем подвергается очистке, достигая высокой степени чистоты.
16. 16. Лиганд, родственный фактору некроза опухоли, содержащий последовательность 8ЕЦ ГО № 4, получаемый способом по п.14, причем указанный лиганд, полученный таким способом, затем подвергается очистке, достигая высокой степени чистоты.
17. 17. Фармацевтическая композиция, содержащая терапевтически эффективное количество лиганда по п.11 и фармацевтически приемлемый носитель.
18. 18. Фармацевтическая композиция, содержащая терапевтически эффективное количество лиганда по п.12 и фармацевтически приемлемый носитель.
19. 19 . Способ предотвращения или уменьшения тяжести аутоиммунного заболевания, предусматривающий стадию введения пациенту терапевтически эффективного количества фармацевтической композиции по п.17.
20. 20. Способ предотвращения или уменьшения тяжести аутоиммунного заболевания, предусматривающий стадию введения пациенту терапевтически эффективного количества фармацевтической композиции по п.18.
21. 21. Способ предотвращения или уменьшения тяжести иммунного ответа на тканевый трансплантат, предусматривающий стадию введения пациенту терапевтически эффективного количества фармацевтической композиции по п.17.
22. 22. Способ предотвращения или уменьшения тяжести иммунного ответа на тканевый трансплантат, предусматривающий стадию введения пациенту терапевтически эффективного количества фармацевтической композиции по п.18.
23. 23. Способ стимуляции иммунной системы, предусматривающий введение пациенту эффективного количества фармацевтической композиции по п.17.
24. 24. Способ стимуляции иммунной системы, предусматривающий введение пациенту эффективного количества фармацевтической композиции по п.18.
25. 25. Способ супрессии иммунной системы, предусматривающий введение пациенту эффективного количества фармацевтической композиции по п.17.
26. 26. Способ супрессии иммунной системы, предусматривающий введение пациенту эффективного количества фармацевтической композиции по п.18.
27. 27. Способ лечения рака, предусматривающий введение пациенту терапевтически эффективного количества фармацевтической композиции по п.17.
28. 28. Способ лечения рака, предусматривающий введение пациенту терапевтически эффективного количества фармацевтической композиции по п.18.
29. 29. Способ идентификации молекулы, которая специфически связывается с лигандом, родственным фактору некроза опухоли, по п.11, предусматривающий (a) обеспечение биологически активного лиганда, родственного фактору некроза опухоли;

    (b) мечение указанного биологически активного лиганда, родственного фактору некроза опухоли, регистрируемой меткой;

    (c) введение композиции, содержащей, по меньшей мере, один белок, в контакт с меченым биологически активным лигандом, родственным фактору некроза опухоли, стадии (Ь);

    (б) регистрирование специфического связывания белка с указанным меченым биологически активным лигандом, родственным фактору некроза опухоли, идентифицирующее таким образом молекулу, которая специфически связывается с меченым лигандом, родственным фактору некроза опухоли.
30. 30. Растворимый фрагмент лиганда, родственного фактору некроза опухоли, по п.11, где указанный фрагмент содержит аминокислотную последовательность 8ЕО ГО № 2 без трансмембранного участка и Ν-конца указанного лиганда, родственного фактору некроза опухоли.
31. 31. Растворимый фрагмент лиганда, родственного фактору некроза опухоли, по п.12, где указанный фрагмент содержит аминокислотную последовательность 8ЕО ГО № 4 без трансмембранного участка и Ν-конца указанного лиганда, родственного фактору некроза опухоли.
32. 32. Аналог лиганда, родственного фактору некроза опухоли, содержащий аминокислотную последовательность, которая, по меньшей мере, на 40% гомологична полипептидной последовательности 8ЕО ГО № 2, причем указанный аналог кодируется молекулой ДНК по п.3.
33. 33. Аналог лиганда, родственного фактору некроза опухоли, содержащий аминокислотную последовательность, которая, по меньшей мере, на 40% гомологична полипептидной последовательности 8ЕО ГО № 4, причем указанный аналог кодируется молекулой ДНК по п.4.
34. 34. Способ получения препарата антител, реагирующего с лигандом, родственным фактору некроза опухоли, по п.11, предусматривающий стадию иммунизации организма указанным лигандом, родственным фактору некроза опухоли, или его антигенным фрагментом.
35. 35. Способ получения препарата антител, реагирующих с лигандом, родственным фактору некроза опухоли, по п.12, предусматривающий стадию иммунизации организма упомянутым лигандом, родственным фактору некроза опухоли, или его антигенным фрагментом.
36. 36. Препарат антитела, полученный способом по п.34.
37. 37. Препарат антитела, полученный способом по п.35.
38. 38. Фармацевтическая композиция, содержащая препарат антител по п.36.
39. 39. Фармацевтическая композиция, содержащая препарат антител по п.37.
40. 40. Способ экспрессии гена в клетке млекопитающего, предусматривающий (a) введение последовательности по п.1, кодирующей лиганд, родственный фактору некроза опухоли, в клетку;

    (b) предоставление упомянутой клетке возможности жить в условиях, в которых указанный ген экспрессируется в упомянутой клетке млекопитающего.
41. 41. Способ экспрессии гена в клетке млекопитающего, предусматривающий:

    (a) введение последовательности по пункту 2, кодирующей лиганд, родственный фактору некроза опухоли, в клетку;

    (b) предоставление упомянутой клетке возможности жить в условиях, в которых указанный ген экспрессируется в упомянутой клетке млекопитающего.
42. 42. Способ лечения нарушения, связанного с лигандом, родственным фактору некроза опухоли, предусматривающий введение в клетку млекопитающего эффективного количества рекомбинантной молекулы по п.7.
43. 43. Способ лечения нарушения, связанного с лигандом, родственным фактору некроза опухоли, предусматривающий введение в клетку млекопитающего эффективного количества рекомбинантной молекулы по п.8.
44. 44. Способ по пп.42 и 43, при котором млекопитающим является человек.
45. 45. Способ индукции гибели клеток, предусматривающий введение агента, способного противодействовать связыванию лиганда, родственного фактору некроза опухоли, по п.11 с его рецептором, причем агентом, способным противодействовать связыванию лиганда, родственного фактору некроза опухоли, с его рецептором, является растворимый лиганд, родственный фактору некроза опухоли, по п.30.
46. 46. Способ индукции гибели клеток, предусматривающий введение агента, способного противодействовать связыванию лиганда, родственного фактору некроза опухоли, по п.12 с его рецептором, причем агентом, способным противодействовать связыванию лиганда, родственного фактору некроза опухоли, с его рецептором, является растворимый лиганд, родственный фактору некроза опухоли, по п.31.
47. 47. Способ по пп.45 и 46, дополнительно предусматривающий введение γ-интерферона.
48. 48. Способ лечения, супрессии или изменения иммунного ответа, включающего в себя путь передачи сигнала между лигандом, родственным фактору некроза опухоли, и его рецептором, при этом указанный способ предусматривает стадию введения эффективного количества агента, способного противодействовать связи между лигандом, родственным фактору некроза опухоли, по п.11 и его рецептором, причем агентом, способным противодействовать связыванию лиганда, родственного фактору некроза опухоли, с его рецептором, является растворимый лиганд, родственный фактору некроза опухоли, по п.30.
49. 49. Способ по п.48, где в указанном иммунном ответе участвуют клетки аденокарциномы человека.
50. 50. Способ идентификации молекулы, которая специфически связывается с лигандом, родственным фактору некроза опухоли, по п.12, предусматривающий (a) обеспечение биологически активного лиганда, родственного фактору некроза опухоли;

    (b) мечение указанного биологически активного лиганда, родственного фактору некроза опухоли, регистрируемой меткой;

    (c) приведение композиции, содержащей, по меньшей мере. один белок, в контакт с меченым биологически активным лигандом, родственным фактору некроза опухоли, стадии (Ь);

    (б) регистрирование специфического связывания белка с указанным меченым биологически активным лигандом, родственным фактору некроза опухоли, идентифицирующее таким образом молекулу, которая специфически связывается с меченым лигандом, родственным фактору некроза опухоли.
51. 51. Способ индукции гибели клеток, предусматривающий введение агента, способного противодействовать связыванию лиганда, родственного фактору некроза опухоли, по п.11 с его рецептором, причем агентом, способным противодействовать связыванию лиганда, родственного фактору некроза опухоли, с его рецептором, является антитело против лиганда, родственного фактору некроза опухоли, по п.11.
52. 52. Способ индукции гибели клеток, предусматривающий введение агента, способного противодействовать связыванию лиганда, родственного фактору некроза опухоли, по п.12 с его рецептором, причем агентом, способным противодействовать связыванию лиганда, родственного фактору некроза опухоли, с его рецептором, является антитело против лиганда, родственного фактору некроза опухоли, по п.12.
53. 53. Способ лечения, супрессии или изменения иммунного ответа, включающего в себя путь передачи сигнала между лигандом, родственным фактору некроза опухоли, и его рецептором, при этом указанный способ предусматривает стадию введения эффективного количества агента, способного противодействовать связи между лигандом, родственным фактору некроза опухоли, по п.12 и его рецептором, причем агентом, способным противодействовать связыванию лиганда, родственного фактору некроза опухоли, с его рецептором, является антитело против лиганда, родственного фактору некроза опухоли, по п.31.