EA009956B1 - Внутриклеточный полипептид (cari) и способы его применения - Google Patents

Abstract

Изобретение относится к взаимодействующему с каспазой-8 полипептиду (Cari), способам его получения и его применению.

Description

Фактор некроза опухолей (ΤΝΡ-альфа) и лимфотоксин (ΤΝΡ-бета) являются полифункциональными провоспалительными цитокинами, образуемыми, в основном, мононуклеарными лейкоцитами, которые оказывают многочисленные действия на клетки (№а11ас11. Ό. (1986) Ιη: 1п!етГетоп 7 (Ιοη Сгеккег, еб.), рр. 83-122, Асабетю Ргекк, Ьопбоп; и Веи!1ег апб Сегат1 (1987)). Как ΤΝΡ-альфа, так и ΤΝΡ-бета начинают действовать в результате связывания со специфическими рецепторами клеточной поверхности. Некоторые из этих действий, по-видимому, являются благоприятными для организма; они могут, например, разрушать опухолевые клетки или инфицированные вирусом клетки и усиливать антибактериальные активности гранулоцитов. Таким образом ΤΝΡ способствует защите организма против опухолей и инфекционных агентов и способствует восстановлению после повреждения. Таким образом, ΤΝΡ может быть использован в качестве противоопухолевого агента, при применении которого он связывается со своими рецепторами на поверхности опухолевых клеток и посредством этого инициирует события, приводящие к гибели опухолевых клеток. ΤΝΡ может быть также использован в качестве противоинфекционного агента.

Однако ΤΝΡ-альфа оказывает вредное действие. Имеется доказательство, что сверхпродуцирование ΤΝΡ-альфа может играть главную патогенную роль в нескольких заболеваниях. Например, известно, что действие ΤΝΡ-альфа, прежде всего на сосудистую систему, является главной причиной симптомов септического шока ^тасеу е! а1., 1994). При некоторых заболеваниях ΤΝΡ может вызывать избыточную потерю веса (кахексию), подавляя активности адипоцитов и вызывая анорексию, и поэтому ΤΝΡ-альфа назвали кахектином. Он был описан также как медиатор повреждения тканей при ревматических заболеваниях (Веибет апб Сегат1, 1987) и как главный медиатор повреждения, наблюдаемого в реакциях трансплантат против хозяина (Стаи О.Е. е! а1., 1989). Кроме того, известно, что ΤΝΡ участвует в процессе воспаления и во многих других заболеваниях.

Два различных, независимо зкспрессируемых рецептора, ΤΝΡ-рецепторы р55 (СО 120а) и р75 (СО120Ь), которые специфически связывают как ΤΝΡ-альфа, так и ΤΝΡ-бета, инициируют и/или опосредуют отмеченные выше биологические эффекты ΤΝΡ. Эти два рецептора имеют структурно непохожие внутриклеточные домены, что предполагает, что они различным образом передают сигнал (см. Нойгаапп е! а1., 1989; Епде1тапп е! а1., 1990; Вгоскйаик е! а1., 1990; Ьое!ксйет е! а1., 1990; 8сйа11 е! а1., 1990; №рйаг е! а1., 1990; 8тйй е! а1., 1990). Однако клеточные механизмы, например различные белки и, возможно, другие факторы, которые участвуют во внутриклеточной передаче сигнала СО120а и СО120Ь, пока еще не выяснены. Речь идет о внутриклеточной передаче сигнала, которая происходит обычно после связывания лиганда, т.е. ΤΝΡ (альфа или бета), с рецептором, который является ответственным за начало каскада реакций, приводящих в конце концов к наблюдаемой реакции клетки на ΤΝΡ.

Что касается вышеупомянутого разрушающего (цитоцидного) действия на клетки ΤΝΡ, в большинстве клеток, исследованных до настоящего времени, это действие запускается, в основном, СО120а. Антитела против внеклеточного домена (лигандсвязывающего домена) СО120а могут сами запускать цитоцидное действие (см. ЕР 412486), которое коррелирует с эффективностью перекрестного связывания рецептора антителами, которое, как считают, является первой стадией в генерировании внутриклеточного процесса передачи сигнала. Кроме того, мутационные исследования (ВгакеЬикй е! а1., 1992; Τа^ιад1^а е! а1., 1993) показали, что биологическая функция СО120а зависит от целостности его внутриклеточного домена, и, следовательно, было сделано предположение, что инициация внутриклеточной передачи сигнала, приводящая к цитоцидному действию ΤΝΡ, происходит как следствие ассоциации двух или более внутриклеточных доменов СО 120а. Кроме того, ΤΝΡ (альфа и бета) встречается в виде гомотримера, и предположили, что в таком виде он индуцирует внутриклеточную передачу сигнала через СО 120а посредством его способности связываться с рецепторными молекулами и сшивать их, т.е. вызывать агрегацию рецептора (Епде1тап Н. е! а1., 1990).

Другой член суперсемейства рецепторов ΤΝΡ/ΝΟΡ представляет собой рецептор ЕА8/АРО1 (СЭ95). СО95 опосредует гибель клеток в форме апоптоза (1!ой е! а1., 1991) и, по-видимому, служит в качестве агента негативной селекции аутореактивных Т-клеток, т.е. во время созревания Т-клеток СО95 опосредует апоптозную гибель Т-клеток, распознающих аутоантигены. Было также обнаружено, что мутации в гене СО95 (1рг) вызывают нарушение лимфопролиферации у мышей, которое является похожим на аутоиммунное заболевание системную красную волчанку (8ЬЕ) человека (^а^а^-Еикипада е! а1., 1992). Лиганд для СО95 является связанной с клеточной поверхностью молекулой, переносимой, среди прочего, Т-клетками-киллерами (или цитотоксическими Т-лимфоцитами - СТЬ), и, следовательно, когда такие СТЬ контактируют с клетками, несущими СО95, они способны индуцировать апоптотическую клеточную гибель несущих СО95 клеток. Далее, были получены моноклональные антитела, которые являются специфическими в отношении СО95, причем эти моноклональные антитела способны индуцировать апоптотическую клеточную гибель в клетках, несущих СО95, в том числе мышиных клетках, трансформированных кДНК, кодирующей СЭ95 человека (например, 1!ой е! а1., 1991).

- 1 009956

Механизмы передачи сигнала ΤΝΡ-рецептора и Рак, содержащие различные рецепторы, их регуляция и идентифицированные молекулы передачи сигнала далее по ходу процесса рассматриваются подробно в обзоре \Уа11асй с1 а1. (1999).

Было обнаружено, что определенные злокачественные клетки и ВИЧ-инфицированные клетки несут СЭ95 на своей поверхности и антитела против СИ95 или лиганд СИ95 могут быть использованы для запуска опосредованных СИ95 цитотоксических эффектов в этих клетках и, следовательно, обеспечивают средство для борьбы с такими злокачественными клетками или ВИЧ-инфицированными клетками (см. Ной е! а1., 1991). Таким образом, нахождение еще и других путей для усиления цитотоксической активности СИ95 может также иметь терапевтическое значение.

В течение длительного времени ощущалась потребность в обеспечении способа модуляции клеточной реакции на ΤΝΡ (альфа или бета) и СИ95-лиганд. Например, в упомянутых выше патологических ситуациях, где сверхэкспрессируется ΤΝΡ или ί.Ό95-лиганд, желательно ингибировать индуцируемые ΤΝΡ или СП95-лигандом цитоцидные эффекты, тогда как в других ситуациях, например при применениях в заживлении ран, желательно усилить действие ΤΝΡ или, в случае СИ95, в опухолевых клетках или ВИЧ-инфицированных клетках, желательно усилить опосредованное СИ95 действие.

Авторами данного изобретения был предпринят ряд подходов (см., например, описания европейских патентов с номерами ЕР 186833, ЕР 308378, ЕР 398327 и ЕР 412486) для регуляции вредных действий ΤΝΡ ингибированием связывания ΤΝΡ с его рецепторами с использованием анти-Е^-антител или с использованием растворимых рецепторов ΤΝΡ (являющихся, по существу, растворимыми внеклеточными доменами этих рецепторов) для конкуренции за связывание ΤΝΡ со связанными с клеточной поверхностью ΤΝΡ-рецепторами (ΤΝΡ-К). Далее, на основе того, что связывание ΤΝΡ с его рецепторами является необходимым для ΤΝΡ-индуцируемых клеточных эффектов, авторами данного изобретения были разработаны подходы (см., например, ЕР 568925) для модуляции действия ΤΝΡ посредством модулирования активности ΤΝΡ-К.

ЕР 568925 относится к способу модулирования трансдукции сигнала и/или расщепления в ΤΝΡ-К, посредством которого пептиды или другие молекулы могут взаимодействовать либо с самим рецептором, либо с эффекторными белками, взаимодействующими с этим рецептором, модулируя таким образом нормальную функцию ΤΝΡ-К. В ЕР 568925 описано конструирование и характеристика различных мутантных форм СИ 120а, имеющих мутации в его внеклеточном, трансмембранном и внутриклеточном доменах. Таким образом, области в вышеупомянутых доменах СИ120а были идентифицированы как существенные для функционирования этого рецептора, т.е. связывания лиганда (ΤΝΡ) и последующей передачи трансдукции сигнала и внутриклеточной передачи сигнала, которая в конечном счете приводит к наблюдаемому действию ΤΝΡ на клетки. Кроме того, также описан ряд способов выделения и идентификации белков, пептидов или других факторов, которые способны связываться с различными областями в вышеупомянутых доменах СИ120а, причем указанные белки, пептиды и другие факторы могут участвовать в регуляции или модуляции активности ΤΝΡ-К. Ряд способов выделения и клонирования ДНК-последовательностей, кодирующих такие белки и пептиды, для конструирования экспрессирующих векторов для получения указанных белков и пептидов и получения антител или их фрагментов, которые взаимодействуют с СИ 120а или с вышеупомянутыми белками и пептидами, которые связывают различные области СИ120а, также описаны в ЕРО 368925. Однако в ЕР 568925 не указаны фактические белки и пептиды, которые связываются с внутриклеточными доменами ΤΝΡ-К. Также в ЕР 568925 нет описания специфических белков или пептидов, способных связывать внутриклеточный домен СИ95.

Таким образом, когда желательно ингибировать действие ΤΝΡ или СО95-лиганда требуется уменьшение количества или активности ΤΝΡ-К или СИ95 на клеточной поверхности, тогда как увеличение количества или активности ΤΝΡ-К или СИ95 может быть желательным, когда требуется усиленное действие ΤΝΡ или СИ95-лиганда. Для этой цели промоторы как СИ120а, так и СЭ120Ь были секвенированы, анализированы, и был обнаружен ряд ключевых мотивов последовательности, которые являются специфическими для различных регулирующих транскрипцию факторов, и экспрессия указанных ΤΝΡ-К, как таковая, может регулироваться на уровне их промоторов, т. е. возможно ингибирование транскрипции на промоторах для уменьшения количества рецепторов и усиление транскрипции на промоторах для увеличения количества рецепторов (ЕР 606869 и \УО 9531206).

Хотя известно, что рецепторы фактора некроза опухолей (ΤΝΡ) и структурно родственный рецептор СИ95 запускают в клетках после стимуляции продуцируемыми лейкоцитами лигандами деструктивные активности, которые приводят к их собственной гибели, механизмы этого запуска являются все еще малопонятными. Мутационные исследования показывают, что в передаче сигнала в отношении цитотоксичности СИ95 и СИ120а участвуют различные области в их внутриклеточных доменах (ВгакеЬикй е! а1., 1992; Τа^ιад1^а е! а1., 1993; Кой аиб Хада1а, 1993). Указанные области (домены гибели) имеют сходство последовательности. Домены гибели как ί.Ό95, так и СО 120а склонны к самоассоциации. Их самоассоциация, по-видимому, способствует агрегации рецептора, которая необходима для инициации передачи сигнала (см. В1дба е! а1., 1994; Во1бш е! а1., 1995), и при высоких уровнях экспрессии рецептора может приводить к запуску лиганднезависимой передачи сигнала (Во1бш е! а1., 1995).

Некоторые из цитотоксических действий лимфоцитов опосредованы взаимодействием продуци- 2 009956 руемого лимфоцитами лиганда с СИ95 в клетках-мишенях (см. также №1§а1а аиб Со1б51е1п. 1995). В уничтожении клеток мононуклеарными фагоцитами участвует ΤΝΡ и его рецептор СИ120а (см. также УапбепаЬее1е е! а1.. 1995). Подобно другим индуцируемым рецепторами эффектам. индукция гибели клеток ΤΝΡ-рецепторами и СИ95 происходит через серию межбелковых взаимодействий. ведущих от связывания лиганд-рецептор к конечной активации ферментативных эффекторных функций. которые. как было показано. включают неферментативные межбелковые взаимодействия. инициирующие передачу сигнала гибели клеток: связывание молекул тримерного ΤΝΡ или СИ95-лиганда с рецепторами и в результате того взаимодействие их внутриклеточных доменов (ВтакеЬикй е! а1.. 1992; ТайадНа е! а1.. 1993; Ной апб №1§а1а. 1993). усиливаемое склонностью мотивов доменов гибели к самоассоциации (Во1бш е! а1.. 1995а). и индуцированное связывание двух цитоплазматических белков (которые могут также связываться друг с другом) с внутриклеточными доменами рецепторов - ΜΟΚΤ-1 (или ΡΆΌΌ) с СИ95 (Во1бт е! а1.. 1995Ь; СЫппшуап е! а1.. 1995; К18ейке1 е! а1.. 1995) и ΤΚΑΌΌ с СИ120а (Нки е! а1.. 1996). Кроме их связывания с СИ95 и СИ 120а ΜΟΚΤ-1 и ΤΚΑΌΌ способны также связываться друг с другом. а также с другими содержащими домен гибели белками. такими как КРР (8!апдег е! а1.. 1995). что обеспечивает функциональное перекрестное общение между СИ95 и СИ120а. Указанные связывания происходят через консервативный мотив последовательности. модуль домена гибели. общий для рецепторов и их ассоциированных белков. Кроме того. хотя в дрожжевом двухгибридном тесте было показано. что ΜΟΚΤ-1 связывается спонтанно с СИ95 в клетках млекопитающих. указанное связывание имеет место только после стимуляции рецептора. что предполагает. что ΜΟΚΤ-1 участвует в инициации событий передачи сигнала СИ95. ΜΟΚΤ-1 не содержит никакого мотива последовательности. характерного для ферментативной активности. и. следовательно. в его способность запускать гибель клеток. по-видимому. не вовлечена активность. свойственная самому ΜΟΚΤ-1. а. скорее. активация некоторого другого белка (белков). который связывает ΜΟΚΤ-1 и действует далее по ходу процесса в каскаде передачи сигнала. Было показано. что клеточная экспрессия мутантов ΜΟΚΤ-1 без Ν-концевой части молекулы блокирует индукцию цитотоксичности посредством СИ95 или СИ120а (Нки е! а1.. 1996; СЫппа1уап е! а1.. 1996). указывая на то. что Ν-концевая область передает сигнал цитоцидного действия обоих рецепторов через межбелковые взаимодействия.

Недавние исследования предполагают участие группы цитоплазматических тиоловых протеаз. которые являются структурно родственными протеазе СЕ ИЗ СаепотйаЬбйщ е1едап§ и превращающему интерлейкин-1 бета ферменту (1СЕ). в возникновении различных физиологических процессов гибели клеток (обзор в Кишат. 1995 и Непкаг!. 1996). Имеется также доказательство того. что протеаза (протеазы) данного семейства участвует в клеточной цитотоксичности. индуцируемой СИ95 и ΤΝΡ-К. Было обнаружено. что специфические пептидные ингибиторы этих протеаз и два кодируемых вирусами белка. которые блокируют их функцию. белок сгтА вируса коровьей оспы и белок р35 бакуловируса. обеспечивают защиту клеток против указанной клеточной цитотоксичности (Епап е! а1.. 1995; Το^τί е! а1.. 1995; Хие е! а1.. 1995; Ве1б1ег е! а1.. 1995). Быстрое расщепление некоторых специфичных клеточных белков. по-видимому. опосредованное протеазой (протеазами) семейства СЕИ3/1СЕ (каспазами). может быть продемонстрировано в клетках вскоре после стимуляции СИ95 или ΤΝΡ-К.

Одна такая протеаза и ее различные изоформы (в том числе ингибиторные). известная как МАСН (в настоящее время каспаза-8). которая является ΜΟΚΤ-1-связывающим белком. была выделена. клонирована. охарактеризована. и были также описаны ее возможные применения. как подробно изложено и включено в данное описание в качестве ссылки в полном объеме. в находящейся в совместной собственности заявке РСТ/И896/10521 и в публикации авторов данного изобретения (Во1бт е! а1.. 1996). Другая такая протеаза и ее различные изоформы (в том числе ингибиторные). названная УсН4 (также называемая каспазой-10). была также выделена и охарактеризована авторами данного изобретения (неопубликованные данные) и другими (Иегг1апбе8-А1петг1 е! а1.. 1996; 8пшуа8и1а е! а1.. 1996). Каспаза-10 является также ΜΟΚΤ-1-связывающим белком. Таким образом. подробности. касающиеся всех аспектов. признаков. характеристик и применений каспазы-10. описаны в приведенных выше публикациях. все из которых включены в данное описание в виде ссылки в полном объеме.

Следует отметить. что каспазы. каспаза-8 и каспаза-10. которые имеют одинаковые продомены (см. Во1бш е! а1.. 1996; [Ии/ю е! а1.. 1996; Ρе^ηаηбе8-А1ηетπ е! а1.. 1996; Ушсеп! апб Όίχί!. 1997). взаимодействуют через их продомены с ΜΟΚΤ-1. причем указанное взаимодействие происходит через эффекторный домен гибели. ИЕИ. присутствующий в Ν-концевой части ΜΟΚΤ-1. и присутствуют в двух копиях в каспазе-8 и каспазе-10 (см. Во1бш е! а1.. 1995Ь; СЫпп1уап е! а1.. 1995).

Каспазы (цистеин-аспартат-специфические протеиназы) являются растущим семейством цистеиновых протеаз. которые имеют несколько общих признаков. Было обнаружено. что большинство каспаз участвуют в инициации и осуществлении запрограммированной гибели клеток. или апоптозе. тогда как оказалось. что другие участвуют в продуцировании провоспалительных цитокинов (Мсйокоп ЭЛУ. е! а1.. 1997; 8а1уе§еп С.8. е! а1.. 1997; Сойеп Ο.Μ. 1997). Они синтезируются в виде каталитически почти неактивных предшественников и обычно активируются расщеплением после специфических внутренних остатков аспартата. присутствующих в междоменных линкерах. Сайты расщепления каспаз определяются тетрапептидными последовательностями (Х-Х-Х-И). и расщепление всегда происходит ниже аспарагино

- 3 009956 вой кислоты. В результате определенные зрелые активные каспазы могут процессировать и активировать сами себя, а также другие неактивные предшественники (Регпапбе8-Л1иетп Т. е! а1., 1996; 8пшуа8и1а 8.М. с1 а1., 1996).

Активация процесса запрограммированной гибели клеток обычно является специфической и включает в себя последовательный процессинг находящихся далее по ходу процесса каспаз, называемых каспазами-палачами, находящимися выше по ходу процесса каспазами, называемыми каспазами-инициаторами. Функциональные характеристики этих двух классов каспаз отражены также в их структуре. Действительно, каспазы-инициаторы содержат более длинные области продоменов в сравнении с каспазами-палачами (8а1уекеп С.8. е! а1., 1997, Сойеи С.М. 1997). Длинный продомен позволяет инициаторным или апикальным каспазам активироваться запуском рецепторов гибели семейства ΤΝΡ-рецепторов. При индуцированной лигандом тримеризации рецепторов гибели каспазы-инициаторы рекрутируются через их длинный Ν-концевой продомен для взаимодействия со специфическими адапторными молекулами с образованием индуцирующего гибель комплекса передачи сигнала (Сойеп С.М. 1997, К18сйке1 Р.С. е! а1., 1995). Например, каспаза-8/МАСН и, возможно, каспаза-10, которая содержит два ΌΕΌ, рекрутируются в рецепторный комплекс адапторными молекулами ΕΑΌΌ/ΜΘΚΤ-1, тогда как каспаза-2, предположительно, рекрутируется ΕΚΑΌΌ/ΚΑΙΌΌ и ΡΙΡ Щада!а 8. е! а1., 1997, МасЕат1аие М. е! а1., 1997, Айтаб М. е! а1., 1997, Эиап Н. е! а1., 1997). Считается, что вследствие трехмерной природы активированного рецепторого комплекса по меньшей мере 2 молекулы каспазы подходят близко друг к другу, что приводит к их активации посредством аутокаталитического процессинга (Уапд е! а1., 1998; Михю е! а1., 1998).

Каспазы синтезируются в виде проферментов, состоящих из трех основных субъединиц, Ν-концевого продомена и двух субъединиц, которые иногда разделены линкерным пептидом. Две субъединицы названы длинной или субъединицей 1 (8ий-1), содержащей основную часть активного ферментативного сайта, и короткой или субъединицей 2 (8ий-2). Для полной активации фермента он процессируется с образованием продомена и двух субдоменов. Две субъединицы образуют гетеродимер. На основе выведенной трехмерной структуры каспазы-3 оказалось, что С-конец длинного домена, а также Ν-конец короткого субдомена должны быть освобождены и С-конец короткой субъединицы должен быть приведен в тесную близость с Ν-концом длинной субъединицы, чтобы получить правильно свернутый и активный фермент (Ко!опба е! а1., 1996, Мйб е! а1., 1997, 8пшуа5и1а е! а1., 1998).

Хотя пути, приводящие к апоптозу или некрозу, всегда считались совершенно различными, недавние открытия позволили предположить, что каспазы, которые представляют собой основные медиаторы апоптоза, могут также участвовать в некрозе как положительным, так и отрицательным образом. Действительно, было показано, что сверхэкспрессия ингибитора каспаз СгтА в клетках Ь929 увеличивает в 1000 раз чувствительность этих клеток к некротической активности ΤΝΕ (Уегсаттеп е! а1., 1998), что указывает на ингибиторную роль каспаз в отношении ΤΝΕ-индуцированной некротической активности. Кроме того, недавно было высказано предположение, что ΤΝΕΚ.1- и Рак-ассоциированные домены гибели, которые играют решающую роль в индукции апоптоза указанными лигандами (обзор в ^а11асй е! а1., 1999), играют важную роль в индукции некроза (Воопе е! а1., 2000). Интересно, что было показано, что индуцированный Рак-Ь некроз печени блокируется ингибиторами каспаз (Кипкбе е! а1., 1997).

Поскольку опосредованный каспазами протеолиз является решающим и центральным элементом апоптозного процесса (Мсйокоп, Ό.ν. апб ТйотпЬепу, Ν.Α. (1997), УШа е! а1., (1997) и 8а1уе8еп. С.8., апб Όίχί!, У.М. (1997)), идентификация важных расположенных далее по ходу процесса молекулярных мишеней указанных протеаз является неизбежной для понимания трансдукции сигнала апоптоза. Было показано, что различные структурные и сигнальные белки расщепляются каспазами во время апоптотической гибели (№сйо1коп, Ό.ν. апб ТйотпЬепу, Ν.Α. (1997), У111а, Р. е! а1. (1997)), в том числе 1САЭ, ингибитор активируемой каспазой ДНКазы, которая является важной для деградации межнуклеосомной ДНК, но не для осуществления апоптоза (Епап, М. е! а1., (1998) и 8акай1га е! а1. (1998)). Предполагается, что гельсолин, регуляторный белок актина, который модулирует превращение гель-золь цитоплазматического актина (Уш, Н.Ь. апб 8!о8ке1, Т.Р. (1979)), участвует в апоптозе на основе (ί) его расщепления во время апоптоза ш у(уо (Ко!йако!а, 8. е! а1. 1997)), (ίί) предупреждения апоптоза его сверхэкспрессией (Ой!ки, М. е! а1. (1997)) и (ίίί) индукции апоптоза одним из расщепленных продуктов (Ко!йако!а, 8. е! а1. (1997)). Гельсолин имеет Са+2-активируемые множественные активности, разделяет филаменты актина и кэпирует быстро растущие концы филаментов, а также служит затравкой при полимеризации актина (Уш, Н.Ь. апб 8!о8ке1, Т.Р. (1980), Киг!й, М., апб Вгуап, 1. (1984), 1аптеу, Ρ.Α., апб 8!о8ке1, Т.Р. (1987)).

В заявке ν0 0039160 описаны взаимодействующие с каспазой-8 белки, способные взаимодействовать с 8иЬ-1 и/или 8иЬ-2 каспазы-8. Взаимодействующие с каспазой белки были обнаружены двухгибридным скринингом с использованием одноцепочечной конструкции каспазы-8.

В заявке ν09839582 (1асоЬк е! а1.) описаны нуклеотидная и предсказанная аминокислотная последовательность секретируемого или мембранного белка ΌΕ518_3, выделенного из библиотеки кДНК головного мозга взрослого человека. Белок был идентифицирован с использованием способов, которые являются селективными для кДНК, кодирующих секретируемые белки (И8 5536637), и был также идентифицирован в качестве секретируемого или трансмембранного белка на основе компьютерного анализа

- 4 009956 аминокислотной последовательности кодируемого белка. Белок согласно данному изобретению отличается от ΌΕ5182_3 по его местоположению (внутриклеточный, а не мембранный/секретируемый) и по его аминокислотной последовательности (имеет одну неконсервативную замену аминокислоты в остатке 230 Е вместо С). В заявке \¥0 многочисленные неродственные активности, которые не подтверждаются никакими данными, приписываются ΌΕ518_3.

Сущность изобретения

Данное изобретение относится к внутриклеточному полипептиду (Сап), способному взаимодействовать с прокаспазой или ее мутеином или фрагментом, причем полипептид содержит аминокислотную последовательность 8ЕЦ ГО N0: 3 или ее изоформу, мутеин, за исключением ΌΕ5182_3, аллельный вариант, фрагмент, слитый белок или производное. В одном варианте полипептид согласно изобретению является расщепляемым ίη νίΐτο и ίη νίνο каспазами, предпочтительно каспазой-8.

Кроме того, в данном изобретении предлагается мутеин полипептида Сап, имеющий доминантнонегативное действие на активность эндогенного полипептида Сап, и мутеины, способные ингибировать или увеличивать цитотоксическое действие каспазы, более предпочтительно каспазы-8.

В одном варианте данного изобретения предлагается нерасщепляемый мутантный полипептид Сап (Сап Ό600Ε), в котором аминокислотный остаток, в котором находится остаток Ό600 в полипептиде Сап, заменен остатком глутаминовой кислоты. Этот полипептид способен увеличивать цитотоксическое действие каспазы-8. В другом варианте данного изобретения предлагается пептиды, производные Сап, ответственные за связывание каспазы-8, такие как пептиды, содержащие аминокислотные последовательности, показанные в 8ЕЦ ГО N0: 4 и 8ЕЦ ГО N0: 5.

Кроме того, данное изобретение относится к ДНК-последовательности, кодирующей полипептид Сап или его изоформу, аллельный вариант, фрагмент, мутеин (например, Сап Ό600Ε), слитый белок или производное, к ДНК-последовательности, способной гибридизоваться в условиях умеренной жесткости, с ДНК-последовательностью, кодирующей полипептид Сап или его изоформу, аллельный вариант, фрагмент, мутеин, слитый белок или производное, или с ДНК-последовательностью, соответствующей 8ЕО ГО N0: 2.

Более конкретно данное изобретение относится к ДНК-последовательности, кодирующей полипептид 8ЕЦ ГО N0: 3. Данное изобретение также относится к ДНК нерасщепляемого мутанта Сап (например, Сап Э600Е) и ДНК, кодирующей пептиды (например, 8ЕЦ ГО N0: 4, 8ЕЦ ГО N0: 5). Кроме того, данное изобретение также относится к рибозиму и антисмысловому олигонуклеотиду, содержащему по меньшей мере 9 нуклеотидов, соответствующему вышеупомянутой ДНК-последовательности, предпочтительно антисмысловому олигонуклеотиду 8ЕЦ ГО N0: 6 и 8ЕЦ ГО N0: 7.

В данном изобретении также предлагаются векторы, содержащие ДНК-последовательность, кодирующую полипептид Сап или его изоформу, аллельный вариант, фрагмент, мутеин, слитый белок или производное, и способы получения полипептида Сап или его изоформы, аллельного варианта, фрагмента, мутеина, слитого белка или производного, введением указанного вектора в прокариотические или эукариотические клетки-хозяева, предпочтительно в клетку млекопитающего, насекомого или дрожжей и более предпочтительно в клетки, выбранные из НеЬа, 293 Т НЕК и СН0, и выращиванием клеток, и выделением продуцированного белка.

Кроме того, в данном изобретении предлагаются вирусный вектор, кодирующий полипептид Сап или его изоформу, аллельный вариант, фрагмент, мутеин, слитый белок, рибозим, антисмысловой олигонуклеотид или производное, и его применение для введения в клетки млекопитающих полипептида Сап, его изоформы, аллельного варианта, фрагмента, мутеина, слитого белка.

Кроме этого, в данном изобретении предлагается вектор, пригодный для направления к мишени регуляторных последовательностей, функциональных в клетках, для активации экспрессии эндогенного Сап или ингибитора Сап.

В другом аспекте данное изобретение относится к поликлональному или моноклональному антителу, химерному антителу, полностью гуманизированному антителу, анти-анти-И-антителу или его фрагменту, направленным на эпитоп полипептида Сап, или его изоформу, аллельный вариант, фрагмент, мутеин, слитый белок или производное, и его применению для диагностических целей или разработки иммуноанализов для детектирования полипептида Сап или его изоформы, аллельного варианта, фрагмента, мутеина, слитого белка или производного в биологических жидкостях.

Кроме того, данное изобретение относится к клетке-хсзяину, выбранной из прокариотических или эукариотических клеток, предпочтительно НеЬа, 293 Т НЕК и СН0, содержащей вектор, кодирующий Сап, и способу получения Сап или его изоформы, мутеина, аллельного варианта, фрагмента, слитого белка или производного. Альтернативно, данное изобретение относится к способу получения Сап или его изоформы, мутеина, аллельного варианта, фрагмента, слитого белка или производного, включающему получение трансгенного животного и выделение белка, полученного из жидкостей организма этого животного.

В одном аспекте данного изобретения предлагается способ генотерапии для лечения воспалительного заболевания, выбранного из рассеянного склероза с первичной олигодендроглиопатией, аутоиммунного увеоретинита, диабета, волчанки, аутоиммунного миокардита I, опосредованного НСУ хрони

- 5 009956 ческого гепатита, хронического гастрита, например гастрита типа А, смешанной соединительнотканной болезни (МСТО), болезни Крона или язвенного колита, включающий индукцию экспрессии Сап или мутеина (например, Сап Ό600Ε), фрагмента (например, 8ЕЦ ΙΌ N0: 5, 8ЕЦ ГО N0: 4), антисмыслового олигонуклеотида, предпочтительно 8ЕЦ ГО N0: 6 и/или 8ЕЦ ГО N0: 7, и рибозима Сап в желаемом участке в пациенте-человеке, нуждающемся в этом.

Кроме того, в данном изобретении предлагается способ лечения воспалительного состояния, выбранного из рассеянного склероза с первичной олигодендроглиопатией, аутоиммунного увеоретинита, диабета, системной красной волчанки, аутоиммунного миокардита I, опосредованного НСУ хронического гепатита, хронического гастрита, например гастрита типа А, смешанной соединительно-тканной болезни (МСТО), болезни Крона или язвенного колита, включающий регуляцию эндогенного Сап или ингибитора Сап нацеливанием вектора, имеющего регуляторные ДНК-последовательности, функциональные в клетках, для обеспечения возможности активации эндогенного гена Сап или эндогенного ингибитора Сап в желаемом участке организма пациента-человека, нуждающегося в этом.

Кроме того, изобретение относится к применению полипептида Сап, его мутеина, изоформы, аллельного варианта, фрагмента (например, 8ЕЦ ГО N0: 5, 8ЕЦ ГО N0: 4), слитого белка или производного, антисмыслового олигонуклеотида (например, 8ЕЦ ГО N0: 6 и/или 8ЕЦ ГО N0: 7), вектора, кодирующего Сап и его фрагменты, и антител против Сап для понижающей регуляции каспазы, в ситуациях, где имеет место избыточная гибель клеток посредством апоптоза, например, индукцией ТИЕ-рецепторого пути передачи сигнала.

Данное изобретение также относится к применению полипептида Сап или его мутеина (например, Сап Ό600Ε), изоформы, аллельного варианта или фрагмента, слитого белка или производного, вектора, кодирующего Сап или его фрагменты, ДНК, кодирующей Сап или его фрагменты и мутеины, вектора, содержащего ДНК, кодирующую Сап или фрагмент или мутеины, векторов для эндогенной активации Сап и антиидиотипических антител Сап для повышающей регуляции активности каспазы и увеличения апоптоза в ситуациях, где требуется избыточная гибель клеток.

В другом аспекте данное изобретение относится к фармацевтической композиции, содержащей терапевтически эффективное количество полипептида Сап или его мутеина (например, Сап Ό600Ε), изоформы, аллельного варианта, фрагмента (например, 8ЕЦ ГО N0: 5, 8ЕЦ ГО N0: 4), слитого белка или производного, ДНК или вектора, кодирующего Сап или мутеины или фрагменты, вектора для эндогенной активации Сап или его ингибитора, антисмыслового олигонуклеотида, рибозима или антитела, специфического в отношении Сап, для лечения воспалительного заболевания, выбранного из рассеянного склероза с первичной олигодендроглиопатией, аутоиммунного увеоретинита, диабета, волчанки, аутоиммунного миокардита I, опосредованного НСУ хронического гепатита, хронического гастрита, например гастрита типа А, смешанной соединительнотканной болезни (МСТО), болезни Крона или язвенного колита.

Кроме того, данное изобретение относится к фармацевтической композиции, содержащей терапевтически эффективное количество полипептида Сап или его мутеина (например, Сап Ό600Ε), изоформы, аллельного варианта, фрагмента, слитого белка или производного, ДНК или вектора, кодирующего Сап, или мутеины, или фрагменты, вектора для эндогенной активации Сап или антиидиотипического антитела, специфического в отношении Сап, для лечения злокачественной опухоли.

В другом варианте данное изобретение относится к фармацевтической композиции, содержащей терапевтически эффективное количество ингибитора Сап для лечения или профилактики заболевания, в котором участвует активность Сап.

Далее, в данном изобретении предлагается способ выделения, идентификации и клонирования другого полипептида того же класса, к которому относится Сап, включающий использование ДНК, кодирующей Сап или его мутеины или фрагменты, для скрининга библиотеки ДНК или каспаза-специфического антитела, пригодного для коиммунопреципитации каспазы и связанного полипептида или аффинной очистки таких полипептидов из проб, выбранных из жидкостей организма, клеточных экстрактов и экспрессионных библиотек ДНК, Сап-специфическими антителами или с использованием полипептида Сап или его мутеина, изоформы, аллельного варианта, фрагмента, слитого белка или производного, в качестве добычи или приманки в дрожжевой двухгибридной системе.

Изобретение относится также к способу выделения полипептида или фактора, участвующего в процессах внутриклеточной передачи сигнала, из проб, выбранных из клеточных экстрактов, жидкостей человека и экспрессионных библиотек, включающему коиммунопреципитацию Сап и полипептидов или факторов, участвующих во внутриклеточной передаче сигнала, с использованием антитела, распознающего Сап.

Кроме того, в данном изобретении предлагается способ скрининга пептида или малой молекулы, являющихся антагонистами Сап, включающий высокопроизводительный скрининг и отбор таких молекул, способных ингибировать взаимодействие Сап с прокаспазой-8, или на мутеин (например, Сап Ό600Ε), изоформу, аллельный вариант, фрагмент (например, 8Ε0 ГО N0: 4 или 8Ε0 ГО N0: 5), слитый белок или производное, или отбор молекул, способных ингибировать апоптоз, усиленный Сап или его мутеином, изоформой, аллельным вариантом, фрагментом, слитым белком или производным.

- 6 009956

Кроме того, данное изобретение относится к способу лечения и/или профилактики нарушения, выбранного из рассеянного склероза с первичной олигодендроглиопатией, аутоиммунного увеоретинита, диабета, волчанки, аутоиммунного миокардита I, опосредованного НСУ хронического гепатита, хронического гастрита, например гастрита типа А, смешанной соединительно-тканной болезни (МСТЭ). болезни Крона или язвенного колита, включающему введение пациенту, нуждающемуся в этом, фармацевтически эффективного количества полипептида Сап или его мутеина (например, Сап Ό600Ε), изоформы, аллельного варианта, фрагмента (например, δΕΟ ΙΌ N0: 4, δΕΟ ΙΌ N0: 5), слитого белка, или производного, или ДНК, или векторов, кодирующих Сап или его мутеин или фрагменты, или векторов для эндогенной активации генов Сап, или ингибитора Сап, или специфического антитела для Сап.

Краткое описание фигур

Фиг. 1 показывает аминокислотную последовательность прокаспазы-8. Пептидные последовательности каспазы-8, используемые для получения тАЬ, показаны жирным шрифтом и подчеркнуты.

Пептид 179 - пептид ΕΌΟΟΝΥΟΚΟΙΡνΕΤΟ, соответствующий С-концу большой субъединицы каспазы-8 (8иЬ-1).

Пептид 182 - пептид ΕδδΡρΤΚΥΙΡΌΕΑΌ, соответствующий Ν-концу малой субъединицы каспазы-8 (8иЬ-2, остатки Ьу8385-О1у399).

Пептид 183 - пептид δΕδρΤΕΌΚνΥρΜΚδΚΡΚ, соответствующий Ν-концу 8иЬ-1 (остатки 8ег217О1у234).

Фиг. 2 показывает эффективную иммунопрецигитацию незначительных количеств каспазы-8, обнаруженных в лизатах клеток В1ЛВ с использованием моноклонального антитела против эпитопа 179. Истощение каспазы-8 из лизатов клеток В1АВ (полученных до, -, и после, +, стимуляции Еак-рецептора) при помощи иммунопреципитации различными антителами показано слева направо.

Дорожки 3 и 4, тАЬ 179: моноклональное антитело, полученное против пептида, соответствующего С-концу 8иЬ-1 (большой субъединицы каспазы-8, остатков Су8360-А§р374).

Дорожки 5 и 6, тАЬ 183.1 и дорожки 7 и 8, тАЬ 183.2, два моноклональных антитела, полученных против пептида, соответствующего Ν-концу 8иЬ-1 (остатков 8ег217-О1у234).

Дорожки 9 и 10, тАЬ 182, моноклональное антитело, полученное против пептида, соответствующего Ν-концу 8иЬ-2 (малой субъединицы каспазы-8) (остатков Ьу8385-А8р399).

Дорожка 11, ΝΜδ - нормальная сыворотка мыши.

Фигура показывает оценку Вестерн-блоттингом количеств каспазы-8, оставшейся в клеточных лизатах после иммунопреципитации указанными антителами и общих клеточных лизатах (дорожки 1 и 2).

Фиг. 3а показывает элюцию каспазы-8, иммунопреципитированной, как на фиг. 2, посредством конкуренции с пептидами, против которых были получены различные антитела. Каспазу-8 в элюатах из этих иммунопреципитатов, образованных указанными антителами, детектируют Вестерн-блот-анализом (как на фиг. 2).

Фиг. 3Ь показывает элюцию каспазы-8, иммунопреципитированной, как на фиг. 2, посредством конкуренции с пептидами, против которых были получены различные антитела. Каспазу-8 в элюатах из этих иммунопреципитатов, образованных указанными антителами, детектируют окрашиванием серебром.

Фиг. 4 показывает эффективную иммунопреципитацию незначительных количеств каспазы-8, обнаруженных в лизатах клеток В1АВ, с использованием поликлональной сыворотки, полученной иммунизацией пептидом, соответствующим С-концу διιό-1 (большой субъединицы каспазы-8, остатки Су§360Акр-374). Истощение каспазы-8 из лизатов клеток В1АБ (полученных до, -, и после, +, стимуляции Еа§рецептора) иммунопреципитацией различными антителами показано слева направо. Каспазу-8, оставшуюся в лизате, детектируют Вестерн-блот-анализом после иммунопреципитации следующими антителами.

Дорожки 3 и 4, ΝΜδ - нормальная сыворотка мышей.

Дорожки 5 и 6, поликлональные анти-179-антитела, кроличье поликлональное антитело, полученное против С-конца διιό-1 (большой субъединицы каспазы-8, остатков Су8360-А§р374).

Дорожки 7 и 8, тАЬ 182.

ТЬ - общий лизат клеток.

Фиг. 5 показывает иммунопреципитированную и элюированную каспазу-8 из лизатов нестимулированных клеток В1АВ с использованием различных антител. Слева направо показаны уровни каспазы-8, детектируемые Вестерн-блот-анализом после элюции иммунопреципитатов, проводимым со следующими антителами.

Дорожка 1, анти-183-сыворотка против Ν-конца διιό-1 (остатки δе^217-С1у234).

Дорожка 2, тАЬ 183.2, моноклональное антитело против Ν-конца διιό-1 (остатки δе^217-С1у234).

Дорожка 3, тАЬ 179, моноклональное антитело против С-конца διιό-1 (большой субъединицы каспазы-8, остатки Су8360-А§р374).

Небольшой (5,6 кДа) фрагмент каспазы-8, продуцируемый в соответствии с новым режимом процессинга, обусловленного тАЬ 179, отмечен стрелкой.

Фиг. 6 показывает каспазу-8 и связанный каспазой-8 полипептид (р72/Сап), которые иммунопреципитировались тАЬ179 из лизатов клеток В1АВ до и после одночасовой стимуляции Еак-лигандом и элюировались пептидом 179. Иммунопреципитированную каспазу-8 и связанные полипептиды с тАЬ 179

- 7 009956 элюировали (как на фиг. 3Ь), разделяли электрофорезом в δΌδ-ПААГ и окрашивали серебром. Дорожки 1 и 2 показывают контроли, в которых клеточные лизаты иммунопреципитировали М1дС1 (мышиным иммуноглобулином 1дС1).

Фиг. 7 показывает схематическое представление мотивов полипептида р72 (Сап). Один мотив скрученной спирали (С) и два тандемно расположенных мотива 8ИКР (8) расположены вблизи Ν-конца этого полипептида, и один мотив О-участок локализован на С-конце полипептида (О-мотив). Указан также остаток аспарагиновой кислоты Ό600 внутри О-мотива. Ό600- является мутантом, в котором остаток Ό600 в полипептиде заменен остатком глутаминовой кислоты.

Фиг. 8 показывает схематическое представление подхода, используемого для получения полноразмерной кДНК р72 (Сап). Е8Т-клон 1МАОЕ 2964545, купленный из !псу(с Оепоттек, в котором отсутствует последовательность первых 21 нуклеотида (кодирующих первые 7 аминокислот), использовали в качестве матрицы для первой полимеразной цепной реакции (ПЦР) вместе с парой праймеров: прямым праймером, Р2, содержащим перекрывающиеся нуклеиновые кислоты с клоном 5' Е8Т и дополнительные 15 нуклеотидов из 21 отсутствующего нуклеотида, и обратным праймером, Р3, содержащим перекрывающиеся последовательности с 3' Е8Т. Полученный продукт ПЦР использовали в качестве матрицы для второй ПЦР вместе с парой праймеров: прямым праймером, Р1, содержащим весь 21 отсутствующий нуклеотид и 5 нуклеиновых кислот Е8Т, и обратный праймер, Р3, содержащий перекрывающиеся последовательности с 3' Е8Т.

Фиг. 9 показывает коиммунопреципитацию каспазы-8 и р72 (Сап) посредством тАЬ 179 из лизатов клеток В1АБ в нулевой временной точке и после 20 мин стимуляции Еак-лигандом. Полипептиды, элюированные после иммунопреципитации тАЬ 179, разделяли электрофорезом в 808-ПААГ и детектировали окрашиванием серебром. Полосу с предположительной молекулярной массой приблизительно 72,5 кДа, соответствующую р72 (Сап), копреципитировали с прокаспазой-8 перед стимуляцией Еак-лигандом (дорожка 3). После 20 мин стимуляции уровень полосы 72,5 кДа уменьшается и детектируется новая полоса, соответствующая полипептиду более низкой молекулярной массы приблизительно 68 кДа (дорожка 4).

Дорожки 1 и 2 показывают отрицательные контроли, содержащие иммунопреципитацию клеточных лизатов мышиным 1дО1 (М1дО1).

Фиг. 10 показывает расщепление Сап активной каспазой-8. Полипептид, кодируемый кДНК р72 (Сап), экспрессировали ίη νίίτο в лизатах ретикулоцитов в присутствии ³⁵8-метионина с использованием сопряженной системы ТпТ Т7 лизата ретикулоцитов и испытывали после инкубации в течение 1 ч при 37°С в присутствии или в отсутствие рекомбинантной активной каспазы-8. Кроме того, расщепление Сап исследовали с продуктами ТпТ, кодируемыми 2 различными мутантами кДНК р72: одним, кодирующим Сап, в котором остаток Ό600, который считают предполагаемым остатком-мишенью для каспазы-8, мутирован в Е [р72 (0600Е)], и другим, в котором этот ген делетирован, и полученный укороченный полипептид не имеет остатков ниже по ходу транскрипции [р72 Ό600 (1-600)]. Полученные полипептиды разделяли электрофорезом на 8Э8-ПААГ и результаты выявляли фосфовизуализацией.

Фиг. 11 показывает каспазу-8 и р72 (Сап), которые коиммунопреципитировали при помощи тАЬ 179 из лизатов клеток В1АВ до (0') или после 5, 10, 20, 40 и 60 мин стимуляции Еак-лигандом. Пептиды элюировали, разделяли электрофорезом в 8Э8-ПААГ и детектировали окрашиванием серебром. Пептид с предположительной молекулярной массой 72,5 кДа детектировали перед стимуляцией (0'). После 5 и 10 мин стимуляции появляется новый полипептид с более низкой предположительной молекулярной массой 68 кДа. После 40 мин стимуляции полоса 72,5 кДа полностью исчезает и детектируется только 68 кДа. При 60 мин ни один из вышеупомянутых полипептидов не копреципитировался с каспазой-8.

Фиг. 12а показывает действие р72 (Сап) на апоптозную гибель клеток, индуцируемую посредством Т№-рецепторного пути передачи сигнала. кДНК р72 (Сап) (р72) или антисмысловую кДНК р72 (а/δ) встраивали в экспрессирующий вектор ]:κ:ΟΝΛ 3.1 и котрансфицировали с Т№-рецептором р55, встроенным в вектор рс^NА 3.1, и с зеленым флуоресцентным белком (ОЕР), экспрессируемым из вектора рЕОЕРС1, в клетках НЕК 293, конститутивно экспрессирующих Т-антиген (в качестве отрицательного контроля использовали вектор без вставки кДНК р72 (рс)). Спустя 24 ч трансфицированные клетки исследовали под флуоресцентным микроскопом и гибель клеток оценивали определением количества клеток, обнаруживающих апоптотическую морфологию, из общей популяции флуоресцентных клеток.

Фиг. 12Ь показывает индукцию гибели клеток вследствие сверхэкспрессии р72 (Сап) в комбинации со стимуляцией Еак-лигандом. Действие сверхэкспрессии Сап на опосредованную Еак-лигандом гибель клеток наблюдали в клетках НЕК 293, конститутивно экспрессирующих Т-антиген. В этом эксперименте клетки котрансфицировали вектором рс^NА3.1 (контрольная группа) или рс^NА3.1, кодирующим Сап, или его антисмысловую последовательность (рс, р72 или р72 а/δ, соответственно), и вектором р8ВС-2, кодирующим секретируемую щелочную фосфатазу (8ЕАР). Спустя 24 ч трансфицированные клетки индуцировали Еаз-лигандом в течение 16 ч и среду для выращивания заменяли свежей средой для выращивания. Гибель клеток измеряли определением количества 8ЕАР, секретируемого в среду для выращивания, во время следующих 24 ч.

Фиг. 13 показывает выравнивание между последовательностью полипептида, полученной в сообщении ТНС (ТНС510568 8ЕЦ ΙΌ ΝΟ: 1), содержащей консенсус всех Е8Т, и полипептидом, предсказан

- 8 009956 ным на основе полученной полноразмерной кДНК (8Еф ΙΌ N0: 3).

Фиг. 14 показывает кинетику регуляции гибели клеток нерасщепляемым мутантом Сап р72 Ό600Ε. Выживание клеток Β1ΆΒ подвергали мониторингу после применения Еак-лиганда в контрольных клетках (В1), клетках, конститутивно экспрессирующих трансфицированный р72 (В2), и клетках, конститутивно экспрессирующих трансфицированный р72 Ό600Ε (В3).

Фиг. 15 показывает минимальную аминокислотную последовательность полипептида Сап, ответственную за связывание каспазы-8. Идентификацию минимального полипептида в Сап, который является ответственным за связывание с прокаспазой-8, выполняли с использованием детального делеционного исследования и копреципитации с прокаспазой-8.

Фиг. 16 показывает ингибирование апоптоза посредством экспрессии антисмысловой молекулы Сап, р8ирег-Сап. Апоптоз клеток индуцировали сверхэкспрессией каспазы-8 (Масй а1) или химеры внеклеточной части ΤΝΕ КТ р55, слитой с трансмембранной и внутриклеточной частью Еак-рецептора (С1*) несколькими независимыми трансфекциями, проводимыми с векторами, кодирующими указанные полипептиды, и ингибирование посредством антисмысловой молекулы Сап оценивали котрансфекцией с р8ирет-Сап (столбцы, заполненные горизонтальными линиями) или с р8ирет-вектором (контроль, столбцы, заполненные вертикальными линиями).

Подробное описание изобретения

Данное изобретение относится к внутриклеточному связывающему каспазу полипептиду р72 (или Сап) или его изоформе, мутеину, аллельному варианту или фрагменту.

С одной стороны, Сап связывается с прокаспазой-8 и усиливает превращение прокаспазы-8 в активную каспазу-8, с другой стороны, активная каспаза-8 расщепляет Сап и, следовательно, активность Сап отрицательно регулируется активной каспазой-8.

Сап может связываться, кроме связывания с прокаспазой-8, с другой каспазой или ее мутеином или фрагментом и также влиять на активность такой каспазы.

Кроме того, изобретение относится к фрагменту Сап или к мутеину, имеющему доминантно-отрицательное действие на активность эндогенного полипептида Сап, и к полипептиду Сап или его мутеину или фрагменту, способным усиливать цитотоксическое действие каспазы, предпочтительно каспазы-8.

Например, получили нерасщепляемый мутантный полипептид Сап (Сап Ό600Ε), в котором аспарагиновая кислота 600 заменена глутаминовой кислотой. Этот полипептид индуцирует более высокую цитотоксичность, чем вариант дикого типа. Были также получены небольшие пептиды, производные Сап (24 и 16 аминокислотных остатков 8Еф ΙΌ N0: 4 и 8Еф ΙΌ N0: 5, соответственно), содержащие домен Сап, который, как было показано, является ответственным за связывание каспазы-8. Такие пептиды могут ингибировать связывание Сап с прокаспазой-8 и, следовательно, ингибировать цитотоксическое действие каспазы-8.

Для идентификации связанных с каспазой полипептидов (например, Сап) клетки могут быть лизированы до или после стимуляции лигандом (например, Еак-лигандом) и подвергнуты иммунопреципитации подходящим специфическим в отношении каспазы антителом.

Подходящее моноклональное антитело для иммунопреципитации получали против пептида из Сконцевого домена каспазы-8 8иЬ-1. Это антитело способно иммунопреципитировать прокаспазу-8 вместе с каспаза-8-связанным белком (например, Сап), и как каспаза-8, так и каспазасвязанный белок могут эффективно элюироваться из иммунного комплекса и восстанавливаться в супернатанте посредством конкуренции с пептидом, полученным из каспазы, который первоначально использовали для образования указанных антител.

Таким образом, каспазасвязанные полипептиды могут быть коиммунопреципитированы в соответствии с данным изобретением такими каспазаспецифическими подходящими антителами из проб, выбранных из клеточных лизатов покоящихся или стимулированных клеток, из экспрессионных кДНК-библиотек и из геномных или комбинированных пептидных библиотек.

Стимуляция клеток может осуществляться лимфокинами, например Еак-лигандом, ΤΝΡ, факторами окружающей среды, такими как голодание, тепловой шок и т. д.

Могут быть созданы антитела против каспазасвязанных белков (например, Сап), обнаруженных в соответствии с данным изобретением. Антитела, специфические для Сап, в том числе их фрагменты, могут быть использованы также для количественного или качественного детектирования Сап в пробе или для детектирования присутствия клеток, экспрессирующих Сап. Это может выполняться иммунофлуоресцентными способами, использующими флуоресцентно меченное антитело (см. ниже), в сочетании со световым микроскопом, проточной цитометрией или флуорометрическим детектированием.

Получение поликлональных антител против полипептидов описано в главе 2 Синей! Рто1осок ίη 1ттипо1оду, \УПеу апб 8оп5 1пс. Получение антител против пептидов может потребовать некоторых изменений в протоколе вследствие обычно более низкой антигенности пептидов в сравнении с полипептидами. Получение поликлональных антител против пептидов описано в вышеупомянутых Сштеп! Рто1осо1§ ίη 1ттипо1о§у, сйар1ег 9.

Антитела, полученные против Сап, могут быть использованы для изменения активности белка внутри клетки, например селективным нацеливанием Сап на клетки, включающим трансдукцию клеток

- 9 009956 внутриклеточно экспрессируемым антителом, или интрателом, против Сап. Получение интрател описано в АО 9914353.

Моноклональные антитела могут быть получены из В-клеток, взятых из селезенки или лимфатических узлов иммунизированных животных, в частности крыс или мышей, слиянием иммортализованных В-клеток в условиях, которые благоприятствуют росту гибридных клеток. Для слияния мышиных В-клеток предпочтительной является клеточная линия Ад-8.

Способ получения моноклональных антител описан во многих статьях и справочниках, таких как Сиггеп! Рто!осок ίη 1ттипо1оду, А11еу апб 8оп§ 1пс. с1ар!ег 2. Глава 9 в этой ссылке описывает иммунизацию животных пептидами. Клетки селезенки или лимфатических узлов этих животных могут быть использованы таким же образом, что и клетки селезенки и лимфатических узлов иммунизированных полипептидом животных, для получения моноклональных антител, как описано в главе 2 в этой ссылке.

Способы, используемые для получения моноклональных антител, дополнительно описаны в КоЫег апб М1к!еш (1975) и в патенте США 4376110.

Получение антител из банка генов антител человека, гипервариабельные области которых заменены почти случайными последовательностями, описано в патенте США 5840479. Такие антитела являются предпочтительными, если трудно иммунизировать животное конкретным пептидом или полипептидом. Некоторые структуры являются слабоиммуногенными и могут оставаться такими, несмотря на добавление адъювантов и связывание с другими полипептидами в слитых конструкциях. Антитела, описанные в И8Р 5840479, являются также предпочтительными, если желательно использовать антитела со структурой, сходной с антителами человека, например, когда желательными являются антитела, которые имеют низкую иммуногенность у человека.

После идентификации подходящего антитела может быть желательным изменение его свойств. Например, химерное антитело может достигать более высоких выходов при получении. Химерные антитела, в которых константные области заменены константными областями человеческих антител, могут быть также желательными, когда требуется, чтобы это антитело имело низкую иммуногенность у людей. Получение химерных антител описано в ряде публикаций, таких как СаЬШу е! а1., 1984; Мотгщоп е! а1., 1984; Воийаппе е! а1., 1984; ЕР 125023, ЕР 171496, ЕР 173494, ЕР 184187, АО 86/01533, АО 87/02671 и Наг1о\т апб Ьапе, Ап!1Ьоб1е8: А ЬаЬога!огу Мапиа1, Со1б 8рппд НагЬог ЬаЬога!огу, 1988.

Полностью гуманизированные антитела являются молекулами, содержащими как вариабельную, так и константную область человеческого иммуноглобулина. Полностью гуманизированные антитела могут потенциально использоваться для терапевтического применения, когда периодическое введение требуется при хронических и рецидивирующихся заболеваниях, таких как аутоиммунные заболевания. Один способ получения полностью человеческих антител заключается в гуманизации мышиной гуморальной иммунной системы, т. е. получении мышиных штаммов, способных продуцировать человеческий 1д (ксеномышей), введением локусов человеческого иммуноглобулина (1д) мышам, у которых были инактивированы эндогенные гены 1д. Эти локусы 1д являются чрезвычайно сложными в смысле их физической структуры и реаранжировки генов и процессов экспрессии, требуемых для получения в конечном счете обширной иммунной реакции. Разнообразие антител главным образом возникает в результате комбинаторной реаранжировки между различными генами V, Ό и 1, присутствующими в локусах 1д. Эти локусы содержат также рассеянные в них регуляторные элементы, которые управляют экспрессией антител, аллельным исключением, переключением классов и созреванием аффинности. Введение нереаранжированных трансгенов 1д человека в мышей показало, что аппарат рекомбинации мыши является совместимым с генами человека. Кроме того, гибридомы, секретирующие антигенспецифические 1ш-тАЬ различных изотипов, могут быть получены иммунизацией ксеномышей антигеном.

Полностью гуманизированные антитела и способы их получения известны в данной области (Мепбех е! а1., Ыа!иге Оепейск 15: 146-156 (1997); Виддетапп е! а1., Еиг. 1. 1ттипо1. 21: 1323-1326 (1991); Тоиихика е! а1., Ргос. Ыа!1. Асаб. 8с1. И8А 97: 722-727 (2000), патент АО 98/24893).

Другим типом антитела является антиидиотипическое антитело. Антиидиотипическое (анти-1б) антитело является антителом, которое распознает уникальные детерминанты, обычно ассоциированные с антигенсвязывающим сайтом антитела. 1б-антитело может быть получено иммунизацией животного того же самого вида и генетического типа (например, мышиного штамма), что и источник тАЬ, для которых получают анти-1б. Иммунизированное животное будет распознавать и отвечать на идиотипические детерминатны иммунизирующего антитела продуцированием антитела к указанным идиотипическим детерминатам (анти-1б-антитела). См., например, патент США № 4699880, который включен в данное описание в качестве ссылки в его полном виде.

Анти-1б-антитело может быть также использовано в качестве иммуногена для индукции иммунной реакции еще и у другого животного с получением так называемого анти-анти-1б-антитела. Это антианти-1б может быть эпитопно идентичным исходному тАЬ, которое индуцировало анти-1б. Таким образом, с использованием антител к идиотипическим детерминантам тАЬ можно идентифицировать другие клоны, экспрессирующие антитела идентичной специфичности.

Термин антитело обозначает как интактные молекулы, так и их фрагменты, такие как, например, ЕаЬ и Е(аЬ')₂, которые способны связывать антиген. У фрагментов ЕаЬ и Е(аЬ')₂ отсутствует Ес-фрагмент

- 10 009956 интактного антитела, они выводятся более быстро из кровотока и могут иметь меньшее неспецифическое связывание в тканях, чем интактное антитело (\Уа111 с1 а1., 1983).

Понятно, что ЕаЬ, и Е(аЬ')₂, и другие фрагменты антител, применимые в данном изобретении, могут быть использованы для детектирования и количественного определения Сап в соответствии с описанными здесь способами для интактных молекул антител. Такие фрагменты обычно получают протеолитическим расщеплением с использованием таких ферментов, как папаин (для получения ЕаЬ-фрагментов) или пепсин (для получения Е(аЬ')₂-фрагментов).

Говорят, что антитело способно связывать молекулу, если оно способно специфически взаимодействовать с молекулой, связывая в результате этого молекулу с антителом. Термин эпитоп относится к части любой молекулы, способной быть связываемой антителом, которая может также распознаваться таким антителом. Эпитопы или антигенные детерминанты обычно состоят из химически активных поверхностных группировок молекул, таких как аминокислоты или боковые цепи сахаров, и имеют специфические трехмерные структурные характеристики, а также специфические характеристики зарядов.

Антитела (или их фрагменты), применимые в данном изобретении, могут использоваться гистологически, например, в иммунофлуоресцентной или иммуноэлектронной микроскопии, для детектирования Сап ίη 8Йи. Детектирование ίη δίΐιι может выполняться взятием гистологического образца у пациента и внесением меченого антитела данного изобретения в такой образец. Антитело (или фрагмент) предпочтительно вносят нанесением или наслаиванием меченого антитела (или фрагмента) на биологическую пробу. Посредством такого способа можно определять не только присутствие полипептида Сап, но также его распределение на исследуемой ткани. С использованием данного изобретения специалисты в данной области легко поймут, что любой из большого разнообразия гистологических способов (например, процедур окрашивания) может быть модифицирован для достижения такого детектирования ίη δίΐιι.

Такие анализы на полипептид Сап данного изобретения обычно предусматривают инкубирование биологической пробы, такой как биологическая жидкость, экстракт ткани, свежесобранные клетки, такие как лимфоциты или лейкоциты, или клетки, которые инкубировались в культуре ткани, в присутствии детектируемо меченного антитела, способного идентифицировать полипептид Сап, и детектирование этого антитела любым из ряда способов, хорошо известных в данной области.

Биологическая жидкость или биологическая проба означает любую жидкость, полученную из клеток, клеточных компонентов или клеточных продуктов или содержащую клетки, клеточные компоненты или клеточные продукты. Биологические жидкости включают в себя, но не ограничиваются ими, супернатанты культур клеток, клеточные лизаты, осветленные клеточные лизаты, клеточные экстракты, тканевые экстракты, кровь, плазму, сыворотку, молоко и их фракции.

Биологическая проба может быть обработана с использованием твердофазной подложки или твердофазного носителя, такого как нитроцеллюлоза, или другой твердой подложки или твердого носителя, которые способны иммобилизовать клетки, частицы клеток или растворимые полипептиды. Затем подложка или носитель могут быть промыты подходящими буферами с последующей обработкой детектируемым меченым антителом в соответствии с данным изобретением, как отмечалось выше. Затем твердофазная подложка или носитель могут быть промыты буфером второй раз для удаления несвязанного антитела. Количество связанной метки на указанной твердой подложке или твердом носителе могут затем детектироваться общепринятыми способами.

Термины твердофазная подложка, твердофазный носитель, твердая подложка, твердый носитель, подложка или носитель обозначают любую подложку или любой носитель, способные связывать антиген или антитела. Хорошо известные подложки или носители включают стекло, полистирол, полипропилен, полиэтилен, декстран, нейлон, амилазы, природные и модифицированные целлюлозы, полиакриламиды, габбро и магнетит. Природа носителя может быть либо растворимой до некоторой степени, либо нерастворимой для целей данного изобретения. Подложка может иметь фактически любую возможную структурную конфигурацию, при условии, что связанная молекула способна связываться с антигеном или антителом. Таким образом, конфигурация подложки или носителя может быть сферической, например в виде гранулы, цилиндрической, например в виде внутренней поверхности пробирки или наружной поверхности стержня. Альтернативно, эта поверхность может быть плоской, как лист, тест-полоска и т.д. Предпочтительные подложки или носители включают в себя полистироловые шарики. Специалистам в данной области будут известны другие подходящие носители для связывания антитела или антигена, или они смогут определить их с использованием рутинного экспериментирования.

Связывающая активность конкретной партии антитела данного изобретения, как отмечалось выше, может быть определена в соответствии с хорошо известными способами. Специалисты в данной области смогут определить рабочие и оптимальные условия анализа для каждого определения при помощи рутинного экспериментирования.

Другие стадии, такие как промывание, перемешивание, встряхивание, фильтрование и т.п., могут быть добавлены к анализам, как это принято или необходимо для конкретной ситуации.

Одним из способов, в котором антитело согласно данному изобретению может быть детектируемо мечено, является связывание его с ферментом и использование в иммуноферментном анализе (ΕΙΑ). Этот фермент, в свою очередь, при последующем экспонировании с подходящим субстратом, будет взаимо

- 11 009956 действовать с субстратом таким образом, что образуется химический компонент, который может быть детектирован, например, спектрофотометрическим, флуорометрическим или визуальным способами. Ферменты, которые могут быть использованы для детектируемого мечения антитела, включают, но не ограничиваются ими, малатдегидрогеназу, стафилококковую нуклеазу, дельта-5-стероидизомеразу, дрожжевую алкогольдегидрогеназу, альфа-глицерофосфатдегидрогеназу, триозофосфатизомеразу, пероксидазу хрена, щелочную фосфатазу, аспарагиназу, глюкозооксидазу, бета-галактозидазу, рибонуклеазу, уреазу, каталазу, глюкозо-6-фосфатдегидрогеназу, глюкоамилазу и ацетилхолинэстеразу. Детектирование может выполняться колориметическими способами, которые используют хромогенный субстрат для фермента. Детектирование может также выполняться визуальным сравнением степени ферментативной реакции субстрата в сравнении с таким же образом приготовленными стандартами.

Детектирование может выполняться с использованием любого из различных других иммуноанализов. Например, радиоактивное мечение антител или фрагментов антител можно детектировать К-РТРазой посредством применения радиоиммуноанализа (К1А). Хорошее описание К1А может быть найдено в ЬаЬогаФгу Тес11пк|ие8 апб ВюсЬепйкЦу ίη Мо1еси1аг Βίοίοβν. Ьу \Уогк. Т.8. е1 а1., №г111 Но11апб РиЬ118Ыпд Сотрапу, ΚΥ (1978) с особой ссылкой на главу под названием Ап 1п1гобис1юп ΐο Кабюиптипе Аккау апб Ке1а1еб Тес11пк.|ие8 Ьу СЬагб, Т., включенной в данное описание в качестве ссылки. Радиоактивный изотоп может детектироваться такими способами, как применение д-счетчика или сцинтилляционного счетчика или радиоавтография.

Антитело согласно данному изобретению может быть также помечено флуоресцентным соединением. Затем при действии на флуоресцентно меченное антитело светом подходящей длины волны его присутствие может быть детектировано вследствие флуоресценции. Наиболее часто используемыми флуоресцентно метящими соединениями являются флуоресцеинизотиоцианат, родамин, фикоэритрин, фикоцианин, аллофикоцианин, альдегид о-фталевой кислоты и флуорескамин.

Антитело может быть также детектируемо мечено с использованием испускающих флуоресценцию металлов, таких как ¹⁵³Е, или других из ряда лантанидов. Указанные металлы могут быть присоединены к антителу с использованием таких хелатирующих металлы групп, как диэтилентриаминпентауксусная кислота (ЕТРА).

Антитело может быть детектируемо мечено связыванием с хемилюминесцентным соединением. Затем присутствие хемилюминесцентно меченного антитела определяют детектированием присутствия люминесценции, которая возникает в ходе химической реакции. Примерами особенно применимых хемилюминесцентно метящих соединений являются люминол, изолюминол, сложный ароматический эфир акридиния, имидазол, соль акридиния и оксалатный эфир.

Подобным образом, биолюминесцентное соединение может быть использовано для мечения антитела данного изобретения. Биолюминесценция является типом хемилюминесценции, обнаруженной в биологических системах, в которых каталитический белок увеличивает эффективность хемилюминесцентной реакции.

Присутствие биолюминесцентного белка определяют детектированием присутствия люминесценции. Важными биолюминесцентными соединениями для целей мечения являются люциферин, люцифераза и экворин.

Молекула антитела данного изобретения может быть адаптирована для использования в иммунометрическом анализе, также известном как двухсайтный или сэндвич-анализ. В обычном иммунометрическом анализе количество немеченого антитела (или фрагмента антитела) связывают с твердой подложкой или с носителем и количество детектируемо меченного растворимого антитела добавляют для обеспечения возможности детектирования и/или количественного определения тройного комплекса, образованного между твердофазным антителом, антигеном и меченым антителом.

Обычно и предпочтительно иммунометрические анализы включают прямые анализы, в которых антитело, связанное с твердой фазой, сначала контактирует с испытуемой пробой для экстракции антигена из этой пробы образованием бинарного твердофазного комплекса антитело-антиген. После подходящего периода инкубации твердую подложку или твердый носитель промывают для удаления остатка жидкой пробы, в том числе непрореагировавшего антигена, если он имеется, и затем контактируют с раствором, содержащим неизвестное количество меченого антитела (которое функционирует как репортерная молекула). После второго периода инкубации для обеспечения возможности образования комплекса меченого антитела с антигеном, связанным с твердой подложкой или с твердым носителем через немеченое антитело, твердую подложку или твердый носитель промывают второй раз для удаления непрореагировавшего меченого антитела.

В другом типе сэндвич-анализа, который может быть применим с антигенами данного изобретения, используют так называемые одновременные и обратные анализы. Одновременный анализ включает единственную стадию инкубации, когда антитело, связанное с твердой подложкой или с твердым носителем, и меченое антитело добавляют к испытуемой пробе одновременно. После завершения инкубации твердую подложку или твердый носитель промывают для удаления остатка жидкой пробы и не вошедшего в комплекс меченого антитела. Затем присутствие меченого антитела, связанного с твердой подложкой или с твердым носителем, определяют, как и в обычном прямом сэндвич-анализе .

- 12 009956

В обратном анализе используют ступенчатое добавление сначала раствора меченого антитела к жидкой пробе с последующим добавлением немеченого антитела, связанного с твердой подложкой или носителем, после подходящего периода инкубации. После второй инкубации твердую фазу промывают обычным образом для освобождения ее от остатка испытуемой пробы и раствора непрореагировавшего меченого антитела. Затем определение меченого антитела, связанного с твердой подложкой или носителем, осуществляют, как в одновременном и прямом анализах.

Создание иммуноанализов, таких как ΒΙΑ или ΕΟ8Α, было описано во многих статьях, руководствах и других публикациях. Делается ссылка на \¥0 97/03998, со стр. 48, строка 4 по стр. 52, строка 27. Иммуноанализы согласно изобретению могут быть двух типов: во-первых, иммуноанализы с использованием иммобилизованного полипептида Сап или эквивалентного пептида могут быть использованы для количественного определения Сап. Во-вторых, для количественного определения полипептидов Сап могут быть использованы иммуноанализы с использованием иммобилизованных антител против эпитопа полипептида Сап.

Такие анализы могут найти применение в диагностике, так как оценка уровня Сап и других полипептидов, участвующих в путях апоптоза, может быть необходимой при ряде нарушений или синдромов, когда существует возможность участия таких путей.

Термины белок и полипептид в данном описании являются взаимозаменяемыми.

Было обнаружено, что полипептид данного изобретения - полипептид 72 кДа - специфически связывает прокаспазу-8. Затем полипептид анализировали дополнительно частичным секвенированием и анализом масс-спектра. Затем полученную таким образом последовательность вводили в программу поиска базы данных и при помощи компьютерного поиска были идентифицированы перекрывающиеся последовательности и Ε8Τ. Используемые программы хорошо известны специалистам в данной области и содержат, например, пакет программ ССС (генетической компьютерной группы). Предпочтительно используют программу поиска, такую как Ваис Ьоса1 АНдитеи! 8еагсй Тоо1 (Ε+ΤΛ8Τ). доступную из сервера ΕΜΒΤ (например, Шр://боуе.етЬ1-йе1бе1Ьегд.бе/В1а812/). Команда В1аз(п может быть использована для поиска нуклеотидных последовательностей, которые являются перекрывающимися или сходными с идентифицированным клоном.

Альтернативно или наряду с вышеупомянутыми способами поиска в базах данных, библиотека, например геномная библиотека или кДНК-библиотека, может быть подвергнута скринингу для идентификации полных клонов. Такие способы скрининга описаны в вышеупомянутых руководствах 8атЬгоок е1 а1. и Ли8иЬе1 е1 а1. Альтернативно или в дополнение, могут быть использованы способы клонирования на основе ПЦР, такие как быстрая амплификация концов кДНК (5'- и 3'-ΚΛ£Ε, Стайат е1 а1., 1991 и приведенные ими ссылки).

В данном варианте обнаруженную ΕδΤ-последовательность подвергали поиску в ТЮВ Нитаи деие тбех и получали сообщение ТНС. Был получен консенсус всех Ε8Τ, которые соответствуют этим последовательностям, ТНС510568 (8ΕΟ ΙΌ N0: 1). Эта консенсусная последовательность не имела нуклеотидов, кодирующих первый метионин и следующие 6 аминокислот Сап, как было оценено из мышиной Ε8Έ которая проявляет высокое сходство с человеческой Εί^ (идентичность приблизительно 90%). Первый метионин и последующие 6 аминокислот соответствующего мышиного белка, которые не отсутствовали в мышиных Ε8Έ сравнивали с рабочими последовательностями генома человека для дополнения отсутствующей последовательности человека. Получали совпадение, соответствующее последовательности клона ^^N^В-232Ε12 хромосомы 19 Ното 8ар1еи8. Этот клон подтверждал отсутствующие 7 аминокислот р72. Полноразмерную кДНК белка р72 получали при помощи ПЦР, схематически представленной на фиг. 8. Полноразмерную ДНК, кодирующую р72, выделяли, секвенировали (8Ε0 ΙΌ N0: 2) и выводили аминокислотную последовательность (8Ε0 ΙΌ N0: 3).

Было обнаружено, что полипептид р72 содержит три консервативных мотива (фиг. 7): мотив С, спиральный мотив, два расположенных тандемно '8ИВР' (также называемых мотивами '8^ЛР', обозначенных как 8 на фиг. 7) (ОеиНе/, Б. аиб Ьа1уаШ, В., 1994) вблизи Оконца полипептида и один расположенный на С-конце 'С-участок' (обозначенный как С на фиг. 7) (Атаутб, Ь. аиб Кооши, Ε.ν., 1999). Считают, что как мотив 8ЦВР, так и мотив С-участок способствуют связыванию РНК, что позволяет предполагать, что мишенью р72 может быть молекула РНК. Таким образом р72 был переименован в Сап (Кари) (название образовано как аббревиатура каспаза-8-ассоциированный полипептид с РНКсвязывающими мотивами). Таким образом, термины Сап и р72 являются в данном описании взаимозаменяемыми.

Полоса, соответствующая полному полипептиду Сап, исчезает после стимуляции клеток, и вместо нее появляется новый полипептид меньшей молекулярной массы. Возможность того, что Сап может расщепляться активированной каспазой-8, исследовали анализом ш уйто, включающим в себя инкубирование рекомбинантно полученной каспазы-8 и меченого полипептида Сап. Сап может быть получен введением его кодирующей последовательности в экспрессирующий вектор, содержащий сильный промотор, и трансфекцией в клетку млекопитающего.

Альтернативно, Сап может быть получен ш νίΙΐΌ с использованием системы трансляции ш νίΙΐΌ. Способ трансляции ш ν Пго хорошо известен специалистам в данной области, и реагенты и подробные

- 13 009956 протоколы для этого способа являются доступными, например, из 81га1адепе, Ьа 1о11а, И8Л.

В данном варианте Сап метили с использованием радиоактивного изотопа. Предпочтительно при использовании изотопного мечения тестируемый полипептид экспрессируют ίη νίΐΐΌ и меченную изотопом аминокислоту, предпочтительно меченную изотопом ³⁵8, вместе с немеченой аминокислотой добавляют во время реакции трансляции ίη νίίΐΌ. Кроме того, предпочтительно, чтобы меченая аминокислота была ³⁵8-метионином, а отношение между меченой и немеченой аминокислотами было равно от 1:1 до приблизительно 1:1000.

Затем меченный радиоактивным изотопом полипептид Сап и рекомбинантно полученный фермент каспазу-8 объединяли в подходящем буфере и выдерживали в течение периода времени, достаточного для осуществления расщепления. Предпочтительный буфер и другие предпочтительные параметры анализа описаны в публикации Во1бт е! а1., 1996. Предпочтительный период зремени составляет обычно от 10 мин до несколько часов, предпочтительно от 30 мин до 1 ч.

После обеспечения времени для осуществления расщепления реакционную смесь разделяли электрофорезом в δΌδ-полиакриламидном геле. Гель сушили и изотоп детектировали с использованием фотографической пленки или фосфовизуализации. Испытуемый полипептид может быть помечен и может детектироваться также с использованием специфических для метки антител в Вестерн-блоте.

Появление дополнительных низкомолекулярных полос в реакциях, в которых добавляют каспазу-8, в сравнении с контрольными реакциями без каспазы-8 указывает на расщепление Сап каспазой-8. Рассчитанный размер полосы с более низкой молекулярной массой, детектируемой после расщепления, дает указание на приблизительное местоположение сайта расщепления.

Проводили исследования с использованием мутационного анализа для нахождения точного остатка-мишени в Сап. Было обнаружено, что Ό-600 является мишенью расщепления, так как мутант Сап, имеющий мутацию в остатке 600 не расщепляется каспазой-8 (р72/мутант Ό600Ε Сап).

Данное изобретение относится также к ДНК-последовательности, кодирующей Сап. Кроме того, данное изобретение относится также к ДНК-последовательностям, кодирующим биологически активные изоформу, мутеин, аллельный вариант, фрагмент или слитый белок Сап. Получение таких мутеинов и фрагментов и производных является стандартной процедурой (см., например, 8атЬгоок е! а1., 1989), в которой в ДНК-последовательностях, кодирующих Сап, один или более кодонов могут быть делетированы, добавлены или заменены другими с образованием мутеинов, имеющих изменение по меньшей мере одного аминокислотного остатка относительно природного полипептида, за исключением мутеина, имеющего глицин в аминокислотном остатке 230 вместо глутаминовой кислоты, как в полипептиде ΌΡ5182_3 в АО 9830582.

ДНК-последовательности данного изобретения кодируют Сап, изоформу, аллельный вариант, фрагмент, мутеины или производное, ДНК-последовательности, способные гибридизоваться с кДНК-последовательностью, произведенной из кодирующей области нативного полипептида Сап, при проведении такой гибридизации в условиях умеренной жесткости, причем эти гибридизуемые ДНК-последовательности кодируют биологически активный полипептид Сап. Таким образом, гибридизуемые ДНК-последовательности содержат ДНК-последовательности, которые имеют относительно высокое сходство с кДНК-последовательностью нативного Сап и как таковые представляют Сап-подобные последовательности, которые могут быть, например, природно полученными последовательностями, кодирующими различные изоформы Сап, или последовательностями природного происхождения, кодирующими полипептиды, принадлежащие к группе Сап-подобных последовательностей, кодирующих полипептид, имеющий активность Сап. Далее, указанные последовательности могут также включать в себя, например, не встречающиеся в природе, полученные синтетически последовательности, которые имеют сходство с кДНК-последовательностью природного Сап, но содержат ряд желаемых модификаций. Такие синтетические последовательности включают все возможные последовательности, кодирующие мутеины, фрагменты и производные Сап, все из которых имеют активность Сап.

В применении в данном описании, условия жесткости являются функцией температуры, используемой в гибридизационном эксперименте, молярности одновалентных катионов и процента формамида в гибридизационном растворе. Для определения степени жесткости, присутствующей в любом конкретном наборе условий, сначала используют уравнение Метко111 е! а1. (1984) для определения стабильности гибридов 100% идентичности, выражаемой в виде температуры плавления гибрида ДНК-ДНК:

1^=81,5^+16,6 (ЬодМ)+0,41 (% ОС)-0,61 (% форм.)-500/Ь где М означает молярность одновалентных катионов, % ОС означает процент нуклеотидов О и С в ДНК, % форм. означает процент формамида в гибридизационном растворе и Ь означает длину гибрида в парах оснований (п.н.). Для каждого 1°С, на который уменьшается от рассчитанной для гибрида со 100% идентичностью, количество допускаемого ошибочного спаривания увеличивается приблизительно на 1%. Таким образом, если ’Гщ, используемая для любого конкретного гибридизационного эксперимента при указанных концентрациях соли и формамида, на 10°С ниже Ьщ, рассчитанной для 100% гибрида по уравнению Ме1пко1й, гибридизация будет происходить даже в том случае, когда имеется приблизительно 10% ошибочное спаривание.

Умеренно жесткие условия являются условиями, которые обеспечивают Τ_ο, которая не более чем

- 14 009956 на 20°С ниже Τ™, которая существовала бы в случае точно спаренного дуплекса с последовательностьюмишенью, либо рассчитанной по приведенной выше формуле, либо фактически измеренной. Без ограничения, для умеренно жестких (на 15-20°С ниже рассчитанной или измеренной Τ гибрида) условий используют промывочный раствор 2х88С (стандартный раствор цитратной соли) и 0,5% 8Ό8 (додецилсульфат натрия) при подходящей температуре, более низкой, чем рассчитанная Τ гибрида. Конечная жесткость условий обусловлена, прежде всего, условиями промывки, в частности, при использовании условий гибридизации, которые позволяют образовываться менее стабильным гибридам вместе со стабильными гибридами. Затем условия промывки при более высокой жесткости удаляют менее стабильные гибриды. Обычной гибридизацией, которая может быть использована с умеренно жесткими условиями промывки, описанными выше, является гибридизация в растворе 6х88С (или 6х88РЕ) (стандартный фосфатно-солевой раствор ЭДТА), 5хреагент Денхардта, 0,5% 8Ό8, 100 мкг/мл денатурированной фрагментированной ДНК спермы лосося при температуре приблизительно на 20-25°С ниже 1^. При применении смешанных зондов предпочтительно использовать тетраметиламмонийхлорид (ТМАС) вместо 8Ό8 (АикиЬе1, 1987, 1999).

Для получения различных вышеупомянутых природно встречающихся Сап-подобных последовательностей могут быть использованы стандартные процедуры скрининга и выделения проб природных ДНК или РНК, полученных из различных тканей с использованием природной кДНК Сап или ее части в качестве зонда (см., например, стандартные процедуры, описанные в 8атЬгоок е! а1., 1989).

Связывающий каспазу полипептид данного изобретения мог бы быть идентифицирован описанной выше иммунопреципитацией тАЬ 179, специфическим в отношении С-конецевого домена 8иЬ-1 каспазы-8. Однако в приведенном выше анализе иммунопреципитации может использоваться антитело, специфическое в отношении С-концевого домена 8иЬ-1 из каспазы, отличающейся от каспазы-8. Данное изобретение относится также к полипептиду или белку, по существу, соответствующему Сап. Термин по существу, соответствующий включает в себя не только полипептид Сап, но также полипептиды или белки, которые являются его мутеинами. Они могут также включать слитые белки, т.е. полипептиды, содержащие Сап или его мутант, слитые с другим белком и имеющие более продолжительный период полужизни в жидкостях тела. Таким образом, Сап может быть слит с другим белком, таким как, например, иммуноглобулин, высокомолекулярным полимером, таким как полиэтиленгликоль (ПЭГ), или т.п.

Мутеины, которые, по существу, соответствуют полипептиду Сап, являются полипептидами, в которых одна или более аминокислот взаимодействующей с каспазой-8 аминокислотной последовательности белка была заменена другой аминокислотой, делетирована и/или инсертирована, за исключением мутеина, содержащего глицин в аминокислотном остатке 230 вместо глутаминовой кислоты, и при условии, что полученный полипептид проявляет, по существу, такую же или более высокую активность, что и Сап, которому он соответствует.

Для того, чтобы полипептид, по существу, соответствовал Сап, изменения в последовательности Сап, например в изоформах, являются обычно относительно небольшими. Хотя число изменений может быть более чем десять, предпочтительно имеются не более чем десять изменений, более предпочтительно не более чем пять изменений и наиболее предпочтительно не более чем три таких изменения. Хотя может быть использован любой способ для нахождения потенциально биологически активных полипептидов, которые, по существу, соответствуют полипептиду Сап, одним из таких способов является применение общепринятых способов мутагенеза на ДНК, кодирующей этот полипептид, приводящих к небольшому числу модификаций. Затем полипептиды, экспрессируемые такими клонами, могут быть подвергнуты скринингу на их способность связываться с каспазой-8 и/или модулировать активность каспазы-8 в модуляции/опосредовании внутриклеточных путей, описанных выше.

Консервативные замены являются такими заменами, которые, как ожидается, не изменяют активности полипептида и обычно должны сначала быть подвергнуты скринингу, так как не должно быть ожидания, что они, по существу, изменяют размер, заряд или конфигурацию данного полипептида и, следовательно, не должны изменять его биологические свойства.

Консервативные замены полипептида Сап включают мутеин, в котором по меньшей мере один аминокислотный остаток в полипептиде был консервативно заменен отличающейся аминокислотой. Такие замены предпочтительно получают в соответствии со следующим перечнем, представленным в табл. 1А, причем эти замены могут быть определены рутинным экспериментированием для обеспечения структурных и функциональных свойств синтезированной молекулы полипептида при сохранении биологической активности, характерной для полипептида Сап.

- 15 009956

Исходный остаток Типичная замена

ТаблицаΙΑ

АЬа

Агд

Азп

Азр

Суз

СЬп

СЬи

СЬу

НЬз

Не

Ьеи

Ьуз

МеЪ

РЬе

Зег

ТЬг

Тгр

Туг

УаЬ

СЬу; Зег

Ьуз

СЬп; НЬз

СЬи

Зег

Азп

Азр

А1а; Рго

Азп; СЬп

Ьеи; УаЬ

Не; УаЬ

Агд; СЬп; СЬи

Ьеи; Туг; ЬЬе

МеТ; Ьеи; Туг

ТЬг

Зег

Туг

Тгр; РЬе

Не; Ьеи

Альтернативно, другой группой замен Сап являются замены, в которых по меньшей мере один аминокислотный остаток в полипептиде удален, а отличающийся остаток встроен на его место в соответствии со следующей табл. ΙΒ. Типы замен, которые могут быть произведены в полипептиде, могут осно вываться на анализе частот аминокислотных замен между гомологичным полипептидом отличающегося вида, таких как представленные в табл. 1-2 δοϊιιιΐζ е! а1., С.Е., Рг1пс1р1сз о£ Рго1еш 81гис1иге 8ргшдегУсг1ад. Νον Уогк, ΝΥ, 1798, и на фиг. 3-9 в СТещЫоп. Т.Е., Рго1ешк: 81гис1иге апб Мо1еси1аг Ргорегйек, \У.Н. Ргеетап & Со., 8ап Егапаксо, СА 1983. На основании такого анализа альтернативные консервативные замены определяются здесь как замены в одной из следующих пяти групп.

Табл. ΙΒ

1. Небольшие алифатические, неполярные или слабо полярные остатки: А1а, 8ег, ТЬг (Рго, С1у).

2. Полярные отрицательно заряженные остатки и их амиды: Акр, Акп, С1и, С1п.

3. Полярные положительно заряженные остатки: Ηίκ, Агд, Ьук.

4. Большие алифатические неполярные остатки: Ме1, Ьеи, 11е, Уа1 (Сук).

5. Большие ароматические остатки: РЬе, Туг, Тгр.

Три аминокислотных остатка в скобках выше имеют особую роль в архитектуре белков. С1у является единственным остатком, не имеющим боковой цепи, и, следовательно, придает гибкость цепи. Однако это склонно активировать образование вторичной структуры, иной, чем α-спиральная структура. Рго, вследствие его необычной геометрии, прочно сжимает цепь и обычно склонен способствовать образованию подобных бета-виткам структур, хотя в некоторых случаях Сук может быть способен участвовать в образовании дисульфидных связей, что является важным в укладке (фолдинге) белков. Авторы обращают внимание на то, что 8с1шП е! а1., выше, объединяют группы 1 и 2, показанные выше. Авторы обращают внимание на то, что Туг, вследствие его потенциала в образовании водородных связей, имеет значительное родство с 8ег и ТЬг и т.д.

Консервативные аминокислотные замены согласно данному изобретению, например, представленные выше, известны в данной области, и можно было бы ожидать, что они сохраняют биологические и структурные свойства полипептида после замены аминокислоты. Большинство делеций и замен согласно данному изобретению являются делециями и заменами, которые не приводят к радикальным изменениям в характеристиках молекулы белка или полипептида. Характеристики определяются, без ограничения, как определяющие как изменения во вторичной структуре, например α-спираль или бета-слой, так и изменения в биологической активности, например связывании с каспазой-8 и/или опосредовании действия каспазы-8 на гибель клеток.

- 16 009956

Примеры получения аминокислотных замен в белках, которые могут быть использованы для получения мутеинов взаимодействующего с каспазой-8 полипептида Сап для применения в данном изобретении, включают известные стадии способа, например, представленные в патенте США ΚΕ 33653, 4959314, 4588585 и 4737462, Магк е1 а1.; 5116943, ΚοΛδ е1 а1., 4965195, Nатеη е1 а1.; 4879111, С1опд е1 а1.; и 5017691, Ьее е1 а1.; а замещенные лизином белки представлены в патенте США № 4904584 (δίκην е( а1.).

Предполагается, что, кроме консервативных замен, описанных выше, которые не будут, по существу, изменять активности полипептида Сап, любые консервативные замены или менее консервативные и более случайные изменения, которые приводят к увеличению биологической активности мутеинов полипептида Сап, входят в объем данного изобретения.

Когда должно быть подтверждено точное действие замены или делеций, специалисту в данной области будет понятно, что действие замены (замен), делеций (делеций) и т.д. будет оцениваться рутинными анализами связывания и гибели клеток. Скрининг с использованием такого стандартного теста не потребует чрезмерного экспериментирования.

Приемлемыми мутеинами Сап являются мутеины, которые сохраняют, по меньшей мере, способность взаимодействия с прокаспазой-8 и посредством этого регулируют активность каспазы-8 во внутриклеточных путях. В одном варианте было обнаружено, что Сап усиливает гибель клеток, опосредуемую Еа§, возможно, увеличением скорости превращения прокаспазы-8 в активную каспазу-8. После образования каспазы-8 она расщепляет Сап, возможно, вызывая его инактивацию. Был получен нерасщепляемый мутеин Сап (мутант Сап Ό600Ε), и было показано, что он является более сильнодействующим, чем полипептид дикого типа, в индукции гибели клеток. Нерасщепляемые мутанты и предпочтительно мутант р72 Ό600Ε могут быть использованы в определенных ситуациях, где может быть желательным увеличение активности каспазы-8. Могут быть получены полипептиды-мутеины, которые имеют так называемое доминантно-негативное действие, а именно полипептид, который является дефектным либо по связыванию с каспазой-8, либо по последующей передаче сигнала или другой активности после такого связывания. Мутеины могут быть использованы, например, для ингибирования цитотоксического действия каспазы-8 или для увеличения его, в зависимости от того, желательно ли увеличивать гибель клеток или выживание клеток, и в зависимости от того, какая из этих активностей является главной активностью, модулируемой взаимодействием Сап и каспазы-8 (см. выше), и это выполняется такими мутеинами посредством конкуренции с природным полипептидом Сап за связывание с каспазой-8 или взаимодействие с каспазой-8.

На генетическом уровне мутеины обычно получают сайт-направленным мутагенезом нуклеотидов в ДНК, кодирующей полипептид Сап, с получением посредством этого ДНК, кодирующей мутеин, с последующим синтезом ДНК и экспрессией полипептида в культуре рекомбинантных клеток. Мутеины обычно проявляют такую же или увеличенную качественную биологическую активность, что и природно встречающийся полипептид, Аи8иЬе1 е( а1., Сиггеп! РгоЮсоЕ ίη Мо1еси1аг Вю1оду, Сгеепе РиЬйсайопк апб У11еу 1п1ег8С1епсе, №\ν Υο^к, ΝΥ, 1987-1995; δатЬ^οοк е( а1., Мо1еси1аг С1ошпд: А ЬаЬога!огу Мапиа1, Со1б δр^^ηд НагЬог ЬаЬога1огу, Со1б δр^^ηд НагЬог, ΝΥ, 1989.

Получение Сап в соответствии с этим или альтернативной нуклеотидной последовательности, кодирующей тот же самый полипептид, но отличающейся от природной последовательности вследствие изменений, допускаемых известной вырожденностью генетического кода, может достигаться сайт-специфическим мутагенезом ДНК, кодирующей ранее полученные мутеины или природную версию полипептида Сап. Сайт-специфический мутагенез позволяет получать мутеины посредством применения специфических олигонуклеотидных последовательностей, которые кодируют ДНК-последовательность желаемой мутации, а также достаточное число соседних нуклеотидов для обеспечения праймерной последовательности достаточного размера и достаточной сложности последовательности для образования стабильного дуплекса на обеих сторонах пересекаемого делеционного сочленения. Обычно предпочтительным является праймер из приблизительно 20-25 нуклеотидов в длину, причем изменяются приблизительно 5-10 комплементирующих нуклеотидов на каждой стороне изменяемой последовательности. Обычно способ сайт-специфического мутагенеза хорошо известен в данной области, как показано на примерах таких публикаций, как статья Абе1тап е( а1. (1983), описание которой включено здесь в качестве ссылки.

Как будет понятно, способ сайт-специфического мутагенеза обычно использует фаговый вектор, который существует в одноцепочечной и двухцепочечной форме. Типичные векторы, применимые в сайтнаправленном мутагенезе, включают такие векторы, как фаг М13, например, описанный Мекыпд е( а1., Т1пгб С1еге1апй δутрο5^ит оп Масгото1еси1е§ апб КесотЬшап! ΩΝΛ, РбЦог А. УаНоп Εкеν^е^, Атйегбат (1981), описание которой включено здесь в качестве ссылки. Указанные фаги являются легко доступными коммерчески, и их применение обычно хорошо известно специалистам в данной области. Альтернативно, для получения одноцепочечной ДНК могут быть использованы плазмидные векторы, которые содержат сайт инициации репликации одноцепочечного фага (Уепа е( а1., МеЛ. Εηζутο1. 153: 3, 1987).

Обычно сайт-направленный мутагенез в соответствии с данным изобретением выполняют получением сначала одноцепочечного вектора, который содержит в своей последовательности ДНК-последовательность, которая кодирует релевантный полипептид. Олигонуклеотидный праймер, несущий желательную мутированную последовательность, получают синтетически при помощи автоматического син

- 17 009956 теза ДНК/олигонуклеотидов. Затем праймер отжигают с содержащим одноцепочечную кодирующую белок последовательность вектором и подвергают действию ДНК-полимеризующих ферментов, таких как фрагмент кленоваполимеразы I Е. со11, для завершения синтеза несущей мутацию цепи. Таким образом, мутированная последовательность и вторая цепь несут желаемую мутацию. Затем этот гетеродуплексный вектор используют для трансформации подходящих клеток, таких как клетки Е. со11 ΙΜ101, и отбирают клоны, которые включают в себя рекомбинантные векторы, несущие аранжировку мутированной последовательности.

После отбора такого клона мутированная последовательность Сап может быть выделена и помещена в подходящий вектор, обычно вектор-переносчик или экспрессирующий вектор типа, который может использоваться для трансфекции подходящего хозяина.

Таким образом, ген или нуклеиновая кислота, кодирующие Сап, могут быть обнаружены, получены и/или модифицированы ίη νίίτο, ίη δίΐιι и/или ίη νίνο с использованием известных способов амплификации ДНК или РНК, таких как полимеразная цепная реакция (ПЦР) и химический синтез олигонуклеотидов. ПЦР делает возможной амплификацию (увеличение в количестве) специфических последовательностей ДНК при помощи повторяемых реакций ДНК-полимеразы. Эта реакция может быть использована в качестве замены клонирования; все, что для нее требуется, это знание последовательности нуклеиновой кислоты. Для проведения ПЦР конструируют праймеры, которые являются комплементарными представляющей интерес последовательности. Затем праймеры создают автоматическим ДНК-синтезом. Поскольку праймеры могут быть сконструированы для гибридизации с любой частью гена, могут быть созданы такие условия, что ошибочные спаривания в спаривании комплементарных оснований могут быть переносимыми. Амплификация этих ошибочно спаренных областей может приводить к синтезу мутагенизированного продукта, приводящему к созданию пептида с новыми свойствами (т. е. сайт-направленному мутагенезу). См. также, например, АшиЬск кирга, С11. 16.

Кроме того, могут быть сконструированы праймеры ПЦР для включения новых сайтов рестрикции или других признаков, таких как терминирующие кодоны на концах амплифицируемого генного сегмента. Это помещение сайтов рестрикции на 5'- и З'-концах амплифицированной последовательности гена позволяет получать сегменты гена, кодирующие полипептид Сап или его фрагмент, являющиеся специально сконструированными для лигирования других последовательностей и/или сайтов клонирования в векторах.

ПЦР и другие способы амплификации РНК и/или ДНК хорошо известны в данной области и могут быть использованы в соответствии с данным изобретением без чрезмерного экспериментирования на основе описания и руководства, представленных здесь. Известные способы амплификации ДНК или РНК включают, но не ограничиваются ими, полимеразную цепную реакцию и родственные способы амплификации (см., например, И.8. ра1еп! Νοκ. 4683195, 4683202, 4800159, 4965188, ίο Ми11щ е! а1.; 4795699 апб 4921794 ίο ТаЬог е! а1.; 5142033 ίο Ιηηίδ; 5122464 ίο νίΠοη е! а1.; 5091310 ίο Ιηηίδ; 5066584 ίο СуПепйеп е! а1.; 4889818 ίο Се1Гаоб еί а1.; 4994370 ίο 8буег еί а1.; 4766067 ίο Βί5\νη5; 4656134 ίο Βίη§ο16; и Ιηηίδ еί а1., ебк., РСК Ρτοίο^Π: А Сшбе ίο Ме11юб аоб АррИстю^) и РНК-опосредованную амплификацию, которая использует антисмысловую РНК относительно последовательности-мишени в качестве матрицы для синтеза двухцепочечной ДНК (патент США № 5130238, Ма1ек еί а1., с товарным названием ΝΑ8ΒΑ); и иммуно-ПЦР, которая комбинирует применение амплификации ДНК с мечением антителом (Ии/1ска еί а1. (1993); 8ηηο еί а1. (1992; 8ηηο еί а1. (1991), полные содержания которых включены в данное описание в качестве ссылки.

Аналогичным образом, биологически активные фрагменты Сап (например, фрагменты любых полипептидов Сап или его изоформ) могут быть получены, как описано выше в отношении мутеинов Сап. Подходящими фрагментами Сап являются фрагменты, которые сохраняют способность белка к связыванию прокаспазы-8 и которые опосредуют биологическую активность Сап или других белков, ассоциированных с каспазой-8, прямо или опосредованно. Альтернативно, подходящими фрагментами Сап являются фрагменты, которые сохраняют способность белка к связыванию прокаспазы-8 и которые могут ингибировать биологическую активность Сап или других белков, ассоциированных с каспазой-8, прямо или опосредованно. Таким образом, могут быть получены фрагменты Сап, которые имеют доминантнонегативное или доминантно-позитивное действие, как это отмечалось выше в отношении мутеинов. Следует отметить, что эти фрагменты представляют особый класс мутеинов согласно изобретению, а именно они являются определенными частями Сап, производными полной последовательности Сап (например, части любого белка Сап или его изоформы), причем каждая такая часть или каждый фрагмент имеет любую из вышеупомянутых желаемых активностей. Такой фрагмент может быть, например, пептидом.

Подобным образом могут быть получены производные посредством стандартных модификаций боковых групп одного или более аминокислотных остатков полипептида Сап, его мутеинов или фрагментов или посредством конъюгации полипептида Сап, его мутеинов или фрагментов с другой молекулой, например антителом, ферментом, рецептором и т.д., которые хорошо известны в данной области. Таким образом, термин производные в применении в данном описании охватывает производные, которые могут быть получены из функциональных групп, встречающихся в качестве боковых цепей на остатках, или Ν- или С-концевых групп с использованием способов, известных в данной области, и они включены

- 18 009956 в данное изобретение. Производные могут иметь химические части молекул, такие как углеводные или фосфатные остатки, при условии, что такая фракция имеет ту же самую или более высокую биологическую активность в сравнении с полипептидом Сап.

Например, производные могут включать алифатические эфиры карбоксильных групп, амиды карбоксильных групп, полученные реакцией с аммиаком или с первичными или вторичными аминами, Νацилпроизводные свободных аминогрупп аминокислотных остатков, образованные с ацильными радикалами (например, алканоильными или карбоциклическими ароильными группами), или 0-ацилпроизводные свободной гидроксильной группы (например, гидроксильной группы остатков серила или треонила), образованные с ацильными радикалами.

Термин производные включает в себя только те производные, которые не изменяют одну аминокислоту на другую из 20 обычно встречающихся природных аминокислот.

Как описано выше, анализы расщепления могут быть использованы для определения того, расщепляются ли полипептид Сап и мутеины каспазой-8.

В варианте данного изобретения сайт расщепления (Ό600) дополнительно определяют получением делеционных мутантов или точковых мутаций Сап и испытанием каждого делеционного или точкового мутанта на их чувствительность к расщеплению каспазой-8, как описано выше. Делеционные мутанты могут быть сконструированы при помощи ПЦР-клонирования желаемых фрагментов испытуемого полипептида с использованием ДНК-последовательности клона, кодирующего указанный испытуемый полипептид, в качестве матрицы. Затем амплифицированные ПЦР фрагменты могут быть встроены в экспрессирующие векторы, посредством чего должны быть обеспечены стартовый кодон АТС и предпочтительно последовательность Козака (Кохак. М, 1984). Дополнительные подробности относительно экспрессии полипептидов могут быть найдены в вышеупомянутой информации фхадеп, касающиеся Нк-меченых белков, а также экспрессии белков вообще. Другой ссылкой относительно экспрессии белков являются также вышеупомянутые Сиггеп! Рго!осок, и в частности глава 16.

Таким образом, сайт расщепления испытуемого полипептида может быть определен получением из него различных делеционных мутантов и определения наименьшего такого делеционного мутанта, который расщепляется каспазой-8.

Другой путь идентификации сайта расщепления использует пептиды, которые получают в соответствии с предсказанной полипептидной последовательностью испытуемого клона. Пептиды можно синтезировать химически, например, как подробно описано в Вобап^хку апб Вобап^хку, Тбе ргасбсе ок рерббе зупШезк, 8рппдег, №\ν Уогк, Ι8ΒΝ 0-387-13471-9, апб Вобап^хку, Тбе рг1пс1р1еь ок рерббе зупШекк, 8рппдег, №\ν Уогк, Ι8ΒΝ 0-387-12359-4. Специальный синтез пептидов по заказу доступен также из нескольких коммерческих компаний, например 8упРер Согр., ПиЬбп, СА И8А, апб Сабкогша Рерббе Векеагсб, 61с., №ра, СА, И8А. Пептиды могут быть также получены либо в виде слияния с другими белками, либо в неслитом состоянии экспрессией рекомбинантной ДНК, кодирующей их, как подробно описано в указанной выше главе 16 Сиггеп! РгоЮсок.

Для использования пептидов для картирования сайта расщепления испытуемого полипептида предсказанную аминокислотную последовательность указанного полипептида делят на зоны и синтезируют пептид, соответствующий каждой зоне. Кроме того, синтезируют пептиды, содержащие приблизительно половину аминокислот одной зоны и смежно содержащие дополнительно приблизительно половину аминскислот непосредственно соседней зоны, так что имеется перекрывание границы между двумя зонами. Зоны содержат 5-100 аминокислот, предпочтительно 9-40 аминокислот и наиболее предпочтительно 20-30 аминокислот. Таким образом, после реакции расщепления они могут анализироваться непосредственно электрофорезом в δΌδ-полиакриламидном геле с УФ-детектированием или визуализацией окрашиванием, например, с использованием Кумасси голубого. Альтернативно, пептиды могут быть мечены для более легкого детектирования, например, изотопным мечением концов (см., например, 8НеусНепко А., е! а1., 1997).

После завершения скрининга пептидов, как описано выше, пептид, который, как теперь известно, содержит сайт расщепления для каспазы-8, может быть исследован дополнительно повторением того же самого способа, но с выбором меньших зон, выбранных из последовательности пептида, который был идентифицирован.

Фактический сайт расщепления пептидов должен соответствовать последовательности расщепления каспазы ΧΧΧΌ (см. Βо1б^η е! а1., Се11 1996 и Мсбокоп е! а1., 1997). Вклад каждой аминокислоты в пептид может оцениваться получением пептидов, которые являются мутированными в одной аминокислоте, и испытанием этих мутированных пептидов на их чувствительность к расщеплению каспазой-8. Аминокислоту, которая должна быть мутирована, предпочтительно заменяют аминокислотой, выбранной из группы, состоящей из заряженных неполярных аминокислот (см. Ьебптдег, Β^осЬеткбу, УоПк, ΝΥ, 1979, глава 4), наиболее предпочтительно выбранной из глицина или аланина.

Посредством мутирования критических аминокислот можно получить пептиды, которые связывают прокаспазу-8, но не являются чувствительными к расщеплению ею. Связывание может быть испытано разделением по размеру комплексов пептид-каспаза-8 при неденатурирующих условиях с использованием электрофореза в акриламидном геле или копреципитацией каспаза-8-специфическими антителами.

- 19 009956

Испытуемый полипептид или его пептидный фрагмент могут быть дополнительно охарактеризованы введением указанного полипептида или пептида в клетку млекопитающего и измерением действия индуцирующих апоптоз реагентов в указанной клетке.

Экспрессия полипептида или пептида Сап в клетке млекопитающего может быть выполнена встраиванием ДНК, кодирующей Сап, в вектор, содержащий промотор, необязательно интронную последовательность и донорный/акцепторный сигналы сплайсинга и дополнительно необязательно содержащий последовательность терминации. Эти способы описаны в общем виде в вышеупомянутых Сиггеп! Рго!осо1к, глава 16.

Вышеуказанные последовательности промотора, интрона и терминации являются функциональными в клетках млекопитающих. Промотор является предпочтительно сильным промотором, таким как вышеуказанный промотор К.8У. СМУ или МР8У. Промотором может быть также ранний промотор 8У40 (Еуегей, е! а1., 1983 и ссылки в этой статье) или клеточный промотор, такой как промотор бета-актина или промотор ЕЬЕ-1 (ТокикЫде, е! а1., 1997). Может использоваться также гибридный промотор, такой как гибрид между оператором 1ас и промотором ЕЬЕ-1 альфа человека, как описано Ебата!ки е! а1., 1997, гибридный промотор СМУ-бета-актина, описанный Α1<η§ί е! а1., 199), или гибрид между операторными последовательностями !е! и промотором СМУ (Еиг1й е! а1., 1994 и ссылки в этой статье).

Последовательности интронов, которые могут быть встроены в виде полных последовательностей, т.е. включающих донорный и акцепторный сайты сплайсинга, могут быть встроены в кодирующую последовательность полипептида, который желательно экспрессировать. Встраивание таких последовательностей интронов может усиливать стабильность РНК и, следовательно, повышать продуцирование желаемого полипептида. Хотя, в принципе, подходящие последовательности интронов могут быть выбраны из любого гена, содержащего интроны, предпочтительными последовательностями интронов являются интрон бета-актина, интрон 8У40 и интрон Т№-рецептора р55.

Последовательность интрона может содержать энхансерные элементы, которые могут усиливать транскрипцию от вышеупомянутых промоторов.

Последовательности интронов могут часто содержать также регуляторные последовательности транскрипции или трансляции, которые придают тканеспецифическую экспрессию. Таким образом, когда желательно экспрессировать полипептид данного изобретения тканеспецифическим образом, такие последовательности интронов могут применяться выгодным образом. Примером интрона, содержащего тканеспецифические энхансерные элементы, является эритроид-специфический энхансер, расположенный в интроне 8 гена 5-аминолевулинатсинтазы 2 человека (8иппуа е! а1., 1998), а обсуждение принципа усиленной продукции белков с использованием последовательностей интронов вместе с примерами интронных последовательностей описано у Ниапд е! а1., 1990.

На 3'-конце ДНК, кодирующей полипептид, который желательно экспрессировать, могут быть добавлены последовательности терминации транскрипции и сигналы полиаденилирования. Такие последовательности могут быть обнаружены во многих генах или даже в большинстве генов. Предпочтительно может быть использован сигнал полиаденилирования 8У40 (8сйек е! а1., 1992 и ссылки в этой статье).

Для экспрессии Сап в клетке млекопитающего мог бы, например, использоваться вектор рс^NΑ3.1 (1пуйгодеп), который содержит промотор СМУ для запуска экспрессии гена, кодирующего желаемый полипептид, и векторы рМР8УЕН с промоторами МР8У.

Рекомбинантные полипептиды могут быть получены либо в бактериальных, либо в эукариотических (например, СНО) культивируемых клетках-хозяевах, трансфицированных векторами, кодирующими такие полипептиды, или в трансгенных животных. При использовании трансгенных животных особенно предпочтительным является получение гетерологичных полипептидов в их молоке. Дающие молоко животные, такие как крупный рогатый скот, овцы и козы, являются, следовательно, предпочтительными хозяевами. См., например, описания патентных заявок ν0 88/00239, ν0 90/05188, ν0 91/02318 и ν0 92/11757 и патенты США 4873191, 4873316 и 5304489, которые включены в данное описание в качестве ссылки в полном объеме.

С использованием рекомбинантной экспрессии тестируемого полипептида полипептид может теперь оцениваться в отношении его действия на сигнал апоптоза, который опосредуется каспазой, например каспазой-8. Для этой цели апоптоз может быть индуцирован либо сверхэкспрессией индуцирующего апоптоз белка, такого как р55 Т№К, белок М0КТ-1, каспаза-8 или их эквивалент; либо активацией сигнала апоптоза запуском ΊΝΕΚ р55, СЭ120а, СЭ95, ΤΚΑМΡ/^Κ3 или эквивалентным рецептором. В одном варианте апоптоз индуцируют сверхэкспрессией ТКТИ р55.

Активация рецептора может быть достигнута также контактированием рецепторов со специфическими лигандами или перекрестным связыванием рецепторов с антителами, предпочтительно поликлональными антителами (см. Епде1тапп е! а1., 1990). В одном варианте сверхэкспрессия Сап сопровождается стимуляцией Еак-лигандом.

Хотя обычно запуск рецептора, подобного СЭ95, Еак-лигандом требует добавления ингибитора белкового синтеза, такого как циклогексимид, для достижения сильного сигнала апоптоза сверхэкспрессия внутриклеточных доменов рецептора или белков, участвующих в передаче сигнала апоптоза, не требуют этого (см. Во1бт е! а1., 1996). В противоположность этому, при проведении стимуляции Еак-лиган

- 20 009956 дом клеток, сверхэкспрессирующих Сап, циклогексимид не требовался для получения сильного сигнала апоптоза. Детектирование апоптоза, время инкубации и другие подробности и параметры этого анализа описаны в указанной выше статье Во1бт с! а1.

Гибель клеток в случае клеток, сверхэкспрессирующих Сап, в сравнении с контрольными клетками может оцениваться любыми способами, такими как способы, основанные на фрагментации ДНК или детектировании апоптозспецифических антигенов и эпитопов. Реагенты и протоколы для детектирования апоптоза в форме наборов являются доступными из вышеупомянутых ВоеЬппдег МаппНспп и других компаний.

Гибель клеток может быть также определена оценкой морфологического вида клеток. Гибель клетки в результате апоптоза характеризуется волнистой клеточной мембраной и сморщиванием клеток в отсутствие лизиса клеток.

Предпочтительно в клетках млекопитающих экспрессируется репортерный ген для обеспечения маркера успешной трансфекции. Когда процедура трансфекции сама приводит к некоторой гибели клеток, в том числе гибели клеток, которые не были трансфицированы, выгодным является оценивать только клетки, которые были трансфицированы. Предпочтительным репортерным геном для этой цели является ОЕР, зеленый флуоресцентный белок, который может быть использован для прямого детектирования без необходимости цветной реакции, этот репортерный ген требует применения флуоресцентного микроскопа. Однако может быть использован любой другой известный репортерный ген, предпочтительно ген, продукты которого легко детектируются с использованием простой цветной реакции, например ген 1;·ι:Ζ легко детектируется инкубацией трансфицированных клеток с Хда1 или подобным реагентом, свидетельствующим об активной бета-галактозидазе, результаты чего могут оцениваться с использованием микроскопа.

Таким образом, с учетом только тех клеток, которые были трансфицированы, т.е. которые экспрессируют репортерный ген, и подсчетом процента клеток, демонстрирующих апоптотическую морфологию, можно оценивать действие конкретного трансфицированного клона и полипептида, экспрессируемого в нем, на апоптоз.

Клетки млекопитающих, используемые для трансфекции и испытания апоптоза, выбирают из клеток НеЬа, хронических миелогенных клеток с морфологией лимфобластов европеоидной расы человека (К562), клеток Т-клеточной лимфомы человека с морфологией лимфобластов (Ни!78), клеток лимфомы Беркитта с морфологией лимфобластов негроидной расы (Кац), клеток Nата1νа лимфомы Беркитта с морфологией лимфобластов человека Ща1т), клеток промиелоцитарного лейкоза с промиелоидной морфологией европеоидной расы человека (НЬ-60), клеток острого лимфобластного лейкоза с морфологией лимфобластов (СЕМ) и Т-клеток с морфологией лимфобластов человека (Е9) и предпочтительно клеток 293 эмбриональных почек человека (НЕК), сверхэкспрессирующих Т-антиген клеток. Трансфекцию предпочтительно выполняют кальций-фосфатным способом, описанным в Сштеп! Рго1осо15 выше. Морфологию клеток оценивают через 1-150 ч после трансфекции, предпочтительно через 4-35 ч и наиболее предпочтительно в течение 24 ч после трансфекции.

Применение вектора для индукции и/или усиления эндогенного продуцирования Сап или ингибитора Сап, обычно молчащего, также рассматривается данным изобретением. Вектор может содержать регуляторные последовательности, функциональные в клетках, в которых желательно зкспрессировать Сап или ингибитор Сап. Такими регуляторными последовательностями могут быть, например, промоторы или энхансеры. Затем регуляторная последовательность может быть введена в правильный локус генома гомологичной рекомбинацией, т. е. функциональным связыванием регуляторной последовательности с геном, экспрессия которого должна быть индуцирована или усилена. Технологию обычно называют активацией эндогенного гена (ЕОА), и она описана, например, в \УО 91/09955.

Специалисту в данной области будет понятно, что можно также подавить экспрессию Сап с использованием того же самого способа, т. е. введением элемента отрицательной регуляции, такого как, например, вызывающий молчание гена элемент, в локус гена Сап, что приводит, следовательно, к отрицательной регуляции или предотвращению экспрессии Сап. Специалисту в данной области будет понятно, что такая отрицательная регуляция или вызывание молчания экспрессии Сап будет оказывать такое же действие, какое оказывает ингибитор Сап, для профилактики и/или лечения заболевания.

Клоны, полученные при скрининге на связывающие каспазу полипептиды по способу данного изобретения, могут быть частичными клонами. Получение полноразмерных клонов, если необходимо, было описано дополнительно выше. ДНК-последовательности полноразмерного клона и частичного клона, первоначально обнаруженного при скрининге согласно данному изобретению, могут найти разнообразные применения.

Например, для манипулирования экспрессией Сап может быть желательным получение антисмысловой РНК в клетке. Для этой цели полную или частичную кДНК, предпочтительно из 9 нуклеотидов, кодирующую полипептид Сап, встраивают в экспрессирующий вектор, содержащий промотор, как отмечалось дополнительно выше. 3'-Конец этой кДНК встраивают посредством этого смежно с 3'-концом промотора, причем 5'-конец кДНК отделен от 3'-конца промотора указанной кДНК. При экспрессии кДНК в клетке получают, следовательно, антисмысловую РНК, которая неспособна кодировать этот по

- 21 009956 липептид. Присутствие антисмысловой РНК в клетке уменьшает экспрессию клеточной (геномной) копии Сап.

Для получения антисмысловой РНК может быть использована полная кДНК. Альтернативно. может быть использован ее фрагмент. который предпочтительно имеет длину 9-2000 нуклеотидов. более предпочтительно 15-500 нуклеотидов и наиболее предпочтительно 20-150 нуклеотидов.

В качестве антисмыслового олигонуклеотида может быть использован синтетический олигонуклеотид. Этим олигонуклеотидом является предпочтительно ДНК-олигонуклеотид. Длина антисмыслового олигонуклеотида равна предпочтительно 9-150. более предпочтительно 12-60 и наиболее предпочтительно 20-50 нуклеотидам. например последовательности 8ЕО ΙΌ ΝΟ: 6 и 8ЕО ΙΌ ΝΟ: 7.

Механизм действия антисмысловой РНК и существующее состояние области применения антисмысловых инструментов рассмотрены в обзоре Китаг е! а1. Μ^с^оЬ^о1. Μо1. Вю1. Кеу. 62. р. 1415-1434. 1998. Применение антисмысловых олигонуклеотидов в ингибировании синтеза рецептора ΒΜΡ было описано Уе11 е! а1.. 1998. Применение антисмысловых олигонуклеотидов для ингибирования синтеза зависимого от напряжения гена калиевого канала Κν1.4 было описано Μе^^^ е! а1.. 1998. Применение антисмысловых олигонуклеотидов для ингибирования синтеза Вс1-х было описано Копбо е! а1.. 1998.

Терапевтическое применение антисмысловых лекарственных средств обсуждается 8ΐίχ 1998. Е1ападап. 1998. Сшпо! апб Τет8атаη^. 1998. и в ссылках в этих статьях.

При конструировании антисмысловых олигонуклеотидов используют обычно модификации олигонуклеотидов. которые усиливают желаемые свойства. Например. используют фосфоротиоатные связи вместо фосфоэфирных связей. природно встречающихся в ДНК. в основном. потому. что такие фосфоротиоатные олигонуклеотиды менее склонны к деградации клеточными ферментами. Репд е! а1. описывают. что нежелательные побочные действия ш νί\Ό фосфоротиоатных олигонуклеотидов могут быть уменьшены при использовании смешанного фосфодиэфирного-фосфоротиоатного скелета. Предпочтительно используют 2'-метоксирибонуклеотидные модификации в 60% олигонуклеотида. Такие модифицированные олигонуклеотиды способны индуцировать антисмысловое действие. сравнимое с действием. наблюдаемым с фосфоротиоатными олигонуклеотидами. Репд е! а1. утверждают далее. что олигонуклеотидные мутеины. неспособные поддерживать активность рибонуклеазы Н. являются неактивными.

Таким образом. предпочтительный антисмысловой олигонуклеотид данного изобретения имеет смешанный фосфодиэфирный-фосфоротиоатный скелет. Наиболее предпочтительно используют 2'-метоксирибонуклеотидные модификации в приблизительно 30-80%. наиболее предпочтительно в приблизительно 60% олигонуклеотида.

В антисмысловой олигонуклеотид может быть введена дополнительная модификация. Например. молекула олигонуклеотида может быть связана с группой. содержащей необязательно частично ненасыщенную алифатическую углеродную цепь и одну или более полярных или заряженных групп. таких как карбоксильные группы. сложноэфирные группы и спиртовые группы. Альтернативно. олигонуклеотиды могут быть связаны с пептидными структурами. которые предпочтительно являются мембранотропными пептидами. Такие модифицированные олигонуклеотиды легче проникают через мембраны. что является решающим для их функции. и могут. следовательно. значительно повышать их активность. Проницаемость мембраны является особенно желательной для антисмысловых лекарственных средств. которые предпочтительно должны достигать головного мозга. Пальмитилсвязанные олигонуклеотиды были описаны Сег§!ег е! а1.. 1998. Гераниолсвязанные олигонуклеотиды были описаны 81юр е! а1.. 1998. Олигонуклеотиды. связанные с пептидами. например мембранотропными пептидами. и их получение были описаны 8оиксЬагеип е! а1.. 1998. Модификации антисмысловых молекул или других лекарственных средств. которые нацеливают такую молекулу на определенные клетки и усиливают поглощение олигонуклеотида указанными клетками. описаны Уапд. 1.. 1998.

С использованием известной последовательности мРНК гена могут быть сконструированы рибозимы. которые являются молекулой РНК. специфически связывающей и расщепляющей указанную молекулу мРНК (см.. например. Сйеп е! а1.. 2Рао апб Рюк. 1993. 81юге е! а1.. 1993. ЛоьерН апб Вигке. 1993. 8Ытауата е! а1.. Сап!ог е! а1.. 1993).

Таким образом. может быть сконструирована кодирующая рибозим последовательность РНК. которая расщепляет мРНК полипептида Сап данного изобретения. Точка расщепления предпочтительно находится в кодирующей области или в 5'-нетранслируемой области. более предпочтительно в 5'-части кодирующей области вблизи стартового кодона трансляция АИС.

ДНК. кодирующая рибозим. в соответствии с данным изобретением может быть введена в клетки посредством поглощения ДНК. поглощения модифицированной ДНК (см. модификации олигонуклеотидов и белков. которые приводят к повышенной проницаемости через мембраны. как описано здесь ниже) или с использованием переноса гена. опосредованного вирусным вектором. как описано подробно ниже.

Таким образом. данное изобретение представляет Сап. его производные пептиды. мутанты. специфические антитела. ДНК. кодирующую белок. рибозим. антисмысловые молекулы ДНК и олигонуклеотиды. Терапевтическое или связанное с научно-исследовательской работой применение этих инструментов требует введения в клетки живого организма. Для этой цели желательно улучшить проницаемость через мембраны пептидов. полипептидов и олигонуклеотидов. В создании пептидов и полипептидов с

- 22 009956 увеличенной проницаемостью мембран может быть использована дериватизация липофильными структурами. Например, к последовательности пептида или полипептида может быть добавлена последовательность известного мембранотропного пептида, как указывалось выше. Далее, пептид или полипептид может быть дериватизован частично липофильными структурами, такими как вышеупомянутые углеводородные цепи, которые замещены по меньшей мере одной полярной или заряженной группой. Например, лауроилпроизводные пептидов были описаны МигаиНЫ с1 а1., 1991. Дополнительные модификации пептидов и полипептидов включают окисление остатков метионина для создания посредством этого сульфоксидных групп, как описано 2ае11апа с1 а1., 1991. 2ае11апа с1 а1. описывают также пептид или производные, в которых относительно гидрофобная пептидная связь заменена ее сложным кетометиленовым изоэфиром (СОСН2). Эти и другие модификации, известные специалистам в области химии полипептидов и пептидов, усиливают проницаемость через мембраны.

Другим путем усиления мембранной проницаемости является применение рецепторов, таких как рецепторы вирусов, на клеточных поверхностях для индукции клеточного поглощения пептида или полипептида. Этот механизм используется часто вирусами, которые специфически связываются с определенными молекулами клеточной поверхности. После связывания клетка поглощает этот вирус в свое внутреннее пространство. Такую молекулу клеточной поверхности называют рецептором вируса. Например, молекулы интегринов САК и АбУ были описаны в качестве рецепторов вирусов для аденовируса, см. Нешт1 с1 а1., 1998 и ссылки в этой статье. Молекулы СЭ4. СРК1, СРК15 и 8ТКЬ33 были идентифицированы как рецепторы/корецепторы для ВИЧ, см. Ебтдег е1 а1., 1998 и ссылки в этой статье.

Таким образом, конъюгация пептидов, полипептидов или олигонуклеотидов с молекулами, о которых известно, что они связываются с рецепторами клеточной поверхности, будет усиливать мембранную проницаемость указанных пептидов, полипептидов или олигонуклеотидов. Примерами подходящих групп для образования конъюгатов являются сахара, витамины, гормоны, цитокины, трансферрин, асиалогликопротеин и подобные им молекулы. Ьо\\· е1 а1., И8Р 5108921, описывают применение указанных молекул для цели усиления мембранной проницаемости пептидов, полипептидов и олигонуклеотидов и получение указанных конъюгатов.

Кроме того, Ьо\\· е1 а1. утверждают, что такие молекулы, как фолат или биотин, могут быть использованы для нацеливания конъюгата на множество клеток в организме вследствие обильной и неспецифической экспрессии рецепторов для этих молекул.

Описанное выше применение белков клеточной поверхности для увеличения мембранной проницаемости пептида, полипептида или олигонуклеотида данного изобретения может быть также использовано в нацеливании указанных пептида, полипептида или олигонуклеотида данного изобретения на определенные типы клеток или ткани. Например, если желательным является нацеливание на раковые клетки, предпочтительно использовать белок клеточной поверхности, который экспрессируется более обильно на поверхности этих клеток. Примерами являются рецептор фолата, антигены муцина МИС1, МИС2, МИС3, МИС4, МиС5АС, МиС5В и МиС7, гликопротеиновые антигены К8А, канцероэмбриональный антиген, простатаспецифический мембранный антиген (Р8МА), НЕК-2/пеи и хорионический гонадотропин-бета человека. Вышеуказанная статья \Уаид е1 а1., 1998 сообщает о применении фолата для нацеливания на раковые клетки и Ζ1ιηη§ е1 а1., 1998 сообщают об относительном изобилии каждого из других указанных выше антигенов в различных типах злокачественных опухолей и в нормальных клетках.

Таким образом, полипептид, пептид или олигонуклеотид данного изобретения может быть, с использованием вышеописанных способов конъюгации, нацелен на определенный тип клеток, если желательно. Например, если желательно усилить апоптоз в клетках лимфоцитарного направления дифференцировки, пептид Сап, его фрагмент, мутанты и производные согласно изобретению могут быть нацелены на такие клетки, например, с использованием молекул МНС класса ΙΙ, которые экспрессируются на этих клетках. Это может быть достигнуто связыванием антитела или его антигенсвязывающего сайта, направленного против константной области указанной молекулы МНС класса ΙΙ, с полипептидом или пептидом данного изобретения. Кроме того, были описаны многочисленные рецепторы клеточной поверхности для различных цитокинов и других коммуникационных молекул клетки, и многие из этих молекул экспрессируются более или менее ограниченным типом ткани или типом клеток образом. Таким образом, когда желательным является нацеливание на подгруппу Т-клеток, молекула СИ4 Т-клеточной поверхности может быть использована для получения конъюгата согласно изобретению. СИ4-связывающие молекулы обеспечиваются вирусом ВИЧ, поверхностный антиген др42 которого способен специфически связываться с молекулой СИ4. Усиливающий апоптоз Сап, мутант или пептид данного изобретения может быть преимущественно нацелен на Т-клетки при лечении пациента, который страдает от аутоиммунных реакций, основанных на Т-клетках, такого как пациент с системной красной волчанкой.

Полипептиды, пептиды и антисмысловые последовательности данного изобретения могут вводиться в клетки с использованием вирусного вектора. Применение в качестве вектора вируса коровьей оспы подробно описано в вышеупомянутой главе 16 СиггепЕ РгоЕосок ίη Мо1еси1аг Вю1оду. Применение аденовирусных векторов описано, например, Тео1 еЕ а1., 1998, Νηπιιηί еЕ а1., 1998, Ребегюн еЕ а1., 1998, СиаидЬт еЕ а1., 1998, и приведенных в них ссылках, И18Ыба еЕ а1., 1998, ЗстуагхеиЬегдег еЕ а1., 1998, и Сао еЕ а1., 1998. Ретровирусный перенос антисмысловых последовательностей был описан Иаше1 еЕ а1., 1998.

- 23 009956

Для лечения и/или профилактики заболеваний, в которых участвует Сап, генотерапевтический вектор, содержащий последовательность ингибитора Сап, если требуется ингибирование апоптоза, или альтернативно содержащий последовательность Сап, если требуется усиление апоптоза, для ингибирования или индуцирования продуцирования и/или активности Сап, соответственно, может быть инъецирован непосредственно, например, в больной сустав, что позволяет избежать проблем, связанных с системным введением генотерапевтических векторов, таких как разбавление векторов, достижение клеток или тканей-мишеней и нацеливание на клетки или ткани-мишени и побочные действия.

При применении вирусов в качестве векторов обычно используют вирусные поверхностные белки для нацеливания вируса. Поскольку многие вирусы, такие как вышеупомянутый аденовирус, являются довольно неспецифичными в их клеточном тропизме, может быть желательным придание им дополнительной специфичности с использованием клеточноспецифического или тканеспецифического промотора. СпксеШ е1 а1., 1998 сообщают о применении специфического для желудочков промотора легкой цепи кардиомиозина для кардиоспецифического нацеливания гена, перенос которого опосредуется аденовирусом.

Альтернативно, может быть сконструирован вирусный вектор для экспрессии дополнительного белка на его поверхности, или поверхностный белок вирусного вектора может быть изменен включением желательной пептидной последовательности. Таким образом может быть сконструирован вирусный вектор для экспрессии одного или более дополнительных эпитопов, которые могут быть использованы для нацеливания указанного вирусного вектора. Например, эпитопы цитокинов, МНС класс 11-связывающие пептиды или эпитопы, производные хоминг-молекул, могут быть использованы для нацеливания вирусного вектора в соответствии с данным изобретением.

Таким образом, Сап может быть использован для генотерапии посредством уменьшения или увеличения эндогенного количества Сап в желательном месте организма пациента-человека.

Взаимодействие Сап с каспазой-8 имеет несколько возможных последствий.

Во-первых, происходит модуляция апоптоза. Это демонстрируется в данной работе в анализе ш νίνο, в котором сверхэкспрессируемый Сап усиливает апоптоз, индуцируемый сверхэкспрессией р55'ТЫЕК, сверхэкспрессией р72 или стимуляцией Еак-лигандом. В одном варианте было показано, что нерасщепляемый мутант р72 Э600Е является более сильнодействующим в потенциировании Еак-лигандом гибели клеток, чем Сап дикого типа. Одним из возможных объяснений этого результата может быть то, что Сап участвует в превращении прокаспазы-8 в активную каспазу-8. Таким образом, нерасщепляемый Сап будет непрерывно индуцировать превращение прокаспазы-8 в активную каспазу-8 и увеличивать апоптоз, в отличие от Сап дикого типа, который может прогрессирующим образом расщепляться и инактивироваться активной каспазой-8. Сап имеет мотивы связывания РНК, и, следовательно, механизм его действия может включать в себя изменения в скорости трансляции и/или оборота различных мРНКтранскриптов, которые затем влияют на экспрессию ключевых белков, участвующих в модуляции гибели клеток.

Во-вторых, активность Сап может модулироваться. Это демонстрируется в данной работе способностью каспазы-8 расщеплять Сап. Вероятным является то, что Сап инактивируется расщеплением. Однако возможно также, что активность Сап изменяется, что происходит индукция новых активностей или что полипептид Сап активируется расщеплением, как и сами каспазы.

Таким образом, Сап, мутанты, предпочтительно мутант Сап/р72 Э600Е, пептиды, например домен связывания каспазы-8 в Сап, содержащий аминокислотные остатки 414-437 (8ЕЦ ΙΌ N0: 4) и остатки 422-437 (8ЕЦ ΙΌ N0: 5), олигонуклеотиды, такие как антисмысловая последовательность Сап, и специфические антитела против Сап применимы в модуляции активности каспазы-8 и апоптоза.

Понижающая регуляция каспазы-8 является желательной в ситуациях, когда имеет место избыточная гибель клеток. Например, в воспалительных заболеваниях, таких как рассеянный склероз с первичной олигодендроглиопатией, аутоиммунный увеоретинит, диабет, системная красная волчанка, аутоиммунный миокардит I, острая печеночная недостаточность независимо от этиологии, НСУ-опосредованный хронический гепатит, хронический гастрит, например гастрит типа А, смешанная соединительнотканная болезнь (МСТО), болезнь Крона и язвенный колит, предполагается, что разрушение ткани организма вызывается сигналами апоптоза. Таким образом, может быть полезным для пациентов, страдающих от этих заболеваний, модулировать понижающим образом активность каспазы-8 в клетках, которые разрушаются посредством апоптотической гибели клеток.

Подобным образом, пептиды или полипептиды данного изобретения, такие как Сап 414-437 и Сап 422-437, могут быть нацелены на другой тип клеток, участвующий в других заболеваниях, перечисленных выше, и других заболеваниях, где было показано, что избыточная апоптотическая гибель клеток опосредует повреждение в наблюдаемой ткани тела.

Повышающая регуляция активности каспазы-8 и усиление апоптоза полипептидом Сап могут использоваться в ситуациях, когда требуется избыточная гибель клеток.

Например, в случае вышеупомянутой олигодендропатии желательным является ингибирование активности каспазы-8 в олигодендроцитах. Рецептор фосфолипида-лизофосфатидной кислоты, связанной с С-белком клеточной поверхности, экспрессируется в олигодендроцитах и в различных других клетках головного мозга, но не в других тканях тела. Поскольку в одном из вариантов было показано, что пути

- 24 009956 передачи сигнала ΤΝΡ-рецептора или каспаза-8-зависимый апоптоз требует активности Сап, небольшой пептид Сап, например полипептид Сап из 24 аминокислот (Сап 414-437), который, как было обнаружено, связывает каспазу-8, может быть нацелен на олигодендроциты для ингибирования апоптоза, опосредованного каспазой-8. Это может достигаться либо связыванием указанного пептида или полипептида с фосфолипидом-лизофосфатидной кислотой, либо введением последовательности антитела, которое специфически узнает указанный рецептор фосфолипида-лизофосфатидной кислоты, в вирусный вектор, так что указанный вирусный вектор связывается с указанным рецептором фосфолипида-лизофосфатидной кислоты.

Антисмысловая РНК, антисмысловой олигонуклеотид с последовательностями, производными кДНК Сап человека, такими как ААСАССАΤААССΤАСАССΤСС (1169-1190) (8ЕЦ ΙΌ ΝΟ: 6), и/или из 3'-нетранслируемого района ААΤСАССААСССΤСССΤССАС (3' 26-47 п.н.) (8ЕЦ ΙΌ ΝΟ: 7), и рибозим данного изобретения могут быть нацелены подобным образом на вышеописанные олигодендроциты или соответствующие клетки при других заболеваниях. В этом случае ингибируется экспрессия полипептида Сап, а не экспрессия самой каспазы-8. Ингибирование экспрессии Сап может уменьшать апоптотическое действие каспазы-8. Однако уменьшение экспрессии полипептидов Сап может фактически увеличивать действие каспазы-8, так как некоторые эндогенные полипептиды Сап способны действовать в качестве негативного регулятора активности каспазы-8. Таким образом, эффект применения антисмысловых олигонуклеотидов и антисмысловых РНК и рибозимов должен быть сначала испытан, например, в описанном выше анализе, перед рассмотрением применения таких агентов для лечения.

С другой стороны, имеются определенные ситуации, в которых может быть желательным увеличение активности каспазы-8. Это может иметь место при том же самом заболевании, как упоминалось выше, например в случае системной красной волчанки. Однако типы клеток, на которые должно проводиться нацеливание, являются другими. Например, в случае системной красной волчанки популяция Тклеток может содержать аутореактивные клетки, которые не разрушаются в вилочковой железе. Таким образом, агент повышающей регуляции каспазы-8 данного изобретения должен быть нацелен на Тклетки. Предпочтительно нацеливать агент повышающей регуляции каспазы-8 на аутореактивные клетки. В некоторых заболеваниях, таких как рассеянный склероз, некоторые клоны Т-клеток играют предположительно критическую роль в развитии заболевания. Таким образом, положительно регулирующий каспазу-8 агент согласно изобретению может быть нацелен на такие клетки с использованием одного или более антител, специфически направленных на вариабельную область Т-клеточного рецептора аутореактивных Т-клеточных клонов, для нацеливания положительно регулирующего каспазу-8 агента данного изобретения, которым может быть полипептид Сап, мутанты или пептид в соответствии с данным изобретением.

Увеличение активности каспазы-8 и апоптоза при помощи Сап могут быть использованы для лечения рака.

Данное изобретение относится к фармацевтическим композициям, содержащим активное вещество, выбранное из одного или более следующих веществ: полипептида Сап, мутантов, предпочтительно р72 0600Е, пептида, такого как пептид, содержащий аминокислотные остатки 414-437 (8ЕЦ Ш ΝΟ: 4) и аминокислотные остатки 422-437 (8ЕЦ Ш ΝΟ: 5), векторов, кодирующих такие Сап, его мутеины и фрагменты, антитела, специфического для Сап, рибозима, антисмысловой РНК или антисмыслового олигонуклеотида в соответствии с данным изобретением.

Терапевтически эффективные количества активного белка (белков) будут функцией многих переменных, например пути введения, клинического состояния пациента.

Терапевтически эффективным количеством является такое количество, которое при введении Сап или его антагониста проявляет биологическую активность. Доза, вводимая в виде однократной или многократных доз индивидууму, будет варьироваться в зависимости от различных факторов, в том числе фармакокинетических свойств, пути введения, состояния и характеристик пациента (пола, возраста, веса тела, здоровья, размера), степени симптомов, сопутствующего лечения, частоты введения и желаемого эффекта. Коррекция и манипуляция установленных диапазонов доз находятся вполне в рамках компетентности специалистов в данной области, так же, как и способы ш νίΙΐΌ и шу1уо определения действия в индивидууме.

Далее, данное изобретение относится к фармацевтическим композициям, содержащим вирусный вектор, способный инфицировать клетки млекопитающих, причем указанный вектор содержит функционально связанные промотор и ДНК-последовательность данного изобретения, кодирующую Сап, мутанты (например, р72 0600Е), пептид (например, Сап 414-437 или Сап 422-437), рибозим, антисмысловую РНК, антисмысловой олигонуклеотид или антитело Сап в соответствии с данным изобретением. Вирусный вектор может необязательно содержать кодирующую последовательность, функционально связанную с промотором, которая кодирует пептид или белок, локализованный на поверхности вируса и который способен связывать поверхностный белок клетки млекопитающего. Поверхностный белок предпочтительно является белком, который обеспечивает поглощение вирусного вектора и предпочтительно экспрессируется тканеспецифическим или специфическим для типа клеток образом, так что он способен обеспечить нацеливание вирусного вектора.

- 25 009956

Сап, его мутеины, фрагменты или производные, мутант р72 О600Е, пептиды Сап 414-437 или Сап 422-437, рибозим, антисмысловая РНК, антисмысловой олигонуклеотид или антитело Сап в соответствии с данным изобретением могут быть также использованы для выделения, идентификации и клонирования других полипептидов того же самого класса, т.е. полипептидов, связывающихся с каспазой-8, или для выделения функционально родственных протеаз или белков, участвующих в процессах внутриклеточной передачи сигнала.

Для этой цели может быть использована описанная выше система иммунопреципитации или может быть использована разработанная система, использующая гибридизацию по Саузерну в нежестких условиях с последующим ПЦР-клонированием (Айкк е! а1., 1989). В публикации А11кк е! а1. описаны идентификация и клонирование двух предположительных протеинтирозинкиназ посредством применения нежестких условий гибридизации по Саузерну с последующим клонированием при помощи ПЦР на основе известной последовательности мотива киназы, рассматриваемой последовательности киназы. Этот подход может быть использован в соответствии с данным изобретением с применением последовательности полипептида Сап для идентификации и клонирования родственных Сап полипептидов.

Другой подход использования полипептида Сап, его мутеинов, фрагментов или производных или антител Сап данного изобретения заключается в применении их в способах аффинной хроматографии для выделения и идентификации других полипептидов или факторов, с которыми они способны связываться, например других полипептидов или факторов, участвующих в процессе внутриклеточной передачи сигнала. Сап, его мутеины, фрагменты или производные, антитела Сап могут быть индивидуально присоединены к матриксам для аффинной хроматографии и затем приведены в контакт с клеточными экстрактами, жидкостями человека или выделенными полипептидами или факторами, предположительно участвующими в процессе внутриклеточной передачи сигнала. После проведения процедуры аффинной хроматографии другие полипептиды или факторы, которые связываются с полипептидом Сап или его мутеинами, фрагментами или производными данного изобретения, могут быть элюированы, выделены и охарактеризованы.

Данное изобретение относится также к применению Сап и его пептидов, таких как домен связывания каспазы-8 в Сап (остатки 414-437 или остатки 422-437), или антител Сап для получения молекулантагонистов Сап, имеющих потенциальную терапевтическую ценность. Эти способы включают использование Сап и его фрагментов для выделения природных антагонистов, малых пептидных антагонистов и непептидных химических антагонистов. Высокопроизводительный скрининг использует роботов для тестирования связывающей активности тысяч соединений (пептидов или химических соединений, например, созданных комбинаторной химией) в отношении мишени-Сап. Тестируемые соединения могут быть получены не только посредством комбинаторной химии, но также из других высокопроизводительных способов синтеза. Автоматизированные способы позволяют осуществить быстрый синтез библиотек молекул, больших коллекций отдельных соединений, которые могут быть подвергнуты скринингу. Соединения могут быть также подвергнуты скринингу на ингибирование взаимодействия Сап или Сап (414-437) и каспазы-8. Антагонистические молекулы могут быть детектированы по их способности ингибировать связывание Сап с прокаспазой-8 или по ингибированию гибели клеток, опосредованной Сап, каспазой-8 или лигандами семейства ΤΝΡ-рецепторов. Получение более крупных и более разнообразных библиотек соединений увеличивает вероятность открытия применимого лекарственного средства в такой библиотеке.

Как отмечалось выше, Сап, его мутеины, фрагменты или производные могут быть также использованы в качестве иммуногенов (антигенов) для получения специфических антител к ним. Эти антитела могут быть также использованы для целей очистки полипептида Сап либо из клеточных экстрактов, либо из среды трансформированных клеточных линий, продуцирующих полипептид Сап или его мутеины или фрагменты. Далее, эти антитела могут быть использованы для диагностических целей для идентификации нарушений, связанных с аномальным функционированием опосредуемой каспазой-8 системы Рак или ΤΝΡ. Таким образом, если такие нарушения связаны с нарушением функционирования внутриклеточной системы передачи сигнала, включающей в себя каспазу-8 или полипептид Сап, такие антитела могли бы служить в качестве важного диагностического инструмента. Такие антитела, полученные с использованием Сап, особенно полностью гуманизированные антитела (например, интратела, см. выше), могут также иметь терапевтическую ценность.

Следует также отметить, что выделение, идентификацию и характеристику полипептида данного изобретения или полипептида того же класса можно выполнять с использованием любой из хорошо известных стандартных процедур скрининга. Например, одной из таких процедур является дрожжевая двухгибридная процедура (см. §!апдет е! а1., 1995). Также, как отмечается выше и ниже, могут быть использованы другие процедуры, такие как аффинная хроматография, процедуры гибридизации ДНК и т.д., как хорошо известно в данной области, для выделения, идентификации и характеристики полипептида данного изобретения или для выделения, идентификации и характеристики дополнительных полипептидов, факторов, рецепторов и т.д., которые способны связываться с полипептидами данного изобретения.

Теперь после описания данного изобретения оно будет более легко понято со ссылкой на следующие примеры, которые приведены в качестве иллюстрации и не предназначены для ограничения данного

- 26 009956 изобретения.

Примеры

Пример 1. Иммунизация мышей для получения моноклональных антител, специфических в отношении каспазы-8.

После активации каспазу-8 расщепляют и собирают в виде двух субъединиц (8иЬ-1 и 8иЬ-2).

Для получения антител, специфических в отношении новых возможных эпитопов, образованных после активации каспазы-8, синтетические пептиды, производные С-конца 8иЬ-1 и Ν-конца 8иЬ-1 и 8иЬ2, использовали для иммунизации мышей.

Следующие пептиды использовали для иммунизации мышей с целью получения моноклональных антител.

Пептид 179 - пептид ΟΟΟΟΝΥΟΚΟΙΡνΕΤΟ, соответствующий С-концу большой субъединицы каспазы-8 (8иЬ-1, эпитоп, соответствующий остаткам Сук360-Акр374 фиг. 1), синтезировали, очищали обращенно-фазовой ВЭЖХ и связывали с носителем КЬН через его природный цистеин для экспонирования этого пептида относительно поверхности носителя.

Пептид 182 - пептид Ε^δΡΟΤΡΥΙΡΟΕΑΟΟ, соответствующий Ν-концу малой субъединицы каспазы-8 (8иЬ-2, остатки Ьук385-61у399), синтезировали, очищали обращенно-фазовой ВЭЖХ и связывали с носителем КЬН через С, который не является производным последовательности 8иЬ-2.

Пептид 183 - пептид δΕδΟ^-ΟΡΑΥΟΜΕ^Ε-ΡΗΓ’, соответствующий Ν-концу 8иЬ-1 (остатки 8ег217О1у234), синтезировали, очищали обращенно-фазовой ВЭЖХ и связывали с носителем КЬН через С, который не является производным последовательности 8иЬ-1.

Четыре иммунизации и две бустер-иммунизации тем же самым количеством антигена (пептидКЬН) проводили с мышами следующим образом.

При первой иммунизации 50 мкг комплекса пептид-КЬН растворяли в 50 мкл РВ8, и гомогенизировали с 50 мкл полного адъюванта Фрейнда, и инъецировали в подошву лапки каждой из пяти 7-недельных самок мышей Ва1Ь/С.

Для второй иммунизации, проводимой спустя 2 недели после первой иммунизации, мышам внутримышечно делали бустер-инъекцию такого же количества пептида в 50% (об./об.) растворе неполного адъюванта Фрейнда.

Для третьей иммунизации, проводимой спустя 2 недели после второй иммунизации, мышам инъецировали внутрибрюшинно 50 мкг пептид-КЬН в 50 мкл РВ8.

Сыворотки инъецированных мышей тестировали спустя 10 дней после второй и третьей иммунизаций.

Четвертую иммунизацию (проводимую только для пептидов 182 и 183) выполняли спустя 1 месяц таким же образом, как и третью иммунизацию.

Спустя 1 месяц после четвертой иммунизации (или третьей иммунизации для мышей, которым вводили пептид 179) проводили две бустер-инъекции (подобно третьей и четвертой иммунизациям) с 2дневным интервалом.

Спустя 4 дня после этого селезенку и паховые лимфатические узлы двух мышей, проявляющих наивысшую специфическую иммунореактивность, извлекали для слияния с миеломными клетками (Екййаг Ζ., 1985).

Пример 2. Иммунизация кроликов для получения поликлональных антител, специфических в отношении каспазы-8.

Кроликов иммунизировали 179-КЬН и 183-КЬН для получения специфических поликлональных антител.

Первую иммунизацию проводили с использованием 100 мкг пептид-КЬН, которые растворяли в 50 мкл РВ8, и гомогенизировали с 50 мкл полного адъюванта Фрейнда, и инъецировали подкожно. Вторую иммунизацию проводили спустя 2 недели тем же самым количеством пептид-КЬН и инъецировали внутримышечно спустя 2 недели с неполным адъювантом Фрейнда. После этих двух иммунизаций следовали две бустер-инъекции тем же самым количеством пептид-КЬН, растворенным в РВ8 и вводимым подкожно с 2-дневным интервалом.

Пример 3. Получение гибридомы, отбор продуцирующих антитела клонов и очистка антител из асцитных жидкостей.

Процесс слияния и отбор гибридомных клеток выполняли согласно протоколам Екййаг Ζ., 1985. Вкратце, смесь клеток селезенки и лимфатических узлов из двух иммунореактивных мышей 110х10⁶ сливали с 32х10⁶ клеток миеломы варианта миеломы Ν8Ο/1 посредством кратковременной инкубации с ПЭГ. ПЭГ сначала медленно разбавляли ЭМЕМ и затем полностью удаляли центрифугированием. Эти клетки ресуспендировали в среде ЭМЕМ-НАТ, распределяли в 96-луночные планшеты при концентрации приблизительно 2,5 х10⁴ клеток на лунку и инкубировали в термостате с 8% СО₂ при 37°С. Среду во всех лунках с гибридомами заменяли на ЭМЕМ, дополненную 10% лошадиной сывороткой (Н8). Пробы супернатантов гибридомных культур подвергали скринингу на присутствие специфических тАЬ спустя 2 недели после слияния с использованием анализа ЕЬ18А (описанного в примере 12 ниже). Клетки из лунок, в которых присутствие специфических антител было детектировано в культуральном супернатан

- 27 009956 те, переносили в 24-луночные планшеты. Положительные клетки субклонировали дважды; на этой стадии было обнаружено, что все эти субклоны являются положительными. Эти клоны размножали в 24 лунках и затем в Т-колбах 25 см². Размноженные культуры подвергали мониторингу на секрецию специфических тАЬ. Ампулы клеток положительных культур замораживали и хранили в жидком азоте.

Из приблизительно 700 клонов, подвергнутых скринингу для детектирования специфических антител к пептиду 179, был обнаружен только один положительный клон (тАЬ 179); из 700 клонов, подвергнутых скринингу для детектирования специфических антител к пептиду 182, был обнаружен только один положительный клон (тАЬ 182), и из 1100 клонов, подвергнутых скринингу для детектирования специфических антител к пептиду 183, были обнаружены два положительных клона (тАЬ 183.1 и 183.2). Положительные клоны субклонировали с использованием лимитирующего разведения в 96-луночных планшетах. Супернатанты из растущих клонов тестировали несколько раз на специфические антитела при помощи ЕЬ18А (описано в примере 12).

Положительные гибридомные клоны выращивали в колбах для культуры ткани в ЭМЕМ, содержащей 15% лошадиную сыворотку, и ампулы замораживали из части этих культур. Параллельно клетки различных гибридомных клонов инъецировали, в каждом случае в 2-4 мыши, для получения асцитных жидкостей. Антитела очищали из асцитной жидкости аффинной очисткой с использованием гранул аГПде1 (АГйде1 15 Вюгаб), сшитых с БСА (Р1егсе Са! 77116), связанных с синтетическим пептидом, используемым: для иммунизации мышей (пептидом 179, 182 или 183).

Для очистки антител асциты, осажденные 50% сульфатом аммония, диализовали против РВ8 в течение 16 при 0°С. После диализа аликвоты инкубировали с 1 мл гранул аГйде1-БСА-пептид в течение 16 ч при 0°С и эти предынкубированные гранулы использовали для упаковки 1 мл колонки. Сначала колонку промывали 10 мл РВ8 с последующей промывкой 10 мМ Трис рН 7,5, содержащим 1М №С1, и промывкой РВ8. Антитела элюировали из колонки раствором, содержащим 100 мМ глицин-НС1 рН 2,7 и 0,5М №С1. Фракции 1 мл собирали в пробирки, содержащие 40 мкл Трис-основания для нейтрализации элюента. Из 25 мл асцита получали приблизительно 5-13,6 мг очищенных антител.

Пример 4. Изотип моноклональных антител.

Изотип моноклональных антител определяли с использованием коммерческого набора для изотипирования (ЪоиШегп Вю!есЬпо1оду Аккоаа!ек, ШС са! 5300-05) в соответствии с процедурой анализа изготовителя. тАЬ 183 и 179 были идентифицированы как 1дС1, тогда как тАЬ 182 было идентифицировано как антитело класса 1дМ.

Пример 5. Иммунопреципитация каспазы-8 при помощи тАЬ 179, 182 и 183.

Различные моноклональные антитела против каспазы-8, описанные в примере 3 выше, тестировали на их способность иммунопреципитировать каспазу-8 (см. пример 13 ниже) из лизатов покоящихся и активированных клеток В_)аЬ. Линия В_)аЬ является непрерывной линией клеток лимфомы, полученной из Африканской разновидности лимфомы Беркитта (С1етеп!к СВ е! а1. 1975).

Клетки В_)аЬ стимулировали Рак-лигандом в течение 1 ч. Клеточные лизаты получали из клеток В_)аЬ до и после стимуляции. После иммунопреципитации с использованием тАЬ 179, 182 и 183 (как описано в примере 13) истощенный лизат и каспазу-8, элюированную соответствующими пептидами, анализировали электрофорезом в 8Э8-ПААГ и окрашиванием серебром или Вестерн-блот-анализом с использованием анти-8иЬ-1-антитела в качестве первого антитела (Се11 81дпа1шд ТесЬпо1оду Сакраке-8 1С12 Са! 9746).

Фиг. 2 показывает Вестерн-блот-анализ (выполняемый, как описано в примере 11 ниже) тотальных клеточных экстрактов и истощенных лизатов, полученных после иммунопреципитации с использованием тАЬ 179, 183.1 и 183.2 и 182.

В нестимулированных клетках (дорожки 2, 4, 6, 8 и 10) детектировали дублет полос, соответствующий изоформам α1 и α2 прокаспазы-8 (прокаспазы-8 53/55 кДа), в тотальных клеточных экстрактах (дорожка 2) и в истощенных лизатах, полученных с анти-183- и анти-182-антителами (дорожки 6, 8 и 10), в противоположность этому, прокаспазу-8 не детектировали в истощенных лизатах, полученных с тАЬ 179 (дорожка 4). Эти результаты показывают, что тАЬ 179 иммунопреципитирует прокаспазу-8.

В стимулированных клетках уровни прокаспазы-8 в целом клеточном экстракте были более низкими (дорожка 1). Дополнительные меньшие полосы, соответствующие фрагментам активированной каспазы-8, появлялись после активации, т.е. дублет частично процессированной каспазы-8, соответствующий изоформам α1 и α2 (частично процессированной каспазы-8 р 41/43 без 8иЬ-2), и меньшая полоса, соответствующая 8иЬ-1 (р 20). Истощение незначительных количеств прокаспазы-8 и фрагментов активированной каспазы-8 с использованием тАЬ тестировали на лизатах стимулированных Рак-лигандом клеток (фиг. 2, дорожки 3, 5, 7, 9 и 11).

Следует отметить, что истощение 8иЬ-1 с использованием тАЬ 182, специфического к 8иЬ-2, также тестировали, так как активированная каспаза-8 содержит 8иЬ-1, связанную с 8иЬ-2, и, следовательно, удаление 8иЬ-2 иммунопреципитацией с использованием тАЬ 182 должно в результате приводить к истощению 8иЬ-1.

Иммунопреципитация каспазы-8 из стимулированных клеточных лизатов показывает, что тАЬ 182,

- 28 009956

183.1 и 183.2, так же, как и контроль сыворотки нормальных мышей (фиг. 2, дорожка 11), не удаляли небольшие количества оставшейся прокаспазы-3 или активных фрагментов каспазы-8 (дорожки 9, 7, 5 и 11, соответственно). В противоположность этим результатам, обработка клеточных лизатов шЛЬ 179 (дорожка 3) эффективно удаляла всю прокаспазу-8, а также активные фрагменты каспазы-8.

Фиг. 3а (Вестерн-блот-анализ) и 3Ь (детектирование белка окрашиванием серебром) показывают, что иммунопреципитированные прокаспаза-8 и активные фрагменты каспазы-8 с использованием антител тАЬ 179, 182 и 183.1 и 183.2 могли эффективно извлекаться в супернатант посредством конкуренции соответствующими пептидами, против которых были индуцированы разные антитела (пример 13).

В нестимулированных клетках (фиг. 3а, дорожки 2, 4, 6, 8 и 10 и фиг. 3Ь, дорожки 2, 3, 6, 8 и 10) прокаспаза-8 эффективно извлекается иммунопреципитацией с использованием тАЬ 179 и конкуренцией с пептидом 179 (фиг. 3а и 3Ь, дорожка 8). В стимулированных клетках, несмотря на небольшое количество оставшейся после активации прокаспазы-8, иммунопреципитация антителами тАЬ 179 приводила к эффективному извлечению белка (фиг. 3а и 3Ь, дорожка 9). Некоторое извлечение прокаспазы-8 можно было наблюдать в неактивированных клетках антителами тАЬ 183.2 (фиг. 3а, дорожка 6) и в активированных клетках антителами тАЬ 183.1 (фиг. 3а, дорожка 5), где активные фрагменты каспазы-8 могли извлекаться в лизатах активированных клеток антителами тАЬ 182 (фиг. 3а, дорожка 3), 183.1 (фиг. 3а, дорожка 5) и 183.2 (фиг. 3а, дорожка 7 только р20).

Полученные результаты показывают, что тАЬ 179, полученный против пептида, соответствующего С-концу 8иЬ-1 (эпитопа 179), является очень эффективным для иммунопреципитации и очистки прокаспазы-8, даже присутствующей в следовых количествах, а также для активированной каспазы-8.

Поликлональное антитело, специфическое для того же самого эпитопа 179 (полученного, как описано в примере 1 выше), получали для исследования того, имеет ли этот эпитоп 179 уникальную способность индуцировать выработку антител, которые обычно могут быть использованы для эффективной иммунопреципитации и очистки прокаспазы-8 и активной каспазы-8. Сравнивали истощенные лизаты, полученные иммунопреципитацией поликлональным антителом, специфическим для эпитопа 179 (дорожки 5 и 6 для активированных и неактивированных клеток, соответственно), или моноклональным антителом, специфическим для эпитопа 182 (дорожки 7 и 8 для активированных и неактивированных клеток, соответственно). Результаты на фиг. 4 ясно показывают, что, действительно, прокаспаза-8 и фрагменты каспазы-8 из лизатов стимулированных клеток также эффективно удаляются из клеточного лизата поликлональными анти-179-антителами и даже еще более эффективно, чем моноклональным анти-182-антителом.

Параллельно иммунопреципитацию и извлечение прокаспазы-8 из лизатов покоящихся клеток, проводимые с тАЬ 183 и поликлональным антителом, специфическим для эпитопа 183 (описанного в примере 1), сравнивали с иммунопреципитацией и извлечением, получаемыми с тАЬ 179. Фиг. 5 показывает, что иммунопреципитация прокаспазы-8 антителом тАЬ 183 и поли-183 является неэффективной, тогда как иммунопреципитация прокаспазы-8 антителом тАЬ 179 является явно превосходной.

Дополнительный полученный из каспазы-8 фрагмент приблизительно 5,6 кДа наблюдается только в иммунопреципитатах, получаемых с тАЬ 179 (дорожка 3). Антитела, полученные против области каспазы-8, которая соответствует С-концу большой субъединицы 8иЬ-1 каспазы, имеют уникальную способность придания каспазе нового способа процессинга.

Описанные выше результаты показывают, что эпитоп 179 каспазы-8, в отличие от других эпитопов, имеет особую способность вызывать образование специфических антител, которые являются очень эффективными для иммунопреципитации прокаспазы-8 и активированной каспазы-8 и способны индуцировать аутопроцессинг прокаспазы-8.

Пример 6. Выделение и идентификация связывающего каспазу-8 полипептида (Сап).

Вследствие его способности эффективно иммунопреципитировать каспазу-8, антитело тАЬ 179 использовали для коиммунопреципитации каспазы-8 и связанных с каспазой-8 белков.

Клетки В_)аЬ (δΐβίηίΐζ М., К1еш С., 1975) стимулировали Рак-лигандом в течение 1 ч и клеточные лизаты получали из клеток до и после стимуляции. После иммунопреципитации и элюции, как описано в примере 13, извлеченные белки разделяли электрофорезом на δΌδ-ПААГ и детектировали окрашиванием серебром. Иммунопреципитация мышиным 1дС1 служила в качестве отрицательного контроля. Результаты на фиг. 6 показывают, что полипептид с предположительной молекулярной массой приблизительно 72,5 кДа (называемый в описании р72) копреципитируется с прокаспазой-8 (р 53/55) в лизатах из покоящихся клеток (дорожка 3), но не с активной каспазой-8 в лизатах из стимулированных клеток (дорожка 4).

Кроме того, было обнаружено, что полипептид р72 коиммунопреципитируется с прокаспазой-8 также в лизатах, полученных из нестимулированных клеток НеЬа, Ρα)ί. Н9, К562, НЬ-60, СЕМ и Ни178 (АТСС).

Эти результаты предполагают, что полипептид р72 обычно связан с прокаспазой-8, но не с активной каспазой-8.

Полосу в δΌδ-ПААГ, соответствующую р72, вырезали, расщепляли трипсином и подвергали анализу ограниченных последовательностей и масс-спектроскопическому анализу. Полученные расщепле

- 29 009956 нием трипсином 7 пептидов использовали для поиска в базе данных белков, выведенных из нуклеотидных последовательностей (или Ε8Έ). Белковая последовательность, соответствующая части предсказанной белковой последовательности Ε8Т-клона человека (8Ε0 ΙΌ N0: 1), обнаружена в банке генов (номер доступа д1/2988397/дЬААС08052.1/(АС004475), функция которой была неизвестна.

Пример 7. Получение полноразмерной кДНК, кодирующей р72.

Полноразмерную кДНК, кодирующую р72, получали следующим образом.

Ε8Т из примера 6 использовали для скрининга каталога генов человека ТЮВ и было получено сообщение ТНС (8Ε0 ΙΌ N0: 1 ТНС510568), содержащее консенсус всех Ε8Έ которые соответствуют этой последовательности.

Клон ДНК, кодирующий часть предсказанного полипептида, покупали из Шсу!^ Сеиошюк (IΜΑСΕ #2964545). В этом клоне отсутствовали нуклеотидные последовательности, кодирующие первый метионин и 6 следующих аминокислот (т.е. 21 нуклеотид). Было обнаружено, что мышиные и человеческие последовательности указанных белков имеют высокое сходство (идентичность приблизительно 90%), поэтому нуклеотидные последовательности, кодирующие первый метионин и 6 следующих аминокислот мышиного белка, которые не отсутствуют в мышиных Ε8Έ сравнивали с рабочей предполагаемой последовательностью генома человека для дополнения отсутствующей последовательности человека. Получили совпадение, соответствующее последовательности клона ЕЕНЕВ-232Е12 хромосомы 19 Ното 8ар1еи8. Указанный клон подтвердил нуклеотидную последовательность, которая кодирует недостающие 7 аминокислот р72. Полноразмерную кДНК р72 получали двумя раундами ПЦР (использовали Такага ΕxТа^, Такага, са! # В001А), которые схематически представлены на фиг. 8.

В первой ПЦР использовали клон, полученный из Iисуΐе Сеиошюк, в качестве матрицы с прямым праймером СТСААСАТССАСААСССССАТСТТССАССАААСС, синтезированным таким образом, что он содержит 15 (подчеркнутых) из 21 отсутствующего нуклеотида вместе с существующей последовательностью р72 (фиг. 8, праймер 2), и обратным праймером ССАСТССАСТСАСТАСТААСССССТСТСССАТТ, содержащим 3'-область, заканчивающуюся стоп-кодоном (фиг. 8, праймер 3).

Вторая ПЦР содержит в качестве матрицы ПЦР-продукт первого раунда ПЦР и прямой праймер ААТССАТССАТСАСТСТСААСАТССАСААСССССА, содержащий все 21 отсутствующих нуклеотида и 5 существующих нуклеотидов (фиг. 8, праймер 1), и тот же самый обратный праймер (фиг. 8, праймер 3). Полную кДНК, кодирующую р72, извлекали и секвенировали (8Ε0 ΙΌ N0: 2) и аминокислотную последовательность предсказывали из нуклеотидной последовательности (8Ε0 ΙΌ N0: 3).

Сравнение последовательности, полученной в сообщении ТНС (8Ε0 ΙΌ N0: 1 ТНС510568), содержащей консенсус всех Ε8Έ и полипептида, предсказанного с использованием полученной полноразмерной кДНК (8Ε0 ΙΌ N0: 3), на фиг. 13 показывает отсутствие 7 первых аминокислот в Ε8Έ отсутствие 25 аминокислотной последовательности в Ε8Т и неточность аминокислоты 397 (пролин вместо лейцина).

Было обнаружено, что полипептид р72 содержит три консервативных мотива (фиг. 7): мотив С, спиральный мотив, два тандемно расположенных '8ИВР' (также называемых мотивами '8\УАР', обозначенных как 8 на фиг. 7) (ПеиНех Б. аиб Ьа£уа118 В., 1994) вблизи Юконца этого полипептида, и один локализованный на С-конце полипептида 'С-участок' (обозначенный как С на фиг. 7) (Атаушб Ь. аиб Кооши Ε.ν., 1999). Авторы считают, что мотивы 8ИВР и С-участок участвуют в связывании РНК, что предполагает, что мишенью р72 может быть молекула РНК. Таким образом, р72 был переименован в Сап (аббревиатура названия каспаза-8-ассоциированный полипептид с РНК-связывающими мотивами).

Пример 8. Расщепление Сап каспазой-8.

Как показано в примере 7, Сап связывается только с прокаспазой-8 и не связывается с активной каспазой-8, как было определено спустя 1 ч после стимуляции. Некоторое количество прокаспазы-8 еще может быть детектировано после 20 мин стимуляции. Для определения, может ли Сап копреципитироваться с прокаспазой-8 при более коротких периодах стимуляции, клетки В_)аЬ, активированные в течение только 20 мин, лизировали и иммунопреципитировали тАЬ 179. После иммунопреципитации и элюции каспазу-8 и связанные полипептиды разделяли электрофорезом в 8Э8-ПААГ и полипептиды детектировали окрашиванием серебром. Одну полосу 72,5 кДа (фиг. 9, дорожка 3), очевидно, соответствующую Сап, иммунопреципитировали в лизатах из клеток перед стимуляцией, тогда как после 20 мин стимуляции, кроме Сап, детектировали полипептид с более низкой предположительной молекулярной массой приблизительно 68 кДа (фиг. 9, дорожка 4). Оба полипептида, 72,5 и 68 кДа, иммунопреципитированных из клеток В_)аЬ, подвергали масс-спектроскопическому анализу. После трипсинизации оба полипептида проявляли сходный профиль пептидов, за исключением одного ясного различия, заключающегося в том, что дополнительный пептид последовательности БВВНРЬНЫРВ (остатки 632-641) присутствовал в полипептиде 72,5 кДа (Сап) на С-конце, но отсутствовал в полипептиде 68 кДа.

Полученный результат предполагает, что при стимуляции клеток фрагмент приблизительно 4,5 кДа удаляется из С-конца Сап, возможно, активированной каспазой-8, приводя к получению меньшего полипептида с предположительной молекулярной массой 68 кДа, который является все еще связанным с оставшейся прокаспазой-8.

Возможно, что остаток Ό600, расположенный на С-конце Сап (фиг. 7), мог бы быть кандидатным остатком для расщепления, так как предположительные фрагменты, происходящие из такого расщепления,

- 30 009956 обнаруживают сходную молекулярную массу с фрагментами Сап, детектируемыми ίη νίνο после 20 мин стимуляции.

Для испытания того, является ли, как предполагается, Сап субстратом каспазы-8 и является ли И600 остатком-мишенью для расщепления, транскрибированный-транслированный ίη νίίτο и меченный радиоактивным изотопом (³⁵8) Сап (система ТпТ) подвергали действию рекомбинантной активной каспазы-8. кДНК Сап экспрессировали ίη νίίτο в лизатах ретикулоцитов в присутствии ³⁵8-метионина с использованием сопряженной системы лизата ретикулоцитов ТпТ Т7 и подвергали расщеплению рекомбинантной активной каспазой-8 (каждую субъединицу 8иЬ-1 и 8иЬ-2, полученную по отдельности в Е. со11, смешивали их и повторно вместе укладывали ίη νίίτο). Вкратце, синтезированный ίη νίίτο ³⁵8-меченый Сап инкубировали в течение 30 мин в протеазном буфере (20 мМ НЕРЕ8 рН 7,5, 0,1% СНАР8, 5 мМ ЭДТА и 2 мМ ДТТ) при 37°С в присутствии или в отсутствие бактериально продуцируемой каспазы-8. Белки и их фрагменты разделяли электрофорезом на 8Э8-ПАЛГ и результаты визуализировали фосфовизуализацией. Результаты (фиг. 10) показывают, что в отсутствие каспазы-8 детектировалась только полоса 72,5 кДа, соответствующая полноразмерному Сап (дорожка 1). Эта полоса исчезает после добавления активированной каспазы-8 в течение 1 ч и появляется новый меньший фрагмент, соответствующий 68 кДа (дорожка 4). Этот результат указывает на то, что белок, кодируемый кДНК Сап, используемый в качестве субстрата, эффективно расщепляется каспазой-8.

Кроме того, систему транскрипции-трансляции ТпТ использовали также для получения ίη νίίτο 2 различных мутантов Сап: 1 - Сап, в котором остаток И 600, который, как предполагается из экспериментов ίη νίνο, является предположительным остатком-мишенью для каспазы-8, был мутирован в Е (И600Е), и 2 - делетированный Сап без остатков ниже по ходу транскрипции от И600 (т.е. экспрессированный белок будет иметь остатки 1-600).

Расщепление двух описанных выше мутантов Сап испытывали в присутствии (фиг. 10, дорожки 5 и 6, соответственно) или в отсутствие (дорожки 2 и 3, соответственно) активной рекомбинантной каспазы8. Как показано на фиг. 10 (дорожки 3 и 6, соответственно), наблюдается один и тот же белковый профиль мутанта Сап Э600Е в присутствии или в отсутствие каспазы-8, что указывает на то, что каспаза-8 не расщепляет мутант Сап Э600Е. Мутант Сап 1-600 мигрирует вместе с фрагментом 68 кДа, полученным после расщепления Сап дикого типа, и не расщепляется дополнительно добавлением каспазы-8 (дорожки 2 и 5). Полученные результаты показывают, что после активации каспаза-8 расщепляет Сап при остатке И600.

Исследования, проведенные ίη νίνο, предполагают, что расщепление Сап каспазой-8 происходит в клетках быстро, в пределах 5-20 мин после стимуляции Еак-лигандом (фиг. 11), и что расщепленный Сап (или, скорее, его более крупный фрагмент) может оставаться связанным с прокаспазой-8.

Пример 9. Функциональная характеристика Сап.

Для анализа действия Сап на апоптотическую гибель клеток, индуцированную ΊΝΕ-рецепторным путем передачи сигнала, использовали кДНК Сап, или антисмысловую кДНК Сап (а/δ), или вектор без вставки кДНК р72 в качестве отрицательного контроля (рс). кДНК встраивали в экспрессирующий вектор рс^NА 3.1 (доступный из Ιηνίίτο^η) и котрансфицировали с ДНК рецептора ТИК р55, встроенной в вектор рс^NА3 (Ιηνίίτο^η), и с репортерным геном зеленого флуоресцентного белка (ОЕР), встроенным в экспрессирующий вектор рЕОЕРС1 (С^ШесЬ), в клетки НЕК 293, конститутивно экспрессирующие Тантиген.

Спустя 24 ч трансфицированные клетки испытывали под флуоресцентным микроскопом и гибель клеток оценивали определением количества клеток, обнаруживающих апоптотическую морфологию из общей популяции флуоресцентных клеток. Было обнаружено, что сверхэкспрессия Сап усиливает гибель клеток, индуцированную сверхэкспрессией Т№-рецептора р55 (фиг. 12а, р72). В противоположность этому, при применении антисмысловой конструкции кДНК для котрансфекции (фиг. 12а, р72/а/§) клетки были защищены от гибели, индуцируемой сверхэкспрессией Т№-рецептора р55.

Полученный результат показывает, что Сап модулирует апоптотическую гибель клеток, индуцируемую Т№-рецепторным путем передачи сигнала.

Обычно запуск рецептора, подобного СИ 120а, посредством ЕакЬ требует добавления ингибитора синтеза белка, такого как циклогексимид, для получения сильного сигнала в отношении апоптоза. Для анализа действия Сап на гибель клеток, индуцируемую путем передачи сигнала Еах, влияние сверхэкспрессии Сап на опосредованную Еак-лигандом гибель клеток без добавления циклогексимида подвергали мониторингу в клетках НЕК 293, конститутивно экспрессирующих Т-антиген (НЕК-293 Т). В указанном эксперименте клетки НЕК-293 Т котрансфицировали вектором рс^NА3.1 или рс^NА3.1, кодирующим Сап или антисмысловой Сап (рс, р72 и р72 а/δ, соответственно), и вектором р8ВС-2 (Ипкъ с! а1., 1983), кодирующим репортерный ген 8ЕАР (секретируемой щелочной фосфатазы). Спустя 24 ч трансфицированные клетки индуцировали Еак-лигандом в течение 16 ч и среду для выращивания заменяли свежей средой для выращивания. Гибель клеток рассчитывали определением количества 8ЕАР, секретируемого в среду для выращивания во время 24 ч (детектируемого по ферментативной реакции, как описано Вο1ά^η е! а1.). Результаты на фиг. 12Ь свидетельствуют о том, что сверхэкспрессия Сап, но не антисмыслового Сап, вызывает гибель в комбинации со стимуляцией Еак-лигандом. Результаты показывают, что

- 31 009956 сверхэкспрессия Сап в отсутствие стимуляции Рак-лигандом не оказывает никакого действия на гибель клеток (не показано).

Исследовали действие сверхэкспрессии р8ирег-Сап, системы для стабильной экспрессии коротких интерферирующих РНК Сап, которые предположительно будут блокировать Сап, на апоптоз, индуцированный в клетках НеЬа сверхэкспрессией Маск а1 (каспазы-8) или химерой, содержащей внеклеточную часть ΤΝΕΒ1 р55, слитую с трансмембранной и внутриклеточной частью Рак-рецептора (СИ).

Клетки НеЬа (2х 10⁵ клеток) высевали и котрансфицировали с использованием 2 мкг содержащей ДНК Маск а1 или СИ плазмиды (скелет плазмиды, рсИХА3 из кгсЦгодеп) и 3 мкг вектора р8ирег (^1111111^11^111е! а1., 2002 8аепсе 296-550) или р8ирег-Сап (р8ирег-Сап является смесью 1:1 плазмид р8ирег, содержащих последовательности, полученные из кДНК Сап человека ААСАССАТААССТАСАССТСС (11691190 8Еф ΙΌ N0: 6) или из 3'-нетранслируемой области ААТСАССААСССТСССТССАС (3' 24-47 п.н. 8Еф ΙΌ N0: 7) и 0,5 мкг плазмиды, содержащей репортерный ген СЕР (скелет плазмиды, рКСЕР С1оп!ес1). Спустя 27 ч после трансфекции клетки исследовали под флуоресцентным микроскопом и гибель клеток оценивали по морфологии СЕР-содержащих клеток.

Результаты суммированы на фиг. 16. Хотя гибель клеток индуцируется сверхэкспрессией Маск а1 или СТ* (апоптоз более увеличен в экспрессирующих Маск а1, чем в экспрессируюших СТ* клетках), клетки, трансфицированные р8ирег-Сап с Маск а1 или СИ, проявляют значительно пониженный апоптоз или отсутствие апоптоза. Полученные результаты показывают, что индукция апоптоза через Т№-рецепторный путь передачи сигнала или каспазой-8 требует активности Сап.

Пример 10. Вестерн-блот-анализ для обнаружения каспаза-8-иммунореактивной сыворотки.

Смесь рекомбинантых очищенных 8иЬ-1 и 8иЬ-2 использовали для Вестерн-блот-анализа антител, полученных против синтетических пептидов. Вкратце, на 12% δΌδ-полиакриламидный гель наносили 100 нг на дорожку смеси 8иЬ-1 и 8иЬ-2 при восстанавливающих условиях (40 мМ ДТТ). На одну дорожку наносили низкомолекулярные маркеры (БМ\У). Белки, разделенные на гелях, переносили электроэлюцией на мембраны РУИЕ с высоким содержанием Р (Атегккат). Мембраны инкубировали в РΒ8, содержащем 5% молоко с низким содержанием жира, 0,05% Твин 20, в течение 16 ч. Мембраны нарезали на полоски и каждую полоску инкубировали в течение 1 ч при комнатной температуре с мышиной антисывороткой (разведенной 1/2000). Полоски мембран промывали РΒ8, содержащим 0,05% Твин 20 (3х15 мин), и инкубировали в течение 1 ч со вторым антителом - козьим антимышиным антителом, конъюгированным с пероксидазой хрена (разведенным 1:10000, Таккоп), в течение 1 ч при комнатной температуре.

Полоски промывали РΒ8, содержащим 0,1% Твин 20 (3х15 мин). Положительные полосы детектировали усиленной хемилюминесценцией (ЕСЬ, Атегккат).

Для Вестерн-блотов, выполняемых в примере 5, использовали антитела, специфические в отношении 8иЬ-1 (Се11 8щпаНпд Тескпо1оду Сакраке-8 ΙΟ^2 Са! 9746).

Пример 11. ЕЫ8А для скрининга гибридомных клонов.

Прямой анализ ЕЫЗА для скрининга гибридом, продуцирующих специфическое антитело, выполняли следующим образом: 96-луночные планшеты покрывали 50 мкл/лунку комплекса БСА-пептид (или только БСА для контрольных планшетов) в концентрации 2,5 мкг/мл в растворе для связывания (0,1М №₂НР0₄, рН 9) в течение 1 ч при 37°С или 16 ч при 4°С. Затем планшеты промывали 3 раза РΒ8-Τ (ΤΒ8 с 0,05% Твин-20) и наносили на них 200 мкл/лунку блокирующего раствора (1% гемоглобин в РΒ8) в течение 1 ч при 37°С и промывали 3 раза РΒ8. 50 мкл культурального супернатанта гибридомы или разведенные стандарты (с РΒ8-Τ) наносили на каждую лунку и инкубировали в течение 1 ч при 37°С или 4 ч при 22°С. После указанного периода инкубации лунки промывали 6 раз РΒ8-Τ. Второе антитело, антимышиное антитело, конъюгированное с НКР (Таккоп 115-025-100), разводили 1:5000 в РΒ8-Τ, инкубировали в течение 1 ч при 37°С и вымывали промыванием 6 раз РΒ8-Τ. Готовили свежий субстрат для НКР (2,2 мл 0,2М №₂НР0₄, рН 9,2, 1,4 мл 0,2М лимонной кислоты, рН 4,35, 6,4 мл Н₂О, 10 мг АΒΤ8 и 1 мкл Н₂О₂) и 50 мкл/лунку наносили и инкубировали при 22°С до проявления окрашивания (приблизительно 5-80 мин). Цветную реакцию останавливали добавлением 50 мкл/лунку 0,2М лимонной кислоты. Планшеты считывали при 405 нм.

В качестве антитела положительного контроля использовали положительную мышиную антисыворотку в разведении 1:1000, а в качестве отрицательного контроля только среды.

Пример 12. Иммунопреципитация каспазы-8.

Для каждой иммунопреципитации использовали 10⁸ клеток. Клетки собирали и лизировали инкубированием в лизирующем буфере с 1% №-40 и полном протеазном ингибиторе (таблетки коктейля протеазных ингибиторов из Коске Мо1еси1аг Β^оскет^са1к) при 0°С в течение 40 мин. Клеточные лизаты помещали в виде аликвот в пробирки Эппендорфа, центрифугировали при 14000 об./мин в течение 10 мин при 4°С и супернатант собирали в новую пробирку. Клеточные лизаты подвергали стадии предварительного осветления, предназначенной для удаления белков, которые связываются неспецифически с Сбелок-сефарозой. Для предварительного осветления клеточный лизат предынкубировали с предварительно промытой РΒ8 С-белок-сефарозой (Ркагтааа) и с мышиным ЦС в течение 2-3 ч при 4°С. После указанной инкубации лизаты центрифугировали в пробирках Эппендорфа в течение 14000 об./мин в те

- 32 009956 чение 30 с, белок-С-сефарозу отбрасывали и собирали предварительно осветленный супернатант. Очищенное моноклональное антитело (или машиный 1дС 1 каппа для отрицательного контроля) и предварительно промытую РВ8 белок-С-сефарозу смешивали и инкубировали с предварительно осветленным супернатантом в течение 4-16 ч при 4°С. После указанного периода инкубации несвязанный материал, называемый истощенным лизатом, собирали центрифугированием (30 с при 14000 об./мин), а связанный материал элюировали промыванием сефарозных гранул 6 раз лизирующим буфером и инкубированием с элюирующим раствором, содержащим 0,2% №-40 лизирующий буфер, ингибиторы протеаз и 400 мкг/мл пептида, используемого для иммунизации (300 мкл элюирущего раствора на 100 мкл сефарозы) в течение 2 ч при 22°С. Пробирки центрифугировали в течение 5 мин при 5000 об./мин и супернатант, называемый элюатом каспазы-8, переносили в новую пробирку.

Пример 13. Оценка действия нерасщепляемого мутанта р72 Э600Е в Рак-опосредованном апоптозе.

Было обнаружено, что Сап расщепляется активной каспазой-8, и сайт специфического расщепления был продемонтрирован получением нерасщепляемого мутанта (р72 Э600Е) (пример 8). Было показано, что временная сверхэкспрессия Сап усиливает апоптотическую активность обработанных Рак-лигандом клеток (пример 9). Для оценки действия нерасщепляемого мутанта р72 Э600Е в сравнении с полипептидом дикого типа в Рак-опосредованном апоптозе клетки В_)аЬ конструировали генетически для конститутивного продуцирования либо мутантного Сап, либо Сап дикого типа и действие Рак-лиганда в сконструированных клетках подвергали мониторингу. Для получения конститутивного продуцирования кДНК, кодирующие каждый из двух белков Сап, встраивали в экспрессирующий вектор рс^NΑ 3.1. Трансфектанты клеток В_)аЬ отбирали в 1500 мкг/мл неомицине и изоляты собирали и тестировали на продуцирование Сап Вестерн-блот-акализом клеточных лизатов. Затем отбирали изоляты, продуцирующие сходные уровни Сап дикого типа и мутанта. Выживание клеток В_)аЬ подвергали мониторингу после нанесения Рак-лиганда на контрольные клетки (В1), клетки, конститутивно экспрессирующие трансфицированный р72 (В2), и клетки, конститутивно экспрессирующие трансфицированный р72 Э600Е (В3). Результаты на фиг. 14 показывают, что клетки, экспрессирующие нерасщепляемый мутант Сап, более эффективно погибают при обработке Рак-лигандом, чем клетки, экспрессирующие Сап дикого типа. Одним из возможных объяснений полученного результата является то, что Сап мог участвовать в превращении прокаспазы-8 в активную каспазу-8. Таким образом, нерасщепляемый Сап будет непрерывно индуцировать превращение прокаспазы-8 в активную каспазу-9, приводя к увеличению апоптоза, в противоположность р72 дикого типа, который будет расщепляться и, возможно, инактивироваться активной каспазой-8.

Для испытания возможного участия Сап в активации каспазы-8 проводили мониторинг скорости превращения прокаспазы-8 в активную каспазу-8 после обработки Рак-лигандом в клетках В_)аЬ, экспрессирующих Сап дикого типа или нерасщепляемый мутант Сап, с использованием Вестерн-блот-анализа с антителами, специфическими для каспазы-8, для обнаружения прокаспазы-8 и активированной каспазы8. Полученные результаты показали, что скорость активации каспазы-8 является более высокой в клетках В_)аЬ, продуцирующих мутантный Сап (не показано).

Полученные результаты предполагают, что р72 участвует в активации каспазы-8 и что увеличение антиапоптозной активности, опосредованное Рак-лигандом, получаемое с клетками, экспрессирующими мутантный р72 Э600Е, в сравнении с белком дикого типа обусловлено тем фактом, что первый белок остается активным (не расщепляется), несмотря на присутствие активной каспазы-8.

Пример 14. Определение домена в Сап, ответственного за связывание каспазы-8.

Проводили делеционные исследования Сап для определения минимальной аминокислотной последовательности в Сап, ответственной за связывание каспазы-8. Сап последовательно делетировали и полученный фрагмент лигировали с репортерным геном СРР и вводили в вектор рс^NΑ3.1/Н^кС (1пуйгодеп). Конструкции Сап (10 мкг) котрансфицировали в клетку НеЬа вместе с вектором (10 мкг), содержащим прокаспазу-8 (Масй а1 (С3608), введенную в вектор рс^NΑ 3 (1п-Уйгодеп)).

Спустя 24 ч после трансфекции клетки лизировали в 1% №-40-лизирующем буфере. Каспазу-8 иммунопреципитировали антителом 179 и С-белком в течение 2 ч. Осажденный комплекс промывали 5 раз промывочным буфером (0,2% №-40-буфером) и элюировали в промывочном буфере, содержащем пептид 179. Иммунопреципитированные белки разделяли электрофорезом в 8Ь8-ПЛАГ и подвергали Вестерн-блот-анализу с использованием антитела к каспазе-8 1С12 (1:2000, Се11к 81дпа1тд Тесйпо1оду) и поликлонального антитела против продуцируемого Е. сой Н1к-Сап (1:2000).

Фиг. 8 показывает схематическое представление Сап, включающего скрученный спиральный мотив, мотив 8ИКР или 8VΑΡ, мотив С-участка, мотивы ΝΕ8, сайт расщепления каспазой-8 Ό600 и соответствующие аминокислоты, охватывающие указанные выше мотивы. Табл. ΙΙ суммирует результаты связывания полноразмерной и делетированной конструкции Сап с каспазой-8.

Ό600, сайт расщепления каспазой-8 в Сап, возможно, не требуется для его связывания, так как мутант Э600Е, действительно, связывает каспазу-8. Делеционная конструкция 393-645 без части Ν-конца белка, включающей некоторые из указанных выше мотивов Сап (мотив скрученной спирали, мотив 8ИКР или 8VΑΡ, мотив С-участка, мотивы ΝΣ8), но содержащая интактный С-конец белка, все еще связывает каспазу-8, что показывает, что, в отличие от С-конца, указанные мотивы не требуются для связы

- 33 009956 вания каспазы-8. Мотив С-участка. возможно. также не является необходимым. как показано с делеционной конструкцией 393-437. которая лишена мотива С-участка и все еще связывается с каспазой. Данный белок мог быть делетирован далее из его Ν-концевой части с получением состоящего из 24 аминокислот пептида 8У^^^ΚС^СΥЕΚСΚΡУС^УСУΤЕ^ (конструкцияи 414-437 8Е0 ΙΌ ΝΟ: 4). который все еще связывается с каспазой-8. Дополнительная делеция 16 аминокислот в таком пептиде по Ν-концу приводила к получению пептида из 9 аминокислот (конструкцияи 429-437). который не мог связывать каспазу-8. Таким образом. делеция только 7 аминокислот Ν-конца конструкции 414-437. приводящая к получению пептида из 16 аминокислот (конструкция 422-437). была испытана. и было показано. что этот пептид связывается с каспазой-8. Таким образом. было обнаружено. что наименьшая аминокислотная последовательность для связывания с каспазой-8 является содержащим 16 аминокислот пептидом с последовательностью СΥЕΚСΚΡУС^УСУΤЕ^ (конструкция 422-437 8ЕО ΙΌ ΝΟ: 5 фиг. 15).

Таблица II

Конструкция Саг!	Связывание с каспазой-8	Комментарий
Полноразмерный Сагч (1-645)	+
Мутант ОбООЕ (1-645)	+	Нерасщепляемый при остатке 600
1-260		Ν-конец, включающий только первый модуль ЗПКР
1-330		Ν-конец, включающий два модуля ЗОКР
1-352		Ν-конец, включающий два модуля ЗиКР и первый ЫЬЗ
1-427		Ν-конец, включающий два модуля ЗиКР и все 3 N1,3
1-490	+	Ν-конец, включающий два модуля ЗСЩР и все 3 ЫЬЗ
1-531	+	Ν-конец, включающий два модуля 5ΝΕΡ и все 3 N1,3
179-645	+	Включающий два модуля ЗОВР и С-конец
260-645	+	Включающий только второй модуль ЗОКР и С-конец
370-645		Включающий только два ΝΣ3 и С-конец
370-645 с мутацией иьз	+	Аналогичный мутанту ЗЮ645, но с мутированной последовательностью N1,3
393-645	+	Содержащий С-конец без всех ИЬЗ
370-484		Содержащий ыъз и часть Сконца, за исключением мотива С-участка
370-484 с мутацией ΝΣ3	+	Аналогичный мутанту 370484, но с мутированной последовательностью N1,3
438-484	-	СГР-гибрид по С-концу
393-437	+	СГР-гибрид по С-концу
398-437		СГР-гибрид по С-концу
406-437	+	СГР-гибрид по С-концу
414-437	+	СГР-гибрид по С-концу
429-437	-	СЕР-гибрид по С-концу
422-437	+	СГР-гибрид по С-концу

- 34 009956

Ссылки

Абе1тап бр. еЕ а1. 1983 ΌΝΆ 2: 183.

Актаб М. е1 а1. Сапсег Кек. 1997; 57(4): 615-9.

Акад1 Υ. е1 а1. 1997 К1бпеу 1п1. 51, р. 1265-9.

Агаушб Ь. апб Κοοηίη Ε.ν. 1999 ΤΊΒδ 24: 342-344.

АгЕе1Е Р. е1 а1. 1988 Сепе 68, 213-9.

Вагшко1-^а1апаЬе 8. е1 а1. Βίο1. Скот. Норре. 8еу1ег. 1994; 375(8): 497-512.

Ве1б1ег Όγ. еЕ а1. 1995. б. Βίο1. Скет. 1995 би1. 14; 270(28): 16526-8.

ВеиНег апб Сегат1 1987 Ν. Епд1. б. Меб. 1987 ЕеЬ. 12; 316(7): 379-85.

В1§ба б. еЕ а1. 1994 б. Ехр. Меб. Аид. 1; 180(2): 445-60

Βο16πι М.Р. еЕ а1. 1995 б. Βίο1. Скет. Арг. 7; 270(14): 7795-8

Βο16πι М.Р. еЕ а1. 1995а Βίο1. Скет. 1995 бап. 6; 270(1): 387-91.

Βο16πι М.Р. еЕ а1. 1995Ь ΕΕΒ8 Ьей. 1995 бип. 19; 367(1): 39-44.

Βο16πι М.Р. еЕ а1. 1996 Се11 1996 бип. 14;85(6): 803-15.

Βοοικ Е. е1 а1. б. Βίο1. Скет. 275, 37596-603.

Βο^ίω^ С.Ь. еЕ а1. 1984 ХаИие 1984 Пес. 13-19; 312(5995): 643-6.

Βι-акеЬикск С. еЕ а1. 1992. ΕМΒΟ б. 1992 Маг.; 11(3): 943-50.

Β^οсккаиκ М. е1 а1. 1990 Ргос. №Е1. Асаб. 8с1. И8А 1990 Арг; 87(8): 3127-31.

СаЬШу 8. еЕ а1. 1984 Р^8 81, 3273.

СапЮг еЕ а1. 1993 Р^8 90, 109-32.

Саο X. еЕ а1. 1998 б. Iттиηο1. 161, 6238-44.

Скеп С.б. еЕ а1. 1992 Апп. ΝΥ Асаб. 8сЕ 660, 271-3.

СЫппа1уап А.М. еЕ а1. 1995 Се11 Мау 19; 81(4): 505-12.

СЫппа1уап А.М. е1 а1. 1996 б. Βίο1. Скет. Маг. 1; 271(9): 4961-5.

С1етепЕк СП. е1 а1. 1975 1пЕ. б. Сапсег 16: 125-33.

Сокеи О.М. 1997 Нюскет. б.; 326 (РЕ 1), 1-16.

Паше1 К. е1 а1. 1998 б. Βιοιικ6. 8сЕ 5, 383-94.

Цепке/ Е. апб ЬаЕуаЕ1к К. 1994 б. Βίο1. Скет. 269: 16170-16179.

Щгкк, ^1гЕк апб Наикег 1983 Сепе 128, 247-249.

Пиан Н. апб Όίχίΐ νΜ. ХаИие 1997; 385(6611): 86-9.

ЦигЕее Τ. е1 а1. Сепек Иеу. 1993; 7(4), 888-69.

ЕбатаЕки Н., ΙΚιζιιό Υ., Ιΐοΐι Н. 1997, Сепе 187, 289-94.

Ебтдег А.Ь. е1 а1. 1998 νίΐΌ1ο§ν. 249, р. 367-78.

Епап М. еЕ а1. 1995 ХаИие Мау 4; 375(6526): 78-81.

Епап М. е1 а1. 1998 №11иге (ΕοΜοπ) 391, 43-50.

Епде1тапп Н. е1 а1. 1990 б. Βίο1. Скет. бап. 25; 265(3): 1531-6.

Епде1тапп Н. е1 а1. 1990 б. Βίο1. Скет. 265, р. 14497-504.

Екккаг Ζ., 1985 ш НуЬ^^бοта ЕескшЛду ш Еке Ьтокаепсе апб тебкте, Ебкеб Ьу Τ^тοЕку А. 8рппдег (Р1епит РиЬккЫпд Сο^рο^аЕ^οη, 1985; СкарЕег 1).

ЕуегеЕЕ Κ.Ό. еЕ а1. 1983 ШсШс Ас1бк Кек. 112447-64.

Еегпапбек-А1петп Τ. еЕ а1. 1996 Ргос. Νη11. Асаб. 8с1. И8А; 93(15): 7464-9.

Е1е1бк 8. еЕ а1. 1989; ХаИие 340(6230): 245-6.

Е1ападап, 1998 Сапсег МеЕакЕаык Кеу. 17, 169-76.

ЕигЕк Р.А. еЕ а1. 1994 Ргос. №Е1. Асаб. 8сЕ И8А 91, 9302-6.

СегкЕег М. еЕ а1. 1998 Апа1. Β^ΐκιη. 262, 177-84.

Сгакат А. еЕ а1. 1991, Β^ΐκιη. Β^οркуκ. Кек. Ε^οωωΜ. 177, 8-16.

Сгаи С.Е. 1989 8ск\ее1/ Меб. \Vοскеηкск^. Пес. 9; 119(49): 1756-61.

СпксеШ Е. еЕ а1. 1998, Нит. Сепе Ткег. 9, 1919-28.

Сиапд-Ьш М. еЕ а1. 1998 Тгапкр1апЕ. Ргос. 30, 2923-4.

Спито! апб Теткаташ, 1998 Ра11то1. Βίο1. (Рапк) 46, р. 347-54.

Наепб1ег Β. еЕ а1. Е. ΕМΒО б. 1987; 6(4); 947-50.

Нетт1 8. еЕ а1. 1998 Нит. Сепе Ткег. 9, р. 2363-73.

НепкагЕ Р.А. 1996. 1ттишЕу Маг.; 4(3): 195-201.

Щктапп Н.Р. еЕ а1. 1989. б. Βίο1. Скет. 8ер. 5; 264(25): 14927-34.

Нки Н. еЕ а1. 1996. Се11 бап. 26; 84(2): 299-308.

Ниапд М.Т. апб ^гтап С.М. 1990 №1с1ею Ас1бк Кек. 18, 937-47.

1к1е 6.Ν. Се11 1996; 84(3): 331-4.

1Лк Ν. еЕ а1. 1991. Се11 би1. 26; 66(2): 233-43.

1Лк апб №да1а 1993 б. Βίο1. Скет. Мау 25; 268(15): 10932-7.

баптеу Р.А., апб 8Еοκκе1 Т.Р. 1987 №Еиге (ΕοΜοΛ 352, 362-364.

^керк апб Βω^, 1993 б. Βίο1. Скет. 268, 24515.

Катте б. еЕ а1. ЕеЬ. 15; 216(2): 357-66.

- 35 009956

Ктд Р. апб СообЬоигп 8. 1. Вю1. Сйет. 1998; 273(15): 8699-704.

К1ксйке1 ЕС. е! а1. ЕМВО 1. 1995; 14(22); 579-88.

Кой1ег апб М11к!еш, 1975 Ыа!иге 256, 495-497.

Копбо 8. е! а1. 1998 Опсодепе 17, 2585-91.

Ко!йако!а 8. е! а1. 1997 8с1епсе 278, 294-298.

Кохак М., 1984 ЫисШс Ас1бк Кек. 12 р. 857-72.

Китаг, 1995 ^епбк Вюсйет. 8с1. Мау; 20(5): 198-202.

Китаг, 1997 8аепсе 278(5343): 1630-2.

Кипк!1е С. е! а1. 1997 1ттипо1. Ье!!. 55, 5-10.

Кийй М., апб Вгуап 1. 1984 1. Вю1. Сйет. 259, 10895-10903.

Ьое!ксйег Н. е! а1. 1990 1. Вю1. Сйет. 1990 Νν. 25; 265(33): 20131-8. \1ас1^;аг1а11е М. е! а1. 1. Вю1. Сйет. 1997; 272(41): 25417-20.

Метко111 е! а1. Апа1. Вюсйет. 1984 Мау 1; 138(2): 267-84.

Меш Ν. е! а1. 1998 Ргос. ЫаЙ. Асаб. 8ск И8А 95 15037-15042.

МйИ Р.К. е! а1. 1. Вю1. Сйет. 1997; 272(10): 6539-47.

Мшга К. е! а1. Вюсйет. В1орйук. Кек. Соттип. 1992; 187(1), 375-80. Моткоп е! а1., 1984 РЫА8 81, 6851.

МигаткЫ е! а1. 1991 Рйагт. Кекеагсй 8, 649.

Мшю е! а1. 1996. Се11 .1ип. 14; 85(6): 817-27.

Мшю М. е! а1. 1. Вю1. Сйет. 1998, 273(5): 2926-30.

Ыада!а апб Со1бк!ет 1995.

\ада!а 8. е! а1. Се11 1997; 88(3): 355-65.

Хакакйппа А. е! а1. 1. Вю1. Сйет. 1997; 272(14): 9567-72.

Ыагиш1 е! а1. 1998 Ат. 1. Кекрй. Се11 Мо1. Вю1. 19, 936-941.

№сйо1коп Ό.№. апб ПютЬеггу Ν.Ά. 1997 ^епбк Вюсйет. 8с1. 22, 299-306. №кЫба е! а1. 1998 8рте 23, 2437-42.

Ыорйаг е! а1. ЕМВО 1. 1990 Ос!.; 9(10): 3269-78

Ой!ки М. е! а1. 1997 ЕМВО 1. 16, 4650-4656.

Ребегкоп е! а1. 1998 1. Сак!гот!ек!. 8игд. 2, 283-91.

С)ие11е Ρ.№. е! а1. 1. Вю1. Сйет. 1995; 270(35): 20775-80.

Ко!опба 1. е! а1. Ыа!. 8!гис!. 8ю1. 1996; 3(7): 619-25.

Ких1ска е! а1. 1993 8с1епсе 260: 487.

8акай1га Н. е! а1. (1998) Ма!иге (Ьопбоп) 391, 96-99.

8акекеп С.8., апб Όίχί! У.М. (1997) Се11 91, 443-446. 8атЬгоок е! а1. 1989.

8апо е! а1. (1991) Вю1ес11пк|иек 9: 1378.

8апо е! а1. (1992) 8с1епсе 258: 120.

8сйа11 е! а1. Се11. 1990 Арг. 20; 61(2): 361-70.

8сйек е! а1. Мо1. Се11 Вю1., р. 5386-93, 1992.

8с11\\'агхепЬегдег е! а1. 1998 1. 1ттипо1. 161, 6383-9.

8йеνсйеπкο А. е! а1. 1997 Кар1б Соттип. Макк. 8ресйот. 11, р. 1015-24. 8Ытауата е! а1. 1993 ШсШс Ас1бк 8утр. 8ег. 29, 177.

81юр е! а1. 1998 1. Эгид Τа^де! 5 261-73.

8йоге е! а1. 1993 Опсодепе 8, 3183.

8тйй е! а1. 1990 1. 1п£ес!. ϋΐδ. Оес.; 162(6): 1349-53.

8оиксйагеип е! а1. 1998 Вюсопщд. Сйет. 9 466-75.

8пптаки1а 8.М. е! а1. 1996 Ргос. №111. Асаб. 8а. И8А; 93(25): 14486-91.

8пптаки1а 8.М. е! а1. 1. Вю!. Сйет. 1998; 273(17) 10107-11.

8!апдег е! а1. 1995 Се11 Мау 19; 81(4): 513-23.

81етйх М. апб К1ет С. Ргос. Νίώ. Асаб. 8а. И8А 1975 8ер.; 72(9): 3518-20. 8!ίχ 1998 8α. Ат. 279 46-50.

8иппуа е! а1. 1. Вю1. Сйет. 273, р. 16798-809, 1998.

ТаПадИа е! а1. 1993 Се11 8ер. 10; 74(5): 845-53.

Τеοй е! а1. 1998 В1ооб 92, 4591-4601.

Теиап е! а1. 1995 Се11 .1ип. 2; 81(5): 801-9.

Люткеи е! а1. 1984 РХА8 81 659-63.

таотЬеггу Ц.А. е! а1. 1. Вю1. Сйет. 1997; 272(29): 17907-11.

Τπ-обе Ρ. е! а1. 1. Вю1. Сйет. 1997; 272(37): 22995-9.

ШкикИде е! а1. 1997 1. У1го1. Ме!йобк. 64 р. 73-80.

^асеу е! а1. 1986 Аппи. Κν. Меб. 45: 491-503.

УапбепаЬее1е е! а1. 1995 1. 1шшипо1. Маг. 15; 154(6): 29О4-13.

Уегсаттеп Ό. е! а1. 1998 1. Ехр. Меб. 4, 1477-85.

- 36 009956

У1е1кшб аиб Б^еге^а 1989 ШкФсЬет^гу; 91(1): 81-8.

УШа Р. еί а1. (1997) Тгсп6к ВюсЬет. 8с1. 22, 388-393.

Утсев/ С. авб Όίχίί У.М. 1997. 1. Βίο1. СЬет. Маг. 7; 272(10): 6578-83.

№аЬ1 е1 а1. 1983 1. №с1. Меб. 24: 316-325.

Vа11асЬ Ό. еί а1. 1999 Аппи. Неу. Iттиηο1. 17, 331-67. νηηβ 1. 1998 ^^го^б Ке1еаке 53, 39-48.

Хие е1 а1. 1995 Хпиге 8ер. 21; 377(6546): 248-51.

Υататοίο е1 а1. 1980. Се11 22, 787-97.

Υататοίο Т. е1 а1. 1. Вю1. СЬет. 1997; 272(49): 30595-8.

Υηηβ X. е1 а1. Μο1. Се11 1998; 1(2): 319-25.

ΥеЬ еί а1. 1998 1. Βοικ. Мтег. Кек. 13. р. 1870-9.

Υίη Н.Ь. авб 8Юкке1 Т.Р. (1979) Хниге (Εο^οη) 281, 583-586.

Υίη Н.Ь. авб 8Юкке1 Т.Р., (1980) 1. Βίο1. СЬет. 255, 9490-9493.

2асЬапа еί а1., 1991 Еиг. 1. ΡЬа^тасο1. 203, 353.

Ζΐιηηβ еί а1. 1998 С1ш. Савсег Кек. 4, 2669-76.

Ζΐιηο аиб Р1ск, 1993 №11иге 365, 448.

Список последовательностей <110> УеФа КезеагсЬ апд ϋενθΊορίϋθητ Со. 1_сс1 оаутб, ыаПасЬ

Тапуа, болсайгоу бапезй, Ко1итат

Акт, кадриГ <120> Связывающий каспазу-8 белок, его получение и применение <130> 497 <150> 145273 <151> 2001-04-09 <150> 146251 <151> 2001-04-09 <150> 147487 <151> 2001-04-09 <160> 7 <170> Ратепхш уегзтол 3.1 <210> 1 <211> 616 <212> Белок <213> Ното зартелз <400> 1

А1а

Агд

61 у

дгд

АЗр

уа!

А1а

61 у

ьуз

А1а

АЗП

Агд

Тгр

Рйе

61 у

уа!

1

5

10

15

д!а

РГО

РГО

Суз

5ег

61 у

1уз

мег

АЗП

Мег

АЗП

Не

Сей

Нт 5

б1п

61 и

20

25

30

- 37 009956

61 и

ьеи 11е д!а 35

61 п

ьуз

ьуз

Агд 61и 11е 61и А1а Ьуз

мех

б! и

61 л

40

45

ьуз

А1 а

Ьуз

61 п

А5П

61 η

Уа1

А1а

Зег

рго

61 η

РГО

рго

НПЗ

РГО

61 у

50

55

60

61 и

Не

ТЬг

А5П

А1а

НТ 5

Азп

Зег

Зег

Суз

11е

Зег

АЗП

Ьуз

РЬе

А1а

65

70

75

80

АЗЛ

АЗр

61у

Зег

РЬе

Ьеи

61п

б1п

рЬе

ьеи

АЗП

а! а

С1у

ьуз

дгд

Зег

85

90

95

ьеи

Ьеи

11е

5ег

Агд

Агд

тИг

61 у

ьеи

61 у

Ьеи

А1 а

Зег

ьеи

рго

61у

100

105

НО

Рго

Уа!

Ьуз

Зег

Туг

Зег

Н18

А1а

Ьуз

61 η

ьеи

Рго

Уа!

д! а

нтз

Агд

115 120 125 рго зег Уа1 РЬе 61π зег Рго Аэр 61 и дэр 61и 61ч 61 и дзр туг 61 и 130 135 140

С1п Тгр иеи С1и 11е Ьуз Уа1 Зег Рго Рго 61и б!у А1а 61и ТЬг дгд

145 150 155 160

Ьуз

Уа1

11е

61 и

Ьуз

ьеи А1а

Агд

рЬе

уа1

А1а

61 и

61 у

61 у

Рго

61 и

165

170

175

Ьеи

61 и

ьуз

Уа1

А1а

МеХ 61 и

АЗр

Туг

ьуз

А5р

АЗП

Рго

А1 а

Рпе

А1а

180 185 190

Рйе

Ьеи

нтз 195

АЗр

ьуз

АЗП

Зег

Агд 200

61 и

РЬе

Ьеи

туг

туг 205

дгд

ьуз

ьуз

Уа!

А1а

б1и

11 е

Агд

Ьуз

61 и

А1а

61 п

ьуз

5ег

61 л

А1а

А1а

зег

61 η

210

215

220

ьуз

Уа1

зег

Рго

Рго

.61 и

Азр

61и

61 и

Уа1

ьуз

АЗП

ьеи

А1а

61 и

ьуз

225

230

235

240

Ьеи

А1а

Агд

рЬе

11 е

А1а

Азр

61 у

61 у

РГО

61 и

Уа1

61 и

ТЬг

11 е

А1а

245

250

255

Ьеи

61л

А5Л

АЗП

Агд

61 и

Азп

61 л

А1а

РЬе

Зег

РЬе

Ьеи

Туг

61 и

Рго

260

265

270

АЗЛ

зег

61 η

С1у

Туг

Ьуз

ТУГ

Туг

Агд

61п

ьуз

Ьеи

61 и

61 и

РЬе

Агд

275

280

285

ьуз

А1а

ьуз

А1а

5ег

Зег

тЬг

С1у

5ег

РЬе

ТЬг

А1 а

РГО

АЗр

Рго

61 у

290 295 300

- 38 009956

ьеи 305

Ьуз дгд ьуз Бег

Рго 310

Рго

61и А1а

ьеи

Бег б1у Бег 315

Ьеи

Рго

Рго 320

А1а

тЬг

ТНг

Суз

Рго

л!а

Бег

Бег

тЬг

рго

д1а

Рго

ТЕ г

11 е

Не

Рго

325

330

335

д!а

РГО

Д1а

А1а

Рго

61у

ьуз

рго

А1а

Бег

А1а

А1а

т(тг

Уа1

ьуз

Агд

340

345

350

Ьуз

Агд

ьуз

5ег

лгд

Тгр

61у

Рго

61 и

61и

АЗР

Ьуз

Уа1

61 и

ьеи

Рго

355

360

365

Рго

Д1а

61и

Ьеи

Уа!

61 η

Агд

АЗр

Уа!

АЗр

А1а

Бег

Рго

Бег

Рго

Ьеи

370

375

380

Бег

Уа!

С1 η

Азр

Ьеи

Ьуз

61у

Ьеи

61 у

Туг

С1и

ьуз

61 у

ьуз

Рго

Уа!

385

390

395

400

61у

Ьеи

х/а!

61 у

Уа1

тЬг

61 и

Ьеи

Бег

Азр

А1а

61 η

ьуз

ьуз

61 η

Ьеи

405

410

415

ьуз

61 и

61п

61п

61 и

мег

61п

С1п

мет

туг

АЗр

мет

11 е

МеТ

61 η

Нт 5

420

425

430

ьуз

Агд

А1а

мег

С1п

Азр

мет

С1г»

Ьеи

ьеи

Тгр

61 и

ьуз

А1а

Уа1

61 η

435

440

445

61 η

нтз 450

61 η

ΗΪ5

61у

туг

Дзр 455

Бег

Азр

61 и

61 и

Уа1 460

Азр

Бег

61 и

ьеи

С1у

ТЬг

тгр

61 и

НТ5

61 η

Ьеи

Агд

Агд

мет

б! и

мет

Азр

Ьуз

тКг

Дгд

465

470

475

480

61 и

тгр

А1а

61и

61л 485

Ьеи

ТЬг

Ьуз

МеТ

б1у 490

Агд

61у

1У5

Н1'з

РЬе 495

Не

61 у

А5р

РЬе

Ьеи

Рго

Рго

АЗр

61 и

Ьеи

61 и

ьуз

РЬе

Мет

61 и

ТЬг

РЬе

500

505

510

ьуз

а! а

Ьеи

ьуз

б!и

61 у

лгд

61 и

РГО

Азр

Туг

Бег

61 и

Туг

ьуз

61 и

515

520

525

РЬе

Ьуз

Ьеи

тьг

Уа!

61 и

А5П

Не

61у

туг

61п

мет

Ьеи

мет

ьуз

мет

530

535

540

61 у

Тгр

Ьуз

61 и

61 у

611Г

61у

ьеи

61 у

Бег

61 и

61у

61 п

61 у

Не

Ьуз

545

550

555

560

АЗП

Рго

Уа!

АЗП

Ьуз

61 у

тЬг

ТЬг

тЬг

Уа1

АЗр

61 у

А1а

б!у

РЬе

61у

565

570

575

- 39 009956

11 е

А5р

Агд

РГО

А1а

61 и

ьеи

5ег

Ьуз

С1и

А5р

А5р

61 и

Туг

61 и

А1а

550

585

590

РЬе

Агд

Цуз

Агд

мег

мех

Ьеи

А1а

Туг

Агд

РЬе

Агд

Рго

АЗП

Рго

Ьеи

595

600

605

Азп

АЗП

РГО

Агд

Агд

РГО

Туг

Туг

510 615

<210>	2
<211>	1938
<212>	ДНК
<213>	ното зар1епз

<400> 2 айдадХсхса	адахддасаа	ссдддахдхх	дсаддааадд	схаассддхд	дХХХддддХТ	60
дсхсссссха	аахсхддааа	аахдаасахд	аасахссгхс	ассаддаада	дсхсахсдсх	120
садаадааас	дддаааххда	адссааааХд	даасадааад	ссаадсадаа	хсаддхддсс	180
адсссхсадс	ссссасаХсс	хддсдаааХс	асааатдсас	асаасхсххс	схдсахтхсс	240
аасаадттхд	ссаасдатдд	хадсххсххд	садсадхххс	хдаадххдса	дааддсасад	300
ассадсасад	асдссссдас	садхдсдссс	адсдссссхс	ссадсасасс	сасссссадс	360
дсхдддаада	ддхсссхдсх	сахсадсадд	сддасаддсс	ХддддсХддс	садссхдссд	420
ддсссхдхда	ададстасхс	ссасдссаад	садсхдсссд	хддсдсассд	сссдадхдхс	480
ххссадхссс	схдасдадда	сдаддаддад	дасхахдадс	адхддсхдда	даХсааадтх	540
Хсасссссад	адддадссда	дасхсддааа	дхдахадада	ааххддсссд	схххдхддса	600
дааддаддсс	ссдадххада	аааадхадсх	ахддаддасх	асааддахаа	сссадсаххт	660
дсахххххдс	асдаХаадаа	хадсадддаа	ххссхсхасх	асаддаадаа	ддхддсхдад	720
ахаадааадд	аадсасадаа	дхсдсаддса	дссхсхсада	аадхххсасс	сссададдас	780
даададдтса	адаассххдс	адаааадххд	дссаддххса	хадсддасдд	дддхсссдад	840
дхддааасса	ххдсссхсса	даасаассдх	дадаассадд	саххсадсхх	хсхдхатдад	900
сссааХадсс	аадддхасаа	дхасхассда	садаадсхдд	аддадххссд	дааадссаад	960
дссадсхсса	саддсадсхх	сасадсассХ	дахсссддсс	хдаадсдсаа	дхссссхссх	1020
даддсссхдх	садддхссхх	асссссадсс	ассассхдсс	ссдссхсдхс	сасдссхдсд	1080
сссасхахса	хсссхдсхсс	адсХдссссс	дддаадссад	ссхссдсадс	сассдхдаад	1140
аддаадсдда	ададссддхд	ддддссхдаа	даддахаадд	хададсхссх	ассхдсхдаа	1200
схддхдсада	дддасдгдда	хдссхсхссс	ХсдссХсХдХ	садххсадда	ссхсаадддд	1260
схсддсхахд	адааддддаа	дссхдхдддх	схадхдддсд	хсасададсх	ххсадасдсс	1320

- 40 009956

садаадаадс	адсХдаадда	дсадсаддад	ахдсадсада	гдХасдасаХ	даьсагдсад	1380
сасаадсддд	ссагдсадда	сахдсадсгд	схдгдддада	аддсадхсса	асадсассад	1440
сасддссахд	асадьдахда	ддаддгддас	адсдадсХдд	дсассхддда	дсассадсхд	1500
сддсдсаХдд	адагддагаа	дассадддаа	Сдддссдадс	адсхдасааа	датдддссдд	1560
ддсаадсасг	гсахсддада	сгХссЬдссХ	ссадасдадс	хддаааадхг	Гасддадасс	1620
гхсааддссс	хдааддаддд	ссдхдадссг	дасгасхсад	адгасаадда	дгссаадсгд	1680
асХдгддада	асаЬсддсха	ссадаьдсхд	ахдаадахдд	дсхддаадда	дддедадддд	1740
стдддсгсад	адддссаддд	сагсаадаас	ссадтдааса	адддсассас	сасадгддас	1800
ддсдссддсг	хсддсаххда	ссддссддсд	дадсхсхсса	аддаддасда	сдадхахдад	1860
дсдхгссдса	ададдагдаХ	дссддсссас	сдсгсссддс	ссаасссссг	даасаахссс	1920
адасддссгх	асгасгда					1938

<210> 3 <211> 645 <212> Белок <213> Ното зартелз <400> 3

МеХ

Зег

ьеи

Ьу5

МеХ

Азр

Азп

Агд

А5р

Уа1

А1а

61 у

Ьуз

А1а

Азп

Агд

1

5

10

15

тгр

рйе

01 у

Уа!

а! а

РГО

рго

ьуз

Зег

61 у

Ьуз

мех

АЗП

мег

АЗЛ

11 е

20

25

30

Ьеи

ΗΪ 3

61 п

61 и

61 и

Ьеи

11е

А1а

61 η

ьуз

ьуз

Агд

61 и

11 е

61 и

А1а

35

40

45

1уз

мег

61 и

б!п

ьуз

А1а

суз

61л

АЗП

61 п

уа1

А1а

Зег

РГО

61 п

рго

50

55

60

Рго

ΗΊ3

Рго

61у

б!и

Не

ТЬг

АЗП

А1а

нтз

АЗП

5ег

Зег

Суз

11е

зег

65

70

75

80

Азп

суз

РНе

а! а

АЗЛ 85

Азр

61 у

Зег

РЙе

Ьеи 90

61 п

61 п

РЬе

ьеи

ьуз 95

Ьеи

61 п

ьуз

А1а

61 п

ТЬг

Зег

Тйг

АЗр

А1а

Рго

тЬг

Зег

А1а

Рго

Зег

А1а

100

105

110

Рго

рго

зег

ТЙГ

РГО

ТБ г

Рго

зег

А1а

61 у

ьуз

дгд

Зег

Ьеи

ьеи

11 е.

115

120

125

- 41 009956

Зег

Агд

Агд

ТЬг

<31 у

Ьеи

<31 у

Ьеи

А1а

Зег

ьеи

Рго

61у

Рго

Уа!

ЬУЗ

130

135

140

Зег

туг

Зег

Н15

А1а

ьуз

61 η

ьеи

рго

Уа!

л!а

Н15

Агд

рго

зег

Уа!

145

150

155

160

рйе

61 л

5ег

Рго

А5р

<31 и

АЗр

61 и

61 и

61и

АЗр

туг

61 и

61 η

Тгр

Ьеи

165

170

175

01 и

11е

ьуз

Уа1

Зег

РГО

РГО

61 и

61 у

А1а

61 и

Т11Г

Агд

ьуз

Уа!

Не

180

185

190

61 и

ьуз

ьеи

Д1а

Агд

РЬе

Уа!

А1а

61 и

С! у

61 у

Рго

61 и

ьеи

61 и

ьуз

195

200

205

Уа1

А1а

мег

С1и

АЗр

туг

ьуз

АЗр

АЗП

Рго

А1а

РЬе

А1 а

РЬе

Ьеи

Н15

210

215

220

А5р

ьуз

А5П

Зег

Агд

61 и

рНе

ьеи

туг

Туг

дгд

ьуз

ЬУЗ

Уа1

А1а

61 и

225

230

235

240

11е

Агд

ЬУЗ

61 и

А1а

61 η

Ьуз

Зег

61 п

д!а

А1а

Зег

61 п

ьуз

Уа1

зег

245 250 255

Рго

Рго

61 и

АЗО

61 и

61и

Уа1

Ьуз

АЗП

ьеи

А1а

61 и

ьуз

ьеи

А1а

Агд

260

265

270

РЬе

11 е

Д1 а

АЗр

61 у

61 у

Рго

61 и

Уа!

61и

ТЬг

11 е

А1а

Ьеи

61л

АЗП

275 280 285

Азл Агд 290

61 и азп

61п А1а РЬе Зег РНе ьеи Туг 61 и

Рго

Азп

Зег

61 η

295

300

61 у

туг

ЬУЗ

Туг

туг

Агд

61 η

ьуз

ьеи

61 и

61 и

РНе

Агд

ьуз

А1а

ьуз

305

310

315

320

А1а

Зег

Зег

ТЬг

61 у

5ег

РЬе

тНг

А1а

Рго

А5р

Рго

61 у

ьеи

ьуз

Агд

325

330

335

ьуз

Зег

РГО

Рго

61 и

А1а

Ьеи

Зег

б!у

Зег

ьеи

РГО

Рго

А1а

ТЬг

ТНг

340

345

350

Суз

рго

А1а

Зег

Зег

тНг

Рго

А1а

Рго

ТЬг

11 е

Не

Рго

А1а

Рго

А1а

355

360

365

А1а

РГО

61 у

ьуз

Рго

А1а

Зег

а! а

А1а

ТЬг

Уа1

ьуз

Агд

ьуз

дгд

ьуз

370

375

380

Зег

дгд

Тгр

С1у

Рго

61 и

61 и

АЗр

ьуз

Уа!

61 и

Ьеи

Ьеи

Рго

А1а

61 и

385 390 395 400

- 42 009956

Ьеи

Уа1

61 п

Агд

АЗр

ι Уа1

АЗр

• л1а

. Зег

РГО

ι 5ег

' Ргс

ι кеи

5ег

1 Уа1

С1п

405

410

415

Азр

ьеи

ЬУ5

61 у

кеи

61 у

Туг

Си

куз

61 у

куз

Рго

Уа1

01 у

кеи

Уа1

420

425

430

€1у

Уа1

ТЬг

С1и

кеи

зег

АЗр

А1а

61л

1У5

ьуз

61л

Беи

ьуз

61 и

61 η

435

440

445

61 η

61и

мег

61 η

61η

мег

Туг

АЗР

МеТ

Не

Мек

61л

нтз

куз

Агд

А1а

450

455

460

мег

61 η

А5р

мег

61 η

кеи

кеи

тгр

б1и

куз

А1а

Уа1

61л

61п

НТЗ

61п

465

470

475

480

НТЗ

61 у

Туг

Азр

Зег

АЗр

С1и

С1и

Уа1

Азр

зег

61и

кеи

С1у

ТЬг

Тгр

485

490

495

61 и

НТ 5

61 η

кеи

Агд

Агд

мет

61 и

мет

Азр

куз

ТЬг

Агд

61 и

Тгр

А1а

500

505

510

61 и

61 η

кеи

ТЙГ

ку5

мет

61у

Агд

61 у

куз

ΗΊ 5

РЬе

Не

61 у

А5р

РЬе

515

520

525

кеи

рго

Рго

А5Р

61 и

Ьеи

б!и

ЬУЗ

РЬе

мет

61 и

тЬг

РЬе

иуз

А1а

кеи

530

535

540

Ьуз

61 и

61 у

Агд

61 и

рго

АЗр

туг

Зег

61 и

Туг

куз

С1и

РЬе

куз

кеи

545

550

555

560

ТЬг

Уа1

61 и

АЗП

11е

61у

Туг

61 η

МеТ

кеи

Мет

Цуз

Мет

61 у

Тгр

куз

565

570

575

61 и

61 у

61и

С1у

кеи

61 у

Зег

б1и

61 у

С1п

61 у

11е

куз

АЗП

Рго

уа!

580

585

590

АЗП

1-У5

61у 595

ТЬг

ТЬГ

тЬг

Уа1

А5р 600

61у

А1а

61 у

РЬе

61 у 605

Не

А5р

Агд

Рго

А1а 610

61и

кеи

Зег

куз

61 и 615

Азр

Азр

61 и

Туг

61 и 620

А1а

РЬе

Агд

йуз

Агд

Мет

мег

кеи

А1а

Туг

Агд

РЬе

Агд

Рго

Азп

Рго

кеи

Азп .

АЗП

Рго

625

630

635

640

Агд Агд Рго Туг Туг

645 <210> 4 <211> 24

- 43 009956 <212> Белок <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Пептид, произведенный из Сап <400>4

Зег уа! с!п дзр ьеи Ьуз б!у Ьеи СТу Туг б!и Ьуз С1 у Ьуз рго Уа! 15 1015 б1у ьеи Уа! с!у Уа! ТНг С1и ьеи <210>5 <211» 16 ' <212> Белок <213> Искусственная последовательность <220>

11^гихи1д у π-ποικί са-1 <400> 5 '

С1у туг б!и ьуз с!у ьуэ рго Уа1 С1у ьеи Уа1 е!у уа! тНг С1и Ьеи 15 10 15 <210> 6 <211> 21 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Антисмысловые олигонуклеотиды относительно последовательности СагЬ <400> 6 21 аададдаьаа ддгададсьс с ^гх <210> 7 <211> 21 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Антисмысловой олигонуклеотид относительно последовательности СагЬ <400> 7 ааьдассаас сдгссстдда с

Claims (68)

1. Внутриклеточный полипептид (Сап), или его изоформа, или производное, способные взаимодействовать с прокаспазой, содержащие аминокислотную последовательность 8ЕО ΙΌ N0: 3.

- 44 009956

2. Полипептид по п.1. отличающийся тем. что он кодируется нуклеотидной последовательностью 8Е0 ΙΌ ΝΟ: 2 или ее сплайсинговым вариантом.

3. Полипептид по любому из пп.1 и 2. отличающийся тем. что он расщепляется ш νίΙΐΌ или ш νί\Ό каспазой.

4. Полипептид по п.1. отличающийся тем. что указанное производное способно ингибировать апоптотическое действие каспазы.

5. Полипептид по п.1. отличающийся тем. что указанное производное способно ингибировать взаимодействие Сап и каспазы.

6. Полипептид по п.1. отличающийся тем. что указанный полипептид. его изоформа или производное способны усиливать апоптотическое действие каспазы.

7. Полипептид по п.6. представляющий собой мутеин Ό600Ε.

8. Полипептид по любому из пп.2-7. отличающийся тем. что указанная каспаза является каспазой-8.

9. Фрагмент полипептида по п.4. содержащий фрагмент аминокислотной последовательности 8Е0 ΙΌ ΝΟ: 3 размером не менее 16 аминокислот. или его изоформа. или производное.

10. Фрагмент по п.9. отличающийся тем. что он оказывает доминантно-отрицательное действие на активность эндогенного полипептида Сап.

11. Фрагмент по п.9. отличающийся тем. что он содержит аминокислотную последовательность 8ЕЕ) ΙΌ ΝΟ: 4 или 8ЕЕ) ΙΌ ΝΟ: 5.

12. Слитый белок. содержащий полипептид по п.1 или его фрагмент.

13. Последовательность ДНК. кодирующая полипептид по любому из пп.1-8. или его изоформу. или фрагмент по пп.9-11. или слитый белок по п.12.

14. Последовательность ДНК по п.13. кодирующая полипептид Сап с аминокислотной последовательностью 8ЕО ΙΌ ΝΟ: 3.

15. Последовательность ДНК по п.13. содержащая ДНК 8ЕО ΙΌ ΝΟ: 2.

16. Последовательность ДНК по п.13. отличающаяся тем. что она кодирует мутеин Сап Ό600Ε.

17. Последовательность ДНК по п.13. кодирующая фрагмент с аминокислотной последовательностью 8ЕЕ) ΙΌ ΝΟ: 4 или 8ЕО ΙΌ ΝΟ: 5.

18. Последовательность ДНК. способная гибридизоваться при умеренно жестких условиях с последовательностью ДНК по п.13. в том числе с последовательностью ДНК 8ЕО ΙΌ ΝΟ: 2.

19. Рибозим. специфический для последовательности ДНК по любому из пп.13-17.

20. Антисмысловая олигонуклеотидная последовательность относительно последовательности ДНК по любому из пп.13-17. содержащая по меньшей мере 9 нуклеотидов.

21. Последовательность по п.20. представляющая собой последовательность 8ЕО ΙΌ ΝΟ: 6 или 8ЕО ΙΌ ΝΟ: 7.

22. Вектор. содержащий последовательность ДНК по любому из пп.13-17. 20 и 21 или рибозим по п.19.

23. Вектор по п.22. отличающийся тем. что он является экспрессирующим или вирусным вектором.

24. Вектор по п.22. отличающийся тем. что он содержит регуляторные последовательности ДНК. функциональные в клетках. для обеспечения возможности активации эндогенного гена Сап или эндогенного ингибитора Сап.

25. Поликлональное или моноклональное антитело. химерное антитело. полностью гуманизированное антитело. антиидиотипическое антитело или его фрагмент. которые были получены с использованием полипептида или его фрагмента по любому из пп.1-11.

26. Применение антитела по п.25 для иммуноанализа для обнаружения Сап в биологических жидкостях.

27. Клетка-хозяин. содержащая вектор по п.23.

28. Способ получения полипептида Сап или его изоформы. фрагмента. слитого белка или производного по любому из пп.1-12. включающий выращивание клетки-хозяина по п.27 и выделение полученного белка.

29. Способ по п.28. отличающийся тем. что клетка является эукариотической или прокариотической клеткой.

30. Способ по п.29. отличающийся тем. что эукариотическая клетка является клеткой млекопитающего. насекомого или дрожжей.

31. Способ по п.30. отличающийся тем. что клетка выбрана из клеток НеЬа. 293 Τ НЕК и СНО.

32. Способ получения полипептида Сап или его изоформы. фрагмента. слитого белка или производного по любому из пп.1-12. включающий получение трансгенного животного. содержащего последовательность ДНК. экспрессия которого приводит к синтезу полипептида Сап в организме животного. и выделение продуцируемого белка из жидкостей организма животного.

33. Генотерапевтический способ лечения воспалительного заболевания. выбранного из рассеянного склероза с первичной олигодендроглиопатией. аутоиммунного увеоретинита. диабета. системной красной волчанки. аутоиммунного миокардита Ι. опосредованного НСУ хронического гепатита. хронического гастрита. например гастрита типа А. смешанной соединительно-тканной болезни (ΜΟΤΌ). болезни

- 45 009956

Крона или язвенного колита, включающий индукцию экспрессии полипептида Сап или его фрагмента по любому из пп.1-11, или антисмыслового олигонуклеотида по п.20, и/или рибозима по п.19 в нужном участке организма пациента-человека.

34. Способ по п.33, отличающийся тем, что полипептид Сап представляет собой мутеин Ό600Ε.

35. Способ по п.33, отличающийся тем, что указанный фрагмент содержит аминокислотные остатки 414-437 8ΕΟ ΙΌ N0: 4 или 422-437 8ΕΟ ΙΌ N0: 5.

36. Способ по п.33, отличающийся тем, что антисмысловая олигонуклеотидная последовательность представляет собой последовательность 8Ε0 ΙΌ N0: 6 или 8Ε0 ΙΌ N0: 7.

37. Способ лечения воспалительного заболевания, выбранного из рассеянного склероза с первичной олигодендроглиопатией, аутоиммунного увеоретинита, диабета, системной красной волчанки, аутоиммунного миокардита Ι, опосредованного НСУ хронического гепатита, хронического гастрита, например гастрита типа А, смешанной соединительно-тканной болезни (МСТО), болезни Крона или язвенного колита, включающий регуляцию эндогенного Сап или ингибитора Сап нацеливанием вектора по п.24 на нужный участок организма пациента-человека.

38. Способ по п.37, включающий активацию эндогенного гена Сап или ингибитора Сап.

39. Применение полипептида Сап, его изоформы, фрагмента, слитого белка или производного по любому из пп.1-12 для понижающей регуляции каспазы при избыточной гибели клеток посредством апоптоза.

40. Применение по п.39, отличающееся тем, что указанный фрагмент содержит аминокислотные остатки 414-4 37 8ΕΕ) ΙΌ N0: 4.

41. Применение по п.39, отличающееся тем, что указанный фрагмент содержит аминокислотные остатки 422-437 8ΕΕ) ΙΌ N0: 5.

42. Применение последовательности по любому из пп.13-17, 20 и 21 для понижающей регуляции каспазы при избыточной гибели клеток посредством апоптоза.

43. Применение по п.42, отличающееся тем, что антисмысловая олигонуклеотидная последовательность представляет собой последовательность 8Ε0 ΙΌ N0: 6 или 8Ε0 ΙΌ N0: 7.

44. Применение вектора по любому из пп.22-24 для понижающей регуляции каспазы при избыточной гибели клеток посредством апоптоза.

45. Применение антитела по п.25 для понижающей регуляции каспазы при избыточной гибели клеток посредством апоптоза.

46. Применение по любому из пп.39-45, отличающееся тем, что каспаза является каспазой-8.

47. Применение по любому из пп.39-45, где апоптоз индуцируется посредством Т№-рецепторного пути передачи сигнала.

48. Применение полипептида Сап или его изоформы, фрагмента, слитого белка или производного по любому из пп.1-12 для повышающей регуляции активности каспазы и апоптоза в ситуациях, в которых требуется избыточная гибель клеток.

49. Применение по п.48, отличающееся тем, что полипептид Сап представляет собой мутеин Ό600Ε.

50. Применение ДНК по любому из пп.13-17, 20 и 21 для повышающей регуляции активности каспазы и усиления апоптоза в ситуациях, в которых требуется избыточная гибель клеток.

51. Применение вектора по любому из пп.22-24 для повышающей регуляции активности каспазы и усиления апоптоза в ситуациях, в которых требуется избыточная гибель клеток.

52. Применение антитела по п.25 для повышающей регуляции активности каспазы и усиления апоптоза в ситуациях, в которых требуется избыточная гибель клеток.

53. Применение по любому из пп.48-52, отличающееся тем, что каспаза является каспазой-8.

54. Фармацевтическая композиция, содержащая терапевтически эффективное количество соединения, выбранного из группы, состоящей из:

a) полипептида Сап, его изоформы, фрагмента, слитого белка или производного по любому из пп.1-12;

b) последовательности по любому из пп.13-17, 20 и 21;

c) рибозима по п.19;

б) вектора по любому из пп.22-24 и

е) антитела по п.25.

55. Фармацевтическая композиция по п.54 для лечения воспалительного заболевания, выбранного из рассеянного склероза с первичной олигодендроглиопатией, аутоиммунного увеоретинита, диабета, системной красной волчанки, аутоиммунного миокардита Ι, опосредованного НСУ хронического гепатита, хронического гастрита, например гастрита типа А, смешанной соединительно-тканной болезни (МСТО), болезни Крона или язвенного колита.

56. Фармацевтическая композиция по п.54 или 55, отличающаяся тем, что мутеин является мутантом Сап Ό600Ε.

57. Фармацевтическая композиция по п.54 или 55, отличающаяся тем, что указанный фрагмент содержит аминокислотные остатки 414-437 8Ε0 ΙΌ N0: 4 или 422-437 8Ε0 ΙΌ N0: 5.

58. Фармацевтическая композиция для лечения рака, содержащая терапевтически эффективное ко

- 46 009956 личество соединения, выбранного из группы, состоящей из:

a) полипептида Сап, его изоформы, фрагмента, слитого белка или производного по любому из пп.1-12;

b) последовательности по любому из пп.13-17, 20 и 21;

c) рибозима по п.19;

б) вектора по любому из пп.22-24 и

е) антитела по п.25.

59. Фармацевтическая композиция по п.58, отличающаяся тем, что полипептид Сап представляет собой мутеин 0600Е.

60. Способ выделения, идентификации и клонирования другого полипептида того же самого класса, к которому относится Сап, включающий скрининг библиотеки ДНК с помощью последовательности по любому из пп.13-17, 20 и 21 или рибозима по п.19.

61. Применение антитела по п.25 для совместной иммунопреципитации каспазы и полипептида того же самого класса, к которому относится Сап, из пробы, представляющей собой жидкость организма, клеточный экстракт или экспрессионную библиотеку ДНК.

62. Способ выделения полипептидов или факторов, участвующих в процессах внутриклеточной передачи сигнала, включающий использование полипептида Сап или его изоформы, фрагмента, слитого белка или производного по любому из пп.1-12 в качестве жертвы или приманки в двугибридном дрожжевом способе.

63. Способ выделения полипептида или фактора, участвующего в процессах внутриклеточной передачи сигнала, из проб, представляющих собой клеточные экстракты, жидкости организма и экспрессионные библиотеки, включающий совместную иммунопреципитацию Сап и полипептидов или факторов, участвующих во внутриклеточной передаче сигнала, с использованием антитела по п.25.

64. Способ скрининга пептида или молекулы-антагониста Сап, включающий отбор молекул, способных ингибировать взаимодействие Сап или его изоформы, фрагмента, слитого белка или производного по любому из пп.1-12 с прокаспазой-8.

65. Способ скрининга пептида или молекулы-антагониста Сап, включающий отбор молекул, способных ингибировать апоптоз, усиленный Сап или его изоформой, фрагментом, слитым белком или производным по любому из пп.1-12.

66. Способ лечения и/или профилактики нарушения, выбранного из рассеянного склероза с первичной олигодендроглиопатией, аутоиммунного увеоретинита, диабета, системной красной волчанки, аутоиммунного миокардита I, опосредованного НСУ хронического гепатита, хронического гастрита, например гастрита типа А, смешанной соединительно-тканной болезни (МСТО), болезни Крона, язвенного колита или злокачественной опухоли, включающий введение пациенту, нуждающемуся в этом, фармацевтически эффективного количества соединения, выбранного из группы, состоящей из:

a) полипептида Сап, его изоформы, фрагмента, слитого белка или производного по любому из пп.1-12;

b) последовательности по любому из пп.13-17, 20 и 21;

c) рибозима по п.19;

б) вектора по любому из пп.22-24 и

е) антитела по п.25.

67. Способ по любому из пп.62, 64, 65 и 66, отличающийся тем, что полипептид Сап представляет собой мутеин 0600Е.

68. Способ по любому из пп.62, 64 и 66, отличающийся тем, что фрагмент содержит аминокислотные остатки 414-437 8ЕО ΙΌ N0: 4 или 422-437 8ЕО ΙΌ N0: 5.

МРЕ’3₽.ЧЬУР1СЕ01РЗЕОЬА5ЪКГ1₁ЗЕРУ1 ΡβΕΚβΕ РI КРАЬМЬЕ'ОЕЬОЕКВМЬЕЕЗЫЬЗ ГЬКЕЬЬГКгайЬаЕЬГТУЬКТККЕЕМЕЕЕЬОТРеНАОТЗАУЕГНГСКМЗИАЕАЫЗОСаТО 3 УРГНККУРНЪЫКУМЬУ013ЕЕУ8КЗЕЬН5 ЕКЕЬЪ0ЕЕ1ЗКСКЬРРРМКЫЯЛ ΕΊΕΜΕΚ ЕУ1ЬбЕСКЬР1ЕККУСА01№ЗЬЬК11ЫРУЕЕЕЗКвЕЕЬСдУМТГЗРЗРЕЕОР$ДЗОТ1Д КУУОИК5КРПСУСЫ1ЫЫНКГАКАЙЕКУРКЬН81КРКН6ТНЬРА5АЬТТТГЕЕЬНГЕ1КР НЙ0СТУЕ01ΥΕ1ЪК1УОЬМРНЗИМРСПСС 1ЬЗНСР№ 11УСТРС0ЕАР1УЕЬТЗОЕТСЬ КСР51АСКРКУЕГ10АС0еРКУ0КСДРУЕТР5ЕЕ0РУЬЕМР1>55Р0ТКУ1РРЕАРГЬЬСМ АТУЦМСУЗУЕНРАЕеТ^У103ЬС03ЬКЕКСРКСР01ЕТ1ЬТЕУЫУЕУЗЫКОРКККМСК0М РОРТГТЬЙККЪУРРЗ р