CZ2000869A3 - Nukleová kyselina kódující ligand APRIL, polypeptidy APRIL a farmaceutické přípravky obsahující tyto polypeptidy - Google Patents

Description

Oblast techniky

Předkládaný vynález se týká nového ligandu a polypeptidů, které jsou členy rodiny nádorového nekrotického faktoru. Nový ligand byl nazván APRÍL, což je zkratka pro A Proliferation Inducing Ligand, tj. ligand indukující proliferaci. Tyto proteiny nebo jejich receptory mají protinádorové a/nebo imunoregulační využití. Kromě toho buňky transfekované geny pro tyto nové ligandy se mohou užít v genové terapii pro léčení nádorů, autoimunitních a zánětlivých nemocí nebo dědičných genetických poruch, a protilátky blokující tyto proteiny mohou mít imunoregulační využití.

Dosavadní stav techniky

Cytokiny příbuzné nádorovému nekrotickému faktoru (TNF) jsou mediátory hostitelské obranné a imunitní regulace. Členové této proteinové rodiny se vyskytují ve formě ukotvené na buněčnou membránu, kdy působí lokálně prostřednictvím vzájemného kontaktu mezi buňkami, nebo se vyskytují jako vylučované proteiny schopné difundovat ke vzdálenějším cílům. Paralelní rodina receptorů ukazuje na to, že přítomnost těchto proteinů vede k iniciaci buněčné smrti nebo buněčné proliferace a diferenciace cílové tkáně. V současnosti rodina TNF ligandů a receptorů obsahuje nejméně 13 známých párů receptor-ligand: TNF:TNF-R, LT-a:TNF-R, LT-α/β:LT-p-R, FasL:Fas, CD40L:CD40, CD30L:CD30, CD27L:CD27, OX40L:OX40 • · • · • · • · · ·

a 4-1BBL:4-1BB, trance/rankL:Light a Tweak. Sekvence DNA kódující tyto ligandy vykazují identitu pouze ve 25 % až 30 %, a to dokonce i v případě největší příbuznosti, ačkoliv příbuznost na úrovni sekvence aminokyselin je přibližně 50%.

Určujícím rysem této rodiny cytokinových receptorů je extracelulární doména bohaté na cystein, která byla objevena (I) vlastnostmi při molekulovém klonování dvou různých receptorů TNF'^Á'. Tato genová rodina kóduj e glykoproteiny transmembránových proteinů typu I s extracelulární vazebnou aomenou aktivaci doménou vážící ligand a a cytoplazmatickým úsekem, transmembránovou se podílí na jeanou který buněčných funkcí. Úsek bohatý na cystein, který je současně vazebným úsekem pro ligand, má centrální doménu z hustě spojených disulfidových můstků, která se několikrát opakuje, což závisí na konkrétním členu rodiny. Většina receptorů má čtyři domény, ačkoliv jsou i receptory pouze se třemi doménami nebo naopak zase se šesti doménami.

Proteiny z rodiny TNF ligandů jsou charakteristické na svém N-konci krátkým úsekem hvdrofilních aminokyselin, který často obsahuje několik argininových nebo lysinových zbytků, které zřejmě slouží jako sekvence k zastavení přenosu. Pak mají transmembránový' -úsek a extracelulární úsek proměnné délky, který odděluje doménu vázající receptor na C-konci od buněčné membrány. Tento úsek se někdy nazývá stopka. Vazebný úsek C-konce představuje větší část proteinu a často, i když ne vždy, obsahuje glykosylační místa. Tyto geny postrádají klasické signální sekvence charakteristické pro membránové proteiny typu I, spíše odpovídají membránovým proteinům typu II, které mají C-konec zasahující mimo buňku a krátký N-konec zasahující do cytoplazmy. V některých případech, jako jsou TNF a LT-α, se může- objevit v průběhu časného opracování proteinu štěpení v úseku stopky a ligand pak existuje především v sekretované formě. Avšak většina ligandů se vyskytuje v membránové formě a zprostředkovává lokalizovaný přenos signálů.

Struktura těchto ligandů byla rozpoznána krystalografickou analýzou TNF, LT-α a CD40L. Struktura TNF a lymfotoxinu alfa (LT-α) je sendvičová, tj. skládají s ze dvou antiparalelnich β-skládaných listů s topologií tzv. meandru (Greek key nebo jelly roli'''¹). Odchylka rms mezi zbytky řetězců Ca a β je 0,61 C, což vede k domněnce o vysokém stupni podobnosti jejich molekulární topografie. Strukturálním rysem, který zjevně vyplývá z molekulárních studií CD40L, TNF a LT-α, je tendence těchto ligandů vytvářet oligomerní komplexy. Oligomerní struktuře je vlastní vytváření vazebných míst pro receptor v místě spojení mezi sousedními podjednotkami, čímž se vytváří multivalentní ligand. Analýzou krystalové struktury se zkoumala kvarterní struktura CD40L, TNF a LT-α a ukázalo se, že CD40L, TNF a LT-α existují jako trimery. Mnoho aminokyselin konzervativních pro tyto ligandy se vyskytuje právě v oblasti úseků kostry struktury β-listu. Je pravděpodobné, že základní sendvičová struktura je zachována u všech těchto molekul, neboť části těchto sekvencí kostry jsou zachovány mezi různými členy celé rodiny. Kvarterní struktura se zřejmě také udržuje, neboť konformace podjednotek pravděpodobně také zůstává podobné.

Členy rodiny TNF mohou být nejlépe charakterizovány jako hlavní přepínače v imunitním systému pro- řízení přežívání buněk a také buněčné diferenciace. V současnosti jsou známy pouze dva sekretované cytokiny, a sice TNF a LT-α, ' na rozdíl od většiny ostatních členů rodiny TNF zakotvených v membráně. Zatímco membránové formy TNF byly dobře charakterizovány a pravděpodobně mají jedinečnou biologickou funkci, funkcí sekretovaných TNF je všeobecná signalizace poplachu buňkám

- 4 • 9

vzdáleným od místa události, která příslušnou událost vyvolala. Sekrece TNF může znásobit událost vedoucí k dobře známými změnám ve výstelce cév a v buňkách v místě zánětu. Naproti tomu členy TNF rodiny vázané na membránu předávají signál prostřednictvím receptoru typu TNF pouze buňkám v přímém kontaktu. Tak např. pomocné T-buňky poskytují pomoc zprostředkovanou CD40 pouze takovým B-buňkám, se kterými se dostanou do přímého kontaktu prostřednictvím interakcí TCR. Podobná omezení na bezprostřední buněčný kontakt se týkají schopnosti indukovat buněčnou smrt u dobře prozkoumaného systému Fas.

Ligandy TNF je možné rozdělit do třech skupin na základě jejich schopnosti indukovat buněčnou smrt (viz tab. III). V první skupině jsou ligandy TNF, Fas a TRAIL, které mohou účinně indukovat buněčnou smrt v mnoha buněčných liniích a jejich receptory mají většinou kanonické smrtící domény. Pravděpodobně ligand DR-3 (TRAMP/WSL-1) by patřil také do této kategorie. Druhou skupinu tvoří takové ligandy, které spouštějí slabší signál' omezený jen na některé buněčné typy. Do této druhé skupiny patří např. TWEAK, ligand CD30 a 1Τσ.1β2. Zajímavou otázkou je, jak členy této skupiny mohou spouštět mechanismus vedoucí k- buněčné smrti, když nemají kanonickou smrtící doménu. Nepřítomnost této domény vede k domněnce, že existuje ještě jiný slabší způsob signalizace v mechanismu buněčné smrti. Do poslední skupiny patří ty členy, které nejsou schopny přenášet žádný signál vedoucí k buněčné smrti. Ale. pravděpodobně členy všech skupin mohou působit antiproliřeračně na některé typy buněk jako následek indukce diferenciace, jako např. CD40 (Funakoshi et al., 1SS4) .

Rodina TNF se dramaticky rozrostla v poslední době a obsahuje nyní 11 různých signálních drah zahrnujících

- 5 1936, Montgomery TNF je mediátor auroimunitnicn buněk, např. a cytotoxické NK-buňky dva různé receptory, regulaci imunitního systému. Expresní vzorce TWEAK a TRAIL ukazují, že v této rodině existuje značná funkční variabilita, dosud nerozpoznaná. To vyniklo zejména novým objevem dvou receptorů, které ovlivňují replikační schopnost viru . Rousova sarkomu a viru Herpes simplex, a také významnými objevy, že TNF mé antivirovou aktivitu a virus neštovic kóduje vějičkové TNF receptory (Brojatsch et al., et al., 1996, Smith 1994, Vassali 1992) septického šoku a kachexie^(Iii) a účastní se regulace vývoje hematopoetických buněk^IIV). Zdá se, že hraje hlavní roli jako mediátor v zánětlivé reakci a v obraně proti bakteriálním, virovým a parazitárním infekcím^<v!, a navíc má zřejmě protináaorovou aktivitu¹^¹. TNF se podílí také na různých chorobách^!VII). TNF je vytvářen různými typy jsou to makrofágy, fibroblasty, T-buňky (natural killer) '. TNF se váže na z nichž každý působí prostřednictvím odlišných specifických signálních molekul uvnitř buňky, což výsledně vede k odlišným účinkům ΤΝΕ^^λ! . TNF může existovat jednak ve formě vázané na membránu, ale i jako volný sekretovaný cytokin^IX).

LT-α má s TNF mnoho společných aktivit, jako např. vazbu na TNF receptory^ίΧΙ), ale na rozdíl od TNF je sekretovén hlavně aktivovanými T-buňkami a některými β-lymfoblastoidními nádory^í>,l2). Heteromerní komplex LT-α a LT-β je komplex vázaný na membránu, kde se váže na LT-β receptory^(A'^l2'^l). Systém LT (tj. LT s receptorem LT-R) se podílí na vývoji periferních lymfoidních orgánů, neboť genetické narušení LT-β vede k poruchám T- a B-buněk ve slezině a k vymizení lymfatických uzlin'

I.XIV)

Systém LT-β se také podílí na buněčné smrti λ v ixv) u některých linií adenokarcinomových buněk • · • · · ·

- 6 Fas-L, další člen rodiny TNF, je exprimován přednostně na aktivovaných T-buňkách^(XVI1. Indukuje smrt buněk nesoucích příslušný receptor, nádorových buněk a buněk infikovaných HIV, a sice mechanismem, který je znám jako programovaná buněčná smrt neboli apoptóza^!'''’^{Ji 1}. Kromě toho je známo, že nedostatek Fas nebo Fas-L vede k lymfoproliferativním poruchám, což potvrzuje roli systému Fas v regulaci imunitní odpovědi ^ίΛν^^{η 1}. Fas systém se také podílí na poškození jater v důsledku chronické infekce virové hepatitidy ^IX*^X) a na autoimunitní odpovědi u pacientů infikovaných HIV^ÍXX). Systém Fas se také účastní destrukce T-buněk u pacientů infikovaných HIV^(XX*^!.

TRAIL, další člen této rodiny, se zřejmě také podílí na buněčné smrti mnoha různých transformovaných buněčných linií různorodého původu^l?'^XI'^!.

CD40-L, další člen rodiny TNF, je exprimován na povrchu T-buněk a indukuje regulaci 3-buněk nesoucích CD40¹. Kromě toho je známo, že změny v genu pro CD40-L jsou příčinou nemoci známé jako syndrom hyper-IgM vázané na χ^:λ>-^ι'^!. Systém CD40 je také spojen s mnoha různými autoimunitními chorobami^{,Λ/Λ 1} a CD40-L má také antivirové vlastnosti^ίλ?ΛΙ). .Ačkoliv se systém CD40 podílí také na záchraně apoptických B buněk^(ΛΛν*') , u jiných buněk než' buněk imunitního systému indukuje apoptózu^|XXVI111. Mnohé další lymfocytární členy rodiny TNF se podílejí na kostimulaci^ÍXXiX).

Obecně lze shrnout, že členy rodiny TNF hrají základní regulační roli v řízení imunitního systému a v aktivaci akutního obranného systému hostitele. Vzhledem k současnému pokroku v ovlivňování členů rodiny TMF s cílem terapeutického prospěchu je pravděpodobné, že členy této rodiny mohou poskytnout jedinečné prostředky proti nemocem. Některé ligandy rodiny TNF mohou přímo indukovat apoptickou smrt mnohých transformovaných buněk, např. LT, TNF, ligand Fas a TRAIL (Nagata 1997) . Aktivace receptoru Fas a zřejmě i TNF a CD30 mohou indukovat buněčnou smrt netransformovaných lymfocytů, což může mít důležitou imunoregulační funkci (Amakawa et al.,

1926, Nagata 1997, Obecně je známo, smrticích domén, straně receptorů

1996, Zheng et al. , 1995).

spustí po agregaci není

Sytwu et al. že buněčná smrt se které jsou umístěny na cytoplazmatické TNF. Tyto smrtící domény organizují uspořádání různých složek signální transdukce, což nakonec vede k aktivaci celé kaskády (Nagata 1997). Některé receptory postrádají kanonické smrtící domény, např. receptor LTb a CD30 (3rowning et al. 1996, Lee et al., 1996) a přesto mohou indukovat buněčnou smrt, i když podstatně slaběji. Tyto receptory pravděpodobně fungují primárně tak, že indukují buněčnou diferenciaci a buněčná smrt je aberantním důsledkem u některých transformovaných buněčných linií, ačkoliv celý obrázek je dosud nejasný, neboť na základě studie s myšmi CD30 null se předpokládá smrtící role v negativní selekci v brzlíku (Amakawa et al., 1996). Naproti tomu, přenos signálů jinými drahami, jako např. právě prostřednictvím CD40, je vyžadován pro udržování a přežívání buněk. Z výše uvedeného vyplývá tedy potřeba charakterizovat další členy rodiny TNF a poskytnout tak 'další prostředky ' k léčení nemocí a ovlivňování imunitního systému.

Bylo navrhováno, že některé členy rodiny TNF by mohly projevovat terapeutický protinádorový účinek, např. v kombinaci s IL-2 (viz patent U.S. 5 425 940) . Avšak dodnes úplný a dostačující způsob léčení rakoviny.

znám

Kombinace chemoterapie se obecně užívá jak ve výzkumu tak i v klinické praxi, a sice s antimetabolity, alkylujícími činidly, antibiotiky, buněčnými jedy apod. Tyto léky se podávají samotné nebo v kombinaci s cílem dosáhnout • · · · • · * ·

- 8 cytotoxického účinku na nádory a/nebo redukovat či eliminovat výskyt buněk rezistentních k léku a omezit vedlejší účinky.

Podstata vynálezu

Předkládaný vynález se týká polypetidu zvaného APRÍL, a řeší řadu problémů, vyskytujicích se díky omezením a nevýhodám dosavadních řešení známých ze stavu techniky. Původci objevili nový člen cytokinové rodiny TNF a určili sekvenci aminokyselin jak myšího tak i lidského proteinu, včetně příslušných sekvencí DNA kódujících tyto proteiny. Vynález je možné využít pro identifikaci nových přípravků pro diagnózu a léčení mnohých nemocí a stavů, což je dále podrobněji popsáno, a také k získání dalších informací o imunitním systému a pro vlastní ovlivňování imunitního systému a imunitních procesu. Kromě toho se předkládaný vynález také týká indukce buněčné smrti při karcinomu.

Další vlastnosti a výhody předkládaného vynálezu budou popsány podrobněji v následujícím popisu, přitom částečně z popisu vyplynou a částečně je bude možno rozpoznat při využití vynálezu. Cíle vynálezu a jeho výhod lze dosáhnout pomocí přípravků a způsobů, které jsou zvláště zdůrazněny v popisu a v patentových nárocích, a také v průvodních obrázcích.

V souladu s cílem vynálezu, aby bylo dosaženo výhod vynálezu, jak je v popisu a příkladech povedení vynálezu uvedeno, vynález zahrnuje sekvence DNA kódující APRÍL. Specificky se vynález týká DNA sekvence kódující lidský APRÍL (sekvence s identifikačním číslem 1). Kromě toho se vynález týká také aminokyselinové sekvence nového ligandu. Aminokyselinová sekvence lidského APRÍL je zde uvedena jako

- 9 • » • « • ·

sekvence identifikačního čísla 2 (id. č. 2). Kromě toho je zde popsána sekvence myšího APRÍL uvedena jako sekvence id. č. 3 a 4. Další provedení vynálezu se týká sekvencí, které mají alespoň 50? homologii se sekvencí DNA kódující 5'-koncovou vazebnou doménu pro receptor, a přitom hybridizují se sekvencí podle vynálezu nebo jejím fragmentem, a které kóduje APRÍL mající sekvenci uvedenou zde jako sekvenci id. č. 1 nebo protein mající podobnou biologickou aktivitu.

Některá provedení vynálezu se týkají sekvencí DNA kódující APRÍL, kde sekvence jsou operativně spojeny se sekvencí kontrolující expresi. Pro použití podle vynálezu je vhodná jakákoliv sekvence pro kontrolu exprese a vhodná sekvence muže být odborníkem snadno vybrána.

Předkládaný vynález se dále týká rekombinantní DNA, která obsahuje sekvenci DNA kódující APRÍL nebo její fragment, a také hostitelů, kteří mají sekvenci APRÍL trvale integrovanou v genomu nebo v podobě episomálního elementu. Podle vynálezu je možné užít jakéhokoliv vhodného hostitele, který může být snadno vybrán odborníkem bez nutnosti nadměrného experimentování.

Další provedení předkládaného vynálezu se týká způsobu přípravy v podstatě čistého APRÍL, který obsahuj kroky, kdy se kultivuje transformovaný hostitel, a dále se týká APRÍL v podstatě zbaveného všech živočišných proteinů, které jsou s ním normálně asociovány.

Vynález se také týká ligandů APRÍL, které mají aminokyselinovou sekvenci uvedenou zde jako sekvenci id. č. 2 nebo jejich fragmentů či homologů. V různých provedeních vynálezu sekvence aminokyselin nebo sekvence DNA APRÍL mohou obsahovat konzervativní inzerce, delece a substituce, jak bude ukázáno dále, nebo mohou obsahovat fragmenty zmíněných sekvencí.

-ιόν jiném provedení se předkládaný vynáleze týká rozpustného konstruktu APRÍL, který je možné použít pro přímé spuštění farmakologické události, kterou zprostředkovává APRÍL. Taková událost může mít terapeutický účinek při stimulaci růstu, v léčení rakoviny a nádorů nebo v manipulaci s imunitním systémem pro léčení imunologických onemocnění. Rozpustné formy APRÍL mohou být metodami genového inženýrství upraveny tak, aby obsahovaly snadno rozpoznatelnou značku, a tím umožnily identifikaci receptorů pro tyto ligandy.

Další provedení předkládaného vynálezu se týkají protilátek proti APRÍL a jejich použití k léčení rakoviny, nádorů, nebo k ovlivňování imunitního systému při léčení imunologických nemocí.

Ještě další provedení předkládaného vynálezu se týká zpuscbů genové terapie pomocí genů pro APRÍL podle předkládaného vynálezu.

Farmaceutický přípravek podle předkládaného vynálezu může případně obsahovat také farmaceuticky přijatelný nosič, adjuvans, plnidlo nebo jiné farmaceutické přípravky, a může být podáván jakýmkoliv způsobem známým v oboru.

Jak předcházející stručný přehled tak i následující podrobný popis vynálezu je třeba považovat za vysvětlení vynálezu a za pouhé příklady provedení vynálezu, které slouží k podrobnějšímu vysvětlení předkládaného vynálezu.

Taktéž obrázky, sloužící k lepšímu porozumění vynálezu a tvořící součást popisu vynálezu, jsou určeny k tomu, aby ilustrovaly některá provedení vynálezu a společně s popisem sloužily k vysvětlení principu předkládaného vynálezu.

« *

- 11 Popis obrázků

Obr. 1. A) Predikovaná aminokyselinová sekvence lidského APRÍL. Je znázorněna predikovaná transmembráncvá oblast (TM, v rámečku), potenciální místa N-glykosylace (označena hvězdičkou) a N-kcnec rekombinantního rozpustného APRÍL (sAPRIL).

3) Srovnání extracelulární proteinové sekvence APRÍL a několika dalších členů rodiny TNF ligandú. Identické a homologní zbytky jsou označeny černě, popřípadě šedě vyplněným rámečkem, TNFa je nádorový nekrotický faktor a, LTa je lymfotoxin a, FasL je ligand Fas(CD95), TRANCE je ligand RANK.

Obr. 2. Exprese APRÍL. A) Northernová analýza (Northern blot) se 2 pg poiyAFRNA v každé dráze u různých lidských tkání se sondou APRÍL cNA.

3) Exprese APRÍL mRNA v různých nádorových buněčných liniích: promyelocytární leukémie HL60, HeLa buňky S3, chronická myeloidní leukémie K562, lymfoblastická leukémie Molt-4, Burkittův lymfom Ráji, kolorektální karcinom A459, melanom G361.

C) Exprese A.PRIL mRNA ve čtyřech různých lidských nádorech (T) a normální tkáni (N) . Pás 18S rRNA je kontrola, která ukazuje shodné nanesení vzorků.

D) Exprese A.PRIL mRNA u primárního karcinomu tlustého střeva. Hybridizace in šitu odhalila nadbytek mRNA pro APRÍL u karcinomu tlustého střeva ve srovnání s normální střevní tkání. Řezy z nádorové tkáně a přilehlé normální tkáně byly hybridizovány s anti-sense cRNA A.PRIL značenou S a jako kontrola byly hybridizovány řezy z nádorové tkáně se sense cRNA APRÍL značenou (negativní kontrola). Horní panely jsou • « « · « ·

- 12 mikrofotografie v temném poli, spodní panely jsou odpovídající mikrofotografie ve světelném poli.

Obr. 3. APRÍL stimuluje buněčný růst. A) Na dávce závislé zvýšení proliferace buněk Jurkat (lidské leukemické T-buňky), stanovené 24 hodin po přidání rozpustného APRÍL. Jako kontroly byly užity ligand Pas (FasL), Tweak a vzorek bez ligand (Kontrola)(levý panel: životaschopnost buněk, pravý panel: inkorporace ^JH-thymidinu.

3) Vliv vyčerpání APRÍL značeného FLAG na růst nádorových buněk. Proliferativní účinek APRÍL značeného FLAG byl neutralizován protilátkami anti-FLAG, ale nikoliv protilátkami anti-myc. C) Účinek APRÍL na rychlost proliferace buněk Ráji (lidské 3-buňky Burkittova lymíomu), buněk A20 (myší 3-lymfom), buněk 3JA3 (lidský 3 lymfom), COS (psí epitelové buňky), MCF-7 (lidský adenokarcinom prsu), HeLa (lidský epiteloidní karcinom) a M3260 (lidský mekanom).

D) Vliv koncentrace telecího fetšlního séra na proliferaci buněk Jurkat indukovanou -APRÍL.

Obr. 4. APRÍL urychluje buněčný růst. A) Charakterizace klonů NIH-3T3 transf ekovaných APRÍL. Hladiny FLAG-APRIL u různých klonů byly analyzovány pomocí westernového přenosu s protilátkou anti-FLAG. Šipka ukazuje protein APRÍL, vysokomolekulární protein je detekován nespecificky.

3) NIH-3T3 klony exprimující APRÍL rostou rychleji než kontrolní slepě transfekované klony.

C) Zrychlený nádorový růst u klonů NIH-3T3 exprimujících APRÍL. Buňky NIH-3T3 (1 χ 10⁵ buněk) a buňky transfekované APRÍL (NIH-AP, 2 různé klony, 1 χ 10⁶ buněk) byly injikovány subkutánně nahým myším a byl monitorován růst nádoru.

- 13 Obr. 5. Srovnání lidské a myší aminokyselinové sekvence APRÍL ukazuje oblast rozsáhlé identity u těchto dvou proteinů. Identické zbytky jsou označeny tečkou nad symboly aminokyselin. Aminokyselinové zbytky označené podtržením představují potenciální místa N-glvkoylace. Počáteční methionin je považován za startovní místo, avšak nelze vyloučit, např. u lidské sekvence, že methionin ležící déle proti směru transkripce (upstream) a ve shodě se čtecím rámcem, může sloužit jako skutečné startovací místo.

Podrobný popis vynálezu

Popis se bude týkat především podrobného popisu výhodných provedení předkládaného vynálezu. Předkládaný vynález se týká sekvencí DNA, které kódují lidský nebo myší APRÍL, jejich fragmentů nebo homologů, a dále se týká exprese těchto DNA v hostitelích těmito DNA transformovanými. Vynález se dále týká použití těchto DNA sekvencí a peptidů, které jsou těmito sekvencemi kódovány. Kromě toho se vynález týká jak lidské tak myší aminokyselinové sekvence APRÍL, nebo jejích fragmentů či homologů, a dále se týká farmaceutického přípravku obsahujícího tyto sekvence nebo z těchto sekvencí odvozeného. Předkládaný vynález se také týká způsobů stimulace buněčného růstu pomocí APRÍL, alternativně způsobů inhibice tumorigeneze pomocí protilátek namířených proti APRÍL nebo receptorů .APRÍL.

A. Definice

Termín homologní v tomto textu popisuje podobnost mezi sekvencemi srovnávaných molekul. Pokud je jistá pozice v obou srovnávaných sekvencích obsazena shodnou baží nebo aminokyselinou, např. jeli stejná pozice v každé ze dvou molekul DNA obsazena adeninem, pak tyto molekuly jsou homologní v dané pozici. Homologie mezi dvěma sekvencemi vyjádřená v procentech je funkce počtu shodných čili homologních pozic, které jsou sdíleny oběma sekvencemi, dělená počtem všech srovnávaných pozic a vynásobená 100. Tak např. jestliže u dvou sekvencí je 6 pozic z 10 shodných neboli homologních, pak tyto sekvence mají 60% homologií. Nebo např. dvě sekvence ATTGCC a TATGGC sdílejí 50% homologií. Obecně se provádí takové srovnání („alignment) tak, že sekvence jsou k sobě navzájem přiloženy, aby poskytly maximální homologií.

Termín rakovina označuje jakoukoliv poruchu typu neoplazie, včetně takových buněčných nemocí jako např. rakovina renálních buněk, Kaposiho sarkom, chronická leukémie, rakovina prsu, sarkom, karcinom vaječníku, rakovina konečníku, rakovina krku, mastocytcm, rakovina plic, adenokarcinom prsu, karcinom dlaždicových buněk hltanu a rakoviny zažívacího traktu nebo žaludku. Výhodně rakovina je leukémie, mastocytom, melanom, lymfom, adenokarcinom prsu a karcinom dlaždicových buněk hltanu.

Termíny purifikovaný preparát nebo v podstatě čistý preparát polypeptidů slouží k označení polypeptidů, který byl oddělen od ostatních proteinů, lipidů a nukleových kyselin, se kterými se společně přirozeně vyskytuje. Výhodně je purifikovaný polypeptid oddělen také od jiných látek jako např. protilátek nebo matrix, které byly použity pro čištění.

Termín transformovaný hostitel zahrnuje jakéhokoliv hostitele se sekvencí, tj . sekvencí APRÍL, trvale integrovanou do genomu.

Termín ošetření nebo léčení se zde užívá pro jakékoliv terapeutické ošetření, např. podávání terapeutického činidla nebo látky, např. léku.

- 15 • ·

Termín v podstatě čistá nukleová kyselina, např. v podstatě čistá DNA,, znamená nukleovou kyselinu, která 1) není bezprostředně spojena s jednou nebo dvěma sekvencemi (jedna na 5'-konci a jedna na 3'-konci), např. kódujícími sekvencemi, se kterými sousedí v přirozeně se vyskytujícím genomu příslušného organismu, ze kterého nukleová kyselina pochází, nebo 2) je v podstatě bez sekvencí nukleových kyselin, které se vyskytují v organismu, ze kterého uvedená nukleová kyselina pochází. Tento termín zahrnuje tedy např. rekombinantní DNA vloženou do vektoru, např. do autonomně se replikujícího plazmidu nebo viru, nebo do genomové DNA prokaryotického nebo eukaryotického organismu, nebo která existuje jako samostatná molekula (např. cDNA nebo fragment genomové DNA vytvořený pomocí PCR nebo působením restrikčních endcnukleáz) nezávislá na jiných sekvencích DNA. V podstatě čistá DNA také zahrnuje rekombinantní DNA, která je součástí hybridního genu kódujícího APRÍL.

Termíny peptidy, proteiny a polypeptidy jsou užívány navzájem zaměnitelným způsobem.

Termín biologicky aktivní je používán ve smyslu mít aktivitu, buďto in vitro nebo in vivo, která se projevuje přímo nebo nepřímo. --Tak např. biologicky aktivní fragment APRÍL může mít např. 70% homologii aminokyselinové sekvence s aktivním místem .APRÍL, výhodněji alespoň 80% homologii a nejvýhodněji alespoň 90% homologii. Identita nebo homologie vzhledem k A.FRIL je definována jako procenta aminokyselinových zbytků v příslušné sekvenci, které jsou identické s aminokyselinovými zbytky sekvencí .APRÍL uvedenými zde jako sekvence id. č. 2 a 4.

Termín ligand se zde obecně užívá pro .APRÍL. Provedení předkládaného vynálezu vyžaduje, pokud není uvedeno jinak, použití technik obvyklých v buněčné biologii, buněčných

- 16 a tkáňových kulturách, molekulární biologii, transgenní biologii, mikrobiologii, techniku rekombinantní DNA a imunologické metody, které jsou v oboru známé. Takové techniky jsou popsány v příslušné odborné literatuře.

Úvod

APRÍL, nový člen TNF rodiny je zde podrobně popsán. Původci vynálezu bylo zjištěno, že zatímco hojnost výskytu transkriptú A.PRIL v normální tkání je nízká, vysoké hladiny mRNA byly detekovány v několika nádorových buněčných liniích, a také v karcinomech tlustého střeva, metastazujících lymfcmech a nádorech štítné žlázy. Dále bylo zjištěno, že in vir.ro přidání re.kombinantního APRÍL stimuluje proliferaci různých buněčných linií. Kromě toho transfekce APRÍL do buněk NIK-5T3 významně urychluje růst nádorů u nahých myší ve srovnání s kontrolami. Exprese a růst stimulují účinek A.PRIL na nádorové buňkv i.n vitro a in vivo vede k doměnce, že APRÍL se podílí na tumorigenezi.

.APRÍL se zdá být jedinečným mezi členy TNF rodiny, jelikož je jednak hojně exprimován v nádorových buňkách a také stimuluje růst mnoha různých nádorových buněčných linií. Vzhledem ke zjevné účasti A.PRIL v tumorigenezi antagonistické protilátky k A.PRIL nebo receptorům .APRÍL poskytnou nové možnosti k léčení rakoviny.

3. Sekvence

DNA podle vynálezu

Jedním aspektem předkládaného vynálezu je (nebo rekombinantní) nukleová kyselina, nukleotidovou sekvenci kódující polypeptid např. sekvence DNA uvedená zde jako sekvence ekvivalenty takových nukleových kyselin.

v podstatě čistá která obsahuje

A.PRIL, jako je id. č. 1 a/nebo

Termín nukleová • » · ·

- 17 kyselina zde zahrnuje také fragmenty nebo ekvivalenty, jako jsou např. sekvence kódující funkčně ekvivalentní polypeptidy. Ekvivalentní nukleotidové sekvence mohou obsahovat sekvence, které se liší jednou nebo několika nukleotidovými substitucemi, adicemi nebo delecemi, jako jsou např. alelické varianty, mutace atd., a mohou také obsahovat nukleotidové sekvence, které se liší od sekvence kódující APRÍL uvedené zde jako sekvence id. č. 1, díky degeneraci genetického kódu.

Předkládaný vynález je popisován obecně vzhledem k sekvencím lidského genu, i když odborníkovi je zřejmé, že se týká i myší sekvence nebo sekvence kódujíc APRÍL z jiných biologických druhů mající vysokou míru homologie s lidskou sekvencí. Lidský protein má, zdá se, všechny charakteristiky rodiny TNF, tj . uspořádání membránového proteinu typu II a konzervativní sekvenční motivy podílející se na uspořádání proteinu do struktury anti-paralelního β-listu, která je typické pro TNE.

Sekvence podle předkládaného vynálezu se mohou použít pro přípravu série DNA sond, které jsou vhodné pro testování různých sad přirozených nebo syntetických DNA na přítomnost sekvencí příbuzných APRÍL nebo jeho fragmenty nebo deriváty. Odborníkovi je zřejmé·,· že termín APRÍL se zde užívá v takovém smyslu, že zahrnuje i jeho biologicky aktivní deriváty, fragmenty a homology.

Sekvence podle předkládaného vynálezu kódující APRÍL se může využít pro expresi peptidu podle vynálezu v různých prokaryotických nebo eukaryotických hostitelích transformovaných takovými sekvencemi. Peptidy APRÍL se mohou použít jako protirakovinná nebo imunoregulační činidla. Obecně to znamená, že jedním z kroků aplikace je kultivovat hostitele transformované molekulou DNA obsahující kódující sekvenci APRÍL, operativně spojenou se sekvencí řídící expresi.

• φ

jiných než DNA. Exoresní

Sekvence DNA a rekombinantní molekuly DNA podle předkládaného vynálezu mohou být exprimovaný pomocí širokého spektra kombinací hostitel/vektor. Tak např. vhodné vektory mohou obsahovat segmenty chromosomových, chromosomových, nebo syntetických sekvencí vektory podle vynálezu jsou charakteristické tím, že obsahují alespoň jednu expresní kontrolní sekvenci, která je operativně spojena se sekvencí kódující .APRÍL vloženou do vektoru, aby bylo možné regulovat či řídit expresi sekvence DNA.

V rámci každého expresního vektoru se mohou vybrat různá místa pro vložení sekvence podle předkládaného vynálezu. Místa jsou většinou navržena podle restríkčních endonukleáz, které v příslušném místě štěpí, a tato místa i enconukleázy jsou odborníkovi dobře známy. Odborníkovi je také zřejmé, že vektor pro použití podle předkládaného vynálezu nemusí obsahovat místa - pro restrikční endonukleázy pro vložení požadovaného fragmentu DNA. Místo toho může být fragment klonován do vektoru alternativním způsobem. Výběr expresního vektoru, a zvláště míst vhodných pro vložení vybraného fragmentu DNA a jeho spojení s expresní kontrolní sekvencí, závisí na mnoha faktorech. K těmto faktorům patří např. velikost proteinu, který má být exp'rimován, citlivost tohoto proteinu k proteolytické degradaci enzymy hostitelské buňky, počet míst pro příslušný restrikční enzym, kontaminace nebo vazba exprimovaného proteinu proteiny hostitelské buňky, které jsou těžko odstranitelné v průběhu purifikace apod. Další faktory, je třeba vzít v úvahu, jsou expresní charakteristiky např. poloha startovacího a ukončovacího kodonů které j ako vzhledem k sekvencím vektoru, a další faktory, které jsou odborníkovi zřejmé. Výběr vektoru a vhodných míst pro vložení sekvence DNA podle předkládaného vynálezu je tedy výsledkem zvážení všech těchto faktorů, přičemž ne všechna řešení jsou • * ♦ · » » · · 4 ·

- 19 stejně účinná pro požadované aplikace. Ale pro odborníka je analýza všech těchto faktorů rutinní záležitostí a výběr vhodného systému pak závisí především na konkrétním použití.

Odborník je snadno schopen vhodně modifikovat expresní kontrolní sekvence tak, aby se získala vyšší úroveň proteinové exprese, např. substitucí kodonů nebo výběrem kodonů určitých zvláštních aminokyselin, které jsou přednostně užívány konkrétním organismem, s cílem zmenšit proteolýzu nebo změnit vzorec glykosylace. Podobně mohou být nahrazeny cysteinové zbytky jinými aminokyselinami, aby se usnadnila produkce nebo uspořádání proteinu, nebo aby se předešlo problémům se stabilitou. Tudíž ne všechnv kombinace hostitel/exoresní ve) fungují se stejnou účinností co se týče exprese sekvence DN.A podle předkládaného vynálezu. Avšak výběr konkrétní vhodné kombinace hostitel/expresní vektor může být odborníkem snadno proveden. K faktorům, které je třeba vzít v úvahu, patří např. kompatibilita hostitele a vektoru, toxicita proteinů kódovaných sekvencemi DNA vektoru pro hostitele, snadnost izolace požadovaného proteinu, expresní charakteristiky sekvencí DNA a expresních kontrolních sekvencí s nimi operativně spojených,- 'biologická bezpečnost, potřeba energie na uspořádání struktury proteinu, forma proteinu a případně modifikace požadovaného proteinu, které nastávají po expresi.

APRÍL produkovaný hostiteli transformovanými sekvencemi DNA podle předkládaného vynálezu, stejně jako nativní .APRÍL purifikovaný způsobem podle vynálezu, nebo vytvořený na základě aminokyselinové sekvence podle vynálezu, jsou užitečné pro řadu protirakovinných, protinádorových a imunoregulačních aplikací. Jsou také užitečné v terapii a způsobech týkajících se i jiných nemocí.

- 20 00 00 I · · 0

I 0 0 0 » 0 0 0 0 » 0 0 0

0 0 0

0

0 0 0 0 0

Předkládaný vynález se také týká použití sekvencí DNA podle vynálezu pro expresi APRÍL ve zvláštních podmínkách, tj.

pn genove teraoii

Navíc APRÍL může bvi expnmovan v nádorových buňkách, kde je jeho exprese řízena promotory vhodnými pro tento účel. Taková exprese může posílit protinádorovou imunitní odpověď nebo přímo ovlivnit přežívání nádoru. APRÍL může také ovlivnit přežívání orgánových štěpů tím, že změní lokální imunitní odpověď. V takovém případě by byl sám štěp nebo buňky, které ho obklopují, modifikován genem A.PRIL metodami genového inženýrství.

Dalším aspektem předkládaného vynálezu je použití izolované nukleové kyseliny kódující APRÍL pro tzv.

'antisense teraoii. iermín terapie se týká podání nebo vytvoření in sílu oligonukleotidú nebo jejich derivátů, které specificky hybridizují (váží se) v normálních buněčných podmínkách s buněčnou mRNA a/nebo DNA kódující požadovaný .APRÍL, aby tak inhibovaly expresi kódovaného proteinu tím, že inhibují transkripci a/nebo translaci. Zmíněná vazba může být konvenční komplementarita párů baží nebo např. V případě vazby na duplexy DNA může jít o vazbu prostřednictvím specifických interakcí v hlavním (velkém) zářezu dvoušroubovicové DNA. Obecně se antisense terapie týká celé řady technik v oboru užívaných a patří sem v podstatě jakákoliv terapie založená na specifické vazbě oligonukleotidové sekvence.

Antisense konstrukt podle předkládaného vynálezu může být podán např. ve formě expresního plazmidu, který při transkripci v buňce tvoří RNA, která je komplementární k buněčné mRNA kódující .APRÍL nebo alespoň k její části. Alternativně může být antisense konstrukt také připravená ex vivo. Takové oligonukleotidová sonda oligonukleotidové sondy jsou výhodně modifikované oligonukleotidy, které jsou rezistentní k endogenním nukleázám β· ·· ····

- 21 ··

I fl »· ·· ·· ► β · fl » · · fl • β 99 a jsou proto stabilní in vivo. Příkladem takových molekul nukleových kyselin vhodných jako antisense oligonukleotidy jsou fosforamidátové, fosfothicátové a metylfosřonátové analogy DNA (viz patentové přihlášky U.S. 5 176 996, 5 264 564 a 5 256 775) . Kromě toho obecný postup jak konstruovat oligomery vhodné pro antisense terapii byly přehledně uvedeny např. v publikacích Van Der Krol et al., 1988, Biotechniques 6: 958-976 a Stein et al., 1988, Cancer Res. 48: 2659-2668, které jsou zde zahrnuty formou odkazu.

C. APRÍL a jeho aminokyselinová sekvence

APRÍL je členem rodiny TNF, jak bylo již diskutováno výše. Protein APRÍL sám, nebo jeho fragmenty či homology, má široké možnosti terapeutického a diagnostického poůžirí, jak bude podrobněji diskutováno dále.

Srovnání sekvence APRÍL s ostatními členy lidské rodiny TNF ukazuje značnou strukturní podobnost. Všechny proteiny sdílejí několik konzervativních úseků v sekvenci extracelulární domény. Celková sekvenční homologie extracelulární domény APRÍL ukazuje nejvyšší stupeň homologie s fasL (21% aminokyselinová identita), TNFa (20%), LT-β (18%) a pak následují TRAIL, TWEAK a TRANCE (15%) .

Nový polypeptid podle předkládaného vynálezu specificky reaguje s receptorem, který dosud nebyl identifikován. Avšak peptidy a způsoby podle předkládaného vynálezu umožňují identifikovat receptory, které specificky reagují s .APRÍL nebo jeho fragmenty.

Určitá provedení podle předkládaného vynálezu zahrnují peptidy odvozené z APRÍL, které mají schopnost vázat se na příslušné receptory. Fragmenty APRÍL je možné připravit různými způsoby, např. rekombinantní technologií, pomocí PCR, • « • · · · • · • ·

- 22 proteolytickým štěpením nebo chemickou syntézou. Vnitřní nebo koncové fragmenty polypeptidů mohou být připraveny odstraněním jednoho nebo několika nukleotidů z jednoho nebo z obou konců nukleové kyseliny, které kóduje polypeptid. Fragmenty polypeptidů lze také připravit expresí mutované DNA. Polypeptidové fragmenty se mohou také chemicky syntetizovat pomocí konvenční techniky známé jako syntéza na pevné fází užívající chemického postupu s ochranou f-moc nebo t-boc (podle Merriffielda). Tak např. peptidy a sekvence DNA podle předkládaného vynálezu je možné v podstatě libovolně rozdělit na fragmenty požadované délky, které se nepřekrývají, nebo na překrývající se fragmenty požadované délky. Příslušné metody jsou podrobněji popsány v následujícím

D. Příorava rozpustných forem APRÍL

Rozpustné formy APRÍL mohou být velmi účinné v přenosu signálu a mohou tudíž být podávány jako lék, který napodobuje přirozenou membránovou formu. Je možné, že APRÍL podle předkládaného vynálezu je přirozeně sekretován jako rozpustný cytokin, ale pokud tomu tak není, je možné uzpůsobit gen metodami genového inženýrství tak, aby se zesílila sekrece. Pro přípravu rozpustné sekretované formy APRÍL je třeba odstranit na úrovni DNA N-koncový transmembránový úsek a některé úseky stonku a nahradit je vedoucí sekvencí typu I nebo alternativně vedoucí sekvencí typu II, která umožní účinné proteolytické štěpení v příslušném hostitelském systému. Odborník je schopen měnit rozsah stonkových úseků ponechaných v expresním konstruktu tak, aby se dosáhlo vazebných vlastnosti k receptorů a sekreční Tak např. odštěpováním z N-konce lze připravit konstrukty obsahující všechny možné délky stonku, takže optimálních účinnosti.

- 23 vzniknou proteiny, které budou začínat aminokyselinou 81 až 139. Tímto typem analýzy lze stanovit optimální délku sekvence stonku.

E. ťříprava protilátek reagujících s APRÍL

Předkládaný vynález se také týká protilátek specificky reagujících s APRÍL nebo jeho receptorem. Antiséra typu anti-protein/anti-peptid nebo monoklonální protilátky lze připravit standardními způsoby (viz např. Antibodies: A Laboratory Manual, Harlow and Lané (eds.), Cold Spring Harbor press, 1988). Savci jako např. myš, křeček nebo králík, se mohou imunizovat imunogenní formou peptidu. Způsoby, jak učinit protein nebo peptid imunogenním, např. tim, že se konjuguje s nosičem, nebo jiné způsoby, jsou v oboru známy.

Imunogenní část APRÍL nebo jeho receptoru může být podána společně s adjuvans. Postup imunizace je možné monitorovat pomocí detekce titru protilátek v plazmě nebo séru. Standardní test ELISA nebo jiné imunotesty se mohou použít s imunogenem coby antigenem k hodnocení hladin protilátek.

Ve výhodném provedení předkládaného vynálezu jsou protilátky imunospecif ické pro antigenní determinanty .APRÍL nebo receptoru APRÍL, t j. antigenní determinanty polypeptidu se sekvencí id. č. 2, nebo pro blízce příbuzný lidský nebo savčí, jiný než lidský, homolog (s homologii 70, 80 nebo 90 %, nejvýhodněji s homologii alespoň 95 %) . V dalším výhodném provedení předkládaného vynálezu protilátky anti-APRIL nebo anti-receptor APRÍL v podstatě křížově nereagují (tzn. reagují pouze specificky) s proteinem, který je např. méně než z 80 % homologní se sekvencí id. č. 2, výhodně méně než z 90 % a nejvýhodněji méně než z 95 % homologní se sekvencí id. č. 2. Tím, že v podstatě křížově nereagují se míní to, že

- 24 protilátka má vazebnou afinitu k nehomolognímu proteinu menší než 10 %, výhodněji menší než 5 %0 a ještě výhodněji menší než 1 vazebné afinity k proteinu se sekvencí id. č. 2.

Termín protilátka se v tomto textu užívá tak, že zahrnuje i fragmenty protilátky, které také specificky reagují s APRÍL nebo jeho receptorem. Protilátky lze fragmentovat pomocí obvyklých způsobů, které jsou v oboru známy, a možnosti využití fragmentů lze pak testovat stejnými způsoby jak bylo popsáno pro celé protilátky. Tak např. fragment Ffab')? je možné připravit působením pepsinu. Výsledný fragment se pak může ošetřit tak, aby se redukovaly disulfidové můstky, čímž vznikne fragment Fab' . K protilátkám podle předkládaného vynálezu dále patří biospecifické a chimérické molekuly, které mají aktivitu namířenou proti APRÍL nebo proti jeho receptoru. Takže pro blokování APRÍL nebo jeho receptoru je možné využít jak monoklonálních tak polyklonélních protilátek namířených proti A.PRIL a příslušnému receptoru, a také příslušné fragmenty jako např. Fab' nebo F(ab')j.

Různé formy protilátek je možné připravit standardními technikami rekombinantní DNA (Winter a Milstein, Nátuře 343: 293-239, 1991) . Např. je možné konstruovat takové chimérické protilátky, kde vazebná doména pro antigen z protilátky zvířete je spojena s lidskou konstantní doménou (Cabilly er al., patent U.S. 4 816 567). Chimérické protilátky redukují imunitní odpověď vyvolanou zvířecím protilátkami, když jsou použity v klinických aplikacích pro lidské pacienty.

Kromě toho se mohou syntetizovat rekombinantní humanizované protilátky, rozpoznávající .APRÍL nebo jeho receptor. Humanizované protilátky jsou chimérické protilátky, které obsahují většinou sekvence lidského IgG, do nichž byly vloženy sekvence zodpovědné za specifickou vazbu k antigenu. Zvířata se imunizují požadovaným antigenem, pak se izoluje příslušná protilátka a . odstraní se z ní část variabilního úseku zodpovědná za specifickou vazbu antigenu. Úsek vážící se pak klonuje do vhodného místa genu kterého byl odstraněn úsek vážící protilátky me zidruhových) antigen ze zvířete lidské protilátky, antigen. Humanizované heterologních (tj.

ze minimalizují použití sekvencí v lidských protilátkách, a tak snižují pravděpodobnost vyvolání imunitní odpověď u ošetřovaného pacienta.

Různé třídy rekombinantních protilátek se mohou vytvářet také tak, že se připraví chimérické nebo humanizované protilátky obsahující variabilní domény a lidské konstantní oomenv

ICH1,

CH2

CH3;

izolované z různých ;říd imunoglobulinů. Tak např. se mohou připravit rekombinantním způsobem protilátky se zvýšenou valencí vazebných míst pro antigen, a to tak, že se klonuje vazebné místo pro antigen do vektoru nesoucího konstantní úsek řetězce lidské protilátky (Arulandam et al., J. Exp. Med. 177: 1433-1450, 1393).

Kromě toho lze použít standardní techniky rekombinantní DNA pro změnu vazebné afinity rekombinantních protilátek s jejich antigeny tím, že se změní· zbytky aminokyselin v blízkosti vazebného místa pro antigen. Vazebná afinita pro antigen u humanizované protilátky se může zvýšit mutagenezí založenou na molekulovém modelování (Quenn et a) Nati. Acad. Sci. USA 86: 10029-33, 1989).

Proč.

r . Vytváření analogů: Příprava a peptidových sekvencí změněných sekvencí

DNA

Analogy APRÍL se mohou lišit od přirozeně se vyskytujícího ligandů v sekvenci aminokyselin, nebo jiným způsobem než aminokyselinovou sekvencí, nebo oběma způsoby. K jiným modifikacím než je modifikace sekvence patří jak • · • · • · · ·

- 26 in vitro tak in vivo chemická derivatizace APRÍL. K těmto nesekvenčním modifikacím patří změny v acetylaci, metylaci, fosíorvlaci, karboxylaci nebo clykosylaci, přičemž tento výčet není limitující.

K výhodným analogům patří .APRÍL nebo jeho biologicky aktivní fragmenty, jejichž sekvence uvedené zde jako sekvence id. č. 2 konzervativními substitucemi, delecemi aminokyselin, které nenarušují biologickou aktivitu APRÍL. Ke konzervativním substitucím typicky patří substituce jedné aminokyseliny jinou aminokyselinou s podobnými vlastnostmi, např. substituce v rámci následujících skupin: valin - glycin, se liší od jednou nebo několika nebo inzercemi clvcin isoieucin :ucm, ;erm asparagová -kyselina glutamová, asparagin - alutamin, zhreonin, lysin - arginin a fenylalanin - tyrosin.

Konzervativní záměny aminokyselin jsou přehledně uvedeny v následující tabulce 1.

Tab. 1

Konzervativní záměny aminokyselin

Aminokyselinu	Kód	Lze nahradit jakoukoliv z následuj icích
Alanin	A	D-.Ala, Gly, 3eta-A.la, L-Cys, D-Cys
Arginin	R	D-.Arg, Lys, D-Lys, homo-.Arg, D-homo-Arg, Met, Ile, D-Met, D-Ile, Orn, D-Orn
.Asparagin	N	D-Asn, Asp, D-A.sp, Glu, D-Glu, Gin, D-Gln
Kyselina asparagová	D	D-Asp, D-Asn, Asn, Glu, D-Glu, Gin, D-Gln
Cystein	C	D-Cys, S-Me-Cys, Met, D-Met, Thr, D-Thr

- 27 • · · · • · · · »» »» · ·

Tab. 1 - pokračování

Am inokyselínu	Kód	Lze nahradit jakoukoliv z následujících
Glut amin	Q	D-Gln, Asn, D-As.n, Glu, D-Glu, Asp, D-Asp,
Kyselina alutamová	T	D-Glu, D-Asp, Asp, .Asn, D-Asn, Gin, D-Gln
Glycin	G	Ala, D-Ala, Pro, D-Pro,-Ala, Asp
Isoleucin	I	D-Ile, Val, D-Val, Leu, D-Leu, Met, D-Met
Leucin	L	D-Leu, Val, D-Val, Leu, D-Leu, Met, D-Met
Lysin	K	D-Lys, Arg, D-.Arg, Homo-Arg, D-Homo-Arg, Met, D-Met, lle, D-Ile, Orn, D-Orn
Methionin	M	D-Mer, S-Me-Cys, lle, D-Ile, Leu, D-Leu, Val, D-Val
Fenylalanin	p	D-Phe, Tyr, D-Thr, L-Dopa, His, D-His Trp, D-Trp, Trans-3,4 nebo 5-fenylprolin, cis-3,4 nebo 5-fenylprolin
Prolin	p	D-Pro, L-l-thioazolidin-4-karboxylová kyselina, D- nebo L-l-oxazolidin-4- karboxylová kyselina
Serin	S	D-Ser, Thr, D-Thr, allo-Thr, Met, D-Met, Met(0), D-Met(0), L-Cys, D-Cys
Threonin	T	D-Thr, Ser, D-Ser, allo-Thr, Met, D-Met, Met(O), D-Met(0), Val, D-Val
Tyrosin	Y	D-Tyr, Phe, D-Phe, L-Dopa, His, D-His
Valin	v	D-Val, Leu, D-Leu, lle, D-Ile, Met, D-Met

- 28 ···· · · · ···· « · · ··· · ··· ·· · • ·· · « · · · · «· ·

K užitečným metodám mutageneze patří mutageneze pomocí PCR a saturační mutageneze, které budou podrobněji popsány v následující části. Také je možné vytvořit knihovnu variant náhodných sekvencí aminokyselin pomocí syntézy sady degenerovaných oligonukleotidových sekvencí.

PCR mutageneze

Při mutagenezi pomocí PCR se využívá malá přesnost Taq polymerázy k zavedení náhodných mutací do klonovaného fragmentu DNA (Leung et al., Technique 1: 11-15, 1989). Je to velmi účinná a přitom velmi rychlá metoda pro vnesení náhodných mutací. Úsek DNA, který má být mutován, se amplifikuje pomocí polymerázové řetězové reakce (PCR) v podmínkách, které snižují přesnost Taq polymerázy, např. jestliže je poměr dGTP/dATP přibližně roven 5 a přidá se Mír' do reakční směsi pro PCR. Celá sada amplifikovaných fragmentů se pak klonuje do vhodných vektoru a vytvoří se tak knihovna náhodných mutant.

Saturační mutageneze

Saturační mutageneze dovoluje rychlé vnesení velkého počtu mutací typu substituce jedné baze do klonovaného fragmentu DNA (Mayers et al., Science 229:242, 1985). Tato technika zahrnuje vytvoření mutací, např. chemickým ošetřením nebo ozářením jednořetězcové DNA in vitro, a pak syntézu komplementárního řetězce DNA. Frekvence mutací může být ovlivněna silou působícího účinku a v podstatě lze dosáhnout substituce všech možných baží. Jelikož celý tento proces nezahrnuje žádnou genetickou selekci mutovaných fragmentů, získají se tak fragmenty jak s neutrálními substitucemi, tak náhodně mutované fragmenty DNA, ze kterých se mohou připravit proteiny se • · • ·

změněnou funkcí. Distribuce bodových mutací není přitom nijak směrována na konzervativní sekvenční prvky.

Degenerované oligonukleotidy

Knihovnu homologů je možné připravit pomocí sady degenerovaných oligonukleotidů. Chemická syntéza degenerovaných sekvencí se muže provést na zařízení pro automatickou syntézu DNA, a syntetické geny se pak vloží (ligují) do vhodného expresního vektoru. Syntéza degenerovaných oligonukleotidů je způsob v oboru dobře známý¹^·¹ a tento způsob byl již využit pro cílený vývoj jiných proteinů^ÍXXXl).

Způsoby cílené neboli nenáhodné mutageneze se mohou využít pro přípravu specifických sekvencí nebo mutací v určitých specifických úsecích. Tyto vytvoření variant, které způsoby se mohou využít pro obsahují delece, inzerce nebo substituce aminokyselinových zbytků ve známé aminokyselinové sekvenci proteinu. Místa mutací se individuálně nebo v sériích naoř. tak, mohou modifikovat že se Γ nejonve substituují konzervativní aminokyseliny a pak se provádějí radikálnější změny v závislosti na získaných výsledcích 2) deletují se (odstraní) cílové zbytky a 3) inzerují se (vloží) zbytky stejné nebo jiné třídy do sousedství příslušného místa, nebo se kombinují všechny uvedené způsoby až 3.

Mutageneze nahrazováním alaninem

Mutageneze nahrazováním alaninem (alanin scanning) je metoda vhodná pro identifikaci určitých zbytků nebo úseků požadovaných proteinů, která jsou výhodnými místy nebo doménami pro mutagenezi (Cunningham and Wells, Science 244: 1081-1085, 1989) . Při této metodě se identifikují zbytky, nebo • · • · · ·

skupiny zbytků (např. nabité aminokyselinové zbytky jako Arg, Asp, His, Lys a Glu) a nahradí se neutrální nebo negativní aminokyselinou (nejvýhodněji alaninem nebo polyalaninem) . Tyto náhrady aminokyselin mohou ovlivnit interakci aminokyselin s okolním vodným prostředím uvnitř nebo vně buňky. Domény, u kterých se projeví funkční citlivost na substituce, se mohou dále zpřesňovat vnášením dalších změn nebo změnami již substituovaných míst. Takže zatímco místo pro vložení variace aminokyselinové sekvence je předem určeno, povaha mutace sama o sobě předem určena není. Tak např. pro optimalizaci účinnosti mutace v určitém místě je možné provést nahrazovací mutagenezi alaninem nebo náhodnou mutagenezi na cílovém kodonu nebo úseku a exprimovat varianty podjednotek požadovaného proteinu, a ty pak testovat na optimální kombinaci a požadovanou aktivitu.

Hutageneze zprostředkovaná oligonukleotidy

Mutageneze zprostředkovaná oligonukleotidy je metoda vhodná pro přípravu substitučních, delečních a inzerčních variant DNA (viz např. Adelman et al., DNA 2: 183, 1983). Požadovaná DNA může být změněna tím, že hybridizuje s oligonukleotidem, který obsahuje mutaci DNA templátu, kde templátem je jednořetězcové forma plazmidu nebo bakteriofágu obsahující nezměněnou nebo nativní sekvenci DNA pro požadovaný protein. Po hybridizace se použije DNA polymeráza pro syntézu celého komplementárního řetězce, takže templát pak obsahuje vložený oligonukleotidový primer a tudíž kóduje vybrané změny v DNA pro daný protein. Obecně se užívají oligonukleotidy velikosti nejméně 25 nukleotidů. Optimální oligonukleotid obsahuje 12 až 15 nukleotidů, které jsou plně komplementární k templátu na obou stranách od nukleotidu (případně nukleotidů) kódujícího mutaci. To zajistí, že oligonukleotid • · • ·

- 31 bude správně hybridizovat s jednořetězcovou templátovou DNA. Oligonukleotidy lze snadno syntetizovat způsoby známými v oboru (viz např. Crea et al., Proč. Nati. Acad. Sci. USA 75: 5765, 1978).

Kazetová mutageneze

Dalším způsobem, jak připravit varianty, je kazetová mutageneze, která je založená na technice, kterou popsali Wells et al.(Gene 34: 315, 1985). Výchozím materiálem je plazmid (nebo jiný vektor), který obsahuje DNA pro proteinovou podjednotku, která má být mutována. Nejdříve je třeba identifikovat kodon (případně kodony), které mají být v proteinové podjednotce mutovány. Je třeba, aby na každé straně od mutovaného místa bylo jedinečné místo pro restrikční endonukleázu. Pokud takové restrikční místo neexistuje, je rřeba ho v požadované lokalizaci vytvořit pomocí výše popsané mutageneze zprostředkované oligonukleotidem. Poté, co do plazmidu byly vložena restrikční místa, plazmid se v těchto místech naštěpí, a tedy linearizuje. Pak se standardním způsobem syntetizuje dvouřetězcový oligonukleotid, který kóduje sekvenci DNA mezi dvěma restrikčními místy a obsahuje požadovanou mutaci. Každý oligonukleotidový řetězec je syntetizován samostatně a pak spolu hybridizují zase standardním způsobem v oboru známým. Tento dvouřetězcový oligonukleotid je nazýván kazetou. Kazeta je přitom navržena tak, aby obsahovala 3'-konec a 5'-konec kompatibilní s konci lir.earizovaného plazmidu, takže může být přímo do plazmidu ligována. Plazmid pak obsahuje mutovanou sekvenci DNA požadovaného proteinu.

- 32 Kombinační mutageneze

Pro vytvoření mutací je také možné použít kombinační mutagenezi. Např. aminokyselinové sekvence skupiny homologních nebo jinak příbuzných proteinových sekvencí se uspořádají tak, aby bylo dosaženo maximální homologie. Všechny sekvence, které se objeví v dané pozici u všech uspořádaných sekvencí se vyberou a vytvoří se z nich degenerovaná sada kombinačních sekvencí. Kombinační mutagenezi se vytvoří velmi různorodá knihovna variant na úrovni nukleových kyselin. Tak např. směs syntetických oligonukleotidů se enzymaticky liguje do genových sekvencí tak, že degenerovaná sada potenciálních sekvencí je exprimovatelná jako individuální peptidy, nebo alternativně, jako sada delších fúzních proteinů obsahujících sadu degenerovaných sekvencí.

Různé techniky jsou v oboru známé pro screening vytvářených mutovaných genů. Techniky pro screening velkých genových knihoven často zahrnují klonování knihovny do replikovatelných expresních vektorů, transformování vhodných buněk výslednou knihovnou vektorů, a expresi genů v podmínkách, kde detekce požadované aktivity, tj. v tomto případě vazbu na APRÍL nebo jeho receptor, umožňuje relativně snadnou izolaci vektoru kódujícího gen, jehož produkt byl detekován. Každá z technik popisovaných v následujících odstavcích je vhodná k vysoce účinnému a vysokokapacitnímu testování velkého počtu sekvencí vytvářených např. technikami náhodné mutageneze.

Vynález dále poskytuje možnost připravovat mimetika pro redukci proteinových vazebných domén polypeptidu APRÍL nebo jeho receptoru, např. peptidová činidla nebo činidla jiné povahy než peptidy. Peptidová mimetika jsou schopna narušit vazbu APRÍL a jeho receptoru. Kritické zbytky APRÍL účastnící se procesu molekulového rozpoznávání receptorového polypeptidu

- 33 ···· ·· · · · · • · · · · · · ··· · · • · · · · ·· · · * · ·· · · ·· · < ·· · · nebo příslušného následného intracelulárního proteinu v signální dráze, mohou být určeny a použity pro přípravu peptidových mimetik APRÍL nebo jeho receptorů, která kompetitivně nebo nekompetitivně inhibují vazbu .APRÍL a jeho receptorů (viz např. Peptide inhibitors of human papilloma virus protein binding to retinoblastoma gene protein, patentové přihlášky EP 412 762 A a EP 831 080 A, které jsou zahrnuty formou odkazu).

Tím, že předkládaný vynález poskytuje purifikovaný a rekombinantní APRÍL, poskytuje také metodu testování, kterou je možné užít pro testování kandidátů léčiv, která jsou funkčně buďto agonisty nebo antagonisty normální buněčné funkce .APRÍL nebo jeho receptorů. V jednom provedení předkládaného vynálezu se pomocí sakového testu hodnotí schopnost sloučeniny modulovat vazbu mezi .APRÍL a jeho receptorem. Odborníkovi je zřejmé, že je možné vytvářet různé varianty testů podle předkládaného vynálezu.

V mnoha programech pro screening léků, které se užívají k testování celé knihovny sloučenin nebo přírodních extraktů, jsou požadovány metody s velkou účinností a kapacitou zpracovaných vzorků, aby bylo možné maximalizovat počet sloučenin otestovaných za jednotku času. Testy, které se provádějí na bezbuněčném systému, jako jsou např. purifikované nebo semipurifikované proteiny, jsou často výhodné jako testy pro tzv. primární screening, který dovoluje rychlý vývoj těchto sloučenin, neboť umožňuje relativně snadnou detekci změn molekulového cíle, ke které dochází působením testované sloučeniny. .Avšak toxické působení na buňky a/nebo biologická dostupnost testované sloučeniny mohou zůstat v takovém in vitro systému bez povšimnutí, neboť test je primárně zaměřen na působení léčiva na molekulový cíl, kde se projevuje

- 34 • · « · • · « · • ·

změnou vazebné afinity k jiným proteinům nebo změnami enzymatických vlastností molekulového cíle.

Izolace receptoru vázajících APRÍL

Pro identifikaci a klonování receptorů je možné použít ligandy rodiny TNF. Pomocí popsaných sekvencí APRÍL je možné fúzovat 5'-konec extracelulární domény, který tvoří vazebnou sekvenci pro receptor, k markerové nebo značkovací sekvenci a pak přidat vedoucí sekvenci, která podpoří sekreci ligandu v některém z mnoha možných expresních systémů. Jeden příklad takového postupu popsali Browning et al (JBC 271: 8618-8626, 1396), kdy ligand LT-β byl sekretován v takové formě. Vedoucí sekvence VCAM byla připojena ke krátké značkovací sekvenci peptidu myc s extracelulární doménou LT-β. Sekvence VCAM byla použita proto, aby napomohla sekreci molekuly LT-β, které je normálně vázána na membránu. Sekretovaný protein si ponechává značku myc na svém N-konci, která nijak nesnižuje schopnost vázat se na receptor. Takový sekretovaný protein se může exprimovat buďto v přechodně transfekovaných buňkách COS nebo v podobném systému, např. vektorech odvozených od E3NA, systému hmyzí buňky a bakuloviru nebo Pichia sp. apod. Jako zdroj označeného ligandu se může využít nepurifikovaný buněčný supernatant.

Buňky exprimující receptor je možné identifikovat tak, že se exponují označenému ligandu. Buňky s navázaným ligandem se pak identifikují pomocí průtokové cytometrie FACS, když se myc označí protilátkou proti peptidu myc (anti-myc, 9E10) a pak íykoerytrinem (nebo obdobnou značkou) značeným anti-myším imunoglobulinem. Buňky pozitivní ve FACS se snadno identifikují a slouží pak jako zdroj RNA kódující receptor. Z této RNA pak může být připravena standardním postupem expresní knihovna a rozdělena do podskupin (pools). Tyto ·« ·· ► ♦ · <

» · · ( » · · <

» · · I • 9 · · ·· · ·· · poté, co se imunoglobulinem podskupiny klonů se pak transfekují do vhodných hostitelských buněk a vazba označeného ligandu na transfekované buňky s receptorem se identifikuje pomocí mikroskopického vyšetření navázaný myc peptid označí anti-myším označeným enzymem, např. galaktosidázou, alkalickou fosfatázou nebo luciferázou. Jakmile se jednou identifikuje pozitivní podskupina klonů, zmenšuje se pak velikost podskupin dokud není identifikována cDNA kódující receptor. Celá tato procedura může být provedena buďto s myším nebo lidským APRÍL, přičemž jedna z nich povede snadněji k receptorů.

G. Farmaceutické přípravky k léčení nemocí s APRÍL souvisej ících

Farmaceutické přípravky podle předkládaného vynálezu se mohou užít k léčení rakovinných onemocnění tak, že se pacientovi, výhodně savci jako je pes,, kočka nebo člověk, podává účinné množství přípravku podle vynálezu, který obsahuje blokující činidlo schopné narušit vazbu mezi A.PRIL a jeho receptorem. rozpustný APRÍL,

K takovým blokujícím činidlům patří protilátky anti-A.PRIL, protilátky anti-receptor APRÍL nebo jejich biologicky aktivní fragmenty, přičemž tento výčet není omezující. Kromě toho inhibující forma APRÍL může být připravena mutací APRÍL, při které se uchová schopnost blokovat spojení mezi A.PRIL a jeho receptorem. Blokující činidla výhodně obsahují fúzní protein receptorů s Ig, který může být zkonstruován způsoby odborníkovi známými.

Přípravky podle předkládaného vynálezu jsou· užitečné k léčení všech rakovinných onemocnění, jako je (přičemž tento výčet není omezující) např. rakovina renélních buněk, Kaposiho

- 36 • · ·» φ · φφφφ « φ · φ ► · » · ·· φ · · C- φ ► ΦΦΦ φφ φ φ · φ φ sarkom, chronická leukémie, rakovina prsu, sarkom, karcinom vaječníku, rakovina konečníku, rakovina krku, mastocytom, rakovina plic, adenokarcinom prsu, karcinom dlaždicových buněk hltanu a rakoviny zažívacího traktu nebo žaludku. Kromě toho jsou tato blokující činidla užitečná k léčení proliferativních nemocí, které se neřadí k nádorům, tj. buněčných hyperproliferací (hyperplázií) , jako je např.

vytváření ložisek při revmatoidní artritidě, chirurgickém zákroku a fibróza plic, jater a dělohy.

Farmaceutické přípravky podle předkládaného vynálezu obsahují terapeuticky účinné množství APRÍL nebo jeho receptorů, nebo jejich fragmentů nebo mimetik, a případně obsahují farmaceuticky přijatelné nosiče a pomocné látky.

Vynález se tudíž také týká léčení rakoviny a způsobů skleroderma, jizvení po stimulace, imunitního nebo v určitých případech systému, nebo jeho částí, v podávání farmaceuticky účinného množství sloučeniny podle předkládaného vynálezu nebo jejích farmaceuticky přijatelných solí nebo derivátů. Přitom odborníkovi je zřejmé, že sloučeniny a způsoby podle vynálezu se mohou kombinovat s řadou dalších terapií.

Přípravky podlé' předkládaného vynálezu mohou být formulovány pro různé způsoby podávání, včetně systémového, inhibice, které

Pro systémové podávání je včetně intramuskulární, topického nebo lokálního podávání výhodné podávání injekční, intravenózní, intraperitoneální a subkutánní injekce, přičemž přípravek podle předkládaného vynálezu může být formulován jako vodný roztok, výhodně ve fyziologicky kompatibilním pufru jako je např. Hankův nebo Ringerův roztok. Kromě toho přípravek podle předkládaného vynálezu může být formulován v pevné formě pro případné rozpuštění nebo resuspendovšní

- 37 ·« flfl ·* • » · · · · • · ·· · · · • · · · · · · • · · · · · · • fl ·· ·· flfl bezprostředně před použitím. Předkládaný vynález se také týká lyofilizovaných forem přípravku.

Přípravek podle předkládaného vynálezu se může podávat také perorálním, transmukosálním nebo transdermálním způsobem. V přípravku pro transmukosální nebo transdermální podávání se použijí vhodné látky usnadňující penetraci (penetranty) vzhledem k bariéře, kterou je nutno překonat. Takové penetranty jsou v oboru známy a patří k nim např. pro transmukosální podávání soli žlučové kyseliny, deriváty kyseliny fusidové a detergenty. Transmukosální podávání lze provádět buď nosní aerodisperzí (sprejem) nebo pomocí čípků. Pro perorální podávání je přípravek formulován v obvyklé lékové formě vhodné pro perorální podávání jako jsou kapsle, tablety a tonika. Pro topické podávání může být přípravek ve formě mastí, mazání, celu nebo krému, jak je v oboru všeobecně

Dávky a dávkovači režim jsou závislé na typu rakoviny a na pacientovi a jeho anamnéze. Podávané množství musí být účinné k léčení, potlačení nebo změně progrese rakoviny. Může se jednat o jednotlivé nebo opakované dávky. Pokud se užijí opakované dávky, což je výhodné, frekvence podávání závisí např. na typu pacienta a typu nemoci, velikosti dávek atd. Pro některé druhy rakoviny je účinné denní podávání, pro jiné druhy je účinné podávání obden nebo jednou za tři dny. Množství aktivní látky podané buď v jedné dávce nebo v průběhu léčení je závislé na mnoha různých faktorech. Tak např. na věku a velikosti subjektu, závažnosti a průběhu onemocnění, které se léčí, způsobu a formě podávání, a samozřejmě na úsudku ošetřujícího lékaře. Avšak účinná dávka je v rozmezí 0,005 až 5 mg/kg/den, výhodně 0,05 až 0,5 mg/kg/den. Odborník sám posoudí, kdy mohou být prospěšné nižší či vyšší dávky.

- 38 • · ···· ·· ·· • · · · · 1 • t · · · • · · · · · a vhodného ředidla, pomalé uvolňování,

Genové konstrukty podle předkládaného vynálezu se mohou použít také jako součást protokolu genové terapie pro přenos nukleových kyselin kódujících buďto agonistické nebo antagonistické formy polypeptidu APRÍL.

Expresní konstrukty APRÍL se mohou podávat prostřednictvím jakéhokoliv biologicky účinného nosiče, např. jakéhokoliv farmaceutického přípravku schopného účinně přenést in vivo gen pro APRÍL do buňky. Tento přístup znamená vložit gen do virového vektoru, který může přímo transfekovat buňku, nebo podat plazmidovou DNA, pomocí např. lipozomů, nebo nějakého vnitrobuněčného nosiče, anebo se může jednat o přímou injekci genového konstruktu. Výhodnou metodou je přenos pomocí virového vektoru.

Farmaceutický přípravek s genovým konstruktem pro genovou terapii se skládá v podstatě ze systému pro přenos genů nebo se může jednat o matrix umožňující do ' které je systém přenášející gen zapuštěn. Alternativně, pokud celý systém pro přenos genů může být připraven int.aktní z rekombinantních buněk, např. jako retrovirový vektor, farmaceutický přípravek pak obsahuje jednu nebo několik buněk, které produkují systém pro přenos genů.

Kromě použití pro terapii se oligomery podle předkládaného vynálezu mohou použít jako diagnostické reagencie pro detekci přítomnosti či absence cílové DNA, nebo sekvencí

RNA aminokyselin, ke kterým se specificky váží. Jiným aspektem předkládaného vynálezu je použití pro hodnocení chemické sloučeniny z hlediska její schopnosti reagovat, tj . např. vázat se či jinak fyzikálně asociovat, s polypeptidem APRÍL nebo jeho fragmenty. Způsob obsahuje kontaktování chemické látky s APRÍL a hodnocení schopnosti látky reagovat s APRÍL. Kromě toho APRÍL podle předkládaného vynálezu se může použít v metodách pro hodnocení přirozeně se vyskytujících ligandů • · ·» · · • · · · · • · · · · · • · · ·

- 39 nebo receptorů APRÍL, a také pro hodnocení chemických látek, které se asociují nebo váží s receptory APRÍL. Někdy je třeba užít označenou verzi A.PRIL pro usnadnění detekce vazby A.PRIL ne jeho receptor nebo buněk pozitivních na receptcr, např. při screeningu činidel, která blokují interakci mezi A.PRIL a jeho receptorem. Kromě toho lze užít buněčné linie transfekované A.PRIL, které mají zvýšenou rychlost růstu, jako základ pro testy k vyhledávání molekul, které blokují aktivitu A.PRIL.

Jiný aspekt předkládaného vynálezu poskytuje způsob hodnocení chemické látky z hlediska její schopnosti modulovat interakci mezi APRÍL a jeho receptorem. Tento způsob obsahuje smíchání A.PRIL a receptoru A.PRIL v podmínkách, kde taková dvojice je schopna interakce, pak přidat chemickou látku, která se testuje, a detekovat vytvoření a nebo naopak rozpad komplexu. Taková modulující činidla se mohou cále hodnotit testy in vitro např. testováním jejich aktivity v bezbuněčném systému, případně ošetřením buněk těmito činidly nebo podáváním těchto činidel zvířatům a následným hodnocením účinků.

Příklady provedení vynálezu

Příklad 1

Analýza A.PRIL northernovým přenosem (northern blot) ukázala, že exprese A.PRIL byla velmi slabá a omezená jen na několik tkání (Obr. 2A) . Dva transkripty velikosti 2,1 kb a 2,4 kb byly nalezena v prostatě, zatímco v PBL byl nalezen kratší transkript velikosti 1,8 kb. Analýza northernovým přenosem byla provedena pomocí komerčně dostupných membrán s přenesenou RNA z lidských tkání Human Multiple Tissue • · ·· · « · *

Northern Blots I, II (Clontech katalog, č. 7760-1 a 7753-1), Human Cancer cell Line MTN Blot (Clontech, katalog, č. 77571) a Human Tumor Panel Blot V (Invitrogen, katalog, č. D 3500-01). membrány byly hybridizovány v hybridizačním roztoku ExpressHyb (Clontech, katalog, č.8015-1) nejméně 1 hodinu při 62 °C. Sondy cDNA značené pomocí náhodných primerů (Boehringer Mannheim) byly syntetizovány pomocí cDNA odpovídající extracelulární doméně APRÍL jakožto templátu. Teplotně denaturovaná sonda cDNA byla přidána v 1,5 x 10° cpm/ml do čerstvého roztoku ExpressHyb. Membrána byla hybridizována 12 až 24 hodin v 62 °C, třikrát opláchnuta ve 2 x SSC s 0,05 % SDS a pak exponována v -70 °C. Analýza A.PRIL northernovým přenosem ukázala, že exprese APRÍL byla velmi slabá a omezená jen na několik tkání (Obr. 2A) . Dva a 2,4 kb byly nalezeny transkripty v prostatě, velikosti 2,1 kb zatímco v P3L byl nalezen kratší transkript velikosti 1,8 kb.

Při delším expozičním času byla objevena A.PRIL mRNA velikosti 2,1 kb v tlustém, střevu, slezině a pankreatu (data neuvedena) . Tato omezená distribuce APRÍL mRNA je ve shodě s původem klonů cDNA v současnosti dostupných v databázi EST klonů. Ze 23 klonů pouze dva pocházely z normálních tkání (pregnantní děloha, pankreatické ostrůvky). Je nápadně, že zbytek EST-klonů (21 klonů, 91 %) byl přítomen v knihovnách cDNA vytvořených z nádorů nebo linií nádorových buněk (nádor vaječníku, 11, nádor prostaty, 3, Gessler-Wilmsúv tumor, 1, karcinom tlustého střeva, 1, tumor endometria, 1, nádor příštitné žlázy, 1, nádor pankreatu, 1, T-buněčný lymfom, 1, buněčná linie pocházející z adenokarcinomu LNCAP, 1). To bylo příčinou dalších testů transformovaných linií na expresi APRÍL mRNA (obr. 2A), a skutečně bylo zjištěno, že všechny buněčné linie silně exprimovaly transkript APRÍL velikosti 2,1 kb.

• ·

- 41 Nejvyšší signály specifické pro APRÍL byly detekovány v kolorektálním adenokarcinomu SW480, v Burkittově lymfomu Ráji a melanomu G36I. Pro potvrzení těchto zjištění byla měřena hladina exprese APRÍL mRNA v několika nádorech a byla porovnána s normálními tkáněmi. APRÍL mRNA byla ve velkém množství detekována u karcinomu štítné žlázy a lymfomu, zatímco v odpovídající normální tkáni byl nalezen pouze slabý hybridizační signál (obr. 2C) . Ve dvou dalších nádorech analyzovaných northernovým přenosem (nádor nedledvinky a příštitné žlázy) nebyla hladina APRÍL mRNA zvýšena. Avšak pomocí hybridizace in šitu byla zjištěna hojnost APRÍL mRNA v lidském adenokarcinomu tlustého střeva ve srovnání s normální tkání tlustého střeva (obr. 2D).

K prozkoumání možných aktivit APRÍL byla exprimována rekombinantní forma rozpustné extracelulární domény APRÍL (sAPRIL) obsahující aminokyseliny 110 až 256 v buňkách 293' . Gen .APRÍL plné délky byl amplifikován z klonu EST pomocí specifického přímého 5'-koncového oligonukleotidového primeru s místem EcoRI (5'-CCAGCCTCATCTCCTTTCTTGC-3') a specifického 3'-koncového primeru s místem Xbal (5'-TCACAGTTTCACAAACCCCAGG3'). Amplifikovaný fragment byl štěpen EcoRI/Xbal a klonován do modifikované verze pCRIII (Invitrogen) v souladu s rámcem N-koncového peptidu FLAG¹¹⁵’. Rozpustná forma A.PRIL (s.APRIL) byla připravena pomocí dvou primeru 5'-AAACAGAAGAAGCAGCACTCTG3' a 5'-TCACAGTTTCACAAACCCCAGG-3' obsahujících místa Pstl a Xbal a pak klonována do modifikovaného vektoru pCRIII obsahujícího jak signál HA pro sekretování proteinu v eukaryotických buňkách tak N-koncový epitop FLAG¹**’.

··«· · · · · · · * « · · ·«· · ··· · · · • i « · · ·· · * ·· · •« *· · · · * ··

- 42 Příklad 2

Značně rozšířená exprese .APRÍL v nádorových buňkách a tkáních vedla k domněnce, že APRÍL nějak souvisí s růstem nádorů a proto byly různé linie nádorových buněk inkubovány s purifikovaným rekombinantním sAPRIL značením FLA.G^!'.

Buněčné linie lidských embryonálních T buněk 293, buňky lidské T-leukémie Jurkat a buňky lidského Burkittova lymřomu 3-buněk Ráji a melanomová buněčná linie byly kultivovány jak bylo dříve popsáno¹' Ostatní buněčné linie zmiňované v tomto popisu jsou deponovány v Americké sbírce mikroorganismů (ATCC, Rockville, Marylland). Všechny buněčné linie byly kultivovány v médiu RPMI nebo DMEM doplněném 10% telecím řetálním sérem.

Pomocí Flag označené verze extracelulární domény (zbytky 103 až 231) lidského FasL a TRAIL (zbytky 95 až 231) byly nedávno popsány . Rozpustný lidský TWE.AK (zbytky 141 až 284) značený Flag byl připraven v buňkách 293 (viz připravovaný rukopis). Protilátka anti-Flag M2 byla získána od firmy Kodak Internationl Biotechnologies. Bylo pozorováno na dávce závislé zvýšení proliferace T-lymfomových buněk Jurkat v přítomnosti APRÍL, detekované zvýšením počtu (přibližně o 50 %) (11) životaschopných buněk 24 hodin po přidání ligandů (obr. 3A) . Proliferace buněk byla stanovena inkubováním buněk v počtu 50 000 buněk na jamku ve 100 μΐ média s uvedenou koncentrací rekombinantního A.PRIL, TWE.AK, TRAIL a FasL a pak stanovením počtu životaschopných buněk po 24 hodinách pomocí proliferačního testu Celltiter 96 AQ (Promega) dle návodu výrobce soupravy nebo pomocí inkorporace H-thvmidinu. Pro imunodepleci Flag-.APRIL byla použita anti-Flag navázaná na agarózu.

- 43 Zvýšení proliferace bylo nezávislé na kostimulačních signálech jako jsou např. protilátky anti-CD3 nebo jiné cytokiny. Podle očekávání přidání . shodně připraveného a purifikovaného FasL k buňkám Jurkat snížilo počet životaschopných buněk, zatímco TWEAk neměl žádný účinek. Zvýšený počet buněk koreloval se zvýšenou (40%) inkorporaci • 3H-thymidinu u buněk ošetřených A.PRIL (obr. 3A) . Imunodeplece v médiu obsahujícím A.PRIL značený pomocí FLAG způsobená protilátkami anti-FLAG, ale nikoliv protilátkami anti-myc, redukovala proliferativní účinek (obr. 33), což ukazuje, že proliferativního účinku bylo dosaženo specificky díky A.PRIL. Zvýšená rychlost proliferace byla -také pozorována u některých 3-lymfomů (lidský RÁJI, myší buňky A.20, ale nikoliv lidský 3J.A3) a buněčných linií epiteliálního původu jako jsou buňky COS a HeLa, a také melanomů (obr. 3C) . Buňky karcinomu prsu RCP-7 neodpovídaly. Účinek na buňky Jurkat byl dokonce ještě výraznější, když bylo selecí fetální sérum sníženo z 10 % na 1 % (obr. 3D) .

Rekombinantní sA.PRIL vytvářel agregáty, což by mohlo vysvětlit značně vysoké koncentrace potřebné pro detekci proliferačního účinku sA.PRIL. Buňky NIH-3T3 byly transfekovány lidským A.PRIL plné délky (12) a bylo tak získáno několik klonů exprimujících A.PRIL (obr. 4A) . Klony NIH-3T3 A.PRIL byly » připraven transfekcí expresního vektoru pCRIII obsahujícího

A.PRIL plné délky značený FLAG pomocí kalciumfosfátové metody. 3uněčné proteiny odpovídající přibližně 2 x 10⁶ buněk v každé dráze byly elektroforeticky separovány na 12% polyakrylamidového gelu v přítomnosti SDS za redukujících podmínek a po té přeneseny na nitrocelulózovou membránu. Imunopřenosová analýza (imunoblot) A.PRIL značeného FLAG byla provedena použitím 5 pg/ml potkaní monoklonální protilátky anti-FLAG M2 (Kodak International 3iotechnologies) . První

- 44 protilátky byly detekovány pomoci afinitně purifikované oslí anti-myší protilátky konjugované s peroxidázou (Dianova, Hamburg, Německo), následovanou chemiluminiscenčni reakcí s využitím systému ECL (Amersnam).

Je zajímavé, že transfektanty APRÍL jevily rychlejší proliferaci než kontrolní transfektanty (obr. 43) . Důvodem je zřejmě to, že buňky NIH-3T3 transfekované APRÍL by mohly mít růstovou výhodu in vivo. Pokud byly buňky divokého typu nebo kontrolní transfektanty NIH-3T3 injikovány nahým myším, hmatatelné nádory byly pozorovány po 5 až 6 týdnech (13) . Naproti tomu, 2 klony buněk NIH-3T3 trvale trnasfekovaných APRÍL indukovaly nádory po 3 až 4 týdnech. Po 6 týdnech musely být myši utraceny vzhledem k přílišnému rozsahu onemocnění (obr. 4C) . NIH-3T3 fibroblastv (ATCC, Rockville, Maryland, USA) a různé transfektanty (1 χ 10⁵ buněk) byly resuspendcvšny v 50 μΐ PBS a injikovány subkutánně do beku nahých myší BALB,^ (Harlan, Ziest, Nizozemí). Velikost nádoru byla měřena každý třetí den. Byly vybrány myši stejného stáří (3 zvířata v každé skuřině) .

Příklad 3

Izolace receptorů vázajícího APRÍL

Pro identifikaci a klonování receptorů byly použity ligandy rodiny TNF. Pomocí popsaných sekvencí APRÍL je možné fúzovat 5'-konec extracelulární domény, který tvoří vazebnou sekvenci pro receptor, k markerové nebo značkovací sekvenci a pak přidat vedoucí sekvenci, která podpoří sekreci ligandů v některém z mnoha možných expresních systémů. Jeden příklad takového postupu popsali Browning et al. (J3C 271: 8618-8626, • * • · · ·

1996), kdy ligand LT-β byl sekretován v takové formě. Vedoucí sekvence VCAM byla připojena ke krátké značkovací sekvenci peptidu myc s extracelulérní doménou LT-β. Sekvence VCAM byla použita proto, aby napomohla sekreci molekuly LT-β, která je normálně vázána na membránu. Sekretovaný protein si ponechává značku myc na svém N-konci, která nijak nesnižuje schopnost vázat se na receptor. Takový sekretovaný protein se muže exprimovat buďto v přechodně transfekovaných buňkách COS nebo v podobném systému, např. vektorech odvozených od EBNA, systému hmyzí buňky a bakuloviru nebo Pichia sp. apod. Jako zdroj označeného ligandu se může využít nepurifikovaný buněčný supernatant.

Buňky exprimující receptor je možné identifikovat tak, že se exponují označenému ligandu. Buňky s navázaným ligandem se pak identifikují pomocí průtokové cytometrie EACS, když se myc označí protilátkou proti peptidu myc- (anti-myc, 9Ξ10) a pak fykoerytrinem (nebo obdobnou značkou) značeným anti-myším imunoglcbulinem. Buňky ' pozitivní ve EACS se snadno identifikují a slouží pak jako zdroj RNA kódující receptor. Z této RNA pak může být připravena standardním postupem expresní knihovna a rozdělena do podskupin (pools). Tyto podskupiny klonů se pak transfekuji do vhodných hostitelských buněk a vazba označeného ligandu na transfekované buňky s receptorem se identifikuje pomocí mikroskopického vyšetření navázaný myc peptid označí anti-myším označeným enzymem, např. galaktosidázou, alkalickou fosfatázou nebo luciferázou. Jakmile se jednou identifikuje pozitivní podskupina klonu, zmenšuje se pak velikost podskupin dokud není identifikována cDNA kódující receptor. Celá tato procedura může být provedena buďto s myším nebo lidským APRÍL, přičemž jedna z nich povede snadněji k receptoru.

poté, co se imunoglcbulinem

Λ « • · · · • ·

- 46 Odborníkovi je zřejmé, modifikace přípravků APRÍL že je možné provést různé podle předkládaného vynálezu v rámci vynálezecké myšlenky vynálezu. Předkládaný vynález proto zahrnuje i takové modifikace a variace, pokud spadají do předmětu vynálezu vymezeného následujícími nároky, nebo pokud jde o ekvivalentní řešení.

- 47 SEZNAM SEKVENCÍ

Sekvence id. č. 1

GGTACGAGGC TTCCTAGAGG GACTGGAACC TAATTCTCCT GAGGCTGAGG 51 GAGGGTGGAG GGTCTCAAGG CAACGCTGGC CCCACGACGG AGTGCCAGGA 101 GCACTAACAG TACCCTTAGC TTGCTTTCCT CCTCCCTCCT TrTTATTTTC 151 AAGTTCCTTT TTATTTCTCC TTGCGTAACA ACCTTCTTCC CTTCTGCACC 201 ACTGCCCGTA CCC7TACCCG CCCCGCCACC TCCTTGCTAC CCCACTCTTG 251 AAACCACAGC TGTTGGCAGG GTCCCCAGCT CATGCCAGCC TCATCTCCTT 301 TCTTGCTAGC CCCCAAAGGG CCTCCAGGCA ACATGGGGGG CCCAGTCAGA 351 GAGCCGGCAC TCTCAGTTGC CCTCTGGTTG AGTTGGGGGG CAGCTCTGGG 401 GGCCGTGGCT TGTGCCATGG CTCTGCTGAC CCAACAAACA GAGCTGCAGA 451 GCCTCAGGAG AGAGGTGAGC CGGCTGCAGG GGACAGGAGG CCCTCCCAG 501 AATGGGGAAG GGTATCCCTG GCAGAGTCTC CCGGAGCAGA GTTCCGATGC 551 CCTGGAAGCC TGGGAGAATG GGGAGAGATC CCGGAAAAGG GAGCAGTGC 601 TCACCCAAAA ACAGAAGAAG CAGCACTCTG TCCTGCACCT GGTTCCCATT 651 AACGCCACCT CCAAGGATGA CTCCGATGTG ACAGAGGTGA TGTGGCAACC 701 AGCTCTTAGG CGTGGGAGAG GCCTACAGGC CCAAGGATAT GGTGTCCGAA 751 TCCAGGATGC TGGAGTTTAT CTGCTGTATA GCCAGGTCCT GTTTCAAGAC 801 GTGACTTTCA CCATGGGTCA GGTGGTGTCT CGAGAAGGCC AAGGAAGGCA 851 GGAGACTCTA TTCCGATGTA TAAGAAGTAT GCCCTCCCAC CCGGACCGGG 901 CCTACAACAG CTGCTATAGC GCAGGTGTCT TCCATTTACA CCAAGGGGAT 951 ATTCTGAGTG 7CA7AATTCC CCGGGCAAGG GCGaAACITa ACCTCTCTCC

1001 ACATGGAACC ttcctggggt ttgtgaaact gtgattgtgt tataaaaagt 1051 ggctcccagc ttggaagacc agggtgggta catactggagACAGCCAAGa 1101 GCTGAGTATA TAAAGGAGAG GGAATGTGCA GGAACAGAGGCATCTTCCTG 1151 GGTTTGGCTC CCCGTTCCTC ACTTTTCCCT TTTCATTCCC ACCCCCTAG A 1201 CTTTGATTTT ACGGATATCT TGCTTCTGTT CCCCATGGAG CTCCGAATTC 1251 TTGCGTGTGT GTAGATGAGG GGCGGGGGAC GGGCGCCAGG CATTGTTCAG 1301 ACCTGGTCGG GGCCCACTGG AAGCATCCAG AACAGCACCA CCATCTTA

Sekvence id. č. 2

MPASSPFLLA PKGPPGNMGG PVREPALSVA LWLSWGAALG AVACAMALLT 51 QQTELQSLRR EVSRLQGTGG PSQNGEGYPW QSLPEQSSDA LEAWENGERS 101 .RKRRAVLTQK QKKQHSVLHL VPINATSKDD SDVTEVMWQP ALRRGRGLQA 151 QGYGVR1QDA GVYLLYSQVL FQDVTFTMGQ VVSREGQGRQ ETLFRCIRSM 201 PSHPDRAYNS CYSAGVFHLH QGD1LSV1IP RARAKLNLSP HGTFLGFVKL

- 48 9 · · ·

Sekvence id. č. 3

GAA7TCGGCA CGAGGC7CCA GGCCACATGG GGGGCTCAGT CAGAGAGCCA 51 GCCCTTTCGG TTGCTCTTTG GTTGAGTTGG GGGGCAGTTC TGGGGGCTGT

101 GACTTGTGCT GTCGCACTAC TGATCCAACA GACAGAGCTG CAAAGCCTAA 151 GGCGGGAGGT GAGCCGGCTG CAGCGGAGTG GAGGGCCTTC CCAGAAGCAG 2 01 GGAGAC-CGCC CATGGCAGAG CCTCTGGGAG CAGAGTCCTG ATGTCCTGGA 251 AGCCTGGAAG GATGGGGCGA AATCTCGGAG AAGGAGAGCA GTACTCACCC 501 AGAAGCACAA GAAGAAGCAC TCAGTCCTGC ATCTTGTTCC AGTTAACATT 351 ACCTCCAAGG ACTCTGACGT GACAGAGGTG ATGTGGCAAC CAGTACTTAG 401 GCGTGGGAGA GGCCCTGGAG GCCCAGGGAG ACATTGTACG AGTCTGGGAC 451 ACTGGAATTT ATCTGCTCTA TAGTCAGGTC CTGTTTCATG ATGTGACTTT 501 CACAATGC-GT CAGGTGGTAT CTCGGGAAGG ACAAGGGAGA AGAGAAACTC 551 TATTCCGATG TATCAGAAGT ATGCCTTCTG ATCCTGACCG TGCCTACAAT 601 AGCTGCTACA G7GCAGGTGT CTTTCATTTA CATCAAGGGG ATATTATCAC 651 TGTCAAAATT CCACGGGCAA ACGCAAAACT TAGCCTTTCT CCGCATGGAA 701 CATTCCTGGG GTTTGTGAAA CTATGATTGT TATAAAGGGG GTGGGGATTT 751 CCCAT7CCAA AAACTGGCTA GACAAAGGAC AAGGAACGGT CAAGAACAGC 801 TCTCCATGGC TTTGCC7TGA CTGTTGTTCC TCCCTTTGCC TTTCCCGCTC 851 CCACTA7CTG GGC777GAC7 CCATGGATAT 7AAAAAAGTA GAA7Á7777G 901 7G777A7C7C CCAAAAA

Sekvence id. č. 4

MGGSVREPAL SVALWLSWGA VLGAVTCAVA LLIQQTELQS LRREVSRLQR 51 SGC-PSQKQGS RPWQSLWSQS PDVLEAWKDG AKSRRRRAVL 7QKHKKKKSV 101 LHLVPVNITS KDSDVTFVMW QPVLRRGRG? GGQGDIVRVW DTGIYLLYSQ 151 VLFHDVTFTM GQWSRSGQG RRE7LFRCIR SMPSDPDRAY NSCYSAGVFH

201 LHQGDIITVK IPRANAKLSL SPHGTFLGFV KL

- 49 9 9 9 9

Citovaná literatura

i. Smiih cl al. 1990; Kohno cl al 1990; Loetscher et al 1990; Schall et al 1990.

ii. See Jones et al., 19S9; Eck et al., 1992.

iii. K. Tracey, in Tumor Necrosis Factors. The Molecules and Their Emerging Role in Medicine, B. Beutler (Ed.), Raven Press, NY, p 255 (1992)); A.

Waage, in Tumor Necrosis Factors. The Molecules and Their Emerging Role in Medicine. B. Beutler (Ed.), Raven Press, NY, p 275 (1992).

iv. G. D. Roodman, in Tumor Necrosis Factors. The Molecules and Their Emerging Role in Medicine, B. Beutler (Ed.), Raven Press, NY, p 117 (1992).

v. A. Nakane, in Tumor Necrosis Facíors, The Molecules and Their Emerging Role in Medicine, B; Beutler (Ed.), Raven Press, NY, p 285 (1992); I. A.

Clark et al., in Tumor Necrosis Factors. The Molecules and Their Emerging Role in Medicine, B. Beutler (Ed.), Raven Press, NY, p 303 (1992); G. E.

Grau et al., in Tumor Necrosis Factors. The Molecules and Their Emerging Role in Medicine. B. Beutler (Ed.), Raven Press, NY, p 329 (1992); P-F. Piguet, in Tumor Necrosis Factors. The Molecules and Their Emerging Role in Medicine. B. Beutler (Ed.), Raven Press, NY, p 341 (1992); G. H. Wong et al., in Tumor Necrosis Factors. The Molecules and Their Emerging Role in

Medicine, B. Beutler (Ed.), Raven Press, NY, p 371 (1992).

vi. S. M al i k, i n Tumor Necrosis Factors. The Molecules and Their Emerging Role in Medicine. B. Beutler (Ed.), Raven Press, NY, p 407 (1992).

vii. D. A. Fox. Am. J. Med.,99. 82 (1995).

viii. D. Goeddel et al., Cold Spring Harbor Symposium Quant. Biol.. 51, 597 (1986); G. Trinchieri, in Tumor Necrosis Factors. The Molecules and Their Emerging Role in Medicine. B. Beutler (Ed.), Raven Press, NY, p 515 (1992).

ix. L. A. Tartaglia et al.. Proč. Nati. Acad. Sci. USA. 88, 9292 (1991); L.A. Tartaglia and D. V. Goeddel. Immunol. Today, 13, 151 (1992).

x. B. Luettig et al., J, Immunol., 143, 4034 (1989); M. Kriegler et al., Cell, 53, 45 (1988).

xi. C. F. Ware et al., in Pathwavs for Cvtolvsis, G. M. Griffiths and J. Tschopp (Eds.), Springer-Verlag, Berlin, Heidelberg, pl75-218 (1995).

xii. N. Paul et al., Ann. Rev. Immunol..6.407 (1988).

xiii. P.D. Crowe et al., Science, 264, 707 (1994). (J. Browning et al., Cell. 72, 847 (1993); J. Browning et al., J. Immunol.. 154, 33 (1995).

- 50 ···* · · · · · · · « · · · » · · · ♦ · · • ·· · · · » ··· ·« · xiv. P. De Togni et al., Science, 264,703 (1993); T.A. Banks et al., J. Immunol., 155, 1685 (1995).

xv. J. Browning and A. Ribolini, J. Immunol.,143,1859 (1989): J. Browning et al., J. Exp. Med.. 183. 867 (1996).

xvi. T. Suda et al., J. Immunol.. 154, 3806 (1995)(T. Suda et al., J, Immunol., 154, 3806 (1995).

xvii. B.C. Trauth et al., Science. 245,301 (1989); S. Yonehara et al., J. Exp. Med,. 169,1747 (1989); S. Nagata and P. Goldstein, Science, 267,1449 (1995); M. H. Falk et al.. Blood. 79. 3300 (1992).

xviii.F. Rieux-Laucat et al., Science, 268,1347 (1995); T. Takahashi et al., Cell, 76,969 (1994); R. Watanabe-Fukunaga et al., Nátuře, 356, 314 (1992).

xix. P. R. Galle and al., J, Exp. Med., 182, 1223 (1995).

xx. F. Silvestris and al., Clin. Immunol. Immunopathol.. 75, 197 (1995).

xxi. P.D. Katsikis et al./l Exp. Med.,181. 2029 (1995); A. D. Badley et al., J. Virol.,70. 199 (1996).

xxii. S. Wiley et al., Immunitv. 3, 673 (1995).

xxiii. J. F. Gauchat et al., FEBS Lett., 315, 259 (.1993); S. Funakosbi et al., Blood, 83,2787 (1994).

xxiv. R. C. Allen et al., Science, 259, 990 (1993).

xxv. L. Biancone et al., Kidnev-Int.,48.458 (1995); C. Mohan et al., J. Immunol., 154, 1470(1995).

xxvi. J. Ruby and al., Nátuře Medicine, 1,437 (1995).

xxvii. Z. Wang et al., J. Immunol,. 155, 3722 (1995); A. M. Cleary and al., L Immunol.. 155, 3329 (1995).

xxviii. S. Hess and H. Engelman. J. Exp. Med.,183, 159 (1996).

xxix. R. G. Goodwin et al, Cell, 73, 447 (1993); Goodwin et al, Eur. L Immunol., 23, 2631 (1993); C. A. Smith etal.,Cell, 73, 1349 (1993).

xxx. See for example, Narang, SA (1983) Tetrahedron 39:3; Itakura et al. (1981) Recombinant DNA. Proč 3rd Cleveland Sympos. Macromolecules, ed. AG Walton, Amsterdam: Elsevier pp273-289; Itakura et al. (1984) Annu. Rey. Biochem. 53:323; Itakura et al. (1984) Science 198:1056; Ike et al. (1983) Nucleic Acid Res. 11:477.

- Si xxxi. See, for example, Scott et al. (1990) Science 249:386-390; Roberts et al. (1992) PNAS 89:2429-2433; Devlin et al. (1990) Science 249: 404-406; Cwirla et al. (1990) PNAS 87: 6378-6382; as *well as U.S. Patents Nos. 5,223,409, 5,198,346, and 5,096,815.

33. M.T. Abreu-Martin, A. Vidrich, D.H. Lynch and S.R. Targan. Divergent induction of apoptosis and EL-8 secretion in HT-29 cells in response to TNF- and ligation of Fas ligand. J, Immunol. 155:4147-4154,1995.

34. K. Agematsu, T. Kobata, F.-C. Yang, T. Nakazawa, K. Fukushima, M. Kitahara, T. Moři, K. Sugita, C. Morimoto and A. Komiyama. CD27/CD70 interaction directly dríves B cell IgG and IgM synthesis. Eur. J. Immunol. 25: 2825-2829, 1995.

35. R. Amakawa, A. Hákem, T.M. Kundig, T. Matsuyama, J.J.L. Simard, E. Timms, A. Wakeham, H.-W. Mittruecker, H. Griesser, H. Takimoto, R. Schmits, A. Shahinian, P.S. Ohashi, J.M. Penninger and T.W. Mak. Impaired negative selection of T cells in Hodgkin=s disease antigen CD30-deficient mice. Cell 84: 551-562. 1996.

36. J.-L. Bodmer, K. Burens, P. Schneider, K. Hofmann, V. Steiner, M. Thome, T. Bomand, M. Hahne, M. Schroeter, K. Becker, A. Wilson, L.E. French, J.L. Browning, H.R. MacDonald, and J. Tschopp. TRAMP, a novel apoptosismediating receptor with sequence homology to tumor necrosis factor receptor and fas (apo-l/CD95). Immunitv 6:79-88, 1997.

37. J. Brojatsch, J. Naughton, M.M. Rolls, K. Zingler and J.A.T. Young. Carl, a TNFR-related protein is a cellular receptor for cytopathic avian lleukosissarcoma viruses and mediates apoptosis. Cell 87: 845-855, 3 996.

38. J.L. Browning, M.J. Androlewicz and C.F. Ware. Lymphotoxin and an associáted 33-kDa glycoprotein are expresed on the surface of an activated human T cell hybridoma. J, Immunol. 147: 1230-7, 1991.

39. J.L. Browning, K. Míatkowski, D.A. Griffíths, P.R.Bourdon, C. Hession, C.M. Ambrose and W. Meier. Preparation and characterization of soluble recombinant heterotrimeric complexes of human lymphotoxins alpha and beta. J. Biol. Chem. 271: 8618-26, 1996.

40. J.E. Castro, J.A. Listman, B.A. Jacobson, Y. Wang, P.A. Lopez, S. Ju, P.W.

Finn and D.L. Perkins. Fas Modulation of apoptosis during negative selection of thymocytes. Immunitv 5: 617-627,1996.

41. C.-Y.A. Chen and A.-B. Shyu. AU-rich elements: characterization and importance in mRNA degradation. Trends in Biol. Sci. 20:465-470, 1995.

• ·

- 52 42. Y. Chicheportiche, C. Ody and P. Vassalli. Identification in mouše macrophages of a new 4 kb mRNA present in hematopoietic tissue which shares a short nucleotide sequence with erythropoietin mRNA. Biochim. Bioohys. Res. Comm. 209: 1076-1081, 1995.

43. A.M. Chinnaiyan, K. O=Rourke, G.-L. Yu, R.H. Lyons, M. Garg, D.R. Duan, L. Xing, R. Gentz, J. Ni and V.M. Dixit. Signál transduction by DR3 a deathdomain-containing receptor related to TNFR-1 and CD95. Science 274:990992, 1996.

44. P. DeTogni et al. Abnormal development of peripheral lymphoid organs in mice deficient in lymphotoxin. Science 264: 703-7, 1994.

45. M.A. DeBenedette, N.R. Chu, K.E. Pollok, J. Hurtako, W.F. Wade, B.S.

Kwon and T.H.Watts. Role of 4-1BB ligand in costimulation of T lymphocyte growth and its upregulation on Ml2 B lymphomas by cAMP. J. Exp. Med. 181: 985-992, 1995?

46. M. Degli-Esposti, T. Davjs-Smith, W.S. Din, P.J. Smolak, R.G. Goodwin and C.A. Smith. Activation of the lymphotoxin-β receptor by cross-linking induces cbemokine production and growth arrest in A375 melanoma cells. J. Immunol, 158: 1756-1762, 1997.

47. T.M. Foy, A. Aruffo, J. Bajorath, J.E. Bunlmann and R.J. Noelle. Immune regulation by CD40 and its lisand gp39. Ann. Rev. Immunol. 14:591-617, 1996.

48. H.J. Gruss, N. Boiani, D.E. Williams, R.J. Armitage, C.A. Smith and R.G. Goodwin. Pleiotropic effects of the GD30 ligand on CD30-expressing cells and lymphoma cell lineš. Blood 83:2045-56, 1994.

49. H.J. Gruss and S.K. Dower. Tumor necrosis factor ligand superfamily: involvement in the patholoey of malignant lymphomas. Blood 85: 3378-404, 1995.

50. J. Kitson, T. Raven, Y.-P. Jiang, D.V. Goeddel, K.M. Giles, K.-T. Pun, C.J. Grinham, R.Brown and S.N. Farrow. A death domain-containing receptor that mediates apoptosis. Nátuře 384: 372-375, 1996.

51. S.Y. Lee, C.G. Park and Y. Choi. T cell receptor-dependent cell death of T cell hybridomas mediated by the CD30 cytoplasmic domain in association with tumor necrosis factor receptor-associated factors. J. Exp. Med. 183: 669-674, 1996.

52. R.I. Montgomery, M.S. Warner, B.J. Lum and P.G. Spear. Herpes simplex virus-1 entry into cells mediated by a novel member of the TNF/NGF receptor family. Cell 87:427-436, 1996.

53. S. Nagata. Apoptosis by death factor. Cell 88:355-365,1997.

54. R.M. Pitti, S.A. Marsters, S. Ruppert, C.J. Donahue, A. Moore and A. Ashkenazi. Induction of apoptosis by Apo-2 ligand, a new member of the tumor necrosis factor cytokine family. J. Biol. Chem. 1996.

55. C.A. Smith, T. Farrah and R.G. Goodwin. The TNF receptor superfamily of cellular and viral proteins: activation, costimulation, and death. Cell 76: 95962, 1994.

56. G.L. Smith. Virus strategies for evasion of the host response to infection. Trends in Microbiol. 3: 81-88, 1994.

57. E.Strueber and W. Strober. The T cell-B cell interaction via OX40-OX40L is necessary for the T cell independent humoral immune response. J. Exp. Med. 183: 979-989, 1996.

58. H.-K. Sytwu, R.S. Liblau and H.O. McDevitt. The roles of Fas/Apo-1 (CD95) and TNF in antigen-induced programmed cell death in T cell receptor trangenic mice. Immunitv 5: 17-30, 1996.

59. P. Vassalli. The pathophysiology of tumor necrosis factors. Ann. Rev. Immunol. 10: 411-452, 1992.

60. L. Zheng, G. Fisher, R.E. Miller, J. Peschon, D.H. Lynch and M.J. Lenardo. Induction of apoptosis in mature T cells by tumour necrosis factor. Nátuře

Claims (23)

1. PATENTOVÉ NÁROKY

   1. Nukleová kyselina kódující ligand .APRÍL, který obsahuje polypeptid složený nejméně ze 102 aminokyselin.
2. 2. Nukleová kyselina podle nároku 1, která kóduje sekvenci id. č. 2.
3. 3. Nukleová kyselina kódující ligand APRÍL nebo jeho fragment, přičemž tento ligand obsahuje aminokyselinovou sekvenci aminokyselin 1 až 55 ze sekvence id. č. 2.
4. 4. Nukleová kyselina kódující ligand APRÍL nebo jeho fragment, přičemž tento ligand obsahuje aminokyselinovou sekvenci aminokyselin 157 až 250 ze sekvence id. č. 2.
5. 5. Nukleové kyselina podle nároků 1 až 4 kódující aminokyselinové substituční analogy sekvence id. č. 2.
6. 6. Nukleová kyselina podle nároku 5, kde substituční analog, pokud je srovnán' se sekvencí id. č. 2, sdílí s ní přinejmenším 40% sekvenční podobnost, a kde substituční analog sdílí přinejmenším 80 % srovnaných cysteinových zbytků s ligandem APRÍL.
7. 7. Nukleová kyselina podle nároku 5, kde substituční analog, pokud je srovnán se sekvencí id. č. 2, sdílí s ní přinejmenším 80% sekvenční podobnost.

   - 55
8. 8. Nukleová kyselina mající nukleotidovou sekvenci, která obsahuj e:

   a) sekvenci id. č. 1, nebo

   b) substituční analog sekvence id. č. 1, nebo

   c) alterační analog sekvence id. č. 1, nebo

   d) deleční analog sekvence id. č. 1.
9. 9. Vektor, který v sobě obsahuje nukleovou kyselinu podle nároku 1, 2, 3, 4 nebo 8 v podobě inzertu, přičemž tento vektor volitelně obsahuje expresní kontrolní sekvenci operativně spojenou s inzertem.
10. 10. Hostitelská buňky obsahující vektor podle nároku 9.
11. 11. Způsob přípravy v podstatě čistého APRÍL·, vyznačující se ti m, že obsahuje kroky, kdy se kultivují hostitelské buňky podle nároku 10.
12. 12. Polypeptid ligandu .APRÍL, který obsahuje alespoň 102 aminokyselin.
13. 13. Polypeptid ligandu' A.PRIL, který obsahuje aminokyselinovou sekvenci aminokyselin 1 až 55 ze sekvence id. č. 2 nebo jeho fragment.
14. 14. Polypeptid ligandu .APRÍL, který obsahuje aminokyselinovou sekvenci aminokyselin 157 až 250 ze sekvence id. č. 2 nebo jeho fragment.
15. 15. Ligand APRÍL vybraný ze skupiny obsahující:

    a) sekvenci id. č. 2 nebo

    b) aminokyselinový substituční analog sekvence id. č. 2.

    - 56
16. 16. Rozpustný polypeptid ligandu APRÍL podle nároků 12 až 15.
17. 17. Farmaceutický přípravek vyznačující se tím, že obsahuje terapeuticky, účinné množství polypeptidů ligandu APRÍL podle nároku 12 až 15 a farmaceuticky přijatelný nosič.
18. 18. Protilátka, která se specificky váže k polypeptidů ligandu APRÍL podle nároku 12, 13, 14, 15 nebo 16,
19. 19. Protilátka, která blokuje vazbu polypeptidů ligandu .APRÍL na polypeptid receptorů APRÍL.
20. 20. Protilátka podle nároku 20, která se specificky váže na polypeptid APRÍL.
21. 21. Použití farmaceutického přípravku podle nároku 17 k výrobě léku pro prevenci nebo redukci závažnosti autoimunitní nemoci, prevenci nebo redukci závažnosti imunitní reakce na tkáňový štěp, stimulaci nebo potlačení imunitního systému nebo léčení rakoviny.
22. 22. Způsob identifikace receptorů pro APRÍL vyznačující se tím, že obsahuje kroky, kdy s s

    a) poskytne APRÍL nebo jeho fragment,

    b) APRÍL nebo jeho fragment označí detekovatelnou značkou,

    c) testují přípravky, aby se identifikovaly receptory, které se váží k detekovatelně značenému b).

    57 23

    24 .

    25.

    26.

    2 7 .
23. 23.

    29.

    Způsob exprese APRÍL v savčí buňce vyznačuj ící se t í m, že obsahuje kroky, kdy se

    a) vnese do buňky gen kódující APRÍL,

    b) buňkám umožní žít v takových podmínkách, že gen je exprimován v savci.

    Použití vektoru obsahujícího gen kódující APRÍL k výrobě léku pro léčené nemocí souvisejících s APRÍL u savců, které obsahuj e

    a) vnesení terapeuticky účinného množství vektoru do buňky,

    b) expresi genu v buňce savce.

    Použití podle nároku 24, kdy savec je člověk.

    Použití podle nároku 24 kdy vektor je virus.

    Použití činidla schopného narušit vazbu .APRÍL s jeho receptorem pro výrobu léku pro indukci buněčné smrti.

    Použití podle nároku 28, které dále obsahuje podání interferonu-γ.

    Použití blokujícího činidla schopného narušit spojení mezi .APRÍL a jeho receptorem k přípravě léku pro léčení, potlačení, aktivaci nebo změnu imunitní odpovědi zahrnující signální dráhu mezi APRÍL a jeho receptorem, nebo léčení, potlačení nebo změnu progrese rakoviny.

    30. Použití podle nároku 29, kde imunitní odpověď zahrnuje buňky lidského karcinomu.

    0 0 *« · * · 0 · 0 ·· 00

    0·0· 00 0 00«« ♦ 0 · · «0 0 » · · ·

    0 0 · 0«0 0 00» ·« ·

    0 00 0 0 00 0 0 00 ·

    00 00 00 00 0 · · *

    - 58 31. Použití podle nároku 29, kce blokující činidlo je modifikovaná inhibující forma APRÍL nebo protilátky anti-APRIL nebo jejich biologicky aktivní fragmenty.'

    32. Použití podle nároku 31, kde blokující činidlo je protilátka proti receptoru APRÍL (anti-receptor APRÍL).

    33. Použití podle nároku 29, kde blokující činidlo se podává pacientovi v kombinaci s alespoň jedním chemoterapeutickým činidlem.

    34. Použití podle nároku 33, kde se dále u pacienta užívá ozařování.

    35. Použití polypeptidů ligandu APRÍL podle nároků 12 až 15 nebo protilátky podle nároků 19 až 21 k přípravě léku pro potlačení růstu nádorových buněk, které exprimují A.PRIL, které obsahuje kroky, kdy se buňky uvedou do kontaktu s účinným množstvím rozpustného polypeptidů ligandu APRÍL podle nároků 12 až 15 nebo protilátky podle nároků 19 až 21.

    36. Použití polypeptidů ligandu A.PRIL podle nároků 12 až 15 nebo protilátky podle nároků 19 až 21 k přípravě léku pro potlačení růstu nádorových buněk, které exprimují polypeptid receptoru A.PRIL, které obsahuje kroky, kdy se buňky uvedou do kontaktu s účinným množstvím rozpustného polypeptidů ligandu A.PRIL podle nároků 12 až 15 nebo protilátky podle nároků 19 až 21.