CZ294615B6 - Léčivo obsahující protilátky reaktivní s polypeptidovým ligandem APRIL pro léčení rakoviny - Google Patents

Abstract

Řešení se týká APRIL, nového členu rodiny nádorového nekrotického faktoru (TNF), modifikovaných APRIL a farmaceutických přípravků, které je obsahují. Dalším předmětem řešení je použití protilátky reaktivní s polypeptidovým ligandem APRIL, která narušuje vazbu mezi polypeptidovým ligandem APRIL a receptorem APRIL, pro výrobu léčiva k léčení, potlačení nebo vyvolání změny progrese rakoviny.ŕ

Description

Oblast techniky

Předkládaný vynález se týká nového ligandu a polypeptidů, které jsou členy rodiny nádorového nekrotického faktoru. Nový ligand byl nazván APRÍL, což je zkratka pro „A Proliferation Inducing Ligand“, tj. ligand indukující proliferaci. tyto proteiny nebo jejich receptory mají protinádorové a/nebo imunoregulační využití. Kromě toho buňky transfekované geny pro tyto nové ligandy se mohou užít v genové terapii pro léčení nádorů, autoimunitních a zánětlivých nemocí nebo dědičných genetických poruch, a protilátky blokující tyto proteiny mohou mít imunoregulační využití. Předmětem vynálezu je konkrétně použití protilátky reaktivní s polypeptidovým ligandem APRÍL, která je schopná narušit spojení mezi polypeptidovým ligandem APRÍL a receptorem APRÍL, pro výrobu léčiva k léčení, potlačení nebo vyvolání změny progrese rakoviny.

Dosavadní stav techniky

Cytokiny příbuzné nádorovému nekrotickému faktoru (TNF) jsou mediátory hostitelské obranné a imunitní regulace. Členové této proteinové rodiny se vyskytují ve formě ukotvené na buněčnou membránu, kdy působí lokálně prostřednictvím vzájemného kontaktu mezi buňkami, nebo se vyskytují jako vylučované proteiny schopné difundovat ke vzdálenějším cílům. Paralelní rodina receptorů ukazuje na to, že přítomnost těchto proteinů vede k iniciaci buněčné smrti nebo buněčné proliferace a diferenciace cílové tkáně. V současnosti rodina TNF ligandů a receptorů obsahuje nejméně 13 známých párů receptor-ligand: TNF:TNF-R, LT-a:TNF-R, LT-α/β: LTβ-R, FasL.Fas, CD40L:CD40, CD30L.CD30, CD27L.CD27, OX40L:OX40 a 4-lBBL:4-lBB, trance/rankL:Light a Tweak. Sekvence DNA kódující tyto ligandy vykazují identitu pouze ve 25 % až 30 %, a to dokonce i v případě největší příbuznosti, ačkoliv příbuznost na úrovni sekvence aminokyselin je přibližně 50 %.

Určujícím rysem této rodiny cytokinových receptorů je extracelulámí doména bohatá na cystein, která byla objevena při molekulovém klonování dvou různých receptorů TNF®. Tato genová rodina kóduje glykoproteiny s vlastnostmi transmembránových proteinů typu I s extracelulámí vazebnou doménou vážící ligand a jednou transmembránovou doménou a cytoplazmatickým úsekem, který se podílí na aktivaci buněčných funkcí. Usek bohatý na cystain, který je současně vazebným úsekem pro ligand, má centrální doménu z hustě spojených disulfidových můstků, která se několikrát opakuje, což závisí na konkrétním členu rodiny. Většina receptorů má čtyři domény, ačkoliv jsou i receptory pouze se třemi doménami nebo naopak zase se šesti doménami.

Proteiny z rodiny TNF ligandů jsou charakteristické na svém N-konci krátkým úsekem hydrofilních aminokyselin, které často obsahuje několik argininových nebo lysinových zbytků, které zřejmě slouží jako sekvence k zastavení přenosu. Pak mají transmembránový úsek aextracelulární úsek poměrné délky, který odděluje doménu vázající receptor na C-konci od buněčné membrány. Tento úsek se někdy nazývá „stopka“. Vazebný úsek C-konce představuje větší část proteinu a často, i když ne vždy, obsahuje glykosylační místa. Tyto geny postrádají klasické signální sekvence charakteristické pro membránové proteiny typu I, spíše odpovídají membránovým proteinům typu II, které mají C-konec zasahující mimo buňku a krátký N-konec zasahující do cytoplazmy. V některých případech, jako jsou TNF a LT-α, se může objevit v průběhu časného opracování proteinu štěpení v úseku „stopky“ a ligand pak existuje především v sekretované formě. Avšak většina ligandů se vyskytuje v membránové formě a zprostředkovává lokalizovaný přenos signálů.

-1 CZ 294615 B6

Struktura těchto ligandů byla rozpoznána krystalografickou analýzou TNF, LT-α a CD40L. Struktura TNF a lymfotoxinu alfa (LT-α) je „sendvičová“, tj. skládají se ze dvou antiparalelních β-skládaných listů s topologií tzv. meandru („Greek key“ nebo ,jelly roll“^(II)). Odchylka rms mezi zbytky řetězců Ca a β je 0,61 C, což vede k domněnce o vysokém stupni podobnosti jejich molekulární topografie. Strukturálním rysem, který zjevně vyplývá z molekulárních studií CD40L, TNF a LT-α, je tendence těchto ligandů vytvářet oligomemí komplexy. Oligomerní struktuře je vlastní vytváření vazebných míst pro receptor v místě spojení mezi sousedními podjednotkami, čímž se vytvoří multivalentní ligand. Analýzou krystalové struktury se zkoumala kvartérní struktura CD40L, TNF a LT-α a ukázalo se, že CD40L, TNF a LT-α existují jako trimery. Mnoho aminokyselin konzervativních pro tyto ligandy se vyskytuje právě v oblasti úseků kostry struktury β—listu. Je pravděpodobné, že základní sendvičová struktura je zachována u všech těchto molekul, neboť části těchto sekvencí kostry jsou zachovány mezi různými členy celé rodiny. Kvartérní struktura se zřejmě také udržuje, neboť konformace podjednotek pravděpodobně také zůstává podobná.

Cleny rodiny TNF mohou být nejlépe charakterizovány jako hlavní přepínače v imunitním systému pro řízení přežívání buněk a také buněčné diferenciace. V současnosti jsou známy pouze dva sekretované cytokiny, a sice TNF a LT-α, na rozdíl od většiny ostatních členů rodiny TNF zakotvených v membráně. Zatímco membránové formy TNF byly dobře charakterizovány a pravděpodobně mají jedinečnou biologickou funkci, funkcí sekretovaných TNF je všeobecná signalizace „poplachu“ buňkám vzdáleným od místa události, která příslušnou událost vyvolala. Sekrece TNF může znásobit událost vedoucí k dobře známým změnám ve výstelce cév a v buňkách vmiste zánětu. Naproti tomu členy TNF rodiny vázané na membránu předávají signál prostřednictvím receptoru typu TNF pouze buňkám v přímém kontaktu. Tak např. pomocné Tbuňky poskytují „pomoc“ zprostředkovanou CD40 pouze takovým B-buňkám, se kterými se dostanou do přímého kontaktu prostřednictvím interakcí TCR. Podobná omezení na bezprostřední buněčný kontakt se týkají schopnosti indukovat buněčnou smrt u dobře prozkoumaného systému Fas.

Ligandy TNF je možné rozdělit do třech skupin na základě jejich schopnosti indukovat buněčnou smrt (viz tab. III). V první skupině jsou ligandy TNF, Fas a TRAIL, které mohou účinně indukovat buněčnou smrt v mnoha buněčných liniích a jejich receptory mají většinou kanonické „smrtící“ domény. Pravděpodobně ligand DR-3 (TRAMP/WSL-1) by patřil také do této kategorie. Druhou skupinou tvoří takové ligandy, které spouštějí slabší signál omezený jen na některé buněčné typy. Do této druhé skupiny patří např. TWEAK, ligand CD30 a ΕΤα1β2. Zajímavou otázkou je, jak členy této skupiny mohou spouštět mechanismus vedoucí k buněčné smrti, když nemají kanonickou „smrtící“ doménu. Nepřítomnost této domény vede k domněnce, že existuje ještě jiný slabší způsob signalizace v mechanismu buněčné smrti. Do poslední skupiny patří ty členy, které nejsou schopny přenášet žádný signál vedoucí k buněčné smrti. Ale pravděpodobně členy všech skupin mohou působit antiproliferačně na některé typy buněk jako následek indukce diferenciace, jako např. CD40 (Funakoshi et al., 1994).

Rodina TNF se dramaticky rozrostla v poslední době a obsahuje nyní 11 různých signálních drah zahrnujících regulaci imunitního systému. Expresní vzorce TWEAK a TRAIL ukazují, že v této rodině existuje značná funkční variabilita, dosud nerozpoznaná. To vyniklo zejména novým objevem dvou receptorů, které ovlivňují replikační schopnost viru Rousova sarkomu a viru Herpes simplex, a také významnými objevy, že TNF má antivirovou aktivitu a virus neštovic kóduje „vějičkové“ TNF receptory (Brojatsch et al., 1996, Montgomery et al., 1996, Smith 1994, Vassali 1992). TNF je mediátor septického šoku a kachexie^(II1) a účastní se regulace vývoje hematopoetických buněk^<IV). Zdá se, že hraje hlavní roli jako mediátor v zánětlivé reakci a v obraně proti bakteriálním, virovým a parazitárním infekcím^(V), a navíc má zřejmě protinádorovou aktivitu^(VI). TNF se podílí také na různých autoimunitních chorobách^(vn). TNF je vytvářen různými typy buněk, např. jsou to makrofágy, fibroblasty, T-buňky a cytotoxické NK-buňky („natural killer“)^<VIII>. TNF se váže na dva různé receptory, z nichž každý působí prostřednictvím

-2CZ 294615 B6 odlišných specifických signálních molekul uvnitř buňky, což výsledně vede k odlišným účinkům TNF^(IX). TNF může existovat jednak ve formě vázané na membránu, ale i jako volný sekretovaný cytokin^<x).

LT-α má s TNF mnoho společných aktivit, jako např. vazbu na TNF receptory^(XI), ale na rozdíl do TNF je sekretován hlavně aktivovanými T-buňkami a některými β-lymfoblastoidními nádory^(XII). T-buňkami a některými β-lymfoblastoidními nádory^(XII). Heteromerní komplex LT-a a LT-β je komplex vázaný na membránu, kde se váže na LT-β receptory^(XIII). Systém TL (tj. LT s receptorem LT-R) se podílí na vývoji periferních lymfoidních orgánů, neboť genetické narušení LT-β vede k poruchám T- a B-buněk ve slezině a k vymizení lymfatických uzlin^(XIV). Systém LT-β se také podílí na buněčné smrti u některých linií adenokarcinomových buněk^(XV).

Fas-L, další člen rodiny TNF, je exprimován přednostně na aktivovaných T-buňkách^(XVI. Indukuje smrt buněk nesoucích příslušný receptor, nádorových buněk a buněk infikovaných HIV, a sice mechanismem, který je znám jako programovaná buněčná smrt neboli apoptóza^<XVII). Kromě toho je známo, že nedostatek Fas nebo Fas-L vede k lymfoproliferativním poruchám, což potvrzuje roli systému Fas v regulaci imunitní odpovědi^(XVIII). Fas systém se také podílí na poškození jater v důsledku chronické infekce virové hepatitidy^(XIX) a na autoimunitní odpovědi u pacientů infikovaných HIV^(XX). Sytém Fas se také účastní destrukce T-buněk u pacientů infikovaných HIV^(XXI).

TRAIL, další člen této rodiny, se zřejmě také podílí na buněčné smrti mnoha různých transformovaných buněčných linií různorodého původu^(XXII).

CD40-L, další člen rodiny TNF, je exprimován na povrchu T-buněk a indukuje regulaci B-buněk nesoucích CD4(r^xxin). Kromě toho je známo, že změny v genu pro CD40-L jsou příčinou nemoci známé jako syndrom hyper-IgM vázané na X^(xxiv). Systém CD40 je také spojen s mnoha různými autoimunitními chorobami^(XXV) a CD40-L má také antivirové vlastnostr^XXVI). Ačkoliv se systém CD40 podílí také na záchraně apoptických B buněk^(XXVII), u jiných buněk než buněk imunitního systému indukuje apoptózu^(XXVIII). Mnohé další lymfocytární členy rodiny TNF se podílejí na kostimulaci^(XXIX).

Obecně lze shrnout, že členy rodiny TNF hrají základní regulační roli v zařízení imunitního systému a v aktivaci akutního obranného systému hostitele. Vzhledem k současnému pokroku v ovlivňování členů rodiny TMF s cílem terapeutického prospěchu je pravděpodobné, že členy této rodiny mohou poskytnout jedinečné prostředky proti nemocem. Některé ligandy rodiny TNF mohou přímo indukovat apoptickou smrt mnohých transformovaných buněk, např. LT, TNF, ligand Fas a TRAIL (Nagata 1997). Aktivace receptoru Fas a zřejmě i TNF a CD30 mohou indukovat buněčnou smrt netransformovaných lymfocytů, což může mít důležitou imunoregulační funkci (Amakawa et al., 1996, Nagata 1997, Sytwu et al., 1996, Zheng et al., 1995). Obecně je známo, že buněčná smrt se spustí po agregaci „smrtících“ domén, které jsou umístěny na cytoplazmatické straně receptorů TNF. Tyto „smrtící“ domény organizují uspořádání různých složek signální transdukce, což nakonec vede k aktivaci celé kaskády (Nagata 1997). Některé receptory postrádají kanonické „smrtící“ domény, např. receptor LTb a CD30 (Browning et al. 1996, Lee et al., 1996) a přesto mohou indukovat buněčnou smrt, i když podstatně slaběji. Tyto receptory pravděpodobně fungují primárně tak, že indukují buněčnou diferenciaci a buněčná smrt je aberantním důsledkem u některých transformovaných buněčných linií, ačkoliv celý obrázek je dosud nejasný, neboť na základě studie s myšmi „CD30 null“ se předpokládá smrtící role v negativní selekci v brzlíku (Amakawa et al., 1996). Naproti tomu, přenos signálů jinými drahami, jako např. právě prostřednictvím CD40, je vyžadováno pro udržování a přežívání buněk. Z výše uvedeného vyplývá tedy potřeba charakterizovat další členy rodiny TNF a poskytnout tak další prostředky k léčení nemocí a ovlivňování imunitního systému.

-3CZ 294615 B6

Bylo navrhováno, že některé členy rodiny TNF by mohly projevovat terapeutický protinádorový účinek, např. v kombinaci s IL-2 (viz patent US 5 425 940). Avšak dodnes není znám úplný a dostačující způsob léčení rakoviny. Kombinace chemoterapie se obecně užívá jak ve výzkumu, tak i v klinické praxi, a sice s antimetabolity, alkylujícími činidly, antibiotiky, buněčnými jedy apod. Tyto léky se podávají samotné nebo v kombinaci s cílem dosáhnout cytotoxického účinku na nádory a/nebo redukovat či eliminovat výskyt buněk rezistentních k léku a omezit vedlejší účinky.

Podstata vynálezu

Předkládaný vynález se týká polypeptidu zvaného APRÍL, a řeší řadu problémů, vyskytujících se díky omezením a nevýhodám dosavadních řešení známých ze stavu techniky. Původci objevili nový člen cytokinové rodiny TNF a určili sekvenci aminokyselin jak myšího, tak i lidského proteinu, včetně příslušných sekvencí DNA kódujících tyto proteiny. Vynález je možné využít pro identifikaci nových přípravků pro diagnózu a léčení mnohých nemocí a stavů, což je dále podrobněji popsáno, a také k získání dalších informací o imunitním systému a pro vlastní ovlivňování imunitního systému a imunitních procesů. Kromě toho se předkládaný vynález také týká indukce buněčné smrti při karcinomu.

Předmětem vynálezu je konkrétně využití protilátky reaktivní s polypeptidovým ligandem APRÍL, která je schopná narušit spojení mezi polypeptidovým ligandem APRÍL a receptorem APRÍL, pro výrobu léčiva k léčení, potlačení nebo vyvolání změny progrese rakoviny, a dalším předmětem je způsob in vitro identifikace sloučeniny schopné potlačit růst buněčné populace, zejména populace nádorových buněk.

V souladu s cílem vynálezu, aby bylo dosaženo výhod vynálezu, jak je v popisu a příkladech povedení vynálezu uvedeno, vynález zahrnuje sekvence DNA kódující APRÍL. Specificky a vynález týká DNA sekvence kódující lidský APRÍL (sekvence s identifikačním číslem 1). Kromě toho se vynález týká také aminokyselinové sekvence nového ligandu. Aminokyselinová sekvence lidského APRÍL je zde uvedena jako sekvence identifikačního čísla 2 (id. č. 2). Kromě toho je zde popsána sekvence myšího APRÍL uvedena jako sekvence id. č. 3 a 4. Další provedení vynálezu se týká sekvencí, které mají alespoň 50% homologii se sekvencí DNA kódující 5'-koncovou vazebnou doménu pro receptor, a přitom hybridizují se sekvencí podle vynálezu nebo jejím fragmentem, a která kóduje APRÍL mající sekvenci uvedenou zde jako sekvenci id. č. 1 nebo protein mající podobnou biologickou aktivitu.

Některá provedení vynálezu se týkají sekvencí DNA kódující APRÍL, kde sekvence jsou operativně spojeny se sekvencí kontrolující expresi. Pro použití podle vynálezu je vhodná jakákoliv sekvence pro kontrolu exprese a vhodná sekvence může být odborníkem snadno vybrána.

Předkládaný vynález se dále týká rekombinantní DNA, která obsahuje sekvenci DNA kódující APRÍL nebo její fragment, a také hostitelů, kteří mají sekvenci APRÍL trvale integrovanou v genomu nebo v podobě episomálního elementu. Podle vynálezu je možné užít jakéhokoliv vhodného hostitele, který může být snadno vybrán odborníkem bez nutnosti nadměrného experimentování.

Další provedení předkládaného vynálezu se týká způsobu přípravy v podstatě čistého APRÍL, který obsahuje kroky, kdy se kultivuje ransformovaný hostitel, a dále se týká APRÍL v podstatě zbaveného všech živočišných proteinů, které jsou s ním normálně asociovány.

Vynález se také týká ligandů APRÍL, které mají aminokyselinovou sekvenci uvedenou zde jako sekvenci id. č. 2 nebo jejich fragmentů či homologů. V různých provedeních vynálezu sekvence aminokyselin nebo sekvence DNA APRÍL mohou obsahovat konzervativní inzerce, delece a substituce, jak bude ukázáno dále, nebo mohou obsahovat fragmenty zmíněných sekvencí.

-4CZ 294615 B6

V jiném provedení se předkládaný vynález týká rozpustného konstruktu APRÍL, který je možné použít pro přímé spuštění farmakologické události, kterou zprostředkovává APRÍL. Taková událost může mít terapeutický účinek při stimulaci růstu, v léčení rakoviny a nádorů nebo v manipulaci s imunitním systémem pro léčení imunologických onemocnění. Rozpustné formy APRÍL mohou být metodami genového inženýrství upraveny tak, aby obsahovaly snadno rozpoznatelnou značku, a tím umožnily identifikaci receptorů pro tyto ligandy.

Další provedení předkládaného vynálezu se týkají protilátek proti APRÍL a jejich použití k léčení rakoviny, nádorů, nebo k ovlivňování imunitního systému při léčení imunologických nemocí.

Ještě další provedení předkládaného vynálezu se týká způsobů genové terapie pomocí genů pro APRÍL podle předkládaného vynálezu.

Farmaceutický přípravek podle předkládaného vynálezu může případně obsahovat také farmaceuticky přijatelný nosič, adjuvans, plnidlo nebo jiné farmaceutické přípravky, a může být podáván jakýmkoliv způsobem známým v oboru.

Jak předcházející stručný přehled tak i následující podrobný popis vynálezu je třeba považovat za vysvětlení vynálezu a za pouhé příklady provedení vynálezu, které slouží k podrobnějšímu vysvětlení předkládaného vynálezu.

Taktéž obrázky, sloužící k lepšímu porozumění vynálezu a tvořící součást popisu vynálezu, jsou určeny k tomu, aby ilustrovaly některá provedení vynálezu a společně s popisem sloužily k vysvětlení principu předkládaného vynálezu.

Přehled obrázků na výkresech

Obr. 1. A) Predikovaná aminokyselinová sekvence lidského APRÍL. Je znázorněna predikovaná transmembránová oblast (TM, v rámečku), potenciální místa N-glykosylace (označena hvězdičkou) a N-konec rekombinantního rozpustného APRÍL (sAPRIL).

B) Srovnání extracelulární proteinové sekvence APRÍL a několika dalších členů rodiny TNF ligandů. Identické a homologní zbytky jsou označeny černě, popřípadě šedě vyplněným rámečkem, TNFa je nádorovým nekrotický faktor a, LTa je lymfotoxin a, FasL je ligand Fas (CD95), TRANCE je ligand RANK.

Obr. 2. Exprese APRÍL. A) Norhernová analýza („Northern blot“) se 2 pg polyA⁺RNA v každé dráze u různých lidských tkání se sondou APRÍL cNA.

B) Exprese APRÍL mRNA v různých nádorových buněčných liniích: promyelocytární leukemie HL60, HeLa buňky S3, chronická myeloidní leukemie K562, lymfoblastická leukemie Molt-4, Burkittův lymfom Ráji, kolorektální karcinom A459, melanom G361.

C) Exprese APRÍL mRNA ve čtyřech různých lidských nádorech (T) a normální tkáni (N). Pás 18S rRNA je kontrola, která ukazuje shodné nanesení vzorků.

D) Exprese APRÍL mRNA u primárního karcinomu tlustého střeva. Hybridizace in šitu odhalila nadbytek rRNA pro APRÍL u karcinomu tlustého střeva ve srovnání s normální střevní tkání. Řezy z nádorové tkáně a přilehlé normální tkáně byly hybridizovány s anti-sense cRNA APRÍL značenou ³⁵S a jako kontrola byly hybridizovány řezy z nádorové tkáně se sense cRNA APRÍL značenou ³⁵S (negativní kontrola). Horní panely jsou mikrofotografie v temném poli, spodní panely jsou odpovídající mikrofotografie ve světelném poli.

-5CZ 294615 B6

Obr. 3. APRÍL stimuluje buněčný růst. A) Na dávce závislé zvýšení proliferace buněk Jurkat (lidské leukemické T-buňky), stanovené 24 hodin po přidání rozpustného APRÍL. Jako kontroly byly užity ligand Fas (FasL), Tweak a vzorek bez ligand (Kontrola) levý panel: životaschopnost buněk, pravý panel: inkorporace ³H-thymidinu.

B) Vliv vyčerpání APRÍL značeného Flag na růst nádorových buněk. Proliferativní účinek APRÍL značeného FLAG byl neutralizován protilátkami anti-FLAG, ale nikoliv protilátkami anti-myc.

C) Účinek APRÍL na rychlost proliferace buněk Ráji (lidské B-buňky Burkittova lymfomu), buněk A20 (myší B-lymfom), buněk BJAB (lidský B lymfom), COS (psí epitelové buňky), MCF-7 (lidský adenokarcinom prsu), Hela (lidský epiteloidní karcinom) a ME260 (lidský mekanom).

D) Vliv koncentrace telecího fetálního séra na proliferaci buněk Jurkat indukovanou APRÍL.

Obr. 4. APRÍL urychluje buněčný růst. A) Charakterizace klonů HIH-3T3 transfekovaných APRÍL. Hladina FLAG-APRIL u různých klonů byly analyzovány pomocí westernového přenosu s protilátkou anti-FLAG. Šipka ukazuje protein APRÍL, vysokomolekulární protein je detekován nespecificky.

B) NIH-3T3 klony exprimující APRÍL rostou rychleji než kontrolní slepě transfekované klony.

C) Zrychlený nádorový růst u klonů NIH-3T3 exprimuj ících APRÍL. Buňky HIH-3T3 (1 x 10⁵ buněk) a buňky transfekované APRÍL (NIH-AP, 2 různé klony, 1 x 10⁶ buněk) byly injikovány subkutánně nahým myším a byl monitorován růst nádorů.

Obr. 5. Srovnání lidské a myší aminokyselinové sekvence APRÍL ukazuje oblast rozsáhlé identity u těchto dvou proteinů. Identické zbytky jsou označeny tečkou nad symboly aminokyselin. Aminokyselinové zbytky označené podtržením představují potenciální místa N-glykoylace. Počáteční methionin je považován za startovní místo, avšak nelze vyloučit, např. u lidské sekvence, že methionin ležící dále proti směru transkripce („upstream“) a ve shodě se čtecím rámcem, může sloužit jako skutečné startovací místo.

Podrobný popis vynálezu

Předmětem vynálezu je konkrétně použití protilátky reaktivní s polypeptidovým ligandem APRÍL, která je schopné narušit spojení mezi polypeptidovým ligandem APRÍL a receptorem APRÍL, pro výrobu léčiva k léčení, potlačení nebo vyvolání změny progrese rakoviny, a dalším předmětem je způsob in vitro identifikace sloučeniny schopné potlačit růst buněčné populace, zejména populace nádorových buněk. Popis se dále bude týkat především podrobného popisu výhodných provedení předkládaného vynálezu. Předkládaný vynález se týká sekvencí DNA, které kódují lidský nebo myší APRÍL, jejich fragmentů nebo homologů, a dále se týká exprese těchto DNA v hostitelích těmito DNA transformovanými. Vynález se dále týká použití těchto DNA sekvencí a peptidů, které jsou těmito sekvencemi kódovány. Kromě toho se vynález týká jak lidské, tak myší aminokyselinové sekvence APRÍL, nebo jejích fragmentů či homologů, a dále se týká farmaceutického přípravku obsahujícího tyto sekvence nebo z těchto sekvencí odvozeného.

A. Definice

Termín „homologní“ v tomto textu popisuje podobnost mezi sekvencemi srovnávaných molekul. Pokud je jistá pozice v obou srovnávaných sekvencích obsazena shodnou bází nebo aminokyselinou, např. je-li stejná pozice v každé ze dvou molekul DNA obsazena adeninem, pak tyto molekuly jsou homologní v dané pozici. Homologie mezi dvěma sekvencemi vyjádřená vpro-6CZ 294615 B6 centech je funkce počtu schopných čili homologních pozic, které jsou sdíleny oběma sekvencemi, dělená počtem všech srovnávaných pozic a vynásobená 100. Tak např. jestliže u dvou sekvencí je 6 pozic z 10 shodných neboli homologních, pak tyto sekvence mají 60% homologii. Nebo např. dvě sekvence ATTGCC a TATGGC sdílejí 50% homologii. Obecně se provádí takové srovnání („alignment“) tak, že sekvence jsou k sobě navzájem „přiloženy“, aby poskytly maximální homologii.

Termín „rakovina“ označuje jakoukoliv poruchu typu neoplázie, včetně takových buněčných nemocí jako např. rakovina renálních buněk, Kaposiho sarkom, chronická leukemie, rakovina prsu, sarkom, karcinom vaječníku, rakovina konečníku, rakovina krku, mastocytom, rakovina plic, adenokarcinom prsu, karcinom dlaždicových buněk hltanu a rakoviny zažívacího traktu nebo žaludku. Výhodně rakovina je leukemie, mastocytom, melanom, lymfom, adenokarcinom prsu a karcinom dlaždicových buněk hltanu.

Termíny „purifíkovaný preparát“ nebo „v podstatě čistý preparát“ polypeptidu slouží k označení polypeptidu, který byl oddělen od ostatních proteinů, lipidů a nukleových kyselin, se kterými se společně přirozeně vyskytuje. Výhodně je purifíkovaný polypeptid oddělen také od jiných látek jako např. protilátek nebo matrix, které byly použity pro čištění.

Termín „transformovaný hostitel“ zahrnuje jakéhokoliv hostitele se sekvencí, tj. sekvencí APRÍL, trvale integrovanou do genomu.

Termín „ošetření“ nebo „léčení“ se zde užívá pro jakékoliv terapeutické ošetření, např. podávání terapeutického činidla nebo látky, např. léku.

Termín „v podstatě čistá nukleová kyselina“, např. v podstatě čistá DNA, znamená nukleovou kyselinu, která 1) není bezprostředně spojena sjednou nebo dvěma sekvencemi (jedna na 5konci a jedna na 3'-konci), např. kódujícími sekvencemi, se kterými sousedí v přirozeně se vyskytujícím genomu příslušného organismu, ze kterého nukleová kyselina pochází, nebo 2) je v podstatě bez sekvencí nukleových kyselin, které se vyskytují v organismu, ze kterého uvedená nukleová kyselina pochází. Tento termín zahrnuje tedy např. rekombinantní DNA vloženou do vektoru, např. do autonomně se replikujícího plazmidu nebo viru, nebo do genomové DNA prokaryotického nebo eukaryotického organismu, nebo která existuje jako samostatná molekula (např. cDNA nebo fragment genomové DNA vytvořený pomocí PCR nebo působením restrikčních endonukleáz) nezávislá na jiných sekvencích DNA. V podstatě čistá DNA také zahrnuje rekombinantní DNA, která je součástí hybridního genu kódujícího APRÍL.

Termíny „peptidy“, „proteiny“ a „polypeptidy“ jsou užívány navzájem zaměnitelným způsobem.

Termín „biologicky aktivní“ je používán ve smyslu mít aktivitu, buďto in vitro, nebo in vivo, která se projevuje přímo nebo nepřímo. Tak např. biologicky aktivní fragment APRÍL může mít např. 70% homologii aminokyselinové sekvence s aktivním místem APRÍL, výhodněji alespoň 80% homologii a nejvýhodněji alespoň 90% homologii. Identita nebo homologie vzhledem k APRÍL je definována jako procenta aminokyselinových zbytků v příslušné sekvenci, které jsou identické s aminokyselinovými zbytky sekvencí APRÍL uvedenými zde jako sekvence id. č. 2 a 4.

Termín „ligand“ se zde obecně užívá pro APRÍL. Provedení předkládaného vynálezu vyžaduje, pokud není uvedeno jinak, použití technik obvyklých v buněčné biologii, buněčných a tkáňových kulturách, molekulární biologii, transgenní biologii, mikrobiologii, techniku rekombinantní DNA a imunologické metody, které jsou v oboru známé. Takové techniky jsou popsány v příslušné odborné literatuře.

-ΊCZ 294615 B6

Úvod

APRÍL, nový člen TNF rodiny je zde podrobně popsán. Původci vynálezu bylo zjištěno, že zatímco hojnost výskytu transkriptů APRÍL v normální tkáni je nízká, vysoké hladiny mRNA byly detekovány v několika nádorových buněčných liniích, a také v karcinomech tlustého střeva, metastazujících lymfomech a nádorech štítné žlázy. Dále bylo zjištěno, že in vitro přidání rekombinantního APRÍL stimuluje proliferaci různých buněčných linií. Kromě toho transfekce APRÍL do buněk NIH-3T3 významně urychluje růst nádorů u nahých myší ve srovnání s kontrolami. Exprese a růst stimulují účinek APRÍL na nádorové buňky in vitro a in vivo vede k domněnce, že APRÍL se podílí na tumorigenezi.

APRÍL se zdá být jedinečným mezi členy TNF rodiny, jelikož je jednak hojně exprimován v nádorových buňkách a také stimuluje růst mnoha různých nádorových buněčných linií. Vzhledem ke zjevné účasti APRÍL v tumorigenezi antagonistické protilátky k APRÍL nebo receptorů APRÍL poskytnou nové možnosti k léčení rakoviny.

B. Sekvence DNA podle vynálezu

Jedním aspektem předkládaného vynálezu je v podstatě čistá (nebo rekombinantní) nukleová kyselina, která obsahuje nukleotidovou sekvenci kódující polypeptid APRÍL, jako je např. sekvence DNA uvedená zde jako sekvence id. č. 1 a/nebo ekvivalenty takových nukleových kyselin. Termín „nukleová kyselina“ zde zahrnuje také fragmenty nebo ekvivalenty, jako jsou např. sekvence kódující funkčně ekvivalentní polypeptidy. Ekvivalentní nukleotidové sekvence mohou obsahovat sekvence, které se liší jednou nebo několika nukleotidovými substitucemi, adicemi nebo delecemi, jako jsou např. alelické varianty, mutace atd., a mohou také obsahovat nukleotidové sekvence, které se liší od sekvence kódující APRÍL uvedené zde jako sekvence id. č. 1, díky degeneraci genetického kódu.

Předkládaný vynález je popisován obecně vzhledem k sekvencím lidského genu, i když odborníkovi je zřejmé, že se týká i myší sekvence nebo sekvence kódujíc APRÍL z jiných biologických druhů maj ící vysokou míru homologie s lidskou sekvencí. Lidský protein má, zdá se, všechny charakteristiky rodiny TNF, tj. uspořádání membránového proteinu typu II a konzervativní sekvenční motivy podílející se na uspořádání proteinu do struktury anti-paralelního β—listu, která je typická pro TNF.

Sekvence podle předkládaného vynálezu se mohou použít pro přípravu série DNA sond, které jsou shodné pro testování různých sad přirozených nebo syntetických DNA na přítomnost sekvencí příbuzných APRÍL nebo jeho fragmenty nebo deriváty. Odborníkovi je zřejmé, že termín APRÍL se zde užívá v takovém smyslu, že zahrnuje i jeho biologicky aktivní deriváty, fragmenty a homology.

Sekvence podle předkládaného vynálezu kódující APRÍL se může využít pro expresi peptidu podle vynálezu v různých prokaryotických nebo eukaryotických hostitelích transformovaných takovými sekvencemi. Peptidy APRÍL se mohou použít jako protirakovínná nebo imunoregulační činidla. Obecně to znamená, že jedním z kroků a aplikace je kultivovat hostitele transformované molekulou DNA obsahující kódující sekvenci APRÍL, operativně spojenou se sekvencí řídicí expresi.

Sekvence DNA a rekombinantní molekuly DNA podle předkládaného vynálezu mohou být exprimovány pomocí širokého spektra kombinací hostíte 1/vektor. Tak např. vhodné vektory mohou obsahovat segmenty chromosomových, jiných než chromosomových, nebo syntetických sekvencí DNA. Expresní vektory podle vynálezu jsou charakteristické tím, že obsahují alespoň jednu expresní kontrolní sekvenci, která je operativně spojena se sekvencí kódující APRÍL vloženou do vektoru, aby bylo možné regulovat či řídit expresi sekvence DNA.

-8CZ 294615 B6

V rámci každého expresního vektoru se mohou vybrat různá místa pro vložení sekvence podle předkládaného vynálezu. Místa jsou většinou navržena podle restrikčních endonukleáz, které v příslušném místě štěpí, a tato místa i endonukleázy jsou odborníkovi dobře známy. Odborníkovi je také zřejmé, že vektor pro použití podle předkládaného vynálezu nemusí obsahovat místa pro restrikční endonukleázy pro vložení požadovaného fragmentu DNA. Místo toho může být fragment klonován do vektoru alternativním způsobem. Výběr expresního vektoru, a zvláště míst vhodných pro vložení vybraného fragmentu DNA a jeho spojení s expresní kontrolní sekvencí, závisí na mnoha faktorech. K těmto faktorům patří např. velikost proteinu, který má být exprimován, citlivost tohoto proteinu k proteolytické degradaci enzymy hostitelské buňky, počet míst pro příslušný restrikční enzym, kontaminace nebo vazba exprimovaného proteinu proteiny hostitelské buňky, které jsou těžko odstranitelné v průběhu purifíkace apod. Další faktory, které je třeba vzít v úvahu, jsou expresní charakteristiky jako je např. poloha startovacího a ukončovacího kodonu vzhledem k sekvencím vektoru, a další faktory, které jsou odborníkovi zřejmé. Výběr vektoru a vhodných míst pro vložení sekvence DNA podle předkládaného vynálezu je tedy výsledkem zvážení všech těchto faktorů, přičemž ne všechna řešení jsou stejně účinná pro požadované aplikace. Ale pro odborníka je analýza všech těchto faktorů rutinní záležitostí a výběr vhodného systému pak závisí především na konkrétním použití.

Odborník je snadno schopen vhodně modifikovat expresní kontrolní sekvence tak, aby se získala vyšší úroveň proteinové exprese, např. substitucí kodonů nebo výběre kodonů určitých zvláštních aminokyselin, které jsou přednostně užívány konkrétním organismem, s cílem zmenšit proteolýzu nebo změnit vzorec glykosylace. Podobně mohou být nahrazeny cysteinové zbytky jinými aminokyselinami, aby se usnadnila produkce nebo uspořádání proteinu, nebo aby se předešlo problémům se stabilitou.

Tudíž ne všechny kombinace hostitel/expresní vektor fungují se stejnou účinností co se týče exprese sekvence DNA podle předkládaného vynálezu. Avšak výběr konkrétní vhodné kombinace hostitel/expresní vektor může být odborníkem snadno proveden. K faktorům, které je třeba vzít v úvahu, patří např. kompatibilita hostitele a vektoru, toxicita proteinů kódovaných sekvencemi DNA vektoru pro hostitele, snadnost izolace požadovaného proteinu, expresní charakteristiky sekvencí DNA a expresních kontrolních sekvencí s nimi operativně spojených, biologická bezpečnost, potřeba energie na uspořádání struktury proteinu, forma proteinu a případně modifikace požadovaného proteinu, které nastávají po expresi.

APRÍL produkovaný hostiteli transformovanými sekvencemi DNA podle předkládaného vynálezu, stejně jako nativní APRÍL purifikovaný způsobem podle vynálezu, nebo vytvořený na základě aminokyselinové sekvence podle vynálezu, jsou užitečné pro řadu protirakovinných, protinádorových a imunoregulačních aplikací. Jsou také užitečné v terapii a způsobech týkajících se i jiných nemocí.

Předkládaný vynález se také týká použití sekvencí DNA podle vynálezu pro expresi APRÍL ve zvláštních podmínkách, tj. při genové terapii. Navíc APRÍL může být exprimován v nádorových buňkách, kde je jeho exprese řízena promotory vhodnými pro tento účel. Taková exprese může posílit protinádorovou imunitní odpověď nebo přímo ovlivnit přežívání nádoru. APRÍL může také ovlivnit přežívání orgánových štěpů tím, že změní lokální imunitní odpověď. V takovém případě by byl sám štěp nebo buňky, které ho obklopují, modifikován genem APRÍL metodami genového inženýrství.

Dalším aspektem předkládaného vynálezu je použití izolované nukleové kyseliny kódující APRÍL pro tzv. „antisense“ terapii. Termín „antisense“ terapie se týká podání nebo vytvoření insitu oligonukleotidů nebo jejich derivátů, které specificky hybridizují (váží se) v normálních buněčných podmínkách s buněčnou mRNA a/nebo DNA kódující požadovaný APRÍL, aby tak inhibovaly expresi kódovaného proteinu tím, že inhibují transkripci a/nebo translaci. Zmíněná vazba může být konvenční komplementarita párů bází nebo např. v případě vazby na duplexy DNA může jít o vazbu prostřednictvím specifických interakcí v hlavním (velkém) zářezu dvou

-9CZ 294615 B6 šroubovicové DNA. Obecně se „antisense“ terapie týká celé řady technik v oboru užívaných a patří sem v podstatě jakákoliv terapie založená na specifické vazbě oligonukleotidové sekvence.

„Antisense“ konstrukt podle předkládaného vynálezu může být podán např. ve formě expresního plazmidu, který při transkripci v buňce tvoří RNA, která je komplementární k buněčné mRNA kódující APRÍL nebo alespoň kjejí části. Alternativně může být „antisense“ konstrukt také oligonukleotidová sonda připravená ex vivo. Takové oligonukleotidové sondy jsou výhodně modifikované oligonukleotidy, které jsou rezistentní k endogenním nukleázám a jsou proto stabilní in vivo. Příkladem takových molekul nukleových kyselin vhodných jako „antisense“ oligonukleotidy jsou fosforamidátové, fosfothioátové a metylfosfonátové analogy DNA (viz patentové přihlášky US 5 176 996, 5 264 564 a 5 256 775). Kromě toho obecný postup jako konstruovat oligomery vhodné pro „antisense“ terapii byly přehledně uvedeny např. v publikacích Van Der Krol et al., 1988, Biotechniques 6: 958-976 a Stein et al., 1988, Cancer Res. 48: 2659-2668, které jsou zde zahrnuty formou odkazu.

C. APRÍL a jeho aminokyselinová sekvence

APRÍL se členem rodiny TNF, jak bylo již diskutováno výše. Protein APRÍL sám, nebo jeho fragmenty či homology, má široké možnosti terapeutického a diagnostického použití, jak bude podrobněji diskutováno dále.

Srovnání sekvence APRÍL s ostatními členy lidské rodiny TNF ukazuje značnou strukturní podobnost. Všechny proteiny sdílejí několik konzervativních úseků v sekvenci extracelulární domény. Celková sekvenční homologie extracelulární domény APRÍL ukazuje nejvyšší stupeň homologie s fasL (21% aminokyselinová identita), TNFa (20%), LT-β (18%) a pak následují TRAIL, TWEAK a TRANCE (15%).

Nový polypeptid podle předkládaného vynálezu specificky reaguje s receptorem, který dosud nebyl identifikován. Avšak peptidy a způsoby podle předkládaného vynálezu umožňují identifikovat receptory, které specificky reagují s APRÍL nebo jeho fragmenty.

Určitá provedení podle předkládaného vynálezu zahrnují peptidy odvozené z APRÍL, které mají schopnost vázat se na příslušné receptory. Fragmenty APRÍL je možné připravit různými způsoby, např. rekombinantní technologií, pomocí PCR, proteolytickým štěpením nebo chemickou syntézou. Vnitřní nebo koncové fragmenty polypeptidu mohou být připraveny odstraněním jednoho nebo několika nukleotidů z jednoho nebo z obou konců nukleové kyseliny, která kóduje polypeptid. Fragmenty polypeptidu lze také připravit expresí mutované DNA. Polypeptidové fragmenty se mohou také chemicky syntetizovat pomocí konvenční techniky známé jako syntéza na pevné fázi užívající chemického postupu s ochranou f-moc nebo t-boc (podle Merriffielda). Tak např. peptidy a sekvence DNA podle předkládaného vynálezu je možné v podstatě libovolně rozdělit na fragmenty požadované délky, které se nepředkládají, nebo na předkládající se fragmenty požadované délky. Příslušné metody jsou podrobněji popsány v následujícím textu.

D. Příprava rozpustných forem APRÍL

Rozpustné formy APRÍL mohou být velmi účinné v přenosu signálu a mohou tudíž být podávány jako lék, který napodobuje přirozenou membránovou formu. Je možné, že APRÍL podle předkládaného vynálezu je přirozeně sekventován jako rozpustný cytokin, ale pokud tomu tak není, je možné uzpůsobit gen metodami genového inženýrství tak, aby se zesílila sekrece. Pro přípravu rozpustné sekretované formy APRÍL je třeba odstranit na úrovni DNA N-koncový transmembránový úsek a některé úseky „stonku“ a nahradit je vedoucí sekvencí typu I nebo alternativně vedoucí sekvencí typu II, která umožní účinné proteolytické štěpení v příslušném hostitelském systému. Odborník je schopen měnit rozsah „stonkových“ úseků ponechaných v expresním konstruktu tak, aby se dosáhlo optimálních vazebných vlastnosti k receptorů a sekreční účinnosti. Tak např. odštěpováním zN-konce lze připravit konstrukty obsahující všechny možné délky

-10CZ 294615 B6 „stonku“, takže vzniklou proteiny, které budou začínat aminokyselinou 81 až 139. Tímto typem analýzy lze stanovit optimální délku sekvence „stonku“.

E. Příprava protilátek reagujících s APRÍL

Předkládaný vynález se také týká protilátek specificky reagujících s APRÍL nebo jeho receptorem. Antiséra typu anti-protein/anti-peptid nebo monoklonální protilátky lze připravit standardními způsoby (viz např. Antibodies: A Laboratory Manual, Harlow and Lané (eds.), Cold Spring Harbor press, 1988). Savci jako např. myš, křeček nebo králík, se mohou imunizovat imunogenní formou peptidu. Způsoby, jak učinit protein nebo peptid imunogenní, např. tím, že se konjuguje s nosičem, nebo jiné způsoby, jsou v oboru známy.

Imunogenní část APRÍL nebo jeho receptory může být podána společně s adjuvans. Postup imunizace je možné monitorovat pomocí detekce titru protilátek v plazmě nebo séru. Standardní test ELIS A nebo jiné imunotesty se mohou použít s imunogenem coby antigenem k hodnocení hladin protilátek.

Ve výhodném provedení předkládaného vynálezu jsou protilátky imunospecifícké pro antigenní determinanty APRÍL nebo receptory APRÍL, tj. antigenní determinanty polypeptidu se sekvencí id. č. 2, nebo pro blízce příbuzný lidský nebo savčí, jiný než lidský, homolog (s homologií 70, 80 nebo 90 %, nejvýhodněji s homologií alespoň 95 %). V dalším výhodném provedení předkládaného vynálezu protilátky anti-APRIL nebo anti-receptor APRÍL v podstatě křížově nereagují (tzn. reagují pouze specificky) s proteinem, který je např. méně než z 80 % homologní se sekvencí id. č. 2, výhodně méně než z 90 % a nejvýhodněji méně než z 95 % homologní se sekvencí id. č. 2. Tím, že „v podstatě křížově nereagují“ se míní to, že protilátka má vazebnou afinitu k nehomolognímu proteinu menší než 10 %, výhodněji menší než 5 % a ještě výhodněji menší než 1 %, vazebné afinity k proteinu se sekvencí id. č. 2.

Termín „protilátka“ se v tomto textu užívá tak, že zahrnuje i fragmenty protilátky, které také specificky reagují s APRÍL nebo jeho receptorem. Protilátky lze fragmentovat pomocí obvyklých způsobů, které jsou v oboru známy, a možnosti využití fragmentů lze pak testovat stejnými způsoby jak bylo popsáno pro celé protilátky. Tak např. fragment F(ab')₂ je možné připravit působením pepsinu. Výsledný fragment se pak může ošetřit tak, aby se redukovaly disulfidové můstky, čímž vznikne fragment Fab'. K protilátkám podle předkládaného vynálezu dále patří biospecifické a chimérické molekuly, které mají aktivitu namířenou proti APRÍL nebo proti jeho receptoru. Tak pro blokování APRÍL nebo jeho receptoru je možné využít jak monoklonálních tak polyklonálních protilátek namířených proti APRÍL a příslušnému receptoru, a také příslušné fragmenty jako např. Fab' nebo F(ab')₂.

Různé formy protilátek je možné připravit standardními technikami rekombinantní DNA (Winter a Milstein, Nátuře 349: 293-299, 1991). Např. je možné konstruovat takové chimérické protilátky, kde vazebná doména pro antigen z protilátky zvířete je spojena s lidskou konstantní doménou (Cabilly et al., patent US 4 816 567). Chimérické protilátky redukují imunitní odpověď vyvolanou zvířecím protilátkám, když jsou použity v klinických aplikacích pro lidské pacienty.

Kromě toho se mohou syntetizovat rekombinantní „humanizované“ protilátky, rozpoznávající APRÍL nebo jeho receptor. Humanizované protilátky jsou chimérické protilátky, které obsahují většinou sekvence lidského IgG, do nichž byly vloženy sekvence zodpovědné za specifickou vazbu k antigenu. Zvířata se imunizují požadovaným antigenem, pak se izoluje příslušná protilátka a odstraní se z ní část variabilního úseku zodpovědná za specifickou vazbu antigenu. Úsek vážící antigen ze zvířete se pak klonuje do vhodného místa genu lidské protilátky, ze kterého byl odstraněn úsek vážící antigen. Humanizované protilátky minimalizují použití heterologních (tj. mezidruhových) sekvencí v lidských protilátkách, a tak snižují pravděpodobnost vyvolání imunitní odpověď u ošetřovaného pacienta.

-11 CZ 294615 B6

Různé třídy rekombinantních protilátek se mohou vytvářet také tak, že se připraví chimérické nebo humanizované protilátky obsahující variabilní domény a lidské konstantní domény (CH1, CH2 a CH3) izolované z různých tříd imunoglobulinů. Tak např. se mohou připravit rekombinantním způsobem protilátky se zvýšenou valencí vazebných míst pro antigen, a to tak, že se klonuje vazebné místo pro antigen do vektoru nesoucího konstantní úsek řetězce lidské protilátky (Arulandam et al., J. Exp. med. 177: 1439-1450, 1993).

Kromě toho lze použít standardní techniky rekombinantní DNA pro změnu vazebné afinity rekombinantních protilátek s jejich antigeny tím že se změní zbytky aminokyselin v blízkosti vazebného místa pro antigen. Vazebná afinita pro antigen u humanizované protilátky se může zvýšit mutagenezí založenou na molekulovém modelování (Quenn et al., Proč. Nati. Acad. Sci. USA 86: 10029-33, 1989).

F. Vytváření analogů: Příprava změněných sekvencí DNA a peptidových sekvencí

Analogy APRÍL se mohou lišit od přirozeně se vyskytujícího ligandu v sekvenci aminokyselin, nebo jiným způsobem než aminokyselinovou sekvencí, nebo oběma způsoby. K jiným modifikacím než je modifikace sekvence patří jak in vitro, tak in vivo chemická derivatizace APRÍL. K těmto nesekvenčním modifikacím patří změny v acetylaci, metylaci, fostorylaci, karboxylaci nebo glykosylaci, přičemž tento výčet není limitující.

K výhodným analogům patří APRÍL nebo jeho biologicky aktivní fragmenty, jejichž sekvence se liší od sekvencí uvedené zde jako sekvence id. č. 2 jednou nebo několika konzervativními substitucemi, delecemi nebo inzercemi aminokyselin, které nenarušují biologickou aktivitu APRÍL. Ke konzervativním substitucím typicky patří substituce jedné aminokyseliny jinou aminokyselinou s podobnými vlastnostmi, např. substituce v rámci následujících skupin: valin glycin, glycin - alanin, valin - isoleucin - leucin, kyselina asparagová - kyselina glutamová, asparagin - glutamin, serin - threonin, lysin - arginin a fenylalanin - tyrosin.

Konzervativní záměny aminokyselin jsou přehledně uvedeny v následující tabulce 1.

Tabulka 1

Konzervativní záměny aminokyselin

Aminokyselinu	Kód	Lze nahradit jakoukoliv z následujících
Alanin	A	D-Ala, Gly, Beta-Ala, L-Cys, D-Cys
Arginin	R	D-Arg, Lys, D-Lys, homo-Arg, D-moho-Arg, Met, Ile, D-Met, D-Ile, Orn, D-Om
Asparagin	N	D-Asn, Asp, D-Asp, Glu, D-Glu, Gin, D-Gln
Kyselina asparagová	D	D-Asp, D-Asn, Asn, Glu, D-Glu, Gin, D-Gln
Cystein	C	D-Cys, S-Me-Cys, Met, D-Met, Thr, D-Thr
Glutamin	Q	D-Gln, Asn, D-Asn, Glu, D-Glu, Asp, D-Asp,
Kyselina glutamová	E	D-Glu, D-Asp, Asp, Asn, D-Asn, Gin, D-Gln
Glycin	G	Ala, D-Ala, Pro, D-Pro, -Ala, Asp
Isoleucin	I	D-Ile, Val, D-Val, Leu, D-Leu, Met, D-Met
Leucin	L	D-Leu, Val, D-Val, Leu, D-Leu, Met, D-Met
Lysin	K	D-Lysin, Arg, D-Arg, Homo-Arg, D-Homo-Arg, Met, D-Met, Ile, D-Ile, Orn, D-Orn
Methionin	M	D-Met, S-Met-Cys, Ile, D-Ile, Leu, D-Leu, Val, D-Val

- 12CZ 294615 B6

Tabulka 1 - pokračování

Aminokyselinu	Kód	Lze nahradit jakoukoliv z následujících
Fenylalanin	F	D-Phe, Tyr, D-Thr, L-Dopa, His, D-His Trp, D-Trp, Trans-3,4 nebo 5-fenylprolin, cis-3,4 nebo 5-fenylprolin
Prolin	P	D-Pro, L-l-thioazolidin-4-karboxylová kyselina, D- nebo L-1 -oxazolidin-4-karboxylová kyselina
Serin	S	D-Ser, Thr, D-Thr, allo-Thr, Met, D-met, Met(O), D-Met(O), L-Cys, D-Cys
Threonin	T	D-Thr, Ser, D-Ser, Allo-Thr, Met, D-met, Met(O), D-Met(O), Val, D-Val
Tyrosin	Y	D-Tyr, Phe, D-Phe, L-Dopa, His, D-His
Valin	v	D-Val, Leu, D-Leu, Ile, D-Ile, Met, D-Met

K užitečným metodám mutageneze patří mutageneze pomocí PCR a saturační mutageneze, které budou podrobněji popsány v následující části. Také je možné vytvořit knihovnu variant náhodných sekvencí aminokyselin pomocí syntézy sady degenerovaných oligonukleotidových sekvencí.

PCR mutageneze

Při mutagenezi pomocí PCR se využívá malá přesnost Taq polymerázy k zavedení náhodných mutací do klonovaného fragmentu DNA (Leung et al., Technique 1: 11—15, 1989). Je to velmi účinná a přitom velmi rychlá metoda pro vnesení náhodných mutací. Úsek DNA, který má být mutován, se aplifikuje pomocí polymerázové řetězové reakce (PCR) v podmínkách, které snižují přesnost Taq polymerázy, např. jestliže je poměr dGTP/dATP přibližně roven 5 a přidá se Mn- do reakční směsi pro PCR. Celá sada amplifikovaných fragmentů se pak klonuje do vhodných vektorů a vytvoří se tak knihovna náhodných mutant.

Saturační mutageneze

Saturační mutageneze dovoluje rychlé vnesení velkého počtu mutací typu substituce jedné báze do klonovaného fragmentu DNA (Mayers et al., Science 229:242, 1985). Tato technika zahrnuje vytvoření mutací, např. chemických ošetřením nebo ozářením jednořetězcové DNA in vitro, a pak syntézu komplementárního řetězce DNA. Frekvence mutací může být ovlivněna silou působícího účinku a v podstatě lze dosáhnout substituce všech možných bází. Jelikož celý tento proces nezahrnuje žádnou genetickou selekci mutovaných fragmentů, získají se tak fragmenty jak s neutrálními substitucemi, tak náhodně mutované fragmenty DNA, ze kterých se mohou připravit proteiny se změnou funkcí. Distribuce bodových mutací není přitom nijak směrovány na konzervativní sekvenční prvky.

Degenerované oligonukleotidy

Knihovnu homologů je možné připravit pomocí sady degenerovaných oligonukleotidů. Chemická syntéza degenerovaných sekvencí se může provést na zařízení pro automatickou syntézu DNA, a syntetické geny se pak vloží ligují) do vhodného expresního vektoru. Syntéza degenerovaných oligonukleotidů je způsobem v oboru dobře známý^(xxx) a tento způsob byl již využit pro cílený vývoj jiných proteinů^(XXXI).

Způsoby cílené neboli nenáhodné mutageneze se mohou využít pro přípravu specifických sekvencí nebo mutací v určitých specifických úsecích. Tyto způsoby se mohou využít pro vytvoření variant, které obsahují delece, inzerce nebo substituce aminokyselinových zbytků ve známé aminokyselinové sekvenci proteinu. Místa mutací se mohou modifikovat individuálně nebo v sériích např. tak, že se 1) nejdříve substituují konzervativní aminokyseliny a pak se provádějí radikálnější změny v závislosti na získaných výsledcích 2) deletují se (odstraní) cílové

-13 CZ 294615 B6 zbytky a 3) inzerují se (vloží) zbytky stejné nebo jiné třídy do sousedství příslušného místa, nebo se kombinují všechny uvedené způsoby 1 až 3.

Mutageneze nahrazováním alaninem

Mutageneze nahrazováním alaninem („alanin scanning“) je metoda vhodná pro identifikaci určitých zbytků nebo úseků požadovaných proteinů, která jsou výhodnými místy nebo doménami pro mutagenezi (Cunningham and Wells, Science 244: 1081-1085, 1989). Při této metodě se identifikují zbytky, nebo skupiny zbytků (např. nabité aminokyselinové zbytky jako Arg, Asp, His, Lys a Glu) a nahradí se neutrální nebo negativní aminokyselinou (nejvýhodněji alaninem nebo polyalaninem). Tyto náhrady aminokyselin mohou ovlivnit interakci aminokyselin s okolním vodným prostředím uvnitř nebo vně buňky. Domény, u kterých se projeví funkční citlivost na substituce, se mohou dále zpřesňovat vnášením dalších změn nebo změnami již substituovaných míst. Takže zatímco místo pro vložení variace aminokyselinové sekvence je předem určeno, povaha mutace sama o sobě předem určena není. Tak např. pro optimalizaci účinnosti mutace v určitém místě je možné provést nahrazovací mutagenezi alaninem nebo náhodnou mutagenezi na cílovém kodonu nebo úseku a exprimovat varianty podjednotek požadovaného proteinu, a ty pak testovat na optimální kombinaci a požadovanou aktivitu.

Mutageneze zprostředkovává oligonukleotidy

Mutageneze zprostředkovaná oligonukleotidy je metoda vhodná pro přípravu substitučních, delečních a inzerčních variant DNA (viz např. Adelman et al., DNA 2: 183, 1983). Požadovaná DNA může být změněna tím, že hybridizuje s oligonukleotidem, který obsahuje mutaci DNA templátu, kde templátem je jednořetězcová forma plazmidu nebo bakteriofágu obsahující nezměněnou nebo nativní sekvenci DNA pro požadovaný protein. Po hybridizace se použije DNA polymeráza pro syntézu celého komplementárního řetězce, takže templát pak obsahuje vložený oligonukleotidový primer a tudíž kóduje vybrané změny v DNA pro daný protein. Obecně se užívají oligonukleotidy velikosti nejméně 25 nukleotidů. Optimální oligonukleotid obsahuje 12 až 15 nukleotidů, které jsou plně komplementární k templátu na obou stranách od nukleotidu (případně nukleotidů) kódujícího mutaci. To zajistí, že oligonukleotid bude správně hybridizovat s jednořetězcovou templátovou DNA. Oligonukleotidy lze snadno syntetizovat způsob známými v oboru (např. Crea et al., Proč. Nati. Acad. Sci. USA 75:5765, 1978).

Kazetová mutageneze

Dalším způsobem, jak připravit varianty, je kazetová mutageneze, která je založená na technice, kterou popsali Wells et al. (Gene 34: 315, 1985). Výchozím materiálem je plazmid (nebo jiný vektor), který obsahuje DNA pro proteinovou podjednotku, která má být mutována. Nejdříve je třeba identifikovat kodon (popřípadě kodony), které mají být v proteinové podjednotce mutovány. Je třeba, aby na každé straně od mutovaného místa bylo jedinečné místo pro restrikční endonukleázu. Pokud takové restrikční místo neexistuje, je třeba ho v požadované lokalizaci vytvořit pomocí výše popsané mutageneze zprostředkované oligonukleotidem. Poté, co do plazmidu byly vložena restrikční místa, plazmid se v těchto místech naštěpí, a tedy linearizuje. Pak se standardním způsobem syntetizuje dvouřetězcový oligonukleotid, který kóduje sekvenci DNA mezi dvěma restrikčními místy a obsahuje požadovanou mutaci. Každý oligonukleotidový řetězec je syntetizován samostatně a pak spolu hybridizují zase standardním způsobem v oboru známým. Tento dvouřetězcový oligonukleotid je nazýván kazetou. Kazeta je přitom navržena tak, aby obsahovala 3'-konec a 5'-konec kompatibilní s konci linearizovaného plazmidu, takže může být přímo do plazmidu ligována. Plazmid pak obsahuje mutovanou sekvenci DNA požadovaného proteinu.

-14CZ 294615 B6

Kombinační mutageneze

Pro vytvoření mutací je také možné použít kombinační mutagenezi. Např. aminokyselinové sekvence skupiny homologních nebo jinak příbuzných proteinových sekvencí se uspořádají tak, aby bylo dosaženo maximální homologie. Všechny sekvence, které se objeví v dané pozici u všech uspořádaných sekvencí se vyberou a vytvoří se z nich degenerovaná sada kombinačních sekvencí. Kombinační mutagenezi se vytvoří velmi různorodá knihovna variant na úrovni nukleových kyselin. Tak např. směs syntetických oligonukleotidů se enzymaticky liguje do genových sekvencí tak, že generovaná sada potenciálních sekvencí je exprimovatelná jako individuální peptidy, nebo alternativně, jako sada delších fúzních proteinů obsahujících sadu degenerovaných sekvencí.

Různé techniky jsou v oboru známé pro screening vytvářených mutovaných genů. Techniky pro screening velkých genových knihoven často zahrnují klonování knihovny do replikovatelných expresních vektorů, transformování vhodných buněk výslednou knihovnou vektorů, a expresi genů v podmínkách, kde detekce požadované aktivity, tj. v tom případě vazbu na APRÍL nebo jeho receptor, umožňuje relativně snadnou izolaci vektoru kódujícího gen, jehož produkt byl detekován. Každá z technik popisovaných v následujících odstavcích je vhodná k vysoce účinnému a vysokokapacitnímu testování velkého počtu sekvencí vytvářených např. technikami náhodné mutageneze.

Vynález dále poskytuje možnost připravit mimetika pro redukci proteinových vazebných domén polypeptidu APRÍL nebo jeho receptoru, např. peptidová činidla nebo činidla jiné povahy než peptidy. Peptidová mimetika jsou schopna narušit vazbu APRÍL a jeho receptoru. Kritické zbytky APRÍL účastnící se procesu molekulového rozpoznávání receptorového polypeptidu nebo příslušného následného intracelulárního proteinu v signální dráze, mohou být určeny a použity pro přípravu peptidových mimetik APRÍL nebo jeho receptoru, která kompetitivně nebo nekompetitivně inhibují vazbu APRÍL a jeho receptoru (viz např. „Peptide inhibitors of human papilloma virus protein binding to retinoblastoma gene protein“, patentové přihlášky EP 412 762 A a EP 831 080 A, které jsou zahrnuty formou odkazu).

Tím, že předkládaný vynález poskytuje purifíkovaný a rekombinantní APRÍL, poskytuje také metodu testování, kterou je možné užít pro testování kandidátů léčiv, která jsou funkčně buďto agonisty, nebo antagonisty normální buněčné funkce APRÍL nebo jeho receptoru. V jednom provedení předkládaného vynálezu se pomocí takového testu hodnotí schopnost sloučeniny modulovat vazbu mezi APRÍL a jeho receptorem. Odborníkovi je zřejmé, že je možné vytvářet různé varianty testů podle předkládaného vynálezu.

V mnoha programech pro screening léků, které se užívají k testování celé knihovny sloučenin nebo přírodních extraktů, jsou požadovány metody s velkou účinností a kapacitou zpracovaných vzorků, aby bylo možné maximalizovat počet sloučenin otextovaných za jednotku času. Testy, které se provádějí na bezbuněčném systému, jako jsou např. purifikované nebo semipurifíkované proteiny, jsou však výhodné jako testy pro tzv. primární screening, který dovoluje rychlý vývoj těchto sloučenin, neboť umožňuje relativně snadnou detekci změn molekulového cíle, ke které dochází působením testované sloučeniny. Avšak toxické působení na buňky a/nebo biologická dostupnost testované sloučeniny mohou zůstat v takovém in vitro systému bez povšimnutí, neboť test je primárně zaměřen na působení léčiva na molekulový cíl, kde se projevuje změnou vazebné afinity k jiným proteinům nebo změnami enzymatických vlastností molekulového cíle.

Izolace receptorů vázajících APRÍL

Pro identifikaci a klonování receptorů je možné použít ligandy rodiny TNF. Pomocí popsaných sekvencí APRÍL je možné fúzovat 5'-konec extracelulární domény, který tvoří vazebnou sekvenci pro receptor, kmarkerové nebo značkovací sekvenci a pak přidat vedou sekvenci, která podpoří sekreci ligandu v některém z mnoha možných expresních systémů. Jeden příklad

-15 CZ 294615 B6 takového postupu popsali Browning et al (JBC 271: 8618-8626, 1996), kdy ligand LT-β byl sekretován v takové formě. Vedoucí sekvence VCAM byla připojena ke krátké značkovací sekvenci peptidu myc s extracelulární doménou TL-β. Sekvence VCAM byla použita proto, aby nepomohla sekreci molekuly LT-β, která je normálně vázána na membránu. Sekretovaný protein si ponechává značku myc na svém N-konci, která nijak nesnižuje schopnost vázat se na receptor. Takový sekretovaný protein se může exprimovat buďto v přechodně transfekovaných buňkách COS, nebo v podobném systému, např. vektorech odvozených od EBNA, systému hmyzí buňky a bakuloviru nebo Pichia sp. apod. Jako zdroj označeného ligandu se může využít nepurifíkovaný buněčný supernatant.

Buňky exprimující receptor je možné identifikovat tak, že se exponují označenému ligandu. Buňky s navázaným ligandem se pak identifikují pomocí průtokové cytometrie FACS, když se myc označí protilátkou proti peptidu myc (anti-myc, 9410) a pak fykoerytrinem (nebo obdobnou značkou) označeným anti-myším imunoglobulinem. Buňky pozitivní ve FACS se snadno identifikují a slouží pak jako zdroj RNA kódující receptor. Z této RNA pak může být připraven standardním postupem expresní knihovna a rozdělena do podskupin („pools“). Tyto podskupiny klonů se pak transfekují do vhodných hostitelských buněk a vazba označeného ligandu na transfekované buňky s receptorem se identifikuje pomocí mikroskopického vyšetření poté, co se nazývaný myc peptid označí anti-myším imunoglobulinem označeným enzymem, např. galaktosidázou, alkalickou fosfatázou nebo luciferázou. Jakmile se jednou identifikuje pozitivní podskupina klonů, zmenšuje se pak velikost podskupin dokud není identifikována cDNA kódující receptor. Celá tato procedura může být provedena buďto s myším, nebo lidským APRÍL, přičemž jedna z nich povede snadněji k receptoru.

G. Farmaceutické přípravky k léčení nemocí souvisejících s APRÍL

Farmaceutické přípravky podle předkládaného vynálezu se mohou užít k léčení rakovinných onemocnění tak, že se pacientovi, výhodně savci jako je pes, kočka nebo člověk, podává účinné množství přípravku podle vynálezu, který obsahuje blokující činidlo schopné narušit vazbu mezi APRÍL a jeho receptorem. V takových blokujících činidlům patří rozpustný APRÍL, protilátky anti-APRIL, protilátky anti-receptor APRÍL nebo jejich biologicky aktivní fragmenty, přičemž tento výčet není omezující. Kromě toho inhibující forma APRÍL může být připravena mutací APRÍL, při které se uchová schopnost blokovat spojení mezi APRÍL a jeho receptorem. Blokující činidla výhodně obsahují fúzní protein receptoru slg, který může být zkonstruován způsoby odborníkovi známými.

Přípravky podle předkládaného vynálezu jsou užitečné k léčení všech rakovinných onemocnění, jako je (přičemž tento výčet není omezující) např. rakovina renálních buněk, Kaposiho sarkom, chronické leukemie, rakovina prsu, sarkom, karcinom vaječníku, rakovina konečníku, rakovina krku, mastocytom, rakovina plic, adenokarcinom prsu, karcinom dlaždicových buněk hltanu a rakoviny zažívacího traktu nebo žaludku. Kromě toho jsou tato blokující činidla užitečná k léčení proliferativních nemocí, které se neřadí k nádorům, tj. buněčných hyperproliferací (hyperplazií), jako je např. skleroderma, vytváření ložisek při revmatoidní artritidě, jizvení po chirurgickém zákroku a fíbróza plic, jater a dělohy.

Farmaceutické přípravky podle předkládaného vynálezu obsahují terapeuticky účinné množství APRÍL nebo jeho receptoru, nebo jejich fragmentů nebo mimetik, a případně obsahují farmaceuticky přijatelné nosiče a pomocné látky.

Vynález se tudíž také týká léčení rakoviny a způsobů stimulace, nebo v určitých případech naopak inhibice, imunitního systému, nebo jeho částí, které spočívají v podávání farmaceuticky účinného množství sloučeniny podle předkládaného vynálezu nebo jejích farmaceuticky přijatelných solí nebo derivátů. Přitom odborníkovu je zřejmé, že sloučeniny a způsoby podle vynálezu se mohou kombinovat s řadou dalších terapií.

-16CZ 294615 B6

Přípravky podle předkládaného vynálezu mohou být formulovány pro různé způsoby podávání, včetně systémového, topického nebo lokálního podávání. Pro systémové podávání je výhodné podávání injekční, včetně intramuskulární, intravenózní, intraperitoneální a subkutánní injekce, přičemž přípravek podle předkládaného vynálezu může být formulován jako vodný roztok, výhodně ve fyziologicky kompatibilním pufru jako je např. Hankův nebo Ringerův roztok. Kromě toho přípravek podle předkládaného vynálezu může být formulován v pevné formě pro přípravné rozpuštění nebo resuspendování bezprostředně před použitím. Předkládaný vynález se také týká lyofílizovaných forem přípravku.

Přípravek podle předkládaného vynálezu se může podávat také perorálním, transmukosálním nebo transdermálním způsobem. V přípravku pro transmukosální nebo transdermální podávání se použije vhodné látky usnadňující penetraci (penetranty) vzhlede k bariéře, kterou je nutno překonat. Takové penetranty jsou v oboru známy a patří k nim např. pro transmukosální podávání soli žlučové kyseliny, deriváty kyseliny fusidové a detergenty. Transmukosální podávání lze provádět buď nosní aerodisperzí (sprejem), nebo pomocí čípků. Pro perorální podávání je přípravek formulován v obvyklé lékové formě vhodné pro perorální podávání jako jsou kapsle, tablety a tonika. Pro topické podávání může být přípravek ve formě mastí, mazání, gelů nebo krémů, jak je v oboru všeobecně známo.

Dávky a dávkovači režim jsou závislé na typu rakoviny a na pacientovi a jeho anamnéze. Podávané množství musí být účinné k léčení, potlačení nebo změně progrese rakoviny. Může se jednat o jednotlivé nebo opakované dávky. Pokud se užijí opakované dávky, což je výhodné, frekvence podávání závisí např. na typu pacienta a typu nemoci, velikosti dávek atd. Pro některé druhy rakoviny je účinné denní podávání, pro jiné druhy je účinné podávání obden nebo jednou za tři dny. Množství aktivní látky podané buď v jedné dávce, nebo v průběhu léčení je závislé na mnoha různých faktorech. Tak např. na věku a velikosti subjektu, závažnosti a průběhu onemocnění, které se léčí, způsobu a formě podávání a samozřejmě na úsudku ošetřujícího lékaře. Avšak účinná dávka je v rozmezí 0,005 až 5 mg/kg/den, výhodně 0,05 až 0,5 mg/kg/den. Odborník sám posoudí, kdy mohou být prospěšné nižší či vyšší dávky.

Genové konstrukty podle předkládaného vynálezu se mohou použít také jako součást protokolu genové terapie pro přenos nukleových kyselin kódujících buďto agonistické, nebo antagonistické formy polypeptidu APRÍL.

Expresní konstrukty APRÍL se mohou podávat prostřednictvím jakéhokoliv biologicky účinného nosiče, např. jakéhokoliv farmaceutického přípravku schopného účinně převést in vitro gen pro apríl do buňky. Tento přístup znamená vložit gen do virového vektoru, který může přímo transfekovat buňku, nebo podat plazmovou DNA, pomocí např. lipozom, nebo nějakého vnitrobuněčného nosiče, anebo se může jednat o přímou injekci genového konstruktu. Výhodnou metodou je přenos pomocí virového vektoru.

Farmaceutický přípravek s genovým konstruktem pro genovou terapii se skládá v podstatě ze systému pro přenos genů a vhodného ředidla, nebo se může jednat o matrix umožňující pomalé uvolňování, do které je systém přenášející gen zapuštěn. Alternativně, pokud celý systém pro přenos genů může být připraven intaktní z rekombinantních buněk, např. jako retrovirový vektor, farmaceutický přípravek pak obsahuje jednu nebo několik buněk, které produkují systém pro přenos genů.

Kromě použití pro terapii se oligomery podle předkládaného vynálezu mohou použít jako diagnostické reagencie pro detekci přítomnosti či absence cílové DNA, RNA nebo sekvencí aminokyselin, ke kterým se specificky váží. Jiným aspektem předkládaného vynálezu je použití pro hodnocení chemické sloučeniny z hlediska její schopnosti reagovat, tj. např. vázat se či jinak fyzikálně asociovat, s polypeptidem APRÍL nebo jeho fragmenty. Způsob obsahuje kontaktování chemické látky s APRÍL a hodnocení schopnosti látky reagovat s APRÍL. Kromě toho APRÍL podle předkládaného vynálezu se může použít v metodách pro hodnocení přirozeně se vyskytuj í

- 17CZ 294615 B6 cích ligandů nebo receptorů APRÍL, a také pro hodnocení chemických látek, které se asociují nebo váží s receptory APRÍL. Někdy je třeba užít označenou verzi APRÍL pro usnadnění detekce vazby APRÍL na jeho receptor nebo buněk pozitivních na receptor, např. při screeningu činidel, která blokují interakci mezi APRÍL a jeho receptorem. Kromě toho lze užít buněčné linie transfekované APRÍL, které mají zvýšenou rychlost růstu, jako základ pro testy k vyhledávání molekul, které blokují aktivitu APRÍL.

Jiný aspekt předkládaného vynálezu poskytuje způsob hodnocení chemické látky z hlediska její schopnosti modulovat interakci mezi APRÍL a jeho receptorem. Tento způsob obsahuje smíchání APRÍL a receptoru APRÍL v podmínkách, kde taková dvojice je schopna interakce, pak přidat chemickou látku, která se testuje, a detekovat vytvoření a nebo naopak rozpad komplexu. Taková modulující činidla se mohou dále hodnotit testy in vitro např. testování jejich aktivity v bezbuněčném systému, případně ošetřením buněk těmito činidly nebo podáváním těchto činidel zvířatům a následným hodnocením účinků.

Příklady provedení vynálezu

Příklad 1

Analýza APRÍL northernovým přenosem („northem blot“) ukázala, že exprese APRÍL byla velmi slabá a omezená jen na několik tkání (obr. 2A). Dva transkripty velikosti 2,1 kb a 2,4 kb byly nalezena v prostatě, zatímco vPBL byl nalezen kratší transkript velikosti 1,8 kb. Analýza northernovým přenosem byla provedena pomocí komerčně dostupných membrán s přenesenou RNA z lidských tkání „Human Multiple Tissue Northem Blots I, II“ (Clontech katalog, č. 7760-1 a 7759-1), „Human Cancer cell Line MTN Blot V“ (Invitrogen, katalog, č. D 3500-01). membrány byl hybridizovány v hybridizačním roztoku „ExpressHyb“ (Clontech, katalog, č. 8015-1) nejméně 1 hodinu při 62 °C. Sondy cDNA značené pomocí náhodných primerů (Boehringe Mannheim) byly syntetizovány pomocí cDNA odpovídající extracelulámí doméně APRÍL jakož templátu. Teplotně denaturovaná sonda cDNA byla přidána v 1,5 x 10⁶ cpm/ml do čerstvého roztoku ExpressHyb. Membrána byla hybridizována 12 až 24 hodin v 62 °C, třikrát opláchnuta ve 2 x SSC s 0,05 % SDS a pak exponována v -70 °C. Analýza APRÍL northernovým přenosem ukázala, že exprese APRÍL byla velmi slabá a omezená jen na několik tkání (obr. 2A). Dva transkripty velikosti 2,1 kb a 2,4 kb byly nalezeny v prostatě, zatímco v PBL byla nalezen kratší transkript velikosti 1,8 kb.

Při delším expozičním času byla objevena APRÍL mRNA velikosti 2,1 kb v tlustém, střevu, slezině a pankreatu (data neuvedena). Tato omezená distribuce APRÍL mRNA je ve shodě s původem klonů cDNA v současnosti dostupných v databázi EST klonů. Ze 23 klonů pouze dva pocházely z normálních tkání (pregnantní děloha, pankreatické ostrůvky). Je nápadné, že zbytek EST-klonů (21 klonů, 91 %) byl přítomen v knihovnách cDNA vytvořených z nádorů nebo linií nádorových buněk (nádor vaječníku, 11, nádor prostaty, 3, Gessler-Wilmsův tumor, 1, karcinom tlustého střeva, 1, tumor endometria, 1, nádor příštitné žlázy, 1, nádor pankreatu, 1, T-buněčný lymfom, 1, buněčná linie pocházející z adenokarcinomu LNCAP, 1). To bylo příčinou dalších testů transformovaných linií na expresi APRÍL mRNA (obr. 2A), a skutečně bylo zjištěno, že všechny buněčné linie silně exprimovaly transkript APRÍL velikosti 2,1 kb.

Nejvyšší signály specifické pro APRÍL byly detekovány v kolorektálním adenokarcinomu SW480, v Burkittově lymfomu Ráji a melanomu G361. Pro potvrzení těchto zjištění byla porovnána s normálními tkáněmi. APRÍL mRNA byla ve velkém množství detekována u karcinomu štítné žlázy a lymfomu, zatímco v odpovídající normální tkání byl nalezen pouze slabý hybridizační signál (obr. 2C). Ve dvou dalších nádorech analyzovaných norhernovým přenosem (nádor nadledvinky a příštitné žlázy) nebyla hladina APRÍL mRNA zvýšena. Avšak pomocí

-18 CZ 294615 B6 hybridizace in šitu byla zjištěna hojnost APRÍL mRNA v lidském adenokarcinomu tlustého střeva ve srovnání s normální tkání tlustého střeva (obr. 2D).

K prozkoumání možných aktivit APRI1 byla exprimována rekombinantní forma rozpustné extracelulární domény APRÍL (sAPRIL) obsahující aminokyseliny 110 až 256 v buňkách 293. Gen APRÍL plné délky byl aplifikován z klonu EST pomocí specifického přímého 5'-koncového oligonukleotidového primeru s místem EcoRI (5'-CCAGCCTCATCTCCTTTCTTGC-3') a specifického 3'-koncového primeru s místem Xbal (5-TCACAGTTTCACAAACCCCAGG3'). Amplifikovaný fragment byl štěpen EcoRI/Xbal a klonován do modifikované verze pCRIII (Invitrogen) v souladu s rámcem N-koncového peptidu FLAG^(I5). Rozpustná forma APRÍL (sAPRIL) byla připravena pomocí dvou primerů 5-AAACAGAAGAAGCAGCACTCTG3' a5-TCACAGTTTCACAAACCCCAGG-3' obsahujících místa Pstl a Xbal a pak klonována do modifikovaného vektoru pCRIII obsahujícího jak signál HA pro sekretování proteinu v eukaryotických buňkách, tak N-koncový epitop FLAG⁽¹⁵⁾.

Příklad 2

Značně rozšířená exprese APRÍL v nádorových buňkách a tkáních vedla k domněnce, že APRÍL nějak souvisí s růstem nádorů a proto byly různé linie nádorových buněk inkubovány s purifikovaným rekombinantním sAPRIL značeným FLAG⁽¹⁰⁾.

Buněčné linie lidských embryonálních T buněk 293, buňky lidské T-leukemie Jurkat a buňky lidského Burkittova lymfomu B-buněk Ráji a melanomová buněčná linie byly kultivovány jak bylo dříve popsáno^{(16, 17)}. Ostatní buněčné linie zmiňované v tomto popisu jsou deponovány v Americké sbírce mikroorganismů (ATCC, Rockville, Marylland). Všechny buněčné linie byly kultivovány v médiu RPMI nebo DMEM doplněném 10% telecím fetálním sérem.

Pomocí Flag označené verze extracelulární domény (zbytky 103 až 281) lidského FasL a TRAIL (zbytky 95 až 281) byly nedávno popsány⁽¹⁸\ Rozpustný lidský TWEAK (zbytky 141 až 284) značený Flag byl připraven v buňkách 293 (viz připravovaný rukopis). Protilátka anti-Flag M2 byla získána od firmy Kodak International Biotechnologies. Bylo pozorováno na dávce závislé zvýšení proliferace T-lymfomových buněk Jurkat v přítomnosti APRÍL, detekované zvýšením počtu (přibližně o 50%) (11) životaschopných buněk 24 hodin po přidání ligandu (obr. 3A). Proliferace buněk byla stanovena inkubováním buněk v počtu 50 000 buněk na jamku ve 100 μΐ média s uvedenou koncentrací rekombinantního APRÍL, TWEAK, TRAIL a FasL a pak stanovením počtu životaschopných buněk po 24 hodinách pomocí proliferačního testu Cellititer 96 AQ (Promega) dle návodu výrobce soustavy nebo pomocí inkorporace ³H-thymidinu. Pro imunodeplaci Flag-APRIL byla použita anti-Flag navázaná na agarózu.

Zvýšení proliferace bylo nezávislé na kostimulačních signálech jako jsou např. protilátky antiCD3 nebo jiné cytokiny. Podle očekávání přidání shodně připraveného a purifíkovaného FasL k buňkám Jurkat snížilo počet životaschopných buněk, zatímco TWEAK neměl žádný účinek. Zvýšený počet buněk koreloval se zvýšenou (40%) inkorporací 3H-thymidinu u buněk ošetřených APRÍL (obr. 3A). Imunodeplece v médiu obsahujícím APRÍL značený pomocí FLAG způsobená protilátkami anti-FLAG, ale nikoliv protilátkami anti-myc, redukovala proliferativní účinek (obr. 3B), což ukazuje, že proliferativního účinku bylo dosaženo specificky díky APRÍL. Zvýšená rychlost proliferace byla také pozorována u některých B-lymfomů (lidský RÁJI, myší buňky A20, ale nikoliv lidský BJAB) a buněčných linií epiteliálního původu jako jsou buňky COS a HeLa a také melanomů (obr. 3C). Buňky karcinomu prsu MCF-7 neodpovídaly. Účinek na buňky Jurkat byl dokonce ještě výraznější, když bylo telecí fetální sérum sníženo z 10 % na 1 % (obr. 3D).

-19CZ 294615 B6

Rekombinantní sAPRIL vytvářel agregáty, což by mohlo vysvětlit značně vysoké koncentrace potřebné pro detekci proliferačního účinku sAPRIL. Buňky NIH-3T3 byly transfekovány lidským APRÍL plné délky (12) a bylo tak získáno několik klonů exprimujících APRÍL (obr. 4A). Klony NIH-3T3 APRÍL byly připraven transfekcí expresního vektoru pCRIII obsahujícího APRÍL plné délky značený FLAG pomocí kalciumfosfátové metody. Buněčné proteiny odpovídající přibližně 2 x 10⁶ buněk v každé dráze byly elektroforeticky separovány na 12% polyakrylamidového gelu v přítomnosti SDS za redukujících podmínek a poté přeneseny na nitrocelulózovou membránu. Imunopřenosová analýza („imunoblot“) APRÍL značeného FLAG byla provedena použitím 5 pg/ml potkaní monoklonální protilátky anti-FLAG M2 (Kodak International Biotechnologies). První protilátky byly detekovány pomocí afínitně purifíkované oslí anti-myší protilátky konjugované s peroxidázou (Dianova, Hamburg, Německo), následovanou chemiluminiscenční reakcí s využitím systému ECL (Amersham).

Je zajímavé, že transfektanty APRÍL jevily rychlejší proliferaci než kontrolní transfektanty (obr. 4B). Důvodem je zřejmě to, že buňky NIH-3T3 transfekované APRÍL by mohly mít růstovou výhodu in vivo. Pokud byly buňky divokého typu nebo kontrolní transfektanty NIH3T3 injikovány nahým myším, hmatatelné nádory byly pozorovány po 5 až 6 týdnech (13). Naproti tomu, 2 klony buněk NIH-3T3 trvale transfekovaných APRÍL indukovaly nádory po 3 až 4 týdnech. Po 6 týdnech musely být myši utraceny vzhledem k přílišnému rozsahu onemocnění (obr. 4C). NIH-3T3 fíbroblasty (ATCC, Rockville, Marylland, USA) a různé transfektanty (1 x 10⁵ buněk) byly resuspendovány v 50 μΙ PBS a injikovány subkutánně do boku nahých myší BALB/C (Harlan, Ziest, Nizozemí). Velikost nádoru byla měřena každý třetí den. Byly vybrány myši stejného stáří (3 zvířata v každé skupině).

Příklad 3

Izolace receptoru vázajícího APRÍL

Pro identifikaci a klonování receptorů byly použity ligandy rodiny INF. Pomocí popsaných sekvencí APRÍL je možné fúzovat 5'-konec extracelulámí domény, který tvoří vazebnou sekvenci pro receptor, k markerové nebo značkovací sekvenci a pak přidat vedoucí sekvenci, která podpoří sekreci ligandu v některém z mnoha možných expresních systémů. Jeden příklad takového postupu popsali Browning et al. (JBC 271: 8618-8626, 1996), kdy ligand LT-β byl sekretován v takové formě. Vedoucí sekvence VCAM byla připojena ke krátké značkovací sekvenci peptidu myc s extracelulámí doménou LT-β. Sekvence VCAM byla použita proto, aby napomohla sekreci molekuly LT-β, která je normálně vázána na membránu. Sekretovaný protein si ponechává značku myc na svém N-konci, která nijak nesnižuje schopnost vázat se na receptor. Takový sekretovaný protein se může exprimovat buďto v přechodně transfekovaných buňkách COS, nebo v podobném systému, např. vektorech odvozených od EBNA, systému hmyzí buňky a bauloviru nebo Pichia sp. apod. Jako zdroj označeného ligandu se může využít nepurifikovaný buněčný supernatant.

Buňky exprimující receptor je možné identifikovat tak, že se exponují označenému ligandu. Buňky s navázaným ligandem se pak identifikují pomocí průtokové cytometrie FACS, když se myc označí protilátkou proti peptidu myc (anti-myc, 9E10) a pak fykoerytrinem (nebo obdobnou značkou) značeným anti-myším imunoglobulinem. Buňky pozitivní ve FACS se snadno identifikují a slouží pak jako zdroj RNA kódující receptor. Z této RNA pak může být připravena standardním postupem expresní knihovna a rozdělena do podskupin („pools“). Tyto podskupiny klonů se pak transfekují do vhodných hostitelských buněk a vazba označeného ligandu na transfekované buňky s receptorem se identifikuje pomocí mikroskopického vyšetření poté, co se navázaný myc peptid označí anti-myším imunoglobulinem označeným enzymem, např. galaktosidázou, alkalickou fosfatázou nebo luciferázou. Jakmile se jednou identifikuje pozitivní podskupina klon, zmenšuje se pak velikost podskupin dokud není identifikována cDNA kódující

-20CZ 294615 B6 receptor. Celá tato procedura může být provedena buďto s myším, nebo lidským APRÍL, přičemž jedna z nich povede snadněji k receptorů.

Odborníkovi je zřejmé, že je možné provést různé modifikace přípravků APRÍL podle předklá5 daného vynálezu v rámci vynálezu myšlenky vynálezu. Předkládaný vynález proto zahrnuje i takové modifikace a variace, pokud spadají do předmětu vynálezu vymezeného následujícími nároku, nebo pokud jde o ekvivalentní řešení.

SEZNAM SEKVENCÍ

Sekvence id.č.1

GGTACGAGGC TTCCTAG AGG G ACTGGAACC TAATTCTCCT GAGGCTGAGG

GAGGGTGGAG GGTCŤCAAGG CAACGCTGGC CCCACGAČGG AGTGCCAGGA

101 GCACTAACAG TACCCTTAGC TTGCTTTCCT CCTCCCTCCT ΤΠΤΑΤΠΤϋ

151 AAGTTCCTTT TTATTTCTCC TTGCGTAACA ACCTTCTTCC CTTCTGCACC

201 actgcccgta cccttacccg ccccgccacc tccttgctac CCCACTCTTG 251 AAACCACAGC TGTTGGCAGG GTCCCCAGCT CATGČCAGCC TCATCTCCTT 301 TCTTGCTAGC CCCCAAAGGG CCTCCAGGCA ACATGGGGGG CCCAGTCAGA 351 GAGCCGGCAC TCTCA GTTGC CCTCTGGTTG AGTTGGGGGG CAGCTCTGGG. 401 GGCCGTGGCT TGTGCCATGG CTCTGCTGAC CCAAČAAACA GAGCTGCAGA 451 GCCTCAGGAG AGAGGTGAGC CGGCTGCAGG GGACAGGAGG CCCTCCCAG 501 AATGGGGAAG GGTATCCCTG GCAGAGTCTC CCGGAGCAGA GTTCCGATGC 551 CCTGGAAGCC TGGGAGAATG GGGAGAGATC CCGGAAAAGG GAGCAGTGC 601 TCACCCAAAA ACAGAAGAAG CAGCACTCTG TCCTGCACCT GGTTCCCATT 651 AACGCCACCT CCAAGGATGA CTCCGATGTG ACAGAGGTGA TGTGGCAACC 701 AGCTCTTAGG CGTGGGAGAG GCCTACAGGC CCAAGGATAT GGTGTCCGAA 751 TCCAGGATGC TGGAGTTTAT CTGCTGTATA GCCAGGTCCT GTTTCAAGAC 801 GTGACTTTCA CCATGGGTCA GGTGGTGTCT CGAGAAGGCC AAGGAAGGCA 851 GGAGACTCTA TTCCGATGTA TAAGAAGTAT GCCCTCCCAC CCGGACCGGG 901 CCTACAACAG CTGCTATAGC GCAGGTGTCT TCCATTTACA CCAAGGGGAT 95) ATTCTGAGTG TCATAATTCC CCGGGCAAGG GCGAAACTTA ACCTCTCTCC 1001 ACATGGÁACC TTCCTGGGGT TTGTGAAACT GTGATTGTGT TATAAAAAGT 1051 GGCTCCC AGC TTGGAAG ACC AGGGTGGGTA CATACTGG AG ACAGCCAAG A 1101 GCTGAGTATA TAAAGGáGAG GGAATGTGCA GGAACAGAGGCATCTTCCTG 1151 GGTTTGGCTC CCCGTTCCTC ACTTTTCCCT TTTCATTCCC ACCCCCTAGA 1201 CTTTGATTTT ACGGATATCT TGCTTCTGTT CCCCATGGAG CTCCG AATTC 1251 TTGCGTGTGT GTAGATGAGG GGCGGGGGAC GGGCGCCAGG CATTGTTCAG 1301 ACCTGGTCGG GGCCCACTGG AAGCATCCAG AACAGCACCA CCATCTTA

Sekvence id.č.2

MPASSPFLLA PKGPPGNMGG PVREPALSVA LWLSWGAALG AVACAMALLT

QQTELQSLRR EVSRLQGTGG PSQNGEGYPW QSLPEQSSDA LEAWENCERS

101 .RKRRAVLTQK QKKQHSVLHL VPJNATSKDD SDVTEVMWQP ALRRGRGLQA

151 QGYG VRJQDA G VYLL YSQVL FQD VTFTMGQ VVSREGQGRQ ETLFRC1RSM

201 PSHPDRAYNS CYSAGVFHLH QGDILSVIIP RARAKLNLSP HGTFLGFVKL

-21 CZ 294615 B6

Sekvence id. č.3

GAATTCGGCA CGAGGCTCCA GGCCACATGG GGGGCTCAGT CAGAGAGČCA

51	GCCCTTTCGG	TTGCTCTTTG
101	GACTTGTGCT	GTCGCACTAC
151	GGCGGGAGGT	GAGCCGGCTG
201	GGAGAGCGCC	CATGGCAGAG
251	AGCCTGGAAG	GATGGGGCGA
201	AGAAGCACAA	GAAGAAGCAC
351	ACCTCCAAGG	ACTCTGACGT
401	GCGTGGGAGA	GGCCCTGGAG
451	ACTGGAATTT	ATCTGCTCTA
501	CACAATGGGT	CAGGTGG7AT
551	TATTCCGATG	TATCAGAAGT
601	AGCTGCTACA	GTGCAGGTGT
651	TGTCAAAATT	CCACGGGCAA
701	CATTCCTGGG	GTTTGTGAAA
751	CCCATTCCAA	AAACTGGCTA
801	TCTCCATGGC	TTTGCCTTGA
651	CCACTA7CTG	GGCTTTGAČT
901	TGTTxATCTC	CCAAAAA

GTTGAGTTGG GGGGCAGTTC TGGGGGCTGT TGATCCAACA GACAGAGCTG CAAAGCCTAA CAGCGGAGTG GAGGGCCTTC CCAGAAGCAG CCTCTGGGAG CAGAGTCCTG ATGTCCTGGA AATCTCGGAG AAGGAGAGCA GTACTCACCC TCAGTCCTGC ATCTTGTTCC AGTTAACATT GACAGAGGTG ATGTGGCAAC CAGTACTTAG GCCCAGGGAG ACATTGTACG AGTCTGGGAC TAGTCAGGTC CTGTTTCATG ATGTGACTTT CTCGGGAAGG ACAAGGGAGA AGAGAAACTC ATGCCTTCTG ATCCTGACCG TGCCTACAAT CTTTCATTTA CATCAAGGGG ATATTATCAC ACGCAAAACT TAGCCTTTCT CCGCATGGAA CTATGATTGT TATAAAGGGG GTGGGGATTT GACAAAGGAC AAGGAACGGT CAAGAACAGC CTGTTGTTCC TCCCTTTGCC TTTCCCGCTC CCATGGATAT TAAAAAAGTA GAATATTTTG

Sekvence id. č. 4

MGGSVREFAI, SVALWLSWGA VLGAVTCAVA LLIQQTELQS LRREVSRLQR

SGGPSQKQGS RPWQSLWEQS PpVLSAWKDG AKSRRRRAVL TQKHKKKHSV 101 LHLVPVNITS KDSDVTEVMW QPVLRRGRGP GGQGDIVRVW DTGIYLLYSQ 151 VLFHDVTFTM GQWSREGQG RRETLFRCIR SMPSDPDRAY NSCYSAGVFH 201 LHQGDI1TVK IPRANAKtSL SPHGTFLGFV KL

Citovaná literatura

i. Smith et al. 1990; Kohno et al. 1990; Loetscher et al 1990; Schall at al. 1990.

ii. See Jones et al., 1989; Eck et al., 1992.

iii. K. Tracey, in Tumor Necrosis Factos. The Molecular and Their Emerging Role in Medicine, B. Beutler (Ed.), Raven Press, NY, p 255 (1992)); A. Waage, In Tumor Necrosis Factors, The Molecules and Their Emerging Role In Medicine, B. Beutler (Ed.), Raven Press, NY, p 275 (1992).

iv. G. D. Roodman, in Tumor Necrosis Factors. The Molecular adn Their Emergign Role in Medicine, B. Beutler (Ed.), Raven Press, NY, p. 117 (1992).

v. A. Nakane, in Tumor Necrosis Factors. The Molecules and Their Emerging Role in Medicine, B. Beutler (Ed.), Raven Press, NY, p 285 (1992); I. A. Clark et al., in Tumor Necrosis Factors. The Molecules and Their Emerging Role in Medicine, B. Beutler (Ed.), Raven Press, NY, p. 303 (1992); G. E. Grau et al., in Tumor Necrosis Factors. The Molecules and Their Emerging Role in Medicine, B. Beutler (Ed.). Raven Press, NY, p. 329 (1992); G. E. Grau et al., in Tumor Necrosis Factor. The Molecules and Their Emerging Role in Medicine, B. Beutler (Ed.), Raven Press, NY, p. 329 (1992); P-F. Piguet, in Tumor Necrosis Factors. The Molecules and Their Emerging Role in Medicine, B. Beutler (Ed.), Raven Press, NX, p.341 (1992); G. H. Wong et al., in Tumor Necrosis Factors. The Molecules and Their Emmerging Role in Medicine, B. Beutler (Ed.), Raven Press, NX, p. 371 (1992).

-22CZ 294615 B6 vi. S. Malík, in Tumor Necrosis Factors. The Molecules and Their Emerging Role in Medicine, B. Beutler (Ed.), Raven Press, NX, p 407 (1992).

vii. D. A. Fox, Am. J. Med., 99, 82 (1995).

viii. D. Goeddel et al., Cold Spring Harbor Symposium Quant. Biol., 51, 597 (1986); G. Trinchieri, in Tumor Necrosis Factors, The Moleculer and Their Emerging Role in Medicine, B. Beutler (Ed.), Raven Press, NY, p 515 (1992).

ix. L. A. Tartaglia et al., Proč Nati. Acad. Sci. USA, 88, 9292 (1991); L. A. Tartaglia and D. V. Goeddel. Immunol. Todav, 13, 151 (1992).

x. B. Luetting et al., J. Immunol., 143, 4034 (1989); M. Kriegler et al., Cell, 53, 45 (1988).

xi. C.F. Ware etal., in Pathways for Cytolysis, G. M. Griffíths and J. Tschopp (Eds.), Springer-Verlag, Berlin, Heidelberg, p 175—218 (1995).

xii. N. Paul et al., Ann, Rev. Immunol., 6, 407 (1988).

xiii. P. D. Crowe et al., Science. 264, 707 (1994). (J. Browning et al., Cell, 72, 847 (1993); J. Browning et al., J. Immunol. 154, 33 (1995).

xiv. P. D. Togni et al., Science, 264, 703 (1993); T. A. Banks et al., J, Immunol., 155, 1685 (1995).

xv. J. Browning and A. Ribolini, J. Immunol., 143, 1859 (1989): J. Browning et al., J. Exp. Med., 183,867(1996).

xvi. T. Suda et al., J. Immunol., 154, 38026 (1995) (T. Suda et al., J. Immunol,, 154, 3806 (1995).

xvii. B. C. Trauth et al., Science, 245, 301 (1989); S. Yonehara et al., J. Exp. Med., 169, 1747 (1989); S. Nagata and P. Goldstein, Science, 267, 1449 (1995); Μ. H. Falk et al., Blood, 79, 3300 (1992).

xviii. F. Rieux-Laucat et al., Science, 268, 1347 (1995); T. Tatakashi et al., Cell, 76, 969 (1994); R. Watanabe-Fukunaga et al., Nátuře, 356, 314 (1992).

xix. P. R. Galle and al., J. Exp. Med., 182, 1223 (1995).

xx. F. Silvestris and al., Clin. Immunol. Immunopathol., 75, 197 (1995).

xxi. P. D. Katsikis et al., J. Exp. Med., 181, 2029 (1995); A. D. Badley et al., J. Virol., 70, 199(1996).

xxii. S. Wiley et al., Immunity, 3, 673 (1995).

xxiii. J. F. Gauchat et al., FEBS Lett., 315, 259 (1993); S. Funakoshi et al., Blood, 83, 2787(1994).

xxiv. R. C. Allen et al., Science, 259, 990 (1993).

xxv. L. Biancone et al., Kidney-Int., 48, 458 (1995); C. Mohan et al., J. Immunol., 154, 1470(1995).

-23 CZ 294615 B6 xxvi. J. Ruby and al., Nátuře Medicine, 1, 437 (1995).

xxvii. Z. Wang et al., J. Immunol., 155, 3722 (1995); A. M. Cleary and al., J. Immunol., 155, 3329(1995).

xxviii. S. Hess and H. Engelman., J. Exp. Med., 183, 159 (1996).

xxix. R. G. Goodwin et al., Cell, 73, 447 (1993); Goodwin et al., Eur. J, Immunol., 23, 2631 (1993); C. A. Smith et al.. Cell. 73, 13 49(1993).

xxx. See for example, Narang, SA (1983) Tetrahedron 39:3; Itakura et al. (1981) Recombinant DNA, Proč 3^rd Cleveland Sympos. Macromolecules. ed. AG Walton, Amsterdam: Elsevier pp273-289; Itakura et al., (1984) Annu. Rev. Biochem. 53:323; Itakura et al. (1984) Science 198:1056; Ike et al. (1983) Nucleic Acid Res. 11:477.

xxxi. See, for example, Scott et al. (1990) Science 249: 386-390; Roberts et al. (1992) PNAS 89: 2429-2433; Devlin et al. (1990) Science 249: 404-406; Cwirla et al. (1990) PNAS 87: 6378-6382; as well as U.S. PatentsNos. 5, 223, 409, 5, 198, 346, and 5,096,815.

33. Μ. T. Abreu-Martin, A. Vidrich, D. H. Lynch and S. R. Targan. Divergent induction of apoptosis and IL-8 secretion in HT-29 cells in response to TNF-,, and Ligation of Fas ligand. J. Immunol. 155: 4147-4154, 1995.

34. K. Agematsu. T. Kobata, F.-C. Yang, T. Nakazawa, K. Fukushima, M. Kitahara, T. Moři, K. Sugita, C. Morimoto and A. Komiyama. CD27/CD70 interaction directly drives B cell IgG and IgM synthesis. Eur, J. Immunol. 25: 2825-2829, 1995.

35. R. Amakawa, A. Hákem, T. M. Kundig, T. Matsuyama, J.J. L. Simard, E. Tímms, A. Wakeham, H.-W. Mittruecker, H. Griesser, H. Takimoto, R. Schmits, A. Shahinian, P. S. Ohashi, J. M. Penninger and T. W. Mak. Impaired negative selection of T cells in Hodgkin=s disease antigen CD30-defíciet mice. Cell 84: 551-562, 196.

36. J.-L. Bodmer, K. Burens, P. Schneider, K. Hofmann, V. Steiner, M. Thome, T. Bornand, M. Hahne, M. Schroeter, K. Becker, A. Wilson, L. E. French, J. L. Browning, H. R. MacDonald, and J. Tschopp. TRAMP, a novel apoptosismediating receptor with sequence homology to tumor necrosis factor receptor 1 and fas (apo-l/CD95). Immunity 6: 79-88, 1997.

37. J. Brojatsch, J. Naughton, Μ. M. Rolls, K. Zingler and J.A.T. Young. Carl, a TNFRrelated protein is a cellular receptor for cytopathic avian lleukosissarcoma viruses and mediates apoptosis. Cell. 87:845-855, 1996.

38. J. L. Browning, M. J. Androlewicz and C. F. Ware. Lymphotoxin and an associated 33-kDa glycoprotein are expressed and the surface of ant activated human T cell hvbridoma. J. Immunol. 147: 1230-7, 1991.

39. J. L. Browning, K. Miatkowski, D. A. Griffiths, R. P. Bourdon, C. Hession, C. M. Ambrose and W. Meier. Preparation and characterization of soluble recombinant heterotrimeric complexes of human lymphotoxins alpha and beta. J. Biol. Chem. 271:8618-26, 1996.

40. J. E. Castro, J. A. Listman, B. A. Jacobson, Y. Wang, P. A. Lopez, S. Ju, P. W. Finn and D. L. Perkins. Fas Modulation of appoptosis during negative selection of thymocytes. Immunity 5:617-627, 1996.

-24CZ 294615 B6

41. C.-Y. A. Chen and A.-B. Shyu. AU-rich elements: characterization and importance in mRNA degradation. Trends in Biol. Sci. 20: 465-470, 1995.

42. Y. Chicheportiche, C. Ody and P. Vassalli. Identification in mouše macrophages of a new 4 kb mRNA present in hematopoietic tissue which shares a short nucleotide sequence with erythropoietic mRNA. Biochim. Biophys. Res. Comm. 209: 1076-1081, 1995.

43. A. M. Chinnaiyan, K. O=Rourke, G.-L. Yu, R. H. Lyons, M. Garg, D. R. Duan, L. Xing, R. Gentz, J. Ni and V. M. Dixit, Signál transduction by DR3 a deathdomain-containing receptor related to TNFR-1 and CD95. Science 274: 990-992. 1996.

44. P. DeTogni et al. Abnormal development of peripheral lymphoid organs in mice deficient in lymphotoxin. Science 264: 703-7, 1994.

45. M. A. DeBenedette, N. R. Chu, K. E. Pollok, J. Hurtako, W. F. Wade, B. S. Kwon and T.

H. Watts. Role of 4-1BG ligand in costimulation of T Lymphocyte growth and its upregulation on M12B lymphomas by cAMP. J. Exp. Med. 181: 985-992, 1995.

46. M. Degli-Esposti, T. Davis-Smith, W. S. Din, P. J. Smolak. R. G. Goodwin and C. A. Smith. Activation of the lymphotoxin-β receptor by cross-linking induces chemokine production and growth arrest in A375 melanoma cells. J. Immunol. 158: 1756-1762, 1997.

47. T. M. Foy, A. Aruffo, J. Bajorath, J. E. Buhlmann and R. J. Noelle. Immune regulation by CD40 and its ligand gp39. Ann. Rev. Immunol. 14:591-617, 1996.

48. H. J. Gruss, N. Boiani, D. E. Williams, R. J. Armitage, C. A. Smith and R. G. Goodwin. Pleitropic effects of the CD30 ligand on CD30-expressing cells and lymphoma cell lineš. Blood 83: 2045-56. 1994.

49. H. J. Gruss and S. K. Dower. Tumor necrosis factor ligand superfamily: involvement in the pathology of malignant lymphomas. Blood 85: 3378-404, 1995.

50. J. Kitson, T. Raven, Y.-P. Jiang, D. V. Goeddel. K.M. Giles, K.-T. Pun, C. J. Grinham, R. Brown and S. N. Farrow. A death domain-Containing receptor thar mediates apoptosis, Nátuře 384: 372-375, 1996.

51. S. Y. Lee, C. G. Park and Y. Choi. T. cell receptor-dependent cell death of T cell hybridomas mediated by the CD30 cytoplasmatic domain in association with tumor necrosid factor receptor-associated factors. J. Exp, Med. 183: 669-674, 1996.

52. R. I. Montgomery, M. S. Warner, B. J. Lumm and P. G. Spear. Herpes simplex virus-1 entry into cell mediated by a novel member of the TNF/NGF receptor family. Cell 87:427436, 1996.

53. S. Nataga. Apoptosis by death factor. Cell 88: 355-365, 1997.

54. R. M. Pitti, S. A. Marsters, S. Ruppert, C. J. Donahue, A Moore and A. Ashkenazi. Induction of apoptosis by Apo-2 ligand, a new member of the tumor necrosis factor cytokine family. J. Biol. Chem. 1996.

55. C. A. Smith, T. Farrah and R. G. Goodwin. The TNF receptor superfamily of cellular and viral proteins: activation, costimulation, and death. Cell 76: 959-62, 1994.

56. G. L. Smith. Virus stretegies for evasion of the host response to infection. Trends in Microbiol. 3:81-88. 1994.

-25 CZ 294615 B6

57. E. Strueber and W. Strober. The T cell-B cell interaction via OX40-OX40L is necessary for the T cell independent humoral immune response. J. Exp. Med. 183. 979-989, 1996.

58. H.-K. Sytwu, R. S. Liblau and H. O. McDevitt. The roles of Fas/Apo-1 (CD95) and TNF in antigen-induced programmed cell death in T cell receptor trangenic mice. Immunity 5:17-30, 1996.

59. P. Vassalli. The pathophysiology of tumor necrosis factors. Ann, Rev. Immunol. 10:411452, 1992.

60. L. Zheng, G. Fisher, R. E. Miller, J. Peschon, D. H. Lynch and M. J. Lenardo. Induction of apoptosis in mature T cells by tumour nectosis factor. Nátuře 377:348-351, 1995.

PATENTOVÉ NÁROKY

Claims (11)

1. Použití protilátky, která se specificky váže na polypeptidový ligand APRÍL mající SEKVENCI ID. č. 2 nebo jeho rozpustný fragment, a narušuje spojení mezi polypeptidovým ligandem APRÍL a polypeptidovým receptorem APRÍL, pro výrobu léčiva pro

a) léčení, potlačení nebo vyvolání změny růstu nádorových buněk,

b) léčení rakoviny a

c) léčení hyperplazie.

2. Použití podle nároku 1, kde nádorové buňky, rakovina nebo hyperplazie způsobují expresi polypeptidového ligandu APRÍL.

3. Použití podle nároku 1, kde nádorové buňky, rakovina nebo hyperplazie způsobují expresi polypeptidového receptoru APRÍL.

4. Použití podle kteréhokoliv z nároků 1 až 3, kdy se protilátka podává v kombinaci s chemoterapeutickým činidlem.

5. Použití podle kteréhokoliv z nároků 1 až 3, kdy se protilátka podává v kombinaci s radiační terapií.

6. Použití podle kteréhokoliv z nároků 1 až 3, kdy protilátka je reaktivní s polypeptidem majícím SEKVENCI ID. č. 2 nebo jeho fragmentem a kdy protilátka narušuje spojení mezi polypeptidovým ligandem APRÍL a polypeptidovým receptorem APRÍL.

7. Použití podle kteréhokoliv z nároků 1 až 3, pro výrobu léčiva k léčení hyperplazie.

8. Použití podle nároku 7, kdy hyperplazie je důsledkem revmatoidní artritidy.

9. Použití podle nároku 8, kdy hyperplazie je panus.

10. Použití podle kteréhokoliv z nároků 1 až 3, pro výrobu léčiva k zamezení růstu nádorových buněk.

11. Použití podle kteréhokoliv z nároků 1 až 3, pro výrobu léčiva k léčení rakoviny.