CN110023499A - 肿瘤坏死因子-α(TNF-α)结合适配体及其治疗用途 - Google Patents
肿瘤坏死因子-α(TNF-α)结合适配体及其治疗用途 Download PDFInfo
- Publication number
- CN110023499A CN110023499A CN201680090346.2A CN201680090346A CN110023499A CN 110023499 A CN110023499 A CN 110023499A CN 201680090346 A CN201680090346 A CN 201680090346A CN 110023499 A CN110023499 A CN 110023499A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- aptamers
- disease
- alpha
- necrosis factor
- tumor necrosis
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
- C12N15/115—Aptamers, i.e. nucleic acids binding a target molecule specifically and with high affinity without hybridising therewith ; Nucleic acids binding to non-nucleic acids, e.g. aptamers
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
- A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
- A61K31/7088—Compounds having three or more nucleosides or nucleotides
- A61K31/7105—Natural ribonucleic acids, i.e. containing only riboses attached to adenine, guanine, cytosine or uracil and having 3'-5' phosphodiester links
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
- C12N15/1034—Isolating an individual clone by screening libraries
- C12N15/1048—SELEX
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
- C12N2310/10—Type of nucleic acid
- C12N2310/16—Aptamers
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
- C12N2310/30—Chemical structure
- C12N2310/31—Chemical structure of the backbone
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
- C12N2310/30—Chemical structure
- C12N2310/32—Chemical structure of the sugar
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
- C12N2310/30—Chemical structure
- C12N2310/32—Chemical structure of the sugar
- C12N2310/321—2'-O-R Modification
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
- C12N2310/30—Chemical structure
- C12N2310/33—Chemical structure of the base
- C12N2310/334—Modified C
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
- C12N2310/30—Chemical structure
- C12N2310/33—Chemical structure of the base
- C12N2310/335—Modified T or U
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
- C12N2310/30—Chemical structure
- C12N2310/34—Spatial arrangement of the modifications
- C12N2310/344—Position-specific modifications, e.g. on every purine, at the 3'-end
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
- C12N2310/30—Chemical structure
- C12N2310/35—Nature of the modification
- C12N2310/351—Conjugate
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Bioinformatics & Computational Biology (AREA)
- Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
- Public Health (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Medicinal Preparation (AREA)
Abstract
本发明公开一种如序列编号1或序列编号2所示的肿瘤坏死因子‑α(TNF‑α)结合RNA适配体及其治疗用途。
Description
技术领域
本发明涉及一种与肿瘤坏死因子-α(TNF-α)进行特异性结合的适配体及其治疗用途{TNF-α-BINDING APTAMER,AND THERAPEUTIC USE FOR SAME}。
背景技术
肿瘤坏死因子-α(TNF-α)是一种由包括巨噬细胞、单球细胞在内的免疫系统细胞分泌且与免疫系统的细胞发生反应的促炎性(pro-inflammatory)细胞因子,其非正常过表达会对包括验证反应在内的败血症、感染症、自身免疫性疾病、抑制排斥反应等各种疾病起到介导作用(Annu.Rev.Immunol.10:411-452,1992;Annu.Rev.Med.45:491-503,1994)。
由于如上所述的原因,已经开发出了以肿瘤坏死因子-α(TNF-α)作为标的的多种抗体医药品。以肿瘤坏死因子-α(TNF-α)作为标的的代表性的抗体医药品包括如注射用依那西普(EnbrelTM)、英夫利昔单抗(RemicadeTM)、阿达木单抗(HumiraTM)、赛妥珠单抗(CimziaTM)等。但是,虽然注射用依那西普能够在利用脂多糖(LPS)进行处理的人髓系白血病单核细胞(THP-1)中对肿瘤坏死因子-α(TNF-α)的分泌进行抑制,但有报告指出也可能会因为细胞结合肿瘤坏死因子-α(TNF-α)的6倍左右的过表达而导致副作用(IntImmunopharmacol.8(5):679-87,2008)的出现,而英夫利昔单抗作为由鼠类可变区和人IgG1恒定区组成的嵌合抗体,具有诱发ADCC(抗体依赖性的细胞介导的细胞毒作用,antibody dependent cellularcy to toxicity)和CDC(补体依赖性的细胞毒作用,complement-dependent cytotoxicity)的问题,而赛妥珠单抗作为聚乙二醇化(pegylation)的人源化抗体,已有动物试验报告指出聚乙二醇化的蛋白质不仅具有诱发免疫反应的问题,还会因为蓄积在肾脏细胞中而形成液泡(vacuole)(Bioconjug Chem.19;24(6):915-25,2013)。
因此,可以说仍然需要开发出以肿瘤坏死因子-α(TNF-α)作为标的的特性更加优秀的药物。
适配体与抗体相同,也是能够与靶蛋白进行特异性结合的核酸配体,自从2004年美国FDA批准将以血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor)作为标的的哌加他尼钠注射液(Macugen)作为老年性黄斑变性(macular degeneration)治疗剂使用以来,在全世界范围内都在积极开展利用适配体的治疗剂的开发活动(Gene Ther 14(4):283-291,2007)。
适配体治疗剂与抗体治疗剂相比具有多种优点,首先因为是与抗体相比更小且更单纯的分子,因此能够进行化学合成且易于进行必要的化学修饰,其次还能够通过SELEX技术(指数富集的配体系统进化技术,Systematic Evolution of Ligands by EXponentialenrichment,Science 249(4968):505-510,1990;Methods Enzymol 267:275-301,1996;Methods Enzymol 318:193-214,2000;美国注册专利第5,475,096号,美国专利注册第5,270,163号,国际专利公开WO 91/19813)在体外(In vitro)提升其选择性和亲和度,进而因为与属于蛋白质的抗体不同,具有热稳定性,因此能够在室温条件下长期进行保管。此外,还具有对于难以制造出多克隆抗体的毒素等也能够制造出适配体、与抗体治疗剂不同,几乎不会在生物体内引起免疫反应、因为抗体必须在体内(In vivo)或细胞水准上制造而适配体能够充分地在体外(In vitro)水准上制造,因此能够通过化学修饰等方式轻易地对药物代谢动力学以及药效学特性进行调节等优点。
这充分表明相对于利用抗体的情况,利用适配体能够开发出在有效性和安全性方面更加优秀的治疗剂。
本发明公开一种与肿瘤坏死因子-α(TNF-α)进行特异性结合的适配体及其治疗用途。
发明内容
本发明的目的在于提供与肿瘤坏死因子-α(TNF-α)进行特异性结合的适配体。
本发明的另一目的在于提供上述适配体的治疗用途。
本发明的其他目的或具体的目的将在后续的内容中进行公开。
本发明人通过如下述实施例所述的方式,在从脱氧核糖核酸(DNA)文库制造出单链核糖核酸(RNA)文库并通过指数富集的配体系统进化(SELEX)技术从各个组中分离出与肿瘤坏死因子-α(TNF-α)进行结合的单链核糖核酸(RNA)之后对其序列进行确认,接下来通过平板结合实验法(plate-based binding assay)从上述核糖核酸(RNA)中筛选出与肿瘤坏死因子-α(TNF-α)的结合亲和力较高的序列编号1的核糖核酸(RNA)适配体(“ATK001”)以及序列编号2的核糖核酸(RNA)适配体(“ATK007”),然后在通过表面等离子体共振(SurfacePlasmon Resonance,SPR)法以及凝胶阻留(Gel retardation)法对上述适配体与肿瘤坏死因子-α(TNF-α)的结合亲和力进行确认的同时,通过利用表面等离子体共振(SPR)分析对与表皮生长因子受体-2(ErbB2)、表皮生长因子受体-3(ErbB3)和胰岛素样生长因子结合蛋白1(IGF-BP1)的结合力以及与肿瘤坏死因子-α(TNF-α)的结合力进行比较评估而确认了对肿瘤坏死因子-α(TNF-α)具有结合特异性,并确认了如果在利用诱发细胞损伤的重组改构人肿瘤坏死因子-α(TNF-α)对肝癌细胞株即SK-HEP1细胞进行处理时同时利用上述ATK001以及ATK002适配体进行处理,则能够对在细胞受到损伤时表达量快速增加的急性期蛋白(Acute phase protein)即肝珠蛋白(Hepatoglobin)、纤维蛋白原-γ(Fibrogen-γ)、纤连蛋白(Fibronectin)、转铁蛋白(Transferrin)等和促炎性细胞因子(肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素1-β(IL1-β)以及白细胞介素6(IL6))以及血管内皮生长因子(VEGF)的表达进行抑制。
在上述物质中,因为肝珠蛋白(Hepatoglobin)等急性期蛋白或促炎性细胞因子等属于在细胞受到损伤时为了进行防御而增加表达的蛋白质,因此当在利用诱发细胞损伤的肿瘤坏死因子-α(TNF-α)进行处理的同时利用上述适配体进行处理时上述急性期蛋白、促炎性细胞因子的表达受到抑制的结果,表明了ATK001以及ATK007适配体对肿瘤坏死因子-α(TNF-α)具有有效的抑制活性。
本发明是以如上所述的实验结果为基础提供,在一方面涉及与肿瘤坏死因子-α(TNF-α)进行结合的如下述序列编号1的ATK001适配体或序列编号2的ATK007适配体,在另一方面涉及上述适配体的治疗用途即作为有效成分包含上述适配体的肿瘤坏死因子-α(TNF-α)抑制用药学组合物或因为肿瘤坏死因子-α(TNF-α)的非正常过表达而导致的障碍或疾病的预防或治疗用药学组合物。
<序列编号1>
G-G-G-A-G-G-A-C-G-A-U-G-C-G-G-C-C-A-C-U-G-G-C-U-A-G-G-A-A-C-U-C-G-A-G-U-A-C-U-G-G-G-U-G-G-C-A-G-A-C-G-A-C-U-C-G-C-C-C-G-A
<序列编号2>
G-C-G-G-A-A-G-C-G-U-G-C-U-G-G-G-C-C-C-G-G-C-U-U-G-C-A-G-G-U-C-G-C-C-G-A-A-A-U-G-A-C-C-G-C-A-C-A-C-A-U-A-A-C-C-C-A-G-A-G-G-U-C-G-A-U
在本说明书中,“肿瘤坏死因子-α(TNF-α)”是指能够根据其功能和序列视为肿瘤坏死因子-α(TNF-α)的在人和鼠等哺乳动物中存在的任意的肿瘤坏死因子-α(TNF-α)。较佳地,是人肿瘤坏死因子-α(TNF-α)。
此外在本说明书中,“适配体”与本行业公知的含义相同,是指与靶分子进行结合的核酸配体,较佳地是指与靶分子进行“特异性”结合的核酸配体。其中,进行“特异性”结合是指在试样或人体等生物体内以与其他分子相比相对较高的亲和度与靶分子进行结合。
此外在本说明书中,“有效成分”是指能够单独呈现出目标药学活性或与本身没有活性的载体一起呈现出药学活性的成分。
此外在本说明书中,“肿瘤坏死因子-α(TNF-α)抑制”是指适用本发明的适配体与肿瘤坏死因子-α(TNF-α)进行结合而对肿瘤坏死因子-α(TNF-α)的固有生物活性进行抑制。通过如上所述的对肿瘤坏死因子-α(TNF-α)的固有生物活性的抑制,能够进一步实现在肿瘤坏死因子-α(TNF-α)非正常过表达时肿瘤坏死因子-α(TNF-α)起到介导作用的(或肿瘤坏死因子-α(TNF-α)的非正常过表达有害的)障碍或疾病的预防或治疗效果。
此外在本说明书中,“肿瘤坏死因子-α(TNF-α)的非正常过表达所导致的障碍或疾病”是指本行业众所周知且本行业公知的各种障碍和疾病。具体来讲,上述障碍和疾病是指呼吸道障碍、哮喘、过敏性以及非过敏性哮喘、感染导致的哮喘、呼吸道合胞病毒(RSV)感染导致的哮喘、慢性阻塞性肺病(COPD)、气道炎症性病症、嗜酸性粒细胞增多、纤维化症以及粘液过多症、囊性纤维化症、肺纤维化症、特应性障碍、特应性皮炎、麻疹、湿疹、过敏性鼻炎、过敏性胃肠炎、皮肤炎症和/或皮肤自身免疫性病症、胃肠道炎症和/或自身免疫性病症、炎症性肠道疾病(IBD)、溃疡性结肠炎、克罗恩病、肝脏炎症和/或自身免疫性病症、肝硬化、肝纤维化症、乙型和/或丙型肝炎病毒引起的肝纤维化症、硬皮病、肿瘤或癌症、肝细胞性肝癌、成胶质细胞瘤、淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤、病毒感染、细菌感染、寄生虫感染、人体T细胞白血病病毒-1(HTLV-1)感染以及接种疫苗所导致的免疫反应。
更具体来讲,上述障碍和疾病包括类风湿性关节炎、骨关节炎、幼年型慢性关节炎、化脓性关节炎、莱姆关节炎、银屑病性关节炎、反应性关节炎、脊柱关节病、全身红斑狼疮、克罗恩病、溃疡性结肠炎、炎症性肠道疾病、胰岛素依赖型幼年型糖尿病、甲状腺炎、哮喘、过敏性疾病、银屑病、硬皮病、移植物抗宿主病、器官移植排斥反应、与器官移植相关的急性或慢性免疫疾病、类肉状瘤病、粥样动脉硬化症、弥散性血管内凝血、川崎氏病、弥漫性毒性甲状腺肿病、肾病综合征、慢性疲劳综合征、韦格纳肉芽肿病、过敏性紫癜病、肾脏的显微镜下多血管炎、慢性活动性肝炎、葡萄膜炎、败血症性休克、中毒性休克综合征、败血症综合征、恶病质、感染性疾病、寄生虫疾病、获得性免疫缺陷综合征、急性横贯性脊髓炎、杭廷顿氏舞蹈病、帕金森病、阿耳滋海默氏病、脑卒中、原发性胆汁性肝硬化、溶血性贫血、恶性肿瘤、心力衰竭、心肌梗塞、爱迪生氏病、散发性疾病、I型多腺体缺乏症以及II型多腺体缺乏症、施密特综合征、成人型(急性)呼吸困难综合征、脱发症、斑块状脱发症、血清反应阴性关节病、关节病、莱特尔氏病、银屑病性关节病、溃疡性结肠炎性关节病、肠病性滑膜炎、衣原体病、耶尔森氏鼠疫杆菌及沙门氏菌关联关节病、脊柱关节病、粥样疾病/动脉硬化症、特应性过敏症、自身免疫性水泡性疾病、寻常型天疱疮、落叶型天疱疮、类天疱疮、线性免疫球蛋白A(IgA)疾病、自身免疫性溶血性贫血、库姆斯氏阳性溶血性贫血、获得性恶性贫血、幼年型恶性贫血、肌痛性脑炎/慢性疲劳(Roral Free)综合征、慢性皮肤粘膜念珠菌病、巨细胞动脉炎、原发性硬化性肝炎、潜伏性自身免疫性肝炎、获得性免疫缺陷疾病综合征、获得性免疫缺陷关联疾病、乙型肝炎、丙型肝炎、普通变化型免疫缺陷病(普通变化型低丙球蛋白血症)、扩张型心肌病、女性不孕症、卵巢功能衰竭、卵巢功能早期衰竭、纤维性肺病、潜伏性纤维化肺泡炎、后炎症型间质性肺病、间质性肺炎、结缔组织疾病关联间质性肺病、复合结缔组织疾病关联肺病、全身性硬化症关联间质性肺病、类风湿性关节炎关联间质性肺病、全身红斑性狼疮关联肺病、皮肌炎/多发性肌炎关联肺病、斯耶格伦氏综合征关联肺病、强直性脊柱炎关联肺病、血管炎弥漫性肺病、含铁血黄素沉着症关联肺病、药物诱导的间质性肺病、纤维化症、放射线纤维化症、梗阻性细支气管炎、慢性嗜酸性粒细胞性肺炎、淋巴细胞浸润性肺病、肝炎后间质性肺病、痛风性关节炎、自身免疫性肝炎、I型自身免疫性肝炎(典型自身免疫性或狼疮性肝炎)、II型自身免疫性肝炎(抗肝肾微粒体(LKM)抗体肝炎)、自身免疫性介导的低血糖症、黑棘皮症导致的B型胰岛素耐受性、甲状旁腺功能减退症、器官移植关联的急性免疫疾病、器官移植关联的慢性免疫疾病、原发性硬化性胆管炎、I型银屑病、特发性白细胞减少症、自身免疫性嗜中性粒细胞减少症、肾脏疾病NOS、血管球性肾炎、肾脏的显微镜下多血管炎、莱姆病、盘状红斑狼疮、男性不孕症特发病或NOS、精子自身免疫性、多发性硬化症(所有亚型)、交感性眼炎、结缔组织疾病继发性肺高血压病、肺出血肾炎综合征、结节性多动脉炎的肺部病症、急性类风湿性热、类风湿性脊柱炎、斯蒂尔氏病、全身性硬化症、斯耶格伦氏综合征、塔卡亚萨氏病/动脉炎、自身免疫性血小板减少症、特发性血小板减少症、自身免疫性甲状腺疾病、甲状腺功能亢进症、甲状腺肿症自身免疫性甲状腺功能低下症(桥本氏病)、萎缩性自身免疫性甲状腺功能低下症、原发性粘液水肿、晶状体性葡萄膜炎、原发性血管炎、白癜风、急性肝脏疾病、慢性肝脏疾病、酒精性肝硬化、酒精介导的肝损伤、胆汁淤积、特异体质性肝脏疾病、药物介导的肝炎、非酒精性脂肪肝炎、过敏以及哮喘、B族链球菌(streptococci)(GBS)肝炎、精神障碍(如抑郁症以及精神分裂症)、辅助性T细胞2(Th2)型以及辅助性T细胞1(Th1)型介导的疾病、急性以及慢性疼痛(不同形态的疼痛)、以及如肺癌,乳腺癌,胃癌,膀胱癌,结肠癌,胰腺癌,卵巢癌,前列腺癌以及直肠癌等癌症以及造血系统恶性肿瘤(白血病以及淋巴瘤)、Aβ脂蛋白血症、手足紫绀症、急性以及慢性寄生虫性或感染性过程、急性白血病、急性淋巴胚细胞性白血病(ALL)、急性髓细胞性白血病(AML)、急性或慢性细菌感染、急性胰腺炎、急性肾功能衰竭、腺癌、艾滋病(AIDS)痴呆综合征、酒精介导的肝炎、过敏性结膜炎、过敏性接触性皮炎、过敏性鼻炎、同种移植排斥反应、α-1-抗胰蛋白酶缺乏症、肌萎缩性侧索硬化症、贫血、心绞痛、前角细胞变性、抗磷脂综合症、抗受体过敏性反应、大动脉及末梢结扎、大动脉解剖、动脉高血压、动脉硬化症、动静脉瘘、共济失调症、心房颤动(延迟性或阵发性)、心房扑动、房室传导阻滞、B细胞淋巴瘤、骨移植排斥反应、骨髓移植(BMT)排斥反应、束支传导阻滞(bundle branch block)、伯基特氏淋巴瘤、烫伤、心源性心律不齐、心源性眩晕综合征、心脏肿瘤、心肌病、心肺转流炎症反应、软骨移植排斥反应、小脑皮质变性、小脑功能障碍、紊乱性或多源性房性心动过速、化学疗法关联障碍、慢性髓细胞性白血病(CML)、慢性酒精中毒、慢性炎症病变、慢性淋巴细胞性白血病(CLL)、慢性阻塞性肺病(COPD)、慢性水杨酸盐中毒、结肠直肠癌、郁血性心脏衰竭、结膜炎、接触性皮炎、肺心病、冠状动脉疾病、克雅氏(Creutzfeldt-Jakob)病、培养阴性败血症、囊纤维化症、细胞因子疗法关联障碍、拳手痴呆症(Dementia pugilistica)、脱髓鞘疾病、登革热、皮炎、皮肤学性病症、糖尿病、幼年型糖尿病、糖尿病性动脉硬化疾病、弥漫性路易体病、扩张性郁血性心肌病、基底核障碍、中年唐氏综合征、中枢神经系统(CNS)多巴胺受体阻隔药物诱导的药物诱导运动障碍、药物敏感性、湿疹、脑脊髓炎、心内膜炎、内分泌病、会厌炎、埃-巴二氏病毒感染、红斑性肢痛症、锥体外束及小脑障碍、家族性噬血细胞性淋巴组织细胞增生症、胎儿胸腺移植排斥反应、弗里德希氏共济失调症、功能性末梢动脉障碍、真菌类败血症、气性坏疽病、胃溃疡、血管球性肾炎、任意器官或组织的移植片排斥反应、革兰氏阴性败血症、革兰式阳性败血症、细胞内有机体导致的肉芽肿瘤、毛细胞白血病、哈勒沃登-施帕茨病(Hallervorden-Spatz disease)、桥本氏甲状腺炎、枯草热、心脏移植排斥反应、血色病、血液透析、溶血性尿毒症综合征/血栓性血小板减少性紫癜、出血、肝炎(A)、希氏束心律不齐、艾滋病病毒(HIV)感染/艾滋病病毒(HIV)神经病变、霍奇金氏病、多动性运动障碍、过敏性反应、过敏性肺炎、高血压、下丘脑-垂体-肾上腺轴评估、特发性爱迪生氏病、特发性肺纤维化症、抗体介导的细胞毒性、无力症、幼儿脊髓性肌萎缩症、大动脉验证、A型流感、电离辐射暴露、虹膜睫状体炎、葡萄膜炎、视神经炎、缺血-再灌注损伤、缺血性脑卒中、幼年型类风湿性关节炎(JRA)、幼年型脊髓性肌萎缩症、卡波西肉瘤、肾脏移植排斥反应、军团杆菌、利什曼病、麻疯病、皮质脊髓类病变、脂肪水肿、肝脏移植排斥反应、淋巴水肿、疟疾、恶性淋巴瘤、恶性组织细胞增生症、恶性黑色素瘤、脑膜炎、脑膜炎菌血症、代谢性/特发性、偏头痛、线粒体多系统障碍、复核结缔组织疾病、单克隆丙种球蛋白病、多发性骨髓瘤、多发性系统变性德杰林-托马斯、夏伊-德雷格综合征以及马查多-约瑟夫)、重症肌无力症、细胞内鸟型结核分支杆菌感染症、分支杆菌结核、骨髓增生异常综合征、心肌梗塞、心肌缺血障碍、鼻咽癌、新生儿慢性肺病、肾炎、肾病、神经变性疾病、神经性I肌萎缩症、嗜中性粒细胞减少性发热、非霍奇金淋巴瘤、腹部大动脉及其分支阻塞、阻塞性动脉疾病、睾丸炎、附睾炎、脏器肿大、骨质疏松、胰腺移植排斥反应、胰腺癌、副肿瘤综合征/恶性高钙血症、副甲状腺移植排斥反应、盆腔炎症性疾病、常年性鼻炎、心包疾病、末梢粥样动脉硬化症、末梢血管障碍、腹膜炎、恶性贫血、肺孢子虫性肺炎、肺炎、POEMS综合征(多发性神经病变、脏器肿大、内分泌病、单克隆丙种球蛋白病以及皮肤病变综合征)、灌注后综合征、泵血后(post-pump)综合征、心肌梗死(MI)后心脏切开综合征、子痫前期、进行性核上性麻痹、原发性肺高血压、放射疗法、雷诺氏现象及疾病、雷诺氏疾病、雷弗素姆病、一般窄QRS心动过速、肾血管性高血压、再灌注损伤、限制性心肌病、肉瘤、硬皮病、老年性舞蹈病、路易小体型老年性痴呆、血清阴性关节病、休克、镰状细胞性贫血、皮肤同种移植排斥反应、皮肤变化综合征、小肠移植排斥反应、实体瘤、特异性心律不齐、脊髓型共济失调、脊髓小脑变性症、链球菌性肌炎、小脑的结构性病变、亚急性硬化性全脑炎、晕厥、心血管梅毒、全身过敏症、全身炎症反应综合征、全身发病型幼年型类风湿性关节炎、T细胞或FAB ALL、毛细血管扩张症、血栓闭塞性脉管炎、血小板减少症、毒性、移植、外伤、出血、过敏症、不稳定型心绞痛、心绞痛、尿路败血症、荨麻疹、心脏瓣膜疾病、下肢静脉、脉管炎、静脉疾病、静脉血栓症、心室纤颤、病毒及真菌类感染、病毒性脑炎/无菌性脑膜炎、病毒相关性吞噬血细胞综合征、韦尼克-科罗萨科夫综合征、威尔森氏病、任意器官或组织的异种移植片排斥反应、急性冠状综合症、急性炎症性脱髓鞘性多发性神经疾病、急性缺血、成人斯蒂尔病、斑块状脱发症、过敏症、抗磷脂抗体综合征、再生不良性贫血、动脉硬化症、特应性湿疹、特应性皮炎、自身免疫性皮炎、链球菌感染相关自身免疫性障碍、自身免疫性蛋白丢失性肠病、自身免疫性听力损失、自身免疫性淋巴细胞增生综合征(ALPS)、自身免疫性心肌炎、自身免疫性未成熟卵巢功能衰竭、眼腱炎、气管扩张症、大疱性类天疱疮、心血管疾病、灾难性抗磷脂综合征、乳糜泻(celiac disease)、颈脊椎病、慢性缺血、瘢痕性类天疱疮、疑似多发性硬化症的临床孤立综合征(CIS)、结膜炎、童年期发病型精神障碍、慢性阻塞性肺病(COPD)、泪囊炎、皮肌炎、糖尿病视网膜病变、幼年型糖尿病、椎间盘突出症(herniation)、椎间盘内破裂正(prolapse)、药物介导的免疫溶血性贫血、心内膜炎、子宫内膜病变、眼内炎、巩膜外层炎、多形渗出性红斑、重症多形性红斑、妊娠性类天疱疮、吉兰-巴雷综合征(Guillain-Barresyndrome,GBS)、枯草热、休斯综合征(Hughes syndrome)、特发性帕金森病、特发性间质性肺炎、血清免疫球蛋白E(IgE)介导的过敏症、免疫溶血性贫血、包涵体肌炎、感染性眼球炎症疾病、炎症性脱髓鞘性疾病、炎症性心脏疾病、炎症性肾脏疾病、特发性肺纤维化症/普通型间质性肺炎(IPF/UIP)、虹膜炎、角膜炎、干燥性角结膜炎、库斯莫尔征或库斯莫尔-梅尔征、兰德里氏麻痹、朗格汉斯细胞组织细胞增多症、网状青斑(livedo reticularis)、黄斑变性、显微镜下多血管炎、强直性脊柱炎、运动神经元障碍、黏膜类天疱疮、多发性器官衰竭症、重症肌无力症、骨髓增生异常症、心肌炎、神经根障碍、神经病征、肝炎、视神经炎、骨质溶解、卵巢癌、少关节型幼年型类风湿性关节炎(JRA)、末梢动脉阻塞性疾病(PAOD)、末梢血管疾病(PVD)、末梢动脉疾病(PAD)、静脉炎、结节性多动脉炎(或结节性动脉周围炎)、多软骨炎、风湿性多肌痛症、白发症、多关节型幼年型类风湿性关节炎(JRA)、多发性内分泌缺乏综合征、多发性肌炎、风湿性多肌痛(PMR)、泵血后(post-pump)综合征、原发性帕金森病、前列腺及直肠癌及造血系统恶性肿瘤(白血病及淋巴瘤)、前列腺炎、纯红细胞再生障碍、原发性肾上腺衰竭症、复发性视神经脊髓炎、再狭窄症、风湿性心脏疾病、SAPHO(滑膜炎、痤疮、脓疱病、骨质增生以及骨炎)、硬皮病、继发性淀粉样变性、休克肺、巩膜炎、坐骨神经痛、继发性肾上腺衰竭症、硅关联结缔组织疾病、斯内登-威尔金森(sneddon-wilkinson)皮肤病、强直性脊柱炎、史蒂文斯-约翰逊综合征(SJS)、全身炎症性反应综合征、颞动脉炎、弓形虫性视网膜炎、中毒性表皮坏死松解症、横贯性脊髓炎、TRAPS(肿瘤坏死因子受体相关性周期热综合征)、II型糖尿病、荨麻疹、普通型间质性肺炎(UIP)、血管炎、春季结膜炎、病毒性视网膜炎、伏格特-小柳-原田(Vogt-Koyanagi-Harada)综合征(VKH综合征)、湿性黄斑变性、伤口治疗、耶尔森氏鼠疫杆菌及沙门氏菌关联关节病。
通常,在筛选出与特定靶分子进行特异性结合的适配体时使用指数富集的配体系统进化(SELEX)技术。指数富集的配体系统进化(SELEX)技术是一种名为“SystematicEvolution of Ligands by EXponential enrichment,指数富集的配体系统进化”的技术的缩写,相关技术已经在文献[Science 249(4968):505-510,1990]、美国注册专利第5,475,096号、美国专利注册第5,270,163号、国际专利公开第WO 91/19813号等中得到公开,而筛选出适配体的具体的方法或适当的试剂、材料等的使用已经在文献[Methods Enzymol267:275-301,1996]、文献[Methods Enzymol 318:193-214,2000]中得到公开。
上述指数富集的配体系统进化(SELEX)技术从单链的核糖核酸(RNA)或脱氧核糖核酸(DNA)寡核苷酸核酸文库出发,此时上述核酸文库的寡核苷酸通常在5’端与3’端之间包括随机序列并在5’端以及3’端包括在文库的所有寡核苷酸之间共有的已知的序列。上述已知的序列中包括可供正向/逆向引物结合的序列、核糖核酸(RNA)聚合酶的启动子序列、用于执行克隆等操作的限制酶识别序列等。因为上述随机序列通常是由20~50个核苷酸构成,因此包括5’端以及3’端在内的寡核苷酸的整体长度通常为30~80个核苷酸,较佳地为40~60个核苷酸。如上所述的寡核苷酸的合成属于本行业公知的技术,其合成方法包括固相寡核苷酸合成技术以及如三酯合成法等液相合成技术等。具体信息能够参考文献[Nucl.Acid Res.14:5399-5467,1986]、文献[Tet.Lett.27:5575-5578,1986]、文献[Nucl.Acid Res.4:2557,1977]、文献[Lett.,28:2449,1978]等。此外,也能够利用市售的自动化脱氧核糖核酸(DNA)合成装置,在利用上述装置时能够获得足以适用指数富集的配体系统进化(SELEX)技术的包含1014~1016个寡核苷酸的核酸文库。此外,当作为核酸文库使用核糖核酸(RNA)文库时,能够通过利用T3、T4、T7等核糖核酸(RNA)聚合酶对脱氧核糖核酸(DNA)文库进行转录的方式获得核糖核酸(RNA)文库。
在通过如上所述的方式获得寡核苷酸核酸文库之后,将利用上述核酸文库执行指数富集的配体系统进化(SELEX)过程,如上所述的指数富集的配体系统进化(SELEX)过程,包括:(a)在适合于与靶分子进行结合的条件下,使上述核酸文库与靶分子接触的步骤;(b)通过将与靶分子进行特异性结合的核酸(寡核苷酸)与未结合核酸进行分离而获得靶分子-核酸复合体的步骤;以及,(c)在靶分子-核酸复合体中对核酸进行扩增的步骤。通过重复执行如上所述的接触步骤、结合步骤(获得靶分子-核酸复合体的步骤)以及扩增步骤一轮以上,较佳地重复执行5次以上,能够筛选出与靶分子的特异性以及结合力得到进一步提升的核酸配体。当核酸文库为核糖核酸(RNA)文库时,将在上述步骤(c)的扩增之前通过互补脱氧核糖核酸(cDNA)合成过程进行扩增并在扩增之后进行转录而获得核糖核酸(RNA)核酸配体。此外,序列排序能够通过在扩增之后对各个独立核酸配体进行克隆的方式完成。
在适用本发明的实施例中,与如上所述的指数富集的配体系统进化(SELEX)技术一起使用平板结合实验法(plate-based binding assay)筛选出了序列编号1以及序列编号2的对肿瘤坏死因子-α(TNF-α)特异性的核糖核酸(RNA)适配体。
作为参考,在本行业中已经公开了几种对上述指数富集的配体系统进化(SELEX)技术进行改良的技术。例如,包括用于提升与靶分子的特异性的反向指数富集的配体系统进化(Counter-SELEX)技术(Science 263(5152):1425-1429,1994)、在适配体治疗剂的开发中考虑到非临床动物试验的切换指数富集的配体系统进化(Toggle SELEX)技术(MolTher 4(6):567-573,2001)、利用靶分子与适配体的镜像异构体的镜像寡核苷酸药物(Spiegelmer)技术(Chem Biol 9(3):351-359,2002)等。
在本说明书中引用了大量的文献,而所引用的文献即使没有特殊地明确说明也应视为本说明书的一部分。
此外在本发明中,适配体既能够是在上述序列编号1或序列编号2中公开的单链核糖核酸(RNA)本身,也能够是对上述核糖核酸(RNA)适配体的核糖核苷酸的糖位置、磷酸盐位置、碱基位置、5’端和/或3’端进行化学变形(修饰)的适配体。
在本行业中公知的是,天然型(wild type)的核糖核酸(RNA)或脱氧核糖核酸(DNA)具有在生物体内容易被核酸内切酶或核酸外切酶分解的特性。如上所述的被化学修饰的适配体能够提升在生物体内的稳定性并借此延长生物体内半衰期,从而提升药效学以及药代动力学特性,同时还能够通过实现对化学、物理分解的抵抗性而提升保管稳定性等。
在糖位置上的变形是指,在适用本发明的核糖核酸(RNA)适配体的一个以上的任意核糖核苷酸的糖中,上述糖的一个以上的羟基(OH group)被如卤素基、脂肪族基、醚基或胺基等修饰的情况。较佳地,是指2’-OH基被OMe、O-烷基、O-烯丙基、S-烷基、S-烯丙基以及卤素中的任意一个修饰的情况,更较佳地,是指被2’-脱氧(2’deoxy)、2’-F、2’-NH2、2’-OMe或上述之组合修饰的情况。
更较佳地,因为在下述实施例中为了制造出序列编号1以及序列编号2的适用本发明的核糖核酸(RNA)适配体而使用了2’F-CTP以及2’F-UTP,因此是指序列编号1以及序列编号2的适用本发明的核糖核酸(RNA)适配体中的所有C以及U为fC(2’-F被修饰的C)以及fU(2’-F被修饰的U)的情况。
关于在2’位置上变形的糖,在本行业中已经公开了包括其制造方法在内的具体事项,例如能够参考文献[Sproat,et al,Nucl.Acid Res.19:733-738(1991)]、文献[Cotten,et al,Nucl.Acid Res.19:2629-2635(1991)]、文献[Hobbs,et al,Biochemistry 12:5138-5145(1973)]等。
此外,关于利用指数富集的配体系统进化(SELEX)技术从包含如上所述的变形的糖的适配体中筛选出对靶分子的亲和度高的适配体的方法,能够参考美国注册专利第5,660,985号、美国注册专利第5,756,703号、美国注册专利第5,580,737号等。在美国注册专利第5,580,737号中,公开了包含被2'-NH2、2'-F、2'-OMe修饰的核苷酸且对靶分子特异性的核酸配体的筛选方法。
此外,在糖位置上的变形也能够通过利用糖衍生物对核糖(ribose)进行替代而实现。作为上述衍生物,能够使用如α-异头糖(a-anomeric sugars)、阿拉伯糖(arabinose)、木糖(xyloses)或来苏糖(lyxoses)等异构糖(epimeric sugars)、吡喃糖(pyranosesugars)、呋喃糖(furanose sugars)、景天庚酮糖(sedoheptuloses)、如甲基核糖苷(methyl riboside)等脱碱基核苷类似物(abasic nucleoside analogs),具体信息能够参考国际专利公开WO 2011/130195等。
核糖核酸(RNA)适配体能够利用T3、T4、T7、SP6核糖核酸(RNA)聚合酶或突变T7聚合酶进行合成,而包含2’变形核苷酸的核糖核酸(RNA)适配体尤其能够利用突变聚合酶进行合成。作为能够用于制造包含2’变形核苷酸的核糖核酸(RNA)适配体的突变聚合酶,在本行业中已经公开了如突变T7聚合酶Y639F、突变T7聚合酶Y639F/H784A以及突变T7聚合酶H784A等。T7聚合酶Y639F是在639位置上将酪氨酸残基替换成苯基丙氨酸的突变聚合酶,在本行业中已经公开了能够将2'-脱氧,2'-NH2-或2'-F-NTP作为基质使用而合成出包含2’变形核苷酸的核糖核酸(RNA)(Science,286:2305-2308,1999),在本行业中被广泛适用于包含2’变形核苷酸的核糖核酸(RNA)的合成。但是,上述突变T7聚合酶Y639F在将具有2’-0Me、2’N3等的2’变形核糖核苷三磷酸(NTP)(尤其是2’变形鸟苷三磷酸(GTP))作为基质使用的方面受到限制(Nucleic Acids Res.,2002,30(24):138)。突变T7聚合酶Y639F/H784A是在Y639F突变核糖核酸(RNA)聚合酶的基础上额外地在784位置上将组氨酸替换成丙氨酸残基的双重突变聚合酶,能够将具有2'-0Me、2'-N3等的2’变形核糖核苷三磷酸(NTP)作为基质使用,而在784位置上将组氨酸替换成丙氨酸残基的单一突变T7聚合酶也能够将具有2'-0Me、2'-N3等的2’变形核糖核苷三磷酸(NTP)作为基质使用。因此,当需要合成出导入2’-0Me、2’-N3等的RNA适配体时,使用突变T7聚合酶Y639F/H784A、突变T7聚合酶H784A等为宜(Nucleic Acids Res.30(24):138,2002)。
此外,在磷酸盐位置上的变形,包括磷酸盐变形为P(O)S(“硫代(thioate)”)、P(S)S(“二硫代(dithioate)”)、P(O)NR2(“酰胺化(amidate)”)、P(O)R、P(O)OR'、CO或CH2(“甲缩醛(formacetal)”)的情况。其中,上述R或R’为独立的H或被置换或未被置换的烷基,上述被置换或未被置换的烷基(尤其是碳原子数为1至20的烷基)包括醚(-O-)结合、芳基、烯基、环烷基或环烯基。当在磷酸盐位置上变形时,其连接基团-O-、-N-、-S-或-C-,通过上述连接基能够使相邻的核苷酸相互结合。
在碱基位置上的变形,包括嘧啶的5-位置变形、嘌呤的8-位置变形、尿嘧啶的4-位置或5-位置变形、胞嘧啶的环外胺变形等。具体来讲,嘧啶的5-位置变形的实例包括苄基羧基酰胺(benzylcarboxyamide)、苄基氨基羰基化合物(benzylaminocarbonyl)、萘基甲基羧基酰胺(naphthylmethylcarboxyamide)、萘基甲基氨基羰基化合物(naphthylmethylaminocarbonyl)、色氨基羧基酰胺(tryptaminocarboxyamide)、色氨基羰基化合物(trypaminocarbonyl)等,尿嘧啶的4-位置或5-位置变形的实例包括在尿嘧啶的4-位置导入=S(4-硫脲嘧啶)、在尿嘧啶的5-位置上导入-Br(5-溴尿嘧啶)、在尿嘧啶的5-位置上导入-I(5-碘尿嘧啶)的情况等。
关于在碱基位置上的变形,能够参考美国注册专利第5,719,273号、美国注册专利第5,660,985号等。尤其是在名为“包含修饰核苷酸的高亲和度核酸配体(High AffinityNucleic Acid Ligands Containing Modified Nucleotides)”的美国注册专利第5,660,985号中,公开了一种利用指数富集的配体系统进化(SELEX)技术筛选出对靶分子的亲和度高且包含在碱基位置上变形的核苷酸的适配体的方法。
适用本发明的核糖核酸(RNA)适配体也能够在5’端和/或3’端变形。例如,能够将5’端变形为衍生自5’-己胺连接基亚磷酰胺的-NH2。或者,能够将3’末端变形为反相胸苷以3’-3’结合(3’帽化(capping))的状态。
适用本发明的核糖核酸(RNA)适配体能够通过将聚亚烷基二醇(“PAG”)以有连接基或以无连接基的方式连接而进行变形。连接基不受到特殊的限制,只要能够充分发挥其作为连接基的作用即可。通常,能够将氨基(R-NH2)、活性酯(R'C(=O)OR")、酸酐(R'C(=O)OC(=O)R")、酰胺(R'(C=O)NR)等作为连接基使用。
在本行业中,已知如上所述的聚亚烷基二醇能够通过防止肾小球滤过(renalfilteration)而提升适配体的血中半衰期。
适用本发明的聚亚烷基二醇(PAG)的分子量通常在5至100kDa的范围之内,但是能够在考虑到适用本发明的适配体的适用症、剂型、给药途径等的前提下选择任意大小进行使用。通常使用10至80kDa范围,较佳地使用30至50kDa范围。
作为聚亚烷基二醇(PAG),最具代表性的是聚乙二醇(“PEG”)。众所周知,聚乙二醇(PEG)不仅能够减少肾小球滤过,而且没有毒性以及免疫原性。PEG的形态或结构不受到特殊的限制,能够使用如线型、分支型、多分支型等。
关于在适配体等核酸中导入包括聚乙二醇(PEG)在内的聚亚烷基二醇(“PAG”)的具体信息,能够参考名为“具有改善的药效学特性的多价适配体治疗剂及其制备和使用方法(Multivalent aptamer therapeutics with improved pharmacodynamic propertiesand methods of making and using the same)”的美国公开专利第2004-0180360号等。
在本行业中,已经公开了与聚亚烷基二醇(PAG)、聚乙二醇(PEG)类似的能够起到增加适配体的血中半衰期并减少肾小球滤过等相同作用的聚亚烷基二醇(PAG)、聚乙二醇(PEG)的代用品。如上所述的代用品也能够在适用本发明的适配体的变形中使用,上述代用品的实例包括聚噁唑啉(POZ)、聚乙二醇(PEG)、羟乙基淀粉(HES)、白蛋白、作为亲脂性化合物的胆固醇等。如上所述的代用品也能够以有连接基或无连接基的方式结合到适用本发明的适配体。
如上所述,在本行业中与适用本发明的适配体的合成相关的内容为公知的信息,例如能够使用固相寡核苷酸合成技术以及如三酯合成法等液相合成技术等,其具体信息能够参考文献[Nucl.Acid Res.14:5399-5467,1986]、文献[Tet.Lett.27:5575-5578,1986]、文献[Nucl.Acid Res.4:2557,1977]、文献[Lett.,28:2449,1978]等。
因为适用本发明的适配体具有能够与肿瘤坏死因子-α(TNF-α)进行结合的肿瘤坏死因子-α(TNF-α)抑制活性,因此能够将其作为有效成分制造出用于对肿瘤坏死因子-α(TNF-α)诱导的障碍和疾病进行预防治疗的药剂学组合物。
在适用本发明的药剂学组合物中,适用本发明的适配体作为其有效成分能够在对肿瘤坏死因子-α(TNF-α)介导的障碍和疾病呈现出有效的预防治疗效果的前提下,根据所适用的疾病、剂型、给药途径等以适当的任意含量(有效量)包含,通常有效量是在以组合物的整理重量为基准的0.001重量%至20.0重量%范围内进行确定。其中,“有效量”是指当按照医疗专家等的意见在给药期间内将适用本发明的组合物向其适用对象即哺乳动物较佳地向人进行给药时能够呈现出如肿瘤坏死因子-α(TNF-α)介导的疾病的改善效果等所预期的医疗、药理学效果的适用本发明的组合物中所包含的有效成分的量。如上所述的有效量能够在相关从业人员的一般的能力范围内通过实验进行确定。
适用本发明的药剂学组合物除有效成分之外还能够包括药剂学上允许的载体并按照本行业中公知的一般方法根据其给药途径制造成口服剂型或非口服剂型。其中,给药途径能够是包括局部途径、口服途径、静脉内途径、肌肉内途径以及通过粘膜组织的直接吸收等在内的任意的适当途径,也能够对两种以上的途径进行组合使用。两种以上途径的组合是根据给药途径对两种以上剂型的药物进行组合的情况,例如在第1次将某一种药物通过静脉内途径进行给药而第2次将另一种药物通过局部途径进行给药的情况。
药学上允许的载体根据其给药途径或剂型属于本行业中公知的信息,具体能够参考包括“大韩民国药典”在内的各个国家的药典。
当适用本发明的药剂学组合物制造成口服用剂型时,能够与适当的载体一起按照本行业公知的方法制造成如粉末、颗粒、片剂、丸剂、糖衣片剂、胶囊剂、液态剂、凝胶剂、糖浆剂、悬浊液、薄片等剂型。此时,作为适合的载体的实例,能够包括如乳糖、葡萄糖、蔗糖、右旋糖、山梨糖醇、甘露醇、木糖醇等糖类;如玉米淀粉、马铃薯淀粉、小麦淀粉等淀粉类;如纤维素、甲基纤维素、乙基纤维素、羧甲基纤维素钠、羟丙基甲基纤维素等纤维素;以及聚乙烯吡咯烷酮、水、羟基苯甲酸甲酯、羟基苯甲酸丙酯、硬脂酸镁、矿物油、麦芽、明胶、滑石、多元醇、植物油、乙醇、甘油等。当进行制剂化时,能够根据需要包含适当的结合剂、润滑剂、崩解剂、着色剂、稀释剂等。作为适当的结合剂,能够包括淀粉、铝镁硅酸盐、淀粉糊、明胶、甲基纤维素、羧甲基纤维素钠、聚乙烯吡咯烷酮、葡萄糖、玉米甜味剂、海藻酸钠、聚乙二醇、蜡等,作为润滑剂,能够包括油酸钠、硬脂酸钠、硬脂酸镁、苯甲酸钠、醋酸钠、氯化钠、二氧化硅、滑石、硬脂酸及其镁盐以及钙盐等,作为崩解剂,能够包括淀粉、甲基纤维素、琼脂(agar)、膨润土、黄原胶、淀粉、海藻酸或其钠盐等。此外作为稀释剂,能够包括乳糖、右旋糖、蔗糖、甘露醇、山梨糖醇、纤维素、甘氨酸等。
当适用本发明的药剂学组合物制造成非口服用剂型时,能够与适当的载体一起按照本行业公知的方法制剂化成注射剂、经皮给药剂、鼻腔吸入剂以及栓剂形态。当制剂化成注射剂时,作为适当的载体能够使用水性等渗溶液或悬浊液,具体来讲能够使用如包含三羟乙基胺的PBS(磷酸盐缓冲液,phosphate buffered saline)或注射用灭菌水、5%右旋糖等等渗溶液。当制剂化成经皮给药剂时,能够制剂化成如软膏剂、霜剂、洗剂、凝胶剂、外用液剂、糊剂、搽剂、压辊剂等形态。当为鼻腔吸入剂时,能够利用如二氯氟甲烷、三氯氟甲烷、二氯四氟乙烷、二氧化碳等适当的推进剂制剂化成气雾喷雾剂形态,而当制剂化成栓剂时,作为其载体能够使用如半合成脂肪酸酯(witepsol)、吐温(tween)61、聚乙二醇类、可可脂、月桂酸甘油酯、聚氧乙烯山梨糖醇酐脂肪酸酯类、聚氧乙烯硬脂酸酯类、山梨糖醇酐脂肪酸酯类等。
适用本发明的药学组合物还能够以如小型单层(unilamellar)囊泡(vesicle)、大型单层囊泡以及多层囊泡等脂质体药物传递系统形态进行给药。脂质体能够利用包含胆固醇、硬脂酰胺或磷脂酰胆碱的多种磷脂进行制造。脂质体药物传递系统属于本行业中公知的信息,例如能够参考美国注册专利第5,262,564号。
关于药剂学组合物的制剂化及其制造相关的其他信息,能够同时参考如文献[Remington's Pharmaceutical Sciences(19th ed.,1995)]等本行业中公知的信息。
适用本发明的药剂学组合物的较佳的给药量,能够根据患者的状态、体重、性别、年龄、患者的重症程度、给药途径在每天0.001mg/kg~1g/kg范围之内,较佳地能够在0.001mg/kg~1g/kg范围之内。例如,在口服给药时能够在每天约0.05至7.500mg/kg之间的范围之内。给药时能够每天一次或多次给药。在上述内容中所记载的给药量仅为示例性目的,在任何方面都不应解释为是对本发明的范围进行的限制。
如上所述,本发明能够提供与肿瘤坏死因子-α(TNF-α)进行结合的适配体以及对肿瘤坏死因子-α(TNF-α)介导的疾病的预防、治疗用途。
附图说明
图1是肿瘤坏死因子-α(TNF-α)适配体ATK001(a)以及ATK007(b)的二级结构模式图;
图2是通过平板结合实验法(plate-based binding assay)对肿瘤坏死因子-α(TNF-α)适配体ATK007与人肿瘤坏死因子-α(TNF-α)的结合量进行测定图示的图表;
图3是通过表面等离子体共振(SPR)法对肿瘤坏死因子-α(TNF-α)适配体ATK001(a)以及ATK007(b)与人肿瘤坏死因子-α(TNF-α)的传感图(sensorgrams)以及解离常数进行图示的示意图;
图4是通过凝胶阻留(Gel retardation)法对肿瘤坏死因子-α(TNF-α)适配体即ATK001(a)以及ATK007(b)进行分析的结果,以及将与肿瘤坏死因子-α(TNF-α)结合的适配体的量以百分比进行图示的图表(c);
图5是通过表面等离子体共振(SPR)法对肿瘤坏死因子-α(TNF-α)适配体ATK001与人肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、表皮生长因子受体-2(ErbB2)以及表皮生长因子受体-3(ErbB3)的传感图(sensorgrams)(a),肿瘤坏死因子-α(TNF-α)适配体ATK007与人肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、表皮生长因子受体-2(ErbB2)以及表皮生长因子受体-3(ErbB3)的传感图(sensorgrams)(b),肿瘤坏死因子-α(TNF-α)适配体ATK007与胰岛素样生长因子结合蛋白1(IGF-BP1)的传感图(sensorgrams)(c)以及各个解离常数进行图示的示意图;
图6是肿瘤坏死因子-α(TNF-α)适配体在急性期蛋白质的转录水准上对其表达造成的影响的结果示意图;
图7是肿瘤坏死因子-α(TNF-α)适配体在促炎性细胞因子以及血管内皮生长因子的转录水准上对其表达造成的影响的结果示意图;
图8是肿瘤坏死因子-α(TNF-α)适配体ATK001与ATK007对NO生成抑制造成的影响的结果示意图。
具体实施方式
接下来,将结合实施例对本发明进行说明。但是,本发明的范围并不限定于如下所述的实施例。
<实施例1>核糖核酸(RNA)适配体文库的制备
为了制备执行指数富集的配体系统进化(SELEX)过程所需要的2组核糖核酸(RNA)文库,首先制备出如下所述的包含随机碱基序列的2种类型的单链脱氧核糖核酸(DNA)寡核苷酸。
5’-GGGAGGACGATGCGGC-Nn-AGACGACTCGCCCGA-3’
[寡核苷酸1]
5’-GCGGAAGCGTGCTGGG-Nn-CACATAACCCAGAGGTCGAT-3’
[寡核苷酸2]
上述5’和3’中分别标有下划线的区域为固定区域,是分别供正向引物与逆向引物结合的部位,而上述Nn为A、G、T、C等n个碱基随机存在的序列。在上述正向引物中,用于核糖核酸(RNA)合成的R7核糖核酸(RNA)聚合酶启动子序列被结合到5’端。
通过将上述2种类型的单链脱氧核糖核酸(DNA)寡核苷酸分别作为模板执行聚合酶链反应(PCR),制备出了2组脱氧核糖核酸(DNA)文库。
具体来讲,在对1,000pM的脱氧核糖核酸(DNA)单链寡核苷酸、2,500pM的聚合酶链反应(PCR)引物、50mMKCl、10mMTris-Cl(pH 8.3)、3mMMgCl2、0.5mM脱氧核糖核苷三磷酸(dNTP)(脱氧腺苷三磷酸(dATP)、脱氧胞苷三磷酸(dCTP)、脱氧鸟苷三磷酸(dGTP)以及脱氧胸苷三磷酸(dTTP))进行混合之后添加0.1U耐热脱氧核糖核酸聚合酶(Taq DNAPolymerase)(珀金埃尔默,加利福尼亚州福斯特城),接下来通过以95℃下30秒、55℃下30秒以及72℃下1分钟为条件进行32轮反应而执行聚合酶链反应(PCR)之后利用QIAquick-spin聚合酶链反应(PCR)纯化柱(凯杰,加利福尼亚州查茨沃思)进行纯化。
将上述所制造出的2组脱氧核糖核酸(DNA)文库分别作为模板,利用T7核糖核酸(RNA)聚合酶通过如下所述的生物体外转录制备出2组核糖核酸(RNA)文库。此时,为了赋予对核糖核酸(RNA)分解酶的抵抗性,使用了腺苷三磷酸(ATP)以及鸟苷三磷酸(GTP)和包含2’-F-置换嘧啶的2’F-CTP、2’F-UTP。
具体来讲,在对200pM的脱氧核糖核酸(DNA)文库、0mM的Tris-Cl(pH 8.0)、12mMMgCl2、5mMDTT、1mM亚精胺(spermidine)、0.002%的曲拉通(Triton)X-100、4%的聚乙二醇(PEG)8000、5U的T7核糖核酸聚合酶(RNA Polymerase)、1mM腺苷三磷酸(ATP)和鸟苷三磷酸(GTP)以及3mM 2’F-CTP和2’F-UTP进行混合之后在37℃下进行6小时的反应。接下来通过利用脱氧核糖核酸酶I(DNaseI)(普洛麦格)处理并在37℃下进行30分钟的反应而去除作为模板使用的脱氧核糖核酸(DNA),然后利用Bio-Spin 6色谱柱(伯乐生命医学产品,加利福尼亚州赫拉克勒斯)进行纯化。利用紫外光谱仪对核酸的量及其纯度进行了检索。
<实施例2>与人肿瘤坏死因子-α(TNF-α)结合的适配体的分离及序列排序
利用指数富集的配体系统进化(SELEX)技术分离出了与人肿瘤坏死因子-α(TNF-α)结合的适配体。
将在上述过程中合成出的单链核酸的核糖核酸(RNA)文库的1014碱基序列/L浓度溶液以200pM/200μL的浓度在指数富集的配体系统进化(SELEX)缓冲液(50mM TrisCl(pH7.4),5mM KCl,100mM NaCl,1mM MgCl2,0.1%的NaN3)中以80℃的温度进行10分钟的加热之后再在冰上放置10分钟。通过添加所使用的单链核酸的5倍浓度的酵母转移核糖核酸(yeast tRNA,生命技术公司)以及0.2%的牛血清白蛋白(BSA,bovine serum albumin,默克公司)制备出反应溶液。
人肿瘤坏死因子-α(TNF-α)的生物素化,是按照蛋白质标记试剂盒(ProteinLabeling kit)(Jena Bioscience公司,德国)的协议实施。利用蒸馏水制造出1M碳酸氢钠(Sodium bicarbonate)溶液并利用二甲基甲酰胺(DMF,dimethylformamide)制造出10mg/ml的生物素溶液。向重组人肿瘤坏死因子-α(TNF-α)(西格玛奥德里奇公司,德国)添加上述所制造的1M碳酸氢钠(Sodium bicarbonate)溶液,制造出碳酸氢钠(Sodium bicarbonate)的最终浓度为100mM且人肿瘤坏死因子-α(TNF-α)的最终浓度为10mg/ml的人肿瘤坏死因子-α(TNF-α)溶液。将所制造出的人肿瘤坏死因子-α(TNF-α)溶液以及上述生物素溶液等量混合并在室温条件下进行1个小时的反应,接下来向葡聚糖凝胶G-25(Sephadex G-25)柱(西格玛奥德里奇公司,德国)添加2.5ml的反应溶液并进行10分钟的反应,接下来通过以10,000xg进行10分钟的离心分离而去除上清液的游离生物素,获得生物素化人肿瘤坏死因子-α(TNF-α)。
通过向上述所制备的包含核糖核酸(RNA)单链核酸的指数富集的配体系统进化(SELEX)缓冲溶液以10μg/ml的浓度添加上述所获得的生物素化人肿瘤坏死因子-α(TNF-α)并进行30分钟的反应而形成核糖核酸(RNA)单链核酸与肿瘤坏死因子-α(TNF-α)的复合体,接下来按照Dynabeads M-280链霉亲和素(Streptavidin)(英杰公司,美国)的协议对核糖核酸(RNA)单链核酸与肿瘤坏死因子-α(TNF-α)的复合体进行分离。具体来讲,向通过使纤维素化人肿瘤坏死因子-α(TNF-α)与单链核酸发生反应而获得的纤维素化人肿瘤坏死因子-α(TNF-α)-单链核酸复合体添加Dynabeads M-280链霉亲和素(Streptavidin)进行反应,从而利用上述复合体的生物素与磁珠的亲和素之间的结合形成生物素化人肿瘤坏死因子-α(TNF-α)-核糖核酸(RNA)单链核酸-磁珠复合体,接下来在利用指数富集的配体系统进化(SELEX)缓冲溶液(1x磷酸盐缓冲液(PBS),1mM醋酸镁(magnesium acetate),pH 7.0)进行洗涤之后利用磁性物质获得了生物素化人肿瘤坏死因子-α(TNF-α)-核糖核酸(RNA)单链核酸-磁珠复合体。
通过直接利用上述所获得的复合体执行反转录酶-聚合酶链锁反应(RT-PCR),从与人肿瘤坏死因子-α(TNF-α)结合的核糖核酸(RNA)单链核酸扩增制造出脱氧核糖核酸(DNA)池。
具体来讲,向上述所获得的复合体添加500nM的引物(primer)并在65℃条件下进行5分钟的变性,接下来在常温下放置10分钟使得核糖核酸RNA与引物结合。在添加1mM脱氧核糖核苷三磷酸(dNTP)、5X RT缓冲液、25U逆转录酶(AMV RTase)(普洛麦格)并在37℃条件下进行30分钟的反应,接下来在进行5分钟的加热之后在4℃下进行冷却而使逆转录酶灭活。向上述所合成的互补脱氧核糖核酸(cDNA)混合2,500pM的聚合酶链反应(PCR)引物、50mM KCl、10mM Tris-Cl(pH 8.3)、3mM MgCl2、0.5mM脱氧核糖核苷三磷酸(dNTP)(脱氧腺苷三磷酸(dATP)、脱氧胞苷三磷酸(dCTP)、脱氧鸟苷三磷酸(dGTP)以及脱氧胸苷三磷酸(dTTP))之后再向其添加0.1U耐热脱氧核糖核酸聚合酶(Taq DNA Polymerase)(珀金埃尔默,加利福尼亚州福斯特城)并通过以95℃下30秒、55℃下30秒以及72℃下1分钟为条件进行32轮反应而执行聚合酶链反应(PCR),从而制造出脱氧核糖核酸(DNA)并通过3%的琼脂糖胶进行确认,接下来通过与制备上述核糖核酸(RNA)文库相同的过程执行体外转录而合成脱氧核糖核酸(RNA),重复3次执行如上所述的选择过程。
通过将在上述反转录酶-聚合酶链锁反应(RT-PCR)和聚合酶连锁反应(PCR)中获得的脱氧核糖核酸(DNA)克隆到T载体中而获得单一克隆,并通过利用上述单一克隆对碱基序列进行分析而从衍生自[寡核苷酸1]的核糖核酸(RNA)文库中获得包含序列编号1的核糖核酸(RNA)(“ATK001”)的25种核糖核酸(RNA)的碱基序列,并获得衍生自[寡核苷酸2]的包含序列编号2的核糖核酸(RNA)(“ATK007”)的37种核糖核酸(RNA)的碱基序列。通过与上述相同的方法对如上所述的已确认序列的脱氧核糖核酸(DNA)执行体外转录,从而制备出在后续的试验中使用的各核糖核酸(RNA)单链核酸。
<实施例3>通过平板结合实验法(plate-based binding assay)测定核糖核酸 (RNA)适配体的结合亲和度
通过平板结合实验法(plate-based binding assay)对核糖核酸(RNA)单链核酸与人肿瘤坏死因子-α(TNF-α)的结合进行了测定。
为了对在上述<实施例2>中已确认序列的核糖核酸(RNA)单链核酸与肿瘤坏死因子-α(TNF-α)的结合亲和力进行调查,将0.5mg/mL的重组人肿瘤坏死因子-α(TNF-α)稀释到杜氏磷酸缓冲液(DPBS,Dulbecco's Phosphate-buffered Saline)中并将最终浓度调整至15μg/mL,接下来将100μL添加到96孔(well)Maxisorb板(Maxisorb plate)中并在4℃条件下进行一晚的培养。接下来在去除肿瘤坏死因子-α(TNF-α)溶液之后利用200μL的洗涤缓冲液(wash buffer:杜氏磷酸缓冲液(DPBS)+0.05%吐温(Tween)20)在常温下进行3次洗涤。接下来利用溶解于杜氏磷酸缓冲液(DPBS)的10mg/mL的牛血清白蛋白(BSA,bovine serumalbumin)200μL在常温下对上述板进行30分钟的封闭(blocking)。接下来去除牛血清白蛋白(BSA)封闭溶液(blocking solution)并重新利用200μL的洗涤溶液进行3次洗涤。将在杜氏磷酸缓冲液(DPBS)中利用0.1%的牛血清白蛋白(BSA)进行连续稀释(serial dilution)的核糖核酸(RNA)单链核酸添加到上述板并在常温下进行3小时的培养。在利用200μL的洗涤缓冲液进行3次洗涤之后,将0.5μg/mL的兔子单一克隆肿瘤坏死因子-α(TNF-α)抗体(Eputomics,美国)100μL添加到上述板并在常温下进行60分钟的培养。接下来,在去除上述肿瘤坏死因子-α(TNF-α)抗体溶液之后利用200μL的洗涤缓冲液对上述板进行3次洗涤。接下来,将利用分析缓冲液(assay buffer)进行1,000倍稀释的抗兔免疫球蛋白G-辣根过氧化物酶(IgG-HRP)二抗(Cell Signaling Technology)100μL添加到各个孔中并进行30分钟的培养。在利用200μL的洗涤缓冲液进行3次洗涤之后,将100μL的3,3’,5,5’-四甲基联苯胺(TMB)溶液(Pierce)添加到各个孔并进行2分钟的培养,接下来将100μL的停止液(stopsolution:2N H2SO4)添加到各个孔中停止反应。接下来,在450nm下利用Victor 3V 1420多标记分析仪(multilabel counter)(珀金埃尔默)对上述检查板进行测定。通过测定结果可以确认,在上述<实施例2>中已分析序列的核糖核酸(RNA)单链核酸中,ATK001或ATK007与重组人肿瘤坏死因子-α(TNF-α)的亲和力最优秀,而且通过对ATK001或ATK007的5次重复实验可以确认,ATK001以及ATK007对重组肿瘤坏死因子-α(TNF-α)的结合亲和力的平均值分别为43nM以及30nM。通过上述实验之一获得的与ATK001相关的数据如图2所示。
<实施例4>通过表面等离子体共振(SPR)分析测定核糖核酸(RNA)适配体结合亲和 度
利用Biacore2000设备(BIACORE公司,美国)执行了表面等离子体共振(SPR,Surface Plasmon Resonance)分析。在制备出NHS(0.1M N-羟基琥珀酰亚胺(Nhydroxysuccinimide))与EDC(0.4M N-乙基-N’-(二甲氨基丙基)碳化二亚胺(N-ethyl-N'-(dimethylaminopropyl)carbodiimide))的等量(50μL)混合物之后以5μL/min的速度流动40s,从而对CM5传感器芯片进行激活。当达到150-200RU时,将需要固定的肿瘤坏死因子-α(TNF-α)蛋白质投入到醋酸钠(pH 4.0)中混合至50ng/L之后进行流动。为了确认蛋白质的固定化是否正确完成,利用50mM NaOH流动5s。在80℃下对核糖核酸(RNA)适配体ATK001以及ATK007进行5分钟的变性之后再在常温条件下进行15分钟的还原,从而制备出分析对象物质(核糖核酸(RNA))。
为了求出动力学(kinetics),将流速变更为30μL/min。通过将上述所准备的分析对象物质溶解到1×汉克平衡盐溶液(HBS)中而制成6.25nM至500nM之间的浓度之后流动到传感器芯片,从而利用平衡解离常数(equilibrium dissociation constant:Kd)对上述所选定的核糖核酸(RNA)适配体与肿瘤坏死因子-α(TNF-α)蛋白质之间的结合亲和度进行了定量化。
平衡解离常数(equilibrium dissociation constant:Kd)是在将上述所选定的核糖核酸(RNA)适配体与肿瘤坏死因子-α(TNF-α)设定为1:1结合之后通过从传感图(sensorgram)获得的Req值的标绘曲线(plot curve)利用动力学Ka/Kd同步程序(kineticsimultaneous Ka/Kd model program)进行计算而得。
其结果,在<实施例2>中选定的与肿瘤坏死因子-α(TNF-α)结合的单链核酸中,ATK001以及ATK007适配体的Kd值计算结果如图3所示,在4.0~7.0nM范围之内,呈现出了强大的结合力。
<实施例5>通过凝胶阻留(Gel retardation)法测定核糖核酸(RNA)适配体结合亲 和度
在逐步增加肿瘤坏死因子-α(TNF-α)蛋白质的量(0~320nM)的同时与利用放射线同位素内部标记过的在<实施例2>中选定的与肿瘤坏死因子-α(TNF-α)结合的单链核酸(50pM)进行反应。在将适配体与肿瘤坏死因子-α(TNF-α)蛋白质、结合缓冲液(30mM Tris-HCl(PH 7.5),150mM NaCl,1.5mM MgCl2,2mM二硫苏糖醇(DTT))、转移核糖核酸(tRNA)3g等混合到共计40μl之后在常温下进行30分钟的结合。添加6X溴酚蓝(BPB)并在4℃条件下以120V在6%非变性凝胶(6%聚丙烯酰胺,1X Tris-硼酸电泳缓冲液(TBE),10mM MgCl2,2%丙三醇)中进行电泳,接下来曝光到X光胶片中进行显影。通过计算出总核糖核酸(RNA)适配体中与肿瘤坏死因子-α(TNF-α)结合的核糖核酸(RNA)适配体的量而测定出分离常数(Kd)。
通过如上所述的实验,在增加肿瘤坏死因子-α(TNF-α)蛋白质的量的同时对利用放射线同位素进行标记的核糖核酸(RNA)发生反应之后在4%非变性丙烯酰胺凝胶上的位置发生变化的量进行了测定,其结果如图4所示。
图4的a以及b是利用放射线同位素进行标记的50pM的核糖核酸(RNA)适配体ATK001(a)和50pM的核糖核酸(RNA)适配体ATK007(b)在逐渐增加肿瘤坏死因子-α(TNF-α)(0-320nM)的量的情况下反应时所得到的肿瘤坏死因子-α(TNF-α)-核糖核酸(RNA)适配体结合体(C)和未结合的核糖核酸(RNA)适配体(F)在4%非变性丙烯酰胺凝胶上的照片,图4的c是与肿瘤坏死因子-α(TNF-α)结合的核糖核酸(RNA)量的百分比计算结果图表,其结果为重复实验3次的测定值的平均值。
如图4所示,核糖核酸(RNA)适配体ATK001和ATK007均以依赖于量的趋势通过与肿瘤坏死因子-α(TNF-α)结合而形成了有效的位置变化,分别呈现出约18nM、5nM的高亲和力的解离常数(Kd)。尤其是所筛选出的ATK001和ATK007能够以约1.2倍的程度与靶蛋白进行强力结合,呈现出更加有效的结合力。
<实施例6>通过表面等离子体共振(SPR)分析测定核糖核酸(RNA)适配体的结合特 异性
为了利用与上述<实施例4>相同的方法,通过表面等离子体共振(SPR)分析对核糖核酸(RNA)与肿瘤坏死因子-α(TNF-α)的结合特异性进行测定,除肿瘤坏死因子-α(TNF-α)之外还将表皮生长因子受体-2(ErbB2)(赛默飞世尔,美国)(Nucleic Acid Ther.2011Jun;21(3):173-178)、表皮生长因子受体-3(ErbB3)(赛默飞世尔,美国)(Proc Natl Acad SciUSA.(2012),109(33):13237-42)以及胰岛素样生长因子结合蛋白1(IGF-BP1)(赛默飞世尔,美国)(Insulin-like growth factor-binding protein 1)(Crit Rev OncolHematol.(2008),66(2):91-98)的结合力通过Kd进行定量化,其结果如图5所示(图5a为ATK001的结合力测定结果,图5b为ATK007的测定结果,图5c为ATK007的结合力测定结果)。
如图5所示,核糖核酸(RNA)适配体ATK001和ATK007对肿瘤坏死因子-α(TNF-α)为10-9M(nM)水准,对表皮生长因子受体-2(ErbB2)以及表皮生长因子受体-3(ErbB3)约为104nM水准,而与胰岛素样生长因子结合蛋白1(IGF-BP1,Insulin-like growthfactor-binding protein 1)几乎不会结合,对肿瘤坏死因子-α(TNF-α)具有较高的结合力。
<实施例7>肿瘤坏死因子-α(TNF-α)适配体对急性期蛋白质(Acute phase protein)、血管内皮生长因子以及促炎性细胞因子的转录造成的影响
在实验的24小时之前,将肝癌细胞株即SK-HEP1细胞(ATCC)以1.0x104的密度接种到装有包含胎牛血清(FBS)的达尔伯克改良伊格尔培养基(DMEM)的96孔平底微量滴定板(96-well flat-bottom microtiter plates)。在磷酸盐缓冲液(PBS)中首先使2μg/mL的适配体(ATK001或ATK007)或20μg/mL的抗肿瘤坏死因子-αmAB(anti-TNF-αmAB)(R&Dsystems)与人肿瘤坏死因子-α(TNF-α)(英杰公司,美国)进行2小时的反应之后,将所形成的反应物添加到包含细胞的孔板的孔中进行2小时的培养。接下来,利用温磷酸盐缓冲液(PBS)对细胞进行西地之后,再额外地在完全培养基中进行48小时的培养。在获取所培养的细胞并对核糖核酸(RNA)进行分离之后,以急性期蛋白质(Acute phase protein)、血管内皮生长因子以及促炎性细胞因子作为对象利用表1和表2中的引物执行了反转录酶-聚合酶链锁反应(RT-PCR)。将聚合酶连锁反应(PCR)产物在琼脂糖胶中进行电泳,对肿瘤坏死因子-α(TNF-α)适配体即ATK001以及ATK007对急性期蛋白质、血管内皮生长因子以及促炎性细胞因子的转录造成的影响进行了评估。
表1急性期蛋白质基因及其引物
表2促炎性细胞因子基因、血管内皮生长因子及其引物
在图6中对其结果进行了图示。如图6所示,因为在实验中所使用的肿瘤坏死因子-α(TNF-α)适配体,急性期蛋白质中在急性期反应期间内的表达量增加的蛋白质(肝珠蛋白(Hepatoglobin)、纤维蛋白原-γ(Fibrogen-γ)、纤连蛋白(Fibronectin)、转铁蛋白(Transferrin))的表达量在转录水准上得到了抑制,而在急性期反应期间内的表达量减少的蛋白质(铁蛋白-L(Feritin-L))几乎没有受到影响。
此外,如图7所示,因为在实验中所使用的肿瘤坏死因子-α(TNF-α)适配体,在急性期反应期间内的表达量增加的促炎性细胞因子(肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素-1β(IL-1β)以及白细胞介素6(IL6))以及血管内皮生长因子(VEGF)的表达量在转录水准上得到了抑制。
<实施例8>肿瘤坏死因子-α(TNF-α)适配体对巨噬细胞的NO生成造成的影响
将小鼠单核巨噬细胞白血病细胞(RAW 264.7)以1.0×105的密度接种到含洛斯维·帕克纪念研究所1640(RPMI 1640)以及10%胎牛血清(FBS)12孔板(12-well plate)的孔中。利用2U/ml的干扰素γ(IFN-γ)(派普泰克,新泽西州)对细胞进行1个小时的预处理之后,将100ng/ml经过肿瘤坏死因子-α(TNF-α)处理的实验溶液添加到含最终浓度为2μg/mL的肿瘤坏死因子-α(TNF-α)适配体(ATK001或ATK007)或最终浓度为2μg/mL的对照物质即核糖核酸(RNA)文库或10μg/ml的抗肿瘤坏死因子-α(TNF-α)mAB的1ml培养基中。在各个时间点分别采集100μl的培养基,且NO2-分析是利用格里斯(Griess)试剂盒(英杰公司,卡尔斯巴德,美国)进行确定。所有实验均三重执行并重复三次。
在图8中对其结果进行了图示。如图8所示,可以发现在利用肿瘤坏死因子-α(TNF-α)核糖核酸(RNA)适配体ATK001和肿瘤坏死因子-α(TNF-α)核糖核酸(RNA)适配体ATK007进行处理时NO生成得到了抑制,且肿瘤坏死因子-α(TNF-α)核糖核酸(RNA)适配体ATK007呈现出与抗肿瘤坏死因子-α(TNF-α)mAB类似水准的抑制活性。
Claims (16)
1.一种核糖核酸适配体或其变形体,其特征在于:
具有序列编号1或序列编号2并与肿瘤坏死因子-α结合。
2.根据权利要求1所述的适配体,其特征在于:
所述肿瘤坏死因子-α为人肿瘤坏死因子-α或鼠肿瘤坏死因子-α。
3.根据权利要求1所述的适配体,其特征在于:
所述核糖核酸适配体为变形的适配体,所述变形的适配体是在核糖核苷酸的糖位置、磷酸盐位置、碱基位置、5’端位置以及3’端位置中的一个以上的位置进行化学变形的适配体。
4.根据权利要求3所述的适配体,其特征在于:
所述变形的适配体为在糖位置上变形的适配体,所述适配体中糖的一个以上的羟基变形为卤素基、脂肪族基、醚基或胺基中的某一个。
5.根据权利要求3所述的适配体,其特征在于:
所述变形的适配体为在糖位置上变形的适配体,所述适配体中糖的2’-OH基变形为OMe、O-烷基、O-烯丙基、S-烷基、S-烯丙基以及卤素基的某一个。
6.根据权利要求1所述的适配体,其特征在于:
所述核糖核酸适配体为变形的适配体,所述变形的适配体中序列编号1或序列编号2中存在的所有C以及U分别为2’-F被修饰的C以及2’-F被修饰的U。
7.根据权利要求1所述的适配体,其特征在于:
所述核糖核酸适配体为在磷酸盐位置上变形的适配体,所述变形的适配体中磷酸盐变形为P(O)S、P(S)S、P(O)NR2、P(O)R、P(O)OR'、CO或CH2。
8.根据权利要求1所述的适配体,其特征在于:
所述核糖核酸适配体为在碱基位置上变形的适配体,所述变形的适配体是在嘧啶的5-位置、嘌呤的8-位置、尿嘧啶的4-位置、尿嘧啶的5-位置或胞嘧啶的环外胺位置上变形。
9.根据权利要求1所述的适配体,其特征在于:
所述核糖核酸适配体为在5’端位置上变形的适配体,所述变形的适配体是在5’末端上结合-NH2的变形。
10.根据权利要求1所述的适配体,其特征在于:
所述核糖核酸适配体为在3’端位置上变形的适配体,所述变形的适配体是反向胸苷以3’-3’结合的变形。
11.根据权利要求1所述的适配体,其特征在于:
所述核糖核酸适配体是将聚亚烷基二醇以有连接基或以无连接基的方式连接的变形。
12.根据权利要求1所述的适配体,其特征在于:
所述核糖核酸适配体是将聚乙二醇以有连接基或以无连接基的方式连接的变形。
13.根据权利要求12所述的适配体,其特征在于:
所述核糖核酸适配体是聚乙二醇以氨基作为连接基导入到5’末端位置上的变形,所述氨基为R-NH2。
14.一种肿瘤坏死因子-α抑制用药剂学组合物,其特征在于:
包含根据权利要求1至权利要求13中的某一项所述的适配体。
15.一种肿瘤坏死因子-α介导的疾病的治疗或预防用药剂学组合物,其特征在于:
包含根据权利要求1至权利要求13中的某一项所述的适配体。
16.根据权利要求15所述的药剂学组合物,其特征在于:
所述肿瘤坏死因子-α介导的疾病,是呼吸道障碍、哮喘、过敏性以及非过敏性哮喘、感染导致的哮喘、呼吸道合胞病毒感染导致的哮喘、慢性阻塞性肺病、气道炎症性病症、嗜酸性粒细胞增多、纤维化症以及粘液过多症、囊性纤维化症、肺纤维化症、特应性障碍、特应性皮炎、麻疹、湿疹、过敏性鼻炎、过敏性胃肠炎、皮肤炎症和/或皮肤自身免疫性病症、胃肠道炎症和/或自身免疫性病症、炎症性肠道疾病、溃疡性结肠炎、克罗恩病、肝脏炎症和/或自身免疫性病症、肝硬化、肝纤维化症、乙型和/或丙型肝炎病毒引起的肝纤维化症、硬皮病、肿瘤或癌症、肝细胞性肝癌、成胶质细胞瘤、淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤、病毒感染、细菌感染、寄生虫感染、人体T细胞白血病病毒-1感染以及接种疫苗所导致的免疫反应。
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
PCT/KR2016/011981 WO2018079864A1 (ko) | 2016-10-24 | 2016-10-24 | TNF-α 결합 압타머 및 그것의 치료적 용도 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CN110023499A true CN110023499A (zh) | 2019-07-16 |
Family
ID=62023616
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN201680090346.2A Pending CN110023499A (zh) | 2016-10-24 | 2016-10-24 | 肿瘤坏死因子-α(TNF-α)结合适配体及其治疗用途 |
Country Status (6)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US11028395B2 (zh) |
EP (1) | EP3530738A4 (zh) |
JP (1) | JP2019535249A (zh) |
CN (1) | CN110023499A (zh) |
CA (1) | CA3041451A1 (zh) |
WO (1) | WO2018079864A1 (zh) |
Families Citing this family (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN112567037A (zh) * | 2018-04-20 | 2021-03-26 | 中央研究院 | 治疗或诊断tnf相关炎性疾病的tnf靶向适配体及其用途 |
Citations (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO1996040717A1 (en) * | 1995-06-07 | 1996-12-19 | Nexstar Pharmaceuticals, Inc. | High-affinity nucleic acid ligands of cytokines |
KR20000029877A (ko) * | 1996-08-07 | 2000-05-25 | 아스트루 마이클 제이 | 종양괴사인자관련리간드 |
CN1550501A (zh) * | 2003-05-15 | 2004-12-01 | �й�����Ԥ���������IJ�����Ԥ������ | 抑制人肿瘤坏死因子活性的寡聚核苷酸 |
Family Cites Families (14)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
ATE160821T1 (de) | 1990-06-11 | 1997-12-15 | Nexstar Pharmaceuticals Inc | Nukleinsäureliganden |
US5660985A (en) | 1990-06-11 | 1997-08-26 | Nexstar Pharmaceuticals, Inc. | High affinity nucleic acid ligands containing modified nucleotides |
US5580737A (en) | 1990-06-11 | 1996-12-03 | Nexstar Pharmaceuticals, Inc. | High-affinity nucleic acid ligands that discriminate between theophylline and caffeine |
US5270163A (en) | 1990-06-11 | 1993-12-14 | University Research Corporation | Methods for identifying nucleic acid ligands |
US5262564A (en) | 1992-10-30 | 1993-11-16 | Octamer, Inc. | Sulfinic acid adducts of organo nitroso compounds useful as retroviral inactivating agents anti-retroviral agents and anti-tumor agents |
US5719273A (en) | 1993-06-14 | 1998-02-17 | Nexstar Pharmaceuticals, Inc. | Palladium catalyzed nucleoside modifications methods using nucleophiles and carbon monoxide |
WO2004047742A2 (en) | 2002-11-21 | 2004-06-10 | Archemix Corporation | Multivalent aptamer therapeutics with improved pharmacodynamic properties and methods of making and using the same |
JP6041373B2 (ja) * | 2010-02-01 | 2016-12-07 | Necソリューションイノベータ株式会社 | TNF−αに結合するアプタマー分子 |
KR101261589B1 (ko) | 2010-04-09 | 2013-05-06 | 주식회사 포스코 | Rig-i 단백질을 표적으로 하는 rna 앱타머 및 그의 용도 |
US20110275794A1 (en) | 2010-04-12 | 2011-11-10 | Somalogic, Inc. | 5-position modified pyrimidines and their use |
KR101090177B1 (ko) | 2010-06-03 | 2011-12-06 | 건국대학교 산학협력단 | 인터류킨32 길항적 rna 앱타머 |
WO2013185241A1 (en) | 2012-06-15 | 2013-12-19 | D5 Pharma Inc. | Aptamers specific to cea and tnf-alpha and their therapeutic uses |
US9206429B2 (en) | 2013-03-14 | 2015-12-08 | Somalogic, Inc. | Aptamers that bind to IL-6 and their use in treating or diagnosing IL-6 mediated conditions |
KR101900878B1 (ko) * | 2016-10-10 | 2018-11-08 | 주식회사 바이오이즈 | TNF-α 결합 압타머 및 그것의 치료적 용도 |
-
2016
- 2016-10-24 JP JP2019522322A patent/JP2019535249A/ja not_active Ceased
- 2016-10-24 CA CA3041451A patent/CA3041451A1/en not_active Abandoned
- 2016-10-24 US US16/344,107 patent/US11028395B2/en active Active
- 2016-10-24 CN CN201680090346.2A patent/CN110023499A/zh active Pending
- 2016-10-24 EP EP16920238.9A patent/EP3530738A4/en not_active Withdrawn
- 2016-10-24 WO PCT/KR2016/011981 patent/WO2018079864A1/ko unknown
Patent Citations (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO1996040717A1 (en) * | 1995-06-07 | 1996-12-19 | Nexstar Pharmaceuticals, Inc. | High-affinity nucleic acid ligands of cytokines |
KR20000029877A (ko) * | 1996-08-07 | 2000-05-25 | 아스트루 마이클 제이 | 종양괴사인자관련리간드 |
CN1550501A (zh) * | 2003-05-15 | 2004-12-01 | �й�����Ԥ���������IJ�����Ԥ������ | 抑制人肿瘤坏死因子活性的寡聚核苷酸 |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
US20190323012A1 (en) | 2019-10-24 |
JP2019535249A (ja) | 2019-12-12 |
EP3530738A4 (en) | 2020-06-03 |
WO2018079864A1 (ko) | 2018-05-03 |
US11028395B2 (en) | 2021-06-08 |
CA3041451A1 (en) | 2018-05-03 |
EP3530738A1 (en) | 2019-08-28 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
AU2011240774B2 (en) | Aptamers to beta-NGF and their use in treating beta-NGF mediated diseases and disorders | |
CN105462985B (zh) | 与靶蛋白质结合的核酸片段 | |
TWI222448B (en) | 1,3-oxathiolane nucleoside analogues | |
ES2710723T3 (es) | Aptámeros que se unen a IL-6 y su uso en el tratamiento o el diagnóstico de afecciones mediadas por IL-6 | |
WO2003062256A1 (en) | 2'-beta-modified-6-substituted adenosine analogs and their use as antiviral agents | |
TW202214855A (zh) | 雙鏈siRNA類似物的共軛物 | |
KR101900878B1 (ko) | TNF-α 결합 압타머 및 그것의 치료적 용도 | |
US20080076776A1 (en) | Therapeutic compounds | |
CN110023499A (zh) | 肿瘤坏死因子-α(TNF-α)结合适配体及其治疗用途 | |
Megati et al. | (R)-(-)-and (S)-(+)-Adenallene: synthesis, absolute configuration, enantioselectivity of antiretroviral effect, and enzymic deamination. | |
CA2657973A1 (en) | Therapeutic compounds | |
CN109096219B (zh) | 一种新型抗pd-l1化合物、其应用及含其的组合物 | |
WO2021249484A1 (zh) | 缀合基团及其缀合物 | |
CN110483640B (zh) | 白介素-6r的人源化单克隆抗体、其编码基因及应用 | |
WO2024125636A1 (zh) | Toll样受体调节剂与dsRNA的联合治疗 | |
CN103709222B (zh) | 7-去氮类嘌呤核糖核苷类化合物、合成方法及其药物用途 | |
US7217815B2 (en) | 2-beta -modified-6-substituted adenosine analogs and their use as antiviral agents | |
NO324263B1 (no) | Kjemiske forbindelser, anvendelse derav ved behandling av kreft, samt farmasoytiske preparater som omfatter slike forbindelser | |
TW202430183A (zh) | Toll樣受體調節劑與dsRNA的聯合治療 | |
CA3186763A1 (en) | Conjugate of double-stranded sirna analogue | |
CN116063469A (zh) | 一种寨卡病毒中和性纳米抗体及其制备方法与应用 | |
WO2023208128A1 (zh) | 一类含核苷酸类似物的双链RNAi类似物的缀合物 | |
CN117242085A (zh) | 经修饰的核苷 | |
US20200181617A1 (en) | Chemically modified rna aptamers and uses thereof |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
PB01 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |
Application publication date: 20190716 |
|
WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |