HU226787B1

HU226787B1 - A tumor necrosis factor related ligand

Info

Publication number: HU226787B1
Application number: HU9903921A
Authority: HU
Inventors: Jeffrey L Browning; Yves Chicheportiche
Original assignee: Biogen Idec Inc; Faculty Of Medicine Of The Uni
Priority date: 1996-08-07
Filing date: 1997-08-07
Publication date: 2009-10-28
Also published as: DE69734397T2; BG64779B1; ES2251737T3; EE05276B1; EP0956351B1; ATE307204T1; SK15799A3; NO20084906L; CZ40399A3; JP4161084B2; AU736289B2; CN1232503A; JP2007204480A; EA199900187A1; EA003187B1; JP2009183294A; EP1591530B1; NO990550D0; IS2606B; BR9711046A

Description

A találmány tárgyát tumornekrózis-faktorral rokon ligandum vagy „TRELL”, a tumornekrózisfaktor-család tagjai közé tartozó polipeptid képezi. A fehérje vagy annak receptora felhasználható rákellenes és/vagy immunszabályozó alkalmazásokban. Továbbá a TRELL-t kódoló génnel fertőzött sejtek felhasználhatók génterápiában daganatok, autoimmun és gyulladásos betegségek vagy öröklött genetikai rendellenességek kezelésére.

A tumornekrózis-faktorral (TNF) rokon citokinek a gazdaszervezet védekezésének és immunszabályozásának közvetítői (mediátorai). E család tagjai membránhoz kapcsolódó formában, sejt-sejt érintkezés útján helyileg működve vagy távolabbi célpontokhoz diffúzióval eljutni képes, kiválasztott fehérjékként léteznek. Receptorok párhuzamos családja jelzi ezen molekulák jelenlétét, amely a célszövetben a sejtek elhalásának elindításához vagy sejtek szaporodásához és differenciálódásához vezet. Jelenleg a ligandumok és receptorok TNF-családja legalább 9 felismert receptor-ligandum párral rendelkezik, ezek közé tartoznak: TNF:TNF-R; LT-a:TNF-R; LT-o^:LT^-R; FasLFas; CD40LCD40; CD30L:CD30; CD27L:CD27; OX40LOX40 és 4-1BBL4-1BB. Ezeket a ligandumokat kódoló DNSszekvenciák csak körülbelül 25-30%-os azonossággal rendelkeznek még a legszorosabban rokon esetekben is, jóllehet az aminosavrokonság körülbelül 50%-os.

A citokinreceptorok ezen családjának meghatározó jellegzetessége a ciszteinben gazdag extracelluláris doménben rejlik, amelyet kezdetben két különálló TNFreceptor molekuláris klónozásával fedeztek fel [Smith et al., 1990; Kohno et al., 1990; Loetscher et al., 1990; Schall et al., 1990], Gének ezen családja I. típusú transzmembránfehérjékre jellemző, extracelluláris ligandumkötő doménnel, egyedüli membránt átfogó régióval és sejtfunkciók aktiválásában részt vevő citoplazmás régióval rendelkező glikoproteineket kódol. A ciszteinben gazdag ligandumkötő régió szorosan kötött diszulfidhoz kapcsolt belső domént mutat, amely az egyes családtagoktól függően sokszorosan ismétlődik. A legtöbb receptornak négy doménje van, bár előfordulhat három vagy hat is.

A ligandumok TNF-családjába tartozó fehérjéket normálisan rövid hidrofil aminosavak rövid N-terminális szakasza jellemzi, gyakran néhány lizin- vagy argininmaradékot tartalmazva, amelyekről feltételezhető, hogy stop-transzferszekvenciákként szolgálnak. Ezt transzmembránrégió és változó hosszúságú extracelluláris régió követi, amely a C-terminális receptorkötő domént elválasztja a membrántól. Erre a régióra időnként mint „nyél’’-re („stalk) utalunk. A C-terminális kötőrégió tartalmazza a fehérje zömét, és gyakran, de nem mindig, glikozilezőhelyeket tartalmaz. Ezekből a génekből hiányoznak az I. típusú membránfehérjékre jellemző klasszikus szignálszekvenciák, II. típusú membránfehérjéik vannak a sejtből kilógó C-terminálissal és a citoplazmában maradó rövid N-terminálissal. Néhány esetben, például TNF-nél és LT-a-nál a szárrégióban előfordulhat hasítás a fehérje kialakulásának elején, és akkor a ligandum elsődlegesen kiválasztott formában található. A legtöbb ligandum azonban membrán formában létezik, helyi jeladást közvetítve.

Ezeknek a ligandumoknak a szerkezete jól meghatározott TNF, LT-α és CD40L krisztallográfiás analízisével. TNF és limfotoxin-α (LT-a) két antiparallel β-redőzésű lemez szendvicsszerkezetével rendelkezik a „jelly roll” vagy Greek key topológia szerint [Jones et al., 1989; Eck et al., 1992], A Ca- és β-szálmaradékok közötti rms eltérés 0,61 C, amely molekuláris topológiájukban nagyfokú hasonlóságra enged következtetni. CD40L, TNF és LT-α molekuláris vizsgálataiból kiderülő szerkezeti sajátság az oligomer komplexekké történő összekapcsolódás hajlama. Az oligomer szerkezetre nézve lényeges a receptorkötő hely kialakulása a szomszédos alegységek közötti kapcsolódási ponton, összetett ligandumot hozva létre. CD40L, TNF és LT-a negyedleges szerkezeteiről kristályszerkezetük analízisével kimutatták, hogy trimerként léteznek. A különböző ligandumok közötti konzervatív aminosavak közül sok a β-lemezes váz (scaffold β-sheet) szakaszaiban található. Valószínű, hogy ezen molekulák mindegyikében megőrződik az alap-szendvicsszerkezet, mivel ezen vázszekvenciák részletei konzervatívak a különböző családtagok körében. A negyedleges szerkezet is fennmaradhat, mivel valószínűleg hasonló marad az alegység-konformáció.

A TNF-család tagjai legjobban mesterkapcsolókként írhatók le az immunrendszerben, egyaránt kontroll alatt tartva a sejt túlélését és differenciálódását. Jelenleg csak TNF és LT-α ismertek mint kiválasztott citokinek, ellentétben a többi túlnyomórészt membránhoz kötött TNF-családtaggal szemben. Míg TNF-nek a membrán formája már jól feltárt, és valószínűleg különleges biológiai szerepekkel rendelkezik, kiválasztott TNF olyan sejtek általános riasztó szignáljaként működik, amelyek a kiváltó esemény helyétől távolabb helyezkednek el. Tehát TNF-kiválasztás megsokszorozhat egy, az érrendszer bélésében és a sejtek gyulladásos állapotában jól ismert változásokhoz vezető eseményt. Ezzel ellentétben a család membránhoz kötött tagjai a TNF típusú receptorokon keresztül csak a közvetlen érintkezésben álló sejteknek küldenek jeleket. Például T-sejtek csak olyan B-sejteknek nyújtanak CD40 közvetítette „segítséget, amelyekkel rokon TCR-kölcsönhatások révén közvetlen kapcsolatba kerültek. Sejthalál kiváltásának képességére gyakorolt hasonló sejt-sejt érintkezési korlátozásokat alkalmaz a jól áttanulmányozott Fas-rendszer.

A programozott sejthalál kiváltásának képessége a TNF-család számos tagjának fontos és jól áttanulmányozott sajátsága. Úgy tűnik, a Fás közvetítette apoptózis szerepet játszik autoreaktív limfociták szabályozásában a periférián és esetleg a tímuszban [Castro et al., Immunity 5, 617-627 (1996)], és jelen találmány a TNF- és CD30-rendszereket szintén bevonja T-sejtek és hatalmas anaplasztikus limfómasejtvonalak túlélésébe [Amakawa et al., Cell 84, 551-562 (1996); Gruss et al., Blood 83, 2045-2056 (1994); Sytwu et al., Immunity 5, 17-30 (1996); Zheng et al., Natúré 377, 348-351 (1995)]. Mi és mások korábban már megmu2

HU 226 787 Β1 tattuk, hogy ennek a sejtvonalnak a pusztulása TNF, Fás vagy Ltb receptor jeladásra adott válaszként apoptózis jellegű [Abreu-Martin et al., J. Immunoi. 755, 4147-4154 (1995); Browning et al., J. Exp. Med. 783, 867 (1996)].

Úgy tűnik, hogy a TNF-ligandumok három csoportra oszthatók sejthalált kiváltó képességük alapján (3. táblázat). Először, TNF, Fás ligandum és TRAIL hatékonyan képes sejthalál kiváltására sok sejtvonalban, és receptoraik a legvalószínűbben rendelkeznek jó kanonikus haláldoménekkel (canonic death domain). Feltételezhetően a DR-3 liganduma (TRAMP/WSL-1) is ebbe a kategóriába tartozik. A következő csoportba azok a ligandumok tartoznak, amelyek kevés sejttípusra korlátozódva, gyengébb halálszignált váltanak ki. Erre az osztályra példák TRELL, CD30 ligandum és Lta1b2. Az egy érdekes kérdés, hogy ez a csoport kanonikus haláldomén hiányában hogyan képes sejthalál kiváltására, és azt sugallja, hogy elkülönülten létezik egy gyengébb haláljeladó mechanizmus. Végül azok a tagok, amelyek nem képesek hatékony halálszignál eljuttatására. Valószínűleg mindegyik csoport rendelkezhet antiproliferatív (sejtszaporodást gátló) hatásokkal néhány sejttípusra a sejt differenciálódásának előidézése következtében, például CD40 [Funakoshi et al., Blood 83, 2787(1994)].

A TNF-család az utóbbi években drámaian megszaporodott, legalább 11 különböző jeladó útvonalat foglal magában, beleértve az immunrendszer szabályozását. TRELL és TRAIL kifejeződési mintái azt jelzik, hogy még több funkciós változat vár felfedezésre ebben a családban. Ezt a vonatkozást mostanában különösen reflektorfénybe helyezte két olyan receptor felfedezése, amelyek befolyásolják Rous-szarkóma és herpes simplex vírus replikációs képességét, valamint azok a régebbi megfigyelések, hogy TNF vírusellenes aktivitással rendelkezik, és Pox vírusok csalétek TNFreceptorokat kódolnak [Brojatsch et al., Cell 87, 845-855 (1996); Montgomery et al., Cell 87, 427-436 (1996); Smith et al., Cell 76, 959-962 (1994); Vassali, Ann. Rév. Immunoi. 70, 411-452 (1992)]. Oldható TRELL keletkezése és a TRELL receptor azonosítása nyújthatná az eszközöket ezen érdekes fehérje biológiai funkciójának megvilágítására.

TNF a szeptikus sokk és cachexia [K. Tracey and A. Waage, in: Tumor Necrosis Factors, The Molecules and Their Emerging Role in Medicine, ed. B. Beutler, Raven Press, NY, p. 255 and p. 275 (1992)] közvetítője, és részt vesz a vérképző sejtek fejlődésének szabályozásában [G. D. Roodman, in: Tumor Necrosis Factors, The Molecules and Their Emerging Role in Medicine, ed. B. Beutler, Raven Press, NY, p. 117 (1992)]. Úgy tűnik, fontosabb szerepet játszik gyulladás és baktérium-, vírus- és parazitafertőzések elleni védekezés közvetítőjeként [A. Nakane, I. A. Clark, G. E. Grau, P. F. Piguet, G. H. Wong, in: Tumor Necrosis Factors, The Molecules and Their Emerging Role in Medicine, ed. B. Beutler, Raven Press, NY, p. 285, p. 303, p. 329, p. 341, p. 371 (1992)], valamint daganatellenes aktivitással rendelkezik [S. Malik, in: Tumor Necrosis Factors, The Molecules and Their Emerging Role in Medicine, ed. B. Beutler, Raven Press, NY, p. 407 (1992)]. TNF különböző autoimmun betegségekben is szerepet játszik [Fox, Am. J. Med. 99, 82 (1995)]. TNF-et sokféle sejttípus előállíthatja, beleértve makrofágokat, fibroblasztokat, T-sejteket és természetes ölő- (killer-) sejteket [Goeddel et al., Cold Spring Harbor Symposium Quant. Bioi. 57, 597 (1986); G. Trinchieri, in: Tumor Necrosis Factors, The Molecules and Their Emerging Role in Medicine, ed. B. Beutler, Raven Press, NY, p. 515 (1992)]. TNF két különböző receptorhoz kötődik, ezek mindegyike specifikus intracelluláris jeladó molekulákon keresztül működik, TNF különböző hatásait eredményezve [Tartaglia et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88, 9292 (1991); Tartaglia and Goeddel, Immunoi. Today 13, 151 (1992)]. TNF létezhet membránhoz kötött formában vagy oldható kiválasztott citokinként [Luettig etal., J. Immunoi. 743, 4034 (1989); Kriegleret al., Cell 53, 45 (1988)].

LT-α sok aktivitásban osztozik TNF-fel, például a TNF-receptorokhoz történő kötődésben [C. F. Ware et al., in: Pathways fór Cytolysis, G. M. Griffiths and J. Tschopp (Eds.), Springer-Verlag Berlin, Heidelberg p. 175-218 (1995)], de TNF-től eltérően úgy tűnik, aktivált T-sejtek és néhány β-limfoblaszt daganat által választódik ki elsődlegesen [Paul et al., Ann. Rév. Immunoi. 6, 407 (1988)]. LT-α és LT-β heteromer komplexe olyan membránhoz kötött komplex, amely az LT-β receptorhoz kötődik [Crowe et al., Science 264, 707 (1994); Browning et al., Cell 72, 847 (1993); Browning et al., J. Immunoi. 754, 33 (1995)]. Az LT rendszer (Lts és LT-R) valószínűleg részt vesz a perifériás nyirokszervek fejlődésében, mivel LT-β genetikai tönkretétele a lépben T- és B-sejtek szervezetlenségéhez és nyirokcsomók hiányához vezet [Togni et al., Science 264, 703 (1993); Banks et al., J. Immunoi. 755, 1685 (1995)]. Az LT-β rendszer szintén közreműködik néhány adenokarcinóma-sejtvonal sejthalálában [Browning and Ribolini, J. Immunoi. 743, 1859 (1989); Browning et al., J. Exp. Med. 783, 867 (1996)].

Fas-L, a TNF-család egy másik tagja, túlnyomórészt aktivált T-sejteken fejeződik ki [Suda et al., J. Immunoi. 754, 3806 (1995)]. Ez kiváltja a receptorát hordozó sejtek - beleértve daganatsejtek és HIV-fertőzött sejtek - halálát programozott sejthalál vagy apoptózis néven ismert mechanizmussal [Trauth et al., Science 245, 301 (1989); Yonehara et al., J. Exp. Med. 769, 1747 (1989); Nagata and Goldstein, Science 267, 1449 (1995); Fáik et al., Blood 79, 3300 (1992)]. Továbbá Fás vagy Fas-L hibái limfoproliferatív rendellenességekhez vezethetnek, megerősítve a Fás rendszer szerepét az immunválaszok szabályozásában [Rieux-Laucat etal., Scince 268, 1347 (1995); Takashi etal., Cell 76, 969 (1994); Watanabe-Fukunaga et al., Natúré 356, 314 (1992)]. A Fás rendszer részt vesz a krónikus hepatitisfertőzésből eredő májkárosodásban [Gallé et al., J. Exp. Med. 782, 1223 (1995)] és HIV-fertőzött betegek autoimmunitásában is [Silvestris et al., Clin. Immunoi. Immunpathol. 75, 197 (1995)]. A Fás rendszer részt vesz HIV-fertőzöttek T-sejt-lebomlásában is [Kat3

HU 226 787 Β1 sikis et al., J. Exp. Med. 181, 2029 (1995); Badley et al., J. Virol. 70, 199 (1996)]. TRAIL, ennek a családnak egy másik tagja, szintén úgy tűnik, hogy részt vesz változatos eredetű transzformált sejtek széles körének pusztulásában [Wileyetal., Immunity 3, 673 (1995)].

CD40-L, a TNF-család egy másik tagja, T-sejtek felületén fejeződik ki, és kiváltja CD40-et tartalmazó B-sejtek szabályozását [Gauchat et al., FEBS Lett. 315, 259 (1993); Funakoshi et al., Blood 83, 2787 (1994)]. Továbbá változtatások a CD40-L génben X-szel kapcsolt hiper-lgM szindróma néven ismert betegséget eredményeznek [Allén et al., Science 259, 990 (1993)]. A CD40 rendszer szintén részt vesz különböző autoimmun betegségekben [Biancone et al., Kidney-lnt. 48, 458 (1995); Mohán et al., J. Immunoi.

154, 1470 (1995)], és CD40-L vírusellenes tulajdonságokkal rendelkezik [Ruby etal., Natúré Medicine 1, 437 (1995)]. Jóllehet a CD40 rendszer részt vesz apoptotikus B-sejtek megmenekülésében [Wang et al., J. Immunoi. 155, 3722 (1995); Cleary et al., J. Immunoi.

155, 3329 (1995)], nem immun sejtekben apoptózist vált ki [Hess and Engelman J. Exp. Med. 183, 159 (1996)]. A TNF-család sok további limfocita tagja szintén benne van kostimulációban [Goodwin et al., Cell 73, 447 (1993); Goodwin et al., Eur. J. Immunoi. 23, 2631 (1993); Smith etal., Cell 73, 1349 (1993)].

A TNF-család tagjainak általában alapvető szabályozószerepük van az immunrendszer ellenőrzésében és a gazdaszervezet védekezőrendszerének aktiválásában. Figyelembe véve a jelen haladást a TNF-család tagjainak terápiás hasznosság céljára történő átalakításában, valószínű, hogy ennek a családnak a tagjai egyedi eszközöket nyújthatnak betegségek kontrollálására. Ennek a családnak néhány liganduma közvetlenül indukálhatja sok transzformált sejt apoptotikus pusztulását, például LT, TNF, Fás ligandum és TRAIL [S. Nagata, Cell 88, 355-365 (1997)]. Fás és talán TNF- és CD30-receptor aktivációja válthatja ki nem transzformált limfociták sejthalálát, amely immunszabályozó szerepet játszhat [Amakawa et al., Cell 84, 551-562 (1996); S. Nagata, Cell 88, 355-365 (1997); Sytwu et al., Immunity 5, 17-30 (1996); Zheng et al., Natúré 377, 348-351 (1995)]. A pusztulás általában a - TNF-receptorok citoplazmás oldalán található - haláldomének aggregációját követően következik be. A haláldomén vezényli a különböző szignáltranszdukciós komponenseket, amelyek a caspase kaszkád aktivációját eredményezik [S. Nagata, Cell 88, 355-365 (1997)]. Néhány receptorból - például Ltb-ből és CD30-ból - hiányoznak kanonikus haláldomének [Browning et al., J. Exp. Med. 183, 867 (1996); Lee et al., J. Exp. Med. 183, 669-674 (1996)], mégis képesek kiváltani sejthalált, bár jóval gyengébben. Valószínű, hogy ezek a receptorok elsődlegesen a sejtdifferenciálódás kiváltásában működnek közre, és a sejthalál egy rendellenes következmény néhány transzformált sejtvonalban, jóllehet ez a kép még tisztázatlan, a CD30 null egereken végzett vizsgálatok szerint sejthalálszerepet valószínűsítenek negatív szelekcióban a tímuszban [Amakawa et al., Cell 84, 551-562 (1996)].

Egyéb útvonalakon, úgymint CD40-en történő jeladáshoz viszont szükséges a sejtek túlélésének fenntartása. Ezért tehát szükséges további, a TNF-család tagjai közé tartozó molekulák azonosítása és jellemzése, ezáltal további eszköz biztosítása betegségek ellenőrzésére és az immunrendszer manipulálására.

Ennek megfelelően a találmány polipeptidre, TRELL-nek nevezett tumornekrózis-faktorral rokon ligandumra irányul, amely lényegében elejét veszi a kapcsolódó szakma korlátáiból és hátrányaiból eredő egy vagy több problémának. A feltaláló a citokinek TNF-családjának új tagját fedezte fel, és mind emberben, mind rágcsálóban meghatározta a fehérje aminosavszekvenciáját és az ezt a fehérjét kódoló DNSszekvenciát. Az igénypontokban meghatározott találmány felhasználható számos betegség és állapot új diagnosztikumainak és terapeutikumainak azonosítására a lent részletesen leírtak szerint ugyanúgy, mint az immunrendszerről és folyamatairól történő információszerzésre és azok manipulálására. Továbbá az igénypontokban meghatározott találmány bevonható sejthalál kiváltásába rák esetén.

A találmány további sajátságait és előnyeit a következő leírásban tesszük közzé, és ezek a leírásból részben nyilvánvalóvá válnak, vagy elsajátíthatók a találmány gyakorlati alkalmazásával. A találmány tárgyai és a találmány egyéb előnyei megvalósíthatók azokkal az összetételekkel és módszerekkel, amelyeket különösen kiemelünk a leírásban és annak igénypontjaiban, valamint az azokhoz kapcsolódó ábrákon.

Ezen és egyéb előnyök eléréséhez és a találmány céljának megfelelően, az itt széleskörűen leírt megvalósítási formák szerint a találmány tárgyát TRELL-t kódoló DNS-szekvencia képezi. Az egér TRELL-t (mTRELL) kódoló nukleotidszekvenciát az 1. számú szekvencia mutatja, és a humán TRELL-t (hTRELL) kódoló szekvencia a 3. számú szekvencia. Specifikusan a találmány tárgyát képezik olyan DNS-szekvenciák, amelyek a 2. számú szekvenciában (mTRELL) vagy a 4. számú szekvenciában (hTRELL) leírt aminosavszekvenciával rendelkező TRELL-t kódolnak. Egyéb megvalósítási formákban a találmány tárgyát olyan szekvenciák képezik, amelyek legalább 50%-ban homológok a TRELL C-terminális receptorkötő doménjét kódoló DNS-sel, és hibridizálnak az igénypontokban meghatározott DNS-szekvenciákkal vagy azok fragmentumaival, és amelyek a 2. számú vagy 4. számú szekvenciával azonosított szekvenciával rendelkező TRELL-t kódolnak.

A találmány bizonyos megvalósítási formái továbbá olyan TRELL-t kódoló DNS-szekvenciára vonatkoznak, ahol a szekvencia működőképesen kapcsolódik expressziós kontrollszekvenciával. Bármilyen - a szakmában jártas egyén által könnyen kiválasztható - alkalmas expressziós kontrollszekvencia felhasználható az igénypontokban meghatározott találmányban.

Szintén a találmány tárgyát képezi TRELL-t vagy annak fragmentumát kódoló szekvenciát tartalmazó rekombináns DNS ugyanúgy, mint a genomjukba stabilan beépített TRELL-szekvenciával vagy episzómás

HU 226 787 Β1 elemekkel rendelkező gazdaszervezetek. A találmányban bármilyen alkalmas gazdaszervezet felhasználható, és szakember kísérletezés nélkül könnyen kiválaszthatja azt.

Más megvalósítási formákban a találmány tárgyát lényegében tiszta TRELL előállítására szolgáló, transzformáit gazdaszervezetek tenyésztésének lépését tartalmazó módszerek és normális esetben hozzákapcsolt állati fehérjéktől mentes TRELL képezi.

A találmány felölel a 4. számú vagy 2. számú szekvenciával azonosított aminosavszekvenciával rendelkező TRELL-t ugyanúgy, mint ennek fragmentumait vagy homológjait. Különböző megvalósítási formákban a TRELL aminosav- és/vagy DNS-szekvenciája tartalmazhat konzervatív inszerciókat, deléciókat és szubsztitúciókat, ahogyan azt az alábbiakban tovább definiáljuk, vagy tartalmazhatja a nevezett szekvenciák fragmentumait.

A találmány tárgyát egyéb megvalósítási formákban olyan oldható TRELL-szerkezetek képezik, amelyek felhasználhatók TRELL közvetítette farmakológiai események közvetlen kiváltására. Ilyen események terápiás előnnyel rendelkezhetnek rák kezelésében vagy immunológiai betegségek kezelésénél az immunrendszer befolyásolására. Oldható TRELL-formák genetikailag létrehozhatók könnyen felismerhető toldalék beépítésével, ilyenformán megkönnyítve TRELL-receptorok azonosítását.

A találmány szerinti gyógyszerkészítmények adott esetben tartalmazhatnak gyógyszerészetileg elfogadható hordozókat, adjuvánsokat, töltőanyagokat vagy egyéb gyógyszer-kompozíciókat is, és a szakmaterületen ismert számos formában vagy beadási úton beadhatók.

Megjegyzendő, hogy az általános és az azt követő részletes leírás példaszerű és magyarázó, és a találmánynak az igénypontok szerinti bővebb magyarázatát kívánja nyújtani.

A kísérő ábrák a találmány további megértését szolgálják, és a találmány számos megvalósítási formáját szemléltetve a leírás részét képezik, és a leírással együtt a találmány alapelveinek magyarázatául szolgálnak.

Az ábrák rövid leírása

1. ábra: Humán és egér TRELL aminosavszekvenciájának összehasonlítása.

2A. és 2B. ábra: A TNF-család humán tagjai aminosavszekvenciájának összehasonlítása.

A TNF-ligandum-család 10 humán tagjának sorba állítása szemlélteti az intracelluláris N-terminális dőlnének és a C-terminális receptorkötő domént a - közvetlenül az első β-szál előtt kezdődő - transzmembránrégiótól elválasztó szárrégiók hosszúságában adódó különbözőségeket. A humán FasL N-terminális része csonkolt. Az összehasonlítás súlyozottan méri a ciszteinkonzerválást, és a bizonyos régiókban mutatott csekély homológia miatt néhány családtag között sok alternatív sorba állítás tervezhető a részletek változtatásával. A szekvenciák fölötti vonalak β-szálszerkezetet jeleznek TNF-ben és LT-ben az Eck és Sprang által használt nómenklatúrával. Kanonikus N-véghez kapcsolódó glikozilezőhelyeket aláhúztuk, mint lehetséges transzmembránszekvenciákat, a TNF-ben diszulfidkötéssel kapcsolódó ciszteineket pedig szaggatott vonalakkal (---) jelöltük. A csillagokkal (***) jelölt szekvenciák a TNF-család tagjainak felismerésében használható motívumok.

3. ábra: TRELL mRNS különböző egérsejtvonalakban és szövetekben történő kifejeződésének Northern-analízise. A vonalak kettőzöttek, és tioglikoláttal indukált peritoneális makrofágokból (1), csontvelőből (2), lépből (3) és májból (4) származó RNS-t tartalmaztak.

4. ábra: TRELL mRNS különböző humán szövetekben történő kifejeződésének Northernanalízise.

5. ábra: Rekombináns TNF, LT-α és TRELL SDSPAGE vizsgálata redukáló- és nem redukálókörülmények között.

6. ábra: TRELL citotoxikus a HT29 humán adenokarcinóma-sejtvonalra.

A: TNF, TRELL, LT-α/β és anti-Fas HT29 sejtvonal szaporodását gátló képessége humán interferon-g jelenlétében. A sejteket 4 napig szaporítottuk a különböző szerek jelenlétében, és a növekedést MTT-festés alkalmazásával határoztuk meg.

B: A sejthalált elszenvedett sejtek morfológiája. A sejteket 2 napig előszaporítottuk, azután 24 órán át kezeltük 80 egység/ml interferon-g-vel. A) nem volt további adagolás; B) 100 ng/ml-t etanollal rögzítettünk, és fáziskontraszt-mikroszkóppal megmutattuk a felső panelekben (400*nagyítás), és megfestettük 1 pg/ml Hoechst festékkel a magok kimutatására az alsó panelben. Az apoptózisra jellemző, kondenzált magokkal rendelkező tipikus sejteket nyilakkal jelezzük.

A találmány előnyben részesített megvalósítási formáit részleteiben mutatjuk be referenciaként. A találmány tárgyát képezik humán vagy egér TRELL-t, ezek fragmentumait vagy homológjait kódoló DNS-szekvenciák és ezen DNS-szekvenciáknak olyan gazdaszervezetekben történő kifejezése, amelyeket ezekkel transzformáltunk. A találmány ezen DNS-szekvenciák és az általuk kódolt peptidek alkalmazására irányul. Továbbá a találmány felölel mind humán, mind egér TRELL aminosavszekvenciákat vagy ezek fragmentumait, valamint az ezeket tartalmazó vagy ezekből származó gyógyszerkészítményeket.

A) Definíciók „Homológ” az itt használt értelemben egymással összehasonlított molekulák szekvenciái közötti szekvenciahasonlóságra utal. Amennyiben mindkét összehasonlított szekvencia egy helyzetét ugyanaz a bázis vagy aminosav monomer alegység foglalja el, például két DNS-molekula mindegyikében egy adott helyzetet adenin foglal el, akkor a molekulák ezen a helyen homológok. Két szekvencia közötti homológia százalékban kifejezve, a két szekvenciában egymással páros

HU 226 787 Β1 vagy homológ helyzetek száma osztva az összehasonlított helyzetek számával, szorozva 100-zal. Például ha két szekvenciában 10 helyzetből 6 páros egymással vagy homológ, akkor a két szekvencia 60%-ban homológ. Például az ATTGCC és TATGGC DNS-szekvenciák 50%-ban homológok. Általában úgy teszünk összehasonlítást, ha két szekvenciát maximális homológiához állítunk sorba.

Polipeptid „tisztított készítménye” vagy „lényegében tiszta készítménye” az itt használt értelemben olyan polipeptidet jelent, amely mentes olyan más fehérjéktől, lipidektől és nukleinsavaktól, amelyekkel együtt a természetben előfordul. A polipeptidet előnyösen egyéb anyagoktól - például antitestektől, mátrixoktól stb. - is elválasztottuk, amelyek annak tisztítására használatosak.

„Transzformált gazdaszervezet” az itt használt értelemben minden olyan gazdaszervezetet felölel, amelynek genomja stabilan beépített szekvenciát, azaz TRELL-szekvenciát tartalmaz, vagy episzómás elemeket kódoló szekvenciával, azaz TRELL-szekvenciával rendelkezik.

Az itt leírtak szerint „kezelés” terápiás kezelést jelent, például a terápiás szer vagy anyag - például hatóanyag - beadását.

„Lényegében tiszta nukleinsav”, például lényegében tiszta DNS, olyan nukleinsav, amely a következők egyike vagy mindkettő: (1) nincs közvetlen összefüggésben olyan szekvenciák egyikével vagy mindkettővel - például kódolószekvenciákkal -, amelyekkel közvetlenül összefüggésben van (azaz egyikkel az 5’-végen és egy másikkal a 3’-végen) a természetben előforduló olyan szervezet genomjában, amelyből a nukleinsav származik; vagy (2) amely lényegében mentes olyan nukleinsavszekvenciától, amellyel abban a szervezetben fordul elő, amelyből a nukleinsav származik. A kifejezés magában foglal például olyan rekombináns DNS-t, amelyet vektorba - például autonóm módon replikációra képes plazmidba vagy vírusba - vagy prokarióta vagy eukarióta szervezet genomiális DNS-ébe építettünk be, vagy amely más DNSszekvenciáktól független, különálló molekulaként létezik (például cDNS vagy PCR-rel vagy restrikciós endonukleázos kezeléssel előállított genomiális DNSfragmentum). Lényegében tiszta DNS magában foglal olyan rekombináns DNS-t is, amely TRELL-t kódoló hibrid gén része.

A „peptidek”, „fehérjék” és „polipeptidek” kifejezéseket itt egymással felcserélhető módon használjuk.

„Biológiailag aktív” az itt használt értelemben olyan in vivő vagy in vitro aktivitást jelent, amely közvetlenül vagy közvetve jelenhet meg. TRELL biológiailag aktív fragmentumai például TRELL aktív helyével 70%-os, előnyösebben legalább 80%-os és legelőnyösebben legalább 90%-os aminosavhomológiával rendelkezhetnek. TRELL-re vonatkozó azonosságot vagy homológiát a szóban forgó szekvencia aminosavmaradékainak azon százalékával definiáljuk, amely azonos a 2. számú vagy 4. számú szekvenciában levő TRELL-maradékokkal.

A jelen találmány gyakorlati megvalósítása - ha másképpen nem jelezzük - a sejtbiológia, sejttenyésztés, molekuláris biológia, transzgén biológia, mikrobiológia, rekombináns DNS és immunológia olyan hagyományos technikáit alkalmazza, amely a szakemberek számára ismert. Ilyen technikákat leírnak az irodalomban [Sambrook and Maniatis, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989); Glover, DNA Cloning, Vol. I and II (1985); Gait, Oligonucleotide Synthesis, M. J. Gait ed., (1984); Mullis et al., U.S.P. 4,683,195 számú szabadalmi irat; Hames and Higgins, Nudeic Acid Hybridization (1984); Hames and Higgins, Transcription and Translation (1984); R. I. Freshney and A. R. Liss Inc., Culture of Animál Cells (1987); IRL Press, Immobilized Cells and Enzymes (1986); Perbal, A Practical Guide to Molecular Cloning (1984); Wu et al., Methods in Enzymology, Vol. 154 and 155, Academic Press Inc., NY; Miller and Calos, Gene Transfer Vectors fór Mammalian Cells, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1987); Mayer and Walker, Immunochemical Methods in Cell and Molecular Biology, Academic Press London (1987); Weirand Blackwell, Handbook of Experimental Immunology, Vol. I—IV (1986); Manipulating the Mouse Embryo, Cold Spring Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY (1986)].

B) A találmány szerinti DNS-szekvenciák

Az itt leírtak szerint a találmány tárgyát egy vonatkozásában olyan lényegében tiszta (vagy rekombináns) nukleinsav képezi, amely tartalmaz TRELL-polipeptidet kódoló nukleotidszekvenciát, úgymint az 1. számú vagy 3. számú szekvenciában leírt DNS-t és/vagy ilyen nukleinsavak ekvivalenseit. A nukleinsav kifejezés ahogyan itt használjuk, felölelhet fragmentumokat és ekvivalenseket, úgymint például funkcionálisan ekvivalens peptideket kódoló szekvenciákat. Ekvivalens nukleotidszekvenciák közé tartozhatnak olyan szekvenciák, amelyek egy vagy több nukleotid helyettesítésben (szubsztitúció), -hozzáadásban (addíció) vagy -delécióban térnek el egymástól, úgymint allélváltozatok, mutációk stb., és beleértünk olyan szekvenciákat, amelyek az 1. számú vagy 3. számú szekvenciában bemutatott, TRELL-t kódoló nukleotidszekvenciától a genetikai kód degeneráltsága folytán térnek el. A feltalálók 1936 bázispárból álló humán DNS-t szekvenáltak, amely - a 4. számú szekvenciában definiált, 248 aminosavból álló szekvenciával rendelkező - TRELL-polipeptidet kódoló nyílt leolvasási keretet tartalmaz.

A feltalálók mind humán, mind rágcsálószekvenciákat leírnak; a találmányt általánosan humán szekvenciákra utalva írjuk le, de a szakember számára érthető, hogy ebbe az egér- (rágcsáló, murine) szekvenciák is beletartoznak. TRELL meglepő sajátsága a receptorkötő dómén kiterjedt szekvenciakonzerválódása egér és ember között; csak a Fás ligandum közelíti meg a konzerválódásnak ezt a szintjét. A rágcsáló- és a humán TRELL-fehérjék egyaránt rendelkeznek a TNFcsalád minden jellemzőjével, azaz II. típusú membránfehérje-szerveződéssel és olyan szekvenciamintázatok

HU 226 787 Β1 konzerválódásával, amelyek a fehérjének a TNF antiparallel β-lemezes szerkezetté történő hajtogatásában vesznek részt.

Az 1. számú szekvenciában az mTRELL-t kódoló nukleotidszekvenciát tesszük közzé; mTRELL aminosavszekvenciáját a 2. számú szekvencia írja le. hTRELL-re vonatkozó DNS- és aminosavszekvenciák a 3. számú és 4. számú szekvenciák.

A találmány szerinti szekvenciák felhasználhatók olyan DNS-próbák sorozatainak elkészítéséhez, amelyek hasznosak természetes és szintetikus DNS-ek különböző kollekcióinak szkrínelésében (szűrésében) olyan szekvenciák jelenlétére, amelyek TRELL-t vagy annak fragmentumait vagy származékait kódolják. A szakember felismeri, hogy az itt alkalmazott referencia „TRELL”-re annak biológiailag aktív származékaira, fragmentumaira vagy homológjaira is utal.

A találmány szerinti TRELL-t kódoló DNS-szekvenciák alkalmazhatók TRELL-peptidek előállítására olyan különböző prokarióta és eukarióta gazdaszervezetekben történő kifejezéssel, amelyeket előzőleg ezekkel a szekvenciákkal transzformáltunk. Ezek a TRELL-peptidek felhasználhatók rákellenes és immunszabályozó alkalmazásokban. Ez általában magában foglalja olyan DNS-molekulával transzformált gazdaszervezet tenyésztésének lépéseit, amely expressziós kontroliszekvenciához működőképesen hozzákapcsolt TRELL-t kódoló szekvenciát tartalmaz.

A találmány szerinti DNS-szekvenciák és rekombináns DNS-molekulák kifejezhetök széles körű gazda/vektor kombinációk felhasználásával. Például alkalmas vektorok tartalmazhatják kromoszómás, nem kromoszómás vagy szintetikus DNS-szekvenciák szegmenseit. A találmány szerinti expressziós vektorokat legalább egy expressziós kontrollszekvencia jellemzi, amely működőképesen kötődhet a vektorba inszertált TRELL DNS-szekvenciához annak érdekében, hogy szabályozza a DNS-szekvencia kifejeződését.

Továbbá minden egyes expressziós vektoron belül különböző helyek választhatók ki a találmány szerinti TRELL-szekvencia inszerciójához. A helyeket általában olyan restrikciós endonukleáz jelzi, amellyel hasíthatok, és ezek a helyek és endonukleázok jól felismerhetők a szakember számára. Természetesen meg kell jegyeznünk, hogy a találmányban felhasználható expressziós vektornak nem szükséges rendelkeznie restrikciós endonukleáz hasítási hellyel a kívánt DNS-fragmentum inszerciójához. Ehelyett a vektor klónozható a fragmentumba más módokon is. Az expressziós vektort és különösen azon belül a kiválasztott DNS-fragmentum és ahhoz működőképesen kötődő expressziós kontrollszekvencia inszerciójához kiválasztott helyet számos különböző faktor határozza meg. Ezek közé a faktorok közé tartozik - korlátozást azonban nem jelent - a kifejezendő fehérje mérete, a kívánt fehérje fogékonysága a gazdasejt enzimjeinek proteolitikus lebontásával szemben, egyes restrikciós enzimekre fogékony helyek száma, a kifejezendő fehérje szennyeződése vagy kapcsolódása olyan gazdasejtfehérjékkel, amelyeknek eltávolítása nehézséget okozhat a tisztítás során. További, figyelembe vehető faktorok közé tartoznak expressziós jellemzők, úgymint start- és stopkodonoknak a vektorszekvenciákhoz képest történő elhelyezkedése és más, a szakember által felismerhető faktorok. A vektor és a találmány szerinti DNS-szekvenciák inszerciós helyének kiválasztását ezen faktorok egyensúlyozásával határozzuk meg, nem minden válogatás azonosan hatékony a kívánt alkalmazáshoz. Ezen paraméterek analízise és az egyes alkalmazástól függően megfelelő rendszer kiválasztása azonban rutinszerű a szakember számára.

A szakember könnyen el tudja készíteni az expressziós kontrollszekvenciák megfelelő módosulatait azaz olyan aminosavakat kódoló kodonok helyettesítésével vagy kiválasztásával, amelyeket előnyösen alkalmaznak egyes szervezetekben a proteolízis minimalizálására vagy glikozilező összetételek módosítására magasabb szintű fehérjekifejeződés eléréséhez. Ehhez hasonlóan ciszteinek megváltoztathatók más aminosavakra az előállítás, újrahajtogatási vagy stabilitási problémák egyszerűsítése céljából.

Ilyenformán tehát nem minden gazda/expressziós vektor kombináció működik egyforma hatékonysággal a találmány szerinti DNS-szekvenciák kifejezésében. Szakemberek azonban el tudnak készíteni egyes gazda/expressziós vektor kombinációkat. Olyan faktorok tekintetbe vehetők, mint például a gazdaszervezet és a vektor összeegyeztethetősége, a DNS-szekvencia által kódolt fehérje toxicitása a gazdaszervezetre, a kívánt fehérje könnyű kinyerése, a DNS-szekvenciák és azokhoz működőképesen kapcsolódó expressziós kontrollszekvenciák kifejeződési jellemzői, biológiai biztonság, költségek és a kívánt fehérje hajtogatása vagy egyéb nélkülözhetetlen posztexpressziós módosítása.

A találmány szerinti szekvenciákkal transzformált gazdaszervezetek által termelt TRELL és homológjai ugyanúgy, mint a találmány szerinti eljárásokkal tisztított natív vagy a találmány szerinti aminosavszekvenciákból előállított TRELL felhasználható különböző készítményekben és módszerekben rákellenes és immunszabályozó alkalmazásokban. Ezek felhasználhatók egyéb betegségekre irányuló terápiában és módszerekben is.

Szintén a találmány tárgyát képezi az itt közzétett DNS-szekvenciák felhasználása TRELL kifejezésére abnormális körülmények között, azaz génterápiás elhelyezésben. TRELL kifejezhető daganatsejtekben olyan promoterek irányítása alatt, amelyek megfelelnek ilyen alkalmazásokban. Az ilyen kifejeződés fokozhatja a daganatellenes immunválaszokat, és közvetlenül befolyásolhatja a daganat túlélését. Citokinek, úgymint TRELL befolyásolhatják beültetett szerv túlélését is a helyi immunválasz megváltoztatása révén. Ebben az esetben a beültetett szervet magát és az azt körülvevő sejteket kell módosítani TRELL gén bevitelével.

A találmány tárgyát egy másik vonatkozásban a TRELL-t kódoló izolált nukleinsav „antiszensz” terápiában történő használata képezi. Ahogyan itt használjuk, „antiszensz” terápia olyan oligonukleotidok vagy származékaik beadására vagy in situ létrehozására utal,

HU 226 787 Β1 amelyek sejtes körülmények között specifikusan hibridizálnak a TRELL-t kódoló celluláris mRNS-sel és/vagy DNS-sel oly módon, hogy gátolják a kódolt fehérje kifejeződését, azaz gátolják a transzkripciót és/vagy transzlációt. A kötődés létrejöhet hagyományos bázispár-komplementaritás révén, vagy például DNS-duplexek esetében a kettős hélix fő árkában specifikus kölcsönhatások révén. Az „antiszensz” terápia általában a szakmában általánosan alkalmazott olyan technikák sorozatára utal, amelyek oligonukleotidszekvenciákhoz történő specifikus kötődésen alapulnak.

A találmány szerinti antiszensz szerkezet bevihető például expressziós plazmidként, amely ha átíródik, a sejtben olyan RNS-t eredményez, amely a TRELL-t kódoló celluláris mRNS-nek legalább egy részével komplementer. Másik lehetőségként az antiszensz szerkezet olyan oligonukleotidpróba lehet, amelyet ex vivő hozunk létre. Az ilyen oligonukleotidpróbák előnyösen olyan módosított oligonukleotidok, amelyek endogén nukleázokkal szemben rezisztensek, és ilyenformán in vivő stabilak. Antiszensz oligonukleotidként történő felhasználásra szánt kísérleti nukleinsavmolekulák DNSnek foszfor-amidát-, foszfotioát- és metil-foszfonátanalógjai [lásd például az 5,176,996; 5,264,564 és 5,256,775 számú szabadalmi iratokat]. Továbbá antiszensz terápiában felhasználható oligomerek összeállításának általános megközelítéseiről számolnak be más irodalmak [például Van Dér Kral et al., Biotechniques 6, 958-976 (1988) és Stein et al., Cancer Rés. 48, 2659-2668 (1988)], amelyeket referenciaként beépítettünk.

C) TRELL és annak aminosavszekvenciái

A találmány szerinti, tumornekrózisfaktor-családdal rokon fehérje (TRELL) a fenti magyarázat szerint a TNF-család tagja. A fehérje, annak fragmentumai vagy homológjai széles körben felhasználhatók terápiás és diagnosztikai célokra.

TRELL sok szövetben jelen van olyan mintázatban, amely viszonylag egyedi a TNF-család tagjai körében. Mivel a TNF-család tagjai részt vesznek a sejthalál, túlélés és differenciálódás szabályozásában, lehetséges, hogy TRELL szintén szerepet játszik a sejtek túlélésében, differenciálódásában és különböző szövetek kijavításában.

Jóllehet TRELL pontos háromdimenziós szerkezete nem ismert, előre jelezhető, hogy a TNF-család tagjaként bizonyos szerkezeti jellemzői közösek a család más tagjaival. Mind egér-, mind humán TRELL-t közzéteszünk itt. Egér-TRELL a létező cDNS-szekvenciából történő levezetés szerint legalább 21 hidrofób aminosavból álló szakaszt tartalmaz, amely vélhetően a II. típusú membránfehérje membránhoz kapcsolódó doménjeként működik. mTRELL aminosavszekvenciáját a 2. számú szekvencia írja le.

Humán TRELL N-terminális hidrofil citoplazmás domént, hozzávetőleg 27 aminosavból álló hidrofób II. típusú transzmembrándomént és 204 aminosavból álló extracelluláris domént tartalmaz. A hTRELL aminosavszekvenciáját a 4. számú szekvencia írja le.

Az 1. ábra mutatja humán és egér-TRELL aminosavszekvenciájának összehasonlítását.

Míg az 52 aminosavból álló N-terminális régió előre jelezhető a cDNS-klónban levő nyílt leolvasási keretből, a pontos kezdő metionin nem jelezhető előre. A Met-36 ésszerű Kozák konszenzusszekvenciával rendelkezik, amely az előnyben részesített startkodonná teheti azt. TRELL-szekvencia összehasonlítása a humán TNF-család egyéb tagjainak szekvenciájával figyelemre méltó szerkezeti hasonlóságot mutat. Például ahogyan az a 2a. és 2b. ábrán látható, mindegyik fehérje a II. típusú membránfehérjékhez hasonló, és az extracelluláris doménben néhány konzervált szekvenciarégió közös. A szekvenciák fölötti vonalakkal jelölt régiók jelölik ezeket a TNF-szekvenciákat, és LT-a benne foglaltatik a molekulák β-szálú szerveződésében. A feltételezett N-véghez kapcsolt glikozilezőhelyeket aláhúztuk. A csillagok (***) a TNF-ben a d iszu Ifid kötésekben részt vevő ciszteineket jelölik. A konzervált domének valószínűleg részt vesznek alegységek közötti kölcsönhatásokban és lemezes szerveződésben.

EST-kutatás 345 bázisból álló humán kiónt fedett fel, amely nagymértékben homológ az egér-TRELL-lel. A humán TRELL aminosavszekvenciáját a 4. számú szekvenciában tesszük közzé. Az EST által kódolt nyílt leolvasási keretek nem tartalmazzák azokat a szekvenciamotívumokat - például a Wiley és munkatársai által a létező adatbázison belül TRAIL EST azonosítására használt motívumokat -, amelyek lehetővé tennék ennek a szekvenciának a ligandumok TNF-családja tagjaként történő jellemzését.

A találmány szerinti új polipeptidek specifikusan kölcsönhatásba lépnek olyan receptorral, amelyet eddig még nem azonosítottak. Az itt közzétett peptidek és módszerek képesek olyan receptorok azonosítására, amelyek specifikusan kölcsönhatásba lépnek TRELLlel vagy annak fragmentumaival.

Az igénypontokkal definiált találmány tárgyát bizonyos megvalósítási formákban olyan TRELL-ből származó peptidek képezik, amelyek rendelkeznek a TRELL-receptorokhoz történő kötődés képességével. TRELL-fragmentumok előállíthatok számos úton, például rekombináns technikával, PCR-rel, proteolitikus emésztéssel vagy kémiai szintézissel. Polipeptid belső vagy terminális fragmentumai létrehozhatók a polipeptidet kódoló nukleinsav egyik végéről vagy mindkét végéről egy vagy több nukleotid eltávolításával. A mutagén hatásnak kitett DNS kifejeződése polipeptidfragmentumokat eredményez. „Végeket leharapó” (endnibbling) endonukleázokkal történő emésztés fragmentumok változatait kódoló DNS-eket hozhat létre. Fehérje fragmentumait kódoló DNS-ek létrehozhatók véletlenszerű nyírással, restrikciós emésztéssel vagy a fent definiált módszerek kombinációjával.

Polipeptidfragmentumok szintetizálhatok kémiailag a szakterületen ismert technikák alkalmazásával, úgymint hagyományos Merrifield-féle szilárd fázisú FMOCvagy t-BOC-kémiával. Például a találmány szerinti peptidek és DNS-szekvenciák tetszőlegesen feldarabolhatok kívánt hosszúságú, egymást át nem lapoló frag8

HU 226 787 Β1 meritumokká vagy kívánt hosszúságú, egymást átlapoló fragmentumokká. Ilyen módszereket részletesebben leírunk az alábbiakban.

D) Oldható TRELL előállítása

A ligandum oldható formái gyakran hatásosan adnak jelet, és ennélfogva hatóanyagként beadhatók, amely utánozza a természetes membránalakot. Lehetséges, hogy TRELL természetes módon citokinként kiválasztódik, ha azonban nem, a gén manipulálható a kiválasztás kikényszerítésére. TRELL oldható kiválasztott formájának előállítása céljából DNS-szinten eltávolítjuk az N-terminális transzmembránrégiókat és a szárrégió néhány részletét, és I. típusú vezér- vagy másik lehetőségként II. típusú vezérszekvenciával helyettesítjük azokat, amelyek hatásos proteolitikus hasítást tesznek lehetővé a kiválasztott expressziós rendszerben. Képzett szakember képes a szekréciós expressziós rendszerben maradó szárrégió mennyiségét változtatni annak érdekében, hogy egyaránt optimalizálja a receptorkötő sajátságokat és a szekréciós hatékonyságot. Például az olyan összeállítások, amelyek minden lehetséges szárhosszúságot - azaz N-terminális csonkolást - tartalmaznak, előállíthatok oly módon, hogy eredményül 81-139. aminosavaktól kezdődő fehérjéket kapjunk. Az optimális szárszekvencia ilyen analízis eredményeként jön létre.

E) TRELL-lel reakcióba lépő antitestek létrehozása

Szintén a találmány tárgyát képezik TRELL-lel vagy ennek receptorával specifikusan reakcióba lépő antitestek. Fehérje, illetve peptid elleni antiszérumok vagy monoklonális antitestek standard eljárásokkal előállíthatok [lásd például Antibodies: A Laboratory Manual ed. by Harlow and Lane, Cold Spring Harbor Press (1988)]. Emlős, úgymint egér, hörcsög vagy nyúl immunizálható a peptid immunogén formájával. Fehérje vagy peptid immunogénné tételére szolgáló technikák közé tartozik hordozóhoz történő konjugáció vagy egyéb, a szakmában jól ismert technikák.

TRELL vagy receptorának immunogén része beadható adjuváns jelenlétében. Az immunizáció előrehaladása nyomon követhető a plazma vagy szérum antitest titerének kimutatásával. Standard ELISA vagy egyéb immunmeghatározások alkalmazhatók az immunogénnel, mint antigénnel az antitestek szintjének becslésére.

Előnyben részesített megvalósítási formában az antitestek immunspecifikusak TRELL vagy receptorának antigéndetermináns csoportjaira, például a 2. számú vagy 4. számú szekvenciával azonosított polipeptid vagy szorosan rokon humán vagy nem humán emlős homológ (például 70, 80 vagy 90%-ban homológ, előnyösebben 95%-ban homológ) antigéndeterminánsaira. A találmány még további előnyben részesített megvalósítási formájában az anti-TRELL vagy anti-TRELLreceptor antitestek lényegében nem adnak keresztreakciót (azaz specifikusan reagálnak) olyan fehérjével, amely például kevesebb mint 80%-ban homológ a

2. számú vagy 4. számú szekvenciával; előnyösebben kevesebb mint 90%-ban homológ a 2. számú vagy 4. számú szekvenciával; és legelőnyösebben kevesebb mint 95%-ban homológ a 2. számú vagy 4. számú szekvenciával. A „lényegében nem ad keresztreakciót” kifejezés azt jelenti, hogy az antitest nem homológ fehérjéhez a 2. számú vagy 4. számú szekvenciához való kötődési affinitáshoz képest kevesebb mint 10%-os, előnyösebben kevesebb mint 5%-os és még előnyösebben kevesebb mint 1%-os kötődési affinitással rendelkezik.

Az itt használt antitest kifejezés szándékunk szerint magában foglalja annak olyan fragmentumait, amelyek szintén specifikusan reagálnak TRELL-lel vagy TRELLreceptorral. Antitestek fragmentálhatók hagyományos technikák alkalmazásával, és a fragmentumok ugyanolyan módon szkrínelhetők, mint az egész antitestek a fent leírtak szerint. Például F(ab’)₂ fragmentumok létrehozhatók az antitest pepszines kezelésével. Az eredményül kapott F(ab’)₂ fragmentum kezelhető diszulfidhidak redukálása céljából, hogy Fab’ fragmentumokat kapjunk. A találmány szerinti antitestek továbbá magukban foglalhatnak anti-TRELL- vagy anti-TRELL-receptor-aktivitással rendelkező biospecifikus és kiméra molekulákat. Ilyenformán TRELL és receptora ellen irányuló monoklonális és poliklonális antitestek (Ab) és antitestfragmentumok, úgymint Fab’ és F(ab’)₂ fragmentumok egyaránt felhasználhatók TRELL és receptora működésének blokkolására.

Antitestek különböző formái készíthetők standard rekombináns DNS-technikák alkalmazásával is [Winter and Milstein, Natúré 349, 293-299 (1991)]. Például összeállíthatók olyan kiméra antitestek, amelyekben az állati antitestből származó antigénkötő dómén humán konstans doménhez kapcsolódik [például Cabilly et al., U.S.P. 4,816,567 számú szabadalmi irat, amelyet itt referenciaként beépítettünk], Kiméra antitestek csökkenthetik az állati antitesteknél megfigyelt kiváltott immunválaszokat, ha azokat humán klinikai kezelésekben alkalmazzuk.

Ezenkívül rekombináns „humanizált antitestek” szintetizálhatók, amelyek felismerik TRELL-t vagy annak receptorát. Humanizált antitestek többnyire olyan humán IgG-szekvenciákat tartalmazó kimérák, amelyekbe inszertáltuk a specifikus antigénkötődésért felelős régiókat. Állatokat immunizálunk a kívánt antigénnel, a megfelelő antitesteket izoláljuk, és a változó régió szekvenciájának a specifikus antigénkötődésért felelős részletét eltávolítjuk. Az állatból származó antigénkötő régiókat azután a humán antitestgének megfelelő helyzetébe klónozzuk, amelyekből az antigénkötő régiókat előzőleg kivágtuk. Humanizált antitestek minimalizálják heterológ (azaz fajok közötti) szekvenciák alkalmazását humán antitestekben, és ilyenformán kevésbé valószínű, hogy immunválaszokat váltanak ki a kezelt alanyban.

Rekombináns antitestek különböző osztályainak összeállítása megvalósítható olyan kiméra vagy humanizált antitestek előállításával, amelyek immunglobulinok különböző osztályaiból izolált variábilis doméneket és humán konstans doméneket (CH1, CH2, CH3) tar9

HU 226 787 Β1 talmaznak. Például megnövekedett antigénkötőhelyértékekkel rendelkező antitestek előállíthatok rekombinánsan az antigénkötő helynek olyan vektorokba történő klónozásával, amelyek hordozzák a humán lánc konstans régióit [Arulanandam et al., J. Exp. Med. 177, 1439-1450 (1993), beépítettük itt referenciaként].

Ezenkívül standard rekombináns DNS-technikák alkalmazhatók rekombináns antitestek antigénjeikkel szembeni kötődési affinitásának megváltoztatására, az antigénkötő helyek környékén levő aminosavmaradékok megváltoztatásával. Humanizált antitest antigénkötő affinitása növelhető molekuláris modellezésen alapuló mutagenezissel [Queen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 86, 10029-10033 (1989), beépítettük itt referenciaként],

F) Analógok létrehozása; módosított DNS- és peptidszekvenciák előállítása TRELL-analógok a természetben előforduló

TRELL-től különbözhetnek aminosavszekvenciában vagy szekvenciákat nem érintő módon, vagy mind a kétféleképpen. A nem szekvencia módosítások közé tartozik in vivő vagy in vitro kémiai származtatás TRELL-ből. Nem szekvencia módosítások - korlátozás nélkül - magukban foglalnak változtatásokat az acetilezésben, metilezésben, foszforilezésben, karboxilezésben vagy glikozilezésben.

Előnyben részesített analógok közé tartoznak TRELL és annak biológiailag aktív fragmentumai, melyeknek szekvenciái egy vagy több konzervatív aminosavhelyettesítésben, vagy egy vagy több nem konzervatív aminosavhelyettesítésben, delécióban vagy inszercióban eltérnek a 2. számú és 4. számú szekvenciában megadott szekvenciától, és amely nem szünteti meg TRELL aktivitását. Konzervatív helyettesítések jellemzően egy aminosavnak hasonló jellegű aminosavval történő cseréjét foglalják magukban, például a következő csoportokon belüli helyettesítéseket: valin, glicin; glicin, alanin; valin, izoleucin, leucin; aszparaginsav, glutaminsav; aszparagin, glutamin; szerin, treonin; lizin, arginin; és fenil-alanin, tirozin.

1. táblázat

Konzervatív aminosavhelyettesítések

Aminosav	Kód	Helyettesítés az alábbiak bármelyikével
Alanin	A	D-Ala, Gly, β-Ala, L-Cys, D-Cys
Arginin	R	D-Arg, Lys, D-Lys, homo-Arg, D-homo-Arg, Met, D-Met, Ile, D-lle, Orn, D-Orn
Aszparagin	N	D-Asn, Asp, D-Asp, Glu, D-Glu, Gin, D-GIn
Aszparagin- sav	D	D-Asp, D-Asn, Asn, Glu, D-Glu, Gin, D-GIn
Cisztein	C	D-Cys, S-Me-Cys, Met, D-Met, Thr, D-Thr
Glutamin	Q	D-GIn, Asn, D-Asn, Glu, D-Glu, Asp, D-Asp

Aminosav	Kód	Helyettesítés az alábbiak bármelyikével
Glutamin- sav	E	D-Glu, D-Asp, Asp, Asn, D-Asn, Gin, D-GIn
Glicin	G	Alá, D-Ala, Pro, D-Pro, β-Ala, Acp
Izoleucin	I	D-lle, Val, D-Val, Leu, D-Leu, Met, D-Met
Leucin	L	D-Leu, Val, D-Val, Met, D-Met
Lizin	K	D-Lys, Arg, D-Arg, homo-Arg, D-homo-Arg, Met, D-Met, Ile, D-lle, Orn, D-Orn
Metionin	M	D-Met, S-Me-Cys, Ile, D-lle, Leu, D-Leu, Val, D-Val, Norleu
Fenil-alanin	F	D-Phe, Tyr, D-Tyr, L-Dopa, His, D-His, Trp, D-Trp, transz3,4- vagy 5-fenil-prolin, cisz3,4- vagy 5-fenil-prolin
Prolin	P	D-Pro, L-tioazolidin-4-karbonsav, D- vagy L-1-oxazolidin-4karbonsav
Szerin	S	D-Ser, Thr, D-Thr, allo-Thr, Met, D-Met, Met(O), D-Met(O), Val, D-Val
Treonin	T	D-Thr, Ser, D-Ser, allo-Thr, Met, D-Met, Met(O), D-Met(O), Val, D-Val
Tirozin	Y	D-Tyr, Phe, D-Phe, L-Dopa, His, D-His
Valin	V	D-Val, Leu, D-Leu, Ile, D-lle, Met, D-Met

Mutagenezis alkalmas módszerei közé tartozik a PCR mutagenezis és szaturációs mutagenezis, az alábbiakban részletesen tárgyaltak szerint. Véletlenszerű aminosav-szekvencia változatok könyvtára szintén létrehozható degenerált oligonukleotid-szekvenciák készletének szintézisével.

- PCR mutagenezis

PCR mutagenezisben redukált Taq polimeráz pontosság használható véletlenszerű mutációknak DNS klónozott fragmentumába történő bevezetésére [Leung etal., Technique 1, 11-15 (1989)]. Ez egy nagyon hatásos és viszonylag gyors módszer véletlenszerű mutációk bevezetésére. A mutációra kijelölt DNS-régió megsokszorozható PCR-rel olyan körülmények között, amely csökkenti a Taq-polimerázzal végzett DNS-szintézis hűségét, például dGTP/dATP=5 arányt alkalmazva, és a PCR-reakcióhoz mangán(ll)ionokat adva. A megsokszorozott DNS-fragmentumok összessége alkalmas klónozóvektorokba inszertálható, hogy véletlenszerű mutáns könyvtárakat kapjunk.

- Szaturációs mutagenezis

Szaturációs mutagenezis nagyszámú egyedi bázishelyettesítés gyors bevezetését teszi lehetővé klónozott DNS-fragmentumokba [Mayers et al., Science 229, 242 (1985)]. Ez a technika mutációk létrehozását fog10

HU 226 787 Β1 lalja magában, például egyszálú DNS in vitro kémiai kezelését vagy besugárzását és komplementer DNSszál szintézisét. A mutációs gyakoriság változtatható a kezelés súlyosságával, és lényegében minden lehetséges bázishelyettesítés megkapható. Mivel ez az eljárás nem tartalmazza mutáns fragmentumok genetikai szelekcióját, DNS véletlenszerű - a működést megváltoztató - mutagenezisével elkészíthető semleges helyettesítések ugyanúgy, mint a fehérje, megkaphatók. A pontmutációk eloszlása konzervatív szekvenciaelemeken nem terjed túl.

- Degenerált oligonukleotidok

Homológok könyvtára is létrehozható degenerált oligonukleotidszekvenciák készletéből. Degenerált szekvenciák kémiai szintézise elvégezhető automata DNS-szintetizálóban, és a szintetikus gének azután megfelelő expressziós vektorba ligálhatók. Degenerált oligonukleotidok szintézise ismert a szakmában [Narang, S. A., Tetrahedron 39, 3 (1983); Itakura et al., Recombinant DNA, Proc. 3rd Cleveland Sympos. Macromolecules, ed. A. G. Walton Amsterdam: Elsevier 273-289 (1981); Itakura et al., Annu. Rév. Biochem. 53, 323 (1984); Itakura et al., Science 198, 1056 (1984); Ike et al., Nucleic. Acid Rés. 11, 477 (1983)]. Ilyen technikákat alkalmaztak egyéb fehérjék irányított evolúciójában [Scott et al., Science 249, 386-390 (1990); Roberts et al., PNAS 89, 2429-2433 (1992); Devlin et al., Science 249, 404-406 (1990); Cwirla et al., PNAS 87, 6378-6382 (1990), valamint az U.S.P. 5,223,409, 5,198,346 és 5,096,815 számú szabadalmi iratok].

Nem véletlenszerű vagy irányított mutagenezistechnikák alkalmazhatók specifikus régiókban specifikus szekvenciák vagy mutációk létrehozására. Ezek a technikák felhasználhatók olyan változatok elkészítésére, amelyek például a fehérje ismert aminosavszekvenciája maradékainak delécióit, inszercióit vagy szubsztitúcióit tartalmazzák. A mutáció helyei módosíthatók egyedileg vagy sorozatban, például 1. először konzervatív aminosavakkal helyettesítve, azután radikálisabb választással a kapott eredményektől függően,

2. a célba vett maradék deléciójával vagy 3. a kiválasztott hely környezetében levő maradékokkal azonos vagy különböző osztályba tartozó maradékok inszerciójával, vagy az 1-3. esetek kombinációjával.

- Alanint letapogató (alanin scanning) mutagenezis

Az alanint letapogató mutagenezis alkalmazható módszer a kívánt fehérje bizonyos maradékainak vagy régióinak azonosítására, amelyek előnyös helyek vagy domének mutagenezishez [Cunningham and Wells, Science 244, 1081-1085 (1989), specifikusan beépítve itt referenciaként]. Alaninletapogatásnál célba vett maradékok maradékát vagy csoportját azonosítjuk (például töltéssel rendelkező maradékokat, úgymint Arg, Asp, His, Lys és Glu), és semleges vagy negatív töltésű aminosavval helyettesítjük (legelőnyösebben alaninnal vagy polialaninnal). Egy aminosav cseréje befolyásolhatja az aminosavak kölcsönhatását a körülvevő vizes környezettel a sejtben vagy a sejten kívül. A helyettesítésekre funkciós érzékenységet mutató domének azután még finom íthatók további vagy egyéb változatoknak a helyettesítés helyénél vagy helyére történő bevezetésével. Ilyenformán tehát, amíg egy aminosavszekvencia-változat bevezetésének helye előre meghatározott, a mutáció természetének önmagánál fogva nem szükséges előre meghatározottnak lennie. Például egy adott helyen történő mutáció végrehajtásának optimalizálására alanint letapogató vagy véletlenszerű mutagenezis vezethető a célba vett kodonnál vagy régiónál, és a kifejeződött kívánt fehérjealegység-változatokat szkríneljük a kívánt aktivitás optimális kombinációjára.

- Oligonukleotid által közvetített mutagenezis

Oligonukleotidközvetített (oligonucleotide mediated) mutagenezis alkalmas módszer szubsztitúciós, deléciós és inszerciós DNS-változatok elkészítésére [Adelman et al., DNA 2, 183 (1983), itt referenciaként beépítve]. Röviden, a kívánt DNS megváltoztatható a DNS-templáton mutációt kódoló oligonukleotiddal való hibridizációval, ahol a templát a kívánt fehérje változatlan vagy natív DNS-szekvenciáját tartalmazó plazmidnak vagy bakteriofágnak az egyszálú formája. Hibridizáció után DNS-polimerázt használunk a templát teljes második komplementer szálának szintéziséhez, amely ilyenformán tartalmazza az oligonukleotidprimert, és kódolni fogja a kiválasztott módosítást a kívánt fehérje DNS-ében. Általában legalább 25 nukleotid hosszúságú oligonukleotidokat használunk. Optimális oligonukleotid 12-15 nukleotidból áll, amelyek a mutációt kódoló nukleotid(ok) mindkét oldalán teljesen komplementerek a templáttal. Ez biztosítja, hogy az oligonukleotid megfelelően fog hibridizálni az egyszálú DNS-templátmolekulával. Az oligonukleotidok könnyen szintetizálhatok a szakmában ismert technikákkal [Crea et al., PNAS 75, 5765 (1978), itt beépítve referenciaként].

- Kazettamutagenezis

Változatok készítésének egy másik módja, a kazettamutagenezis Wells és munkatársai által leírt technikán [Gene 34, 315 (1985)] alapul, amelyet itt referenciaként beépítettünk. A kiindulási anyag lehet plazmid (vagy más vektor), amely tartalmazza a mutációra kijelölt fehérjealegység DNS-ét. A mutációra kijelölt fehérjealegység DNS-ében a kodon(oka)t azonosítjuk. Az azonosított mutációs hely(ek) mindkét oldalán kell lennie egyedi restrikciós endonukleáz helynek. Ha nem léteznek ilyen restrikciós hasítási helyek, létrehozhatók a fentiekben leírt oligonukleotid közvetítette mutagenezis módszerének alkalmazásával, a kívánt fehérjealegység DNS megfelelő helyeire történő bevezetéssel. Miután bevezettük a restrikciós hasítási helyeket a plazmidba, a plazmidot linearizálás céljából hasítjuk ezeken a helyeken. A restrikciós helyek közötti DNSszekvenciát kódoló, de a kívánt mutáció(ka)t tartalmazó kettős szálú oligonukleotidot standard eljárások segítségével szintetizáljuk. A két szálat egymástól elválasztva szintetizáljuk, és azután standard technikák al11

HU 226 787 Β1 kalmazásával hibridizáltatjuk. Ezt a kettős szálú oligonukleotidot nevezzük kazettának. Ezt a kazettát úgy tervezzük meg, hogy a linearizált plazmid végeivel összehasonlítható 3’- és 5’-végekkel rendelkezzen oly módon, hogy közvetlenül ligálható legyen a plazmidba. A plazmid tehát most már tartalmazza a mutációt szenvedett kívánt fehérjealegység DNS-szekvenciáját.

- Kombinatorikus mutagenezis

Kombinatorikus mutagenezis is alkalmazható mutánsok létrehozására. Például sorba állítjuk homológok egy csoportjának vagy egyéb rokon fehérjéknek az aminosavszekvenciáit előnyösen úgy, hogy a lehető legnagyobb homológiát érjük el. Minden olyan aminosav, amely megjelenik a sorba állított szekvenciák egy adott helyzetében, kiválasztható kombinatorikus szekvenciák degenerált készletének létrehozására. Változatok sokszínű könyvtára hozható létre a nukleinsavak szintjén kombinatorikus mutagenezissel, és sokszínű génkönyvtár kódolja ezeket. Például szintetikus oligonukleotidok keveréke enzimesen ligálható génszekvenciákba oly módon, hogy a potenciális szekvenciák degenerált készlete kifejezhető egyedi pepiidként, vagy másképpen a degenerált szekvenciák készletét tartalmazó nagyobb, fúziós fehérjeként.

A szakmában különböző technikák ismertek a létrehozott mutáns géntermékek szkrínelésére. Nagy génkönyvtárak szkrínelésének technikái gyakran tartalmazzák a génkönyvtár klónozását replikációra képes expressziós vektorokba, alkalmas sejtek transzformálását az eredményül kapott vektorkönyvtárral és a gének kifejezését olyan körülmények között, amelynél a kívánt aktivitás - például ebben az esetben TRELL-hez vagy receptorához való kötődés - kimutatása elősegíti a kimutatott terméket kódoló gént tartalmazó vektor viszonylag könnyű izolálását. Az alábbiakban leírt technikák mindegyike alkalmas - például véletlenszerű mutagenezissel létrehozott - nagyszámú szekvencia szkríneléséhez nagy átmenőteljesítményű analízisre.

Szintén a találmány tárgyát képezi a tárgy TRELLpolipeptidek vagy receptoraik fehérjekötő doménjeinek csökkentése utánzatok, például peptid vagy nem peptid szerek létrehozása céljából. A peptidutánzatok képesek a TRELL és receptora közötti kötés szétszakítására. Receptor polipeptid vagy downstream intracelluláris fehérje molekuláris felismerésében részt vevő kritikus TRELL-maradékok meghatározhatók és felhasználhatók TRELL vagy annak receptorából származó olyan peptid utánzatai létrehozására, amelyek kompetitíven vagy nem kompetitíven gátolják TRELL-nek receptorhoz való kötődését [lásd például „Peptide inhibitors of humán papilloma vírus protein binding to retinoblastoma gene protein” EP-412,762A és EP-B31,080A szabadalmi iratokat, amelyeket itt specifikusan beépítettünk referenciaként].

G) Gyógyszerkészítmények

Tisztított és rekombináns TRELL elérhetővé tételével a jelen találmány olyan meghatározásokat nyújt, amelyek felhasználhatók olyan drogjelöltek szkrínelésére, amelyek vagy agonistái, vagy antagonistái a normális sejtműködésnek, ebben az esetben TRELL-nek vagy receptorának. Egy megvalósítási formában a meghatározás egy vegyületnek a TRELL és receptora közötti kötődés módosításának képességét értékeli. A meghatározási módok változatai kielégítőek, és a jelen találmányfényében érthetőek a szakember számára.

Sok olyan drogszkrínelési programnál, amely vegyületek és természetes kivonatok könyvtárait teszteli, nagy átmenőteljesítményű vizsgálat szükséges annak érdekében, hogy maximalizáljuk az adott időperiódusban átvizsgált vegyületek számát. Sejtmentes rendszerekben végzett vizsgálatokat - úgymint tisztított vagy félig tisztított fehérjékből származókat - gyakran előnyben részesítünk mint „elsődleges” szkríneket, amelyekben lehetővé válik a molekuláris célpontban történt változtatás - tesztvegyület által közvetített - gyors kifejlesztése és viszonylag könnyű kimutatása.

Továbbá a tesztvegyület celluláris toxicitásának hatásaitól és/vagy biológiai hozzáférhetőségétől általában eltekinthetünk az in vitro rendszerben, ehelyett a meghatározás elsődlegesen a drognak a molekuláris célpontra gyakorolt hatására irányul, amely megnyilvánulhat a molekuláris célpont egyéb fehérjékhez történő kötődési affinitásának vagy enzimes sajátságainak megváltozásában.

A találmány szerinti gyógyszerkészítmények tartalmazhatnak terápiásán hatásos mennyiségű TRELL-t vagy TRELL-receptort vagy ezek fragmentumait vagy utánzatait, és adott esetben tartalmazhatnak gyógyszerészetileg elfogadható hordozókat. Ennek megfelelően ez a találmány rák kezelésére és az immunrendszer vagy részei stimulálására vagy bizonyos esetekben gátlására nyújt módszereket a találmány szerinti vegyület vagy annak gyógyszerészetileg elfogadható sói vagy származékai gyógyszerészetileg hatásos mennyiségének beadásával. Természetesen meg kell jegyeznünk, hogy a találmány szerinti készítmények és módszerek más terápiákkal kombinálva is felhasználhatók különböző kezelésekhez.

A készítmények formulázhatók különböző beadási módokhoz, beleértve rendszeres, alkalmi vagy helyhez kötött beadást. Rendszeres beadáshoz előnyben részesítjük az injekciót, beleértve intramuszkuláris, intravénás, intraperitoneális és szubkután injekciót, a találmány szerinti készítmények formulázhatók oldatként, előnyösen fiziológiásán összeegyeztethető pufferben, úgymint Hank-oldatban vagy Ringer-oldatban. Ezenkívül a készítmények formulázhatók szilárd formában, amelyet adott esetben közvetlenül felhasználás előtt feloldunk vagy szuszpendálunk. Liofilezett formák szintén a találmány tárgyát képezik.

A készítmények beadhatók szájon át (orálisan) vagy nyálkahártyán vagy bőrön keresztül. Nyálkahártyán vagy bőrön keresztül történő beadáshoz az áthatolandó akadálynak megfelelő áthatolószert alkalmazunk a készítményben. Ilyen áthatolószerek ismertek a szakmában, és ezek közé tartoznak - például nyálkahártyán keresztül történő beadáshoz - epesók, fuzidinsavszármazékok és detergensek. Nyálkahártyán ke12

HU 226 787 Β1 resztüli beadás történhet orrspray segítségével vagy kúpok alkalmazásával. Szájon át történő beadáshoz a készítményeket hagyományos szájon át szedhető formákba, úgymint kapszulákba, tablettákba és tonikokba formulázzuk. Helyi beadáshoz a találmány szerinti készítményeket balzsamokba, kenőcsökbe, gélekbe vagy krémekbe formulázzuk a szakmában jól ismert módszerek szerint.

A találmány szerinti készítmények előnyösen egységadagokba kerülnek, és naponta egyszer vagy többször adjuk be azokat. Az egy alkalommal vagy a kezelés során beadott aktív vegyület mennyisége sok faktortól függ. Például az alany életkorától és méretétől, a kezelendő betegség súlyosságától és lefolyásától, a beadás módjától és formájától és a kezelőorvos döntéseitől. Hatásos dózis körülbelül 0,005-5 mg/kg/nap tartományban lehet, előnyösen körülbelül 0,05-0,5 mg/kg/nap. A szakember képes felismerni, hogy ennél alacsonyabb és magasabb dózisok szintén alkalmazhatók.

A találmány szerinti génszerkezetek felhasználhatók génterápiás eljárás részeként is, TRELL-polipeptid agonista vagy antagonista formáját kódoló nukleinsavak bevitelére.

TRELL expressziós szerkezetei beadhatók bármilyen biológiailag hatásos hordozóban, például bármilyen formulában vagy készítményben, amely hatásosan képes a TRELL gént in vivő a sejtekbe bevinni. A megközelítések közé tartozik a gén inszerciója vírusvektorokba, amelyek képesek a sejtet közvetlenül megfertőzni, vagy plazmid-DNS-szállítása például liposzómák vagy intracelluláris hordozók segítségével ugyanúgy, mint a génszerkezet közvetlen injektálása. Előnyben részesítjük a vírusvektormódszerekkel történő átvitelt.

A génterápiás gyógyszerkészítmény állhat lényegében a génszállító rendszerből elfogadható oldószerben, vagy tartalmazhat lassú elengedésű mátrixot, amelyben a génszállító eszköz be van ágyazva. Másik lehetőségként, ahol a teljes génszállító rendszer elkészíthető érintetlen formában rekombináns sejtekből, például retrovírusvektorokból, a gyógyszerkészítmény tartalmazhat egy vagy több sejtet, amelyek előállítják a génszállító rendszert.

A terápiás felhasználáson kívül a találmány szerinti oligomerek felhasználhatók diagnosztikai reagensekként olyan cél DNS, RNS vagy aminosavszekvenciák jelenlétének vagy hiányának kimutatására, amelyekhez specifikusan kötődnek. A találmány egyéb vonatkozásaiban felhasználható kémiai részek azon képességének értékelésére, hogy kölcsönhatásba lépnek, például kötődnek vagy fizikailag kapcsolódnak TRELLpolipeptiddel vagy annak fragmentumaival. A módszer tartalmazza a kémiai rész érintkeztetését a TRELL-polipeptiddel és a TRELL-lel való kölcsönhatás képességének értékelését. Ezenkívül a találmány szerinti TRELL felhasználható TRELL természetben előforduló ligandumainak vagy receptorainak értékelésére szolgáló módszerekben ugyanúgy, mint TRELL-receptorokkal kapcsolódó vagy kötést létesítő kémiai részek értékelésében.

Bizonyos vonatkozásban az igénypontokkal definiált találmány tárgyát képezi kémiai egység azon képességének meghatározására szolgáló módszer, hogy képes-e módosítani a TRELL és receptora közötti kölcsönhatást. A módszer tartalmazza TRELL-receptor és TRELL olyan körülmények közötti kombinálását, ahol a pár képes kölcsönhatásba lépni egymással, az értékelendő kémiai rész hozzáadását, és a komplexek kialakulásának vagy szétesésének kimutatását. Ezek a módosítószerek tovább értékelhetők in vitro, például aktivitásuk tesztelésével sejtmentes rendszerben, és azután adott esetben a készítmény beadásával sejtbe vagy állatba és a hatás kiértékelésével.

H) Példák

1. TRELL cDNS-ek izolálása

a) Rágcsáló-TRELL klónozása

Az mTRELL-t kódoló cDNS-t PCR-rel izoláltuk egér peritoneális makrofágok cDNS-könyvtárából. A transzmembránrégió aminosavszekvenciája és elhelyezkedése membránfehérjére jellemző. mTRELL aminosavszekvenciáját a 2. számú szekvenciában és a DNSszekvenciát az 1. számú szekvenciában tesszük közzé.

Makrofág sejteket nyertünk Balb/c egerekből peritoneális öblítéssel, és az egy órán belül a műanyagon megtapadt sejteket lizáltuk és feldolgoztuk RNS-kivonáshoz. Egéreritropoetin- (vörösvérsejtképzést fokozó hormon) szekvenciából származó antiszensz 5’-GTTCCAGGCCAGCCTGGG-3’ oligonukleotidprimert szintetizáltunk [Shoemaker and Mistock, „Murine erythropoietin gene: cloning, expression and humán gene homology” Mól. Cell Bioi. 6, 849 (1986), amelyet specifikusan beépítettünk itt referenciaként]. Ezt a prímért használtuk 5’RACE eljárásban a gyártó utasításai szerint (5’RACE rendszer BRL-től) a BRL által tervezett rögzítőprimerrel társítva. A cDNS első szálát az egy órán belül megtapadt peritoneális makrofágokból származó RNS-ből állítottuk elő. Sokszorozást (amplifikációt) végeztünk Perkin Elmer DNS-hőciklizálóban Perkin Elmer Taq DNS-polimerázzal. 94 °C-on 5 percig tartó denaturálás után a következő cikluskörülményeket alkalmaztuk: 35 ciklus 94 °C-on 30 másodpercig, 55 °C-on 30 másodpercig és 72 °C-on 3 percig. További kiterjesztést végeztünk 72 °C-on, és a reakciókat 4 °C-on tartottuk. A PCR-reakció analízise agarózgélen 2 megsokszorozott fragmentumot - 650 bp és 500 bp eredményezett. A két fragmentumot kivágtuk a gélből, pBS-T vektorokba inszertáltuk és szekvenáltuk. A két inszertum különböző volt. Mindkettő mindkét végén ugyanazt az eritropoetin gén specifikus oligonukleotidot tartalmazta, amelyet a PCR-szintézisben primerként használtunk. ³²P-vel jelzett, véletlenszerű primerfragmentumokkal végzett Northern-hibridizáció azt jelezte, hogy két különböző RNS-sel hibridizáltak, az 500 bp fragmentum 1,4 kb makrofág RNS-sel hibridizált. ³²P-vel jelzett ribopróbákat használtunk mindkét irányban Northern-hibridizációban a cDNS orientációjának megállapítására.

A megállapított orientációkból és szekvenciákból két belső prímért származtattunk az 1,4 kb mRNS-hez.

HU 226 787 Β1

Ezeket 3’ és 5’RACE-PCR-ben alkalmaztuk, külön-külön. A 3’RACE kísérlet 750 bp fragmentumot eredményezett, amelyet pBS-T vektorba inszertáltunk és szekvenáltunk. Ez megfelel az 1,4 kb RNS 3’-végének, mivel a szekvencia AATAAA ráadás poliA szignállal rendelkezik közvetlenül a poliA terület előtt. Az 5’RACE kísérlet nem vezetett sáv megjelenéséhez. A Clontech Marathon cDNS-amplifikációs kitet használtuk cDNSkönyvtár készítésére egy óra alatt megtapadt makrofágokból. A meghatározott cDNS-szekvenciából származó szensz és antiszensz oligonukleotidokkal PCR-rel izolált 1040 bp fragmentumot használtuk, és a kit univerzális primerét. Ez az eredeti 1040 bp fragmentumnál nagyobb méretű fragmentum izolálását eredményezte. Az új, szekvenált fragmentum 60 bp ráadás az 5’-szekvenciához (1. számú szekvencia).

Tioglikoláttal indukált peritoneális egérmakrofágokból RNS-t vontunk ki egyórás megtapadás után. Hibridizációt végeztünk ³²P-vel jelzett mTRELL cDNS-sel. A 3. ábra mutatja TRELL mRNS-kifejeződés Northernanalízisét peritoneális egérmakrofágokban és különböző egérszövetekben.

Az első 21 aminosav hidrofób transzmembrándomént vázol fel. Az elérhető adatbázisokban a nukleotidvagy aminosavszinten nem találtunk azonos szekvenciákat. A PROSITE program és a 225 aminosavból álló szekvencia felhasználásával megállapítottuk, hogy a szekvencia a fehérjék TNF-családjához tartozik. A fehérje is rendelkezett az LT-a-ra és a család más tagjaira leírt különböző doménekkel [Browning et al., Cell 72, 847 (1993); Ware et al., „The ligands and receptors of the lymphotoxin system”, in Pathways fór Cytolysis, G. M. Griffiths and J. Tschopp (eds.) Springer-Verlag Berlin, Heidelberg p 175-218 (1995), amelyek mindegyikét specifikusan beépítettük itt referenciaként]. Ez a szekvencia egyedi. A nukleotid- vagy aminosavszinteken gyenge azonosság vagy hasonlóság volt megfigyelhető a TNF-család különböző tagjaival vagy bármilyen szekvenciával. EST-adatbázisban való kereséssel 1 humán szekvencia adódott tisztán homológnak a rágcsálószekvenciával. A 154742,5’ klón (GenBank letéti száma: R55379), amelyet Soares (Washington University) készített mellkaskönyvtárból, 345 bázispárból áll, és 89%-ban homológ a rágcsáló-TRELL-lel. Az elérhető adatbázisokban nem találtunk olyan humán szekvenciát, amely a rendelkezésre álló mTRELL 5’DNSsel párt képzett volna.

b) Humán TRELL klónozása

i) Oligonukleotidpróbák és PCR-primerek létrehozása

Az egér-TRELL-lel homológ humán EST R55379 szekvenciáját használtuk fel alapként oligonukleotidprimerek szintéziséhez.

Két, 20 nukleotidból álló oligonukleotid szensz szálait:

LTB-065 5=CCC TGC GCT GCC TGG AGG AA (R55379 70-89. nukleotidjai);

LTB-066 5=TGA TGA GGG GAA GGC TGT CT (R55379 14-33. nukleotidjai);

és egy, 20 nukleotidból álló antiszensz oligonukleotidot:

LTB-067 5=AGA CCA GGG CCC CTC AGT GA (R55379 251-270. nukleotidjai) szintetizáltunk.

ii) mRNS és cDNS-könyvtár forrás azonosítása hTRELL klónozásához

PoliA-t és mRNS-t humán májból (6510-1), lépből (6542-1) és nyirokcsomóból (6594-1) Clontechtől szereztünk be. PoliA-t és mRNS-t a THP-1, U937 és II-23 humán sejtvonalakból a Biogen (Cambridge, MA) készített. Humán mandula- (tonsilla) cDNS-könyvtárat lambda gt10-ben és DNS-t a mandulakönyvtárból szintén a Biogen készített.

RT-PCR-t végeztünk a hat RNS-mintán. Minden egyes cDNS-reakció 1 pg poliA+mRNS, 50 mM Tris pH 8,3, 75 mM KCI, 3 mM MgCI₂, 10 mM DTT, 250 μΜ dNTP, 50 ng random hexamer (50 ng/μΙ) és 400 egység Supercript II reverz transzkriptáz (Gibco BRL 6542-1) keverékét tartalmazta 40 pl végső térfogatban. A reakciót 20 °C-on 20 percig, 42 °C-on 50 percig és 99 °C-on 5 percig inkubáltuk. PCR-hez minden egyes cDNS-reakció egyötödét vagy a cDNS-könyvtár 100-1000 ng DNS-ét használtuk fel. Minden egyes mintára két PCR-reakciót állítottunk össze, egyet az LTB-065 és LTB-067 primerpárral, amely 201 bp PCRterméket eredményez, és a második reakciót az LTB066 és LTB-067 primerpárral, amely 257 bp terméket hoz létre, ha a transzkriptum reprezentálva van a mintában. A PCR-reakciókat 10 mM Tris pH 8,3, 50 mM KCI, 1,5 mM MgCI₂, 0,01% zselatin, 10% DMSO és 100 μΜ dNTP keverékében végeztük el, és mindegyik primerből 30 pmol-t és 5 egység Amplitaqot (Perkin Elmer N801-0060) használtunk fel. A PCR-reakciót Perkin Elmer Cetus DNA Thermal Cycler Model 480 hőciklizálóban végeztük el. Az alkalmazott cikluskörülmények a következők voltak: 95 °C 1 percig, 60 °C 1 percig és 72 °C 1 percig, 35 cikluson keresztül.

A máj-, lép-, nyirokcsomó-, THP-1 és mandulamRNS-ből helyes méretű termékeket kaptunk, az U937 vagy II-23 mRNS-ből viszont nem. A májból kapott 201 bp PCR-terméket megtisztítottuk a cDNS-könyvtár szkrínelésére próbaként történő felhasználáshoz.

iii) cDNS-könyvtár szkrínelése

PCR-rel bebizonyosodott, hogy a mandulakönyvtár tartalmazta TRELL-t, a lambda gt10 humán mandulacDNS-könyvtárból 1 millió tarfoltképző egységet (pfu=plaque forming unit) szélesztettünk 1*10⁵pfu/Nunc™ sűrűségben lemezre. Kettős kiemeléseket végeztünk 20^20 cm-es Schleicher and Schuell BA-S 85 Optitran™ szűrőkre. A 201 bp PCR-terméket random priming technikával ³²P-vel jeleztük [Feinberg and Vogelstein, Anal. Biochem. 137, 266-267 (1984), amelyet specifikusan beépítettünk itt referenciaként], A szűrőket egy éjszakán át hibridizáltuk 65 °C-on 400 ml plakk szkrínelő pufferben (50 mM Tris pH 7,5, 1 M NaCI, 0,1% nátrium-pirofoszfát, 0,2% PVP és 0,2% Ficoll), amely 10% dextrán-szulfátot, 100 pg/ml tRNS-t

HU 226 787 Β1 és 6χ10⁵ cpm/ml próbát tartalmazott. Ezeket kétszer mostuk plakk szkrínelő pufferrel és kétszer 2X SSC, 0,1% SDS keverékében 65 °C-on, és intenzifikáló szkrínnel 40 óráig röntgenfilmnek tettük ki -70 °C-on.

A kétszeres pozitívakat kiszedegettük a mintalemezekről zselatint tartalmazó SM-re (100 mM NaCI, 10 mM MgSO₄, 50 mM Tris pH 7,5). 12 pozitívat plakktisztításnak vetettünk alá. 12 tisztított jelöltből lambda miniprep DNS-t emésztettünk Notl-gyel, elektroforézist végeztünk 1% agarózgélen, Southern-blotnak vetettük alá, és a 201 bp próbával hibridizáltuk. A próbával hibridizált, legnagyobb inszertumokkal rendelkező kiónokat (körülbelül 2 kb) kiválogattuk nagy léptékű DNStisztításhoz és DNS-szekvenáláshoz. Az inszertumokat ezen kiónok mindegyikéből a pBluescript SK+ (Stratagene 212205) Notl helyére szubklónoztuk. DNS-szekvenciát a lambda DNS-ből és a plazmid-DNS-ből kaptunk. Úgy tűnt, hogy a 2006 bp cDNS-inszertumot tartalmazó F1a klón a kódolórégió 5’-végén egy intront tartalmazott, és nem tartalmazott teljes nyílt leolvasási keretet. Az A2a klón, amelyet PB133-nak is nevezünk, 1936 bp cDNS-inszertumot tartalmazott. Ez a klón 543 bp 5’ nem transziáit régiót, 852 bp nyílt leolvasási keretet és 3’ nem transziáit régiót tartalmazott, poliadenilációs szignált vagy poliA farkat viszont nem.

Az A2a klón cDNS hTRELL nyílt leolvasási keretét kódoló nukleotidszekvenciát a 3. számú szekvenciában tesszük közzé. A levezetett, 284 aminosavból álló szekvenciát a 4. számú szekvenciában hozzuk nyilvánosságra. A 36. helyzetben levő második metionin inkább lehet transzlációs starthely, mivel ez a hely sokkal jobban kielégíti a Kozák definíciója szerinti startszignálkövetelményeket.

Az azonosított szekvenciákat felhasználva meghatároztuk a TRELL-t kódoló cDNS-ek szekvenciáit. A fentiekben leírt DNS-szekvenciákból (azaz 3. számú szekvenciából) levezettük TRELL aminosavszekvenciáit (4. számú szekvenciát). Nyilvánvaló, hogy a fehérjemérnökség mai szintjén a szakember tervszerű változtatásokat, inszerciókat vagy deléciókat tehet ezekben az aminosavszekvenciákban, és az általunk itt leírt molekulákkal lényegében azonos biológiai vagy immunológiai aktivitásokkal rendelkező molekulák változatait kaphatja.

iv) Humán TRELL-kifejeződés Northern-analízise

A 2a humán cDNS-klón 440 bp PpuMI/BstXI fragmentumát random priming technikával ³²P-vel jelöltük, és felhasználtuk próbaként különböző humán szövetekből származó RNS-t tartalmazó kereskedelmi Northern-blotokhoz. Northern-analízis azt mutatta, hogy a hTRELL-fragmentum körülbelül 1,4-1,6 kb hosszúságú, egyszálú mRNS-fajtával hibridizált. Humán TRELL az immunrendszer legtöbb szervében kifejeződik, azaz lépben, perifériás vér limfocitákban (pbl=peripheral blood lymphocytes), nyirokcsomókban, vakbélben, de viszonylag kevés a tímuszban, magzati májban (őslimfociták forrása) és csontvelőben (4. ábra). Ilyenformán a másodlagos immunrendszer szervei elsődlegesen fejeznek ki TRELL-t. Kifejeződést mutattunk ki a petefészkekben, prosztatában, vékonybélben, vastagbélben, szívben, agyban, placentában, tüdőben, májban, vázizomban, vesében és hasnyálmirigyben is. A kifejeződés viszonylag alacsony volt a herékben, májban, vesében és tímuszban. Ez a mintázat széles körű kifejeződést mutat, amely nagyon hasonló a TRAIL-liganduméhoz, kivéve TRAIL-ligandum gyenge kifejeződését szívben és agyban.

c) A TRELL-ligandumhoz kötődő receptor izolálása

A TNF-család ligandumai felhasználhatók receptorok azonosítására és klónozására. A leírt TRELL-szekvenciával a receptort kötő szekvenciát tartalmazó TRELL-ligandum extracelluláris doménjének 5’-vége fuzionálható markerhez vagy toldalék szekvenciához, és azután hozzáadható egy vezérszekvencia, amely kikényszeríti a ligandum kiválasztódását számos expressziós rendszer bármelyikében. Erre a technológiára egy példát írnak le Browning és munkatársai [JBC 271, 8618-8626 (1996)], ahol az LT-β ligandumot választják ki ilyen formában. A VCAM vezérszekvenciát kapcsolták egy rövid myc peptidtoldalékhoz, amelyet az LT-β extracelluláris doménje követett. A VCAM szekvenciát használták a normális esetben membránhoz kötött LT-β molekula kiválasztódásának kikényszerítésére. A kiválasztódott fehérje N-végén megmarad a myc toldalék, amely nem rontja a receptorhoz való kötődés képességét. Ilyen kiválasztott fehérje kifejezhető vagy átmenetileg transzformált Cos sejtekben, vagy hasonló rendszerben, például EBNA-ból származó vektorokban, rovarsejtekben, baculovírusban, Pichiában stb. A tisztítatlan sejtfelülúszót használhatjuk fel a toldalékkal ellátott ligandum forrásaként.

A receptort kifejező sejtek azonosíthatók a toldalékkal ellátott ligandummal összehozva. A ligandummal kapcsolódott sejteket FACS kísérletben azonosítjuk, a myc toldalékot anti-myc peptidantitesttel (9E10) jelölve, amelyet phycoerythrinnel (vagy hasonló jelöléssel) jelölt antiegér immunglobulin követ. FACS pozitív sejtek könnyen azonosíthatók, és a receptort kódoló RNS forrásaként szolgálhatnak. Azután expressziós könyvtárat készíthetünk ebből az RNS-ből standard technikákkal, és egymástól elválasztva összegyűjthetjük azokat. Kiónok gyűjteményével transzformálhatunk alkalmas gazdasejtet, és a toldalékkal ellátott ligandumnak receptort hordozó (pozitív) transzformált sejtekhez való kötődését mikroszkopikusan megfigyelhetjük, miután a kötésben levő myc toldalékot enzimmel jelölt antiegér lg reagenssel, azaz galaktozidázzal, alkalikus foszfatázzal vagy luciferázzal jelölt antitesttel tesszük láthatóvá. Miután meghatároztuk a pozitív poolt, a pool méretét addig csökkentjük, amíg azonosítjuk a receptort kódoló cDNS-t. Ez az eljárás elvégezhető vagy az egér-, vagy a humán TRELL-lel, aszerint, melyik vezet könnyebben receptorhoz.

2. Sejtek és reagensek

Minden sejtet az amerikai törzsgyűjteményből (ATCC, Rockville, MD) szereztünk be, kivéve a WEHI164 klón 13-at, amelyet dr. Kawashimától kaptunk

HU 226 787 Β1 (Geneva Biomedical Research Institute, Geneva Switzerland). A HT29 szubklónt (HT29-14) az előzőekben leírtuk (Browning et al., 1996), és a TNF-re érzékeny ME180 szubklónt dr. Cári Ware-tól kaptuk. A II-23 T-sejt-hibridómát már leírtuk (Browning et al., 1991). Balb/c egereket injekcióztunk intraperitoneálisan 3 nappal kivégzésük előtt 1,5 ml tioglikolátlevessel (Difco Láb., Ml). Sejteket vettünk a peritoneális üregből, és ml-enként 10⁶ sejtet tenyésztettünk 1 órán át DMEM-ben (Gibco Láb). A meg nem tapadt sejteket lemostuk a lemezekről, és a megtapadt sejteket - majdnem kizárólag makrofágokat - lizáltuk Tri-reagensben (Molecular Research Center Inc.), és RNS-extrakciót végeztünk.

Rekombináns humán TNF, Lta, Lta1/b2 antitesteket ezekre a fehérjékre és a receptor-lg fúziós fehérjéket már korábban leírtuk (Browning et al., 1995). Az anti-CD40L antitest 5C8-at leírtuk. Poliklonális antihTRELL szérumot készítettünk tiszta rekombináns hTRELL (CFA-ban) nyirokcsomóba adott injekciójával, ahogyan azt már korábban leírtuk (Browning and Ribolini, 1989). Két hónap után anti-hTRELL választ figyeltünk meg, és immunglobulint tisztítottunk Protein A Sepharose alkalmazásával.

Egér-TRELL klónozása

Az egéreritropoetin- (vörösvérsejtképzést fokozó hormon) szekvenciából származó 5’-GTT CCA GGC CAG CCT GGG-3’ antiszensz oligonukleotidprimert használtuk 5’RACE eljárásban a gyártó utasításai szerint (5’RACE rendszer BRL-től) a BRL által tervezett rögzítőprimerrel társítva. A cDNS első szálát az egy órán belül megtapadt peritoneális makrofágokból származó RNS-ből állítottuk elő. Sokszorozási (amplifikációt) végeztünk Perkin Elmer DNS-hőciklizálóban Perkin Elmer Taq DNS-polimerázzal. 94 °C-on 5 percig tartó denaturálás után a következő cikluskörülményeket alkalmaztuk: 35 ciklus 94 °C-on 30 másodpercig, 55 °C-on 30 másodpercig és 72 °C-on 3 percig, amelyet további kiterjesztés követett 72 °C-on. A PCRreakció analízise agarózgélen 2 megsokszorozott fragmentumot - 650 bp és 500 bp - eredményezett. A két fragmentumot kivágtuk a gélből, pBS-T vektorokba inszertáltuk és szekvenáltuk. ³²P-vel jelzett, véletlenszerű primerfragmentumokkal végzett Northern-hibridizáció azt jelezte, hogy az 500 bp fragmentum 1,4 kb makrofág RNS-sel hibridizált. ³²P-vel jelzett ribopróbákat használtunk mindkét irányban Northern-hibridizációban a cDNS orientációjának megállapítására. A megállapított orientációkból és szekvenciákból két belső prímért származtattunk az 1,4 kb mRNS-hez: 5’-TCA GGT GCA CTT TGA TGA GG-3’ és 5’-CTG TCA GCT CCT CCT GAG-3’, amelyeket 3’ és 5’RACE-PCR-ben alkalmaztunk, külön-külön. A 3’RACE kísérlet 750 bp fragmentumot eredményezett, amelyet pBS-T vektorba inszertáltunk és szekvenáltunk. Ez megfelel az 1,4 kb RNS 3’-végének, mivel a szekvencia ráadás poliA szignállal rendelkezik közvetlenül a poliA terület előtt. Az 5’RACE kísérlet nem vezetett sáv megjelenéséhez. A Clontech Marathon cDNS-amplifikációs kitet használtuk cDNS-könyvtár készítésére egy óra alatt megtapadt makrofágokból. PCR-hez a meghatározott cDNSszekvenciából származó szensz és antiszensz (5’AGC AGG AGC CTT CTC AGG AG-3’ és 5’-GAT CCA GGG AGG AGC TTG TCC-3’) oligonukleotidprimerekkel izolált 1040 bp PCR-fragmentumot használtuk, és a kit univerzális primerét. Ez az eredeti 1040 bp fragmentumnál az 5’-végen 60 bp-ral hosszabb fragmentum izolálását eredményezte.

Humán TRELL klónozása

Az EST-adatbázisban való keresés 1 olyan humán kiónt mutatott, amely tisztán homológ a rágcsálószekvenciával. A 154742 klón (GenBank letéti száma: R55379) 345 bp szekvenciával rendelkezik, amely 89%-ban homológ a rágcsáló-cDNS-sel. EST-ből származó két prímért (5’-CCC TGC GCT GCC TGG AGG AA-3’ és 5’-AGA CCA GGG CCC CTC AGT GA-3’) használtunk különböző szövetek és könyvtárak szkrínelésére RT-PCR-rel hTRELL-transzkriptumok jelenlétére. Megfelelő méretű termékeket kaptunk májból, lépből, nyirokcsomóból, ΤΗΡ-1-ből és mandulából, U937 mRNS-ből azonban nem. A 201 bp terméket klónoztuk és felhasználtuk lambda gt10 humán mandulacDNS-könyvtár szkrínelésére. 10⁶ tarfoltképző egységet szélesztettünk 10⁵ pfu/lemez sűrűségben. Kettős kiemeléseket végeztünk 20*20 cm-es nitro-cellulózszűrőkre, és random priming technikával készült próbával hibridizáltattuk. A szűrőket egy éjszakán át 65 °C-on, 10% dextrán-szulfátot, 100 mg/ml tRNS-t és 6*10⁵ cpm/ml próbát tartalmazó plakk szkrínelő pufferben [50 mM Tris pH 7,5, 1 M NaCI, 0,1% nátrium-pirofoszfát, 0,2% poli(vinil-pirrolidon) és 0,2% Ficoll] hibridizáltuk. Ezeket kétszer mostuk plakk szkrínelő pufferrel és kétszer 2X SSC, 0,1% SDS keverékében 65 °C-on. Lambda miniprep DNS-eket készítettünk pozitív kolóniákból, és a legnagyobb inszertumokkal rendelkező kiónokat kiválogattuk nagy léptékű DNS-tisztításhoz és DNS-szekvenáláshoz. Az inszertumokat a pBluescript SK+ Notl helyére szubklónoztuk.

RNS-analízis

A hTRELL cDNS-nek vagy a 0,45 kb PpuMI/BstXI fragmentumát, vagy az 1,25 kb Narl/Notl fragmentumát megjelöltük random priming technikával, és felhasználtuk Clontechtől beszerzett humán és egérszövet Northern-blotjainak próbáihoz. Egérszövetekből és -sejtekből TRI-reagenssel vontuk ki az RNS-t. A Northernanalízist lényegében a már leírtak szerint végeztük [Chicheportiche and Vassali, Biochim. Biophys. Rés. Comm. 209, 1076-1081 (1995)] 4 pg teljes RNS-sel és ³²P-vel jelölt (random priming) mTRELL cDNS-sel.

Kromoszómakijelölés

Monokromoszómás sejthibridekből (HGMP Resource Centre, Hinxton, Cambridge, UK) származó DNS-panelt használtunk 340 bp fragmentum PCR sokszorozására a rágcsálószekvenciával nem homológ, 3’ nem transziáit régióból választott primerekkel (5’-AGT CGT CCC AGG CTG CCG GCT-3’ és 5’-CCT GAA

HU 226 787 Β1

GTG GGG TCT TCT GGA-3’). A sokszorozást 40 cikluson keresztül végeztük: 94 °C-on 30 másodpercig, 65 °C-on 90 másodpercig és 72 °C-on 90 másodpercig. A kimutatás etídium-bromiddal festett agarózgélen történt.

Rekombináns hTRELL-fehérje kifejezése Oldható expressziós szerkezetet, amely - hasonlóan a limfotoxin-ff-ra leírtakhoz - kombinálja a VCAM vezérszekvenciát, a myc peptidtoldalékot és a hTRELL extracelluláris doménjét, készítettünk az LT-β előállítására leírtakhoz hasonló módon (Browning et al., 1996). A következő DNS-fragmentumokat izoláltuk: a VCAM vezérszekvenciát kódoló Notl/tompa fragmentumot, a myc toldalékot kódoló, már leírt oligonukleotidpárt (5’ tompa, 3’ PpuMI hely), TRELL 0,45 kb PpuMI/BstXI fragmentumát és TRELL 0,65 kb BstXI/Notl fragmentumát. A négy fragmentumot Notl/foszfatáz enzimpárral hasított pBluescript vektorba ligáltuk. A Notl inszertumot ebből a vektorból átvittük a pFastBaol vektorba (Gibco BRL) és felhasználtuk rekombináns baculovírus létrehozására. Oldható TRELL-t készítettünk HiFiveTM rovarsejtek megfertőzésével (10 MOI), és a tápközeget 2 nap után gyűjtöttük be. A következőket adtuk a tápközeghez: HEPES-puffer (pH 7,4) 25 mM végső koncentrációban, 1 mM AEBSF (Pierce) és 1 mg/ml pepsztatin. A tápoldatot leszűrtük, és tízszeresére betöményítettük ultraszűréssel Amicon 10 kD kizárószűrőn (cutoff filter) keresztül. A tömény, TRELL-t tartalmazó tápoldatot közvetlenül vittük fel SP Sepharose Fást Flow oszlopra, és 0,4 M NaCI-ot tartalmazó 25 mM HEPES-pufferrel (pH 7,0) mostuk. TRELL ugyanezzel a pufferrel 0,6 M NaCI-nál eluált.

A kiválasztódás (szekréció) vizsgálata EBNA-alapú kifejeződéshez vektorokat állítottunk össze a CH269 vektor felhasználásával, amely a pEBVHis ABC (Invitrogen) módosított változata, amelyből az EBNA gént és a hisztidintoldalékot eltávolították. hTNF 0,71 kb fragmentumát a pFastBac vektorban dr. P. Pescamento és A. Goldfeld bocsátotta rendelkezésünkre. Az SnaBI/Xhol inszertumot a CH269 Pvull/Xhol helyére ligáltuk. A genomiális TNFinszertum dr. G. Kollias ajándéka volt, és ezt inszertáltuk az A. Goldfeld-féle CH269 vektorba. A2a hTRELL klón 1,8 kb Notl inszertumát, a hCD40L cDNS-t tartalmazó 0,98 kb Notl fragmentumot (dr. E. Garbertől) és hLT-a-t tartalmazó 1,46 kb Notl inszertumot (Browning et al., 1995) ligáltunk CH269 Notl helyére. A hLT-β kódolórégióját módosított starthellyel (Browning et al., 1995) tartalmazó 0,81 kb Hindlll inszertumot CH269 Hindlll helyére ligáltuk. EBNA-293 sejteket fertőztünk a különböző CH269 vektorokkal a GFP vektorral együtt lipofektamin (lipofectamine) felhasználásával, és vagy 5 mM EDTA-t tartalmazó PBS-sel eltávolítottuk FACS analízishez, vagy 2 nap után a sejteket metabolikus jelölésnek tettük ki. Mindkét eljárás a következő antitesteket használta fel: hTRELL nyúl poliklonális Ig-frakció, hTNF az mAb (monoklonális antitest) 104c, hLT-α az mAb AG9, ίΤ-α1/β2 az mAb B9 és

CD40L az mAb 5C8. A FACS analízist 10% FBS-t és 50 pg/ml hővel kicsapott humán IgG-t 5 pg/ml antitesttel tartalmazó RPMI-tápközegben végeztük el. Fikoeritrinnel (phycoerythrin) jelölt antiegér vagy nyúl IgG-t (Jackson ImmunoResearch) alkalmaztunk az antitestkötődés kimutatására. GFB-vel fertőzött sejtek élő kapuk voltak. Immunprecipitációhoz a sejteket 2 nappal a transzfekció után PBS-sel mostuk, és 200 μθί/ml TranSIabelt (ION) tartalmazó met/cys mentes MEM-be vittük át. A felülúszót 6 óra múlva kinyertük, és a leírtak szerint (Browning et al., 1995) immunprecipitációnak vetettük alá.

Citotoxicitásvizsgálatok

Sejtszaporítási vizsgálatokat végeztünk a korábban leírtak szerint (Browning and Ribolini, 1989). Mikroszkópos vizsgálathoz HT29-14 sejteket szélesztettünk 12 üregű lemezekre 200 000 sejt/üreg sűrűségben, és 2 napig szaporítottuk. Humán TRELL-t, TNF-et, limfotoχϊη-α.1/β2-ΐ (Browning et al., 1996) vagy anti-Fas-t (CH11, Kamaya) adtunk hozzá 80 egység/ml humán interferon-g-vel együtt. 26 óra elteltével a tápoldatot amely citokin vagy anti-Fas kezelés után sok elpusztult, és a műanyagtól elvált sejtet tartalmazott - eltávolítottuk. A maradék sejteket 80% etanollal rögzítettük, és mg/ml Hoechst festéket tartalmazó PBS-ben mostuk.

perc után a festéket eltávolítottuk, a sejteket PBS-ben mostuk, és fluoreszcenciamikroszkóppal vizsgáltuk.

2. táblázat

Humán TRELL-kötőhelyek és citotoxikus hatások különböző sejtvonalakon

Sejtvonal	Típus	TRELL- kötés	Citotoxi- citás⁸
Hematopoetikus
Jurkat	T-limfóma	-	-
SKW 6,4	EBV B-sejt		-
Namalwa	Burkitt-limfóma	-	-
K562	promielocita (fiatal fehérvérsejt)	+	-
THP-1	monocitikus leukémia	++	-
Nem hematopoietikus
HT29	vastagbél-adeno- karcinóma	+	++b
ME-180	méhnyakrák		-
Hela	méhnyakrák		_c
MCF-7	melladenokarci- nóma		+/-
293	embrióvesesejt	+	ND
Cos	vesefibroblasztok	+	ND

^a 3-5 napos szaporítási vizsgálat humán interferon-g jelenlétében és nélkül;

^b Citotoxicitást csak interferon-g jelenlétében figyeltünk meg; ^c Morfológiai változások;

ND=nem határoztuk meg.

HU 226 787 Β1

3. táblázat

Különböző TNF-családtagok csoportosítása citotoxicitás mintázat alapján

Csoport	Receptoraktiválás
Apoptózis potenciális kiváltói sok sejttípusban	TNF, Fás, TRAIL-R³, DR-3
Gyenge indukálok, nem minden sejttípusban	ίΤ-β-R, TRELL-R³, CD30
Nem képes kiváltani sejthalált, néhány elrendezésben szaporodásgátló	CD27, CD40, OX-40

^a Ezeket a receptorokat még nem azonosították.

SZEKVENCIÁK JÉG YZÉKE SEQUENCE LISTING (1) GENERAL INFORMATION:

(i) APPLICANT: Chicheportiche, Yves Browning, Jeffrey L.

(ii) TITLE OF INVENTION: A TUMOR NECROSIS FACTOR RELATED LIGAND (iii) NUMBER OF SEQUENCES: 4 (iv) CORRESPONDENCE ADDRESS:

(A) ADDRESSEE: BIOGEN, INC.

(B) STREET: 14 CAMBRIDGE CENTER (C) CITY: CAMBRIDGE (D) STATE: MA (E) COUNTRY: US (F) ZIP: 02142 (v) COMPUTER READABLE FORM:

(A) MÉDIUM ΤΥΡΕ: Floppy disk (B) COMPUTER: IBM PC compatible (C) OPERATING SYSTEM: PC-DOS/MS-DOS (D) SOFTWARE: Patentln Release #1.0, Version #1.30 (vi) CURRENT APPLICATION DATA:

(A) APPLICATION NUMBER: notyet assigned (B) FILING DATE: 07-May-1997 (C) CLASSIFICATION:

(viii) ATTORNEY/AGENT INFORMATION:

(A) NAME: FLYNN, KERRYA.

(B) REGISTRATION NUMBER: 33,693 (C) REFERENCE/DOCKET NUMBER: A003 PCT CIP (ix) TELECOMMUNICATION INFORMATION:

(A) TELEPHONÉ: (617) 679-3583 (B) TELEFAX: (617) 679-2838 (2) INFORMATION FÓR SEQ ID NO:1:

(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:

(A) LENGTH: 1168 base pairs (Β) ΤΥΡΕ: nucleic acid (C) STRANDEDNESS: double (D) TOPOLOGY: linear (ii) MOLECULE ΤΥΡΕ: cDNA (iii) HYPOTHETICAL: NO

HU 226 787 Β1 (iv) ANTI-SENSE: NO (vi) ORIGINAL SOURCE:

(A) ORGANISM: TNF family related protein (ix) FEATURE:

(A) NAME/KEY: CDS (B) LOCATION: 2..676 (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:1:

G GTG CTG AGC CTG GGC CTG GCG CTG GCC

TGC CTT GGC CTC CTG CTG

Cys Leu Gly Leu Leu Leu

Val Leu Ser Leu Gly Leu Alá Leu Alá 1 5

GTC Val

GTG GTC AGC

CTG GGG

AGC Ser

TGG Trp

GCA Alá

ACG Thr 25

CTG Leu

TCT Ser

GCC Alá

CAG Gin

GAG Glu 30

CCT Pro

94

Val

Ser

Leu 20

Gly

TCT

CAG

GAG

CTG

ACA

GCA

GAG

GAC

CGC

CGG

GAG

CCC

CCT

GAA

CTG

142

Ser

Gin

Glu

Leu

Thr

Alá

Glu

Asp

Arg

Glu

Pro

Glu

Leu

35

40

45

AAT

CCC

CAG

ACA

GAG

GAA

AGC

CAG

GAT

GTG

GTA

CCT

TTC

TTG

GAA

CAA

190

Asn

Pro

Gin

Thr

Glu

Ser

Gin

Asp

Val

Pro

Phe

Leu

Glu

Gin

50

55

60

CTA

GTC

CGG

CCT

CGA

AGA

AGT

GCT

CCT

AAA

GGC

CGG

AAG

GCG

CGG

CCT

238

Leu

Val

Arg

Pro

Arg

Ser

Alá

Pro

Lys

Gly

Arg

Lys

Alá

Arg

Pro

65

70

75

CGC

CGA

GCT

ATT

GCA

GCC

CAT

TAT

GAG

GTT

CAT

CCT

CGG

CCA

GGA

CAG

286

Arg

Alá

Ile

Alá

His

Tyr

Glu

Val

His

Pro

Arg

Pro

Gly

Gin

80

85

90

95

GAT

GGA

GCA

CAA

GCA

GGT

GTG

GAT

GGG

ACA

GTG

AGT

GGC

TGG

GAA

GAG

334

Asp

Gly

Alá

Gin

Alá

Gly

Val

Asp

Gly

Thr

Val

Ser

Gly

Trp

Glu

100

105

110

ACC

AAA

ATC

AAC

AGC

TCC

AGC

CCT

CTG

CGC

TAC

GAC

CGC

CAG

ATT

GGG

382

Thr

Lys

Ile

Asn

Ser

Pro

Leu

Arg

Tyr

Asp

Arg

Gin

Ile

Gly

115

120

125

GAA

TTT

ACA

GTC

ATC

AGG

GCT

GGG

CTC

TAC

CTG

TAC

TGT

CAG

GTG

430

Glu

Phe

Thr

Val

Ile

Arg

Alá

Gly

Leu

Tyr

Leu

Tyr

Cys

Gin

Val

130

135

140

CAC

TTT

GAT

GAG

GGA

AAG

GCT

GTC

TAC

CTG

AAG

CTG

GAC

TTG

CTG

GTG

478

His

Phe

Asp

Glu

Gly

Lys

Alá

Val

Tyr

Leu

Lys

Leu

Asp

Leu

Val

145

150

155

AAC

GGT

GTG

CTG

GCC

CTG

CGC

TGC

CTG

GAA

TTC

TCA

GCC

ACA

GCA

526

Asn

Gly

Val

Leu

Alá

Leu

Arg

Cys

Leu

Glu

Phe

Ser

Alá

Thr

Alá

160

165

170

175

GCA

AGC

TCT

CCT

GGG

CCC

CAG

CTC

CGT

TTG

TGC

CAG

GTG

TCT

GGG

CTG

574

Alá

Ser

Pro

Gly

Pro

Gin

Leu

Arg

Leu

Cys

Gin

Val

Ser

Gly

Leu

180

185

190

HU 226 787 Β1

TTG

CCG

CTG

CGG

CCA

GGG

TCT

TCC

CTT

CGG

ATC

CGC

ACC

CTC

CCC

TGG

622

Leu

Pro

Leu

Arg

Pro

Gly

Ser

Leu

Arg

Ile

Arg

Thr

Leu

Pro

Trp

195

200

205

GCT

CAT

CTT

AAG

GCT

GCC

CCC

TTC

CTA

ACC

TAC

TTT

GGA

CTC

TTT

CAA

670

Alá

His

Leu

Lys

Alá

Pro

Phe

Leu

Thr

Tyr

Phe

Gly

Leu

Phe

Gin

210

215

220

GTT

CAC

TGAGGGGCCT

TGCTCTCCCA GATTCCTTAA ACTTTCCCTG

GCTCCAGGAG

726

Val

His

225

CATCACCACA CCTCCCTACC CCACCCCCAC TCCTCCACCC CCTCGCTGCT CCTTGGTCCA GTCCTGTCTC TCCTCAAAGG CAGCCAGAGC TTGTTCACAT GTTTCCATTC CACAGACGTA TCCTTGCTCT TCTTAACATC CCATCCCACC ACAACTATCC ACCTCACTAG CTCCCAAAGC CCCTACTTAT CCCTGACTCC CCCACCCACT CACCCGACCA CGTGTTTATT GACTTTGTGC ACCAGGCACT GAGATGGGCT GGACCTGGTG GCAGGAAGCC AGAGAACCTG GGACTAGGCC AGAAGTTCCC AACTGTGAGG GGGAAGAGCT GGGGACAAGC TCCTCCCTGG ATCCCTGTGG ATTTTGAAAA GATACTATTT TTATTATTAT TGTGACAAAA TGTTAAATGG ATATTAAAGA GAATAAATCA TGATTTCTCT TC (2) INFORMATION FÓR SEQ ID NO:2:

(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:

(A) LENGTH: 225 amino acids (B) TYPE: amino acid (D) TOPOLOGY: linear (ii) MOLECULE TYPE: protein (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:2:

786

846

906

966

1026

1086

1146

1168

Val Leu Ser Leu Gly Leu Alá Leu Alá Cys Leu 15 10

Val Val Ser Leu Gly Ser Trp Alá Thr Leu Ser 20 25

Gin Glu Glu Leu Thr Alá Glu Asp Arg Arg Glu 35 40

Pro Gin Thr Glu Glu Ser Gin Asp Val Val Pro 50 55

Val Arg Pro Arg Arg Ser Alá Pro Lys Gly Arg 65 70 75

Arg Alá Ile Alá Alá His Tyr Glu Val His Pro 85 90

Gly Alá Gin Alá Gly Val Asp Gly Thr Val Ser 100 105

Lys Lle Asn Ser Ser Ser Pro Leu Arg Tyr Asp 115 120

Phe Thr Val Ile Arg Alá Gly Leu Tyr Tyr Leu 130 135

Gly Leu Leu Leu Val 15

Alá Gin Glu Pro Ser 30

Pro Pro Glu Leu Asn 45

Phe Leu Glu Gin Leu 60

Lys Alá Arg Pro Arg 80

Arg Pro Gly Gin Asp 95

Gly Trp Glu Glu Thr 110

Arg Gin Ile Gly Glu 125

Tyr Cys Gin Val His 140

HU 226 787 Β1

Phe 145

Asp

Glu

Gly Lys

Alá 150

Val

Tyr

Leu

Lys

Leu 155

Asp

Leu

Val

Asn 160

Gly

Val

Leu

Alá

Leu

Arg

Cys

Leu

Glu

Phe

Ser

Alá

Thr

Alá

165

170

175

Ser

Pro

Gly

Pro

Gin

Leu

Arg

Leu

Cys

Gin

Val

Ser

Gly

Leu

180

185

190

Pro

Leu

Arg

Pro

Gly

Ser

Leu

Arg

He

Arg

Thr

Leu

Pro

Trp

Alá

195

200

205

His

Leu

Lys

Alá

Pro

Phe

Leu

Thr

Tyr

Phe

Gly

Leu

Phe

Gin

Val

210

215

220

His

225 (2) INFORMATION FÓR SEQ ID NO:3:

(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:

(A) LENGTH: 1373 base pairs (Β) ΤΥΡΕ: nucleic acid (C) STRANDEDNESS: double (D) TOPOLOGY: linear (ii) MOLECULE ΤΥΡΕ: cDNA (iii) HYPOTHETICAL: NO (iv) ANTI-SENSE: NO (vi) ORIGINAL SOURCE:

(A) ORGANISM: TNF family related protein (ix) FEATURE:

(A) NAME/KEY: CDS (B) LOCATION: 1..852 (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:3:

ATG Met 1

TCA Ser

TTG Leu

TTA Leu

GAC Asp 5

TTT Phe

GAA Glu

ATT lle

TCC Ser

GCC Alá 10

CGC Arg

CGG Arg

CTC Leu

CCC Pro

CTC Leu 15

CCC Pro

48

CGA

TCC

CTC

GGG

TCC

CGG

GAT

GGG

GCG

GTG

AGG

CAG

GCA

CAG

CCC

96

Arg

Ser

Leu

Gly

Ser

Arg

Asp

Gly

Alá

Val

Arg

Gin

Alá

Gin

Pro

20

25

30

CCC

GCC

CCC

ATG

GCC

CGT

CGG

AGC

CAG

AGG

CGG

AGG

GGG

CGC

CGG

144

Pro

Alá

Pro

Met

Alá

Arg

Ser

Gin

Arg

Gly

Arg

35

40

45

GGG

GAG

CCG

GGC

ACC

GCC

CTG

GTC

CCG

CTC

GCG

CTG

GGC

CTG

GGC

192

Gly

Glu

Pro

Gly

Thr

Alá

Leu

Val

Pro

Leu

Alá

Leu

Gly

Leu

Gly

50

55

60

CTG

GCG

CTG

GCC

TGC

CTC

GGC

CTC

CTG

GCC

GTG

GTC

AGT

TTG

GGG

240

Leu

Alá

Leu

Alá

Cys

Leu

Gly

Leu

Alá

Val

Ser

Leu

Gly

65

70

75

80

HU 226 787 Β1

AGC Ser

CGG Arg

GCA TCG

CTG Leu 85

TCC Ser

GCC Alá

CAG Gin

GAG Glu

CCT Pro 90

GCC Alá

CAG Gin

GAG Glu

CTG Leu 95

GTG Val

288

Alá

Ser

GCA

GAG

GAC

CAG

GAC

CCG

TCG

GAA

CTG

AAT

CCC

CAG

ACA

GAA

336

Alá

Glu

Asp

Gin

Asp

Pro

Ser

Glu

Leu

Asn

Pro

Gin

Thr

Glu

100

105

110

AGC

CAG

GAT

CCT

GCG

CCT

TTC

CTG

AAC

CGA

CTA

GTT

CGG

CCT

CGC

AGA

384

Ser

Gin

Asp

Pro

Alá

Pro

Phe

Leu

Asn

Arg

Leu

Val

Arg

Pro

Arg

115

120

125

AGT

GCA

CCT

AAA

GGC

CGG

AAA

ACA

CGG

GCT

CGA

AGA

GCG

ATC

GCA

GCC

432

Ser

Alá

Pro

Lys

Gly

Arg

Lys

Thr

Arg

Alá

Arg

Alá

Ile

Alá

130

135

140

CAT

TAT

GAA

GTT

CAT

CCA

CGA

CCT

GGA

CAG

GAC

GGA

GCG

CAG

GCA

GGT

480

His

Tyr

Glu

Val

His

Pro

Arg

Pro

Gly

Gin

Asp

Gly

Alá

Gin

Alá

Gly

145

150

155

160

GTG

GAC

GGG

ACA

GTG

AGT

GGC

TGG

GAG

GAA

GCC

AGA

ATC

AAC

AGC

TCC

528

Val

Asp

Gly

Thr

Val

Ser

Gly

Trp

Glu

Alá

Arg

Ile

Asn

Ser

165

170

175

AGC

CCT

CTG

CGC

TAC

AAC

CGC

CAG

ATC

GGG

GAG

TTT

ATA

GTC

ACC

CGG

576

Ser

Pro

Leu

Arg

Tyr

Asn

Arg

Gin

Ile

Gly

Glu

Phe

Ile

Val

Thr

Arg

180

185

190

GCT

GGG

CTC

TAC

CTG

TAC

TGT

CAG

GTG

CAC

TTT

GAT

GAG

GGG

AAG

624

Alá

Gly

Leu

Tyr

Leu

Tyr

Cys

Gin

Val

His

Phe

Asp

Glu

Gly

Lys

195

200

205

GCT

GTC

TAC

CTG

AAG

CTG

GAC

TTG

CTG

GTG

GAT

GGT

GTG

CTG

GCC

CTG

672

Alá

Val

Tyr

Leu

Lys

Leu

Asp

Leu

Val

Asp

Gly

Val

Leu

Alá

Leu

210

215

220

CGC

TGC

CTG

GAG

GAA

TTC

TCA

GCC

ACT

GCG

GCC

AGT

TCC

CTC

GGG

CCC

720

Arg

Cys

Leu

Glu

Phe

Ser

Alá

Thr

Alá

Ser

Leu

Gly

Pro

225

230

235

240

CAG

CTC

CGC

CTC

TGC

CAG

GTG

TCT

GGG

CTG

TTG

GCC

CTG

CGG

CCA

GGG

768

Gin

Leu

Arg

Leu

Cys

Gin

Val

Ser

Gly

Leu

Alá

Leu

Arg

Pro

Gly

245

250

255

TCC

CTG

CGG

ATC

CGC

ACC

CTC

CCC

TGG

GCC

CAT

CTC

AAG

GCT

GCC

816

Ser

Leu

Arg

Ile

Arg

Thr

Leu

Pro

Trp

Alá

His

Leu

Lys

Alá

260

265

270

CCC

TTC

CTC

ACC

TAC

TTC

GGA

CTC

TTC

CAG

GTT

CAC

TGAGGGGCCC

862

Pro

Phe

Leu

Thr

Tyr

Phe

Gly

Leu

Phe

Gin

Val

His

275

280

TGGTCTCCCC

TCCCCTCTGC

GCCTGGGCCT

ACAACTCCCC

CCCCCAGTGA

TCTGTGGGCA

GCGGCAGGAA

ACAGTCGTCC

CCCACCCTCA

GTTCACGTGT

CACCGCCCAC

TCTCGACTCC

AGGATGGGTC

GCCAAAGAGA

CAGGCTGCCG

GCCGCTCTTT

TTTCCATCCC

TCTCCACCTC

CCCCTGGCCA

CAGAAGACCC

CTGGGCCTAG

GCTCCCCTCG

GCTCCAGACC

ACATAAATAC

ACTAGCTCCC

CAGACCCCCA

CACTTCAGGC

GCCAGGAGTT

ACAGCTCTCT

TGCCCCTCCC

AGTATTCCCA

CAATCCCTGA

GGGCATTGTG

ACTAAGAGGG

CCCAAATGTG

GGGCACCCGG

TCTAGAGGCT

CTCTTATCTT

CCCTTTGAGG

TTCACTGTAC

GCTGGACCTG

AGGGGCGAGA

922

982

1042

1102

1162

1222

1282

HU 226 787 Β1

AACAAGACAA GCTCCTCCCT TGAGAATTCC CTGTGGATTT TTAAAACAGA TATTATTTTT ATTATTATTG TGACAAAATG TTGATAAATG G (2) INFORMATION FÓR SEQ ID NO:4:

(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:

(A) LENGTH: 284 amino acids (B) TYPE: amino acid (D) TOPOLOGY: linear (ii) MOLECULE TYPE: protein (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:4:

1342

1373

Met 1

Ser

Leu

Asp 5

Phe

Glu

Ile

Ser

Alá 10

Arg Arg Leu

Pro

Leu 15

Pro

Arg

Ser

Leu

Gly

Ser

Arg

Asp

Gly

Alá

Val

Arg

Gin

Alá

Gin

Pro

20

25

30

Pro

Alá

Pro

Met

Alá

Arg

Ser

Gin

Arg

Gly

Arg

35

40

45

Gly

Glu

Pro

Gly

Thr

Alá

Leu

Val

Pro

Leu

Alá

Leu

Gly

Leu

Gly

50

55

60

Leu

Alá

Leu

Alá

Cys

Leu

Gly

Leu

Alá

Val

Ser

Leu

Gly

65

70

75

80

Ser

Arg

Alá

Ser

Leu

Ser

Alá

Gin

Glu

Pro

Alá

Gin

Glu

Leu

Val

85

90

95

Alá

Glu

Asp

Gin

Asp

Pro

Ser

Glu

Leu

Asn

Pro

Gin

Thr

Glu

100

105

110

Ser

Gin

Asp

Pro

Alá

Pro

Phe

Leu

Asn

Arg

Leu

Val

Arg

Pro

Arg

115

120

125

Ser

Alá

Pro

Lys

Gly

Arg

Lys

Thr

Arg

Alá

Arg

Alá

Ile

Alá

130

135

140

His

Tyr

Glu

Val

His

Pro

Arg

Pro

Gly

Gin

Asp

Gly

Alá

Gin

Alá

Gly

145

150

155

160

Val

Asp

Gly

Thr

Val

Ser

Gly

Trp

Glu

Alá

Arg

Ile

Asn

Ser

165

170

175

Ser

Pro

Leu

Arg

Tyr

Asn

Arg

Gin

Ile

Gly

Glu

Phe

Ile

Val

Thr

Arg

180

185

190

Alá

Gly

Leu

Tyr

Leu

Tyr

Cys

Gin

Val

His

Phe

Asp

Glu

Gly

Lys

195

200

205

Alá

Val

Tyr

Leu

Lys

Leu

Asp

Leu

Val

Asp

Gly

Val

Leu

Alá

Leu

210

215

220

Arg

Cys

Leu

Glu

Phe

Ser

Alá

Thr

Alá

Ser

Leu

Gly

Pro

225 230 235 240

HU 226 787 Β1

Gin	Leu	Arg	Leu	Cys 245	Gin	Val	Ser	Gly
Ser	Ser	Leu	Arg	Ile	Arg	Thr	Leu	Pro
			260					265
Pro	Phe	Leu	Thr	Tyr	Phe	Gly	Leu	Phe
		275					280

Leu	Alá	Leu	Arg	Pro 255	Gly
Alá	His	Leu	Lys 270	Alá	Alá

Val His

Claims

SZABADALMI IGÉNYPONTOK

1. DNS-szekvencia, amely:

(a) egy, az 1. számú szekvenciában (SEQ ID NO: 1) vagy a 3. számú szekvenciában (SEQ ID NO: 3) bemutatott nukleotidszekvenciát tartalmazó DNS-szekvencia;

(b) egy, a 2. számú szekvenciában (SEQ ID NO: 2) vagy a 4. számú szekvenciában (SEQ ID NO: 4) bemutatott aminosavszekvenciával rendelkező polipeptidet kódoló DNS-szekvencia;

(c) egy, a (b) pont szerinti polipeptid egy olyan fragmentumát kódoló DNS-szekvencia, amely fragmentum a sejthalált szabályozó képességgel rendelkezik;

(d) egy, olyan DNS-szekvencia, amely az (a) pont szerinti DNS-szekvenciával 60%-ban homológ, és amely egy olyan polipeptidet kódol, amely a sejthalált szabályozó képességgel rendelkezik;

(e) egy, az (a)-(c) pontok bármelyike szerinti DNS-szekvenciához képest degenerált DNS-szekvencia; és (f) egy, az (a)-(e) pontok bármelyike szerinti DNSszekvencia által kódolt polipeptid egy olyan oldható formáját kódoló DNS-szekvencia, amely megtartja a sejthalált szabályozó képességét; vagy ezek komplementer szálai által alkotott csoportból kiválasztott.
2. Az 1. igénypont szerinti DNS-szekvencia, amely DNS-szekvencia egy olyan DNS-szekvencia, amely egy, a 4. számú szekvenciával (SEQ ID NO: 4) megadott aminosavszekvenciával rendelkező polipeptidet kódol, vagy ennek komplementer szála.
3. Az 1. igénypont (c) pontja szerinti DNS-szekvencia, ahol a polipeptid fragmentuma egy:

(i) az 1. számú szekvencia (SEQ ID NO: 1) 65-241. nukleotidjainak, vagy (ii) a 3. számú szekvencia (SEQ ID NO: 3) 241-417. nukleotidjainak megfelelő bármely nukleotidhelyzetek által kódolt aminosavnál kezdődő aminoterminálissal rendelkezik.
4. Az 1. igénypont (c) pontja vagy a 3. igénypont szerinti DNS-szekvencia, ahol a DNS-szekvencia által kódolt fragmentum:

(i) a 2. számú szekvencia (SEQ ID NO: 2) 22-80. aminosavainak; vagy (ii) a 4. számú szekvencia (SEQ ID NO: 4) 81-139. aminosavainak megfelelő bármely aminosavhelyzetnél kezdődő aminoterminálissal rendelkezik.
5. Az 1. igénypont (c) pontja szerinti DNS-szekvencia, amely DNS-szekvencia a 3. számú szekvencia (SEQ ID NO: 3) 106-852. nukleotidjait tartalmazza.
6. Az 1. igénypont (c) pontja vagy az 5. igénypont szerinti DNS-szekvencia, amely DNS-szekvencia által kódolt fragmentum a 4. számú szekvencia (SEQ ID NO: 4) 36-284. aminosavait tartalmazza.
7. Az 1-6. igénypontok bármelyike szerinti DNSszekvencia, amely cDNS vagy genomiális DNS.
8. Rekombináns DNS-molekula, amely egy, az 1-7. igénypontok bármelyikében meghatározott olyan DNSszekvenciát tartalmaz, amely DNS-szekvencia működőképesen kapcsolódik egy expressziós szabályozószekvenciához.
9. Gazdasejt, amely egy, az 1-7. igénypontok bármelyikében meghatározott DNS-szekvenciát tartalmazó vektorral transzformált.
10. A 9. igénypont szerinti gazdasejt, amely egy prokarióta vagy eukarióta sejt.
11. Eljárás egy, az 1-7. igénypontok bármelyike szerinti DNS-szekvencia által kódolt polipeptid előállítására, azzal jellemezve, hogy tartalmazza a 9. igénypont szerinti gazdasejt tenyésztésének lépését.
12. TRELL-polipeptid vagy fragmentuma, amelynek aminosavszekvenciája:

(a) egy, a 2. számú szekvenciában (SEQ ID NO: 2) vagy a 4. számú szekvenciában (SEQ ID NO: 4) bemutatott aminosavszekvenciával rendelkező polipeptid;

(b) az (a) pont szerinti polipeptid egy olyan fragmentuma, amely fragmentum a sejthalált szabályozó képességgel rendelkezik;

(c) a (b) pont szerinti olyan fragmentum, amely a 2. számú szekvencia (SEQ ID NO: 2) 22-80. aminosavait, a 4. számú szekvencia (SEQ ID NO: 4) 81-139. aminosavait vagy a 4. számú szekvencia (SEQ ID NO: 4) 36-284. aminosavait tartalmazza;

(d) a 2. számú szekvenciában (SEQ ID NO: 2) vagy a 4. számú szekvenciában (SEQ ID NO: 4) bemutatott aminosavszekvenciához 70% homológiával rendelkező olyan polipeptid, amely polipeptid rendelkezik a sejthalált szabályozó képességgel;

(e) egy, az 1. számú szekvenciában (SEQ ID NO: 1) vagy a 3. számú szekvenciában (SEQ ID NO: 3) bemutatott DNS-szekvencia által kódolt polipeptid; és (f) egy, a 11. igénypont szerinti eljárással nyerhető olyan polipeptid, amely a sejthalált szabályozó képességgel rendelkezik;

által alkotott csoportból kiválasztott.
13. A 12. igénypont szerinti TRELL-polipeptid, amely polipeptid a 12. igénypont (c) pontja szerinti polipeptid.

HU 226 787 Β1
14. Antitest vagy antigénkötő fragmentuma, amely specifikusan reagál a 12. igénypont szerinti polipeptiddel, amely polipeptid a sejthalált szabályozó képességgel rendelkezik.
15. A 14. igénypont szerinti antitest vagy antigénkötő fragmentum, amely specifikusan reagál a 12. igénypont (a) pontja szerinti polipeptiddel.
16. A 14. igénypont szerinti antitest vagy antigénkötő fragmentum, amely monoklonális, poliklonális, kiméra vagy humanizált.
17. A 14. igénypont szerinti antitest vagy antigénkötő fragmentum, amely fragmentum egy Fab’ vagy F(ab’)₂ fragmentum.
18. Készítmény, amely az 1-7. igénypontok bármelyike szerinti DNS-szekvenciát, a 8. igénypont szerinti rekombináns DNS-molekulát, a 9. igénypont szerinti gazdasejtet, a 12. igénypont szerinti poli5 peptidet és/vagy a 14-17. igénypontok bármelyike szerinti antitestet vagy antigénkötő fragmentumot tartalmazza.
19. A 18. igénypont szerinti készítmény, amely egy, továbbá még adott esetben gyógyszerészetileg elfo10 gadható hordozókat, adjuvánsokat vagy töltőanyagokat is tartalmazó gyógyszerkészítmény.
20. A 18. igénypont szerinti készítmény, amely egy diagnosztikai készítmény.