CZ297387B6

CZ297387B6 - Sekvence DNA kódující ligand príbuzný TNF, polypeptid a zpusob jeho prípravy, protilátka reaktivní s polypeptidem a farmaceutická kompozice

Info

Publication number: CZ297387B6
Application number: CZ0040399A
Authority: CZ
Inventors: Chicheportiche@Yves; L. Browning@Jeffrey
Original assignee: Biogen Idec Ma Inc.; The Faculty Of Medicine Of The University Of Geneva
Priority date: 1996-08-07
Filing date: 1997-08-07
Publication date: 2006-11-15
Also published as: DE69734397T2; BG64779B1; ES2251737T3; EE05276B1; EP0956351B1; ATE307204T1; SK15799A3; NO20084906L; CZ40399A3; JP4161084B2; AU736289B2; CN1232503A; JP2007204480A; EA199900187A1; EA003187B1; JP2009183294A; EP1591530B1; NO990550D0; IS2606B; BR9711046A

Abstract

Resení popisuje ligand TRELL príbuzný nádorovému nekrotickému faktoru, který je novým clenem rodinynádorového nekrotického faktoru (TNF), DNA kódující tento polypeptid, a také fragmenty TRELL, kterési uchovávají puvodní apoptotickou aktivitu vuci bunkám karcinomu tlustého streva. Dále se týká protilátek reaktivních s polypeptidem TRELL a téz farmaceutických kompozic uzitecných pro lécení ovlivnování imunitního systému a lécení rakoviny.

Description

(54) Název vynálezu:

Sekvence DNA kódující ligand příbuzný TNF, polypeptid a způsob jeho přípravy, protilátka reaktivní s polypeptidem a farmaceutická kompozice (57) Anotace:

Řešení popisuje ligand TRELL příbuzný nádorovému nekrotickému faktoru, který je novým členem rodiny nádorového nekrotického faktoru (TNF), DNA kódující tento polypeptid, a také fragmenty TRELL, které si uchovávají původní apoptotickou aktivitu vůči buňkám karcinomu tlustého střeva. Dále se týká protilátek reaktivních s polypeptidem TRELL a též farmaceutických kompozic užitečných pro léčení ovlivňování imunitního systému a léčení rakoviny.

Sekvence DNA kódující ligand příbuzný TNF, polypeptid a způsob jeho přípravy, protilátka reaktivní s polypeptidem a farmaceutická kompozice

Oblast techniky

Předkládaný vynález se týká ligandu příbuzného nádorovému nekrotickému faktoru neboli TRELL, což je polypeptid patřící do rodiny proteinů nádorového nekrotického faktoru (TNF, „Tumor Necrosis Factor“). Tento protein nebo jeho receptor mohou mít protinádorové nebo imunoregulační použití. Kromě toho buňky transfekované genem kódujícím TRELL se mohou použít k protinádorové genové terapii a ke genové terapii autoimunitních a zánětlivých onemocnění a také ke genové terapii dědičných genetických poruch.

Předkládaný vynález byl vytvořen zčásti v průběhu práce na grantech č. 31-42275.94 a 32^41729.94, které získala Irene Garcia od Swiss National Fund. Výhradní práva jsou definována v odstavcích 28 a 29 statutu Swiss National Fund.

Dosavadní stav techniky

Cytokiny příbuzné nádorovému nekrotickému faktoru (TNF) j sou mediátory hostitelské obranné reakce a regulace imunitní odpovědi. Členové této proteinové rodiny se vyskytují ve formě ukotvené na buněčnou membránu a působí lokálně prostřednictvím vzájemného kontaktu mezi buňkami, nebo se vyskytují jako vylučované proteiny schopné difundovat ke vzdálenějším cílům. Paralelní rodina receptorů ukazuje na to, že přítomnost těchto proteinů vede k iniciaci buněčné smrti nebo buněčné proliferace a diferenciace cílové tkáně. V současnosti rodina TNF ligandů a receptorů obsahuje nejméně 9 známých párů receptor-ligand: TNF:TNF-R, LT-a:TNF-R, LT-cc/p:LT-p-R, FasL:Fas, CD40L:CD40, CD3OL:CD3O, CD27L:CD27, OX40L:OX40 a 4-lBBL:4-lBB. Sekvence DNA kódující tyto ligandy vykazují identitu pouze ve 25 % až 30 %, a to dokonce i v případě největší příbuznosti, ačkoliv příbuznost na úrovni sekvence aminokyselin je přibližně 50%.

Určujícím rysem této rodiny cytokinových receptorů je extracelulámí doména bohatá na cystein, která byla objevena při molekulovém klonování dvou různých receptorů TNF. Tato genová rodina kóduje glykoproteiny s vlastnostmi transmembránových proteinů typu 1 s extracelulámí vazebnou doménou vážící ligand, jednou transmembránovou doménou a cytoplazmatickým úsekem, který se podílí na aktivaci buněčných funkcí. Usek bohatý na cystein, který je současně vazebným úsekem pro ligand, má centrální doménu z hustě spojených disulfídových můstků, která se několikrát opakuje, což závisí na konkrétním členu rodiny. Většina receptorů má čtyři domény, ačkoliv jsou i receptory se třemi doménami nebo naopak zase se šesti doménami.

Proteiny z rodiny TNF ligandů jsou charakteristické na svém N-konci krátkým úsekem hydrofílních aminokyselin, který často obsahuje několik argininových nebo lysinových zbytků, které zřejmě slouží jako sekvence k zastavení přenosu. Pak mají transmembránový úsek a extracelulámí úsek proměnné délky, který odděluje vazebnou doménu pro receptor na C-konci od buněčné membrány. Tento úsek se někdy nazývá „stopka“. Vazebný úsek představuje větší část proteinu a často, i když ne vždy, obsahuje glykosylační místa. Tyto geny postrádají klasickou signální sekvenci charakteristickou pro membránové proteiny typu 1, spíše odpovídají membránovým proteinům typu II, které mají C-konec zasahující mimo buňku a krátký N-konec zasahující do cytoplazmy. V některých případech, jako jsou TNF a LT-α, se může objevit v průběhu časného opracování proteinu štěpení v úseku „stopky“ a ligand pak existuje především v secemované formě. Avšak většina ligandů se vyskytuje v membránové formě a zprostředkovává lokalizovaný přenos signálů.

-1 CZ 297387 B6

Struktura těchto ligandů byla rozpoznána krystalografickou analýzou TNF, LT-α a CD40L. Struktura TNF a lymfotoxinu alfa (LT-α) je „sendvičová“, tj. skládají se ze dvou antiparalelních β-skládajících listů s topologií tzv. „Greek key“ neboli ,jelly roli“. Odchylka rms mezi zbytky řetězců a a β je 0,61 C, což vede k domněnce o vysokém stupni podobnosti jejich molekulární topografie. Strukturálním rysem, který zjevně vyplývá z molekulárních studií CD40L, TNF a LT-oc, je tendence těchto ligandů vytvářet oligomemí komplexy. Oligomemí struktuře je vlastní vytváření vazebných míst pro receptor v místě spojení mezi sousedními podjednotkami, čímž se vytváří multivalentní ligand. Analýzou krystalové struktury se zkoumala kvartémí struktura CD40L, TNF a LT-α a ukázalo se, že CD40L, TNF a LT-α existují jako trimery. Mnoho aminokyselin konzervovaných mezi těmito ligandy se vyskytuje právě v oblasti úseků kostry struktury β—listu. Je pravděpodobné, že základní sendvičová struktura je zachována u všech těchto molekul, neboť části těchto sekvencí kostry jsou konzervovány mezi různými členy celé rodiny. Kvartémí struktura se zřejmě také udržuje, neboť konformace podjednotek pravděpodobně také zůstává podobná.

Členy rodiny TNF mohou být nejlépe charakterizovány jako hlavní přepínače v imunitním systému pro řízení přežívání buněk a také buněčné diferenciace. V současnosti jsou známy pouze dva secemované cytokiny, a sice TNF a LT-α, na rozdíl od většiny ostatních členů rodiny TNF zakotvených v membráně. Zatímco membránové formy TNF byly dobře charakterizovány a pravděpodobně mají jedinečnou biologickou funkci, funkcí secemovaných TNF je všeobecná signalizace „poplachu“ buňkám vzdáleným od místa události, která příslušnou událost vyvolala. Sekrece TNF může znásobit událost vedoucí k dobře známým změnám ve výstelce cév a v buňkách v místě zánětu. Naproti tomu členy TNF rodiny vázané na membránu předávají signál prostřednictvím receptorů typu TNF pouze buňkám v přímém kontaktu. Tak např. pomocné T-buňky poskytují „pomoc“ zprostředkovanou CD40 pouze takovým B-buňkám, se kterými se dostanou do přímého kontaktu prostřednictvím interakcí TCR. Podobná omezení na bezprostřední buněčný kontakt se týkají schopnosti indukovat buněčnou smrt a v současnosti zkoumaného systému Fas.

Schopnost indukovat programovanou buněčnou smrt je důležitou a nyní velmi zkoumanou vlastností několika členů rodiny TNF. Apoptóza zprostředkovaná Fas hraje zřejmě roli v regulaci autoreaktivních periferních lymfocytů a možná také vbrzlíku (Castro et al., 1996). Současné výzkumy také poukazují na roli TNF a CD30 v přežívaná T-buněk a linií velkých anaplastických lymfomových buněk (Amakawa et al., 1996, Gruss et al., 1994, Sytwu et al., 1996, Zheng et al., 1995). Již dříve jsme my i jiní autoři prokázali, že odumírání takové linie jako reakce na buněčnou signalizaci zprostředkovanou TNF, Fas nebo LTb, má vlastnosti apoptózy (Abreu-Martin et al., 1995, Browning et al., 1996).

Ligandy TNF je možné rozdělit do třech skupin na základě jejich schopnosti indukovat buněčnou smrt (viz tab. 3 v oddíle Příklady). V první skupině jsou ligandy TNF, Fas a TRAIL, které mohou účinně indukovat buněčnou smrt v mnoha liniích ajejich receptory mají většinou kanonické „smrtící“ domény. Pravděpodobně ligand DR-3 (TRAMP/WSL-1) by patřil také do této kategorie. Druhou skupinu tvoří takové ligandy, které spouštějí slabší signál omezený jen na některé buněčné typu. Do této druhé skupiny patří např. TRELL, CD30 ligand a LTablb2. Zajímavou otázkou je, jak členy této skupiny mohou spouštět mechanismus vedoucí k buněčné smrti, když nemají kanonickou „smrtící“ doménu. Nepřítomnost této domény vede k domněnce, že existuje ještě jiný způsob signalizace v mechanismu buněčné smrti. Do poslední skupiny patří ty členy, které nejsou schopny přenášet žádný signál vedoucí k buněčné smrti. Ale pravděpodobně členy všech skupin mohou působit antiproliferačně na některé typy buněk jako následek indukce diferenciace, jako např. CD40 (Funakoshi et al., 1994).

Rodina TNF se dramaticky rozrostla v poslední době a obsahuje nyní 11 různých signálních drah zahrnujících regulaci imunitního systému. Expresní vzorce TRELL a TRAIL ukazují, že v této rodině existuje značná funkční variabilita, dosud nerozpoznaná. To vyniklo zejména novým

-2CZ 297387 B6 objevem dvou receptorů, které ovlivňují replikační schopnost viru Rousova sarkomu a viru herpes simplex, a také významnými objevy, že TNF má antivirovou aktivitu a virus neštovic kóduje „vějičkové“ TNF receptory (Brojatsch et al., 1996, Montgomery et al., 1996, Smith 1994, Vassali

1992). Vytvoření rozpustného TRELL a identifikace receptorů TRELL by měla poskytnout nástroj k objasnění biologické funkce tohoto zajímavého proteinu.

TNF je mediátor septického šoku a kachexie a účastní se regulace vývoje hematopoetických buněk. Zdá se, že hraje hlavní roli jako mediátor v zánětlivém reakci a v obraně proti bakteriálním, virovým a parazitárním infekcím, a navíc má zřejmě protinádorovou aktivitu. TNF se podílí také na různých autoimunitních chorobách. TNF vytvářejí různé typy buněk, např. jsou to makrofágy, fíbroblasty, T-buňky a cytotoxické NK-buňky („natural killer“). TNF se váže na dva různé receptory, z nichž každý působí prostřednictvím odlišných specifických signálních molekul uvnitř buňky, což výsledně vede k odlišným účinkům TNF. TNF existuje jednak ve formě vázané na membránu, ale i jako volný secemovaný cytokin.

LT-α má s TNF mnoho společných aktivit, jako např. vazbu na TNF receptory, ale na rozdíl od TNF je secemován hlavně aktivovanými T-buňkami a některými β-lymfoblastoidními nádory. Heteromemí komplex LT-α a LT-β je komplex vázaný na membránu, kde se váže na LT-β receptory. Systém LT (tj. LT s receptorem LT) se podílí na vývoji periferních lymfoidních orgánů, neboť genetické narušení LT-β vede k poruchám T a B-buněk ve slezině a k nepřítomnosti lymfatických uzlin. Systém LT-β se také podílí na buněčné smrti u některých linií adenokarcinomových buněk.

Fas-L, další člen rodiny TNF, je exprimován přednostně v aktivovaných T-buňkách. Indukuje smrt buněk nesoucích příslušný receptor, nádorových buněk a buněk infikovaných HIV, a sice mechanismem, který je znám jako programovaná buněčná smrt neboli apoptóza. Kromě toho je známo, že nedostatek Fas nebo Fas-L vede k Iymfoproliferativním poruchám, což potvrzuje roli systému Fas v regulaci imunitní odpovědi. Fas systém se také podílí na poškození jater v důsledku chronické infekce virové hepatitidy a na autoimunitní odpovědi u pacientů infikovaných HIV. Systém Fas se také účastní destrukce T-buněk u pacientů infikovaných HfV.

TRAIL, další člen této rodiny, se zřejmě také podílí na smrti mnoha různých transformovaných buněčných linií různorodého původu.

CD40-L, další člen rodiny TNF, je exprimován na povrchu T buněk a indukuje regulaci B buněk nesoucích CD40. Kromě toho je známo, že změny v genu pro CD40-L jsou příčinou nemoci známé jako syndrom hyper-IgM spojený s chromozómem X. Systém CD40 je také spojen s mnoha různými autoimunitními chorobami a CD40-L má také antivirové vlastnosti. Ačkoliv se systém CD40 podílí také na záchraně apoptických B buněk, u jiných buněk než buněk imunitního systému indukuje apoptózu. Mnohé další lymfocytámí členy rodiny TNF se podílejí na kostimulaci.

Obecně lze shrnout, že členy rodiny TNF hrají základní regulační roli v řízení imunitního systému a v aktivaci akutního obranného systému hostitele. Vzhledem k současnému pokroku v ovlivňování členů rodiny TNF s cílem terapeutického prospěchu je pravděpodobné, že členy této rodiny poskytnou jedinečný prostředek kontroly nemocí. Některé ligandy rodiny TNF mohou přím indukovat apoptickou smrt mnohých transformovaných buněk, např. LT, TNF, ligand Fas a TRAIL (Nagata 1997). Fas a zřejmě i TNF a aktivace receptorů CD30 mohou indukovat buněčnou smrt netransformovaných lymfocytů, což může mít důležitou imunoregulační funkci (Amakawa et al., 1996, Nagata 1997, Sytwu et al., 1996, Zheng et al., 1995). Obecně je známo, že odumírání se spustí po agregaci „smrtících“ domén, které jsou na cytoplazmatické straně receptorů TNF. Tyto „smrtící“ domény organizují uspořádání různých složek signální transdukce, což nakonec vede k aktivaci celé kaskády (Nagata 1997). Některé receptory postrádají kanonické „smrtící“ domény, např. receptor LTb a CD30 (Browning et al., 1996, Lee et al., 1996) a přesto mohou indukovat buněčnou smrt, i když podstatně slaběji. Tyto receptory pravděpodobně fungují

-3CZ 297387 B6 primárně tak, že indukují buněčnou diferenciaci a smrt je aberantním důsledkem u některých transformovaných buněčných linií, ačkoliv celý obrázek je dosud nejasný, neboť na základě studie s myšmi „CD30 null“ se předpokládá smrtící role v negativní selekci v brzlíku (Amakawa et al., 1996). Naproti tomu, přenos signálů jinými drahami, jako např. právě prostřednictvím CD40, je vyžadován pro udržování a přežívání buněk. Z výše uvedeného vyplývá tedy potřeba charakterizovat další členy rodiny TNF a poskytnout tak další prostředky ke kontrole nemocí a ovlivňování imunitního systému.

Podstata vynálezu

Předkládaný vynález se týká polypeptidů, a sice ligandu příbuzného nádorovému nekrotickému faktoru, zvaného TRELL, a tento vynález řeší řadu problémů a omezení a eliminuje nevýhody dosavadních řešení v oboru známých. Původce objevil nového člena rodiny TNF cytokinů a určil sekvenci aminokyselin jak myšího, tak i lidského proteinu, včetně příslušných sekvencí DNA kódujících tyto proteiny. Vynález je možné využít pro identifikaci přípravků pro diagnózu a léčení mnohých nemocí a stavů, což je dále podrobněji popsáno, a také k získání dalších informací o imunitním systému, a pro vlastní ovlivňování imunitního systému a imunitních procesů. Kromě toho se předkládaný vynález také týká indukce buněčné smrti při karcinomu.

Další vlastnosti a výhody předkládaného vynálezu budou popsány v následujícím popisu, přitom částečně z popisu vyplynou a částečně je bude možno rozpoznat při využití vynálezu. Cíl vynálezu a jeho výhody lze dosáhnout pomocí přípravků a způsobů, které jsou zvláště zdůrazněny v popisu a v nárocích, a také v průvodních obrázcích.

V souladu s cílem vynálezu, aby bylo dosaženo výhod vynálezu, jak je v popisu a příkladech provedení vynálezu uvedeno, vynález se týká sekvence DNA kódující TRELL. Nukleotidová sekvence myšího TRELL (mTRELL) je zde uvedena jako sekvence s identifikačním číslem 1 (id. č. 1) a sekvence lidského TRELL (hTRELL) je zde uvedena jako sekvence id. č. 3. Vynález se specificky týká sekvence DNA, která kóduje TRELL, který má sekvenci aminokyselin uvedenou zde jako sekvenci id. č. 2 (mTRELL) nebo 4 (hTRELL). Další provedení vynálezu se týká sekvence, která má alespoň 50% homologii se sekvencí DNA kódující vazebnou doménu pro receptor na 5'-konci TRELL, a přitom hybridizuje se sekvencí podle vynálezu nebo jejím fragmentem, a která kóduje TRELL, který má sekvenci uvedenou zde jako sekvenci id. č. 4 nebo id. č. 2.

Některá provedení vynálezu se týkají sekvence DNA kódující TRELL, kde sekvence je operativně spojena se sekvencí, která řídí expresi. Pro použití ve vynálezu je vhodná jakákoliv sekvence pro řízení exprese a vhodná sekvence může být odborníkem snadno vybrána.

Předkládaný vynález se dále týká rekombinantní DNA, která obsahuje sekvencí DNA kódující TRELL nebo její fragment, a také hostitelů, kteří mají trvale integrovanou sekvenci TRELL v genomu nebo v podobě episomálního elementu. Podle vynálezu je možné užít jakéhokoliv vhodného hostitele, který může být vybrán odborníkem bez vynaložení nadměrného úsilí.

Další provedení předkládaného vynálezu se týká způsobu přípravy v podstatě čistého TRELL, který obsahuje kroky, kdy se kultivuje transformovaný hostitel a dále se týká TRELL prostého všech živočišných proteinů, které jsou s ním normálně asociovány.

Vynález zahrnuje TRELL, který má aminokyselinovou sekvenci uvedenou zde jako sekvenci id. č. 4 nebo sekvenci id. č. 2, nebo jeho fragmenty či homology. V různých provedeních vynálezu sekvence aminokyselin nebo sekvence DNA TRELL mohou obsahovat konzervativní inzerce, delece a substituce, jak bude ukázáno dále nebo mohou obsahovat fragmenty zmíněných sekvencí.

-4CZ 297387 B6

Jiné provedení předkládaného vynálezu se týká rozpustného konstruktu TRELL, který je možné použít pro přímé spuštění farmakologické události zprostředkované TRELL. Taková událost může mít terapeutický účinek v léčení rakoviny nebo v manipulaci s imunitním systémem pro léčení imunologických onemocnění. Rozpustné formy TRELL mohou být metodami genového 5 inženýrství upraveny tak, aby obsahovaly snadno rozpoznatelnou značku, a tím umožnily identifikaci receptorů TRELL.

Další provedení předkládaného vynálezu se týká použití TRELL pro genovou terapii.

Farmaceutický přípravek podle předkládaného vynálezu může volitelně obsahovat také farmaceuticky přijatelný nosič, adjuvans, plnidlo nebo jiné farmaceutické přípravky, a může být podáván jakýmkoliv způsobem známým v oboru.

Jak předcházející stručný přehled tak i následující podrobný popis vynálezu je třeba považovat za 15 vysvětlení vynálezu a za příklady, které slouží k podrobnějšímu vysvětlení předkládaného vynálezu.

Taktéž obrázky slouží k lepšímu porozumění vynálezu a tvoří součást popisu vynálezu, jsou určeny k tomu, aby ilustrovaly některá provedení vynálezu a společně s popisem sloužily 20 k vysvětlení principu předkládaného vynálezu.

Popis obrázků

Obr. 1 ukazuje srovnávací analýzu aminokyselinových sekvencí lidského a myšího TRELL.

Obr. 2A a 2B ukazují srovnávací analýzu aminokyselinových sekvencí lidských členů rodiny TNF.

Obr. 3 ukazuje výsledek „northemové“ analýzy exprese mRNA TRELL v různých liniích myších buněk a tkáních. Dráhy jsou v duplikátech a obsahují RNA z 1) peritoneálních makrofágů indukovaných thioglykolátem 2) kostní dřeně 3) sleziny a 4) jater.

Obr. 4 je výsledek „northemové“ analýzy exprese mRNA TRELL v různých lidských tkáních.

Obr. 5. je výsledek SDS-PAGE elektroforézy rekombinantního TNF, LT-α a TRELL v redukujících a neredukujících podmínkách.

Obr. 6 ukazuje, že TRELL je cytotoxický pro buňky lidského adenokarcinomu HT29.

A. Schopnost TNF, TRELL, LTa/β a anti-Fas blokovat růst buněk linie HT29 v přítomnosti lidského interferonu-α. Buňky byly kultivovány 4 dny v přítomnosti různých činidel a růst byl hodnocen pomocí barvení MTT.

B. Morfologie buněk, u kterých probíhá proces buněčné smrti. Buňky byly předpěstovány 2 dny a pak po 24 hodin podrobeny působení 80 U/ml interferonu-g, a to buďto bez dalšího ošetření (A) nebo po fixaci etanolem lOOng/ml (B). Horní panely ukazují buňky ve fázovém kontrastním mikroskopu (zvětšení 400x), dolní panely buňky ošetřené barvivém Hoechst 1 pg/ml pro zvýraznění jader. Šipky ukazují typické buňky s kondenzovaným jádrem, které je charakteristické pro apoptózu.

-5CZ 297387 B6

Podrobný popis vynálezu

Popis se bude týkat především podrobností výhodného provedení předkládaného vynálezu. Předkládaný vynález se týká sekvencí DNA, které kódují lidský nebo myší TRELL, jeho fragmenty nebo homology, a dále se týká exprese těchto DNA v hostitelích těmito DNA transformovanými. Kromě toho se vynález týká jak lidské tak myší aminokyselinové sekvence TRELL, nebo jeho fragmentů či homologů, a dále se týká farmaceutického přípravku obsahujícího tyto sekvence nebo z těchto sekvencí odvozeného.

A. Definice

Termín „homologní“ v tomto textu popisuje podobnost mezi sekvencemi srovnávaných molekul. Pokud je jistá pozice v obou srovnávaných sekvencích obsazena shodnou monomemí jednotkou, tj. bází nebo aminokyselinou, např. je-li stejná pozice v každé ze dvou molekul DNA obsazena adeninem, pak tyto molekuly jsou homologní v dané pozici.

Homologie mezi dvěma sekvencemi vyjádřená v procentech je funkce počtu shodných čili homologních pozic, které jsou sdíleny oběma sekvencemi, dělená počtem všech srovnávaných pozic a vynásobená 100. Tak např. jestliže u dvou sekvencí je 6 pozic z 10 shodných neboli homologních, pak tyto sekvence mají 60% homologii. Nebo např. dvě sekvence ATTGCC a TATGGC sdílejí 50% homologii. Obecně se provádí takové srovnání, kdy sekvence jsou k sobě navzájem „přiloženy“ tak, aby homologie byla maximální.

Termíny „purifikovaný preparát“ nebo „v podstatě čistý preparát“ polypeptidu slouží k označení polypeptidu, který byl oddělen od ostatních proteinů, lipidů a nukleových kyselin, se kterými se společně přirozeně vyskytuje. Výhodně je polypeptid oddělen také od jiných látek jako např. protilátek nebo matrix; které byly použity pro čištění.

Termín „transformovaný hostitel“ zahrnuje jakéhokoliv hostitele se sekvencí, tj. sekvencí TRELL, trvale integrovanou do genomu, nebo hostitele, který má sekvenci, tj. sekvenci TRELL, kódovanou episomálními elementy.

Termín „ošetření“ se zde užívá pro jakékoliv terapeutické ošetření, např. podávání terapeutického agens nebo látky, např. léku.

Termín „v podstatě čistá nukleová kyselina“, např. v podstatě čistá DNA, znamená nukleovou kyselinu, která 1) není bezprostředně spojena s jednou nebo dvěma sekvencemi (jedna na 5'-konci a jedna na 3-konci), např. kódujícími sekvencemi, se kterými sousedí v přirozeně se vyskytujícím genomu příslušného organismu, ze kterého je nukleová kyselina připravena, nebo 2) je v podstatě bez sekvencí nukleových kyselin, které se vyskytují v organismu, ze kterého je uvedená nukleová kyselina připravena, nebo platí současně obě možnosti. Tento termín zahrnuje např. rekombinantní DNA vloženou do vektoru, např. do autonomně se replikujícího plazmidů nebo viru, nebo do genomové DNA prokaryotického nebo eukaryotického organismu, nebo která existuje jako samostatná molekula, např. cDNA nebo fragment genové DNA vytvořený pomocí PCR nebo působením restrikčních endonukleáz, nezávislá na jiných sekvencích DNA. V podstatě čistá DNA také zahrnuje rekombinantní DNA, která je součástí hybridního genu kódujícího TRELL.

Termíny „peptidy“, „proteiny“ a „polypeptidy“ popisují totéž a jsou užívány navzájem zaměnitelným způsobem.

Termín „biologicky aktivní“ je používán ve smyslu mít aktivitu, buďto in vitro nebo in vivo, která se přímo nebo nepřímo projevuje. Tak např. biologicky aktivní fragment TRELL může mít např. 70% homologii aminokyselinové sekvence s aktivním místem TRELL, výhodněji alespoň 80% homologii a nejvýhodněji alespoň 90% homologii. Identita nebo homologie vzhledem k TRELL

-6CZ 297387 B6 je definována jako procenta aminokyselinových zbytků v příslušné sekvenci, které jsou identické s aminokyselinovými zbytky sekvencí TRELL uvedenými zde jako sekvence id. č. 2 a 4.

Provedení předkládaného vynálezu vyžaduje, pokud není uvedeno jinak, použití technik obvyklých v buněčné biologii, buněčných a tkáňových kulturách, molekulární biologii, transgenní biologii, mikrobiologii, techniku rekombinantní DNA a imunologické metody, které jsou v oboru známé. Takové techniky jsou popsány v příslušné odborné literatuře.

B. Sekvence DNA podle vynálezu

Jedním aspektem předkládaného vynálezu je v podstatě čistá (nebo rekombinantní) nukleová kyselina, která obsahuje nukleotidovou sekvencí kódující polypeptid TRELL, jako je např. sekvence uvedená zde jako sekvence id. č. 1 nebo 3 a/nebo ekvivalenty takových nukleových kyselin. Termín „nukleová kyselina“ zahrnuje také fragmenty nebo ekvivalenty, jako jsou např. sekvence kódující funkčně ekvivalentní polypeptidy. Ekvivalentní nukleotidové sekvence mohou obsahovat sekvence, které se liší jednou nebo několika nukleotidovými substitucemi, adicemi nebo delecemi, jako jsou např. alelické varianty, mutace atd., a mohou také obsahovat nukleotidové sekvence, které se liší od sekvencí kódujících TRELL uvedených zde jako sekvence id. č. 1 nebo 3, díky degeneraci genetického kódu. Původce sekvencoval lidskou DNA velikosti 1936 bp, která obsahuje otevřený čtecí rámec kódující polypeptid TRELL, který obsahuje 248 aminokyselin, jak je zde uvedeno v sekvenci id. č. 4.

Ve vynálezu jsou popsány jak lidské tak i myši sekvence, přičemž popis vynálezu se obecně týká lidských sekvencí, ale odborníkovi je zřejmé, že totéž se obdobně týká myších sekvencí. Pozoruhodným rysem TRELL je rozsah shody sekvence (konzervativnost sekvence) domény vážící receptor mezi člověkem a myší. Pouze ligand Fas se blíží obdobné míře. Jak myší tak lidský protein TRELL mají všechny charakteristické vlastnosti členů rodiny TNF, tj. organizací membránového proteinu typu II a konzervované sekvenční motivy důležité pro prostorové uspořádání proteinu do struktury antiparalelního β—listu charakteristické pro TNF.

Nukleotidová sekvence mTRELL je v této přihlášce uvedena jako sekvence id. č. 1, sekvence aminokyselin mTRELL je sekvence id. č. 2. Sekvence DNA a sekvence aminokyselin hTRELL jsou zde uvedeny jako sekvence id. č. 3 a 4.

Sekvence podle předkládaného vynálezu se mohou použít pro přípravu série DNA sond, které jsou vhodné pro testování různých sad přirozených nebo syntetických DNA, zda tyto sekvence kódují TRELL nebo jeho fragmenty nebo deriváty. Odborníkovi je zřejmé, že termín TRELL se zde užívá v takovém smyslu, že zahrnuje i biologicky aktivní deriváty, fragmenty a homology TRELL.

Sekvence kódující TRELL podle předkládaného vynálezu se může využít pro expresi peptidů TRELL v různých prokaiyotických nebo eukaryotických hostitelích transformovaných takovými sekvencemi. Peptidy TRELL se mohou použít jako protirakovinná nebo imunoregulační agens. Obecně to znamená, že jedním z kroků aplikace je kultivovat hostitele transformované molekulou DNA obsahující kódující sekvenci TRELL, operativně spojenou se sekvencí řídící expresi.

Sekvence DNA a rekombinantní molekuly DNA podle předkládaného vynálezu mohou být exprimovány pomocí širokého spektra kombinací hostitel/vektor. Tak např. vhodné vektory mohou obsahovat segmenty chromozómových, jiných než chromozómových, nebo syntetických sekvencí DNA. Expresní vektory podle vynálezu obsahují alespoň jednu sekvenci pro řízení exprese, která je operativně spojena se sekvencí kódující TRELL vloženou do vektoru, aby bylo možné regulovat či řídit expresi sekvence DNA.

V rámci každého expresního vektoru se mohou vybrat různá místa pro vložení sekvence TRELL podle předkládaného vynálezu. Místa jsou většinou navržena podle restrikčních endonukleáz,

-7CZ 297387 B6 které v příslušném místě štěpí, a tato místa i endonukleázy jsou odborníkovi dobře známy. Odborníkovi je také zřejmé, že vektor pro použití podle předkládaného vynálezu nemusí obsahovat místa pro restrikční endonukleázy pro vložení požadovaného fragmentu DNA, místo toho může být fragment klonován do vektoru alternativním způsobem. Výběr expresního vektoru a zvláště míst vhodných pro vložení vybraného fragmentu DNA a jeho spojení se sekvencí řídicí expresi, závisí na mnoha faktorech. K těmto faktorům patří např. velikost proteinu, který má být exprimován, citlivost tohoto proteinu k proteolytické degradaci enzymu hostitelské buňky, počet míst pro příslušný restrikční enzym, kontaminace nebo vazba exprimovaného proteinu proteiny hostitelské buňky, které jsou těžko odstranitelné v průběhu purifikace apod. Další faktory, které je třeba vzít v úvahu, jsou expresní charakteristiky jako je např. poloha startovacího a ukončovacího kodonů vzhledem k sekvencím vektoru, a další faktory, které jsou odborníkovi zřejmé. Výběr vektoru a vhodných míst pro vložení sekvence DNA podle předkládaného vynálezu je tedy výsledkem zvážení všech těchto faktorů, přičemž ne všechna řešení jsou stejně účinná pro požadované aplikace. Ale pro odborníka je analýza všech těchto faktorů rutinní záležitostí a výběr vhodného systému pak závisí především na konkrétním použití.

Odborník je snadno schopen vhodně modifikovat sekvence řídící expresi tak, aby se získal vyšší úroveň proteinové exprese, např. substitucí kodonů nebo výběrem kodonů určitých zvláštních aminokyselin, které jsou přednostně užívány konkrétním organismem, s cílem zmenšit proteolýzu nebo změnit vzorec glykosylace. Podobně mohou být nahrazeny cysteinové zbytky jinými aminokyselinami, aby se usnadnila produkce nebo uspořádání proteinu, nebo aby se předešlo problémům se stabilitou.

Ne všechny kombinace hostitele a expresního vektoru fungují se stejnou účinností co se týče exprese sekvence DNA podle předkládaného vynálezu. Avšak výběr konkrétní vhodné kombinace hostitele a expresního vektoru může být odborníkem proveden. K faktorům, které je třeba vzít v úvahu, patří např. kompatibilita hostitele a vektoru, toxicita proteinů kódovaných sekvencemi DNA vektoru pro hostitele, snadnost izolace požadovaného proteinu, expresní charakteristiky sekvencí DNA a sekvencí řídících expresi s nimi operativně spojených, biologická bezpečnost, potřeba energie na uspořádání struktury proteinu, forma proteinu a případně poexpresní modifikace požadovaného proteinu.

TRELL a jeho homology, produkované hostiteli transformovanými sekvencemi DNA podle předkládaného vynálezu, stejně jako nativní TRELL purifíkovaný způsobem podle vynálezu, nebo vytvořený na základě aminokyselinové sekvence podle vynálezu, jsou užitečné pro řadu aplikací protinádorových a imunoregulačních. Jsou také užitečné v terapii a způsobech týkajících se i jiných nemocí.

Předkládaný vynález se také týká použití sekvencí DNA podle vynálezu pro expresi TRELL ve zvláštních podmínkách, tj. při genové terapii. TRELL může být exprimován v nádorových buňkách, kde by exprese byla řízena promotory vhodnými pro tento účel. Taková exprese může posílit protinádorovou imunitní odpověď nebo přímo ovlivnit přežívání nádoru. Takové cytokiny jako TRELL mohou také ovlivnit přežívání orgánových štěpů tím, že změní lokální imunitní odpověď. V takovém případě by byl sám štěp nebo buňky, které ho obklopují, ovlivněn genem TRELL upraveným metodami genového inženýrství.

Dalším aspektem předkládaného vynálezu je použití izolované nukleové kyseliny kódující TRELL pro tzv. „antisense“ terapii. Termín „antisense“ terapie se týká podání nebo in šitu vytvoření oligonukleotidů nebo jejich derivátů, které specificky hybridizují (váží se) v normálních buněčných podmínkách s buněčnou mRNA a/nebo DNA kódující TRELL, a tak inhibují expresi kódovaného proteinu tím, že inhibují transkripci a/nebo translaci. Zmíněná vazba může být konvenční komplementarita párů bází nebo např. v případě vazby na duplexy DNA, vazba prostřednictvím specifických interakcí v hlavním (velkém) zářezu dvoušroubovicové DNA. Obecně se „antisense“ terapie týká celé řady technik v oboru užívaných a patří sem v podstatě jakákoliv terapie založená na specifické vazbě oligonukleotidové sekvence.

-8CZ 297387 B6

Antisense konstrukt podle předkládaného vynálezu je např. expresní plazmid, který při transkripci v buňce, produkuje RNA, která je komplementární (tj. má opačnou, tedy „antisense“ orientaci) k buněčné mRNA kódující TRELL. Alternativně může být „antisense“ konstrukt také oligonukleotidová sonda připravená ex vivo. Takové oligonukleotidové sondy jsou výhodně modifikované oligonukleotidy, které jsou rezistentní k endogenním nukleázám a jsou proto stabilní in vivo. Příkladem takových molekul nukleových kyselin vhodných jako „antisense“ oligonukleotidy jsou fosfoamidátové, fosfothioátové a methylfosfonátové analogy DNA (viz patentové přihlášky USA č. 5 176 996, 5 264 564 a 5 256 775). Kromě toho obecný postup jak konstruovat oligomery vhodné pro „antisense“ terapii byly přehledně publikovány např. Van Der Krol et al., 1988, Biotechniques 6: 958-976 a Stein et al., 1988, Cancer Res. 48: 2659-2668, na což se tímto odkazujeme.

C. TRELL a jeho aminokyselinová sekvence

Protein TRELL, tj. protein příbuzný nádorovému nekrotickému faktoru (TNF), podle předkládaného vynálezu patří do rodiny proteinů TNF. Tento protein sám, nebo jeho fragmenty či homology, má široké možnosti terapeutického a diagnostického použití.

TRELL se vyskytuje v mnoha tkáních, ale vzorec vyskytuje zpravidla jedinečný pro členy rodiny TNF. Jelikož se členy rodiny TNF podílejí na regulaci buněčné smrti a přežívání, a na buněčné diferenciaci, je i možné, že TRELL se také podílí na přežívání buněk, diferenciaci a reparaci buněk v různých tkáních.

I když dosud není známa přesná trojrozměrná struktura TRELL, na základě příslušnosti k rodině TNF lze předpovědět, že TRELL sdílí určité strukturní rysy s ostatními členy této rodiny. V přihlášce jsou popsány jak myši tak i lidský TRELL. Myší TRELL, jak lze dedukovat z existující sekvence cDNA, obsahuje úsek alespoň 21 hydrofobních aminokyselin, který pravděpodobně u membránových proteinů typu II působí jako doména ukotvující protein v membráně. Aminokyselinová sekvence mTRELL je zde uvedena jako sekvence id. č. 2.

Lidský TRELL obsahuje na N-konci hydrofílní cytoplazmatickou doménu, hydrofobní zhruba v rozsahu 27 aminokyselin, transmembránovou doménu typu II a extracelulámí doménu z 204 aminokyselin. Aminokyselinová sekvence hTRELL je zde uvedena jako sekvence id. č. 4.

Obr. 1 představuje srovnání aminokyselinových sekvencí lidského a myšího TRELL.

Zatímco 52 aminokyselin N-koncového úseku je možné předpovědět na základě otevřeného čtecího rámce z klonu cDNA, přesná poloha počátečního methioninu nemohla být určena. Met-36 (methionin v poloze 36) poskytuje přiměřenou konsenzuální Kozákovu sekvenci, takže je to pravděpodobně vhodný počáteční kodon. Srovnání sekvence TRELL s ostatními členy lidské rodiny TNF ukazuje značenou strukturní podobnost. Tak např. jak je patrno z obr. 2A a 2B, všechny proteiny připomínají membránové proteiny typu II a sdílejí několik úseků konzervovaných sekvencí extracelulámí domény. Na obrázcích úseky s čárkami nad sekvencemi ukazují ty sekvence TNF a LTa, které vytvářejí strukturu β—listu v dané molekule. Předpokládaná místa Nglykosylace jsou podtržena. Hvězdičky označují cysteinové zbytky vytvářející disulfidové vazby v molekule TNF. Konzervativní domény se pravděpodobně podílejí na interakcích podjednotek a na vytváření struktury listu.

Prohledávání databáze EST klonů vedlo k objevení lidského klonu o velikosti 345 bp, který je silně homologní s myším TRELL. Lidská aminokyselinová sekvence TRELL je zde uvedena jako sekvence id. ě. 4. Otevřené čtecí rámce zmíněného EST klonu neobsahují sekvenční motivy, které by umožnily charakterizovat sekvenci jakožto člena rodiny TNF nebo příslušného ligandů (tj. motivy, které užili Wiley et al. pro identifikaci EST klonu pro TRAIL v dostupné databázi).

-9CZ 297387 B6

Nový polypeptid podle předkládaného vynálezu specificky reaguje s receptorem, kteiý dosud nebyl identifikován. Avšak peptidy a způsoby podle předkládaného vynálezu umožňují identifikovat receptory, které specificky reagují s TRELL nebo jeho fragmenty.

Určitá provedení podle předkládaného vynálezu zahrnují peptidy odvozené z TRELL, které mají schopnost vázat se na receptory pro TRELL. Fragmenty TRELL je možné připravit různými způsoby, např. rekombinantní technologií, pomocí PCR, proteolytickým štěpením nebo chemickou syntézou. Vnitřní nebo koncové fragmenty polypeptidů se mohou připravit odstraněním jednoho nebo několika nukleotidů z jednoho nebo zobou konců nukleové kyseliny, která kóduje polypeptid. Fragmenty polypeptidů lze také připravit expresí mutované DNA. Pomocí štěpení endonukleázou, která „ukusuje konce“ DNA, je možné připravit celou řadu fragmentů. DNA, která kóduje fragmenty proteinu, se může také připravit náhodným „rozstříháním“ řetězců DNA, nebo restrikčním štěpením anebo kombinací metod výše uvedených.

Polypeptidové fragmenty se mohou také chemicky syntetizovat pomocí konvenční techniky známé jako syntéza na pevné fázi užívající f-moc nebo t-boc (Merriffield). Tak např. peptidy a sekvence DNA podle předkládaného vynálezu je možné v podstatě libovolně rozdělit na fragmenty požadované délky, které se nepřekrývají, nebo na překrývající se fragmenty požadované délky. Příslušné metody jsou popsány v následujícím textu.

D. Příprava rozpustného TRELL

Rozpustné formy ligandu jsou často velmi účinné v přenosu signálu a mohou tudíž být podávány jako lék, který napodobuje přirozenou membránovou formu. Je možné, že TRELL je přirozeně secemován jako rozpustný cytokin, ale pokud tomu tak není, je možné uzpůsobit gen metodami genového inženýrství tak, aby se zesílila sekrece. Pro přípravu rozpustné secemované formy TRELL by bylo třeba odstranit na úrovni DNA N-koncový transmembránový úsek a některé úseky „stonku“, a nahradit je vedoucí sekvencí typu I nebo typu II, která umožní účinné proteolytické štěpení v příslušném hostitelském systému. Odborník je schopen optimalizovat vazebné vlastnosti k receptoru a sekreční účinnost tím, že lze měnit rozsah „stonkových“ úseků ponechaných v expresním konstruktu. Tak např. lze připravit odštěpováním zN-konce konstrukty obsahující všechny možné délky „stonku“, takže vzniknou proteiny, které budou začínat aminokyselinou 81 až 139. Tímto typem analýzy lze stanovit optimální délku sekvence „stonku“.

E. Příprava protilátek reaktivních s TRELL

Předkládaný vynález se také týká protilátek specificky reagujících s TRELL nebo jeho receptorem. Antiséra anti-protein/anti-peptid nebo monoklonální protilátky mohou být připraveny standardními způsoby (viz např. Antibodies: A Laboratory Manual, Harlow and Lané (eds.), Cold Spring Harbor press, 1988). Savci jako např. myš, křeček nebo králík, se mohou imunizovat imunogenní formou peptidu. Způsoby, jak učinit protein nebo peptid imunogenním tím, že se např. konjuguje s nosičem, nebo jiné způsoby, jsou v oboru známy.

Imunogenní část TRELL nebo jeho receptoru může být podána společně s adjuvans. Postup imunizace je možné monitorovat pomocí detekce titru protilátek v plazmě nebo séru. Standardní test ELISA nebo jiné imunotesty se mohou použít s imunogenem coby antigenem k ohodnocení hladin protilátek.

Ve výhodném provedení předkládaného vynálezu jsou protilátky imunospecifícké nebo antigenní determinanty TRELL nebo jeho receptoru, tj. antigenní determinanty polypeptidů sekvence id. č. 2 nebo 4, nebo blízce příbuzný lidský nebo savčí, jiný než lidský, homolog (s homologií 70, 80 nebo 90%, nejvýhodněji s homologií alespoň 95 %). V dalším výhodném provedení předkládaného vynálezu protilátky anti-TRELL nebo anti-receptor TRELL v podstatě křížově nereagují (tj. reagují pouze specificky) s proteinem, který je např. méně než z 80 % homologní se sekvencí id. č. 2 nebo i. č. 4, výhodně méně než z 90 % a nejvýhodněji méně než z 95 % homologní se

-10CZ 297387 B6 sekvencí id. č. 2 nebo id. č. 4. Tím, že „v podstatě křížově nereagují“ se míní to, že protilátka má vazebnou afinitu k nehomolognímu proteinu menší než 10 % vazebné afinity k proteinu sekvence id. č. 2 nebo id. č. 4.

Termín „protilátka“ se v tomto textu užívá tak, že zahrnuje i fragmenty protilátky, které také specificky reagují s TRELL nebo receptorem TRELL. Protilátky lze fragmentovat pomocí obvyklých způsobů, které jsou v oboru známy, a možnosti využití fragmentů lze pak testovat stejnými způsoby jak bylo popsáno pro celé protilátky. Tak např. fragment F(ab')₂ je možné připravit působením pepsinu. Výsledný fragment se pak může ošetřit tak, aby se redukovaly disulfídové ío můstky, čímž vznikne fragment Fab'. Protilátky podle předkládaného vynálezu jsou dále tvořeny podle biospecifíckými a chimérickými molekulami, které mají aktivitu namířenou proti TRELL nebo proti receptoru TRELL. Takže pro blokování TRELL nebo jeho receptoru je možné využít jak monoklonálních tak polyklonálních protilátek namířených proti TRELL a receptoru TRELL, a také příslušné fragmenty jako např. Fab' nebo F(ab')₂.

Různé formy protilátek je možné připravit standardními technikami rekombinantní DNA (Winter a Milstein, Nátuře 349: 239-299, 1991). Např. je možné konstruovat takové chimérické protilátky, kde vazebná doména pro antigen z protilátky zvířete je spojena s lidskou konstantní doménou (Cabilly et al., patentová přihláška USA č. 4 816 567). Chimérické protilátky redukují pozo20 rovanou imunitní odpověď vyvolanou zvířecími protilátkami, když jsou použity v klinických aplikacích pro lidské pacienty.

Kromě toho se mohou syntetizovat rekombinantní „humanizované“ protilátky, rozpoznávající TRELL nebo jeho receptor. Humanizované protilátky jsou chimérické protilátky, které obsahují 25 většinou sekvence lidského IgG, do nichž byly vloženy sekvence zodpovědné za specifickou vazbu k antigenu. Zvířata se imunizují požadovaným antigenem, pak se izoluje příslušná protilátka a odstraní se z ní část variabilního úseku zodpovědná za specifickou vazbu antigenu. Usek vážící antigen ze zvířete se pak klonuje do vhodného místa genu lidské protilátky, ze kterého byl odstraněn úsek vážící antigen. Humanizované protilátky minimalizují použití heterologních (tj. 30 mezidruhových) sekvencí v lidských protilátkách, které pak s menší pravděpodobností vyvolají imunitní odpověď u ošetřovaného pacienta.

Různé třídy rekombinantních protilátek se mohou vytvářet také tak, že se připraví chimérické nebo humanizované protilátky obsahující variabilní domény a lidské konstantní domény (CH1, 35 CH2 a CH3) izolované z různých tříd imunoglobulinů. Tak např. se mohou připravit rekombinantním způsobem protilátky se zvýšenou valencí vazebných míst pro antigen, a to tak, že se klonuje vazebné místo pro antigen do vektoru nesoucího konstantní úsek řetězce lidské protilátky (Arulandam et al., J. Exp. Med. 177: 1439-1450, 1993). Kromě toho lze použít standardní techniky rekombinantní DNA pro změnu vazebné afinity rekombinantních protilátek s jejich antigeny 40 tím, že se změní zbytky aminokyselin v blízkosti vazebného místa pro antigen. Vazebná afinita pro antigen u humanizované protilátky se může zvýšit mutagenezí založenou na molekulovém modelování (Quenn et al., Proč. Nati. Acad. Sci. USA 86: 10029-33, 1989).

F. Vytváření analogů a příprava změněných sekvencí DNA a peptidů

Analogy TRELL se mohou lišit od přirozeně se vyskytujícího TRELL v sekvenci aminokyselin, nebo jinak než v sekvenci aminokyselin, nebo oběma způsoby. Jiné modifikace než modifikace sekvence jsou jak in vitro tak in vivo chemické derivatizace TRELL. K těmto nesekvenčním modifikacím patří (nejen) změny v acetylaci, metylaci, fosforylaci, karboxylaci nebo glykosylaci.

K výhodným analogům TRELL patří TRELL nebo jeho biologicky aktivní fragmenty, jejichž sekvence se liší od sekvencí uvedených zde jako sekvence id. č. 2 a id. č. 4 jednou nebo několika konzervativními substitucemi aminokyselin nebo jednou nebo několika substitucemi, delecemi nebo inzercemi aminokyselin, které sice nejsou konzervativní, ale nenarušují aktivitu TRELL. Ke 55 konzervativním substitucím typicky patří substituce jedné aminokyseliny jinou aminokyselinou

-11 CZ 297387 B6 s podobnými vlastnostmi, např. substituce v rámci následujících skupin: valin - glycin, glycin alanin, valin - izoleucin - leucin, kyselina aspartová - kyselina glutamová, asparagin - glutamin, serin - threonin, lysin - arginin a fenylalanin - tyrosin.

Konzervativní záměny aminokyselin jsou přehledně uvedeny v tab. 1.

Tabulka 1 io Konzervativní záměny aminokyselin

Aminokyselinu	Kód	Nahraď jakoukoliv z následujících
Alanin	A	D-Ala, Gly, Beta-Ala, L-Cys, D-Cys
Arginin	R	D-Arg, Lys, D-Lys, homo-Arg, D-homo-Arg, Met, Ile, D-Met, D-Ile, Orn, D-Orn
Asparagin	N	D-Asn, Asp, D-Asp, Glu, D-Glu, Gin, D-Gln
Kyselina aspartová	D	D-Asp, D-Asn, Asn, Glu, D-Glu, Gin, D-Gln
Cystein	C	D-Cys, S-Me-Cys, Met, D-Met, Thr, D-Thr
Glutamin	Q	D-Gln, Asn, D-Asn, Glu, D-Glu, Asp, D-Asp,
Kyselina glutamová	E	D-Glu, D-Asp, Asp, Asn, D-Asn, Gin, D-Gln
Glycin	G	Ala, D-Ala, Pro, D-Pro,-Ala, Asp
isoleucin	I	D-Ile, Val, D-Val, Leu, D-Leu, Met, D-Met
Leucin	L	D-Leu, Val, D-Val, Leu, D-Leu, Met, D-Met

- 12CZ 297387 B6

Tabulka pokračování

Aminokyselinu	Kód	Nahraď jakoukoliv z následujících
Lysin	K	D-Lys, Arg, D-Arg, Homo-Arg, D-Homo-Arg, Met, D-Met, Ile, D-Ile, Orn, D-Orn
Methionin	M	D-Met, S-Me-Cys, Ile, D-Ile, Leu, D-Leu, Val, D-Val
Fenylalanin	F	D-Phe, Tyr, D-Thr, L-Dopa, His, D-His Trp, D-Trp, Trans-3,4 nebo 5-fenylprolin, cis-3,4 nebo 5-fenylprolin
Prolin	P	D-Pro, L-l-thioazolidin-4-karboxylová kyselina, D- nebo L-l-oxazolidin-4karboxylová kyselina
Serin	s	D-Ser, Thr, D-Thr, allo-Thr, Met, D-Met, Met(O), D-Met(0), L-Cys, D-Cys
Threonin	T	D-Thr, Ser, D-Ser, allo-Thr, Met, D-Met, Met(O), D-Met(0), Val, D-Val
Tyrosin	Y	D-Tyr, Phe, D-Phe, L-Dopa, His, D-His
Valin	v	D-Val, Leu, D-Leu, Ile, D-Ile, Met, D-Met

Vhodnými způsoby mutageneze je mutageneze pomocí pCR a saturační mutageneze, které budou popsány v následující části. Také je možné vytvořit knihovnu variant náhodných sekvencí aminokyselin pomocí syntézy sady degenerovaných oligonukleotidových sekvencí.

Mutageneze pomocí PCR

Při mutagenezi pomocí PCR se využívá relativně malá přesnost Taq polymerázy k zavedení náhodných mutací do klonovaného fragmentu DNA (Leung et al., Techniques 1: 11-15, 1989). Je to velmi účinná a přitom velmi rychlá metoda pro vnesení náhodných mutací. Úsek DNA, který má být mutován, se amplifikuje pomocí polymerázové řetězové reakce (PCR) v podmínkách, které snižují přesnost Taq polymerázy, tj. jestliže je poměr dGTP/dATP přibližně roven 5 a přidá se Mn²⁺ do reakční směsi pro PCR. Celá sada amplifikovaných fragmentů se pak klonuje do vhodných vektorů a vytvoří se tak knihovna náhodných mutantů.

Saturační mutageneze

Saturační mutageneze dovoluje rychlé vnesení mutací typu substituce jedné báze do klonovaného fragmentu DNA (Mayers et al., Science 229:242, 1985). Tato technika zahrnuje generaci mutací, tj. chemické ošetření nebo ozáření jednořetězcové DNA in vitro, a pak syntézu komplementárního řetězce DNA. Frekvence mutací může být ovlivněna silou působícího účinku a v podstatě lze dosáhnout substituce všech možných bází. Jelikož celý tento proces nezahrnuje žádnou gene- 13 CZ 297387 B6 tickou selekci mutovaných fragmentů, získají se tak fragmenty jak s neutrálními substitucemi, tak náhodně mutované fragmenty DNA, ze kterých se mohou připravit proteiny se změněnou funkcí.

Distribuce bodových mutací není přitom nijak směrována na konzervativní sekvenční prvky.

Mutageneze pomocí degenerovaných oligonukleotidů

Knihovnu homologů je možné připravit pomocí sady degenerovaných oligonukleotidů. Chemická syntéza degenerovaných sekvencí se může provést na automatickém syntetizátoru DNA, a syntetické geny se pak vloží (ligují) do vhodného expresního vektoru. Syntéza degenerovaných oligonukleotidů je způsob v oboru dobře známý (31) a tento způsob byl již využit pro cílený vývoj jiných proteinů (32).

Způsob cílené nebo nenáhodné mutageneze se může využít pro přípravu specifických sekvencí nebo mutací v určitých specifických úsecích. Tento způsob se může využít pro vytvoření variant, které obsahují delece, inzerce nebo substituce aminokyselinových zbytků ve známé aminokyselinové sekvenci proteinu. Místa mutací se mohou modifikovat individuálně nebo v sériích např. tak, že se 1) nejdříve substituují konzervativní aminokyseliny a pak se provádějí radikálnější změny v závislosti na získaných výsledcích 2) deletují se (odstraní) cílové zbytky a 3) inzerují se (vloží) zbytky stejné nebo jiné třídy do sousedství příslušného místa, nebo se kombinují všechny 3 uvedené způsoby.

Mutageneze nahrazováním alaninem

Mutageneze nahrazováním alaninem („alanin scanning“) je metoda vhodná pro identifikaci určitých zbytků nebo úseků požadovaných proteinů, které jsou výhodnými místy nebo doménami pro mutagenezi (Cunningham and Wells, Science 244: 1081-1085, 1989). Při této metodě se identifikují zbytky, nebo skupiny zbytků (např. nabité aminokyselinové zbytky jako Arg, Asp, His, Lys a Glu) a nahradí se neutrální nebo negativní aminokyselinou (nejvýhodněji alaninem nebo polyalaninem). Tyto náhrady aminokyselin mohou ovlivnit interakci aminokyselin s okolním vodným prostředím uvnitř nebo vně buňky. Domény, u kterých se projeví funkční citlivost na substituce, se mohou dále zpřesňovat vnášením dalších změn nebo změnami již substituovaných míst. Takže zatímco místo pro vložení variace aminokyselinové sekvence je predeterminováno, povaha mutace sama o sobě predeterminována není. Tak např. pro optimalizaci účinnosti mutace v určitém místě je možné provést alanin-nahrazovací nebo náhodnou mutagenezi na cílovém kodonu nebo úseku a exprimovat varianty podjednotek požadovaného proteinu a ty pak testovat na optimální kombinaci a požadovanou aktivitu.

Mutageneze zprostředkovaná oligonukleotidy

Mutageneze zprostředkovaná oligonukleotidy je metoda vhodná pro přípravu substitučních, delečních a inzerčních variant DNA (viz např. Adelman et al., DAN 2: 183, 1983). Požadovaná DNA může být změněna tím, že hybridizuje s oligonukleotidem, který obsahuje mutaci DNA templátu, kde templátem je jednořetězcová forma plazmidu nebo bakteriofágu obsahující nezměněnou nebo nativní sekvenci DNA pro požadovaný protein. Po hybridizace se použije DNA polymeráza pro syntézu celého komplementárního řetězce, takže templát pak obsahuje vložený oligonukleotidový primer a tudíž kóduje vybrané změny v DNA pro daný protein. Obecně se užívají oligonukleotidy velikosti 25 nukleotidů. Optimální oligonukleotid obsahuje 12 až 15 nukleotidů, které jsou plně komplementární k templátu na obou stranách od nukleotidu (případně nukleotidů) kódujícího mutaci. To zajistí, že oligonukleotid bude správně hybridizovat sjednořetězcovou templátovou DNA. Oligonukleotidy lze snadno syntetizovat způsoby známými v oboru (viz např. Crea et al., Proč. Nati. Acad. Sci. USA 75: 5765, 1978).

- 14CZ 297387 B6

Kazetová mutageneze

Dalším způsobem, jak připravit varianty, je kazetová mutageneze založená na technice, kterou popsali Wells et al. (Gene 34: 315, 1985). Výchozím materiálem je plazmid (nebo jiný vektor), který obsahuje DNA pro proteinovou podjednotku, která má být mutována. Nejdříve je třeba identifikovat kodon (případně kodony), které mají být v proteinové podjednotce mutovány. Je třeba, aby na každé straně od mutovaného místa bylo jedinečné místo pro restrikční endonukleázu. Pokud takové restrikční místo neexistuje, je třeba ho v požadované lokalizaci vytvořit pomocí výše popsané mutageneze zprostředkované oligonukleotidem. Poté, co do plazmidu byla vložena restrikční místa, plazmid se v těchto místech naštěpí, a tedy linearizuje. Pak se standardním způsobem syntetizuje dvouřetězcový oligonukleotid, který kóduje sekvenci DNA mezi dvěma restrikčními místy a obsahuje požadovanou mutaci. Každý oligonukleotidový řetězec je syntetizován samostatně a pak spolu hybridizují zase standardním způsobem v oboru známým. Tento dvouřetězcový oligonukleotid je nazýván kazetou. Kazeta je přitom navržena tak, aby obsahovala 3'-konec a 5'-konec kompatibilní s konci linearizovaného plazmidu, takže může být přímo do plazmidu ligována. Plazmid pak obsahuje mutovanou sekvenci DNA požadovaného proteinu.

Kombinační mutageneze

Pro vytvoření mutací je také možné použít kombinační mutagenezi. Aminokyselinové sekvence skupiny homologních nebo jinak příbuzných proteinových sekvencí se uspořádají tak, aby bylo dosaženo maximální homologie. Všechny sekvence, které se objeví v dané pozici u všech uspořádaných sekvencí se vyberou a vytvoří se z nich degenerovaná sada kombinačních sekvencí. Kombinační mutagenezi se vytvoří velmi různorodá knihovna variant na úrovni nukleových kyselin. Tak např. směs syntetických oligonukleotidů se enzymaticky liguje do genových sekvencí tak, že degenerovaná sada potenciálních sekvencí je exprimovatelná jako individuální peptidy, nebo alternativně, jako sada dalších fúzních proteinů obsahujících sadu degenerovaných sekvencí.

Různé techniky jsou v oboru známé pro screening vytvářených mutovaných genů. Techniky pro screening velkých genových knihoven často zahrnují klonování knihovny do replikovatelných expresních vektorů, transformování vhodných buněk výslednou knihovnou vektorů, a expresi genů v podmínkách, kde detekce požadované aktivity, tj. v tomto případě vazba na TRELL nebo jeho receptor, umožňuje relativně snadnou izolaci vektoru kódujícího gen, jehož produkt byl detekován. Každá z technik popisovaných v následujících odstavcích je vhodná k vysoce účinnému a vysokokapacitnímu testování velkého počtu sekvencí vytvářených např. technikami náhodné mutageneze.

Vynález dále poskytuje možnost připravovat mimetika pro redukci proteinových vazebných domén polypeptidu TRELL nebo jeho receptoru, tj. peptidová činidla nebo činidla jiné povahy než peptidy. Peptidová mimetika jsou schopna narušit vazbu TRELL a jeho receptoru. Kritické zbytky TRELL účastnící se procesu molekulového rozpoznávání receptorového polypeptidu nebo příslušného následného intracelulámího proteinu v signální dráze, mohou být určeny a použity pro přípravu peptidových mimetik TRELL nebo jeho receptoru, která kompetitivně nebo nekompetitivně inhibují vazbu TRELL a jeho receptoru (viz např. „Peptide inhibitors of human papilloma virus protein binding to retinoblastoma gene protein“, patentové přihlášky EP 412 762 A a EP B31 080 A, na které se tímto odkazujeme).

G. Farmaceutické přípravky

Tím, že předkládaný vynález poskytuje čistý a/nebo rekombinantní TRELL, poskytuje také metodu pro testování kandidátů léčiv, která jsou funkčně agonisty nebo antagonisty, a sice TRELL nebo jeho receptoru. V jednom provedení předkládaného vynálezu se pomocí takového testu hodnotí schopnost sloučeniny modulovat vazbu mezi TRELL a jeho receptorem. Je možné pak vytvářet různé varianty testů podle předkládaného vynálezu, což je odborníkovi zřejmé.

-15CZ 297387 B6

V mnoha programech pro screening léků, které testují celé knihovny sloučenin nebo přírodních extraktů, jsou požadovány metody s velkou účinností a kapacitou zpracovaných vzorků, tj. aby bylo možné maximalizovat počet sloučenin otestovaných za jednotku času. Testy, které se provádějí na bezbuněčném systému, jako jsou např. purifikované nebo semipurifíkované proteiny, jsou často výhodné jako testy pro tzv. primární screening, který dovoluje rychlý vývoj těchto sloučenin, neboť umožňuje relativně snadnou detekci změn molekulového cíle, ke které dochází působením testované sloučeniny. Avšak toxické působení na buňky a/nebo biologická dostupnost testované sloučeniny mohou být ignorovány v takovém in vitro systému, neboť test je primárně zaměřen na působení léčiva na molekulový cíl a projevy změn vazebné afinity s jinými proteiny nebo změny enzymatických vlastností molekulového cíle.

Farmaceutické přípravky podle předkládaného vynálezu obsahují terapeuticky účinné množství TRELL nebo receptoru TRELL, nebo jejich fragmentů nebo mimetik, a případně obsahují farmaceuticky přijatelné nosiče a pomocné látky.

Vynález se tudíž také týká způsobu léčení rakoviny a způsobů stimulace, nebo v určitých případech naopak inhibice, imunitního systému, nebo jeho částí, které spočívají v podávání farmaceuticky účinného množství sloučeniny podle předkládaného vynálezu nebo jejích farmaceuticky přijatelných solí nebo derivátů. Přitom odborníkovi je zřejmé, že sloučeniny a způsoby podle vynálezu se mohou kombinovat s řadou terapií.

Přípravek podle předkládaného vynálezu může být formulován pro různé lékové formy a způsoby podávání, včetně systémového, topického nebo lokálního podávání. Pro systémové podávání je výhodné podávání injekční, včetně intramuskulámí, intravenózní, intraperitoneální a subkutánní injekce, přičemž přípravek podle předkládaného vynálezu může být formulován jako vodný roztok, výhodně ve fyziologicky kompatibilním pufru jako je např. Hankův nebo Ringerův roztok. Kromě toho přípravek podle předkládaného vynálezu může být formulován v pevné formě pro případné rozpuštění nebo resuspendování bezprostředně před použitím. Předkládaný vynález se také týká lyofilizovaných forem přípravku.

Přípravek podle předkládaného vynálezu se může podávat také perorálním, transmukosálním nebo transdermálním způsobem. V přípravku pro transmukosální nebo transdermální podávání se použijí vhodné látky usnadňující penetraci (penetranty) vzhledem k bariéře, kterou je nutno překonat. Takové penetranty jsou v oboru známy a patří k nim např. pro transmukosální podávání soli žlučové kyseliny, deriváty kyseliny fusidové a detergenty. Transmukosální podávání lze provádět buď nasální aerodisperzí nebo pomocí čípků. Pro perorální podávání je přípravek formulován v obvyklé lékové formě vhodné pro perorální podávání jako jsou kapsle, tablety a tonika. Pro topické podávání může být přípravek ve formě mastí, mazání, gelů nebo krémů, jak je v oboru všeobecně známo.

Výhodně je přípravek podle předkládaného vynálezu ve formě jednotkové lékové dávky a je podáván jedenkrát nebo vícekrát denně. Množství aktivní látky podané v jedné dávce v průběhu léčení je závislé na mnoha různých faktorech. Tak např. na věku a velikosti subjektu, závažnosti a průběhu onemocnění, které se léčí, způsobu a formě podávání, a samozřejmě na úsudku zkušeného lékaře. Avšak účinná dávka může být v rozmezí přibližně 0,005 až 5 mg/kg/den, výhodně přibližně 0,05 až 0,5 mg/kg/den. Odborník sám posoudí, kdy mohou být prospěšné nižší či vyšší dávky.

Genové konstrukty podle předkládaného vynálezu se mohou použít také jako součást protokolu genové terapie pro přenos nukleových kyselin kódujících buďto agonistické nebo antagonistické formy polypeptidů TRELL.

Expresní konstrukty TRELL se mohou podávat prostřednictvím jakéhokoliv biologicky účinného nosiče, tj. jakéhokoliv farmaceutického přípravku schopného účinně přenést in vivo gen pro

-16CZ 297387 B6

TRELL do buňky. Tento přístup znamená vložit gen do virového vektoru, který může přímo transfekovat buňku, nebo podat plazmidovou DNA, pomocí např. lipozomů, nebo nějakého vnitrobuněčného nosiče, anebo se může jednat o přímou injekci genového konstruktu. Výhodnou metodou je však přenos pomocí virového vektoru.

Farmaceutický přípravek s genovým konstruktem pro genovou terapii se skládá v podstatě ze systému pro přenos genů a vhodného ředidla, nebo se může jednat o matrix umožňující pomalé uvolňování, do které je systém přenášející gen zapuštěn. Alternativně, pokud celý systém pro přenos genů může být připraven intaktní z rekombinantních buněk, např. jako retrovirový vektor, farmaceutický přípravek pak obsahuje jednu nebo několik buněk, které produkují systém pro přenos genů.

Kromě použití pro terapii se oligomery podle předkládaného vynálezu mohou použít jako diagnostické reagencie pro detekci přítomnosti či absence cílové DNA, RNA nebo sekvencí aminokyselin, ke kterým se specificky váží.

Jiným aspektem předkládaného vynálezu je použití pro hodnocení chemické sloučeniny z hlediska její schopnosti reagovat, tj. např. vázat se či jinak fyzikálně asociovat, s polypeptidem TRELL nebo jeho fragmenty. Kromě toho TRELL podle předkládaného vynálezu se může použít v metodách pro hodnocení přirozeně se vyskytujících ligandů nebo receptorů TRELL, a také pro hodnocení chemických látek, které se asociují nebo váží s receptory TRELL.

Jiný aspekt předkládaného vynálezu poskytuje způsob hodnocení chemické látky z hlediska její schopnosti modulovat interakci mezi TRELL a jeho receptorem. Tento způsob znamená smísit TRELL a receptor TRELL v podmínkách, kde taková dvojice je schopna interakce, pak přidat chemickou látku, která se testuje, a detekovat vytvoření a nebo naopak rozpad komplexu. Takové modulující činidlo může být dále hodnoceno testy in vitro na aktivitu v bezbuněčném systému a pak se, případně ošetřením buněk nebo podáváním zvířatům, mohou hodnotit účinky.

Příklady provedení vynálezu

Izolace cDNA TRELL

Příklad 1

A) Klonování myšího genu TRELL cDNA kódující mTRELL byla izolována pomocí PCR z knihovny cDNA z myších peritoneálních makrofágů. Sekvence aminokyselin a umístění transmembránového úseku je typické pro membránové proteiny. Aminokyselinová sekvence mTRELL je zde uvedena jako sekvence id. č. 2 a příslušná sekvence DNA je zde uvedena jako sekvence id. č. 1.

Makrofágové buňky byly získány z peritonea myší Balb/c peritoneální laváží a buňky, které adherzovaly k plastu do jedné hodiny po odebrání, byly lyžovány a byla z nich extrahována RNA. Byl připraven syntetický oligonukleotidový primer 5'GTTCCAGGCCAGCCTGGG3' ze sekvence myšího erytropoetinu (viz C. B. Shoemaker a L. D. Mistock: „Murine erythropoietin gene: cloning, expression and human gene homology“, Mol. Cell. Biol. 6: 849, 1986). Tento primer byl použit pro metodu ,,5'RACE“ (systém 5'RACE od firmy BRL) podle návodu výrobce ve spojení s kotvicím primerem dle BRL. První řetězec cDNA byl připraven z RNA z makrofágů adherujících do jedné hodiny, jak bylo uvedeno výše. Amplifikace byla provedena pomocí termálního DNA cykleru firmy Perkin Elmer a s Taq DNA polymerázou taktéž od Perkin Elmer. Po první denaturaci 5 minut při 94 °C byly podmínky cyklů následující: 35 cyklů sestávajících z 30 sekund v 94 °C, 30 sekund v 55 °C a 3 minuty v 72 °C. Závěrečným krokem byla dodatečná

- 17CZ 297387 B6 extenze při 72 °C a pak byla reakce udržována při 4 °C. Analýza experimentu PCR na agarózovém gelu ukázala dva amplifíkované fragmenty velikosti 650 bp a 500 bp. Oba fragmenty byly vyříznuty z gelu, vloženy do vektoru pBS-T a sekvencovány. Ukázalo se, že šlo o různé fragmenty. Oba měly na konci shodný oligonukleotid specifický pro stejný erytropoetinový gen, který byl použit jako primer pro PCR syntézu. Northemová analýza pomocí fragmentů náhodně značených ³²P ukázala, že hybridizovaly se dvěma různými RNA, přičemž fragment 500 bp hybridizoval s RNA velikosti 1,4 kb v makrofágách. Pro určení orientace cDNA byly v northemové analýze užity ribonukleotidové sondy (ribosondy) značené ³²P.

Z určených sekvencí a orientací byly odvozeny dva vnitřní příměry pro RNA velikosti 1,4 kb. Ty byly využity pro metodu 5'RACE-PCR. experiment 5'RACE-PCR poskytl fragment velikosti 750 bp, který byl vložen do vektoru pBS-T a sekvencován. Ukázalo se, že odpovídal 3'-konci RNA o velikosti 1,4 kb, neboť obsahoval polyadenylační signál AATAAA právě před polyadenylovou sekvencí polyA. Uplatnění metody 5'RACE nevedlo k vytvoření žádného pásu. Souprava pro amplifíkaci Marathon cDNA Amplification Kit (Clontech) byla použita pro přípravu cDNA knihovny z výše popsaných adherujících makrofágů. Byl použit fragment velikosti 1040 bp získaný PRC pomocí „antisense“ a „sense“ oligonukleotidových primerů z určené sekvence DNA společně s univerzálními primery ze soupravy. To vedlo k vytvoření fragmentu delšího než bylo původních 1040 bp. Nový fragment, který byl sekvencován, byl delší o 60 bp na 5'-konci (sekvence id. č. 1).

Byla také izolována RNA z myších peritoneálních makrofágů indukovaných thioglykolátem po hodinové adherenci. Hybridizace byl provedena s cDNA pro mTRELL značenou ³²P. Obr. 3 ukazuje výsledky northemové analýzy exprese mRNA pro TRELL v peritoneálních makrofágách myši a v dalších myších orgánech.

Prvních 21 aminokyselin představuje hydrofobní transmembránovou doménu. V dostupných databázích nebyla nalezena žádná shodná sekvence ani na úrovni nukleotidů ani aminokyselin. Pomocí programu PROSÍTE a 225 aminokyselinových sekvencí bylo zjištěno, že dotčená sekvence patří do proteinové rodiny TNF. Protein má také různé domény popsané pro LT-α a jiné členy této rodiny (J. Browning et al., Lymphotoxin-α, a novel member of the TNF family that forms heteromeric complex with lymphotoxin on the surface“, Cell 72: 847, 1993, C. F. Ware et al.“ THE ligand and receptors of the lymphotoxin systém“, in Pathways of cytolysis, G. M. Griffiths and J. Tschopp (Eds.), Springer, Verlag, Berlin, Heidelberg, s. 175-218, 1995). Ukázalo se, že tato sekvence je jedinečná. Na úrovni nukleotidů nebo aminokyselin byla pozorována slabá míra identity nebo podobnosti při srovnání s ostatními členy rodiny TNF nebo i s jinými sekvencemi. Prohledávání databáze EST klonů vedlo k odhalení jedné lidské sekvence zcela jasně homologní s touto myší sekvencí. Klon 154742,5' (GenBank, přístupové číslo R55379) z knihovny z prsu, kterou vytvořil Soares, Washington University, velikosti 345 bp vykazoval 89% homologii s myším TRELL. V dostupných databázích nebyla nalezena žádná sekvence, která by souhlasila s dostupným 5'koncem TRELL.

Příklad 2

B) Klonování lidského TRELL

1) Příprava oligonukleotidových sond a primerů pro PCR

Jako základ pro syntézu oligonukleotidových primerů byla využita sekvence lidského EST klonu R55379, která je homologní s myším TRELL. Byly připraveny dva „sense“ (souhlasné) oligonukleotidy - 20mery:

LTB-065: 5'CCC TGC GCT GCC TGG AGG AA (nt 70 až 89 z R55379) a

-18CZ 297387 B6

LTB-066: 5'TGA TGA GGG GAA GGC TGT CT (nt 14 až 33 z R55379) a jeden „antisense“ (s opačným smyslem orientace) 20mer:

LTB-067: 5'AGA CCA GGG CCC CTC AGT GA (nt 251 až 270 z R55379).

2) Identifikace mRNA a zdrojová cDNA knihovna pro klonování TRELL

PolyA+mRNA z lidských jater (katalog, č. 6510-1), sleziny (katalog, č. 6542-1) a lymfatických uzlin (katalog, č. 6594-1) byly zakoupeny od firmy Clontech. PolyA+mRNA z buněk lidských buněčných linií THP-1, U937 a 11-23 byly připraveny firmou Biogen, Cambridge, MA. cDNA knihovna z lidských tonsil ve fágu Lambda gtlO a také DNA z této knihovny byly připraveny také v Biogenu.

Na šesti vzorcích RNA byla provedena reverzní transkripce sdružená s polymerázovou řetězovou reakcí (RT-PCT). Každá reakce pro syntézu cDNA obsahovala 1 pg polyA+mRNA, 50 mM Tris pH 8,3, 75 mM KCI, 3mM MgCl₂, lOmM DTT, 250mM dNTP, 50 ng náhodných hexamerů (50ng/pl) a 400 U reverzní transkriptázy Superscript II (Gibco BRL, katalog, č. 6542-1) v celkovém objemu 40 μΐ. Reakce byla inkubována ve 20 °C po 20 minut, ve 42 °C po 50 minut a nakonec v 99 °C 5 minut. Pro následující PCR pak byla užita jedna pětina každé cDNA reakce nebo 100 až 1000 ng DNA z cDNA knihovny. Byly provedeny dvě PCR reakce pro každý vzorek, jedna s párem primerů LTB-065 a LTB-067, která by vedla ke vzniku produktu o velikosti 201 bp, a druhá reakce s párem primerů LTB-066 a LTB-067, která by poskytla produkt velikosti 257 bp, pokud bude přítomen příslušný transkript ve vzorku. PCR byla provedena ve lOmM Tris pH 8,3, 50mM KCI, l,5mM MgCl₂, 0,01% želatině, 10% DMSO, 100 μΜ dNTP s 30 pmol každého primerů a 5 U polymerázy AmpliTaq (Perkin Elemer, katalog, č. N801-0060). PCR byla provedena v termocykleru Perkin Elmer Cetus Model 480. Podmínky cyklů byly 95 °C, 1 minuta, 60 °C, 1 minuta a 72 °C, 1 minuta, a to opakováno v 35 cyklech.

Produkt správné velikosti byl získán z jater, sleziny, lymfatických uzlin, THP-1 tonsil, ale U937 a 11-23 mRNA neposkytly žádný produkt. PCR produkt z jater velikostí 201 bp byl purifikován a použit dále jako sonda pro screening cDNA knihovny.

3) Screening cDNA knihovny

Poté, co bylo pomocí PCR prokázáno, že cDNA knihovna z tonsil obsahuje TRELL, 1 milion pfu (jednotek vytvářejících plaky) z Lambda gtlO cDNA knihovny lidských tonsil bylo vyseto na misky Nunc™ v hustotě lxlO⁵ pfu. Byly vytvořeny duplikátní otisky na membránové filtry Schleicher and Shuell BA-S 85 Opitran™. PCR produkt zmíněný výše o velikosti 201 bp byl označen ³²P pomocí náhodných primerů (Feinberg and Vogelstein, Anal. Biochem. 137: 266-267, 1984). Filtry pak byly hybridizovány přes noc při 65 °C ve 400 ml „Plaque screen“ pufru (50mM Tris pH 7,5, 1M NaCl, 0,1% difosforečnanu sodného, 0,2% PVP, 0,2% Ficoll) s 10% dextransulfátem, 100 pg/ml tRNA a 6x10⁵ cpm/ml sondy. Po hybridizaci byly filtry dvakrát opláchnuty „Plaque screen“ pufrem a pak dvakrát 2xSSC, 0,1% SDS při 65 °C a poté exponovány na film při -70 °C s intenzifikačním stínítkem po dobu 40 hodin.

Dvojitě pozitivní plaky byly přeneseny z původních misek do média SM (lOOmM NaCl, lOmM MgSO₄, 50mM Tris pH 7,5) s želatinou. 12 pozitivních plaků pak bylo purifikováno. Lambda DNA získaná minipreparací z 12 purifíkovaných plaků byla naštěpena restriktázou Notl a analyzována elektroforézou na 1 % agarózovém gelu, pak analyzována Southemovým přenosem a hybridizována se sondou 210 bp výše zmíněnou.

Klony s nejdelším inzertem (přibližně 2 kb), které hybridizovaly se sondou, byly vybrány pro purifikaci DNA ve velkém měřítku a pro DNA sekvencování. Inzert z každého z těchto klonů byl

- 19CZ 297387 B6 subklonován do Notl místa plazmidů pBluescript SK+ (Stratagene, katalog, č. 212205). Byly získány sekvence DNA lambda a plazmidové DNA. Klon Fl, který obsahoval cDNA inzert velikosti 2006 bp obsahoval intron na 5'konci kódujícího úseku ale neobsahoval úplný čtecí rámec. Klon A2a, zvaný též PB133 obsahoval cDNA inzert velikosti 1936 bp. Tento klon obsahoval netranslatovaný úsek 3'konce velikosti 543 bp, otevřený čtecí rámec velikosti 852 bp a netranslatovaný úsek 3'konce, ale neobsahoval polyadenylační signál ani polyA koncovou sekvenci.

Nukleotidová sekvence kódující otevřený čtecí rámec pro hTRELL cDNA v klonu A2a je zde uvedena jako sekvence id. č. 3. Dedukovaná aminokyselinová sekvence obsahující 284 aminokyselin je zde uvedena jako sekvence id. č. 4. Druhý methionin v pozici 36 je pravděpodobně translační počátek, neboť toto místo nejlépe odpovídá požadavkům kladeným na takový počátek podle Kozaka.

Pomocí identifikovaných sekvencí cDNA byla určena cDNA kódující TRELL. Ze sekvencí výše popsaných (tj. sekvence id. č. 3) byla dedukována aminokyselinová sekvence TRELL (tj. sekvence id. č. 4). Přitom je zřejmé, že v souladu se stavem techniky, odborník by byl schopen provést v těchto sekvencích účelné záměny, inzerce nebo delece, a tím byl získal řadu různých molekul s v podstatě shodnou biologickou nebo imunologickou aktivitou, jakou mají molekuly popisované v této přihlášce.

4) Northemová analýza exprese lidského TRELL

Fragment PpuMl/BstXl z lidského klonu 2a velikosti 440 bp byl označen 32P pomocí náhodných primerů a použit jako sonda pro testování komerčně dostupných northemových otisků obsahujících RNA z různých tkání člověka. Tato northemová analýza ukázala, že sonda hybridizovala s jediným druhem mRNA velikosti 1,4 až 1,6 kb. TRELL je exprimován ve většině orgánů imunitního systému, tj. ve slezině, lymfocytech periferní krve (pbl), lymfatických uzlinách, apendixu, ale relativně málo v thymu, fetálních játrech (které jsou zdrojem předchůdců lymfocytů) a kostní dřeni (viz obr. 4). Takže primárně jsou to orgány sekundárního imunitního systému, které exprimují TRELL. Ale exprese TRELL byla detekována i ve vaječníku, prostatě, tenkém střevu, tlustém střevu, srdci, mozku, placentě, plicích, játrech, kosterním svalstvu, ledvinách a pankreatu. Exprese byla relativně nízká ve varlatech, játrech, ledvinách a thymu. Tento expresní vzorec ukazující na široce rozšířenou expresi, připomíná expresi ligandů TRAIL, až na to, že TRAIL je málo exprimován v srdci a mozku.

Příklad 3

C) Izolace receptorů vážícího ligand TRELL

Ligandy rodiny TNF se mohou použít pro identifikaci a klonování receptorů. S využitím popsaných sekvencí TRELL je možné fúzovat 5'-konec extracelulámí domény TRELL ligandů, který tvoří vazebnou sekvenci pro receptor, kmarkerové nebo značkovací sekvenci a pak přidat vedoucí sekvenci, která podpoří sekreci ligandů v některém z mnoha možných expresních systémů. Jeden příklad takového postupu popsali Browning et al (JBC 271: 8618-8626, 1996), kdy ligand LT-β byl secemován v takové formě. Vedoucí sekvence VCAM byla připojena ke krátké značkovací sekvenci peptidu myc s extracelulámí doménou LT-β. Sekvence VCAM byla použita proto, aby napomohla sekreci molekuly LT-β, která je normálně vázána na membránu. Secemovaný protein si ponechává značku myc na svém N-konci, která nijak nesnižuje schopnost vázat se na receptor. Takový secemovaný protein se může exprimovat buďto v přechodně transfekovaných buňkách COS nebo v podobném systému, např. vektorech odvozených od EBNA, systému hmyzí buňky a bakuloviru nebo Pichia sp. apod. Jako zdroj označeného ligandů se může využít nepurifíkovaný buněčný supematant.

-20CZ 297387 B6

Buňky exprimující receptor je možné identifikovat tím, že se exponují označenému ligandu. Buňky s navázaným ligandem se pak identifikují pomocí průtokové cytometrie FACS, když se označí značka myc protilátkou proti peptidu myc (anti-myc, 9E10) a pak fytoerytrinem (nebo obdobnou značkou) značeným myším imunoglobulinem. Buňky pozitivní ve FACS se snadno identifikují a slouží pak jako zdroj RNA kódující receptor. Z této RNA pak může být připravena standardním postupem expresní knihovna a rozdělena do podskupin („pools“). Tyto podskupiny klonů se pak transfekují do vhodných hostitelských buněk a vazba označeného ligandu na transfekované buňky s receptorem se identifikuje pomocí mikroskopického vyšetření poté, co se navázaný myc peptid označí anti-myším imunoglobulinem označeným enzymem, např. galaktosidázou, alkalickou fosfatázou nebo luciferázou. Jakmile se jednou identifikuje pozitivní podskupina klonů, zmenšuje se pak velikost podskupin dokud není identifikována cDNA kódující receptor. Celá tato procedura může být provedena buďto s myším nebo lidským TRELL, přičemž jedna z nich povede snadněji k receptorů.

Buňky, reagencie a metody použité v př. 1 až 3

Všechny buňky byly získány z Americké sbírky mikroorganismů Američan Type Culture Collection (ATCC), Rockville, MD, kromě klonu 13 buněk WEHI 164, které poskytl Dr. Kawashima (Geneva Biomedical Research Institute, Geneva, Switzerland). Subklon HT29 (HT29-14) byl již dříve popsán (Browning et al., 1996) a subklon ME180 senzitivní kTNF poskytl Dr. Carl Ware. Hybridom T-buněk 11-23 byl již také popsán dříve (Browning et al. 1991).

Myši Balb/c byly injikovány peritoneálně 3 dny před usmrcením 1,5 ml thioglykolátové suspenze (Difco lab., MI). Buňky pak byly odebrány z peritoneální dutiny a kultivovány v hustotě 106buněk/ml po 1 hodinu v médiu DMEM (Gibco Lab.). Neadherující buňky byly odstraněny opláchnutím misek a adherující buňky, téměř výlučně makrofágy, byly lyžovány činidlem Tri-Reagent (Molecular Research Center lne.) a byla z nich extrahována RNA.

Rekombinantní lidské proteiny TNF, LTa, LTal/b2, a také protilátky k těmto proteinům jakož i fúzní proteiny receptor-Ig byly již dříve popsány (Browning et al., 1995). Také protilátka anti-CD40L nazvaná 5C8 byla publikována. Polyklonální sérum anti-hTRELL bylo připraveno tak, že se injikoval čistý rekombinantní hTRELL v CFA do lymfatických uzlin, jak bylo již popsáno (Browning a Ribolini, 1989). Po dvou měsících, kdy byla viditelná odpověď proti hTRELL, byly purifikovány imunoglobuliny pomocí sefarózy s proteinem-A (Protein-ASepharose).

Klonování myšího TRELL

Byl připraven syntetický oligonukleotidový primer 5'GTTCCAGGCCAGCCTGGG3' ze sekvence myšího erytropoetinu a tento primer byl použit pro metodu ,,5'RACE“ (systém 5'RACE od firmy BRL) podle návodu výrobce ve spojení s kotvicím primerem dle BRL. První řetězec cDNA byl připraven z RNA z makrofágů adherujících do jedné hodiny, jak bylo uvedeno výše. Amplifikace byla provedena pomocí termálního DNA cykleru firmy Perkin Elmer S Taq DNA polymerázou taktéž od Perkin Elmer. Po první denaturaci 5 minut při 94 °C byly podmínky cyklů následující: 35 cyklů sestávajících z 30 sekund v 94 °C, 30 sekund v 55 °C a 3 minuty v 72 °C. Závěrečným krokem byla dodatečná extenze při 72 °C. Analýza experimentu PCR na agarózovém gelu ukázala dva amplifikované fragmenty velikosti 650 bp a 500 bp. Oba fragmenty byly vyříznuty z gelu, vloženy do vektoru pBS-T a sekvencovány. Northemová analýza pomocí fragmentů náhodně značených ³²P ukázala, že fragment 500 bp hybridizoval s RNA velikosti 1,4 kb v makrofágách. Pro určení orientace cDNA byly v northemové analýze v obou směrech užity ribonukleotidové sondy (ribosondy) značené ³²P.

Z určených sekvencí a orientací byly odvozeny dva vnitřní primery pro RNA velikosti 1,4 kb, a sice 5'TCAGGTGCACTTTGATGAGG3' a 5'CTGTCAGCTCCTCCTGAG3', které byly vyu

-21 CZ 297387 B6 žity pro metodu 5'RACE-PCR. Experiment 5'RACE-PCR poskytl fragment velikosti 750 bp, který byl vložen do vektoru pBS-T a sekvencován. Ukázalo se, že odpovídal 3'konci RNA o velikosti 1,4 kb, neboť obsahoval polyadenylační signál AATAAA právě před polyadenylovou sekvencí polyA. Uplatnění metody 5'RACE nevedlo k vytvoření žádného pásu. Souprava pro amplifikaci Marathon cDNA Amplification Kit (Clontech) byla použita pro přípravu cDNA knihovny zvýše popsaných adherujících makrofágů. Byl použit fragment velikosti 1040 bp získaný PCR pomocí antisense a sense oligonukleotidových primerů z určené sekvence DNA společně s univerzálními primery ze soupravy. To vedlo k vytvoření fragmentu o 60 bp delšího než bylo původních 1040 bp.

Klonování lidského TRELL

Průzkum databáze EST klonů ukázal jeden klon, který byl zjevně homologní s myší sekvencí. Tento klon 15472 (GenBank, přístupové č. R55379) obsahuje sekvenci velikosti 345 bp s 89% homologií s myší cDNA. Z EST klonu byly odvozeny dva oligonukleotidové primery, 5'CCC TGC GCT GCC TGG AGG AA3' a 5'AGA CCA GGG CCC CTC AGT GA3', které byly použity pro screening různých tkání a knihoven pomocí RT-PCR na přítomnost transkriptů hTRELL. Produkty správné velikosti byly získány z jater, sleziny, lymfatických uzlin, THP-1 atonsil, ale U937 a II-23 mRNA neposkytly žádný produkt. PCR produkt velikosti 201 bp byl klonován a použit dále jako sonda pro screening Lambda gtlO cDNA knihovny z lidských tonsil. 10⁶ pfu (jednotek vytvářejících plaky) z Lambda gtlO cDNA knihovny lidských tonsil bylo vyseto na misky Nunc™ v hustotě lxl 0⁵ pfu. Byly vytvořeny duplikátní otisky na nitrocelulózové filtry 20x20 a filtry pak byly hybridizovány se sondou označenou pomocí náhodných primerů. Filtry byly hybridizovány přes noc při 65 °C ve 400 ml „Plaque screen“ pufru (50mM Tris pH 7,5, 1M NaCl, 0,1 % difosforečnanu sodného, 0,2 % PVP, 0,2 % Ficoll) s 10% dextransulfátem, 100pg/ml tRNA a 6x10⁵ cpm/ml sondy. Po hybridizaci byly filtry dvakrát opláchnuty „Plaque screen“ pufrem a pak dvakrát 2xSSC, 0,1% SDS při 65 °C. Lambda DNA byla připravena minipreparací z pozitivních kolonií a klony s nejdelším inzertem byly vybrány pro purifikaci DNA ve velkém měřítku a pro DNA sekvencování. Inzert z každého z těchto klonů byl subklonován do Notl místa plazmidů pBluescript SK+ (Stratagene, katalog, č. 212205).

Analýza RNA

Buďto fragment PpuMl/BstXl velikosti 0,45 kb nebo fragment Narl/Notl velikosti 1,25 kb z hTRELL cDNA byl označen pomocí náhodných primerů a použit jako sonda pro testování lidských a myších tkání, zakoupených jako northemové otisky od firmy Clontech, northemovou analýzou. RNA z myších tkání a buněčných linií byla extrahována pomocí činidla TRI-Reagent. Northemová analýza byla provedena v podstatě postupem, který popsali Chicheportiche a Vassalli (1994) se 4 pg celkové RNA a sondou z mTRELL cDNA značenou ³²P.

Příklad 4

Přiřazení v chromozomu

Panel DNA z monochromozomových buněčných hybridů (HGMP Resource Centre, Hinxton, Cambridge, UK) byl použit pro amplifikaci fragmentu velikosti 340 bp pomocí PCR s primery vybranými podle 3'-koncového netranslatovaného úseku, které nebyly homologní s myší sekvencí (5'AGTCGTCCCAGGCTGCCGGCT3' a 5'CCTGAAGTGGGGTCTTCTGGA3'). Amplifíkace byla provedena ve 40 cyklech 94 °C, 30 sekund, 65 °C, 90 sekund a 72 °C, 90 sekund. Výsledné produkty byly detekovány na agarózovém gelu obarveném ethidiumbromidem.

-22CZ 297387 B6

Příklad 5

Exprese rekombinantního proteinu hTRELL

Byl připraven konstrukt pro expresi rozpustného produktu, který kombinoval vedoucí sekvenci VCAM, značku peptidu myc a extracelulámí doménu hTRELL podobně jak bylo již popsáno pro LTb (Browning et al., 1996). Byly izolovány následující fragmenty: Notl fragment s tupým koncem kódující vedoucí sekvenci VCAM, pár oligonukleotidů kódující vedoucí sekvenci VCAM, pár oligonukleotidů kódující značkovací peptid myc (5'-konec tupý, 3'PpuMl), které byly popsány výše, a fragmenty TRELL PpuMl/BstXl velikosti 0,45 kb a BstXl/Notl velikosti 0,65 kb. Všechny čtyři fragmenty byly ligovány do vektoru pBleuescript SK+ naštěpeného Notl a ošetřeného fosfatázou. Inzert Notl z tohoto vektoru byl přenesen do vektoru pFastTRELL (Gibco BRL) a použit pro přípravu rekombinantního bakuloviru. Rozpustný TRELL byl připraven tak, že se infikovaly hmyzí buňky HiFive™ infekcí MOI 10 a po 2 dnech se sbíralo médium. Do média byly přidány následující látky: pufr HEPES do výsledné koncentrace 25mM, pH 7,4, lmM AEBSF (Pierce) a 1 mg/ml pepstatinu. Médium se pak filtrovalo a koncentrovalo lOx ultrafiltrací přes hranový filtr Amicon 10 kDA. Koncentrované médium obsahující TRELL se přímo naneslo na kolonu SP Sepharose Fast Flow, která se promyla 25mM HEPES pufrem pH 7,0 s 0,4M NaCl, TRELL byl pak eluován stejným pufrem s 0,6M NaCl. Purifíkovaný TRELL byl pak podroben analýze velikosti.

Příklad 6

Analýza sekrece

Vektory pro expresi založenou na EBNA byly konstruovány pomocí vektoru CH269, což je modifikovaná verze pEBVHis ABC (Invitrogen), kde byl odstraněn EBNA gen a histidinová značka. Fragment hTNF velikosti 0,71 kb ve vektoru pFastbac poskytly Dr. P. Pescamento a A. Goldfeld. Inzert SnaBI/Xhol byl ligován do míst PvuII/XhoI vektoru CH269. Genomový inzert TNF obsahující deleci štěpných míst 1-12 poskytl jako dar Dr. G. Kollias, a A. Goldfeld ho vložil do vektoru CH269. Notl inzert hTRELL velikosti 1,8 kb z klonu A2a, fragment velikosti 0,98 kb obsahující hCD40L cDNA od Dr. E. Garbera a Notl inzert velikosti 1,46 kb obsahující hLTa (Browning et al., 1995) byly ligovány do Notl místa vektoru CH269. HindlII inzert velikosti 0,81 kb obsahující kódující úsek hLTb s modifikovaným počátkem (Browning et al., 1995) byl ligován do HindlII místa vektoru CH269. Buňky EBNA-293 byly transfekovány různými vektory CH269 společně s vektorem GFP pomocí lipofectaminu a pak v PBS s 5mM EDTA použity pro analýzu FACS nebo po dvou dnech byly buňky použity pro metabolické značení. Oba způsoby využívají následujících protilátek: hTRELL králičí polyklonální frakci Ig, hTNF monoklonální protilátka 104c, hLT monoklonální protilátka AG9, LTal/b2 monoklonální protilátka B9 a CD40L monoklonální protilátka 5c8. Analýza FACS byla prováděna v médiu RPMI obsahujícím 10% FBS a 50 pg/ml tepelně agregovaného lidského IgG s protilátkami v koncentraci 5 pg/ml. Fykoretrinem značená anti-myší nebo králičí protilátka IgG (Jakson ImmunoResearch) byly použity k detekci vazby protilátky. Živé transfekované buňky značené GFP byly pomocí FACS vybrány. Pro imunoprecipitaci byly buňky 2 dny po transfekci opláchnuty PBS a přeneseny do média MEM bez met/cys obsahujícího 200 pCi/ml TranSlabel (ICN). Pak byl odebrán supernatant a provedena imunoprecipitace podle Browninga et al. (1995).

Příklad 7

Testy cytotoxicity

Testy buněčného růstu byly prováděny, jak bylo již dříve publikováno (Browning a Ribolini, 1989). Pro mikroskopické vyhodnocování byly buňky HT29-14 vysety do 12jamkových misek v hustotě 200 000 buněk/jamku a pěstovány 2 dny. Lidský TRELL, TNF, lymfotoxin-alb2 (Browning et al., 1995) nebo anti-fas (CH11, Kamaya) byly přidány společně s 80 U/ml lidského

-23 CZ 297387 B6 interferonu-g. Po 26 hodinách se médium odstranilo, společně s mnoha mrtvými buňkami, které se oddělily od plastové jamky po ošetření cytokiny nebo anti-fas. Zbylé buňky byly fixovány

80% etanolem a opláchnuty PBS s 1 mg/ml barviva Hoechst. Barva byla odstraněna po dvou minutách, buňky byly opláchnuty PBS a vyšetřovány fluorescenční mikroskopií.

Výsledky jsou ukázány v následujících tabulkách.

Tabulka 2

Vazebná místa lidského TRELL a cytotoxické působení na různé buněčné linie

Buněčná linie	Typ	Vazba TRELL	Cytotoxicita¹
Buňky hematopoetické řady
Jurkat	T-lymfom	-	-
SKW 6,4	EBV B-buňky		-
Namalwa	Burkittův lymfom	-	-
K562	promyelocyty	+	-
ΊΉΡ-1	monocytárni leukemie	4- 4-	-
Ostatní buňky
HT29	adenokarcinom tlustého střeva	+	++^b
ME-1S 0	cervikálni karcinom		-
HeLa	cervikálni karcinom		_d
MCF-7	adenokarcinom prsu		+/-
293	buňky embryonálních ledvin	+	nd^c
Cos	fibroblasty ledvin	+	nd

^a 3 až 5denní proliferační test v přítomnosti či nepřítomnosti lidského interferonu g, ^b cytotoxicita byla pozorována pouze v přítomnosti lidského interferonu g, ^c neměřeno, ^d morfologické změny.

Tabulka 3

Rozdělení členů rodiny TNF do skupin podle cytotoxicity

Skupina	Aktivace receptorů
Silné induktory apoptózy mnoha buněčných typů	TNF, Fas, TRAIL-R^a, DR-3
Slabé induktory pouze u některých buněčných typů	LTb-R, TRELL-R^a, CD30
Nemohou indukovat buněčnou smrt, za určitých podmínek působí antiproliferativně	CD27, CD40, OX-40

tyto receptory nebyly dosud identifikovány.

-24CZ 297387 B6

Seznam citované literatury

1. Smith et al. 1990; Kohno et al 1990; Loetscher et al 1990; Schall et al 1990.

2. See Jones et al., 1989; Eck et al., 1992.

3. K. Tracey, in Tumor Necrosis Factors. The Molecules and. Their Emerging Role in Medicine. B. Beutler (Ed.), Raven Press, NY, p 255 (1992)); A. Waage, in Tumor Necrosis Factors. The Molecules and Their Emerging Role in Medicine. B. Beutler (Ed.), Raven Press, NY, p 275 (1992).

4. G. D. Roodman, in Tumor Necrosis Factors, The Molecules and Their Emerging Role in Medicine. B. Beutler (Ed.), Raven Press, NY, p 117 (1992).

5. A. Nakane, in Tumor Necrosis Factors. The Molecules and Their Emerging Role in Medicine. B. Beutler (Ed.), Raven Press, NY, p 285 (1992); I. A. Clark et al., in Tumor Necrosis Factors. The Molecules and Their Emerging Role in Medicine. B. Beutler (Ed.), Raven Press, NY, p 303 (1992); G. E. Grau et al., in Tumor Necrosis Factors. The Molecules and Their Emerging Role in Medicine. B. Beutler (Ed.), Raven Press, NY, p 329 (1992); P-F. Piguet, in Tumor Necrosjs Fgctors. The Molecules and Their Emerging Role in Medicine. B. Beutler (Ed.), Raven Press, NY, p 341 (1992); G. H. Wong et al., in Tumor Necrosis Factors. The Molecules and.Their Emerging RoleJn Medicine. B. Beutler (Ed.), Raven Press, NY, p 371 (1992).

6. S. Malik, in Tumor Necrosis Factors. The Molecules and Their Emerging Role in Medicine. B. Beutler (Ed.), Raven Press, NY, p 407 (1992).

7. D. A. Fox, AmJ-Med..99, 82 (1995).

8. D. Goeddel et al., Cold Spring Harbor Symposium Quant, Biol.. 51, 597 (1986); G. Trinchieri, in Tumor Necrosis Factors. Tne Molecules and Their Emerging Role in Medicine. B. Beutler (Ed.), Raven Press, NY, p 515 (1992).

9. L. A. Tartaglia et al., Proč. Nati. Acad. Sci. USA. 88, 9292 (1991); L.A. Tartaglia and D. V. Goeddel, Immunol. Todav. 13, 151 (1992).

10. B. Luenig et al., J, Immunol.. 143, 4034 (1989); M. Kriegleret al._T Cell. 53, 45 (1988).

11. C. F. Ware et a·., in Patbyvavs for Cytolysis, G. M. Grifnths and J. Tschopp (Eds.), Sprmger-Verlag, Berlin, Heidelberg, pl 75-218 (1995).

12. N. Paul et al., Ann,^Rcv>.Imm,unaL,6,407 (1988).

13. P.D. Crowe et al., Science. 264, 707 (1994). (J. Browning et al., Cell, 72, 847 (1993); J. Browning et al., 1 Immunol.. 154, 33 (1995).

-25CZ 297387 B6

14. P. De Togni et al., Science. 264,703 (1993); T.A. Banks et al., J, Immunol.. 155,1685 (1995).

15. J. Browning and A. Ribolini, J. Immunol..143.1859 (1989): J. Browning et al., J. Exp, Med.,183. 867(1996).

16. T. Suda et al., J. Immunol.. 154, 3806 (1995)(T. Suda et al., J, Immunol.. 154, 3806 (1995).

17. B.C. Trauth et al., gcience. 245,301 (1989); S. Yonehara et al._r J. Exp. Med.. 169,1747 (1989); S. Nagata and P. Goldstein, Science. 267, 1449 (1995); Μ. H. Falk et al., Blood. 79,3300(1992).

18. F. Rieux-Laucat et al., Science. 268,1347 (1995); T. Takahashi et al., Cell, 76,969 (1994); R. Watanabe-Fukunaga et al., Nátuře, 356,314 (1992).

19. P. R. Galle and al., J, Exp. Med.. 182,1223 (1995).

20. F. Siivestris and al., Clin. Immunol, Immunopathol.. 75, 197 (1995).

21. P.D. Katsikis et al., L Exp. Med..181.2029 (1995); A. D. Badley et al., J, Virol..70. 199 (1996).

22. S. Wiley et al., Immuníty, 3, 673 (1995).

23. J. F. Gauchat et al., FEBSLett.. 315,259 (1993); S. Funakoshi et a!., Blood. 83, 2787 (1994).

24. R. C. Alien et al., Science. 259, 990 (1993).

25. L. Biancone et al., Kidney-Int.,48. 458 (1995); C. Mohan etal., J. Immunol.. 154, 1470 (1995).

26. J. Ruby and al., Nátuře Medicine. 1,437 (1995).

27. Z. Wang et al., J, Immunol.. 155, 3722 (1995); A. M. Cleary and al., J, Immunol.. 155, 3329 (1995).

28. S. Hess and H. Er.gelman, J. Exp. Med..l83. 159 (1996).

29. R. G. Goodwin et al, Cell. 73, 447 (1993); Goodwin et al, Eur. J. Immunol.. 23, 2631 (1993); C. A. Smith etal., Cell, 73, 1349(1993).

30. See, for example, Moleculai Cloning A Laboratory Manual. 2nd Ed., ed. by Sambrook, Fritsch and Maniatis (Cold Spring Harbor Laboratory Press: 1989); DNA Cloning. Volumes I and II (D. N. Glover ed., 1985); Qligonucleotide Synthesis (M. J. Gait ed., 1984); Mullis et al. U.S. Patent No: 4.683,195: Nucleic Acid Hvbridization (B. D.

-26CZ 297387 B6

Hames & S. J. Higgins eds. 1984); Transcription And Translation (B. D. Hames & S. J. Higgins eds. 1984); Culture Of Anima! Cells (R. I. Freshney, Alan R. Liss, lne., 1987); Immobilized Cells And Enzvmes (IRL Press, 1986); B. Perbal, A Praclica! Guide To Molecular Cloning (1984); the treatise, Methods In Enzymology (Academie Press, lne., N.Y.); Gene Transfer Vectors For Mammalian Cells (J. H. Miller and Μ. P. Calos eds., 1987, Cold Spring Harbor Laboratory); Methods In Enzymology. Vols. 154 and 155 (Wu et al. eds.)j Immunochemical Methods In Cell And Molecular Biology (Mayer and Walker, eds., Academie Press, London, 1987); Handbook Of Experimenta! Immunology Volumes MV (D. M. Weir and C. C. Blackwell, eds., 1986); Manipulating the Mouše Embryo. (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1986).

31. See for example, Narang, SA (1983) Tetrahedron 39:3; Itakura et al. (1981) Recombinant DNA. Proč 3rd Cleveland Sympos, Macrpmolecules. ed. AG Walton, Amsterdam: Elsevier pp273-289; Itakura et al. (1984) Annu. Rev. Biochem. 53:323; Itakura et al. (1984) Science 198:1056; Ike et al. (1983) Nucleic Acid Res. 11:477.

32. See, for example, Scott et al. (1990) Science 249:386-390; Roberts et al. (1992) PNAS 89:2429-2433; Devlin et al. (1990) Science 249: 404-406; Cwirla et al. (1990) PNAS 87: 6378-6382; as well as U.S. Patents Nos. 5,223,409, 5,198,346, and 5,096,815.

33. M.T. Abreu-Martin, A. Vjdrich. D.H. Lynch and S.R. Targan. Divergent induction of apoptosis and IL-8 sccretion in HT-29 cells in response to TNF- and ligation of Fas ligand. J, Immunol, T55: 4147-4154. 1995.

34. K. Agematsu, T. Kobata, F.-C. Yang. T. Nakazawa, K. Fukushima, M. Kitahara, T. Moři, K. Sugita, C. Morimoto and A. Komiyama. CD27/CD70 interaction directly drives B cell IgG and IgM synthesis. Eur. J. Immunol. 25: 2825-2829, 1995.

35. R. Amakawa, A. Hákem, T.M. Kundig, T. Matsuyama, J.J.L. Simard, E. Timms, A. Wakeham, H.-W. Mirtruecker, H. Griesser, H. Takimoto, R. Schmits, A. Shahinian, P.S. Ohashi, J.M. Penninger and T.W. Mak. Impaired negative selection of T cells in Hodgkin=s disease antigen CD30-deficient mice. Cell 84:551-562, 1996.

36. J.-L. Bodmer, K. Burens, P. Schneider, K. Hoftnann, V. Steiner, M. Thome, T. Bomand, M. Hahne. M. Schroeter, K.. Becker, A. Wilson, L.E. French, J.L. Browning, H.R. MacDonald. and J. Tschopp. TRAMP, a novel apoptosis-mediating receptor with sequence homology to tumor neerosis factor receptor 1 and fas (apo-l/CD95).

Imm unity 6: 79-88, 1997.

37. J. Brojatsch, J. Naughton, M.M. Rolls, K. Zingler and J.A.T. Young. Caři, a TNFRrelated protein is a cellular receptor for cytopathic avian lleukosis-sarcoma viruses and mediates apoptosis. Cell 87: 845-855, 1996.

38. J.L. Browning. M.J. Androlewicz and C.F. Ware. Lymphotoxin and an associated 33kDa glvcoprotein are expresed on the surface of an activated human T cell hybridoma. J. Immunol. 147:1230-7,1991.

-27CZ 297387 B6

39. J.L. Browning, K. Miatkowski, D.A. Griffiths, P.R.Bourdon, C. Hession, C.M. Ambrose and W. Meier. Preparation and characterization of soluble recombinant heterotrimeric complexes of human lymphotoxins alpha and beta. J, Biol. Chem. 271: 8618-26, 1996.

40. J.E. Castro, J.A. Listman, B.A. Jacobson, Y. Wang, P.A. Lopez, S. Ju, P.W. Finn and D.L. Perkins. Fas Modulation of apoptosis during negative selection of thymocytes. Immunitv 5: 617-627,1996.

41. C.-Y.A. Chen and A.-B. Shyu. AU-rich elements: characterization and importance in mRNA degradation. Trends in Biol, Sci. 20:465-470, 1995.

42. Y. Chicheportiche, C. Ody and P. Vassalli. Identification in mouše macrophagcs of a new 4 kb mRNA present in hematopoietic tissue whích shares a short nucleotide sequence with erythropoietin mRNA. Biochim. Biophvs. Res. Comm. 209: 10761081,1995.

43. A.M. Chinnaiyan, K. O=Rourke, G.-L. Yu, R.H. Lyons, M. Garg, D.R. Duan, L. Xing, R. Genu, J. Ni and V.M. Dixit. Signál transduction by DR3 a death-domain-containing receptor related to TN'FR-1 and CD95. Science 274:990-992, 1996.

44. P. DeTogni et al. Abnormal development of peripheral lymphoid organs in mice deficient in lymphotoxin. Science 264: 703-7, 1994.

45. M.A. DeBenedevte, N.R. Chu, K.E. Poliok, J. Hurtako, W.F. Wade, B.S. Kwon and T.H.Wans. Role of4-lBB ligand in costimulation ofT lymphocyte growth and its upregulation on M12 B lymphomas by cAMP. J, Exp. Med. 181: 985-992, 1995.

46. M. Degli-Esposti, T. Davis-Smith, W.S. Din, P.J. Smolak, R.G. Goodwin and C.A. Smith. Activation of the lymphotoxin-β receptor by cross-linking induces chemokine production and growth arrest in A375 melanoma cells. J. Immunol, 158: 1756-1762, 1997.

47. T.M. Foy, A. Aruffo, J. Bajorath, J.E. Buhlmann and R.J. Noelle. Immune regulation by CD40 and its ligand gp39. Ann, Rev, Immunol.. 14: 591-617, 1996.

48. H.J. Gruss, N. Boiani, D.E. Williams, R.J. Armitage, C.A. Smith and R.G. Goodwin. Pleiotropic effects of the CD30 ligand on CD30-expressing cells and Iymphoma cell lineš. Blood 83: 2045-56, 1994.

49. H.J. Gruss and S.K. Dower. Tumor neerosis factor ligand superfamily: involvement in the pathology of malignant lymphomas. Blood 85: 3378-404, 1995.

50. J. Kitson, T. Raven, Y.-P. Jiang, D.V. Goeddel, K.M. Giles, K.-T. Pun, C.J. Grinham, R.Brown and S.N. Farrow. A death domain-containing receptor that mediates apoptosis. Nátuře 384: 372-375, 1996.

-28CZ 297387 B6

51. S.Y. Lee, C.G. Park and Y. Choi. T cell receptor-dependent cell death of T cel! hybridomas mediated by the CD30 cytoplasmic domain in association with tumor necrosis factor receptor-associated factors. J. Exp. Med. 183: 669-674, 1996.

52. R.I. Montgomery, M.S. Wamer, B.J. Lum and P.G. Spear. Herpes simplex virus-1 entry into celis mediated by a novel member of the TNF/NGF receptor family. Cell 87: 427-436, 1996.

53. S. Nagata. Apoptosis by death factor. Cell 88:355-365,1997.

54. R.M. Fini, S.A. Marsters, S. Ruppert, C.J. Donahue, A. Moore and A. Ashkenazi. Induction of apoptosis by Apo-2 ligand, a new member of the tumor necrosis factor cytokine family. J. Biol. Chem. 1996.

55. C.A. Smith, T. Farrah and R.G. Goodwin. The TNF receptor superfamily of cellular and viral proteins: activation, costimulation, and death. Cell 76: 959-62, 1994.

56. G.L. Smith. Virus strategies for evasion of the host response to infection. Trends in MicrobioL 3:81-88,1994.

57. E.Strueber and W. Strobcr, The T cell-B cell interaction via OX40-OX40L is necessary for the T celí independent humoral immune response. J. Exp. Med. 183:979-989, 1996.

58. H.-K. Sytwu, R.S. Liolau and H.O. McDevitt. The roles of Fas/Apo-1 (CD95) and TNF in antigen-induced programrned cell death in T cell receptor trangenic mice. Immunity 5:17-30,1996.

59. P. Vassalli. The palhopnysiologv of tumor necrosis factors. Ann, Re v Immunol. 10: 411-452, 1992.

60. L. Zheng, G. Fisher, R.E. Miller, J. Peschon, D.H. Lynch and M.J. Lenardo. Induction of apoptosis in mature T celis by rumour necrosis factor. Nátuře 377: 348-351, 1995.

SEZNAM SEKVENCÍ (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 1:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 1168 párů bází (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: dvojité (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: cDNA (iii) HYPOTETICKÁ: ne (iv) OPAČNÁ ORIENTACE: ne (vi) PŮVODNÍ ZDROJ:

(A) ORGANISMUS: protein příbuzný rodině TNF

-29CZ 297387 B6 (ix) ZNAKY:

(A) JMÉNO/KLÍČ: CDS (B) POZICE: 2..676 (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 1:

G GTG CTG AGC CTG GGC CTG GCG CTG GCC TGC CTT GGC CTC CTG CTG 46

Val Leu Ser Leu Gly Leu Ala Leu Ala Cys Leu Gly Leu Leu Leu 15 10 15

GTC Val

GTG GTC

AGC Ser

CTG GGG

AGC Ser

TGG Trp

GCA ACG CTG

TCT GCC

CAG GAG

CCT Pro

94

Val

Leu 20

Gly

Ala

Thr 25

Leu

Ser

Ala

Gin

Glu 30

TCT

CAG

GAG

CTG

ACA

GCA

GAG

GAC

CGC

CGG

GAG

CCC

CCT

GAA

CTG

142

Ser

Gin

Glu

Leu

Thr

Ala

Glu

Asp

Arg

Glu

Pro

Glu

Leu

35

40

45

AAT

CCC

CAG

ACA

GAG

GAA

AGC

CAG

GAT

GTG

GTA

CCT

TTC

TTG

GAA

CAA

190

Asn

Pro

Gin

Thr

Glu

Ser

Gin

Asp

Val

Pro

Phe

Leu

Glu

Gin

50

55

60

CTA

GTC

CGG

CCT

CGA

AGA

AGT

GCT

CCT

AAA

GGC

CGG

AAG

GCG

CGG

CCT

238

Leu

Val

Arg

Pro

Arg

Ser

Ala

Pro

Lys

Gly

Arg

Lys

Ala

Arg

Pro

65

70

75

CGC

CGA

GCT

ATT

GCA

GCC

CAT

TAT

GAG

GTT

CAT

CCT

CGG

CCA

GGA

CAG

286

Arg

Ala

Ile

Au. a

Ala

His

Tyr

Glu

Val

His

Pro

Arg

Pro

Gly

Gin

80

85

90

95

GAT

GGA

GCA

CAA

GCA

GGT

GTG

GAT

GGG

ACA

GTG

AGT

GGC

TGG

GAA

GAG

334

Asp

Gly

Ala

Gin

Ala

Gly

Val

Asp

Gly

Thr

Val

Ser

Gly

Trp

Glu

100

105

110

-30CZ 297387 B6

ACC Thr	AAA ATC	AAC Asn 115	AGC Ser
Lys	Ile
GAA	TTT	ACA	GTC	ATC
Glu	Phe	Thr	Val	ile
		130

TCC AGC CCT CTG CGC TAC Ser Ser Pro Leu Arg Tyr

120

GAC CGC CAG ATT GGG Asp Arg Gin Ile Gly 125

AGG GCT GGG CTC TAC TAC CTG TAC TGT CAG GTG

Arg Ala Gly Leu Tyr Tyr Leu Tyr Cys Gin Val

302

430

CAC His

TTT GAT GAG GGA AAG GCT GTC TAC

CTG AAG CTG

GAC Asp

TTG Leu

CTG Leu

GTG Val

478

Phe 145

Asp

Glu Gly

Lys Ala 150

Val

Tyr

Leu

Lys

Leu 155

AAC

GGT

GTG

CTG

GCC

CTG

CGC

TGC

CTG

GAA

TTC

TCA

GCC

ACA

GCA

526

Asn

Gly

Val

Leu

Ala

Leu

Arg

Cys

Leu

Glu

Phe

Ser

Ala

Thr

Ala

160

165

170

175

GCA

AGC

TCT

CCT

GGG

CCC

CAG

CTC

CGT

TTG

TGC

CAG

GTG

TCT

GGG

CTG

574

Ala

Ser

Pro

Gly

Pro

Gin

Leu

Arg

Leu

Cys

Gin

Val

Ser

Gly

Leu

180

185

190

TTG

CCG

CTG

CGG

CCA

GGG

TCT

TCC

CTT

CGG

ATC

CGC

ACC

CTC

CCC

TGG

622

Leu

Pro

Leu

Arg

Pro

Gly

Ser

Leu

Arg

Ile

Arg

Thr

Leu

Pro

Trp

195

200

205

GCT

CAT

CTT

AAG

GCT

GCC

CCC

TTC

CTA

ACC

TAC

TTT

GGA

CTC

TTT

CAA

670

Ala

His

Leu

Lys

Ala

Pro

Phe

Leu

Thr

Tyr

Phe

Gly

Leu

Phe

Gin

210

215

220

GTT CAC TGAGGGGCC” TGCTCTCCCA GATTCCTTAA ACTTTCCCTG GCTCCAGGAG 726

Val His

225

CATCACCACA	CCTCCCTACC	CCACCCCCAC	TCCTCCACCC	CCTCGCTGCT	CCTTGGTCCA	786
GTCCTGTCTC	TCCTCAAAGG	CAGCCAGAGC	T7GTTCACAT	GTTTCCATTC	CACAGACGTA	846
TCCTTGCTCT	TCTTAACATC	CCATCCCACC	ACAACTATCC	ACCTCACTAG	CTCCCAAAGC	906
CCCTACTTAT	CCCTGACTCC	CCCACCCACT	CACCCGACCA	CGTGTTTATT	GACTTTGTGC	966
ACCAGGCACT	GAGATGGGCT	GGACCTGGTG	GCAGGAAGCC	AGAGAACCTG	GGACTAGGCC	1026
AGAAG7TCCC	AACTGTGAGG	GGGAAGAGCT	GGGGACAAGC	TCCTCCCTGG	ATCCCTGTGG	10B6
A Γ GAAAA	GATAC7ATTT	ΤΤΑΤΤΆΤΤΑΤ	TGTGACAAAA	TGTTAAATGG	ATATTAAAGA	1146
GAATAAATCA	TGATTTCTCT	TC				1168

(2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 2:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 225 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: protein

-31 CZ 297387 B6 (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 2:

Val 1

Leu

Ser Leu Gly Leu 5

Ala Leu Ala Cys 10

Leu Gly

Leu

Leu 15

Val

Ser

Leu

Gly

Ser

Trp

Ala

Thr

Leu

Ser

Ala

Gin

Glu

Pro

Ser

20

25

30

Gin

Glu

Leu

Thr

Ala

Glu

Asp

Arg

Glu

Pro

Glu

Leu

Asn

35

40

45

Pro

Gin

Thr

Glu

Ser

Gin

Asp

Val

Pro

Phe

Leu

Glu

Gin

Leu

50

55

60

Val

Arg

Pro

Arg

Ser

Ala

Pro

Lys

Gly

Arg

Lys

Ala

Arg

Pro

Arg

65

70

75

80

Arg

Ala

Ile

Ala

His

Tyr

Glu

Val

His

Pro

Arg

Pro

Gly

Gin

Asp

85

90

95

Gly

Ala

Gin

Ala

Gly

Val

Asp

Gly

Thr

Val

Ser

Gly

Trp

Glu

Thr

100

105

110

Lys

Ile

Asn

Ser

Pro

Leu

Arg

Tyr

Asp

Arg

Gin

Ile

Gly

Glu

115

120

125

Phe

Thr

Val

Ile

Arg

Ala

Gly

Leu

Tyr

Leu

Tyr

Cys

Gin

Val

His

130

135

140

Phe

Asp

Glu

Gly

Lys

Ala

Val

Tyr

Leu

Lys

Leu

Asp

Leu

Val

Asn

145

150

155

160

Gly

Val

Leu

Ala

Leu

Arg

Cys

Leu

Glu

Phe

Ser

Ala

Thr

Ala

165

170

175

Ser

Pro

Gly

Pro

Gin

Leu

Arg

Leu

Cys

Gin

Val

Ser

Gly

Leu

180

18S

190

Pro

Leu

Arg

Pro

Gly

Ser

Leu

Arg

Ile

Arg

Thr

Leu

Pro

Trp

Ala

195

200

205

His

Leu

Lys

Ala

Pro

Phe

Leu

Thr

Tyr

Phe

Gly

Leu

Phe

Gin

Val

210

215

220

His

225

-32CZ 297387 B6 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 3:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 1373 párů bází (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: dvojité (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: cDNA (iii) HYPOTETICKÁ: ne (iv) OPAČNÁ ORIENTACE: ne (vi) PŮVODNÍ ZDROJ:

(A) ORGANISMUS: protein příbuzný rodině TNF (ix) ZNAKY:

(A) JMÉNO/KLÍČ: CDS (B) POZICE: 1..852

-33CZ 297387 B6 (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 3:

ATG Met 5

TCA Ser

TTG TTA GAC Leu Leu Asp 5

TTT Phe

GAA Glu

ATT TCC GCC CGC CGG

CTC Leu

CCC Pro

CTC CCC Leu Pro 15

48

Ile

Ser

Ala 10

Arg

CGA

TCC

CTC

GGG

TCC

CGG

GAT

GGG

GCG

GTG

AGG

CAG

GCA

CAG

CCC

96

Arg

Ser

Leu

Gly

Ser

Arg

Asp

Gly

Ala

Val

Arg

Gin

Ala

Gin

Pro

20

25

30

CCC

GCC

ccc

ATG

GCC

CGT

CGG

AGC

CAG

AGG

CGG

AGG

GGG

CGC

CGG

144

Pro

Ala

Pro

Met

Ala

Arg

Ser

Gin

Arg

Gly

Arg

3S

40

45

GGG

GAG

CCG

GGC

ACC

GCC

CTG

GTC

CCG

CTC

GCG

CTG

GGC

CTG

GGC

192

Gly

Glu

Pro

Gly

Thr

Ala

Leu

Val

Pro

Leu

Ala

Leu

Gly

Leu

Gly

50

55

€0

CTG

GCG

CTG

GCC

TGC

CTC

GGC

CTC

CTG

GCC

GTG

GTC

AGT

TTG

GGG

240

Leu

Ala

Leu

Al a

Cvs

Leu

Gly

Leu

Ala

Val

Ser

Leu

Gly

65

70

75

80

AGC

CGG

GCA

TCG

CTG

TCC

CAG

GAG

CCT

GCC

CAG

GAG

CTG

GTG

288

Ser

Arg

Ala

Ser

Leu

ser

Ala

Gin

Glu

Pro

Ala

Gin

Glu

Leu

Val

B5

90

95

GCA

GAG

GrtG

GAC

CAG

GAC

CCG

TCG

GAA

CTG

AAT

CCC

CAG

ACA

GAA

336

Al 3

Glu

G1U

Asp

Gin

Asp

Pro

Ser

Glu

Leu

Asn

Pro

Gin

Thr

Glu

100

105

110

AGC

CAG

GAT

CCT

GCG

CCT

TTC

CTG

AAC

CGA

CTA

GTT

CGG

CCT

CGC

AGA

384

Ser

Gin

Asp

Pro

Ala

Pro

Phe

Leu

Asn

Arg

Leu

Val

Arg

Pro

Arg

115

120

125

432

CGA AGA GCG ATC GCA GCC

Arg Arg Ala Ile Ala Ala 140

CCT AAA GGC CGG AAA ACA CGG GCT

Pro Lye Gly Arg Lys Thr Arg Ala

135

AGT GCA

Ser Ala

130

-34CZ 297387 B6

CAT His 145

TAT

GAA GTT

CAT CCA

CGA Arg

CCT GGA CAG GAC

GGA Gly

GCG Ala

CAG GCA GGT

480

Glu

Val

His

Pro 150

Pro

Gly

Gin

Asp 155

Gin

Ala

Gly 160

G * G

GAC

GGG

ACA

GTG

AGT

GGC

TGG

GAG

GAA

GCC

AGA

ATC

AAC

AGC

TCC

528

Val

Asp

Gly

Thr

Val

Ser

Gly

Trp

Glu

Ala

Arg

Ile

Asn

Ser

16S

170

175

AGC

CTG

CGC

TAC

AAC

CGC

CAG

ATC

GGG

GAG

TTT

ATA

GTC

ACC

CGG

576

Ser

Pro

Leu

Arg

Tyr

Asn

Arg

Gin

Ile

Gly

Glu

Phe

Ile

Val

Thr

Arg

1BC

1BS

190

GCT

GGG

CTC

TAC

CTG

<*·

TGT

CAG

GTG

CAC

TTT

GAT

GAG

GGG

AAG

624

Ala

Gly

Leu

Tyr

Leu

Tyr

Cys

Gin

Val

His

Phe

Asp

Glu

Gly

Lys

195

200

205

GCT

GTC

TAC

CTG

AAG

CTG

GAC

TTG

CTG

GTG

GAT

GGT

GTG

CTG

GCC

CTG

672

Ala

Val

Tyr

Leu

Lys

Leu

Asp

Leu

Val

Asp

Gly

Val

Leu

Ala

Leu

210

215

220

CGC

TGC

CTG

GAG

GAA

TTC

TCA

GCC

ACT

GCG

GCC

AGT

TCC

CTC

GGG

CCC

720

Arg

Cys

Leu

Glu

Phe

Ser

Ala

Thr

Ala

Ser

Leu

Gly

Pro

225

230

235

240

CAG

CTC

CGC

CTC

TGC

CAG

GTG

TCT

GGG

CTG

TTG

GCC

CTG

CGG

CCA

GGG

768

Gin

Arg

Leu

Cys

Gin

Val

Ser

Gly

Leu

Ala

Leu

Arg

Pro

Gly

245

250

255

TCC

CTG

CGG

ATC

CGC

ACC

CTC

CCC

TGG

GCC

CAT

CTC

AAG

GCT

GCC

816

Ser

Leu

Arg

Ile

Arg

Thr

Leu

Pro

Trp

Ala

His

Leu

Lys

Ala

250

265

270

ccc

TTC

CTC

ACC

TAC

TTC

GC-A

CTC

TTC

CAG

GTT

CAC

TGAC-GGGCCC

862

Pro

Phe

Leu

Thr

Tyr

Phe

Gly

Leu

Phe

Gin

Val

His

275

280

TGGTCTCCCC	ACAGTCGTCC	CAGGCTGCCG	GCTCCCCTCG	ACAGCTCTCT	GGGCACCCGG	922
TCCCCTCTGC	CCCACCCTCA	GCCGCTCTTT	GCTCCAGACC	TGCCCCTCCC	TCTAGAGGCT	982
GCCTGGGCCT	GTTCACGTGT	TTTCCATCCC	ACATAAATAC	AGTATTCCCA	CTCTTATCTT	1042
ACAACTCCGC	CACCGCCCAC	TCTCCACCTC	ACTAGCTCCC	CAATCCCTGA	CCCTTTGAGG	1102
CCCC'>_AGTGA	TCTCGACTCC	CCCCTGGCCA	CAGACCCCCA	GGGCATTGTG	TTCACTGTAC	1162
	AG ortTuuiGTC	CAGAAGACCC	CACTTCAGGC	ACTAAGAGGG	GCTGGACCTG	1222
GCGGCAGGAA	GCCAAAGAGA	CTGGGCCTAG	GCCAGGAGTT	CCCAAATGTG	AGGGGCGAGA	1282
AACAAGACAA	GCTCCTCCCT	TGAGAATTCC	CTGTGGATTT	TTAAAACAGA	TATTATTTTT	1342

ATTATTATTG TGACAAAATG TTGATAAATG G (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 4:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 284 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina

1373

-35CZ 297387 B6 (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: protein (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 4:

Met 1

Ser

Leu

Leu Asp 5

Phe Glu

Ile

Ser Ala 10

Arg

Leu

Pro

Leu 15

Pro

Arg

Ser

Leu

Gly

Ser

Arg

Asp

Gly

Ala

Val

Arg

Gin

Ala

Gin

Pro

20

25

30

Pro

Ala

Pro

Met

Ala

Arg

Ser

Gin

Arg

Gly

Arg

35

40

45

Gly

Glu

Pro

Gly

Thr

Ala

Leu

Val

Pro

Leu

Ala

Leu

Gly

Leu

Gly

50

55

60

Leu

Ala

Leu

Ala

Cys

Leu

Gly

Leu

Ala

Val

Ser

Leu

Gly

65

70

75

50

Ser

Arg

Ala

Ser

Leu

Ser

Ala

Gin

Glu

Pro

Ala

Gin

Glu

Leu

Val

85

90

95

Ala

Glu

Asp

Gin

Asp

Pro

Ser

Glu

Leu

Asn

Pro

Gin

Thr

Glu

100

105

3.10

Ser

Gin

Asp

Pro

Ala

Pro

Phe

Leu

Asn

Arg

Leu

Val

Arg

Pro

Arg

115

120

125

Ser

Ala

Pro

Lys

Gly

Arg

Lys

Thr

Arg

Ala

Arg

Ala

Ile

Ala

130

135

140

His

Tyr

Glu

Val

His

Pro

Arg

Pro

Gly

Gin

Asp

Gly

Ala

Gin

Ala

Gly

145

150

155

160

Val

Asp

Gly

Thr

Val

Ser

Gly

Trp

Glu

Ala

Arg

Ile

Asn

Ser

165

170

175

Ser

Pro

Leu

Arg

Tyr

Asn

Arg

Gin

Ile

Gly Glu

Phe

Ile

Val

Thr

Arg

1Θ0

185

190

Ala

Gly

Leu

Tyr

Leu

Tyr

Cys

Gin

Val

His

Phe

Asp

Glu

Gly

Lys

195 200 205

-36CZ 297387 B6

Ala

Val 210

Tyr

Leu

Lys

Leu

Asp 215

Leu

Val

Asp

Gly 220

Val

Leu

Ala

Leu

Arg 225

Cys

Leu

Glu

Phe 230

Ser

Ala

Thr

Ala

Ala 235

Ser

Leu

Gly

Pro 240

Gin

Leu

Arg

Leu

Cys 245

Gin

Val

Ser

Gly

Leu 250

Leu

Ala

Leu

Arg

Pro 255

Gly

Ser

Leu

Arg 260

Ile

Arg

Thr

Leu

Pro 265

Trp

Ala

His

Leu

Lys 270

Ala

Pro

Phe

Leu

Thr

Tyr

Phe

Gly

Leu

Phe

Gin

Val

His

275 280

PATENTOVÉ NÁROKY

Claims

1. Sekvence DNA vybraná ze skupiny sestávající z:

(a) sekvence DNA obsahující nukleotidovou sekvenci uvedenou jako sekvence id. č. 1 nebo sekvence id. č. 3, (b) sekvence DNA kódující polypeptid, který má aminokyselinovou sekvenci uvedenou jako sekvence id. č. 2 nebo sekvence id. č. 4, (c) sekvence DNA, která kóduje alespoň fragment polypeptidu podle (b), přičemž fragment si zachovává schopnost indukovat apoptózu buněk karcinomu tlustého střeva HT-29, (d) sekvence DNA, která je alespoň z 60 % homologní se sekvencí DNA podle (a), a která kóduje polypeptid schopný indukovat apoptózu buněk karcinomu tlustého střeva HT-29, (e) sekvence DNA, která kóduje rozpustnou formu polypeptidu kódovaného sekvencí podle kteréhokoliv z bodů (a) až (d) zachovávající si schopnost indukovat apoptózu buněk karcinomu tlustého střeva HT-29, nebo její komplementární řetězec.

2. Sekvence DNA podle nároku 1, která kóduje polypeptid mající aminokyselinovou sekvenci id. č. 4, nebo její komplementární řetězec.

3. Sekvence DNA podle nároku 1, bodu (c), kde fragment polypeptidu má N-koncový fragment začínající aminokyselinou kódovanou kteroukoliv z nukleotidových poloh:

(i) nukleotidů 65 až 241 sekvence id. č. 1 nebo (ii) nukleotidů 241 až 417 sekvence id. č. 3.

4. Sekvence DNA podle nároku 1, bodu (c), nebo nároku 3, kde fragment kódovaný DNA sekvencí má N-koncový fragment začíná kteroukoliv aminokyselinou z aminokyselinových poloh:

(i) aminokyselin 22 až 80 sekvence id. č. 2 nebo (ii) aminokyselin 81 až 139 sekvence id. č. 4.

5. Sekvence DNA podle nároku 1, bodu (c), která obsahuje nukleotidy 106 až 852 ze sekvence id. č. 3.

-37CZ 297387 B6

6. Sekvence DNA podle nároku 1, bodu (c), nebo nároku 5, kde fragment kódovaný DNA sekvencí obsahuje aminokyseliny 36 až 284 ze sekvence id. č. 4.

7. Sekvence DNA podle kteréhokoliv z nároků 1 až 6, která je cDNA nebo genomová DNA.

8. Rekombinantní molekula DNA, která obsahuje sekvenci DNA podle kteréhokoliv z nároků 1 až 7, kterážto sekvence je operativně spojena se sekvencí řídící expresi.

9. Hostitelská buňka transformovaná vektorem obsahujícím DNA sekvenci nebo molekulu podle kteréhokoliv z nároků 1 až 8.

10. Hostitelská buňka podle nároku 9, která je eukaryotická nebo prokaryotická buňka.

11. Způsob přípravy polypeptidu kódovaného sekvencí DNA podle kteréhokoliv z nároků 1 až 7, vyznačující se tím, že zahrnuje krok, kdy se kultivuje hostitelská buňka podle nároku 9.

12. Polypeptid TRELL nebo jeho fragment mající aminokyselinovou sekvenci vybranou ze skupiny sestávající z:

(a) polypeptidu, který má aminokyselinovou sekvenci id. č. 2 nebo id. č. 4, (b) fragmentu polypeptidu podle (a), který indukuje apoptózu buněk karcinomu tlustého střeva HT-29, (c) fragmentu podle (b), který obsahuje aminokyseliny 22 až 80 ze sekvence id. č. 2, aminokyseliny 81 až 139 ze sekvence id. č. 4 nebo aminokyseliny 36 až 284 ze sekvence id. č. 4, (d) polypeptidu, který má alespoň 70% homologii s aminokyselinovou sekvencí id. č. 2 nebo 4, přičemž polypeptid má schopnost indukovat apoptózu buněk karcinomu tlustého střeva HT29, (e) polypeptidu, který je kódován sekvencí DNA id. č. 1 nebo 3, (f) polypeptidu, který je kódován DNA sekvencí začínající kterýmkoliv z nukleotidů 65 až 241 sekvence id. č. 1, a (g) polypeptidu, který je kódován DNA sekvencí začínající kterýmkoliv z nukleotidů 241 až 417 sekvence id. č. 3.

13. Polypeptid TRELL podle nároku 12, kterým je polypeptid podle bodu (c).

14. Protilátka nebo její fragment vázající antigen specificky reaktivní s polypeptidem podle nároku 12.

15. Protilátka nebo její fragment vázající antigen podle nároku 14 specificky reaktivní s polypeptidem podle nároku 12, bodu (c).

16. Protilátka nebo její fragment vázající antigen podle nároku 14, která je monoklonální, polyklonální, chimérická nebo humanizovaná protilátka.

17. Fragment vázající antigen protilátky podle nároku 14, který je fragmentem Fab' nebo F(ab')₂.

18. Protilátka nebo její fragment vázající antigen podle nároku 14, která blokuje působení TRELL a jeho receptoru.

19. Farmaceutická kompozice, vy z n a č uj í c í se t í m , že obsahuje sekvenci DNA podle kteréhokoliv z nároků 1 až 7, rekombinantní molekulu podle nároku 8, polypeptid podle nároku 12 a/nebo protilátku nebo její fragment vázající antigen podle kteréhokoliv z nároků 14 až 18.

-38CZ 297387 B6

20. Farmaceutická kompozice podle nároku 19, vyznačující se tická kompozice.

t í m , že je to diagnos-

21. Farmaceutická kompozice podle nároku 19, vyznačující se tím, že dále obsahuje farmaceuticky přijatelné nosiče, adjuvans nebo plnidla.

22. Farmaceutická kompozice podle nároku 19, vyznačující se tím, že obsahuje protilátku nebo její fragment vázající antigen specificky reaktivní s polypeptidem podle nároku 12, bodu (a).

23. Farmaceutická kompozice podle nároku 22 pro použití při prevenci nebo zeslabení síly imunitní reakce proti tkáňovému štěpu.

24. Farmaceutická kompozice podle nároku 22 pro použití při utlumení imunitního systému.

25. Farmaceutická kompozice podle nároku 22 pro použití při léčení rakoviny.

26. Farmaceutická kompozice podle nároku 19, vyznačující se tím, že obsahuje polypeptid podle nároku 12.

27. Farmaceutická kompozice podle nároku 26 pro použití při prevenci nebo zeslabení síly imunitní reakce proti tkáňovému štěpu.

28. Farmaceutická kompozice podle nároku 26 pro použití při stimulaci imunitního systému.

29. Farmaceutická kompozice podle nároku 26 pro použití při utlumení imunitního systému.

30. Farmaceutická kompozice podle nároku 26 pro použití při léčení rakoviny.

31. Způsob přípravy protilátek reaktivních s TRELL, vy zn ač u j í c í se t í m , že zahrnuje krok, kdy se TRELL nebo jeho antigenní fragment injikuje do organizmu s výjimkou člověka a protilátka reagující s TRELL nebo jeho antigenním fragmentem se z organizmu izoluje.

32. Antisense nukleová kyselina namířená proti TRELL obsahující nukleotidovou sekvenci hybridizující alespoň s částí sekvence id. č. 1 nebo sekvence id. č. 3.

33. Protilátka, která se váže na polypeptid TRELL nebo jeho fragment, jak je definován v nároku 12, pro použití jako diagnostické činidlo ke stanovení hladiny TRELL u pacientů s diagnózou:

(1) autoimunitního onemocnění, (2) imunitní reakce proti tkáňovému štěpu, (3) stavů spojených s nadměrnou stimulací imunitního systému, (4) stavů spojených s takovým imunitním systémem, který potřebuje stimulaci, a (5) rakoviny.

8 výkresů

-39CZ 297387 B6

Srovnání proteinu příbuzných rodině TNF (TFRPs) člověka a myši

O

Pí §

0 0 O Pí w

0 d W Pí fM