MXPA01005425A

MXPA01005425A - Polipeptidos de transmembrana y secretados y acidos nucleicos que codifican los mismos.

Info

Publication number: MXPA01005425A
Application number: MXPA01005425A
Authority: MX
Inventors: Paul J Godowski
Original assignee: Genentech Inc
Priority date: 1998-12-01
Filing date: 1999-12-01
Publication date: 2002-04-24
Also published as: AU2474700A; EP1135495A2; US20040235109A1; WO2000032776A3; CA2347677A1; KR20010081111A; WO2000032776A2; JP2003524387A

Abstract

La presente invencion esta dirigida a los polipeptidos de membrana y secretados y a las moleculas de acido nucleico que codifican esos polipeptidos. Tambien se proporcionan aqui vectores y celulas hospederas que comprenden aquellas secuencias de acidos nucleicos, moleculas de polipeptidos quimericos que comprenden los polipeptidos de la presente invencion fusionados a secuencias de polipeptidos heterologas, anticuerpos que se enlazan a los polipeptidos de la presente invencion y a metodos para la produccion de polipeptidos de la presente invencion.

Description

POLIPEPTIDOS DE TRANSMEMBRANA Y SECRETADOS Y ÁCIDOS NUCLEICOS QUE CODIFICAN LOS MISMOS CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención se refiere en general a la identificación y aislamiento del nuevo ADN y a la producción recombinante de nuevos polipéptidos. ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Las proteínas extracelulares juegan papeles importantes en, entre otras cosas, la formación, diferenciación y mantenimiento de los organismos multicelulares. El destino de muchas células individuales, por ejemplo, la proliferación, migración, diferenciación, o interacción con otras células, está gobernado típicamente por la información recibida de otras células y/o del medio ambiente inmediato. Esta información a menudo se transmite mediante polipéptidos secretados (por ejemplo, factores mitogénicos, factores de sobrevivencia, factores citotóxicos, factores de diferenciación, neuropéptidos y hormonas) los cuales, a su vez, son recibidos e interpretados por diversos receptores celulares o proteínas enlazadas a la membrana. Estos polipéptidos secretados o moléculas de señalización normalmente pasan a través de la Ref. No. 128959 trayectoria secretoria celular para alcanzar su sitio de acción en el medio ambiente extracelular. Las proteínas secretadas tienen varias aplicaciones industriales, que incluyen el uso como agentes farmacéuticos, de diagnósticos, biosensores y bio-reactores. La mayoría de los fármacos proteinicos disponibles en el presente, tales como los agentes tromboliticos, interferones, interleucinas, eritropoietinas, factores de estimulación de la colonia, y varias otras citocinas, son proteínas secretorias. Sus receptores, los cuales son proteínas enlazadas a la membrana, también tienen uso potencial como agentes de diagnóstico o terapéuticos. Se han realizado esfuerzos tanto por la industria como por la academia para identificar nuevas proteínas secretadas, nativas. Muchos esfuerzos están enfocados en la selección de bibliotecas de ADN recombinantes de mamífero para identificar las secuencias de codificación para nuevas proteínas secretadas. Los ejemplos de los métodos y técnicas de selección se describen en la literatura [ver, por ejemplo, Klein et al., Proc. Nati. Acad. Sci. 93:7108-7113 (1996); Patente Norteamericana No. 5,536,637)]. Las proteínas enlazadas a la membrana y los receptores pueden jugar papeles importantes en, entre otras cosas, la formación, diferenciación y mantenimiento de los organismos multicelulares. El destino de muchas células individuales, por ejemplo, la proliferación, migración, diferenciación, o interacción con otras células, está gobernado típicamente por la información recibida de otras células y/o del medio ambiente inmediato. Esta información a menudo se transmite mediante polipéptidos secretados (por ejemplo, factores mitogénicos, factores de sobrevivencia, factores citotóxicos, factores de diferenciación, neuropéptidos, y hormonas) los cuales, a su vez, son recibidos e interpretados por diversos receptores celulares o proteínas enlazadas a la membrana. Tales proteínas enlazadas a la membrana y los receptores celulares incluyen, pero no están limitados a, receptores de citocina, cinasas receptoras, fosfatasas receptoras, receptores implicados en las interacciones célula-célula, y las moléculas de adhesina celulares como las selectinas e integrinas. Por ejemplo, la transducción de señales que regulan el crecimiento y la diferenciación celular se regulan en parte por la fosforilación de varias proteínas celulares. Las proteínas tirosina cinasas, enzimas que catalizan ese proceso, también pueden actuar como receptores del factor de crecimiento. Los ejemplos incluyen el receptor del factor de crecimiento de los fibroblastos y el receptor del factor de crecimiento de los nervios. Las proteínas enlazadas a la membrana y las moléculas receptoras también tienen varias aplicaciones industriales, que incluyen los agentes de diagnóstico o terapéuticos. Las inmunoadhesinas receptoras, por ejemplo, se pueden emplear como agentes terapéuticos para bloquear la interacción receptor-ligando. Las proteínas enlazadas a la membrana también se pueden emplear para separar el péptido potencial o los inhibidores de moléculas pequeñas de la interacción relevante del receptor/ligando. Se han realizado esfuerzos tanto por la industria como por la academia para identificar nuevas proteínas receptoras o enlazadas a la membrana, nativas. Muchos esfuerzos están enfocados a la selección de las bibliotecas de ADN recombinantes de mamífero para identificar las secuencias de codificación para nuevas proteínas receptoras o enlazadas a la membrana. 1. PR0241 El cartílago es un tejido conectivo especializado con una matriz extracelular grande que contiene una red densa de fibras de colágeno y un alto contenido de proteoglicanos . Mientras que la mayoría del proteoglicano en el cartílago es aggrecano, el cual contiene muchas cadenas de sulfato de queratina y sulfato de condroitina y forma agregados multimoleculares enlazándose con la proteína de enlace al hialuronano, el cartílago también contiene un número de proteoglicanos de peso molecular más pequeño. Uno de estos proteoglicanos de peso molecular más pequeño es una proteína llamada biglicano, un proteoglicano el cual está ampliamente distribuido en la matriz extracelular de varios otros tejidos conectivos que incluyen los tendones, el tejido esclerótico, piel, y similares. Se sabe que el biglicano posee las secuencias de repetición ricas en leucina y dos cadenas de sulfato de condroitina/sulfato de dermatano y funcionan para enlazarse el dominio de enlace a la célula de la fibronectina de manera que inhibe la unión celular a la misma. Se especula que los proteoglicanos de peso molecular pequeño tal como el biglicano pueden jugar papeles importantes en el crecimiento y/o reparación de los cartílagos y en los padecimientos degenerativos tal como la artritis. Como tal, hay un interés en identificar y caracterizar nuevos polipéptidos que tengan homología a la proteína de biglicano. Se describe aquí la identificación y caracterización de nuevos polipéptidos que tienen homología a la proteína de biglicano, en donde aquellos polipéptidos se designan aquí como polipéptidos PR0241. 2. PR0243 La cordina (Xenopus, Xchd) es un factor soluble secretado por el organizador de Spemann el cual tiene una actividad dorsalizante potente (Sasai et al . , Cell 1_9 : 779- 90 (1994); Sasai et al . , Na ture 376: 333-36 (1995). Otros factores dorsalizantes secretados por el organizador son la noggina (Smith y Harían, Cell 70: 829-840 (1992); Lamb et al . , Science 262: 713-718 (1993) y la folistatina (Hemmanti-Brivanlou et al . , Cell 77: 283-295 (1994). La cordina subdivide el ectodermo primitivo en dominios neural contra no neural, e induce la formación del notocordio y los músculos mediante la dorsalización del mesodermo. Esto lo hace funcionando como un antagonista de las señales ventralizantes BMP-4. Esta inhibición es mediada mediante el enlace directo de la cordina al BMP-4 en el espacio extracelular, evitando así la activación del receptor BMP-4 mediante BMP-4 (Piccolo et al . , Develop . Biol . 182: 5-20 (1996) . El BMP-4 se expresa en un gradiente desde el lado ventral del embrión, mientras que la cordina se expresa en un gradiente complementario a aquél del BMP-4. La cordina antagoniza el BMP-4 para establecer el extremo inferior del gradiente de BMP-4. Así, el equilibrio entre la señal a partir de la cordina y otros factores derivados del organizador contra la señal del BMP proporciona la capa germinal del ectodermo con su información de la posición dorsal-ventral. La cordina también puede estar involucrada en la formación del patrón dorsal-ventral del sistema nervioso central (Sasai et al . , Cell 79: 779-90 (1994). También induce exclusivamente los tejidos neurales anteriores (tipo parte anterior del cerebro) , anteriorizando así el tipo neural (Sasai et al . , Cell 79: 779-90 (1997). Dado su papel en la inducción y formación del patrón de las neuronas, la cordina puede probar ser útil en el tratamiento de padecimientos neurodegenerativos y daño neural, por ejemplo, debido al trauma o después de la quimioterapia. Se describe aquí la identificación y caracterización de nuevos polipéptidos que tienen homología a la proteína cordina, en donde aquellos polipéptidos se designan aquí como polipéptidos PR0243. 3. PR0299 Las proteínas notch están involucradas en la señalización durante el desarrollo. Pueden efectuar un desarrollo asimétrico potencial y pueden señalizar la expresión de otras proteínas involucradas en el desarrollo. [Ver Robey, E., Curr. Opin. Genet. Dev., 7 (4) :551 (1997), Simpson, P., Curr. Opin. Genet. Dev., 7 (4) :537 (1997), Blobel, CP., Cell, 90 (4) :589 (1997)], Nakayama, H. et al., Dev. Genet., 21 (1) :21 (1997), Nakayama, H. et al., Dev. Genet. , 21 (1) :21 (1997), Sullivan, S.A. et al., Dev. Genet., 20(3) :208 (1997) y Hayashi, H. et al., Int. J. Dev. Biol., 40(6) : 1089 (1996)]. La activación mediada por el serrato de las proteínas notch se ha observado en el compartimento dorsal del disco imaginal de las alas de la Drosophila. Fleming, et al., Development, 124 (15) : 2973-81 (1997). La proteína notch es de interés tanto por su papel en el desarrollo así como por sus capacidades de señalización. También de interés son los nuevos polipéptidos que pueden jugar un papel en el desarrollo y/o señalización. Se describe aquí la identificación y caracterización de nuevos polipéptidos que tienen homología a la proteína notch, en donde aquellos polipéptidos se designan aquí como polipéptidos PR0299. 4. PR0323 Las dipeptidasas son proteínas enzimáticas que funcionan para escindir una gran variedad de dipéptidos diferentes y que están involucradas en un gran número de procesos biológicos muy importantes en organismos mamíferos y no mamíferos. Numerosas enzimas de dipeptidasas diferentes a partir de una variedad de organismos de mamíferos y no mamíferos diferentes, se han identificado y caracterizado. Las enzimas de dipeptidasas de mamíferos juegan papeles importantes en muchos procesos biológicos diferentes que incluyen, por ejemplo, la digestión de las proteínas, la activación, inactivación, o modulación de la actividad de la hormona dipeptídica, y la alteración de las propiedades físicas de las proteínas y enzimas. A la luz de los papeles fisiológicos importantes que juegan las enzimas dipeptidasas, se han realizado esfuerzos actualmente tanto por la industria como por la academia para identificar nuevos homólogos de dipeptidasas nativos. Muchos de estos esfuerzos están enfocados a la selección de bibliotecas de ADN recombinante de mamíferos para identificar las secuencias que codifican las nuevas proteínas del receptor de enlace a la membrana y secretadas. Los ejemplos de métodos y técnicas de selección se describen en la literatura [ver, por ejemplo, Klein et al., Proc. Nati. Acad. Sci., 93:7108-7113 (1996); Patente Norteamericana No. 5,536,637)]. Se describe aquí la identificación de nuevos polipéptidos que tienen homología con varias enzimas de dipeptidasa, designados aquí como polipéptidos PR0323. 5. PR0327 La prolactina, la hormona de la pituitaria anterior está codificada por un miembro de la familia de los genes de la hormona del crecimiento/prolactina/lactógeno placentario. En mamíferos, la prolactina es la responsable del desarrollo de las glándulas mamarias y la lactancia. La prolactina funciona para estimular la expresión de los genes de la proteína de la leche incrementado tanto la transcripción de los genes como la vida media del ARNm. Los efectos fisiológicos de la proteína prolactina están mediados a través de la capacidad de la prolactina para enlazarse a un receptor de la prolactina de la superficie celular. El receptor de prolactina se encuentra en una variedad de tipos de células diferentes, tiene una masa molecular de aproximadamente 40,000 y aparentemente no está enlazado por los enlaces de disulfuro así mismo o a otras subunidades. Los niveles del receptor de prolactina están regulados diferencialmente dependiendo del tejido estudiado. Dados los papeles fisiológicos importantes que juegan las moléculas del receptor de la superficie celular in vivo, se han hecho esfuerzos en el presente tanto por la industria como por la academia para identificar nuevas proteínas receptoras enlazadas a la membrana, nativas, que incluyen aquéllas las cuales comparten la homología de la secuencia con el receptor de prolactina. Muchos de estos esfuerzos están enfocados en la selección de las bibliotecas de ADN recombinante de mamíferos para identificar las secuencias de codificación para las nuevas proteínas del receptor enlazado a la membrana. Los ejemplos de métodos y técnicas de selección se describen en la literatura [ver, por ejemplo, Klein et al., Proc. Nati. Acad. Sci., 9_3: 7108-7113 (1996); Patente Norteamericana No. 5,536,637)]. Se describe aquí la identificación y caracterización de los nuevos polipéptidos que tienen homología significativa a la proteína del receptor de prolactina, designados aquí como polipéptidos PR0327. 6. PR0233 Los estudios han reportado que el estado de redox de las células es un factor determinante importante del destino de las células. Además, las especies que reaccionan con el oxígeno se han reportado como citotóxicas, que provocan el padecimiento inflamatorio, que incluye la necrosis de tejidos, falla de los órganos, aterosclerosis, infertilidad, defectos de nacimiento, envejecimiento prematuro, mutaciones y malignidades. Así, el control de la oxidación y reducción es importante por un número de razones, que incluyen el control y la prevención de las apoplejías, ataques al corazón, esfuerzos oxidativos, hipertensión. Los radicales y antioxidantes libres de oxígeno parecen jugar un papel importante en el sistema nervioso central después de la isquemia y reperfusión cerebral. Además, el daño cardiaco, relacionado a la isquemia y reperfusión se ha reportado como causada por la acción de los radicales libres. En relación a esto, las reductasas, y particularmente, las oxidoreductasas, son de interés. Además, los factores de transcripción, NF-kappa B y AP-1, son conocidos como reguladores del estado redox y afectan la expresión de una gran variedad de genes que se piensa que están involucrados en la patogénesis del SIDA, cáncer, aterosclerosis y complicaciones diabéticas. Las publicaciones que describen adicionalmente esta materia incluyen Kelsey et al., Br. J. Cáncer, 76(7):852-4 (1997); Friedrich y Weiss, J. Theor. Biol., 187 (4 ): 259-40 (1997) y Pieulle, et al., J. Bacteriol., 179 ( 18 ): 5684-92 (1997). Dada la importancia fisiológica de las reacciones redox in vivo, se han realizado esfuerzos para identificar nuevas proteínas nativas que estén implicadas en las reacciones redox. Se describe aquí la identificación de nuevos polipéptidos que tienen homología a la reductasa, designados aquí como polipéptidos PR0233. 7. PR0344 Las proteínas complementarias comprenden un grupo grande de proteínas del suero algunas de las cuales actúan en una cascada enzimática, produciendo las moléculas efectoras involucradas en la inflamación. Las proteínas complementarias son de importancia fisiológica particular para regular el movimiento y la función de las células involucradas en la inflamación. Dada la importancia fisiológica de la inflamación y los mecanismos relacionados in vivo, se han hecho esfuerzos en el presente para identificar nuevas proteínas nativas que estén involucradas en la inflamación. Se describe la identificación y caracterización de nuevos polipéptidos que tienen homología a las proteínas complementarias, en donde aquellos polipéptidos se designan aquí como polipéptidos PR0344. 8. PR0347 Las proteínas ricas en cisteína son en general proteínas que tienen estructuras tridimensionales y/o existen en formas multiméricas debido a la presencia de numerosos residuos de cisteína los cuales son capaces de formar puentes de disulfuro. Una proteína rica en cisteína bien conocida es el receptor de mannosa el cual está expresado en, entre otros tejidos, el hígado en donde sirve para enlazar la mannosa y transportarla hacia las células del hígado. Se conoce que otras proteínas ricas en cisteína juegan papeles importantes en muchos otros procesos fisiológicos y bioquímicos. Como tales, hay un interés en identificar nuevas proteínas ricas en cisteína. En relación a esto, los solicitantes describen aquí la identificación y caracterización de nuevos polipéptidos ricos en cisteína que tienen homología de secuencia significativa con la proteína-3 secretoria rica en cisteína, designados aquí como polipéptidos PR0347. 9. PR0354 El inhibidor de inter-alfa-tripsina (ITI) es un inhibidor de proteasa circulante grande (Mr aproximadamente 240,000) encontrado en el plasma de muchas especies de mamíferos. El inhibidor intacto es una glicoproteína y consiste de tres subunidades glicosiladas que interactúan a través de un enlace de glicosaminoglicano fuerte. La actividad anti-tripsina del ITI está localizada en la subunidad más pequeña (es decir, la cadena ligera) del complejo, en donde esa cadena ligera es conocida ahora como la proteína bikunina. La cadena ligera madura consiste de una secuencia N-terminal de 21 aminoácidos, glicosilada en Ser-10, seguida por dos dominios tipo Kunitz en tándem, el primero de los cuales está glicosilado en Asn-45 y el segundo de los cuales es capaz de inhibir la tripsina, quimiotripsina y plasmina. Las dos cadenas restantes del complejo ITI son cadenas pesadas que funcionan para interactuar con la cadena ligera activa enzimáticamente del complejo.

Se han realizado esfuerzos tanto por la industria como por la academia para identificar nuevas proteínas nativas. Muchos de estos esfuerzos están enfocados a la selección de bibliotecas de ADN recombinante de mamíferos para identificar las secuencias que codifican las nuevas proteínas del receptor de enlace a la membrana y secretadas. Los ejemplos de métodos y técnicas de selección se describen en la literatura [ver, por ejemplo, Klein et al., Proc. Nati. Acad. Sci., 93:7108-7113 (1996); Patente Norteamericana No. 5,536,637)]. Se describe aquí la identificación y caracterización de nuevos polipéptidos que tienen homología significativa con la cadena pesada de ITI, designados en la presente solicitud como polipéptidos PR0354. 10. PR0355 La molécula asociada con las células T, reguladora o citotóxica o proteína "CRTAM" está relacionada estructuralmente a la superfamilia de las inmunoglobulinas. La proteína CRTAM deberá ser capaz de mediar varias respuestas inmunes. Los anticuerpos típicamente se enlazan a las proteínas CRTAM con alta afinidad. Zlotnik, A., Faseb, 10(6): A1037, Abr. 216, Junio de 1996. Dada la importancia fisiológica de los antígenos de las células T y los procesos inmunes in vivo, se han hecho esfuerzos en el presente tanto para identificar nuevas proteínas nativas las cuales estén involucradas en las respuestas inmunes. Ver también Kennedy et al., Patente Norteamericana No. 5,686,257 (1997). Se describe la identificación y caracterización de nuevos polipéptidos que tienen homología a la CRTAM, designados en la presente solicitud como polipéptidos PR0355. 11. PR0357 Las interacciones proteína-proteína incluyen aquéllas involucradas con los complejos de receptor y antígeno y los mecanismos de señalización. Conforme se conoce más acerca de los mecanismos estructurales y funcionales en los que descansan las interacciones proteína-proteína, se pueden manipular más fácilmente las interacciones proteína-proteína para regular el resultado particular de la interacción proteína-proteína. Así, los mecanismos en los que descansan las interacciones proteína-proteína son de interés para la comunidad científica y médica. Todas las proteínas que contienen repeticiones ricas en leucina se piensa que están implicadas en las interacciones proteína-proteína. Las repeticiones ricas en leucina son porciones de secuencia corta presentes en un número de proteínas con diversas funciones y localizaciones celulares. La estructura cristalina de la proteína inhibidora de la ribonucleasa ha revelado que las repeticiones ricas en leucina corresponden a las unidades estructurales beta-alfa. Estas unidades están arregladas de manera que forman una lámina beta paralela con una superficie expuesta al solvente, de manera que la proteína adquiere una forma no globular, inusual. Estas dos características han sido indicadas como responsables de las funciones proteína-enlace de las proteínas que contienen repeticiones ricas en leucina. Ver, Kobe y Deisenhofer, Trends Biochem. Sci. 19 (10) : 415-421 (Oct. de 1994). Se ha reportado un estudio sobre proteoglicanos ricos en leucina que sirven como organizadores de tejido, orientadores y ordenadores de fibrillas de colágeno durante la ontogenia y están implicados en procesos patológicos tales como la curación de las heridas, la reparación de los tejidos, y la formación del estroma del tumor. Iozzo, R. V., Crit. Rev. Biochem. Mol. Biol., 32 (2) : 141-174 (1997). Otros estudios que implican a las proteínas ricas en leucina en la curación de las heridas y en la reparación de los tejidos, son: De La Salle, C, et al., Vouv. Rev. Fr. Hematol. (Alemania), 37 (4) : 215-222 (1995), que reporta mutaciones en las porciones ricas en leucina en un complejo asociado con el padecimiento de sangrado del síndrome de Bernard-Soulier, Chlemetson, K. J. , Thromb. Haemost. (Alemania), 74(1): 111-116 (Julio de 1995) , reporta que las plaquetas tienen repeticiones ricas en leucina y Ruoslahti, E. I., et al., WO9110727-A por La Jolla Cáncer Research Foundation reporta que el enlace de la decorina al factor ß del crecimiento transformante tiene implicación en el tratamiento para el cáncer, la curación de las heridas y en la formación de cicatrices. Relacionada por la función a este grupo de proteínas está el factor de crecimiento similar a la insulina (IGF), en que es útil en la curación de heridas y está asociado con las terapias relacionadas con el re- crecimiento del tejido, tales como el tejido conectivo, la piel y los huesos; en la promoción del crecimiento del cuerpo en los humanos y animales; y en la estimulación de otros procesos relacionados con el crecimiento. La subunidad lábil del ácido (ALS) de IGF también es de interés en que incrementa la vida media del IGF y es parte del complejo IGF in vivo. Otra proteína que se ha reportado que tiene repeticiones ricas en leucina es la proteína SLIT que se ha reportado como útil en el tratamiento de padecimientos neuro-degenerativos tales como el padecimiento de Alzheimer, el daño de los nervios tales como en el padecimiento de Parkinson y el diagnóstico de cáncer, ver, Artavanistsakonas, S. y Rothberg, J. M., WO9210518-A1 por la Universidad de Yale. También de interés es el LIG-1, una glicoproteína de la membrana que está expresada específicamente en >las células gliales en el cerebro de ratón y tiene repeticiones ricas en leucina y dominios similares a la inmunoglobulina. Suzuki, et al., J. Biol. Chem. (U.S.), 271 (37 ): 22522 (1996). Otros estudios que se reportan sobre las funciones biológicas de las proteínas que tienen repeticiones ricas en leucina incluyen: Tayar, N., et al., Mol. Cell Endocrinol . , (Irlanda), 125 (1-2) : 65-70 (Dic. de 1996) (implicación del receptor de gónadotropina) ; Miura, Y., et al., Nippon Rinsho (Japón), 54 (7) : 1784-1789 (Julio de 1996) (implicación de la apoptosis); Harris, P. C, et al., J. Am. Soc. Nephrol., 6 (4) : 1125-1133 (Oct. de 1995) (implicación del padecimiento del riñon) . Se han hecho esfuerzos tanto por la industria como por la academia para identificar nuevas proteínas que tengan repeticiones ricas en leucina para entender mejor las interacciones proteína-proteína. De particular interés son aquellas proteínas que tienen repeticiones ricas en leucina y homología con las proteínas conocidas que tienen repeticiones ricas en leucina tales como la subunidad lábil de ácido del factor de crecimiento similar a la leucina. Muchos esfuerzos se han enfocado a la selección de bibliotecas de ADN recombinantes de mamíferos para identificar las secuencias de codificación para nuevas proteínas enlazadas a la membrana y secretadas que tengan repeticiones ricas en leucina. Los ejemplos de métodos y técnicas de selección se describen en la literatura [ver, por ejemplo, Klein et al., Proc. Nati. Acad. Sci., 93 : 7108-7113 (1996); Patente Norteamericana No. 5,536,637)]. Se describe la identificación y caracterización de nuevos polipéptidos que tienen homología a la subunidad lábil de ácido del factor de crecimiento similar a la insulina, en donde aquellos polipéptidos se designan PR0357. 12. PR0715 El control de numerosas células en mamíferos, se cree que está determinado, en parte, por un equilibrio entre la proliferación celular y la muerte celular. Una forma de la muerte celular, a menudo está referida como una muerte celular necrótica, está caracterizada típicamente como una forma patológica de muerte celular que resulta de algunos traumas o daños celulares. En contraste, hay otra forma "fisiológica" de muerte celular que usualmente procede de una manera controlada u ordenada. Esta forma controlada u ordenada de muerte celular a menudo está referida como "apoptosis" [ver, por ejemplo, Barr et al., Bio/Technology, 12:487-493 (1994); Steller et al., Science, 267:1445-1449 (1995) ] . La muerte celular apoptótica ocurre de manera natural en muchos procesos fisiológicos, que incluyen el desarrollo embriónico y la selección clonal en el sistema inmune [Itoh et al., Cell, 6^:233-243 (1991)]. Los niveles disminuidos de muerte celular apoptótica han sido asociados con una variedad de condiciones patológicas, que incluyen el cáncer, el lupus, y la infección por virus herpes [Thompson, Science, 267: 1456-1462 (1995)]. Los niveles incrementados de muerte celular apoptótica se pueden asociar con una variedad de otras condiciones patológicas, que incluyen el SIDA, el padecimiento de Alzheimer, el padecimiento de Parkinson, la esclerosis lateral amiotrófica, la esclerosis múltiple, la retinitis pigmentosa, la degeneración cerebelar, la anemia aplástica, el infarto al miocardio, apoplejía, el daño por reperfusión, y el padecimiento del hígado inducido por toxinas [ver, Thompson, supra] . La muerte celular apoptótica típicamente está acompañada por uno o más cambios morfológicos y bioquímicos característicos en las células, tales como la condensación del citoplasma, la pérdida de los microvilus de la membrana del plasma, la segmentación del núcleo, la degradación del ADN cromosómico o la pérdida de la función mitocondrial. Una variedad de señales extrínsecas e intrínsecas se cree que generan o inducen tales cambios celulares morfológicos y bioquímicos [Raff, Nature, 3_56:397-400 (1992); Steller supra; Sachs et al., Blood, 82:15 (1993)]. Por ejemplo, se pueden generar mediante estímulo hormonal, tales como las hormonas glucocorticoides para los timocitos inmaduros, así como la extracción de ciertos factores de crecimiento [Watanabe-Fukunaga et al., Nature, 356:314-317 (1992)].

También, algunos oncogenes identificados como myc, reí , y ElA, y los supresores de tumores, tales como p53, se ha reportado que tienen un papel en la inducción de la apoptosis. Asimismo se ha observado que ciertos fármacos quimioterapéuticos y algunas formas de radiación tienen la actividad que induce la apoptosis [Thompson, supra] . Varias moléculas, tales como el factor a de la necrosis del tumor ("TNF-a") , el factor ß de la necrosis del tumor ("TNF-ß" ó "linfotoxina a") , la linfotoxina ß ("LT-ß") , el ligando CD30, el ligando CD27, el ligando CD40, el ligando OX-40, el ligando 4-1BB, el ligando Apo-1 (también referido como ligando Fas o ligando CD95) , y el ligando Apo- 2 (también referido como TRAIL) han sido identificados como miembros de la familia del factor de necrosis del tumor ("TNF") de las citocinas [Ver, por ejemplo, Gruss y Dower, Blood, 85:3378-3404 (1995); Pitti et al., J. Biol. Chem., 271:12687-12690 (1996); Wiley et al., Immunity, 3:673-682 (1995); Browning et al., Cell, 72:847-856 (1993); Armitage et al., Nature, 357:80-82 (1992), WO 97/01633 publicada el 16 de Enero de 1997; WO 97/25428 publicada el 17 de Julio de 1997] . Entre estas moléculas, el TNF-a, TNF-ß, el ligando CD30, el ligando 4-1BB, el ligando Apo-1, el ligando Apo-2, (TRAIL) se han reportado como implicados en la muerte celular apoptótica. Se ha reportado que tanto TNF-a como TNF-ß inducen la muerte apoptótica en células tumorales susceptibles [Sch id et al., Proc. Nati. Acad. Sci., 83: 1881 (1986); Dealtry et al., Eur. J. Immunol., 17:689 (1987)]. Zheng et al. ha reportado que el TNF-a está involucrado en la apoptosis post-estimulación de las células T positivas CD8 [Zheng et al., Nature, 3T7:348-351 (1995)]. Otros investigadores han reportado que el ligando CD30 puede estar involucrado en la eliminación de células T auto-reactivas en el timo [Amakawa et al., Cold Spring Harbor Laboratory Symposium on Programmed Cell Death, Abstr. No. 10, (1995)]. Las mutaciones en el receptor Fas/Apo-1 del ratón o los genes de ligando (llamados Ipr y gld, respectivamente) han sido asociados con algunos padecimientos autoinmunes, que indican que el ligando Apo-1 puede jugar un papel en la regulación de la eliminación clonal de los linfocitos auto-reactivos en la periferia [Krammer et al., Curr. Op. Immunol., 6:279-289 (1994); Nagata et al., Science, 267:1449-1456 (1995)]. El ligando Apo-1 también está reportado por inducir la apoptosis post-estimulación en los linfocitos T positivos CD4 y en los linfocitos B, y puede estar involucrado en la eliminación de los linfocitos activados cuando su función no se requiere más [Krammer et al., supra; Nagata et al., supra] . Los anticuerpos monoclonales de ratón, agonistas, enlazados específicamente al receptor Apo-1 han sido reportados como que muestran una actividad de muerte celular que es comparable o similar a aquélla de TNF-a [Yonehara et al., J. Exp. Med., 169: 1747-1756 (1989)]. La inducción de varias respuestas celulares mediadas por tales citocinas de la familia TNF se cree que está iniciada por su enlace a receptores celulares específicos. Dos receptores TNF distintos de aproximadamente 55 kDa (TNFR1) y 75 kDa (TNFR2) han sido identificados [Hohman et al., J. Biol. Chem., 264:14927-14934 (1989); Brockhaus et al., Proc. Nati. Acad. Sci., 82:3127-3131 (1990); EP 417,563, publicada el 20 de Marzo de 1991] y los ADNc de ratón y de humanos que corresponden a ambos tipos de receptores han sido aislados y caracterizados [Loetscher et al., Cell, 61:351 (1990); Schall et al., Cell, 61:361 (1990); Smith et al., Science, 248:1019-1023 (1990); Lewis et al., Proc. Nati. Acad. Sci., 8^:2830-2834 (1991); Goodwin et al., Mol. Cell. Biol., 11:3020-3026 (1991)]. Los ligandos de la familia TNF identificados hasta ahora, con excepción de la linfotoxina-a, son proteínas de transmembrana del tipo II, cuyo C-terminal es extracelular. En contraste, la mayoría de los receptores en la familia del receptor TNF (TNFR) identificados hasta ahora son proteínas de transmembrana del tipo I. En ambas familias del ligando TNF y del receptor, sin embargo, la homología identificada entre los miembros de la familia se ha encontrado principalmente en el dominio extracelular ("ECD") . Varias de las citocinas de la familia TNF, que incluyen el TNF-a, el ligando Apo-1 y el ligando CD40, se escinden proteolíticamente en la superficie celular; la proteína resultante en cada caso forma típicamente una molécula homotrimérica que funciona como una citocina soluble. Las proteínas de la familia del receptor TNF también son usualmente escindidas proteolíticamente para liberar los ECD del receptor soluble que pueden funcionar como inhibidores de las citocinas similares. Recientemente, se han identificado otros miembros de la familia TNFR. Tales nuevos miembros identificados de la familia TNFR incluyen CARI, HVEM y osteoprotegerina (OPG) [Brojatsch et al., Cell, 87:845-855 (1996); Montgomery et al., Cell, 87 : 27-436 (1996); Marsters et al., J. Biol. Chem. , 272:14029-14032 (1997); Simonet et al., Cell, 89:309-319 (1997)]. De manera diferente otras moléculas similares al TNFR conocidas, Simonet et al., supra, reportan que la OPG no contiene secuencia de separación de transmembrana hidrofóbica. Para una revisión de la familia TNF de las citocinas y sus receptores, ver Gruss y Dower, supra . Los solicitantes describen aquí la identificación y caracterización de nuevos polipéptidos que tienen homología a los miembros de la familia del factor de necrosis del tumor de los polipéptidos, designados aquí como polipéptidos PR0715. 13. PR0353 Las proteínas complementarias comprenden un gran grupo de proteínas de suero algunas de las cuales actúan en una cascada enzimática, produciendo moléculas efectoras que involucran la inflamación. Las proteínas complementarias son de importancia particular para regular el movimiento y la función de las células involucradas en la inflamación. Dada la importancia fisiológica de la inflamación y los mecanismos relacionados in vivo, se han hecho esfuerzos en el presente para identificar nuevas proteínas nativas que estén involucradas en la inflamación. Se describe aquí la identificación y caracterización de nuevos polipéptidos que tienen homología con las proteínas complementarias, designados aquí como polipéptidos PR0353. 14. PR0361 Las mucinas comprenden una familia de glicoproteínas las cuales han sido implicadas en la carcinogénesis . Las mucinas y las proteínas similares a las mucinas son secretadas tanto por las células normales como por las células transformadas. Tanto los cambios cualitativos como cuantitativos en las mucinas han sido involucrados en varios tipos de cáncer. Dada la importancia médica del cáncer, se han hecho esfuerzos en el presente para identificar nuevas proteínas nativas que puedan ser útiles para el diagnóstico y tratamiento del cáncer. Las proteínas quitinasas comprenden una familia de la cual ha sido implicada en las respuestas de la patogénesis en las plantas. Las proteínas quitinasa se producen por plantas y microorganismos y pueden jugar un papel en la defensa de la plantas al daño. Dada la importancia de los mecanismos de defensa de las plantas, se han hecho esfuerzos en el presente para identificar nuevas proteínas nativas, las cuales puedan ser útiles para la modulación de las respuestas relacionadas a la patogénesis en las plantas. Se describe la identificación y caracterización de nuevos polipéptidos que tienen homología a la mucina y a la quitinasa, designados en la presente solicitud como polipéptidos PR0361. 15. PR0365 Los polipéptidos tales como la proteína humana 2-19 pueden funcionar como citocinas. Las citocinas son proteínas de bajo peso molecular que funcionan para estimular o inhibir la diferenciación, proliferación o función de las células inmunes. Las citocinas a menudo actúan como mensajeros intercelulares y tienen efectos fisiológicos múltiples. Dada la importancia fisiológica de los mecanismos inmunes ín vivo, se han hecho esfuerzos en el presente para identificar nuevas proteínas nativas que estén involucradas en el efecto del sistema inmune. Se describe aquí la identificación y caracterización de nuevos polipéptidos que tienen homología a la proteína humana 2-19, designados aquí como polipéptidos PR0365. BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN 1. PR0241 Los solicitantes han identificado un clon de ADNc que codifican un nuevo polipéptido que tiene homología con la proteína biglicano, en donde el polipéptido está designado en la presente solicitud como "PR0241". En una modalidad, la invención proporciona una molécula de ácido nucleico aislada que comprende el ADN que codifica un polipéptido PR0241. En un aspecto, el ácido nucleico aislado que comprende el ADN que codifica al polipéptido PR0241 que tiene los residuos de aminoácidos 1 a 379 de la Figura 2 (SEC. ID NO: 2), o es complementario para tal secuencia de ácido nucleico codificante, y permanece establemente unido a la misma bajo condiciones al menos moderadas, y de manera opcional, bajo condiciones altamente severas . En otra modalidad, la invención proporciona el polipéptido aislado PR0241. En particular, la invención proporciona el polipéptido PR0241 de secuencia nativa, aislado, el cual en una modalidad, incluye una secuencia de aminoácidos que comprende los residuos 1 hasta 379 de la Figura 2 (SEC. ID NO: 2) . Otra modalidad de la presente invención está dirigida a un polipéptido PR0241 que carece del péptido de señal N-terminal, en donde el polipéptido PR0241 comprende aproximadamente los aminoácidos 16 a 379 de la secuencia de aminoácidos del PR0241 de longitud completa (SEC. ID. NO: 2) . 2. PR0243 Los solicitantes han identificado los clones de ADNc (DNA35917-1207) que codifican un nuevo polipéptido, designado en la presente solicitud como "PR0243".

En una modalidad, la invención proporciona una molécula de ácido nucleico aislada que tiene al menos aproximadamente 80% de identidad de secuencia con (a) una molécula de ADN que codifica un polipéptido PR0243 que comprende la secuencia de aminoácidos de aproximadamente 1 ó de manera aproximada 24 hasta 954 de la Figura 4 (SEC. ID NO: 1 ) , o (b) el complemento de la molécula de ADN de (a). La identidad de secuencia es de aproximadamente 85%, de manera más preferible aproximadamente 90%, de manera más preferible aproximadamente 95%. En un aspecto, el ácido nucleico aislado tiene al menos aproximadamente 80%, preferiblemente al menos aproximadamente 85%, más preferiblemente al menos aproximadamente 90% y más preferiblemente al menos aproximadamente 95% de identidad de secuencia con un polipéptido que tiene los residuos de aminoácidos 1 ó aproximadamente 24 a 954 de la Figura 4 (SEC. ID NO: 7) . Preferiblemente, el grado más alto de identidad de secuencia ocurre dentro de los cuatro (4) agrupamientos de cisteína conservados (aminoácidos 51 a 125; aminoácidos 705 a 761; aminoácidos 784 a 849; y aminoácidos 897 a 931) de la Figura 4 (SEC. ID. NO: 7) . En una modalidad adicional, la molécula de ácido nucleico aislada comprende el ADN que codifica un polipéptido PR0243 que tiene los residuos de aminoácidos 1 ó aproximadamente 24 a 954 de la Figura 4 (SEC. ID NO: 7), o es complementario para tal secuencia de ácido nucleico codificante, y permanece establemente unido a la misma bajo condiciones al menos moderadas, y de manera opcional, bajo condiciones altamente severas. En otro aspecto, la invención proporciona un ácido nucleico de la proteína de longitud completa del clon DNA35917-1207, depositado con el ATCC bajo el número de acceso ATCC 209508, alternativamente la secuencia de codificación del clon DNA35917-1207, depositado bajo el número de acceso ATCC 209508. Aún en otra modalidad, la invención proporciona el polipéptido aislado PR0243. En particular, la invención proporciona el polipéptido PR0243 de secuencia nativa aislada, el cual en una modalidad, incluye una secuencia de aminoácidos comprende los residuos 1 ó aproximadamente 24 a 954 de la Figura 4 (SEC. ID NO: 7) . Los polipéptidos PR0243 nativos con o sin la secuencia de señal nativa (residuos 1 a 23 en la Figura 4 (SEC. ID NO: 7)), y con o sin la metionina de iniciación están incluidos específicamente. Alternativamente, la invención proporciona un polipéptido PR0243 codificado por el ácido nucleico depositado bajo el número de acceso ATCC 209508. 3. PR0299 Los solicitantes han identificado un clon de ADNc que codifica un nuevo polipéptido, en donde el polipéptido está designado en la presente solicitud como "PR0299". En una modalidad, la invención proporciona una molécula de ácido nucleico aislada que comprende el ADN que codifica un polipéptido PR0299. En un aspecto, el ácido nucleico aislado comprende el ADN que codifica al polipéptido PR0299 que tiene los residuos de aminoácidos 1 a 737 de la Figura 6 (SEC. ID NO: 15), o es complementario para tal secuencia de ácido nucleico codificante, y permanece establemente unido a la misma bajo condiciones al menos moderadas, y de manera opcional, bajo condiciones altamente severas. En otra modalidad, la invención proporciona el polipéptido aislado PR0299. En particular, la invención proporciona el polipéptido PR0299 de secuencia nativa, aislado, el cual en una modalidad, incluye una secuencia de aminoácidos que comprende los residuos 1 hasta 737 de la Figura 6 (SEC. ID NO: 15) . Una modalidad adicional de la presente invención está dirigida a un dominio extracelular aislado de un polipéptido PR0299. 4. PR0323 Los solicitantes han identificado un clon de ADNc que codifica un nuevo polipéptido que tiene homología con la proteína dipeptidasa microsómica, en donde el polipéptido está designado en la presente solicitud como "PR0323". En una modalidad, la invención proporciona una molécula de ácido nucleico aislada que comprende el ADN que codifica un polipéptido PR0323. En un aspecto, el ácido nucleico aislado comprende el ADN que codifica al polipéptido PR0323 que tiene los residuos de aminoácidos 1 a 433 de la Figura 10 (SEC. ID NO: 24), o es complementario para tal secuencia de ácido nucleico codificante, y permanece establemente unido a la misma bajo condiciones al menos moderadas, y de manera opcional, bajo condiciones altamente severas. En otra modalidad, la invención proporciona el polipéptido aislado PR0323. En particular, la invención proporciona el polipéptido PR0323 de secuencia nativa, aislado, el cual en una modalidad, incluye una secuencia de aminoácidos que comprende los residuos 1 hasta 433 de la Figura 10 (SEC. ID NO: 24). 5. PR0327 Los solicitantes han identificado un clon de ADNc que codifica un nuevo polipéptido que tiene homología con el receptor de prolactina, en donde el polipéptido está designado en la presente solicitud como "PR0327". En una modalidad, la invención proporciona una molécula de ácido nucleico aislada que comprende el ADN que codifica un polipéptido PR0327. En un aspecto, el ácido nucleico aislado que comprende el ADN que codifica al polipéptido PR0327 tiene los residuos de aminoácidos 1 a 422 de la Figura 14 (SEC. ID NO: 32), o es complementario para tal secuencia de ácido nucleico codificante, y permanece establemente unido a la misma bajo condiciones al menos moderadas, y de manera opcional, bajo condiciones altamente severas . En otra modalidad, la invención proporciona el polipéptido aislado PR0327. En particular, la invención proporciona el polipéptido PR0327 de secuencia nativa, aislado, el cual en una modalidad, incluye una secuencia de aminoácidos que comprende los residuos 1 hasta 422 de la Figura 14 (SEC. ID NO: 32). 6. PR0233 Los solicitantes han identificado un clon de ADNc que codifica un nuevo polipéptido, en donde el polipéptido está designado en la presente solicitud como "PR0233". En una modalidad, la invención proporciona una molécula de ácido nucleico aislada que comprende el ADN que codifica un polipéptido PR0233. En un aspecto, el ácido nucleico aislado que comprende el ADN que codifica al polipéptido PR0233 que tiene los residuos de aminoácidos 1 a 300 de la Figura 16 (SEC. ID NO: 37), o es complementario para tal secuencia de ácido nucleico codificante, y permanece establemente unido a la misma bajo condiciones al menos moderadas, y de manera opcional, bajo condiciones altamente severas. En otra modalidad, la invención proporciona el polipéptido aislado PR0233. En particular, la invención proporciona el polipéptido PR0233 de secuencia nativa, aislado, el cual en una modalidad, incluye una secuencia de aminoácidos que comprende los residuos 1 hasta 300 de la Figura 16 (SEC. ID NO: 37). 7. PR0344 Los solicitantes han identificado los clones de ADNc que codifican un nuevo polipéptido, en donde el polipéptido está designado en la presente solicitud como "PR0344". En una modalidad, la invención proporciona una molécula de ácido nucleico aislada que comprende el ADN que codifica un polipéptido PR0344. En un aspecto, el ácido nucleico aislado que comprende el ADN que codifica al polipéptido PR0344 que tiene los residuos de aminoácidos 1 a 243 de la Figura 18 (SEC. ID NO: 42), o es complementario para tal secuencia de ácido nucleico codificante, y permanece establemente unido a la misma bajo condiciones al menos moderadas, y de manera opcional, bajo condiciones altamente severas. En otra modalidad, la invención proporciona el polipéptido aislado PR0344. En particular, la invención proporciona el polipéptido PR0344 de secuencia nativa, aislado, el cual en una modalidad, incluye una secuencia de aminoácidos que comprende los residuos 1 hasta 243 de la Figura 18 (SEC. ID NO: 42) . 8. PR0347 Los solicitantes han identificado un clon de ADNc que codifica un nuevo polipéptido que tiene homología con la proteína-3 secretoria rica en cisteína, en donde el polipéptido está designado en la presente solicitud como "PR0347". En una modalidad, la invención proporciona una molécula de ácido nucleico aislada que comprende el ADN que codifica un polipéptido PR0347. En un aspecto, el ácido nucleico aislado comprende el ADN que codifica al polipéptido PR0347 que tiene los residuos de aminoácidos 1 a 455 de la Figura 20 (SEC. ID NO: 50), o es complementario para tal secuencia de ácido nucleico codificante, y permanece establemente unido a la misma bajo condiciones al menos moderadas, y de manera opcional, bajo condiciones altamente severas.

En otra modalidad, la invención proporciona el polipéptido aislado PR0347. En particular, la invención proporciona el polipéptido PR0347 de secuencia nativa, aislado, el cual en una modalidad, incluye una secuencia de aminoácidos que comprende los residuos 1 hasta 455 de la Figura 20 (SEC. ID NO: 50). 9. PR0354 Los solicitantes han identificado los clones de ADNc que codifican un nuevo polipéptido que tiene homología con la cadena pesada del inhibidor de inter-alfa-tripsina (ITI), en donde el polipéptido está designado en la presente solicitud como "PR0354". En una modalidad, la invención proporciona una molécula de ácido nucleico aislada que comprende el ADN que codifica un polipéptido PR0354. En un aspecto, el ácido nucleico aislado que comprende el ADN que codifica al polipéptido PR0354 que tiene los residuos de aminoácidos 1 a 694 de la Figura 22 (SEC. ID NO: 55), o es complementario para tal secuencia de ácido nucleico codificante, y permanece establemente unido a la misma bajo condiciones al menos moderadas, y de manera opcional, bajo condiciones altamente severas. En otra modalidad, la invención proporciona el polipéptido aislado PR0354. En particular, la invención proporciona el polipéptido PR0354 de secuencia nativa, aislado, el cual en una modalidad, incluye una secuencia de aminoácidos que comprende los residuos 1 hasta 694 de la Figura 22 (SEC. ID NO: 55). 10. PR0355 Los solicitantes han identificado un clon de ADNc que codifica un nuevo polipéptido, en donde el polipéptido está designado en la presente solicitud como "PR0355". En una modalidad, la invención proporciona una molécula de ácido nucleico aislada que comprende el ADN que codifica un polipéptido PR0355. En un aspecto, el ácido nucleico aislado comprende el ADN que codifica al polipéptido PR0355 que tiene los residuos de aminoácidos 1 a 440 de la Figura 24 (SEC. ID NO: 61), o es complementario para tal secuencia de ácido nucleico codificante, y permanece establemente unido a la misma bajo condiciones al menos moderadas, y de manera opcional, bajo condiciones altamente severas. En. otra modalidad, la invención proporciona el polipéptido aislado PR0355. En particular, la invención proporciona el polipéptido PR0355 de secuencia nativa, aislado, el cual en una modalidad, incluye una secuencia de aminoácidos que comprende los residuos 1 hasta 440 de la Figura 24 (SEC. ID NO: 61) . Una modalidad adicional de la presente invención está dirigida a un dominio extracelular aislado de un polipéptido PR0355. 11. PR0357 Los solicitantes han identificado un clon de ADNc que codifica un nuevo polipéptido que tiene homología con la subunidad lábil de ácido (ALS) del factor de crecimiento similar a la insulina (IGF), en donde el polipéptido está designado en la presente solicitud como "PR0357". En una modalidad, la invención proporciona una molécula de ácido nucleico aislada que comprende el ADN que codifica un polipéptido PR0357. En un aspecto, el ácido nucleico aislado comprende el ADN que codifica al polipéptido PR0357 que tiene los residuos de aminoácidos 1 a 598 de la Figura 26 (SEC. ID NO: 69), o es complementario para tal secuencia de ácido nucleico codificante, y permanece establemente unido a la misma bajo condiciones al menos moderadas, y de manera opcional, bajo condiciones altamente severas. En otra modalidad, la invención proporciona el polipéptido aislado PR0357. En particular, la invención proporciona el polipéptido PR0357 de secuencia nativa, aislado, el cual en una modalidad, incluye una secuencia de aminoácidos que comprende los residuos 1 hasta 598 de la Figura 26 (SEC. ID NO: 69) . Una modalidad adicional de la presente invención está dirigida a un dominio extracelular aislado de un polipéptido PR0357. 12. PR0715 Los solicitantes han identificado los clones de ADNc que codifican nuevos polipéptidos que tienen homología con los polipéptidos de la familia del factor de necrosis del tumor, en donde los polipéptidos están designados en la presente solicitud como "PR0715". En una modalidad, la invención proporciona una molécula de ácido nucleico aislada que comprende el ADN que codifica un polipéptido PR0715. En un aspecto, el ácido nucleico aislado que comprende el ADN que codifica al polipéptido PR0715 que tiene los residuos de aminoácidos 1 a 250 de la Figura 28 (SEC. ID NO: 76), o es complementario para tal secuencia de ácido nucleico codificante, y permanece establemente unido a la misma bajo condiciones al menos moderadas, y de manera opcional, bajo condiciones altamente severas. En otra modalidad, la invención proporciona el polipéptido aislado PR0715. En particular, la invención proporciona el polipéptido PR0715 de secuencia nativa, aislado, el cual en una modalidad, incluye una secuencia de aminoácidos comprende los residuos 1 hasta 250 de la Figura 28 (SEC. ID NO: 76) . Una modalidad adicional de la presente invención está dirigida a un dominio extracelular aislado de un polipéptido PR0715. 13. PR0353 Los solicitantes han identificado un clon de ADNc que codifica un nuevo polipéptido, en donde los polipéptidos están designados en la presente solicitud como "PR0353". En una modalidad, la invención proporciona una molécula de ácido nucleico aislada que comprende el ADN que codifica un polipéptido PR0353. En un aspecto, el ácido nucleico aislado comprende el ADN que codifica al polipéptido PR0353 que tiene los residuos de aminoácidos 1 a 281 de la Figura 30 (SEC. ID NO: 78), o es complementario para tal secuencia de ácido nucleico codificante, y permanece establemente unido a la misma bajo condiciones al menos moderadas, y de manera opcional, bajo condiciones altamente severas. En otra modalidad, la invención proporciona el polipéptido aislado PR0353. En particular, la invención proporciona el polipéptido PR0353 de secuencia nativa, aislado, el cual en una modalidad, incluye una secuencia de aminoácidos que comprende los residuos 1 hasta 281 de la Figura 30 (SEC. ID NO: 78). 14. PR0361 Los solicitantes han identificado un clon de ADNc que codifica un nuevo polipéptido, en donde el polipéptido está designado en la presente solicitud como "PR0361". En una modalidad, la invención proporciona una molécula de ácido nucleico aislada que comprende el ADN que codifica un polipéptido PR0361. En un aspecto, el ácido nucleico aislado que comprende el ADN que codifica al polipéptido PR0361 que tiene los residuos de aminoácidos 1 a 431 de la Figura 32 (SEC. ID NO: 83), o es complementario para tal secuencia de ácido nucleico codificante, y permanece establemente unido a la misma bajo condiciones al menos moderadas, y de manera opcional, bajo condiciones altamente severas. La secuencia de ácido nucleico aislada puede comprender el inserto de ADNc del vector depositado el 5 de Febrero de 1998 como ATCC 209621 el cual incluye la secuencia de nucleótidos que codifica al PR0361. En otra modalidad, la invención proporciona el polipéptido aislado PR0361. En particular, la invención proporciona el polipéptido PR0361 de la secuencia nativa aislada, el cual en una modalidad, incluye una secuencia de aminoácidos que comprende los residuos 1 a 431 de la Figura 32 (SEC. ID NO: 83) . Una modalidad adicional de la presente invención está dirigida a un dominio extracelular aislado de un polipéptido PR0361 que tiene los aminoácidos 1 a 379 de la Figura 32 (SEC. ID NO: 83) . Opcionalmente, el polipéptido PR0361 se obtiene o se puede obtener mediante la expresión del polipéptido codificado por el inserto de ADNc del vector depositado el 5 de Febrero de 1998 como ATCC 209621. 15. PR0365 Los solicitantes han identificado un clon de ADNc que codifica un nuevo polipéptido, en donde el polipéptido está designado en la presente solicitud como "PR0365". ( En una modalidad, la invención proporciona una molécula de ácido nucleico aislada que comprende el ADN que codifica un polipéptido PR0365. En un aspecto, el ácido nucleico aislado comprende el ADN que codifica al polipéptido PR0365 que tiene los residuos de aminoácidos 1 a 235 de la Figura 34 (SEC. ID NO: 91), o es complementario para tal secuencia de ácido nucleico codificante, y permanece establemente unido a la misma bajo condiciones al menos moderadas, y de manera opcional, bajo condiciones altamente severas. En otro aspecto, el ácido nucleico aislado que comprende el ADN que codifica el polipéptido PR0365 que tiene los residuos de aminoácidos 21 a 235 de la Figura 34 (SEC. ID NO: 91), o es complementario para tal secuencia de ácido nucleico codificante, y permanece establemente unido a la misma bajo condiciones al menos moderadas, y de manera opcional, bajo condiciones altamente severas . En otra modalidad, la invención proporciona el polipéptido aislado PR0365. En particular, la invención proporciona el polipéptido PR0365 de secuencia nativa, aislado, el cual en una modalidad, incluye una secuencia de aminoácidos que comprende los residuos 1 hasta 235 de la Figura 34 (SEC. ID NO: 91) . Una modalidad adicional de la presente invención está dirigida a la secuencia de aminoácidos que comprende los residuos 21 hasta 235 de la Figura 34 (SEC. ID NO: 91) . 16. Modalidades Adicionales En otras modalidades de la presente invención, la invención . proporciona vectores que comprenden ADN que codifica cualquiera de los polipéptidos descritos aquí. También se proporciona una célula hospedera que comprende cualquiera de tales vectores. A manera de ejemplo, las células hospederas pueden ser células de CHO, E. coli , o levaduras. También se proporciona un proceso para cualquiera de los polipéptidos descritos antes o posteriormente y comprende cultivar células hospederas bajo condiciones adecuadas para la expresión del polipéptido deseado y recuperar el polipéptido deseado a partir del cultivo de células . En otras modalidades, la invención proporciona moléculas quiméricas que comprenden cualquiera de los polipéptidos descritos aquí fusionados a un polipéptido heterólogo o secuencia de aminoácidos. Un ejemplo de tal molécula quimérica comprende cualquiera de los polipéptidos descritos aquí fusionados a una secuencia marcadora de epítope o a una región Fc de una inmunoglobulina. En otra modalidad, la invención proporciona un anticuerpo que se enlaza específicamente a cualquiera de los polipéptidos descritos antes o posteriormente. Opcionalmente el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal, anticuerpo humanizado, fragmento de anticuerpo o anticuerpo de cadena simple . En aún otras modalidades, la invención proporciona sondas de oligonucleótidos útiles para aislar secuencias genómicas y secuencias de nucleótidos de ADNc, en donde aquellas sondas se pueden derivar de cualquiera de las secuencias de nucleótidos descritas antes o posteriormente. En otras modalidades, la invención proporciona una molécula de ácido nucleico aislada que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido PRO. En un aspecto, la molécula de ácido nucleico aislada que comprende una secuencia de nucleótidos que tiene al menos aproximadamente 80% de identidad de secuencia, de manera preferible al menos aproximadamente 81% de identidad de secuencia, de manera más preferible al menos aproximadamente 82% de identidad de secuencia, aún de manera más preferible al menos aproximadamente 83% de identidad de secuencia, aún de manera más preferible al menos aproximadamente 84% de identidad de secuencia, aún de manera más preferible al menos aproximadamente 85% de identidad de secuencia, aún de manera más preferible al menos aproximadamente 86% de identidad de secuencia, aún de manera más preferible al menos aproximadamente 87% de identidad de secuencia, aún de manera más preferible al menos aproximadamente 88% de identidad de secuencia, aún de manera más preferible al menos aproximadamente 89% de identidad de secuencia, aún de manera más preferible al menos aproximadamente 90% de identidad de secuencia, aún de manera más preferible al menos aproximadamente 91% de identidad de secuencia, aún de manera más preferible al menos aproximadamente 92% de identidad de secuencia, aún de manera más preferible al menos aproximadamente 93% de identidad de secuencia, aún de manera más preferible al menos aproximadamente 94% de identidad de secuencia, aún de manera más preferible al menos aproximadamente 95% de identidad de secuencia, aún de manera más preferible al menos aproximadamente 96% de identidad de secuencia, aún de manera más preferible al menos aproximadamente 97% de identidad de secuencia, aún de manera más preferible al menos aproximadamente 98% de identidad de secuencia, aún de manera más preferible al menos aproximadamente 99% de identidad de secuencia a (a) una molécula de ADN que codifica un polipéptido PRO que tiene una secuencia de aminoácidos de longitud completa como se describe en la presente, una secuencia de aminoácidos de longitud completa que carece del péptido de señal como se describe en la presente, un dominio extracelular de una proteína de transmembrana como se describe en la presente, con o sin el péptido de señal, como se describe en la presente o cualquier otro fragmento definido específicamente de la secuencia de aminoácidos de longitud completa como se describe en la presente, o (b) el complemento de la molécula de ADN de (a) . En otros aspectos, la molécula de ácido nucleico aislada que comprende una secuencia de nucleótidos que tiene al menos aproximadamente 80% de identidad de secuencia, de manera preferible al menos aproximadamente 81% de identidad de secuencia, de manera más preferible al menos aproximadamente 82% de identidad de secuencia, aún de manera más preferible al menos aproximadamente 83% de identidad de secuencia, aún de manera más preferible al menos aproximadamente 84% de identidad de secuencia, aún de manera más preferible al menos aproximadamente 85% de identidad de secuencia, aún de manera más preferible al menos aproximadamente 86% de identidad de secuencia, aún de manera más preferible al menos aproximadamente 87% de identidad de secuencia, aún de manera más preferible al menos aproximadamente 88% de identidad de secuencia, aún de manera más preferible al menos aproximadamente 89% de identidad de secuencia, aún de manera más preferible al menos aproximadamente 90% de identidad de secuencia, aún de manera más preferible al menos aproximadamente 91% de identidad de secuencia, aún de manera más preferible al menos aproximadamente 92% de identidad de secuencia, aún de manera más preferible al menos aproximadamente 93% de identidad de secuencia, aún de manera más preferible al menos aproximadamente 94% de identidad de secuencia, aún de manera más preferible al menos aproximadamente 95% de identidad de secuencia, aún de manera más preferible al menos aproximadamente 96% de identidad de secuencia, aún de manera más preferible al menos aproximadamente 97% de identidad de secuencia, aún de manera más preferible al menos aproximadamente 98% de identidad de secuencia, aún de manera más preferible al menos aproximadamente 99% de identidad de secuencia a (a) una molécula de ADN que comprende la secuencia de ADNc del polipéptido PRO de longitud completa como se describe en la presente, la secuencia codificante del polipéptido PRO que carece del péptido de señal como se describe en la presente, una secuencia codificante de un dominio extracelular de un polipéptido PRO de transmembrana, con o sin el péptido de señal, como se describe en la presente o la secuencia codificante de cualquier otro fragmento definido específicamente de la secuencia de aminoácidos de longitud completa como se describe en la presente, o (b) el complemento de la molécula de ADN de (a) . En un aspecto adicional, la invención se refiere a una molécula de ácido nucleico aislada que comprende una secuencia de nucleótidos que tiene al menos aproximadamente 80% de identidad de secuencia, de manera preferible al menos aproximadamente 81% de identidad de secuencia, de manera más preferible al menos aproximadamente 82% de identidad de secuencia, aún de manera más preferible al menos aproximadamente 83% de identidad de secuencia, aún de manera más preferible al menos aproximadamente 84% de identidad de secuencia, aún de manera más preferible al menos aproximadamente 85% de identidad de secuencia, aún de manera más preferible al menos aproximadamente 86% de identidad de secuencia, aún de manera más preferible al menos aproximadamente 87% de identidad de secuencia, aún de manera más preferible al menos aproximadamente 88% de identidad de secuencia, aún de manera más preferible al menos aproximadamente 89% de identidad de secuencia, aún de manera más preferible al menos aproximadamente 90% de identidad de secuencia, aún de manera más preferible al menos aproximadamente 91% de identidad de secuencia, aún de manera más preferible al menos aproximadamente 92% de identidad de secuencia, aún de manera más preferible al menos aproximadamente 93% de identidad de secuencia, aún de manera más preferible al menos aproximadamente 94% de identidad de secuencia, aún de manera más preferible al menos aproximadamente 95% de identidad de secuencia, aún de manera más preferible al menos aproximadamente 96% de identidad de secuencia, aún de manera más preferible al menos aproximadamente 97% de identidad de secuencia, aún de manera más preferible al menos aproximadamente 98% de identidad de secuencia, aún de manera más preferible al menos aproximadamente 99% de identidad de secuencia a (a) una molécula de ADN que codifica al mismo polipéptido maduro codificado por cualquiera de los ADNc de proteína humana, depositado con el ATCC como se describe en la presente, o (b) el complemento de la molécula de ADN de (a) . Otro aspecto de la invención proporciona una molécula de ácido nucleico aislada que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido PRO que es ya sea un dominio de transmembrana eliminado o un dominio de transmembrana inactivado, o es complementaria a tal secuencia de nucleótidos codificante, en donde el (los) dominio (s) de transmembrana de tal polipéptido son como se describieron en la presente. Por lo tanto, se contemplan los dominios extracelulares solubles de los polipéptidos PRO descritos en la presente. Otra modalidad está dirigida a los fragmentos de una secuencia que codifica al polipéptido PRO, que pueden utilizarse como, por ejemplo, sondas de hibridización o para fragmentos codificantes de un polipéptido PRO que opcionalmente puede codificar un polipéptido que comprende un sitio de enlace de un anticuerpo anti-PRO o como sondas de oligonucléotidos antisentido. Tales fragmentos de ácido nucleico son usualmente al menos de aproximadamente 20 nucleótidos de longitud, de manera más preferible al menos de aproximadamente 30 nucleótidos de longitud, de manera más preferible al menos de aproximadamente 40 nucleótidos de longitud, aún de manera más preferible al menos aproximadamente 50 nucleótidos de longitud, aún de manera más preferible al menos aproximadamente 60 nucleótidos de longitud, aún de manera más preferible al menos aproximadamente 70 nucleótidos de longitud, aún de manera más preferible al menos aproximadamente 80 nucleótidos de longitud, aún de manera más preferible al menos aproximadamente 90 nucleótidos de longitud, aún de manera más preferible al menos aproximadamente 100 nucleótidos de longitud, aún de manera más preferible al menos aproximadamente 110 nucleótidos de longitud, aún de manera más preferible al menos aproximadamente 120 nucleótidos de longitud, aún de manera más preferible al menos aproximadamente 130 nucleótidos de longitud, aún de manera más preferible al menos aproximadamente 140 nucleótidos de longitud, aún de manera más preferible al menos aproximadamente 150 nucleótidos de longitud, aún de manera más preferible al menos aproximadamente 160 nucleótidos de longitud, aún de manera más preferible al menos aproximadamente 170 nucleótidos de longitud, aún de manera más preferible al menos aproximadamente 180 nucleótidos de longitud, aún de manera más preferible al menos aproximadamente 190 nucleótidos de longitud, aún de manera más preferible al menos aproximadamente 200 nucleótidos de longitud, aún de manera más preferible al menos aproximadamente 250 nucleótidos de longitud, aún de manera más preferible al menos aproximadamente 300 nucleótidos de longitud, aún de manera más preferible al menos aproximadamente 350 nucleótidos de longitud, aún de manera más preferible al menos aproximadamente 400 nucleótidos de longitud, aún de manera más preferible al menos aproximadamente 450 nucleótidos de longitud, aún de manera más preferible al menos aproximadamente 500 nucleótidos de longitud, aún de manera más preferible al menos aproximadamente 600 nucleótidos de longitud, aún de manera más preferible al menos aproximadamente 700 nucleótidos de longitud, aún de manera más preferible al menos aproximadamente 800 nucleótidos de longitud, aún de manera más preferible al menos aproximadamente 900 nucleótidos de longitud y aún de manera más preferible al menos aproximadamente 1000 nucleótidos de longitud, en donde en este contexto el término "aproximadamente" significa más o menos el 10% de la longitud de la secuencia de nucleótidos de referencia de aquella longitud a la que se hace referencia. Se observa que los nuevos fragmentos de un polipéptido PRO que codifica la secuencia de nucleótidos puede ser determinada de una manera habitual alineando la secuencia de nucleótidos que codifica al polipéptido PRO con otras secuencias de nucleótidos conocidas utilizando cualquiera de un número de programas de alineamiento de secuencias bien conocidos y determinando que el (los) fragmento (s) de la secuencia de nucleótidos que codifica al polipéptido PRO, son nuevos. La totalidad de tales secuencias de nucleótidos que codifican al polipéptido PRO se contemplan en la presente. También están contemplados los fragmentos del polipéptido PRO codificados por estos fragmentos de la molécula del nucleótido, preferiblemente aquellos fragmentos del polipéptido PRO que comprenden un sitio de enlace para un anticuerpo anti-PRO. En otra modalidad, la invención proporciona el polipéptido PRO aislado, codificado por cualquiera de las secuencias de ácido nucleico identificadas en la presente anteriormente . En cierto aspecto, la invención se refiere a un polipéptido PRO aislado, que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos aproximadamente 80% de identidad de secuencia, de manera preferible al menos aproximadamente 81% de identidad de secuencia, de manera más preferible al menos aproximadamente 82% de identidad de secuencia, aún de manera más preferible al menos aproximadamente 83% de identidad de secuencia, aún de manera más preferible al menos aproximadamente 84% de identidad de secuencia, aún de manera más preferible al menos aproximadamente 85% de identidad de secuencia, aún de manera más preferible al menos aproximadamente 86% de identidad de secuencia, aún de manera más preferible al menos aproximadamente 87% de identidad de secuencia, aún de manera más preferible al menos aproximadamente 88% de identidad de secuencia, aún de manera más preferible al menos aproximadamente 89% de identidad de secuencia, aún de manera más preferible al menos aproximadamente 90% de identidad de secuencia, aún de manera más preferible al menos aproximadamente 91% de identidad de secuencia, aún de manera más preferible al menos aproximadamente 92% de identidad de secuencia, aún de manera más preferible al menos aproximadamente 93% de identidad de secuencia, aún de manera más preferible al menos aproximadamente 94% de identidad de secuencia, aún de manera más preferible al menos aproximadamente 95% de identidad de secuencia, aún de manera más preferible al menos aproximadamente 96% de identidad de secuencia, aún de manera más preferible al menos aproximadamente 97% de identidad de secuencia, aún de manera más preferible al menos aproximadamente 98% de identidad de secuencia, aún de manera más preferible al menos aproximadamente 99% de identidad de secuencia a un polipéptido PRO que tiene una secuencia de aminoácidos de longitud completa como se describe en la presente, una secuencia de aminoácidos de longitud completa que carece del péptido de señal como se describe en la presente, un dominio extracelular de una proteína de transmembrana, con o sin el péptido de señal, como se describe en la presente o cualquier otro fragmento definido específicamente de la secuencia de aminoácidos de longitud completa como se describe en la presente. En un aspecto adicional, la invención se refiere a un polipéptido PRO aislado, que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos aproximadamente 80% de identidad de secuencia, de manera preferible al menos aproximadamente 81% de identidad de secuencia, de manera más preferible al menos aproximadamente 82% de identidad de secuencia, aún de manera más preferible al menos aproximadamente 83% de identidad de secuencia, aún de manera más preferible al menos aproximadamente 84% de identidad de secuencia, aún de manera más preferible al menos aproximadamente 85% de identidad de secuencia, aún de manera más preferible al menos aproximadamente 86% de identidad de secuencia, aún de manera más preferible al menos aproximadamente 87% de identidad de secuencia, aún de manera más preferible al menos aproximadamente 88% de identidad de secuencia, aún de manera más preferible al menos aproximadamente 89% de identidad de secuencia, aún de manera más preferible al menos aproximadamente 90% de identidad de secuencia, aún de manera más preferible al menos aproximadamente 91% de identidad de secuencia, aún de manera más preferible al menos aproximadamente 92% de identidad de secuencia, aún de manera más preferible al menos aproximadamente 93% de identidad de secuencia, aún de manera más preferible al menos aproximadamente 94% de identidad de secuencia, aún de manera más preferible al menos aproximadamente 95% de identidad de secuencia, aún de manera más preferible al menos aproximadamente 96% de identidad de secuencia, aún de manera más preferible al menos aproximadamente 97% de identidad de secuencia, aún de manera más preferible al menos aproximadamente 98% de identidad de secuencia, aún de • manera más preferible al menos aproximadamente 99% de identidad de secuencia a una secuencia de aminoácidos codificada por cualquiera de los ADNc de proteína humana, depositados con el ATCC como se describe en la presente. En un aspecto adicional, la invención se refiere a un polipéptido PRO aislado, que comprende una secuencia de aminoácidos con un registro de al menos de aproximadamente 80% positivos, de manera preferible al menos aproximadamente 81% positivos, de manera más preferible al menos aproximadamente 82% positivos, aún de manera más preferible al menos aproximadamente 83% positivos, aún de manera más preferible al menos aproximadamente 84% positivos, aún de manera más preferible al menos aproximadamente 85% positivos, aún de manera más preferible al menos aproximadamente 86% positivos, aún de manera más preferible al menos aproximadamente 87% positivos, aún de manera más preferible al menos aproximadamente 88% positivos, aún de manera más preferible al menos aproximadamente 89% positivos, aún de manera más preferible al menos aproximadamente 90% positivos, aún de manera más preferible al menos aproximadamente 9]% positivos, aún de manera más preferible al menos aproximadamente 92% positivos, aún de manera más preferible al menos aproximadamente 93% positivos, aún de manera más preferible al menos aproximadamente 94% positivos, aún de manera más preferible al menos aproximadamente 95% positivos, aún de manera más preferible al menos aproximadamente 96% positivos, aún de manera más preferible al menos aproximadamente 97% positivos, aún de manera más preferible al menos aproximadamente 98% positivos y aún de manera más preferible al menos aproximadamente 99% positivos cuando se comparó con la secuencia de aminoácidos de un polipéptido PRO que tiene una secuencia de aminoácidos de longitud completa como se describe en la presente, una secuencia de aminoácidos de longitud completa que carece del péptido de señal como se describe en la presente, un dominio extracelular de una proteína de transmembrana, con o sin el péptido de señal, como se describe en la presente o cualquier otro fragmento definido específicamente de la secuencia de aminoácidos de longitud completa como se describe en la presente. En un aspecto específico, la invención proporciona un polipéptido PRO aislado sin la secuencia de señal N-terminal y/o la metionina inicial y está codificado por una secuencia de nucleótidos que codifica tal secuencia de aminoácidos como se describe anteriormente en la presente. Los procesos para producir el mismo también se describen en la presente, en donde aquellos procesos que comprenden cultivar una célula hospedera u hospedera comprenden un vector que comprende la molécula de ácido nucleico codificante, apropiada, bajo condiciones adecuadas para la expresión del polipéptido PRO, y recuperar el polipéptido PRO del cultivo celular. Otro aspecto de la invención proporciona un polipéptido PRO aislado que es ya sea un dominio de transmembrana eliminado o un dominio de transmembrana inactivado. Los procesos para producir el mismo también se describen en la presente, en donde aquellos procesos que comprenden cultivar una célula hospedera comprende un vector que comprende la molécula de ácido nucleico codificante, apropiada, bajo condiciones adecuadas para la expresión del polipéptido PRO, y recuperar el polipéptido PRO del cultivo celular. Aún en otra modalidad, la invención se refiere a los agonistas y antagonistas de un polipéptido PRO nativo que se define en la presente. En una modalidad particular, el agonista o antagonista es un anticuerpo anti-PRO o una molécula pequeña. En una modalidad adicional, la invención se refiere a un método para identificar los agonistas o antagonistas para un polipéptido PRO que comprende poner en contacto el polipéptido PRO con una molécula candidata y monitorear una actividad biológica mediada por dicho polipéptido PRO. Preferiblemente, el polipéptido PRO es un polipéptido PRO nativo. Todavía en una modalidad adicional, la invención se refiere a una composición de la materia que comprende un polipéptido PRO, o un agonista o antagonista de un polipéptido PRO como se describe en la presente, o un anticuerpo anti-PRO, en combinación con un portador. Opcionalmente, el portador es un portador aceptable farmacéuticamente . Otra modalidad de la presente invención está dirigida al uso de un polipéptido PRO, o un agonista o antagonista del mismo como se describe previamente en la presente, o un anticuerpo anti-PRO, para la preparación de un medicamento útil en el tratamiento de una condición que es sensible al polipéptido PRO, un agonista o antagonista del mismo o un anticuerpo anti-PRO. BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS La Figura 1 muestra una secuencia de nucleótidos (SEC. ID NO: 1) de un ADNc del PR0241 de la secuencia nativa, en donde la SEC. ID NO: 1 es un clon designado aquí como "DNA34392-1170". La Figura 2 muestra la secuencia de aminoácidos (SEC. ID NO: 2) derivada de la secuencia de codificación de la SEC. ID NO: 1 mostrada en la Figura 1. La Figura 3 muestra una secuencia de nucleótidos (SEC. ID NO: 6) de un ADNc del PR0243 de la secuencia nativa, en donde la SEC. ID NO: 6 es un clon designado aquí como "DNA35917-1207". La Figura 4 muestra la secuencia de aminoácidos (SEC. ID NO: 7) derivada de la secuencia de codificación de la SEC. ID NO: 6 mostrada en la Figura 3. La Figura 5 muestra una secuencia de nucleótidos (SEC. ID NO: 14) de un ADNc del PR0299 de la secuencia nativa, en donde la SEC. ID NO: 14 es un clon designado aquí como "DNA39976-1215". La Figura 6 muestra la secuencia de aminoácidos (SEC. ID NO: 15) derivada de la secuencia de codificación de la SEC. ID NO: 14 mostrada en la Figura 5.

La Figura 7 muestra una secuencia de nucleótidos designada aquí como DNA28847 (SEC. ID NO: 18). La Figura 8 muestra una secuencia de nucleótidos designada aquí como DNA35877 (SEC. ID NO: 19) . La Figura 9 muestra una secuencia de nucleótidos (SEC. ID NO: 23) de un ADNc del PR0323 de la secuencia nativa, en donde la SEC. ID NO: 23 es un clon designado aquí como "DNA35595-1228". La Figura 10 muestra la secuencia de aminoácidos (SEC. ID NO: 24) derivada de la secuencia de codificación de la SEC. ID NO: 23 mostrada en la Figura 9. La Figura 11 muestra una secuencia de nucleótidos de una sola hebra (SEC. ID NO: 29) que contiene la secuencia de nucleótidos (nucleótidos 79-1416) de una proteína de fusión quimérica entre un polipéptido derivado de PR0323 y una porción de un dominio constante de IgG, en donde la proteína de fusión quimérica está designada en la presente como "PR0454". La secuencia de nucleótidos de una sola hebra (SEC. ID. NO: 29) que codifica la proteína de fusión PR0323/IgG (PR0454) se designa aquí como "DNA35872". La Figura 12 muestra la secuencia de aminoácidos (SEC. ID NO: 30) derivada de los nucleótidos 79-1416 de la secuencia de nucleótidos mostrada en la Figura 11. El empalme en la secuencia de aminoácidos del PR0454 entre las secuencias derivadas del PR0323 y las secuencias derivadas de IgG aparece entre los aminoácidos 415-416 en la figura. La Figura 13 muestra una secuencia de nucleótidos (SEC. ID NO: 31) de un ADNc del PR0327 de la secuencia nativa, en donde la SEC. ID NO: 31 es un clon designado aquí como "DNA38113-1230". La Figura 14 muestra la secuencia de aminoácidos (SEC. ID NO: 32) derivada de la secuencia de codificación de la SEC. ID NO: 31 mostrada en la Figura 13. La Figura 15 muestra una secuencia de nucleótidos (SEC. ID NO: 36) de un ADNc del PR0233 de la secuencia nativa, en donde la SEC. ID NO: 36 es un clon designado aquí como "DNA34436-1238". La Figura 16 muestra la secuencia de aminoácidos (SEC. ID NO: 37) derivada de la secuencia de codificación de la SEC. ID NO: 36 mostrada en la Figura 15. La Figura 17 muestra una secuencia de nucleótidos (SEC. ID NO: 41) de un ADNc del PR0344 de la secuencia nativa, en donde la SEC. ID NO: 41 es un clon designado aquí como "DNA40592-1242". La Figura 18 muestra la secuencia de aminoácidos (SEC. ID NO: 42) derivada de la secuencia de codificación de la SEC. ID NO: 41 mostrada en la Figura 17. La Figura 19 muestra una secuencia de nucleótidos (SEC. ID NO: 49) de un ADNc del PR0347 de la secuencia nativa, en donde la SEC. ID NO: 49 es un clon designado aquí como "DNA44176-1244". La Figura 20 muestra la secuencia de aminoácidos (SEC. ID NO: 50) derivada de la secuencia de codificación de la SEC. ID NO: 49 mostrada en la Figura 19. La Figura 21 muestra una secuencia de nucleótidos (SEC. ID NO: 54) de un ADNc del PR0354 de la secuencia nativa, en donde la SEC. ID NO: 54 es un clon designado aquí como "DNA44192-1246". La Figura 22 muestra la secuencia de aminoácidos (SEC. ID NO: 55) derivada de la secuencia de codificación de la SEC. ID NO: 54 mostrada en la Figura 21. La Figura 23 muestra una secuencia de nucleótidos (SEC. ID NO: 60) de un ADNc del PR0355 de la secuencia nativa, en donde la SEC. ID NO: 60 es un clon designado aquí como "DNA39518-1247". La Figura 24 muestra la secuencia de aminoácidos (SEC. ID NO: 61) derivada de la secuencia de codificación de la SEC. ID NO: 60 mostrada en la Figura 23. La Figura 25 muestra una secuencia de nucleótidos (SEC. ID NO: 68) de un ADNc del PR0357 de la secuencia nativa, en donde la SEC. ID NO: 68 es un clon designado aquí como "DNA44804-1248". La Figura 26 muestra la secuencia de aminoácidos (SEC. ID NO: 69) derivada de la secuencia de codificación de la SEC. ID NO: 68 mostrada en la Figura 25. La Figura 27 muestra una secuencia de nucleótidos (SEC. ID NO: 75) de un ADNc del PR0715 de la secuencia nativa, en donde la SEC. ID NO: 75 es un clon designado aquí como "DNA52722-1229". La Figura 28 muestra la secuencia de aminoácidos (SEC. ID NO: 76) derivada de la secuencia de codificación de la SEC. ID NO: 75 mostrada en la Figura 27. La Figura 29 muestra una secuencia de nucleótidos (SEC. ID NO: 77) de un ADNc del PR0353 de la secuencia nativa, en donde la SEC. ID NO: 77 es un clon designado aquí como "DNA41234-1242". La Figura 30 muestra la secuencia de aminoácidos (SEC. ID NO: 78) derivada de la secuencia de codificación de la SEC. ID NO: 77 mostrada en la Figura 29. La Figura 31 muestra una secuencia de nucleótidos (SEC. ID NO: 82) de un ADNc del PR0361 de la secuencia nativa, en donde la SEC. ID NO: 82 es un clon designado aquí como "DNA45410-1250". La Figura 32 muestra la secuencia de aminoácidos (SEC. ID NO: 83) derivada de la secuencia de codificación de la SEC. ID NO: 82 mostrada en la Figura 31. La Figura 33 muestra una secuencia de nucleótidos (SEC. ID NO: 90) de un ADNc del PR0365 de la secuencia nativa, en donde la SEC. ID NO: 90 es un clon designado aquí como "DNA46777-1253". La Figura 34 muestra la secuencia de aminoácidos (SEC. ID NO: 91) derivada de la secuencia de codificación de la SEC. ID NO: 90 mostrada en la Figura 33. DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LAS MODALIDADES PREFERIDAS Los términos "polipéptido PRO" y "PRO" como se utilizan aquí y cuando se han seguido inmediatamente por una designación numérica se refieren a varios polipéptidos, en donde la designación completa (es decir, PRO/número) se refiere a secuencias de polipéptidos específicas como se describe aquí. Los términos "PRO/número de polipéptido" y "PRO/número" en donde el término "número" proporciona una designación numérica actual como se utiliza en la presente que engloba los polipéptidos de secuencia nativa y las variantes del polipéptido (las cuales se definen enseguida en la presente) . Los polipéptidos PRO descritos en la presente se pueden aislar a partir de una variedad de fuentes, tales como los tipos de tejidos humanos o de otra fuente, o preparados mediante métodos recombinantes o sintéticos . Un "polipéptido PRO de secuencia nativa" comprende un polipéptido que tiene la misma secuencia de aminoácidos que el polipéptido PRO correspondiente derivado maduro. Tales polipéptidos PRO de la secuencia nativa se pueden aislar del maduro o se pueden producir mediante medios recombinantes o sintéticos. El término "polipéptido PRO de la secuencia nativa" específicamente engloba las formas secretadas o truncadas que aparecen de manera natural de los polipéptidos PRO específicos (por ejemplo, una secuencia del dominio extracelular) , formas variantes que se presentan de manera natural (por ejemplo, formas empalmadas alternativamente) y variantes alélicas que se presentan de manera natural del polipéptido. En varias modalidades de la invención, los polipéptidos PRO de secuencia nativa descritos en la presente son polipéptido de secuencia nativa de longitud completa o maduros que comprenden las secuencias de aminoácidos de longitud completa mostradas en las figuras acompañantes. Los codones de inicio y detención se muestra en letras remarcadas y subrayadas en las figuras. Sin embargo, mientras que el polipéptido PRO descrito en las figuras acompañantes se muestra para empezar con los residuos de metionina designados en la presente como la posición 1 del aminoácido en las figuras, es concebible y posible que otros residuos de metionina localizados ya sea corriente arriba o corriente debajo de la posición 1 del aminoácido en las figuras puedan ser empleados como el residuo de aminoácidos de inicio para los polipéptidos PRO. El "dominio extracelular" o "ECD" del polipéptido PRO se refiere a una forma del polipéptido PRO que está esencialmente libre de los dominios citoplásmicos y de transmembrana. De manera ordinaria, un ECD del polipéptido PRO tiene menos del 1% de tales dominios citoplásmicos y/o de transmembrana y preferiblemente, tendrán menos del 0.5% de tales dominios. Se sobreentenderá que cualquier dominio de transmembrana identificado para los polipéptidos PRO de la presente invención se identifican conforme al criterio habitualmente empleado en la técnica para identificar ese tipo de dominio hidrofóbico. Los límites exactos de un dominio de transmembrana pueden variar pero la mayoría no tiene más de aproximadamente 5 aminoácidos en caulquier extremo del dominio como se identificó inicialmente. De manera opcional, por lo tanto, un dominio extracelular de un polipéptido PRO puede contener desde aproximadamente 5 ó menos aminoácidos en ya sea un lado del límite del dominio extracelular/dominio de transmembrana como se identificó en los Ejemplos o en la especificación y tales polipéptidos, con o sin el péptido de señal asociado, y el ácido nucleico que codifica los mismos, se contemplar por la presente invención. La localización aproximada de los "péptidos de señal" de varios polipéptidos PRO descritos en la presente, se muestra en las figuras acompañantes. Se observa, sin embargo, que el límite C-terminal del péptido de señal puede variar, pero la mayoría probablemente no es mayor de aproximadamente 5 aminoácidos en cualquier lado del límite C-terminal del péptido de señal como se identificó inicialmente, en donde el limite C-terminal del péptido de señal puede ser identificado consecuentemente con el criterio empleado habitualmente en la técnica para identificar aquel tipo de elemento de la secuencia de aminoácidos (por ejemplo, Nielsen et al., Prot. Eng. 10:1-6 (1997) y von Heinje et al., Nucí. Acids. Res. 14:4683-4690 (1986)). Además, también se reconoce que, en algunos casos, la escisión de una secuencia de señal de un polipéptido secretado no es completamente uniforme, dando como resultado más de una especie secretada. Estos polinucleótidos maduros, donde el péptido de señal se escinde dentro de no más de aproximadamente 5 aminoácidos en ya sea un lado del límite C-terminal del péptido de señal identificado en la presente, y los polipéptidos que codifican los mismos, se contemplan por la presente invención. La "variante del polipéptido PRO" significa un polipéptido PRO activo como se define antes o posteriormente que tiene al menos aproximadamente 80% de identidad de la secuencia de aminoácidos con un polipéptido PRO de secuencia nativa de longitud completa como se describe en la presente, una secuencia del polipéptido PRO carece del péptido de señal como se describe en la presente, un dominio extracelular de un polipéptido PRO, con o sin el péptido de señal, como se describe en la presente o cualquier otro fragmento de un polipéptido PRO de longitud completa como se describe en la presente. Tales variantes del polipéptido PRO incluyen, por ejemplo, los polipéptidos PRO en donde uno o más residuos de aminoácidos se agregan, o se eliminan, en el N- o C-terminales de la secuencia de aminoácidos, nativa de longitud completa. Ordinariamente, una variante de polipéptido PRO tendrá al menos aproximadamente 80% de identidad de secuencia de aminoácidos, preferiblemente al menos aproximadamente 81% de identidad de secuencia de aminoácidos, más preferiblemente al menos aproximadamente 82% de identidad de secuencia de aminoácidos, más preferiblemente al menos aproximadamente 83% de identidad de secuencia de aminoácidos, más preferiblemente al menos aproximadamente 84% de identidad de secuencia de aminoácidos, más preferiblemente al menos aproximadamente 85% de identidad de secuencia de aminoácidos, más preferiblemente al menos aproximadamente 86% de identidad de secuencia de aminoácidos, más preferiblemente al menos aproximadamente 87% de identidad de secuencia de aminoácidos, más preferiblemente al menos aproximadamente 88% de identidad de secuencia de aminoácidos, más preferiblemente al menos aproximadamente 89% de identidad de secuencia de aminoácidos, más preferiblemente al menos aproximadamente 90% de identidad de secuencia de aminoácidos, más preferiblemente al menos aproximadamente 91% de identidad de secuencia de aminoácidos, más preferiblemente al menos aproximadamente 92% de identidad de secuencia de aminoácidos, más preferiblemente al menos aproximadamente 93% de identidad de secuencia de aminoácidos, más preferiblemente al menos aproximadamente 94% de identidad de secuencia de aminoácidos, más preferiblemente al menos aproximadamente 95% de identidad de secuencia de aminoácidos, más preferiblemente al menos aproximadamente 96% de identidad de secuencia de aminoácidos, más preferiblemente al menos aproximadamente 97% de identidad de secuencia de aminoácidos, más preferiblemente al menos aproximadamente 98% de identidad de secuencia de aminoácidos y más preferiblemente al menos aproximadamente 99% de identidad de secuencia de aminoácidos con la secuencia del polipéptido PRO nativa de longitud completa como se describe en la presente, la secuencia del polipéptido PRO que carece del péptido de señal como se describe en la presente, un dominio extracelular de un polipéptido PRO, con o sin el péptido de señal, como se describe en la presente o cualquier otro fragmento definido específicamente de la secuencia del polipéptido PRO de longitud completa como se describe en la presente. Ordinariamente, los polipéptidos de la variante PRO son de al menos aproximadamente 10 aminoácidos de longitud, a menudo de al menos aproximadamente 20 aminoácidos de longitud, más a menudo de al menos aproximadamente 30 aminoácidos de longitud, más a menudo de al menos aproximadamente 40 aminoácidos de longitud, más a menudo de al menos aproximadamente 50 aminoácidos de longitud, más a menudo de al menos aproximadamente 60 aminoácidos de longitud, más a menudo de al menos aproximadamente 70 aminoácidos de longitud, más a menudo de al menos aproximadamente 80 aminoácidos de longitud, más a menudo de al menos aproximadamente 90 aminoácidos de longitud, más a menudo de al menos aproximadamente 100 aminoácidos de longitud, más a menudo de al menos aproximadamente 150 aminoácidos de longitud, más a menudo de al menos aproximadamente 200 aminoácidos de longitud, más a menudo de al menos aproximadamente 300 aminoácidos de longitud, o más. El "porcentaje (%) de la identidad de la secuencia de aminoácidos" con respecto a las secuencias de los polipéptidos PRO identificadas en la presente está definido como el porcentaje de los residuos de aminoácidos en una secuencia candidata que es idéntica con los residuos de aminoácidos en la secuencia del polipéptido PRO específica, después de alinear las secuencias e introducir los espacios, si es necesario, para lograr el porcentaje máximo de identidad de la secuencia, y sin considerar ninguna substitución conservativa como parte de la identidad de la secuencia. La alineación para propósitos de determinar el porcentaje de identidad de la secuencia de aminoácidos se puede lograr de varias maneras que están dentro de las habilidades en la técnica, por ejemplo, utilizando un programa de computadora disponible públicamente tal como los programas BLAST, BLAST-2 ALIGN, o Megalign (DNASTAR) . Aquellos expertos en la técnica pueden determinar los parámetros apropiados para medir la alineación, que incluye cualquier algoritmo necesario para lograr un alineamiento máximo sobre la longitud completa de las secuencias que están siendo comparadas. Para los propósitos de la presente, sin embargo, el % de los valores de identidad de la secuencia de aminoácidos se generaron utilizando el programa de computadora ALIGN-2, en donde el código fuente completo para el programa ALIGN-2 se proporciona en la Tabla 1 siguiente. El programa para computadora de comparación de secuencias ALIGN-2 pertenece a Genentech, Inc. y el código fuente mostrado en la Tabla 1 a continuación se presentó con la documentación para el usuario en la Oficina de Derechos de Autor de los Estados Unidos, Washington D.C., 20559, en donde se registró bajo el Registro de Derecho de Autor de los Estados Unidos No. TXU510087. El programa ALIGN-2 está disponible al público a través de Genentech, Inc., Sur de San Francisco, California o puede ser compilada a partir del código fuente provisto en la Tabla 1 a continuación. El programa ALIGN-2 debe ser compilado para utilizarse en el sistema operativo UNIX, preferiblemente UNIX V4.0D digital. Todos los parámetros de comparación de secuencias se ajustan mediante el programa ALIGN-2 y no varían. En las situaciones en donde se emplea ALIGN-2 para las comparaciones de secuencias de aminoácidos, el % de identidad de secuencia de aminoácidos de una secuencia de aminoácidos A dada a, con, o contra una secuencia de aminoácidos B dada (la cual puede ser alternativamente conjuntada como una secuencia de aminoácidos A dada que tiene o comprende un cierto % de identidad de secuencia de aminoácidos a, con, o contra una secuencia de aminoácidos B dada) se calcula como sigue: 100 veces la fracción X/Y en donde X es el número de residuos de aminoácidos registrados como concordancias idénticas mediante el programa de alineación de secuencias ALIGN-2 en que el programa de alineación de A y B, y en donde Y es el número total de los residuos de aminoácidos en B. Se apreciará que cuando la longitud de la secuencia de aminoácidos A no es igual a la longitud de la secuencia de aminoácidos B, el % de identidad de secuencia de aminoácidos de A hasta B no será igual al % de identidad de secuencia de aminoácidos de B hasta A. Como los ejemplos del % de los cálculos de identidad de secuencia de aminoácidos utilizando este método, las Tablas 2 y 3 demuestran cómo calcular el % de identidad de secuencia de aminoácidos de la secuencia de aminoácidos designada como "Proteína de Comparación" a la secuencia de aminoácidos designada "PRO", en donde "PRO" representa la secuencia de aminoácidos de un polipéptido PRO hipotético de interés. La "Proteína de Comparación" representa la secuencia de aminoácidos de un polipéptido contra el cual el polipéptido "PRO" de interés está siendo comparado, y "X", "Y" y "Z" cada uno representa diferentes residuos de aminoácidos hipotéticos. A menos que se especifique de otra manera, todos los valores del % de identidad de secuencia de aminoácidos utilizados en la presente se obtienen como se describe en el párrafo precedente inmediatamente utilizando el programa para computadora ALIGN-2. Sin embargo, los valores del % de identidad de secuencia de aminoácidos también se puede obtener como se describió abajo utilizando el programa para computadora WU-BLAST-2 (Altschul et al., Methods in Enzymology 266:460-480 (1996)). La mayoría de los parámetros de búsqueda WU-BLAST-2 se ajustan como valores por defecto. Aquéllos que no se ajustan como valores por defecto, es decir, los parámetros ajustables, se ajustan con los siguientes valores: espacio de traslape = 1, fracción de traslape = 0.125, umbral de palabra (T) = 11, y matriz de puntuación = BLOSUM62. Cuando se emplea WU-BLAST-2, un valor del % de identidad de secuencia de los aminoácidos se determina dividiendo (a) el número de residuos de aminoácidos idénticos que concuerdan entre la secuencia de aminoácidos del polipéptido PRO de interés que tiene una derivada de secuencia del polipéptido PRO nativo y la secuencia de aminoácidos de comparación de interés (es decir, la secuencia contra la cual el polipéptido PRO de interés se compara, la cual puede ser un polipéptido variante de PRO) como se determina por WU-BLAST-2 mediante (b) el número total de residuos de aminoácidos del polipéptido PRO de interés. Por ejemplo, en la oración "un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos A que tiene al menos 80% de identidad de secuencia de aminoácidos con la secuencia de aminoácidos B", la secuencia de aminoácidos A es la secuencia de aminoácidos de comparación de interés y la secuencia de aminoácidos B es la secuencia de aminoácidos del polipéptido PRO de interés. El porcentaje de identidad de secuencia de aminoácidos también puede ser determinado utilizando el programa de comparación de secuencias NCBI-BLAST2 (Altshul et al., Nucleic Acids Res. 25:3389-3402 (1997)). El programa de comparación de secuencias NCBI-BLAST2 se puede descargar de http://www.ncbi.nlm.nih.gov. El NCBI-BLAST2 utiliza varios parámetros de búsqueda, en donde todos aquellos parámetros de búsqueda se ajustan como valores por defecto que incluyen, por ejemplo, no enmascarado = si, hebra = todas, apariciones esperadas = 10, longitud de baja complejidad mínima = 15/5, valor e de pasos múltiples = 0.01, constante para pasos múltiples = 25, disminución para el alineamiento del espaciamiento final = 25 y matriz de puntuación = BLOSUM62. En situaciones en donde se emplea el NCBI-BLAST2 para las comparaciones de secuencia de aminoácidos, el % de identidad de secuencia de aminoácidos de una secuencia de aminoácidos A dada a, con, o contra una secuencia de aminoácidos B dada (la cual se puede nombrar alternativamente como una secuencia de aminoácidos A dada que tiene o comprende un cierto % de identidad de secuencia de aminoácidos a, con, o contra una secuencia de aminoácidos B dada) se calcula como sigue: 100 veces la fracción X/Y en donde X es el número de residuos de aminoácidos registrados como concordancias idénticas mediante el programa de alineación de secuencias NCBI-BLAST2 en que el programa de alineación de A y B, y en donde Y es el número total de los residuos de aminoácidos en B. Se apreciará que cuando la longitud de la secuencia de aminoácidos A no es igual a la longitud de la secuencia de aminoácidos B, el % de identidad de secuencia de aminoácidos de A hasta B no será igual al % de identidad de secuencia de aminoácidos de B hasta A. El "polinucleótido de la variante PRO" o la "secuencia de ácido nucleico de la variante PRO" significa una molécula de ácido nucleico que codifica un polipéptido PRO activo como se define antes o posteriormente y que tiene al menos aproximadamente 80% de identidad de la secuencia del ácido nucleico con una secuencia de ácidos nucleótidos que codifican una secuencia del polipéptido PRO de la secuencia nativa de longitud completa como se describe en la presente, una secuencia del polipéptido PRO de secuencia nativa de longitud completa que carece del péptido de señal como se describe en la presente, un dominio extracelular de un polipéptido PRO, con o sin el péptido de señal, como se describe en la presente o cualquier otro fragmento de una secuencia del polipéptido PRO de longitud completa como se describe en la presente. De manera ordinaria, un polinucleótido variante del PRO tendrá al menos aproximadamente 80% de identidad de secuencia de ácidos nucleicos, de manera más preferible al menos aproximadamente 81% de identidad de secuencia de ácidos nucleicos, de manera más preferible al menos aproximadamente 82% de identidad de secuencia de ácidos nucleicos, de manera más preferible al menos aproximadamente 83% de identidad de secuencia de ácidos nucleicos, de manera más preferible al menos aproximadamente 84% de identidad de secuencia de ácidos nucleicos, de manera más preferible al menos aproximadamente 85% de identidad de secuencia de ácidos nucleicos, de manera más preferible al menos aproximadamente 86% de identidad de secuencia de ácidos nucleicos, de manera más preferible al menos aproximadamente 87% de identidad de secuencia de ácidos nucleicos, de manera más preferible al menos aproximadamente 88% de identidad de secuencia de ácidos nucleicos, de manera más preferible al menos aproximadamente 89% de identidad de secuencia de ácidos nucleicos, de manera más preferible al menos aproximadamente 90% de identidad de secuencia de ácidos nucleicos, de manera más preferible al menos aproximadamente 91% de identidad de secuencia de ácidos nucleicos, de manera más preferible al menos aproximadamente 92% de identidad de secuencia de ácidos nucleicos, de manera más preferible al menos aproximadamente 93% de identidad de secuencia de ácidos nucleicos, de manera más preferible al menos aproximadamente 94% de identidad de secuencia de ácidos nucleicos, de manera más preferible al menos aproximadamente 95% de identidad de secuencia de ácidos nucleicos, de manera- más preferible al menos aproximadamente 96% de identidad de secuencia de ácidos nucleicos, de manera más preferible al menos aproximadamente 97% de identidad de secuencia de ácidos nucleicos, de manera más preferible al menos aproximadamente 98% de identidad de secuencia de ácidos nucleicos, de manera más preferible al menos aproximadamente 99% de identidad de secuencia de ácidos nucleicos, con la secuencia de ácido nucleico que codifica una secuencia del polipéptido PRO de la secuencia nativa de longitud completa como se describe en la presente, la secuencia del polipéptido PRO de la secuencia nativa de longitud completa que carece del péptido de señal como se describe en la presente, un dominio extracelular de un polipéptido PRO, con o sin la secuencia de señal, como se describe en la presente o cualquier otro fragmento de la secuencia del polipéptido PRO de longitud completa como se describe en la presente. Las variantes no engloban la secuencia de nucleótidos nativa.

De manera ordinaria, los polinucleótidos variantes de PRO son de al menos aproximadamente 30 nucleótidos de longitud, a menudo de al menos aproximadamente 60 nucleótidos de longitud, más a menudo de al menos aproximadamente 90 nucleótidos de longitud, más a menudo de al menos aproximadamente 120 nucleótidos de longitud, más a menudo de al menos aproximadamente 150 nucleótidos de longitud, más a menudo de al menos aproximadamente 180 nucleótidos de longitud, más a menudo de al menos aproximadamente 210 nucleótidos de longitud, más a menudo de al menos aproximadamente 240 nucleótidos de longitud, más a menudo de al menos aproximadamente 270 nucleótidos de longitud, más a menudo de al menos aproximadamente 300 nucleótidos de longitud, más a menudo de al menos aproximadamente 450 nucleótidos de longitud, más a menudo de al menos aproximadamente 600 nucleótidos de longitud, más a menudo de al menos aproximadamente 900 nucleótidos de longitud, o más. El "porcentaje (%) de identidad de la secuencia de ácido nucleico" con respecto a las secuencias de ácido nucleico que codifican al PRO identificadas en la presente, está definido como el porcentaje de nucleótidos en una secuencia candidata que es idéntica con los nucleótidos en la secuencia del ácido nucleico PRO de interés, después de alinear las secuencias e introducir los espacios, si es necesario, para lograr el porcentaje máximo de identidad de secuencia. La alineación para propósitos de determinar el porcentaje de identidad de secuencia de ácido nucleico se puede lograr de varias maneras que están dentro de las habilidades en la técnica, por ejemplo, utilizando un programa de computadora disponible públicamente tal como los programas BLAST, BLAST-2 ALIGN, o Megalign (DNASTAR) . Para los propósitos de la presente, sin embargo, los valores del % de identidad de secuencia del ácido nucleico se generaron utilizando el programa de computadora de comparación de secuencias ALIGN-2, en donde el código fuente completo para el programa ALIGN-2 se proporciona en la Tabla 1 siguiente. El programa para computadora de comparación de secuencias ALIGN-2 pertenece a Genentech, Inc. y el código fuente mostrado en la Tabla 1 a continuación se presentó con la documentación para el usuario en la Oficina de Derechos de Autor de los Estados Unidos, Washington D.C., 20559, en donde se registró bajo el Registro de Derecho de Autor de los Estados Unidos No. TXU510087. El programa ALIGN-2 está disponible al público a través de Genentech, Inc., Sur de San Francisco, California o puede ser compilada a partir del código fuente provisto en la Tabla 1 a continuación. El programa ALIGN-2 debe ser compilado para utilizarse en el sistema operativo UNIX, preferiblemente UNIX V4.0D digital. Todos los parámetros de comparación de secuencias se ajustan mediante el programa ALIGN-2 y no varían. En las situaciones en donde se emplea el ALIGN-2 para las comparaciones de secuencias de ácidos nucleicos, el % de identidad de secuencia de ácidos nucleicos de una secuencia de ácidos nucleicos C dada a, con, o contra una secuencia de ácidos nucleicos D dada (la cual puede ser alternativamente nombrar como una secuencia de ácidos nucleicos C dada que tiene o comprende un cierto % de identidad de secuencia de ácidos nucleicos a, con, o contra una secuencia de ácidos nucleicos D dada) se calcula como sigue: 100 veces la fracción W/Z en donde W es el número de nucleótidos registrados como concordancias idénticas mediante el programa de alineación de secuencias ALIGN-2 en que la alineación del programa de de C y D, y en donde Z es el número total de nucleótidos en D. Se apreciará que cuando la longitud de la secuencia de ácidos nucleicos C no es igual a la longitud de la secuencia de ácidos nucleicos D, el % de identidad de secuencia de ácidos nucleicos de C hasta D no será igual al % de identidad de secuencia de ácidos nucleicos de D hasta C. Como los ejemplos del % de los cálculos de identidad de secuencia de los ácidos nucleicos, las Tablas 4 y 5, demuestran cómo calcular el % de identidad de secuencia de ácido nucleico de la secuencia de ácidos nucleicos designada como "ADN de Comparación" a la secuencia de ácido nucleico designada "PRO-ADN", en donde "PRO-ADN" representa la secuencia de ácido nucleico de la secuencia de ácido nucleico del PRO hipotético de interés, el "ADN de Comparación" representa la secuencia de nucleótidos de una molécula de ácido nucleico contra la cual la molécula de ácido nucleico del "PRO-ADN" de interés está siendo comparado, y "N", "L" y "V" cada uno representa diferentes nucleótidos hipotéticos. A menos que se especifique de otra manera, todo los valores del % de identidad de secuencia del ácido nucleico utilizados en la presente se obtienen como se describe en el párrafo precedente inmediatamente utilizando el programa para computadora ALIGN-2. Sin embargo, los valores del % de identidad de secuencia de aminoácidos también se puede obtener como se describió abajo utilizando el programa para computadora WU-BLAST-2 (Altschul et al., Methods in Enzymology 266:460-480 (1996)). La mayoría de los parámetros de búsqueda WU-BLAST-2 se ajustan como valores por defecto.

Aquéllos que no se ajustan como valores por defecto, es decir, los parámetros ajustables, se ajustan con los siguientes valores: espacio de traslape = 1, fracción de traslape = 0.125, umbral de palabra (T) = 11, y matriz de puntuación = BLOSUM62. Cuando se emplea WU-BLAST-2, un valor se determina un % de identidad de secuencia de ácido nucleico dividiendo (a) el número de nucleótidos idénticos que concuerdan entre la secuencia de ácidos nucleicos de la molécula de ácido nucleico que codifica al polipéptido PRO de interés que tiene una secuencia derivada del ácido nucleico que codifica al polipéptido PRO de secuencia nativa y la comparación de la molécula de ácido nucleico de interés (es decir, la secuencia contra la cual la molécula de ácido nucleico que codifica al polipéptido PRO de interés se compara, la cual puede ser un polinucleótido PRO variante) como se determino por WU-BLAST-2 mediante (b) el número total de nucleótidos de la molécula de ácido nucleico que codifica al polipéptido PRO de interés. Por ejemplo, en la frase u oración "una molécula de ácido nucleico aislada que comprende una secuencia de ácido nucleico A que tiene al menos 80% de identidad de secuencia de ácido nucleico con la secuencia de ácido nucleico B", la secuencia de ácido nucleico A es la molécula de ácido nucleico de comparación de interés y la secuencia de ácido nucleico B es la secuencia de ácido nucleico de la molécula de ácido nucleico que codifica al polipéptido PRO de interés. El porcentaje de identidad de secuencia de ácido nucleico también puede ser determinado utilizando el programa de comparación de secuencias NCBI-BLAST2 (Altshul et al., Nucleic Acids Res. 25:3389-3402 (1997)). El programa de comparación de secuencias NCBI-BLAST2 se puede descargar de http://www.ncbi.nlm.nih.gov. El NCBI-BLAST2 utiliza varios parámetros de búsqueda, en donde todos aquellos parámetros de búsqueda se ajustan como valores por defecto que incluyen, por ejemplo, no enmascarado = si, hebra = todas, apariciones esperadas = 10, longitud de baja complejidad mínima = 15/5, valor e de pasos múltiples = 0.01, constante para pasos múltiples = 25, disminución para el alineamiento del espaciamiento final = 25 y matriz de puntuación = BLOSUM62. En situaciones en donde se emplea el NCBI-BLAST2 para las comparaciones de secuencia de ácido nucleico, el % de identidad de secuencia de ácido nucleico de una secuencia de ácido nucleico C dada a, con, o contra una secuencia de ácido nucleico D dada (la cual se puede nombrar alternativamente como una secuencia de ácido nucleico C dada que tiene o comprende un cierto % de identidad de secuencia de ácido nucleico a, con, o contra una secuencia de ácido nucleico D dada) se calcula como sigue: 100 veces la fracción W/Z en donde W es el número de nucleótidos registrados como concordancias idénticas mediante el programa de alineación de secuencias NCBI-BLAST2 en que el programa de alineación de C y D, y en donde Z es el número total de nucleótidos en D. Se apreciará que cuando la longitud de la secuencia de ácidos nucleicos C no es igual a la longitud de la secuencia de ácidos nucleicos D, el % de identidad de secuencia de ácidos nucleicos de C hasta D no será igual al % de identidad de secuencia de ácidos nucleicos de D hasta C. En otras modalidades, los polinucleótidos variantes de PRO, son moléculas de ácido nucleico que codifican un polipéptido PRO activo y que son capaces de hibridizar, preferiblemente bajo condiciones de lavado e hibridización severas, a secuencias de nucleótidos que codifican un polipéptido PRO de longitud completa, como se describe aquí. Los polipéptidos variantes del PRO pueden ser aquéllos que se codifican mediante un polinucleótido variante del PRO. El término "positivos", en el contexto de la comparación de la secuencia realizado como se describe arriba, incluye residuos en las secuencias comparadas que no son idénticas pero que tienen propiedades similares (por ejemplo, como resultado de substituciones conservativas, ver Tabla 6 a continuación) . Para propósitos en la presente, los valores del % de positivos se determina dividiendo (a) el número de residuos de aminoácidos que registran un valor positivo entre la secuencia de aminoácidos del polipéptido PRO de interés que tiene una secuencia derivada de la secuencia del polipéptido PRO nativo y la secuencia de aminoácidos de comparación de interés (es decir, la secuencia de aminoácidos contra la cual la secuencia del polipéptido PRO se va a comparar) como se determino en la matriz BLOSUM62 de WU-BLAST-2 mediante (b) el número total de los residuos de aminoácidos del polipéptido PRO de interés. A menos que se especifique de otra manera, los valores de % de los positivos se calculan como se describió en el párrafo inmediatamente precedente. Sin embargo, en el contexto de las comparaciones de identidad de secuencia de aminoácidos realizadas como se describe para ALIGN-2 y NCBI-BLAST2 anteriores, incluye los residuos de aminoácidos en las secuencias comparadas que no solamente son idénticas, sino también aquellas que tienen propiedades similares. Los residuos de aminoácidos que registran un valor positivo a un residuo de aminoácido de interés son aquellos que son ya sea idénticos a los residuos de aminoácidos de interés o son una substitución preferida (como se define en la Tabla 6 posterior) de los residuos de aminoácidos de interés. Para las comparaciones de secuencias de aminoácidos utilizando ALIGN-2 o NCBI-BLAST2, los valores del % de positivos de una secuencia de aminoácidos A dada, con, o contra una secuencia de aminoácidos B (la cual se puede nombrar alternativamente como una secuencia de aminoácidos A dada que tiene o comprende un cierto % de positivos a, con, o contra una secuencia de aminoácidos B dada) se calcula como sigue: 100 veces la fracción X/Y en donde X es el número de residuos de aminoácidos que registran un valor positivo como se definió anteriormente mediante el programa de alineación de secuencias ALIGN-2 o NCBI-BLAST2 en que el programa de alineación de A y B, y en donde Y es el número total de los residuos de aminoácidos en B. Se apreciará que cuando la longitud de la secuencia de aminoácidos A no es igual a la longitud de la secuencia de aminoácidos B, el % de identidad de secuencia de aminoácidos de A hasta B no será igual al % de identidad de secuencia de aminoácidos de B hasta A. "Aislado", cuando se usa aquí describe varios polipéptidos descritos aquí, que significa que el polipéptido ha sido identificado y separado y/o recuperado de un componente de su medio ambiente natural. Los componentes contaminantes de su medio ambiente natural son materiales que interferirían típicamente con los usos de diagnóstico o de terapia para el polipéptido, y pueden incluir enzimas, hormonas y otros solutos proteináceos o no proteináceos. En las modalidades preferidas, el polipéptido será purificado (1) hasta un grado suficiente para obtener al menos 15 residuos de la secuencia de aminoácidos N-terminal o interna o mediante el uso de un secuenciador de tasa giratoria, o (2) homogeneizar mediante SDS-PAGE bajo condiciones no reductoras o reductoras utilizando azul de Coomassie o, preferiblemente, teñido con plata. El polipéptido aislado incluye el polipéptido in sí tu dentro de las células recombinantes, puesto que al menos un componente del medio ambiente natural del polipéptido PRO no estará presente. De manera ordinaria, sin embargo, el polipéptido aislado será preparado por al menos una etapa de purificación. Un ácido nucleico que codifica al polipéptido PRO "aislado" u otro ácido nucleico que codifica un polipéptido es una molécula de ácido nucleico que está identificada y separada de al menos una molécula de ácido nucleico contaminante con el cual está asociado ordinariamente en la fuente natural del ácido nucleico que codifica al polipéptido. Una molécula de ácido nucleico que codifica al polipéptido, aislada, es diferente de una que está en la forma o tal como se encuentra en la naturaleza. Las moléculas de ácido nucleico que codifican al polipéptido, aisladas, por lo tanto se distinguen de las moléculas de ácido nucleico que codifican al polipéptido, específicas, tal como se encuentran en las células naturales. Sin embargo, una molécula de ácido nucleico que codifica al polipéptido, aislada, incluye las moléculas de ácido nucleico que codifican al polipéptido, contenidas en las células que ordinariamente expresan el polipéptido en donde, por ejemplo, la molécula del ácido nucleico está en una localización cromosómica diferente de aquélla de las células naturales . El término "secuencias de control" se refiere a las secuencias de ADN necesarias para la expresión de una secuencia de codificación enlazada operablemente en un organismo huésped particular. Las secuencias de control que son adecuadas para los procariotes, por ejemplo, incluyen un promotor, opcionalmente una secuencia operadora, y un sitio de enlace al ribosoma. Las células eucarióticas son conocidas como que utilizan a los promotores, señales de poliadenilación, y mejoradores. El ácido nucleico está "enlazado operablemente" cuando se coloca en una relación funcional con otra secuencia de ácido nucleico. Por ejemplo, ADN para una presecuencia o líder secretoria que está operablemente enlazada al ADN para un polipéptido si se expresa como una preproteína que participa en la secreción del polipéptido; un promotor o mejorador está enlazado operablemente a una secuencia de codificación si afecta la transcripción de la secuencia; o un sitio de enlace del ribosoma está enlazado operablemente a una secuencia de codificación si está colocado para facilitar la traducción. Generalmente, "enlazado operablemente" significa que las secuencias de ADN que están enlazadas son contiguas, y, en el caso de un líder secretorio o de secreción, contiguo y en una fase de lectura. Sin embargo, los mejoradores no tienen que estar contiguos. El enlace se lleva a cabo mediante ligación en sitios de restricción convenientes. Si tales sitios no existen, los adaptadores o enlazadores del oligonucleótido sintético se utilizan de acuerdo con la práctica convencional . El término "anticuerpo" se usa en el sentido más amplio y cubre específicamente, por ejemplo, los anticuerpos monoclonales anti-PRO, únicos (que incluye el agonista, antagonista, y anticuerpos neutralizantes) , las composiciones del anticuerpo anti-PRO con especificidad poliepitópica, los anticuerpos anti-PRO de cadena única, y los fragmentos de los anticuerpos anti-PRO (ver enseguida) . El término "anticuerpo monoclonal" como se utiliza aquí se refiere a un anticuerpo obtenido a partir de una población de anticuerpos homogéneos substancialmente, es decir, los anticuerpos individuales que comprenden la población son idénticos excepto por posibles mutaciones que se presentan de manera natural que pueden estar presentes en menores cantidades . La "severidad" de las reacciones de hibridización es fácilmente determinable por alguien con habilidades ordinarias en la técnica, y en general es un cálculo empírico que depende de la longitud de la sonda, la temperatura de lavado, y la concentración de sal. En general, las sondas más largas requieren temperaturas más altas para llevar una formación de moléculas de ácido nucleico híbridas adecuadas, mientras que las sondas más cortas necesitan temperaturas más bajas. La hibridización en general depende de la capacidad del ADN desnaturalizado para volver a formar moléculas de ácido nucleico hibridizadas cuando están presentes las hebras complementarias en un medio ambiente por debajo de su temperatura de fusión. Entre más grande sea el grado de homología deseado entre la secuencia de la sonda y la hibridizable, más alta será la temperatura que se puede utilizar. Como resultado, se desprende que las temperaturas relativamente altas tenderán a hacer a las condiciones de reacción más severas, mientras que las temperaturas más bajas las harán menos severas. Para detalles adicionales en la explicación de la severidad de las reacciones de hibridización, ver Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Wiley Interscience Publishers, (1995) . "Condiciones severas" o "condiciones de alta severidad", como se definen en la presente, pueden ser identificadas como aquéllas que: (1) emplean temperatura alta y fuerza iónica baja para el lavado, por ejemplo, cloruro de sodio 0.015 M/citrato de sodio 0.0015 M/dodecil sulfato de sodio al 0.1% a 50°C, (2) emplean durante la hibridización un agente desnaturalizante, tal como formamida, por ejemplo, formamida al 50% (v/v) con albúmina de suero bovino al 0.1%/Ficoll al 0.1%/polivinilpirrolidona al 0.1%/amortiguador de fosfato de sodio 50 mM a pH 6.5 con cloruro de sodio 750 mM, citrato de sodio 75 mM a 42°C; o (3) emplean formamida al 50%, SSC 5 x (NaCl 0.75 M, citrato de sodio 0.075 M) , fosfato de sodio 50 mM (pH 6.8), pirofosfato de sodio al 0.1%, solución de Denhardt 5 x, ADN de esperma de salmón sonicado (50 µg/ml), SDS al 0.1%, y sulfato de dextrano al 10% a 42 °C, con lavados a 42 °C en SSC 0.2 x (cloruro de sodio sodio/citrato de sodio) y formamida al 50% a 55 °C, seguido por un lavado de alta severidad que consiste de SSC 0.1 x que contiene EDTA a 55°C. Las "condiciones moderadamente severas" se identifican como se describen en Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, New York: Cold Spring Harbor Press, 1989, e incluyen el uso de una solución de lavado y condiciones de hibridización (por ejemplo, temperatura, fuerza iónica, y % de SDS) menos severas que las que se describen anteriormente. Un ejemplo de condiciones moderadamente severas es una condición tal como una incubación durante toda la noche a 37 °C en una solución que comprende: formamida al 20%, SSC 5 x (NaCl 150 mM, citrato de trisodio 15 mM) , fosfato de sodio 50 mM (pH 7.6), solución de Denhardt 5 x, sulfato de dextrano al 10%, y 20 mg/ml de ADN de esperma de salmón desnaturalizado, seguido por el lavado de los filtros en SSC 1 x a aproximadamente 37-50°C. El técnico con habilidades en la materia reconocerá cómo ajustar la temperatura, fuerza iónica, etc., conforme sea necesario para acomodar los factores tales como la longitud de la sonda y similares. El término "epítope marcado" como se utilizó en la presente se refiere a un polipéptido quimérico que comprende un polipéptido PRO fusionado a un "polipéptido de marca". El polipéptido de marca tiene suficientes residuos para proporcionar un epítope contra el cual se puede hacer un anticuerpo, no obstante que es corto esto no interfiere con la actividad del polipéptido al cual se va a fusionar. El polipéptido de marca preferiblemente también es medianamente único de modo que el anticuerpo no reacciona de manera cruzada substancialmente con otros epítopes. Los polipéptidos de marca adecuados generalmente tienen al menos seis residuos de aminoácidos y usualmente entre aproximadamente 8 y 50 residuos de aminoácidos (preferiblemente, entre aproximadamente 10 y 20 residuos de aminoácidos) . Como se utiliza en la presente, el término "inmunoadhesina" designa moléculas similares a anticuerpos que combinan la especificidad de enlace de una proteína heteróloga (una "adhesina") con las funciones efectoras de los dominios constantes de inmunoglobulina. Estructuralmente, las inmunoadhesinas comprenden una fusión de una secuencia de aminoácidos con la especificidad de enlace deseada la cual es diferente del reconocimiento de los antígenos y el sitio de enlace de un anticuerpo (es decir, es "heterólogo") , y una secuencia del dominio constante de la inmunoglobulina. La parte de la adhesina de una molécula de inmunoadhesina típicamente es una secuencia de aminoácidos contigua que comprende al menos el sitio de enlace de un receptor o un ligando. La secuencia del dominio de la constante de inmunoglobulina en la inmunoadhesina se puede obtener de cualquier inmunoglobulina, tal como los subtipos IgG-1, IgG-2, IgG-3, ó IgG-4, IgA (incluyendo IgA-1 e IgA-2), IgE, IgD ó IgM. "Activo" o "actividad" para el propósito de la presente se refiere a las formas del polipéptido PRO que retienen las actividades biológicas y/o inmunológicas del PRO que se presenta de manera natural, o nativo, en donde "biológica" se refiere a una función biológica (ya sea inhibidora o estimuladora) provocada PRO un PRO que se presenta de manera natural o nativa, diferente de la capacidad de inducir la producción de un anticuerpo contra un epítope antigénico posesionado por un PRO que se presenta de manera natural o nativa y una actividad "inmunológica" se refiere a la capacidad de inducir la producción de un anticuerpo contra un epítope antigénico posesionado por un PRO que se presenta de manera natural o nativo. El término "antagonista" se utiliza en un amplio sentido, e incluye cualquier molécula que parcial o totalmente bloquea, inhibe, o neutraliza una actividad biológica de un polipéptido PRO nativo descrito en la presente. De una manera similar, el término "agonista" se utiliza en un amplio sentido e incluye cualquier molécula que imite una actividad biológica de un polipéptido PRO nativo descrito en la presente. Las moléculas del agonista o antagonista, adecuadas, específicamente incluyen los anticuerpos del agonista o antagonista o los fragmentos de anticuerpo, fragmentos o variantes de la secuencia de aminoácidos de los polipéptidos PRO nativos, péptidos, moléculas orgánicas pequeñas, etc. Los métodos para identificar los agonistas o antagonistas de un polipéptido PRO pueden comprender poner en contacto un polipéptido PRO con un agonista candidato o una molécula antagonista y medir un cambio detectable en una o más actividades biológicas normalmente asociadas con el polipéptido PRO. "Tratamiento" se refiere tanto al tratamiento terapéutico como profiláctico o a las medidas de prevención, en donde el objetivo es prevenir o retardar (disminuir) la condición o padecimiento patológico objetivo. Aquéllos que necesitan el tratamiento incluyen aquéllos que ya tienen el padecimiento así como a aquéllos que están proclives a tener el padecimiento o aquéllos en donde el padecimiento va a ser evitado. La administración "crónica" se refiere a la administración del agente o agentes de un modo continuo en oposición a un modo agudo, de manera que se mantenga el efecto terapéutico inicial (actividad) durante un periodo de tiempo extendido. La administración "intermitente" es el tratamiento que no sólo se da consecutivamente sin interrupción sino que es cíclico de naturaleza. "Mamífero" para propósitos del tratamiento se refiere a cualquier animal clasificado como mamífero, que incluye humanos, animales domésticos y de granja, y de zoológico, animales deportivos, o animales mascotas, tales como perros, gatos, vacas, caballos, borregos, cerdos, cabras, conejos etc. Preferiblemente, el mamífero aquí es un humano.

La administración "en combinación con" uno o más agentes terapéuticos incluyen la administración simultánea (concurrente) y consecutiva en cualquier orden. "Portadores" como se utiliza aquí incluye portadores, excipientes, o estabilizantes aceptables farmacéuticamente que no son tóxicos para las células o para el mamífero que va a estar expuesto al mismo en las dosis y concentraciones empleadas. A menudo el portador aceptable fisiológicamente es una solución amortiguada de pH acuosa. Los ejemplos de portadores aceptables fisiológicamente incluyen amortiguadores tales como fosfato, citrato, y otros ácidos orgánicos; los antioxidantes incluyen ácido ascórbico; los polipéptidos de bajo peso molecular (menores de aproximadamente 10 residuos); proteínas, tales como albúmina de suero, gelatina, o inmunoglobulinas; polímeros hidrofílicos tales como polivinilpirrolidona; aminoácidos tales como glicina, glutamina, asparagina, arginina o lisina; monosacáridos, disacáridos, y otros carbohidratos que incluyen glucosa, mannosa, o dextrinas; agentes quelantes tales como el EDTA; alcoholes de azúcar tales como manitol o sorbitol; contraiones formadores de sal tales como sodio; y/o surfactantes no iónicos tales como TWEEN™, polietilenglicol (PEG), y PLURONICS™.

Los "fragmentos de anticuerpos" comprenden una porción de un anticuerpo intacto, preferiblemente el enlace del antígeno o la región variable del anticuerpo intacto.

Los ejemplos de los fragmentos del anticuerpo incluyen los fragmentos Fab, Fab', F(ab')2' y Fv; los diacuerpos; los anticuerpos lineales (Zapata et al., Protein Eng. 8(10): 1057-1062 [1995]); las moléculas de anticuerpos de cadena sencilla; y los anticuerpos multiespecíficos formados de los fragmentos de anticuerpos. La digestión de la papaína de los anticuerpos produce dos fragmentos de enlace de antígenos idénticos, llamados fragmentos "Fab", cada uno con un sitio de enlace del antígeno sencillo, y un fragmento "Fc" residual, una designación que refleja la capacidad de cristalizar fácilmente. El tratamiento con pepsina genera un fragmento F(ab')2 c3ue tiene dos sitios de combinación de antígenos y que es capaz de enlazar cruzadamente al antígeno. El "Fv" es un fragmento de anticuerpo mínimo que contiene un sitio de reconocimiento y enlace del antígeno completo. Esta región consiste de un dímero de un dominio variable de cadena pesada y uno de cadena ligera, en ajuste con una asociación no covalente. Es en esta configuración que hay tres CDR de cada interacción de dominio variable que definen un sitio de enlace al antígeno en la superficie del dímero VH-VL. Colectivamente, los seis CDR confieren especificidad de enlace al antígeno al anticuerpo. Sin embargo, aún un dominio de variable única (o la mitad de un Fv comprende solamente tres CDR específicos para un antígeno) que tiene la capacidad de reconocer y enlazar antígenos, aunque con una menor afinidad que el sitio de enlace completo. El fragmento Fab también contiene el dominio constante de la cadena ligera y el primer dominio constante (CH1) de la cadena pesada. Los fragmentos Fab difieren de los fragmentos Fab por la adición de unos pocos residuos en el carboxi terminal del dominio CH1 de cadena pesada que incluye una o más cisteínas de la región de articulación del anticuerpo. El Fab'-SH es la designación en la presente para el Fab1 en la cual el o los residuos de cisteína de los dominios constantes contienen un grupo tiol libre. Los fragmentos del anticuerpo F(ab')2 originalmente fueron producidos como pares de los fragmentos Fab1 los cuales tienen cisteínas de articulación entre ellos. Otros acoplamientos químicos de los fragmentos de anticuerpos son también conocidos. Las "cadenas ligeras" de anticuerpos (inmunoglobulinas) de cualquier especie de vertebrados se puede asignar a uno de dos tipos distintos claramente, llamados kappa y lambda, en base a las secuencias de aminoácidos de sus dominios constantes. Dependiendo de la secuencia de aminoácidos del dominio constante de sus cadenas pesadas, las inmunoglobulinas se pueden asignar a diferentes clases. Hay cinco clases principales de inmunoglobul-inas: IgA, IgD, IgE, IgG e IgM, y varias de estas se pueden dividir adicionalmente en subclases (isotipos), por ejemplo, IgGl, IgG2, IgG3, IgG4, IgA, e IgA2. Los fragmentos del anticuerpo "Fv de cadena sencilla" o "sFv" comprenden los dominios VH y VL del anticuerpo, en donde estos dominios están presentes en una cadena de polipéptido sencilla. Preferiblemente, el polipéptido Fv comprende además un enlazador del polipéptido entre los dominios VH y VL que permite que el sFv forme la estructura deseada para el enlace del antígeno. Para una revisión del sFv ver Pluckthun en The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg y Moore eds., Springer-Verlag, New York, pp. 269-315 (1994) . El término "diacuerpos" se refiere a fragmentos de anticuerpos pequeños con dos sitios de enlace al antígeno, cuyos fragmentos comprenden un dominio variable de cadena pesada (VH) conectado a un dominio variable de cadena ligera (V_) en la misma cadena del polipéptido (VH - VL) . Utilizando un enlazador que es demasiado corto para permitir el apareamiento entre los dos dominios en la misma cadena, los dominios se forzan a aparearse con los dominios complementarios de otra cadena y crean dos sitios de enlace de antígeno. Los diacuerpos se describen con mayor detalle en, por ejemplo, EP 404,097; WO 93/11161; y Hollinger et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 90:6444-6448 (1993). Un anticuerpo "aislado" es uno que ha sido identificado y separado y/o recuperado de un componente de su medio ambiente natural. Los componentes contaminantes de su medio ambiente natural son materiales que interferirían con los usos terapéuticos y de diagnóstico para el anticuerpo, y pueden incluir enzimas, hormonas, y otros solutos proteínicos o no proteínicos. En las modalidades preferidas, el anticuerpo se purificará (1) para ser mayor del 95% en peso del anticuerpo como se determina por el método Lowry, y más preferiblemente más del 99% por peso, (2) hasta un grado suficiente para obtener al menos 15 residuos de la secuencia de aminoácidos N-terminal o interna mediante el uso de un secuenciador de tasa giratoria, o (3) homogeneizar mediante SDS-PAGE bajo condiciones no reductoras o reductoras utilizando azul de Coomassie o, preferiblemente, teñido con plata. El anticuerpo aislado incluye el anticuerpo in situ dentro de las células recombinantes, puesto que al menos un componente del medio ambiente natural del anticuerpo no estará presente. De manera ordinaria, sin embargo, el anticuerpo aislado será preparado por al menos una etapa de purificación. La palabra "etiqueta" cuando se utiliza aquí se refiere a un compuesto o composición detectable que está conjugado directamente al anticuerpo para generar un anticuerpo "etiquetado". La etiqueta puede ser detectable por sí misma (por ejemplo etiquetas de radioisótopos o etiquetas fluorescentes) o, en el caso de una etiqueta enzimática, pueden catalizar la alteración química de un compuesto o composición del substrato que es detectable. Por "fase sólida" se indica una matriz no acuosa a la cual el anticuerpo de la presente invención se puede adherir. Los ejemplos de las fases sólidas englobadas en la presente incluyen aquéllas formadas parcial o completamente de vidrio (por ejemplo, vidrio de poros controlados), polisacáridos (por ejemplo, agarosa) , poliacrilamidas, poliestireno, alcohol polivinílico y siliconas. En ciertas modalidades, dependiendo del contexto, la fase sólida puede comprender el pozo de una placa de ensayo; en otras es una columna de purificación (por ejemplo, una columna de cromatografía por afinidad) . Este término también incluye una fase sólida discontinua de partículas discretas, tales como aquéllas descritas en la Patente Norteamericana No. 4,275,149. Un "liposoma" es una vesícula pequeña compuesta de varios tipos de lípidos, fosfolípidos y/o surfactantes que son útiles para suministrar un fármaco (tales como un polipéptido PRO o un anticuerpo del mismo) a un mamífero.

Los componentes del liposoma se arreglan de manera común en una formación de bicapas, similar al arreglo de lípidos de las membranas biológicas. Una "molécula pequeña" se define en la presente que tiene un peso molecular por debajo de aproximadamente 500 Daltons .

Tabla 1 /* * C-C incrementado desde 12 a 15 * Z es promedio de EQ * B es promedio de ND * corresponde con la detención es _M; detención-detención = 0; J (incógnita) correspondencia = 0 */ #def?nir M -8 /* valor de una correspondencia o concordancia con una detención v */ int _día[26][26] = { /* A C D E F G H I J K L M N O P Q R S T U V W X Y Z*/ /* A*/ 2, 0,-2, 0, 0,-4, 1,-1,-1, 0,-1,-2,-1, 0,_M, 1, 0,-2, 1, 1, 0, 0,-6, 0,-3, 0}, B*/ 0, 3,-4, 3, 2,-5, 0, 1,-2, 0, 0,-3,-2, 2,_M,-1, 1, 0, 0, 0, 0,-2,-5, 0,-3, 1}, /*C*/ {-2,-4,15,-5,-5,-4,-3,-3,-2, 0,-5,-6,-5,-4,_M,-3,-5,-4, 0,-2, 0,-2,-8, 0, 0,-5}, /*D*/ 0, 3,-5, 4, 3,-6, 1, 1,-2, 0, 0,-4,-3, 2,_M,-1, 2,-1, 0, 0, 0,-2,-7, 0,-4, 2}, /*E*/ 0, 2,-5, 3, 4,-5, 0, 1,-2, 0, 0,-3,-2, 1,_M,-1, 2,-1, 0, 0, 0,-2,-7, 0,-4, 3}, /*F*/ -4,-5,-4,-6,-5, 9,-5,-2, 1, 0,-5, 2, 0,-4,_M,-5,-5,-4,-3,-3, 0,-1, 0, 0, 7,-5}, /*G*/ 1, 0,-3, 1, 0,-5, 5,-2,-3, 0,-2,-4,-3, 0,_M,-l,-l,-3, 1, 0, 0,-1,-7, 0,-5, 0}, /*H*/ {-1, 1,-3, 1, 1,-2,-2, 6,-2, 0, 0,-2,-2, 2,_M, 0, 3, 2,-1,-1, 0,-2,-3, 0, 0, 2}, /*I*/ {-1,-2,-2,-2,-2, 1,-3,-2, 5, 0,-2, 2, 2,-2,_M,-2,-2,-2,-l, 0, 0, 4,-5, 0,-1,-2}, /*)*/ 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0,_M, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0}, /*K*/ -1, 0,-5, 0, 0,-5,-2, 0,-2, 0, 5,-3, 0, 1,_M,-1, 1, 3, 0, 0, 0,-2,-3, 0,-4, 0}, /*L*/ -2,-3,-6,-4,-3, 2,-4,-2, 2, 0,-3, 6, 4,-3,_M,-3,-2,-3,-3,-l, 0, 2,-2, 0,-1,-2}, /*M*/ -1,-2,-5,-3,-2, 0,-3,-2, 2, 0, 0, 4, 6,-2,_M,-2,-l, 0,-2,-1, 0, 2,-4, 0,-2,-1}, /*N*/ 0, 2,-4, 2, 1,-4, 0, 2,-2, 0, 1,-3,-2, 2,_M,-1, 1, 0, 1, 0, 0,-2,-4, 0,-2, 1}, 1*0*1 _M,_M,_M,_M,_M,_M,_M,_M,_M,_M._M,_M,_M,_M,0,_M,_M,_M,_M,_M,_M,_M,_M,_M,_M,_M /*P*/ 1,-1 -3,-1,-1,-5,-1, 0,-2, 0,-l,-3,-2,-l,_M, 6, 0, 0, 1, 0, 0,-1,-6, 0,-5, 0}, l*Q*l 0, 1, -5, 2, 2,-5,-1, 3,-2, 0, 1,-2,-1, 1,_M, 0, 4, 1,-1,-1, 0,-2,-5, 0,-4, 3}, /*R*/ -2,0 -4,-1,-1,-4,-3, 2,-2, 0, 3,-3, 0, 0,_M, 0, 1, 6, 0,-1, 0,-2, 2, 0,-4, 0}, /*S*/ 1,0, 0, 0, 0,-3, 1,-1,-1, 0, 0,-3,-2, 1,_M, 1,-1, 0, 2, 1, 0,-1,-2, 0,-3, 0}, l*?*l 1,0, -2, 0, 0,-3, 0,-1, 0, 0, 0,-1,-1, 0,_M, 0,-1,-1, 1, 3, 0, 0,-5, 0,-3, 0}, l*M*l 0,0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0,_M, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0}, ?*v*? 0,-2, -2,-2,-2,-1,-1,-2, 4, 0,-2, 2, 2,-2,_M,- 1,-2,-2,-1, 0, 0, 4,-6, 0,-2,-2}, /*w*/ •6,-5, -8,-7,-7, 0,-7,-3,-5, 0,-3,-2,-4,-4,_M,-6,-5, 2,-2,-5, 0,-6,17, 0, 0,-6}, /*x*/ 0,0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0,_M, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0}, /*Y*/ -3,-3, 0,-4,-4, 7,-5, 0,-1, 0,-4,-l,-2,-2,_M,-5,-4,-4,-3,-3, 0,-2, 0, 0,10,-4}, ?*z*? 0, 1,-: 5, 2, 3,-5, 0, 2,-2, 0, 0,-2,-1, 1,_M, 0, 3, 0, 0, 0, 0,-2,-6, 0,-4, 4} }; Tabla 1 (cont.) */ ftincluir <stdio.h> #incluir <ctype.h> #definir MAXJMP 16 /* saltos max. en un diag */ #def?nir MAXSEP 24 /* no continua para penalizar los espacios más grandes que este */ #definir JMPS 1024 /* saltos max. en una trayectoria */ #definir MX 4 /* guardar si hay al menos MX-1 bases desde el último salto */ #def?nir DMAT /* valor de bases con correspondencia */ ^definir DMIS /* penalidad para bases que no se corresponden */ #def?nir DINSO /* penalidad para un espacio */ ftdefinir DINS1 /* penalidad por base */ #definir PINSO /* penalidad por espacio */ #def?nir PINS1 /* penalidad por residuo */ estruct. jmp { corto n[MAXJMP]; /* tamaño de salto (neg para dely) */ corto no etiquetado xfMAX MP]; /* base no. de salto de sec. x */ /* limita la sec. a 2?16 -l */ estruct diag { int puntuación; /* puntuación en el último salto */ largo desviación; /* desviación del bloque previo */ corto ¡salto; /* índice de saltos actuales */ estruc salt. jp; /* lista de saltos */ }; estruct tray. { int espac; /* numero de espacios guía */ corto n[JMPS]; /* tamaño de saltos (separación) */ int x[JMPS]; /* loe. de salt (último elemento antes de espacio) */ }; car *oarchivo; /* nombre de archivo de salida */ car *nombrex[2]; /* nombres de sec. : getsecs() */ car *prog; /* nombre prog para mens. de error */ car *secx[2]; /* secs: obtenersecsO */ int dmax; /* diag mejor: nw() */ int dmax?; /* diag final */ int adn; /* ajustar si adn: principal() */ int sep. de extremos; /* ajustar si se penalizan sep. extremas */ int sepx, sepy; /* separaciones totales en secs */ int lenO, lenl; /* lens sec. */ int nsepx, nsepy; /* tamaño total de separaciones */ int smax; /* puntuación max: n () */ int *xbm; /* mapa de bitios para corresp. */ largo desv.; /* desviación actual en archivo de salto */ estruct diag *dx; /* diagonales retenciones */ estruct tray. PP.2]; /* tray. retenciones para secs */ car *calloc(), *malloc(), *índice(), *strcpy(); car *getsec(), *g_calloc(); Tabla 1 (conf) /* Programa de alineación Needleman- Wunsch * uso: progs archivo 1 archivo2 * donde archivo 1 y archivo2 son dos adn o dos secuencias de proteínas. * Las secuencias pueden estar en la porción superior o inferior o pueden contener ambigüedad * Cualquier línea que empiece con ';', ">' o '<* se ignoran * Longitud de archivo max. es 65535 (limitado por x corto no etiquetado en la estruc de salt) * Una secuencia con 1/3 o más de sus elementos ACGTU se considera que es ADN * Salida está en el archivo "align.out" * * El programa puede crear un archivo tmp en /tmp para sostener info sobre respaldo. * Versión original desarrollada abajo BSD 4.3 en un vax 8650 */ ^incluir "nw.h" «incluir "day.h" estático _dbval[26] = { 1 , 14,2, 13,0,0,4, 11 ,0,0, 12,0,3, 15,0,0,0,5,6,8,8,7,9,0, 10,0 estático _pbval[26] = { 1, 2|(1«('D,-,A,))|(1«CN'-,A')), 4; 8, 16, 32, 64, 128, 256, OxFFFFFFF, 1«10, 1«11, 1«12, 1«13, 1«14, 1«15, 1«16, 1«17, 1«18, 1«19, 1«20, 1«21, 1 «22, 1«23, 1«24, 1«25|(1«(?'-,A'))|(1«(,Q,-,A')) principal(ac, av) principal int ac; car *av[]: { prog = av[0]; si (ac != 3) { fimprimirf(stderr,"uso: %s archivo 1 archivo 2\n", prog); f?mprimirf(stderr,"donde archivo 1 y archivo 2 son dos secuencias de adn o dos proteínas.\n"); fimprimirf(stderr,"Las secuencias pueden estar en la porción superior o inferior.."); fimprimirf(stderr,"Cualquier línea que empiece con ';' o '<' se ignora\n"); fimprimirf (stderr,"Salida está en el archivo \"align.out\"\n"); salida(l); } nombrex[0] = av[l]; nombrex[l] = av[2]; secx[0] = getsec(nombrex[0], &len0); secx[ 1 ] = getsec(nombrex[ 1 ], &len 1 ); xbm = (adn)? .dbval : -pbval; separaciones de extremos = /* 1 para penalizar separaciones de extremos */ archivo o = "align.out"; /* archivo de salida */ nw(); /* llenar en la matriz, obtener posibles saltos */ leersalt(); /* ajustar saltos reales */ imprimirO; /* imprimir alineación, */ l?mpiar(O); /* no enlazar cualquier archivo tmp */ Tabla 1 (cont.) /* efectuar alineación, regresar a mejor puntaje: principal() * adn: valores en Fitch y Smith, PNAS, 80, 1382-1386, 1983 * pro: valores PAM 250 * Cuando los puntajes son iguales se prefieren no correspondencias a cualquier espacio, preferir * un nuevo espacio para extender un espacio en curso, y preferir un espacio en secx * a una separación en sec y. */ nw() nw car *px, *py; /* secs y ptrs */ int *ndely, *dely; /* mantener carril de dely */ int ndelx, delx; /* mantener carril de delx */ int *tmp; /* para intercambiar hileraO, hileral */ iinntt mmiiss;; /* puntaje para cada tipo */ int insO, insl; /* inserción de penalidades */ registrar id; /* índice diagonal */ registrar ü; /* índice de salto */ registrar *col0, *coll ; /* registro para última hilera, actual */ rreeggiissttrraarr x xxx,, y yyy;; /* índice en secs. */ dx = (estruct diag *)g_calloc("obtener diags", Ien0+Ienl+1, tamaño de(estruct diag)); ndely = (int *)g_calloc("obtener ndely", lenl+1, tamaño de(int)); dely = (int *)g_calloc("obtener dely", lenl+1, tamaño de(int)); colO = (int *)g_calloc("obtener colO", lenl+1, tamaño de(int)); coi l = (int *)g_calloc("obtener coll ", lenl+1, tamaño de(int)); insO = (adn)? DINS0 : PINS0; insl = (adn)? DINSl : PINS1; smax = -10000; si (separaciones de extremo) { para (col0[0] = dely[0] = -insO, yy = 1 ; yy <= lenl ; yy++) { col0[yy] = dely[yy] = col0[yy-l] - insl ; ndelyfyy] = yy; } col0[0] = 0; /* Waterman Bull Math Biol 84 V } entonces para (yy = 1 ; yy <= lenl; yy++) dely[yy] = -insO; /* llenar en matriz de correspondencia */ para (px = secx[0], xx = 1 ; xx <= lenO; px++, xx++) { /* iniciar primera entrada en col */ si (separaciones de extremo) { si (xx = 1) coll [0] = delx = -(insO+insl); entonces col 1[0] = delx = col0[0] - insl ; ndelx = xx; } entonces coll [0] = 0; delx = -insO; ndelx = 0; Tabla 1 (cont.) ...nw para (py = secx[ 1 ], yy = 1 ; yy <= len 1 ; py++, yy++) { mis = colO[yy-l]; 5 si (adn) mis += (xbm[*px-,A']&xbm[*py-,A'])? DMAT : DMIS; entonces mis += _día[*px-,A'][*py-,A,]; 10 /* pena por actualización para del en la sec x; * favorezca el nuevo del sobre el del en curso * ignore MAXSEP si las separaciones de extremo pesan más */ si (separaciones de extremo || ndely[yy] < MAXSEP) { 15 si (col0[yy] - insO >= dely[yy]) { dely.yy] = col0[yy] - (insO+insl); ndely[yy] = 1; } entonces { dely[yy] -= insl; 20 ndely[yy]++; } } entonces { si (colOfyy] - (insO+insl) >= dely[yy]) { dely[yy] = colOfyy] - (insO+insl); 25 ndelyfyy] = 1 ; } entonces ndely[yy] } 30 /* penalidad por actualización para del en sec y; * favorezca el nuevo del sobre el del en curso */ si (separaciones de extremo || ndelx < MAXSEP) { si (coll[yy-l] - insO >= delx) { 35 delx = coll[yy-I] - (insO+insl); ndelx = 1 ; } entonces { delx -= insl; ndelx++; 40 } } entonces { si (coll[yy-l] - (insO+insl) >= delx) { delx = coll[yy-l] - (insO+insl); ndelx = 1; 4 5 } entonces ndelx++; } /* recolectar el registro máximo; estamos favoreciendo 50 * falta sobre cualquiera del y delx sobre dely * Tabla 1 (cont.) ...nw id = xx - yy + lenl - 1; si (mis >= delx && mis >= delyfyy]) coll [yy] = mis; entonces si (delx >= delyfyy]) { coll[yy] = delx; ij = dx[id].isalt; si (dx[id].jp.n[0] && (!adn || (ndelx >= MAXJMP && xx > dx[id].jp.x[ij]+MX) || mis > dx[id].puntaje+DINSO)) { dx[id].isalt++; si (++¡j >= MAXJMP) { escribirsalt(id); ij = dxfid].isalt = 0; dx[id].desviar = desviar; desviar += tamaño de(estruct salt) + tamaño de(desviar); } } dx[id].jp.n[ij] = ndelx; dxfid] jp.xfij] = xx; dx[id].score = delx; } entonces { coll [yy] = delyfyy]; ij = dx[id].isalt; si (dx[id].jp.n[0] && (!adn || (ndelyfyy] >= MAXJMP && xx > dx[id].jp.x[ij]+MX) || mis > dx[id].puntaje+DINS0)) { dx[id].isalt++; si (++ij >= MAXJMP) { escribirsalts(id); ij = dx[id].isalt = 0; dxfid]. desviar = desviar; desviar += tamaño de(estruct jmp) + tamaño de(desviar); } } dx[id].jp.n[ij] = -ndelyfyy]; dxfidj.jp.xfij] = xx; dxfid]. puntaje = delyfyy]; } si (xx = lenO && yy < lenl ) { /* último col */ si (separaciones de extremo) col 1 [yy] -= insO+insl *(len 1 -yy); si (col 1 fyy] > s ax) { smax = coll [yy]; dmax = id; } } } si (separaciones de extremo && xx < lenO) coll [yy-l] -= insO+insl *(lenO-xx); si (coll [yy-l] > smax) { smax = col l [yy-l]; dmax = id; } tmp = colO; colO = coil; coil = tmp; } (vacío) libre((car *)ndely); (vacío) libre((car *)dely); (vacío) libre((car *)col0); (vacío) libre((car *)coll); Tabla 1 (cont.) /* * * imprimirO - solamente la rutina visible fuera de este módulo * * estático: * obtenermat() - respaldo de las trazas de la mejor vía, contabilidad o conteo de las correspondencias: imprimir() * pr_alinear() - alineación de imprimir de lo descrito en el arreglo pf]: imprimir() * dumpblock() - bloque de vuelco de memoria-volcar un bloque de líneas con números, stars: pr_alinear() * nums() - poner fuera una línea del número: bloque de volcado de memoria() * ponerlíneaO - colocar fuera una línea (nombre, [num], sec, [num]): bloque de volcado de memoria () * stars() - -poner una línea de stars: bloque de volcado de memoria () * quitarnombreO - quitar cualquier trayectoria y prefijo de un nombre de sec */ #incluir "nw.h" «definir ESPAC 3 «definir P_LINEA 256 /* línea de salida máxima */ «definir P ESPAC 3 /* espacio entre el nombre o el número y sec */ externo _día[26][26]; int olen; /* restablecer la longitud de línea de salida */ ARCHIVO *fx; /* archivo de salida */ imprimir() imprimir int lx, ly, primer espaciamiento, último espaciamiento; /* traslape */ si ((fx = f abierto(o archivo, " ")) = 0) { fímprimir(stderr,"%s: no se puede escribir %s\n", prog, o archivo); limpiar(l); } fimprimirf(fx, "<primera secuencia: %s (longitud = %d)\n", nombrexfO], lenO); fimprimirf(fx, "<segunda secuencia: %s (longitud = %d)\n", nombrex[l], lenl ); olen = 60; lx = lenO; ly = lenl; primer espaciamiento = último espaciamiento = 0; si (dmax < lenl - 1) { /* espaciamiento guía en x */ pp[0].espac = primer espaciamiento = lenl - dmax - 1 ; ly -= pp[0].espac; } entonces si (dmax > lenl - 1) {/* sep guía en y */ pp[l].espac = primer espaciamiento = dmax - (lenl - 1); lx -= pp[l].espac; } si (dmaxO < lenO - 1) { /* sep de cola en x */ último espaciamiento = lenO - dmaxO -1 ; lx -= último espaciamiento; } entonces si (dmaxO > lenO - 1 ) { /* espaciamiento de traslape en y */ último espaciamiento = dmaxO - (lenO - 1); ly -= último espaciamiento; } obtenermat(lx, ly, primer espaciamiento, último espaciamiento); pr_alinear(); Tabla 1 (cont.) /* * rastro trasero de la mejor vía, conteo de correspondencias */ estático obtenermat(lx, ly, primer espaciamiento, último espaciamiento) Obtenermat int lx, ly; /* "núcleo" (menos espaciamientos de extremo) */ int primer espaciamiento, último espaciamiento; /* traslape de la cola guía */ { int nm, iO, il, tamO, taml ; car salidaxf32]; doble pet; registrar nO, ni ; registrar car *p0, *pl; /* obtener las correspondencias totales, puntaje */ iO = ?l = tam0 = taml = 0; pO = secxfO] + pp[l].espac; p 1 = secx[ 1 ] + pp[0] .espac; n0 = pp[l].espac + 1 ; ni = pp[0]. espac + 1 ; nm = 0; entonces ( *p0 && *pl ) { si (tamO) { pl++; nl++; tamO— ; } entonces si (taml) { p0++; n0++; taml-; } entonces { si (xbm[*pO-,A,]&xbm[*pl-,A']) nm++; si (n0++ = = pp[0].x[i0]) tam0 = pp[0].n[i0++]; si (nl++ = = pp[l].?[il]) taml = pp[l].n[il++]; p0++; pl++; } /* homología pet: * si se penalizan las separaciones de extremo, la base es la sec más corta * entonces, destruir las salientes y tomar un núcleo más corto */ si (separaciones de extremo) lx = (len0 < lenl )? len0 : lenl; entonces lx = (lx < ly)? lx : ly; pct = 100.*(doble)nm/(doble)lx; fimprimirf(fx, "\n"); fímprirmif(fx, "<%d corresponde a %s en un traslape de %d: %.similaridad de 2f por ciento \n", nm, (nm = = 1)? "" : "es", lx, pet); Tabla 1 (cont.) f.mprimirf(fx, "<separación en una primera secuencia: %d", sepx); ...obtenermat si (sepx) { (vacío) simprimirf(salidax, " (%d %s%s)", nsepx, (adn)? "base":"residuo", (nsepx = 1)? "":"s"); fimprimirf(fx,"%s", salidax); fimprimirf(fx, ", separaciones en una segunda secuencia: %d", sepy); si (sepy) { (vacío) simprimirf(salidax, " (%d %s%s)", nsepy, (adn)? "base":"residuo", (nsepy = = 1)? "":"s"); fimprimirf(fx,"%s", salidax); } si (adn) fimprimirf(fx, "\n<puntaje: %d (correspondencia = %d, no correspondencia = %d, penalidad de separación = %d + %d por base)\n", smax, DMAT, DMIS, DINSO, DINS1); entonces fimprimirf(fx, "\n<puntaje: %d (matriz Dayhoff PAM 250, penalidad de separación = %d + %d por residuo)\n", smax, PINSO, PINSl); si (separación de extremos) fimprimirf(fx, "<separaciones de extremos penalizadas, separaciones de extremo izquierdas: %d %s%s, separaciones de extremo derechas: %d %s%s\n", primer espaciamiento, (adn)? "base" : "residuo", (primer espaciamiento = = 1 )? "" : "s", último espaciamiento, (adn)? "base" : "residuo", (último espaciamiento = = 1 )? "" : "s"); entonces f?mprimirf(fx, "<separaciones extremas no penalizadas\n"); estático nm; /* correspondencias en el núcleo — para verificar */ estático Imax; /* longitudes de nombres de archivos eliminados */ estático «[2]; /* índice de salto para una trayectoria */ estático nc[2]; /* número en el inicio de la línea actual */ estático ni[2]; /* numero de elemento actual — para formar el espaciado */ estático tam[2]; car estático *ps[2]; /* ptr al elemento actual */ car estático *po[2]; /* ptr a la ranura car de la siguiente salida */ car estático salida[2][P LINEA]; /* línea de salida */ car estático star[P_LINEA]; /* ajuste mediante stars() */ /* * alineación de imprimir de lo descrito en la trayectoria estruc ppf] */ estático pr_alinear() pr_alinear { int nn; /* conteo de car */ int más; registrar para (i = 0, Imax = 0; i < 2; i++) { nn = nombre eliminado(nombrexfi]); si (nn > Imax) Imax = nn; nc[i] = l ; ni[i] = l; tamfi] = ijfi] = 0; psfi] = secxfi]; pofi] = salida[i]; Tabla 1 (cont.) para (nn = nm = 0, más = 1; más; ) { ...pr_alinear para (i = más = 0; i < 2; i++) { /* * ¿tenemos más de esta secuencia? */ si (!*ps[i]) continuar; más++; si (pf )[i].espac) { /* espacio guía */ *po[i]++ = "; pp[i].espac~; } entoi ices si (tamfi]) { /* en un espacio */ *P0[Í]++ = ; tamfi]—; i entonces { /* estamos colocando un elemento sec */ •pop] = *PS[¡] si (es inferior( *ps[¡])) *ps[i] = toupper(*ps[i]); po[i]++; ps[i]++; /* * ¿estamos en el siguiente espacio para esta sec? */ si (ni[i] = = pp[i].x[ij[i]]) { * necesitamos unir todas las separaciones * en esta locación */ tamfi] = pp[i].n[ij[i]++]; entonces (ni[i] = = pp[i]. ?[_[ .]) tamfi] += PP[i] n[ij[i]++]; ni[i]++; } si (++nn = olen || !más && nn) { bloque de volcado de memoria(); para (i = 0; i < 2; i++) pofi] = outfi]; nn = 0; } } } /* * volcar un bloque de líneas, que incluir números, stars: pr alinear() */ estático bloque de volcado de memoria() bloque de volcado de memoria { registrar i; para (i = 0; i < 2; i++) *po[i]- = '\0'; Tabla 1 (cont.) bloque de volcado de memoria (vacío) ponercCW, fx); para (i = 0; i < 2; i++) { si (*salida[i] && (*salida[i] != ' ' || *(po[i]) != ' ')) { si (i = = 0) nums(i); si (i = = 0 && *salida[ 1 ]) stars(); poner línea (i); si (i = = 0 && *salida[l]) fimprimirf(fx, star); si (i = = l) nums(i); } } /* * poner fuera una línea de número: bloque de volcado de memoria() */ estático nums(ix) nums int íx; /* indizar hacia adentro y hacia afuera[] la línea sec que se mantiene */ car nlínea[P_LINEA]; registrar ¡, j; registrar car *pn, *px, *py; para (pn = nlínea, i = 0; i < lmax+P_ESPAC; i++, pn++) *pn = " para (i = nc[ix], py = out[ix]; *py; py++, pn++) { si (*py = = -') *pn = ' entonces { si (i%10 = = 0 || (i = = 1 && nc[ix] != 1)) { j = (i < 0)? -i : i; para (px = pn; j; j /= 10, px-) *px =j%10 + '0'; si (i < 0) *px = '-'; } entonces *pn = ' • i++; } } *pn = '\0'; ncfix] = i; para (pn = nlínea; *pn; pn++) (vacío) ponerc(*pn, fx); (vacío) ponerc('\n', fx); } /* * poner fuera una línea (nombre, [num], sec, [num]): bloque de volcado de memoria() */ estático poner línea(ix) poner línea int ?x; Tabla 1 (cont.) poner línea int i; registrar car *px; para (px = nombrexfix], i = 0; *px && *px != ':'; px++, i++) (vacío) ponerc(*px, fx); para (; i < lmax+P_ESPAC; i++) (vacío) ponercC ', fx); /* este conteo desde 1 : * ni[] es el elemento actual (desde 1) * nc[] es el número en el inicio de la línea actual */ para (px = salidafix]; *px; px++) (vacío) poner c(*px&0x7F, fx); (vacío) ponercC\n', fx); } /* * poner una línea de stars (las secs siempre dentro fuera[0], fuerafl]): bloque de volcado de memoria() */ estático stars() stars { int i; registrar car *p0, *pl, ex, *px; si (!*salida[0] || (*salida[0] = = " && *(po[0]) = = ") II !*salida[l] || (*salida[l] = = " && *(?o[l]) = = ")) regresar; px = star; para (i = lmax+P_ESPAC; i; i-) *px++ = ' '; para (pO = salida[0], pl = salida[l]; *p0 && *pl ; p0++, pl++) { si (esalfa(*p0) && esalfa(*pl)) { si (xbm[*pO-'A']&xbm[*pl-'A']) { CX nm++; } entonces si (!adn && _día[*pO-?'][*pl-?'] > 0) ex = '.'; entonces ex = "; } entonces cx = *px++ = ex; } *px++ = V; *px = '\0'; Tabla 1 (cont.) /* * separar la trayectoria o prefijo de pn, len de retorno: pr_alinear() */ estático quitar el nombre(pn) quitar el nombre car *pn; /* nombre de archivo (puede ser trayectoria ) */ { registrar car *px, *py; py = 0; para (px = pn; *px; px++) si (*px = 7) py = px + 1 ; si (py) (vacío) strcpy(pn, py); regresar(strlen(pn)); } Tabla 1 (cont.) /* * limpiar() - limpiar cualquier archivo tmp * obtener secuencia() - leer en la sec, el ajuste de adn, len, maxlen * g_calloc() — calloc() con error de verificación * leersalts() _ obtener los saltos buenos, a partir del archivo tmp si es necesario * escribirsaltsO - escribir un arreglo lleno de saltos a un archivo tmp: nw() */ «incluir "nw.h" «incluir <sys/archivo.h> car *jnombre = "/tmp/homgXXXXXX"; /* archivo tmp para saltos */ ARCHIVO *f¡; int limpiar(); /* limpiar archivo tmp */ largo buscar 1(); /* * eliminar cualquier archivo tmp si se indica */ limpiar(i) limpiar int i; { -i (fj) (vacío) desenlazado(nombre j); salida(i); /* * leer, regresar ptr a sec, ajustar adn, len, maxlen * líneas de salto que inician con ';', '<*, o '>' * sec en la porción superior o inferior */ car * obtener secuencia( archivo, len] 1 obtener secuencia car *archivo; /* nombre de archivo */ int *len; /* len sec */ { car línea[1024], *psec; registar car *px, *py; int natgc, tien; ARCHIVO *fp; si ((fp = fabrir(archivo,"r")) == 0) { fimpresiónf(stderr,"%s: no se puede 11er %s\n", prog, archivo); salida(l); } tien = natgc = 0; mientras (fobteners(línea, 1024, fp)) { si (*línea = ';' || *línea = '<' || *línea == '>') continuar; para (px = línea; *px != '\n'; px++) si (essuperior(*px) || esinferior(*px)) tlen++; > si ((psec = malloc((sin señalizar)(tlen+6))) = 0) { fimprimirf(stderr,"%s: malloc() fallo en obtener %d bitios para %s\n", prog, tlen+6, archivo); salida(l); } psecfO] = psecfl] = psec[2] = psec[3] = "\0'; Tabla 1 (cont.) ...obtener sec py = psec + 4; *len = tien; rebobinar(fp); mientras (fobteners(línea, 1024, fp)) { si (*línea = = ';' || *línea = = '<* || *Iínea = = >') continuar; para (px = línea; *px != V; px++) { si (essuperior(*px)) *py++ = *p?; entonces si (esinferior(*px)) *py++ = asuperior(*px); si (índice("ATGCU",*(py-l ))) natgc++; } } *py++ = '\0'; *py = ,\0'; (vacío) fcerrar(fp); adn = natgc > (tlen/3); regresa r(psec+4); car * g_calloc(msg, nx, sz) g_calloc car *msj; /* programa, rutina de llamado */ int nx, sz; /* numero y tamaño de los elementos */ *px, *calloc(); si ((px = calloc((sinseñalizar)nx, (sinseñalizar)sz)) = 0) { si (*msj) { fimprimirf(stderr, "%s: g_calloc() fallo %s (n=%d, sz=%d)\n", prog, msj, nx, sz); salida(l); } } regresa r(px); } i* * obtener saltos finales de dxf] o archivo tmp, ajustar pp[], reiniciar dmax: principal() */ Ieersalts() leersalts { int fd = -l ; int tam, iO, il; registrar ?,J, xx; «« ( .) < (vacío) fcerrar(fj); si ((fd = abrirünombre, 0_RDSOALMENTE, 0)) < 0) { fimprimirf(stderr, "%s: no se puede abrir() %s\n", prog, jnombre); Ilimpiar(i ); } } para (i = ¡0 = il = 0, dmaxO = dmax, xx = lenO; ; i++) { entonces (1 ) { para (j = dx[dmax].isalt; j >= 0 && dx[dmax].jp.x[j] >= xx; j— ) Tabla 1 (cont.) ...leersalts si (j < 0 && dx[dmax]. desviar && fj) { (vacío) lbuscar(fd, dx[dmax]. desviar, 0); (vacío) leer(fd, (car *)&dx[dmax].jp, tamaño de(estruct salto)); (vacío) leer(fd, (car *)&dx[dmax].desviar, tamaño de(dx[dmax]. desviar)); dx[dmax].isalt = MAXJMP-1; } entonces terminar; } sí (i >= SALTS) { fimprimirf(stderr, "%s: demasiadas separaciones en la alineación \n", prog); limpiar(l); } si Ü >= 0) { tam = dx[dmax].jp.n[j]; xx = dx[dmax].jp.x[j]; dmax += tam; si tam < 0) { /* separación en la segunda sec */ pp[l].n[il] = -tam; xx += tam; /* id = xx - yy + lenl - 1 */ pp[l].x[il] = xx - dmax + lenl - 1 ; sepy++; nsepy -= tam; /* ignorar MAXSEP cuando se efectúan las separaciones de extremos */ tam = (-tam < MAXSEP || separaciones de extremos)'' -tam : MAXSEP; i l++; } entonces si (tam > 0) { /* separación en la primera sec */ pp[0].n[i0] = tam; pp[0].x[i0] = xx; sepx++; nsepx += tam; /* ignorar MAXSEP cuando se efectúan las separaciones de extremos */ tam = (tam < MAXSEP || separación de extremos)? tam : MAXSEP; Í0++; } } entonces terminar; } /* invertir el orden de los saltos */ para (j = 0, i0~; j < iO; j++, i0~) { i = pp[0].n[¡]; PPfOJ.nfj] = pp[0].n[¡0]; pp[0].n[i0] = i; i = pp[0].xß]; pp[0].xfj] = pp[0].x[i0]; PP[0].x[i0] = i; > para (j = 0, il--; j < il ; j++, il-) { i = PPfl] nfj]; Pp[l].nD] = PPfl].n[il]; pp[l].n[il] = i; i = pp[i].?fj]; PPfi] xü] = PP[i] ?[ii]; pp[i].?[ii] = i; } si (fd >= 0) (vacío) cerrar(fd); i (fj) { (vacío) sin enlazar (nombre j): f = 0; desviar = 0; Tabla 1 (cont.) /* * escribir una desviación de estructura de salto llena de la previa (si existe) : nw() */ saltos de escritura(ix) saltos de escritura int ix; car *mktemp(): si (!fj) { si (mktemp(nombre j) < 0) { fimprimirf(stde?t, "%s: can't mktemp() %s\n", prog, nombre j); limpiar(l); } si ((fj = fabrir(jnombre, " ")) = 0) { fimprimirf(stderr, "%s: no se puede escribir %s\n", prog, nombre j); salida(l); } } (vacío) fescribir((car *)&dx[ix].st, tamaño de(struct salt), 1, fi); (vacío) fescribir((car *)&dx[ix]. desviar, tamaño de(dx[ix]. desviar), 1, fj); Tabla 2 PRO XXXXXXXXXXXXXXX (Longitud = 15 aminoácidos) Proteína de Comparación XXXXXYYYYYYY (Longitud = 12 aminoácidos) % de identidad de secuencia de aminoácidos = (el número de residuos de aminoácidos que corresponden idénticamente entre las dos secuencias de polipéptidos como se determina mediante ALIGN-2) dividido por (el número total de residuos de aminoácidos del polipéptido PRO) = dividido por 15 = 33.3% Tabla 3 PRO XXXXXXXXXX (Longitud = 10 aminoácidos) Proteína de Comparación XXXXXYYYYYYZZYZ (Longitud = 15 aminoácidos) % de identidad de secuencia de aminoácidos = (el número de residuos de aminoácidos que corresponden idénticamente entre las dos secuencias de polipéptidos como se determina mediante ALIGN-2) dividido por (el número total de residuos de aminoácidos del polipéptido PRO) = dividido por 10 = 50% Tabla 4 PRO-DNA NNNNNNNNNNNNNN (Longitud = 14 nucleótidos) ADN de Comparación NNNNNNLLLLLLLLLL (Longitud = 16 nucleótidos) % de identidad de secuencia de ácido nucleico = (el número de nucleótidos que corresponden idénticamente entre las dos secuencias de ácido nucleico como se determina por ALIGN-2) dividido por (el número total de nucleótidos de la secuencia de ácido nucleico PRO-ADN) = 6 dividido por 14 = 42.9% Tabla 5 PRO-DNA N^p íNNNNNNNNN (Longitud = 12 nucleótidos) ADN de Comparación NNNNLLLVV (Longitud = 9 nucleótidos) % de identidad de secuencia de ácido nucleico = (el número de nucleótidos que corresponden idénticamente entre las dos secuencias de ácido nucleico como se determina por ALIGN-2) dividido por (el número total de nucleótidos de la secuencia de ácido nucleico PRO-ADN) = 4 dividido por 12 = 33.3% II . Composiciones y Métodos de la Invención A. Polipéptidos PRO de Longitud Completa La presente invención proporciona nuevas secuencias de nucleótidos identificadas y aisladas que codifican los polipéptidos referidos en la presente invención como polipéptidos PRO. En particular, se han identificado y aislado los ADNc que codifican varios polipéptidos PRO, como se describe con más detalle en los Ejemplos posteriores. Se observa que a las proteínas producidas en rondas de expresión separadas se les pueden dar diferentes números PRO pero el número UNQ es único para cualquier ADN dado y para la proteína codificada, y no será cambiado. Sin embargo, por razones de simplicidad, en la presente especificación la proteína codificada por las moléculas de ácido nucleico nativas de longitud completa descritas en la presente así como todos los demás homólogos nativos y las variantes incluidas en la definición anterior del PRO, serán referidos como "PRO/número", independientemente de su origen o modo de preparación. Como se describe en los Ejemplos posteriores, varios clones de ADNc se han depositado con el ATCC. Las secuencias de nucleótidos actuales de aquellos clones se pueden determinar fácilmente por alguien con habilidades en la técnica mediante la secuenciación del clon depositado utilizando los métodos habituales en la técnica. La secuencia de aminoácidos predicha se puede determinar de la secuencia de nucleótidos utilizando una técnica de rutina. Para los polipéptidos PRO y los ácidos nucleicos codificantes descritos en. la presente. Los solicitantes identificaron que se considera mejor que la estructura de lectura se pueda identificar con la información de la secuencia disponible a la vez. 1. Polipéptidos PR0241 de Longitud Completa La presente invención proporciona nuevas secuencias de nucleótidos identificadas y aisladas que codifican los polipéptidos referidos en la presente invención como PR0241. En particular, los Solicitantes han identificado y aislado el ADNc que codifica al polipéptido PR0241, como se describe con más detalle en los Ejemplos posteriores. Utilizando los programas de computadora de alineación de secuencias BLAST y FastA, los Solicitantes encontraron que una porción del polipéptido PR0241 tiene cierta homología con varias proteínas de biglicano. De conformidad con esto, se cree en el presente que el polipéptido PR0241 descrito en la presente solicitud es un nuevo polipéptido homólogo del biglicano identificado y puede poseer la actividad típica de las proteínas de biglicano. 2. Polipéptidos PR0243 de Longitud Completa La presente invención proporciona nuevas secuencias de nucleótidos identificadas y aisladas que codifican los polipéptidos referidos en la presente invención como PR0243. En particular, los Solicitantes han identificado y aislado el ADNc que codifica al polipéptido PR0243, como se describe con más detalle en los Ejemplos posteriores. Utilizando los programas de computadora de alineación de secuencias BLAST, BLAST-2 y FastA, los Solicitantes encontraron que un PR0243 de secuencia nativa de longitud completa (mostrado en la Figura 4 y SEC. ID. NO: 7) tiene cierta identidad de secuencia de aminoácidos con la rana rayada africana y la cordina de Xenopus y cierta homología con la cordina de rata. De conformidad con esto, se cree en el presente que el polipéptido PR0243 descrito en la presente solicitud es un nuevo miembro identificado de la familia de la proteína cordina y puede poseer la capacidad de influir la formación de notocordio y músculos mediante la dorsalización del mesodermo. 3. Polipéptidos PR0299 de Longitud Completa La presente invención proporciona nuevas secuencias de nucleótidos identificadas y aisladas que codifican los polipéptidos referidos en la presente invención como PR0299.

En particular, los Solicitantes han identificado y aislado el ADNc que codifica al polipéptido PR0299, como se describe con más detalle en los Ejemplos posteriores. Utilizando los programas de computadora de alineación de secuencias BLAST y FastA, los Solicitantes encontraron que varias porciones del polipéptido PR0299 tienen cierta homología con la proteína notch. De conformidad con esto, se cree en el presente que el polipéptido PR0299 descrito en la presente solicitud es un nuevo miembro identificado de la familia de la proteína notch y posee las propiedades de señalización típicas de la familia de la proteína. 4. Polipéptidos PR0323 de Longitud Completa La presente invención proporciona nuevas secuencias de nucleótidos identificadas y aisladas que codifican los polipéptidos referidos en la presente invención como PR0323. En particular, los Solicitantes han identificado y aislado el ADNc que codifica al polipéptido PR0323, como se describe con más detalle en los Ejemplos posteriores. Utilizando los programas de computadora de alineación de secuencias BLAST y FastA, los Solicitantes encontraron que varias porciones del polipéptido PR0323 tienen cierta homología con varías proteínas de dipeptidasa. De conformidad con esto, se cree en el presente que el polipéptido PR0323 descrito en la presente solicitud es un nuevo homólogo de dipeptidasa identificado que tiene la actividad de dipeptidasa. 5. Polipéptidos PR0327 de Longitud Completa La presente invención proporciona nuevas secuencias de nucleótidos identificadas y aisladas que codifican los polipéptidos referidos en la presente invención como PR0327.

En particular, los Solicitantes han identificado y aislado el ADNc que codifica al polipéptido PR0327, como se describe con más detalle en los Ejemplos posteriores. Utilizando los programas de computadora de alineación de secuencias BLAST y FastA, los Solicitantes encontraron que las porciones del polipéptido PR0327 tienen cierta homología con varias proteínas del receptor de prolactina. De conformidad con esto, se cree en el presente que el polipéptido PR0327 descrito en la presente solicitud es un nuevo homólogo del receptor de prolactina identificado y tiene la actividad típica de una proteína del receptor de prolactina. 6. Polipéptidos PR0233 de Longitud Completa La presente invención proporciona nuevas secuencias de nucleótidos identificadas y aisladas que codifican los polipéptidos referidos en la presente invención como PR0233.

En particular, los Solicitantes han identificado y aislado el ADNc que codifica al polipéptido PR0233, como se describe con más detalle en los Ejemplos posteriores. Utilizando los programas de computadora de alineación de secuencias BLAST y FastA, los Solicitantes encontraron que varias porciones del polipéptido PR0233 tienen cierta homología con varias proteínas de reductasa. Los Solicitantes también encontraron que el ADN que codifica al polipéptido PR0233 tiene homología significativa con las proteínas de Caenorhabdi tis elegans . De conformidad con esto, se cree en el presente que el polipéptido PR0233 descrito en la presente solicitud es un nuevo miembro identificado de la familia reductasa y posee la capacidad de efectuar el estado redox de una célula típica de la familia reductasa. 7. Polipéptidos PR0344 de Longitud Completa La presente invención proporciona nuevas secuencias de nucleótidos identificadas y aisladas que codifican los polipéptidos referidos en la presente invención como PR0344. En particular, los Solicitantes han identificado y aislado el ADNc que codifica al polipéptido PR0344, como se describe con más detalle en los Ejemplos posteriores. Utilizando los programas de computadora de alineación de secuencias BLAST y FastA, los Solicitantes encontraron que varias porciones del polipéptido PR0344 tienen cierta homología con las proteínas complementarias de ratón y humano. De conformidad con esto, se cree en el presente que el polipéptido PR0344 descrito en la presente solicitud es un nuevo miembro identificado de la familia de la proteína complementaria y posee la capacidad de afectar el proceso de inflamación como es típico de la familia complementaria de las proteínas. 8. Polipéptidos PR0347 de Longitud Completa La presente invención proporciona nuevas secuencias de nucleótidos identificadas y aisladas que codifican los polipéptidos referidos en la presente invención como PR0347. En particular, los Solicitantes han identificado y aislado el ADNc que codifica al polipéptido PR0347, como se describe con más detalle en los Ejemplos posteriores. Utilizando los programas de computadora de alineación de secuencias BLAST y FastA, los Solicitantes encontraron que las porciones del polipéptido PR0347 tienen cierta homología con varias proteínas secretorias ricas en cisteína. De conformidad con esto, se cree en el presente que el polipéptido PR0347 descrito en la presente solicitud es un nueva proteína secretoria rica en cisteína identificada y puede poseer la actividad típica de la familia de la proteína secretoria rica en cisteína. 9. Polipéptidos PR0354 de Longitud Completa La presente invención proporciona nuevas secuencias de nucleótidos identificadas y aisladas que codifican los polipéptidos referidos en la presente invención como PR0354. En particular, los Solicitantes han identificado y aislado el ADNc que codifica al polipéptido PR0354, como se describe con más detalle en los Ejemplos posteriores. Utilizando los programas de computaaora de alineación de secuencias BLAST y FastA, los Solicitantes encontraron que las porciones del polipéptido PR0354 tienen cierta homología con la proteína de cadena pesada del inhibidor de inter-alfa-tripsina. De conformidad con esto, se cree en el presente que el polipéptido PR0354 descrito en la presente solicitud es un nuevo homólogo de la cadena pesada del inhibidor de inter-alfa-tripsina identificado.

. Polipéptidos PR0355 de Longitud Completa La presente invención proporciona nuevas secuencias de nucleótidos identificadas y aisladas que codifican los polipéptidos referidos en la presente invención como PR0355. En particular, los Solicitantes han identificado y aislado el ADNc que codifica al polipéptido PR0355, como se describe con más detalle en los Ejemplos posteriores. Utilizando los programas de computadora de alineación de secuencias BLAST y FastA, los Solicitantes encontraron que varias porciones del polipéptido PR0355 tienen cierta homología con la proteína CRTAM. Los Solicitantes también encontraron que el ADN que codifica al polipéptido PR0355 tiene homología - con la proteína de desarrollo y activación del timocito, el receptor H20A, el receptor H20B, el receptor de poliovirus y la proteína 1 delta AGM de Cercopi thecus aethiops . De conformidad con esto, se cree en el presente que el polipéptido PR0355 descrito en la presente solicitud es un nuevo miembro identificado de la familia CRTAM. 11. Polipéptidos PR0357 de Longitud Completa La presente invención proporciona nuevas secuencias de nucleótidos identificadas y aisladas que codifican los polipéptidos referidos en la presente invención como PR0357. En particular, los Solicitantes han identificado y aislado el ADNc que codifica al polipéptido PR0357, como se describe con más detalle en los Ejemplos posteriores. Utilizando los programas de computadora de alineación de secuencias BLAST y FastA, los Solicitantes encontraron que varias porciones del polipéptido PR0357 tienen cierta homología con la subunidad lábil de ácido del factor de crecimiento similar a la insulina. Los Solicitantes también encontraron que las regiones no codificantes del DNA44804-1248 se alinea con una marca de genes humanos como se describe en WO 95/14772. Los Solicitantes encontraron además que las regiones no codificantes del DNA44804-1248 se alinea con el ADN viral recombinante humano/tipo 12 como se describe en Deuring y Doerfler, Gene, 26:283-289 (1983). En base a la homología de la región codificante, se cree en el presente que el polipéptido PR0357 descrito en la presente solicitud es nuevo miembro identificado de la familia con repeticiones ricas en leucina de las proteínas, y particularmente, está relacionada con la subunidad lábil del factor de crecimiento similar a la insulina. Como tal, es probable que el PR0357 esté involucrado en los mecanismos de enlace, y puede ser parte de un complejo. 12. Polipéptidos PR0715 de Longitud Completa La presente invención proporciona nuevas secuencias de nucleótidos identificadas y aisladas que codifican los polipéptidos referidos en la presente invención como PR0715.

En particular, los Solicitantes han identificado y aislado el ADNc que codifica al polipéptido PR0715, como se describe con más detalle en los Ejemplos posteriores. Utilizando los programas de computadora de alineación de secuencias BLAST y FastA, los Solicitantes encontraron que varias porciones del polipéptido PR0715 tienen cierta homología con varios miembros de la familia de necrosis del tumor de las proteínas. De conformidad con esto, se cree en el presente que los polipéptidos PR0715 descritos en la presente solicitud son nuevos miembros identificados de la familia del factor de necrosis del tumor de las proteínas. 13. Polipéptidos PR0353 de Longitud Completa La presente invención proporciona nuevas secuencias de nucleótidos identificadas y aisladas que codifican los polipéptidos referidos en la presente invención como PR0353. En particular, los Solicitantes han identificado y aislado el ADNc que codifica al polipéptido PR0353, como se describe con más detalle en los Ejemplos posteriores. Utilizando los programas de computadora de alineación de secuencias BLAST y FastA, los Solicitantes encontraron que varias porciones del polipéptido PR0353 tienen cierta homología con las proteínas complementarias de ratón y humano. De conformidad con esto, se cree en el presente que los polipéptidos PR0353 descritos en la presente solicitud son nuevos miembros identificado de la familia de la proteína complementaria y posee la capacidad de efectuar el proceso de inflamación como es típico de la familia complementaria de las proteínas. 14. Polipéptidos PR0361 de Longitud Completa La presente invención proporciona nuevas secuencias de nucleótidos identificadas y aisladas que codifican los polipéptidos referidos en la presente invención como PR0361. En particular, los Solicitantes han identificado y aislado el ADNc que codifica al polipéptido PR0361, como se describe con más detalle en los Ejemplos posteriores. Utilizando los programas de computadora de alineación de secuencias BLAST y FastA, los Solicitantes encontraron que varias porciones del polipéptido PR0361 tienen cierta homología con las proteínas mucina y quitinasa. De conformidad con esto, se cree en el presente que el polipéptido PR0361 descrito en la presente solicitud es un nuevo miembro identificado de las familias de la proteína mucina y/o quitinasa y pueden estar asociados con el cáncer, la patogénesis de las plantas o las funciones receptoras típicas de las familias de la proteína mucina y quitinasa, respectivamente 15. Polipéptidos PR0365 de Longitud Completa La presente invención proporciona nuevas secuencias de nucleótidos identificadas y aisladas que codifican los polipéptidos referidos en la presente invención como PR0365. En particular, los Solicitantes han identificado y aislado el ADNc que codifica al polipéptido PR0365, como se describe con más detalle en los Ejemplos posteriores. Utilizando los programas de computadora de alineación de secuencias BLAST y FastA, los Solicitantes encontraron que varias porciones del polipéptido PR0365 tienen cierta homología con la proteína humana 2-19. De conformidad con esto, se cree en el presente que el polipéptido PR0365 descrito en la presente solicitud es un nuevo miembro identificado de la familia de la proteína humana 2-19. 2. Variantes del Polipéptido PRO Además de los polipéptidos PRO de secuencia nativa, de longitud completa descritos en la presente, se contempla que se pueden preparar variantes PRO. Las variantes PRO se pueden preparar introduciendo los cambios de nucleótidos apropiados en el ADN del PRO, y/o mediante la síntesis del polipéptido PRO deseado. Aquéllos con habilidades en la técnica apreciarán que los cambios de aminoácidos pueden alterar los procesos post-traduccionales del PRO, tales como el cambio del número o posición de los sitios de glicosilación o la alteración de las características de anclaje de la membrana. Las variaciones en el PRO de secuencia nativa de longitud completa o en varios dominios del PRO descritos en la presente, se pueden hacer, por ejemplo, utilizando cualquiera de las técnicas y guías para las mutaciones conservativas y no conservativas establecidas, por ejemplo, en la Patente Norteamericana No. 5,364,934. Las variaciones pueden ser una substitución, eliminación o inserción de uno o más codones que codifican el PRO que resulta en un cambio en la secuencia de aminoácidos del PRO comparado con el PRO de secuencia nativa. Opcionalmente la variación es mediante la substitución de al menos un aminoácido con cualquier otro aminoácido en uno o más de los dominios del PRO. La guía para determinar cual residuo de aminoácido se puede insertar, substituir o eliminar sin afectar adversamente la actividad deseada se puede encontrar comparando la secuencia del PRO con aquélla del homólogo de las moléculas de proteína conocidas y minimizando el número de cambios de la secuencia de aminoácidos hechos en las regiones de alta homología. Las substituciones de aminoácidos pueden dar como resultado el reemplazo de un aminoácido con otro aminoácido que tenga propiedades químicas y/o estructurales similares, tales como el reemplazo de una leucina con una serina, es decir, los reemplazos de aminoácidos conservativos. Las inserciones o eliminaciones pueden estar opcionalmente en el rango de 1 a 5 aminoácidos. La variación permitida se puede determinar mediante las inserciones, eliminaciones o substituidos que se hacen sistemáticamente de los aminoácidos en la secuencia y probando las variantes resultantes para la actividad exhibida mediante la secuencia nativa, madura o de longitud completa. Los fragmentos del polipéptido PRO se proporcionan en la presente. Tales fragmentos se pueden truncar en el N- terminal o C-terminal, o pueden carecer de residuos internos, por ejemplo, cuando se comparan con una proteína nativa de longitud completa. Ciertos fragmentos carecen de los residuos de aminoácidos que no son esenciales para una actividad biológica deseada para el polipéptido PRO. Los fragmentos PRO se pueden preparar mediante cualquier número de técnicas convencionales. Los fragmentos del péptido deseado pueden ser sintetizados químicamente. Un método alternativo implica la generación de fragmentos PRO mediante la digestión enzimática, por ejemplo, tratando la proteína con una enzima conocida para las proteínas de escisión en los sitios definidos por los residuos de aminoácidos particulares, o mediante la digestión del ADN con las enzimas de restricción adecuadas y aislando el fragmento deseado. Aún otra técnica adecuada implica el aislamiento y amplificación de un fragmento de ADN que codifica un fragmento del polipéptido deseado, mediante la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) . Los oligonucleótidos que definen el extremo terminal deseado del fragmento de ADN, se emplean en los cebadores 5' y 3' en la PCR. Preferiblemente, los fragmentos del polipéptido PRO comparten al menos una actividad biológica y/o inmunológica con el polipéptido PRO nativo descrito en la presente. En las modalidades particulares, las substituciones conservativas de interés se muestran en la Tabla 1 bajo el encabezado de substituciones preferidas. Si tales substituciones resultan en un cambio en la actividad biológica, entonces más cambios substanciales, denominados substituciones ejemplares en la Tabla 6, o como se describe adicionalmente enseguida con referencia a las clases de aminoácidos se introducen en los productos seleccionados. Tabla 6 Residuo Substituciones Substituciones Original Ejemplares Preferidas Ala (A) val; leu; ile val Arg (R) lys;. gln; asn lys Asn (N) gln; his; lys; arg gln Asp (D) glu glu Cys (C) ser ser Gln (Q) asn asn Glu (E) asp asp Gly (G) pro; ala ala His (H) asn; gln; lys; arg arg He (I) leu; val; met; ala; leu phe; norleucina Leu (L) norleucina; ile; val; ile met; ala; phe Lys (K) arg; gln; asn arg Met (M) leu; phe; ile leu Phe (F) leu; val; ile; ala; leu tyr Pro (P) ala ala Ser (S) thr thr Thr (T) ser ser Trp (W) tyr; phe tyr Tyr (Y) trp; phe; thr; ser phe Val (V) ile; leu; met; phe; leu ala; norleucina Las modificaciones substanciales en la función o la identidad inmunológica del polipéptido PRO se complementan mediante la selección de substituciones que difieren significativamente en su efecto de mantener (a) la estructura de la cadena principal del polipéptido en el área de la substitución, por ejemplo, como una lámina o conformación helicoidal, (b) la carga de hidrofobicidad de la molécula en el sitio objetivo, o (c) la densidad de la cadena lateral. Los residuos que se presentan de manera natural se dividen en grupos basados en propiedades de cadenas laterales comunes: (1) hidrofóbicos: norleucina, met, ala, val, leu, ile; (2) hidrofílicos neutrales: cys, ser, thr; (3) acídicos: asp, glu; (4) básicos: asn, gln, his, lys, arg; (5) residuos que influyen la orientación de la cadena: gly, pro; y (6) aromáticos: trp, tyr, phe. Las substituciones no conservativas intercambiarán un miembro de una de estas clases por otra clase. Tales residuos substituidos también se pueden introducir en los sitios de substitución conservativos o, más preferiblemente, en los sitios restantes (no conservados) . Las variaciones se pueden hacer utilizando métodos conocidos en la técnica tales como mutagénesis por PCR, exploración de alanina, mutagénesis mediada por oligonucleótidos (dirigida al sitio) . La mutagénesis dirigida al sitio [Cárter et al., Nucí. Acids Res., 13 : 4331 (1986); Zoller et al., Nucí. Acids Res., 10:6487 (1987)], la mutagénesis del cásete o cartucho [Wells et al., Gene, 3_4:315 (1985)], la mutagénesis por selección de restricción [Wells et al., Philos. Trans. R. Soc. London SerA, 317: 415 (1986)], u otras técnicas conocidas se pueden realizar en el ADN clonado para producir el ADN de la variante PRO. El análisis de los aminoácidos por exploración también se puede emplear para identificar uno o más aminoácidos a lo largo de una secuencia contigua. Entre los aminoácidos de exploración preferidos están los aminoácidos neutrales, relativamente pequeños. Tales aminoácidos incluyen alanina, glicina, serina y cisteína. La alanina es típicamente un aminoácido de exploración preferido entre este grupo debido a que elimina la cadena lateral más allá del beta-carbono y es menos susceptible a alterar la conformación principal de la cadena de la variante [Cunningham y Wells, Science, 244: 1081-1085 (1989)]. La alanina también es preferida típicamente porque es el aminoácido más común. Además, se encuentra frecuentemente tanto en posiciones escondidas como expuestas [Creightan, The Proteins, (W.H. Freeman & Co. N.Y.); Chothia, J. Mol. Biol . , 150 : 1 (1976)]. Si la substitución con alanina no genera las cantidades adecuadas de variante, se puede utilizar un aminoácido isotérico. C. Modificaciones de PRO Las modificaciones covalentes de PRO están incluidas dentro del alcance de esta invención. Un tipo de modificación covalente incluye los residuos de aminoácidos objetivo de reacción del polipéptido PRO con un agente de derivación orgánico que es capaz de reaccionar con las cadenas laterales seleccionadas o los residuos N- ó C-terminales del PRO. La derivatización con agentes bifuncionales es útil, por ejemplo, para la reticulación del PRO a una matriz o superficie de soporte insoluble en agua para usarse en el método para la purificación de los anticuerpos anti-PRO, y viceversa. Los agentes de reticulación comúnmente utilizados incluyen, por ejemplo, 1, l-bis (diazoacetil) -2-feniletano, glutaraldehído, esteres de N-hidroxisuccinimida, por ejemplo, esteres con ácido 4- azidosalicílico, imidoésteres homobifuncionales, que incluyen esteres de disuccinimidilo tales como 3,3'-ditiobis (succinimidilpropionato) , maleimidas bifuncionales tales como bis-N-maleimido-1, 8-octano y agentes tales como metil-3- [ (p-azidofenil) ditio] propioimidato. Otras modificaciones incluyen la desamidación de los residuos glutaminilo y asparaginilo a los residuos glutamilo y aspartilo correspondientes, respectivamente, la hidroxilación de la prolina y lisina, la fosforilación de los grupos hidroxilo de los residuos serilo o treonilo, la metilación de los grupos a-amino de las cadenas laterales de lisina, arginina, y de histidina [T.E. Creighton, Proteins: Structure and Molecular Properties, W.H. Freeman & Co., San Francisco, pp. 79-86 (1983)], la acetilación de la amina N-terminal, y la amidación de cualquier grupo carboxílico C-terminal .

Otro tipo de modificación covalente del polipéptido PRO incluida dentro del alcance de esta invención comprende alterar el patrón de glicosilación nativo del polipéptido. "Alterar el patrón de glicosilación nativo" se indica aquí con propósitos de eliminar una o más porciones de carbohidratos encontrados en un PRO de secuencia nativa (ya sea eliminando el sitio de glicosilación subyacente o suprimiendo la glicosilación mediante medios químicos y/o enzimáticos) , y/o agregar uno o más sitios de glicosilación que no estén presentes en el PRO de secuencia nativa. Además, la frase incluye cambios cualitativos en la glicosilación de las proteínas nativas, que implican un cambio en la naturaleza y proporciones de varias porciones de carbohidrato presentes. Además de los sitios de glicosilación para el polipéptido PRO se pueden completar mediante la alteración de la secuencia de aminoácidos. La alteración se puede hacer, por ejemplo, por la adición de, o substitución por, uno o más residuos de serina o treonina al PRO de secuencia nativa (para los sitios de glicosilación enlazados al oxígeno) . La secuencia de aminoácidos del polipéptido PRO se puede opcionalmente alterar a través de los cambios a nivel del ADN, particularmente mediante la mutación del ADN que codifica el polipéptido PRO en las bases preseleccionadas tales como los codones que se generan que se traducirán en los aminoácidos deseados. Otro medio para incrementar el número de las porciones de carbohidratos en el polipéptido PRO es mediante acoplamiento químico o enzimático de los glicósidos al polipéptido. Tales métodos se describen en la técnica, por ejemplo, en la publicación WO 87/05330 publicada el 11 de Septiembre de 1987, y en Aplin y Wriston, CRC Crit. Rev. Biochem. , pp. 259-306 (1981). La eliminación de las porciones de carbohidratos presentes en el polipéptido PRO se puede realizar química o enzimáticamente o mediante substitución mutacional de codones que codifican los residuos de aminoácidos que sirven como objetivos para la glicosilación. Las técnicas de desglicosilación química son conocidas en la técnica y se describen, por ejemplo, por Hakimuddin, et al., Arch. Biochem. Biophys., 259:52 (1987) y por Edge et al., Anal. Biochem. , 118: 131 (1981). La escisión enzimática de las porciones de carbohidrato en los polipéptidos se puede lograr mediante el uso de una variedad de endo- y exo-glicosidasas como se describe por Thotakura et al., Meth. Enzymol., 138:350 (1987).

Otro tipo de modificación covalente del PRO comprende enlazar el polipéptido PRO a uno de una variedad de polímeros no proteínicos, por ejemplo, polietilenglicol, polipropilenglicol, o polioxialquilenos, de la manera establecida en las Patentes Norteamericanas Nos. 4,640,835; 4,496,689; 4,301,144; 4,670,417; 4,791,192 ó 4,179,337. El PRO de la presente invención también se puede modificar de tal manera que forme una molécula quimérica que comprenda un PRO fusionado a otro, el polipéptido heterólogo o la secuencia de aminoácidos. En una modalidad, tal molécula quimérica comprende una fusión del PRO con un polipéptido de marca o tag el cual proporciona un epítope al cual se puede enlazar selectivamente el anticuerpo anti-tag. El epítope tag se coloca generalmente en el amino- o carboxi-terminales del PRO. La presencia de tales formas marcadas del epítope del PRO se pueden detectar utilizando un anticuerpo contra el polipéptido tag. También, la provisión del tag del epítope permite que el PRO se purifique fácilmente por purificación por afinidad utilizando un anticuerpo anti-tag u otro tipo de matriz de afinidad que se enlace al tag del epítope. Varios polipéptidos tag y sus respectivos anticuerpos son bien conocidos en la técnica. Los ejemplos incluyen las marcas o tags polihistidina (poli-his) o poli-histidina- glicina (poli-his-gli) ; el polipéptido tag de HA flu y su anticuerpo 12CA5 [Field et al., Mol. Cell. Biol., 8:2159- 2165 (1988)]; el tag del c-myc y los anticuerpos 8F9, 3C7, 6E10, G4, B7 y 9E10 a los mismos [Evan et al., Molecular and Cellular Biology, 5:3610-3616 (1985)]; y las marcas o tag de la glicoproteína D (gD) del virus de Herpes Simplex y su anticuerpo [Paborsky et al., Protein Engineering, 3(6):547- 553 (1990)]. Otros polipéptidos tag incluyen el péptido Flag [Hopp et al., BioTechnology, 6:1204-1210 (1988)]; el péptido del epítope KT3 [Martin et al., Science, 255:192-194 (1992)]; un péptido del epítope de a-tubulina [Skinner et al., J. Biol. Chem., 266:15163-15166 (1991)]; y el tag del péptido de la proteína 10 del gen T7 [Lutz-Freyermuth et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 7:6393-6397 (1990)]. En una modalidad alternativa, la molécula quimérica puede comprender una fusión del PRO con una inmunoglobulina o una región particular de una inmunoglobulina. Para una forma bivalente de la molécula quimérica (también referida como una "inmunoadhesina") , tal fusión podría ser la región Fc de una molécula IgG. Las fusiones Ig preferiblemente incluyen la substitución de una forma soluble (dominio de transmembrana eliminado o inactivado) de un polipéptido PRO en lugar de al menos una región variable dentro de una molécula Ig. En una modalidad particularmente preferida, la fusión de la inmunoglobulina incluye la articulación, CH2 y CH3, o la articulación, las regiones CH1, CH2 y CH3 de una molécula IgGl. Para la producción de las fusiones de inmunoglobulina ver también la Patente Norteamericana No. 5,428,130 expedida el 27 de Junio de 1995. D. Preparación del PRO La descripción que sigue se refiere principalmente a la producción del PRO mediante células cultivadas transformadas o transfectadas con un vector que contiene el ácido nucleico del PRO deseado. Por supuesto, se contempla que los métodos alternativos, que son bien conocidos en la técnica, se pueden emplear para preparar el PRO. Por ejemplo, la secuencia del PRO, o porciones del mismo, se pueden producir mediante la síntesis del péptido directa utilizando técnicas de fase sólida [ver, por ejemplo, Stewart et al., Solid-Phase Peptide Synthesis, W.H. Freeman Co., San Francisco, CA (1969); Merrifield, J. Am. Soc, 85:2149-2154 (1963)]. La síntesis de la proteína in vi tro se puede realizar utilizando técnicas manuales o mediante automatización. La síntesis automatizada se puede complementar, por ejemplo, utilizando un Sintetizador de Péptidos de Biosistemas Aplicados (Foster City, CA) utilizando las instrucciones del fabricante. Varias porciones del PRO deseadas se pueden sintetizar químicamente de manera separada y combinadas utilizando métodos químicos o enzimáticos para producir el PRO de longitud completa. 1. Aislamiento del ADN que Codifica al PRO El ADN que codifica al PRO se puede obtener a partir de una biblioteca de ADNc preparada a partir del tejido que se cree que posee el ARNm del PRO deseado y expresarlo en un nivel detectable. De conformidad con esto, el ADN del PRO humano se puede obtener convenientemente a partir de una biblioteca de ADNc preparada a partir del tejido humano, tal como se describe en los Ejemplos. El gen que codifica al PRO también se puede obtener a partir de una biblioteca genómica o mediante procedimientos sintéticos conocidos (por ejemplo, la síntesis de ácido nucleico automatizada) . Las bibliotecas se pueden seleccionar con sondas (tales como anticuerpos para el PRO deseado o los oligonucleótidos de al menos aproximadamente 20-80 bases) designados, para identificar el gen de interés o la proteína codificada por el mismo. La selección o separación del ADNc o la biblioteca genómica con la sonda seleccionada se puede conducir utilizando procedimientos estándar, tales como se describen en Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989) . Un método alternativo para aislar el gen que codifica al PRO es utilizar la metodología de PCR [Sambrook et al., supra; Dieffenbach et al., PCR Primer: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1995) ] . Los Ejemplos que siguen describen las técnicas para seleccionar o separar una biblioteca de ADNc. Las secuencias de oligonucleótidos seleccionadas como sondas deberán ser de longitud suficiente y no de ambigüedad suficiente para que se minimicen los positivos falsos. El oligonucleótido se etiqueta preferiblemente de tal manera que se pueda detectar luego de la hibridización al ADN en la biblioteca que está siendo seleccionada. Los métodos de etiquetado son bien conocidos en la técnica, e incluyen el uso de radioetiquetas como ATP etiquetada con 32P, la biotinilación o el etiquetado por enzimas. Las condiciones de hibridización, incluyen severidad moderada y alta severidad, y se proporcionan en Sambrook et al., supra . Las secuencias identificadas en tales métodos de selección de bibliotecas se pueden comparar y alinear con otras secuencias conocidas depositadas y disponibles en las bases de datos públicas tales como GenBank u otras bases de datos de secuencias privadas. La identidad de secuencia (en cualquier nivel de nucleótido o de aminoácido) dentro de regiones definidas de la molécula o a través de la secuencia de longitud completa se puede determinar utilizando los métodos conocidos en la técnica y como se describen en la presente. El ácido nucleico que tiene la secuencia de codificación de la proteína se puede obtener mediante la separación del ADNc seleccionado o las bibliotecas genómicas utilizando la secuencia de aminoácidos deducida descrita en la presente por primera vez, y, si es necesario, utilizando los procedimientos de extensión de cebadores convencionales como se describen en Sambrook et al., supra, para detectar los precursores y procesar los intermediarios del ARNm que pueden no haber sido transcritos inversamente hacia el ADNc. 2. Selección y Transformación de las Células Hospederas Las células huésped u hospederas se transfectan o transforman con vectores de clonación o expresión descritos en la presente para la producción y cultivo del PRO en medios nutrientes convencionales modificados como los apropiados para la inducción de promotores, la selección de transformantes, o la amplificación de genes que codifican las secuencias deseadas. Las condiciones de cultivo, tales como el medio, la temperatura, el pH y similares, se pueden seleccionar por los técnicos hábiles en la materia sin una experimentación indebida. En general, los principios, protocolos, y técnicas prácticas para maximizar la productividad de los cultivos celulares se pueden encontrar en Mammalian Cell Biotechnology: a Practical Approach, M. Butler, ed. (IRL Press, 1991) y Sambrook et al., supra. Los métodos de transfección celular eucariótica y de transformación celular procariótica son conocidos para los técnicos con habilidades ordinarias, por ejemplo, el CaCl2, CaPO-j, por medio por liposomas y la electroporación.

Dependiendo de la célula hospedera utilizada, se realiza la transformación utilizando técnicas estándar apropiadas para tales células. El tratamiento con calcio que emplea cloruro de calcio, como se describe en Sambrook et al., supra, o la electroporación se usa generalmente para los procariotes. La infección con Agrobacterium tumefaciens se utiliza para la transformación de ciertas células de plantas, como se describe por Shaw et al., Gene, 23:315 (1983) y por la publicación WO 89/05859 publicada el 29 de Junio de 1989. Para las células de mamíferos sin tales paredes celulares, se pueden emplear el método de precipitación del fosfato de calcio de Graham y van der Eb, Virology, 52:456-457 (1978). Los aspectos generales de las transformaciones del sistema huésped u hospedero de las células de mamíferos han sido descritos en la Patente Norteamericana No. 4,399,216. Las transformaciones en levaduras se llevan a cabo típicamente de acuerdo con el método de Van Solingen et al., J. Bact., 130: 946 (1977) y Hsiao et al., Proc. Nati. Acad. Sci. (USA), 76:3829 (1979). Sin embargo, otros métodos para introducir el ADN en las células, tales como por microinyección nuclear, electroporación, fusión de protoplastos bacterianos con células intactas, o policationes, por ejemplo, polibreno, poliornitina, también se puede utilizar. Para varias técnicas de transformación de células de mamíferos, ver Keown et al., Methods in Enzymology, 185:527-537 (1990) y Mansour et al., Nature, 336: 348-352 (1988). Las células hospederas adecuadas para la clonación o expresión del ADN en los vectores aquí incluyen los procariotes, levaduras, o células de eucariotes superiores. Los procariotes adecuados incluyen pero no están limitados a eubacterias, tales como organismos Gram-negativos o Grampositivos, por ejemplo, Enterobacteriaceae tal como E. coli . Varias cepas de E. coli están públicamente disponibles, tales como la cepa MM294 de E. coli K12 (ATCC 31,446); E. coli X1776 (ATCC 31,537); la cepa E. Coli W3110 (ATCC 27,325) y K5 772 (ATCC 53,635). Otras células huésped u hospederas procarióticas incluyen Enterobacteriaceae tal como Escherichia , por ejemplo, E. coli , En terobacter, Erwinia , Klebsiella , Proteus, Salmonella , por ejemplo, Salmonella typhimurium, Serra tia , por ejemplo, Serra tia marcescans, y Shigella , así como Bacilli tal como B. subtilis y B. licheniformis (por ejemplo, B. licheniformis 41P descrita en DD 266,710 publicada el 12 de Abril de 1989), Pseudomonas tales como P. aeruginosa , y Streptomyces . Estos ejemplos son ilustrativos en lugar de limitantes. La cepa W3110 es un huésped particularmente preferido o huésped principal debido a que es una cepa huésped común para las fermentaciones del producto de ADN recombinante. Preferiblemente, las células huésped u hospederas secretan cantidades mínimas de enzimas proteolíticas. Por ejemplo, la cepa W3110 se puede modificar para efectuar una mutación genética en los genes que codifican las proteínas endógenas al huésped, con ejemplos de tales huéspedes incluyendo la cepa 1A2 de E. coli W3110, la cual tiene el genotipo completo tonA; la cepa 9E4 de E. coli W3110, que tiene el genotipo completo tonA ptr3; la cepa 27C7 de E. coli W3110 (ATCC 55,244), que tiene el genotipo completo tonA ptr3 phoA E15 (argF-lac) 169 degP ompT kanr; la cepa 37D6 de E. coli W3110, que tiene el genotipo completo tonA ptr3 phoA E15 (argF-lac) 169 degP ompT rbs UlvG karí ; la cepa 40B4 de E. coli W3110, la cual es la cepa 37D6 con una mutación de eliminación de degP no resistente a la kanamicina; y una cepa de E. coli que tiene la proteasa periplásmica mutante descrita en la Patente Norteamericana No. 4,946,783 expedida el 7 de Agosto de 1990. Alternativamente, los métodos in vi tro de la clonación, por ejemplo, el PCR u otras reacciones de la polimerasa del ácido nucleico, son adecuados . Además de los procariotes, los microbios eucarióticos tales como los hongos o levaduras filamentosas son adecuados para la clonación o expresión de los huéspedes para los vectores que codifican el polipéptido PRO. El Saccharomyces cerevisiae es un microorganismo huésped eucariótico inferior comúnmente utilizado. Otros incluyen Schizosaccharomyces pombe (Beach y Nurse, Nature, 290: 140 [1981]; EP 139,383 publicada el 2 de Mayo de 1985) ; huéspedes Kluyveromyces (Patente Norteamericana No. 4,943,529; Fleer et al . , Bio/Technology, 9:968-975 (1991)) tales como, por ejemplo, K. lactis (MW98-8C, CBS683, CBS4574; Louvencourt et al . , J.

Bacteriol.; 737 [1983]), K. fragilis (ATCC 12,424), K. bulgaricus (ATCC 16,045;, K. wickeramii (ATCC 24,178), K. wal tii (ATCC 56,500), K. drosophilarum (ATCC 36,906; Van den Berg et al . , Bio/Technoloqy, 8:135 (1990)), K. thermotolerans, y K. marxianus; yarrowia (EP 402,226); Pichia pastoris (EP 183,070; Sreekrishna et al . , J. Basic Microbiol. , 28:265-278 [1988]); Candida ; Trichoderma reesia (EP 244,234); Neurospora crassa (Case et al . , Proc . Nati. Acad. Sci. USA, 76:5259-5263 [1979]); Schwanniomyces tales como Schwanniomyces occiden talis (EP 394,538 publicada el 31 de Octubre de 1990) ; y hongos filamentosos tales como, por ejemplo, Neurospora , Penicilli um, Tolypocladi um (WO 91/00357 publicada el 10 de Enero de 1991), y huéspedes Aspergill us tales como A. nidulans (Ballance et al . , Biochem. Biophys. Res. Commun., 112:284-289 [1983]; Tilburn et al . , Gene, 26:205-221 [1983]; Yelton et al . , Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 81: 1470-1474 [1984]) y A. niger (Kelly y Hynes, EMBO J. , 4:475-479 [1985]). Las levaduras metilotrópicas son adecuadas en la presente e incluyen, pero no están limitadas a levaduras capaces de crecer en metanol, seleccionadas del genero que consiste de Hansenula , Candida , Kloeckera , Pichia , Saccharomyces, Torulopsis, y Rhodotorula . Una lista de especies específicas que son ejemplares de esta clase de levaduras se pueden encontrar en C. Anthony, The Biochemistry of Methylotrophs, 269 (1982). Las células hospederas adecuadas para la expresión del PRO glicosilado se derivan de los organismos multicelulares. Los ejemplos de las células de invertebrados incluyen células de insectos tales como Drosophila S2 y Spodoptera Sf9, así como células de plantas. Los ejemplos de líneas celulares de huéspedes de mamíferos útiles incluyen las células de ovario de hámster chino (CHO) y COS. Los ejemplos más específicos incluyen la línea CVl de riñon de mono, transformada por SV40 (COS-7, ATCC CRL 1651); la línea del riñon embriónico humano (células 293 ó 293 subclonadas para el crecimiento en cultivo en suspensión, Graham et al., J. Gen. Virol. , 36:59 (1977)); las células de ovario de hámster chino/-DHFR (CHO, Urlaub y Chasin, Proc. Nati. Acad.

Sci. USA, 77:4216 (1980)); las células sertoli de ratón (TM4, Mather, Biol. Reprod., 23:243-251 (1980)); las células de pulmón humano (W138, ATCC CCL 75); las células de hígado humano (Hep G2, HB 8065); y el tumor mamario de ratón (MMT 060562, ATCC CCL51) . La selección de las células hospederas apropiadas se considera que está dentro de las habilidades en la técnica. 3. Selección y Uso de un Vector Replicable El ácido nucleico (por ejemplo, ADNc o ADN genómico) que codifica un PRO deseado se puede insertar en un vector replicable para la clonación (amplificación del ADN) o para la expresión. Varios vectores están públicamente disponibles. El vector puede, por ejemplo, estar en la forma de un plásmido, cósmido, partícula viral, o fago. La secuencia de ácido nucleico apropiada se puede insertar en el vector con una variedad de procedimientos. En general, el ADN se inserta en un sitio o sitios de endonucleasa de restricción apropiado utilizando técnicas conocidas en el arte. Los componentes de vectores en general incluyen, pero no están limitados a, uno o más de una secuencia de señal, un origen de replicación, uno o más genes marcadores, un elemento mejorador, un promotor, y una secuencia de terminación de transcripción. La construcción de vectores adecuados que contienen uno o más de estos componentes, emplea técnicas de ligación estándar que son conocidas para un técnico con habilidades. El PRO se puede producir recombinantemente no sólo de manera directa, sino también como un polipéptido de fusión con un polipéptido heterólogo, que puede ser una secuencia de señal u otro polipéptido que tenga un sitio de escisión específico en el N-terminal de la proteína o polipéptido maduro. En general, la secuencia de señal puede ser un componente del vector, o puede ser una parte del ADN que codifica al PRO que se inserta en el vector. La secuencia de señal puede ser una secuencia de señal procariótica seleccionada, por ejemplo, del grupo de la fosfatasa alcalina, la penicilinasa, lpp, o los líderes de enterotoxina II estables al calor. Para la secreción de la levadura la secuencia de señal puede ser, por ejemplo, el líder de invertasa de levadura, el líder del factor alfa (que incluye los líderes del factor a de Saccharomyces y Kl uyveromyces, el último descrito en la Patente Norteamericana No. 5,010,182), o el líder de la fosfatasa acida, el líder de la glucoamilasa de C. albicans (EP 362,179 publicada el 4 de Abril de 1990), o la señal descrita en WO 90/13646 publicada el 15 de Noviembre de 1990. En la expresión celular de mamíferos, las secuencias de señal de mamíferos se pueden utilizar para dirigir la secreción de la proteína, tal como las secuencias de señal de los polipéptidos secretados de los mismos o especies relacionadas, así como líderes secretorios virales. Tanto los vectores de expresión como de clonación contienen una secuencia de ácido nucleico que permite al vector replicarse en una o más células huésped u hospederas seleccionadas. Tales secuencias son bien conocidas para una variedad de bacterias, levaduras, y virus. El origen de la replicación del plásmido pBR322 es adecuado para la mayoría de las bacterias Gram-negativas, el origen del plásmido 2µ es adecuado para la levadura, y varios orígenes virales (SV40, polioma, adenovirus, VSV ó BPV) son útiles para los vectores de clonación en las células de mamíferos. Los vectores de expresión y clonación típicamente contendrán un gen de selección, también llamado un marcador seleccionable. Los genes de selección típicos codifican proteínas que (a) confieren resistencia a antibióticos u otras toxinas, por ejemplo, ampicilina, neomicina, metotrexato o tetraciclina, (b) complementan diferencias auxotróficas, o (c) suministran nutrientes críticos no disponibles del medio del complejo, por ejemplo, el gen que codifica la racemasa D-alanina para Bacilli . Un ejemplo de los marcadores seleccionables para células de mamíferos son aquéllos que permiten la identificación de las células competentes para tomar el ácido nucleico que codifica al PRO, tal como DHFR o timidina cinasa. Una célula hospedera apropiada cuando se emplea el DHFR de tipo natural o salvaje es la línea celular CHO deficiente en la actividad DHFR, preparada y propagada como se describe por Urlaub et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 77:4216 (1980). Un gen de selección adecuado para usarse en las levaduras es el gen trpl presente en el plásmido YRp7 de levaduras [Stinchcomb et al., Nature, 282:39 (1979); Kingsman et al., Gene, 7:141 (1979); Tschemper et al., Gene, 10:157 (1980)]. El gen trpl proporciona un marcador de selección para una cepa mutante de levaduras que carecen de la capacidad de crecer en triptofano, por ejemplo, ATCC No. 44076 ó PEP4-1 [Jones, Genetics, 85:12 (1977)]. Los vectores de expresión y clonación usualmente contienen un promotor enlazado operablemente a la secuencia de ácido nucleico que codifica al PRO para dirigir la síntesis de ARNm. Los promotores reconocidos por una variedad de células huésped u hospederas potenciales son bien conocidos. Los promotores adecuados para usarse con huéspedes procarióticos incluyen los sistemas promotores de ß-lactamasa y lactosa [Chang et al., Nature, 275:615 (1978); Goeddel et al., Nature, 281:544 (1979)], fosfatasa alcalina, un sistema promotor de triptofano (trp) [Goeddel, Nucleic Acids Res., 8:4057 (1980); EP 36,776], y promotores híbridos tales como el promotor tac [deBoer et al., Proc. Nati. Acad.

Sci. USA, 80:21-25 (1983)]. Los promotores para usarse en sistemas bacterianos también contendrán una secuencia Shine- Delgarno (S.D.) enlazada operablemente al ADN que codifica al PRO. Los ejemplos de secuencias promotoras adecuadas para usarse con huéspedes de levaduras incluyen los promotores para la 3-fosfoglicerato cinasa [Hitzeman et al., J. Biol. Chem. , 255:2073 (1980)] u otras enzimas glicolíticas [Hess et al., J. Adv. Enzyme Res., 7:149 (1968)]; Holland, Biochemistry, 17:4900 (1978)], tales como la enolasa, deshidrogenasa de gliceraldehído-3-fosfato, hexocinasa, descarboxilasa de piruvato, fosfofructocinasa, isomerasa de glucosa-6-fosfato, mutasa de 3-fosfoglicerato, piruvato cinasa, isomerasa de triosefosfato, isomerasa de fosfoglucosa, y glucocinasa. Otros promotores de levaduras, que son promotores inducibles que tienen la ventaja adicional de la transcripción controlada por condiciones de crecimiento, son las regiones promotoras para la alcohol deshidrogenasa 2, isocitocromo C, fosfatasa acida, enzimas degradativas asociadas con el metabolismo de nitrógeno, metalotioneina, deshidrogenasa de gliceraldehído-3-fosfato, y enzimas responsables para la utilización de la maltosa y galactosa.

Los vectores adecuados y promotores para usarse en la expresión de levaduras se describen además en la EP 73,657. La transcripción del polipéptido PRO de los vectores en células hospederas u hospederas de mamíferos es controlada, por ejemplo, mediante promotores obtenidos de los genomas de los virus tales como virus polioma, virus fowlpox (UK 2,211,504 publicada el 5 de Julio de 1989), adenovirus (tales como Adenovirus 2), virus del papiloma bovino, virus del sarcoma de las aves, citomegalovirus, un retrovirus, virus de hepatitis B y Virus 40 de Simio (SV40) , de los promotores de mamíferos heterólogos, por ejemplo, el promotor de actina o un promotor de inmunoglobulina, y de los promotores de choque calorífico, siempre que tales promotores sean compatibles con los sistemas de las células hospederas. La transcripción de un ADN que codifica al PRO por eucariotes superiores se puede incrementar insertando una secuencia mejoradora en el vector. Los mejoradores son elementos cis-actuantes de ADN, usualmente de manera aproximada 10 a 300 bp, que actúan sobre un promotor para incrementar su transcripción. Muchas secuencias mejoradoras son ahora conocidas de los genes de mamíferos (globina, elastasa, albúmina, a-fetoproteína, e insulina) .

Típicamente, sin embargo, se usará un mejorador de un virus de célula eucariótica. Los ejemplos incluyen el mejorador SV40 en el lado tardío del origen de replicación (bp 100- 270), el mejorador de promotor temprano de citomegalovirus, el mejorador de polioma en el lado tardío del origen de replicación, y los mejoradores de adenovirus. El mejorador se puede empalmar en el vector en la posición 5' ó 3' a la secuencia de codificación del PRO, pero preferiblemente está localizado en un sitio 5' del promotor. Los vectores de expresión utilizados en las células huésped u hospederas eucarióticas (levaduras, hongos, insectos, plantas, animales, humanos, o células nucleadas de otros organismos multicelulares) contendrán también secuencias necesarias para la terminación de la transcripción y para la estabilización del ARNm. Tales secuencias están comúnmente disponibles de las regiones no traducidas 5' y ocasionalmente 3' de los ADNc o ADNs virales o eucarióticos. Estas regiones contienen segmentos de nucleótidos transcritos como fragmentos poliadenilados en la porción no traducida del ARNm que codifica al PRO. Todavía otros métodos, vectores, y células huésped u hospederas adecuadas para la adaptación a la síntesis del PRO en los cultivos de células de vertebrados recombinantes, se describen en Gething et al., Nature, 293:620-625 (1981); Mantei et al., Nature, 281:40-46 (1979); EP 117,060; y EP 117,058. 4. Detección del Gen de Amplificación/Expresión La amplificación y/o expresión del gen se puede medir en una muestra directamente, por ejemplo, mediante manchado o transferencia Southern convencional, manchado o transferencia Northern para cuantificar la transcripción del ARNm [Thomas, Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 77:5201-5205 (1980)], el manchado de puntos (análisis de ADN), o hibridización in si tu, utilizando una sonda etiquetada apropiadamente, se basan en las secuencias provistas en la presente. Alternativamente, los anticuerpos se pueden emplear, los cuales reconocen dobles o dúplex específicos, que incluyen dúplex de ADN, dúplex de ARN, y dúplex de híbridos ADN-ARN o dobles o dúplex de ADN-proteína . Los anticuerpos a su vez se pueden etiquetar y los ensayos se pueden llevar a cabo en donde el dúplex o doble se une a la superficie, de manera que luego de la formación del dúplex en la superficie, se pueda detectar la presencia del anticuerpo enlazado al dúplex o doble. La expresión del gen, alternativamente, se puede medir mediante métodos inmunológicos, tales como manchado inmunohistoquímico de las células o secciones de tejidos y ensayos de cultivos celulares o fluidos corporales, para cuantificar directamente la expresión del producto del gen. Los anticuerpos útiles para el manchado y/o ensayo inmunohistoquímico de fluidos de muestra pueden ser ya sea monoclonales o policlonales, y se pueden preparar en cualquier mamífero. Convenientemente, los anticuerpos se pueden preparar contra un polipéptido PRO de secuencia nativa o contra un péptido sintético basado en las secuencias de ADN provistas aquí o contra la secuencia exógena fusionada a un ADN del polipéptido PRO y que codifica un epítope del anticuerpo específico. 5. Purificación del Polipéptido Las formas del PRO se pueden recuperar del medio de cultivo o de los lisados de células huésped u hospederas. Si la membrana enlazada, se puede liberar de la membrana utilizando una solución detergente adecuada (por ejemplo, Triton-X 100) o mediante escisión enzimática. Las células empleadas en la expresión del PRO se pueden romper mediante varios medios físicos o químicos, tales como ciclización por congelamiento, sonicación, rompimiento mecánico, o agentes de lisado celular. Se puede desear purificar al PRO a partir de proteínas o polipéptidos de células recombinantes. Los siguientes procedimientos son ejemplares de los procedimientos de purificación adecuados: mediante fraccionamiento en una columna de intercambio iónico; precipitación con etanoi; HPLC de fase inversa; cromatografía sobre sílice o sobre una resina de intercambio catiónico tal como DEAE; cromatoenfocamiento; SDS-PAGE; precipitación con sulfato de amonio; filtración en gel utilizando, por ejemplo, Sephadex G-75; columnas de Sepharose de proteína A para eliminar contaminantes tales como IgG; y columnas de metal quelante para enlazar formas etiquetadas con epítope del PRO. Varios métodos de la purificación de proteína sé pueden emplear y tales métodos son conocidos en la técnica y descritos por ejemplo en Deutscher, Methods in Enzymology, 182 (1990) ; Scopes, Protein Purification: Principies and Practice, Springer-Verlag, New York (1982). Las etapas de purificación seleccionadas dependerán, por ejemplo, de la naturaleza de los procesos de purificación utilizados y del PRO particular producido.. E. Usos para el PRO Las secuencias de nucleótidos (o sus complementos) que codifican al PRO tienen varias aplicaciones en el campo de la biología molecular, que incluyen los usos como sondas de hibridización, en la formación de mapas de cromosomas y genes, y en la generación de ARN y ADN antisentido. El ácido nucleico del PRO también será útil para la preparación de los polipéptidos PRO mediante las técnicas recombinantes descritas en la presente. El gen PRO de la secuencia nativa de longitud completa, o porciones del mismo, se pueden utilizar como sondas de hibridización para una biblioteca de ADNc para aislar el ADNc del PRO de longitud completa o para aislar aún otros ADNc (por ejemplo, aquellas variantes que se presentan de manera natural codificantes del PRO o PRO de otras especies) que tienen una identidad de secuencia deseada a la secuencia del PRO nativo, descrito en la presente. Opcionalmente, la longitud de las ondas será de aproximadamente 20 a aproximadamente 50 bases. Las sondas de hibridización pueden ser derivadas de al menos parcialmente las nuevas regiones de la secuencia de nucleótidos, nativa, de longitud completa en donde aquellas regiones se pueden determinar sin experimentación indebida o a partir de secuencias genómicas que incluyen promotores, elementos mejoradores e intrones del PRO de secuencia nativa. A manera de ejemplo, un método de selección o separación comprenderá aislar la región de codificación del gen de PRO que utiliza la secuencia de ADN conocida para sintetizar una sonda seleccionada de aproximadamente 40 bases. Las sondas de hibridización se pueden etiquetar mediante una variedad de etiquetas, que incluyen radionucleótidos tales como 32P ó 35S, o etiquetas enzimáticas tales como fosfatasa alcalina acoplada a la sonda vía sistemas de acoplamiento avidina/biotina. Las sondas de etiquetado tienen una secuencia complementaria a aquélla del gen del PRO de la presente invención y se pueden usar para seleccionar bibliotecas de ADNc humano, ADN genómico o ARNm para determinar que miembros de tales bibliotecas hibridizarán la sonda. Las técnicas de hibridización se describen con más detalle en los Ejemplos siguientes. Cualquier secuencia EST descrita en la presente solicitud puede emplearse de manera similar como sondas, utilizando los métodos descritos en la presente. Otros fragmentos útiles de los ácidos nucleicos del PRO incluyen los oligonucleótidos sentido o antisentido que comprenden la secuencia de ácido nucleico de una sola hebra (ya sea ARN o ADN) capaz de enlazarse al ARNm del PRO objetivo (sentido) o a las secuencias de ADN PRO (antisentido) . Los oligonucleótidos sentido y antisentido, de acuerdo con la presente invención, comprenden un fragmento de la región de codificación del ADN del PRO. Tal fragmento comprende generalmente al menos aproximadamente 14 nucleótidos, de manera preferible aproximadamente 14 a 30 nucleótidos. La capacidad de derivar un oligonucleótido sentido o antisentido, en base a una secuencia de ADN que codifica una proteína dada se describe, por ejemplo, en Stein y Cohén (Cáncer Res. 48:2659, 1988) y van der Krol et al. (BioTechniques 6:958, 1988). El enlace de los oligonucleótidos sentido o antisentido a las secuencias de ácido nucleico objetivo da como resultado la formación de los dobles o dúplex que bloquean la transcripción o traducción de la secuencia objetivo mediante uno de varios medios, que incluyen la degradación mejorada de los dobles o dúplex, la terminación prematura de la transcripción o traducción, o por otros medios. Los oligonucleótidos antisentido por consiguiente se pueden utilizar para bloquear la expresión de las proteínas PRO. Los oligonucleótido sentido o antisentido comprenden además los oligonucleótidos que tienen cadenas principales de fosfodiéster de azúcar, modificadas (diferentes a los enlaces de azúcar, tales como aquéllos descritos en WO 91/06629) y en donde tales enlaces de azúcar son resistentes a las nucleasas endógenas. Tales oligonucleótidos con enlaces de azúcar resistentes son estables in vivo (es decir, capaces de resistir la degradación enzimática) , pero retienen la especificidad de secuencia para ser capaces de enlazarse a las secuencias de nucleótidos objetivo. Otros ejemplos de los oligonucleótidos sentido y antisentido incluyen aquellos oligonucleótidos que se enlazan covalentemente a las porciones orgánicas, tales como aquéllos descritos en WO 90/10048, y otras porciones que incrementan la afinidad del oligonucleótido para una secuencia de ácido nucleico objetivo, tal como poli-(L-lisina) . Además, los agentes de intercalación, tales como la elipticina, y los agentes de alquilación o los complejos de metal pueden ser anexados a los oligonucleótidos sentido y antisentido para modificar las especificidades de enlace del oligonucleótido sentido o antisentido para la secuencia de nucleótidos objetivo. Los oligonucleótidos sentido y antisentido se pueden introducir en una célula que contiene la secuencia de ácido nucleico objetivo mediante cualquier método de transferencia de genes, que incluye, por ejemplo, la transfección de ADN mediada con CaPO-j, electroporación, o utilizando los vectores de transferencia de genes tales como el virus Epstein-Barr. En un procedimiento preferido, el oligonucleótido sentido y antisentido se inserta en un vector retroviral adecuado. Una célula que contiene la secuencia de ácido nucleico objetivo se pone en contacto con el vector retroviral recombinante, ya sea in vivo o ex vivo. Los vectores retrovirales adecuados incluyen, pero no están limitados a, aquéllos derivados del retrovirus murino M-MuLV, N2 (un retrovirus derivado del MuLV) , o los vectores de copia doble, designados DCT5A, DCT5B y DCT5C (ver WO 90/13641) . Los oligonucleótidos sentido y antisentido también pueden ser introducidos en una célula que contenga la secuencia de nucleótidos objetivo mediante la formación de un conjugado con una molécula de enlace de ligando, como se describe en WO 91/04753. Las moléculas de enlace del ligando adecuadas, incluyen, pero no están limitadas a, los receptores de superficie celular, los factores de crecimiento, otras citocinas, u otros ligandos que se enlazan a los receptores de la superficie celular. Preferiblemente, la conjugación de la molécula de enlace del ligando no interfiere substancialmente con la capacidad de la molécula de enlace del ligando de enlazarse a su molécula o receptor correspondiente, o bloquea la entrada del oligonucleótido sentido o antisentido o su versión conjugada en la célula. Alternativamente, un oligonucleótido sentido o antisentido se puede introducir en una célula que contiene la secuencia del ácido nucleico objetivo mediante la formación de un complejo oligonucleótido-lípido, como se describe en WO 90/10448. El complejo del oligonucleótido- lípido sentido o antisentido preferiblemente se disocia dentro de la célula mediante una lipasa endógena. Las moléculas de ADN o ARN antisentido son generalmente al menos de aproximadamente 5 bases de longitud, aproximadamente 10 bases de longitud, aproximadamente 15 bases de longitud, aproximadamente 20 bases de longitud, aproximadamente 25 bases de longitud, aproximadamente 30 bases de longitud, aproximadamente 35 bases de longitud, aproximadamente 40 bases de longitud, aproximadamente 45 bases de longitud, aproximadamente 50 bases de longitud, aproximadamente 55 bases de longitud, aproximadamente 60 bases de longitud, aproximadamente 65 bases de longitud, aproximadamente 70 bases de longitud, aproximadamente 75 bases de longitud, aproximadamente 80 bases de longitud, aproximadamente 85 bases de longitud, aproximadamente 90 bases de longitud, aproximadamente 95 bases de longitud, aproximadamente 100 bases de longitud, o más. Las sondas también se pueden emplear en las técnicas PCR para generar un conjunto de secuencias para la identificación de secuencias de codificación del PRO relacionadas cercanamente. Las secuencias de nucleótidos que codifican un PRO también se pueden utilizar para construir sondas de hibridización para la formación de mapas de genes que codifican ese PRO y para el análisis genético de individuos con padecimientos genéticos. Las secuencias de nucleótidos provistas aquí pueden formar mapas para un cromosoma y regiones específicas de un cromosoma utilizando técnicas conocidas, tales como hibridización in si tu, análisis de enlace contra marcadores cromosómicos conocidos, y selección de hibridización con bibliotecas. Cuando las secuencias de codificación para el PRO codifica una proteína la cual se enlaza a otra proteína (por ejemplo, en donde el PRO es un receptor) , el PRO se puede utilizar en ensayos para identificar otras proteínas o moléculas involucradas en la interacción de enlace. Mediante tales métodos, los inhibidores de la interacción del enlace receptor/ligando se pueden identificar. Las proteínas implicadas en tales interacciones de enlace también se pueden utilizar para seleccionar péptidos o inhibidores de moléculas pequeñas o agonistas de la interacción de enlace. También, el receptor PRO se puede utilizar para aislar el ligando o ligandos correlacionados. Los ensayos de selección se pueden diseñar para encontrar compuestos líderes o guía que imiten la actividad biológica de un polipéptido PRO nativo o un receptor para el PRO. Los ensayos de selección incluirán ensayos capaces de seleccionar de manera altamente específica las bibliotecas químicas, haciéndolas particularmente adecuadas para identificar candidatos de fármacos de moléculas pequeñas. Las moléculas pequeñas contempladas incluyen compuestos orgánicos o inorgánicos sintéticos. Los ensayos se pueden realizar en una variedad de formatos, que incluyen los ensayos de enlace proteína-proteína, los ensayos de selección o separación bioquímica, los inmunoensayos y los ensayos basados en células, los cuales están bien caracterizados en la técnica. Los ácidos nucleicos que codifican un PRO o sus formas modificadas también se pueden utilizar para generar ya sea animales transgénicos o animales "marcados" los cuales, a su vez, son útiles en el desarrollo y selección de reactivos útiles terapéuticamente. Un animal transgénico (por ejemplo, una rata o ratón) es un animal que tiene células que contienen un transgen, dicho transgen fue introducido en el animal o un ancestro del animal en una etapa prenatal, por ejemplo, una etapa embriónica. Un transgen es un ADN que está integrado en el genoma de una célula desde la cual se desarrolla un animal transgénico. En una modalidad, el ADNc que codifica un PRO se puede utilizar para clonar el ADN genómico que codifica al PRO de acuerdo con las técnicas establecidas y las secuencias genómicas utilizadas para generar los animales transgénicos que contienen las células que expresan el ADN que codifica al PRO. Los métodos para generar animales transgénicos, particularmente animales tales como ratones o ratas, se han vuelto convencionales en la técnica y se describen, por ejemplo, en las Patentes Norteamericanas Nos. 4,736,866 y 4,870,009. Típicamente, las células particulares serán el objetivo para la incorporación del transgen del PRO con mejoradores específicos de tejido. Los animales transgénicos que incluyen una copia de un transgen que codifica un PRO introducido en una línea germinal del animal en una etapa embriónica se puede utilizar para examinar el efecto de la expresión incrementada del ADN que codifica al PRO. Tales animales se pueden utilizar como animales de prueba para reactivos para conferir protección de, por ejemplo, las condiciones patológicas asociadas con su sobreexpresión. De acuerdo con esta faceta de la invención, un animal se trata con el reactivo y se reduce la incidencia de la condición patológica, comparado con los animales no tratados que llevan el transgen, lo cual indicaría una intervención terapéutica potencial para la condición patológica. Alternativamente, los homólogos no humanos del PRO se pueden utilizar para construir un animal "marcado" del PRO que tiene un gen defectuoso o alterado que codifica al PRO como resultado de la recombinación homologa entre el gen endógeno que codifica al PRO y el ADN genómico alterado que codifica al PRO introducido en una célula madre embriónica del animal. Por ejemplo, el ADNc que codifica un PRO se puede usar para clonar al ADN genómico que codifica al PRO de acuerdo con las técnicas establecidas. Una porción del ADN genómico que codifica un PRO se puede eliminar o reemplazar con otro gen, tal como un gen que codifica un marcador seleccionable que se puede usar para monitorear la integración. Típicamente, varias kilobases de ADN flanqueantes no alteradas (tanto en los extremos 5' como 3' ) se incluyen en el vector [ver por ejemplo, Thomas y Capecchi, Cell, 51:503 (1987) para una descripción de vectores de recombinación homólogos] . El vector se introduce en una línea de célula base o madre embriónica (por ejemplo, mediante electroporación) y se seleccionan las células en las cuales el ADN introducido tiene homología recombinada con el ADN endógeno [ver por ejemplo, Li et al., Cell, 69:915 (1992)]. Las células seleccionadas se inyectan entonces en un blastocisto de un animal (por ejemplo, un ratón o rata) para formar quimeras de agregación [ver por ejemplo, Bradley, en Teratocarcinomas and Embryonic Stem Cells : A Practical Approach, E. J. Robertson, ed. (IRL, Oxford, 1987), pp. 113-152]. Un embrión quimérico se puede implantar entonces en un animal hembra pseudopreñada adecuado y el embrión se lleva a termino para crear un animal "marcado". Al cosechar la progenie el ADN recombinado homólogamente en sus células germinales se puede identificar mediante técnicas estándar y se utiliza para criar más animales en los cuales todas las células del animal contendrán el ADN recombinado homólogamente. Los animales marcados se pueden caracterizar por ejemplo, por su capacidad de defenderse contra ciertas condiciones patológicas y por desarrollar condiciones patológicas debido a la ausencia del polipéptido PRO. El ácido nucleico que codifica los polipéptidos PRO también se pueden utilizar en la terapia genética. En las aplicaciones de la terapia genética, se introducen los genes en las células para lograr la síntesis in vivo de un producto genético terapéutico efectivo, por ejemplo para el reemplazo de un gen defectuoso. La "terapia genética" incluye tanto la terapia genética convencional en donde se logra un efecto permanente mediante un tratamiento sencillo, y la administración de los agentes terapéuticos genéticos, que implica una sola administración o la administración repetida del ARNm o ADN terapéuticamente efectivo. Los ARN o los ADN antisentido se pueden utilizar como agentes terapéuticos para bloquear la expresión de ciertos genes in vivo . Ya se ha mostrado que los oligonucleótidos antisentido cortos se pueden importar hacia las células donde los mismos actúan como inhibidores a pesar de sus bajas concentraciones intracelulares provocadas por su absorción restringida mediante la membrana celular. (Zamecnik et al . , Proc. Nati. Acad. Sci. USA 83:4143-4146 [1986]). Los oligonucleótidos se pueden modificar para mejorar su absorción, por ejemplo, substituyendo sus grupos de fosfodiéster cargados negativamente por grupos no cargados. Existe una variedad de técnicas disponibles para introducir los ácidos nucleicos en las células viables. Las técnicas varían dependiendo de sí el ácido nucleico se transfiere a las células cultivadas in vi tro, o in vivo en las células del huésped pretendido. Las técnicas adecuadas para la transferencia del ácido nucleico en las células de mamífero in vi tro incluyen el uso de liposomas, electroporación, microinyección, fusión celular, DEAE-dextrano, el método de precipitación con fosfato de calcio, etc. Las técnicas de transferencia de genes in vivo preferidas actualmente incluyen la transfección con vectores virales (típicamente retrovirales) y la transfección mediada con liposoma-proteína revestida viral (Dzau et al., Trends in Biotechnology 11, 205-210 [1993]). En algunas situaciones es deseable proporcionar la fuente de ácido nucleico con un agente que tiene como destino las células objetivo, tal como un anticuerpo específico para una proteína de membrana de superficie celular o la célula objetiva, un ligando para un receptor sobre la célula objetivo, etc. Cuando se emplean los liposomas, las proteínas que se enlazan a una proteína de membrana de superficie celular asociada con la endocitosis se pueden utilizar para apuntar y/o para facilitar la absorción, por ejemplo, las proteínas de capside o fragmentos de las mismas trópicos para un tipo de célula particular, los anticuerpos para las proteínas que experimentan la internalización en ciclos, las proteínas que apuntan a la localización intracelular y mejoran la vida media intracelular. La técnica de la endocitosis mediada con el receptor se describe, por ejemplo, por Wu et al., J^ Biol. Chem. 2.62, 4429-4432 (1987); y Wagner et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA 87, 3410-3414 (1990) . Para revisión del marcado del gen y los protocolos de terapia genética ver Anderson et al., Science 256, 808-813 (1992). Los polipéptidos PRO descritos en la presente también se pueden emplear como marcadores del peso molecular para los propósitos de electrofóresis de la proteína y las secuencias de ácido nucleico aisladas se pueden utilizar para expresar recombinantemente aquellos marcadores. Las moléculas de ácido nucleico que codifican los polipéptidos PRO o fragmentos de los mismos descritos en la presente son útiles para la identificación de cromosomas. A este respecto, existe la necesidad vigente de identificar nuevos marcadores de cromosomas, puesto que sólo algunos reactivos de marcado de cromosomas, en base a los datos de secuencia actuales, están disponibles en la actualidad. Cada molécula de ácido nucleico del PRO de la presente invención, se puede utilizar como un marcador de cromosomas. Los polipéptidos PRO y las moléculas de ácido nucleico de la presente invención también se pueden utilizar para clasificar el tipo de tejido, en donde los polipéptidos PRO de la presente invención se puedan expresar de manera diferente en un tejido cuando se compara con otro. Las moléculas de ácido nucleico del PRO se utilizarán para generar sondas para PCR, análisis Northern, análisis Southern y análisis Western. Los polipéptidos PRO descritos en la presente también se emplean como agentes terapéuticos. Los polipéptidos PRO de la presente invención se pueden formar de acuerdo a los métodos conocidos para preparar las composiciones útiles farmacéuticamente, por medio de lo cual el producto PCR de los mismos se combine en una mezcla con el vehículo portador farmacéuticamente aceptable. Las formulaciones terapéuticas se preparan para almacenarse mezclando el ingrediente activo que tiene el grado deseado de pureza con los portadores, excipientes o estabilizadores aceptables fisiológicamente (Remington's Pharmaceutical Sciences 16a edición, Osol, A. Ed. (1980)), en la forma de formulaciones liofilizadas o soluciones acuosas. Los portadores, excipientes o estabilizadores aceptables no son tóxicos para los recipientes en las dosificaciones y concentraciones empleadas, e incluyen amortiguadores tales como fosfato, citrato y otros ácidos orgánicos; los antioxidantes que incluyen el ácido ascórbico; los polipéptidos de peso molecular bajo (menos de aproximadamente 10 residuos) ; las proteínas, tales como albúmina de suero, gelatina o inmunoglobulinas; polímeros hidrofílicos tales como polivinilpirrolidona, aminoácidos tales como glicina, glutamina, asparagina, arginina o lisina; monosacáridos, disacáridos y otros carbohidratos que incluyen la glucosa, mannosa, o dextrinas; agentes quelantes tales como EDTA; alcoholes de azúcar tales como manitol o sorbitol; los contraiones que forman sales tales como sodio; y/o surfactantes no iónicos tales como TWEEN™, PLURONICS™ ó PEG. Las formulaciones que se van a utilizar in vivo deben ser estériles. Esto es completado fácilmente mediante la filtración a través de las membranas de filtración estériles, antes o después de la liofilización y reconstitución. Las composiciones terapéuticas en la presente generalmente se colocan en un recipiente que tiene un orificio de acceso estéril, por ejemplo, una bolsa o vial de solución intravenosa que tiene un tapón horadable mediante una aguja para inyección hipodérmica. La ruta de administración está acorde con los métodos conocidos, por ejemplo, inyección o infusión mediante rutas intravenosas, intraperitoneales, intracerebrales, intramusculares, intraoculares, intraarteriales o intralesionales, administración tópica o mediante sistemas de liberación sostenida. Las dosificaciones y concentraciones de fármacos deseados de las composiciones farmacéuticas de la presente invención pueden variar dependiendo del uso particular visualizado. La determinación de la dosificación apropiada o ruta de administración está bien dentro de las habilidades de un técnico ordinario. Los experimentos con animales proporcionan la guía confiable para la determinación de las dosis efectivas para la terapia humana. El escalamiento entre especies de las dosis efectivas se puede realizar siguiendo los principios determinados por Mordenti, J. y Chappell, W. "The use of interspecies scaling in toxicokinetics" En Toxicokinetics and New Drug Development, Yacobi et al., Eds., Pergamon Press, New York 1989, pp. 42-96. Cuando se emplea la administración in vivo de un polipéptido PRO o agonista o antagonista del mismo, las cantidades de dosificaciones normales pueden variar desde aproximadamente 10 ng/kg hasta 100 mg/kg del peso del cuerpo del mamífero o más por día, de manera preferible aproximadamente 1 µg/kg/día hasta 10 mg/kg/día, dependiendo de la ruta de administración. La guía para la dosificación y métodos particulares de suministro se proporcionan en la literatura; ver, por ejemplo, las Patentes Norteamericanas Nos. 4,657,760; 5,206,344; ó 5,225,212. Se anticipa que las diferentes formulaciones serán efectivas para diferentes compuestos de tratamiento y diferentes padecimientos, que la del objetivo de administración al órgano o tejido, por ejemplo, puede necesitar el suministro de una manera diferente de aquélla a un tejido u órgano diferente. Donde se desea la administración de liberación sostenida de un PRO en una formulación con características de liberación adecuadas para el tratamiento de cualquier padecimiento o desorden que requiera la administración del polipéptido PRO, se contempla la microencapsulación del polipéptido PRO. La microencapsulación de las proteínas recombinantes para la liberación sostenida se ha realizado exitosamente con la hormona del crecimiento humana (rhGB) , el interferón- (rhIFN-) , la interleucina-2, y el MN rgpl20. Johnson et al., Nat. Med., 2:795-799 (1996); Yasuda, Biomed. Ther. , 27:1221-1223 (1993); Hora et al., Bio/Technology, 8:755-758 (1990); Cleland, "Design and Production of Single Immunization Vaccines using Polylactide Polyglicolide Microsphere Systems", in Vaccine Design: The Subunit and Adjuvant Approach, Powell y Newman, eds, (Plenum Press: New York, 1995), pp. 439-462; WO 97/03692, WO 96/40072, WO 96/07399; y la Patente Norteamericana No. 5,654,010. Las formulaciones de liberación sostenida de estas proteínas se desarrollaron utilizando el polímero del ácido poli-láctico-coglicólico (PLGA) debido a su biocompatibilidad y amplio rango de propiedades biodegradables. Los productos de degradación del PLGA, los ácidos láctico y glicólico, se pueden eliminar rápidamente dentro del cuerpo humano. Además, la degradabilidad de este polímero se puede ajustar desde meses hasta años dependiendo de su peso y composición molecular. Lewis, "Controlled reléase of bioactive agents from lactide/glicolide polymer", en: M. Chasin y R. Langer (Eds.), Biodegradable Polymers as Drug Delivery Systems (Marcel Dekker: New York, 1990), pp. 1-41. Esta invención engloba los métodos de selección de compuestos para identificar aquéllos que imitan al polipéptido PRO (agonistas) o evitar el efecto del polipéptido PRO (antagonistas) . Los ensayos de selección para los candidatos de fármacos antagonistas se diseñan para identificar los compuestos que se enlazan o el complejo con los polipéptidos PRO codificados mediante los genes identificados en la presente, o de otra manera interfieren con la interacción de los polipéptidos codificados con otras proteínas celulares. Tales ensayos de selección incluirán los ensayos tratables para la selección de alto rendimiento de las bibliotecas químicas, haciéndolas particularmente adecuadas para identificar los candidatos de fármacos de moléculas pequeñas. Los ensayos se pueden realizar en una variedad de formatos, que incluyen los ensayos de enlace proteína-proteína, los ensayos de selección bioquímicos, los inmunoensayos, los ensayos basados en células, los cuales están bien caracterizados en la técnica. Todos los ensayos para los antagonistas son comunes porque requieren poner en contacto el candidato del fármaco con un polipéptido PRO codificado mediante un ácido nucleico identificado en la presente bajo condiciones y durante un tiempo suficiente para permitir que estos dos componentes interactúen. En los ensayos de enlace, la interacción es el enlace y el complejo formado se puede aislar o detectar en la mezcla de reacción. En una modalidad particular, el polipéptido PRO codificado por el gen identificado en la presente o el candidato del fármaco se inmoviliza sobre una fase sólida, por ejemplo, sobre una placa microtituladora, mediante la unión covalente o no covalente. La unión no covalente generalmente se completa recubriendo la superficie sólida con una solución del polipéptido PRO y secándola. Alternativamente, un anticuerpo inmovilizado, por ejemplo, un anticuerpo monoclonal, específico para el polipéptido PRO que se inmoviliza se puede utilizar para anclarlo a una superficie sólida. El ensayo se realiza agregando el componente inmovilizado, el cual se puede etiquetar mediante una etiqueta detectable, al componente inmovilizado, por ejemplo, la superficie recubierta que contiene el componente anclado. Cuando se completa la reacción, los componentes que no reaccionaron se eliminan, por ejemplo, mediante lavado, y se detectan los complejos anclados sobre la superficie sólida. Cuando el componente originalmente no inmovilizado lleva una etiqueta detectable, la detección de la etiqueta inmovilizada sobre la superficie indica que ocurrió el complejo. Cuando el componente originalmente no inmovilizado, lleva una etiqueta, se puede detectar el complejo, por ejemplo, utilizando un anticuerpo etiquetado que enlaza específicamente al complejo inmovilizado.

Si el compuesto candidato interactúa con pero no enlaza a un polipéptido PRO particular codificado mediante un gen identificado en la presente, su interacción con aquel polipéptido se puede ensayar mediante métodos bien conocidos para detectar las interacciones proteína-proteína. Tales ensayos incluyen métodos tradicionales, tales como, por ejemplo, reticulación, co-inmunoprecipitación, y co-purificación a través de gradientes o columnas cromatográficas. Además, las interacciones proteína-proteína se pueden monitorear utilizando el sistema genético en base a las levaduras, descrito por Fields y colaboradores (Fields y Song, Nature (Londres), 340:245-246 (1989); Chien et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 88:9578-9582 (1991)) como se describe por Chevray y Nathans, Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 89: 5789-5793 (1991) . Muchos activadores transcripcionales, tales como la GAL4 de levadura, consiste de dos dominios modulares discretos físicamente, uno que actúa como el dominio que se enlaza al ADN, y el otro que funciona como el dominio de transcripción-activación. El sistema de expresión de levadura descrito en publicaciones anteriores (generalmente referido como el "sistema híbrido doble") , toma ventaja de esta propiedad, y emplea dos proteínas híbridas, una en la cual la proteína objetivo se fusiona al dominio de enlace al ADN del GAL4, y otra, en la cual las proteínas de activación, candidatas, se fusionan al dominio de activación. La expresión de un gen reportero GALl-lacZ bajo el control de un promotor activado con GAL4 depende de la reconstrucción de la actividad del GAL4 vía la interacción proteína-proteína. Las colonias que contienen los polipéptidos que interactúan se detectan con un substrato cromogénico para la ß-galactosidasa. Un equipo completo (MATCHMAKER™) para identificar las interacciones proteína-proteína entre dos proteínas utilizando la técnica de dos híbridos, está comercialmente disponible de Clontech. Este sistema también se puede extender a los dominios de proteína del mapa, implicados en las interacciones de la proteína específica así como los residuos de aminoácidos precisos que son cruciales para estas interacciones. Los compuestos que interfieren con la interacción de un gen que codifica un polipéptido PRO identificado en la presente y otros componentes intra- o extracelulares se pueden probar como sigue: usualmente se prepara una mezcla de reacción que contiene el producto del gen y el componente intra- o extracelular bajo condiciones y durante un tiempo que permita la interacción y enlace de los dos productos. Para probar la capacidad de un compuesto candidato para inhibir el enlace, la reacción se activa en la ausencia y en la ' presencia del compuesto de prueba. Además, se puede agregar un placebo a la tercera mezcla de reacción, para servir como control positivo. El enlace (formación del complejo) entre el compuesto de prueba y el compuesto intra- o extracelular presente en la mezcla, se monitorea como se describe anteriormente. La formación de un complejo en las o la reacción de control pero no en la mezcla de reacción que contiene el compuesto de prueba indica que el compuesto de prueba interfiere con la interacción del compuesto de prueba y su socio de reacción. Para un ensayo para los antagonistas, el polipéptido PRO se puede agregar a una célula junto con el compuesto que se va a seleccionar para una actividad particular y la capacidad del compuesto para inhibir la actividad de interés en la presencia del polipéptido PRO indica que el compuesto es un antagonista del polipéptido PRO. Alternativamente, se pueden detectar los antagonistas combinando el polipéptido PRO y un antagonista potencial con los receptores del polipéptido PRO enlazado a la membrana o los receptores recombinantes bajo condiciones apropiadas para un ensayo de inhibición competitivo. El polipéptido PRO se puede etiquetar, tal como por medio de radioactividad, de tal manera que el número de las moléculas del polipéptido PRO, enlazadas al receptor, se puede utilizar para determinar la efectividad del antagonista potencial. El gen que codifica al receptor se puede identificar mediante numerosos métodos conocidos por aquéllos hábiles en la técnica, por ejemplo, la separación por cribado del ligando y la clasificación FACS. Coligan et al., Current Protocols in Immun., 1(2): Capítulo 5 (1991) . Preferiblemente, la clonación de expresión se emplea en donde el ARN poliadenilado se prepara a partir de una célula sensible al polipéptido PRO y una biblioteca de ADNc creada a partir de este ARN se divide en conjuntos y se utiliza para transferir las células COS u otras células que no sean sensibles al polipéptido PRO. Las células transfectadas que se hacen crecer en portaobjetos de cristal se exponen al polipéptido PRO etiquetado. El polipéptido PRO se puede etiquetar mediante una variedad de medios que incluyen la yodación o inclusión de un sitio de reconocimiento para una proteína cinasa específica del sitio. Siguiendo la fijación e incubación, los portaobjetos se someten al análisis auto-radiográfico. Los conjuntos positivos se identifican y los sub-conjuntos se preparan y se re-transfectan utilizando un proceso de sub-conjunto y re-selección interactiva, que produce eventualmente un clon sencillo que codifica al receptor putativo. Como un método alternativo para la identificación del receptor, el polipéptido PRO etiquetado se puede enlazar mediante fotoafinidad con las preparaciones de membrana o 5 extracto celular que expresan la molécula receptora. El material reticulado se resuelve mediante PAGE y se expone a una película de rayos X. Se puede remover el complejo etiquetado que contiene el receptor, se resuelve en fragmentos de péptido, y se someten a la micro-secuenciación de proteína. La secuencia de aminoácidos obtenida de la micro-secuenciación se podría utilizar para diseñar un conjunto de sondas de oligonucleótidos degenerados para seleccionar una biblioteca de ADNc que identifique al gen que codifica al receptor putativo. 15 En otro ensayo para los antagonistas, las células de mamíferos o una preparación de la membrana que expresa el receptor que se incubarían con un polipéptido PRO etiquetado en la presencia del compuesto candidato. La habilidad del compuesto para mejorar o bloquear esta interacción podría medirse entonces. Los ejemplos más específicos de los antagonistas potenciales incluyen un oligonucleótido que se enlaza a las fusiones de la inmunoglobulina con el polipéptido PRO, y, en _*____________! particular, los anticuerpos incluyen, sin limitación, los anticuerpos poli- y monoclonales y los fragmentos de anticuerpos, los anticuerpos de cadena simple, los anticuerpos anti-idiotípicos, y las versiones quiméricas o humanizadas de tales anticuerpos o fragmentos, así como también los anticuerpos humanos y los fragmentos de anticuerpos. Alternativamente, un antagonista potencial puede ser una proteína cercanamente relacionada, por ejemplo, una forma mutada del polipéptido PRO que reconoce al receptor pero que no tiene efecto, por lo tanto inhibe competitivamente la acción del polipéptido PRO. Otro antagonista potencial del polipéptido PRO es un constructo de ARN o ADN antisentido preparado utilizando la tecnología antisentido, donde, por ejemplo, una molécula de ARN o ADN antisentido actúa para bloquear directamente la traducción del ARNm hibridizando al ARNm objetivo y evitando la traducción de la proteína. La tecnología antisentido se puede utilizar para controlar la expresión del gen a través de la formación de triple hélice o del ADN o ARN antisentido, ambos métodos se basan en el enlace de un polinucleótido al ARN o ARN. Por ejemplo, la porción codificante 5' de la secuencia de polinucleótidos, que codifica a los polipéptidos PRO maduros en la presente, se utiliza para diseñar un oligonucleótido del ARN antisentido o a partir de aproximadamente 10 a 40 pares base de longitud. Un oligonucleótido de ADN se designa para ser complementario a la región del gen implicado en la transcripción (triple hélice - ver Lee et al., Nucí. Acids Res. , 6:3073 (1979); Cooney et al., Science, 241: 456 (1988); Dervan et al., Science, 251:1360 (1991)), lo cual evita la transcripción y la producción del polipéptido PRO. El oligonucleótido del ARN antisentido hibridiza al ARNm in vivo y bloquea la traducción de la molécula de ARNm en el polipéptido PRO (antisentido - Okano, Neurochem. , 56:560 (1991) ; Oligodeoxynucleotides as Antisense Inhibitors of Gene Expression (CRC Press: Boca Ratón, FL, 1988). Los oligonucleótidos descritos anteriormente se pueden suministrar a células de tal manera que el ARN o ADN antisentido se pueda expresar in vivo para inhibir la producción del polipéptido PRO. Cuando se utiliza el ADN antisentido, se prefieren los oligodesoxirribonucleótidos derivados del sitio de traducción-iniciación, por ejemplo, entre aproximadamente las posiciones -10 y +10 de la secuencia de nucleótidos del gen objetivo. Los antagonistas potenciales incluyen las moléculas pequeñas que se enlazan al sitio activo, el sitio de enlace al receptor, o el factor de crecimiento u otro sitio de enlace relevante del polipéptido PRO, por consiguiente se bloquea la actividad biológica normal del polipéptido PRO. Los ejemplos de las moléculas pequeñas incluyen, pero no están limitados a, péptidos pequeños o moléculas similares a péptidos, preferiblemente péptidos solubles, y los compuestos sintéticos, orgánicos o inorgánicos no peptidílicos. Las ribozimas son moléculas de ARN enzimáticas capaces de catalizar la escisión específica del ARN. Las ribozimas actúan mediante la hibridización específica de la secuencia al ARN objetivo complementario, seguido por la escisión endonucleolítica. Los sitios específicos de escisión de la ribozima dentro del objetivo del ARN potencial se pueden identificar mediante técnicas conocidas. Para detalles adicionales ver, por ejemplo, Rossi, Current Bioloqy, 4:469-471 (1994), y la publicación PCT No. WO 97/33551 (publicada el 18 de Septiembre de 1997) . Las moléculas de ácido nucleico en la formación de triple hélice utilizadas para inhibir la transcripción deberán ser de hebra simple o compuestas de desoxinucleótidos . La composición base de estos oligonucleótidos se designa de tal manera que se promueva la formación de triple hélice vía las reglas de apareamiento de bases de Hoogsteen, lo cual generalmente requiere de elasticidades considerables de purinas o pirimidinas en una sola hebra de un dúplex. Para más detalles ver, por ejemplo, la publicación PCT No. WO 97/33551, supra . Estas moléculas pequeñas se pueden identificar mediante cualquiera o más de los ensayos de selección descritos anteriormente y/o mediante cualquier otra técnica de selección bien conocida por aquellos hábiles en el arte. Los polipéptidos PR0241 de la presente invención los cuales poseen actividad biológica relaciona con aquélla de la proteína biglicano endógena se pueden emplear tanto in vivo para propósitos terapéuticos como in vi tro . Aquellos con habilidades ordinarias en la técnica sabrán bien cómo emplear los polipéptidos PR0241 de la presente invención para tales propósitos. La cordina es un gen candidato para un síndrome de dismorfia conocido como Síndrome de Cornelia de Lange (CDL) el cual se caracteriza por características faciales distintivas (líneas del pelo anterior baja, sinofris, orificios nasales revirados, prognatismo maxilar, filtrum largo, boca en forma de "carpa"), el retardo en el crecimiento prenatal y postnatal, retardo mental y, a menudo pero no siempre, anormalidades en los miembros superiores. Hay también casos raros en donde el CDL está presente en asociación con la trombocitopenia. El gen para el CDL se ha podido conformar en forma de mapa mediante el enlace al 3q26.3 (OMIM #124470). El involucramiento del Xchd en la formación del patrón de Xenopus temprano y el desarrollo del sistema nervioso hace que el CHD sea un gen candidato intrigante. El CHD forma mapas en la región apropiada del cromosoma 3. Está muy cercano al THPO, y las eliminaciones engloban tanto al THPO como al CHD lo cual daría como resultado casos raros de trombocitopenia y anormalidades en el desarrollo. El análisis in situ del CD reveló que casi todos los tejidos de adultos son negativos para la expresión del CHD, la única señal positiva se observó en la línea de escisión de la articulación sinovial en desarrollo que se forma entre la cabeza femoral y el acetabulum (articulación de la cadera) que implica al CHD en el desarrollo y presumiblemente en el crecimiento de los huesos largos. Tal función, si se rompe, podría dar como resultado retardo en el crecimiento. La secuencia de aminoácidos del CHD humano, predichos a partir del ADNc es 50% idéntica (y 66% conservada) al Xchd. Todas las 40 cisteínas en los dominios ricos en 4 cisteínas se conservaron. Estos dominios ricos en cisteína son similares a aquéllos observados en la trombospondina, el procolágeno y el factor de von Willebrand. Bornstein, P. FASEB J 6: 3290-3299 (1992); Hunt, L. & Barker, W. Biochem . Biophys . Res . Commun . 144: 876-882 (1987). El lugar del CHD humano (PR0243 genómico) comprende 23 exones en 9.6 kb del ADN genómico. La metionina de iniciación está en el exon 1 y el codon de detención en el exon 23. La isla de CpG está localizada en el extremo 5' y del gen, que inicia aproximadamente 100 bp de 5' del exon 1 y se extiende a través del primer exon y termina dentro del primer intrón. Los lugares de THPO y CHD están organizados en una forma cabeza con cabeza con aproximadamente 2.2 kb de separación en sus sitios de inicio de transcripción. Al nivel de la proteína, el PR0243 es 51% idéntico a la cordina de Xenopus (Xchd) . Se conservan todas las cuarenta cisteínas en los amontonamientos ricos en cisteína uno amino terminal y tres carboxi terminal. El PR0243 es un polipéptido de 954 aminoácidos que tiene una secuencia de señal en los residuos 1 a aproximadamente 23. Hay 4 amontonamientos de cisteína: (1) los residuos de manera aproximada desde 51 hasta aproximadamente 125; (2) los residuos de manera aproximada desde 705 hasta aproximadamente 761; (3) los residuos de manera aproximada desde 784 hasta aproximadamente 849; y (4) los residuos de manera aproximada desde 897 hasta aproximadamente 931. Hay cerraduras de leucina potenciales en los residuos de manera aproximada desde 315 hasta aproximadamente 396, y sitios de N-glicosilación 217, 351, 351, 365 y 434. Los polipéptidos PR0299 y las porciones de los mismos que tienen homología a la proteína notch pueden ser útiles para propósitos terapéuticos in vivo, así como para varias otras aplicaciones. La identificación de nuevas proteínas notch y moléculas relacionadas pueden ser relevantes para un número de padecimientos humanos tales como aquéllos que afectan el desarrollo. Así, la identificación de nuevas proteínas notch y moléculas similares al notch es de especial importancia en que tales proteínas pueden servir como terapéuticos potenciales para una variedad de diferentes padecimientos humanos. Tales polipéptidos pueden jugar también papeles importantes en la investigación biotecnológica y médica así como en varias aplicaciones industriales. Como resultado, hay un interés científico y médico particular en nuevas moléculas, tales como PR0299.

Los polipéptidos PR0323 de la presente invención los cuales poseen actividad biológica relaciona con aquélla de una o más proteínas de dipeptidasa endógenas se pueden emplear tanto in vivo para propósitos terapéuticos como in vi tro. Aquellos con habilidades ordinarias en la técnica sabrán bien cómo emplear los polipéptidos PR0323 de la presente invención para tales propósitos. Los polipéptidos PR0327 de la presente invención los cuales poseen actividad biológica relaciona con aquélla de la proteína receptora de prolactina endógena se pueden emplear tanto in vivo para propósitos terapéuticos como in vi tro . Aquellos con habilidades ordinarias en la técnica sabrán bien cómo emplear los polipéptidos PR0327 de la presente invención para tales propósitos. Los polipéptidos PR0327 que poseen la capacidad de enlazarse a la prolactina pueden funcionar tanto in vi tro como in vivo como antagonistas de la prolactina. Los polipéptidos PR0233 y las porciones de los mismos que tienen homología a la reductasa también pueden ser útiles para propósitos terapéuticos in vivo, así como para varias otras aplicaciones. La identificación de nuevas proteínas de reductasa y moléculas relacionadas pueden ser relevantes para un número de padecimientos humanos tales como el padecimiento inflamatorio, la falla de los órganos, aterosclerosis, daño cardiaco, infertilidad, defectos de nacimiento, envejecimiento prematuro, SIDA, cáncer, complicaciones diabéticas y mutaciones en general. Dado que los radicales libres de oxígeno y los antioxidantes parecen jugar papeles importantes en un número de procesos de padecimientos, la identificación de nuevas proteínas de reductasa y las moléculas similares a la reductasa es de especial importancia en que tales proteínas pueden servir como terapéuticos potenciales para una variedad de diferentes padecimientos humanos. Tales polipéptidos pueden jugar también papeles importantes en la investigación biotecnológica y médica así como en varias aplicaciones industriales. Como resultado, hay un interés científico y médico particular en nuevas moléculas, tales como PR0233. Los polipéptidos PR0344 y las porciones de los mismos que tienen homología a las proteínas complementarias también pueden ser útiles para propósitos terapéuticos in vivo, así como para varias otras aplicaciones. La identificación de nuevas proteínas complementarias y moléculas relacionadas pueden ser relevantes para un número de padecimientos humanos tales como el efecto de la respuesta inflamatoria de las células del sistema inmune. Así, la identificación de nuevas proteínas complementarias y moléculas similares a las complementarias es de especial importancia en que tales proteínas pueden servir como terapéuticos potenciales para una variedad de diferentes padecimientos humanos. Tales polipéptidos pueden jugar también papeles importantes en la investigación biotecnológica y médica así como en varias aplicaciones industriales. Como resultado, hay un interés científico y médico particular en nuevas moléculas, tales como PR0344. Los polipéptidos PR0347 de la presente invención los cuales poseen actividad biológica relacionada con aquélla de las proteínas secretorias ricas en cisteína se pueden emplear tanto in vivo para propósitos terapéuticos como in vi tro . Aquéllos con habilidades ordinarias en la técnica sabrán bien cómo emplear los polipéptidos PR0347 de la presente invención para tales propósitos. Los polipéptidos PR0354 de la presente invención los cuales poseen actividad biológica relacionada con aquélla de la cadena pesada de la proteína inhibidora inter-alfa-tripsina se pueden emplear tanto in vivo para propósitos terapéuticos como in vi tro . Aquéllos con habilidades ordinarias en la técnica sabrán bien cómo emplear los polipéptidos PR0354 de la presente invención para tales propósitos . Los polipéptidos PR0355 y las porciones de los mismos que tienen homología al CRTAM también pueden ser útiles para propósitos terapéuticos in vivo, así como para varias otras aplicaciones. La identificación de nuevas moléculas asociadas con las células T pueden ser relevantes para un número de padecimientos humanos tales como las condiciones que involucran el sistema inmune en general. Dado que la proteína CRTAM se enlaza a los anticuerpos los cuales juegan papeles importantes en un número de procesos de padecimientos, la identificación de nuevas proteínas CRTAM y moléculas similares a CRTAM es de especial importancia en que tales proteínas pueden servir como terapéuticos potenciales para una variedad de diferentes padecimientos humanos. Tales polipéptidos pueden jugar también papeles importantes en la investigación biotecnológica y médica así como en varias aplicaciones industriales. Como resultado, hay un interés científico y médico particular en nuevas moléculas, tales como PR0355. El PR0357 se puede utilizar en ensayos de enlace competitivos con ALS para determinar su actividad con respecto al ALS. Además, la PR0357 se puede utilizar en ensayos para determinar si prolonga los polipéptidos los cuales pueden formar complejos que tengan vidas medias más largas in vivo. La PR0357 se puede utilizar de manera similar en ensayos con carboxipeptidasas, a las cuales también tienen homología. Los resultados se pueden aplicar de acuerdo a esto. Los polipéptidos PR0715 de la presente invención los cuales poseen actividad biológica relacionada con aquélla de la familia del factor de necrosis del tumor de las proteínas, se pueden emplear tanto in vivo para propósitos terapéuticos como in vi tro. Aquéllos con habilidades ordinarias en la técnica sabrán bien cómo emplear los polipéptidos PR0715 de la presente invención para tales propósitos. Se esperará que los polipéptidos PR0715 se enlacen a sus receptores específicos, activando así tales receptores. Las variantes de los polipéptidos PR0715 de la presente invención pueden funcionar como agonistas o antagonistas de su actividad del receptor específico. Los polipéptidos PR0353 y las porciones de los mismos que tienen homología a la proteína complementaria también pueden ser útiles para propósitos terapéuticos in vivo, así como para varias otras aplicaciones. La identificación de nuevas proteínas complementarias y moléculas relacionadas pueden ser relevantes para un número de padecimientos humanos tales como el efecto de la respuesta inflamatoria de las células del sistema inmune. Así, la identificación de nuevas proteínas complementarias o moléculas similares a las complementarias es de especial importancia en que tales proteínas pueden servir como terapéuticos potenciales para una variedad de diferentes padecimientos humanos. Tales polipéptidos pueden jugar también papeles importantes en la investigación biotecnológica y médica así como en varias aplicaciones industriales. Como resultado, hay un interés científico y médico particular en nuevas moléculas, tales como PR0353. Los polipéptidos PR0361 y las porciones de los mismos que tienen homología a las proteínas de mucina y/o quitinasa también pueden ser útiles para propósitos terapéuticos in vivo, así como para varias otras aplicaciones. La identificación de nuevas proteínas de mucina y/o quitinasa y moléculas relacionadas pueden ser relevantes para un número de padecimientos humanos tales como el cáncer o aquéllos que involucran las moléculas de superficie celular o los receptores. Así, la identificación de nuevas proteínas de mucina y/o quitinasa es de especial importancia en que tales proteínas pueden servir como terapéuticos potenciales para una variedad de diferentes padecimientos humanos. Tales polipéptidos pueden jugar también papeles importantes en la investigación biotecnológica y médica así como en varias aplicaciones industriales. Como resultado, hay un interés científico y médico particular en nuevas moléculas, tales como PR0361. Los polipéptidos PR0365 y las porciones de los mismos que tienen homología a la proteína humana 2-19 también pueden ser útiles para propósitos terapéuticos in vivo, así como para varias otras aplicaciones. La identificación de nuevas proteínas humanas 2-19 y moléculas relacionadas pueden ser relevantes para un número de padecimientos humanos tales como la modulación del enlace o actividad de las células del sistema inmune. Así, la identificación de nuevas proteínas humanas 2-19 y moléculas similares a las proteínas humanas 2-19 es de especial importancia en que tales proteínas pueden servir como terapéuticos potenciales para una variedad de diferentes padecimientos humanos. Tales polipéptidos pueden jugar también papeles importantes en la investigación biotecnológica y médica así como en varias aplicaciones industriales. Como resultado, hay un interés científico y médico particular en nuevas moléculas, tales como PR0365.

**«*"*»-* * F. Anticuerpos Anti-PRO La presente invención además proporciona los anticuerpos anti-PRO. Los anticuerpos ejemplares incluyen anticuerpos policlonales, monoclonales, humanizados, biespecíficos y heteroconjugados. 1. Anticuerpos Policlonales Los anticuerpos anti-PRO pueden comprender los anticuerpos policlonales. Los métodos para preparar anticuerpos policlonales son bien conocidos por los técnicos con habilidades en la técnica. Los anticuerpos policlonales se pueden generar en mamíferos, por ejemplo, mediante una o más inyecciones de un agente inmunizante y, si se desea, un adyuvante. Típicamente, el agente inmunizante y/o se inyectarán en el mamífero mediante inyecciones subcutáneas o intraperitoneales múltiples. El agente inmunizante puede incluir el polipéptido PRO o una proteína de fusión del mismo. Puede ser útil conjugar el agente inmunizante a una proteína conocida que va ser inmunogénica en el mamífero que va a ser inmunizado. Los ejemplos de tales proteínas inmunogénicas incluyen pero no están limitadas a hemocianina del limpet clave, albúmina de suero, tiroglobulina de bovino, e inhibidor de tripsina de soya. Los ejemplos de adyuvantes que pueden ser empleados incluyen el adyuvante completo de Freund y el adyuvante de MPL-TDM (monofosforil Lípido A, dicorinomicolato de trehalosa sintético) . El protocolo de inmunización se puede seleccionar por alguien con habilidades en la técnica sin experimentación indebida. 2. Anticuerpos Monoclonales Los anticuerpos anti-PRO pueden, alternativamente, ser anticuerpos monoclonales. Los anticuerpos monoclonales se pueden preparar utilizando métodos de hibridoma, tales como aquéllos descritos por Kohler y Milstein, Nature, 256 : 495 (1975). En un método de hibridoma, un ratón, hámster, u otro animal huésped apropiado, se inmuniza típicamente con un agente inmunizante para generar linfocitos que produzcan o sean capaces de producir anticuerpos que se enlacen específicamente al agente inmunizante. Alternativamente, los linfocitos se pueden inmunizar in vi tro . El agente inmunizante típicamente incluirá el polipéptido PRO de interés o una proteína de fusión del mismo. En general, se utilizan ya sea linfocitos de sangre periférica ("PBLs") si se desean células de origen humano, o células del bazo o células del nodo linfático si se desean fuentes de mamíferos no humanos. Los linfocitos se fusionan entonces con una línea celular inmortalizada utilizando un agente de fusión adecuado, tal como el polietilenglicol, para formar una célula de hibridoma [Goding, Monoclonal Antibodies: Principies and Practice, Academic Press, (1986) pp. 59-103] . Las líneas celulares inmortalizadas son usualmente células de mamífero transformadas, particularmente células de mieloma de roedor, bovino y de origen humano. Usualmente, se emplean líneas celulares de mieloma de ratón o de rata. Las células de hibridoma se pueden cultivar en un medio de cultivo que contiene preferiblemente una o más substancias que inhiben el crecimiento o sobrevivencia de las células inmortalizadas, no fusionadas. Por ejemplo, si las células parentales carecen de la hipoxantina guanina fosforibosil transferasa de la enzima (HGPRT ó HPRT) , el medio de cultivo para los hibridomas típicamente incluirá la hipoxantina, aminopterina, y timidina ("medio HAT"), cuyas substancias evitan el crecimiento de las células deficientes en HGPRT. Las líneas celulares inmortalizadas preferidas son aquéllas que se fusionan eficientemente, y soportan expresiones de niveles altos estables del anticuerpo mediante las células que producen anticuerpos seleccionados, y son sensibles a un medio tal como el medio HAT. Las líneas celulares inmortalizadas más preferidas son las líneas de mieloma de murino, que se pueden obtener, por ejemplo, del Salk Institute Cell Distribution Center, San Diego, California y del American Type Culture Collection, Manassas Virginia. También se describen las líneas celulares del 5 heteromieloma de ratón-humano y mieloma de humano para la producción de anticuerpos monoclonales de humano [Kozbor, J. Immunol. , 133:3001 (1984); Brodeur et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, Marcel Dekker, Inc., New York, (1987) pp . 51-63]. 10 El medio de cultivo en el cual se cultivan las células de hibridoma se puede ensayar para la presencia de anticuerpos monoclonales dirigidos contra el PRO. Preferiblemente, la especificidad de enlace de los anticuerpos monoclonales producida por las células de hibridoma se determina mediante inmunoprecipitación o mediante un ensayo de enlace in vi tro, tal como el radioinmunoensayo (RÍA) o el ensayo inmunoabsorbente de enlace a la enzima (ELISA) . Tales técnicas y ensayos son conocidos en el arte. La afinidad de enlace del anticuerpo monoclonal puede, por ejemplo, determinarse mediante el análisis Scatchard de Munson y Pollard, Anal. Biochem. , 107:220 (1980) . Después de que se identifican las células de -ri-rt-i-M-H-fa-i-M- hibridoma deseadas, los clones se pueden subclonar mediante procedimientos de dilución limitantes y crecimiento mediante métodos estándar [Goding, supra] . El medio de cultivo adecuado para este propósito incluye, por ejemplo, el Medio de Eagle Modificado con Dulbecco y el medio RPMI-1640. Alternativamente, las células de hibridoma se pueden hacer crecer in vivo como ascitos en un mamífero. Los anticuerpos monoclonales secretados por los subclones se pueden aislar o purificar a partir del medio de cultivo o el fluido de los ascitos mediante los procedimientos de purificación de inmunoglobulina convencionales tales como, por ejemplo, la cromatografía de A-Sepharose, hidroxilapatita, electrofóresis en gel, diálisis, o cromatografía por afinidad. Los anticuerpos monoclonales también se pueden hacer mediante métodos de ADN recombinantes, tales como aquéllos descritos en la Patente Norteamericana No. 4,816,567. El ADN que codifica los anticuerpos monoclonales de la invención se puede aislar fácilmente y secuenciar utilizando procedimientos convencionales (por ejemplo, utilizando sondas de oligonucleótidos que son capaces de enlazarse específicamente a genes que codifican a las cadenas pesada y ligera de los anticuerpos murinos) . Las células de hibridoma de la invención sirven como una fuente preferida de tal ADN. Una vez aislado, el ADN se puede colocar en los vectores de expresión, los cuales se transfectan entonces en las células hospedera tales como las células COS de simio, las células de ovario de hámster chino (CHO) , o las células de mieloma que no producen de otra manera proteínas inmunoglobulinas, para obtener la síntesis de los anticuerpos monoclonales en las células hospederas recombinantes. El ADN también se puede modificar, por ejemplo, mediante la substitución de la secuencia de codificación para los dominios constantes de cadenas pesadas y ligeras humanas en lugar de las secuencias murinas homologas [Patente Norteamericana No. 4,816,467; Morrison et al., supra] o mediante la unión covalente a la secuencia de codificación de la inmunoglobulina todo o parte de la secuencia de codificación para un polipéptido que no es de inmunoglobulina. Tal polipéptido que no es de inmunoglobulina se puede substituir por los dominios constantes de un anticuerpo de la invención, o se puede substituir por los dominios variables de un sitio de combinación del antígeno de un anticuerpo de la invención para crear un anticuerpo bivalente quimérico. Los anticuerpos pueden ser anticuerpos monovalentes. Los métodos para preparar anticuerpos monovalentes son bien conocidos en la técnica. Por ejemplo, un método involucra la expresión recombinante de cadenas pesadas modificadas y cadenas ligeras de inmunoglobulina. La cadena pesada está truncada generalmente en cualquier punto en la región Fc para evitar la reticulación o enlace cruzado de la cadena pesada. Alternativamente, los residuos de cisteína relevantes se substituyen con otro residuo de aminoácido o son eliminadas para evitar el enlace cruzado. Los métodos in vi tro también son adecuados para la preparación de anticuerpos monovalentes. La digestión de los anticuerpos produce fragmentos del mismo, particularmente, fragmentos Fab, los cuales se pueden complementar utilizando técnicas de rutina conocidas en la técnica. 3. Anticuerpos Humanos y Humanizados Los anticuerpos anti-PRO de la invención pueden además comprender anticuerpos humanizados o anticuerpos de humanos. Las formas humanizadas de los anticuerpos no humanos (por ejemplo, murino) son inmunoglobulinas quiméricas, cadenas de inmunoglobulinas o fragmentos del mismo (tal como Fv, Fab, Fab', F(ab')2 u otras subsecuencias de enlace al antígeno de los anticuerpos) los cuales contienen la secuencia mínima derivada de la inmunoglobulina no humana. Los anticuerpos humanizados incluyen inmunoglobulinas humanas (anticuerpo recipiente) en el cual los residuos de una región determinante complementaria (CDR) del recipiente se reemplazan por residuos de un CDR de una especie no humana (anticuerpo donador) tal como el ratón, rata o conejo que tienen la especificidad, afinidad y capacidad deseadas. En algunos casos, los residuos de la estructura Fv de la inmunoglobulina humana se reemplazan por los residuos no humanos correspondientes. Los anticuerpos humanizados también pueden comprender residuos que no se encuentran ni en el anticuerpo recipiente ni en el CDR importado ni en las secuencias de la estructura. En general, el anticuerpo humanizado comprenderá substancialmente todos o al menos uno, y típicamente dos, dominios de variable, en las cuales todo o substancialmente todas las regiones CDR corresponden a aquéllas de una inmunoglobulina no humana y todas o substancialmente todas de las regiones FR de una secuencia de consenso de inmunoglobulina humana. El anticuerpo humanizado óptimamente comprenderá al menos una porción de una región constante de inmunoglobulina (Fc), típicamente aquélla de una inmunoglobulina humana [Jones et al., Nature, 321: 522-525 (1986); Riechmann et al., Nature, 332:323-329 (1988); y Presta, Curr. Op. Struct. Biol., 2:593-596 (1992)].

Los métodos para la humanización de anticuerpos no humanos son bien conocidos en la técnica. Generalmente, un anticuerpo humanizado tiene uno o más residuos de aminoácidos introducidos en el mismo a partir de una fuente que es no humana. Estos residuos de aminoácidos no humanos a menudo se refieren como residuos "importados", los cuales se toman típicamente de un dominio de variable "importado". La humanización se puede realizar esencialmente siguiendo el método de Winter y colaboradores [Jones et al., Nature, 321:522-525 (1986); Riechmann et al., Nature, 332:323-329 (1988); Verhoeyen et al., Science, 239:1534-1536 (1988)], substituyendo las secuencias CDR ó CDRs del roedor por las secuencias correspondientes de un anticuerpo humano. De acuerdo con esto, tales anticuerpos "humanizados" son anticuerpos quiméricos (Patente Norteamericana No. 4,816,567), en donde substancialmente menos de un dominio de variable humana, intacto, se ha substituido por la secuencia correspondiente de una especie no humana. En la práctica, los anticuerpos humanizados, son típicamente los anticuerpos humanos en los cuales algunos residuos CDR y posiblemente algunos residuos FR sen substituidos por residuos de sitios análogos en los anticuerpos de roedores. Los anticuerpos humanos también se pueden producir utilizando varias técnicas conocidas en el arte, que incluyen las bibliotecas de muestra del fago [Hoogenboom y Winter, J. Mol. Biol., 22_7:381 (1991); Marks et al., J. Mol. Biol. , 222:581 (1991)]. Las técnicas de Colé et al., y Boerner et al., también están disponibles para la preparación de anticuerpos monoclonales humanos [Colé et al., Monoclonal Antibodies and Cáncer Therapy, Alan R. Liss, p. 77 (1985) y Boerner et al., J. Immunol., 147 (1) :86-95 (1991)]. De manera similar, los anticuerpos humanos se pueden hacer introduciendo el lugar de la inmunoglobulina humana en los animales transgénicos, por ejemplo, ratones en los cuales los genes de inmunoglobulina endógenos se han inactivado parcial o completamente. Durante el desafío, se observó la producción de anticuerpos humanos, la cual se asemeja cercanamente a aquélla observada en los humanos en todas las estimaciones, incluyendo la reestructuración de genes, montaje, y repertorio de anticuerpos. Este alcance se describe, por ejemplo, en las Patentes Norteamericanas Nos. 5,545,807; 5,545,806; 5,625,126; 5,633,425; 5,661,016, y en las siguientes publicaciones científicas: Marks et al., Bio/Technology 10, 779-783 (1992); Lonberg et al., Nature 368 856-859 (1994); Morrison, Nature 368, 812-13 (1994); Fishwild et al., Nature Biotechnology 14, 845-51 (1996); Neuberger, Nature Biotechnology 14, 826 (1996); Lonberg y Huszar, Intern. Rev. Immunol . 13 65-93 (1995) . 4. Anticuerpos Biespecíficos Los anticuerpos biespecíficos son anticuerpos monoclonales, humanizados o preferiblemente humanos, que tienen especificidades de enlace para al menos dos antígenos diferentes. En el presente caso, una de las especificidades de enlace es para el PRO, la otra es una para cualquier otro antígeno, y preferiblemente para una proteína de superficie celular o receptor o subunidad de receptor. Los métodos para preparar anticuerpos biespecíficos son bien conocidos en la técnica. Tradicionalmente, la producción recombinante de anticuerpos biespecíficos se basa en la co-expresión de dos pares de inmunoglobulinas de cadena pesada/cadena ligera, en donde las dos cadenas pesadas tienen diferentes especificidades [Milstein y Cuello, Nature, 305:537-539 (1983)]. Debido a la clasificación aleatoria de las cadenas pesadas y ligeras de la inmunoglobulina, estos hibridomas (cuadromas) producen una mezcla potencial de diez diferentes- moléculas de anticuerpos, de las cuales solamente una tiene la estructura biespecífica correcta. La purificación de la molécula correcta se realiza usualmente mediante las etapas de cromatografía por afinidad. Los procedimientos similares se describen en WO 93/08829, publicada el 13 de Mayo de 1993, y en Traunecker et al., EMBO J. , 10:3655-3659 (1991). Los dominios de variables de anticuerpos con las especificidades de enlace deseadas (sitios de combinación anticuerpo-antígeno) se pueden fusionar a secuencias de dominio constantes de inmunoglobulina. La fusión preferiblemente es con un dominio constante de cadena pesada de inmunoglobulina, que comprende al menos parte de las regiones de articulación, CH2 y CH3. Se prefiere tener la primera región constante de cadena pesada (CH1) que contenga el sitio necesario para el presente enlace de cadena ligera en al menos una de las fusiones. Los ADNs que codifican las fusiones de cadena pesada de inmunoglobulina y, si se desea, las cadenas ligeras de inmunoglobulina, se insertan en vectores de expresión separados, y se co-transfectan en un organismo huésped adecuado. Para detalles adicionales de la generación de anticuerpos biespecíficos ver, por ejemplo, Suresh et al . , Methods in Enzymoloqy, 1 1:210 (1986). De acuerdo con otro método descrito en WO 96/27011, la interfaz entre un par de moléculas de anticuerpos se puede manejar por ingeniería genética para maximizar el porcentaje de heterodímeros que se recuperaron del cultivo celular recombinante. La interfaz preferida- comprende al menos una parte de la región CH3 de un dominio constante del anticuerpo. En este método, una o más cadenas laterales de aminoácidos, pequeñas, de la interface de la primer molécula del anticuerpo se reemplazan con las cadenas laterales más largas (por ejemplo, tirosina o triptofano) . Las "cavidades" compensadoras de tamaño similar o idéntico se crearon para la cadena o cadenas laterales largas, en la interface de la segunda molécula del anticuerpo reemplazando las cadenas laterales de aminoácidos largas con otras más pequeñas (por ejemplo alanina o treonina) . Esto proporciona un mecanismo para incrementar el rendimiento del heterodímero sobre otros productos terminales no deseados tales como los homodímeros. Los anticuerpos biespecíficos se pueden preparar como anticuerpos de longitud completa o fragmentos de anticuerpos (por ejemplo anticuerpos biespecíficos F(ab')2). Las técnicas para generar anticuerpos biespecíficos a partir de fragmentos de anticuerpos se han descrito en la literatura. Por ejemplo, los anticuerpos biespecíficos se pueden preparar utilizando un enlace químico. Brennan et al . , Science 229:81 (1985) describe un procedimiento en donde los anticuerpos intactos se escinden proteolíticamente para generar los fragmentos F(ab')2. Estos fragmentos se reducen en la presencia de arsenita de sodio, el agente que forma complejos de ditiol para estabilizar los ditioles vecinos y prevenir la formación del disulfuro intermolecular. Los fragmentos Fab' generados se convierten entonces en derivados de tionitrobenzoato (TNB) . Uno de los derivados Fab' -TNB se reconvierte entonces al Fab' -tiol mediante la reducción con mercaptoetilamina y se mezcla con una cantidad equimolar del otro derivado Fab' -TNB para formar el anticuerpo biespecífico. Los anticuerpos biespecíficos producidos se pueden utilizar como agentes para la inmovilización selectiva de las enzimas. Los fragmentos Fab' se pueden recuperar directamente de la E. coli y acoparse químicamente para formar anticuerpos biespecíficos. Shalaby et al . , J. Exp. Med. 175:217-225 (1992) describe la producción de una molécula F(ab')2 del anticuerpo biespecífico humanizado completamente. Cada fragmento Fab' se secretada de manera separada a partir de la E. coli y se somete al acoplamiento químico in vi tro para formar el anticuerpo biespecífico. El anticuerpo biespecífico así formado es capaz de enlazarse a las células que sobreexpresan el receptor ErbB2 y las células T normales, así como también provoca la actividad violenta de los linfocitos citotóxicos humanos contra los objetivos del tumor de pecho humano. Se han descrito varias técnicas para hacer y aislar los fragmentos de anticuerpos biespecíficos directamente a partir del cultivo celular recombinante. Por ejemplo, los anticuerpos biespecíficos se han producido utilizando los cierres de leucina. Kostelny et al . , J. Immunol. 148 (5) : 1547-1553 (1992). Los péptidos del cierre de leucina de las proteínas Fos y Jun se enlazan a las porciones Fab' de dos diferentes anticuerpos mediante la fusión genética. Los homodímeros del anticuerpo se reducen a la región de articulación para formar los monómeros y luego se re-oxidan para formar los heterodímeros del anticuerpo. Este método también se puede utilizar para la producción de los heterodímeros del anticuerpo. La tecnología del "diacuerpo" descrita por Hollinger et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA 90:6444-6448 (1993) ha proporcionado un mecanismo alternativo para la construcción de los fragmentos del anticuerpo biespecífico. Los fragmentos comprenden un dominio variable de cadena pesada (VH) conectado al dominio variable de cadena ligera (V) mediante un enlazador que es demasiado corto para permitir el apareamiento entre los dos dominios en la misma cadena. De conformidad con esto, los dominios VH y VL de un fragmento se fuerzan a aparearse con los dominios VL y VH complementarios de otro fragmento, formando por lo tanto dos sitios de enlace al antígeno. Se ha reportado también otra estrategia para la construcción de fragmentos de anticuerpos biespecíficos mediante el uso de los dímeros Fv de cadena simple (sFv) . Ver, Gruber et al . , J. Immunol. 152:5368 (1994). Se contemplan los anticuerpos con más de dos valencias. Por ejemplo, se pueden preparar los anticuerpos triespecíficos. Tutt et al . , J. Immunol. 147:60 (1991). Los anticuerpos biespecíficos ejemplares se pueden enlazar a dos epítopes diferentes en un polipéptido PRO dado en la presente. Alternativamente, un brazo del polipéptido anti-PRO se puede combinar con un brazo que se enlaza a una molécula de activación en un leucocito tal como una molécula receptora de las células T (por ejemplo, CD2, CD3, CD28, ó B7), o los receptores Fc para IgG (Fc?R), tales como Fc?RI (CD64), Fc?RII (CD32) y Fc?RIII (CD16) en lo que se refiere a los mecanismos de defensa celular local para la célula que expresa el polipéptido PRO particular. Estos anticuerpos poseen el brazo de enlace al PRO y un brazo que se enlaza a un agente citotóxico o un quelador del radionúclido, tal como EOTUBE, DPTA, DOTA, o TETA. Otro anticuerpo biespecífico de interés se enlaza al polipéptido PRO y además se enlaza al factor de tejido (TF) . 5. Anticuerpos Heteroconjugados Los anticuerpos heteroconjugados están también dentro del alcance de la presente invención. Los anticuerpos heteroconjugados están compuestos de dos anticuerpos enlazados covalentemente. Tales anticuerpos, por ejemplo, han sido propuestos como objetivos de las células del sistema inmune a las células no deseadas [Patente Norteamericana No. 4,676,980], y para el tratamiento de la infección de VIH [WO 91/00360; WO 92/200373; EP 03089] . Se contempla que los anticuerpos se puedan preparar in vi tro utilizando métodos conocidos en la química de la proteína sintética, que incluye aquéllas que involucran agentes de reticulación. Por ejemplo, las inmunotoxinas se pueden construir utilizando una reacción de intercambio de disulfuro o por la formación de un enlace de tioéter. Los ejemplos de reactivos adecuados para este propósito incluyen iminotiolato y metil-4-mercaptobutirimidato y aquéllos descritos, por ejemplo, en la Patente Norteamericana No. 4,676,980. 6. Ingeniería Genética de la Función del Efector Es deseable modificar el anticuerpo de la invención on respecto a la función del efecto, para mejorar, por ejemplo, la efectividad del anticuerpo en el tratamiento del cáncer. Por ejemplo, el (los) residuo (s) de cisteína se pueden introducir en la región Fc, permitiendo por lo tanto la formación de enlace del disulfuro de inter-cadenas en esta región. El anticuerpo homodimérico así generado puede tener la capacidad de internalización mejorada y/o la muerte celular incrementada mediada por el complemento y la citotoxicidad celular dependiente del anticuerpo (ADCC) . Ver Carón et al . , J. Exp Med., 176: 1191-1195 (1992) y Shopes, J. Immunol., 148: 2918-2922 (1992) . Los anticuerpo homodiméricos con la actividad anti-tumor mejorada también se puede preparar utilizando los enlazadores cruzados heterobifuncionales descritos en Wolff et aJ. Cáncer Research, 53: 2560-2565 (1993) . Alternativamente, se puede diseñar mediante ingeniería genética un anticuerpo que tiene las regiones Fc duales y por consiguiente se puede mejorar la lisis del complemento y las capacidades ADCC. Ver Stevenson et al . , Anti-Cancer Drug Design, 3: 219-230 (1989) . 7. Inmunoconjugados La invención también corresponde a los inmunoconjugados que comprenden un anticuerpo conjugado a un agente citotóxico tal como un agente quimioterapéutico, toxina (por ejemplo una toxina enzimáticamente activa de origen bacteriano, fúngico, de plantas, o de origen animal, o fragmentos de los mismos) , o un isótopo radioactivo (es decir un radioconjugado) . Se han descrito anteriormente los agentes quimioterapéuticos útiles en la generación de tales inmunoconj ugados . Las toxinas enzimáticamente activas y los fragmentos de las mismas que se pueden utilizar incluyen la cadena de difteria A, los fragmentos activos no enlazados de la toxina de difteria, la cadena de la exotoxina A (de Pseudomonas aeruginosa ) , la cadena de ricina A, la cadena de abrina A, la cadena de modeccina A, alfa-sarcina, las proteínas Aleuri tes fordii, las proteínas diantina, las proteínas Phytolaca americana (PAPI, PAPII, y PAP-S) , el inhibidor de momordica charantia, curcina, crotina, inhibidor de sapaonaria officinalis, gelonina, mitogelina, restrictocina, fenomicina, enomicina, y los tricotecenos . Una variedad de radionúclidos están disponibles para la producción de los anticuerpos radioconjugados . Los ejemplos incluyen 212Bi, 131I, 131In, 90Y, y 186Re. Los conjugados del anticuerpo y el agente citotóxico se hacen utilizando una variedad de agentes de acoplamiento a la proteína tales como propionato de N-succinimidil-3- (2- piridilditiol) (SPDP), iminotiolano (IT), subproductos bifuncionales de los imidoésteres (tales como HCL de adipimidato de dimetilo) , esteres activos (tales como suberato de disuccinimidilo) , aldehidos (tales como glutaraldehído) , compuestos de bis-azido (tales como bis (p- azidobenzoilo) hexandiamina) , subproductos de bis-diazonio (tales como bis- (p-diazoniobenzoilo) -etilendiamina) , diisocianatos (tales como 2, 6-diisocianato de tolieno) , y los compuestos bis-activos de flúor (tales como 1,5-difluoro-2, 4-dinitrobenceno) . Por ejemplo, una inmunotoxina de ricino se puede preparar como se describe en Vitetta et al . , Science, 238: 1098 (1987). El ácido 1-isotiocianatobencil-3-metildietileno triaminopentaacético etiquetado con carbono 14 (MX-DTPA) es un agente quelatante ejemplar para la conjugación del radionúclido con el anticuerpo. Ver WO94/11026. En otra modalidad, el anticuerpo se puede conjugar con un "receptor" (tal como estreptavidina) para la utilización en el pre-objetivo del tumor en donde el conjugado del anticuerpo-receptor se administra al paciente, seguido por la eliminación de un conjugado no enlazado de la circulación utilizando un agente de clarificación y luego la administración del "ligando" (por ejemplo, avidina) que se conjuga con un agente citotóxico (por ejemplo, un radionucléotido) . 8. Inmunoliposomas Los anticuerpos descritos en la presente también se pueden formular como inmunoliposomas . Los liposomas que contienen el anticuerpo se preparan mediante los métodos conocidos en la técnica, tal como se describe en Epstein et al . , Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 82: 3688 (1985); Hwang et al . , Proc. Nati Acad. Sci. USA, 77: 4030 (1980); y las Patentes Norteamericanas Nos. 4,485,045 y 4,544,545. Los liposomas con un tiempo de circulación mejorado se describen en la Patente Norteamericana No. 5,013,556. Particularmente los liposomas útiles se pueden generar mediante el método de evaporación de fase inversa con una composición de lípido que comprende la fosfatidilcolina, colesterol, y la fosfatidiletanolamina derivada con PEG (PEG-PE) . Los liposomas se forzan a pasar a través de los filtros de tamaño de poro definido para producir los liposomas con el diámetro deseado. Los fragmentos Fab' del anticuerpo de la presente invención se puede conjugar con los liposomas como se describe en Martin et al . , J. Biol. Chem., 257: 286-288 (1982) vía una reacción de intercambio de disulfuro. Un agente quimioterapéutico (tal como Doxorubicina) está opcionalmente contenida dentro del liposoma. Ver Gabizon et al . , J. National Cáncer Inst., 81(19): 1484 (1989). 9. Composiciones Farmacéuticas de los Anticuerpos Los anticuerpos que se enlazan específicamente a un polipéptido PRO identificado en la presente invención, así como a otras moléculas identificadas por los ensayos de selección descritos antes en la presente, se pueden administrar para el tratamiento de varios padecimientos en la forma de composiciones farmacéuticas. Si el polipéptido PRO es intracelular y los anticuerpos completos se utilizan como inhibidores, se prefieren los anticuerpos de internalización. Sin embargo, las lipofecciones o liposomas también se pueden utilizar para suministrar el anticuerpo, o un fragmento de anticuerpo, en las células. Cuando se utilizan los fragmentos del anticuerpo, se prefiere el fragmento inhibidor más pequeño que se une específicamente al dominio de la proteína objetivo. Por ejemplo, en base a las secuencias de región variable de un anticuerpo, las moléculas del péptido se pueden diseñar para retener la capacidad de enlazarse a la secuencia de la proteína objetivo. Tales péptidos se pueden sintetizar químicamente y/o producirse mediante la tecnología del ADN recombinante. Ver, por ejemplo, Marasco et al . , Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 90: 7889-7893 (1993). La formulación en la presente también puede contener más de un compuesto activo que es necesario para la indicación particular que se va a tratar, preferiblemente aquéllas con actividades complementarias que no se afectan adversamente una a la otra. Alternativamente, o además, la composición puede comprender un agente que mejora su función, tal como, por ejemplo, un agente citotóxico, citocina, agente quimioterapéutico, agente inhibidor del crecimiento. Tales moléculas están presentes adecuadamente en combinación con cantidades que son efectivas para el propósito pretendido. Los ingredientes activos también se pueden atrapar en microcápsulas preparadas, por ejemplo, mediante técnicas de reunión de partículas o mediante la polimerización interfacial, por ejemplo, hidroximetilcelulosa o microcápsulas de gelatina y microcápsulas de poli- (metilmetacilato) , respectivamente, en sistemas de suministro de fármacos coloidales (por ejemplo, liposomas, microesferas de albúmina, microemulsiones, nano-partículas, y nanocápsulas) o en macroemulsiones . Tales técnicas se describen en Remington's Pharmaceutical Sciences, supra .

Las formulaciones que van a ser utilizadas para administración in vivo deben ser estériles. Esto se completa fácilmente mediante la filtración a través de las membranas de filtración estériles. Las preparaciones de liberación sostenida se pueden preparar. Los ejemplos adecuados de las preparaciones de liberación sostenida incluyen matrices semipermeables de los polímeros hidrofóbicos sólidos que contienen el anticuerpo, cuyas matrices están en la forma de artículos conformados, por ejemplo, películas, o microcápsulas. Los ejemplos de las matrices de liberación sostenida incluyen los poliésteres, hidrogeles (por ejemplo, el poli (2-hidroxietil-metacrilato) , o poli (vinilalcohol) ) , poliláctidas (Patente Norteamericana No. 3,773,919), copolímeros del ácido L-glutámico y ? etil-L-glutamato, acetato de etilenvinilo no degradable, los copolímeros del ácido glicólico-ácido láctico degradable tales como el LUPRON DEPOT™ (microesferas inyectables compuestas del copolímero de ácido láctico-ácido glicólico y el acetato de leuprolida) , y el ácido poli-D- (-) -3-hidroxibutírico. Mientras que los polímeros tales como el acetato de etilenvinilo y el ácido láctico-ácido glicólico son capaces de liberar las moléculas durante un período de 100 días, ciertos hidrogeles liberan proteínas durante tiempos más cortos. Cuando los anticuerpos encapsulados permanecen en el cuerpo durante un tiempo muy largo, los mismos pueden desnaturalizar o agregar como resultado de la exposición a la humedad a 37 °C, dando como resultado una pérdida de actividad biológica y los posibles cambios en la inmunogenicidad. Las estrategias racionales se pueden idear para la estabilización dependiendo del mecanismo implicado. Por ejemplo, si se descubre que el mecanismo de agregación es una formación de enlace S-S intermolecular a través del intercambio de tio-disulfuro, se puede lograr la estabilización modificando los residuos de sulfhidrilo, liofilizando a partir de las soluciones acidas, controlando el contenido de humedad, utilizando los aditivos apropiados, y desarrollando composiciones de matriz del polímero específico. G. Usos para los Anticuerpos anti-PRO Los anticuerpos anti-PRO de la invención tienen varias utilidades. Por ejemplo, los anticuerpos anti-PRO se pueden utilizar en ensayos de diagnóstico para un PRO, por ejemplo, para la detección de su expresión en células específicas, tejidos, o suero. Varias técnicas de ensayo de diagnóstico conocidas en la técnica se pueden utilizar, tales como ensayos de enlace competitivos, ensayos de emparedado directos o indirectos y ensayos de inmunoprecipitación conducidos en ya sea fases heterogéneas u homogéneas [Zola, Monoclonal Antibodies: A Manual of Techniques, CRC Press, Inc. (1987) pp. 147-158]. Los anticuerpos utilizados en los ensayos de diagnóstico se pueden etiquetar con una porción detectable. La porción detectable deberá ser capaz de producir, ya sea directa o indirectamente, una señal detectable. Por ejemplo, la porción detectable puede ser un radioisótopo, tal como H, 14C, 32P, 35S, ó I25I, un compuesto fluorescente o quimioluminiscente, tal como isotiocianato de fluoresceina, rodamina, o luciferina, o una enzima, tal como fosfatasa alcalina, beta-galactosidasa o peroxidasa de rábano. Se puede emplear cualquier método conocido en la técnica para conjugar el anticuerpo con la porción detectable, incluyendo aquellos métodos descritos por Hunter et al., Nature, 144:945 (1962); David et al., Biochemistry, 13:1014 (1974); Pain et al., J. Immunol. Meth., 4_0:219 (1981); y Nygren, J. Histochem. and Cytochem. , 30:407 (1982). Los anticuerpos anti-PRO son también útiles para la purificación por afinidad del PRO a partir del cultivo de células recombinantes o fuentes naturales. En este proceso, los anticuerpos contra el PRO se inmovilizan en un soporte adecuado, tal como una resina Sephadex o papel filtro, utilizando métodos bien conocidos en la técnica. El anticuerpo inmovilizado se pone en contacto entonces con una muestra que contiene el PRO que va a ser purificado, y posteriormente el soporte se lava con un solvente adecuado que eliminará substancialmente todo el material en la muestra excepto el PRO, el cual se enlaza al anticuerpo inmovilizado. Finalmente, el soporte se lava con otro solvente adecuado que liberará al PRO del anticuerpo. Los siguientes ejemplos se ofrecen con propósitos ilustrativos solamente, y no intentan limitar el alcance de la presente invención de ninguna manera. Todas las patentes y referencias de la literatura citadas en la presente especificación están incorporadas aquí como referencia en su totalidad. EJEMPLOS Los reactivos comercialmente disponibles referidos en los ejemplos fueron utilizados de acuerdo a las instrucciones del fabricante a menos que se indique de otra manera. La fuente de aquellas células identificadas en los siguientes ejemplos, y a través de toda la específicamente, mediante los números de acceso ATCC es la Colección de Cultivos Tipo Americano, Rockville, Maryland.

EJEMPLO 1 : Selección o Separación de la Homología del Dominio Extracelular para Identificar los Nuevos Polipéptidos y el ADNc que Codifica para el Mismo Las secuencias del dominio extracelular (ECD) (que incluyen la secuencia de la señal de secreción, si es que la hay) desde aproximadamente 950 proteínas secretadas conocidas desde la base de datos pública Swiss-Prot se utilizaron para buscar las bases de datos EST. Las bases de datos EST incluyen bases de datos públicos (por ejemplo, Dayhoff, GenBank) , y bases de datos particulares (por ejemplo LIFESEQ™, Incyte Pharmaceuticals, Palo Alto, CA) . La búsqueda fue realizada utilizando el programa de computadora BLAST ó BLAST2 (Altschul, y Gish, Methods in Enzymoloqy 266: 460-80 (1996); http: //blast . wustl/edu/blast/README. html) como una comparación de las secuencias de la proteína ECD a una traducción de la estructura 6 de las secuencias EST. Aquellas comparaciones con el registro Blast de 70 (o en algunos casos 90) o mayores que no codificaron proteínas conocidas fueron amontonadas y ensambladas en las secuencias de ADN de consenso con el programa "phrap" (Phil Green, University of Washington, Seattle, WA) . Utilizando esta homología del dominio extracelular, se ensamblaron las secuencias del ADN del consenso en relación a otras secuencias EST identificadas. Además, las secuencias del ADN del consenso fueron a menudo (pero no siempre) extendidas utilizando ciclos repetidos de BLAST y phrap para extender la secuencia del consenso tanto como fuera posible utilizando las fuentes de las secuencias EST descritas anteriormente. En base a las secuencias de consenso obtenidas como se describe arriba, los oligonucleótidos se sintetizaron y se utilizaron para identificar mediante PCR una biblioteca de ADNc que contenía la secuencia de interés y para usarse como sondas para aislar un clon de la secuencia de codificación de longitud completa para un polipéptido PRO. Los cebadores de PCR hacia delante y hacia atrás o inverso en general van desde 20 a 30 nucleótidos y a menudo están diseñados para dar un producto de PCR de aproximadamente 100-1000 bp de longitud. Las secuencias de la sonda son típicamente de 40-55 bp de longitud. En algunos casos, los oligonucleótidos adicionales se sintetizan cuando la secuencia de consenso es mayor de aproximadamente 1-1.5 kbp. Para seleccionar varias bibliotecas para un clon de longitud completa, se seleccionó el ADN de las bibliotecas mediante la amplificación con PCR, como por Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, con el par cebador de PCR. Una biblioteca positiva se utilizó entonces para aislar los clones que codifican al gen de interés utilizando el oligonucleótido de la sonda y uno de los pares cebadores. Las bibliotecas ADNc utilizadas para aislar los clones ADNc se construyeron mediante métodos estándar utilizando reactivos comercialmente disponibles tales como aquéllos de Invitrogen, San Diego, CA. El ADNc fue cebado con oligo dT que contiene el sitio Notl, enlazados a la porción roma a los adaptadores de hemicinasa Salí, escindidos con Notl, con un tamaño apropiado por electrofóresis en gel, y clonado en una orientación definida en un vector de clonación adecuado (tal como pRKB o pRKD; pRK5B es un precursor de pRK5D que no contiene el sitio Sfil; ver, Holmes et al., Science, 253:1278-1280 (1991)) en los sitios únicos Xhol y Notl. EJEMPLO 2: Aislamiento de los Clones de ADNc mediante selección con Amilasa 1. Preparación de la biblioteca ADNc cebada con el oligo dT Se aisló el ARNm a partir de un tejido humano de interés utilizando los reactivos y protocolos de Invitrogen, San Diego, CA (Fast Track 2) . Este ARN se utilizó para generar una biblioteca de ADNc cebada con oligo dT en el vector pRK5D utilizando reactivos y protocolos de Life Technologies, Gaithersburg, MD (Sistema de Plásmido Super Script) . En este procedimiento, se dimensionó un ADNc de doble hebra más grande que 1000 bp y se clonó el ADNc enlazado con Sall/Notl en el vector escindido Xhol/Notl. El pRK5D es un vector de clonación que tiene un sitio de iniciación de la transcripción sp6 seguido por un sitio de enzima de restricción Sfil que precede a los sitios de clonación Xhol/Notl del ADNc. 2. Preparación de la biblioteca de ADNc cebada aleatoriamente Se generó una segunda biblioteca de ADNc para representar preferencialmente los extremos 5' de los clones de ADNc primarios. Se generó el ARN Sp6 de la biblioteca primaria (descrita arriba), y este ARN se utilizó para generar una biblioteca de ADNc cebada aleatoriamente en el vector pSST-AMY.O utilizando reactivos y protocolos de Life Technologies (Sistema de Plásmido Super Script, mencionado anteriormente) . En este procedimiento el ADNc de doble hebra se dimensionó a 500-1000 bp, enlazado de manera roma con los adaptadores Notl, escindido con Sfil, y clonado en el vector escindido Sfil/Notl. El pSST-AMY.O es un vector de clonación que tiene un promotor de alcohol deshidrogenasa de levadura que precede los sitios de clonación de ADNc y la secuencia de amilasa de ratón (la secuencia madura sin la señal de secreción) seguida por el terminador de alcohol de deshidrogenasa de levadura, después de los sitios de clonación. Así, los ADNc clonados en este vector que están fusionados en la estructura con al secuencia de amilasa llevará a la secreción de la amilasa desde colonias de levadura transfectadas apropiadamente. 3. Transformación y Detección El ADN de la biblioteca descrita en el párrafo 2 arriba se enfrió en hielo y se le agregó la bacteria electrocompetente DH10B (Life Technologies, 20 ml) . La mezcla de bacteria y vector se sometió a electroporación como se recomienda por el fabricante. Subsecuentemente, se agregó el medio SOC (Life Technologies, 1 ml) y la mezcla se incubó a 37 °C durante 30 minutos. Los transformantes se colocan en placas en 20 placas LB de 150 mM estándar, que contenían ampicilina y se incubaron durante 16 horas (37°C). Se separaron las colonias positivas de las placas y el ADN se aisló de las pelotillas de bacterias utilizando protocolos estándar, por ejemplo ingrediente CsCl. El ADN purificado se colocó entonces en los protocolos de levaduras que se mencionaron a continuación. Los métodos de levaduras se dividen en tres categorías: (1) La transformación de la levadura con el vector combinado plásmido/ADNc; (2) Detección y aislamiento de los clones de levaduras que secretan amilasa; y (3) La amplificación por PCR del inserto directamente desde la colonia de levaduras y la purificación del ADN para la secuenciación en análisis subsecuentes. La cepa de levadura utilizada fue HD56-5A (ATCC-90785) . Esta cepa tenía el siguiente genotipo: MAT alfa, ura3-52, leu2-3, leu2-112, his3-ll, his3-15, MAL+, SUC+, GAL+. Preferiblemente, los mutantes de levadura se pueden emplear pues tienen vías post-traduccionales deficientes. Tales mutantes pueden tener alelos deficientes en translocación en sec71, sec!2 , sec62 , con el sec71 truncado siendo el más preferido. Alternativamente, los antagonistas (que incluyen los nucleótidos antisentido y/o los ligandos) que interfieren con la operación normal de estos genes, otras proteínas implicadas en esta vía de post-traducción (por ejemplo, SEC61p, SEC72p, SEC62p, SEC63p, TDJlp ó SSAlp-4p) o la formación compleja y estas proteínas, también se pueden emplear preferiblemente en combinación con las levaduras que expresan la amilasa.

La transformación se realizó en base al protocolo subrayado por Gietz et al., Nucí. Acid. Res. , 20:1425 (1992). Las células transformadas se inocularon entonces desde agar hacia el caldo de medio complejo YEPD (100 ml) y se hicieron crecer durante toda la noche a 30°C. El caldo de YEPD se preparó como se describe en Kaiser et al., Methods in Yeast Genetics, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY, p. 207 (1994) . Se cultivó durante toda la noche luego se diluyó hasta aproximadamente 2 x 10 células/ml (aprox. OD0o = 0.1) en un caldo fresco YEPD (500 ml) y se hizo volver a crecer hasta 1 x 107 células/ml (aprox. ODÓOO = 0.4-0.5) . Entonces se cosecharon las células y se prepararon para la transformación mediante la transferencia hacia botellas o frascos de rotor GS3 en un roto Sorval GS3 a 5,000 rpm durante 5 minutos, el sobrenadante se descargó, y luego se resuspendió en agua estéril, y se centrifugó nuevamente en tubos falcon de 50 ml a 3,500 rpm en una centrífuga Beckman GS-6KR. El sobrenadante se descargó y las células se lavaron subsecuentemente con LiAc/TE (10 ml, Tris-HCl 10 mM, EDTA 1 mM pH 7.5, Li2OOCCH3 100 mM) , y se resuspendió en LiAc/TE (2.5 ml) . La transformación tuvo lugar mezclando las células preparadas (100 µl) con ADN de testículos de salmón, de una sola hebra, desnaturalizados, frescos (Lofstrand Labs, Gaithersburg, MD) y la transformación del ADN (1 µg, vol. < 10 µl) en tubos de microcentrífuga. La mezcla se mezcló de manera breve generando un vórtice, luego se agregó PEG/TE al 40% (600 µl, polietilenglicol-4000 al 40%, Tris-HCl 10 mM, EDTA 1 mM, Li2OOCCH3 100 mM, pH 7.5). Esta mezcla se mezcló de manera suave y se incubó a 30°C mientras se agitaba durante 30 minutos. Las células luego se calentaron repentinamente a 42°C durante 15 minutos, y el recipiente de reacción se centrifugó en una microcentrífuga a 12,000 rpm durante 5-10 segundos, se decantó y se resuspendió en TE (500 µl, Tris-HCl 10 mM, EDTA 1 mM, pH 7.5) seguido por recentrifugación. Las células luego se diluyeron en TE (1 ml) y se rociaron alícuotas (200 µl) en el medio selectivo previamente preparado en placas de crecimiento de 150 mm (VWR) . Alternativamente, en lugar de múltiples reacciones pequeñas, la transformación se realizó utilizando una sola reacción a gran escala, en donde las cantidades de reactivos se escalaron de manera acorde. El medio selectivo utilizado fue un agar con dextrosa, completo, sintético, carente de uracilo (SCD-Ura) preparado como se describe en Kaiser et al., Methods in Yeast Genetics, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY, p. 208-210 (1994). Los transformantes se hicieron crecer a 30°C durante 2-3 días. La detección de colonias que secretan amilasa se realizó incluyendo almidón rojo en el medio de crecimiento selectivo. El almidón se acopló al colorante rojo (Reactivo Red-120, Sigma) como se describe en el procedimiento por Biely et al., Anal. Biochem., 172:176-179 (1988). El almidón acoplado se incorporó en las placas de agar SCD-Ura a una concentración final de 0.15% (p/v), y se amortiguó con fosfato de potasio a pH de 7.0 (50-100 mM de concentración final) . Las colonias positivas se recolectaron y se marcaron a través del medio selectivo fresco (sobre placas de 150 mm) para obtener pozos aislados y colonias únicas identificables. Las colonias únicas aisladas en pozos, positivas para la secreción de amilasa se detectaron mediante incorporación directa de almidón rojo en el agar SCD-Ura amortiguado. Las colonias positivas se determinaron por su capacidad de romper el almidón resultante en un halo claro alrededor de la colonia positiva visualizada directamente . 4. Aislamiento del ADN mediante Amplificación por PCR Cuando se aisló una colonia positiva, se recolectó una porción de la misma mediante un palillo de dientes, y se diluyó en agua estéril (30 µl) en una placa de 96 pozos. A este tiempo, las colonias positivas ya sea se congelaron y se almacenaron para análisis subsecuente y se amplificaron inmediatamente. Se utilizó una alícuota de células (5 µl) como una plantilla para la reacción con PCR en un volumen de 25 µl que contenía: 0.5 µl de Klentaq (Clontech, Palo Alto, CA) ; 4.0 µl de dNTP 10 mM (Perkin Elmer-Cetus) ; 2.5 µl de amortiguador Kentaq (Clontech); 0.25 µl de oligo 1 delantero; 0.25 µl de oligo 2 inverso; 12.5 µl de agua destilada. La secuencia del oligonucleótido 1 delantero fue: 5'-TGTAAAACGACGGCCAGTTAAATAGACCTGCAATTATTAATCT-3' (SEC. ID NO: 16) La secuencia del oligonucleótido 2 inverso fue: 5' -CAGGAAACAGCTATGACCACCTGCACACCTGCAAATCCATT-3' (SEC. ID NO: 17) El PCR luego se realizó como sigue: a. Desnaturalizado 92°C, 5 minutos b. 3 ciclos de: Desnaturalizado 92°C, 30 segundos Calentamiento y 59°C, 30 segundos Enfriamiento Extensión 72°C, 60 segundos c. 3 ciclos de: Desnaturalizado 92°C, 30 segundos Calentamiento y 57°C, 30 segundos Enfriamiento Extensión 72°C, 60 segundos d. 25 ciclos de: Desnaturalizado 92°C, 30 segundos Calentamiento y 55°C, 30 segundos Enfriamiento Extensión 72°C, 60 segundos e. Retención 4°C Las regiones subrayadas de los oligonucleótidos se sometieron a enfriamiento y calentamiento para la región promotora ADH y la región de amilasa, respectivamente, y se amplificó una región de 307 bp desde el vector pSST-AMY.O cuando no estuvo presente ningún inserto. Típicamente, los primeros 18 nucleótidos del extremo 5' de estos oligonucleótidos contenían sitios de enfriamiento y calentamiento para los cebadores de secuenciación. Así, el producto total de la reacción con PCR de un vector vacío fue de 343 bp. Sin embargo, el ADNc fusionado con la secuencia de señal resultó en secuencias de nucleótidos más largas considerablemente . Siguiendo el PCR, se examinó una alícuota de la reacción (5 µl) mediante electrofóresis en gel de agarosa en un gel de agarosa al 1% utilizando un sistema de amortiguamiento Tris-Borato-EDTA (TBE) como se describe por Sambrook et al., supra. Los clones resultaron en un producto PCR fuerte único más grande de 400 bp cuando se analizó posteriormente mediante secuenciación con ADN después de la purificación con una columna de limpieza con PCR 96 Qiaquick (Qiagen Inc., Chatsworth, CA) .

EJEMPLO 3 : Aislamiento de los Clones de ADNc que Codifican al PR0241 Humano Una secuencia de ADN de consenso se ensambló en relación a otras secuencias EST identificadas como se describió en el Ejemplo 1 anterior. Esta secuencia de consenso se designó aquí como DNA30876. En base a la secuencia de consenso DNA30876, se sintetizaron los oligonucleótidos: 1) para identificar mediante PCR de una biblioteca de ADNc que contenía la secuencia de interés, y 2) para usarse como sondas para aislar un clon de la secuencia de codificación de longitud completa para el PR0241. Se sintetizaron los cebadores PCR (delantero e inverso) : cebador PCR delantero 5'-GGAAATGAGTGCAAACCCTC-3' (SEC. ID. NO: 3) cebador PCR inverso 5'-TCCCCAAGCTGAACACTCATTCTGC-3' (SEC. ID. NO: 4) Adicionalmente, se construyó una sonda de hibridización del oligonucleótido sintética a partir de la secuencia DNA30876 de consenso que tenía la siguiente secuencia de nucleótidos sonda de hibridización 5'-GGGTGACGGTGTTCCATATCAGAATTGCAGAAGCAAAACTGACCTGCAGTT-3' (SEC. ID. NO: 5) Para separar varias bibliotecas de una fuente de un clon de longitud completa, se seleccionó el ADN de las bibliotecas mediante amplificación por PCR con los pares del cebador de PCR identificados arriba. Una biblioteca positiva se utilizó entonces para aislar los clones que codifican al gen PR0241 utilizando el oligonucleótido de sonda y uno de los cebadores PCR. Se aisló el ARN para la construcción de las bibliotecas de ADNc a partir de tejido de riñon fetal humano (LIB29) . La secuenciación del ADN de los clones aislados como se describió arriba dio la secuencia de ADN de longitud completa para el PR0241 [designado aquí como DNA34392-1170 (SEC. ID NO: 1)] y la secuencia de la proteína derivada para el PR0241. La secuencia de nucleótidos completa del DNA34392-1170 se muestra en la Figura 1 (SEC. ID NO: 1) . El clon DNA34392-1170 contiene una sola estructura de lectura abierta con un sitio de iniciación de traducción aparente en las posiciones del nucleótido 234-236 y que termina en el codon de detención en las posiciones del nucleótido 1371-1373 (Figura 1) . El precursor del polipéptido predicho es de 379 aminoácidos de longitud (Figura 2) . La proteína PR0241 de longitud completa mostrada en la Figura 2 tiene un peso molecular estimado de aproximadamente 43,302 daltons y u pl de aproximadamente 7.30. El clon DNA34392-1170 fue depositado en el ATCC y se le asignó el no. de depósito de ATCC, ATCC 209526. El análisis de la secuencia de aminoácidos del PR0241 de longitud completa sugiere que él mismo posee homología significativa a varias proteínas del proteoglicano biglicano, indicando así que el PR0241 puede ser un nuevo polipéptido homólogo del biglicano. EJEMPLO : Aislamiento de los Clones de ADNc que Codifican al PR0243 Humano mediante Cebadores Errantes Genómicos In troducción : La trombopoietina humana (THPO) es una hormona glicosilada de 352 aminoácidos que consiste de dos dominios. El dominio N-terminal que comparte 50% de similaridad a la eritropoietina, es responsable de la actividad biológica. La región C-terminal se requiere para la secreción. El gen para la trombopoietina (THPO) forma un mapa para el cromosoma 3q27-q28 en donde los seis exones de este gen abarcan pares de base de 7 kilobases del ADN genómico (Gurney et al . , Blood 8J3: 981-988 (1995) . Para determinar sí hubo genes que codifican a los homólogos de THPO localizados en proximidad con al THPO, los fragmentos de ADN genómicos de este región se identificaron y se secuenciaron. Tres clones Pl y un clon PAC (Genome Systems Inc., St . Louis, MO; cat. Nos. Pl-2535 y PAC-6539) que engloban el lugar THPO se aislaron y se secuenció una región de 140 kb utilizando la estrategia de creación bibliotecas de genes clonados derivados, ordenados (Chen et al . , Genomi cs 17_: 651-656 (1993)), acoplados con una metodología de llenado de intervalos de nucleótidos faltantes a base de PCR. El análisis reveló que la región es rica en genes con cuatro genes adicionales localizados muy cercanamente a THPO: la proteína 2 asociada del tipo 1 del receptor del factor de necrosis del tumor (TRAP2) y el factor gamma de iniciación del alargamiento (elf4g) , el canal 2 de cloruro (CLCN2) y la subunidad hRPB17 de la polimerasa II del ARN. Mientras que se encontró el homólogo THPO en la región, se han predecido cuatro nuevos genes mediante la detección de genes asistida por computadora (GRAIL) (Xu et al . , Gen . Engin . 16: 241-253 (1994), la presencia de los islas CpG (Cross, S. y Bird, A., Curr. Opin . Genet . & Devel . 5: 109-314 (1995), y homología a los genes conocidos (como se detecto por WU-BLAST2.0) (Altschul y Gish, Methods Enzymol . 2_66: 460-480 (1996) (http: //blast .wustl.ed. /blast/README. html) .

Clones Pl y PAC: El clon Pl humano inicial se aisló a partir de la biblioteca genómica Pl (Genome Systems Inc., St. Louis, MO; cat. Nos. Pl-2535) seleccionada con los cebadores PCR diseñados a partir de la secuencia genómica THPO (A. L., Gurney et al . , Blood 85: 981-988 (1995)). Los cebadores PCR se diseñan a partir de las secuencias terminales derivadas de este clon Pl y PAC (Genome Systems, Cat. Nos.: Pl-2535 & PAC-6539) para identificar los clones que se sobreponen. Estra tegia de Creación de Bibliotecas de Genes Clonados Derivados , Ordenados : La Estrategia de Creación de Bibliotecas de Genes Clonados Derivados, Ordenados (OSS) (Chen et al . , Genomics _1_7: 651-656 (1993)) involucra la formación de un mapa y la secuenciación de los clones de ADN genómicos grandes con una metodología jerárquica. El clon Pl o PAC se sometió a tratamiento con sonido y los fragmentos se subclonaron en el vector lambda (?Bluestar) (Novagen, Inc., Madison, Wl; cat. no. 69242-3). Los insertos del subclon lambda se aislaron a partir de PCR de rango amplio (Barnes, W. Proc. Na ti . Acad. Sci . USA 91: 2216-2220 (1994) y los extremos se secuenciaron. Las secuencias del extremo lambda se sobrepusieron para crear un mapa parcial del clon original. Se identificaron aquellos clones lambda con secuencias extremas o terminantes sobrepuestas, los insertos subclonados en el vector del plásmido (pUC9 ó pCU18) y los extremos de los subclones del plásmido se secuenciaron y se ensamblaron para generar una secuencia contigua. Esta estrategia de secuenciación dirigida minimiza la redundancia requerida mientras que permite a alguien explorar y concentrarse en regiones de interés. Para definir mejor el lugar THPO y buscar otros genes relacionados a la familia de hematopoietina, se aislaron cuatro clones genómicos a partir de esta región mediante selección por PCR mediante las bibliotecas Pl y PAC humanas (Genome Systems, Inc., Cat. Nos.: PI-2535 y PAC-6539) . Los tamaños de los fragmentos genómicos son como sigue: Pl.t es de 40 kb; Pl.g es de 70 kb; PI.u es de 70 kb; y PAC.z es de 200 kb. Aproximadamente 80% de la región del ADN genómico de 200 kb se secuenció mediante la Estrategia de Creación de Bibliotecas de Genes Clonados Derivados, Ordenados (OSS) (Chen et al . , Genomics 17J 651-656 (1993)) y se ensambló en contiguos utilizando el AutoAssembler™ (Applied Biosystems, Perkin Elmer, Foster City, CA, cat. no. 903227). El orden preliminar de estos contiguos se determinó mediante análisis manual. Hubo 46 contiguos y se empleó el llenado en los intervalos de los nucleótidos faltantes. La Tabla 7 es un resumen del número y tamaño de los intervalos.

Tabla 7 Resumen de los intervalos de los nucleótidos faltantes en la región de 140 kb Tamaño del intervalo número < 50 bp 13 50-150 bp 7 150-300 bp 7 300-1000 bp 10 1000-5000 bp 7 > 5000 bp 2 (15,000 bp) Secuenciación del ADN: Se utilizó la química de ABI DYE-primer™ (PE Applied Biosystems, Foster City, CA; Cat. No.: 402112) para secuenciar los extremos de los subclones lambda y del plásmido. Se utilizó la química de ABI DYE-terminater™ (PE Applied Biosystems, Foster City, CA; Cat. No.: 403044) para secuenciar los productos de PCR con sus respectivos cebadores de PCR. Las secuencias se recolectaron con un instrumento ABI377. Para los productos de PCR más grandes que 1 kb, se utilizaron los cebadores errantes. La secuencia de los contiguos generados mediante la estrategia OSS en un AutoAssembler™ a (Applied Biosystems, Perkin Elmer, Foster City, CA, cat. no. 903227) y los archivos de traza de secuencia para el llenado de los intervalos de nucleótidos faltantes se importaron hacia el Sequencher™ (Gene Codes Corp., Ann Arbor, MI) para la sobrecolocación y la edición. Estrategia de llenado de los intervalos de nucleótidos fal tantes a base de PCR. Los cebadores se diseñaron en base a los extremos 5' y 3' secuenciados de cada contiguo, evitando la repetición y las regiones de secuencia de baja calidad. Todos los cebadores se diseñaron para ser 19-24 mers con el contenido de 50-70% del G/C. Los oligos se sintetizaron y se purificaron con gel mediante métodos estándar. Puesto que la orientación y el orden de los contiguos son desconocidos, se utilizaron las permutaciones de los cebadores en las reacciones de amplificación. Se utilizaron dos equipos PCR: primero, el equipo PCR XL (Perkin Elmer, Norwalk, CT; Cat. No.: N8080205) , con tiempos de extensión de aproximadamente 10 minutos; y segundo, se utilizó el equipo PCR polimerasa Taq (Qiagen Inc., Valencia, CA; Cat. No. 201223) bajo condiciones de alta severidad si se observaron productos múltiples o rudimentarios con el equipo PCR XL. El producto PCR principal de cada reacciones exitosas se extrajo de un gel de agarosa de bajo punto de fusión al 0.9% y se purificó con el equipo de Purificación de ADN Geneclean antes de la secuenciación. Análisis : La identificación y caracterización de las regiones de codificación se realizó como sigue: primero, las secuencias repetitivas se enmascararon utilizando RepeatMasker (A.F.A. Smit & P. Green, http://ftp.genome.washington.ed/RM/RM_details.html) el cual selecciona las secuencias de ADN en el formato FastA contra una biblioteca de elementos repetitivos y regresar una secuencia de cuestionamiento enmascarada. Las repeticiones no enmascaradas se identificaron comparando la secuencia a la base de datos GenBank utilizando WUBLAST (Altschul, S & Gish, W., Methods Enzymol . 266: 460-480 (1996) y se enmascararon manualmente. A continuación, los genes conocidos se revelaron comparando las regiones genómicas contra la base de datos de la proteína de Genentech utilizando el algoritmo WUBLAST2.0 y anotando mediante alineación las secuencias de ADNc y genómicas para cada gen, respectivamente, utilizando un algoritmo Needleman-Wunch (Needlman y Wunsch, J. Mol . Biol . 4_8: 443-453 (1970) para encontrar las regiones de identidad local entre las secuencias los cuales de otra manera eran diferentes ampliamente. La estrategia da como resultado la detección de todos los exones de los cinco genes conocidos en la región, THPO, TRAP2, elF4g, CLCN2 y hRPB17 (Tabla 8) Tabla 8 Resumen de los genes conocidos localizados en la región analizada de 140 kb Genes conocidos Posición en el mapa factor 4 gamma de iniciación de 3q27-qter la traducción eucariótica trombopoietina 3q26-q27 canal de cloruro 2 3q26-qter proteína 2 asociada con el no previamente formado en receptor TNF el mapa subunidad hRPBl7 de la no previamente formado en polimerasa II de ARN el mapa Finalmente, las unidades de transcripción novedosas se predijeron utilizaron un número de metodologías. Se utilizaron las islas de CpG (Cross, S. y Bird, A., Curr. Opin . Genet . & Devel . 5: 109-314 (1995) para definir las regiones promotoras y se identificaron como amontonamientos de sitios escindidos mediante secuencias palindrómicas de 6 ó 8-mer, ricas en GC reconocedoras de las enzimas. Las islas CpG están asociadas usualmente con las regiones promotoras de los genes. El análisis WUBLAST2.0 de las regiones genómicas cortas (10-20 kb) contra el GenBank revelaron apareamientos con los EST. Las secuencias EST individuales (o donde era posible, sus archivos de cromatogramas de secuencias) se recuperaron y se ensamblaron con el Sequencher para proporcionar una secuencia de ADNc teórica (designada aquí como DNA34 15) . El GRAIL2 (ApoCom Inc., Knoxville, TN, versión de línea de comando para el DEC alfa) se utilizó para predecir un nuevo exon. Los cinco genes conocidos en la región servida como controles internos para el acceso del algoritmo GRAIL. Aislamien to: Se aislaron los clones de ADNc de cordina a partir de una biblioteca de pulmón fetal humano cebado con oligo-dT. El ARN del poliA+ del pulmón fetal humano se compró de Clontech (cat #6528-1, lote # 43777) y se utilizaron 5 mg para construir una biblioteca de ADN en el pKR5B (Genentech, LIB26) . El cebador 3' (pGACTAGTTCTAGATCGCGAGCGGCCGCCTTTTTTTTTTTT) (SEC. ID. NO: 8) y el enlazador 5' (pCGGACGCGTGGGGCCTGCGCACCCAGCT) (SEC. ID.

NO: 9) se diseñaron para introducir los sitios de restricción Salí y Notl. Se seleccionaron los clones con las sondas de oligonucleótido diseñadas de la secuencia de ADNc de la cordina humana putativa (DNA34415) deducida mediante "empalme" manualmente junto con los exones genómicos propuestos del gen. Los cebadores de PCR que flanquean las sondas se utilizaron para confirmar la identidad de los clones de ADNc antes de la secuenciación. Las selección de las sondas de oligonucleótidos fueron las siguientes: OLI5640 34415.pl 5' -GCCGCTCCCCGAACGGGCAGCGGCTCCTTCTCAGAA-3' (SEC. ID. NO: 10) y OLI5642 34415 p2 5' -GGCGCACAGCACGCAGCGCATCACCCCGAATGGCTC-3' (SEC. ID. NO: 11); y sondas flanqueantes utilizadas fueron las siguientes: OLI5639 34415. fl 5' -GTGCTGCCCATCCGTTCTGAGAAGGA-3' (SEC. ID. NO: 12) y OLI5643 34415. r 5' -GCAGGGTGCTCAAACAGGACAC-3' (SEC. ID. NO: 13) . EJEMPLO 5: Manchado Northern y Análisis de Hibridización del ARN in si tu del PR0243 La expresión del ARNm del PR0243 en los tejidos humanos se examinó mediante el análisis de manchado Northern. Las manchas de ARN de poliA+ humano derivadas de los tejidos de adultos y fetales humanos (Clontech, Palo Alto, CA; Cat. Nos. 7760-1 y 7756-1) se hibridizaron a una sonda de fragmentos de ADNc etiquetada con 32P en base al ADNc del PR0243 de longitud completa. Las manchas se incubaron con las sondas en el amortiguador de hibridización (SSPE 5X; solución de Denhardt 2X; 100 mg/mL de ADN de esperma de salmón cortado desnaturalizado: formamida al 50%; SDS al 2%) durante 60 horas a 42°C. Las manchas se lavaron varias veces en SSC 2X; SDS al 0.05% durante 1 hora a temperatura ambiente, seguido por un lavado de alta severidad durante 30 minutos en SSC 0.1X; SDS al 0.1% a 50°C y se sometió a auto-radiografía. Las manchas se revelaron después de una exposición durante toda la noche mediante el análisis fosforimager (Fuji) . Se detectaron los transcriptos de ARNm del PR0243. El análisis del patrón de expresión mostró las señales fuertes del transcrito 4.0 kb esperado en el hígado de adulto y fetal y una señal muy suave en el riñon de adulto. El cerebro, pulmón y riñon fetales fueron negativos, como lo fueron el corazón, cerebro, pulmón y páncreas de adulto. Los transcriptos más pequeños se observaron en la placenta (2.0 kb) , músculo esquelético de adulto (1.8 kb) e hígado fetal (2.0 kb) . La hibridización in si tu del tejido humano de adulto del PR0243 dio una señal positiva en la línea de escisión de la articulación sinovial en desarrollo que se forma entre la cabeza femoral y el acetábulo. Todos los otros tejidos fueron negativos. Se examinaron las secciones adicionales de cara, cabeza, extremidades fetales humanos y los embriones de ratón. La expresión en los tejidos fetales humanos se observaron adyacentes al desarrollo de los miembros y los huesos faciales en la mesenquima perosteal. La expresión fue altamente específica y estuvo a menudo adyacente a las áreas que sufren vascularización. La expresión también se observó en el desarrollo de los lóbulos temporal y occipital del cerebro fetal, aunque no se observó en otro lado en el cerebro. Además, la expresión en los ganglios del oído interno en desarrollo. No se observó la expresión en ninguno de los tejidos de ratón con las sondas humanas . La hibridización in situ se realizó utilizando un protocolo optimizado, utilizando ribosondas etiquetadas con 33P generantes de PCR. (Lu y Gillett, Cell Vision 1: 169-176 (1994)). Los tejidos fetales y de adultos, humanos, inmersos en parafina, fijados en formalina, se seccionaron, se desparafinizaron, se desproteinaron en proteinasa K (20 g/ml) durante 15 minutos a 37°C, y después se procesaron para hibridización in situ como se describió por Lu y Gillett (1994). Una ribosonda antisentido etiquetada con [33P]-UTP a partir de un producto PCR y se hibridizaron durante toda la noche a 55°C. Los cortes se sumergieron en una emulsión de rastreo nuclear de Kodak NTB2 y se expusieron durante 4 semanas. EJEMPLO 6: Aislamiento de los Clones de ADNc que Codifican al PR0299 Humano Una secuencia de ADNc designada aquí como DNA28847 (Figura 7; SEC. ID. NO: 18) se aisló como se describe en el Ejemplo 2 anterior. Después de un análisis adicional, se encontró una versión truncada 3' del DNA28847 y se designó aquí como DNA35877 (Figura 8; SEC. ID. NO: 19). En base a la secuencia de consenso DNA35877, se sintetizaron los oligonucleótidos 1) para identificar mediante PCR una biblioteca de ADNc que contenía la secuencia de interés, y 2) para utilizarse como sondas para aislar un clon de secuencia de codificación de longitud completa de PR0299. Los cebadores delantero e inverso en general estuvieron en el rango desde 20 a 30 nucleótidos y a menudo están diseñados para dar un producto de PCR de aproximadamente 100-1000 bp de longitud. Las secuencias de la sonda son típicamente de 40-55 bp de longitud. En algunos casos, los oligonucleótidos adicionales se sintetizan cuando la secuencia de consenso es mayor de aproximadamente 1-1.5 kbp. Para seleccionar varias bibliotecas para un clon de longitud completa, se seleccionó el ADN de las bibliotecas mediante la amplificación con PCR, como lo indica Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, con el par cebador PCR. Una biblioteca positiva se utilizó entonces para aislar los clones que codifican al gen de interés utilizando el oligonucleótido de sonda y uno de los pares cebadores. Se sintetizaron los cebadores PCR delantero e inverso: cebador PCR delantero 5'-CTCTGGAAGGTCACGGCCACAGG-3' (SEC. ID NO: 20) cebador PCR inverso 5'-CTCAGTTCGGTTGGCAAAGCTCTC-3' (SEC. ID NO: 21) Adicionalmente, se construyó una sonda de hibridización del oligonucleótido sintética a partir de la secuencia DNA35877 de consenso que tenía la siguiente secuencia de nucleótidos sonda de hibridización 5' -CAGTGCTCCCTCATAGATGGACGAAAGTGTGACCCCCCTTTCAGGCGAGAGTTTGCCA ACCGAACTGA-3' (SEC. ID NO: 22) Para seleccionar varias bibliotecas de una fuente de un clon de longitud completa, se seleccionó el ADN de las bibliotecas mediante amplificación por PCR con el par del cebador PCR identificado anteriormente. Una biblioteca positiva se utilizó entonces para aislar los clones que codifican al gen PR0299 utilizando el oligonucleótido de sonda y uno de los cebadores PCR. Se aisló el ARN para la construcción de las bibliotecas de ADNc a partir de tejido de cerebro fetal humano. Las bibliotecas de ADNc utilizadas para aislar los clones ADNc se construyeron mediante métodos estándar utilizando reactivos comercialmente disponibles tales como aquéllos de Invitrogen, San Diego, CA. El ADNc fue cebado con oligo dT que contiene el sitio Notl, se enlazó con la porción roma a los adaptadores de hemicinasa de Salí, se escindió con Notl, se dimensionó apropiadamente mediante electrofóresis en gel, y se clonó en una orientación definida en un vector de clonación adecuado (tal como pRKB o pRKD; pRK5B es un precursor de pRK5D que no contiene el sitio Sfil; ver, Holmes et al., Science, 253 : 1278-1280 (1991)) en los sitios únicos Xhol y Notl. La secuenciación del ADN de los clones aislados como se describió anteriormente dio la secuencia de ADN de longitud completa para el PR0299 [designado aquí como DNA39976-1215] (SEC. ID NO: 14) y la secuencia de la proteína derivada para el PR0299. La secuencia de nucleótidos completa del DNA39976-1215 se muestra en la Figura 5 (SEC. ID NO: 14) . El clon DNA39976-1215 contiene una sola estructura de lectura abierta con un sitio de iniciación de traducción aparente en las posiciones 111-113 del nucleótido y termina en el codon de detención en las posiciones 2322-2324 del nucleótido (Figura 5) . El precursor del polipéptido predicho es de 737 aminoácidos de longitud (Figura 6) . Las regiones importantes de la secuencia del polipéptido codificada por el clon DNA39976-1215 han sido identificadas e incluyen los siguiente: un péptido de señal correspondiente a los aminoácidos 1-28; la región de transmembrana putativa correspondiente a los aminoácidos 638-662, 10 repeticiones EGF, correspondiente a los aminoácidos 80-106, 121-203, 336-360, 378-415, 416-441, 454-490, 492-528, 529-548, 567-604, y 605-622, respectivamente, y 10 sitios de glicosilación enlazados a N, potenciales, que corresponden a los aminoácidos 107-120, 204-207, 208-222, 223-285, 286-304, 361-374, 375-377. 442-453, 549-563, y 564-566, respectivamente. El clon DNA39976-1215 ha sido depositado con el ATCC y se le asignó el no. de depósito ATCC, ATCC 209524. El análisis de la secuencia de aminoácidos del PR0299 de longitud completa sugiere que las porciones del mismo poseen homología significativa a las proteínas notch, indicando así que el PR0299 puede ser un nuevo homólogo de la proteína notch y tiene la actividad típica de la proteína notch. EJEMPLO 7 : Aislamiento de los Clones de ADNc que Codifican al PR0323 Humano Una secuencia de ADN de consenso se ensambló en relación a otras secuencias EST como se describió en el Ejemplo 1 anterior. Esta secuencia de consenso se designó aquí como DNA30875. En base a la secuencia de consenso DNA30875, se sintetizaron los oligonucleótidos: 1) para identificar mediante PCR una biblioteca de ADNc que contenía la secuencia de interés, y 2) para usarse como sondas para aislar un clon de la secuencia de codificación de longitud completa para el PR0323. Se sintetizaron los cebadores PCR (dos delanteros y uno inverso) : cebador 1 PCR delantero 5'-AGTTCTGGTCAGCCTATGTGCC-3' (SEC. ID. NO: 25) cebador 12PCR delantero 5'-CGTGATGGTGTCTTTGTCCATGGG-3' (SEC. ID. NO: 26) cebador PCR inverso 5'-CTCCACCAATCCCGATGAACTTGG-3' (SEC. ID. NO: 27) Adicionalmente, se construyó una sonda de hibridización del oligonucleótido sintética a partir de la secuencia DNA30875 de consenso que tenía la siguiente secuencia de nucleótidos sonda de hibridización 5' -GAGCAGATTGACCTCATACGCCGCATGTGTGCCTCCTATTCTGAGCTGGA-3' (SEC. ID. NO: 28) 5 Para separar varias bibliotecas de una fuente de un clon de longitud completa, se seleccionó el ADN de las bibliotecas mediante amplificación por PCR con los pares del cebador de PCR identificados arriba. Una biblioteca positiva se utilizó entonces para aislar los clones que codifican al gen PR0241 utilizando el oligonucleótido de sonda y uno de los cebadores PCR. Se aisló el ARN para la construcción de las bibliotecas de ADNc a partir de tejido de hígado fetal humano (LIB6) . La secuenciación del ADN de los clones aislados como se describió arriba dio la secuencia de ADN de longitud completa para el PR0323 [designado aquí como DNA35595-1228] (SEC. ID NO: 23) y la secuencia de la proteína derivada para el PR0323. La secuencia de nucleótidos completa del DNA35595- 20 1228 se muestra en la Figura 9 (SEC. ID NO: 23) . El clon DNA35595-1228 contiene una sola estructura de lectura abierta con un sitio de iniciación de traducción aparente en las posiciones del nucleótido 110-112 y que termina en el —••- ^-•-"-^~- ---*-* » - - - - codon de detención en las posiciones del nucleótido 1409- 1411 (Figura 9) . El precursor del polipéptido predicho es de 433 aminoácidos de longitud (Figura 10) . La proteína PR0323 de longitud completa mostrada en la Figura 10 tiene un peso molecular estimado de aproximadamente 47,787 daltons y un pl de aproximadamente 6.11. El clon DNA35595-1228 fue depositado en el ATCC y se le asignó el no. de depósito de ATCC 209528. El análisis de la secuencia de aminoácidos del PR0323 de longitud completa sugiere que las porciones del mismo poseen homología significativa a varias proteínas de dipeptidasa, indicando así que el PR0323 puede ser una nueva proteína dipeptidasa. EJEMPLO 8: Aislamiento de los Clones de ADNc que Codifican al PR0327 Humano Se buscó una base de datos de ADN de una marca de secuencia expresada (EST) (LIFESEQ™, Incyte Pharmaceuticals, Palo Alto, CA) y varias secuencias EST se identificaron las cuales muestran ciertos grados de homología a la proteína del receptor de prolactina humana. Aquellas secuencias EST se alinearon utilizando phrap y se obtuvo una secuencia de consenso. Esta secuencia de ADN de consenso se extendió entonces utilizando ciclos repetidos de BLAST y phrap para extender la secuencia de consenso tanto como sea posible utilizando las fuentes de las secuencias EST descritas anteriormente. La secuencia del ensamble extendido se designó aquí DNA38110. Se realizaron las búsquedas anteriores utilizando el programa de computadora BLAST ó BLAST2 (Altschul, y Gish, Methods in Enzymology 266: 460-480 (1996)). Aquellas comparaciones con el registro Blast de 70 (o en algunos casos 90) o mayores que no codificaron proteínas conocidas fueron amontonadas y ensambladas en las secuencias de ADN de consenso con el programa "phrap" (Phil Green, University of Washington, Seattle, Washington) . En base a la secuencia de consenso DNA38110 obtenida como se describió anteriormente, se sintetizaron los oligonucleótidos: 1) para identificar mediante PCR una biblioteca de ADNc que contenía la secuencia de interés, y 2) para usarse como sondas para aislar un clon de la secuencia de codificación de longitud completa para el PR0327. Se sintetizaron los cebadores PCR (delantero e inverso) como sigue: cebador PCR delantero 5'-CCCGCCCGACGTGCACGTGAGCC-3' (SEC. ID NO: 33) cebador PCR inverso 5'-TGAGCCAGCCCAGGAACTGCTTG-3' (SEC. ID NO: 34) Adicionalmente, se construyó una sonda de hibridización del oligonucleótido sintética a partir de la secuencia de consenso DNA38110 de consenso que tenía la siguiente secuencia de nucleótidos sonda de hibridización 5'-CAAGTGCGCTGCAACCCCTTTGGCATCTATGGCTCCAAOAAAGCCGGGAT-3' (SEC. ID NO: 35) Para separar varias bibliotecas de una fuente de un clon de longitud completa, se seleccionó el ADN de las bibliotecas mediante amplificación por PCR con el par del cebador de PCR identificado arriba. Una biblioteca positiva se utilizó entonces para aislar los clones que codifican al gen del PR0327 utilizando el oligonucleótido de sonda y uno de los cebadores PCR. Se aisló el ARN para la construcción de las bibliotecas de ADNc a partir del tejido de pulmón fetal humano (LIB26) . La secuenciación del ADN de los clones aislados como se describió arriba dio la secuencia de ADN de longitud completa para el PR0327 [designado aquí como DNA38113-1230] (SEC. ID NO: 16) y la secuencia de la proteína derivada para el PR0327.

La secuencia de nucleótidos completa de DNA38113-1230 se muestra en la Figura 13 (SEC. ID NO: 31) . El clon DNA38113-1230 contiene una sola estructura de lectura abierta con un sitio de iniciación de traducción aparente en las posiciones del nucleótido 119-121 y que termina en el codon de detención después de las posiciones del nucleótido 1385-1387 (Figura 13) . El precursor del polipéptido predicho es de 422 aminoácidos de longitud (Figura 14) . La proteína PR0327 de longitud completa mostrada en la Figura 14 tiene un peso molecular estimado de aproximadamente 46,302 daltons y un pl de aproximadamente 9.42. El clon DNA38113-1230 ha sido depositado en el ATCC y se le asignó el no. de depósito de ATCC, ATCC 209530. El análisis de la secuencia de aminoácidos del polipéptido PR0327 de longitud completa sugiere que él mismo posee homología significativa a la proteína del receptor de prolactina humana, indicando así que el PR0327 puede ser una nueva proteína de enlace de la prolactina. EJEMPLO 9: Aislamiento de los Clones de ADNc que Codifican al PR0233 Humano Una secuencia de ADN de consenso se ensambló en relación a otras secuencias EST como se describió en el Ejemplo 1 anterior. Esta secuencia de consenso se designó . aquí como DNA30945. En base a la secuencia de consenso DNA30945, se sintetizaron los oligonucleótidos: 1) para identificar mediante PCR de una biblioteca de ADNc que contenía la secuencia de interés, y 2) para usarse como sondas para aislar un clon de la secuencia de codificación de longitud completa para el PR0233. Se sintetizaron los cebadores PCR como sigue: cebador PCR delantero 5'-GGTGAAGGCAGAAATTGGAGATG-3' (SEC. ID. NO: 38) cebador PCR inverso 5'-ATCCCATGCATCAGCCTGTTTACC-3' (SEC. ID. NO: 39) Adicionalmente, se construyó una sonda de hibridización del oligonucleótido sintética a partir de la secuencia DNA30945 de consenso que tenía la siguiente secuencia de nucleótidos sonda de hibridización 5'-GCTGGTGTAGTCTATACATCAGATTTGTTTGCTACACAAGATCCTCAG-3' (SEC. ID. NO: 40) Para separar varias bibliotecas de una fuente de un clon de longitud completa, se seleccionó el ADN de las bibliotecas mediante amplificación por PCR con los pares del cebador de PCR identificados arriba. Una biblioteca positiva se utilizó entonces para aislar los clones que codifican al ._ ,. gen PR0233 utilizando el oligonucleótido de sonda y uno de los cebadores PCR. Se aisló el ARN para la construcción de las bibliotecas de ADNc a partir de tejido de cerebro fetal humano . La secuenciación del ADN de los clones aislados como se describió arriba dio la secuencia de ADN de longitud completa para el PR0233 [designado aquí como DNA34436-1238 ] (SEC. ID NO: 36) y la secuencia de la proteína derivada para el PR0233. La secuencia de nucleótidos completa del DNA34436- 1238 se muestra en la Figura 15 (SEC. ID NO: 36) . El clon DNA34436-1238 contiene una sola estructura de lectura abierta con un sitio de iniciación de traducción aparente en las posiciones del nucleótido 101-103 y que termina en el codon de detención en las posiciones del nucleótido 1001-1003 (Figura 15). El precursor del polipéptido predicho es de 300 aminoácidos de longitud (Figura 16) . La proteína PR0233 de longitud completa mostrada en la Figura 16 tiene un peso molecular estimado de aproximadamente 32,964 daltons y un pl de aproximadamente 9.52. Además, las regiones de interés incluyen el péptido de señal y un sitio activo de oxidoreductasa putativo, están designados en la Figura 16. El clon DNA34436-1238 fue depositado en el ATCC y se le asignó el no. de depósito de ATCC, ATCC 209523. El análisis de la secuencia de aminoácidos del PR0233 de longitud completa sugiere que las porciones del mismo poseen homología significativa a varias proteínas reductasa, indicando así que el PR0233 puede ser una nueva reductasa.

EJEMPLO 10: Aislamiento de los Clones de ADNc que Codifican al PR0344 Humano Una secuencia de ADN de consenso se ensambló en relación a otras secuencias EST como se describió en el Ejemplo 1 anterior. Esta secuencia de consenso se designó aquí como DNA34398. En base a la secuencia de consenso DNA34398, se sintetizaron los oligonucleótidos: 1) para identificar mediante PCR de una biblioteca de ADNc que contenía la secuencia de interés, y 2) para usarse como sondas para aislar un clon de la secuencia de codificación de longitud completa para el PR0344. En base a la secuencia de consenso DNA34398, se sintetizaron los cebadores PCR delantero e inverso como sigue : cebador PCR delantero (34398. fl) 5'-TACAGGCCCAGTCAGGACCAGGGG-3' (SEC. ID. NO: 43) cebador PCR delantero (34398. f2) 5'-AGCCAGCCTCGCTCTCGG-3' (SEC. ID. NO: 44) cebador PCR delantero (34398. f3) 5'-GTCTGCGATCAGGTCTGG-3' (SEC. ID. NO: 45) cebador PCR inverso (34398. rl) 5'-GAAAGAGGCAATCGATTCGC-3' (SEC. ID. NO: 46) cebador PCR inverso (34398. r2) 5'-GACTTACACTTGCCAGCACAGCAC-3' (SEC. ID. NO: 47) Adicionalmente, se construyó una sonda de hibridización del oligonucleótido sintética a partir de la secuencia DNA34398 de consenso que tenía la siguiente secuencia de nucleótidos sonda de hibridización (34398.pl) 5'-GGAGCACCACCAACTGGAGGGTCCGGAGTAGCGAGCGCCCCGAAG-3' (SEC. ID. NO: 48) Para separar varias bibliotecas de una fuente de un clon de longitud completa, se seleccionó el ADN de las bibliotecas mediante amplificación por PCR con los pares del cebador de PCR identificados arriba. Una biblioteca positiva se utilizó entonces para aislar los clones que codifican al gen PR0344 utilizando el oligonucleótido de sonda y uno de los cebadores PCR. Se aisló el ARN para la construcción de las bibliotecas de ADNc a partir de tejido de riñon fetal humano. La secuenciación del ADN de los clones aislados como se describió arriba dio la secuencia de ADN de longitud completa para el PR0344 [designado aquí como DNA40592-1242] (SEC. ID NO: 41) y la secuencia de la proteína derivada para el PR0344. La secuencia de nucleótidos completa del DNA40592- 1242 se muestra en la Figura 17 (SEC. ID NO: 41). El clon DNA40592-1242 contiene una sola estructura de lectura abierta con un sitio de iniciación de traducción aparente en las posiciones del nucleótido 227-229 y que termina en el codon de detención en las posiciones del nucleótido 956-958 (Figura 17). El precursor del polipéptido predicho es de 243 aminoácidos de longitud (Figura 18). Las regiones importantes de la secuencia de aminoácidos del PR0344 nativo incluyen el péptido de señal, el inicio de la proteína madura, y dos sitios de N-miristoilación potenciales como se muestra en la Figura 18. El clon DNA40592-1242 fue depositado en el ATCC y se le asignó el no. de depósito de ATCC, ATCC 209492. El análisis de la secuencia de aminoácidos del PR0344 de longitud completa sugiere que las porciones del mismo poseen homología significativa a varias proteínas complementarias de murino y de humano, indicando así que el PR0344 puede ser una nueva proteína complementaria.

EJEMPLO 11: Aislamiento de los Clones de ADNc que Codifican al PR0347 Humano Una secuencia de ADN de consenso se ensambló en relación a otras secuencias EST como se describió en el Ejemplo 1 anterior. Esta secuencia de consenso se designó aquí como DNA39499. En base a la secuencia de consenso DNA39499, se sintetizaron los oligonucleótidos: 1) para identificar mediante PCR de una biblioteca de ADNc que contenía la secuencia de interés, y 2) para usarse como sondas para aislar un clon de la secuencia de codificación de longitud completa para el PR0347. Se sintetizaron los cebadores PCR (delantero e inverso) como sigue: cebador PCR delantero 5'-AGGAACTTCTGGATCGGGCTCACC-3' (SEC. ID. NO: 51) cebador PCR inverso 5'-GGGTCTGGGCCAGGTGGAAGAGAG-3' (SEC. ID. NO: 52) Adicionalmente, se construyó una sonda de hibridización del oligonucleótido sintética a partir de la secuencia DNA39499 de consenso que tenía la siguiente secuencia de nucleótidos sonda de hibridización 5' -GCCAAGGACTCCTTCCGCTGGGCCACAGGGGAGCACCAGGCCTTC-3' (SEC. ID. NO: 53) Para separar varias bibliotecas de una fuente de un clon de longitud completa, se seleccionó el ADN de las bibliotecas mediante amplificación por PCR con los pares del cebador de PCR identificados arriba. Una biblioteca positiva se utilizó entonces para aislar los clones que codifican al gen PR0347 utilizando el oligonucleótido de sonda y uno de los cebadores PCR. Se aisló el ARN para la construcción de las bibliotecas de ADNc a partir de tejido de riñon fetal humano (LIB228) . La secuenciación del ADN de los clones aislados como se describió arriba dio la secuencia de ADN de longitud completa para el PR0347 [designado aquí como DNA44176-1244] (SEC. ID NO: 49) y la secuencia de la proteína derivada para el PR0347. La secuencia de nucleótidos completa del DNA44176-1244 se muestra en la Figura 19 (SEC. ID NO: 49) . El clon DNA44176-1244 contiene una sola estructura de lectura abierta con un sitio de iniciación de traducción aparente en las posiciones del nucleótido 123-125 y que termina en el codon de detención en las posiciones del nucleótido 1488-1490 (Figura 19) . El precursor del polipéptido predicho es de 455 aminoácidos de longitud (Figura 20) . La proteína PR0347 de longitud completa mostrada en la Figura 20 tiene un peso molecular estimado de aproximadamente 50,478 daltons y un pl de aproximadamente 8.44. El clon DNA44176-1244 fue depositado en el ATCC y se le asignó el no. de depósito de ATCC, ATCC 209532. El análisis de la secuencia de aminoácidos del PR0347 de longitud completa sugiere que las porciones del mismo poseen homología significativa a varias proteínas secretorias ricas en cisteína, indicando así que el PR0347 puede ser una nueva proteína secretoria rica en cisteína. EJEMPLO 12: Aislamiento de los Clones de ADNc que Codifican al PR0354 Humano Se buscó una base de datos de ADN de una marca de secuencia expresada (EST) (LIFESEQ™, Incyte Pharmaceuticals, Palo Alto, CA) y varias secuencias EST se identificaron las cuales poseen ciertos grados de homología con la cadena pesada del inhibidor inter-alfa-tripsina y con otra. Aquellas secuencias EST se alinearon utilizando phrap y se obtuvo una secuencia de consenso. La secuencia de ADN de consenso se extendió entonces utilizando ciclos repetidos de BLAST y phrap para extender la secuencia de consenso tanto como sea posible utilizando las secuencias EST homologas derivadas tanto de las bases de datos EST públicas (por ejemplo, GenBank) como de la base de datos de ADN EST particular (LIFESEQ™, Incyte Pharmaceuticals, Palo Alto, CA) . La secuencia del ensamble extendido se designó aquí DNA39633. Se realizaron las búsquedas anteriores utilizando el programa de computadora BLAST ó BLAST2 (Altschul, y Gish, Methods in Enzymology 266: 460-480 (1996)). Aquellas comparaciones con el registro Blast de 70 (o en algunos casos 90) o mayores que no codificaron proteínas conocidas fueron amontonadas y ensambladas en las secuencias de ADN de consenso con el programa "phrap" (Phil Green, University of Washington, Seattle, Washington) . En base a la secuencia de consenso DNA39633 obtenida como se describió anteriormente, se sintetizaron los oligonucleótidos: 1) para identificar mediante PCR una biblioteca de ADNc que contenía la secuencia de interés, y 2) para usarse como sondas para aislar un clon de la secuencia de codificación de longitud completa para el PR0354. Los cebadores de PCR hacia delante y hacia atrás o inverso en general van desde 20 a 30 nucleótidos y a menudo están diseñados para dar un producto de PCR de aproximadamente 100-1000 bp de longitud. Las secuencias de la sonda son típicamente de 40-55 bp de longitud. En algunos casos, los oligonucleótidos adicionales se sintetizan cuando la secuencia de consenso es mayor de aproximadamente 1-1.5 kbp. Para seleccionar varias bibliotecas para un clon de longitud completa, se seleccionó el ADN de las bibliotecas mediante la amplificación con PCR, como por Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, con el par cebador de PCR. Una biblioteca positiva se utilizó entonces para aislar los clones que codifican al gen de interés utilizando el oligonucleótido de la sonda y uno de los pares cebadores. Se sintetizaron los cebadores PCR como sigue: cebador PCR delantero 1 (39633. fl) 5'-GTGGGAACCAAACTCCGGCAGACC-3' (SEC. ID NO: 56) cebador PCR delantero 2 (39633. f2) 5'-CACATCGAGCGTCTCTGG-3' (SEC. ID NO: 57) cebador PCR inverso (39633. rl) 5'-AGCCGCTCCTTCTCCGGTTCATCG-3' (SEC. ID NO: 58) Adicionalmente, se construyó una sonda de hibridización del oligonucleótido sintética a partir de la secuencia de consenso DNA39633 de consenso que tenía la siguiente secuencia de nucleótidos sonda de hibridización 5' -TGGAAGGACCACTTGATATCAGTCACTCCAGACAGCATCAGGGATGGG-3' (SEC. ID NO: 59) Para separar varias bibliotecas de una fuente de un clon de longitud completa, se seleccionó el ADN de las bibliotecas mediante amplificación por PCR con el par del cebador de PCR identificado arriba. Una biblioteca positiva se utilizó entonces para aislar los clones que codifican al gen del PR0354 utilizando el oligonucleótido de sonda y uno de los cebadores PCR. Se aisló el ARN para la construcción de las bibliotecas de ADNc a partir del tejido de riñon fetal humano (LIB227) . Las bibliotecas de ADNc utilizadas para aislar los clones de ADNc se construyeron mediante métodos estándar utilizando reactivos disponibles comercialmente tales como aquéllos de Invitrogen, San Diego, CA. Se cebó el ADNc con el oligo dT que contiene un sito Notl, enlazado con una punta roma a los adaptadores de hemicinasa de Salí, escindido con Notl, de un tamaño apropiado para la electrofóresis en gel, y se clonó en una orientación definida en un vector de clonación adecuado (tal como pRK5B ó pRKD; pRK5B es un precursor del pRK5D que no contiene el sitio Sfil; ver Holmes et al., Science, 253: 1278-1280 (1991)) en los sitios únicos Xhol y Notl. La secuenciación del ADN de los clones aislados como se describió arriba dio la secuencia de ADN de longitud completa para el PR0354 [designado aquí como DNA44192-1246] (SEC. ID NO: 54) y la secuencia de la proteína derivada para el PR0354. La secuencia de nucleótidos completa de DNA44192-1246 se muestra en la Figura 21 (SEC. ID NO: 54) . El clon DNA44192-1246 contiene una sola estructura de lectura abierta con un sitio de iniciación de traducción aparente en las posiciones del nucleótido 72-74 y que termina en el codon de detención después de las posiciones del nucleótido 2154-2156 (Figura 21) . El precursor del polipéptido predicho es de 694 aminoácidos de longitud (Figura 22). La proteína PR0354 de longitud completa mostrada en la Figura 22 tiene un peso molecular estimado de aproximadamente 77,400 daltons y un pl de aproximadamente 9.54. El clon DNA44192-1246 ha sido depositado en el ATCC y se le asignó el no. de depósito de ATCC, ATCC 209531. El análisis de la secuencia de aminoácidos del polipéptido PR0354 de longitud completa sugiere que él mismo posee homología significativa a la proteína de la cadena pesada del inhibidor inter-alfa-tripsina, indicando así que el PR0354 puede ser un nuevo homólogo de la proteína de la cadena pesada del inhibidor inter-alfa-tripsina.

EJEMPLO 13: Aislamiento de los Clones de ADNc que Codifican al PR0355 Humano Una secuencia de ADN de consenso se ensambló en relación a otras secuencias EST utilizando BLAST y phrap como se describió en el Ejemplo 1 anterior. Esta secuencia de consenso se designó aquí como DNA35702. En base a la secuencia de consenso DNA35702, se sintetizaron los oligonucleótidos: 1) para identificar mediante PCR de una biblioteca de ADNc que contenía la secuencia de interés, y 2) para usarse como sondas para aislar un clon de la secuencia de codificación de longitud completa para el PR0355. Se sintetizaron los cebadores PCR delantero e inverso -como sigue: cebador PCR delantero 5'-GGCTTCTGCTGTTGCTCTTCTCCG -3' (SEC. ID. NO: 62) cebador PCR delantero 5'-GTACACTGTGACCAGTCAGC-3' (SEC. ID. NO: 63) cebador PCR delantero 5'-ATCATCACAGATTCCCGAGC-3' (SEC. ID. NO: 64) cebador PCR inverso 5'-TTCAATCTCCTCACCTTCCACCGC -3' (SEC. ID. NO: 65) cebador PCR inverso 5'-ATAGCTGTGTCTGCGTCTGCTGCG -3' (SEC. ID. NO: 66) Adicionalmente, se construyó una sonda de hibridización del oligonucleótido sintética a partir de la secuencia DNA35702 de consenso que tenía la siguiente secuencia de nucleótidos sonda de hibridización 5' -CGCGGCACTGATCCCCACAGGTGATGGGCAGAATCTGTTTACGAAAGACG-3' (SEC. ID. NO: 67) Para separar varias bibliotecas de una fuente de un clon de longitud completa, se seleccionó el ADN de las bibliotecas mediante amplificación por PCR con los pares del cebador de PCR identificados arriba. Una biblioteca positiva se utilizó entonces para aislar los clones que codifican al gen PR0355 utilizando el oligonucleótido de sonda y uno de los cebadores PCR. Se aisló el ARN para la construcción de las bibliotecas de ADNc a partir de tejido de hígado fetal humano. La secuenciación del ADN de los clones aislados como se describió arriba dio la secuencia de ADN de longitud completa para el PR0355 [designado aquí como DNA39518-1247] (SEC. ID NO: 60) y la secuencia de la proteína derivada para el PR0355.

La secuencia de nucleótidos completa del DNA39518- 1247 se muestra en la Figura 23 (SEC. ID NO: 60). El clon DNA39518-1247 contiene una sola estructura de lectura abierta con un sitio de iniciación de traducción aparente en las posiciones del nucleótido 22-24 y que termina en el codon de detención en las posiciones del nucleótido 1342- 1344 (Figura 23) . El precursor del polipéptido predicho es de 440 aminoácidos de longitud (Figura 24). La proteína PR0355 de longitud completa mostrada en la Figura 24 tiene un peso molecular estimado de aproximadamente 48,240 daltons y un pl de aproximadamente 4.93. Además, las regiones de interés incluyen el péptido de señal, las repeticiones de Ig en el dominio extracelular, sitios de N-glicosilación potenciales, y el dominio de transmembrana potencial, están designados en la Figura 24. El clon DNA39518-1247 fue depositado en el ATCC y se le asignó el no. de depósito de ATCC, ATCC 209529. El análisis de la secuencia de aminoácidos del PR0355 de longitud completa sugiere que las porciones del mismo poseen homología significativa a la proteína CRTAM, indicando así que el PR0355 puede ser una nueva proteína CRTA .

EJEMPLO 14: Aislamiento de los Clones de ADNc que Codifican al PR0357 Humano El clon no. "2452972" de la marca de expresión de la secuencia mediante Incyte Pharmaceuticals, Palo Alto, CA se utilizó como una búsqueda de base de datos. Las secuencias del dominio extracelular (ECD) (que incluyen la secuencia de la señal de secreción, si es que la hay) desde aproximadamente 950 proteínas secretadas conocidas desde la base de datos pública Swiss-Prot se utilizaron para buscar las bases de datos de la marca de secuencia expresada (EST) la cual se traslapa con una porción del clon EST no. "2452972" de Incyte. Las bases de datos EST incluyen bases de datos públicos (por ejemplo, GenBank), y una base de datos de ADN EST particular (LIFESEQ™, Incyte Pharmaceuticals, Palo Alto, CA) . La búsqueda fue realizada utilizando el programa de computadora BLAST ó BLAST2 (Altschul, y Gish, Methods in Enzymology 266: 460-80 (1996)) como una comparación de las secuencias de la proteína ECD a una traducción de la estructura 6 de las secuencias EST. Aquellas comparaciones con el registro Blast de 70 (o en algunos casos 90) o mayores que no codificaron proteínas conocidas fueron amontonadas y ensambladas en las secuencias de ADN de consenso con el programa "phrap" (Phil Green, University of Washington, Seattle, Washington) . Una secuencia de ADN de consenso se ensambló en relación a otras secuencias EST utilizando phrap. Esta secuencia de consenso se designó aquí DNA37162. En este caso, la secuencia de consenso se extendió utilizando los ciclos repetidos de BLAST y phrap para extender la secuencia del consenso tanto como fuera posible utilizando las fuentes de las secuencias EST descritas arriba. En base a la secuencia de consenso DNA37162, se sintetizaron los oligonucleótidos 1) para identificar mediante PCR una biblioteca de ADNc que contenía la secuencia de interés, y 2) para utilizarse como sondas para aislar un clon de secuencia de codificación de longitud completa de PR0257. Los cebadores PCR delantero e inverso en general estuvieron en el rango desde 20 a 30 nucleótidos y a menudo están diseñados para dar un producto de PCR de aproximadamente 100-1000 bp de longitud. Las secuencias de la sonda son típicamente de 40-55 bp de longitud. En algunos casos, los oligonucleótidos adicionales se sintetizan cuando la secuencia de consenso es mayor de aproximadamente 1-1.5 kbp. Para seleccionar varias bibliotecas para un clon de longitud completa, se seleccionó el ADN de las bibliotecas mediante la amplificación con PCR, como lo indica Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, con el par cebador PCR. Una biblioteca positiva se utilizó entonces para aislar los clones que codifican al gen de interés utilizando el oligonucleótido de sonda y uno de los pares 5 cebadores. Se sintetizaron los cebadores PCR como sigue: cebador PCR delantero 1: 5'-CCCTCCACTGCCCCACCGACTG-3' (SEC. ID NO: 70); cebador PCR inverso 1: 10 5'-CGGTTCTGGGGACGTTAGGGCTCG-3' (SEC. ID NO: 71); y cebador PCR delantero 2: 5'-CTGCCCACCGTCCACCTGCCTCAAT-3' (SEC. ID NO: 72). Adicionalmente, se construyó una sonda de hibridización del oligonucleótido sintética a partir de la 15 secuencia de consenso DNA37162 de consenso que tenía la siguiente secuencia de nucleótidos: sonda de hibridización 1: 5'-AGGACTGCCCACCGTCCACCTGCCTCAATGGGGGCACATGCCACC-3' (SEC. ID NO: 73) ; y 20 sonda de hibridización 2: 5' -ACGCAAAGCCCTACATCTAAGCCAGAGAGAGACAGGGCAGCTGGG-3' (SEC. ID NO: 74) . Para separar varias bibliotecas de una fuente de un -U-t-ta^jÉ- d. clon de longitud completa, se seleccionó el ADN de las bibliotecas mediante amplificación por PCR con el par del cebador de PCR identificado arriba. Una biblioteca positiva se utilizó entonces para aislar los clones que codifican al gen del PR0357 utilizando el oligonucleótido de sonda y uno de los cebadores PCR. Se aisló el ARN para la construcción de las bibliotecas de ADNc a partir del tejido de hígado fetal humano. Las bibliotecas de ADNc utilizadas para aislar los clones de ADNc se construyeron mediante métodos estándar utilizando reactivos disponibles comercialmente tales como aquéllos de Invitrogen, San Diego, CA. Se cebó el ADNc con el oligo dT que contiene un sito Notl, enlazado con una punta roma a los adaptadores de hemicinasa de Salí, escindido con Notl, de un tamaño apropiado para la electrofóresis en gel, y se clonó en una orientación definida en un vector de clonación adecuado (tal como pRKB ó pRKD; pRK5B es un precursor del pRK5D que no contiene el sitio Sfil; ver Holmes et al., Science, 253: 1278-1280 (1991)) en los sitios únicos Xhol y Notl. La secuenciación del ADN de los clones aislados como se describió arriba dio la secuencia de ADN de longitud completa para el PR0357 [designado aquí como DNA44804-1248] (SEC. ID NO: 68) y la secuencia de la proteína derivada para el PR0357. La secuencia de nucleótidos completa de DNA44804-1248 se muestra en la Figura 25 (SEC. ID NO: 68) . El clon DNA44804-1248 contiene una sola estructura de lectura abierta con un sitio de iniciación de traducción aparente en las posiciones del nucleótido 137-139 y que termina en el codon de detención después de las posiciones del nucleótido 1931-1933 (Figura 25) . El precursor del polipéptido predicho es de 598 aminoácidos de longitud (Figura 26) . El clon DNA44804-1248 ha sido depositado en el ATCC y se le asignó v el no. de depósito de ATCC, ATCC 209527. El análisis de la secuencia de aminoácidos del polipéptido PR0357 de longitud completa sugiere que las porciones del mismo poseen homología significativa al ALS, indicando así que el PR0357 puede ser una nueva proteína con repeticiones ricas en leucina relacionada a ALS. EJEMPLO 15: Aislamiento de los Clones de ADNc que Codifican al PR0715 Humano Se buscó una base de datos de ADN EST particular (LIFESEQ™, Incyte Pharmaceuticals, Palo Alto, CA) para las secuencias EST que codifican los polipéptidos que tienen homología con el TNF-a. Esta búsqueda dio como resultado la identificación de la Marca de Secuencia Expresada de Incyte No. 2099855. Una secuencia de ADN de consenso se ensambló en relación a otras secuencias EST utilizando seqext y "phrap" (Phil Green, University of Washington, Seattle, Washington) . Esta secuencia de consenso se designa aquí como DNA52092. En base a la alineación de varios clones EST identificados en este ensamble, un solo clon EST del conjunto EST de Merck/Washington University (clon EST no. 725887, Acceso No. AA292358) se obtuvo y su inserto se secuenció. La secuencia DNA52722-1229 de longitud completa se obtuvo entonces de la secuenciación del inserto de ADN del clon EST no. 725887. La secuencia de nucleótidos completa del DNA52722-1229 se muestra en la Figura 27 (SEC. ID NO: 75) . El clon DNA52722-1229 contiene una sola estructura de lectura abierta con un sitio de iniciación de traducción aparente en las posiciones del nucleótido 114-116 y que termina en el codon de detención en las posiciones del nucleótido 864-866 (Figura 27). El precursor del polipéptido predicho es de 250 aminoácidos de longitud (Figura 28). La proteína PR0715 de longitud completa mostrada en la Figura 28 tiene un peso molecular estimado de aproximadamente 27,433 daltons y un pl de aproximadamente 9.85.

El análisis de la secuencia de aminoácidos de los polipéptidos PR0715 de longitud completa sugiere que las porciones de los mismos poseen homología significativa a la familia del factor de necrosis del tumor de las proteínas, indicando así que el PR0715 es una nueva proteína del factor de necrosis del tumor. EJEMPLO 16: Aislamiento de los Clones de " ADNc que Codifican al PR0353 Humano Una secuencia de ADN de consenso se ensambló en relación a otras secuencias EST utilizando phrap como se describió en el Ejemplo 1 anterior. Esta secuencia de consenso se designó aquí como DNA36363. La secuencia de ADN de consenso se extendió entonces utilizando ciclos repetidos de BLAST y phrap para extender la secuencia de consenso tanto como sea posible utilizando las fuentes de las secuencias EST descritas anteriormente. En base a la secuencia de consenso DNA36363, se sintetizaron los oligonucleótidos: 1) para identificar mediante PCR una biblioteca de ADNc que contenía la secuencia de interés, y 2) para usarse como sondas para aislar un clon de la secuencia de codificación de longitud completa para el PR0353. En base a la secuencia de consenso DNA36363, se sintetizaron los cebadores PCR delantero e inverso como sigue: cebador PCR delantero 5'-TACAGGCCCAGTCAGGACCAGGGG-3' (SEC. ID NO: 79) cebador PCR inverso 5'-CTGAAGAAGTAGAGGCCGGGCACG-3' (SEC. ID NO: 80). Adicionalmente, se construyó una sonda de hibridización del oligonucleótido sintética a partir de la secuencia de consenso DNA36363 de consenso que tenía la siguiente secuencia de nucleótidos: sonda de hibridización 5'-CCCGGTGCTTGCGCTGCTGTGACCCCGGTACCTCCATGTACCCGG-3' (SEC. ID NO: 81) Para separar varias bibliotecas de una fuente de un clon de longitud completa, se seleccionó el ADN de las bibliotecas mediante amplificación por PCR con el par del cebador de PCR identificado arriba. Una biblioteca positiva se utilizó entonces para aislar los clones que codifican al gen del PR0353 utilizando el oligonucleótido de sonda y uno de los cebadores PCR. Se aisló el ARN para la construcción de las bibliotecas de ADNc a partir del tejido de riñon fetal humano. La secuenciación del ADN de los clones aislados como se describió arriba dio la secuencia de ADN de longitud completa para el PR0353 [designado aquí como DNA41234-1242] (SEC. ID NO: 77) y la secuencia de la proteína derivada para el PR0353. 5 La secuencia de nucleótidos completa de DNA41234-1242 se muestra en la Figura 29 (SEC. ID NO: 77). El clon DNA41234-1242 contiene una sola estructura de lectura abierta con un sitio de iniciación de traducción aparente en las posiciones del nucleótido 305-307 y que termina en el codon de detención después de las posiciones del nucleótido 1148-1150 (Figura 29) . El precursor del polipéptido predicho es de 281 aminoácidos de longitud (Figura 30) . Las regiones importantes de la secuencia de aminoácidos codificada por el PR0353 incluye el péptido de señal, que corresponde a los aminoácidos 1-26, el inicio de la proteína madura en la posición 27 del aminoácido, un sitio de N-glicosilación potencial, que corresponde a los aminoácidos 93-98 y una región que tiene homología con un precursor de la proteína relacionada al complemento de adipocitos de 30 kd, que corresponde a los aminoácidos 99-281. El clon DNA41234-1242 ha sido depositado en el ATCC y se le asignó el no. de depósito de ATCC, ATCC 209618. El análisis de la secuencia de aminoácidos de los -^-ta-ua-ia?i--??-? polipéptidos PR0353 de longitud completa sugiere que las porciones de los mismos poseen homología significativa a las porciones de las proteínas complementarias de humano y murino, indicando así que el PR0353 puede ser una nueva proteína complementaria. EJEMPLO 17: Aislamiento de los Clones de ADNc que Codifican al PR0361 Humano Una secuencia de ADN de consenso se ensambló en relación a otras secuencias EST utilizando phrap como se describió en el Ejemplo 1 anterior. Esta secuencia de consenso se designó aquí como DNA40654. En base a la secuencia de consenso DNA40654, se sintetizaron los oligonucleótidos: 1) para identificar mediante PCR de una biblioteca de ADNc que contenía la secuencia de interés, y 2) para usarse como sondas para aislar un clon de la secuencia de codificación de longitud completa para el PR0361. Se sintetizaron los cebadores PCR delantero e inverso como sigue: cebador PCR delantero 5'-AGGGAGGATTATCCTTGACCTTTGAAGACC-3' (SEC. ID. NO: 84) cebador PCR delantero 5'-GAAGCAAGTGCCCAGCTC-3' (SEC. ID. NO: 85) cebador PCR delantero 5'-CGGGTCCCTGCTCTTTGG-3' (SEC. ID. NO: 86) cebador PCR inverso 5'-CACCGTAGCTGGGAGCGCACTCAC-3' (SEC. ID. NO: 87) cebador PCR inverso 5'-AGTGTAAGTCAAGCTCCC-3' (SEC. ID. NO: 88) Adicionalmente, se construyó una sonda de hibridización del oligonucleótido sintética a partir de la secuencia DNA40654 de consenso que tenía la siguiente secuencia de nucleótidos sonda de hibridización 5' -GCTTCCTGACACTAAGGCTGTCTGCTAGTCAGAATTGCCTCAAAAAGAG-3' (SEC. ID. NO: 89) Para separar varias bibliotecas de una fuente de un clon de longitud completa, se seleccionó el ADN de las bibliotecas mediante amplificación por PCR con los pares del cebador de PCR identificados arriba. Una biblioteca positiva se utilizó entonces para aislar los clones que codifican al gen PR0361 utilizando el oligonucleótido de sonda y uno de los cebadores PCR. Se aisló el ARN para la construcción de las bibliotecas de ADNc a partir de tejido de riñon fetal humano.

La secuenciación del ADN de los clones aislados como se describió arriba dio la secuencia de ADN de longitud completa para el PR0361 [designado aquí como DNA45410-1250] (SEC. ID NO: 82) y la secuencia de la proteína derivada para el PR0361. La secuencia de nucleótidos completa del DNA45410- 1250 se muestra en la Figura 31 (SEC. ID NO: 82) . El clon DNA45410-1250 contiene una sola estructura de lectura abierta con un sitio de iniciación de traducción aparente en las posiciones del nucleótido 226-228 y que termina en el codon de detención en las posiciones del nucleótido 1519- 1521 (Figura 31). El precursor del polipéptido predicho es de 431 aminoácidos de longitud (Figura 32) . La proteína PR0361 de longitud completa mostrada en la Figura 32 tiene un peso molecular estimado de aproximadamente 46,810 daltons y un pl de aproximadamente 6.45. Además, las regiones de interés incluyen el dominio de transmembrana (aminoácidos 380-409) y las secuencias típicas de la familia arginasa de las proteínas (aminoácidos 3-14 y 39-57) están designados en la Figura 32. El clon DNA45410-1250 fue depositado en el ATCC y se le asignó el no. de depósito de ATCC, ATCC 209621. El análisis de la secuencia de aminoácidos del PR0361 de longitud completa sugiere que las porciones del mismo poseen homología significativa a las proteínas de quitinasa y/o mucina, indicando así que el PR0361 puede ser una nueva proteína de mucina y/o quitinasa. EJEMPLO 18: Aislamiento de los Clones de ADNc que Codifican al PR0365 Humano Una secuencia de ADN de consenso se ensambló en relación a otras secuencias EST utilizando phrap como se describió en el Ejemplo 1 anterior. Esta secuencia de consenso se designó aquí como DNA35613. En base a la secuencia de consenso DNA35613, se sintetizaron los oligonucleótidos: 1) para identificar mediante PCR de una biblioteca de ADNc que contenía la secuencia de interés, y 2) para usarse como sondas para aislar un clon de la secuencia de codificación de longitud completa para el PR0365. Se sintetizaron los cebadores PCR delantero e inverso como sigue: cebador PCR delantero 5'-AATGTGACCACTGGACTCCC-3' (SEC. ID. NO: 92) cebador PCR delantero 5'-AGGCTTGGAACTCCCTTC-3' (SEC. ID. NO: 93) cebador PCR inverso 5'-AAGATTCTTGAGCGATTCCAGCTG-3' (SEC. ID. NO: 94) Adicionalmente, se construyó una sonda de hibridización del oligonucleótido sintética a partir de la secuencia DNA35613 de consenso que tenía la siguiente secuencia de nucleótidos sonda de hibridización 5' -AATCCCTGCTCTTCATGGTGACCTATGACGACGGAAGCACAAGACTG-3' (SEC. ID. NO: 95) Para separar varias bibliotecas de una fuente de un clon de longitud completa, se seleccionó el ADN de las bibliotecas mediante amplificación por PCR con los pares del cebador de PCR identificados arriba. Una biblioteca positiva se utilizó entonces para aislar los clones que codifican al gen PR0365 utilizando el oligonucleótido de sonda y uno de los cebadores PCR. Se aisló el ARN para la construcción de las bibliotecas de ADNc a partir de tejido de riñon fetal humano. La secuenciación del ADN de los clones aislados como se describió arriba dio la secuencia de ADN de longitud completa para el PR0365 [designado aquí como DNA46777-1253] (SEC. ID NO: 90) y la secuencia de la proteína derivada para el PR0365. La secuencia de nucleótidos completa del DNA46777-1253 se muestra en la Figura 33 (SEC. ID NO: 90) . El clon DNA46777-1253 contiene una sola estructura de lectura abierta con un sitio de iniciación de traducción aparente en las posiciones del nucleótido 15-17 y que termina en el codon de detención en las posiciones del nucleótido 720-722 (Figura 33) . El precursor del polipéptido predicho es de 235 aminoácidos de longitud (Figura 34) . Las regiones importantes de la secuencia de polipéptidos codificada por el clon DNA46777-1253 han sido identificadas e incluyen lo siguiente: un péptido de señal que corresponde a los aminoácidos 1-20, el inicio de la proteína madura que corresponde al aminoácido 21, y sitios de N-glicosilación potenciales como se muestra en la Figura 34. El clon DNA46777-1253 fue depositado en el ATCC y se le asignó el no. de depósito de ATCC, ATCC 209619. El análisis de la secuencia de aminoácidos del PR0365 de longitud completa sugiere que las porciones del mismo poseen homología significativa a la proteína humana 2-19, indicando así que el PR0365 puede ser un nuevo homólogo de la proteína humana 2-19. EJEMPLO 19: Uso del Acido Nucleico que Codifica al Polipéptido PRO como Sondas de Hibridización El siguiente método describe el uso de una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido PRO como una sonda de hibridización. El ADN que comprende la secuencia de codificación de un polipéptido PRO de interés que se describe aquí puede ser empleado como una sonda o usarse como una base desde la cual 5 se preparen sondas para ADNs homólogos (tales como aquéllos que codifican variantes que se presentan de manera natural del polipéptido PRO) en bibliotecas de ADNc de tejido humano o en bibliotecas genómicas de tejido humano. La hibridización y el lavado de los filtros que contienen ya sea ADNs de la biblioteca, se realizan bajo las siguientes condiciones altamente severas. La hibridización de la sonda derivada del ácido nucleico que codifica al polipéptido PRO radioetiquetado a los filtros se realizó en una solución de formamida al 50%, SSC 5x, SDS 0.1%, pirofosfato de sodio 0.1%, fosfato de sodio 50 mM, pH 6.8, solución de Denhardt 2x, y sulfato de dextrano al 10% a 42°C durante 20 horas. El lavado de los filtros se realizó en una solución acuosa de SSC O.lx y SDS 0.1% a 42°C. Los ADNs que tenían una identidad de secuencia deseada con el ADN que codifica al polipéptido PRO de secuencia nativa, de longitud completa se puede identificar entonces utilizando técnicas estándar conocidas en la técnica . iilirri ll .?É~?M ?ir"-?l? -? m u EJEMPLO 20: Expresión de los Polipéptidos PRO en E. coli Este ejemplo ilustra la preparación de una forma no glicosilada de un polipéptido PRO deseado mediante expresión recombinante en E. coli . La secuencia de ADN que codifica al polipéptido PRO deseado se amplifica inicialmente utilizando los cebadores PCR. Los cebadores deberán contener sitios de enzima de restricción que corresponden a los sitios de enzima de restricción en el vector de expresión seleccionado. Se puede emplear una variedad de vectores de expresión. Un ejemplo de un vector adecuado es pBR322 (derivado de E. coli ; ver Bolívar et al., Gene, 2:95 (1977)) que contiene los genes para la resistencia a la ampicilina y a la tetraciclina. El vector se digiere con la enzima de restricción y se desfosforila . Las secuencias amplificadas de PCR se ligan entonces en el vector. El vector preferiblemente incluirá secuencias que codifiquen para un gen de resistencia al antibiótico, un promotor trp, un líder polihis (que incluye los primeros seis codones STII, la secuencia polihis, y el sitio de escisión de la enterocinasa) , la región de codificación del polipéptido PRO específico, el terminador transcripcional lambda, y un gen argU. La mezcla de ligación se usa entonces para transformar una cepa de E. coli seleccionada utilizando los métodos descritos en Sambrook et al., supra. Las transformantes se identifican por su capacidad de crecer en placas LB y las colonias resistentes al antibiótico se seleccionan así. El ADN del plásmido se puede aislar y confirmar mediante análisis de restricción y secuenciación de ADN. Los clones seleccionados se pueden hacer crecer durante toda la noche en un medio de cultivo líquido tal como caldo LB suplementado con antibióticos. El cultivo durante toda la noche puede subsecuentemente ser usado para inocular un cultivo a gran escala. Las células se hacen crecer entonces a una densidad óptica deseada, durante la cual el promotor de expresión se activa. Después de cultivar las células durante varias horas, las células se pueden cosechar durante centrifugación. Las pelotillas de células obtenidas mediante centrifugación se pueden solubilizar utilizando varios agentes conocidos en la técnica, y el polipéptido PRO solubilizado se puede purificar entonces utilizando una columna que forma quelatos con metales bajo condiciones que permiten una aglutinación muy cercana de la proteína. El PRO se expresó en E . coli en una forma etiquetada o marcada poli-His, utilizando el siguiente procedimiento. El ADN que codifica al PRO se amplificó inicialmente utilizando los cebadores PCR seleccionados. Los cebadores contenidos en los sitios de la enzima de restricción que corresponden a los sitios de enzima de restricción en el vector de expresión seleccionado, y otras secuencias útiles que proporcionan una iniciación de traducción confiable y eficiente, purificación rápida en una columna que forma quelatos de metal, y la eliminación proteolítica con enterocinasa. Las secuencias marcadas poli-His, amplificadas con PCR se ligaron entonces en un vector de expresión, las cuales se usan para transformar un huésped de E. coli en base en la cepa 52 (W3110 fuhA(tonA) lon galE rpoHts (htpRts) clpP (laclq). Los transformantes primero se hicieron crecer en LB que contenía carbenicilina 50 mg/mL a 30°C con agitación hasta que se alcance una densidad óptica u O.D. 600 de 3-5. Los cultivos se diluyeron entonces de 50 a 100 veces en un medio CRAP (preparado mediante mezclado de 3.57 g de (NH-jjSO-j, 0.71 g de citrato de sodio«2H20, 1.07 g de KCl, 5.36 g de extracto de levadura Difco, 5.36 g de SF hycase Sheffield en 500 mL de agua, así como MPOS 110 mM, pH 7.3, glucosa al 0.55% (p/v) y MgS?4 7 mM) y se hace crear durante aproximadamente 20-30 horas a 30°C con agitación. Se eliminaron las muestras para verificar la expresión mediante análisis SDS-PAGE, y el cultivo volumétrico se centrifugó hasta formar pelotillas de células. Las pelotillas de células se congelaron hasta la purificación y el redoblado. La pasta de E . coli a partir de fermentaciones de 0.5 a 1 L (pelotillas de 6-10 g) se resuspendieron en 10 volúmenes (p/v) en guanidina 7 M, Tris 20 mM, amortiguador pH 8. Se agregó sulfito de sodio sólido y tetrationato de sodio para hacer las concentraciones finales de 0.1 M y 0.02 M, respectivamente, y la solución se agitó durante toda la noche a 4°C. Esta etapa da como resultado una proteína desnaturalizada con todos los residuos de cisteína bloqueados mediante sulfitolización. La solución se centrifugó a 40.000 rpm en una Ultracentrífuga Beckman durante 30 minutos. El sobrenadante se diluyó con 3-5 volúmenes del amortiguador de columna formadora de quelatos de metal iguanidina 6 M, Tris 20 mM, pH 7.4) y se filtró a través de filtros de 0.22 mieras para clarificación. Dependiendo del extracto clarificado se cargó en una columna formadora de quelatos de metal de Ni-NTA de Qiagen de 5 ml, equilibrada en el amortiguador de la columna de quelato de metal. La columna se lavó con una solución amortiguadora adicional que contiene imidazol 50 mM (Calbiochem, grado Utrol), pH 7.4. La proteína se eluyó con amortiguador que contenía imidazol 250 mM. Las fracciones que contenían la proteína deseada se conjuntaron y se almacenaron a 4°C. Se estimó la concentración de proteína por su absorbancia a 280 nm utilizando el coeficiente de extinción calculado en base a su secuencia de aminoácidos. Las proteínas fueron redobladas mediante dilución lenta de una muestra en una solución amortiguadora de redoblado preparada recientemente, que consistía de: Tris 20 mM, pH 8.6, NaCl 0.3 M, urea 2.5 M, cisteína 5 mM, glicina 20 mM y EDTA 1 mM. Los volúmenes de redoblado se eligieron de modo que las concentraciones finales de la proteína estuvieran entre 50 a 100 microgramos/mL. La solución de redoblado se agitó suavemente a 4°C durante 12-36 horas. La reacción de redoblado se enfrió rápidamente mediante la adición de TFA hasta una concentración final de 0.4% (pH de aproximadamente 3) . Antes de una purificación posterior de la proteína, la solución se filtró a través de un filtro de 0.22 mieras y se agregó acetonitrilo hasta una concentración final de 2-10%. La proteína de redoblado se sometió a cromatografía en una columna de fase inversa Poros Rl/H utilizando un amortiguador móvil de TFA al 0.1% con elución con un gradiente de acetonitrilo desde 10 hasta 80%. Las alícuotas de las fracciones con una absorbancia de A280 se analizaron en los geles de poliacrilamida SDS y las fracciones que contenían la proteína redoblada homogénea fueron conjuntadas. En general, las especies redobladas adecuadamente de la mayoría de las proteína se eluyeron en las concentraciones más bajas de acetonitrilo puesto que aquellas especies son las más compactas con sus interiores hidrofóbicos revestidos desde la interacción con la resina de fase inversa. Las especies agregadas usualmente se eluyen a concentraciones de acetonitrilo más altas. Además de resolver las formas no dobladas adecuadamente de las proteínas desde la forma deseada, la etapa de la fase inversa también elimina la endotoxina de las muestras. Las fracciones que contienen los polipéptidos PRO doblados deseados se conjuntaron y el acetonitrilo se eliminó utilizando una corriente suave de nitrógeno dirigida a la solución. Las proteínas se formularon en Hepes 20 mM, pH 6.8 con cloruro de sodio 0.14 M y manitol al 4% mediante diálisis o mediante filtración en gel utilizando resinas G25 Superfine (Pharmacia) equilibradas en el amortiguador de formulación y filtradas en esterilidad. Muchos de los polipéptidos PRO descritos en la presente se expresaron exitosamente como se describió anteriormente . EJEMPLO 21: Expresión de los Polipéptidos PRO en las Células de Mamífero Este ejemplo ilustra la preparación de una forma glicosilada de un polipéptido PRO deseado mediante expresión recombinante en células de mamífero. Se empleó el vector, pRK5 (ver EP 307,247, publicada el 15 de Marzo de 1989), como el vector de expresión. Opcionalmente, el ADN que codifica al polipéptido PRO se ligó en el pRK5 con las enzimas de restricción seleccionadas para permitir la inserción del ADN del polipéptido PRO utilizando los métodos de ligación tales como los descritos en Sambrook et al., supra. El vector resultante se llamó el polipéptido PRO pRK5. En una modalidad, las células huésped seleccionadas pueden ser células 293. Las células 293 de humano (ATCC CCL 1573) se hicieron crecer hasta confluencia en las placas de cultivo de tejido en un medio tal como DMEM suplementado con suero de bovino fetal y opcionalmente, con los componentes de nutrientes y/o antibióticos. Se mezclaron aproximadamente 10 µg de ADN del polipéptido PRO pRK5 con aproximadamente 1 µg de ADN que codifica al gen de ARN VA [Thimmappaya et al., Cell, 31.5>43 (1982)] se disuelven en 500 µL de Tris-HCl 1 <-•*" "'*>-' mM, EDTA 0.1 mM, CaCl2 0.227 M. A esta mezcla se agregó, gota a gota, 500 µL de HEPES 50 M (pH 7.35), NaCl 280 mM, NaP?4 1.5 mM, y se permitió que se formará un precipitado durante 10 minutos a 25°C. El precipitado se suspendió y se 5 agregó a las células 293 y se dejó sedimentar durante aproximadamente cuatro horas a 37 °C. El medio de cultivo se aspiró y se agregaron 2 mL de glicerol al 20% en PBS al 20% durante 30 segundos. Se lavaron entonces las células 293 con un medio libre de suero, el medio fresco se agregó y las células se incubaron durante aproximadamente 5 días. Aproximadamente 24 horas después de las transfecciones, se eliminó el medio de cultivo y se reemplazó con medio de cultivo (solo) o con un medio de cultivo que contenía 200 µCi/mL de S-cisteína y 20 µCi/mL de S-metionina. Después de 12 horas de incubación, se colectó el medio condicionado, se concentró en un filtro giratorio, y se cargó en gel SDS al 15%. El gel procesado se puede secar y se expuso a una película durante un periodo seleccionado de tiempo para revelar la presencia del polipéptido PRO. Los cultivos que contienen las células transfectadas pueden sufrir una incubación adicional (en un medio libre de suero) y el medio se probó en varios bioensayos seleccionados. _^^¡g^¡^ En una técnica alternativa, el polipéptido PRO se puede introducir en las células 293 de manera transiente utilizando el método de sulfato de dextrano descrito por Somparyrac et al., Proc. Nati. Acad. Sci., 12:7575 (1981). Las células 293 se hacen crecer hasta una densidad máxima en un matraz giratorio y se agregan 700 µg de ADN del polipéptido PRO pRK5. Las células primero se concentran del matraz giratorio mediante centrifugación y se lavan con PBS. El precipitado de ADN-dextrano se incubó en pelotillas de células durante cuatro horas. Las células se tratan con glicerol al 20% durante 90 segundos, se lavan con un medio de cultivo de tejido, y se re-introducen en el matraz giratorio que contiene el medio de cultivo del tejido, 5 µg/ml de insulina de bovino y 0.1 µg/ml de transferrina de bovino. Después de aproximadamente cuatro días, el medio acondicionado se centrifuga y se filtra para eliminar las células y los desechos. La muestra que contiene el polipéptido PRO expresado se puede concentrar y purificar entonces mediante cualquier método seleccionado tal como diálisis y/o cromatografía en columna. En otra modalidad, los polipéptidos PRO se pueden expresar en células CHO. El polipéptido PRO pRK5 se puede transfectar en células CHO utilizando los reactivos conocidos tales como CaP?4 ó DEAE-dextrano. Como se describió arriba, los cultivos celulares se pueden incubar, y el medio se reemplaza con el medio de cultivo (solo) o el medio que contiene una radioetiqueta tal como 35S-metionina. Después de determinar la presencia del polipéptido PRO, el medio de cultivo se puede reemplazar con un medio libre de suero. Preferiblemente, los cultivos se incuban durante aproximadamente 6 días, y luego el medio condicionado es cosechado. El medio que contiene el polipéptido PRO expresado se puede concentrar y purificar mediante cualquier método seleccionado. El polipéptido PRO marcado con el epítope se puede expresar en células CHO huésped. El polipéptido PRO se puede subclonar fuera del vector pRK5. El inserto del subclon puede someterse a PCR para fusionarse en una estructura con una marca del epítope seleccionada tal como una marca polihis en un vector de expresión del Baculovirus. El inserto del polipéptido PRO etiquetado con poli-his se puede subclonar entonces en un vector accionado SV40 que contiene un marcador de selección tal como DHFR para la selección de clones estables. Finalmente, las células CHO se pueden transfectar (como se describió anteriormente) con el vector accionado SV40. El etiquetado se puede realizar, como se describió anteriormente, para verificar la expresión. El medio de cultivo que contiene el polipéptido PRO marcado con poli-His expresado se puede concentrar entonces mediante cualquier método seleccionado, tal como la cromatografía por afinidad del quelato Ni 2+. El PRO también se puede expresar en las células CHO y/o COS mediante un procedimiento de expresión transiente o en las células CHO mediante otro procedimiento de expresión estable. La expresión estable en las células CHO se realizó utilizando el siguiente procedimiento. Las proteínas fueron expresadas como un constructo IgG (inmunoadhesina) , en las cuales las secuencias de codificación para las formas solubles (por ejemplo dominios extracelulares) de las proteínas respectivas se fusionaron a una secuencia de región constante IgGl que contiene la articulación, el CH2 y los dominios CH2 y/o es una forma marcada con poli-His. Siguiendo la amplificación con PCR, los respectivos ADNs fueron subclonados en un vector de expresión CHO utilizando las técnicas estándar como se describió en Ausubel et al., Current Protocols of Molecular Biology, Unidad 3.16, John Wiley and Sons (1997). Los vectores de expresión CHO se construyeron para tener sitios de restricción compatibles 5' y 3' del ADN de interés para permitir el movimiento de vaivén conveniente de los ADNc. La expresión utilizada del vector en las células CHO es como se describió en Lucas et al . , Nucí . Acids Res . 2? : 9 1774-1779 5 (1996), y utiliza el promotor/mej orador temprano SV40 para accionar la expresión del ADNc de interés y la reductasa de dihidrofolato (DHFR) . La expresión de DHFR permite la selección para un mantenimiento estable del plásmido después de la transfección. 10 Doce microgramos del ADN del plásmido deseado se introdujeron en aproximadamente 10 millones de células CHO utilizando reactivos de transfección disponibles comercialmente Superfect (Quiagen) , Dosper ó Fugene (Boehringer Mannheim) . Las células se hicieron crecer y se describieron en Lucas et al . , supra. Aproximadamente 3 x 10" células se congelaron en una ámpula para un crecimiento y producción adicionales como se describió posteriormente. Las ámpulas que contienen el ADN del plásmido se disolvieron mediante la colocación en un baño de agua y se mezclaron con un movimiento en forma de vórtice. Los contenidos se tomaron a través de una pipeta en un tubo de centrífuga que contenía 10 mLs del medio y se centrifugaron a 1000 rpm durante 5 minutos. El sobrenadante se aspiró y las células se resuspendieron en 10 mL del medio selectivo (0.2 µm de PS20 filtrado con 0.2 µm de suero de bovino fetal diafiltrado al 5%) . Las células se formaron en alícuotas en un recipiente giratorio de 100 mL que contenía 90 mL de un medio selectivo. Después de 1-2 días, las células se transfirieron a un medio giratorio de 250 mL llenado con 150 mL del medio de crecimiento selectivo y se incubaron a 37°C. Después de otros 2-3 días, se sembraron los medios giratorios de 250 mL, 500 mL y 2000 mL con 3 x 105 células/mL. El medio de células se intercambió con un medio fresco mediante centrifugación y resuspensión en el medio de producción. Aunque se puede emplear cualquier medio CHO adecuado, un medio de producción descrito en la Patente Norteamericana No. 5,122,469, expedida el 16 de Junio de 1992 se utilizó realmente. El medio giratorio de producción de 3L se sembró con 1.2 x 10 células/mL. En el día 0, se determinó el pH del número de células. En el día 1, el medio giratorio se muestreó y se empezó el rociado con aire filtrado. En el día 2, el medio giratorio se muestreó, la temperatura se movió a 33°C, y se agregaron 30 mL de 500 g/L de glucosa y 0.6 mL de antiespumante al 10% (por ejemplo, emulsión de polidimetilsiloxano al 35%, Emulsión de Grado Médico 365 de Dow Corning) . Durante toda la producción, el pH se ajustó conforme fue necesario para mantenerse a alrededor de 7.2. Después de 10 días, o hasta que se disminuyó la viabilidad por abajo del 70%, el cultivo celular se cosechó mediante centrifugación y se filtró a través de un filtro de 0.22 µm. El filtrado fue ya sea almacenado a 4°C o cargado inmediatamente en columnas para purificación. Para los constructos marcados con poli-His, las proteínas se purificaron utilizando una columna Ni-NTA (Qiagen) . Antes de la purificación, se agregó el imidazol al medio condicionado a una concentración de 5 mM. El medio condicionado se bombeó en una columna Ni-NTA de 6 mL equilibrada en Hepes 20 mM, pH 7.4, el amortiguador que contenía NaCl 0.3 M e imidazol 5 mM a una velocidad de flujo de 4-5 ml/min. a 4°C. Después de cargarse, la columna se lavó con un amortiguador de equilibrio adicional y la proteína se eluyó con un amortiguador de equilibrio que contenía imidazol al 0.25 M. La proteína altamente purificada se desalinizó subsecuentemente en un amortiguador de almacenamiento que contenía Hepes 10 mM, NaCl 0.14 M y manitol al 4%, pH 6.8, con una columna G25 Superfine (Pharmacia) y se almacenó a -80°C. Los constructos de inmunoadhesina (que contienen Fc) se purificaron del medio condicionado como sigue. El medio condicionado se bombeó en una columna de Proteína A de 5 mL (Pharmacia) que se equilibró en amortiguador de fosfato de sodio 20 mM, pH 6.8. Después de cargarse, la columna se lavó extensivamente con un amortiguador de equilibrio antes de la elución con ácido cítrico 100 mM, pH 3.5. La proteína eluida se neutralizó inmediatamente mediante la recolección de fracciones de 1 mL en tubos que contienen 275 µL de amortiguador Tris de 1 M, pH 9. La proteína altamente purificada se desalinizó subsecuentemente en amortiguador de almacenamiento como se describió para las proteínas marcadas poli-His. La homogeneidad se valoró mediante los geles de poliacrilamida y mediante la secuenciación de aminoácidos N-terminales por la degradación de Edman. Muchos de los polipéptidos PRO descritos en la presente se expresaron exitosamente como se describió anteriormente . EJEMPLO 22: Expresión de los Polipéptidos PRO en las Levaduras El siguiente método describe la expresión recombinante de un polipéptido PRO deseado en levaduras. Primero, los vectores de expresión de levaduras se construyeron para la producción o secreción intracelular de los polipéptidos PRO desde el promotor ADH2/GAPDH. El ADN que codifica un polipéptido PRO deseado, un péptido de señal deseado y el promotor se inserta en los sitios de la enzima de restricción adecuados en el plásmido seleccionado para dirigir la expresión intracelular del polipéptido PRO. Para la secreción, el ADN que codifica al polipéptido PRO se puede clonar al plásmido seleccionado, junto con el ADN que codifica al promotor ADH2/GAPDH, la secuencia señal/líder secretoria del factor alfa de la levadura, y las secuencias enlazadoras (si se necesitan) para la expresión del polipéptido PRO. Las células de levadura tales como la cepa de levadura AB110, se puede transformar entonces con los plásmidos de expresión descritos arriba y cultivos en medios de fermentación seleccionados. Los sobrenadantes de levadura transformados se pueden analizar por precipitación con ácido tricloroacético al 10% y la separación mediante SDS-PAGE, seguido por el teñido de los geles con el teñido Azul Coomassie . El polipéptido PRO recombinante se puede subsecuentemente aislar y purificar mediante la eliminación de células de levadura de la fermentación mediante centrifugación y luego de la concentración del medio utilizando filtros del cartucho seleccionado. El concentrado que contiene el polipéptido PRO se puede adicionalmente purificar utilizando las resinas de cromatografía de columna seleccionada. Muchos de los polipéptidos PRO descritos en la presente se expresaron exitosamente como se describió anteriormente . EJEMPLO 23: Expresión de los Polipéptidos PRO en las Células de Insectos Infectadas con Baculovirus El siguiente método describe la expresión recombinante de los polipéptido PRO en las células de insectos infectadas con Baculovirus. El polipéptido PRO deseado está fusionado corriente arriba de una marca de epítope que contenida en un vector de expresión de un baculovirus. Tales marcas de epítope incluyen las marcas de poli-his y las marcas de inmunoglobulina (como las regiones Fc de IgG) . Se emplea una variedad de plásmidos, que incluyen los plásmidos derivados de los plásmidos disponibles comercialmente tales como pVL1393 (Novagen) . De manera breve, el polipéptido PRO o la porción deseada del polipéptido PRO (tal como la secuencia que codifica el dominio extracelular de una proteína de >? transmembrana) se amplifica mediante PCR con los cebadores complementarios a las regiones 5' y 3' . El cebador 5' puede incorporar sitios de enzima de restricción flanqueantes (seleccionados) . El producto se digiere entonces con 5 aquellas enzimas de restricción seleccionadas y se subclona en el vector de expresión. El baculovirus recombinante se genera mediante la cotransfección del plásmido anterior y el ADN del virus BaculoGold™ (Pharmingen) en células de Spodoptera frugiperda ("Sf9") (ATCC CRL 1711) utilizando lipofectina (disponible comercialmente de GIBCO-BRL) . Después de 4-5 días de incubación a 28°C, los virus liberados se cosechan y se utilizan para amplificaciones posteriores. La infección viral y la expresión de la proteína se realizan como se describe por O'Reilley et al., Baculovirus expression vectors: A Laboratory Manual, Oxford: Oxford University Press (1994) . Se puede purificar entonces el polipéptido PRO marcado con poli-his expresado, por ejemplo, mediante cromatografía por afinidad de quelatos Ni2+ como sigue. Los extractos se preparan de las células Sf9 infectadas con el virus recombinante como se describe por Rupert et al . , Na ture, 362:175-179 (1993). De manera breve, las células Sf9 - ii-ai-i-jl-Ui-.->-^--? se lavan, se resuspenden en amortiguador de sonicación (25 mL de Hepes, pH 7.9; 12.5 mM de MgCl2; EDTA 0.1 mM; Glicerol al 10%; NP-40 al 0.1%; KCl 0.4 M) , y se sonifican dos veces durante 20 segundos en hielo. Los sonificados se aclaran 5 mediante centrifugación y el sobrenadante se diluye 50 veces en amortiguador de carga (fosfato 50 mM, NaCl 300 mM, Glicerol al 10%, pH 7.8 ) y se filtran a través de un filtro de 0.45 µm. La columna de agarosa Ni2+-NTA (disponible comercialmente de Qiagen) se prepara con un lecho de un volumen de 5 mL, se lava con 25 mL de agua y se equilibra con 25 mL de amortiguador de carga. El extracto de células filtrado se carga en la columna a 0.5 mL por minuto. La columna se lava hasta una línea base de A280 con amortiguador de carga, punto en el cual se inicia la recolección la fracción. Enseguida, la columna se lava con un amortiguador de lavado secundario (fosfato 50 mM, NaCl 300 mM, Glicerol al 10%, pH 6.0), que se eluye con una proteína de enlace no específica. Después de alcanzar la línea base A2eo de nuevo, la columna se revela con un gradiente de Imidazol de 0 a 500 mM en el amortiguador de lavado secundario. Se recolectan fracciones de 1 mL y se analizan mediante SDS-PAGE y se tiñen con plata o con manchado western con el conjugado Ni2+- NTA hasta fosfatasa alcalina (Qiagen) . Las fracciones que _ü___St___ contienen el polipéptido PRO marcado con Hisio eluido se conjuntan y se dializan contra el amortiguador de carga. Alternativamente, la purificación del polipéptido PRO marcado con IgG (o marcado con Fc) se puede realizar utilizando técnicas de cromatografía, que incluyen por ejemplo, la cromatografía en columna de la Proteína A ó de la proteína G. Muchos de los polipéptidos PRO descritos en la presente se expresaron exitosamente como se describió anteriormente. EJEMPLO 24: Preparación de los Anticuerpos que se Enlazan a los Polipéptidos PRO Este ejemplo ilustra la preparación de los anticuerpos monoclonales que se pueden enlazar específicamente a un polipéptido PRO. Las técnicas para la producción de los anticuerpos monoclonales son conocidas en la técnica y se describieron, por ejemplo, en Goding, supra. Los inmunógenos que se pueden emplear incluyen el polipéptido PRO purificado, las proteínas de fusión que contienen el polipéptido PRO, y las células que expresan el polipéptido PRO recombinante en la superficie celular. La selección del inmunógeno se puede hacer por un técnico con habilidades en la técnica sin una experimentación indebida. Los ratones, tales como Balb/c, se inmunizan con el inmunógeno del polipéptido PRO emulsificado en un adyuvante de Freund completo y se inyectó subcutáneamente o intraperitonealmente en una cantidad desde 1-100 microgramos. Alternativamente, el inmunógeno se emulsifica en un adyuvante MPL-TDM (Ribi Immunochemical Research, Hamilton, MT) y se inyectan las almohadillas de las patas traseras de los animales. Se dejo crecer la inmunidad en los ratones durante 10 a 12 días posteriores con el inmunogen emulsificado en el adyuvante seleccionado. Posteriormente, durante varias semanas, se le aumentó la inmunidad a los ratones con inyecciones de inmunización adicionales. Las muestras de suero se obtuvieron periódicamente de los ratones de los ratones mediante sangrado retro-orbital para la prueba en los ensayos de ELISA para detectar anticuerpos del polipéptido anti-PRO. Después de que se detectó un título de anticuerpos adecuado, los animales "positivos" para los anticuerpos se puede inyectar con una inyección intravenosa final del polipéptido PRO. De tres a cuadro más tarde, los ratones se sacrificaron y se cosecharon las células del bazo. Las células del bazo se fusionaron entonces (utilizando polietilenglicol al 35%) a una línea celular de mieloma murino seleccionado tal como P3X63AgU.l, disponible de ATCC, No. CRL 1597. Las fusiones generaron células de hibridoma que se pueden entonces colocar en placas de cultivo de tejido de 96 pozos que contienen el medio HAT (hipoxantina, aminopterina, y timidina) para la inhibir la proliferación de células no fusionadas, de híbridos de mieloma, e híbridos celulares del bazo. Las células de hibridoma se pueden seleccionar en un ensayo ELISA para la reactividad contra el polipéptido PRO. La determinación de las células de hibridoma "positivas" secretan los anticuerpos monoclonales deseados contra el polipéptido PRO está dentro de la habilidad en la técnica. Las células de hibridoma positivas se pueden inyectar intraperitonealmente en ratones singeneicos Balb/c para producir ascitos que contienen los anticuerpos monoclonales del polipéptido anti-PRO. Alternativamente, las células de hibridoma se pueden hacer crecer en matraces de cultivo de tejido o en botellas cilindricas. La purificación de los anticuerpos monoclonales producidos en los ascitos se puede complementar utilizando precipitación con sulfato de amonio, seguido de cromatografía de exclusión en gel. Alternativamente, se puede emplear la cromatografía por afinidad basada en el enlace del anticuerpo a la proteína A o a la proteína G. EJEMPLO 25: Purificación de los Polipéptidos PRO Utilizando Anticuerpos Específicos 5 Los polipéptidos PRO nativos o recombinantes se pueden purificar mediante una variedad de técnicas estándar en el arte de la purificación de la proteína. Por ejemplo, el polipéptido pro-PRO, el polipéptido PRO maduro, o el polipéptido pre-PRO se purifican mediante cromatografía por inmunoafinidad utilizando anticuerpos específicos para el polipéptido PRO de interés. En general, una columna de inmunoafinidad se construye mediante acoplando covalentemente el anticuerpo del polipéptido anti-PRO a una resina cromatográfica activada. 15 Las inmunoglobulinas policlonales se preparan a partir del suero inmune ya sea mediante precipitación con sulfato de amonio o mediante purificación en la Proteína A inmovilizada (Pharmacia LKB Biotechnology, Piscataway, N.J.). De manera similar, los anticuerpos monoclonales se preparan a partir del fluido de ascitos de ratón mediante precipitación con sulfato de amonio o cromatografía en la Proteína A inmovilizada. La inmunoglobulina purificada parcialmente se une covalentemente a una resina tíl._nfcÜHi¿É=¡M¡fa cromatográfica tal como SEPHAROSE activada con CnBr (Pharmacia LKB Biotechnology) . El anticuerpo se acopla a la resina, se bloquea la resina, y la resina derivada se lava de acuerdo a las instrucciones del fabricante. 5 Tal columna de inmunoafinidad es utilizada en la purificación del polipéptido PRO mediante la preparación de una fracción a partir de las células que contienen el polipéptido PRO en una forma soluble. Esta preparación se deriva mediante solubilización de la célula completa o de una fracción subcelular obtenida vía centrifugación diferencial mediante la adición de detergente o por otros métodos bien conocidos en la técnica. Alternativamente, el polipéptido PRO soluble que contiene una secuencia de señal se puede secretar en una cantidad útil en el medio en el cual las células se hacen crecer. Una preparación que contiene el polipéptido PRO soluble se hace pasar sobre la columna de inmunoafinidad, y la columna se lava bajo condiciones que permitan la absorbancia preferencial del polipéptido PRO (por ejemplo, amortiguadores iónicamente más fuertes en la presencia de detergente) . Entonces, la columna se eluye bajo condiciones que rompen el enlace del polipéptido PRO/anticuerpo (por ejemplo, un amortiguador con pH bajo tal como uaB-^Mu**--.. aproximadamente pH 2-3, ó una alta concentración de caótropo tal como urea o el ion de tiocianato) , y el polipéptido PRO se recolecta. EJEMPLO 26: Selección del Fármaco Esta invención es particularmente útil para seleccionar compuestos mediante el uso de polipéptido PRO o fragmentos enlazantes del mismo en cualquiera de una variedad de técnicas de selección de fármacos. El polipéptido PRO o fragmento empleado en tal prueba puede ser ya sea libres en solución, fijados a un soporte sólido, llevados en una superficie celular, o localizados intracelularmente. Un método de selección del fármaco utiliza células huésped eucarióticas o procarióticas que se transforman establemente con ácidos nucleicos recombinantes que expresan el polipéptido PRO o fragmentos del mismo. Los fármacos se seleccionan contra tales células transformadas en ensayos de enlace competitivos. Tales células, ya sea en forma viable o fija, se pueden usar para ensayos de enlace estándar. Se puede medir, por ejemplo, la formación de complejos entre el polipéptido PRO o un fragmento del mismo y el agente que se va a probar. Alternativamente, se puede examinar la disminución de la formación del complejo entre el polipéptido PRO y su célula objetivo o los receptores del objetivo provocados por el agente que se va a probar. Así, la invención proporciona métodos para seleccionar fármacos o cualquier otro agente que puede afectar un padecimiento o desorden asociado con el polipéptido PRO. Estos métodos comprenden poner en contacto tal agente con un polipéptido PRO o fragmento del mismo y llevar a cabo el ensayo (I) para la presencia de un complejo entre el agente y el polipéptido PRO o fragmentos del mismo, o (ii) para la presencia de un complejo entre el polipéptido PRO o fragmento del mismo y la célula, mediante métodos bien conocidos en la técnica. En tales ensayos de enlace competitivos, el polipéptido PRO o fragmentos del mismo se etiquetan típicamente. Después de la incubación adecuada el polipéptido PRO libre o fragmento del mismo se separa del que está presente en forma enlazada, y la cantidad de la etiqueta libre o que no forma complejos es una medida de la capacidad del agente particular para enlazar al polipéptido PRO o para interferir con los complejos de polipéptido PRO/célula. Otra técnica para la selección de fármacos proporciona una alta eficiencia de selección para compuestos que tienen una afinidad de enlace adecuada a un polipéptido y se describe en detalle en WO 84/03564, publicada el 13 de Septiembre de 1984. Se estableció brevemente, un gran número de compuestos de prueba de péptidos pequeños diferentes, se sintetizan en un substrato sólido, tal como porciones pequeñas de plástico u otra superficie. Conforme se aplica un polipéptido PRO, el compuesto de prueba de un péptido se hace reaccionar con el polipéptido PRO y se lava. El polipéptido PRO enlazado se detecta mediante métodos bien conocidos en la técnica. El polipéptido PRO purificado también se puede revestir directamente en placas para usarse en las técnicas de selección de fármacos antes mencionadas. Además, se pueden usar anticuerpos no neutralizantes para capturar al péptido e inmovilizarlo en el soporte sólido. Esta invención también contempla el uso de ensayos de selección de fármacos competitivos en los cuales los anticuerpos neutralizantes capaces de enlazar al polipéptido PRO específicamente compiten con un compuesto de prueba para enlazarse a un polipéptido PRO o fragmentos del mismo. De esta manera, los anticuerpos se pueden utilizar para detectar la presencia de cualquier péptido que comparta una o más determinantes antigénicas con el polipéptido PRO. EJEMPLO 27: Diseño Racional del Fármaco El objetivo del diseño racional del fármaco es producir análogos estructurales del polipéptido activo biológicamente de interés (es decir, un polipéptido PRO) o de moléculas pequeñas con las cuales interactúan, por ejemplo, agonistas, antagonistas, o inhibidores. Cualquiera de estos ejemplos se pueden utilizar para diseñar fármacos que son formas más activas o estables del polipéptido PRO o que mejoran o interfieren con la función del polipéptido PRO in vivo ( c . f. , Hodgson, Bio/Technology, 9: 19-21 (1991)). En una modalidad, la estructura tri-dimensional del polipéptido PRO, o de un complejo inhibidor del polipéptido PRO, se determina mediante cristalografía de rayos X, mediante modelado por computadora o, más típicamente, mediante una combinación de las dos modalidades. Tanto la forma y las cargas del polipéptido PRO se pueden obtener para elucidar la estructura y para determinar los sitios activos de la molécula. Menos a menudo, la información útil con respecto a la estructura del polipéptido PRO se puede obtener mediante el modelado basado en la estructura de las proteínas homologas. En ambos casos, la información estructural relevante se utiliza para diseñar moléculas similares al polipéptido PRO análogo o para identificar inhibidores eficientes. Utilizando los ejemplos del diseño racional de fármacos, se pueden incluir las moléculas que tengan actividad o estabilidad como se muestra por Braxton y Wells, Biochemistry, 3_1: 7796-7801 (1992) o que actúen como inhibidores, agonistas, o antagonistas de los péptidos nativos como se muestra por Athauda et al . , J. Biochem. , 113:742-746 (1993). 5 También es posible aislar un anticuerpo específico del objetivo, seleccionado mediante ensayo funcional, como se describió arriba, y entonces resolverlo en su estructura cristalina. Esta modalidad, en principio, genera un núcleo de fármaco con el cual luego se puede subsecuentemente diseñar un fármaco. Es posible desviar la cristalografía de la proteína conjuntamente por la generación de anticuerpos anti-idiotípicos (anti-ids) a un anticuerpo activo farmacológicamente, funcional. Como una imagen al espejo de una imagen del espejo, el sitio de enlace del anti-ids se esperaría para ser un análogo del receptor original. El anti-id podría usarse entonces para identificar y aislar los péptidos de bancos y péptidos producidos química o biológicamente. Los péptidos aislados actuarían entonces como el núcleo del fármaco. 20 En virtud de la presente invención, las cantidades suficientes del polipéptido PRO pueden estar disponibles para realizar tales estudios analíticos como cristalografía por rayos X. Además, el conocimiento de la secuencia de H___wllÍB¡_i__a__- aminoácidos del polipéptido PRO proporcionará aquí una guía para aquéllos que emplean técnicas de modelación por computadora en lugar de o además de cristalografía por rayos X. EJEMPLO 28: /Amplificación de los Genes Este ejemplo muestra que los genes que codifican los polipéptidos PR0327, PR0344, PR0347, PR0357 y PR0715 se amplifican en el genoma de ciertos cánceres del pulmón, colon y/o seno humano y/o líneas celulares. La amplificación esta asociada con la sobreexpresión del producto del gen, indicando que los polipéptidos son objetivos útiles para la intervención terapéutica en ciertos cánceres tales como cánceres de colon, pulmón, seno y otros cánceres. Los agentes terapéuticos pueden tomar la forma de antagonistas del polipéptido PR0327, PR0344, PR0347, PR0357 y PR0715, por ejemplo, los anticuerpos quiméricos, murino-humanos, humanizados o humanos contra un polipéptido PR0327, PR0344, PR0347, PR0357 y PR0715. Estas amplificaciones también son útiles como marcadores de diagnóstico para la presencia de un tipo específico de un tipo de tumor. El material de inicio para la selección fue el ADN genómico aislado a partir de una variedad de cánceres. El ADN se cuantificó de manera precisa, por ejemplo, fluorométricamente. Como un control negativo, el ADN se aisló a partir de las células de diez individuos con salud normal los cuales se conjuntaron y usaron como controles de ensayo para la copia del gen en individuos saludables (no mostrado) . El ensayo de la nucleasa 5' (por ejemplo, TaqMan™) y la PCR cuantitativa en tiempo real (por ejemplo, ABI Prizm 770 Sequence Detection System™ (Perkin Elmer, Applied Biosystems División, Foster City, CA) ) , se utilizaron para encontrar genes potencialmente amplificados en ciertos cánceres. Los resultados se utilizaron para determinar si el ADN que codifica al PR0327, PR0344, PR0347, PR0357 y PR0715 está sobre-representado en cualquiera de los cánceres de pulmón o de colon o las líneas celulares de cánceres o las líneas celulares del cáncer de seno que fueron seleccionados. Los cánceres primarios del pulmón se obtuvieron a partir de individuos con tumores del tipo y etapa como se indica en la Tabla 9. Una explicación de las abreviaturas usadas para la designación de los tumores primarios listados en la Tabla y los tumores primarios y líneas celulares referidas a través de este ejemplo están dadas más adelante. Los resultados del TaqMan™ se reportan en unidades delta (?) CT. Una unidad corresponde a 1 ciclo PCR o aproximadamente una amplificación de 2 veces en relación a la normal, dos unidades corresponden a 4 veces, 3 unidades a 8 veces y así sucesivamente. La cuantificación se obtuvo utilizando cebadores y una sonda fluorescente derivada TaqMan™ del gen que codifica al PR0327, PR0344, PR0347, PR0357 y PR0715. Las regiones del PR0327, PR0344, PR0347, PR0357 y PR0715 las cuales contienen más probablemente las secuencias de ácido nucleico, únicas, y las cuales probablemente tienen que estar empalmadas en intrones se prefieren para la derivación de sondas y cebadores, por ejemplo, las regiones no traducida 3' . Las secuencias de los cebadores y las sondas (delantera, inversa y sonda) utilizadas para el análisis de amplificación de los genes PR0327, PR0344, PR0347, PR0357 y PR0715 son como sigue: PR0327 (DNA38113-Í230) delantero 5' -CTCAAGAAGCACGCGTACTGC-3' (SEC. ID NO: 96) sonda 5' -CCAACCTCAGCTTCCGCCTCTACGA-3' (SEC ID NO: 97) inverso 5' -CATCCAGGCTCGCCACTG-3' (SEC. ID NO: 98) PR0344 (DNA40592-1242) delantero 5' -TGGCAAGGAATGGGAACAGT-3' (SEC. ID NO: 99) sonda 5' -ATGCTGCCAGACCTGATCGCAGACA-3' (SEC. ID NO: 100) inverso 5' -GGGCAGAAATCCAGCCACT-3' (SEC. ID NO: 101) PR0347 (DNA44176-1244) delantero 5' -CCCTTCGCCTGCTTTTGA-3' (SEC. ID NO: 102) sonda 5' -GCCATCTAATTGAAGCCCATCTTCCCA-3' (SEC. ID NO: 103) inverso 5' -CTGGCGGTGTCCTCTCCTT-3' (SEC. ID NO: 104) PR0357 (DNA44804-1248) delantero 5' -CCTCGGTCTCCTCATCTGTGA-3' (SEC. ID NO: 105) sonda 5' -TGGCCCAGCTGACGAGCCCT-3' (SEC. ID NO: 106) inverso 5' -CTCATAGGCACTCGGTTCTGG-3' (SEC. ID NO: 107) PR0715 (DNA52722-1229) delantero 5' -TGGCTCCCAGCTTGGAAGA-3' (SEC. ID NO: 108) sonda 5' -CAGCTCTTGGCTGTCTCCAGTATGTACCCA-3' (SEC. ID NO: 109) inverso 5' -GATGCCTCTGTTCCTGCACAT-3' (SEC. ID NO: 110) La reacción del ensayo de la nucleasa 5' es una técnica a base de PCR fluorescente la cual hace uso de la actividad de la exonucleasa 5' de la enzima de la polimerasa de ADN Taq para monitorear la amplificación en tiempo real. Se utilizan dos cebadores de oligonucleótido para generar un amplicón típico de una reacción PCR. Un tercer oligonucleótido, o sonda, se diseña para detectar la secuencia de nucleótidos localizada entre los cebadores PCR. La sonda no es extendible mediante la enzima de la polimerasa del ADN Taq, y está etiquetada con un tinte fluorescente reportero y un tinte fluorescente de apagado. Cualquier emisión inducida por láser a partir del tinte reportero es bloqueada o apagada por el tinte de apagado cuando los dos tintes se localizan cercanamente entre sí 5 conforme están en la sonda. Durante la reacción de amplificación, la enzima de la polimerasa de ADN Taq escinde la sonda de una manera dependiente de la plantilla. Los fragmento de la sonda resultante se disocian en solución, y la señal del tinte reportero liberado está libre del efecto de apagado del segundo fluoróforo. Una molécula del tinte reportero se libera por cada nueva molécula sintetizada, y la detección del tinte reportero no apagado proporciona la base para la interpretación cuantitativa de los datos. El procedimiento de la nucleasa 5' se hace correr en un dispositivo PCR cuantitativo de tiempo real tal como ABI Prism 7700TM Sequence Detection. El sistema consiste de una cámara y computadora de dispositivo acoplado a la carga, láser, fcrmador de ciclos térmicos (CCD) . El sistema amplifica las muestras en un formato de 96 pozos en un formador de ciclos térmicos. Durante la amplificación, se recoleta la señal fluorescente inducida por láser en tiempo real a través de los cables de fibras ópticas para todos los 96 pozos y se detecta en el CCD. El sistema incluye un ánáüi ?iu programa de computadora para correr el instrumento y para analizar los datos. Los datos del ensayo de nucleasa 5' se expresan inicialmente como Ct, o el ciclo de umbral. Esto es definido como el ciclo en el cual la señal del reportero se acumula por arriba del nivel de fondo de fluorescencia. Los valores ?Ct se usan como medición cuantitativa del número relativo de copias de inicio de una secuencia objetivo particular en una muestra de ácido nucleico cuando se compara con los resultados del ADN del cáncer de comparación respecto a los resultados del ADN de humano normal. La Tabla 9 describe la etapa, la etapa T y la etapa N de varios tumores primarios los cuales se utilizaron para seleccionar los compuestos PR0327, PR0344, PR0347, PR0357 y PR0715 de la invención.

Tabla 9 Perfiles de Tumores Primarios ddeell Pulmón y del Colon Etapa del Tumor Primario Etapa Otra Etapa Etapa Dukes Etapa T Etapa N Tumor de pulmón humano AdenoCa (SRCC724) [LTl] HA Tl NI Tumor de pulmón humano SqCCa (SRCC725) [LTl a] IIB T3 NO Tumor de pulmón humano AdenoCa (SRCC726) [LT2] IB T2 NO Tumor de pulmón humano AdenoCa (SRCC727) [LT3] IIIA Tl N2 Tumor de pulmón humano AdenoCa (SRCC728) [LT4J IB T2 NO Tumor de pulmón humano SqCCa (SRCC729) [LT6] IB T2 NO Tumor de pulmón humano Aden/SqCCa (SRCC730) [LT7] 1A Tl NO Tumor de pulmón humano AdenoCa (SRCC731 ) [LT9] IB T2 NO Tumor de pulmón humano SqCCa (SRCC732) [LT10] IIB T2 N I Tumor de pulmón humano SqCCa (SRCC733) [LTl 1] HA Tl NI Tumor de pulmón humano AdenoCa (SRCC734) [LT12] IV T2 NO Tumor de pulmón humano AdenoCa/SqCCa (SRCC735) [LTl 3] IB T2 NO Tumor de pulmón humano SqCCa (SRCC736) [LTl 5] IB T2 NO Tumor de pulmón humano SqCCa (SRCC737) [LT16] IB T2 NO Tumor de pulmón humano SqCCa (SRCC738) [LTl 7] IIB T2 NI Tumor de pulmón humano SqCCa (SRCC739) [LTl 8] IB T2 NO Tumor de pulmón humano SqCCa (SRCC740) [LTl 9] IB T2 NO Tumor de pulmón humano LCCa (SRCC741 ) [LT21] IIB T3 NI Pulmón humano AdenoCa (SRCC81 1 ) [LT22] IA TI NO Colon humano AdenoCa (SRCC742) [CT2] Ml D T14 NO Colon humano AdenoCa (SRCC743) [CT3] B PT3 NO Colon humano AdenoCa (SRCC744) [CT8] B T3 NO Colon humano AdenoCa (SRCC745) [CT10] A PT2 NO Colon humano AdenoCa (SRCC746) [CT12] MO, Rl B T3 NO Colon humano AdenoCa (SRCC747) [CT14] pMO, RO B PT3 pNO Colon humano AdenoCa (SRCC748) [CT15] M1 , R2 D T4 N2 Colon humano AdenoCa (SRCC749) [CT16] pMOl B PT3 pNO Colon humano AdenoCa (SRCC750) [CT17] Cl PT3 pNl Colon humano AdenoCa (SRCC751) [CT1] MO, Rl B PT3 NO Colon humano AdenoCa (SRCC752) [CT4] B PT3 MO Colon humano AdenoCa (SRCC753) [CT5] G2 Cl PT3 pNO Colon humano AdenoCa (SRCC754) [CT6] pMO, RO B pT3 pNO Colon humano AdenoCa (SRCC755) [CT7] Gl A pT2 pNO Colon humano AdenoCa (SRCC756) [CT9] G3 D pT4 pN2 Colon humano AdenoCa (SRCC757) [CT1 1] B T3 NO Colon humano AdenoCa (SRCC758) [CT18] MO, RO B pT3 pNO Preparación del ADN: El ADN se preparó a partir de líneas de células cultivadas, tumores primarios y sangre humana normal. El aislamiento se realizó utilizando el equipo de purificación, el conjunto amortiguador y la proteasa todos de Qiagen, de acuerdo a las instrucciones del fabricante y a la descripción que sigue a continuación. Lisis del cul tivo celular: Las células se lavaron y se tripsinizaron a una concentración de 7.5 x 108 por punta de la muestra y se convirtieron en pelotillas mediante centrifugación a 1000 rpm durante 5 minutos a 4°C, seguido por lavado nuevamente con 1/2 volumen de recentrifugación con PBS. Las pelotillas se lavaron una tercera vez, las células suspendidas se recolectaron y se lavaron 2x con PBS. Las células se suspendieron entonces en 10 ml de PBS. El Amortiguador Cl se equilibró a 4°C. La proteasa #19155 de Qiagen se diluyó en 6.25 ml de ddH20 frío hasta una concentración final de 20 mg/ml y se equilibró a 4°C. Se prepararon 10 ml del Amortiguador G2 diluyendo material RNAsa A de Qiagen (100 mg/ml) hasta una concentración final de 200 µg/ml. Se agregó entonces el Amortiguador Cl (10 ml, 4°C) y ddH20 (40 ml, 4°C) a los 10 ml de suspensión celular, se mezclaron y se invirtieron e incubaron en hielo durante 10 minutos. Los núcleos celulares se convirtieron en pelotillas mediante centrifugación en un rotor de alabes oscilantes Beckman a 2500 rpm a 4°C durante 15 minutos. El sobrenadante se descargó y los núcleos se suspendieron en un vórtice en 2 ml del Amortiguador Cl (a 4°C) y 6 ml de ddH20, seguido por una segunda centrifugación a 4°C a 2500 rpm durante 15 minutos. Los núcleos se resuspendieron nuevamente en el amortiguador residual utilizando 200 µl por muestra. Se agregó el amortiguador G2 (10 ml) a los núcleos suspendidos mientras que se aplicaba un movimiento en vórtice o giratorio suave. Luego de la completación de la adición del amortiguador, se aplicó un movimiento en vórtice vigoroso durante 30 segundos. Se agregó la proteasa de Quiagen (20 µl, preparada como se indicó arriba) y se incubó a 50°C durante 60 minutos. La incubación y la centrifugación se repitieron hasta que los lisados estuvieron claros (por ejemplo, incubación adicional de 30-60 minutos, formando pelotillas a 3000 x g durante 10 min., 4°C). Preparación y lisis de las muestras de tumores humanos sólidos : Se pesaron las muestras de tumores y se colocaron en tubos cónicos de 50 ml y se mantuvieron en hielo. El procesamiento estuvo limitado a no más de 250 mg de tejido por preparación (1 punta o muestra/preparación) . La solución de proteasa se preparó de manea fresca diluyendo en 6.25 ml de ddH20 frío hasta una concentración final de 20 mg/ml y se almacenó a 4°C. Se preparó el amortiguador G2 (20 ml) diluyendo DNAsa A hasta una concentración final a 200 mg/ml (a partir de 100 mg/ml de material almacenado) . El tejido del tumor se homogeneizó en 19 ml del amortiguador G2 durante 60 segundos utilizando la punta grande del politrón en una campana TC de flujo laminar para evitar la inhlación de aerosoles, y se mantuvo a temperatura ambiente. Entre las muestras, el politrón se limpió haciéndolo girar a 2 x 30 segundos cada uno en 2L de ddH20 seguido por el amortiguador G2 (50 ml) . Si el tejido estaba presente aun en la punta del generador, el aparato se desensambló y se limpió. Se agregó la proteasa de Quiagen (preparada como se indicó arriba, 1.0 ml), seguida por un movimiento en vórtice e incubación a 50°C durante 3 horas. La incubación y la centrifugación se repitieron hasta que los lisados fueron claro (por ejemplo, la incubación adicional por 30-60 minutos, formación de pelotillas a 3000 x g durante 10 min., 4°C) .

Preparación y lisis de la sangre humana : Se extrajo sangre de voluntarios saludables utilizando los protocolos de agentes infecciosos estándar y se citraron en muestras de 10 ml por punta o muestra. La 5 proteasa de Quiagen se preparó de manera fresca mediante la dilución en 6.25 ml de ddH20 frío hasta una concentración final de 20 mg/ml y se almacenó a 4°C. Se preparó el amortiguador G2 diluyendo RNAsa A hasta una concentración final de 200 µg/ml a partir de 100 mg/ml material almacenado) . La sangre (10 ml) se colocó en un tubo cónico de 50 ml y se agregaron 10 ml del amortiguador Cl y 30 ml de ddH20 (previamente equilibrados ambos a 4°C), y los componentes se mezclaron y se invirtieron y se mantuvieron en hielo durante 10 minutos. Los núcleos se peletizaron con un rotor de alabes oscilantes Beckman a 2500 rpm a 4°C durante 15 minutos y se descargó el sobrenadante. Con un movimiento en vórtice, los núcleos se suspendieron en 2 ml del Amortiguador Cl (4°C) y 6 ml de ddH20 (4°C). El movimiento en vórtice se repitió hasta que las pelotillas fueron de color blanco. Los núcleos se resuspendieron entonces en el amortiguador residual utilizando una punta o muestra de 200 µl . Se agregó el amortiguador G2 (10 ml) a los núcleos suspendidos mientras que se efectúa un _aülfcá^^1£a______ movimiento en vórtice suave, seguido por un movimiento en vórtice durante 30 segundos. Se agregó la proteasa de Quiagen (200 µl) y se incubó a 50°C durante 60 minutos. La incubación y la centrifugación se repitió hasta que los lisados fueron claros (por ejemplo, incubación adicional por 30-60 minutos, formación de pelotillas a 3000 x g durante 10 min. , 4°C) . Purificación de los lisados claros : (1) Aislamiento del ADN genómico: El ADN genómico se equilibró (1 muestra por preparación de maxi punta o muestra) con 10 ml del amortiguador QBT. Se equilibró el amortiguador por elución con QF a 50 °C. Las muestras se sometieron a un movimiento en vórtice durante 30 segundos, luego se cargaron en puntas equilibradas y se drenaron mediante gravedad. Las puntas se lavaron con 2 x 15 ml del amortiguador QC. El ADN se eluyó en tubos Corex de 30 ml sometidos por tratamiento con autoclave, silanizados, con 15 ml del amortiguador QF (50°C) . Se agregó isopropanol (10.5 ml) a cada muestra, los tubos se cubrieron con parafina y se mezclaron mediante inversión repetida hasta que se precipitó el ADN. Las muestras se convirtieron en pelotillas mediante centrifugación en el rotor SS-34 a 15,000 rpm durante 10 minutos a 4°C. La localización de las pelotillas se marcó y se descargó el sobrenadante, y se agregaron 10 ml de etanol al 70% (4°C). Las muestras se convirtieron a pelotillas nuevamente mediante centrifugación en el rotor SS-34 a 10,000 rpm durante 10 minutos a 4°C. La localización de las pelotillas se marcó y se descargó el sobrenadante. Los tubos se colocaron entonces sobre su lado en una estructura porta-muestras de secado y se secaron durante 10 minutos a 37 °C, teniendo cuidado de no sobresecar las muestras. Después del secado, las pelotillas se disolvieron en 1.0 ml de TE (pH 8.5) y se colocaron a 50°C durante 1-2 horas. Las muestras se mantuvieron durante toda la noche a 4°C y se continuó la disolución. La solución de ADN se transfirió entonces a tubos de 1.5 ml con una aguja de calibre 26 en una jeringa con tuberculina. La transferencia se repitió 5x para cortar el ADN. Las muestras se colocaron entonces a 50°C durante 1-2 horas. (2) Cuantificación del ADN genómico y preparación para el ensayo de amplificación del gen: Los niveles de ADN en cada tubo se cuantificaron mediante espectrofotometría estándar A26or A_so en una dilución 1:20 (5 µl del ADN + 95 µl de ddH20) utilizando cubetas de cuarzo de 0.1 ml en el espectrofotómetro Beckman DU640. Las proporcione de A26o/ 28o estuvieron en el rango de 1.8-1.9. Cada una de las muestras de ADN se diluyó entonces adicionalmente hasta aproximadamente 200 ng/ml en TE (pH 8.5). si el material original estaba altamente concentrado (aproximadamente 700 ng/µl), el material se colocó a 50°C durante varias horas hasta que se resuspendió. Se realizó entonces la cuantificación de ADN fluorométrica en el material diluido (20-600 ng/ml) utilizando las guías del fabricante según se modificaron a continuación. Esto se realizó o complementó permitiendo a un fluorómetro Hoeffer Dyna Quant 200 calentarse hasta aproximadamente 15 minutos. Se diluyó una solución de trabajo de teñido Hoechst (#H33258, 10 µl, preparada dentro de las 12 horas de uso) en 100 ml del amortiguador TNE lx. Una cubeta de 2 ml se llenó con la solución de fluorómetro, se colocó en la máquina, y la máquina se consideró como un objetivo. Se agregó pGEM 3Zf(+) (2 µl, lote #360851026) a 2 ml de la solución del fluorómetro y se calibró a 200 unidades. Se probó entonces con 2 µl adicionales de pGEM 3Zf(+) ADN y la lectura se confirmó a 400 +/- 10 unidades. Cada muestra se leyó entonces al menos en triplicado. Cuando se encontró que las 3 muestras estuvieron dentro del 10% ente sí, su promedio se tomo y este valor se utilizó como el valor de cuantificación. Se utilizó entonces la concentración determinada fluorométricamente para diluir cada muestra hasta 10 ng/µl en ddH20. Esto se realizó simultáneamente en todas las muestras patrones para un ensayo de la placa única TaqMan, y con suficiente material para correr 500-1000 ensayos. Las muestras se probaron en triplicado con cebadores Taqman™ y la sonda tanto de B-actina como de GAPDH sobre una placa única con ADN de humano normal y sin controles de patrón. Las muestras diluidas se utilizaron siempre que el valor CT del ADN humano normal substraído o restado del ADN de prueba fuera +/- 1 Ct . El ADN genómico, con lote calificado, diluido, se almacenó en alícuotas de 1.0 ml a -80°C. Las alícuotas se usaron subsecuentemente en el ensayo de amplificación del gen y se almacenaron a 4°C. Cada alícuota de 1 ml es suficiente para 8-9 placas ó 64 pruebas. Ensayo de amplificación del gen : Los compuestos PR0327, PR0344, PR0347, PR0357 y PR0715 de la invención se seleccionaron n los siguientes tumores primarios y los valores resultantes ?Ct fueron mayores o iguales a 1.0 como se reportó en la Tabla 10.

Tabla 10 Valores ?Ct en tumores primarios y modelos de líneas celulares Tumores Primarios de las PR0327 PR0344 PR0347 PR0357 PR0715 Líneas Celulares LTl — — 1.035 — 1.625 LTla 1.045 1.865 1.18 1.045 1.0 2.47 1.93 LT3 1.135 — 1.325 2.93 — 1.2 10 LT6 1.395 — 1.945 2.6 — 1.42 3.18 LT9 — — 2.645 3.47 1.005 2.91 LT10 1.305 — 1.845 3.42 1.125 1.13 3.51 LTl l 1.53 1.52 1.395 1.185 1.76 15 1.35 2.875 1.12 LT12 2.99 1.2 1.425 1.225 1.63 2.15 1.73 2.225 1.1 1 1.14 LT13 2.48 1.81 2.035 1.585 2.29 1.69 1.175 2.28 1.665 1.83 1 05 1.15 1.31 LTl 5 2.89 1.62 1.615 2.205 2.33 20 1.33 2J3 2.445 1.89 1.27 1.89 1.44 LT16 1.16 1.13 — 2.605 1.2 2.65 1.09 1.1 LTl 7 1.76 1.46 1.24 1.275 1.95 1.09 2.855 1.33 1.01 25 >l-tt-?- Éi Tumores Primarios de las PR0327 PR0344 PR0347 PR0357 PR0715 Líneas Celulares LTl 8 — 2.455 T?4 LTl 9 3.58 2.47 1.835 2.295 2.38 1.35 2.645 LT21 — 1.09 1.14 2.675 CT2 3.645 1.84 2.1 2.01 1.675 1.605 1.605 CT3 1.125 1.01 1.135 1.105 CT18 1.645 1.3 1.1 1.285 1.345 10 CT10 2.535 1.42 2.155 1.785 CT12 1.885 CTM 2.515 1.16 1.39 1.5 1.265 1.45 1.575 CT15 1.305 1.17 1.3 1.25 1.585 1.475 CT16 1.475 1.33 1.05 1.095 15 1.055 1.475 CT17 1.715 1.245 1.375 CT1 1.375 1.245 1.045 1.045 1.285 1.6 1.085 CT4 2.225 1.465 1.275 1.375 2.23 20 1.165 CT5 2.505 1.515 1.625 1.695 1.975 1.985 2.07 1715 CT6 2.285 1.085 1.305 1.73 1.245 -i*-a-t-¿fc-*-ÍiM-^->-H--ka-.

Tumores Primarios de las PR0327 PR0344 PR0347 PR0357 PR0715 Líneas Celulares CT7 — r. i/735 T?05 5 1.65 1.025 CT9 1.585 1.0 CT1 1 3.335 1.335 1.315 1.835 2.185 1.525 2.54 CT18 1.075 1.69 SRCC771 (H157 1.65 SRCC772 (H441) 2.23 SRCC773 (H460) 1.12 SRCC774 (SKMES-1) 1.18 SRCC777 (SW620) 2.24 SRCC777 (Colo320) 1.01 SRCC830 (HCC2998) 1.23 SRCC831 (KM12) 1.61 SRCC832 (H522) 1.02 15 - SRCC833 (H810) 1.11 PRQ327 : Se re-examinó el PR0327 (DNA38113-1230) junto con tumores seleccionados de las selecciones iniciales anteriores con la formación de un mapa de estructura. La Tabla 11 describe los marcadores de la porción relativamente invariante, altamente conservada, que se emplearon en asociación con el PR0327 (DNA38113-1230) . Los marcadores de la porción relativamente invariante, altamente conservada se localizaron aproximadamente cada 20 megabases a lo largo del •*•- *---»---'•--"»"--Cromosoma 19, y se utilizaron para el control aneuploide. Los valores ?Ct para los marcadores de la porción relativamente invariante, altamente conservada, descritos a lo largo del Cromosoma 19 en relación al PR0327 (DNA38113-1230) se indican para los tumores seleccionados en la Tabla 13. El PR0327 (DNA38113-1230) también se re-examinó junto con los tumores seleccionados de la selección inicial anterior con la formación del mapa del epicentro. La Tabla 12 describe los marcadores del epicentro que se emplearon en asociación con el PR0327 (DNA38113-1230) . Estos marcadores están localizados en proximidad cercana al DNA38113-1230 y se utilizaron para valorar el estado de amplificación de la región del Cromosoma 19 en el cual está localizado el DNA 38113-1230. La distancia entre los marcadores se mide en centirays (cR) , la cual es una unidad de ruptura de radiación aproximadamente igual al 1% de la oportunidad de un rompimiento entre dos marcadores. Un cR es aproximadamente equivalente a 20 kilobases. La Tabla 14 indica los valores ?Ct para los resultados de la formación del mapa del epicentro en relación al DNA 38113-1230, que indica la amplificación relativa en la región más inmediata a la localización real del DNA 38113-1230 a lo largo del Cromosoma 19. Tabla 11 Marcadores de la Porción Relativamente Invariante, Altamente Conservada a lo largo del Cromosoma 19 Tabla 12 Marcadores del Epicentro a lo largo del Cromosoma 19 utilizados para DNA38113-1230 Tabla 13 Amplificación de los marcadores de la Porción Relativamente Invariante, Altamente Conservada en relación al DNA38113- 1230 (?Ct) Tabla 14 Amplificación de los marcadores del epicentro en relación al DNA38113-1230 (?Ct) PR0715 (DNA52722-1229) : El PR0715 también se re-examinó tanto en la formación del mapa del epicentro como en la porción relativamente invariante, altamente conservada. La Tabla 15 indica las localizaciones cromosómicas de la porción relativamente invariante, altamente conservada que se utilizaron para el procedimiento. Los marcadores de la porción relativamente invariante, altamente conservada, están localizados aproximadamente cada 20 megabases y se utilizaron para el control aneuploide. La Tabla 16 indica los marcadores formadores del mapa del epicentro que se utilizaron para el procedimiento. Los marcadores están localizados en proximidad cercana al DNA52722-1229 y se utilizaron para determinar la amplificación del ADN relativo en la vecindad inmediata del DNA52722-1229. La distancia entre los marcadores se mide en centirays, la cual es una unidad de ruptura de radiación aproximadamente igual al 1% de la oportunidad de un rompimiento entre dos marcadores. Un cR es aproximadamente equivalente a alrededor de 20 kilobases. En la Tabla 16, "BAC" significa cromosoma artificial bacteriano. Los extremos de un clon BAC los cuales contuvieron el gen de interés fueron secuenciados. Los cebadores y sondas TaqMan fueron hechos a partir de esta secuencia, los cuales se indican en la tabla. Los clones BAC son típicamente de 100 a 150 Kb, de manera que estos cebadores y sondas se pueden utilizar como marcadores cercanos al ADN de la sonda de los tumores. En la Tabla 16, el marcador SHGC-31370 es el marcador que se encuentra como el más cercano a la localización en el cromosoma 17 en donde se forma el mapa de DNA52722-1229.

Tabla 15 Marcadores de la Porción Relativamente Invariante, Altamente Conservada a lo largo del Cromosoma 17 para DNA52722-1229 Tabla 16 Marcadores del Epicentro Utilizados en el Cromosoma 17 en la Vecindad del DNA52722-1229 La Tabla 17 indica los valores ?Ct para los resultados de los marcadores de la porción relativamente invariante descritos arriba a lo largo del cromosoma 17 en relación al DNA52722-1229 para los tumores seleccionados.

Tabla 17 Amplificación de los Marcadores de la Porción Relativamente Invariante, Altamente Conservada en relación al DNA52722- 1229 La Tabla 18 indica los valores ?Ct para los resultados de los marcadores del epicentro indicados, indicando la amplificación relativa a lo largo del cromosoma 17 en la vecindad inmediata del DNA52722-1229.

Tabla 18 Amplificación de los Marcadores del Epicentro en Relación al DNA52722-1229 PR0357 ( DNA44804-1248 ; El PR0357 se re-examinó con los tumores seleccionados 25 -_*_____a__i_a______i_k i-l-ai-_& a partir de la selección inicial anterior con la formación del mapa de la porción relativamente invariante altamente conservada. La Tabla 19 indica la formación del mapa cromosómico de los marcadores de la porción relativamente 5 invariante altamente conservada que se utilizaron en el presente ejemplo. Los marcadores de la porción relativamente invariante, altamente conservada, están localizados aproximadamente cada 20 megabases y se utilizaron para el control aneuploide. 10 También se examinó el PR0357 con la formación del mapa del epicentro. Los marcadores indicados en la Tabla 20 están localizados en proximidad cercana (en el genoma) al DNA44804-1248 y se utilizaron para valorar la amplificación relativa en la vecindad inmediata del cromosoma 16 en donde está localizado el DNA44804-1248. La distancia entre los marcadores individuales se mide en centirays (cR) , la cual es una unidad de ruptura de radiación aproximadamente igual al 1% de la oportunidad de un rompimiento entre los dos marcadores. Un cR es muy cercanamente equivalente a 20 kilobases. El marcador SHGC-6154 es el marcador que se encuentra como el más cercano a la localización en el cromosoma 16 en donde se forma el mapa de DNA44804-1248. -aa-ii-i-i Tabla 19 Marcadores de la Porción Relativamente Invariante, Altamente Conservada para DNA44804-1248 Tabla 20 Marcadores del Epicentro para DNA44804-1248 a lo largo del Cromosoma 16 Los valores ?Ct de los marcadores de la porción relativamente invariante, altamente conservada, descritos arriba a lo largo del cromosoma 16 en relación al DNA44804- 1248 están descritos en la Tabla 21. Tabla 21 Amplificación de los Marcadores de la Porción Relativamente Invariante, Altamente Conservada en relación al DNA44804- 1248 (?Ct) La Tabla 22 indica los valores ?Ct para los resultados de la formación del mapa del epicentro en relación al DNA44804-1248, que indica la amplificación relativa en la región más inmediata a la localización real del DNA44804-1248 a lo largo del cromosoma 16. Tabla 22 Amplificación de los Marcadores del Epicentro en Relación al DNA44804-1248 CONCLUSIÓN: Se reportan los valores ?Ct para los ADNs anteriores en una variedad de tumores. Un ?Ct de > 1 se usó típicamente como el valor de umbral para el registro de amplificación, pues esto representa una duplicación de la copia del gen. Esos datos anteriores indican que la amplificación significativa de los ácidos nucleicos probados ocurrió en los tumores primarios del pulmón y/o tumores primarios del colon. La amplificación fue confirmada mediante la formación del mapa de la porción relativamente invariante, altamente conservada. El análisis de los marcadores de la porción relativamente invariante, altamente conservada reporta la amplificación relativa de las regiones cromosómicas particular en los tumores indicados, mientras que el análisis de los marcadores del epicentro da una lectura más precisa de la amplificación relativa en la región inmediatamente en la vecindad del gen de interés. Se ha conformado la amplificación mediante la formación del mapa del epicentro y los datos evidenciaron una amplificación significativa en los tumores primarios del colon y/o tumores primarios del pulmón. La amplificación de los marcadores del epicentro conocidos más cercanos, no ocurre en una extensión más grande que aquélla de los ADNs 5 probados. Esto sugiere de manera fuerte que los ADNs probados son responsables de la amplificación de la región particular en el cromosoma respectivo. Debido a que la amplificación de los ADNs probado ocurre en varios tumores del pulmón y del colon, es 10 altamente probablemente que estos ADNs jueguen un papel importante en la formación o crecimiento de tumores. Como resultado, los antagonistas (por ejemplo, anticuerpos) dirigidos contra las proteínas codificadas por los ADNs probados se esperaría que tuvieran una utilidad en la 15 terapia del cáncer y como reactivos de diagnóstico útiles. Los polipéptidos codificados por los ADNs probados tienen utilidad como marcadores de diagnóstico para determinar la presencia de células tumorales del pulmón y/o muestras de tejido del colon. Las secuencias de ácido nucleico que 20 codifican estos polipéptidos tienen utilidad como fuentes de sondas de ácido nucleico para realizar los procedimientos de diagnóstico anteriores.

M-«-M-*-tt-t-i-Í-U£-tt- e-M-. ^^¡ EJEMPLO 29: Capacidad del Polipéptido PR0241 para Estimular la Liberación de los Proteoglicanos a partir del Cartílago (Ensayo 97) La capacidad del polipéptido PR0241 para estimular la liberación de los proteoglicanos de los tejidos de los cartílagos se probó como sigue. Un resultado positivo en este ensayo evidencia que se espera que el polipéptido sea útil en el tratamiento terapéutico de varios padecimientos o enfermedades del cartílago y/o los huesos que incluyen, por ejemplo, la artritis. La articulación metacarfofalangeal de cerdos adultos de 4-6 meses de edad, se disectó asépticamente, y se removió el cartílago articular mediante un corte libre de manos teniendo cuidado de evitar cortar el hueso. El cartílago se 15 cortó y se cultivó en volumen durante 24 horas en una atmósfera humidificada de 95% de aire y 5% de CO2 en un medio libre de suero (SF) (DME/F12 1:1) con valores de BSA al 0.1% y 100 U/ml de penicilina y 100 µg/ml de estreptomicina. Después de lavar tres veces, aproximadamente 100 mg del 20 cartílago articular se dividió en alícuotas en tubos micrónicos y se incubó durante 24 horas adicionales en el medio anterior SF. Se agregaron entonces los polipéptidos PR0241 al 1% ya sea solos o en combinación con 18 ng/ml de :....-.¿.fu . *...¡.„ interleucina-la, un estimulador conocido de la liberación de proteoglicano del tejido del cartílago. El sobrenadante se cosechó entonces y se sometió a ensayos para la cantidad de proteoglicanos utilizando el ensayo colorimétrico con azul de 1, 9-dimetil-metileno (DMB) (Farndale y Buttle, Biochem. Biophys. Acta 883:173-177 (1985)). Un resultado positivo en este ensayo indica que el polipéptido de prueba encontrará uso, por ejemplo, en el tratamiento de problemas de las articulaciones relacionadas con los deportes, defectos del cartílago articular, osteoartritis o artritis reumatoide. Cuando se probaron los polipéptidos PR0241 en el ensayo anterior, los polipéptidos demostraron una capacidad marcada de estimular la liberación de proteoglicanos a partir del tejido del cartílago tanto basalmente como después de la estimulación con interleucina-la y a 24 y 72 horas después del - tratamiento, indicando así que los polipéptidos PR0241 serán útiles para estimular la liberación de proteoglicano del tejido del cartílago. Como tales los polipéptidos PR0241 son útiles para el tratamiento de problemas de las articulaciones relacionadas con los deportes, defectos del cartílago articular, osteoartritis o artritis reumatoide.

EJEMPLO 30: Ensayo Antitumor In Vitro con PR0344 (Ensayo 161) La actividad antiproliferativa de varios polipéptidos PRO se determinó en los ensayos de investigación, de descubrimientos de fármacos anti-cáncer in vitro, orientados 5 al padecimiento, del National Cáncer Institute (NCI), utilizando un ensayo de enlace del colorante de sulforhoda ina B (SRB) como se describió por Skehan et al., J. Na ti . Cáncer Inst . 82:1107-1112 (1990). Las 60 líneas de células tumorales empleadas en este estudio ("el panel NCI"), así como las condiciones para su mantenimiento y cultivo ín vitro se han descrito por Monks et al., J. Na ti . Cáncer Inst . 83:757-766 (1991). El propósito de esta selección es iniciar la evaluación de la actividad citostática y/o citotóxica de los compuestos de prueba contra diferentes tipos de tumores (Monks et al., supra ; Boyd, Cáncer Princ . Pra ct . Oncol . Upda te 3(10): 1-12 [1989]). Las células de aproximadamente 60 líneas celulares tumorales se cosecharon con tripsina/EDTA (Gibco) , se lavaron una vez, se resuspendieron en IMEM y se determinó su viabilidad. Las suspensiones de célula se agregaron mediante pipeta (100 µL en volumen) en placas de microtitulación de 96 pozos separadas. La densidad celular para la incubación de 6 días fue menor de aquélla para la incubación de 2 días ¡^^^ para evitar el sobrecrecimiento . Los inoculados se dejaron en un periodo de preincubación de 24 horas a 37 °C para estabilización. Las diluciones a una concentración de prueba pretendida de dos veces se agregaron a un tiempo cero en alícuotas de 100 µL a los pozos de las placas de microtitulación (dilución 1:2). Los compuestos de prueba se evaluaron a diluciones de cinco medias logarítmicas (1000 a 100,000 veces). Las incubaciones tomaron lugar durante dos días y seis días en un atmósfera de CO2 al 5% y humedad al 100%. Después de la incubación, el medio se eliminó y las células se fijaron en 0.1 ml de ácido tricloroacético al 10% a 40°C. Las placas se lavaron cinco veces con agua desionizada, se secaron, se tiñeron durante 30 minutos con 0.1 ml del colorante sulforhodamina al 0.4% (Sigma) disuelto en ácido acético al 1%, se enjuagaron cuatro veces con ácido acético al 1% para eliminar el colorante no enlazado, se enlazaron y las manchas se extrajeron durante cinco minutos con 0.1 ml de base Tris 10 mM [tris (hidroximetil) aminometano] , pH 10.5. La absorbancia (OD) de la sulforhodamina B a 492 nm se midió utilizando un lector de placas de microtitulación de 96 pozos, interconectado con una computadora.

Una muestra de prueba se consideró positiva si mostraba al menos un efecto inhibidor de crecimiento del 50% en una o más concentraciones. Los resultados se muestran en la siguiente Tabla 23, en donde las abreviaturas son como sigue: NSCL = carcinoma del pulmón de las células no pequeñas CNS = sistema nervioso central Tabla 23 Compuesto de prueba Concentración Días Tipo de Línea Celular del Tumor Designación de la Línea Celular PR0344 1.2 nM 2 Leucemia HL-60 (TB) PR0344 1.2 nM 6 Renal U0-31 y CAKI-l PR0344 14.9 nM 2 Colon KM- 12 PR0344 14.9 nM 2 CNS SF-268 PR0344 14.9 nM 2 Ovarios OVCAR-4 PR0344 14.9 nM 2 Renal CAKI-1 PR0344 14.9 nM 2 Seno MDA-MB-435 PR0344 14.9 nM 6 Leucemia HL-60 (TB) PR0344 14.9 nM 6 Colon KM- 12 PR0344 14.9 nM 6 CNS SF-295 PR0344 14.9 nM 6 NSCL HOP62 Los resultados de estos ensayos demostraron que los polipéptidos PR0344 son útiles para inhibir el crecimiento neoplástico en un número de células tumorales diferentes y que se pueden utilizar terapéuticamente para lo mismo. Los anticuerpos contra el PR0344 son útiles par la purificación por afinidad de este polipéptido útil. Los ácidos nucleicos que codifican los polipéptidos PR0344 son útiles para la preparación recombinante de estos polipéptidos.

EJEMPLO 31: Inhibición de la Proliferación del Crecimiento Celular Endotelial Estimulado por el Factor del Crecimiento Endotelial Vascular (VEGF) (Ensayo 9) Se probó la capacidad de varios polipéptidos PRO para inhibir la proliferación estimulada por VEGF de las células endoteliales. Los polipéptidos que prueban positivo en este ensayo son útiles para inhibir el crecimiento celular endotelial en mamíferos en donde tal efecto sería benéfico, por ejemplo, para inhibir el crecimiento de tumores. Específicamente, las células endoteliales capilares corticales adrenales de bovino (ACE) (de un cultivo primario, con un máximo 12-16 pasajes) se colocaron en placas de 96 pozos a 500 células/pozo por 100 microlitros. El medio del ensayo incluía DMEM glucosa baja, suero de ternera al 10%, glutamina 2 mM, lx de penicilina/estreptomicina/fungizona. Los pozos de control incluían lo siguiente: (1) no se agregaron células ACE; (2) solo células ACE; (3) células ACE más 5 ng/ml de FGF; (4) células ACE más 3 ng/ml de VEGF; (5) células ACE más 3 ng/ml de VEGF más 1 ng/ml de TGF-beta; y (6) células ACE más 3 ng/ml de VEGF más 5 ng/ml de LIF. Las muestras de prueba, los polipéptidos PRO etiquetados con poli-his (en volúmenes de 100 microlitros), se agregaron entonces a los pozos (a diluciones de 1%, 0.1% y 0.01%, respectivamente). Los cultivos de células se incubaron durante 6-7 días a 37°C/C02 al 5%. Después de la incubación, el medio en los pozos se aspiró, y las células se lavaron IX con PBS. Se agregó entonces una mezcla de reacción de fosfatasa acida (100 microlitros, acetato de sodio 0.1M, pH 5.5, Tritón X-100 al 0.1%, fosfato de p-nitrofenilo 10 mM) a cada pozo. Después de una incubación durante 2 horas a 37 °C, la reacción se detuvo por la adición de 10 µl NaOH ÍN. Se midió la densidad óptica (OD) en un lector de placas de microtitulación a 405 nm. La actividad de los polipéptidos PRO se calculó como el porcentaje de inhibición de la proliferación estimulada por VEGF (3 ng/ml) (como se determina midiendo la actividad de fosfatasa acida a OD 405 nm) en relación a las células sin estimulación. Se empleó TGF-beta como una referencia de actividad en 1 ng/ml, puesto que el TGF-beta bloquea el 70-90% de la proliferación de las células ACE estimuladas con VEGF. Los resultados son indicativos de la utilidad de los polipéptidos PRO en la terapia del cáncer y específicamente en la inhibición de la angiogénesis del tumor. Los valores numéricos (inhibición relativa) se determinan calculando el porcentaje de inhibición de la proliferación estimulada por VEGF por los polipéptidos PRO en relación a las células sin estimulación y dividiendo ese porcentaje en el por ciento de inhibición obtenido por TGF-ß a 1 ng/ml el cual se sabe que bloquea el 70-90% de la proliferación celular estimulada por VEGF. Los resultados se consideran positivos si el polipéptido PRO muestra 30% o más de la inhibición de la estimulación del crecimiento celular endotelial (inhibición relativa 30% ó mayor) . El siguiente polipéptido probó positivo en este ensayo: PR0323. EJEMPLO 32: Sobrevivencia de las Células Fotoreceptoras de los Bastoncillos (Ensayo 56) Este ensayo muestra que ciertos polipéptidos de la invención actúan para mejorar la sobrevivencia/proliferación de las células fotoreceptoras de los bastoncillos y, por lo tanto, son útiles para el tratamiento terapéutico de los padecimientos o daño de la retina, que incluyen, por ejemplo, tratamiento de la pérdida de la visión en mamíferos, debido a la retinitis pigmentosa, ADMD, etc. Las crías o cachorros de rata Sprague Dawley a los 7 días después del nacimiento (población mezclada: tipos de células neuronales retínales y gliales) se sacrifican mediante decapitación después de una anestesia con CO2 y se removieron los ojos bajo condiciones estériles. La retina neural se disecta del epitelio del pigmento y otros tejidos oculares y luego se disocia en una sola suspensión de células utilizando tripsina al 0.25% en PBS libre de Ca 2+, Mg2+. Las retinas se incuban a 37 °C durante 7-10 minutos después de lo cual la tripsina se inactiva mediante la adición de inhibidor de tripsina de soya 1 ml . Las células se colocan en placas a 100,000 células por pozo en placas de 96 pozos en DMEM/F12 suplementado con N2. Las células para todos los experimentos se hacen crecer a 37 °C en una atmósfera saturada de agua de C02 al 5%. Después de 2-3 días en cultivo, las células se fijan utilizando paraformaldehído al 4% y luego se tiñen utilizando CMFDA Verde de CellTracker. El Rho 4D2 (ascitos o IgG 1:100), un anticuerpo monoclonal dirigido hacia la rodopsina del pigmento visual se utiliza para detectar las células fotoreceptoras de los bastoncillos mediante inmunofluorescencia indirecta. Los resultados se calculan como % de sobrevivencia: el número total de calceína - células positivas de rodopsina a los 2-3 días de cultivo, se dividen por el número total de células positivas de rodopsina en los 2-3 días en el cultivo. Las células totales (fluorescentes) se cuantifican con una amplificación de objetivo de 20x utilizando una cámara CCD y un programa de imagen NIH para Macintosh. Los campos en los pozos se escogen aleatoriamente. Los siguientes polipéptidos probaron positivos en este ensayo: PR0243. 5 EJEMPLO 33: Inducción de c-Fos de los Pericitos (Ensayo 93) Este ensayo muestra que ciertos polipéptidos de la invención actúan para inducir la expresión del c-fos en las células pericitos y, por lo tanto, son útiles no sólo como marcadores de diagnóstico para tipos particulares de tumores 10 asociados con pericitos sino también para dar lugar a antagonistas que se esperaría que fueran útiles para el tratamiento terapéutico de los tumores asociados con pericitos. Específicamente, en el día 1, los pericitos se reciben de VEC Technologies y casi 5 ml del medio se 15 remueven del matraz. En el día 2, los pericitos se tripsinizan, se lavan, se hacen girar y luego se colocan en placas de 96 pozos. En el día 7, el medio se elimina y los pericitos se tratan con 100 µl de muestras de prueba del polipéptido PRO y los controles (control positivo = DME + 20 suero al 5% +/- PDGF a 500 ng/ml; control negativo = proteína 32) . Los replicados se promedian y se determina el SD/DV. Las veces de incremento sobre el valor de la Proteína 32 (control de amortiguador) indicado mediante unidades de **"'**a,'?a?^^ •—— -- - - *-.-*.,.. - *.* *** quimioluminiscencia (RLU) leídas mediante un lector luminómetro contra la frecuencia se grafican en un histograma de dos veces por arriba del valor de la Proteína 32 y se consideran positivos para el ensayo. Matriz SY: Medio de crecimiento = DMEM de baja glucosa = FBS al 20% + pen strep IX + fungizona IX. Medio de Ensayo = DMEM de baja glucosa + FBS al 5%. Los siguientes polipéptidos probaron positivos en este ensayo: PR0241. EJEMPLO 34: Actividad Inhibidora en el Ensayo de Reacción Mezclada de los Linfocitos (MLR) (Ensayo 67) Este ejemplo muestra que uno o más de los polipéptidos de la invención son activos como inhibidores de la proliferación de linfocitos T estimulados. Los compuestos que inhiben la proliferación de los linfocitos son útiles terapéuticamente en donde es benéfica la supresión de una respuesta inmune. El protocolo básico para este ensayo se describe en Current Protocols in Immunology, unidad 3.12; editado por J E Coligan. A M Kruisbeek, D H Margues, E M Shevach, Strober, National Institutes of Health, Published by John Wiley & Sons, Inc. Más específicamente, en una variante de ensayo, las células mononucleares de la sangre periférica (PBMC) se aislan de los individuos mamíferos, por ejemplo un voluntario humano, mediante leucoferesis (un donador suministrará PBMCs estimulador, el otro donador suministrará PBMCs de respuesta) . Si se desea, las células se congelan en suero de bovino fetal y DMSO después del aislamiento. Las células congeladas se deshielan o descongelan durante toda la noche en un medio de ensayo (37°C, C02 al 5%), y luego se lavan y se resuspenden a 3 x 106 células/ml del medio de ensayo (RPMI: suero de bovino fetal al 10%, penicilina/estreptomicina al 1%, glutamina al 1%, HEPES al 1%, aminoácidos no esenciales, piruvato al 1%). Los PBMCs estimuladores se prepara mediante la irradiación de las células (aproximadamente 3000 Rads) . El ensayo se prepara colocando en placas en pozos por triplicado una mezcla de: 100:1 de la muestra de prueba diluida al 1% ó al 0.1%. 50:1 de las células estimuladoras irradiadas, y 50:1 de las células PBMC de respuesta. Se utilizan 100 microlitros del medio de cultivo celular ó 100 microlitros de CD4-IgG como el control. Los pozos se incuban entonces a 3 °C, C02 al 5% durante 4 días. En el día 5, cada pozo se pulsa con timidina tritiada (1.0 mC/pozo; Amersham) . Después de 6 horas las células se lavan 3 veces y luego se evalúa la absorción de la etiqueta. En otra variante de este ensayo, los PBMCs se aislan del bazo de los ratones Balb/c y C57B6. Las células se sacan de los bazos cosechados recientemente en un medio de ensayo (RPMI: suero de bovino fetal al 10%, glutamina al 1%, penicilina/estreptomicina al 1%, HEPES al 1%, aminoácidos no esenciales, piruvato al 1%) y los PBMCs se aislan mediante la colocación en capas superiores de estas células sobre Lympholyte M (Organon Teknika) , se centrifuga a 2000 rpm durante 20 minutos, se recolectan y se lava la capa de células mononucleares en el medio de ensayo y se resuspenden las células a lxlO7 células/ml del medio de ensayo. Se conduce el ensayo como se describió arriba. Cualquier decremento por debajo del control se considera como un resultado positivo para un compuesto inhibidor, con decrecimientos de menos o igual al 80% siendo los preferidos. Sin embargo, cualquier valor menor que ese control indica un efecto inhibidor para la proteína de prueba. El siguiente polipéptido probó positivo en este ensayo: PR0361.

EJEMPLO 35: Distribución de la Expresión del Tejido Se construyeron sondas de oligonucleótido a partir de las secuencias de nucleótidos que codifican al polipéptido PRO mostradas en las figuras acompañantes para usarse en reacciones de amplificación de PCR cuantitativas. Las sondas de oligonucleótidos se eligieron a manera de dar un fragmento amplificado de 200-600 pares de bases aproximadamente desde el extremo 3' de su plantilla asociada en una reacción PCR estándar. Se emplearon las sondas de oligonucleótidos en reacciones de amplificación PCR cuantitativas, estándar, con bibliotecas de ADNc aisladas de diferentes fuentes de tejidos de adultos y/o fetos de humano y se analizaron mediante electrofóresis en gel de agarosa para obtener una determinación cuantitativa del gel nivel de expresión del ácido nucleico que codifica al polipéptido PRO en los diversos tejidos probados. El conocimiento del patrón de expresión o la expresión diferencial del ácido nucleico que codifica al polipéptido en los diferentes tipos de tejidos humanos proporciona un marcador de diagnóstico útil para imprimir el tejido, con o sin otros marcadores específicos del tejido, para la determinación de la fuente de tejido principal de un tumor metastático, y similar. Los resultados de estos ensayos se muestran en la Tabla 24 continuación. Tabla 24 Acido Nucleico Significativamente Expresado en No Significativamente Expresado en DNA34392-1170 hígado, riñon, cerebro, pulmón placenta DNA39976-1215 cerebro pulmón DNA35595-1228 páncreas, cerebro, riñon, hígado DNA34436-1238 pulmón, placenta, cerebro testículos DAN44176- 1244 hígado cerebro, pulmón DNA44192- 1246 riñon hígado DNA44804-1248 pulmón, cerebro DNA41234- 1242 pulmón, hígado, riñon cerebro DNA45410-1250 pulmón, cerebro, riñon, hígado DNA46777-1253 hígado, placenta, cerebro EJEMPLO 36: Inducción de la Hemoglobina Fetal en una Línea Celular Eritroblástica (Ensayo 107) Este ensayo es útil para seleccionar los polipéptidos PRO que tienen capacidad de inducir la conmutación de la hemoglobina adulta a la hemoglobina fetal en una línea celular eritroblástica. Las moléculas que prueban positivas en este ensayo se esperan que sean útiles para el tratamiento terapéutico de varios padecimientos asociados con la hemoglobina de mamíferos tales como las diversas talasemias. El ensayo se realizó como sigue. Las células eritroblásticas se colocan en placas en un medio de crecimiento estándar a 100 células/pozo en un formato de 96 pozos. Se agregan los polipéptidos PRO al medio de crecimiento a una concentración de 0.2% ó 2% y las células se incuban durante 5 días a 37 °C. Como un control positivo, las células se tratan con hemina 100 µM y como un control negativo, las células están no tratadas. Después de 5 días, se preparan los lisados celulares y se analizan para la expresión de la gamma globina (un marcador fetal) . Un positivo en este ensayo es un nivel de gamma globina de al menos 2 veces por arriba del control negativo. El siguiente polipéptido probó positivo en este ensayo: PR0243. EJEMPLO 37: Hibridización In si tu La hibridización in si tu es una técnica poderosa y versátil para la detección y localización de secuencias de ácido nucleico dentro de preparación de células o tejidos. Puede ser útil, por ejemplo, para identificar los sitios de la expresión de los genes, analizar la distribución del tejido de la transcripción, identificar y localizar la infección viral, seguir los cambios en la síntesis de ARNm específico y como ayuda en la formación de mapas de cromosomas. La hibridización in si tu se realizó siguiendo una versión optimizada del protocolo por Lu y Gillett, Cell Vision 1:169-176 (1994), utilizando ribosondas marcadas con 33P generadas por PCR. De manera breve, los tejidos humanos embebidos en parafina, fijados con formalina, se seccionaron, se desparafinizaron, se desproteinizaron en proteinasa K (20 g/ml) durante 15 minutos a 37°C, y se procesaron posteriormente para hibridización in si tu como se describió por Lu y Gillett, supra . Se generó una ribosonda de antisentido etiquetada con [33-P] UTP a partir de un producto PCR y se hibridizó a 55°C durante toda la noche. Los cortes se enjuagaron en emulsión de rastreo nuclear Kodak NTB2 y se expusieron durante 4 semanas. Síntesis de P-Ribosonda Se secaron al vacío y con velocidad 6.0 µl (125 mCi) de 33P-UTP (Amersham BF 1002, SA <2000 Ci/mmoles) . A cada tubo que contenía 33P-UTP, se le agregaron los siguientes ingredientes: 2.0 µl de amortiguador de transcripción 5x 1.0 µl de DTT (100 mM) 2.0 µl de mezcla NTP (2.5 mM: 10 µ; cada uno de GTP 10 mM, CTP & ATP + 10 µl de H20) 1.0 µl de UTP (50 µM) 1.0 µl de Rnasin 1.0 µl de plantilla de ADN (1 µg) 1.0 µl de H20 1.0 µl de polimerasa de ARN (para productos PCR T3 = AS, T7 = S, usualmente) Los tubos se incubaron se incubaron a 37 °C durante una hora. Se agregó 1.0 µl de DNasa de RQ1, seguido por incubación a 37 °C durante 15 minutos. Se agregaron 90 µl de TE (Tris mM pH 7.6/EDTA 1 mM pH 8.0), y la mezcla se agregó mediante una pipeta en papel DE81. La solución restante se cargó en una unidad de ultrafiltración Microcon-50, y se hizo girar utilizando el programa 10 (6 minutos). La unidad de filtración se invirtió en un segundo tubo y se hizo girar utilizando el programa 2 (3 minutos) . Después del giro de recuperación final, se agregaron 100 µl de TE. 1 µl del producto final se tomó con una pipeta sobre papel DE81 y se contabilizó en 6 mL de Biofluor II. La sonda se hizo correr en un gel de TBE/urea. Se agregaron 1-3 µl de la sonda ó 5 µl de ARN Mrk III a 3 µl del amortiguador de carga. Después del calentamiento en un bloque de calentamiento de 95°C durante tres minutos, el gel se colocó inmediatamente en hielo. Los pozos de gel se lavaron, la muestra se cargó, y se corrió a 180-250 voltios durante 45 minutos. El gel se envolvió en una envoltura sarán y se expuso a una película XAR con una pantalla intensificadora en un congelador a -70°C desde una hora a toda la noche. 33 P-Hibridización A. Pretratamiento de las secciones congeladas Los cortes se removieron del congelador, se colocaron en charolas de aluminio y se enjugaron a temperatura ambiente durante 5 minutos. Las charolas se colocaron en un incubador a 55°C durante cinco minutos para reducir la condensación. Los cortes se fijaron durante 10 minutos en paraformaldehído al 4% en hielo en una campana humeante, y se lavaron en 0.5 x SSC durante 5 minutos, a temperatura ambiente (25 mL de SSC 20 x + 975 ml de H20 SQ) . Después de la desproteinización en 0.5 µg/mL de proteinasa K durante 10 minutos a 37°C (12.5 µl de material 10 mg/ml en 250 ml de amortiguador RNasa libre RNasa precalentado) , las secciones se lavaron en SSC 0.5 x durante 10 minutos a temperatura ambiente. Las secciones se deshidrataron en etanol al 70%, 95%, 100%, 2 minutos cada una. B. Pretratamiento de las secciones embebidas en parafina Los cortes se desparafinizaron, se colocaron en H2O SQ, y se lavaron dos veces en SSC 2 x a temperatura ambiente, durante 5 minutos cada vez. Las secciones se desproteinizaron en proteinasa K 20 µg/ml (500 µl de 10 mg/ml en 250 ml de amortiguador RNasa libre de RNasa; 37 °C, 15 minutos) - embrión humano, o proteinasa K 8 x (100 µl en 250 mL de amortiguador RNasa, 37°C, 30 minutos) - tejidos de formalina. Un enjuague subsecuente en SSC 0.5 x y la deshidratación se realizaron como se describió anteriormente. C. Prehibridización Los cortes se dejaron en una caja de plástico revestida con amortiguador Box (SSC 4 x, formamida al 50%) -papel filtro saturado. El tejido se cubrió con 50 µl del amortiguador de hibridización (3.75 g de Sulfato de Dextrano + 6 ml de H20 SQ) , se hizo girar hasta generar un vórtice y se calentó en el microondas durante 2 minutos con la tapa quitada. Después del enfriamiento en hielo, se agregaron 18.75 ml de formamida, 3.75 ml de SSC 20 x y 9 ml de H20 SQ, el tejido se volvió a hacer girar hasta generar un vórtice, y se incubó a 42°C durante 1-4 horas. D. Hibridización La sonda 1.0 x 106 cpm y 1.0 µl de ARNt (50 mg/ml de material) por corte se calentaron a 95°C durante 3 minutos.

Los cortes se enfriaron en hielo, y se agregaron 48 µl del amortiguador de hibridización por corte. Después de generar el vórtice, se agregaron 50 µl de la mezcla 33P a 50 µl de prehibridización en el corte. Los cortes se incubaron durante toda la noche a 55 °C. E. Lavados El lavado se hizo 2 x 10 minutos con' SSC 2x, EDTA a temperatura ambiente (400 ml de SSC 20 x + 16 ml de EDTA 0.25 M, Vf = 4L) , seguido por tratamiento con RNasa a 37°C durante 30 minutos (500 µl de 10 mg/ml en 250 ml de amortiguador RNasa = 20 µg/ml) . Los cortes se lavaron 2 x 10 minutos con SSC 2 x, EDTA a temperatura ambiente. Las condiciones de lavado severas fueron las siguientes: 2 horas a 55°C, SSC 0.1 x, EDTA (20 ml de SSC 20 x + 16 ml de EDTA, Vf = 4L) . F. Oligonucleótidos Se realizó el análisis in si t u en una variedad de secuencias de ADN descritas aquí. Los oligonucleótidos empleados para estos análisis son los siguientes. (1) DNA44804-1248 (PR0357) pl 5' -GGATTCTAATACGACTCACTATAGGGCTGCCCGCAACCCCTTCAACTG-3' (SEC. ID. NO: 111) p2 5'-CTATGAAATTAACCCTCACTAAAGGGACCGCAGCTGGGTGACCGTGTA-3' (SEC. ID. NO: 112) (2) DNA52722-1229 (PRQ715) pl 5 ' -GGATTCTAATACGACTCACTATAGGGCCGCCCCCGCCACCTCCT-3 ' (SEC. ID. NO: 113) p2 5' -CTATGAAATTAACCCTCACTAAAGGGACTCGAGACACCACCTGACCCA-3' (SEC. ID. NO: 114) p3 5' -GGATTCTAATACGACTCACTATAGGGCCCAAGGAAGGCAGGAGACTCT-3' (SEC. ID. NO: 115) p4 5' -CTATGAAATTAACCCTCACTAAAGGGACTAGGGGGTGGGAATGAAAAG-3' (SEC. ID. NO: 116) (3) DNA38113-1230 (PRQ327) pl 5' -GGATTCTAATACGACTCACTATAGGGCCCCCCTGAGCTCTCCCGTGTA-3' (SEC. ID. NO: 117) p2 5' -CTATGAAATTAACCCTCACTAAAGGGAAGGCTCGCCACTGGTCGTAGA-3' (SEC. ID. NO: 118) (4) DNA35917-1207 (PRQ243) pl 5' -GGATTCTAATACGACTCACTATAGGGCAAGGAGCCGGGACCCAGGAGA-3' (SEC. ID. NO: 119) p2 5' -CTATGAAATTACCCTCACTAAAGGGAGGGGGCCCTTGGTGCTGAGT-3' (SEC. ID. NO: 120) G. Resultados Se realizaron los análisis in si tu en una variedad de secuencias de ADN descritas aquí. Los resultados de estos análisis son los que siguen. (1) DNA44804-1248 (PR0357) La expresión de nivel bajo a moderado en los sitios de formación de los huesos en los tejidos fetales y en las células malignas de un osteosarcoma. Señal posible en la placenta y la médula espinal. Todos los otros tejidos son negativos . Tejidos fetales humanos examinados (semanas E12-E16) incluyen : hígado, riñon, glándulas adrenales, pulmones, corazón, grandes vasos, esófago, estómago, bazo, gónadas, cerebro, médula espinal, y pared del cuerpo. Tejidos de humanos adultos examinados: hígado riñon estómago, bazo, glándulas adrenales, páncreas, pulmón, carcinoma colónico, carcinoma de las células renales y osteosarcoma. El daño al hígado inducido por acetaminofen y la cirrosis hepática. Tejidos de Chimpancé: tiroides, paratiroides, nodulos linfáticos, nervios, lengua, timo, glándulas adrenales, mucosa gástrica y glándulas salivales. Mono Rhesus: cerebro y cerebelo. (2) DNA52722-1229 (PR0715) Las señales altamente generalizadas observadas en muchos tejidos - señales más altas observadas en la placenta, osteoblastos, túbulos renales dañados, hígado dañado, metástasis del hígado colorrectal y la vejiga. Tejidos fetales humanos examinados (semanas E12-E16) incluyen: placenta, cordón umbilical, hígado, riñon, glándulas adrenales, tiroides, pulmón, corazón, grandes vasos, esófago, estómago, intestino delgado, bazo, timo, páncreas, cerebro, ojos, médula espinal, paredes del cuerpo, pelvis y miembros inferiores. Tejidos de humanos adultos examinados: hígado, riñon, glándulas adrenales, miocardio, aorta, bazo, pulmón, piel, condrosarcoma, ojos, estómago, colon, carcinoma colónico, próstata, mucosa de la vejiga y vejiga. El daño al hígado inducido por acetaminofen y la cirrosis hepática. Tejidos de Rhesus examinados: corteza cerebral (rm) , hipocampo (rm) . Tejidos de Chimpancé examinados: tiroides, paratiroides, nodulos linfáticos, nervios, lengua, timo, glándulas adrenales, mucosa gástrica y glándulas salivales. (3) DNA38113-1230 (PR0327) Se observó una expresión de alto nivel en el desarrollo del pulmón fetal de ratón y de humano. Los pulmones de adulto humano normal, que incluyen el epitelio bronquial, fueron negativos. La expresión en la submucosa de la traquea fetal humana, posiblemente en las células del músculo liso. También se observó la expresión en células no trofoblásticas de histogénesis incierta en la placenta humana. El ratón se observó en la expresión del desarrollo del hocico y en desarrollo de la lengua. Todos los otros tejidos son negativos. Función especulada: posible papel en el desarrollo bronquial. Tejidos fetales humanos examinados (semanas E12-E16) incluyen : placenta, cordón umbilical, hígado, riñon, glándulas adrenales, tiroides, pulmón, corazón, grandes vasos, esófago, estómago, intestino delgado, bazo, timo, páncreas, cerebro, ojos, médula espinal, paredes del cuerpo, pelvis y miembros inferiores. Tejidos de humanos adultos examinados: hígado, riñon, glándulas adrenales, miocardio, aorta, bazo, nodulos linfáticos, páncreas, pulmón, piel, corteza cerebral (rm) , hipocampo (rm) , cerebelo (rm) , pene, ojos, vejiga, estómago, carcinoma gástrico, colon, carcinoma colónico, tiroides (chimpancé) paratiroides (chimpancé) , ovario (chimpancé) y condrosarcoma . (4) DNA35917-1207 (PR0243) El síndrome de Cornelia de Langé (CdLS) es un síndrome congénito. Esto significa que se presenta desde el nacimiento. El CdLS es un padecimiento que causa un retraso en el desarrollo físico, intelectual, y de lenguaje. La gran mayoría de los niños CdLS son mentalmente retardados, con el grado de retardo mental que varía desde moderado a severo. Los coeficientes intelectuales (IQ) van de 30 a 85. El promedio de IQ es de 53. Las características faciales y de la cabeza incluyen tamaño pequeño de la cabeza, cejas delgadas que a menudo se encuentran en la línea media, pestañas largas, nariz corta hacia arriba, labios delgados hacia abajo, orejas colocadas un poco más abajo y paladar arqueado alto o paladar hendido. Otras características pueden incluir retardo en el lenguaje, aún en la mayoría de los casos afectados moderadamente, crecimiento retardado y estatura pequeña, grito de baja tensión, manos y pies pequeños, cinco dedos incurvados, arrugas simiescas, y excesivo pelo en el cuero. El diagnóstico depende de la presencia de una combinación de estas características. Muchas de estas características aparecen en grados variables. En algunos casos estas características pueden no estar presentes o pueden ser moderadas de manera que se reconocerán solamente cuando se observen mediante un genetista entrenado u otra persona familiarizada con el síndrome. Aunque se conoce mucho acerca del CdLS, reportes recientes sugieren que hay mucho más por aprender. En este estudio se examinaron secciones adicionales, de la cara, cabeza, y miembros del feto humano y de embrión de ratón. No se observó expresión en cualquiera de los tejidos de ratón. La expresión se observó solamente con la sonda antisentido. Se observó la expresión adyacente al desarrollo de los miembros y los huesos faciales en la mesenquima perosteal. La expresión fue altamente específica y a menudo estuvo adyacente a las áreas que sufren vascularización. La distribución es consistente con las anormalidades esqueléticas observadas en el síndrome de Cornelia de Lange. La expresión también se observó en el desarrollo de los lóbulos temporales y occipital del cerebro fetal, pero no se observó en ningún otro lado. Además, se observó la expresión en los ganglios del desarrollo del oído interno; el significado de este hallazgo no es claro. Aunque estos datos no proporcionan información funcional, la distribución es consistente con los sitios que se sabe están afectados más severamente en este síndrome. Adicionalmente, se observó una expresión apenas visible en la línea de escisión en el desarrollo de la articulación sinovial que se forma entre la cabeza femoral y el acetábulo (articulación de la cadera) . Si se observa este patrón de expresión en los sitios de formación de la articulación en cualquier lado, podría explicar las ______*! anormalidades faciales y de los miembros observadas en el síndrome de Cornelia de Lange. EJEMPLO 38: Actividad del ARNm de PR0243 en Oocitos Xenopus Para demostrar que el clon de cordina humano (DNA3917-1207) que codifica al PR0243 es funcional y actúa de una manera predicha por la cordina de Xenopus y los genes sog de Drosophila, el ADN del plásmido super-enrolado o helicoidal a partir del DNA3917-1207 se preparó de Qiagen y se utilizó para la inyecciones en embriones de Xenopus laevis. La microinyección del ARNm de cordina de Xenopus en los blastómeros ventrovegetales induce a los ejes secundarios (gemelos) (Sasai et al., Cell 79:779-790 (1994) •y el sog de Drosophila también induce un eje secundario cuando se expresa ectópicamente en el lado ventral del embrión de Xenopus Xenopus (Holley et al., Nature 376:249- 253 (1995) y Schmidt et al., Development 121:4319-4328 (1995)). La capacidad del sog para funcionar en los oocitos de Xenopus sugiere que los procesos involucrados en la formación del patrón dorsoventral se han conservado durante la evolución. Métodos Manipulación del embrión Xenopus Las ranas hembras adulto se potencializaron con 200 I.U. de suero mare de embarazo 3 días antes de usarse y con 800 I.U. de gónadotropina coriónica humana la anterior de la inyección. Los oocitos frescos se obtuvieron por presión de las ranas hembra la siguiente mañana y la fertilización in vitro de los oocitos se realizó mezclando los oocitos con testículos molidos de ranas macho sacrificadas. Los embriones en desarrollo se mantuvieron y se colocaron en etapas de acuerdo con Niewkoop y Faber, Normal Table of Xenopus laevis, N.-H. P. Co., ed. (Amsterdam, 1967). A los huevos fertilizados se les eliminó la gelatina con cisteína al 2% (pH 7.8) durante 10 minutos, se lavaron una vez agua destilada y se transfirieron al MBS 0.1 x con Ficoll al 5%. Los huevos fertilizados se recubrieron en charolas de inyección en MBS 0.1 X con Ficoll al 5%. Los embriones de Xenopus en desarrollo en etapas de dos células se inyectaron con 200 pg de pRK5 que contiene cordina tipo nativo o salvaje (DNA3917-1207) ó 200 pg de pRK5 sin un inserto como control. Los embriones inyectados se mantuvieron en charolas por otras 6 horas, después de lo cual se transfirieron a MBS 0.1 x con 50 mg/ml de gentamicina hasta alcanzar la etapa 37-38 de Nieukwkoop. Resultados : La inyección de ADNc de la cordina humana en blastómeros únicos dio como resultado la ventralización del renacuajo. La ventralización del renacuajo es visible en que se acortan y se enrosca la cola y la expansión de la glándula de cemento. La capacidad de la cordina humana para funcionar como un agente ventralizante en Xenopus muestra que la proteína codificada por el DNA3917-1207 es funcional e influye en la formación del patrón dorsal-ventral en las ranas y sugiere que el proceso involucrado en la formación del patrón dorsoventral se ha conservado durante la evolución, con los mecanismos en común entre los humanos, moscas, y ranas. Depósito del Material Los siguientes materiales han sido depositados con la Colección del Cultivo Tipo Americano, 12301 Parklawn Drive, Rockville, MD, USA (ATCC) : Material Dep. ATCC No. Fecha del Depósito DNA34392-1170 ATCC 209526 10 de Diciembre de 1997 DNA35917-1207 ATCC 209508 3 de Diciembre de 1997 DNA39976-1215 ATCC 209524 10 de Diciembre de 1997 DNA15595-1228 ATCC 209528 10 de Diciembre de 1997 DNA38113-1230 ATCC 209530 10 de Diciembre de 1997 DNA34436-1238 ATCC 209523 10 de Diciembre de 1997 DNA40592-1242 ATCC 209492 21 de Noviembre de 1997 DNA44176-1244 ATCC 269532 10 de Diciembre de 1997 DNA44192-1246 ATCC 209531 10 de Diciembre de 1997 DNA39518-1247 ATCC 209529 10 de Diciembre de 1997 DNA44804-1248 ATCC 209527 10 de Diciembre de 1997 DNA52722-1229 ATCC 209570 7 de Enero de 1998 DNA41234-1242 ATCC 209618 5 de Febrero de 1998 DNA45410-1250 ATCC 209621 5 de Febrero de 1998 DNA46777-1253 ATCC 209619 5 de Febrero de 1998 Estos depósitos se hicieron bajo las condiciones del Tratado de Budapest en el Reconocimiento Internacional del Depósito de Microorganismos con el Propósito del Procedimiento de Patente y las Regulaciones en relación al mismo (Tratado de Budapest) . Esto asegura el mantenimiento de un cultivo viable del depósito durante 30 año desde la fecha de depósito. Los depósitos estarán disponibles por ATCC bajo los términos del Tratado de Budapest, y sujetos a un acuerdo entre Genentech, Inc. y ATCC, lo cual asegura una disponibilidad permanente y no restringida de la progenie del cultivo del depósito al público luego de la expedición de la patente Norteamericana pertinente o luego de que se deje abierto al público cualquier solicitud de patente Norteamericana o extranjera, lo cual ocurra primero, y asegure la disponibilidad de la progenie a aquél que sea determinado por el Comisionado Norteamericano de Patentes y Marcas de acuerdo al 35 USC § 122 y a las reglas del Comisionado de acuerdo al mismo (que incluye 37 CFR § 1.14 con referencia particular a 886 OG 638) . El cesionario de la presente solicitud está de acuerdo que si un cultivo de los materiales en el depósito muriera, se perdiera o se destruyera cuando se cultivará bajo condiciones adecuadas, los materiales serán rápidamente remplazados luego de la notificación con otro material igual. La disponibilidad del material depositado no se considera una licencia para practicar la invención en contravención de los derechos otorgados bajo la autoridad de cualquier gobierno de acuerdo con sus leyes de patente. La anterior especificación escrita se considera que es suficiente para permitir a alguien con habilidades en la técnica practicar la invención. La presente invención no está limitada en el alcance por el constructo depositado, puesto que la modalidad depositada intenta ser una sola ilustración de ciertos aspectos de la invención y cualquier constructo o construcción que tenga un equivalente funcional y que esté dentro del alcance de esta invención. El depósito de material en la presente no constituye una admisión de que la descripción descrita aquí contenida sea inadecuada para permitir la práctica en cualquier aspecto de la invención, que incluye la mejor modalidad de la misma, tampoco está considerada como limitante del alcance de las reivindicaciones a las ilustraciones específicas que representa. De manera específica, varias modificaciones de la invención además de aquellas mostradas y descritas aquí se volverán aparentes para aquellos hábiles en la técnica de la descripción anterior y que caen dentro del alcance de las reivindicaciones anexas. Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.

Claims

REIVINDICACIONES Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones: 1.- El ácido nucleico aislado caracterizado porque tiene al menos una identidad de secuencia de ácido nucleico del 80% con respecto a una secuencia de nucleótidos que codifica una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de la secuencia de aminoácidos mostrada en la
Figura 2 (SEC. ID NO: 2), Figura 4 (SEC. ID NO: 7), Figura 6 (SEC. ID NO: 15), Figura 10 (SEC. ID NO: 24), Figura 14
(SEC. ID NO: 32), Figura 16 (SEC. ID NO: 37), Figura 18
(SEC. ID NO: 42), Figura 20 (SEC. ID NO: 50), Figura 22
(SEC. ID NO: 55), Figura 24 (SEC. ID NO: 61), Figura 26
(SEC. ID NO: 69), Figura 28 (SEC. ID NO: 76), Figura 30 (SEC. ID NO: 78), Figura 32 (SEC. ID NO: 83), y Figura 34
(SEC. ID NO: 91) . 2.- El ácido nucleico aislado caracterizado porque tiene al menos una identidad de secuencia de ácido nucleico del 80% con respecto a una secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo que consiste de la secuencia de nucleótidos mostrada en la Figura 1 (SEC. ID NO: 1), Figura 3 (SEC. ID NO: 6), Figura 5 (SEC. ID NO: 14), Figura 9 (SEC. ID NO: 23), Figura 13 (SEC. ID NO: 31), Figura 15 (SEC. ID
-^-¡^^MM^^-^ NO: 36), Figura 17 (SEC. ID NO: 41), Figura 1-9 (SEC. ID NO: 49), Figura 21 (SEC. ID NO: 54), Figura 23 (SEC. ID NO: 60), Figura 25 (SEC. ID NO: 68), Figura 27 (SEC. ID NO: 75), Figura 29 (SEC. ID NO: 77), Figura 31 (SEC. ID NO: 82), y Figura 33 (SEC. ID NO: 90) . 3.- El ácido nucleico aislado caracterizado porque tiene al menos una identidad de secuencia de ácido nucleico del 80% con respecto a una secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo que consiste de la secuencia de codificación de longitud completa de la secuencia de nucleótidos mostrada en la Figura 1 (SEC. ID NO: 1), Figura 3 (SEC. ID NO: 6), Figura 5 (SEC. ID NO: 14), Figura 9 (SEC. ID NO: 23), Figura 13 (SEC. ID NO: 31), Figura 15 (SEC. ID NO: 36), Figura 17 (SEC. ID NO: 41), Figura 19 (SEC. ID NO: 49), Figura 21 (SEC. ID NO: 54), Figura 23 (SEC. ID NO: 60), Figura 25 (SEC. ID NO: 68), Figura 27 (SEC. ID NO: 75), Figura 29 (SEC. ID NO: 77), Figura 31 (SEC. ID NO: 82), y Figura 33 (SEC. ID NO: 90) . 4.- El ácido nucleico aislado caracterizado porque tiene al menos una identidad de secuencia de ácido nucleico del 80% con respecto la secuencia de codificación de longitud completa del ADN depositado bajo el número de acceso ATCC 209526, ATCC 209508, ATCC 209524, ATCC 209528, ATCC 209530, ATCC 209523, ATCC 209492., ATCC 209532, ATCC 209531, ATCC 209529, ATCC 209527, ATCC 209570, ATCC 209618, ATCC 209621, ATCC 209619. 5.- Un vector caracterizado porque comprende el ácido nucleico de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4. 6.- El vector de conformidad con la reivindicación 5, caracterizado porque está operablemente enlazado a las secuencias de control reconocidas por una célula hospedera transformada con el vector. 7.- Una célula hospedera caracterizada porque comprende el vector de conformidad con la reivindicación 5. 8.- La célula hospedera de conformidad con la reivindicación 7, caracterizada porque dicha célula es una célula CHO.
9.- La célula hospedera de conformidad con la reivindicación 7, caracterizada porque dicha célula es una E. coli .
10.- La célula hospedera de conformidad con la reivindicación 7, caracterizada porque dicha célula es una célula de levadura.
11.- Un proceso para la producción de polipéptidos PRO caracterizado porque comprende cultivar la célula hospedera de la reivindicación 7 bajo condiciones adecuadas para la expresión de dicho polipéptido PRO y recuperar dicho polipéptido PRO del cultivo celular.
12.- Un polipéptido aislado caracterizado porque tiene al menos una identidad de secuencia de aminoácidos del 80% con respecto a una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de la secuencia de aminoácidos mostrada en la Figura 2 (SEC. ID NO: 2), Figura 4 (SEC. ID NO: 7), Figura 6 (SEC. ID NO: 15), Figura 10 (SEC. ID NO: 24), Figura 14 (SEC. ID NO: 32), Figura 16 (SEC. ID NO: 37), Figura 18 (SEC. ID NO: 42), Figura 20 (SEC. ID NO: 50), Figura 22 (SEC. ID NO: 55), Figura 24 (SEC. ID NO: 61), Figura 26 (SEC. ID NO: 69), Figura 28 (SEC. ID NO: 76), Figura 30 (SEC. ID NO: 78), Figura 32 (SEC. ID NO: 83), y Figura 34 (SEC. ID NO: 91).
13.- Un polipéptido aislado caracterizado porque tiene un valor al menos 80% positivo cuando se compara con una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de la secuencia de aminoácidos mostrada en la Figura 2 (SEC. ID NO: 2), Figura 4 (SEC. ID NO: 7), Figura 6 (SEC. ID NO: 15), Figura 10 (SEC. ID NO: 24), Figura 14 (SEC. ID NO: 32), Figura 16 (SEC. ID NO: 37), Figura 18 (SEC. ID NO: 42), Figura 20 (SEC. ID NO: 50), Figura 22 (SEC. ID NO: 55), Figura 24 (SEC. ID NO: 61), Figura 26 (SEC. ID NO: 69), Figura 28 (SEC. ID NO: 76), Figura 30 (SEC. ID NO: 78), Figura 32 (SEC. ID NO: 83), y Figura 34 (SEC. ID NO: 91) . 5
14.- Un polipéptido PRO aislado caracterizado porque tiene al menos una identidad de secuencia de aminoácidos del 80% con respecto a la secuencia de aminoácidos codificada por la secuencia de codificación de longitud completa del ADN depositado bajo el número de acceso ATCC 209526, ATCC 10 209508, ATCC 209524, ATCC 209528, ATCC 209530, ATCC 209523, ATCC 209492, ATCC 209532, ATCC 209531, ATCC 209529, ATCC 209527, ATCC 209570, ATCC 209618, ATCC 209621, ATCC 209619.
15.- Una molécula quimérica caracterizada porque comprende un polipéptido de conformidad con cualquiera de 15 las reivindicaciones 12 a 14, fusionado con una secuencia de aminoácidos heteróloga.
16.- La molécula quimérica de conformidad con la reivindicación 15, caracterizada porque la secuencia de aminoácidos heteróloga es una secuencia de marca o etiqueta 20 de epítope.
17.- La molécula quimérica de conformidad con la reivindicación 15, caracterizada porque la secuencia de aminoácidos heteróloga es una región Fc de una inmunoglobulina. ________!_____•
18.- Un anticuerpo caracterizado porque se enlaza específicamente a un polipéptido de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 12 a 14.
19.- El anticuerpo de conformidad con la 5 reivindicación 18, caracterizado porque dicho anticuerpo es un anticuerpo monoclonal, un anticuerpo humanizado o un anticuerpo de una sola cadena.
20.- El ácido nucleico aislado caracterizado porque tiene al menos una identidad de secuencia de ácido nucleico 10 del 80% con respecto a: (a) una secuencia de nucleótidos que codifica al polipéptido mostrado en la Figura 2 (SEC. ID NO: 2), Figura 4 (SEC. ID NO: 7), Figura 6 (SEC. ID NO: 15), Figura 10 (SEC. ID NO: 24), Figura 14 (SEC. ID NO: 32), Figura 16 15 (SEC. ID NO: 37() , Figura 18 (SEC. ID NO: 42), Figura 20 (SEC. ID NO: 50), Figura 22 (SEC. ID NO: 55), Figura 24 (SEC. ID NO: 61), Figura 26 (SEC. ID NO: 69), Figura 28 (SEC. ID NO: 76), Figura 30 (SEC. ID NO: 78), Figura 32 (SEC. ID NO: 83), y Figura 34 (SEC. ID NO: 91), que carece 20 de su péptido de señal asociado; (b) una secuencia de nucleótidos que codifica un dominio extracelular del polipéptido mostrado en la Figura 2 (SEC. ID NO: 2), Figura 4 (SEC. ID NO: 7), Figura 6 (SEC. ID M-t-u-MÉlu?É-a -?ÉIÉi-? NO: 15), Figura 10 (SEC. ID NO: 24), Figura 14 (SEC. ID NO: 32), Figura 16 (SEC. ID NO: 37), Figura 18 (SEC. ID NO: ,42), Figura 20 (SEC. ID NO: 50), Figura 22 (SEC. ID NO: 55), Figura 24 (SEC. ID NO: 61), Figura 26 (SEC. ID NO: 69), Figura 28 (SEC. ID NO: 76), Figura 30 (SEC. ID NO: 78), Figura 32 (SEC. ID NO: 83), y Figura 34 (SEC. ID NO: 91), con su péptido de señal asociado; o (c) una secuencia de nucleótidos que codifica un dominio extracelular del polipéptido mostrado en la Figura 2 (SEC. ID NO: 2), Figura 4 (SEC. ID NO: 7), Figura 6 (SEC. ID NO: 15), Figura 10 (SEC. ID NO: 24), Figura 14 (SEC. ID NO: 32), Figura 16 (SEC. ID NO: 37), Figura 18 (SEC. ID NO: 42), Figura 20 (SEC. ID NO: 50), Figura 22 (SEC. ID NO: 55), Figura 24 (SEC. ID NO: 61), Figura 26 (SEC. ID NO: 69), Figura 28 (SEC. ID NO: 76), Figura 30 (SEC. ID NO: 78), Figura 32 (SEC. ID NO: 83), y Figura 34 (SEC. ID NO: 91), que carece de su péptido de señal asociado.
21.- Un polipéptido aislado caracterizado porque tiene al menos una identidad de secuencia de aminoácidos del 80% con respecto a: (a) el polipéptido mostrado en la Figura 2 (SEC. ID NO: 2), Figura 4 (SEC. ID NO: 7), Figura 6 (SEC. ID NO: 15), Figura 10 (SEC. ID NO: 24), Figura 14 (SEC. ID NO: 32), Figura 16 (SEC. ID NO: 37), Figura 18 (SEC ID NO: 42), Figura 20 (SEC. ID NO: 50), Figura 22 (SEC. ID NO: 55), Figura 24 (SEC. ID NO: 61), Figura 26 (SEC. ID NO: 69), Figura 28 (SEC. ID NO: 76), Figura 30 (SEC. ID NO: 78), Figura 32 (SEC. ID NO: 83), y Figura 34 (SEC. ID NO: 91), que carece de su péptido de señal asociado; (b) un dominio extracelular del polipéptido mostrado en la Figura 2 (SEC. ID NO: 2), Figura 4 (SEC. ID NO: 7), Figura 6 (SEC. ID NO: 15), Figura 10 (SEC. ID NO: 24), Figura 14 (SEC. ID NO: 32), Figura 16 (SEC. ID NO: 37), Figura 18 (SEC. ID NO: 42), Figura 20 (SEC. ID NO: 50), Figura 22 (SEC. ID NO: 55), Figura 24 (SEC. ID NO: 61), Figura 26 (SEC. ID NO: 69), Figura 28 (SEC. ID NO: 76), Figura 30 (SEC. ID NO: 78), Figura 32 (SEC. ID NO: 83), y Figura 34 (SEC. ID NO: 91), con su péptido de señal asociado; o (c) un dominio extracelular del polipéptido mostrado en la Figura 2 (SEC. ID NO: 2), Figura 4 (SEC. ID NO: 7), Figura 6 (SEC. ID NO: 15), Figura 10 (SEC. ID NO: 24), Figura 14 (SEC. ID NO: 32), Figura 16 (SEC. ID NO: 37), Figura 18 (SEC. ID NO: 42), Figura 20 (SEC. ID NO: 50), Figura 22 (SEC. ID NO: 55), Figura 24 (SEC. ID NO: 61), Figura 26 (SEC. ID NO: 69), Figura 28 (SEC. ID NO: 76), Figura 30 (SEC. ID NO: 78), Figura 32 (SEC. ID NO: 83), y Figura 34 (SEC. ID NO: 91), que carece de su péptido de señal asociado. -tf---?ü>tM-& -a-aUM-1-