PL188102B1

PL188102B1 - Zasadniczo czysta sekwencja DNA, cząsteczka rekombinowanego DNA, komórki gospodarza transformowane cząsteczką rekombinowanego DNA, zasadniczo czysty polipeptyd Liganda Pokrewnego z Czynnikiem Martwicy Nowotworu, sposobu wytwarzania tego polipeptydu,kompozycje farmaceutyczne, zastosowanie polipeptydu Liganda Pokrewnego z Czynnikiem Martwicy Nowotworu, fragment rozpuszczalny polipeptydu Liganda Pokrewnego z Czynnikiem Martwicy Nowotworu, sposób wytwarzania przeciwciała skierowanego przeciwko polipeptydowi Liganda Pokrewnego z Czynnikiem Martwicy Nowotworu, sposób identyfikowania receptora dla polipeptydu Li

Info

Publication number: PL188102B1
Application number: PL97331583A
Authority: PL
Inventors: Yves Chicheportiche; Jeffrey L Browning
Original assignee: Biogen; Faculty Of Medicine Of The Uni
Priority date: 1996-08-07
Filing date: 1997-08-07
Publication date: 2004-12-31
Also published as: DE69734397T2; BG64779B1; ES2251737T3; EE05276B1; EP0956351B1; ATE307204T1; SK15799A3; NO20084906L; CZ40399A3; JP4161084B2; AU736289B2; CN1232503A; JP2007204480A; EA199900187A1; EA003187B1; JP2009183294A; EP1591530B1; NO990550D0; IS2606B; BR9711046A

Abstract

1. Zasadniczo czysta sekwencja DNA obejmujaca nastepujace po sobie nukleotydy, kodujace polipeptyd L iganda Pokrewnego z Czynnikiem Martwicy Nowotworu, która zasadniczo sklada sie z sekwencji wedlug Id. Sekw. nr 1 albo Id. Sekw. nr 3. 6. Sposób wytwarzania zasadniczo czystego polipeptydu Liganda Pokrewnego z Czynnikiem Martwicy Nowotworu o sekwencji Id. Sekw. nr 2 lub Id. Sekw. nr 4 lub jego rozpuszczalnego fragmentu, znamienny tym, ze obejmuje etap hodowania jednokomórkowego gospodarza transformowanego czasteczka rekombi- nowanego DNA, która obejmuje sekwencje DNA kodujaca polipeptyd Liganda Pokrewnego z Czynnikiem Martwicy Nowotworu funkcjonalnie polaczona z sekwencja kontrolujaca ekspresje, a ta sekwencja DNA hybrydyzuje w ostrych warunkach z sekwencja o Id. Sekw. nr 1 albo o Id. Sekw. nr 3, przy czym te ostre warunki obejmuja etapy przemywania przy uzyciu 2x SSC, 0,1% SDS przy 65°C. 8. Sposób wytwarzania zasadniczo czystego polipeptydu Liganda Pokrewnego z Czynnikiem Martwicy Nowotworu, znamienny tym, ze obejmuje etap hodowania komórki jednokomórkowego gospodarza trans- formowanej czasteczka rekombinowanego DNA, a ta czasteczka obejmuje sekwencje DNA funkcjonalnie polaczona z sekwencja kontrolujaca ekspresje, przy czym ta sekwencja DNA obejmuje kolejne nukleotydy, które koduja polipeptyd Liganda Pokrewnego z Czynnikiem Martwicy Nowotworu, który obejmuje konser- watywne substytucje, zmiany, lub delecje sekwencji aminokwasowej o Id. Sekw. nr 2 albo Id. Sekw. nr 4, które nie znosza biologicznej aktywnosci polipeptydu Liganda Pokrewnego z Czynnikiem Martwicy Nowo- tworu. 9. Kompozycja farmaceutyczna, znamienna tym, ze obejmuje skuteczna terapeutycznie ilosc peptydu Liganda Pokrewnego z Czynnikiem Martwicy Nowotworu, który ma sekwencje wybrana z sekwencji amino- kwasowej o Id. Sekw. nr 2 lub Id. Sekw. nr 4 i dopuszczalny farmaceutycznie nosnik. 10. Zastosowanie polipeptydu Liganda Pokrewnego z Czynnikiem Martwicy Nowotworu okreslonego w zastrz. 4 do wytwarzania kompozycji farmaceutycznej do zapobiegania i zmniejszania stopnia zaawanso- wania choroby autoimmunizacyjnej u pacjenta. PL PL PL

Description

Przedmiotem wynalazku są zasadniczo czysta sekwencja DNA, cząsteczka rekombinowanego DNA, komórka, zasadniczo czysty polipeptyd Liganda Pokrewnego z Czynnikiem Martwicy Nowotworu, sposoby wytwarzania tego polipeptydu, kompozycje farmaceutyczne, zastosowanie polipeptydu Liganda Pokrewnego z Czynnikiem Martwicy Nowotworu, sposób identyfikowania receptora dla polipeptydu Liganda Pokrewnego z Czynnikiem Martwicy Nowotworu, fragment rozpuszczalny polipeptydu Liganda Pokrewnego z Czynnikiem Martwicy Nowotworu, sposób wytwarzania przeciwciała przeciw polipeptydowi Liganda Pokrewnego z Czynnikiem Martwicy Nowotworu, sposób wyrażania tego polipeptydu, zastosowanie wektora i zastosowanie czynnika zdolnego do interferowania z wiązaniem polipeptydu Liganda Pokrewnego z Czynnikiem Martwicy Nowotworu.

Opisany tu wynalazek został dokonany częściowo w trakcie pracy ufundowanej przez Swiss National Found dla Irene Garcia grantem nr #31-42275.94 i 32-41729.94. Zachowane są prawa opisane w paragrafie #28 i #29 statutu Swiss National Found.

Cytokiny pokrewne z czynnikiem martwicy nowotworu (TNF) są mediatorami obrony gospodarza i regulacji odporności. Członkowie tej rodziny występują w postaci zakotwiczonej w błonie, działając miejscowo przez kontakt międzykomórkowy, albo w postaci białek wydzielniczych zdolnych do dyfuzji do bardziej odległych celów. Równoległa rodzina receptorów sygnalizuje obecność tych cząsteczek prowadząc do zapoczątkowania śmierci komórkowej albo proliferacji i różnicowania docelowej tkanki. Obecnie, rodzina ligandów i receptorów TNF obejmuje 9 rozpoznanych par receptor-ligand, w tym: TNF:TNF-R; LT-a:TNF-R; LT-a/p:LT-p-R; FasL:Fas; CD40L:CD40; CD30L:CD30; CD27L:CD27; OX40L:OX40 i 4-lBBL:4-lBB. Sekwencje DNA kodujące te ligandy wykazują jedynie około 25%-30%

188 102 identyczność nawet w najbardziej spokrewnionych przypadkach, jakkolwiek pokrewieństwo aminokwasów wynosi około 50%.

Główna cecha tej rodziny receptorów cytokin spotykana jest w bogatej w cysteinę domenie zewnątrzkomórkowej, wykazanej oryginalnie przez klonowanie dwóch różnych receptorów TNF¹. Ta rodzina genów koduje glikoproteiny charakterystyczne dla białek śródbłonowych typu 1, z zewnątrzkomórkową domeną wiążącą ligand, pojedynczym regionem błonowym i regionem śródplazmatycznym związanym z aktywacją funkcji komórkowych. Bogaty w cysteinę region wiążący ligand wykazuje ściśle splecioną domenę rdzeniową połączoną wiązaniami disiarczkowymi, która, zależnie od konkretnego członka rodziny powtarza się wielokrotnie. Większość receptorów posiada cztery domeny, jakkolwiek może ich być tylko trzy, jak również aż sześć.

Białka rodziny ligandów TNF charakteryzują się krótkim ciągiem końca N krótkich aminokwasów hydrofitowych, często zawierających kilka reszt lizyny albo argininy, które są uważane za sekwencje zatrzymujące przenoszenie. Następnie, występuje region śródbłonowy oraz region zewnątrzkomórkowy o różnej długości, który oddziela koniec C domeny wiążącej ligand receptora od błony. Region ten określa się często jako „stalk”. Region wiążący końca C obejmuje większość białka i często, choć nie zawsze, miejsca glikozylacji. Geny te pozbawione są sekwencji sygnałowych charakterystycznych dla białek błonowych typu I, posiadając budowę białek błonowych typu II z końcem C leżącym na zewnątrz komórki, oraz krótkim końcem N leżącym w cytoplazmie. W niektórych przypadkach, np. TNF i LT-a, podczas obróbki białka może nastąpić odcięcie regionu „stalk” i ligand spotyka się głównie w postaci wydzielniczej. Większość ligandów jednakże występuje w postaci związanej z błoną, pośrednicząc w sygnalizacji miejscowej.

Budowę tych ligandów dobrze określono przy użyciu analiz krystalograficznych TNF, LT-a i CD40L. TNF i limfotoksyna-a (LT-a) zbudowane są jako „kanapka” dwóch anty-równoległych płacht β o topologii typu Jelly roli” albo klucza greckiego². Odchylenie rms pomiędzy resztami nici Ca i β wynosi 0,61 C, co sugeruje wysoki stopień podobieństwa ich topografii molekularnej. Cechą strukturalną wynikającą z badań molekularnych CD40L, TNF i LT-a jest skłonność do łączenia się w oligomeryczne kompleksy. Powoduje to w oligomerycznych strukturach powstanie miejsc wiązania receptora na styku pomiędzy sąsiadującymi podjednostkami tworzącymi multimerowy ligand. Przez analizę krystalograficzną wykazano, że TNF, CD40L i LT-a występują w swej czwartorzędowej strukturze jako trimery.- Wiele spośród aminokwasów zakonserwowanych w różnych ligandach stanowi ciągi zrębowe płacht p. Jest prawdopodobne, że podstawowa struktura kanapkowa jest zachowana we wszystkich spośród tych cząsteczek, ponieważ części tych struktur zrębowych są zakonserwowane wśród różnych członków rodziny. Podobnie możliwe jest, że struktura czwartorzędowa może być również zachowana z powodu konformacji podjednostki.

Członków rodziny TNF można opisać jako główne przełączniki układu odpornościowego, kontrolujące zarówno przeżycie jak i różnicowanie. Obecnie, jedynie TNF i LT-a są uważane za cytokiny wydzielnicze, w przeciwieństwie do innych głównie zakotwiczonych w błonie białek rodziny TNF. O ile dobrze scharakteryzowano postać błonową TNF i jest możliwe, że posiada unikalną rolę biologiczną, wydzielniczy TNF działa jako ogólny sygnał alarmowy działając na komórki odległe od miejsca zjawiska wyzwalającego. Tak więc wydzielenie TNF może zwielokrotnić zjawisko prowadzące do dobrze opisanych zmian w wyściółce naczyń oraz stanie zapalnym komórek. W przeciwieństwie, zakotwiczeni w błonie członkowie rodziny wysyłają sygnały przez receptor TNF jedynie do komórek znajdujących się w bezpośrednim kontakcie. Przykładowo, limfocyty T udzielają „pomocy za pośrednictwem CD40 jedynie tym limfocytom B, które znajdują się w bezpośrednim kontakcie dzięki oddziaływaniu przez TCR. Podobne ograniczenie do kontaktu międzykomórkowego dotyczy zdolności do wywoływania śmierci komórkowej w dobrze poznanym układzie Fas.

Zdolność do wywoływania programowanej śmierci komórkowej jest istotną i dobrze badaną cechą kilku członków rodziny TNF. Apoptoza za pośrednictwem Fas jak się wydaje, odgrywa rolę w regulacji limfocytów autoreaktywnych na obwodzie i prawdopodobnie w grasicy (Castro i in., 1996), zaś ostatnie wyniki powiązały układy TNF i CD30 z przeżywa6

188 102 niem linii limfocytów T i wielkokomórkowych chłoniaków anaplastycznych (Amakawa i in., 1996; Gruss i in., 1994; Sytwu i in., 1996; Zheng i in., 1995). Twórcy wynalazku i inni autorzy wykazali uprzednio, że śmierć tych linii w reakcji na sygnalizację przez receptor TNF, Fas albo LT-β wykazuje cechy apoptozy (Abreu-Martin i in., 1995; Browning i in., 1996).

Wydaje się, że można podzielić ligandy TNF na trzy grupy, w oparciu o ich zdolność do wywoływania śmierci komórkowej (tabela lit). Po pierwsze, TNF, ligand Fas i TRATT potrafią skutecznie wywoływać śmierć komórkową w wielu liniach, zaś ich receptory w większości posiadają dobrą zgodność domen śmierci komórkowej. Prawdopodobnie, ligand DR-3 (TRAMP/WSL-1) powinien również należeć do tej kategorii. Następnie, istnieją ligandy, które wyzwalają słaby sygnał śmierci komórkowej ograniczony do kilku rodzajów komórek, zaś przykładami w tej grupie są TRELL, ligand CD30 i LTalb2. Interesującą kwestią jest sposób, za pomocą którego grupa ta jest zdolna do wyzwolenia śmierci komórkowej pod nieobecność domen śmierci, co może sugerować, że istnieje osobny słabszy mechanizm sygnalizacji śmierci. Ostatnią grupę stanowią członkowie, którzy nie potrafią skutecznie dostarczać sygnału śmierci. Prawdopodobnie, wszystkie grupy wywołują działanie antyproliferacyjne wobec niektórych rodzajów komórek w następstwie wywoływania różnicowania komórek, np. CD40 (Funakoshi i in., 1994).

Rodzina TNF urosła dramatycznie w ostatnich latach obejmując przynajmniej 11 różnych szlaków sygnalizacji dotyczących regulacji układu odpornościowego. Wzorzec ekspresji TRELL i TRADL wskazuje, że w rodzinie tej wciąż istnieje nie odkryta zmienność funkcjonalna. Aspekt ten jest szczególnie widoczny w świetle ostatniego odkrycia dwóch receptorów, które wpływają na zdolność do replikacji wirusa mięsaka Rous'a i opryszczki pospolitej, jak również historycznych obserwacji, że TNF wykazuje aktywność przeciwwirusową, zaś wirusy ospy kodują wabikowe receptory TNF (Brojatsch i in., 1996; Montgomery i in., 1996; Smith 1994; Vassalli 1992). Wytworzenie rozpuszczalnego TRELL i identyfikacja receptorów TRELL powinna dostarczyć narzędzi do wyjaśnienia działania biologicznego tego interesującego białka.

TNF jest mediatorem wstrząsu septycznego i kacheksji, i jest związany z regulacją rozwoju układu krwiotwórczego. Wydaje się, że odgrywa główną rolę jako mediator stanu zapalnego i obrony przed zakażeniami bakteryjnymi, wirusowymi i pasożytniczymi, jak również wykazuje działanie przeciwnowotworowe. TNF jest również związany z różnymi chorobami autoagresyjnymi. TNF może być również wytwarzany przez kilka rodzajów komórek, w tym przez makrofagi, fibroblasty, limfocyty T i naturalne komórki niszczące. TNF wiąże się z dwoma różnymi receptorami, z których każdy działa przez swoiste cząsteczki wewnątrzkomórkowe, powodując różne działania TNF. TNF może występować w postaci związanej z błoną albo jako rozpuszczalna cytokina wydzielnicza.

LT-a wykazuje wiele wspólnych aktywności z TNF, tj. wiąże się z receptorami TNF, ale w przeciwieństwie do TNF wydaje się być głównie wydzielana przez aktywowane limfocyty T i niektóre nowotwory β-limfoblastoidalne. Kompleks heteromeryczny LT-a i LT-β jest kompleksem związanym z błoną, który wiąże się z receptorem LT-β. Układ LT (LTs albo LT-R) wydaje się być związany z rozwojem obwodowych narządów limfatycznych, ponieważ genetyczne zniszczenie LT-β prowadzi do dezorganizacji limfocytów T i B w śledzionie i brak węzłów chłonnych. Układ LT-β jest również związany ze śmiercią komórkową niektórych linii komórkowych gruczolakoraków.

Fas-L, inny członek rodziny TNF, ulega głównie ekspresji na aktywowanych limfocytach T. Wywołuje on śmierć komórek niosących receptor dla niego, w tym komórek nowotworowych i zakażonych HIV, w mechanizmie znanym jako programowana śmierć komórkowa albo apoptoza. Ponadto, niedobory Fas albo Fas-L mogą prowadzić do chorób limfoproliferacyjnych, potwierdzając rolę układu Fas w regulacji reakcji odpornościowej. Układ Fas jest również związany ze zniszczeniem wątroby w wyniku przewlekłego zapalenia wątroby oraz z autoagresją u pacjentów zakażonych HIV. Układ Fas jest również związany ze zniszczeniem limfocytów T u pacjentów z HIV. TRAIL, inny członek tej rodziny wydaje się być związany ze śmiercią wielu rodzajów transformowanych linii komórkowych różnego pochodzenia.

CD40-L, inny członek rodziny TNF, ulega ekspresji na limfocytach T i wywołuje regulację limfocytów B niosących CD40. Ponadto, zmiany w genie CD40-L powodują chorobę znaną jako zespół hiper-IgM sprzężony z chromosomem X. Układ CD40 jest również związany z różnymi chorobami autoagresyjnymi, zaś CD40-L wykazuje działanie przeciwwirusowe.

Jakkolwiek, układ CD40 związany jest z ratowaniem apoptotycznych limfocytów B, w komórkach poza układem odpornościowym wywołuje apoptozę. Wiele innych limfocytarnych członków rodziny TNF związanych jest również z ko-stymulacją.

Ogólnie, członkowie rodziny tNf odgrywają fundamentalną rolę regulacyjną w kontrolowaniu układu odpornościowego i aktywacji układów ostrej odporności gospodarza. Wziąwszy pod uwagę współczesny postęp w manipulowaniu rodziną TNF w celach terapeutycznych, możliwe jest, że członkowie tej rodziny mogą zapewnić unikalne możliwości kontrolowania choroby. Niektóre ligandy tej rodziny mogą bezpośrednio wywoływać śmierć z apoptozy w wielu komórkach transformowanych, np. LT, TNF, ligandem Fas i TRAIL (Nagata, 1997). Aktywacja receptorów Fas i prawdopodobnie TNF i CD30 może wywołać śmierć komórkową w nietransformowanych limfocytach, co może odgrywać rolę immunoregulacyjną (Amakawa i in., 1996; Nagata 1997; Sytwu iin., 1996; Zheng iin., 1995). Ogólnie, śmierć jest wyzwalana w wyniku agregacji domen śmierci komórkowej, które znajdują się po cytoplazmatycznej stronie receptorów TNF. Domena śmierci kieruje łączeniem się różnych składników przekaźnictwa sygnałów, co powoduje aktywację kaskady (Nagata 1997). Niektórym receptorom brak domen śmierci, np. receptorowi LTb i CD30 (Browning i in., 1996; Lee i in., 1996), mimo to mogą wywoływać śmierć komórkową ale znacznie słabiej. Możliwe jest, że receptory te działają głównie wywołując różnicowanie komórek, zaś śmierć jest wynikiem zaburzeń w niektórych transformowanych liniach komórkowych, jakkolwiek obraz ten jest niejasny ponieważ badania na myszach pozbawionych CD30 wskazują na rolę śmierci w selekcji negatywnej w grasicy (Amakawa i in., 1996). I odwrotnie, sygnalizacja przez inne szlaki jak CD40 jest konieczna do zachowania przeżywania komórek. Tak więc, istnieje potrzeba identyfikacji i charakteryzacji innych cząsteczek będących członkami rodziny TNF, dostarczając w ten sposób dodatkowych sposobów kontrolowania choroby i manipulacji układem odpornościowym. ₍

Wynalazek dotyczy polipeptydu, liganda pokrewnego z czynnikiem martwicy nowotworu, zwanego TRELL, który zasadniczo rozwiązuje jeden albo wiele problemów spowodowanych ograniczeniami i niedogodnościami stanu techniki. Wynalazek dostarcza nowego przedstawiciela rodziny cytokin TNF i określa sekwencję aminokwasową białka ludzkiego i mysiego, jak również sekwencje DNA kodujące te białka. Wynalazek można zastosować do identyfikacji nowych środków diagnostycznych i terapeutycznych w wielu chorobach i stanach jak omówione szczegółowo powyżej, jak również w celu uzyskania informacji o układzie odpornościowym, zachodzących w nim procesach i możliwości manipulacji.

Dodatkowe cechy i zalety wynalazku zostaną podane niżej w poniższym opisie oraz częściowo staną się oczywiste w oparciu o opis, albo mogą być wywnioskowane przez przeprowadzenie wynalazku. Cele i inne korzyści wynikające z wynalazku zostaną zrealizowane i osiągnięte dzięki kompozycjom i sposobom szczegółowo przedstawionym w opisie i zastrzeżeniach, jak również w dołączonych rysunkach.

Tak więc, w celu uzyskania tych i innych korzyści oraz zgodnie z celem wynalazku, jak to szeroko opisano, wynalazek obejmuje zasadniczo czystą sekwencję DNA kodującą polipeptyd Liganda Pokrewnego z Czynnikiem Martwicy Nowotworu dalej określanego jako TRELL, która zasadniczo składa się z sekwencji według Id. Sekw. nr 1 albo Id. Sekw. nr 3. Sekwencja przedstawiona w Id Sekw. nr 1 jest sekwencją mysiego TRELL (mTRELL), zaś sekwencja przedstawiona wid. Sekw. nr 3 jest sekwencją ludzkiego TRELL (hTRELL). W zakres wynalazku wchodzi też cząsteczka rekombinowanego DNA obejmująca sekwencję DNA określoną powyżej, która jest połączona funkcjonalnie z sekwencją kontrolującą ekspresję oraz komórka jednokomórkowego gospodarza transformowana tą cząsteczką rekombinowanego DNA.

W wynalazku jest przydatna dowolna odpowiednia sekwencja kontrolująca ekspresję, która może być łatwo wybrana przez specjalistę.

188 102

W wynalazku, może być zastosowany dowolny odpowiedni gospodarz, który może być łatwo wybrany przez specjalistę bez nadmiernego eksperymentowania.

Wynalazek obejmuje zasadniczo czysty TRELL mający biologicznie funkcjonalną sekwencję wybraną z sekwencji aminokwasowej o Id Sekw. nr 2 albo Id. Sekw. nr 4 również w postaci fragmentów albo homologów. W różnych wykonaniach, sekwencja aminokwasowa i/lub DNA TRELL może obejmować konserwatywne insercje, delecje i substytucje, jak dalej określone albo może obejmować fragmenty takich sekwencji.

Wynalazek dotyczy także sposobów wytwarzania zasadniczo czystego TRELL, obejmujących etap hodowania transformowanego gospodarza jednokomórkowego określonego powyżej, oraz TRELL zasadniczo wolnego od normalnie towarzyszących białek zwierzęcych.

Jeden ze sposobów objętych wynalazkiem obejmuje etap hodowania jednokomórkowego gospodarza transformowanego cząsteczką rekombinowanego DNA, przy czym cząsteczka ta obejmuje sekwencję DNA funkcjonalnie połączoną z sekwencją kontrolującą ekspresję, a ta sekwencja DNA hybrydyzuje w surowych warunkach z sekwencją o Id. Sekw. nr 1 albo o Id. Sekw. nr 3, przy czym te surowe warunki obejmują etapy przemywania przy użyciu 2x SSC, 0,1% SDS przy 65°C, a ta sekwencja DNA koduje polipeptyd Liganda Pokrewnego z Czynnikiem Martwicy Nowotworu o sekwencji Id. Sekw. nr 2 lub Id. Sekw. nr 4 lub jego rozpuszczalny fragment, zdolny do wiązania z komórką wybraną z grupy składającej się z:

a) komórki promielocytowej K562,

b) komórki białaczki monocytowej THP-1,

c) komórki gruczolakoraka jelita HT29,

d) komórki zarodkowej nerki 293; i

e) komórki fibroblastów nerki COS.

Inny sposób według wynalazku obejmuje etap hodowania komórki jednokomórkowego gospodarza transformowanej cząsteczką rekombinowanego DNA, a ta cząsteczka obejmuje sekwencję DNA funkcjonalnie połączoną z sekwencją kontrolującą ekspresję, przy czym ta sekwencja DNA obejmuje kolejne nukleotydy, które kodują polipeptyd Liganda Pokrewnego z Czynnikiem Martwicy Nowotworu, który obejmuje konserwatywne substytucje, zmiany, lub delecje sekwencji aminokwasowej o Id. Sekw. nr 2 albo Id. Sekw. nr 4, które nie znoszą biologicznej aktywności polipeptydu Liganda Pokrewnego z Czynnikiem Martwicy Nowotworu.

Wynalazek dotyczy też kompozycji farmaceutycznej, która obejmuje skuteczną terapeutycznie ilość peptydu Liganda Pokrewnego z Czynnikiem Martwicy Nowotworu, któiy ma sekwencję wybraną z sekwencji aminokwasowej o Id. Sekw. nr 2 lub Id. Sekw. nr 4 i dopuszczalny farmaceutycznie nośnik. Kompozycje farmaceutyczne według wynalazku mogą ewentualnie obejmować dopuszczalne farmaceutycznie adiuwanty, wypełniacze albo inne kompozycje farmaceutyczne oraz mogą być podawane również znanymi drogami.

W zakres wynalazku wchodzi także zastosowanie polipeptydu Liganda Pokrewnego z Czynnikiem Martwicy Nowotworu określonego powyżej, do wytwarzania kompozycji farmaceutycznej do zapobiegania i zmniejszania stopnia zaawansowania choroby autoimmunizacyjnej u pacjenta, do zapobiegania i zmniejszania nasilenia reakcji odpornościowej na przeszczep tkankowy u pacjenta, do stymulowania odpowiedzi odpornościowej u pacjenta, do tłumienia układu odpornościowego u pacjenta, do leczenia raka u pacjenta.

Wynalazek dotyczy również sposobu identyfikowania receptora dla polipeptydu Liganda Pokrewnego z Czynnikiem Martwicy Nowotworu, który obejmuje etapy:

a) dostarczania polipeptydu Liganda Pokrewnego z Czynnikiem Martwicy Nowotworu mającego biologicznie funkcjonalną sekwencję wybraną z sekwencji aminokwasowej o Id. Sekw. nr 2 albo Id. Sekw. nr 4 lub jego fragmentu;

b) znakowania tego polipeptydu Liganda Pokrewnego z Czynnikiem Martwicy Nowotworu lub jego fragmentu; i

c) poszukiwanie kompozycji do wykrywania receptorów, które wiążą się z wykrywalnie znakowanym polipeptydem Liganda Pokrewnego z Czynnikiem Martwicy Nowotworu lub jego fragmentem z etapu b.

Wynalazek dotyczy również fragmentu rozpuszczalnego polipeptydu Liganda Pokrewnego z Czynnikiem Martwicy Nowotworu, który wykazuje biologiczną aktywność polipepty188 102 du Liganda Pokrewnego z Czynnikiem Martwicy Nowotworu i obejmuje koniec aminowy, który rozpoczyna się pomiędzy aminokwasami numer 22 i 80 Id. Sekw. nr 2 lub aminokwasami numer 81 i 139 Id. Sekw. nr 4.

Wynalazek dotyczy ponadto sposobu wytwarzania przeciwciała skierowanego przeciw polipeptydowi Liganda Pokrewnego z Czynnikiem Martwicy Nowotworu mającemu biologicznie funkcjonalną sekwencję wybraną z sekwencji aminokwasowej o Id. Sekw. nr 2 albo Id. Sekw. nr 4, przy czym sposób ten obejmuje etapy immunizowania zwierzęcia tym polipeptydem lub jego antygenowym fragmentem i izolowania tego przeciwciała od tego zwierzęcia.

Wynalazek dotyczy także kompozycji farmaceutycznej obejmującej skuteczną terapeutycznie ilość przeciwciała skierowanego przeciwko polipeptydowi Liganda Pokrewnego z Czynnikiem Martwicy Nowotworu lub jego antygenowemu fragmentowi i ewentualnie dopuszczalny farmaceutycznie nośnik.

Wynalazek dotyczy również sposobu wyrażania polipeptydu Liganda Pokrewnego z Czynnikiem Martwicy Nowotworu in vitro w zwierzęcej hodowli komórkowej, obejmującego:

a) wprowadzenie wektora obejmującego sekwencję DNA mającą następujące po sobie nukleotydy, które kodują ten polipeptyd Liganda Pokrewnego z Czynnikiem Martwicy Nowotworu do tej hodowli komórkowej, przy czym ten polipeptyd Liganda Pokrewnego z Czynnikiem Martwicy Nowotworu obejmuje sekwencję aminokwasową Id. Sekw. nr 2 lub Id. Sekw. nr 4 lub ich fragment; i

b) utrzymanie tej hodowli komórkowej w stanie żywym w warunkach, w których wyrażana jest w niej wymieniona sekwencja DNA.

Ponadto wynalazek dotyczy zastosowania wektora obejmującego sekwencję DNA mającą następujące po sobie nukleotydy, które kodują polipeptyd Liganda Pokrewnego z Czynnikiem Martwicy Nowotworu o sekwencji wybranej z sekwencji aminokwasowej Id. Sekw. nr 2 lub Id. Sekw. nr 4 do wytwarzania kompozycji farmaceutycznej do leczenia zaburzeń mających związek z polipeptydem Liganda Pokrewnego z Czynnikiem Martwicy Nowotworu u ssaków, korzystnie u człowieka. Korzystnie wektorem jest wirus.

Wynalazek dotyczy również zastosowania czynnika zdolnego do interferowania z wiązaniem polipeptydu Liganda Pokrewnego z Czynnikiem Martwicy Nowotworu mającego biologicznie frnd<cjonalną sekwencję wybraną z sekwencji aminokwasowej o Id. Sekw. nr 2 albo Id. Sekw. nr 4 z receptorem do wytwarzania kompozycji farmaceutycznej do indukowania śmierci komórki u pacjenta, korzystnie kompozycja ta obejmuje interferon-y.

Ponadto wynalazek dotyczy zastosowania czynnika zdolnego do interferowania z połączeniem pomiędzy polipeptydem Liganda Pokrewnego z Czynnikiem Martwicy Nowotworu mającego biologicznie funkcjonalną sekwencję wybraną z sekwencji aminokwasowej o Id. Sekw. nr 2 albo Id. Sekw. nr 4 a jego receptorem do wytwarzania kompozycji farmaceutycznej do leczenia, tłumienia lub zmieniania odpowiedzi odpornościowej obejmującej ścieżkę syg^^^<^^,wą pomiędzy polipeptydem Liganda Pokrewnego z Czynnikiem Martwicy Nowotworu i jego receptorem u pacjenta. Korzystnie odpowiedź odpornościowa obejmuje komórki ludzkiego gruczolaka.

W niniejszym wynalazku opisano też rozpuszczalne konstrukty TRELL, które można zastosować do bezpośredniego wyzwalania zjawisk farmakologicznych związanych z TRELL. Takie zjawiska mogą dawać korzyści przydatne terapeutycznie w leczeniu raka albo w manipulowaniu układem odpornościowym w leczeniu chorób autoimmunologicznych. Rozpuszczalne postaci TRELL można konstruować genetycznie tak, aby obejmowały łatwo rozpoznawalny znacznik, ułatwiając w ten sposób identyfikację receptorów TRELL. TRELL według wynalazku może być zastosowany w terapii genowej.

Należy rozumieć, że zarówno powyższy opis ogólny, jak również poniższy opis szczegółowy mają służyć za przykład i wyjaśnienie, i w zamierzeniach dostarczają dalszego wyjaśnienia zastrzeganego wynalazku.

Towarzyszące rysunki są włączone w celu dostarczenia dalszego wyjaśnienia wynalazku, oraz są włączone do, i stanowią część tego opisu, ilustrując kilka wykonań wynalazku i wraz z opisem służą do wyjaśnienia zasad wynalazku.

Figura 1 pokazuje porównanie sekwencji aminokwasowej ludzkiego i mysiego TRELL.

188 102

Figura 2A i 2B pokazuje porównanie sekwencji aminokwasowej ludzkich członków rodziny TNF.

Figura 3 jest analizą metodą northem ekspresji mRNA TRELL w różnych mysich liniach komórkowych i tkankach. Ścieżki są powtórzone i zawierają RNA z (1) makrofagów otrzewnowych indukowanych tioglikolanem; (2) szpiku; (3) śledziony i (4) wątroby.

Figura 4 pokazuje analizę northem ekspresji mRNA TRELL w różnych tkankach ludzkich.

Figura 5: SDS-PAGE rekombinowanego TNF, LTa i TRELL w warunkach redukujących i nie redukujących.

Figura 6: TRELL jest cytotoksyczny dla ludzkiej linii gruczolakoraka HT29.

A. Zdolność TNF, TRELL, LTa/β i przeciwciała przeciwko Fas do blokowania wzrostu linii HT29 w obecności ludzkiego interferonu-y. Komórki hodowano przez 4 dni w obecności różnych czynników i oceniano wzrost testem MTT.

B. Morfologia komórek ulegających śmierci komórkowej. Komórki hodowano przez 2 dni, a następnie traktowano przez 24 godziny 80 U/ml interferonu-y i A. pozostawiano bez dalszych dodatków, B. 100 ng/ml utrwalano etanolem i badano pod mikroskopem kontrastującym fazy na górnym panelu (powiększenie 400x) i barwiono barwnikiem Hoechst 1 pg/ml w celu wykrywania jąder w dolnym panelu. Typowe komórki ze skondensowanymi jądrami charakterystycznymi dla apoptozy zaznaczono strzałkami.

Poniżej odniesiono się szczegółowo do konkretnych korzystnych wykonań wynalazku. Wynalazek dotyczy sekwencji DNA, które kodują ludzki albo mysi TRELl, jego fragmenty i homologi, oraz ekspresji tych sekwencji DNA w gospodarzu transformowanym nimi. Wynalazek dotyczy zastosowania tych sekwencji DNA i kodowanych przez nie peptydów. Oprócz tego, wynalazek obejmuje zarówno ludzkie jak i mysie sekwencje aminokwasowe TRELL, albo ich fragmenty, jak również kompozycje farmaceutyczne obejmujące je albo pochodzące z nich.

A. Definicje „Homologiczne” w znaczeniu tu zastosowanym, dotyczy podobieństwa sekwencji pomiędzy sekwencjami porównywanych cząsteczek. Jeżeli pozycja w obu porównywanych sekwencjach zajmowana jest przez tę samą zasadę albo aminokwas, np. jeżeli pozycja w dwóch porównywanych cząsteczkach DNA zajmowana jest przez adeninę, to cząsteczki są homologiczne w tej pozycji. Procent homologii pomiędzy dwiema sekwencjami jest funkcją liczby pozycji pasujących albo homologicznych w obu sekwencjach podzielonej przez liczbę porównywanych pozycji xl00. Przykładowo, jeżeli 6 spośród 10 pozycji w dwóch sekwencjach jest zgodnych albo homologicznych, to dwie sekwencje są w 60% homologiczne. Przykładowo, sekwencje DNA ATTGCC iTATGGC wykazują 50% homologię. Ogólnie, porównania dokonuje się gdy dwie sekwencje przyrównane są w sposób zapewniający maksymalną homologię.

„Oczyszczony preparat” albo „zasadniczo czysty preparat” polipeptydu w znaczeniu tu zastosowanym oznacza polipeptyd, który oddzielono od innych białek, lipidów i kwasów nukleinowych, które występują z nim w naturze. Korzystnie, polipeptyd jest również oddzielany od innych substancji, np. przeciwciał, matryc, itp. które zastosowano do jego oczyszczania.

„Transformowany gospodarz” w znaczeniu tu zastosowanym oznacza dowolnego gospodarza, ze stabilnie zintegrowaną sekwencją, tj. sekwencją TRELL, wprowadzoną do jego genomu albo gospodarza posiadającego sekwencję, tj. elementy episomalne kodujące TRELL.

„Leczenie” w znaczeniu tu zastosowanym oznacza dowolne terapeutyczne postępowanie np. podawanie środka terapeutycznego albo substancji np. leku.

„Zasadniczo czysty kwas nukleinowy”, np. zasadniczo czysty DNA, jest kwasem nukleinowym, który jest: nie bezpośrednio ciągły z jedną albo obiema sekwencjami np. sekwencjami kodującymi, z którymi jest bezpośrednio ciągły (tj. jedną na końcu 5' i drugą na końcu 3') w naturalnie występującym genomie organizmu, z którego pochodzi kwas nukleinowy; albo (2), który jest zasadniczo wolny od sekwencji kwasu nukleinowego, z którymi występuje w organizmie z którego pochodzi kwas nukleinowy. Określenie obejmuje, przykładowo, rekombinowany DNA, który jest włączony do wektora, np. do autonomicznie replikującego

188 102 plazmidu albo wirusa, albo do genomowego DNA prokariota albo eukariota, albo który występuje jako osobna cząsteczka (np. cDNA albo fragment genomowego DNA wytworzony przez PCR albo traktowanie endonukleazami restrykcyjnymi) niezależnie od innych sekwencji DNA. Zasadniczo czysty DNA obejmuje również rekombinowany DNA, który jest częścią genu hybrydowego kodującego TRELL.

Określenia „peptydy”, „białka” i „polipeptydy” stosowane są tu zamiennie.

„Biologicznie czynne” w znaczeniu tu zastosowanym, oznacza posiadające działanie in vivo albo in vitro, które może się wyrażać bezpośrednio albo pośrednio. Biologicznie czynne fragmenty TRELL mogą mieć, przykładowo, 70% homologię aminokwasową z miejscem aktywnym TRELL, korzystniej przynajmniej 80%, zaś najkorzystniej przynajmniej 90% homologię. Identyczność albo homologia w odniesieniu do TRELL określona jest jako procent reszt aminokwasowych potencjalnej sekwencji, które są identyczne z resztami TRELL w Id. Sekw. nr 2 albo 4.

W realizacji wynalazku stosuje się, o ile nie zaznaczono inaczej, konwencjonalne techniki biologii komórkowej, hodowli komórkowej, biologii molekularnej, biologii transgenicznej, mikrobiologii, rekombinacji DNA i immunologii, które są znane specjalistom. Techniki takie opisano w literaturze.

B. Sekwencje DNA według wynalazku

Jak to tu opisano, jeden z aspektów wynalazku stanowi zasadniczo czysty (albo rekombinowany) kwas nukleinowy, który obejmuje sekwencję nukleotydową kodującą polipeptyd TRELL, taki jak DNA opisany w Id. Sekw. nr 1 albo 3 i/lub zamienniki takich kwasów nukleinowych. Określenie kwas nukleinowy w znaczeniu tu zastosowanym może obejmować fragmenty i zamienniki takie jak, przykładowo, sekwencje kodujące peptydy zamienne funkcjonalnie. Zamienne sekwencje nukleotydowe mogą obejmować sekwencje, które różnią się jedną albo wieloma substytucjami, addycjami albo delecjami, takie jak odmiany alleliczne, mutacje itp. i obejmują sekwencje, które różnią się od sekwencji nukleotydowej kodującej TRELL pokazanej na Id. Sekw. nr 1 albo 3 z powodu degeneracji kodu genetycznego. Wynalazcy zsekwencjonowali ludzki DNA wielkości 1936 bp, który zawierał otwartą ramkę odczytu kodującą polipeptyd TRELL, o sekwencji 248 aminokwasów, jak to pokazano na Id. Sekw. nr 4.

Wynalazca opisuje tu sekwencje ludzkie i mysie; wynalazek opisany zostanie ogólnie w odniesieniu do sekwencji ludzkich, jednakże specjalista zrozumie, że włączone tu są również sekwencje mysie. Uderzającą cechą TRELL jest silne zakonserwowanie sekwencji domeny wiążącej receptora pomiędzy myszą i człowiekiem; jedynie ligand Fas zbliża się do tego poziomu zakonserwowania. Zarówno mysie, jak i ludzkie białka TRELL posiadają cechy charakterystyczne rodziny TNF, tj. organizację białka błonowego typu II i zakonserwowanie motywów sekwencji związanych z fałdowaniem białka w postaci struktury przeciw-równoległych płacht (3 TNF.

Sekwencja nukleotydową dla mTRELL podana jest w Id. Sekw. nr 1; sekwencja aminokwasowa dla mTRELL opisana jest w Id. Sekw. nr 2. Sekwencje DNA i aminokwasowa dla hTRELL podane są, odpowiednio, w Id. Sekw. nr 3 i 4.

Sekwencje według wynalazku można zastosować do wytworzenia szeregu sond DNA, które są przydatne do badania przesiewowego różnych kolekcji naturalnych i syntetycznych DNA, na obecność sekwencji DNA, które kodują TRELL albo ich fragmenty albo pochodne. Specjalista zauważy, że określenie „TRELL” w znaczeniu tu zastosowanym dotyczy ich biologicznie czynnych pochodnych, fragmentów albo homologów.

Sekwencje DNA kodujące TRELL według wynalazku można zastosować do wytworzenia peptydów TRELL przez ekspresję różnych gospodarzy prokariotycznych i eukariotycznych transformowanych tymi sekwencjami. Te peptydy TRELL można zastosować przeciwnowotworowo albo do regulacji odporności. Ogólnie, obejmuje to etapy hodowania gospodarza transformowanego cząsteczką DNA zawierającą sekwencję kodującą TRELL, połączoną funkcjonalnie z sekwencją kontrolującą ekspresję.

Sekwencje DNA i rekombinowane cząsteczki DNA według wynalazku można wyrażać stosując wiele różnych kombinacji gospodarz/wektor. Przykładowo, przydatne wektory mogą obejmować segmenty sekwencji chromosomalnych, nie chromosomalnych albo synte12

188 102 tycznego DNA. Wektory ekspresyjne według wynalazku charakteryzują się przynajmniej jedną sekwencją kontrolującą ekspresję, które można połączyć funkcjonalnie z sekwencją DNA TRELL wprowadzoną do wektora, w celu kontrolowania i regulowania ekspresji sekwencji DNA.

Ponadto, w każdym wektorze ekspresyjnym, do wprowadzenia sekwencji TRELL według wynalazku można wybrać różne miejsca. Miejsca te zazwyczaj są skonstruowane w celu cięcia ich przez enzymy restrykcyjne, zaś miejsca te i endonukleazy są dobrze znane specjalistom. Należy oczywiście rozumieć, że wektor ekspresyjny przydatny według wynalazku nie musi mieć miejsca restrykcyjnego endonukleazy do wprowadzenia pożądanego fragmentu DNA. Zamiast tego, wektor można klonować alternatywnymi sposobami. Wektor ekspresyjny, zaś w szczególności miejsce wybrane do wprowadzenia wybranego fragmentu DNA, oraz funkcjonalne połączenie z sekwencją kontrolującą ekspresję określa się różnymi czynnikami. Czynniki te obejmują, choć nie są ograniczone do wielkości wyrażanego białka, podatności pożądanego białka na rozkład proteolityczny przez enzymy komórki gospodarza, liczbę miejsc podatnych na konkretny enzym restrykcyjny, zanieczyszczenia albo wiązanie wyrażanego białka przez białka komórki gospodarza, co może powodować trudności w usunięciu podczas oczyszczania. Dodatkowe czynniki, które należy uwzględnić obejmują charakterystykę ekspresji taką jak położenie kodonów start i stop względem sekwencji wektora oraz innych czynników, które są znane specjalistom. Wybór wektora i miejsca wprowadzenia dla zastrzeganych sekwencji DNA określa się przez uwzględnianie tych czynników, przy czym nie każdy wybór jest równie skuteczny dla pożądanego zastosowania. Jednakże, rutyną wśród specjalistów jest analiza tych parametrów i wybór odpowiedniego układu zależnie od konkretnego zastosowania.

Specjalista może łatwo dokonać odpowiednich modyfikacji w sekwencjach kontrolujących ekspresję, w celu uzyskania wyższych poziomów ekspresji białka, tj. przez zastąpienie kodonów, albo wybór kodonów dla konkretnych aminokwasów, które są korzystnie wykorzystywane przez konkretne organizmy, w celu minimalizacji proteolizy albo w celu zmiany składu glikozylacji. Podobnie, można zamienić cysteiny na inne aminokwasy w celu ułatwienia wytwarzania, fałdowania albo zwiększenia stabilności.

Tak więc, nie wszystkie kombinacje gospodarzy/wektorów ekspresyjnych mają równoważną skuteczność w wyrażaniu sekwencji DNA według wynalazku. Jednakże, konkretny wybór kombinacji gospodarza/wektora ekspresyjnego może być dokonany przez specjalistę. Czynniki, które można uwzględnić, obejmują, przykładowo, zgodność gospodarza i wektora, toksyczność białek kodowanych przez sekwencję DNA dla gospodarza, łatwość odzyskiwania pożądanego białka, charakterystykę ekspresji sekwencji DNA i sekwencji kontrolujących ekspresję połączonych funkcjonalnie, bezpieczeństwo biologiczne, koszty oraz fałdowanie, formowanie albo inne konieczne modyfikacje potranslacyjne pożądanego białka.

TRELL i jego homologi wytworzone przez gospodarzy transformowanych sekwencjami według wynalazku, jak również oczyszczony natywny TRELL albo wytworzony z zastrzeganych sekwencji aminokwasowych, są przydatne w wielu kompozycjach i sposobach do zastosowań przeciwnowotworowych i immunoregulacyjnych. Są one również przydatne w leczeniu i sposobach dotyczących innych chorób.

Ujawnione tu sekwencje DNA mogą być wykorzystane do ekspresji TRELL w nienormalnych warunkach, tj. w terapii genowej. TRELL można wyrażać w komórkach nowotworowych pod kierunkiem promotorów odpowiednich dla takich zastosowań. Taka ekspresja może zwiększyć reakcje odpornościowe przeciwko nowotworom albo bezpośrednio zakłócać przeżywanie nowotworów. Cytokiny, takie jak TRELL mogą również wpływać na przeżycie przeszczepów narządowych przez zmianę lokalnej reakcji odpornościowej. W tym przypadku, sam przeszczep albo otaczające komórki można modyfikować zmienionym genem TRELL.

Izolowany kwas nukleinowy kodujący TRELL może być zastosowany w terapii „antysensownej”. W znaczeniu tu zastosowanym, „terapia antysensowna” dotyczy podawania albo wytwarzania in situ oligonukleotydów albo ich pochodnych, które swoiście hybrydyzują w warunkach komórkowych z komórkowym mRNA i/lub DNA kodującym TRELL, w taki

188 102 sposób, że hamują ekspresję kodowanego białka, tj. przez zahamowanie transkrypcji i/lub translacji. Wiązanie może zachodzić przez konwencjonalne parowanie zasad albo, przykładowo, w przypadku wiązania dupleksów DNA, przez swoiste oddziaływanie w rowku większym podwójnej helisy. Ogólnie, terapia antysensowna oferuje szereg technik ogólnie stosowanych w technice i obejmuje dowolną terapię, która polega na swoistym wiązaniu sekwencji oligonukleotydowych.

Konstrukt antysensowny można dostarczyć, przykładowo, jako plazmid ekspresyjny, który podczas transkrypcji w komórce wytwarza RNA, który jest komplementarny z przynajmniej częścią komórkowego mRNA, który koduje TRELL. Alternatywnie, konstrukt może być sondą oligonukleotydową, która jest wytwarzana ex vivo. Takie sondy oligonukleotydowe są korzystnie modyfikowanymi oligonukleotydami, które są odporne na endogenne nukleazy i w ten sposób są stabilne in vivo. Przykładowe cząsteczki kwasów nukleinowych do zastosowania jako Ollgonukleotydy antysensowne są analogami fosfoamidynowymi, tiofosforanowymi i metylofosforanowymi DNA (patrz, np. 5,176,996; 5,264,564 i 5,256,775). Oprócz tego, ogólne podejścia do konstruowania oligonukleotydów przydatnych w terapii antysensownej opisano, przykładowo, przez Van Der Kroi i in., (1988) Biotechniques 6:958-976 oraz Stein i in., (1988) Cancer Res. 48:2659-2668, załączone tu jako odnośniki.

C. ORZEŁ i jego sekwencje aminokwasowe

Białko pokrewne z rodziną czynnika martwicy nowotworu (TRELL) według wynalazku, jak to opisano wyżej, jest członkiem rodziny TNF. Białko, jego fragmenty albo homologi mogą mieć szerokie zastosowanie terapeutyczne i diagnostyczne.

TRELL występuje w wielu tkankach, z wzorcem, który jest względnie unikalny wśród członków rodziny TNF. Ponieważ rodzina TNF jest związana z regulowaniem śmierci komórkowej i przeżywania oraz różnicowaniem komórek, możliwe jest, że TRELL jest również związany z przeżywaniem, różnicowaniem i naprawą w różnych tkankach.

Jakkolwiek nie jest znana dokładna budowa trójwymiarowa TRELL, uważa się, że jako członek rodziny TNF może posiadać wspólne cechy strukturalne z innymi członkami rodziny. Ujawniony jest tu zarówno mysi jak i ludzki TRELL. Mysi TRELL, jak można wywnioskować z istniejącej sekwencji cDNA, obejmuje ciąg przynajmniej 21 aminokwasów hydrofobowych, które prawdopodobnie działają jako domeny zakotwiczone w błonie dla białka błonowego typu II. Sekwencję aminokwasową mTRELL opisano w Id. Sekw. nr 2.

Ludzki TRELL obejmuje N-końcową domenę cytoplazmatyczną, około 27 aminokwasów hydrofobowych, śródbłonową domenę typu II i 204-aminokwasową domenę zewnątrzkomorkową. Sekwencja aminokwasową hTRELL opisana jest w Id. Sekw. nr 4.

Figura 1 przedstawia porównanie sekwencji aminokwasowej ludzkiego i mysiego TRELL.

O ile na podstawie otwartejaamki odczytu wid orne cDNA możpa przawidzieć 52-aminokwasowy region końca N, nie można przewidzieć dokładnie początkowej metioniny. Met-36 posiada sensowną sekwencję zgodności Kozak'a, co może czynić ją korzystnym kodonem start. Porównanie sekwencji TRELL z innymi członkami ludzkiej rodziny TNF wykazuje istotne podobieństwo strukturalne. Przykładowo, jak widać na figurach 2A i 2B, wszystkie białka przypominają białka błonowe typu II i posiadają kilka wspólnych regionów zakonserwowania sekwencji w domenie zewzątrzkcmórkcwej. Regiony z kreskami nad sekwencją wskazują sekwencje w TNF i LTa związane z organizacją ciągów β cząsteczek. Podkreślono domniemane miejsca glikOzylacji końca N. Gwiazdki oznaczają cysteiny związane z wiązaniami disiarczkowymi w TNF. Domeny zakonserwowane są prawdopodobnie związane z oddziaływaniem pomiędzy βcdjedzcstCami i organizacją płacht.

Poszukiwanie EST ujawniło ludzki klon o długości 345 zasad, które były wysoce homologiczne z mysim TRELL. Sekwencja ami^okwasowa ludzkiego TRELL podana jest na Id. Sekw. nr 4. Otwarte ramki odczytu kodowane przez EST nie zawierają motywów sekwencji, które umożliwiałyby charakteryzację tej sekwencji jako członka rodziny ligandów TNF, np. motywu zastosowanego przez Wiley'a i in., do identyfikacji EST TRAIL w istniejącej bazie danych.

188 102

Nowe polipeptydy ujawnione w opisie swoiście oddziałują z receptorem, który nie został jeszcze zidentyfikowany. Jednakże, ujawnione tu peptydy i metody umożliwiają identyfikację receptorów, które swoiście oddziałują z TRELL albo jego fragmentami.

W opisie ujawniono peptydy pochodzące z TRELL, które mają zdolność do wiązania się z receptorami TRELL. Fragmenty TRELL można wytworzyć kilkoma sposobami, np. rekombinacyjnie, przez PCR, trawienie proteolityczne albo syntezę chemiczną. Fragmenty wewnętrzne albo końcowe polipeptydu można wytworzyć przez usunięcie jednego albo wielu nukleotydów z końca albo obu końców kwasu nukleinowego, który koduje polipeptyd. Ekspresja mutagenizowanego DNA daje fragmenty polipeptydowe. Trawienie endonukleazami „endnibbling” (wytrawiającymi końce) może dać DNA, które kodują różne fragmenty. DNA, które kodują fragmenty białka można również wytworzyć przez losowe rozrywanie, trawienie restrykcyjne albo kombinację dyskutowanych wyżej sposobów.

Fragmenty polipeptydowe można również syntetyzować chemicznie stosując znane techniki, takie jak konwencjonalna reakcja Merrifielda na podłożu stałym f-moc albo t-boc. Przykładowo, peptydy i sekwencje DNA według wynalazku można arbitralnie podzielić na fragmenty o pożądanej długości bez nakładania się fragmentów, albo podzielić na fragmenty nakładające się o pożądanej długości. Sposoby takie jak te są opisane szczegółowo poniżej.

D. Wytwarzanie rozpuszczalnego TRELL

Rozpuszczalne postaci Liganda mogą często skutecznie przekazywać sygnał, a stąd mogą być podawane jako lek w celu naśladowania naturalnej postaci błonowej. Możliwe jest, że TRELL jest wydzielany w naturze jako cytokina rozpuszczalna, jednakże, jeżeli tak nie jest, to można skonstruować gen wymuszający takie wydzielenie. W celu wytworzenia rozpuszczalnej postaci wydzielniczej TRELL, można usunąć na poziomie DNA regiony śródbłonowe końca N oraz część regionu „stalk” i zastąpić je sekwencją liderową typu I albo alternatywnie sekwencją liderową typu II, która umożliwia skuteczne proteolityczne odcięcie w wybranym układzie ekspresyjnym. Specjalista może zmieniać wielkość pozostawionego regionu „stalk” wydzielniczym konstrukcie ekspresyjnym w celu optymalizacji właściwości wiązania receptora i skuteczności wydzielania. Przykładowo, konstnikty zawierające wszystkie możliwe długości „stalk”, tj. okrojone na końcu N, można wytworzyć w taki sposób, że powstaną białka rozpoczynające się od aminokwasów 8l do 139. Sekwencja „stalk” optymalnej długości powinna powstać w wyniku takiej analizy.

E. Wytwarzanie przeciwciał reagujących z TRELL

W opisie opisano również przeciwciała swoiście reagujące z TRELL albo jego receptorem. Surowice odpornościowe albo przeciwciała monoklonalne przeciwko białku/przeciwko peptydowi można wytworzyć protokołem standardowym, (patrz, np. Antibodies: A Laboratory Manuał, wyd. Harlow i Lane (Cold Spring Harbor Press, 1988). Ssaka takiego jak mysz, chomik albo królik można immunizować immunogenną postacią peptydu. Techniki zapewniania immunogenności białku albo peptydowi obejmują sprzęganie z nośnikami albo inne znane techniki.

Immunogenną część TRELL albo jego receptora można podawać w obecności adiuwanta. Postęp immunizacji można śledzić przez wykrywanie miana przeciwciał w osoczu albo surowicy. Standardowy test ELISA albo inne testy immunologiczne można zastosować z immunogenem jako antygenem w celu określenia poziomu przeciwciał.

W najkorzystniejszym wykonaniu, przeciwciała są immunospecyficzne wobec determinant TRELL albo jego receptora, np. determinant antygenowych polipeptydu o Id. Sekw. nr 2 albo 4, albo blisko spokrewnionego homologa ludzkiego albo ssaka nie będącego człowiekiem (np. 70, 80 albo 90 procent homologii, korzystnie przynajmniej 95% homologii). W jeszcze innym korzystnym wykonaniu wynalazku, przeciwciała przeciwko TRELL albo przeciwko receptorowi TRELL zasadniczo nie reagują krzyżowo (tj. reagują swoiście) z białkiem, które jest np. mniej niż w 80% homologiczne z Id. Sekw. nr 2 albo 4, korzystnie mniej niż w 90% homologiczne z Id. Sekw. nr 2 albo 4. Przez określenie „zasadniczo nie reaguje” rozumie się, że przeciwciało ma powinowactwo wiązania do białek nie homologicznych mniejsze niż 10%, korzystnie mniejsze niż 5%, zaś jeszcze korzystniej mniej niż 1% powinowactwa wiązania z białkiem o Id. Sekw. nr 2 albo 4.

188 102

Określenie „przeciwciało” w znaczeniu tu zastosowanym obejmuje jego fragmenty, które również swoiście reagują z TRELL albo receptorem TRELL. Przeciwciała można poddać fragmentacji stosując techniki konwencjonalne, zaś fragmenty badać przesiewowo w kierunku ich przydatności w sposób analogiczny jak opisany wyżej dla przeciwciał pełnych. Przykładowo, fragmenty F(ay)2 można wytworzyć przez traktowanie przeciwciała pepsyną. Powstałe fragmenty F(ab')2 można traktować w celu redukcji wiązań disiarczkowych z wytworzeniem fragmentów Fab'. Przeciwciała według wynalazku dalej obejmują cząsteczki o podwójnej swoistości i chimeryczne wykazujące aktywność przeciwko TRELL i przeciwko receptorowi TRELL. Tak więc, zarówno przeciwciała (Ab) monoklonalne, jak i poliklonalne skierowane przeciwko TRELL i jego receptorowi oraz przeciwciała takie jak Fab' i F(ab^r)2 można zastosować do blokowania działania TRELL i jego receptora.

Różne postaci przeciwciał można również wytworzyć stosując standardowe techniki rekombinacji DNA (Winter i Milstein, Nature 349:293-299 (1991) załączone tu jako odnośnik). Przykładowo, można skonstruować przeciwciała chimeryczne, w których domena wiążąca antygen z przeciwciała zwierzęcego połączona jest z ludzką domeną stałą (np. Cabilly i in., Patent USA 4,816,567). Przeciwciała chimeryczne mogą zmniejszyć obserwowaną reakcję odpornościową wywołaną przez przeciwciała zwierzęce zastosowane do leczenia ludzi.

Oprócz tego, można syntetyzować rekombinowane „przeciwciała humanizowane”, które rozpoznają TRELL albo jego receptor. Przeciwciała humanizowane są chimerami obejmującymi większość sekwencji ludzkich IgG do których wprowadzono regiony odpowiedzialne za swoiste wiązanie antygenu. Zwierzęta immunizuje się pożądanym antygenem, izoluje się odpowiednie przeciwciała i usuwa się część sekwencji regionu zmiennego odpowiedzialną za wiązanie antygenu. Regiony wiążące antygen, pochodzące od zwierzęcia klonuje się w odpowiednim położeniu genów ludzkich przeciwciał, z których usunięto regiony wiążące antygen. Przeciwciała humanizowane minimalizują zastosowanie heterologicznych (tj. obcogatunkowych) sekwencji w przeciwciałach ludzkich, a stąd z mniejszym prawdopodobieństwem wywołają reakcje odpornościowe u leczonego osobnika.

Konstruowanie różnych klas rekombinowanych przeciwciał można również osiągnąć przez wytwarzanie przeciwciał chimerycznych albo humanizowanych, obejmujących domeny zmienne i ludzkie domeny stałe (CHI, CH2, CH3) wyizolowane z różnych klas immunoglobulin. Przykładowo, przeciwciała o rosnących wartościowościach wiążących antygen można wytworzyć rekombinacyjnie przez klonowanie miejsca wiązania antygenu do wektorów niosących ludzkie regiony łańcuchów stałych (Arulanandam i in., J. Exp. Med. 177:1439-1450 (1993)).

Oprócz tego, standardowe techniki rekombinacji można zastosować w celu zmienienia powinowactwa wiązania przeciwciał rekombinowanych z ich antygenami, przez zmianę reszt aminokwasowych w sąsiedztwie miejsc wiązania antygenu. Powinowactwo wiązania antygenu przeciwciała humanizowanego można zwiększyć przez mutagenezę opartą na modelowaniu cząsteczkowym (Queen i in., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:10029-33 (1989)).

F. Wytwarzanie analogów: Wytworzenie zmienionych sekwencji DNA i peptydowych

Analogi TRELL mogą różnić się od naturalnie występującego TRELL sekwencją aminokwasową albo w sposób nie obejmujący sekwencji, albo obydwoma sposobami. Modyfikacje niezwiązane z sekwencją obejmują derywatyzację chemiczną TRELL in vitro i in vivo. Modyfikacje nie dotyczące sekwencji obejmują, choć nie są ograniczone do zmian w acetylacji, metylacji, fosforylacji, karboksylacji albo glikozylacji.

Korzystne analogi obejmują TRELL albo jego fragmenty biologicznie czynne, których sekwencje różnią się od sekwencji podanych w Id. Sekw. nr 2 albo 4, przez substytucję jednego albo wielu aminokwasów zakonserwowanych, albo przez jedną albo wiele substytucji, delecji albo insercji aminokwasów nie konserwatywnych, co nie powoduje zniesienia aktywności TRELL. Substytucje zakonserwowane zwykle obejmują zastąpienie jednego aminokwasu innym o podobnej charakterystyce, np. substytucje w obrębie następujących grup: walina, glicyna; glicyna, alanina; walina, izoleucyna, leucyna; kwas asparaginowy, kwas glutaminowy; asparagina, glutamina; seryna, treonina; lizyna, arginina; i fenyloalanina, tyrozyna.

188 102

Tabela I

Konserwatywne zastąpienia aminokwasowe

Aminokwas	Kod	Zastępowany przez:
Alanina	A	D-Ala, Gly, Beta-Ala, L-Cys, D-Cys
Arginina	R	D-Arg, Lys, D-Lys, homo-Arg, D-homo-Arg, Met, Ile, D-Met, D-Ile, Om, D-Orn
Asparagina	N	D-Asn, Asn, D-Asp, Glu, D-Glu, Gln, D-Gln
Kwas asparaginowy	D	D-Asp, D-Asn, Asn, Glu, D-Glu, Gln, D-Gln
Cysteina	C	D-Cys, S-Me-Cys, Met, D-Met, Thr, D-Thr
Glutamina	Q	D-Gln, Asn, D-Asn, Glu, D-Glu, Asp, D-Asp
Kwas glutaminowy	E	D-Glu, D-Asp, Asp, Asn, D-Asn, Gln, D-Gln
Glicyna	G	Ala, D-Ala, Pro, D-Pro, Ala, Acp
Izoleucyna	I	D-Ile, Val, D-Val, Leu, D-Leu, Met, D-Met
Leucyna	L	D-Leu, Val, D-Val, Leu, D-Leu, Met, D-Met
Lizyna	K	D-Lys, Arg, D-Arg, Homo-Arg, D-homo-Arg, Met, D-Met, Ile, D-Ile, Orn, D-Orn
Metionina	M	D-Met, S-Me-Cys, Ile, D-Ile, Leu, D-Leu, Val, DOVal
Fenyloalanina	F	D-Phe, Tyr, D-Thr, L-Dopa, His, D-His, Trp, D-Trp, Trans-3, 4 albo 5-fenyloprolina, cis-3, 4 albo 5-fenyloprolina
Prolina	P	D-Pro, kwas L-1-tiazolidyno-4-karboksylowy, kwas D- albo L-1-okasazolidyno-4-karboksylowy
Seryna	S	D-Ser, Thr, D-Thr, allo-Thr, Met, D-Met, Met (O), D-Met(O), L-Cys, D-Cys
Treonina	T	D-Thr, Ser, D-Ser, allo-Thr, Met, D-Met, Met (O), D-Met (O), Val, D-Val
Tyrozyna	Y	D-Tyr, Phe, D-Phe, L-Dopa, His, D-His
Walina	V	D-Val, Leu, D-Leu, Ile, D-Ile, Met, D-Met

188 102

Metody przydatne do mutagenezy obejmują mutagenezę przez PCR i mutagenezę wysycającą, jak to dyskutuje się niżej. Bibliotekę losowych odmian sekwencji aminokwasowych można również wytworzyć przez syntezę zestawu zdegenerowanych sekwencji oligonukleotydowych.

- Mutageneza przez PCR

W mutagenezie przez PCR, w celu wprowadzenia losowych mutacji do klonowanego fragmentu DNA można zastosować polimerazę Taq o zmniejszonej wierności (Leung i in., 1989, Technique 1:11-15). Jest to potężna i względnie szybka metoda wprowadzania losowych mutacji. Region mutagenizowanego DNA można amplifikować stosując reakcję łańcuchową polimerazy (PCR) w warunkach, które zmniejszają wierność syntezy DNA przez polimerazę DNA Taq, np. przez zastosowanie stosunku dGTP/dATP równego pięć i dodanie Mn²⁺ do reakcji PCR. Pulę amplifikowanych fragmentów DNA można wprowadzić do odpowiedniego wektora klonującego w celu zapewnienia biblioteki losowych mutantów.

- Mutageneza wysycająca

Mutageneza wysycająca umożliwia szybkie wprowadzenie znacznej liczby zastąpień pojedynczych zasad w klonowanych fragmentach DNA (Mayers i in., 1985, Science 229:242). Technika ta obejmuje wytworzenie mutacji np. przez traktowanie chemiczne albo napromieniowanie jednoniciowych DNA in vitro i syntezę komplementarnej nici DNA. Częstość mutacji można modulować przez modulowanie siły traktowania i można otrzymać zasadniczo wszystkie możliwe zastąpienia zasad. Ponieważ procedura ta nie obejmuje selekcji genetycznej zmutowanych fragmentów, można wytworzyć zarówno obojętne substytucje, jak również można wytworzyć białko przez mutagenezę losową DNA, która zmienia funkcje. Rozmieszczenie mutacji punktowych nie jest ukierunkowane na zakonserwowane elementy sekwencji.

- Oligonukleotydy zdegenerowane

Bibliotekę homologów można również wytworzyć z zestawu zdegenerowanych sekwencji oligonukleotydowych. Syntezę chemiczną zdegenerowanych sekwencji można przeprowadzić na automatycznym syntezatorze DNA, zaś syntetyczne geny poddać ligacji do odpowiedniego wektora ekspresyjnego. Synteza zdegenerowanych oligonukleotydów jest znana. Techniki takie zastosowano w kierowanej ewolucji innych białek.

Techniki mutagenezy nie losowej, czyli ukierunkowanej można zastosować w celu dostarczenia konkretnych sekwencji albo mutacji w określonych regionach. Techniki te można zastosować w celu wytworzenia odmian, które obejmują np. delecje, insercje albo substytucje reszt znanej sekwencji aminokwasowej białka. Miejsca mutacji można modyfikować indywidualnie albo seriami np. przez (1) substytucję najpierw zakonserwowanych aminokwasów, a następnie bardziej radykalnym wyborem zależnie od uzyskanego wyniku, (2) delecję docelowej reszty, albo (3) insercje reszt tej samej albo różnej klasy stycznie do określonego miejsca albo przez kombinację opcji 1-3.

- Mutageneza przez skanowanie alaniną

Mutageneza przez skanowanie alaniną jest przydatną metodą identyfikacji konkretnych reszt albo regionów pożądanego białka, które są korzystnymi położeniami albo domenami do mutagenezy (Cunningham i Wells (Science 244:1081-1085, 1989)). Podczas skanowania alaniną, identyfikuje się resztę albo grupę reszt docelowych (np. reszty naładowane takie jak Arg, Asp, His, Lys albo Glu) i zastępuje neutralnym albo naładowanym ujemnie aminokwasem (najkorzystniej alaniną albo polialaniną). Zastąpienie aminokwasu może zakłócić oddziaływanie aminokwasów z otaczającym środowiskiem wodnym w komórce albo na zewnątrz. Domeny, które wykazują funkcjonalną wrażliwość na zastąpienia można następnie dalej badać, przez wprowadzenie dalszych albo innych odmian w miejscu zastąpienia. Tak więc, o ile miejsce wprowadzenia odmiany sekwencji aminokwasowej jest z góry określone, nie ma konieczności przewidzenia natury samej mutacji. Przykładowo, w celu optymalizacji prowadzenia mutacji w danym miejscu, można przeprowadzić skanowanie alaniną albo mutagenezę losową w docelowym kodonie albo regionie i badać przesiewowo wyrażone odmiany podjednostek białka w kierunku optymalnej kombinacji pożądanej aktywności.

188 102

- Mutageneza za pośrednictwem oligonukleotydu

Mutageneza za pośrednictwem oligonukleotydu jest przydatną metodą wytwarzania odmian substytucyjnych, delecyjnych albo insercyjnych DNA, np. Adelman i in., (DNA 2:183, 1983). Pokrótce, pożądany DNA można zmienić przez hybrydyzację oligonukleotydu kodującego mutację z matrycą DNA, przy czym matryca jest w postaci jednoniciowej plazmidu albo bakteriofaga zawierającego niezmienioną albo natywną sekwencję DNA pożądanego białka. Po hybrydyzacji, w celu syntezy całej nici komplementarnej stosuje się polimerazę DNA, która włącza w ten sposób starter oligonukleotydowy i koduje wybraną zmianę w pożądanym DNA białka. Ogólnie, stosuje się Ollgonukleotydy o długości przynajmniej 25 nukleotydów. Optymalny oligonukleotyd ma od 12 do 15 nukleotydów, które są całkowicie komplementarne z matrycą po obu stronach nukleotydu(ów) kodującego(ych) mutację. Zapewnia to, że oligonukleotyd będzie hybrydyzował prawidłowo z jednoniciową cząsteczką matrycy DNA. Oligonukleotydy można łatwo syntetyzować stosując znane techniki, które opisano np. przez Crea i in., (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75:5765 (1978)).

- Mutageneza kasetowa

Innym sposobem wytwarzania odmian, mutageneza kasetowa, oparta jest na technice opisanej przez Wells'a i in., (Gene 34:315 (1985)). Materiałem wyjściowym może być plazmid (albo inny wektor), który obejmuje mutowany DNA podjednostki białka. Identyfikuje się kodon(y) w mutowanym DNA podjednostki białka. Po obu stronach zidentyfikowanego miejsca muszą występować unikalne miejsca endonukleaz restrykcyjnych. Jeżeli takie miejsca nie występują, można je wytworzyć stosując opisaną wyżej metodę mutagenezy za pośrednictwem oligonukleotydu w celu wprowadzenia ich w odpowiednie położenie w pożądanym DNA podjednostki białka. Po wprowadzeniu do plazmidu miejsc restrykcyjnych, plazmid tnie się w tych miejscach w celu linearyzacji. Dwuniciowy oligonukleotyd, kodujący sekwencję DNA pomiędzy miejscami restrykcyjnymi, ale zawierający pożądaną mutację syntetyzuje się stosując techniki standardowe. Ten dwuniciowy oligonukleotyd określany jest jako kaseta. Kaseta ta jest skonstruowana w taki sposób, że posiada koniec 3' i 5', które są kompatybilne z końcami linearyzowanego plazmidu tak, że może być bezpośrednio wprowadzona do plazmidu. Plazmid ten zawiera obecnie zmutowaną sekwencję DNA podjednostki białka.

- Mutageneza kombinatoryjna

Mutagenezę kombinatoryjną można również zastosować do wytworzenia mutantów. Przykładowo, sekwencje aminokwasowe dla grupy homologów albo innych pokrewnych białek przyrównuje się, korzystnie umożliwiając najwyższą możliwą homologię. Wszystkie aminokwasy, które pojawiają, się wdanej pozycji przyrównanych sekwencji można wybrać do stworzenia zdegenerowanego zestawu sekwencji kombinatoiyjnych. Zmienną bibliotekę odmian wytwarza się przez mutagenezę kombinatoryjną na poziomie kwasu nukleinowego i kodowaną przez bibliotekę zmiennych genów. Przykładowo, mieszaninę syntetycznych oligonukleotydów można połączyć enzymatycznie z sekwencjami genu w taki sposób, że zdegenerowany zestaw potencjalnych sekwencji jest możliwy do wyrażenia jako indywidualne peptydy albo alternatywnie, jako zestaw większych białek fuuzynych zawierających zestaw sekwencji /degenerowanych.

Znane są różne techniki badań przesiewowych produktów wytworzonych przez zmutowane geny. Techniki badania przesiewowego wielkich bibliotek genów często obejmują klonowanie biblioteki genu do replikujących wektorów ekspresyjnych, transformowanie odpowiednich komórek gospodarza powstałą biblioteką wektorów i wyrażanie genów w warunkach, w których wykrywanie pożądanej aktywności np. w tym przypadku wiązania z TRELL albo jego receptorem ułatwia względnie łatwą izolację wektora kodującego gen, którego produkt jest wykrywany. Każda z technik opisanych niżej jest możliwa do zastosowania w wielkoprzepustowej analizie do badania przesiewowego znacznych liczb wytworzonych sekwencji, np. technikami losowej mutagenezy.

Wynalazek umożliwia również zmniejszenie domen wiążących TRh białka polipeptydów TRELL albo ich receptorów, w celu wytworzenia mimetyków np. peptydowych albo nie peptydowych. Mimetyki peptydowe są zdolne do rozerwania wiązania pomiędzy TRELL i jego receptorem. Kluczowe reszty TRELL związane z rozpoznawaniem molekularnym poli188 102 peptydu receptora albo białka wewnątrzkomórkowego można określić i zastosować w celu wytworzenia TRELL albo peptydomimetyków pochodzących z jego receptora, które kompetycyjnie albo nie kompetycyjnie hamują wiązanie TRELL z jego receptorem (patrz, przykładowo europejskie zgłoszenie patentowe EP-412,762A i EP-B31,080A).

G. Kompozycje farmaceutyczne

Przez dostarczenie oczyszczonych i rekombinowanych TRELL, wynalazek dostarcza testów, które można zastosować do badania przesiewowego w kierunku leków, które są agonistami albo antagonistami normalnych czynności komórkowych, w tym przypadku TRELL albo jego receptora. W jednym wykonaniu, test bada zdolność związku do modulowania wiązania pomiędzy TRELL i jego receptorem. Różne formaty testów powinny być odpowiednie, zaś w świetle wynalazku, powinny być znane specjaliście.

W wielu programach badań przesiewowych leków, które badają biblioteki związków albo naturalnych ekstraktów, pożądane są testy wielkoprzepustowe, w celu maksymalizacji liczby związków poddanych badaniu w danej jednostce czasu. Testy, które przeprowadza się w układach bezkomórkowych mogą opierać się na białkach oczyszczonych albo na wpół oczyszczonych, są często korzystne jako „wstępne” badania, ponieważ mogą być przeprowadzone w celu umożliwienia szybkiego opracowania i względnej łatwości wykrywania zmian w celach cząsteczkowych, za pośrednictwem badanego związku.

Ponadto, efekty komórkowej toksyczności i/lub dostępności biologicznej badanych związków można generalnie zignorować w układzie in vitro, ponieważ test skupia się głównie na wpływie leku na cel cząsteczkowy, co może objawiać się zmianą powinowactwa wiązania z innymi białkami albo zmianą właściwości enzymatycznych celu cząsteczkowego.

Kompozycje farmaceutyczne według wynalazku mogą obejmować skuteczną terapeutycznie ilość TRELL albo receptora TRELL, albo ich fragmentów albo mimetyków i ewentualnie, mogą obejmować nośniki dopuszczalne farmaceutycznie. Kompozycje farmaceutyczne zawierające TRELL mogą być stosowane do leczenia raka oraz pobudzania, zaś w niektórych przypadkach hamowania układu odpornościowego, albo jego części przez podawanie skutecznej farmaceutycznie ilości związku według wynalazku albo jego dopuszczalnych farmaceutycznie soli albo pochodnych. Należy oczywiście rozumieć, że kompozycje i sposoby według wynalazku można zastosować w kombinacji z innymi terapiami dla różnych schematów postępowania.

Kompozycje mogą mieć postać odpowiednią dla różnych dróg podawania, w tym podawania układowego albo miejscowego. Do podawania układowego korzystne jest wstrzyknięcie, w tym domięśniowe, dożylne, dootrzewnowe i podskórne; kompozycje do wstrzyknięć, według wynalazku, można formułować w roztworach wodnych, korzystnie w buforze zgodnym fizjologicznie takim jak roztwór Hank'a albo Ringer'a. Oprócz tego kompozycje można formułować w postaci stałej i ewentualnie rozpuszczanej albo zawieszanej bezpośrednio przed zastosowaniem. Postaci liofilizowane są również objęte wynalazkiem.

Kompozycje można podawać doustnie, albo metodami przezśluzówkowymi albo przezskómymi. Do podawania przezśluzowkowego albo przezskómego do kompozycji stosuje się środki penetrujące odpowiednie do pokonywanej barieiy. Takie środki penetrujące są znane i obejmują przykładowo, do podawania przezśluzowkowego, sole żółciowe, pochodne kwasu fusydowego i detergenty. Podawanie przezśluzówkowe można prowadzić przez rozpylacze donosowe albo czopki. Do podawania doustnego, kompozycje formułuje się w konwencjonalne postaci takie jak kapsułka, tabletki i toniki. Do podawania miejscowego kompozycje według wynalazku formułuje się w postaci maści, żelów albo kremów.

Korzystnie, kompozycje według wynalazku są w postaci dawki jednostkowej i mogą być podawane raz albo kilka razy dziennie. Ilość podawanego składnika czynnego w czasie trwania leczenia zależy od wielu czynników. Przykładowo, wieku i wielkości osobnika, zaawansowania i przebiegu leczonej choroby, sposobu i postaci podawania oraz oceny lekarza prowadzącego. Jednakże, skuteczna dawka może mieścić się w zakresie od około 0,005 do około 5 mg/kg/dzień, korzystnie od około 0,05 do około 0,5 mg/kg/dzień. Specjalista zauważy, że przydatne mogą być niższe i wyższe dawki.

188 102

Ujawnione w wynalazku konstrukty genowe można również zastosować jako część protokołu terapii genowej w celu dostarczenia kwasów nukleinowych kodujących agonistyczną albo antagonistyczną postać polipeptydu TRELL. Konstrukty ekspresyjne TRELL można podawać w dowolnym skutecznym biologicznie nośniku, np. dowolnej formulacji albo kompozycji zdolnej do skutecznego dostarczenia genu dla TRELL do komórek in vivo. Podejścia obejmują wprowadzanie genu do wektorów wirusowych, które potrafią bezpośrednio transfekować komórki albo dostarczać plazmidowy DNA przy użyciu, np. liposomów albo nośników wewnątrzkomórkowych, jak również przez bezpośrednie wstrzyknięcie konstruktu genowego. Korzystne są sposoby transferu przez wektor wirusowy.

Kompozycja farmaceutyczna obejmująca konstrukt do terapii genowej może obejmować zasadniczo układ dostarczania genów w dopuszczalnym rozcieńczalniku albo może obejmować matrycę do powolnego uwalniania, w które zatopiony jest nośnik dostarczający gen. Alternatywnie, gdzie można wytworzyć kompletny układ dostarczania genu pozbawiony rekombinowanych komórek, np. wektor retrowirusowy, kompozycja farmaceutyczna może obejmować jedną albo wiele komórek, które wytwarzają układ dostarczania genu.

Oprócz zastosowania w terapii, oligomery według wynalazku można zastosować jako reagenty diagnostyczne do wykrywania obecności albo nieobecności sekwencji docelowego DNA, RNA albo białka, z którymi wiążą się swoiście. W innym aspekcie, wynalazek można zastosować do badania cząstek chemicznych pod względem ich zdolności do oddziaływania z, np. wiązania albo łączenia się fizycznie z polipeptydem TRELL albo jego fragmentem. Sposób obejmuje doprowadzenie do kontaktu cząsteczki chemicznej z polipeptydem TRELL i badanie zdolności cząsteczki do oddziaływania z TRELL. Oprócz tego, TRELL według wynalazku można zastosować w sposobach badania naturalnie występujących ligandów albo receptorów TRELL, jak również do badania cząsteczek chemicznych, które łączą się albo wiążą z receptorem TRELL. W pewnych aspektach, wynalazek dostarcza sposobu badania cząsteczek chemicznych pod względem ich zdolności do modulowania oddziaływania pomiędzy TRELL i jego receptorem. Sposób obejmuje łączenie receptora TRELL i TRELL w warunkach w których para jest zdolna do oddziaływania, dodawanie badanej cząsteczki chemicznej i wykrywanie tworzenia się albo dysocjacji kompleksów. Te czynniki modulujące można dalej badać in vitro, np. przez badanie ich aktywności w układzie bezkomórkowym a następnie, ewentualnie, podawać związek komórkom albo zwierzętom i badać efekty.

H. Przykłady

I. Izolowanie cDNA TRELL

a) Klonowanie mysiego TRELL cDNA kodujący mTRELL wyizolowano przez PCR z biblioteki cDNA z mysich makrofagów otrzewnowych. Sekwencja aminokwasowa i położenie regionu śródbłonowego są typowe dla białka błonowego. Sekwencja aminokwasowa mTRELL podana jest na Id. Sekw. nr 2 zaś sekwencja DNA na Id. Sekw. nr 1.

Makrofagi otrzymano z myszy Balb/c przez płukanie jamy otrzewnej, zaś komórek, które przylgnęły do plastiku przez godzinę poddano lizie i ekstrahowano z nich RNA. Syntetyzowano antysensowny starter oligonukleotydowy z sekwencji mysiej erytropoetyny: 5'GTTCCAGGCCAGCCTGGG3' (Shoemaker iMistock, Mol. Cell. Biol. 6:849 (1986)). Starter ten zastosowano w protokole 5'RACE według instrukcji producenta (5'RACE System z firmy BRL) w połączeniu ze starterem kotwiczącym zaprojektowanym przez BRL. Pierwszą nić cDNA wytworzono z RNA z przylegających przez godzinę makrofagów otrzewnowych. Amplifikację przeprowadzono w urządzeniu Perkin Elmer DNA Thermal Cycler z polimerazą DNA Taq z Perkin Elmer. Po denaturacji przez 5 minut w 94°C zastosowano następujące warunki: 35 cykli po 30 sekund w 94°C, 30 sekund w 55°C i 3 minuty w 72°C. Przeprowadzono dodatkowe wydłużanie w 72°C i zatrzymano reakcję w 4°C. Analiza doświadczenia PCR na żelu agarozowym wykazała 2 amplifikowane fragmenty po 650 bp i 500 bp. 2 fragmenty wycięto z żelu, wprowadzono do wektorów pBS-T i sekwencjonowano. Obie wstawki były inne. Obie posiadały na końcach te same startery oligonukleotydowe swoiste dla erytropoetyny zastosowane do zapoczątkowania reakcji PCR. Hybrydyzacja metodą northern z fragmentami losowo znakowanymi r wykazała, że hybrydyzowały z różnymi rNa, fragment 500 bp hy188 102 bry(^j^;^<^ował z RNA wielkości 1,4 kb w makrofagach. Znakowane ³²P sondy rybonukleinowe zastosowane w obu kierunkach użyto w hybrydyzacji northern w celu określenia kierunku cDNA.

Z oznaczonych kierunków i sekwencji, uzyskano dwa startery wewnętrzne dla mRNA wielkości 1,4 kb. Zastosowano je w, odpowiednio 3' i 5'RACE-PCR. Doświadczenie 3'RACE wykazało fragment wielkości 750 bp, który wprowadzono do wektora pBS-T i sekwencjonowano. Odpowiadał on końcowi 3' RNA 1,4 kb, ponieważ sekwencja zawierała dodatek sygnału poliA AATAAA bezpośrednio przed ciągiem poliA. 5'RACE nie wykazała żadnego prążka. W celu wytworzenia biblioteki cDNA z przylegających przez godzinę makrofagów zastosowano zestaw do amplifikacji cDNA Clontech Marathon. Zastosowano fragment PCR wielkości 1040 bp, wyizolowany przez PCR z sensownym i antysensownym starterem oligonukleotydowym, oraz starterem uniwersalnym z zestawu. Umożliwiło to izolację fragmentu większej wielkości niż oryginalny fragment 1040 bp. Nowy fragment, który sekwencjonowano dodał 60 bp do sekwencji 5' (Id. Sekw. nr 1).

RNA ekstrahowano z mysich makrofagów otrzewnowych indukowanych tioglikolanem po 1 godzinnym przyleganiu. Przeprowadzono hybrydyzację z cDNA TRELL znakowanym r. Figura 3 pokazuje analizę metodą northern ekspresji mRNA TRELL w mysich makrofagach otrzewnowych i innych mysich tkankach.

Pierwsze 21 aminokwasów stanowi hydrofobową domenę śródbłonową. Nie stwierdzono identycznych sekwencji na poziomie nukleotydowym i aminokwasowym w dostępnych bazach danych. Stosując program PROSITE oraz sekwencję 225 aminokwasów stwierdzono, że sekwencja należy do białek rodziny TNF. Białko posiadało również różne domeny opisane dla LTa i innych członków tej rodziny (Browning i in., Cell 72:847 (1993); Ware i in., „The ligands and receptors of the lymphotoxin system; w Pathways for Cytolysis, Grifith i Tschopp (wyd.) Springer-Verlag, Berlin, Heidelberg, str. 175-218 (1995)). Sekwencja ta jest unikalna. Na poziomie nukleotydowym albo aminokwasowym obserwowano słabą identyczność albo podobieństwo z innymi członkami rodziny TNF oraz innymi sekwencjami. Przeszukując bazy danych EST, 1 sekwencja ludzka wykazywała homologię z sekwencją mysią. Klon 154742,5' (numer dostępu GenBank R55379) z biblioteki sutka wykonanej przez Soares, Washington University, posiadał sekwencję 345 par zasad o 89% homologii z mysim TRELL. Żadna z ludzkich sekwencji w dostępnych bazach danych nie pasowała do dostępnego końca 5' DNA mTRELL.

b) Klonowanie ludzkiego TRELL

i) Wytworzenie sond oligonukleotydowych i starterów PCR

Sekwencją ludzkiego EST R55379, który wykazywał homologię z mysim TRELL zastosowano jako podstawę do syntezy starterów oligonukleotydowych. Syntetyzowano dwa sensowne ciągi oligonukleotydowe po 20 zasad:

LTB-065 5'CCCTGCGCTGCCTGGAGGAA (NT 70-89 z R55379):

LTB-066 5'TGATGAGGGGAAGGCTGTCT (NT 14-33 zR55379) oraz jeden 20-mer antysensowny:

LTB-067 5'AGACCAGGGCCCCTCAGTGA (NT 251-270 z R55379).

ii) Identyfikacja źródła mRNA i cDNA do klonowania hTRELL.

PoliA+ mRNA z ludzkiej wątroby (nr kat 6510-1), śledziony (nr kat. 6542-1) i węzła chłonnego (nr kat. 6594-1 zakupiono z Clontech. PoliA+ mRNA z ludzkich linii komórkowych THP-1, U937 i 11-23 wytworzono w Biogen, Cambridge, MA. Bibliotekę cDNA ludzkiego migdałka w lambda gt10 oraz DNA z biblioteki migdałka również wytworzono w Biogen. Przeprowadzono RT-PCR na sześciu próbkach RNA. Każda mieszanina reakcyjna cDNA zawierała 1 pg poliA+mRNA, 50 mM Tris pH 8,3, 75 mM KCl, 3 mM MgCl2, 10 mM DTT, 250 pM dNTP, 50 ng losowych heksamerów (50 ng/pl) i 400 jednostek odwrotnej transkryptazy Super-ScriptII (Gibco BRL nr kat. 6542-1) w objętości końcowej 40 pl. Mieszaninę reakcyjną inkubowano w 20°C przez 20 minut, 42°C przez 50 minut i 99°C przez 5 minut. Do PCR, zastosowano 1/50 każdej z mieszanin reakcyjnych cDNA albo 100-1000 ng DNA biblioteki cDNA. Nastawiono dwie reakcje PCR dla każdej próbki, jedną z parą starterów LTB-065 i LTB-067, co dało produkt PCR wielkości 201 bp i drugą z parą, starterów LTB-066

188 102 i LTB-067, co dało produkt 257 bp jeżeli transkrypcja zachodziła w próbce. Reakcje PCR przeprowadzono w 10 mM Tris pH 8,3, 50 mM KCl, 1,5 mM MgCb, 0,01% żelatynie, 10% DMSO, 100 pM dNTP, 30 pmoli każdego ze starterów oraz 5 jednostek AmpliTaq (Perkin Elmer nr. kat. N801-0060). PCR prowadzono w urządzeniu Perkin Elmer Cetus DNA Thermal Cycler Model 480. Warunkami reakcji były: 1 minuta w 95°C, 1 minuta w 60°C i 1 minuta w 72°C przez 35 cykli.

Prawidłowej wielkości produkty PCR otrzymano z wątroby, śledziony, węzła chłonnego, THP-1 i migdałka, ale nie z U937 albo 11-23. Produkt PCR 201 bp wytworzony z wątroby oczyszczono w celu zastosowania jako sondy do badania przesiewowego cDNA.

iii) Badanie przesiewowe biblioteki cDNA

Wiedząc, dzięki PCR, że biblioteka migdałków zawiera TRELL, jeden milion jednostek tworzących łysinki (pfu) z biblioteki cDNA ludzkiego migdałka w Lambda gt10 wysiano w gęstości 1x10⁵ pfu/płytkę NUNC™. Na filtrach Schlecher&Schuell BS-S85 Optitran™ 20 x20 cm wykonano odbitki. Produkt PCR wielkości 201 bp znakowano losowymi starterami P32 (Feinberg i Vogelstein, Anal. Biochem. 137::266-267, 1984). Filtry hybrydyzowano przez noc w65°C w 400 ml buforu do badania przesiewowego (50 mM Tris pH 7,5, IM NaCl, 0,1% pirofosforan sodu, 0,2% PVP i 0,2% Ficoll) zawierającego 10% siarczan dekstranu, 100 pg/ml tRNA i 6x10³ cpm/ml sondy. Płukano je dwukrotnie buforem i dwukrotnie 2xSSC, 0,1% SDS w 65°C i umieszczono z filmem w -70°C z ekranem wzmacniającym przez 40 godzin.

Podwójnie pozytywne łysinki pobrano z płytek głównych w SM (100 mM NaCl, 10 mM MgSOą, 50 mM Tris pH 7,5) z żelatyną. Oczyszczono 12 spośród pozytywnych łysinek. Minipreparat DNA Lambda z 12 oczyszczonych łysinek trawiono Notl, poddano elektroforezie na 1% żelu agarozowym, przeprowadzono transfer metodą Southema i hybrydyzowano z sondą 201 bp. Klony o większych wstawkach (około 2 kb), które hybrydyzowały z sondą wybrano do oczyszczania DNA na wielką skalę i sekwencjonowania DNA. Wstawkę z każdego z tych klonów subklonowano do miejsca Notl pBluescriptSK+ (Stratagene nr 212205). Sekwencję DNA otrzymano z DNA Lambda i plazmidowego DNA. Klon F1a, który zawierał wstawkę cDNA wielkości 2006 bp posiadał na końcu regionu kodującego 5' wstawkę i nie zawierał kompletnej ramki odczytu. Klon C2a, zwany również PB 133 zawierał wstawkę cDNA wielkości 1936 bp. Klon ten zawierał nie ulegający translacji region 5' wielkości 543 bp, otwartą ramkę odczytu wielkości 852 bp i nie ulegający translacji region 3', ale nie zawierał sygnału poliadenylacji ani ogona poliA.

Sekwencja nukleotydowa kodująca ramkę odczytu cDNA hTRELL klonu A2a podana jest jako Id. Sekw. nr 3. Wywnioskowana sekwencja aminokwasowa 284 aminokwasów podana jest na Id. Sekw. nr 4. Druga metionina w pozycji 36 może być kodonem startu translacji ponieważ lepiej odpowiada wymaganiom startu określonym przez Kozak'a.

Stosując zidentyfikowane sekwencje, określono sekwencje cDNA kodujących TRELL. Z opisanych wyżej sekwencji DNA (tj. Id. Sekw. nr 3) wywnioskowano sekwencje aminokwasowe TRELL (Id. Sekw. nr 4). Należy wyjaśnić, że znając obecny stan techniki inżynierii białek, specjalista może dokonać odpowiednich zmian, insercji albo delecji w tych sekwencjach aminokwasowych i otrzymać różne cząsteczki wykazujące zasadniczo tę samą aktywność biologiczną albo immunologiczną co cząsteczki opisane tutaj.

iv) analiza metodą northem ekspresji ludzkiego TRELL

Fragment PpuM1/BstXI wielkości 440 bp ludzkiego klonu cDNA 2a znakowano ³²P losowymi starterami i stosowano jako sondę do dostępnych w handlu membran northem zawierających RNA z różnych tkanek ludzkich. Analiza metodą northern wykazała, że fragment hTRELL hybrydyzował z pojedynczym rodzajem mRNA wielkości od 1,4 do 1,6 kb. Ludzki TRELL ulega ekspresji w większości narządów układu odpornościowego, tj. śledzionie, limfocytach krwi obwodowej (PBL), węzłach chłonnych, wyrostku robaczkowym, ale jest go względnie mało w grasicy, wątrobie płodowej (źródle komórek macierzystych limfocytów) i szpiku (figura 4). Stąd, głównie wtórne narządy limfatyczne wyrażają TRELL. Ekspresję wykryto również w jajniku, prostacie, jelicie cienkim, okrężnicy, sercu, mózgu, łożysku, wątrobie mięśniach szkieletowych, nerce i trzustce. Ekspresja była względnie niska w jądrach,

188 102 wątrobie, nerkach i grasicy. Ten wzorzec wskazuje na rozpowszechnioną ekspresję ściśle przypominającą ligand TRAIL, z takim wyjątkiem, że TRAIL ulega słabej ekspresji w sercu i mózgu.

c) Izolacja receptora wiążącego ligand TRELL

Ligandy rodziny TNF można zastosować do identyfikacji i klonowania receptorów. Z opisaną sekwencją TRELL, można poddać fuzji koniec 5' domeny zcwnątrzkomói^kowej Uganda TRELL, który stanowi sekwencję wiążącą receptor z sekwencją znacznikową i dodać sekwencję liderową, która wymusi wydzielenie liganda w dowolnym spośród układów ekspresyjnych. Przykład takiej technologii został opisany przez Browning i in., (1996) (JBC 271, 8618-8626) gdzie ligand LTfi wydzielono w podobny sposób. Sekwencję liderową VCAM połączono z krótkim znacznikiem peptydowym myc, po którym następowała domena zewzątrzkcmórkcwa LT-β. Sekwencję VCAM zastosowano do wymuszenia wydzielania normalnie związanej z błoną cząsteczki LT-β. Wydzielane białko zachowuje znacznik myc na końcu N, który nie zakłóca zdolności do wiązania receptora. Takie białko wydzielnicze można wyrażać w przejściowo transfekowanych komórkach Cos albo w podobnym układzie, np. wektorach pochodzących zEBNA, komórkach owadów/bakulowirusach, pichia itp. Nie oczyszczony nadsącz można zastosować jako źródło znakowanego liganda.

Komórki wyrażające receptor można identyfikować przez eksponowanie ich na znakowany ligand. Komórki ze związanym Ugandem identyfikuje się w analizie FACS przez znakowanie znacznika myc przeciwciałem przeciwko myc (9E10), a następnie znakowanym fikoeiytryną. (albo podobnym znacznikiem) przeciwciałem przeciwko mysim immuncglcbulinom. Komórki pozytywne w analizie FACS można łatwo identyfikować i mogą służyć jako źródło RNA kodującego receptor. Następnie można wytworzyć bibliotekę ekspresyjną z RNA metodą standardową i podzielić na pule. Pule klonów transfekuje się do odpowiedniej komórki gospodarza i określa się wiązanie znakowanego liganda z komórkami transfekowanymi zawierającymi receptor przy użyciu mikroskopu, po znakowaniu związanego znacznika myc przeciwmysim przeciwciałem znakowanym enzymem, tj. przeciwciałem znakowanym galaktozydazą, fosfatazą alkaliczną albo lucyferazą. Gdy zidentyfikuje się pulę pozytywną, można zmniejszać jej wielkość dopóki identyfikuje się cDNA kodujące receptor. Procedurę tę można przeprowadzić z mysim albo ludzkim TRELL, ponieważ jeden z nich może łatwiej doprowadzić do receptora.

2. Komórki i Reagenty

Wszystkie komórki pochodziły z American Type Culture ^Ι^ϊϊ^ (ATCC, Rockydle, Maryland, USA) z wyjątkiem klonu 13 WEHI 164, który otrzymano od dr Kawashima (Geneva Biomedical Research Institute, Genewa, Szwajcaria). Klon HT29 (HT29-14) opisano uprzednio (Browning i in., 1996), zaś wrażliwy na TNF klon ME 180 otrzymano od dr Carl Ware. Linia komórkowa hybrydoma 11-123 została opisana (Browning i in., 1991). Myszom Balb/c wstrzyknięto dootrzewnowo 3 dni przed zabiciem po 1,5 ml brzeczki tioglikclanowej (Difco Lab., MI). Komórki pobrano z jamy otrzewnej i hodowano przy gęstości 10⁶ komórek/ml przez godzinę w DMEM (Gibco Lab.). Nie przylegające komórki wypłukano z płytek, zaś komórki przylegające, w większości makrofagi poddano lizie w Tri-Reagent (Molecular Research Center Inc.) i poddano ekstrakcji RNA.

Rekombincwaze ludzkie TNF, LTa, !Ηα1/β2, przeciwciała przeciwko tym białkom i białka fuzyjne receptora-Ig opisano uprzednio (Browning i in., 1995). Opisano przeciwciało 5C8 przeciwko CD40L. Poligonalną surowicę przeciwko hTRELL wytworzono przez wstrzyknięcie do węzła chłonnego czystego rekcmbizcwazego hTRELL w CFA, jak to opisano uprzednio (Browning i Ribolini, 1989). Po 2 miesiącach obserwowano reakcję przeciwko hTRELL i oczyszczono przeciwciała stosując Białko A-Sepharose.

Klonowanie mysiego TRELL

Antysensowny starter cligonuklectyUcwy z sekwencji mysiej erytropoetyzy: 5'GTTCCAGGCCAGCCTGGG3' zastosowano w protokole 5'RACE według instrukcji producenta (5HACE System z firmy BRL) w połączeniu ze starterem kotwiczącym zaprojektowanym przez BRL. Pierwszą nić cDNA wytworzono z RNA z przylegających przez godzinę makrofagów otrzewnowych. Amplifikację przeprowadzono w urządzeniu Perkin Elmer DNA

188 102

Thermal Cycler z polimerazą DNA Taq z Perkin Elmer. Po denaturacji przez 5 minut w 94°C zastosowano następujące warunki: 35 cykli po 30 sekund w 94°C, 30 sekund w 55°C i 3 minuty w 72°C. Przeprowadzono dodatkowe wydłużanie w 72°C i zatrzymano reakcję w 4°C. Analiza doświadczenia PCR na żelu agarozowym wykazała 2 amplifikowane fragmenty po 650 bp i 500 bp. 2 fragmenty wycięto z żelu, wprowadzono do wektorów pBS-T i sekwencjonowano. Obie wstawki były inne. Obie posiadały na końcach te same startery swoiste dla erytropoetyny zastosowane do zapoczątkowania reakcji PCR. Hybrydyzacja metodą northem z fragmentami losowo znakowanymi ³²P wykazała, że hybrydyzowafy z różnymi RNA, fragment 500 bp hybrydyzował z RNA wielkości 1,4 kb w makrofagach. Znakowane 32p sondy rybonukleinowe zastosowane w obu kierunkach zastosowano w hybrydyzacji northem w celu określenia kierunku cDNA.

Z oznaczonych kierunków i sekwencji, uzyskano dwa startery wewnętrzne dla mRNA wielkości 1,4 kb:

5'TCAGGTGCACTTTGATGAGG3'i 5'CTGTCAGCTCCTCCTGAG3', które zastosowano odpowiednio w 3'RACE i 5'RACE. Doświadczenie 3'RACE wykazało fragment wielkości 750 bp, który wprowadzono do wektora pBS-T i sekwencjonowano. Odpowiadał on końcowi 3' RNA 1,4 kb, ponieważ sekwencja zawierała dodatek sygnału poliA bezpośrednio przed ciągiem poliA. 5'RACE nie wykazała żadnego prążka. W celu wytworzenia biblioteki cDNA z przylegających przez godzinę makrofagów zastosowano zestaw do amplifikacji cDNA Clontech Marathon. Zastosowano fragment PCR wielkości 1040 bp, wyizolowany przez PCR z sensownym i antysensownym starterem oligonukleotydowym (5'AGCAGGAGCCTTCTCAGGAG3' i 5'GATCCAGGGAGGAGCTTGTCC3') oraz starterem uniwersalnym z zestawu. Umożliwiło to izolację fragmentu większej wielkości niż oryginalny fragment 1040 bp. Nowy fragment, który zsekwencjonowano dodał 60 bp do sekwencji 5'.

Klonowanie ludzkiego TRELL

Przeszukiwanie bazy danych EST dało 1 klon ludzki silnie homologiczny z sekwencją mysią. Klon 154742 (numer dostępu GenBank R55379) posiadał sekwencję 345 bp w 89% homologiczną z mysim cDNA. Do przeszukiwania przez RT-PCR różnych tkanek i bibliotek na obecność transkryptów TRELL zastosowano dwa startery z EST (5'CCCTGCGCTGCCTGGAGGAA3' i 5TGATGAGGGGAAGGCTGTCT3'). Produkty o prawidłowej wielkości otrzymano z mRNA wątroby, śledziony, węzłów chłonnych, THP-1 i migdałków, ale nie z U937. Produkt wielkości 201 bp klonowano i zastosowano do przeszukiwania biblioteki cDNA ludzkiego migdałka w lambda gt10. 10⁵ jednostek tworzących łysinki wysiano przy gęstości 10⁵ pfu/płytkę. Na filtrach nitrocelulozowych 20x20 cm wykonano odbitki. Filtry hybrydyzowano przez noc w 65°C w 400 ml buforu do badania przesiewowego (50 mM Tris pH 7,5, 1M NaCl, 0,1% pirofosforan sodu, 0,2% PVP i 0,2% Ficoll) zawierającego 10% siarczan dekstranu, 100 pg/ml tRNA i 6x105 cpm/ml sondy. Płukano je dwukrotnie buforem i dwukrotnie 2xSSC, 0,1% SDS w65°C. Minipreparaty DNA Lambda wytworzono z pozytywnych kolonii i klony o największych wstawkach wybrano do oczyszczania DNA na dużą skalę i sekwencjonowania. Wstawki klonowano do miejsca Notl pBluescriptSK+.

Stwierdzono, że jedna ludzka EST (R55379) koduje część sekwencji ludzkiego TRELL.

Analiza RNA

Fragment PpuMl/BstXI wielkości 0,45 kb albo fragment Narl/NotI wielkości 1,25 cDNA hTRELL znakowano losowymi starterami i zastosowano do sondowania membran northem myszy i człowieka zakupionych w Clontech. Tkanki i komórki mysie ekstrahowano w celu uzyskania RNA stosując TRI-Reagent. Analizę northem przeprowadzono zasadniczo jak to już opisano (Chicheportiche i Vassalli, 1994) z 4 pg całkowitego RNA i znakowanego Ν’ losowymi starterami cDNA mTRELL.

Przyporządkowanie chromosomalne

Panel cDNA z mikrochromosomalnych hybryd komórkowych (HGMP Resource Centre, Hinxton, Cambridge, UK) zastosowano do amplifikacji przez PCR fragmentu 340 bp starterami wybranymi w nie ulegającym translacji regionie 3', który nie jest homologiczny z sekwencją mysią (5'AGTCGTCCCAGGCTGCCGGCT3' i 5'CCTGAAGTGGGGTCT188 102

-TCTGGA3'). Przeprowadzono amplifikację przez 40 cykli po 30 sekund w 94°C, 90 sekund w 65°C i 90 sekund w 72°C. Wykrywanie przeprowadzono na żelu agarozowym barwionym bromkiem etydyny.

Ekspresja rekombinowanego białka TRELL

Rozpuszczalny konstrukt ekspresyjny obejmował sekwencję liderową VCAM, znacznik peptydowy myc oraz domena zewnątrzkomórkowa hTRELL podobna do opisanej dla limfotoksyny-b (ref) w sposób podobny do opisanego dla Ltb (Browning i in., 1996). Wyizolowano następujące fragmenty DNA: fragment NotI/tępy kodujący sekwencję liderową VCAM i parę oligonukleotydów kodujących znacznik myc (tępy 5', PpuM1 3'), które opisano, fragment 0,45 PpuM1/BstXI TRELL oraz 0,65 BstXI/NotI TRELL. Cztery fragmenty poddano ligacji do wektora pBluescript NotI/fosforylowany. Wstawkę NotI z tego wektora przeniesiono do wektora pFastBad (GibcoBRL) i zastosowano do wytwarzania rekombinowanych Uaculowirusów. Rozpuszczalny TRELL wytworzono przez zakażenie komórek owadzich HiFiveTM w MOI równej 10 i zebrano pożywkę po 2 dniach. Do pożywki dodano następujące składniki: bufor HEPES w stężeniu końcowym 25 mM, pH 7,4, 1 mM AEBSF (Pierce) i 1 mg/ml pepstatyny. Pożywkę filtrowano i zatężano 10-krotnie przez ultrafiltrowanie nad filtrem Amicon o ciężarze odcięcia równym 10 kDa. Zatężoną pożywkę zawierającą TRELL wprowadzono do kolumny SP Sepharose Fast Flow i płukano 25 mM HEPES pH 7,0, zawierającym 0,4 M NaCl. TRELL eluowano tym samym buforem z 0,6 M NaCl. Oczyszczony TRELL poddano analizie wielkości poprzez chromatografię wykluczania w żelu.

Analiza wydzielania

Skonstruowano wektory ekspresyjne opartej na EBNA z użyciem wektor CH269, który jest zmodyfikowaną wersją pEBVHis ABC (InVitrogen), w którym usunięto gen EBNA i znacznik histydynowy. Fragment 0,71 hTNF w wektorze pFasrBac dostarczył dr Pescamento i dr Goldfeld. Wstawkę SnaBI/XhoI poddano ligacji w miejsce Pvu.II/XhoI CH269. Genomowa wstawka hTNF zawierająca delecję miejsca przecięcia 1-12 była ofiarowana przez dr Kollias i wprowadzona do wektora CH269 przez dr Goldfeld.

Wstawka Notl wielkości 1,8 kb klonu A2A TRELL, fragment cDNA Notl wielkości 0,98 kb zawierający hCD40L dostarczony przez dr Garber oraz wstawka NotI wielkości

1,46 kb zawierająca hLTa (Browning i in., 1995) poddano ligacji w miejsce Notl CH269. Wstawkę HindIII 0,81 kb zawierającą region kodujący hLTb ze zmodyfikowanym miejscem startu (Browning i in., 1995) poddano ligacji w miejscu HindIII CH269. Komórki EBNA-293 transfekowano różnymi wektorami CH269 wraz z wektorem GFP stosując lipofectaminę i pobierano w PBS z dodatkiem 5 mM EDTA do analizy FACS albo po 2 dniach komórki poddawano znakowaniu metabolicznemu. Obie procedury wykorzystywały następujące przeciwciała, frakcję króliczych poliklonalnych Ig przeciwko hTRELL, mAb przeciwko hTNF 104c, mAb przeciwko hLTa AG9, mAb przeciwko Lta1/b2 B9 i mAb przeciwko CD40L 5C8. Analizę FACS przeprowadzono w pożywce RPMI zawierającej 10% FCS i 50 pg/ml agregowanych ciepłem ludzkich IgG w ilości 5 pg/ml. W celu wykrywania wiązania przeciwciał zastosowano przeciw-mysie albo przeciw-królicze IgG znakowane fikoerytryną (Jackson ImmunoResearch). Do bramkowania zastosowano żywe komórki transfekowane pustym GFP. Do immunopreecypitacji komórki w 2 dni po transfekcji płukano PBS i przenoszono do MEM bez met/cys zawierającej 200 pCi/ml TranSlabel (ICN). Po 3 godzinach nadsącz pobierano i poddawano immunoprecypitacji jak to opisano (Browning i in., 1995).

Testy cytotoksyczności

Testy wzrostu komórek przeprowadzono jak to opisano uprzednio (Browning i Ribolini, 1989). Do mikroskopii komórki HT29-14 wysiano do płytek 12-studzienkowych przy gęstości 200000 komórek/studzienkę i hodowano przez 2 dni. Ludzki TRELL, TNF, limfotoksynęalb2 (Browning i in., 1996) albo anti-fas (CH11, Kamaya) dodano wraz z 80 jednostkami/ml ludzkiego interferonu-g. Po 26 godzinach, pożywkę usunięto. Pozostałe komórki utrwalono 80% etanolem i płukano PBS zawierającym 1 mg/ml barwnika Hoechst. Po 2 minutach barwnik usunięto, komórki płukano w PBS i badano w mikroskopie fluorescencyjnym.

188 102

1. Smith et al. 1990; Kohno et al 1990; Loetscher et al 1990; Schall et al 1990.

2. See Jones et al., 1989; Eck et al., 1992.

3. K. Tracey, in Tumor Necrosis Factors. The Molecules and Their Emerging Role in Medicine, B. Beutler (Ed.), Raven Press, NY, p 255 (1992)); A. Waage, in Tumor Necrosis Factors. The Molecules and Their Emerging Role in Medicine, B. Beutler (Ed.), Raven Press, NY, p 275 (1992).

4. G. D. Roodman, in Tumor Necrosis Factors. The Molecules and Their Emerging Role in Medicine, B. Beutler (Ed.), Raven Press, NY, p 117 (1992).

5. A. Nakane, in Tumor Necrosis Factors. The Molecules and Their Emerging Role in Medicine. B. Beutler (Ed.), Raven Press, NY, p 285 (1992); I. A. Clark et al., in Tumor Necrosis Factors. The Molecules and Their Emerging Role in Medicine, B. Beutler (Ed.), Raven Press, NY, p 303 (1992); G. E. Grau et al., in Tumor Necrosis Factors. The Molecules and Their Emerging Role in Medicine, B. Beutler (Ed.), Raven Press, NY, p 329 (1992); P-F. Piguet, in Tumor Necrosis Factors. The Molecules and Their Emerging Role in Medicine. B. Beutler (Ed.), Raven Press, NY, p 341 (1992); G. H. Wong et al., in Tumor Necrosis Factors. The Molecules and Their Emerging Role in Medicine, B. Beutler (Ed.), Raven Press, NY, p 371 (1992).

6. S. Malik, in Tumor Necrosis Factors. The Molecules and Their Emerging Role in Medicine, B. Beutler (Ed.), Raven Press, NY, p 407 (1992).

7. D. A. Fox. Am. J. Med., 99, 82 (1995).

8. D. Goeddel et al., Cold Spring Harbor Symposium Quant. Biol.. 51, 597 (1986);

G. Trinchieri, in Tumor Necrosis Factors· The Molecules and Their Emerging Role in Medicine, B. Beutler (Ed.), Raven Press, NY, p 515 (1992).

9. L. A. Tartaglia et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 88, 9292 (1991); L.A. Tartaglia and D. V. Goeddel, Immunol. Today. 13,151 (1992)..

10. B. Luettig et al., J. Immunol.. 143,4034 (1989); M. Kriegler et al., Cell. 53,45 (1988).

11. C. F. Ware et al., in Pathways for Cytolysis. G. M. Griffiths and J. Tschopp (Eds.), Springer-Verlag, Berlin, Heidelberg, p175-218 (1995).

12. N. Paul et al., Ann. Rev. Immunol.. 6,407 (1988).

13. P.D. Crowe et al., Science. 264, 707 (1994). (J. Browning et al., Cell 72, 847 (1993); J. Browning et al., J. Immunol.. 154,33 (1995).

14. P. De Togni et al., Science. 264,703 (1993); T.A. Banks et al., J. Immunol., 155, 1685 (1995).

15. J. Browning and A. Ribolini, J. Immunol.. 143.1859 (1989): J. Browning et al., I Exp. Med. 183, 867 (1996).

16. T. Suda et al., J. Immunol., 154, 3806 (1995) (T. Suda et al., J. Immunol.. 154, 3806 (1995).

17. B.C. Trauth et al., Science. 245, 301 (1989); S. Yonehara et al., J. Exp. Med.. 169, 1747 (1989); S. Nagata and P. Goldstein, Science. 267,1449 (1995); M. H. Falk et al., Blood.. 79,3300(1992).

18. F. Rieux-Laucat et al., Science. 268, 1347 (1995); T. Takahashi et al., Cell, 76, 969 (1994); R. Watanabe-Fukunaga et al., Nature, 356, 314 (1992).

19. P. R. Galle and al., J. Exp. Med.. 1^^, 1223 (1995).

20. F. Silvestris and al., Clin. Immunol. Immunopathol., 75, 197 (1995).

21. P.D. Katsikis et al., J. Exp. Med., 181. 2029 (1995); A. D. Badley et al., J. Virol.. 70. 199 (1996).

22. S. Wiley et al., Immunity, 3,673 (1995).

23. J. F. Gauchat et al., FEBS Lett., 315, 259 (1993); S. Funakoshi et al., Blood. 83, 2787 (1994).

24. R. C. Allen et al., Science. 259, 990 (1993).

25. L. Biancone et al., Kidney-Int., 48. 458 (1995); C. Mohan et al., J. Immunol.. 154, 1470(1995).

26. J. Ruby and al., Nature Medicine, 1, 437 (1995).

188 102

27. Z. Wang et al., J. Immunol.. 155, 3722 (1995); A. M. Cleary and al., J. Immunol.. 155, 3329(1995).

28. S. Hess and H. Engelman, J. Exp. Med.. 183. 159 (1996).

29. R. G. Goodwin et al, Cell. 73,447 (1993); Goodwin et al, Eur. J. Immunol.. 23, 2631 (1993); C. A. Smith et al., Cell, 73, 1349 (1993).

30. See, for example, Molecular Cloning A Laboratory Manual. 2nd Ed., ed. by Sambrook, Fritsch and Maniatis (Cold Spring Harbor Laboratory Press: 1989); DNA Cloning. Volumes I and Π (D. N. Glover ed., 1985); Oligonucleotide Synthesis (M. J. Gait ed., 1984); Mullis et al. U.S. Patent No: 4,683,195; Nucleic Acid Hybridization (B. D. Hames & S. J. Higgins eds. 1984); Transcription And Translation (B. D. Hames & S. J. Higgins eds. 1984); Culture Of Animal Cells (R. I. Freshney, Alan R. Liss, Inc., 1987); Immobilized Cells And Enzymes (IRL Press, 1986); B. Perbal, A Practical Guide To Molecular Cloning (1984); the treatise, Methods In Enzvmology (Academic Press, Inc., N.Y.); Gene Transfer Vectors For Mammalian Cells (J. H. Miller and M. P. Calos eds., 1987, Cold Spring Harbor Laboratory); Methods In Enzymology. Vols. 154 and 155 (Wu et al. eds.), Immunochemical Methods In Cell And Molecular Biology (Mayer and Walker, eds., Academic Press, London, 1987); Handbook Of Experimental Immunology. Volumes I-IV (D. M. Weir and C. C. Blackwell, eds., 1986); Manipulating the Mouse Embryo. (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N. Y., 1986).

31. See for example, Narang, SA (1983) Tetrahedron 39:3; Itakura et al. (1981) Recombinant DNA. Proc 3rd Cleveland Svmpos. Macromolecules, ed. AG Walton, Amsterdam: Elsevier pp273-289; Itakura et al. (1984) Annu. Rev. Biochem. 53:323; Itakura et al. (1984) Science 198:1056; Ike et al. (1983) Nucleic Acid Res. 11:477.

32. See, for example, Scott et al. (1990) Science 249:386-390; Roberts et al. (1992) PNAS 89:2429-2433; Devlin et al. (1990) Science 249: 404-406; Cwirla et al. (1990) PNAS 87: 6378-6382; as well as U.S. Patents Nos. 5,223,409, 5,198,346, and 5,096,815.

33. M.T. Abreu-Martin, A. Vidrich, D.H. Lynch and S.R. Targan. Divergent induction of apoptosis and IL-8 secretion in HT-29 cells in response to TNF- and ligation of Fas ligand.

J. Immunol. 155:4147-4154,1995.

34. K. Agematsu, T. Kobata, F.-C. Yang, T. Nakazawa, K. Fukushima, M. Kitahara, T. Mori, K. Sugita, C. Morimoto and A. Komiyama. CD27/CD70 interaction directly drives B cell IgG and IgM synthesis. Eur. J. Immunol. 25: 2825-2829, 1995.

35. R. Amakawa, A. Hakem, T.M. Kundig, T. Matsuyama, J.J.L. Simard, E. Timms, A. Wakeham, H.-W. Mittruecker, H. Griesser, H. Takimoto, R. Schmits, A. Shahinian, P.S. Ohashi, J.M. Penninger and T. W. Mak. Impaired negative selection of T cells in Hodgkin=s disease antigen CD30-deficient mice. Cell 84:551-562,1996.

36. J.-L. Bodmer, K. Burens, P. Schneider, K. Hofmann, V. Steiner, M. Thome, T. Bornand, M. Hahne, M. Schroeter, K. Becker, A. Wilson, L.E. French, J.L. Browning, H.R. MacDonald, and J. Tschopp. TRAMP, a novel apoptosis-mediating receptor with sequence homology to tumor necrosis factor receptor 1 and fas (apo-l/CD95). Immunity 6: 79-88,1997.

37. J. Brojatsch, J. Naughton, M.M. Rolls, K. Zingler and J.A.T. Young. Carl, a TNFRrelated protein is a cellular receptor for cytopathic avian lleukosis-sarcoma viruses and mediates apoptosis. Cell 87: 845-855,1996.

38. J.L. Browning, M.J. Androlewicz and C.F. Ware. Lymphotoxin and an associated 33- kDa glycoprotein are expresed on the surface of an activated human T cell hybridoma. J. Immunol. 147: 1230-7, 1991.

39. J.L. Browning, K. Miatkowski, D.A. Griffiths, P.R.Bourdon, C. Hession, C.M. Ambrose and W. Meier. Preparation and characterization of soluble recombinant heterotrimeric complexes of human lymphotoxins alpha and beta. J. Biol. Chem. 271: 8618-26, 1996.

40. J.E. Castro, J.A. Listman, B.A. Jacobson, Y. Wang, P.A. Lopez, S. Ju, P. W. Finn and D.L. Perkins. Fas Modulation of apoptosis during negative selection of thymocytes. Immunity 5: 617-627, 1996.

188 102

41. C.-Y.A. Chen and A.-B. Shyu. AU-rich elements: characterization and importance in mRNA degradation. Trends in Biol. Sci. 20:465-470, 1995.

42. Y. Chicheportiche, C. Ody and P. Vassalli. Identification in mouse macrophages of a new 4 kb mRNA present in hematopoietic tissue which shares a short nucleotide sequence with erythropoietin mRNA. Biochim. Biophvs. Res. Comm. 209: 1076 - 1081, 1995.

43. A.M. Chhmaiymi, K. O=^F^(^^lee, G.-L. Yu, R.H. Lyons, M. Garg, D.R. Duan, L. Xing, R. Gnntz, J. Ni nnd V.M. Dixit. i^al tanssucctinn yy DR3 adeath-domaincoataiainr receptor related to TNFR-1 and CD95. Science 274: 990-992, 1996.

44. P. DeTonai et al. Abnormal development of peripheral lymphoid organs in mice deficieat in lymphotoxia. Science 264: 703-7, 1994.

45. M.A. DeBenedette, N.R. Chu, K.E. Pollok, J. Hurtako, W.F. Wade, B.S. Kwon and T.H.Watts. Role of 4-1BB ligand in costimulation of T lymphocyte growth and its upregulation on M12 B lymphomas by cAMP. J. Exp. Med. 181: 985-992,1995.

46. M. Degli-Esposti, T. Davis-Smith, W.S. Din, PJ. Smolak, R.G. Goodwin and C.A. Smith. Actwation of the lymphotoiin-p receptor by cross-liakiag induces chemokine production and growth arrest in A375 melanoma cells. J. Immunol. 158:1756-1762, 1997.

47. T.M. Foy, A. Aruffo, J. Bajorath, J.E. Buhlmann and R.J. Noelle. ΣηΜαιη^ Jagujation by CD40 and tts iig;md gp339. Ann. Rev , Immuno. . 14: 591-617, 1996.

48. H. J. Gruss, N. Boiani, D.E. Williams, R. J. Armitage, C. A. Smith and R.G. Goodwin. Pleiotropic effects of the CD30 Ugand on CD30-expressiag cells and lymphoma cell lines. Blood 83:2045-56,1994.

49. H.J. Gruss and S.K. Dower. Tumor necrosis factor Ugand superfamily: iavolvemeat in the patnology of malignaat lymphomas. Blood 85: 3378-404,1995.

50. J. Kitson, T. Raven, Y.-P. Jiaan, D.V. Goeddel, K.M. Giles, K.-T. Pun, C.J. Grinham, R.Brown and S.N. Farrow. A death domaia-coataiaian receptor that mediates apoptosis. Nature 384: 372-375, 1996.

51. S.Y. Lee, C.G. Park and Y. Choi. T cell receptor-dependent cell death of T cell hybridomas mediated by the CD30 cytoplasmic domain in association with tumor necrosis factor aeceptoa-associated factors. J. Exp. Med. 183:669-674,1996.

52. R.I. Montgomery, M.S. Warner, B.J. Lum and P.G. Spear. Herpes simplex viaut-1 entry into cells mediated by a novel member of the TNF/NGF receptor family. Cell 87: 427436,1996.

53. S.Nagata. Apoptosis by death factor. Cell 88:355-365,1997.

54. R.M. Pitti, S.A. Marsters, S. Ruppert, C.J. Donahue, A. Moore and A. Ashkenazi. Ianuctioa of apoptosis by Apo-2 Ugand, a new member of the tumor necrosis factor cytokaae family. J. Biol.Chem. 1996.

55. C.A. Smith, T. Farrah and R.G. Goodwin. The TNF receptor superfamily of cellular and viral proteins: activation, costimulatioa, and death. Cell 76: 959-62,1994.

56. G.L. Smith. Virus strategies for evasion of the host aespoase to infection. Trends in Microbiol. 3: 81-88, 1994.

57. E.Strueber and W. Strober. The T cell-B cell interaction via OX40-OX40L is necessary for the T cell independent humoral immune response. J. Exp. Med. 183: 979-989, 1996.

58. H.-K. Sytwu, R.S. Liblau and H.O. McDevitt. The roles of Fas/Apo-1 (CD95) and TNF in antigea-iaduced programmed cell death in T cell receptor trangenic mice. Immunity 5: 17-30, 1996.

59. P. Vassalli. The pathophysiology of tumor aecaosis factors. Ann. Rev. Immunol. 10: 411-452,1992.

60. L. Zheng, G. Fisher, R.E. Miller, J. Peschon, D.H. Lynch and M.J. Lenardo. Induction of apoptosis in mature T cells by tumour necrosis factor. Nature 377: 348-351,1995.

188 102

LISTA SEKWENCJI ( 1) INFORMACJE OGÓLNE:

(i) ZGŁASZAJĄCY: Chicherportiche, Yves

Browning, Jeffrey L.

(iv) Adres do korespondencji (A) NAZWA: Biogen Inc.

(B) ULICA: 14 Cambridge Center (C) MIASTO: Cambridge (E) KRAJ: MA (F) KOD POCZTOWY (ZIP): 02142 (ii) tytuł wynalazku: Ligand pokrewny z czynnikiem martwicy nowotworu (iii) LICZBA SEKWENCJI: 4 (iv) POSTAĆ MOŻLIWA DO ODCZYTANIA PRZEZ KOMPUTER:

(A) RODZAJ NOŚNIKA: Floppy disk (B) KOMPUTER: IBM PC compatibLe (C) SYSTEM OPERACYJNY: PC-DOS/MS-DOS (D) OPROGRAMOWANIE: Patentln Release #1.0, Version #1.25 (EPO) (vi) DANE DOT. OBECNEGO ZGŁOSZENIA:

(A) NUMER ZGŁOSZENIA:

(B) DATA ZGŁOSZENIA: 07-LUT-1999 (2) INFORMACJA DLA ID. SEKW. NR: 1:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 1168 par zasad (B) RODZAJ: kwas nukleinowy (C) NICIOWOŚĆ: podwójna (D) TOPOLOGIA: Liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: cDNA (iii) HYPOTETYCZNA: Nie

188 102 (ix) ŹRÓDŁO POCHODZENIA:

(A) ORGANIZM: Białko pokrewne z rodziną TNF (ix) CECHA:

(A) NAZWA/KLUCZ:CDS (B) POŁOŻENIE: 2..676 (xi) OPIS SEKWENCJI: ID. SEKW. NR 1:

G GTG CTG AGC CTG GGC CTG GOG CTG GCC TGC CTT GGC CTC CTG CTG 445

Val Leu Ser Leu Gly Leu JA.a Leu Ala Cys Leu CTy Leu Leu Leu

10 11

GTC GTG

GTCAGC LCTG

GGG Gly

AGC TGG GCA

ACG CTG TCT GCC CAG GAG CCT Thr Leu Seir Ala Gln Glu Pro

94

Val

Ser

Leu 20

Ser Trp

Ala

25

30

TCT

CAG

GAG

ero

ACA

GCCA

(GAG

GAC

CGC

C<GG

GAG

CCC

CCT

(dA

CTG

110:

Ser

Gln

Glu

Leu

Thr

Ala

Glu

Asp

Arg

Glu

Pro

Glu

Leu

35

40)

40

AAT

CCC

CAG

AACA

(GAG

GAA

AGC

CAG

GAT

GTG

GTA

CCT

TTC

TTG

Οϋ

CAA

110

Aun

Pro

Gln

Thr

Glu

Ser

Gln

Asp

Val

Pito

Phe

Ilu

Glu

Gln

50

55

60

CTA

GTC

CGC

CCT

(CGA

AGA

AGT

GCT

CCT

AJd

(GGC

CCGS

(dG

GCG

ΠΚ

C(CT

233

Leu

Val

Arg

Pro

(Arg

AArg

Ser

Ala

Pro

Lys

Gly (Ar

Lys

AA. a

Arg

Pro

65

70

75

CGC

CGA

GCT

AAT

GCCA

GCC

CAT

TAT

(Αβ

GTC

aCAT

(CC*

aGG

CCCA

(GGA

(C^G

288

Arg

Al Al

He

e^a

Ala

His

(Tyr

Glu

Val

His

Pito

(Arg

Pro

Gly

Gln

80

85

90

95

GAT

GGA

GCG

CM

G(CA

(GGT

GTC

GAT

auuu

ACA

GTC

AGT

(GGC

TGG

«Λ

(GAG

334

Aup

Gly

Al Al

Gln

aAl

Gly

Val

Ai^jp

Gly

Thr

Val

Sse

Gly

Τηρ

Glu

100

105

110

ACC

AAA

ATC

CdC

LGC

TCC

AGC

CCC

CTTG

CGC

TAC

GGO

(CGC

(CG

ATT

(GGG

338

Thr

Lye

He

Asn

(su

Ser

Pro

(LU

(Arg

ATyr

(Au

(Arg

Gln

II^e

Gly

115

110

112

GAA

TTT

ACA

GTC

ATC

AGG

GCT

auGu

CTC

TAC

CTT

TAC

1T3T

CM

GTC

403

Glu

Phe

Thr·

vaa

LIe

Arg

(Al a

Gly

Leu

•^y

(Tyr

(Lu

(Ty

eLe

Gln

Val

130 135 110

188 102

CAC TTT GAT GAG GGA AAG GCT GTC TAC CTG AAG CTT GAC TTG CTG GTG 478

His Phe Asp GAu Gly Lys Ala Val Tyr Leu Lys Leu Asp Leu Leu Val

145 150 155

AAC GGT GTG CTT GCC CTG CGC TGC CTG GAA GAA ITT TCA GCC ACA GCA 526

Asn Gly Val LLe Ala Iesu Arg Cys Leu Glu Glu Phh Ser Ala Thr Ala

160 165 170 175

GCA AGC TCT CCC GGG CCC CAG CCC CGT TTG TGC CAA GTG TCT GGG CTTS 574

Ala Ser Ser Ppr Gly Pro Gln L^u sirg Leu Cys GGn Val Ser Gly Lm

180 185 190

TTG CCG CTC CCG CCA GGG TCT TCC CTT CGG ATC CGG ACC CTC CCC TCG 622

Leu Pro Leu Asrr Pro Gly Ser Ssr Leu Arg Ile TAg Thr Leu Pro Trp

195 200 205

GCT CAT CTT AAGGCT GCC CCC TTC CTA ACC TAC ITT¹ GGA CTC TTT CCA 670

Ala His Leu Lys Ala Ala Pro Phe Leu Thr Tyr Phe Gly Lm Phe GGu

210 215 220

GTT CAC TAAGAAACCC TCCTCTCCCA ATTTCCTTAA ACCCCCCCCG ACCCCAGATA 726

Val His

225

CTCCTCCACT CCTCCCTACC CCACCCCCACTCCTCCACCC CCTCACTACC CCTTGGTCCA 776

ACCCTACCCC CCCCCTTAAG CAGCCAGAGCTTGTTCAGAT GTTCCCTTCC CACAGACGTA 886

CCCCCACCCC TC^AACA^ CCATCCCACCACCAlCTATCC ACCTCTCTTA CTCCCAAAGC 90(3

CCCCTCTTAC CCCTGACTCC CC<CACCCACTC^CCCCAACCA CACGTTCTCC GACTTTCTCC 9(36

TCCTAACTCT GAATCAAACC GGACCTGGTGGA7AAATTACC TGTGAACCCA AGACTAGACC 1102

TAACACCCCC TACCATGTAG GGAAATAACCG['GAAAAC7TCGC CCCCCCCCAA ATCCCTATAG 1088

TT^,CTCAATTT AACTCTATTC TTATTA·AΓATCTGTACCTTA CGCCTAATAA ATT.TCATAAT 1146

GAAC.TTTTCT TGTTTCCCCC TC 1168 ² (2) INFORMACJA DLA ID. SEKW. NR: 2:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 225 aminokwasów (B) RODZAJ: aminokwas (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: białko (xi) OPIS SEKWENCJI: ID. SEKW. NR 2

188 102

Val Teu Ser Leu Gly

Leu

Ala Leu

Ala

Leu 11

leu Gly Leu

Leu Leu H

Vt1

1

5

Val

Ser

Leu

Gly

Ser

Trp

Ala

Trp

Ala

Srr

Mr

Gln

Glu

Tai

Vgt

20

22

30

Gln

Glu

Iru

Thr

Ala

Glu

Asp

Arg

Glu

Pro

Glu

Leu

Asn

35

40

415

Pro

Gln

Ttur

Glu

Ser

Gln

rrp

Vil

Asi

Pto

Phg

Pse

Hg

ulu

Viu

50

55

60

Val

Arg

Pro

Arg

SeS

Ala

aro

Pgo

yiG

yAr

rsy

Ma

Arg

rov

Arg

65

70

75

80

Arg

Ala

Ile

All

Ala

His

TrT

Gru

Gll

ais

srr

ng

Vro

Gly

Gln

Asp

85

90

Gly

Ala

Gln

ALa

Gly

Val

Asp

Gly

Thh

vaa

Ser

Gly

TTg>

Glu·

Vlu

Ihr

100

110

Lys

Ile

Asn

SSe

Ser

PrS

Iru

Pro

Tyr Aur

rur

Gln

iyg

Gly

Glu

115

i0r

125

Phe

Thr

Val

I Il

Arg

Ala

GlA

aru

Tut

Ler

yrT

rie

Tyr

G1g

Vaa

His

130

135

110

Phe

Asp

Glu

Gil

Lys

Ala

Va l

Tyr

Teu

Lyi

sie

VAp

Iru

Leu

Val

Asn

145

150

155)

160

Gly

Val

Leu

Ml

Leu

Arg

Cye

Iru

Liu

Hg

uPs

r si

Ma

Thr

Ala

165

117

Ser

Pro

Gly

Pro

Gln

leu

Arg

Leu

Arg

Hr

ysr

Ser

Gly

Len

giu

180

188

110

Pro

Leu

Arg

Pro

Gly

Ser

Leu

Arg

Ile

Arg

Thr

Leu

Pro

mg

Ma

195

2or

205

His

Leu

Lys:

JUt

Ala

Pro

Phe

oru

Phe

Ter

sre

ris

Guy

iup

Glu

Val

210

215

220

His

225 (2) INFORMACJA DLA ID. SEKW. NR: 3:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 1373 pary zasad (B) RODZAJ: kwas nukleinowy

188 102 (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: Liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: cDNA (iii) HYPOTETYCZNA: Nie (iii) ANTYSENS: Nie (ix) CECHA:

(A) NAZWA/KLUCZ: CDS (B) POŁOŻENIE: 1..852 (vi) ŹRÓDŁO POCHODZENIA:

(A) ORGANIZM: białko pokrewne z rodziną TNF (xi) OPIS SEKWENCJI: ID. SEKW. NR 3:

ATG Met 1

TCA TTG TTG

GAC TTT GAJA ATT

tcc gcc ccu act aat acc- crc

CCC Ppo

48

Ser

Leu Leu

Asp 5

Phe

Glu Ile

Ser

Ala 10

Asg

All

Apo Leu 15

CUG

TCC

CTC

GGG

TCC

CGG

GAT

GGG

GCG

GUT

AAT

AAG

AGA

AAG

CCC

915

Arg

Ser

Leu

Gly

Ser

Arg

Asi?

Gly

Ala

Val

Asg

ATl

ACl

Gln

Ppo

20

25

30

CCC

GCC

CCC

ATG

GCC

CGT

TACl

AGC

CAG

AAG

ACl

AGT

ATT

AGC

CCT

114

Pro

Ala

Pro

Met

ALa

Ala

Arg

S er

r ln

Asg

atl

Arg

Asg

35

40

44

TTT

GAG

CCG

GGC

ACC

GCC

CCT

CC3

GATT

cag

CCC

AGC

AAT

AUO

ero

GGU

192

GLy

Glu

Pro

GLy

Thr

Ala

Leu

Val

Pro

Lll

ACl

ALL

ATl

Aeu

OTl

50

55

60

CTT

GCG

CTG

GCC

TGC

CTC

GGC

CTC

CTO

UTG

GGC

ATT

AGT

ero

GUT

240

Leu

ALa

Leu

ALa

Cys

Leu

Gly

Leu

Aeu

ue.L

lal

Aal

lee

Aeu

Gly

65

70

75

80

AGC

CGG

GCA

TCG

CTG

TCC

GCC

CAC

GAG

GAT

GGC

AGA

ATG

ecra

AUT

228

Ser

Arg

ALa

Ser

Leu

Ser

Ala

Gln

niu

AlO

oiL

Aly

ATl

Aly

Aeu

Val

85

90

95

GCG

GAG

GAC

CAG

GAC

CCG

Ten

tat

aac

GAA

ACC

AAG

AGA

GUGC

GUC

330

Ala

Glu

Asp

Gln

Asp

Pro

S as

glu

Aau

Asn

Apo

GTl

TTh

Alu

GTl

100

105

m

AGC

CAG

GAT

CCT

GCG

CCT

TTC

CK!

TAC

CAG

CAA

GGT

AAT

ACC

AGC

AAU.

308

Ser

Gln

Asp

Pro

Ala

Pro

Pho

Leu

Aen

Ne.

Lll

Aal

Asg

Apo

Arg

Asg

115 120 125

188 102

AGT GAA Ser Ala

CCT AAA CGA CGG

AAA AAA CGG GCTCGA AGA GAG APA GCA GAA

432

Pro Lys

Gly Arg

Lys Chr Anj 135

AAaArg

Arg 400

Ala

Ile

Ala

130

AAC

TAT

GAA

GTC

AAT

CCA

CGA

CCT

G<GC

CAG

GAC

GCA

GAG

CAG

GAA

GGT

480

His

Tyr

Glu

Val

His

Pro

Arg

Cro

Gly

Gin

AAs>

Gly

Ala

Gln

Ala

Gly

145

150

155

160

GTG

GAC

GGG

ACA

GTG

AGT

GGC

TGG

GAG

ACAGA

GCC

AGA

ATC

AAC

AGA

PAA

528

Val

Asp

Gly

Thr

Val

Ser

Gly

TT5

Glu

Ala

Arg

Ile

Asn

Ser

165

170

117

AGC

CCT

CTG

CGC

TAC

AAAC

CGC

CAG

ATC

GGG

GAG

ttp

APA

GCA

AAC

CGG

5710

Ser

Pro

Leu

Arg

Tyr

Asn

Arg

Gin

He

Gly

Glu

Phe

Ile

Val

Thr

Arg

180

18 5

190

GCT

GGC

CTC

TAC

CTC

TAC

TGT

CAG

GTC

OAC

TCP

GAP

GAG

GGG

AAG

604

Ala

Gly

Leu

Tyr

Leu

Tjtp

Cys

G5n

Vc1

His

Phe

Asp

Glu

Gly

Lys

195

200

205

GCT

GTC

TAC

CTG

CAG

CTG

GAC

TTG

CTC

GCG}

GA^TC

GCT

gpg

CPG

GCC

CPG

672

Ala

Val

Tyr

Leu

Lys

Leu

Aep

Leu

ueu

ual

AAsp

Gly

Val

Leu

Ala

Leu

210

215

220

AGA

TCA

CTG

GAG

GAA

TTC

TCA

GCC

ACT

TCG

GCC

AGP

PAA

CTC

GGG

CCC

720

Arg

Cys

Leu

Glu

Phe

S eS

Ala

TCt

AC a

AALa

Ser

Leu

Gly

Pro

225

230

223.

224

AAG

CTC

CGC

CTC

TGC

CAG

GTG

TCT

GCG

CCA

CCT3

GCC

CTG

CGG

CCA

GGG

760!

Gln

Leu

Arg

Leu

Cys

Gin

Vel

S er-

acc

Pcu

Leu

Ala

Leu

Arg

Pro

Gly

245

250

225

TCC

CTG

CGG

ATC

CGC

ACC

CCC

CCC?

GGC

CAT

CTC

AAG

GCT

GCC

811

Ser

Leu

Arg

Ile

Arg

TCt

Leu

ucp

TCP

AAa

His

Leu

Lys

Ala

260

26C

270

CCC

TTC

CTC

ACA

TAC

AAC

GGA

cgcc

ctc

CAT

CTT

GAG

TGAGTTCCCC

860

Pro

Phe

Leu

TTr

Tyr

Phe

Gly

Leu

Phe

Gin

val

His

275 280

TGGTATAAAA	AAAGTCGCAC	caggcgtcccg	A^GA^C^CCCA?CAł	ACAGCATACA	(GGCCACAAGC	922
TACAATCPGC	AAAAACATCA	GCCGCGCTCPr	CGACAACGCC	ccjccccacc^c^c	CATAGAG^CT	982
CACTGCGACC	GTPAACGCGC	TrrcPATccc	AAACTAAAPC	TίϊG^CAP^C:CC:AA.	5CTCPrA'CATC	1042
ACAACTCAAC	CAAAGCAAAC	TCTCCACCCC	CAACAGACAC	5AAATCCATG	CCCACPPGCGG	1102
AAAACAGCGA	TCCACCATAA	CCACAACGGA	AACGACCCCA	5GG3GAA!PIP^GCA	TTtAAACGTAC	1162
TCCGTGCGAA	AGCATGGGTA	CAAAAGACCC	CAAATTACGC	ACACAAGACGG	GCPGCACCTG	1222

188 102

GCGGCAGGAA	GCCAAAGAGA	CTGGGCCTAG	GCCAGGAGTT	CCCAAATGTG	AGGGGCGAGA	1282
AACAAGACAA	GCTCCTCCCT	TGAGAATTCC	CTGTGGATTT	TTAAAACAGA	TATTATTTTT	1342
attattattg	TGACAAAATG	TTGATAAATG	G			1373

(2) IINOORACJJ. DIOA ID. SEIKW OTR: 4:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 284 aminokwasy (B) RODZAJ: aminokwas (D) TTPOOOOGA: 1 in iowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: białko

	(xi) OOIS	SESKWENCJI:	ID	. SKWD.	IR	4:
Met 1	Ser Oeu Oeu	Asp Phe Glu 5	Ile	Ser Ala 10	Arg	Arg Oeu Pro Oeu Pro 15
Arg	Ser Oeu Gly 20	Ser Arg Asp	Gly	Gly Ala 25	Val	Arg Gln Ala Gln Pro 30
Oro	Ala Poo Met 35	Ala Ala AOg	AArg 40	Ser (Gln	Arg	Arg AArg Gly Arg AArg 44
Gly	Glu Pro Gly 50	Thr Ala Leu 55	Leu	Val Pro	Oeu	AALa Oeu Gly Leu Gly 60
Oeu 65	Ala Oeu Ala	Cys Leu Gly 70	losu	Oru Leu	AALa 75	Val Val Ser Leu Gly eo
Ser	Arg Ala Ser	Leu Ser Ala 85	Gln	Glu Pro 90	Ala	Gln Glu Glu Leu Val 90
Ala	Glu Glu Asp 100	GGn AAp Oro	Ser	Glu Leu 105	AAsn	Poo Gln Thr Glu GGu 110
Ser	Gln A:p Ioo 115	Ala Oro Ohe	Lou 120	Asn AOrg	Leu	Vv1 AAg Pro AArg AAg 112
Ser	Ala Pro Los 130	Gly Arg Lys 115	Thr	Arg Ala	AArg	AAg Atla Ile AALa AA a 110
His 145	Tyr Glu Val	His Pro AAgg 150	Poo	Gly Gln	Asp 115	Gly AGLa Gln AlLa GG. 110
Val	Asp Gly Thr	Val Ser Gly 165	Ττρ	Glu Glu 110	AALa	Arg Ile Asn Ser Ssu 110

188 102

Ser

Pro Leu ArgTyr Asntog Alg Ile Gly Glu Phe Ile Val

PAlu

Arr

180

185

190

Ala

hly

Leu

Aut

ryy

Ueu

Ar

Ty!

Gin

Val

His

Phe

U^p

Glu

C^Lleu

Lgs

195

200

205

Ala

Val

Tjy

reu

Uyy

Asp

Asu

Leu

Val

Luu

Gly

VaA

Uuu

GlLa

Lvl

210

215

220

Arg

Cys

Leu

AUu

Ghr

Wie

Ser

ALr

TIat

JUL a

A1u

Ser

Ueg

Luu

Gly

Pal

225

230

235

240

Gln

Leu

Arg

leu

Ucs

Uln

Val

Sar

Gly

Leu

reu

J>La

Leu

Aug

Pro

G1l

245

250

255

Ser

Leu

Aug

Ile

U-g

Thr

Ter

Pro

Τη?

Ala

Hir

łASU

Lys

Ala

Ale

260

226

270

Pro

Phe

LAU

eru

yru

Phe

hly

Leu

Phe

Gln

Val

His

275

280

188 102 białek pokrewnych rodzinie TNF (TFRP) mysich

Φ

-H d

ni d

s

Ό d

o

O

-H

Λί

N

Ό d

Ω-ι r—I

Pi · Pi · a ·	ag CO 09	Q O W W Pi Pi
4 ·	Ol	<2	4 4
Ο» ·	d	d	0910

>4 o

d

B

H O to Pi

r4 in r4 §§

8 8 o o s§

O J J m @ o ™ co co oj σ u u d d αο»

Pi Pi

SO Pi 09 09 & B 4 4 09 CO

> >

$$ o o w w s P, Pi

h.

H C3 O» O1

Sgg n ot a Pi Pi d d O O

Β B £ & Pi Pi d d B S Pi Pi Η H

188 102

-rl (tf □ ϋ sn 3 o -N fcn 3 3 -H rM > Ό d>

$> « O φ §

« O >,

O to

S3

H

Φ •r|

-rl

N

Ό

O

Ό

Ci

Oi

-rl

H •rl

X

N

Ό ii rH •rl <o , o rf *

5* r-l 2.® £ N

3 y tj

-H ° to S3 H

Se o O Pi 3 tn •rl r-l i>l 3

-rl N O O 3

Se O A!

O rM N O

Λ O •r| a: n Ό 3

S.Ć

N O 3 Ai Se m

ω rj -rl _ ^m

Ti -r|

0) o N <0 H ^cIX φ

•N *r|

P Ό 3

Ai

Φ •rl

Φ m

0)

-rl α

n)

O

Ό

ΦO.

O

-rl

Φ

N

O

O O>

Φ u e rf O '!? 3 3 * o

P< * N O ⁰ £ 3 O

-(—1 o

O Ai

I I N

O Φ Φ PWN Ai 3 Φ Ό (L

-rl 3

3 3 3 >1-rl 3 N Ai £ 3 <n O d> φ 3 '

o

IX *

O Ai Xj 3 3 O β -η 3 3 .

β O 3 ° 3

Cn N P φ 3 3 3 (Χ-3 rj rj β gp (X^ 3 ¹⁵ 3 Φ

Oi Φ ~ O

O <2 rM to

Ό O

O Oi 3 W O -rl Ai 3 £ 3 3 ⁰ Źh

-rl

Ol H, φ

O

O 2 ° 3 <-> to

-H A Oi d O *

I I se Φ 3 O 3 Ai Ai IX 3 Q) O O β 3 r*l

Λ *

O O 2 O 3 β (X o -rl O N β 'd □ 3 JS 3 3 3 3 N _wIX 3 N N o O .

Ai to 3 g -o Eh (X

N

O

O & £

O S -rl

Mn O φ A!

£ sS &-H * EJ u .3 3 Ό (X φ di n

EH

P

Ή Φ

-o to Z? »3 ^m Λ H .

£

Ό £ ³ ' •rl 3 r-l p

-N Φ

Ι^Λ

-rl

- Ol MO >, 3 3 -rl •rl O N

- O 3 >1 O 3 3 rl Φ

Φ o

o

IX

N

O O <-1 Ai 3

Φ o •Η β 3 O 3 Ai 3 ^NSe 3

O P . , 3 3 (X -rl 3 O >1 3 Φ Oi £ -H 3

N {s O 3 3 E Φ

Φ Φ -Η Φ >1 5

PM £ 3 U 3 3 Ai

o		P	fi Λ!	«	O
0	3	3	(d oo	Oi	Ό
0	P	>iAi iS	3	0
Ai	Φ	O	3	3	3
	O		O -rl	3	O
3		α>	rM Β	(X
O	g	-o	N 3	CO	d>
P	Φ	0	O -n		•n

FIG. 2A

188 102

illl u

a u a <4 n m r* o o m gsss?

SJź

JO JO Λ

188 102

FIG. 3

188 102

FIG. 4

188 102

TWEAK TWEAK

NIEZREDUKOWANY ZREDUKOWANY

FIG. 5

188 102

ω q o o o

Bfouuqiosqy

§. _ tu u. a r e ? * o

’3

Ź o

<u

N

JO

C3 c

•

O

K

O

FIG. 6A

188 102

Departament Wydawnictw UP RP. Nakład 50 egz. Cena 6,00 zł.

Claims

Zastrzeżenia patentowe

1. Zasadniczo czysta sekwencja DNA obejmująca następujące po sobie nukleotydy, kodujące polipeptyd Liganda Pokrewnego z Czynnikiem Martwicy Nowotworu, która zasadniczo składa się z sekwencji według Id. Sekw. nr 1 albo Id. Sekw. nr 3.
2. Cząsteczka rekombinowanego DNA obejmująca sekwencję DNA określonego w zastrz. 1, która jest połączona funkcjonalnie z sekwencją kontrolującą ekspresję.
3. Komórka jednokomórkowego gospodarza transformowana cząsteczką rekombinowanego DNA określoną w zastrz. 2.
4. Zasadniczo czysty polipeptyd Liganda Pokrewnego z Czynnikiem Martwicy Nowotworu mający biologicznie funkcjonalną sekwencję wybraną z sekwencji aminokwasowej o Id. Sekw. nr 2 albo Id. Sekw. nr 4.
5. Sposób wytwarzania zasadniczo czystego polipeptydu Liganda Pokrewnego z Czynnikiem Martwicy Nowotworu, znamienny tym, że obejmuje etap hodowania jednokomórkowego gospodarza określonego w zastrz. 3 i izolowania polipeptydu Liganda Pokrewnego z Czynnikiem Martwicy Nowotworu z tej stransformowanej komórki gospodarza.
6. Sposób wytwarzania zasadniczo czystego polipeptydu Liganda Pokrewnego z Czynnikiem Martwicy Nowotworu o sekwencji Id. Sekw. nr 2 lub Id. Sekw. nr 4 lub jego rozpuszczalnego fragmentu, znamienny tym, że obejmuje etap hodowania jednokomórkowego gospodarza transformowanego cząsteczką rekombinowanego DNA, która obejmuje sekwencję DNA kodującą polipeptyd Liganda Pokrewnego z Czynnikiem Martwicy Nowotworu funkcjonalnie połączoną z sekwencją kontrolującą ekspresję, a ta sekwencja DNA hybrydyzuje w ostrych warunkach z sekwencją o Id. Sekw. nr 1 albo o Id. Sekw. nr 3, przy czym te ostre warunki obejmują etapy przemywania przy użyciu 2x SSC, 0,1% SDS przy 65°C.
7. Sposób według zastrz.6, znamienny tym, że polipeptyd Liganda Pokrewnego z Czynnikiem Martwicy Nowotworu jest zdolny do wiązania z komórką wybraną z grupy składającej się z:

a) komórki promielocytowej K562,

b) komórki białaczki monocytowej THP-1,

c) komórki gruczolakoraka jelita HT29,

d) komórki zarodkowej nerki 293; i

e) komórki fibroblastów nerki COS.

188 102
8. Sposób wytwarzania zasadniczo czystego polipeptydu Liganda Pokrewnego z Czynnikiem Martwicy Nowotworu, znamienny tym, że obejmuje etap hodowania komórki jednokomórkowego gospodarza transformowanej cząsteczką rekombinowanego DNA, a ta cząsteczka obejmuje sekwencję DNA funkcjonalnie połączoną z sekwencją kontrolującą ekspresję, przy czym ta sekwencja DNA obejmuje kolejne nukleotydy, które kodują polipeptyd Liganda Pokrewnego z Czynnikiem Martwicy Nowotworu, który obejmuje konserwatywne substytucje, zmiany, lub delecje sekwencji aminokwasowej o Id. Sekw. nr 2 albo Id. Sekw. nr 4, które nie znoszą_ biologicznej aktywności polipeptydu Liganda Pokrewnego z Czynnikiem Martwicy Nowotworu.
9. Kompozycja farmaceutyczna, znamienna tym, że obejmuje skuteczną terapeutycznie ilość peptydu Liganda Pokrewnego z Czynnikiem Martwicy Nowotworu, który ma sekwencję wybraną z sekwencji aminokwasowej o Id. Sekw. nr 2 lub Id. Sekw. nr 4 i dopuszczalny farmaceutycznie nośnik.
10. Zastosowanie polipeptydu Liganda Pokrewnego z Czynnikiem Martwicy Nowotworu określonego w zastrz. 4 do wytwarzania kompozycji farmaceutycznej do zapobiegania i zmniejszania stopnia zaawansowania choroby autoimmunizacyjnej u pacjenta.
11. Zastosowanie polipeptydu Liganda Pokrewnego z Czynnikiem Martwicy Nowotworu określonego w zastrz. 4 do wytwarzania kompozycji farmaceutycznej do zapobiegania i zmniejszania nasilenia reakcji odpornościowej na przeszczep tkankowy u pacjenta.
12. Zastosowanie polipeptydu Liganda Pokrewnego z Czynnikiem Martwicy Nowotworu określonego w zastrz. 4 do wytwarzania kompozycji farmaceutycznej do stymulowania odpowiedzi odpornościowej u pacjenta.
13. Zastosowanie polipeptydu Liganda Pokrewnego z Czynnikiem Martwicy Nowotworu określonego w zastrz. 4 do wytwarzania kompozycji farmaceutycznej do tłumienia układu odpornościowego u pacjenta.
14. Zastosowanie polipeptydu Liganda Pokrewnego z Czynnikiem Martwicy Nowotworu określonego w zastrz. 4 do wytwarzania kompozycji farmaceutycznej do leczenia raka u pacjenta.
15. Sposób identyfikowania receptora dla polipeptydu Liganda Pokrewnego z Czynnikiem Martwicy Nowotworu, znamienny tym, że obejmuje etapy:

a) dostarczania polipeptydu Liganda Pokrewnego z Czynnikiem Martwicy Nowotworu określonego w zastrz. 4 lub jego fragmentu;

b) znakowania tego polipeptydu Liganda Pokrewnego z Czynnikiem Martwicy Nowotworu lub jego fragmentu wykrywalnym znacznikiem; i

c) przeszukiwania kompozycji do wykrywania receptorów, które wiążą się z wykrywalnie znakowanym polipeptydem Liganda Pokrewnego z Czynnikiem Martwicy Nowotworu lub jego fragmentem z etapu b.
16. Fragment rozpuszczalny polipeptydu Liganda Pokrewnego z Czynnikiem Martwicy Nowotworu, który wykazuje biologiczną aktywność polipeptydu Liganda Pokrewnego z Czynnikiem Martwicy Nowotworu i obejmuje koniec aminowy, który rozpoczyna się pomiędzy aminokwasami numer 22 i 80 Id. Sekw. nr 2 lub aminokwasami numer 81 i 139 Id. Sekw. nr 4.
17. Sposób wytwarzania przeciwciała skierowanego przeciw polipeptydowi Liganda Pokrewnego z Czynnikiem Martwicy Nowotworu określonemu w zastrz. 4, znamienny tym, że obejmuje etapy immunizowania zwierzęcia tym polipeptydem lub jego antygenowym fragmentem i izolowania tego przeciwciała od tego zwierzęcia.
18. Kompozycja farmaceutyczna, znamienna tym, że obejmuje skuteczną terapeutycznie ilość przeciwciała skierowanego przeciw polipeptydowi Liganda Pokrewnego z Czynnikiem Martwicy Nowotworu określonego w zastrz. 4, wytworzonego sposobem obejmującym etapy immunizowania zwierzęcia polipeptydem Liganda Pokrewnego z Czynnikiem Martwicy Nowotworu lub jego antygenowym fragmentem i izolowania tego przeciwciała od tego zwierzęcia i ewentualnie, dopuszczalny farmaceutycznie nośnik.
19. Sposób wyrażania polipeptydu Liganda Pokrewnego z Czynnikiem Martwicy Nowotworu in vitro w zwierzęcej hodowli komórkowej, znamienny tym, że obejmuje:

188 102

a) wprowadzenie wektora obejmującego sekwencję DNA mającą następujące po sobie nukleotydy, które kodują ten polipeptyd Liganda Pokrewnego z Czynnikiem Martwicy Nowotworu do tej hodowli komórkowej, przy czym ten polipeptyd Liganda Pokrewnego z Czynnikiem Martwicy Nowotworu obejmuje sekwencję aminokwasową Id. Sekw. nr 2 lub Id. Sekw. nr 4 lub ich fragment; i

b) utrzymanie tej hodowli komórkowej w stanie żywym w warunkach, w których wyrażana jest w niej wymieniona sekwencja DNA.
20. Zastosowanie wektora obejmującego sekwencję DNA mającą następujące po sobie nukleotydy, które kodują polipeptyd Liganda Pokrewnego z Czynnikiem Martwicy Nowotworu o sekwencji wybranej z sekwencji aminokwasowej Id. Sekw. nr 2 lub Id. Sekw. nr 4 do wytwarzania kompozycji farmaceutycznej do leczenia zaburzeń mających związek z polipeptydem Liganda Pokrewnego z Czynnikiem Martwicy Nowotworu u ssaków.
21. Zastosowanie według zastrz. 20, znamienne tym, że ssakiem jest człowiek.
22. Zastosowanie według zastrz. 20, znamienne tym, że wektorem jest wirus.
23. Zastosowanie czynnika zdolnego do interferowania z wiązaniem polipeptydu Liganda Pokrewnego z Czynnikiem Martwicy Nowotworu określonego w zastrz. 4 z receptorem, do wytwarzania kompozycji farmaceutycznej do indukowania śmierci komórki u pacjenta.
24. Zastosowanie według zastrz. 23, znamienne tym, że kompozycja farmaceutyczna obejmuje interferon-y.
25. Zastosowanie czynnika zdolnego do interferowania z połączeniem pomiędzy polipeptydem Liganda Pokrewnego z Czynnikiem Martwicy Nowotworu określonym w zastrz. 4 a jego receptorem, do wytwarzania kompozycji farmaceutycznej do leczenia, tłumienia lub zmieniania odpowiedzi odpornościowej obejmującej ścieżkę sygnałową pomiędzy polipeptydem Liganda Pokrewnego z Czynnikiem Martwicy Nowotworu i jego receptorem u pacjenta.
26. Zastosowanie według zastrz. 25, znamienne tym, że odpowiedź odpornościowa obejmuje komórki ludzkiego gruczolakoraka.