KR20000029877A

KR20000029877A - 종양괴사인자관련리간드

Info

Publication number: KR20000029877A
Application number: KR1019997001045A
Authority: KR
Inventors: 치쉐포르티쉐이베스; 브라우닝제프리엘
Original assignee: 아스트루 마이클 제이; 바이오겐, 인코포레이티드; 더 팩컬티 오브 메디신 오브 더 유니버시티 오브 제네바
Priority date: 1996-08-07
Filing date: 1997-08-07
Publication date: 2000-05-25
Also published as: EP1591530A3; EP0956351A1; JP4161084B2; SK288012B6; IS4967A; EP1591530A2; CN1308451C; HK1025994A1; DK0956351T3; EP0956351B1; AU736289B2; ES2251737T3; EA199900187A1; NO20084906L; HU226787B1; AU3829497A; JP4411330B2; CN101024831A; HUP9903921A3; IL128407A

Abstract

본 발명은 종양 괴사 인자류(TNF)의 신규 성분인 종양 괴사 관련 리간드(TRELL), 변형된 TRELL 및 이들을 함유하는 약학적 조성물에 관한 것이다.

Description

종양 괴사 인자 관련 리간드{A TUMOR NECROSIS FACTOR RELATED LIGAND}

종양 괴사 인자(TNF) 관련 시토킨은 숙주의 방어 및 면역 조절의 매개인자이다. 이 군의 구성원은 세포간 접촉을 통해 국부적으로 작용하는 막에 고정된 형태로 존재하거나, 또는 보다 원거리의 표적으로 확산할 수 있는 분비 단백질로 존재한다. 이것에 대등한 수용체군은 표적 조직에 존재하는 세포의 사멸이나 세포 증식 및 분화의 개시를 유도하는 상기 분자의 존재를 감지한다. 현재 밝혀진 TNF군의 리간드 및 수용체는, 예컨대 TNF:TNF-R, LT-α:TNF-R, LT-α/β:LT-β-R, FasL:Fas, CD40L:CD40, CD30L:CD30, CD27L:C27, OX40L:OX40 및 4-1BBL:4-1BB를 비롯하여 9갖가지 이상의 수용체-리간드 쌍이다. 이들 리간드를 암호화하는 DNA 서열은 가장 관련성이 큰 경우에도 단지 약 25% 내지 약 30%의 동일성을 나타내지만, 아미노산 관련도는 약 50%이다.

상기 군의 시토킨 수용체가 나타내는 명확한 특성은 두가지 별개의 TNF 수용체의 분자 클로닝에 의해 최초로 밝혀진 시스테인 풍부 세포외 도메인에서 발견된다¹. 이 군의 유전자는 세포외 리간드 결합 도메인, 단일 막 전폭(spanning) 영역 및 세포 기능의 활성화에 관여하는 세포질 영역을 가진 1형 경막(transmembrane) 단백질의 특징인 당단백질을 암호화한다. 시스테인 풍부 리간드 결합 영역은 특정 군 구성원에 따라 여러번 반복되는 단단하게 짜여진 이황화 결합된 코어 도메인을 나타낸다. 대부분의 수용체는 4개의 도메인을 가지지만, 3개처럼 작거나 6개처럼 많을 수도 있다.

TNF군 리간드의 단백질은 보통 짧은 친수성 아미노산으로 이루어지고, 종종 종결 전달 서열로 작용하는 것으로 생각되는 몇 개의 리신 또는 아르기닌 잔기를 포함하는 짧은 N-말단 영역을 특징으로 한다. 그 다음에는 경막 영역 및 막으로부터 C-말단 수용체 결합 도메인을 분리하는 다양한 길이의 세포외 영역이 따른다. 이 영역은 종종 "줄기(stalk)"라 부른다. C-말단 결합 영역은 단백질의 대부분을 차지하고, 종종, 반드시 그런 것은 아니지만, 당부가 부위를 포함한다. II형 막 단백질은 세포 외부에 놓이는 C 말단과 세포질에 소재하는 짧은 N-말단을 가지고 있으므로, 이들 유전자에는 I형 막 단백질의 특징인 고전적인 신호 서열이 없다. 일부 경우, 예컨대, TNF 및 LT-α의 경우 줄기 영역은 단백질 가공 중 초기에 절단될 수 있는데, 그 후 리간드가 주로 분비형으로 발견된다. 그러나, 대부분의 리간드는 국부화된 신호작용을 매개하는 막 형태로 존재한다.

상기 리간드의 구조는 TNF, LT-α 및 CD40L의 결정학 분석에 의해 널리 규명되었다. TNF 및 림포톡신-α(LT-α)는 둘다 "젤리 롤" 또는 그릭 키(Greek key) 형태와 두 개의 역평행 β-주름형 시트의 샌드위치 형의 구조를 이루고 있다². Cα및 β-가닥 잔기들 사이 rms 편차는 0.61C인데, 이것은 그 분자 지형에 고도의 유사성이 있음을 암시하는 것이다. CD40L, TNF 및 LT-α의 분자 연구로부터 나타나는 구조적 특징은 올리고머성 복합체로 조립되는 경향이다. 올리고머성 구조는 본래 다가의 리간드를 생성시키는 인접 서브유닛 사이의 연접부에 수용체 결합 부위를 갖고 있다. TNF, CD40L 및 LT-α의 4차 구조는 그 결정 구조 분석에 의하면 삼량체로 존재하는 것으로 나타났다. 상이한 리간드 사이에 보존적인 다수의 아미노산은 스캐폴드 β-시트 형태를 이루고 있다. 상기 스캐폴드 서열의 일부는 다양한 군의 구성원들 중에서 보존적이기 때문에, 상기 기본 샌드위치 구조 역시 상기 분자 모두에서 보존되는 것 같다. 서브유닛 모양이 유사하게 잔존하기 때문에, 4차 구조도 보존될 수 있다.

TNF 군의 구성원은 세포 생존 및 분화를 제어하는 면역계에서 주 스위치로 설명되는 것이 가장 적합할 것이다. TNF 및 LT-α만은 TNF군의 다른 주요 막 고정형 구성원과 달리 분비형 시토킨으로서 현재 인지되어 있다. TNF의 막 형태는 그 특성이 잘 규명되어 있고 특이적인 생물학적 역할을 가지는 것으로 보이는 반면에, 분비형 TNF는 유발 현상 부위로부터 보다 원거리의 세포에 대해 일반 경보 신호로 기능한다. 따라서, TNF 분비는 맥관 내벽에서 잘 설명되어 있는 변화 및 세포의 염증 상태를 초래하는 현상을 증폭시킬 수 있다. 대조적으로, TNF 군의 막 결합 구성원은 TNF형 수용체를 통해 직접 접촉하고 있는 세포로만 신호를 보낸다. 예를 들면, T 세포는 동족 TCR 상호작용을 통해 직접 접촉된 B 세포에만 CD40이 매개하는 "도움 작용(help)"을 제공한다. 세포 사멸을 유도하는 능력에 대한 유사한 세포간 접촉 제한은 널리 연구된 Fas 시스템에 적용된다.

프로그램된 세포 사멸을 유도하는 능력이 TNF군의 여러 구성원들에 있어서 중요하고 널리 연구된 특성이다. Fas가 매개하는 고사(apoptosis)는 말초 및 가능성 있기로는 흉선에서 자가반응성 림프구를 조절하는 역할을 하는 것으로 보이고(Castro 등, 1996), 최근의 연구에서는 또한 T 세포의 생존 및 대형 세포 퇴행성 림프종 세포주의 생존에 TNF 및 CD30 시스템이 관련 있음이 제안되었다(Amakawa 등, 1996; Gruss 등, 1994; Sytwu 등, 1996; Zheng 등, 1995). 본원 발명자들 및 기타 연구자들은 이미 TNF, Fas 또는 LTb 수용체 신호작용에 대한 반응으로 상기 세포주가 사멸하는 바 고사의 특성을 갖는다는 것을 알아냈다(Abreu-Martin 등, 1995; Browning 등, 1996).

TNF 리간드가 세포 사멸을 유도하는 능력에 기초하여 TNF 리간드를 3개 군으로 분리할 수 있는 것으로 보인다(표 3). 첫째, TNF, Fas 리간드 및 TRAIL은 다수의 세포주에서 세포 사멸을 효과적으로 유도할 수 있고, 그 수용체는 주로 역시 양호한 정규 사멸 도메인을 가진다. 아마도 DR-3(TRAMP/WSL-1)에 대한 리간드 역시 상기 범주에 속할 것이다. 다음으로는, 몇 가지 세포 유형에 국한된 보다 약한 사멸 신호를 유발하는 상기 리간드가 있고, TRELL, CD30 리간드 및 LTa1b2가 이 부류의 예이다. 이 그룹이 정규의 사멸 도메인의 부재하에 어떻게 세포 사멸을 유발하는가 하는 것은 흥미로운 문제이며, 별도의 보다 약한 신호작용 메카니즘이 존재한다는 것을 암시하는 것이다. 마지막으로, 사멸 신호를 효과적으로 전달할 수 없는 상기 구성원들이 있다. 아마도, 모든 그룹은 결국 세포 분화를 유도하는 일부 세포 유형, 예컨대, CD40에 대해 증식 억제 효과를 가질 수 있다(Funakoshi 등, 1994).

TNF군은 최근에 면역계의 조절에 관여하는 11개 이상의 상이한 신호작용 경로 분자를 포함하여 급격히 증가하였다. 특히, TRELL 및 TRAIL의 발현 패턴은 훨씬 더 많은 기능성 변화가 있어 TNF 군에 포함되지 않는 것으로 보인다. 이러한 관점은 최근에 로우스 육종 바이러스 및 단순 포진 바이러스가 복제하는 능력에 영향을 끼치는 두 수용체의 발견 뿐만 아니라, TNF가 항바이러스 활성을 가지고 천연두 바이러스가 유인 TNF 수용체를 암호화한다는 관찰을 특히 돋보이게 하였다(Brojatsch 등, 1996; Montgomery 등, 1996; Smith, 1994; Vassalli, 1992). 세대 용해성의 TRELL 및 TRELL 수용체의 확인은 상기 흥미로운 단백질의 생물학적 기능을 규명하기 위한 도구를 제공하는 것이다.

TNF는 패혈증 쇼크 및 악액질의 매개물질이고³, 조혈 세포 발육의 조절에 관여한다⁴. TNF는 염증의 매개물질 및 박테리아, 바이러스 및 기생충 감염에 대한 방어물질로서 주요한 역할을 할 뿐만 아니라⁵, 항종양 활성을 가지는 것으로⁶보인다. 또한, TNF는 상이한 자가면역 질병에 관여한다⁷. TNF는 대식세포, 섬유아세포, T 세포 및 천연 킬러 세포를 비롯한 여러 가지 세포 유형에 의해 생성될 수 있다⁸. TNF는 각각 특이 세포내 신호작용 분자를 통해 작용하여 TNF의 상이한 효과를 일으키는 두 개의 상이한 수용체에 결합한다⁹. TNF는 막 결합 형태로 또는 분비되는 가용성 시토킨으로 존재할 수 있다.

LT-α는 TNF와 다수의 활성을 공유한다. 즉, TNF 수용체에 결합하여¹¹TNF와 달리 활성화된 T 세포 및 일부 β-림프아구 종양에 의해 주로 분비되는 것으로 보인다¹². LT-α및 LT-β의 헤테로머 복합체는 LT-β수용체에 결합하는 막 결합 복합체이다¹³. LT-β의 유전자 파괴는 비장에서의 T 세포 및 B 세포의 해체 및 림프절의 부재를 초래하기 때문에, LT 시스템(LTs 및 LT-R)은 말초 림프양 기관의 발육에 관여하는 것으로 보인다¹⁴. LT-β는 또한 일부 선암 세포주의 세포 사멸에 관여한다¹⁵.

TNF군의 또 다른 구성원인 Fas-L은 활성화된 T 세포상에서 주로 발현된다¹⁶. 이것은 프로그램된 세포 사멸 또는 고사로 공지된 메카니즘에 의해 종양 세포 및 HIV-감염 세포를 비롯하여 그 수용체를 보유하는 세포의 사멸을 유도한다¹⁷. 또한, Fas 또는 Fas-L의 결핍은 림프증식성 질환을 초래할 수 있는데, 이는 면역 반응의 조절에 있어서의 Fas 시스템의 역할을 확인해 주는 것이다¹⁸. Fas 시스템은 또한 간염 만성 감염에서 기인되는 간 손상¹⁹, 및 HIV 감염 환자에서의 자가면역²⁰에 관여한다. 또한, Fas 시스템은 또한 HIV 환자의 T-세포 파괴에 관여한다²¹. TNF 군의 또 다른 구성원인 TRAIL은 또한 다양한 기원의 형질전환된 세포주의 광범위한 변종의 사멸에도 관여하는 것 같다²².

TNF군의 또 다른 구성원인 CD40-L은 T 세포상에서 발현되고, CD40 보유 B세포의 조절을 유도한다²³. 또한, CD40-L 유전자의 변화는 X-연결된 초IgM 증후군으로 공지된 질병을 초래한다²⁴. CD40 시스템은 또한 상이한 자가면역 질병에 관여하며²⁵, CD40-L은 항바이러스성을 갖는 것으로 공지되어 있다²⁶. CD40 시스템이 고사성 B 세포의 구제에 관여하지만²⁷, 비면역 세포에서 그것은 고사를 유도한다²⁸. TNF 군의 다수의 추가 림프구 역시 동시 자극에 관여한다²⁹.

일반적으로, TNF 군의 구성원은 면역계의 제어 및 민감한 숙주 방어계의 활성화에 근본적인 조절적 역할을 한다. 치료적 이점을 위한 TNF군의 구성원의 조작에 있어서의 최근의 진보로 인해, 상기 군의 구성원은 질병을 제어하는 특이 수단을 제공할 수 있는 것 같다. 상기 군의 일부 리간드는 다수의 형질전환된 세포의 고사성 사멸을 직접 유도할 수 있는 것으로서, 그 예로는 LT, TNF, Fas 리간드 및 TRAIL이 있다(Nagata, 1977). Fas 및 가능하기로는 TNF 및 CD30 수용체의 활성화는 면역조절 기능을 수행할 수 있는 형질전환되지 않은 림프구의 세포 사멸을 유도할 수 있다(Amakawa 등, 1996; Nagata, 1997; Sytwu 등, 1996; Zheng 등, 1995). 일반적으로, TNF 수용체 중 세포질 쪽에 소재하는 사멸 도메인이 응집되면 사멸이 유발된다. 사멸 도메인은 캐스파제 다단계 반응(caspase cascade)의 활성화를 일으키는 다양한 신호 변환 성분의 조립을 조화시키는 작용을 한다(Nagata, 1997). 일부 수용체는 정규의 사멸 도메인이 결핍되어 있는데, 예컨대, LTb 수용체 및 CD30(Browning 등, 1996; Lee 등, 1996)은 보다 약하기는 하지만 여전히 세포 사멸을 유도할 수 있다. 이러한 상황은 CD30이 없는 생쥐에 관한 연구가 흉선에서의 음성 선택에 있어서 사멸 역할을 제안하고 있지만, 상기 수용체가 주로 세포 분화를 유도하고, 이 사멸은 일부 형질전환된 세포주에서 결국 비정상적인 것 같다(Amakawa 등, 1996). 반대로, CD40과 같은 다른 경로를 통한 신호 작용은 세포 생존을 유지하기 위해 필요하다. 따라서, TNF 군의 구성원인 추가의 분자를 확인하고 특성규명하여 질병을 제어하고 면역계를 조절하는 수단을 제공해야 할 필요성이 대두된다.

본 발명은 종양 괴사 인자 관련 리간드 또는 "TRELL", 즉 종양 괴사 인자군의 일원인 폴리펩티드에 관한 것이다. 이 단백질 또는 그 수용체는 항암 및/또는 면역조절 용도를 가질 수 있다. 또한, TRELL에 대한 유전자로 형질감염된 세포는 유전자 치료에 사용하여 종양, 자가면역성 및 염증성 질환 또는 유전되는 유전자 질환을 치료할 수 있다.

본 명세서에 기재하는 발명은 부분적으로 스위스 국가 기금으로부터 아이린 가르시아에게 인가된 인가번호 31-42275.94 및 32-41729.94하에서의 연구 과정중에 이루어졌다. 예약된 권리는 스위스 국가 기금법의 제28항 및 제29항에 언급되어 있다.

도 1은 인간 및 생쥐 TRELL의 아미노산 서열을 비교한 것이다.

도 2A 및 도 2B는 TNF 군에 속하는 인간에서 기원한 구성원의 아미노산 서열을 비교한 것이다.

도 3은 상이한 생쥐 세포주 및 조직에서의 TRELL mRNA 발현의 노던 블롯 분석 결과를 나타낸 것이다. 레인들은 중복 실험된, (1) 티오글리콜레이트에 의해 유도된 복막 대식세포, (2) 골수, (3) 비장 및 (4) 간에서 유래한 RNA를 포함한다.

도 4는 상이한 인간 조직에서의 TRELL mRNA 발현의 노던 블롯 분석 결과를 나타낸 것이다.

도 5는 환원 및 비환원 조건하에서 재조합 TNF, LTα및 TRELL의 SDS-PAGE 결과를 나타낸 것이다.

도 6은 TRELL이 인간 선암 세포주 HT29에 세포독성을 갖는다는 것을 나타내는 것으로서, 도 6A는 인간 인터페론-g의 존재하에 TNF, TRELL, LTα/β및 항Fas가 HT29 세포주의 성장을 차단하는 능력을 나타낸다. 세포들은 다양한 작용제의 존재하에 4일 동안 성장시켰고, MTT 염색법을 사용하여 성장을 평가하였다. 도 6B는 세포 사멸을 진행하는 세포의 형태를 나타낸다. 세포들은 2일 동안 사전 성장시킨 다음, 80 U/㎖의 인터페론g로 24 시간 동안 처리한 후, 에탄올 무첨가하에(A), 그리고 에탄올 첨가하에 100 ng/㎖를 고정시켜 위상차 현미경(400x 확대)으로 관찰한 결과(상부 패널)와 1 ㎍/㎖의 훽스트 염료로 염색하여 핵을 나타낸 결과(하부 패널)를 얻었다. 고사의 특징인 응집된 핵을 가진 대표적인 세포는 화살표로 나타냈다.

상세한 설명

이제 본 발명의 바람직한 양태를 참조하여 본 발명을 상세히 설명하고자 한다. 본 발명은 인간 또는 생쥐의 TRELL을 암호화하는 DNA 서열, 그 단편 및 상동체와, 이들을 사용하여 형질전환시킨 숙주에서의 상기 DNA 서열의 발현에 관한 것이다. 본 발명은 상기 DNA 서열 및 이들이 암호화하는 펩티드의 용도에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 TRELL에 대한 인간 및 생쥐의 아미노산 서열 또는 그 단편 뿐만 아니라, 이들을 포함하거나 이들로부터 유래한 약학 조성물을 포함한다.

A. 정의

본원에서 사용된 "상동성"이란 비교되는 분자들이 가진 서열들 사이의 서열 유사성을 의미한다. 두 개의 비교되는 서열중 어떤 위치가 동일한 염기 또는 아미노산 단량체 서브유닛에 의해 점유되는 경우, 예컨대, 두 개의 DNA 분자 각각의 위치가 아데닌에 의해 점유되는 경우, 그 분자는 그 위치에서 상동성이 있는 것이다. 두 서열들 사이의 상동성 비율은 두 서열이 공유하는 일치 또는 상동성 위치의 수를 비교된 위치의 수로 나누고, 100을 곱한 값이다. 예를 들면, 두 서열의 위치 10개중 6개가 일치되거나 또는 상동성인 경우, 그 두 서열은 60%의 상동성이 있다. 예를 들면, DNA 서열 ATTGCC 및 TATGGC는 50%의 상동성을 공유한다. 일반적으로, 최대 상동성을 얻기 위해서 두 서열을 정렬시킨 후 비교한다.

본원에 사용된 폴리펩티드의 "정제된 제조물" 또는 "실질적으로 순수한 제조물"이란 자연적으로 함께 존재하는 다른 단백질, 지질 및 핵산으로부터 분리된 폴리펩티드를 의미한다. 폴리펩티드는 또한 그것을 정제하기 위해 사용되는 기타 물질, 예컨대, 항체, 기질 등으로부터 분리된 것이 바람직하다.

본원에 사용된 "형질전환된 숙주"란 그 게놈내로 도입되어 안정하게 통합된 서열, 즉 TRELL 서열을 가진 임의의 숙주 또는 에피좀 요소를 암호화하는 서열, 즉 TRELL을 보유하는 숙주를 포함하는 개념이다.

본원에 사용된 "치료"는 치료제 또는 치료 물질(예컨대, 약)의 투여와 같은 임의의 치료학적 처치를 포함한다.

"실질적으로 순수한 핵산"(예컨대, 실질적으로 순수한 DNA)는 핵산이 유래한 유기체의 자연 발생적 게놈에 바로 인접(즉, 하나는 5' 단부 및 하나는 3' 단부)하고 있는 서열, 예컨대, 암호 서열과 함께 이 서열 중 어느 하나의 서열 또는 두 서열에 바로 인접하지 않은 서열을 한 가닥 또는 양 가닥에 가진 핵산 또는 핵산이 유래한 유기체에 함께 존재하는 핵산 서열이 실질적으로 부재하는 핵산이다. 이 용어는, 예를 들면 벡터, 예컨대 자발적으로 복제하는 플라스미드 또는 바이러스 중에 병입되거나, 또는 원핵세포 또는 진핵세포의 게놈 DNA 중에 병입되거나, 또는 다른 DNA 서열과는 무관한 별개의 분자(예컨대, cDNA, 또는 PCR 또는 제한 엔도뉴클레아제에 의해 생성된 게놈 DNA 단편)로서 존재하는 재조합 DNA를 포함한다. 실질적으로 순수한 DNA는 또한 TRELL을 암호화하는 하이브리드 유전자의 일부인 재조합 DNA를 포함한다.

"펩티드", "단백질" 및 "폴리펩티드"란 용어는 본원에서 호환적으로 사용된다.

본원에 사용된 "생물학적 활성이 있는"이란 직접 또는 간접으로 실시할 수 있는 생체내 또는 생체외 활성을 가진 것을 의미한다. TRELL의 생물학적 활성이 있는 단편은 예를 들면, TRELL의 활성 부위와 70%, 보다 바람직하게는 80% 이상, 가장 바람직하게는 90% 이상의 아미노산 상동성을 가질 수 있다. TRELL과 관련한 동일성 또는 상동성은 서열번호 2 또는 서열번호 4의 TRELL 잔기와 동일한 후보 서열의 아미노산 잔기의 비율로서 정의된다.

다른 언급이 없으면, 본 발명의 실시에는 당해 기술 분야에 속하는 세포 생물학, 세포 배양, 분자 생물학, 돌연변이 생물학, 미생물학, 재조합 DNA 및 면역학의 통상적인 기술을 이용할 수 있다. 그러한 기술들은 문헌³⁰에 기재되어 있다.

B. 본 발명의 DNA 서열

본 명세서에 언급한 바와 같이, 본 발명의 한 양태는 TRELL 폴리펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열, 예를 들어 서열 번호 1 또는 3에 기재된 DNA 및/또는 이러한 핵산의 등가물을 포함하는 실질적으로 순수한(또는 재조합) 핵산에 관한 것이다. 본 명세서에서 사용한 용어 '핵산'은 예를 들어 기능적으로 등가의 펩티드를 암호화하는 서열과 같은 단편 및 등가물을 포함할 수 있다. 등가의 뉴클레오티드 서열은 대립유전자 변이체, 돌연변이 등과 같이 하나 이상의 뉴클레오티드 치환, 첨가 또는 결실에 의해 달라지는 서열을 포함하며, 유전자 암호의 축퇴로 인해 서열 번호 1 또는 3에 나타낸 TRELL을 암호화하는 뉴클레오티드 서열과는 다른 서열을 포함할 수 있다. 본 발명자들은 서열 번호 4에 나타낸 248개의 아미노산 서열을 보유하는 TRELL 폴리펩티드를 암호화하는 오픈 리딩 프레임을 함유하는 인간의 1936 bp DNA의 서열을 결정하였다.

본 발명자들은 본 명세서에 인간과 쥐의 서열을 기재하였으며, 본 명세서에는, 당업자라면 생쥐 서열이 본원에 포함되는 것으로 이해하겠지만, 일반적으로 인간 서열을 참고하여 기재하였다. TRELL의 놀라운 특징은 생쥐와 인간의 수용체 결합 도메인 간에 상당한 서열 보존성이 있는데, 이 수준은 Fas 리간드만이 근접하게 나타내는 정도이다. 쥐 및 인간 TRELL 단백질은 둘다 TNF 류의 모든 특성, 즉 타입 II 막 단백질 구성과 TNF 역평행 β 시이트 구조로 상기 단백질의 접힘에 관여하는 서열 모티프의 보존성을 갖고 있다.

mTRELL의 뉴클레오티드 서열은 서열 번호 1에 나타냈으며, mTRELL의 아미노산 서열은 서열 번호 2에 나타냈다. hTRELL의 DNA 및 아미노산 서열은 각각 서열 번호 3과 서열 번호 4에 나타냈다.

본 발명의 서열은 TRELL 또는 이의 단편 또는 유도체를 암호화하는 DNA 서열의 존재로 인해 천연 및 합성 DNA의 여러 가지 수집물을 선별하는데 유용한 일련의 DNA 프로브를 제조하는데 사용할 수 있다. 당업자는 본 명세서에 사용된 용어 'TRELL'이 생물학적으로 활성인 이의 유도체, 단편 또는 상동체도 역시 의미한다는 것을 잘 이해할 것이다.

본 발명의 TRELL를 암호화하는 DNA 서열은 이들 서열로 형질전환된 여러 가지 원핵 숙주 및 진핵 숙주에서 발현하여 TRELL 펩티드를 제조하는 데 사용할 수 있다. 이들 TRELL 펩티드는 항암 치료 분야 및 면역 조절 분야에 이용할 수도 있다. 일반적으로 이러한 분야에 대한 적용은 발현 조절 서열에 작동가능하게 연결된, TRELL을 암호화하는 서열을 함유하는 DNA 분자로 형질전환된 숙주를 배양하는 단계를 포함한다.

본 발명의 DNA 서열 및 재조합 DNA 분자는 다양한 숙주/벡터 조합을 이용하여 발현시킬 수 있다. 예를 들어, 유용한 벡터는 염색체, 비염색체 또는 합성 DNA 서열의 분절을 포함할 수 있다. 본 발명의 발현 벡터는 벡터 내에 삽입된 TRELL DNA 서열의 발현을 제어하고 조절하기 위해, 상기 DNA 서열에 작동가능하게 연결될 수 있는 하나 이상의 발현 조절 서열을 특징으로 한다.

또한, 각각의 발현 벡터에서 본 발명의 TRELL 서열을 삽입할 수 있는 부위는 다양하다. 이 부위들은 보편적으로 이 부위들을 절단하는 제한 엔도뉴클레아제로 표시되는데, 이 부위들과 엔도뉴클레아제는 당업자에게 공지되어 있다. 물론, 본 발명에 유용한 발현 벡터는 소정 DNA 단편의 삽입을 위한 임의의 제한 엔도뉴클레아제 부위를 보유할 필요는 없는 것으로 이해해야 한다. 대신에, 상기 벡터는 별법을 이용하여 단편으로 클로닝할 수 있다. 발현 벡터 및 특히 선택된 DNA 단편의 삽입을 위해 벡터 내부에 선택된 특정 부위 및 그의 발현 조절 서열에 대한 작동가능한 연결은 여러 가지 요인에 의해 결정된다. 이들 요인으로는 발현하려는 단백질의 크기, 소정 단백질의 숙주 세포 효소에 의한 단백질 분해에 대한 민감성, 특정 제한 효소에 민감한 부위의 수, 정제중에 제거되기 어려운 것으로 드러날 수 있는, 숙주 세포에 의해 발현된 단백질의 오염 또는 결합을 들 수 있으나, 이로 제한되는 것은 아니다. 고려할 수 있는 추가 요인으로는 벡터 서열에 상대적인 개시 및 종결 코돈의 위치와 같은 발현 특성을 들 수 있으며, 기타 요인은 당업자라면 인식할 수 있을 것이다. 벡터 및 청구한 DNA 서열의 삽입 위치는 이들 요인을 균형있게 고려하여 결정되는데, 모든 선택이 소정 분야에 동등·유효하게 적용되는 것은 아니다. 그러나, 특정 용도에 따라 이들 변수들을 분석하고 적합한 시스템을 선택하는 것은 당업자에게는 일반적인 일이다.

당업자는 발현 조절 서열에 용이하게 적합한 변경을 가하여 단백질의 발현 수준을 한층 더 높일 수 있다. 즉, 특정 유기체에 우선적으로 사용되는 특정 아미노산을 위한 코돈의 치환 또는 코돈의 선택과 같은 변경을 가하여 단백질 분해를 최소화하거나 글리코실화 조성을 변경시키는 것이다. 또한, 시스테인을 기타 아미노산으로 변경시켜 생성, 재접힘 또는 안정성 문제를 단순화할 수도 있다.

따라서, 모든 숙주/발현 벡터 조합이 본 발명의 DNA 서열을 발현하는데 동등한 효능을 발휘하는 것은 아니다. 그러나, 숙주/발현 벡터 조합의 특별한 선택은 당업자에 의해 충분히 이루어질 수 있다. 고려해야 되는 요인들은, 예를 들어 숙주 및 벡터의 상용성, DNA 서열에 의해 암호화되는 단백질의 숙주에 대한 독성, 소정 단백질의 회수 용이성, DNA 서열과 이 서열에 작동적으로 연결된 발현 조절 서열의 발현 특성, 생물학적 안정성, 비용 및 접힘, 형태 또는 소정 단백질의 기타 필요한 발현후 변경을 들 수 있다.

본 발명의 서열로 형질전환된 숙주에 의해 생성된 TRELL 및 이의 상동체 뿐만 아니라 본 발명의 방법으로 정제되거나, 청구된 아미노산 서열로부터 제조된 천연 TRELL은 항암 치료 분야 및 면역 조절 분야에 이용되는 다양한 조성물 및 방법에 유용하다. 또한, 이들은 기타 질병 치료 및 방법에도 유용하다.

또한, 본 발명은 비정상적인 조건, 즉 유전자 치료법 환경 하에서 TRELL을 발현하는 본 명세서에 개시된 DNA 서열의 용도에 관한 것이다. TRELL은 이러한 용도에 적합한 프로모터의 지시하에서 종양 세포 내에서 발현될 수 있다. 이러한 발현은 항암 면역 반응을 증강시키거나 종양의 생존에 직접 영향을 미친다. 또한, TRELL과 같은 시토킨은 국부 면역 반응을 변경시키므로써 장기 이식편의 생존에 영향을 미칠 수 있다. 이 경우, 이식편 자체 또는 주위 세포는 조작된 TRELL 유전자로 변경된다.

본 발명의 다른 관점은 '안티센스' 치료법에서 TRELL을 암호화하는 분리된 핵산의 용도에 관한 것이다. 본 명세서에서 사용한 용어 '안티센스' 치료법은 세포 조건 하에서 TRELL을 암호화하는 세포성 mRNA 및/또는 DNA와 특이적으로 하이브리드를 형성하므로써 암호화된 단백질의 발현을 억제, 즉 전사 및/또는 해독을 억제하는 올리고뉴클레오티드 또는 이의 유도체의 투여 또는 동일계내 생성을 의미한다. 결합은 통상적인 염기쌍 상보성에 의할 수도 있고, 또는 예를 들어 DNA 이본쇄로 결합하는 경우에는 이중 나선의 주 홈 내에서의 특이 상호작용에 의할 수도 있다. 일반적으로, '안티센스' 치료법은 당업계에서 사용되는 일련의 기법을 의미하며, 올리고뉴클레오티드 서열에 대한 특이 결합에 의존하는 임의의 치료법을 내포한다.

본 발명의 안티센스 구성물은 예를 들어 발현 플라스미드로서 전달될 수 있는데, 이 플라스미드는 세포 내에서 전사되는 경우 TRELL을 암호화하는 세포성 mRNA의 적어도 한 부분과 상보적인 RNA를 생성한다. 별법으로 안티센스 구성물은 생체외에서 생성되는 올리고뉴클레오티드 프로브일 수 있다. 이러한 올리고뉴클레오티드 프로브는 내인성 뉴클레아제에 대해 내성을 가진 변형된 올리고뉴클레오티드가 바람직하고, 이는 생체내에서 안정하다. 안티센스 올리고뉴클레오티드로서 사용하기 위한 예시적인 핵산 분자는 DNA의 포스포아미데이트, 포스포티오에이트 및 메틸포스포네이트 유사체이다(참조: 예를 들어, 5,176,996; 5,264,564; 및 5,256,775). 부가적으로, 안티센스 치료법에 유용한 올리고머를 구성하기 위한 일반적인 방법은 본 명세서에 참고로 인용한 문헌[참조: Van Der Krol 등, Biotechniques 6: 958-976 (1988); Stein 등, Cancer Res 48: 2659-2668 (1988)]에 기재되어 있다.

C. TRELL 및 그의 아미노산 서열

상기한 바와 같이, 본 발명의 종양 괴사 인자군 관련 단백질(TRELL)은 TNF군의 한 구성원이다. 이 단백질, 그의 단편 또는 상동체는 치료 및 진단 분야에서 광범위하게 이용된다.

TRELL은 많은 조직에서 TNF군의 구성원들 중에서 비교적 독특한 패턴으로 존재한다. TNF군의 구성원들은 세포 사멸과 생존의 조절 및 세포 분화에 관련되어 있기 때문에, TRELL도 여러 조직에서의 세포 생존, 분화 및 수복과 관련이 있을 가능성이 있다.

TRELL의 정확한 3차 구조는 밝혀지지 않았지만, TNF군의 한 구성원임을 고려하여 예상할 수 있는 것은 TRELL이 TNF류의 다른 구성원과 어떤 구조적 특성을 공유할 수 있다라는 것이다. 생쥐 및 인간 TRELL은 둘 다 본 명세서를 통해 개시하였다. 기존의 cDNA 서열로부터 유추할 수 있는 생쥐 TRELL은 아마도 타입 II 막 단백질을 위한 막 고정 도메인으로서 작용하는 21개 이상의 소수성 아미노산 영역을 포함한다. mTRELL의 아미노산 서열은 서열 번호 2에 나타낸다.

인간 TRELL은 N-말단 친수성 세포질 도메인, 약 27개 아미노산의 소수성 경막 타입 II 도메인 및 204개 아미노산의 세포외 도메인을 포함한다. hTRELL의 아미노산 서열은 서열 번호 4에 나타낸다.

도 1은 인간 및 생쥐 TRELL의 아미노산 서열을 비교한 도면이다.

52개 아미노산의 N-말단 영역은 cDNA 클론내의 오픈 리딩 프레임으로부터 예상할 수 있지만, 정확한 개시 메티오닌은 예상할 수 없다. Met-36은 이상적인 콘센서스 Kozak 서열을 보유하기 때문에 바람직한 개시 코돈이 될 수 있다. TRELL 서열과 인간 TNF군의 다른 구성원과의 비교 결과 상당한 구조적 유사성을 확인하였다. 예를 들어, 도 2A와 도 2B에서 확인할 수 있는 바와 같이 모든 단백질은 타입 II 막 단백질과 닮았으며, 세포외 도메인에서 몇몇 서열 보존 영역을 공유하였다. 서열 상단에 막대로 표시한 영역은 TNF와 LTα의 β가닥 구성에 관련된 이들 분자 내의 서열을 의미한다. 추정적인 N-연결된 글리코실화 부위는 밑줄로 표시하였다. 별표(*)는 TNF 내에서 이황화 결합에 관련된 시스테인을 나타낸다. 보존된 도메인은 서브유닛간의 상호작용 및 시이트 구성에 관련되는 것으로 보인다.

EST 조사 결과 생쥐 TRELL과 매우 상동성인 345개의 염기로 구성된 인간 클론이 있음을 확인하였다. 인간 TRELL 아미노산 서열은 서열 번호 4에 나타냈다. EST에 의해 암호화된 오픈 리딩 프레임은 이 서열을 TNF군 리간드의 한 구성원으로 특정화하는 것이 가능한 서열 모티프, 예를 들어 기존의 데이타 베이스에서 TRAIL EST를 확인하기 위해 Wiley 등이 사용한 모티프를 함유하고 있지 않다.

본 발명의 신규 폴리펩티드는 아직 확인되지 않은 수용체와 특이적으로 상호작용한다. 그러나, 본 명세서에 개시한 펩티드와 방법은 TRELL 또는 이의 단편과 특이적으로 상호작용하는 수용체의 확인을 가능하게 한다.

특정 구체예로서 청구된 발명은 TRELL 수용체와 결합하는 능력을 보유하는 TRELL로부터 유도된 펩티드를 포함한다. TRELL의 단편은 몇가지 방법, 예를 들어 재조합, PCR, 단백질 분해 또는 화학 합성에 의해 제조할 수 있다. 폴리펩티드의 내부 또는 말단 단편은 상기 폴리펩티드를 암호화하는 핵산의 한 단부 또는 양 단부로부터 하나 이상의 뉴클레오티드를 제거하므로써 생성할 수 있다. 돌연변이 유발된 DNA를 발현시키면 폴리펩티드 단편이 생성된다. 따라서, '말단-니블링(end-nibbling)' 엔도뉴클레아제를 이용한 분해는 다양한 단편을 암호화하는 DNA를 생성할 수 있다. 또한, 단백질의 단편을 암호화하는 DNA는 무작위 절단, 제한 분해 또는 상기한 방법을 병용하여 생성시킬 수 있다.

또한, 폴리펩티드 단편은, 예를 들어 통상의 메리필드 고상법의 f-moc 또는 t-boc 화학과 같은 당업계에 공지된 방법으로 화학 합성할 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 펩티드와 DNA 서열은 단편의 중첩없이 소정의 길이로 자의적으로 절단하거나 소정 길이의 중첩 단편으로 절달할 수 있다. 이하 이들 방법을 상술한다.

D. 가용성 TRELL의 생성

이 리간드의 가용성 형태는 종종 효과적으로 신호 작용을 나타낼 수 있기 때문에 천연 막 형태를 모방하는 약물로서 투여할 수 있다. TRELL은 천연적으로 가용성 시토킨으로 분비되나, 그렇지 않은 경우 유전자를 재조작하여 분비형으로 만드는 것도 가능하다. TRELL의 가용성 분비 형태를 생성하기 위해, N-말단 경막 영역과 줄기(stalk) 영역의 일정 부분을 DNA 수준에서 제거하고, 이들은 선택된 발현 계에서 효율적인 단백분해 절단이 가능한 타입 I 리더 서열 또는 그외에 타입 II 리더 서열로 대체한다. 당업자는 분비 발현 구성물 내에 보유되는 줄기 영역의 양을 변화시키므로써 수용체 결합 특성과 분비 효율 둘다를 최적화할 수 있다. 예를 들어, 모든 가능한 줄기 길이를 보유하는 구성물, 즉 N-말단이 절두(truncation)된 구성물을 제작하여 아미노산 81 내지 139에서 출발하는 단백질을 생성할 수 있다. 최적 길이의 줄기 서열은 이러한 유형의 분석법으로 얻을 수 있다.

E. TRELL와 반응하는 항체의 제조

본 발명은 또한 TRELL 또는 그의 수용체와 특이적으로 반응하는 항체에 관한 것이다. 항단백질/항펩티드 항혈청 또는 모노클로날 항체는 표준 방법[참조: Antibodies: A Laboratory Manual ed. Harlow and Lane(Cold Spring Harbor Press: 1988)]으로 제조할 수 있다. 생쥐, 햄스터 또는 토끼와 같은 포유류는 상기 펩티드의 면역원성 형태를 이용하여 면역화할 수 있다. 단백질 또는 펩티드에게 면역원성을 부여하는 기법은 담체접합법 또는 당업계에 공지된 다른 방법을 이용할 수 있다.

TRELL 또는 그의 수용체의 면역원성 부분은 보조제와 함께 투여할 수 있다. 면역화의 진전은 혈장 또는 혈청의 항체 역가를 검출하므로써 모니터링할 수 있다. 항체의 수준을 평가하기 위해 항원으로 면역원을 이용하는 표준 ELISA 또는 기타 면역 분석법을 사용할 수 있다.

바람직한 구체예에서, 환자 항체는 TRELL 또는 그의 수용체의 항원 결정기, 예를 들어 서열 번호 2 또는 4의 폴리펩티드의 항원 결정기 또는 밀접하게 관련된 인간 또는 비인간 포유류 상동체(예를 들어, 70, 80 또는 90% 상동성, 바람직하게는 95% 이상의 상동성)에 면역특이성이 있다. 본 발명의 다른 바람직한 구체예에서, 항TRELL 또는 항TRELL-수용체 항체는 예를 들어 서열 번호 2 또는 4와 80% 미만, 바람직하게는 90% 미만, 가장 바람직하게는 95% 미만의 상동성을 갖는 단백질과 실질적으로 교차 반응(즉, 특이적으로 반응)하지 않는다. 상기한 '실질적으로 교차 반응하지 않는다'라는 어구의 의미는 항체가 갖는 비상동성 단백질에 대한 결합 친화도가 서열 번호 2 또는 4의 단백질에 대한 결합 친화도의 10% 미만, 더 바람직하게는 5% 미만, 더욱 더 바람직하게는 1% 미만임을 의미하는 것이다.

본 명세서에서 사용한 '항체'라는 용어는 TRELL 또는 TRELL-수용체와 특이적으로 반응하는 이의 단편도 포함하는 의미이다. 항체는 통상적인 기법으로 단편화할 수 있으며, 단편은 유용성을 위해 전체 항체에 대해 상기한 방법과 동일한 방법으로 선별한다. 예를 들어, F(ab')₂단편은 항체를 펩신 처리하여 생성할 수 있다. 생성된 F(ab')₂단편은 이황화 가교를 환원시키는 처리를 수행하여 Fab' 단편을 생성할 수 있다. 또한, 본 발명의 항체는 항TRELL 또는 항TRELL-수용체 활성을 보유하는 생물특이성 및 키메라 분자도 내포하는 의미로 사용된다. 따라서, 모노클로날 및 폴리클로날 항체(Ab)는 TRELL 또는 그의 수용체에 대해 유도되며, Fab'와 F(ab')₂와 같은 항체 단편을 이용하여 TRELL 및 그의 수용체의 작용을 차단할 수 있다.

또한, 표준 재조합 DNA 기법[참조: Winter 및 Milstein, Nature 349: 293-299 (1991); 본 명세서에 참고 인용함]을 이용하여 여러 가지 형태의 항체를 제조할 수 있다. 예를 들어, 키메라 항체는 동물 항체로부터 취한 항원 결합 도메인을 인간 불변 도메인에 연결시켜 구성할 수 있다(참조: Cabilly 등, US 4,816,567; 본 명세서에 참고 인용함). 키메라 항체는 인간 임상 치료에 사용하는 경우 동물 항체에 의해 유발되는 관찰된 면역원성 반응을 감소시킬 수 있다.

또한, TRELL 또는 그의 수용체를 인식하는 재조합 '인체화 항체' 를 합성할 수 있다. 인체화 항체는 거의 인간 IgG 서열을 포함하는 키메라이며, 그 내부에 특정 항원 결합을 담당하는 영역이 삽입되어 있다. 동물을 소정의 항원을 이용하여 면역화하고, 상응하는 항체를 분리한 뒤, 특정 항원 결합을 담당하는 가변 영역 서열의 부분을 제거한다. 이어서, 동물 유래의 항원 결합 영역을 항원 결합 영역이 결실된 인간 항체 유전자의 적합한 부위 내로 클로닝한다. 인체화 항체는 인간 항체에 이종(즉, 종 사이) 서열의 이용을 최소화하면 치료 환자에서 면역 반응을 덜 유발시킬 것이다.

또한, 상이한 부류의 재조합 항체의 구성은 상이한 부류의 면역글로불린으로부터 분리한 가변 도메인과 인간 불변 도메인(CH1, CH2, CH3)을 포함하는 키메라 또는 인체화 항체를 제조하므로써 수행할 수 있다. 예를 들어, 증가된 항원 결합 부위 결합가(valencies)를 갖는 항체는 항원 결합 부위를 인간:쇄 불변 영역을 보유하는 벡터 내로 클로닝하므로써 재조합적으로 제조할 수 있다[참조: Arulanandam 등, J. Exp. Med. 177: 1439-1450 (1993); 본 명세서에 참고로 인용함].

또한, 표준 재조합 DNA 기법을 이용하여 항원 결합 부위 주변의 아미노산 잔기를 변경시키므로써 재조합 항체와 그들이 항원간의 결합 친화성을 변경시킬 수 있다. 인체화 항체의 항원 결합 친화성은 분자 모델링에 기초한 돌연변이유발로 증가시킬 수 있다[참조: Queen 등, Proc. Natl. Acad. Sci. 86: 10029-33 (1989); 본 명세서에 참고로 인용함].

F. 유사체의 생성: 변형된 DNA 및 펩티드 서열의 제조

TRELL의 유사체와 자연 발생하는 TRELL과는 아미노산 서열 또는 서열 이외의 다른 관점 또는 상기한 두 관점의 측면에서 상이할 수 있다. 서열이외의 변형은 생체내 또는 시험관내에서 TRELL을 화학적 유도체화하는 것을 포함한다. 서열이외의 변형은 아세틸화, 메틸화, 포스포릴화, 카르복실화 또는 글리코실화 변화를 포함하나, 이로 제한되는 것은 아니다.

바람직한 유사체에는 하나 이상의 보존적 아미노산 치환 또는 TRELL의 활성을 파괴하지 않는 하나 이상의 비보존적 아미노산 치환, 결실 또는 삽입에 의해 서열 번호 2 또는 4에 부여된 서열과는 상이한 서열을 보유하는 TRELL 또는 이의 생물학적으로 활성인 단편을 포함한다. 보존적 치환으로는 전형적으로 한 아미노산의 유사한 특성을 가진 다른 아미노산으로의 치환, 예를 들어 하기 군 내에서의 치환을 포함한다: 발린, 글리신; 글리신, 알라닌; 발린, 이소로이신, 로이신; 아스파르트산, 글루탐산; 아스파라긴, 글루타민; 세린, 트레오닌; 리신, 아르기닌; 및 페닐알라닌, 티로신.

보존적 아미노산 치환

아미노산	코드	치환 아미노산
알라닌	A	D-Ala, Gly, 베타-Ala, L-Cys, D-Cys
아르기닌	R	D-Arg, Lys, D-Lys, 호모-Arg, D-호모-Arg, Met, Ile, D-Met, D-Ile, Orn, D-Orn
아스파라긴	N	D-Asn, Asp, D-Asp, Glu, D-Glu, Gln, D-Gln
아스파르트산	D	D-Asp, D-Asn, Asn, Glu, D-Glu, Gln, D-Gln
시스테인	C	D-Cys, S-Me-Cys, Met, D-Met, Thr, D-Thr
글루타민	Q	D-Gln, Asn, D-Asn, Glu, D-Glu, Asp, D-Asp
글루탐산	E	D-Glu, D-Asp, Asp, Asn, D-Asn, Gln, D-Gln
글리신	G	Ala, D-Ala, Pro, D-Pro, Ala, Acp
이소로이신	I	D-Ile, Val, D-Val, Leu, D-Leu, Met, D-Met
로이신	L	D-Leu, Val, D-Val, Leu, D-Leu, Met, D-Met
리신	K	D-Lys, Arg, D-Arg, 호모-arg, D-호모-Arg, Met, D-Met, Ile, D-Ile, Orn, D-Orn
메티오닌	M	D-Met, S-Me-Cys, Ile, D-Ile, Leu, D-Leu, Val, D-Val
페닐알라닌	F	D-Phe, Tyr, D-Thr, L-Dopa, His, D-His, Trp, D-Trp, 트란스-3,4 또는 5-페닐프롤린, 시스-3,4 또는 5-페닐프롤린
프롤린	P	D-Pro, L-I-토아졸리딘-4-카르복실산, D- 또는 L-1-옥사졸리딘-4-카르복실산
세린	S	D-Ser, Thr, D-Thr, 알로-Thr, Met, D-Met, Met(O), D-Met(O), D-Met(O), L-Cys, D-Cys
트레오닌	T	D-Thr, Ser, D-Ser, 알로-Thr, Met, D-Met, Met(O), D-Met(O), Val, D-Val
티로신	Y	D-Tyr, Phe, D-Phe, L-Dopa, His, D-His
발린	V	D-Val, Leu, D-Leu, Ile, D-Ile, Met, D-Met

돌연변이유발의 유용한 방법으로는 하기 보다 구체적으로 기재되는 PCR 돌연변이유발법 및 포화 돌연변이유발법을 포함한다. 또한, 일군의 축퇴성 올리고뉴클레오티드 서열을 합성하면 무작위 아미노산 서열 변이체의 라이브러리를 작제할 수도 있다.

PCR 돌연변이유발법

PCR 돌연변이유발법에서는 클로닝된 DNA 단편에 무작위 돌연변이를 형성시키기 위하여 Taq 폴리머라제의 충실도를 감소시큰 방법을 사용할 수 있다(Leung et al., 1989, Technique, 1:11-15). 이 방법은 무작위 돌연변이를 만들 수 있는 매우 강력하고 비교적 신속한 방법이다. 돌연변이될 DNA 영역은 폴리머라제 연쇄 반응(PCR)을 사용하여 Taq DNA 폴리머라제에 의한 DNA 합성의 충실도를 감소시키는 조건, 예컨대 dGTP/dATP의 비를 5로 하고 PCR 반응액에 Mn²⁺를 첨가하여 증폭시킬 수 있다. 이와 같이 증폭된 DNA 단편의 수집물을 적절한 클로닝 벡터 중으로 삽입하면 무작위 돌연변이 라이브러리를 얻을 수 있다.

포화 돌연변이유발법

포화 돌연변이유발법은 클로닝된 DNA 단편 중에 단독 염기 치환을 신속하게 다수 도입시킬 수 있다(Mayers et al., 1985, Science 229:242). 이 기법은 예컨대 시험관내에서 일본쇄 DNA를 화학 처리하거나 방사선 조사한 뒤, 상보성 DNA 가닥을 합성하여 돌연변이를 생성시키는 것을 포함한다. 돌연변이 빈도는 처리 정도를 조정하여 조절할 수 있으며, 사실상 모든 염기를 치환시키는 것도 가능하다. 이 절차는 돌연변이 단편에 대한 유전자를 선택할 필요가 없기 때문에, DNA를 무작위 돌연변이유발시켜 중성 치환 뿐만 아니라 단백질의 중성 치환을 실시할 수 있으며, 이 중에서 기능을 변화시키는 것을 얻을 수 있다. 점 돌연변이는 보존적 서열 인자들에만 편중하여 분포되지 않는다.

축퇴성 올리고뉴클레오티드

일군의 축퇴성 올리고뉴클레오티드 서열로부터 상동체 라이브러리를 제조할 수 있다. 축퇴성 서열은 자동 DNA 합성기를 사용하여 화학적 합성할 수 있고, 이와 같이 합성된 유전자는 적절한 발현 벡터에 결찰시킨다. 축퇴성 올리고뉴클레오티드의 합성은 당해 기술 분야에 공지되어 있다³¹. 이 기법은 기타 다른 단백질의 지시성 생성에도 이용된다.

비무작위 또는 지시성 돌연변이유발 기법은 특정 서열을 제조하거나 특정 영역에 돌연변이를 제공하는데 사용할 수 있다. 이 기법은 예컨대 단백질의 공지된 아미노산 서열 중, 예컨대 잔기의 결실, 삽입 또는 치환을 포함하는 변이체를 제조하는데 사용할 수 있다. 돌연변이 부위는 예컨대 (1) 제1 아미노산을 보존적 아미노산으로 치환시키고, 그 다음 얻어지는 결과에 따라 보다 적합한 라디칼로 치환시키는 방법, (2) 표적 잔기를 결실시키는 방법, 또는 (3) 소정 부위의 인접 부위에 동일하거나 다른 부류의 잔기를 삽입하는 방법, 또는 이 3가지 방법 중 임의의 조합 방법을 사용하여 개별적으로 또는 연속적으로 변화시킬 수 있다.

알라닌 스캐닝 돌연변이유발법

알라닌 스캐닝 돌연변이유발법은 돌연변이유발의 바람직한 위치 또는 도메인으로서, 목적 단백질의 특정 잔기 또는 영역을 확인할 수 있는 유용한 방법이다[Cunningham and Wells(Science 244:1081-1085, 1989), 참고문헌에 상세히 기재됨]. 알라닌 스캐닝에서는 먼저 표적 잔기 또는 표적 잔기 그룹(예, Arg, Asp, His, Lys 및 Glu과 같은 하전을 띤 잔기)를 일단 확인한 뒤, 중성 아미노산이나 음하전을 띤 아미노산(가장 바람직하게는 알라닌 또는 폴리알라닌)으로 치환시킨다. 아미노산 치환은 세포 내외의 주위 수성 환경과 아미노산들의 상호작용에 영향을 미칠 수 있다. 그 다음 치환 부위에 기타 다른 변이체를 도입하거나 변이체를 추가 도입시켜 치환시 기능적 민감성을 나타내는 도메인을 확인할 수 있다. 이와 같이 하여, 아미노산 서열 변이를 도입시킬 부위는 미리결정할 필요가 있지만, 돌연변이 자체의 성질은 미리결정할 필요가 없다. 예컨대, 소정의 부위에 제공된 돌연변이가 최적의 작용을 나타내도록 하기 위하여 표적 코돈이나 영역에 알라닌 스캐닝이나 무작위 돌연변이유발을 실시할 수 있으며, 그 발현물 중에서 목적 활성의 최적 조합을 나타내는 바람직한 단백질 서브유니트 변이체를 선별한다.

올리고뉴클레오티드 매개 돌연변이유발법

올리고뉴클레오티드 매개 돌연변이유발법은 DNA의 치환, 결실 및 삽입 변이체를 제조하는 유용한 방법이다[예컨대, Adelman et al., (DNA 2:183, 1983), 본 발명에 참고 인용됨]. 간단히 설명하면, 돌연변이를 암호하는 올리고뉴클레오티드를 DNA 주형에 하이브리드화하여 목적 DNA를 변이시킬 수 있는데, 여기에서 주형은 목적 단백질에 대한 비변형 또는 천연 DNA 서열을 포함하는 플라스미드 또는 박테리오파지의 일본쇄 형태이다. 하이브리드화후, DNA 폴리머라제를 사용하여 주형의 제2 상보성 가닥 전체를 합성한다. 이 가닥에는 상기 올리고뉴클레오티드 프라이머가 병입되어 있을 것이고, 목적 단백질의 DNA에는 소정의 변화가 암호되어 있을 것이다. 일반적으로, 뉴클레오티드 길이가 25개 이상인 올리고뉴클레오티드를 사용한다. 올리고뉴클레오티드는 돌연변이를 암호하는 뉴클레오티드 중 어느 한쪽의 주형에 대하여 완전하게 상보적인 12개 내지 15개 뉴클레오티드를 가진 것이 가장 적합하다. 그 이유는 이와 같은 길이의 올리고뉴클레오티드가 일본쇄 DNA 주형 분자에 적절하게 하이브리드할 수 있기 때문이다. 이와 같은 올리고뉴클레오티드는 예컨대 본 발명에 참고 인용된 문헌[Crea et al., Proc.Natl.Acad.Sci. USA, 75:5765(1978)]에 기재된 바와 같이 당해 기술 분야에 알려진 기법을 사용하여 쉽게 합성할 수 있다.

카세트 돌연변이유발법

변이체를 제조하는 또 다른 방법인, 카세트 돌연변이유발법은 본 발명에 참고 인용된 문헌[Wells et al., Gene, 34:315(1985)]에 기재된 기법을 토대로 한 것이다. 출발 물질은 돌연변이될 단백질 서브유니트 DNA를 함유하는 플라스미드(또는 기타 다른 벡터)일 수 있다. 먼저, 돌연변이될 단백질 서브유니트 DNA 중의 코돈을 확인한다. 이와 같이 확인된 돌연변이 부위의 양쪽에는 각각 고유한 제한 효소 부위가 있어야 한다. 이와 같은 제한 부위가 없다면 전술한 올리고뉴클레오티드 매개의 돌연변이유발법을 사용하여 목적 단백질 서브유니트 DNA 중의 적절한 부위에 제한 효소 부위를 도입시킬 수 있다. 이와 같이 제한 효소 부위가 플라스미드 중에 도입되면 그 플라스미드의 제한 효소 부위를 절단하여 플라스미드를 선형화한다. 또한, 제한 효소 부위 사이의 DNA 서열을 암호하되 목적 돌연변이를 함유하는 이본쇄 올리고뉴클레오티드는 표준 방법을 사용하여 합성한다. 즉, 각각 두 가닥을 합성하고, 그 다음 표준 기법을 사용하여 함께 하이브리드한다. 이와 같이 제조된 이본쇄 올리고뉴클레오티드를 카세트라고 한다. 이 카세트는 선형화된 플라스미드의 말단에 상응하는 3' 말단 및 5' 말단을 갖도록 디자인하면 상기 플라스미드에 직접 결찰시킬 수 있다. 이와 같은 플라스미드는 돌연변이된 목적 단백질 서브유니트 DNA 서열을 함유한다.

조합형 돌연변이유발법

조합형 돌연변이유발법 역시 돌연변이를 형성시키는데 사용할 수 있다. 예컨대, 먼저 일군의 상동체 단백질이나 기타 다른 관련 단백질들의 아미노산 서열을 가능한한 최고의 상동성을 나타내도록 정렬하는 것이 좋다. 정렬된 서열 중 일정 위치에 나타나는 아미노산을 모두 선택하여 축퇴성 조합형 서열 군을 만들 수 있다. 핵산 수준에서의 조합형 돌연변이유발법은 다양한 변이체 라이브러리를 만들고, 이것을 암호하는 다양한 유전자 라이브러리를 만든다. 예컨대, 합성 올리고뉴클레오티드 혼합물을 유전자 서열에 효소적으로 결찰시켜 가능한 축퇴성 서열 군을 개개의 펩티드 또는 축퇴성 서열 군을 포함하는 큰 융합 단백질 군으로 발현시킬 수 있다.

이와 같이 생성된 돌연변이 유전자 생성물을 선별하는 방법은 당해 기술 분야에 널리 알려져 있다. 다수의 유전자 라이브러리를 선별하는 방법은 유전자 라이브러리를 복제성 발현 벡터에 클로닝하는 단계, 생성된 벡터 라이브러리로 적절한 세포를 형질전환시키는 단계 및 목적 활성, 예컨대 이 경우에는 TRELL이나 이의 수용체에 결합하는 성질의 검출이 비교적 용이하여, 검출된 생성물의 유전자를 암호하는 벡터를 용이하게 분리할 수 있는 조건하에서 유전자를 발현시키는 단계를 포함한다. 하기 기재되는 각 기법은 예컨대 무작위 돌연변이유발 기법을 통해 생성된 다수의 서열을 선별하는 높은 생성율의 분석법을 제공한다.

본 발명은 목적 TRELL 폴리펩티드 또는 이들의 수용체 중에서 단백질 결합 도메인을 감소시켜 유사체, 예컨대 펩티드제 또는 비펩티드제를 생성하는 방법을 제공한다. 이 펩티드 유사체는 TRELL과 이의 수용체의 결합을 방해할 수 있다. 또한, 수용체 폴리펩티드 또는 다운스트림의 세포내 단백질을 분자적 인식하는데 관계하는 TRELL의 주요 잔기를 결정하면 수용체와 TRELL의 결합을 경쟁적 또는 비경쟁적으로 억제하는 TRELL 또는 이의 수용체 유래의 펩티도유사체를 만들 수 있다[예컨대, "Peptide inhibitors of human papilloma virus protein binding to retinoblastoma gene protein" 유럽 특허 출원 EP-412,762A 및 EP-B31,080A, 본 명세서에 구체적으로 참고 인용됨].

G. 약학 조성물

본 발명은 유용한 재조합 TRELL 정제물을 제조하므로써, 일반 세포 기능, 이 경우에는 TRELL이나 이의 수용체에 대한 작동물질이나 길항물질인 후보 약물을 선별하는데 사용할 수 있는 분석법을 제공한다. 일 양태로서, 이 분석법은 TRELL과 이것의 수용체 간의 결합을 조절하는 화합물의 활성을 평가할 수 있다. 다양한 형식의 분석법이 이용가능하며, 당업자라면 본 발명을 통해 충분히 이해할 수 있을 것이다.

화합물 및 천연 추출물의 라이브러리를 시험하는 많은 약물 선별 프로그램에서, 소정 시간내에 조사되는 화합물의 수를 최대화하기 위해서는 높은 작업률의 분석법이 바람직하다. 보통, "1차" 선별법으로는 정제 단백질 또는 반정제된 단백질을 사용하여 실시할 수 있는 무세포계 분석법이 바람직한데, 그 이유는 이 분석법이 분자 표적 중에 시험 화합물에 의해 매개된 변화를 신속하게 발생시켜 비교적 용이하게 검출할 수 있기 때문이다. 더욱이, 이와 같은 시험관내 반응계에서는 시험 화합물의 세포 독성 및/또는 생체이용률의 영향이 무시되는 것이 일반적이고, 그 대신 분자 표적의 효소적 성질 변화 또는 기타 다른 단백질과의 결합 친화성의 변화로 명백히 알 수 있는 바와 같은 분자 표적에 대한 약물의 효과에 주로 촛점을 두고 있다.

본 발명의 약학 조성물은 TRELL이나 TRELL 수용체, 또는 이의 단편이나 유사체의 치료적 유효량 및 선택적으로 약학적 허용성 담체를 포함할 수 있다. 따라서, 본 발명은 본 발명에 따른 화합물이나 이의 약학적 허용성 염 또는 유도체를 약학적 유효량으로 투여하는, 종양 치료 방법 및 면역계 또는 이의 일부를 자극 또는 특정 경우에는 억제하는 방법을 제공한다. 물론, 본 발명의 조성물 및 방법은 각종 치료시의 다른 치료법과 함께 사용할 수 있음은 당연한 것이다.

본 발명의 조성물은 각종 투여 형태, 예컨대 전신용, 국소용 또는 국부 투여용으로 조제할 수 있다. 전신 투여용인 경우에는 주사액, 예컨대, 근육내, 정맥내, 복막내 및 경피 주사액이 바람직하며, 이 때 본 발명의 조성물은 액체 용액, 바람직하게는 행크스액이나 링거액과 같은 생리적 상용성 완충액으로 조제할 수 있다. 또한, 본 발명의 조성물은 고형으로 조제할 수 있으며, 선택적으로 사용하기 전에 바로 재용해하거나 현탁시켜 사용할 수 있다. 또한, 동결건조 형태도 본 발명에 포함된다.

본 발명의 조성물은 경구, 경점막 또는 경피 수단으로 투여할 수 있다. 경점막 또는 경피 투여시에는 투과될 장벽에 적당한 침투제를 조성물에 첨가하는 것이 좋다. 이와 같은 침투제는 당업계에 공지되어 있으며, 예컨대 경점막용으로는 담즙염, 푸시드산 유도체 및 계면활성제를 포함한다. 경점막 투여는 비측 분무 또는 좌제로 실시할 수 있다. 경구 투여시, 본 발명의 조성물은 캅셀, 정제 및 토닉과 같은 통상적인 경구 투여 형태로 조제한다. 국소 투여시, 본 발명의 조성물은 당해 기술 분야에 공지된 바와 같은 연고, 고약, 젤 또는 크림으로 조제한다.

본 발명의 조성물은 단위 투여 형태인 것이 바람직하고, 1일 1회 이상으로 투여될 수 있다. 1회 또는 치료 기간 동안 투여되는 활성 화합물의 양은 많은 요인에 따라 달라진다. 예컨대, 검체의 연령, 키, 치료 질환의 정도와 진행 과정, 투여 방법 및 형태, 주치의의 판단에 따라 달라진다. 하지만, 유효량은 약 0.005 내지 약 5 ㎎/㎏/일 범위, 바람직하게는 약 0.05 내지 약 0.5 ㎎/㎏/일 범위이다. 또한, 이보다 낮거나 높은 투여량도 사용할 수 있다는 것은 당업자라면 잘 알고 있을 것이다.

또한, 본 발명에 따른 유전자 작제물은 TRELL 폴리펩티드의 길항물 또는 작동물 형태를 암호하는 핵산을 전달하는 유전자 치료법의 일부분으로 사용할 수 있다.

TRELL의 발현 작제물은 임의의 생물학적 유효 담체를 통해, 예컨대 TRELL에 대한 유전자를 생체내 세포로 효과적으로 전달할 수 있는 모든 배합물이나 조성물로 투여할 수 있다. 전달 방법으로는 세포를 직접 형질감염시킬 수 있는 바이러스 벡터, 또는 예컨대 리포좀이나 세포내 운반체를 이용하는 전달용 플라스미드 DNA 중에 유전자를 삽입하는 방법 뿐만 아니라 유전자 작제물을 직접 주입하는 방법도 포함한다. 이 중에서도 바이러스 벡터 전이 방법이 바람직하다.

유전자 치료용 작제물의 약학적 제제는 허용성 희석제 중에 함유된 유전자 전달계를 주로 포함하거나 또는 유전자 전달 부형제를 매립시킨 서방형 매트릭스를 포함할 수 있다. 그 외에도, 완전한 유전자 전달계(예컨대, 레트로바이러스 벡터)를 재조합 세포로부터 손상없이 생성할 수 있다면 이것의 약학적 제제는 유전자 전달계를 생성하는 1종 이상의 세포를 포함할 수 있다.

치료적 용도외에도, 본 발명에 기재된 올리고머는 진단 시약으로 사용되어, 이 올리고머가 특이적으로 결합하는 표적 DNA, RNA 또는 아미노산 서열의 존재 또는 부재를 조사할 수 있다. 다른 양태로서, 본 발명은 TRELL 폴리펩티드 또는 이의 단편과 상호작용, 예컨대 결합하거나 물리적으로 화합하는 성질을 통해 화학 존재물을 판단하는 방법에 사용할 수 있다. 이 방법은 화학 존재물과 TRELL 폴리펩티드를 접촉시키는 단계 및 상기 존재물이 TRELL과 상호작용하는 활성을 평가하는 단계를 포함한다. 또한, 본 발명의 TRELL은 천연적으로 발생된 TRELL의 리간드 또는 수용체를 평가하는 방법 및 TRELL 수용체와 화합하거나 결합하는 화학 존재물을 평가하는 방법에 사용할 수 있다.

또 다른 양태로서, 본 발명은 TRELL과 이것의 수용체 간에 형성되는 상호작용을 조절하는 성질을 가진 화학 존재물을 평가하는 방법을 제공한다. 이 방법은 TRELL 수용체와 TRELL을 이들이 상호작용할 수 있는 조건하에서 혼합하는 단계, 평가할 화학 존재물을 첨가하는 단계 및 복합체 형성이나 복합체 해리를 측정하는 단계를 포함한다. 이와 같은 조절제는 예컨대 무세포계에서 활성을 시험하여 시험관내에서 평가한 뒤, 그 다음 선택적으로 세포나 동물에 그 화합물을 투여하여 그 효과를 더 측정할 수 있다.

따라서, 본 발명은 관련 기술 분야의 제한 및 단점으로 인한 하나 이상의 문제를 실질적으로 해결하는 TRELL로 불리는 종양 괴사 인자 관련 리간드인 폴리펩티드에 관한 것이다. 본원 발명자는 TNF 군의 시토킨의 새로운 구성원을 발견하였고, 그 단백질의 인간 및 쥐의 아미노산 서열 뿐만 아니라, 이들 단백질을 암호화하는 DNA 서열을 규명하였다. 본 발명을 사용하여 아래에서 보다 상세히 언급하는 다수의 질병 및 상태에 대한 새로운 진단 방법 및 치료 방법을 밝힐 수 있을 뿐만 아니라, 면역계와 면역과정에 대한 정보를 얻어 그를 조작할 수 있다. 또한, 본 발명은 암에서의 세포 사멸의 유도에 관여한다.

본 발명의 추가의 특징 및 장점은 후술하는 설명에서 제시하며, 부분적으로는 그 설명으로부터 나타나거나 또는 본 발명의 실시에 의해 이해할 수 있다. 본 발명의 목적 및 기타 장점은 상세한 설명 및 특허청구범위와 첨부 도면에서 구체적으로 제시한 조성물 및 방법에 의해 실현되고 얻어질 것이다.

따라서, 상기 장점 및 기타 장점을 얻기 위해, 그리고 본원에서 구체화되고 광범위하게 기재된 본 발명의 목적에 따라, 본 발명은 TRELL을 암호화하는 DNA 서열을 포함한다. 생쥐 TRELL(mTRELL)의 뉴클레오티드 서열은 서열번호 1에 그리고 인간의 TRELL(hTRELL)의 뉴클레오티드 서열은 서열번호 3에 제시되어 있다. 구체적으로, 본 발명은 서열번호 2(mTRELL) 또는 서열번호 4(hTRELL)에서 확인되는 아미노산 서열을 가진 TRELL을 암호화하는 DNA 서열에 관한 것이다. 다른 양태로, 본 발명은 TRELL의 C 말단 수용체 결합 도메인을 암호화하는 DNA와 50% 이상의 상동성이 있고, 본 발명의 DNA 서열 또는 그 단편에 하이브리드화하며, 서열번호 4 또는 서열번호 2에 확인되는 서열을 가진 TRELL을 암호화하는 서열에 관한 것이다.

특정 양태로 본 발명은 발현 제어 서열에 작동 가능하게 연결되어 있고 TRELL을 암호화하는 DNA 서열에 관한 것이다. 임의의 적합한 발현 제어 서열이 본 발명에 유용하며, 당업자라면 용이하게 선택할 수 있다.

본 발명은 또한 TRELL을 암호화하는 서열 또는 그 단편을 포함하는 재조합 DNA 뿐만 아니라, 그 게놈내로 도입되어 안정하게 통합된 TRELL 서열을 가지거나 또는 에피좀 요소를 보유한 숙주를 포함한다. 적합한 임의의 숙주를 본 발명에 이용할 수 있고, 당업자라면 과도한 실험 없이 용이하게 선택할 수 있다.

또 다른 양태로, 본 발명은 형질전환된 숙주를 배양하는 단계를 포함하는 실질적으로 순수한 TRELL 및 통상 관련된 동물 단백질이 본질적으로 없는 TRELL을 제조하는 방법에 관한 것이다.

본 발명은 서열번호 4 또는 서열번호 2에서 확인되는 아미노산 서열을 가진 TRELL 뿐만 아리라 그 단편 또는 상동체를 포함한다. 다양한 양태로, TRELL의 아미노산 서열 및/또는 DNA 서열은 아래에 추가로 명시되는 것과 같은 보존적 삽입, 결실 및 치환을 포함하거나 또는 상기 서열들의 단편을 포함할 수 있다.

본 발명은 또 다른 양태로 TRELL이 매개하는 약리학적 현상을 직접 자극하는 데 사용될 수 있는 가용성의 TRELL 구성체에 관한 것이다. 그러한 현상은 암의 치료 또는 면역학적 질병을 치료하기 위한 면역계의 조작에서 유용한 치료적 이점을 가질 수 있다. 가용성의 TRELL 형태는 유전자 조작에 의해 용이하게 인지 가능한 태그를 혼입시켜 TRELL 수용체의 확인을 용이하게 할 수 있다.

또 하나의 양태로, 본 발명은 본원에 개시되고 청구되는 TRELL을 사용한 유전자 치료 방법에 관한 것이다.

본 발명의 약학 제제는 임의 성분으로 약학적으로 허용 가능한 담체, 보조제, 충전제 또는 기타 약학 조성물을 포함할 수 있고, 당해 분야에 공지된 다수의 형태 또는 경로중 하나로 투여할 수 있다.

상기 일반적인 설명 및 후술하는 상세한 설명은 예시 및 설명을 목적으로 하며, 청구된 본 발명을 보다 상세히 설명하기 위한 것으로 이해되어야 한다.

첨부 도면은 본 발명의 이해를 돕기 위해 포함되는 것으로 본 명세서에 포함되어 그 일부를 이루며, 본 발명의 여러 가지 양태를 예시하고, 상세한 설명과 함께 본 발명의 원리를 설명하는 역할을 한다.

1. TRELL cDNA 분리

a) 쥐의 TRELL 클로닝

생쥐 복막의 대식세포 유래의 cDNA 라이브러리로부터 mTRELL을 암호하는 cDNA를 PCR로 분리하였다. 경막 영역의 위치와 아미노산 서열은 막 단백질의 전형적인 예를 나타내었다. mTRELL의 아미노산 서열은 서열 번호 2에 기재하고, DNA 서열은 서열 번호 1에 기재한다.

대식세포는 Balb/c 생쥐로부터 복막 투석법으로 얻었고, 1시간 이내에 플라스틱에 유착하는 세포를 모아 용해시켜 RNA를 추출하였다. 생쥐 에리트로포이에틴 서열을 이용하여 안티센스 올리고뉴클레오티드 프라이머 5'GTTCCAGGCCAGCCTGGG3'를 합성하였다[C.B.Shoemaker and L.D.Mistock, "Murine erythropoietin gene: cloning, expression and human gene homology", Mol.Cell.Biol., 6, 849(1986), 본 명세서의 참고 문헌에 포함됨]. 이 프라이머와 함께 BRL에서 고안된 고착 프라이머를 5' RACE 방법(BRL의 5' RACE 시스템)에 제조자의 추천 방식대로 사용하였다. cDNA의 제1 가닥은 1 시간 유착성인 복막 대식세포 유래의 RNA로부터 만들었다. 증폭은 퍼킨 엘머(Perkin Elmer) DNA 가열 순환기에서 퍼킨 엘머 제품인 Taq DNA 폴리머라제를 사용하여 실시하였다. 94 ℃에서 5분간 변성시키고 다음과 같은 순환 조건으로 처리하였다. 즉, 94 ℃에서 30초, 55 ℃에서 30초 및 72 ℃에서 3분의 처리를 35회 순환실시하였다. 72 ℃에서 추가 신장 반응을 실시한 다음, 이 반응액을 4 ℃에 보관하였다. PCR 실험물을 아가로스 겔로 분석한 결과 650 bp와 500 bp인 2개의 증폭 단편이 나타났다. 이 2개의 단편을 겔로부터 절단하고 pBS-T 벡터에 삽입한 뒤 서열분석하였다. 이 두 삽입체는 상이한 것으로 나타났다. 이 삽입체는 둘다 각 말단에 PCR 합성을 개시하는데 사용했던 동일한 에리트로포이에틴 유전자 특이적인 올리고뉴클레오티드를 갖고 있었다. 그 다음, 32P 표지를 가진 무작위 프라이밍된 단편과 노던 하이브리드화한 결과, 상기 두 삽입체는 상이한 RNA에 각각 하이브리드하였는데, 이 중에서 500 bp 단편은 대식세포에 존재하는 1.4 kb RNA에 하이브리드하는 것으로 나타났다. cDNA의 배향을 측정하기 위한 노던 하이브리드화에는³²P 표지된 리보프로브를 양 방향으로 사용하였다.

이와 같이 측정된 배향 결과와 그 서열로부터 1.4 kb mRNA에 대한 2개의 내부 프라이머를 얻었다. 이 프라이머를 각각 3' 및 5' RACE-PCR에 사용하였다. 3'RACE 실험에서는 pBS-T 벡터 중에 삽입된 750 bp의 단편이 확인되었고, 이것을 서열분석하였다. 이 서열은 폴리A 트랙의 바로 앞에 폴리A 부가 시그널 AATAAA를 갖고 있기 때문에 1.4 kb RNA의 3' 말단에 해당하는 것이었다. 5'RACE 실험에서는 어떤 밴드도 관찰되지 않았다. 1 시간안에 유착된 대식세포로부터 클론테크 마라톤(Clontech Marathon) cDNA 증폭 키트를 사용하여 cDNA 라이브러리를 제조하였다. 상기 서열분석된 cDNA 서열 유래의 센스 올리고뉴클레오티드 프라이머와 안티센스 올리고뉴클레오티드 프라이머를 사용하여 PCR로 분리한 1040 bp PCR 단편과 키트 중에 함유된 일반(universal) 프라이머를 가지고 PCR을 실시하였다. 그 결과 본래의 1040 bp 단편보다는 큰 크기의 단편이 분리되었다. 이와 같이 분리된 새 단편을 서열분석한 결과 5' 서열에 60 bp가 더 존재하였다(서열 번호 1).

1 시간 동안 유착시킨 후, 생쥐의 티오글리콜레이트 유도성 복막 대식세포로부터 RNA를 추출하였다. 하이브리드화에는³²P 표지된 mTRELL cDNA를 사용하였다. 도 3은 생쥐 복막 대식세포와 여러 생쥐 조직에서 나타나는 TRELL mRNA의 발현을 노던 분석한 결과이다.

처음 21개의 아미노산은 소수성 경막 도메인을 나타낸 것이다. 입수할 수 있는 모든 데이타 베이스를 조사해 본 결과, 뉴클레오티드 또는 아미노산 수준에서 그 서열이 동일한 것은 전혀 찾을 수 없었다. PROSITE 프로그램을 사용한 결과 225개 아미노산 서열이 TNF계 단백질에 속하는 것으로 측정되었다. 또한, 이 단백질은 LT-α 및 이 단백질계의 기타 다른 구성원들이 가진 여러 도메인을 갖고 있었다[J.Browning et al., Lymphotoxin-α, a novel member of the TNF family that forms a heteromeric complex with lymphotoxin on the cell surface", Cell, 72, 847(1993); C.F.Ware et al., "The ligands and receptors of the lymphotoxin system", in Pathways for cytolysis, G.M.Griffiths and J.Tschopp(Eds), Springer-Verlag, Berlin, Heidelberg, p174-218(1995), 각각 본명세서의 참고 문헌에 인용됨]. 이 서열은 고유 서열이었다. 즉, 이 서열은 뉴클레오티드 또는 아미노산 수준에서 TNF계의 다른 구성 단백질이나 기타 다른 임의의 서열과 약한 동일성 또는 유사성을 나타내었다. EST 데이타 베이스 조사 결과, 상기 쥐 서열과 명백히 상동성이 있는 인간 서열은 1가지이었다. 이 클론 154742,5'[워싱톤 유니버시티에 근무하는 소어스(Soares)가 제조한 전흉부 라이브러리에서 얻어짐, GenBank 수탁 번호 : R55379)]은 쥐 TRELL과 89%의 상동성을 가진 345 염기쌍 서열이다. 그 외에 입수용이한 데이타 베이스에서는 유용한 mTRELL의 5' DNA와 일치하는 인간 서열을 찾을 수 없었다.

b) 인간 TRELL의 클로닝

i) 올리고뉴클레오티드 프로브와 PCR 프라이머의 제조

생쥐 TRELL과 상동성이 있는 인간 EST R55379의 서열을 사용하여 올리고뉴클레오티드 프라이머를 합성하였다. 그 결과, 2개의 센스 가닥 20mer 올리고뉴클레오티드와 1개의 안티센스 20mer 올리고뉴클레오티드가 합성되었다.

센스 올리고뉴클레오티드

LTB-065 5= -CCC TGC GCT GCC TGG AGG AA(R55379의 NT 70 내지 89)

LTB-066 5= -TGA TGA GGG GAA GGC TGT CT(R55379의 NT 14 내지 33)

안티센스 올리고뉴클레오티드

LTB-067 5= -AGA CCA GGG CCC CTC AGT GA(R55379의 NT 251 내지 270)

ii) hTRELL 클로닝에 유용한 mRNA 및 cDNA 라이브러리원의 식별

인간의 간(cat# 6510-1), 비장(cat# 6542-1) 및 림프절(cat# 6594-1) 유래의 폴리A+ mRNA는 클로테크에서 구입하였다. 인간의 세포주 THP-1, U937 및 II-23 유래의 폴리A+ mRNA는 미국 매사츄세츠주 캠브리지에 소재하는 바이오겐에서 입수하였다. Lambda gt10에 존재하는 인간 편도 cDNA 라이브러리 및 편도 라이브러리 유래의 DNA 역시 바이오겐에서 입수하였다.

6가지 RNA 시료를 가지고 RT-PCR을 실시하였다. 각 cDNA 반응액은 최종 부피 40 ㎕ 중에 폴리A+ mRNA 1 ㎍, 50mM Tris pH 8.3, 75mM KCl, 3mM MgCl₂, 10mM DTT, 250 μM dNTP, 무작위 6량체(50 ng/㎕) 50 ng 및 400 유니트의 Superscript 역전사효소(기브코 BRL cat#6542-1)을 함유하였다. 이 반응액을 20℃에서 20 분, 42℃에서 50 분, 99℃에서 5 분 동안 항온처리하였다. PCR 반응을 위하여, 각 cDNA 반응액의 1/5이나 cDNA 라이브러리 DNA의 100 내지 1000 ng을 사용하였다. 각 시료 마다 2개의 PCR 반응액을 만들고, 그 중 1개의 반응액에는 프라이머 쌍 LTB-065와 LTB-067을 사용하여 201 bp PCR 생성물을 얻었고, 다른 반응액에는 프라이머 쌍 LTB-066과 LTB-067을 사용하여 257 bp PCR 생성물을 얻었다(시료 중에 전사체가 나타나는 경우). PCR 반응은 10 mM Tris pH 8.3, 50 mM KCl, 1.5 mM MgCl₂, 0.01% 젤라틴, 10% DMSO, 100 μM dNTP, 각 프라이머 30 pmol 및 Amplitaq 5 유니트(퍼킨 엘머 cat#N801-0060)를 함유하는 용액 중에서 실시하였다. PCR은 퍼킨 엘머 세투스 DNA 가열 순환기 모델 #480에서 실시하였다. 사용된 순환 조건은 95℃에서 1분, 60℃에서 1분 및 72℃에서 1분간 35회 실시하였다.

정확한 크기의 생성물은 간, 비장, 림프절, THP-1 및 편도에서 얻을 수 있었고, U937 또는 II-23 mRNA에서는 얻을 수 없었다. 간에서 얻은 201bp의 PCR 생성물은 정제하여 cDNA 라이브러리 선별용 프로브로 사용하였다.

iii) cDNA 라이브러리 선별

편도 라이브러리가 TRELL을 함유함을 PCR로 증명하기 위하여, 람다 gt10 인간 편도 cDNA 라이브러리 1x10⁶플라크 형성 유니트(PFU)를 1x10⁵PFU/Nunc^TM평판의농도로 도말하였다. 20x20 ㎝ Schleicher 및 Scheull BA-S 85 Optitran^TM필터 상에 중복 부양물(lift)를 만들었다. 201 bp PCR 생성물은 무작위 프라이밍법(Feinberg and Vogelstein, Anal.Biochem 137:266-267, 1984, 본명세서에 참고문헌으로 인용됨)으로 P³²로 표지시켰다. 필터를 10% 덱스트란 설페이트, 100 ㎍/㎖ tRNA 및 6x10⁵CPM/㎖ 프로브를 함유하는 400 ㎖ 플라크 선별 완충액(50 mM Tris pH 7.5, 1M NaCl, 0.1% 파이로인산나트륨, 0.2% PVP 및 0.2% 피콜) 중에 첨가하여 65℃에서 하룻밤 동안 하이브리드하였다. 이 필터를 플라크 선별 완충액으로 2회 세척한 다음, 65℃에서 2xSSC, 0.1% SDS로 2회 세척하고, -70℃에서 증감 스크린을 사용하여 필름에 40 시간 동안 노출시켰다.

양성 군을 마스터 평판에서 2 반복으로 취하여 SM(100 mM NaCl, 10mM MgSO₄, 50mM Tris, pH7.5) + 젤라틴에 첨가하였다. 양성군에서 12개 후보를 플라크 정제하였다. 12개의 후보 정제물로부터 람다 미니프렙으로 제조한 DNA를 Not1로 절단하고, 1% 아가로스 겔 전기영동한 다음, 서던 블롯팅하고 201 bp 프로브와 하이브리드하였다. 이 프로브에 하이브리드한 최대 삽입체(약 2 kb)를 가진 클론을 선택하여 대량 DNA 정제와 DNA 서열분석을 실시하였다. 이 클론들 각각의 삽입체를 pBluescript SK+(스트라타진 #212205)의 Not1 부위에 서브클로닝하였다. 람다 DNA와 플라스미드 DNA로부터 DNA 서열을 얻었다. 2006 bp의 cDNA 삽입체를 가진 클론 F1a는 암호 영역의 5' 말단에 1개의 인트론을 가지고 있는 것으로 나타났고, 완전한 오픈 리딩 프레임은 함유하지 않았다. PB133으로 부른 클론 A2a는 1936 bp의 cDNA 삽입체를 함유하였다. 이 클론은 543 bp의 5' 비해독 영역, 852 bp의 오픈 리딩 프레임 및 3' 비해독 영역을 함유하지만, 폴리아데닐화 시그널이나 폴리A 테일은 갖고 있지 않았다.

hTRELL cDNA 클론 A2a의 오픈 리딩 프레임을 암호하는 뉴클레오티드 서열은 서열 번호 3에 기재하였다. 이로부터 추론되는 284 아미노산 서열은 서열 번호 4에 기재하였다. 위치 36에 있는 제2의 메티오닌은 해독 개시 부위일 가능성이 큰데, 그 이유는 이 부위가 Kozak에 의해 규정된 바와 같은 개시부의 필요 조건을 가장 근접하게 충족하고 있기 때문이다.

식별된 서열을 사용하여 TRELL을 암호하는 cDNA의 서열을 결정하였다. 전술한 DNA 서열(즉, 서열 번호 3)로부터 본 발명자들은 TRELL의 아미노산 서열(서열 번호 4)을 추론하였다. 현재 단백질 조작 기술 분야의 수준에서 당업자는 상기 아미노산 서열에 의도적인 변화, 삽입 또는 결실을 만들어, 본 명세서에 기재된 분자와 실질적으로 동일한 생물학적 활성 또는 면역학적 활성을 가진 다양한 분자를 얻을 수 있다는 것을 명백히 알 것이다.

iv. 인간 TRELL 발현의 노던 분석

인간 cDNA 클론 2a의 440 bp PpuM1/BstX1 단편을 무작위 프라이밍으로 32P 표지한 뒤 다양한 인간 조직에서 얻은 RNA를 함유하는 시판용 노던 블롯을 탐침하는데 사용하였다. 노던 분석 결과 hTRELL 단편은 길이가 약 1.4 내지 1.6 kb인 단독 mRNA 종에 하이브리드하는 것으로 나타났다. 인간 TRELL은 면역계 기관 대부분, 즉 비장, 말초 혈액 림프구(pbl), 림프절, 충수에서 발현되지만, 흉선, 태아 간(선조 림프구원) 및 골수에서는 비교적 저농도로 발현되었다(도 4). 즉, 2차 면역계의 기관이 주로 TRELL을 발현하였다. 또한, 난소, 전립선, 소장, 결장, 심장, 뇌, 태반, 폐, 간, 골격근, 신장 및 췌장에서도 발현이 관찰되었다. 또, 정소, 간, 신장 및 흉선에서도 비교적 저농도로 발현되었다. 이와 같은 패턴은 TRAIL이 심장과 뇌에서 약하게 발현되는 것을 제외하고는 TRAIL 리간드와 매우 유사한 광범위한 발현 패턴이었다.

c) TRELL 리간드에 결합하는 수용체 분리

수용체를 분리하고 클로닝하기 위하여 TNF계의 리간드를 사용하였다. 전술한 TRELL 서열을 사용하여 수용체 결합 서열을 구성하는 TRELL 리간드의 세포외 도메인 중 5' 말단에 마커 또는 태그화 서열을 융합시킨 다음, 많은 발현계 중 임의의 발현계에서 리간드를 분비시키는 리더 서열을 첨가하였다. 이 기법의 1가지 예는 문헌[Browning et al.,(1996)(JBC 271, 8618-8626)]에 기재되어 있으며, 이 문헌에서는 LT-β 리간드가 상기와 같은 형태로 분비되었다. VCAM 리더 서열은 짧은 myc 펩티드 태그에 커플링시킨 다음 LT-β의 세포외 도메인에 커플링시켰다. 이 VCAM 서열을 사용하여 정상의 막 결합된 LT-β분자를 분비시켰다. 이와 같은 분비 단백질은 N-말단 상에, 수용체에 결합하는 성질을 손상시키지 않는 myc 태그를 갖고 있다. 이와 같은 분비 단백질은 일시 감염된 Cos 세포나 또는 이와 유사한 세포계, 예컨대 EBNA계 벡터, 곤충 세포/바큘로바이러스, 피키아 등에서 발현될 수 있다. 이와 같은 세포의 미정제 상청액은 태그화된 리간드의 공급원으로 사용할 수 있다.

수용체를 발현하는 세포는 태그화된 리간드에 노출시켜 확인할 수 있다. 리간드가 결합된 세포는 myc 태그를 항myc 펩티드 항체(9E10)와 그 다음 피코에리트린(또는 유사 라벨) 표지된 항생쥐 면역글로불린으로 표지한 후 FACS 실험으로 식별한다. FACS 양성 세포는 용이하게 식별할 수 있으며 수용체를 암호하는 RNA원으로 사용된다. 그 다음 이 RNA를 이용하여 표준 기법으로 발현 라이브러리를 제조하고 수집물로 분할하였다. 클론 수집물을 사용하여 적합한 숙주 세포를 형질감염시키고, 결합된 myc 펩티드 태그를 효소 표지된 항생쥐 Ig 시약, 즉 갈락토시다제, 알칼리성 포스파타제 또는 루시페라제 표지된 항체로 표지한 후 수용체를 가진 양성의 형질감염된 세포에 대한 태그화된 리간드의 결합을 현미경 관찰로 조사하였다. 먼저 양성의 수집물을 확인한 후, 이 수집물의 크기를 감소시켜 가면서 수용체 암호 cDNA를 식별하였다. 이와 같은 절차는 수용체를 보다 쉽게 찾을 수 있는 생쥐 또는 인간 TRELL을 사용하여 실시할 수 있다.

2. 세포 및 시약

모든 세포는 미국 모식균 배양물 수집소(ATCC, 미국 매릴랜드주 록빌 소재)에서 얻었고, 단 WEHI 164 클론 13은 가와시마 박사(스위스 제네바에 소재하는 제네바 바이오메디칼 리서치 인스티튜트에 근무)에게서 얻었다. HT29 서브클론(HT29-14)은 전술한 바와 같이 얻었으며(Browning et al., 1996), TNF 감수성 ME180 서브클론은 칼 웨어 박사에게서 얻었다. II-23 T 세포 하이브리도마는 문헌을 통해 개시된 것이다(Browning et al. 1991). Balb/c 생쥐을 죽이기 3일 전에 티오글리콜레이트액(Difco Lab., MI) 1.5 ㎖를 복막 주입하였다. 그 다음 복강에서 세포를 취하여 DMEM(Gibco Lab.) 중에서 1 시간 동안 10⁶세포/㎖로 배양하였다. 평판으로부터 비유착성 세포는 세정하여 제거하고 거의 대부분이 대식세포인 유착성 세포는 Tri-Reagent(Molecular Research Center Inc.)로 용균시킨 뒤 RNA를 추출하였다.

재조합 인간 TNF, LTa, LTa1/b2, 이 단백질들에 대한 항체 및 수용체-Ig 융합 단백질은 전술한 바와 같다(Browning et al., 1995). 항-CD40L 항체 5C8도 개시된 바 있다. 폴리클로널 항hTRELL 혈청은 전술한 바와 같이 CFA 중에 재조합 hTRELL 정제물을 림프절내 주사하여 제조하였다(Browning and Ribolini, 1989). 2 개월 후, 항hTRELL 반응이 관찰되었고 단백질 A-세파로스를 사용하여 면역글로불린을 정제하였다.

생쥐 TRELL 클로닝

생쥐 에리트로포이에틴 서열 유래의 안티센스 올리고뉴클레오티드 프라이머 5'GTTCCAGGCCAGCCTGGG3'는 BRL 제품인 고착 프라이머와 함께 사용하여 5'RACE 절차를 제조자(BRL의 5' RACE 시스템)의 추천에 따라 실시하였다. 1 시간 안에 유착하는 복막 대식세포 유래의 RNA를 사용하여 제1 가닥의 cDNA를 제조하였다. 퍼킨 엘머 DNA 고온 순환기에서 Taq DNA 폴리머라제를 사용하여 증폭을 실시하였다. 94℃에서 5분 동안 변성시킨 후, 다음과 같이 순환 처리하였다. 94℃에서 30초, 55℃에서 30초, 72℃에서 3분간의 처리를 35회 순환시킨 다음, 마지막에 72℃에서 추가 신장 반응시켰다. 이와 같은 PCR 실험물을 아가로스 겔에서 분석한 결과 650 bp 및 500 bp인 2개의 증폭 단편이 관찰되었다. 이 두 단편을 겔로부터 떼내어 pBS-T 벡터에 삽입한 뒤 서열분석하였다.³²P 표지된 무작위 프라이밍 단편을 사용하여 노던 하이브리드한 결과 500 bp 단편이 대식세포 중의 1.4 kb RNA에 하이브리드함을 관찰하였다. cDNA의 배향을 측정하기 위하여 32P 표지된 리보프로브를 노던 하이브리드화에 양방향으로 사용하였다. 이와 같이 측정된 배향과 서열로부터 1.4 kb mRNA에 대해 2개의 내부 프라이머, 즉 5'TCAGGTGCACTTTGATGAGG3' 및 5'CTGTCAGCTCCTCCTGAG3'를 얻었고, 각각 3'RACE-PCR 및 5'RACE-PCR에 사용하였다. 3'RACE 실험 결과 750bp 단편이 관찰되었고, 이것을 pBS-T 벡터에 삽입하여 서열분석하였다. 이 서열은 폴리 A 트랙 바로 앞에 폴리A 부가 시그널을 갖고 있었기 때문에 1.4 kb RNA의 3' 말단에 해당하는 것이었다. 5'RACE를 통해서는 어떤 밴드도 관찰되지 않았다. 1 시간안에 유착된 대식세포로부터 클론테크 마라톤(Clontech Marathon) cDNA 증폭 키트를 사용하여 cDNA 라이브러리를 제조하였다. 상기 서열분석된 cDNA 서열 유래의 센스 올리고뉴클레오티드 프라이머와 안티센스 올리고뉴클레오티드 프라이머(5'AGCAGGAGCCTTCTCAGGAG3' 및 5'GATCCAGGGAGGAGCTTGTCC3')로 분리된 1040 bp PCR 단편과 키트 중에 함유된 일반(universal) 프라이머를 가지고 PCR을 실시하였다. 그 결과 본래의 1040 bp 단편보다 5' 서열에 60 bp가 더 존재하는 단편이 분리되었다.

인간 TRELL 클로닝

EST 데이타 베이스를 조사한 결과 쥐 서열과 가까운 상동성이 있는 1개의 인간 클론을 얻었다. 이 클론 154742(Genbank 수탁 번호 R55379)은 쥐의 cDNA와 89%의 상동성이 있는 345 bp의 서열을 갖고 있었다. EST에서 얻은 2개의 프라이머(5' CCCTGCGCTGCCTGGAGGAA3' 및 5'AGACCAGGGCCCCTCAGTGA3')를 사용하여 RT-PCR로 여러 조직과 라이브러리 중에 hTRELL 전사체가 존재하는 지를 선별하였다. 정확한 크기의 생성물을 간, 비장, 림프절, THP-1 및 편도에서 얻었으나 U937 mRNA에서는 얻지 못하였다. 201 bp 생성물을 클로닝하였고, 이것을 사용하여 람다 gt10 인간 편도 cDNA 라이브러리를 선별하였다. 10⁶플라크 형성 유니트를 10⁵PFU/평판의 농도로 도말하였다. 20x20 ㎝ 니트로셀룰로스 필터 상에 중복 부양물(lift)를 만든 뒤, 무작위 프라이밍으로 제조한 프로브와 하이브리드하였다. 필터를 10% 덱스트란 설페이트, 100 ㎍/㎖ tRNA 및 6x10⁵CPM/㎖ 프로브를 함유하는 플라크 선별 완충액(50 mM Tris pH 7.5, 1M NaCl, 0.1% 파이로인산나트륨, 0.2% PVP 및 0.2% 피콜) 중에 첨가하여 65℃에서 하룻밤 동안 하이브리드하였다. 이 필터를 플라크 선별 완충액으로 2회 세척한 다음, 65℃에서 2xSSC, 0.1% SDS로 2회 세척하였다. 양성 콜로니로부터 람다 미니프렙으로 DNA를 제조하고, 가장 큰 삽입체를 가진 콜로니를 선택하여 다량 DNA 정제와 서열 분석에 이용하였다. 삽입체를 pBlueScript SK+의 NotI 부위에 서브클로닝하였다. ()의 일부를 암호하는 인간의 EST를 발견하였다.

RNA 분석

hTRELL cDNA의 0.45 kb PpuM1/BstX1 단편 또는 1.25 kb NarI/NotI 단편을 무작위 프라이밍으로 표지한 뒤 클론테크에서 구입한 인간 및 생쥐 조직의 노던 블롯을 탐침하는데 사용하였다. 생쥐 조직과 세포의 RNA는 TRI 시약으로 추출하였다. 노던 분석은 총 RNA 4㎍과 32P 표지되고 무작위 프라이밍된 mTRELL cDNA를 사용하여 대부분 문헌(Chicheportiche and Vassalli, 1994)에 기재된 바와 같이 실시하였다.

염색체 정렬

단독염색체 세포 하이브리드(영국 캠브리지 힌스톤에 소재하는 HGMP Resource centre) 유래의 DNA 패널을, 쥐 서열(5'AGTCGTCCCAGGCTGCCGGCT3' 및 5'CCTGAAGTGGGGTCTTCTGGA3')과 상동성이 아닌 3' 비해독 영역 중에서 선택된 프라이머를 사용하여 PCR로 340 bp 단편으로 증폭시켰다. 증폭은 94℃에서 30초, 65℃에서 90초 및 72℃에서 90초간 40회 처리하였다. 아가로스 겔을 에티디움 브로마이드로 염색하여 검출하였다.

재조합 hTRELL 단백질의 발현

림프독소-b(ref)에서 개시된 것과 유사한 hTRELL의 VACM 리더 서열, myc 펩티드 태그 및 세포외 도메인을 결합시킨 가용성 발현 작제물을 LTb에서 개시된 방법(Browning et al., 1996)과 유사하게 제조하였다. 그 결과 다음과 같은 DNA 단편, 즉 개시된 바 있는 VCAM 리더를 암호하는 NotI/평활 단편과 myc 태그를 암호하는 올리고뉴클레오티드 쌍(5' 평활말단, 3'PpuM1 부위), TRELL의 0.45 kb PpuM1/BstX1 단편 및 TRELL의 0.65 kb BstX1/NotI 단편을 분리하였다. 이 4가지 단편을 Not1/포스파타제처리된 pBluescript 벡터 중에 결찰시켰다. 이 벡터 유래의 Not1 삽입체를 pFastBac1 벡터(GibcoBRL) 중으로 전이시켜 재조합 바큘로바이러스를 생성하는데 사용하였다. 가용성 TRELL은 HiFiveTM 곤충 세포를 10의 MOI로 감염시켜 제조하고 이 배지를 2일 후 수거하였다. 이 배지에 다음과 같은 성분을 첨가하였다. 최종 농도 25 mM의 HEPES 완충액(pH7.4), 1mM AEBSF(Pierce) 및 1㎎/㎖ 펩스타틴. 이 배지를 여과하고 Amicon 10 kDa 컷오프 여지를 이용하는 한외여과로 10배 농축하였다. 농축 TRELL을 함유하는 반응액을 SP 세파로스 Fast Flow 컬럼 상에 직접 장입하고 0.4M NaCl을 함유하는 25 mM HEPES 완충액(pH 7.0)으로 세척하였다. 그 다음 0.6M NaCl을 함유하는 동일 완충액으로 TRELL을 용출시켰다. 이와 같이 정제된 TRELL을 () 상에서 크기 분석하였다.

배출 분비 분석

EBNA계의 발현용 벡터는, EBNA 유전자와 히스티딘 태그가 제거된 pEBVHis ABC(Invitrogen)의 변형체인 벡터 CH269를 사용하여 작제하였다. pFastBac 벡터 중의 hTNF 0.71kb 단편은 피.페스카멘토 박사와 에이.골드펠드 박사에게서 입수하였다. SnaBI/XhoI 삽입체를 CH269의 PvuII/XhoI 부위에 결찰시켰다. 1 내지 12의 절단 결실부를 포함하는 게놈 TNF 삽입체는 지.콜리아스 박사에게서 얻었고, 이것을 에이.골드펠드 박사에게서 얻은 CH269 벡터에 삽입하였다. 이 CH269의 NotI 부위에, hTRELL 클론 A2A의 1.8 kb NotI 삽입체, 이.가버 박사에게서 얻은 hCD40L cDNA를 함유하는 0.98 kb NotI 단편 및 hLTa(Browning et al.,1995)를 함유하는 1.46 kb NotI 삽입체를 결찰시켰다. CH269의 HindIII 부위에는 변형된 개시 부위(Browning et al., 1995)를 가진 hLTb 암호 영역을 함유하는 0.81 kb HindIII 삽입체를 결찰시켰다. 리포펙트아민을 사용하여 GFP 벡터와 함께 각종 CH269 벡터로 EBNA-293 세포를 형질감염시키고, FACS 분석을 위해 5 mM EDTA를 함유한 PBS를 제거하거나 또는 2일 후에 세포를 대사적으로 표지하였다. 이 두가지 절차 모두에 다음과 같은 항체, hTRELL 래빗 폴리클로널 Ig 분획, hTNF mAb 104c, hLTa mAb AG9, LTa1/b2 mAb B9 및 CD40L mAb 5C8을 사용하였다. FACS 분석은 10% FBS와 50 ㎍/㎖를 열불활성화된 인간 IgG을 함유하는 RPMI 배지에서 항체 5 ㎍/㎖을 사용하여 실시하였다. 피코에리트린 표지된 항생쥐 또는 래빗 IgG(Jackson ImmunoResearch)를 사용하여 항체 결합을 검측하였다. GFP가 선명한 형질감염된 세포를 생존 상태로 수거하였다. 면역침전을 위해, 형질감염시킨지 2일 후에 PBS로 세척하고 200 μCi/㎖ TranSlabel(ICN)을 함유하는 met/cys 제거된 MEM으로 전이시켰다. 수시간 후 상청액을 수거하고 문헌(Browning et al., 1995)에 기재된 바와 같이 면역침전시켰다.

면역독성 분석

세포 증식 분석은 문헌(Browning and Ribolini, 1989)에 기재된 바와 같이 실시하였다. 경검을 위해 HT29-14 세포를 12웰 평판에 200,000 세포/웰의 농도로 파종하고 2일 동안 증식시켰다. 인간 TRELL, TNF, 림프독소-alb2(Browning et al., 1996) 또는 항fas(CH11, Kamaya)를 인간 인터페론g 80 유니트/㎖와 함께 첨가하였다. 26 시간 후, 시토킨 또는 항fas 처리에 의해 평판에서 분리된 많은 사세포를 함유하는 배지를 제거하였다. 남아있는 세포를 80% 에탄올에 고정시키고 1 ㎎/㎖ 훽스트 염료를 함유하는 PBS로 세척하였다. 2분 후 염료를 제거하고 세포를 PBS로 세척한 뒤 형광현미경으로 조사하였다.

각종 세포주에 대한 인간 TRELL 결합 부위 및 세포독성 효과

세포주	종류	TRELL 결합	세포독성^a
조혈 세포
Jurkat	T 림프종	-	-
SKW6.4	EBV B 세포		-
Namalwa	Burkitt 림프종	-	-
K562	전골수세포	+	-
THP-1	단구백혈병	++	-
비조혈세포
HT29	결장선암	+	++^b
ME-180	경부암종		-
Hela	경부암종		-^d
MCF-7	전흉부선암		+/-
293	태아 신장 세포	+	nd
Cos	신장 섬유아세포	+	nd
^a인간 인터페론g의 존재 및 부재하에 3 내지 5일간의 증식 분석^b세포독성이 인터페론g 존재하에서만 관찰됨.^cND, 측정안됨.^d형태 변화

세포독성 패턴에 따른 각종 TNF계 성분들의 분류

군	수용체 활성화
다양한 세포 종류에서 나타나는 고사의 강력한 유도인자	TNF, Fas, TRAIL-R^a, DR-3
일정 세포 종류에만 나타나는 약한 유도인자	LTb-R, TRELL-R^a, CD30
일부 환경에서 증식억제성이지만 세포 사멸은 유도할 수 없는 군	CD27, CD40, OX-40
^a이 수용체는 현재 미확인 상태임.

참고 문헌

서열 목록

(1)일반 정보 :

(i)출원인 : 치쉐포르티쉐 이베스; 브라우닝 제프리 엘.

(ii)발명의 명칭 : 종양 괴사 인자 관련 리간드

(iii) 서열의 수 : 4

(iv) 서신 주소 :

(A) 수신인 : 바이오겐, 인코포레이티드

(B) 스트리트 : 캠브리지 센터 14

(C) 도시 : 캠브리지

(D) 주 : 매사츄세츠

(E) 국가 : 미국

(F) 우편번호(ZIP) : 02142

(v) 컴퓨터 판독 형태 :

(A)매체 유형 : 플로피 디스크

(B)컴퓨터 : IBM PC 호환기종

(C)작동 체계 : PC-DOS/MS-DOS

(D)소프트웨어 : PatentIn Release #1.0, Version #1.30

(vi) 현 출원 데이터 :

(A) 출원 번호 : 미지정

(B) 출원일 : 1997. 5. 7.

(C) 분류 번호 :

(viii) 대리인 정보 :

(A) 성명 : 플린 케리 에이.

(B) 등록 번호 : 33,693

(C) 참조 번호 : A003 PCT

(ix) 통신 정보 :

(A) 전화 : 04120-66376

(B) 팩스 : 04120-50592

(2) 서열 번호 1 에 대한 정보 :

(i)서열 특성 :

(A)길이 : 1168 염기쌍

(B)서열형 : 핵산

(C)쇄의 수 : 2본쇄

(D)토폴로지 : 직쇄상

(ii) 분자의 종류 : cDNA

(iii) 추정 서열 : 아니오

(iv) 안티센스 : 아니오

(vi) 기원 :

(A) 생물명 : TNF계 관련 단백질

(ix) 서열의 특징

(A) 명칭/키 : CDS

(B) 존재위치 : 2..676

(xi) 서열 번호 1:

서열 1

_

(2) 서열 번호 2 에 대한 정보 :

(i) 서열 특성 :

(A) 길이 : 225 아미노산

(B) 서열형 : 아미노산

(D) 토폴로지 : 직쇄상

(ii) 분자의 종류 : 단백질

(xi) 서열 번호 2:

서열 2

(2) 서열 번호 3 에 대한 정보 :

(i)서열 특성 :

(A)길이 : 1373 염기쌍

(B)서열형 : 핵산

(C)쇄의 수 : 2본쇄

(D)토폴로지 : 직쇄상

(ii) 서열의 종류 : cDNA

(iii) 추정 서열 : 아니오

(iv) 안티센스 : 아니오

(vi) 기원 :

(A) 생물명 : TNF계 관련 단백질

(ix) 서열의 특징

(A) 명칭/키 : CDS

(B) 존재위치 : 1..852

(xi) 서열 번호 3:

서열 3a

서열 3b

(2) 서열 번호 4 에 대한 정보 :

(i) 서열 특성 :

(A) 길이 : 284 아미노산

(B) 서열형 : 아미노산

(D) 토폴로지 : 직쇄상

(ii) 분자의 종류 : 단백질

(xi) 서열 번호 4:

서열 4a

서열 4b

Claims

TRELL(종양 괴사 관련 리간드)을 암호하는 DNA 서열 또는 이것의 단편.
서열 번호 1 또는 서열 번호 3에 기재된 서열을 실질적으로 포함하는, TRELL을 암호하는 DNA 서열.
서열 번호 1 또는 서열 번호 3에 기재된 서열을 실질적으로 포함하는 DNA 서열로서, 이 DNA가 서열 번호 2 또는 서열 번호 4에 기재된 서열을 실질적으로 포함하는 폴리펩티드를 암호하는 것이 특징인 DNA 서열.
서열 번호 1 또는 서열 번호 3에 기재된 서열 중 최소한 단편에 하이브리드하는 DNA 서열로서, 이 단편은 20개 이상의 연속 염기를 포함하고, 그 DNA 서열은 TRELL의 활성 부위와 30% 이상의 상동성이 있는 폴리펩티드를 암호하는 것이 특징인 DNA 서열.
제2항에 있어서, 서열이 보존적 치환, 변화 또는 결실을 가진 서열 번호 1 또는 서열 번호 3에 기재된 서열을 실질적으로 포함하는 것이 특징인 DNA 서열.
발현 조절 서열에 작동가능하게 결합되어 있고 TRELL을 암호하는 DNA 서열을 포함하는 재조합 DNA 분자.
제6항에 있어서, 서열 번호 1 또는 서열 번호 3에 기재된 서열을 포함하는 것이 특징인 재조합 DNA 분자.
제6항 또는 제7항에 기재된 재조합 DNA 분자로 형질전환된 숙주.
서열 번호 2 또는 서열 번호 4에 기재된 아미노산 서열을 가진 TRELL을 암호하는 DNA 서열.
제8항에 기재된 단세포 숙주를 배양하는 단계를 포함하여 실질적으로 순수한 TRELL을 생성하는 방법.
정상의 동물 단백질이 실질적으로 없는 TRELL.
제11항에 있어서, 서열 번호 2 또는 서열 번호 4에 기재된 서열을 실질적으로 포함하는 TRELL.
TRELL의 치료적 유효량이나 이것의 활성 단편 및 약학적 허용성 담체를 포함하는 약학적 조성물.
제13항에 기재된 약학적 조성물의 치료적 유효량을 투여하는 단계를 포함하여 자가면역 질환의 정도를 경감 또는 억제하는 방법.
제13항에 있어서, TRELL 또는 이것의 활성 단편이 서열 번호 2 또는 서열 번호 4에 기재된 서열이나 이것의 생물학적 활성 단편을 포함하는 것이 특징인 약학적 조성물.
제13항에 기재된 약학적 조성물의 치료적 유효량을 투여하는 것을 포함하여 조직 이식편에 대한 면역 반응의 정도를 경감 또는 억제하는 방법.
제13항에 기재된 조성물을 투여하는 것을 포함하는 면역계 자극 방법.
제13항에 기재된 약학적 조성물의 유효량을 투여하는 것을 포함하는 면역계 억제 방법.
제13항에 기재된 약학적 조성물의 치료적 유효량을 투여하는 것을 포함하는 암 치료 방법.
a) TRELL 또는 이것의 단편을 제공하는 단계,

b) TRELL 또는 이것의 단편을 검측가능한 라벨로 표지하는 단계,

c) 상기 단계 b)에서 검측가능하게 표지된 TRELL에 결합하는 수용체를 검측하기 위해 조성물을 선별하는 단계를 포함하여, TRELL에 대한 수용체를 확인하는 방법.
제11항에 기재된 TRELL의 가용성 생물학적 활성 단편.
a) 서열 번호 1 또는 서열 번호 3에 기재된 서열을 포함하는 DNA 서열;

b) 상기 단계 a)에 기재된 DNA에 하이브리드하고 제12항에 기재된 TRELL과 40% 이상 상동성인 폴리펩티드의 발현을 암호하는 DNA 서열로 구성된 군 중에서 선택되는 DNA에 의해 암호된 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드.
TRELL이나 이것의 수용체 또는 이것의 생물학적 활성 단편과 반응성인 항체 제조물.
제23항에 있어서, 모노클로널 항체를 포함하는 항체 제조물.
TRELL이나 이것의 수용체 또는 이것의 항원성 단편으로 유기체를 면역화하는 단계를 포함하여, TRELL이나 이것의 수용체와 반응성인 항체 제조물을 제조하는 방법.
서열 번호 1 또는 서열 번호 3에 기재된 서열 중 최소한 일부분과 하이브리드하는 핵산 서열을 포함하는, TRELL에 대한 안티센스 핵산.
제24항에 기재된 항체 제조물을 포함하는 약학적 조성물.
a) TRELL을 암호하는 유전자를 세포 중으로 도입시키는 단계,

b) 상기 유전자를 포유류 세포 중에서 발현시킬 수 있는 조건하에서 세포를 생육시키는 단계를 포함하여 포유류 세포 중에서 유전자를 발현시키는 방법.
a) TRELL을 암호하는 유전자를 포함하는 벡터의 치료적 유효량을 세포 중으로 도입시키는 단계, 및

b) 상기 유전자를 포유류 세포 중에서 발현시키는 단계를 포함하여, 포유류 중의 TRELL 관련 질환을 치료하는 방법.
제29항에 있어서, 포유류가 인간인 것이 특징인 방법.
제29항에 있어서, 벡터가 바이러스인 것이 특징인 방법.
TRELL이 수용체에 결합하는 것을 방해할 수 있는 제제를 투여하는 것을 포함하여 세포 사멸을 유도하는 방법.
제32항에 있어서, 인터페론-γ를 투여하는 것을 더 포함하는 방법.
TRELL과 이것의 수용체 사이의 결합을 방해할 수 있는 제제의 유효량을 투여하는 단계를 포함하여, TRELL과 이것의 수용체 사이의 신호작용 경로를 포함하는 면역 반응을 치료, 억제 또는 변질시키는 방법.
제34항에 있어서, 면역 반응이 인간의 선암 세포와 관련있는 것이 특징인 방법.