KR20010081111A - 분비 및 막횡단 폴리펩티드 및 이를 코딩하는 핵산 - Google Patents

분비 및 막횡단 폴리펩티드 및 이를 코딩하는 핵산 Download PDF

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Abstract

본 발명은 분비 폴리펩티드 및 막횡단 폴리펩티드에 관한 것이며, 이런 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 분자에 관한 것이다. 본원에서는 또한 상기 핵산 서열을 포함하는 벡터 및 숙주 세포, 본 발명의 폴리펩티드를 이종 폴리펩티드 서열에 융합시킨 키메라 폴리펩티드 분자, 본 발명의 폴리펩티드에 결합하는 항체, 및 본 발명의 폴리펩티드를 제조하는 방법도 제공된다.

Description

분비 및 막횡단 폴리펩티드 및 이를 코딩하는 핵산 {Secreted and Transmembrane Polypeptides and Nucleic Acids Encoding the Same}
세포외 단백질은 무엇보다도 다세포 생물의 형성, 분화 및 유지에 중요한 역할을 담당한다. 많은 개별 세포의 운명, 예를 들어 증식, 이동, 분화 또는 다른 세포와의 상호작용은 다른 세포 및(또는) 인접 환경으로부터 받은 정보에 의해 지배당하는 것이 일반적이다. 이런 정보는 종종 분비된 폴리펩티드 (예를 들면 유사분열 촉진인자, 생존 인자, 세포독성 인자, 분화 인자, 신경 펩티드 및 호르몬)에 의해 전달되어, 결국엔 다양한 세포 수용체들이나 막결합 단백질들에 의해 수용되고 해독된다. 이들 분비 폴리펩티드 또는 신호전달 분자는 대개 세포 분비 경로를 통해 세포외 환경의 자신의 작용 장소에 도달하게 된다.
분비 단백질은 제약, 진단, 바이오센서, 생물반응기 등과 같은 다양한 산업적 용도를 갖고 있다. 사실상 혈전융해제, 인터페론, 인터루킨, 에리트로포이에틴, 콜로니 자극 인자 및 다양한 다른 사이토킨 등 현재 이용되는 대부분의 단백질 의약은 분비 단백질이다. 이들의 수용체인 막결합 단백질도 치료제나 진단제로서가능성이 있다. 새로운 천연 분비 단백질을 찾아내려는 노력이 산업계와 학계에서 진행되고 있다. 이런 노력 가운데 상당수는 포유류 재조합 DNA 라이브러리를 스크리닝해서 신규한 분비 단백질의 코딩 서열을 찾아내는데 집중되어 있다. 스크리닝 방법 및 기술의 예는 문헌 (Klein et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 93:7108-7113 (1996); 제5,536,637호)에 기재되어 있다.
막결합 단백질 및 수용체는 무엇보다도 다세포 생물의 형성, 분화 및 유지에서 중요한 역할을 담당할 수 있다. 많은 개별 세포의 운명, 예를 들어 증식, 이동, 분화 또는 다른 세포와의 상호작용은 다른 세포 및(또는) 인접 환경으로부터 받은 정보에 의해 지배당하는 것이 일반적이다. 이런 정보는 종종 분비된 폴리펩티드 (예를 들면 유사분열 촉진인자, 생존 인자, 세포독성 인자, 분화 인자, 신경 펩티드 및 호르몬)에 의해 전달되어, 결국엔 다양한 세포 수용체들이나 막결합 단백질들에 의해 수용되고 해독된다. 이러한 막결합 단백질과 세포 수용체로는 사이토킨 수용체, 수용체 키나제, 수용체 포스파타제, 세포-세포 상호작용에 관여하는 수용체, 셀렉틴 및 인테그린과 같은 세포 어드헤신 (adhesin) 분자 등을 들 수 있으나 이것으로 국한되는 것은 아니다. 세포 성장 및 분화를 조절하는 신호 도입 (transduction)은 부분적으로 여러 세포 단백질의 인산화를 통해 조절된다. 이 과정을 촉매하는 효소인 단백질 티로신 키나제는 성장 인자 수용체로도 작용할 수 있다. 그 예로는 섬유아세포 성장 인자 수용체 및 신경 성장 인자 수용체 등을 들 수 있다.
막결합 단백질 및 수용체 분자는 제약 및 진단제를 비롯한 다양한 산업적 용도를 갖는다. 예를 들면 수용체 면역어드헤신 (immunoadhesin)는 수용체-리간드 상호작용을 차단하는 치료제로 사용될 수 있다. 막결합 단백질은 또한 관련 수용체/리간드 상호작용의 억제할 수 있는 펩티드 또는 소분자 억제제를 스크리닝하는데도 사용될 수 있다.
신규한 천연 수용체 또는 막결합 단백질을 찾아내려는 학계 및 산업계의 노력이 진행되고 있다. 이런 노력 가운데 상당수는 포유류 재조합 DNA 라이브러리를 스크리닝해서 신규한 수용체 또는 막결합 단백질의 코딩 서열을 찾아내는데 집중되어 있다.
1.PRO241
연골은 치밀한 콜라겐 섬유 망상구조 및 고함량의 프로테오글리칸을 포함하는 커다란 세포외 매트릭스가 있는 분화된 결합 조직이다. 연골에서 대부분의 프로테오글리칸은 많은 황산 콘드로이틴 및 황산 케라틴 사슬을 포함하고 연결 단백질과 함께 히알루로난에 결합하여 다중분자성 집합체를 형성하는 어그리칸 (aggrecan)이지만, 연골에는 또한 저분자량의 프로테오글리칸도 많이 포함되어 있다. 상기 저분자량 프로테오글리칸 중 하나가 비글리칸이라 불리는 단백질로서, 이것은 힘줄, 공막, 피부 등을 포함하는 다양한 다른 결합 조직의 세포외 메트릭스에 넓게 분포되어 있는 프로테오글리칸이다. 비글리칸은 류신 풍부 반복 서열 및 두 개의 황산 콘드로이틴/황산 데르마탄 사슬이 있다고 알려져 있고, 피브로넥틴의 세포-결합 도메인에 결합하여 세포가 그 부위에 결합하는 것을 억제하는 기능을 한다. 비글리칸과 같은 저분자량의 프로테오글리칸은 연골의 성장 및(또는) 수복 및관절염과 같은 퇴행성 질환에서 중요한 역할을 할 수 있다. 따라서, 비글리칸 단백질과 상동성이 있는 신규 폴리펩티드를 찾아내고 특징을 규명하는데 관심이 있다.
본 발명자들은 비글리칸 단백질과 상동성이 있으며 본원에서 PRO241 폴리펩티드로 지칭되는 신규 폴리펩티드의 확인 및 특징규명에 관해 설명한다.
2.PRO243
코르딘 (Xenopus, Xchd)은 강력한 등형성 (dorsalization) 활성이 있는 슈페만 형성체에 의해 분비되는 가용성 인자이다 (Sasai et al.,Cell 79: 779-90 (1994); Sasai et al.,Nature 376: 333-36 (1995)). 상기 형성체에 의해 분비되는 다른 등형성 인자는 노긴 (noggin) (Smith and Harlan,Cell 70: 829-840 (1992); Lamb et al.,Science 262: 713-718 (1993)) 및 폴리스타틴 (follistatin) (Hemmanti-Brivanlou et al.,Cell 77: 283-295 (1994))이다. 코르딘은 초기 외배엽을 신경 대 비신경 도메인으로 세분하고, 중배엽을 등형성시켜 척삭 및 근 형성을 유도한다. 코르딘은 배형성 (ventralization) BMP-4 신호에 대한 길항제로 기능하여 상기 기능을 수행한다. 상기의 억제는 코르딘이 세포외 공간에서 직접 BMP-4에 결합하여 BMP-4에 의한 BMP-4 수용체의 활성을 방해하게 됨으로써 매개된다 (Piccolo et al.,Develop. Biol. 182: 5-20 (1996)).
BMP-4는 배 (embryo)의 배쪽으로부터 구배를 형성하여 발현되는 반면, 코르딘은 BMP-4에 상보적인 구배로 발현된다. 코르딘은 BMP-4가 낮은 말단 구배를 형성하도록 길항작용을 한다. 따라서, 코르딘 및 다른 형성체-유도 인자의 신호와BMP 신호 사이의 균형은 외배엽성 배엽에 그의 등-배 위치 정보를 제공한다. 또한, 코르딘은 중추 신경계의 등-배 패턴 형성에 관련될 수 있다 (Sasai et al.,Cell 79: 779-90 (1994)). 코르딘은 오로지 전방 신경 조직 (전뇌형)을 유도하여 신경형을 전방화할 수도 있다 (Sasai et al.,Cell 79: 779-90 (1997)). 신경 유도 및 패턴 형성에서의 역할을 볼 때, 코르딘은 예를 들어 외상에 기인하거나 화학요법 후의 신경 퇴행성 질환 및 신경 손상의 치료에 유용함이 입증될 수 있다.
본 발명자들은 코르딘 단백질과 상동성이 있으며 본원에서 PRO243 폴리펩티드로 지칭되는 신규 폴리펩티드의 확인 및 특징규명에 관해 설명한다.
3.PRO299
노치 (notch) 단백질은 발생 과정중의 신호 전달과 관련이 있다. 상기 단백질은 비대칭 발생 가능성에 영향을 줄 수 있고, 발생에 관련된 다른 단백질들의 발현을 신호 전달할 수 있다 (문헌 (Robey, E.,Curr. Opin. Genet. Dev.,7(4):551 (1997); Simpson, P.,Curr. Opin. Genet. Dev.,7(4):537 (1997); Blobel CP.,Cell,90(4):589 (1997); Nakayama, H. et al.,Dev. Genet.,21(1):21 (1997); Sullivan,S.A. et al.,Dev. Genet.,20(3):208 (1997) 및 Hayashi, H. et al.,Int. J. Dev. Biol.,40(6):1089 (1996) 참조). 세레이트에 의해 매개되는 노치의 활성은 초파리의 날개 성충 디스크 (wing imaginal disc)의 등쪽 구획에서 관찰되었다 (Fleming et al.,Development, 124(15):2973 (1997)). 노치는 발생뿐만 아니라 신호 전달 능력에서도 흥미로운 단백질이다. 또한, 발생 및(또는) 신호 전달에서 역할을 할 수 있는 신규 폴리펩티드에도 관심이 있다.
본 발명자들은 노치 단백질과 상동성이 있으며 본원에서 PRO299 폴리펩티드로 지칭되는 신규 폴리펩티드의 확인 및 특징규명에 관해 설명한다.
4.PRO323
디펩티다제는 서로 다른 매우 다양한 디펩티드를 분해하는 기능을 하고, 포유류 및 비포유류 유기체에서 매우 중요한 생물학적 과정에 관련된 효소 단백질이다. 서로 다른 다양한 포유류 및 비포유류 유기체에서 수많은 상이한 디펩티다제 효소가 확인되고 특징이 규명되었다. 포유류의 디펩티다제 효소는 예를 들면, 단백질 소화, 디펩티드 호르몬 활성의 조절, 활성화, 또는 불활성화, 및 단백질과 효소의 물리적 특성 변화와 같은 다양한 생물학적 과정에서 중요한 역할을 한다.
디펩티다제 효소에 의해 수행되는 중요한 생리적 역할 때문에, 신규의 천연 디펩티다제 상동체를 찾아내려는 노력이 산업계와 학계에서 진행되고 있다. 이런 노력 가운데 상당수는 포유류 재조합 DNA 라이브러리를 스크리닝해서 신규 분비 단백질 및 막결합 수용체 단백질의 코딩 서열을 찾아내려는데에 집중되어 있다. 스크리닝 방법 및 기술의 예는 문헌 (예를 들어, Klein et al.,Proc. Natl. Acad. Sci., 93:7108-7113 (1996) 및 미국 특허 제5,536,637호 참조)에 기재되어 있다.
본 발명자들은 다양한 디펩티다제 단백질과 상동성이 있으며 본원에서 PRO323 폴리펩티드로 지칭되는 신규 폴리펩티드의 확인 및 특징규명에 관해 설명한다.
5.PRO327
뇌하수체 전엽 호르몬인 프로락틴은 성장 호르몬/프로락틴/태반 락토겐 유전자 족의 한 구성원에 의해 코딩된다. 포유류에서 프로락틴은 유선 발달 및 수유를 일차적으로 담당한다. 프로락틴은 유전자 전사와 mRNA 반감기 둘 다를 증가시켜 젖 단백질 유전자의 발현을 촉진시키는 기능을 한다.
프로락틴 단백질의 생리적 효과는 프로락틴의 세포 표면 프로락틴 수용체로의 결합력을 통해 매개된다. 프로락틴 수용체는 서로 다른 다양한 세포 유형에서 발견되고, 분자량은 약 40,000이며, 스스로나 다른 서브유닛에 이황화 결합으로 연결되지 않는다. 프로락틴 수용체의 양은 연구된 조직에 따라 다르게 조절된다.
생체내 세포 표면 수용체 분자가 수행하는 중요한 생리적 역할 때문에, 신규한 천연 막결합 수용체 단백질 (프로락틴 수용체와 서열 상동성이 있는 것을 포함함)을 찾아내려는 학계 및 산업계의 노력이 현재 진행되고 있다. 이런 노력 가운데 상당수는 포유류 재조합 DNA 라이브러리를 스크리닝해서 신규 막결합 수용체 단백질의 코딩 서열을 찾아내는데 집중되어 있다. 스크리닝 방법 및 기술의 예는 문헌 (예를 들어, Klein et al.,Proc. Natl. Acad. Sci., 93:7108-7113 (1996) 및 미국 특허 제5,536,637호 참조)에 기재되어 있다.
본 발명자들은 프로락틴 수용체 단백질과 상당한 상동성이 있으며 본원에서 PRO327 폴리펩티드로 지칭되는 신규 폴리펩티드의 확인 및 특징규명에 관해 설명한다.
6.PRO233
세포의 산화환원 상태가 세포 운명의 중요한 결정 요소라는 연구 결과가 보고되었다. 게다가, 반응성 산소종은 세포 독성이 있어서 조직 괴사, 기관의 기능부전, 아테롬성 동맥 경화증, 불임, 출생 결함, 조기 노화, 돌연변이 및 악성 종양을 비롯해서 염증 질환을 유발하는 것으로 보고되었다. 따라서, 산화 및 환원을 제어하는 것은 졸중, 심장 마비, 산화 스트레스 및 고혈압의 억제 및 예방을 포함하는 다양한 이유 때문에 중요하다.
산소 유리 라디칼 및 산화방지제는 대뇌의 국소 빈혈 및 재관류 후에 중추 신경계에서 중요한 역할을 하는 것으로 보인다. 게다가, 국소 빈혈 및 재관류와 연관된 심장 손상은 유기 라디칼의 작용으로 인해 유발된다고 보고되었다. 이런 점에서 리덕타제, 특히 옥시도리덕타제에 관심이 있다. 또한, 전사 인자 (NF-κB 및 AP-1)는 산화환원 상태에 의해 조절되고, AIDS, 암, 아테롬성 동맥 경화증 및 당뇨 합병증의 발병과정과 관련되어 있다고 생각되는 많은 다양한 유전자의 발현에 영향을 주는 것으로 알려져 있다. 상기 주제를 좀더 설명하는 문헌은 문헌 (Kelsey et al.,Br. J. Cancer, 76(7):852-854 (1997); Friedrich and Weiss,J. Theor. Biol., 187(4):529-540 (1997); 및 Pieulle et al.,J. Bacteriol., 179(18):5684-5692 (1997)) 등을 포함한다. 생체내 산화환원 반응의 생리적 중요성 때문에, 산화환원 반응과 관련된 신규한 천연 단백질을 찾아내려는 노력이 현재 진행되고 있다. 본 발명자들은 리덕타제에 상동성이 있으며 본원에서 PRO233 폴리펩티드로 지칭되는 신규 폴리펩티드의 확인 및 특징규명에 관해 설명한다.
7.PRO344
보체 단백질은 거대한 혈청 단백질군을 이루며, 이들 중 일부는 계단식 효소촉매과정 (enzymatic cascade)에 관여하여 염증 관련 이펙터 분자를 생성한다. 보체 단백질은 염증과 관련된 세포의 운동 및 기능 조절에서 특히 생리적으로 중요하다. 염증 및 이와 관련된 생체내 메커니즘의 생리적 중요성 때문에, 염증과 관련된 신규한 천연 단백질을 찾아내려는 노력이 현재 진행되고 있다. 본 발명자들은 보체 단백질과 상동성이 있으며 본원에서 PRO344 폴리펩티드로 지칭되는 신규 폴리펩티드의 확인 및 특징규명에 관해 설명한다.
8.PRO347
시스테인 풍부 단백질은 통상 복잡한 삼차원 구조를 갖고(거나) 이황화 결합을 형성할 수 있는 많은 시스테인 잔기가 있어서 다량체 형태로 존재한다. 잘 알려져 있는 시스테인 풍부 단백질의 하나가 다른 조직보다는 간에서 발현되는 만노스 수용체이며, 상기 수용체는 만노스에 결합하여 이를 간 세포로 수송하는 역할을 한다. 다른 시스테인 풍부 단백질들은 다양한 생리적 과정 및 생화학적 과정에서 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있다. 따라서, 신규한 시스테인 풍부 단백질을 찾아내는데 관심이 있다. 이런 관점에서, 본 발명자들은 시스테인 풍부 분비 단백질-3에 상당한 서열 상동성이 있으며 본원에서 PRO347 폴리펩티드로 지칭되는 신규한 시스테인 풍부 폴리펩티드의 확인 및 특징규명에 관해 설명한다.
9.PRO354
인터-알파-트립신 억제제(inter-alpha-trypsin inhibitor: ITI)는 많은 포유류 종의 혈장에서 발견되는, 커다란 (분자량은 약 240,000) 순환 프로테아제 억제제이다. 온전한 상태의 상기 억제제는 당단백질이고, 강한 글리코사미노글리칸 결합을 통해 상호작용하는 세 개의 글리코실화 서브유닛으로 구성되어 있다. ITI의트립신 억제 활성은 복합체의 가장 작은 서브유닛 (즉, 경쇄)에 위치해 있으며, 현재 단백질 비쿠닌이라고 알려져 있다. 성숙 경쇄는 21 개의 아미노산으로 구성된 N-말단 서열 (세린-10에서 글리코실화됨) 및 이에 이은 두 개의 나란한 쿠니츠형 (Kuniz-type) 도메인 (첫 번째 도메인의 아스파라긴-45에서 글리코실화되어 있고, 두 번째 도메인은 트립신, 키모트립신 및 플라스민을 억제할 수 있음)으로 구성되어 있다. ITI 복합체의 나머지 두 사슬은 복합체의 효소 활성 경쇄와 상호작용하는 중쇄이다.
신규한 천연 단백질을 찾아내려는 학계 및 산업계의 노력이 진행되고 있다. 이런 노력 가운데 상당수는 포유류 재조합 DNA 라이브러리를 스크리닝해서 신규 분비 및 막결합 수용체 단백질의 코딩 서열을 찾아내는데 집중되어 있다. 스크리닝 방법 및 기술의 예는 문헌 (예를 들어, Klein et al.,Proc. Natl. Acad. Sci., 93:7108-7113 (1996) 및 미국 특허 제5,536,637호 참조)에 기재되어 있다. 본 발명자들은 ITI 중쇄와 상당한 상동성이 있으며 본원에서 PRO354 폴리펩티드로 지칭되는 신규 폴리펩티드의 확인 및 특징규명에 관해 설명한다.
10.PRO355
세포 독성 또는 조절 T세포 결합 분자 또는 "CRTAM" 단백질은 면역글로불린 거대족과 구조적으로 관련되어 있다. CRTAM 단백질은 다양한 면역 반응을 매개할 수 있어야 한다. 항체들은 CRTAM 단백질에 통상적으로 고친화도로 결합한다 (Zlotnik, A.,Faseb, 10(6): A1037, Abr. 216, June 1996). 생체내 T세포 항원 및 면역 반응의 생리적 중요성 때문에, 면역 반응에 관여하는 신규한 천연 단백질을 찾아내려는 노력이 현재 진행되고 있다. 이와 관련해서는 문헌 (Kennedy et al., 미국 특허 제5,686,257호 (1997))을 참조할 수도 있다. 본 발명자들은 CRTAM과 상동성이 있으며 본원에서 PRO355 폴리펩티드로 지칭되는 신규 폴리펩티드의 확인 및 특징규명에 관해 설명한다.
11.PRO357
단백질-단백질 상호작용은 수용체와 항원 복합체 및 신호 전달 메카니즘을 포함한다. 단백질-단백질 상호작용에 대한 기본적인 구조적 및 기능적 메카니즘이 더 많이 밝혀질수록, 단백질-단백질 상호작용의 결과가 특정 상태로 조절되도록 더 쉽게 조작할 수 있다. 단백질-단백질 상호작용의 기본적 메커니즘은 과학계 및 의학계에 관심의 대상이 되고 있다.
류신 풍부 반복부를 포함하는 모든 단백질은 단백질-단백질 상호작용에 관여하는 것으로 생각된다. 류신 풍부 반복부는 기능과 세포내 위치가 다양한 많은 단백질에 존재하는 짧은 서열 모티프이다. 리보뉴클레아제 억제제 단백질의 결정 구조를 통해 밝혀진 바로는 류신 풍부 반복부는 베타-알파 구조 단위와 일치한다. 이들 단위는 한쪽 면이 용매에 노출된 평행한 베타 시트를 형성하도록 배열되어 있어서, 이 단백질은 독특한 비(非)구형을 취하게 된다. 위와 같은 두 가지 특징은 류신 풍부 반복부를 포함하는 단백질의 단백질-결합 기능을 담당하는 것으로 밝혀졌다. 이와 관련해서는 문헌 (Kobe and Deisenhofer,Trends Biochem. Sci., 19(10):415-421 (Oct. 1994))을 참조할 수 있다.
개체 발생시 콜라겐 섬유를 배향하고 정돈하는 조직 형성체로서 기능하며,창상 치유, 조직 수복 및 종양 지질 (支質) 형성 등의 병리적 과정에 관여하는 류신 풍부 프로테오글리칸에 관한 연구 결과가 보고되었다 (Iozzo, R. V.,Crit. Rev. Biochem. Mol. Biol., 32(2):141-174 (1997)). 류신 풍부 단백질이 창상 치유 및 조직 수복에 연루되어 있다는 또다른 연구 결과도 있다. 출혈 장애 버나드-소울리어 증후군과 관련된 복합체 중의 류신 풍부 모티프가 돌연변이되었음을 보고한 문헌 (De La Salle, C., et al.,Vouv. Rev. Fr. Hematol. (Germany), 37(4):215-222 (1995), 혈소판이 류신 풍부 반복부를 갖는다고 보고한 문헌 (Chlemetson, K.J., Thromb. Haemost. (Germany), 74(1):111-116 (July 1995)), 및 형질전환 성장 인자 β에 결합하는 데코린이 암 치료, 창상 치유 및 흉터 형성에 관여하는 것으로 보고한 라졸라 암연구재단 (La Jolla Cancer Research Foundation)의 (Ruoslahti, E. I. et al. WO9110727-A)이 그것이다. 인슐린 유사 성장 인자 (IGF)가 결합 조직, 피부 및 뼈 등의 조직 재성장과 관련된 창상 치유 및 관련 치료법에 유용하고 사람 및 동물에게서 신체 성장을 촉진하는데 유용하며, 기타 성장 관련 과정을 촉진시키는데 유용하다는 측면에서 IGF는 이런 단백질군과 기능상 관련되어 있다. IGF의 산 불안정성 서브유닛 (ALS)도 이것이 IGF의 반감기를 증가시키고 생체내 IGF 복합체의 일부라는 점 때문에 흥미가 있다.
류신 풍부 반복부를 갖는 것으로 보고된 또다른 단백질은 SLIT 단백질로서, 이 단백질은 알쯔하이머병 등의 신경 퇴행성 질환 및 파킨슨병 등의 신경 손상 및 암 진단에 유용한 것으로 보고된 바 있다 (Artavanistsakonas, S. and Rothberg, J. M., WO9210518-A1, 예일대학). 또한 마우스 뇌의 신경교 세포에서 특이적으로발현되는 막 당단백질인 LIG-1도 류신 풍부 반복부 및 면역글로불린 유사 도메인을 갖고 있어 흥미롭다 (Suzuki et al.,J. Biol. Chem.(US) 271 (32): 22522 (1996)). 류신 풍부 반복부를 갖는 단백질의 생물학적 기능에 관한 다른 연구 보고서로는 (Tayar, N., et al.,Mol. Cell Endocrinol., (Ireland), 125(1-2):65-70 (Dec. 1996)) (고나도트로핀 수용체 관련), (Miura, Y., et al.,Nippon Rinsho(Japan), 54(7):1784-1789 (July 1996)) (아폽토시스 관련), (Harris, P. C., et al.,J. Am. Soc. Nephrol., 6(4):1125-1133 (Oct. 1995)) (신장병 관련) 등이 있다.
단백질-단백질 상호작용을 더 잘 이해하기 위해 류신 풍부 반복부를 포함하는 신규 단백질을 찾아내려는 학계 및 산업계의 노력이 진행되고 있다. 인슐린 유사 성장 인자의 산 불안정성 서브유닛과 같은 류신 풍부 반복 서열을 갖는 공지된 단백질과 상동성이 있고 류신 풍부 반복 서열을 갖는 단백질에 특히 관심이 있다. 이런 노력 가운데 상당수는 포유류 재조합 DNA 라이브러리를 스크리닝해서 신규 분비 및 막-결합 단백질의 코딩 서열을 찾아내는데 집중되어 있다. 스크리닝 방법 및 기술의 예는 문헌 (예를 들어, Klein et al.,Proc. Natl. Acad. Sci., 93:7108-7113 (1996); 미국 특허 제5,536,637호 참조)에 기재되어 있다.
본 발명자들은 인슐린 유사 성장 인자의 산 불안정성 서브유닛과 상동성이 있으며 본원에서 PRO357 폴리펩티드로 지칭되는 신규 폴리펩티드의 확인 및 특징규명에 관해 설명한다.
12.PRO715
포유류에서 세포 수의 조절은 세포 증식과 세포 사멸 사이의 균형에 의해 부분적으로 결정된다고 믿고 있다. 종종 괴사적 세포 사멸이라 불리는 세포 사멸의 한 가지 형태는 통상적으로 어떤 외상이나 세포 손상에서 기인한 병리적 형태의 세포 사멸로 특징지워진다. 반대로, 순차적 또는 제어된 방식으로 진행되는 다른 "생리적" 형태의 세포 사멸도 있다. 상기 순차적 또는 제어된 방식의 세포 사멸은 "아폽토시스"라 불린다 (예를 들어, 문헌 (Barr et al.,Bio/Technology,12:487493 (1994); Steller et al.,Science,267:1445-1449 (1995)) 참조). 아폽토시스에 의한 세포 사멸은 배 발생 및 면역계의 클론 선택을 포함하는 많은 생리적 과정에서 자연적으로 일어난다 (Itoh et al.,Cell,66:233-243 (1991)). 아폽토시스에 의한 세포 사멸의 감소는 암, 낭창 및 허피스 (herpes) 바이러스 감염을 포함하는 다양한 병리적 상태와 연관이 있다 (Thompson,Science 267:1456-1462 (1995)). 아폽토시스에 의한 세포 사멸의 증가는 AIDS, 알쯔하이머병, 파킨슨병, 근위축성 측삭경화증, 다발성 경화증, 색소성 망막염, 소뇌 변성, 재생불량성 빈혈, 심근경색증, 졸중, 재관류 손상 및 독소에 의해 유도된 간 질환을 포함하는 다양한 병리적 상태와 연관이 있다 (Thompson, 상기 문헌 참조).
아폽토시스에 의한 세포 사멸은 통상적으로 세포에서 하나 이상의 특징적인 형태적 또는 생화학적 변화 (세포질의 응축, 세포막 미세융모의 유실, 핵의 분할, 염색체 DNA의 분해 또는 미토콘드리아의 기능 상실)를 수반한다. 다양한 외인성 또는 내인성 신호가 상기 형태적 및 생화학적 세포 변화를 유발 또는 유도한다고 생각된다 (Raff,Nature,356:397400 (1992); Steller, 상기 문헌, 및 Sachs etal.,Blood,82:15 (1993)). 예를 들면, 상기의 변화는 미성숙 흉선세포에 대한 당질코르티코이드 호르몬과 같은 호르몬 자극 뿐만 아니라 특정 성장 인자의 회수에 의해 유발될 수 있다 (Watanabe-Fukunaga et al.,Nature,356:314-317 (1992)). 또한,myc, rel및E1A와 같은 일부 밝혀진 종양 유전자 및p53과 같은 종양 억제 유전자가 아폽토시스를 유도하는 역할을 하는 것으로 보고되었다. 특정 화학요법용 약물 및 일부 형태의 방사능도 유사하게 아폽토시스 유도 활성을 갖는 것으로 관찰되었다 (Thompson, 상기 문헌).
종양 괴사 인자-α("TNF-α"), 종양 괴사 인자-β("TNF-β" 또는 "림포톡신-α"), 림포톡신-β("LT-β"), CD30 리간드, CD27 리간드, CD40 리간드, OX-40 리간드, 4-1BB 리간드, Apo-1 리간드 (Fas 리간드 또는 CD95 리간드라고도 불림) 및 Apo-2 리간드 (TRAIL이라고도 불림)와 같은 다양한 분자들이 사이토킨의 종양 괴사 인자 ("TNF") 족의 구성원으로 밝혀졌다 (예를 들면, 문헌 (Gruss and Dower,Blood 85:3378-3404 (1995); Pitti et al.,J. Biol. Chem.,271:12687-12690 (1996); Wiley et al.,Immunity,3:673-682 (1995); Browning et al.,Cell 22:847-856 (1993); Armitage et al.,Nature 357:80-82 (1992)) 참조). 상기 분자 중에서, TNF-α, TNF-β, CD30 리간드, 4-1BB 리간드, Apo-1 리간드 및 Apo-2 리간드 (TRAIL)가 아폽토시스에 의한 세포 사멸과 관련이 있는 것으로 보고되었다. TNF-α 및 TNF-β는 모두 감수성 종양 세포에서 아폽토시스에 의한 사멸을 유도한다고 보고되었다 (Schmid et al.,Proc. Natl. Acad. Sci.,83:1881 (1986); Dealtry et al.,Eur. J. Immunol.,17:689 (1987)). 젱 (Zheng) 등은 TNF-α가CD8-양성 T 세포의 후자극 아폽토시스와 관련되어 있다고 보고하였다 (Zheng et al.,Nature,377:348-351(1995)). 다른 연구자들은 CD30 리간드가 흉선에서 자가반응성 T 세포의 제거에 관련되어 있다고 보고하였다 (Amakawa et al., Cold Spring Harbor Laboratory Symposium on Programmed Cell Death, Abstr. No. 10, (1995)).
마우스의 Fas/Apo-1 수용체 또는 리간드 유전자 (각각lpr및gld라 불림)의 돌연변이는 일부의 자가면역 질환과 관련되어 있고, 이것은 Apo-1 리간드가 말초에서 자가반응성 림프구의 클론 제거를 조절할 수 있음을 나타낸다 (Krammer et al.,Curr. Op. Immunol.,6:279-289 (1994); Nagata et al.,Science 267:1449-1456 (1995)). Apo-1 리간드는 또한 CD4-양성 T 림프구 및 B 림프구에서 후자극 아폽토시스를 유도하는 것으로 보고되었고, 림프구의 기능이 더이상 필요하지 않게 된 활성 림프구의 제거에 관련될 수 있다 (Krammer et al., 상기 문헌; Nagata et al., 상기 문헌). Apo-1 수용체에 특이적으로 결합하는 마우스의 모노클로날 항체에 대한 아고니스트가 TNF-α와 유사하거나 이에 필적할 만큼 세포를 죽이는 활성이 있음이 보고되었다 (Yonehara et al.,J. Exp. Med.,169:1747-1756 (1989)).
상기 TNF 족 사이토킨이 매개하는 다양한 세포 반응의 유도는 이것이 특이적 세포 수용체에 결합함으로써 시작된다고 여겨진다. 약 55-kDa (TNFR1) 및 75-kDa (TNFR2)의 두 가지 상이한 TNF 수용체가 밝혀졌고 (Hohman et al.,J. Biol. Chem.,264:14927-14934 (1989); Brockhaus et al.,Proc. Natl. Acad. Sci.,87:3127-3131 (1990); 1991년 3월 20일에 출원된 EP 417,563), 상기 두 가지 유형의 수용체에 상응하는 인간 및 마우스의 cDNA가 단리 및 특성화되었다 (Loetscher et al.,Cell,61:351 (1990); Schall et al.,Cell,61:361 (1990); Smith et al.,Science,248:1019-1023 (1990); Lewis et al.,Proc. Natl. Acad. Sci.,88:2830-2834 (1991); Goodwin et al.,Mol. Cell. Biol.,11:3020-3026 (1991)). 림포톡신-α를 제외한 현재까지 밝혀진 TNF 족 리간드는 C-말단이 세포외에 있는 유형 Ⅱ의 막횡단 단백질이다. 반대로, 현재까지 밝혀진 TNF 수용체 (TNFR) 족의 대개의 수용체는 유형 Ⅰ의 막횡단 단백질이다. 그러나 TNF 리간드 및 수용체 족 둘다에서, 족 구성원들 사이의 상동성은 주로 세포외 도메인 (extracellular domain: "ECD")에서 발견됨이 밝혀졌다. TNF-α, Apo-1 리간드 및 CD40 리간드를 포함하는 몇 가지 TNF 족 사이토킨은 세포 표면에서 단백질 가수 분해에 의해 절단되는데, 이 결과 생성되는 단백질은 가용성 사이토킨으로 기능하는 동종 삼량체 분자를 형성한다. 또한, TNF 수용체 족 단백질은 단백질 가수 분해에 의해 절단되어 동족 사이토킨의 억제제로 기능할 수 있는 가용성 수용체 ECD를 방출한다.
최근, TNFR 족의 다른 구성원이 발견되었다. 상기 새로이 발견된 TNFR 족 구성원들로는 CAR1, HVEM 및 오스테오프로테게린 (osteoprotegerin: OPG)이 있다 (Brojatsch et al.,Cell,87:845-855 (1996); Montgomery et al.,Cell 87:427-436 (1996); Marsters et al.,J. Biol. Chem.,272:14029-14032 (1997); Simonet et al.,Cell,89:309-319 (1997)). 시모넷 (Simonet) 등의 상기 문헌에서는 기타의 알려진 TNFR-유사 분자와는 달리 OPG에는 소수성 막횡단 스패닝 서열이 없다고 보고하였다.
TNF 족 사이토킨 및 그 수용체에 관해 살펴보고 싶으면 그러스 (Gruss) 및 다우어 (Dower)의 상기 문헌을 참조할 수 있다.
본 발명자들은 종양 괴사 인자 폴리펩티드 족 구성원에 상동성이 있으며 본원에서 PRO715 폴리펩티드로 지칭되는 신규 폴리펩티드의 확인 및 특징규명에 관해 설명한다.
13.PRO353
보체 단백질은 거대한 혈청 단백질군이며, 이들 중 일부는 계단식 효소촉매과정 (enzymatic cascade)에 관여하여 염증 관련 이펙터 분자를 생성한다. 보체 단백질은 염증과 관련된 세포의 운동 및 기능 조절에서 특히 중요하다. 염증 및 이와 관련된 생체내 메커니즘의 생리적 중요성 때문에, 염증과 관련된 신규한 천연 단백질을 찾아내려는 노력이 현재 진행되고 있다. 본 발명자들은 보체 단백질과 상동성이 있으며 본원에서 PRO353 폴리펩티드로 지칭되는 신규 폴리펩티드의 확인 및 특징규명에 관해 설명한다.
14.PRO361
뮤신은 발암 관련 당단백질 족이다. 뮤신 및 뮤신 유사 단백질은 정상 세포 및 형질전환 세포 둘다에서 분비된다. 뮤신의 질적 및 양적 변화는 다양한 형태의 암과 연루되어 있다. 암의 의학적 중요성 때문에, 암의 진단 또는 치료에 유용할 수 있는 신규한 천연 단백질을 찾아내려는 노력이 현재 진행되고 있다.
키티나제 단백질은 식물에서 발병 반응과 관련된 족이다. 키티나제 단백질은 식물 및 미생물에 의해 생성되고, 식물이 손상되는 것을 방어하는 역할을 할 수있다. 식물 방어 메카니즘의 중요성 때문에, 식물에서 발병-관련 반응 조절에 유용할 수 있는 신규한 천연 단백질을 찾아내려는 노력이 현재 진행되고 있다. 본 발명자들은 뮤신 및 키티나제에 상동성이 있으며 본원에서 PRO361 폴리펩티드로 지칭되는 신규 폴리펩티드의 확인 및 특징규명에 관해 설명한다.
15.PRO365
인간 2-19 단백질과 같은 폴리펩티드는 사이토킨으로 기능할 수 있다. 사이토킨은 면역 세포의 분화, 증식 또는 기능을 촉진시키거나 억제하는 기능을 하는 저분자량의 단백질이다. 종종 사이토킨은 세포내 전달자 역할을 하고, 다중적 생리 효과를 나타낸다. 생체내 면역 메카니즘의 중요성 때문에, 면역계에 영향을 주는데 관련되는 신규한 천연 단백질을 찾아내려는 노력이 현재 진행되고 있다. 본 발명자들은 인간 2-19 단백질에 상동성이 있으며 본원에서 PRO365 폴리펩티드로 지칭되는 신규 폴리펩티드의 확인 및 특징규명에 관해 설명한다.
발명의 요약
1.PRO241
본 발명자들은 본원에서 "PRO241"이라고 지칭되며 비글리칸 단백질에 상동성이 있는 신규 폴리펩티드를 코딩하는 cDNA 클론을 찾아냈다.
한 실시양태에서 본 발명은 PRO241 폴리펩티드를 코딩하는 DNA를 포함하는 단리된 핵산 분자를 제공한다. 한 측면에서, 이 단리된 핵산 분자는 도 2 (서열 2)의 아미노산 잔기 1 내지 379를 갖는 PRO241 폴리펩티드를 코딩하는 DNA를 포함하는 것이거나, 또는 이 코딩 핵산 서열에 상보적이어서 적어도 중간정도의 엄격조건 및 경우에 따라 고엄격 조건에서 상기 코딩 핵산 서열에 안정하게 결합된 채로 남아있는 것이다.
다른 실시양태에서 본 발명은 단리된 PRO241 폴리펩티드를 제공한다. 특히 본 발명은 단리된 천연 서열 PRO241 폴리펩티드를 제공하며, 이 경우의 한 실시양태에서 이 폴리펩티드는 도 2 (서열 2)의 잔기 1 내지 379를 포함하는 아미노산 서열을 포함한다. 본 발명의 추가의 실시양태는 N-말단 신호 펩티드가 없는 PRO241 폴리펩티드에 관한 것이며, 이 경우의 PRO241 폴리펩티드는 전장 PRO241 아미노산 서열 (서열 2) 중 아미노산 약 16 내지 379를 포함한다.
2.PRO243
본 발명자들은 본원에서 "PRO243"이라고 지칭되며 신규 폴리펩티드를 코딩하는 cDNA 클론 (DNA35917-1207)을 찾아냈다.
한 실시양태에서, 본 발명은 (a) 도 4 (서열 7)의 아미노산 1 또는 약 24 내지 954의 서열을 포함하는 PRO243 폴리펩티드를 코딩하는 DNA 분자 또는 (b) DNA 분자 (a)의 상보체와의 서열 동일성이 약 80 % 이상인 단리된 핵산 분자를 제공한다. 서열 동일성은 바람직하게는 약 85 % 이상, 더욱 바람직하게는 약 90 % 이상, 가장 바람직하게는 약 95 % 이상이다. 한 측면에서, 단리된 핵산은 도 4 (서열 7)의 아미노산 잔기 1 또는 약 24 내지 954를 갖는 폴리펩티드와의 서열 동일성이 약 80 % 이상, 바람직하게는 약 85 % 이상, 더욱 바람직하게는 약 90 % 이상, 가장 바람직하게는 약 95 % 이상이다. 바람직하게는, 가장 높은 서열 동일성은 도 4 (서열 7)의 4 개의 보존성 시스테인 클러스터 (아미노산 51 내지 125, 아미노산 705내지 761, 아미노산 784 내지 849 및 아미노산 897 내지 931)에서 나타난다. 추가의 실시양태에서, 이 단리된 핵산 분자는 도 4 (서열 7)의 아미노산 잔기 1 또는 약 24 내지 954를 갖는 PRO243 폴리펩티드를 코딩하는 DNA를 포함하는 것이거나, 또는 이 코딩 핵산 서열에 상보적이어서 적어도 중간정도의 엄격 조건 및 경우에 따라 고엄격 조건에서 상기 코딩 핵산 서열에 안정하게 결합된 채로 남아있는 것이다. 또다른 측면에서, 본 발명은 ATCC에 기탁번호 ATCC 209508호로 기탁된 클론 DNA35917-1207의 전장 단백질의 핵산, 달리 표현하면 기탁번호 ATCC 209508호로 기탁된 클론 DNA35917-1207의 코딩 서열을 제공한다.
다른 실시양태에서 본 발명은 단리된 PRO243 폴리펩티드를 제공한다. 특히 본 발명은 단리된 천연 서열 PRO243 폴리펩티드를 제공하며, 이 경우의 한 실시양태에서 이 폴리펩티드는 도 4 (서열 7)의 잔기 1 또는 약 24 내지 954를 포함하는 아미노산 서열을 포함한다. 구체적으로는, 천연 신호 서열 (도 4 (서열 7)의 아미노산 1 내지 23)을 포함하거나 포함하지 않고, 개시 메티오닌을 포함하거나 포함하지 않는 천연 PRO243 폴리펩티드가 포함된다. 달리 표현하면, 본 발명은 기탁번호 ATCC 209508호로 기탁된 핵산에 의해 코딩되는 PRO243 폴리펩티드를 제공한다.
3.PRO299
본 발명자들은 본원에서 "PRO299"라고 지칭되며 신규 폴리펩티드를 코딩하는 cDNA 클론을 찾아냈다.
한 실시양태에서 본 발명은 PRO299 폴리펩티드를 코딩하는 DNA를 포함하는 단리된 핵산 분자를 제공한다. 한 측면에서, 이 단리된 핵산 분자는 도 6 (서열15)의 아미노산 잔기 1 내지 737을 갖는 PRO299 폴리펩티드를 코딩하는 DNA를 포함하는 것이거나, 또는 이 코딩 핵산 서열에 상보적이어서 적어도 중간정도의 엄격 조건 및 경우에 따라 고엄격 조건에서 상기 코딩 핵산 서열에 안정하게 결합된 채로 남아있는 것이다.
다른 실시양태에서 본 발명은 단리된 PRO299 폴리펩티드를 제공한다. 특히 본 발명은 단리된 천연 서열 PRO299 폴리펩티드를 제공하며, 이 경우의 한 실시양태에서 이 폴리펩티드는 도 6 (서열 15)의 잔기 1 내지 737을 포함하는 아미노산 서열을 포함한다. 본 발명의 추가의 실시양태는 PRO299 폴리펩티드의 단리된 세포외 도메인에 관한 것이다.
4.PRO323
본 발명자들은 본원에서 "PRO323"이라고 지칭되며 미립체의 디펩티다제 단백질에 상동성이 있는 신규 폴리펩티드를 코딩하는 cDNA 클론을 찾아냈다.
한 실시양태에서 본 발명은 PRO323 폴리펩티드를 코딩하는 DNA를 포함하는 단리된 핵산 분자를 제공한다. 한 측면에서, 이 단리된 핵산 분자는 도 10 (서열 24)의 아미노산 잔기 1 내지 433을 갖는 PRO323 폴리펩티드를 코딩하는 DNA를 포함하는 것이거나, 또는 이 코딩 핵산 서열에 상보적이어서 적어도 중간정도의 엄격 조건 및 경우에 따라 고엄격 조건에서 상기 코딩 핵산 서열에 안정하게 결합된 채로 남아있는 것이다.
다른 실시양태에서 본 발명은 단리된 PRO323 폴리펩티드를 제공한다. 특히 본 발명은 단리된 천연 서열 PRO323 폴리펩티드를 제공하며, 이 경우의 한 실시양태에서 이 폴리펩티드는 도 10 (서열 24)의 잔기 1 내지 433을 포함하는 아미노산 서열을 포함한다.
5.PRO327
본 발명자들은 본원에서 "PRO327"이라고 지칭되며 프로락틴 수용체에 상동성이 있는 신규 폴리펩티드를 코딩하는 cDNA 클론을 찾아냈다.
한 실시양태에서 본 발명은 PRO327 폴리펩티드를 코딩하는 DNA를 포함하는 단리된 핵산 분자를 제공한다. 한 측면에서, 이 단리된 핵산 분자는 도 14 (서열 32)의 아미노산 잔기 1 내지 422를 갖는 PRO327 폴리펩티드를 코딩하는 DNA를 포함하는 것이거나, 또는 이 코딩 핵산 서열에 상보적이어서 적어도 중간정도의 엄격 조건 및 경우에 따라 고엄격 조건에서 상기 코딩 핵산 서열에 안정하게 결합된 채로 남아있는 것이다.
다른 실시양태에서 본 발명은 단리된 PRO327 폴리펩티드를 제공한다. 특히 본 발명은 단리된 천연 서열 PRO327 폴리펩티드를 제공하며, 이 경우의 한 실시양태에서 이 폴리펩티드는 도 14 (서열 32)의 잔기 1 내지 422를 포함하는 아미노산 서열을 포함한다.
6.PRO233
본 발명자들은 본원에서 "PRO233"이라고 지칭되며 신규 폴리펩티드를 코딩하는 cDNA 클론을 찾아냈다.
한 실시양태에서 본 발명은 PRO233 폴리펩티드를 코딩하는 DNA를 포함하는 단리된 핵산 분자를 제공한다. 한 측면에서, 이 단리된 핵산 분자는 도 16 (서열37)의 아미노산 잔기 1 내지 300을 갖는 PRO233 폴리펩티드를 코딩하는 DNA를 포함하는 것이거나, 또는 이 코딩 핵산 서열에 상보적이어서 적어도 중간정도의 엄격 조건 및 경우에 따라 고엄격 조건에서 상기 코딩 핵산 서열에 안정하게 결합된 채로 남아있는 것이다.
다른 실시양태에서 본 발명은 단리된 PRO233 폴리펩티드를 제공한다. 특히 본 발명은 단리된 천연 서열 PRO233 폴리펩티드를 제공하며, 이 경우의 한 실시양태에서 이 폴리펩티드는 도 16 (서열 37)의 잔기 1 내지 300을 포함하는 아미노산 서열을 포함한다.
7.PRO344
본 발명자들은 본원에서 "PRO344"라고 지칭되며 신규 폴리펩티드를 코딩하는 cDNA 클론을 찾아냈다.
한 실시양태에서 본 발명은 PRO344 폴리펩티드를 코딩하는 DNA를 포함하는 단리된 핵산 분자를 제공한다. 한 측면에서, 이 단리된 핵산 분자는 도 18 (서열 42)의 아미노산 잔기 1 내지 243을 갖는 PRO344 폴리펩티드를 코딩하는 DNA를 포함하는 것이거나, 또는 이 코딩 핵산 서열에 상보적이어서 적어도 중간정도의 엄격 조건 및 경우에 따라 고엄격 조건에서 상기 코딩 핵산 서열에 안정하게 결합된 채로 남아있는 것이다.
다른 실시양태에서 본 발명은 단리된 PRO344 폴리펩티드를 제공한다. 특히 본 발명은 단리된 천연 서열 PRO344 폴리펩티드를 제공하며, 이 경우의 한 실시양태에서 이 폴리펩티드는 도 18 (서열 42)의 잔기 1 내지 243을 포함하는 아미노산서열을 포함한다.
8.PRO347
본 발명자들은 본원에서 "PRO347"이라고 지칭되며 시스테인 풍부 분비 단백질-3에 상동성이 있는 신규 폴리펩티드를 코딩하는 cDNA 클론을 찾아냈다.
한 실시양태에서 본 발명은 PRO347 폴리펩티드를 코딩하는 DNA를 포함하는 단리된 핵산 분자를 제공한다. 한 측면에서, 이 단리된 핵산 분자는 도 20 (서열 50)의 아미노산 잔기 1 내지 455를 갖는 PRO347 폴리펩티드를 코딩하는 DNA를 포함하는 것이거나, 또는 이 코딩 핵산 서열에 상보적이어서 적어도 중간정도의 엄격 조건 및 경우에 따라 고엄격 조건에서 상기 코딩 핵산 서열에 안정하게 결합된 채로 남아있는 것이다.
다른 실시양태에서 본 발명은 단리된 PRO347 폴리펩티드를 제공한다. 특히 본 발명은 단리된 천연 서열 PRO347 폴리펩티드를 제공하며, 이 경우의 한 실시양태에서 이 폴리펩티드는 도 20 (서열 50)의 잔기 1 내지 455를 포함하는 아미노산 서열을 포함한다.
9.PRO354
본 발명자들은 본원에서 "PRO354"라고 지칭되며 인터-알파-트립신 억제제 (ITI)의 중쇄에 상동성이 있는 신규 폴리펩티드를 코딩하는 cDNA 클론을 찾아냈다.
한 실시양태에서 본 발명은 PRO354 폴리펩티드를 코딩하는 DNA를 포함하는 단리된 핵산 분자를 제공한다. 한 측면에서, 이 단리된 핵산 분자는 도 22 (서열 55)의 아미노산 잔기 1 내지 694를 갖는 PRO354 폴리펩티드를 코딩하는 DNA를 포함하는 것이거나, 또는 이 코딩 핵산 서열에 상보적이어서 적어도 중간정도의 엄격 조건 및 경우에 따라 고엄격 조건에서 상기 코딩 핵산 서열에 안정하게 결합된 채로 남아있는 것이다.
다른 실시양태에서 본 발명은 단리된 PRO354 폴리펩티드를 제공한다. 특히 본 발명은 단리된 천연 서열 PRO354 폴리펩티드를 제공하며, 이 경우의 한 실시양태에서 이 폴리펩티드는 도 22 (서열 55)의 잔기 1 내지 694를 포함하는 아미노산 서열을 포함한다.
10.PRO355
본 발명자들은 본원에서 "PRO355"라고 지칭되며 신규 폴리펩티드를 코딩하는 cDNA 클론을 찾아냈다.
한 실시양태에서 본 발명은 PRO355 폴리펩티드를 코딩하는 DNA를 포함하는 단리된 핵산 분자를 제공한다. 한 측면에서, 이 단리된 핵산 분자는 도 24 (서열 61)의 아미노산 잔기 1 내지 440을 갖는 PRO355 폴리펩티드를 코딩하는 DNA를 포함하는 것이거나, 또는 이 코딩 핵산 서열에 상보적이어서 적어도 중간정도의 엄격 조건 및 경우에 따라 고엄격 조건에서 상기 코딩 핵산 서열에 안정하게 결합된 채로 남아있는 것이다.
다른 실시양태에서 본 발명은 단리된 PRO355 폴리펩티드를 제공한다. 특히 본 발명은 단리된 천연 서열 PRO355 폴리펩티드를 제공하며, 이 경우의 한 실시양태에서 이 폴리펩티드는 도 24 (서열 61)의 잔기 1 내지 440을 포함하는 아미노산 서열을 포함한다. 본 발명의 추가의 실시양태는 PRO355 폴리펩티드의 단리된 세포외 도메인에 관한 것이다.
11.PRO357
본 발명자들은 본원에서 "PRO357"이라고 지칭되며 인슐린 유사 성장 인자 (IGF) 산 불안정성 서브유닛 (ALS)에 상동성이 있는 신규 폴리펩티드를 코딩하는 cDNA 클론을 찾아냈다.
한 실시양태에서 본 발명은 PRO357 폴리펩티드를 코딩하는 DNA를 포함하는 단리된 핵산 분자를 제공한다. 한 측면에서, 이 단리된 핵산 분자는 도 26 (서열 69)의 아미노산 잔기 1 내지 598을 갖는 PRO357 폴리펩티드를 코딩하는 DNA를 포함하는 것이거나, 또는 이 코딩 핵산 서열에 상보적이어서 적어도 중간정도의 엄격 조건 및 경우에 따라 고엄격 조건에서 상기 코딩 핵산 서열에 안정하게 결합된 채로 남아있는 것이다.
다른 실시양태에서 본 발명은 단리된 PRO357 폴리펩티드를 제공한다. 특히 본 발명은 단리된 천연 서열 PRO357 폴리펩티드를 제공하며, 이 경우의 한 실시양태에서 이 폴리펩티드는 도 26 (서열 69)의 잔기 1 내지 598을 포함하는 아미노산 서열을 포함한다. 본 발명의 추가의 실시양태는 PRO357 폴리펩티드의 단리된 세포외 도메인에 관한 것이다.
12.PRO715
본 발명자들은 본원에서 "PRO715"라고 지칭되며 종양 괴사 인자 족 폴리펩티드에 상동성이 있는 신규 폴리펩티드를 코딩하는 cDNA 클론을 찾아냈다.
한 실시양태에서 본 발명은 PRO715 폴리펩티드를 코딩하는 DNA를 포함하는단리된 핵산 분자를 제공한다. 한 측면에서, 이 단리된 핵산 분자는 도 28 (서열 76)의 아미노산 잔기 1 내지 250을 갖는 PRO715 폴리펩티드를 코딩하는 DNA를 포함하는 것이거나, 또는 이 코딩 핵산 서열에 상보적이어서 적어도 중간정도의 엄격 조건 및 경우에 따라 고엄격 조건에서 상기 코딩 핵산 서열에 안정하게 결합된 채로 남아있는 것이다.
다른 실시양태에서 본 발명은 단리된 PRO715 폴리펩티드를 제공한다. 특히 본 발명은 단리된 천연 서열 PRO715 폴리펩티드를 제공하며, 이 경우의 한 실시양태에서 이 폴리펩티드는 도 28 (서열 76)의 잔기 1 내지 250을 포함하는 아미노산 서열을 포함한다. 본 발명의 추가의 실시양태는 PRO715 폴리펩티드의 단리된 세포외 도메인에 관한 것이다.
13.PRO353
본 발명자들은 본원에서 "PRO353"이라고 지칭되며 신규 폴리펩티드를 코딩하는 cDNA 클론을 찾아냈다.
한 실시양태에서 본 발명은 PRO353 폴리펩티드를 코딩하는 DNA를 포함하는 단리된 핵산 분자를 제공한다. 한 측면에서, 이 단리된 핵산 분자는 도 30 (서열 78)의 아미노산 잔기 1 내지 281을 갖는 PRO353 폴리펩티드를 코딩하는 DNA를 포함하는 것이거나, 또는 이 코딩 핵산 서열에 상보적이어서 적어도 중간정도의 엄격 조건 및 경우에 따라 고엄격 조건에서 상기 코딩 핵산 서열에 안정하게 결합된 채로 남아있는 것이다.
다른 실시양태에서 본 발명은 단리된 PRO353 폴리펩티드를 제공한다. 특히본 발명은 단리된 천연 서열 PRO353 폴리펩티드를 제공하며, 이 경우의 한 실시양태에서 이 폴리펩티드는 도 30 (서열 78)의 잔기 1 내지 281을 포함하는 아미노산 서열을 포함한다.
14.PRO361
본 발명자들은 본원에서 "PRO361"이라고 지칭되며 신규 폴리펩티드를 코딩하는 cDNA 클론을 찾아냈다.
한 실시양태에서 본 발명은 PRO361 폴리펩티드를 코딩하는 DNA를 포함하는 단리된 핵산 분자를 제공한다. 한 측면에서, 이 단리된 핵산 분자는 도 32 (서열 83)의 아미노산 잔기 1 내지 431을 갖는 PRO361 폴리펩티드를 코딩하는 DNA를 포함하는 것이거나, 또는 이 코딩 핵산 서열에 상보적이어서 적어도 중간정도의 엄격 조건 및 경우에 따라 고엄격 조건에서 상기 코딩 핵산 서열에 안정하게 결합된 채로 남아있는 것이다. 단리된 핵산 서열은 ATCC 209621호로 1998년 2월 5일 기탁된 벡터 중 PRO361을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 cDNA 삽입체를 포함할 수 있다.
다른 실시양태에서 본 발명은 단리된 PRO361 폴리펩티드를 제공한다. 특히 본 발명은 단리된 천연 서열 PRO361 폴리펩티드를 제공하며, 이 경우의 한 실시양태에서 이 폴리펩티드는 도 32 (서열 83)의 잔기 1 내지 431을 포함하는 아미노산 서열을 포함한다. 본 발명의 추가의 실시양태는 도 32 (서열 83)의 아미노산 서열 중 아미노산 1 내지 379를 포함하는 PRO361 폴리펩티드의 단리된 세포외 도메인에 관한 것이다. 경우에 따라, PRO361 폴리펩티드는 ATCC 209621호로 1998년 2월 5일기탁된 벡터 중의 cDNA 삽입체에 의해 코딩되는 폴리펩티드를 발현시켜 수득되거나 수득될 수 있다.
15.PRO365
본 발명자들은 본원에서 "PRO365"라고 지칭되며 신규 폴리펩티드를 코딩하는 cDNA 클론을 찾아냈다.
한 실시양태에서 본 발명은 PRO365 폴리펩티드를 코딩하는 DNA를 포함하는 단리된 핵산 분자를 제공한다. 한 측면에서, 이 단리된 핵산 분자는 도 34 (서열 91)의 아미노산 잔기 1 내지 235를 갖는 PRO365 폴리펩티드를 코딩하는 DNA를 포함하는 것이거나, 또는 이 코딩 핵산 서열에 상보적이어서 적어도 중간정도의 엄격 조건 및 경우에 따라 고엄격 조건에서 상기 코딩 핵산 서열에 안정하게 결합된 채로 남아있는 것이다. 또다른 측면에서, 이 단리된 핵산 분자는 도 34 (서열 91)의 아미노산 잔기 21 내지 235를 갖는 PRO365 폴리펩티드를 코딩하는 DNA를 포함하는 것이거나, 또는 이 코딩 핵산 서열에 상보적이어서 적어도 중간정도의 엄격 조건 및 경우에 따라 고엄격 조건에서 상기 코딩 핵산 서열에 안정하게 결합된 채로 남아있는 것이다.
다른 실시양태에서 본 발명은 단리된 PRO365 폴리펩티드를 제공한다. 특히 본 발명은 단리된 천연 서열 PRO365 폴리펩티드를 제공하며, 이 경우의 한 실시양태에서 이 폴리펩티드는 도 34 (서열 91)의 잔기 1 내지 235를 포함하는 아미노산 서열을 포함한다. 본 발명의 추가의 실시양태는 도 34 (서열 91)의 잔기 21 내지 235를 포함하는 아미노산 서열에 관한 것이다.
16.부가의 실시양태
본 발명의 다른 실시양태에서, 본 발명은 본원의 상기 폴리펩티드 중 임의의 것을 코딩하는 DNA를 포함하는 벡터를 제공한다. 또한 이러한 임의의 벡터를 포함하는 숙주 세포를 제공한다. 예로서, 숙주 세포는 CHO 세포, 대장균 (E. coli) 또는 효모일 수 있다. 본원에 기재한 임의의 폴리펩티드를 제조하는 방법도 제공되는데, 이 방법은 원하는 폴리펩티드의 발현에 적합한 조건 하에서 숙주 세포를 배양하고 이 세포 배양물로부터 원하는 폴리펩티드를 회수하는 것을 포함한다.
다른 실시양태에서, 본 발명은 이종 폴리펩티드 또는 아미노산 서열에 융합된 본원에 기재된 임의의 폴리펩티드를 포함하는 키메라 분자를 제공한다. 이러한 키메라 분자의 예로는 에피토프 태그 서열 또는 면역글로불린의 Fc 영역에 융합된 본원에 기재된 임의의 폴리펩티드를 포함한다.
다른 실시양태에서, 본 발명은 또한 상기 또는 하기 폴리펩티드 중 임의의 것에 특이적으로 결합하는 항체를 제공한다. 경우에 따라 이 항체는 모노클로날 항체, 인간화 항체, 항체 단편 또는 단쇄 항체이다.
또 다른 실시양태에서, 본 발명은 게놈 및 cDNA의 뉴클레오티드 서열을 단리하기에 유용한 올리고뉴클레오티드 프로브 또는 안티센스 프로브를 제공하며, 여기서 상기 프로브는 상기 또는 하기 뉴클레오티드 서열 중 임의의 것으로부터 유래될 수 있다.
다른 실시양태에서, 본 발명은 PRO 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 단리된 핵산 분자를 제공한다.
한 측면에서, 상기 단리된 핵산 분자는 (a) 본원에 기재된 바와 같은 전장 아미노산 서열, 본원에 기재된 바와 같은 신호 펩티드가 결여된 아미노산 서열, 본원에 기재된 바와 같은 신호 펩티드를 갖거나 갖지 않는 막횡단 단백질의 세포외 도메인, 또는 본원에 기재된 바와 같은 전장 아미노산 서열의 임의의 다른 특별하게 정의된 단편을 갖는 PRO 폴리펩티드를 코딩하는 DNA 분자, 또는 (b) 상기 (a)의 DNA 분자의 상보체와의 서열 동일성이 약 80 % 이상, 바람직하게는 약 81 % 이상, 더욱 바람직하게는 약 82 % 이상, 더욱 바람직하게는 약 83 % 이상, 더욱 바람직하게는 약 84 % 이상, 더욱 바람직하게는 약 85 % 이상, 더욱 바람직하게는 약 86 % 이상, 더욱 바람직하게는 약 87 % 이상, 더욱 바람직하게는 약 88 % 이상, 더욱 바람직하게는 약 89 % 이상, 더욱 바람직하게는 약 90 % 이상, 더욱 바람직하게는 약 91 % 이상, 더욱 바람직하게는 약 92 % 이상, 더욱 바람직하게는 약 93 % 이상, 더욱 바람직하게는 약 94 % 이상, 더욱 바람직하게는 약 95 % 이상, 더욱 바람직하게는 약 96 % 이상, 더욱 바람직하게는 약 97 % 이상, 더욱 바람직하게는 약 98 % 이상, 더욱 바람직하게는 약 99 % 이상인 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
다른 측면에서, 상기 단리된 핵산 분자는 (a) 본원에 기재된 바와 같은 전장 PRO 폴리펩티드 cDNA의 코딩 서열, 본원에 기재된 바와 같은 신호 펩티드가 결여된 PRO 폴리펩티드의 코딩 서열, 또는 본원에 기재된 바와 같은 신호 펩티드를 갖거나 갖지 않는 막횡단 PRO 폴리펩티드의 세포외 도메인, 또는 본원에 기재된 바와 같은 전장 아미노산 서열의 임의의 다른 특별하게 정의된 단편을 갖는 PRO 폴리펩티드를 코딩하는 DNA 분자, 또는 (b) 상기 (a)의 DNA 분자의 상보체와의 서열 동일성이 약80 % 이상, 바람직하게는 약 81 % 이상, 더욱 바람직하게는 약 82 % 이상, 더욱 바람직하게는 약 83 % 이상, 더욱 바람직하게는 약 84 % 이상, 더욱 바람직하게는 약 85 % 이상, 더욱 바람직하게는 약 86 % 이상, 더욱 바람직하게는 약 87 % 이상, 더욱 바람직하게는 약 88 % 이상, 더욱 바람직하게는 약 89 % 이상, 더욱 바람직하게는 약 90 % 이상, 더욱 바람직하게는 약 91 % 이상, 더욱 바람직하게는 약 92 % 이상, 더욱 바람직하게는 약 93 % 이상, 더욱 바람직하게는 약 94 % 이상, 더욱 바람직하게는 약 95 % 이상, 더욱 바람직하게는 약 96 % 이상, 더욱 바람직하게는 약 97 % 이상, 더욱 바람직하게는 약 98 % 이상, 더욱 바람직하게는 약 99 % 이상인 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
추가의 측면에서, 본 발명은 (a) 본원에 기재된 바와 같은 ATCC에 기탁된 인간 단백질 cDNA 중 임의의 것에 의해 코딩되는 것과 동일한 성숙 폴리펩티드를 코딩하는 DNA 분자 또는 (b) 상기 (a)의 DNA 분자의 상보체와의 서열 동일성이 약 80 % 이상, 바람직하게는 약 81 % 이상, 더욱 바람직하게는 약 82 % 이상, 더욱 바람직하게는 약 83 % 이상, 더욱 바람직하게는 약 84 % 이상, 더욱 바람직하게는 약 85 % 이상, 더욱 바람직하게는 약 86 % 이상, 더욱 바람직하게는 약 87 % 이상, 더욱 바람직하게는 약 88 % 이상, 더욱 바람직하게는 약 89 % 이상, 더욱 바람직하게는 약 90 % 이상, 더욱 바람직하게는 약 91 % 이상, 더욱 바람직하게는 약 92 % 이상, 더욱 바람직하게는 약 93 % 이상, 더욱 바람직하게는 약 94 % 이상, 더욱 바람직하게는 약 95 % 이상, 더욱 바람직하게는 약 96 % 이상, 더욱 바람직하게는 약 97 % 이상, 더욱 바람직하게는 약 98 % 이상, 더욱 바람직하게는 약 99 % 이상인뉴클레오티드 서열을 포함하는 단리된 핵산 분자에 관한 것이다.
다른 측면에서 본 발명은 막횡단 도메인이 결실되거나 막횡단 도메인이 불활성화된 PRO 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열, 또는 이러한 코딩 뉴클레오티드 서열의 상보체를 포함하는 단리된 핵산 분자를 제공하며, 그러한 폴리펩티드의 막횡단 도메인(들)을 본원에 기재한다. 따라서, 본원에 기재된 PRO 폴리펩티드들의 가용성 세포외 도메인이 고려된다.
또다른 실시양태는 예를 들어 안티센스 올리고뉴클레오티드 프로브, 또는 항-PRO 항체에 대한 결합 부위를 포함하는 폴리펩티드를 포함하는 폴리펩티드를 코딩할 수도 있는 PRO 폴리펩티드의 코딩 단편에 대한 혼성화 프로브로 사용될 수 있는 PRO 폴리펩티드 코딩 서열 또는 그 상보체의 단편에 관한 것이다. 이러한 핵산 단편은 일반적으로 길이가 뉴클레오티드 약 20 개 이상, 바람직하게는 약 30 개 이상, 더 바람직하게는 약 40 개 이상, 더 바람직하게는 약 50 개 이상, 더 바람직하게는 약 60 개 이상, 더 바람직하게는 약 70 개 이상, 더 바람직하게는 약 80 개 이상, 더 바람직하게는 약 90 개 이상, 더 바람직하게는 약 100 개 이상, 더 바람직하게는 약 110 개 이상, 더 바람직하게는 약 120 개 이상, 더 바람직하게는 약 130 개 이상, 더 바람직하게는 약 140 개 이상, 더 바람직하게는 약 150 개 이상, 더 바람직하게는 약 160 개 이상, 더 바람직하게는 약 170 개 이상, 더 바람직하게는 약 180 개 이상, 더 바람직하게는 약 190 개 이상, 더 바람직하게는 약 200 개 이상, 더 바람직하게는 약 250 개 이상, 더 바람직하게는 약 300 개 이상, 더 바람직하게는 약 350 개 이상, 더 바람직하게는 약 400 개 이상, 더 바람직하게는 약450 개 이상, 더 바람직하게는 약 500 개 이상, 더 바람직하게는 약 600 개 이상, 더 바람직하게는 약 700 개 이상, 더 바람직하게는 약 800 개 이상, 더 바람직하게는 약 900 개 이상, 더 바람직하게는 약 1000 개 이상이며, 이 때 본 문맥에서 용어 "약"은 언급한 뉴클레오티드 서열 길이±이 길이의 10 %를 의미한다. PRO 폴리펩티드 코딩 뉴클레오티드 서열의 신규 단편은, 잘 알려진 많은 서열 정렬 프로그램 중 임의의 것을 사용하여 이 PRO 폴리펩티드 코딩 뉴클레오티드서열을 다른 공지된 뉴클레오티드 서열과 함께 정렬시키고, 어떤 PRO 폴리펩티드 코딩 뉴클레오티드 서열 단편(들)이 신규한 것인지를 결정함으로써 일상적인 방식으로 결정할 수 있음을 알아야 한다. 본원에서는 이러한 PRO 폴리펩티드 코딩 뉴클레오티드 서열 모두가 고려된다. 또한 이런 뉴클레오티드 분자 단편에 의해 코딩되는 PRO 폴리펩티드 단편, 바람직하게는 항-PRO 항체에 대한 결합 부위를 포함하는 PRO 폴리펩티드 단편들도 고려된다.
다른 실시양태에서, 본 발명은 상기에서 확인된 단리된 핵산 서열들 중 임의의 것에 의해 코딩되는 단리된 PRO 폴리펩티드를 제공한다.
특정 측면에서, 본 발명은 본원에 기재된 바와 같은 전장 아미노산 서열, 또는 본원에 기재된 바와 같은 신호 펩티드가 결여된 아미노산 서열, 본원에 기재된 바와 같은 신호 펩티드를 갖거나 갖지 않는 막횡단 단백질의 세포외 도메인, 또는 본원에 기재된 바와 같은 전장 아미노산 서열의 임의의 다른 특별하게 정의된 단편을 갖는 PRO 폴리펩티드와의 서열 동일성이 약 80 % 이상, 바람직하게는 약 81 % 이상, 더욱 바람직하게는 약 82 % 이상, 더욱 바람직하게는 약 83 % 이상, 더욱 바람직하게는 약 84 % 이상, 더욱 바람직하게는 약 85 % 이상, 더욱 바람직하게는 약 86 % 이상, 더욱 바람직하게는 약 87 % 이상, 더욱 바람직하게는 약 88 % 이상, 더욱 바람직하게는 약 89 % 이상, 더욱 바람직하게는 약 90 % 이상, 더욱 바람직하게는 약 91 % 이상, 더욱 바람직하게는 약 92 % 이상, 더욱 바람직하게는 약 93 % 이상, 더욱 바람직하게는 약 94 % 이상, 더욱 바람직하게는 약 95 % 이상, 더욱 바람직하게는 약 96 % 이상, 더욱 바람직하게는 약 97 % 이상, 더욱 바람직하게는 약 98 % 이상, 더욱 바람직하게는 약 99 % 이상인 아미노산 서열을 포함하는 단리된 PRO 폴리펩티드에 관한 것이다.
추가의 측면에서, 본 발명은 본원에 기재된 바와 같은 ATCC에 기탁된 인간 단백질 cDNA들 중 임의의 것에 의해 코딩되는 아미노산 서열과의 서열 동일성이 약 80 % 이상, 바람직하게는 약 81 % 이상, 더욱 바람직하게는 약 82 % 이상, 더욱 바람직하게는 약 83 % 이상, 더욱 바람직하게는 약 84 % 이상, 더욱 바람직하게는 약 85 % 이상, 더욱 바람직하게는 약 86 % 이상, 더욱 바람직하게는 약 87 % 이상, 더욱 바람직하게는 약 88 % 이상, 더욱 바람직하게는 약 89 % 이상, 더욱 바람직하게는 약 90 % 이상, 더욱 바람직하게는 약 91 % 이상, 더욱 바람직하게는 약 92 % 이상, 더욱 바람직하게는 약 93 % 이상, 더욱 바람직하게는 약 94 % 이상, 더욱 바람직하게는 약 95 % 이상, 더욱 바람직하게는 약 96 % 이상, 더욱 바람직하게는 약 97 % 이상, 더욱 바람직하게는 약 98 % 이상, 더욱 바람직하게는 약 99 % 이상인 아미노산 서열을 포함하는 단리된 PRO 폴리펩티드에 관한 것이다.
추가의 측면에서, 본 발명은 본원에 기재된 바와 같은 전장 아미노산 서열,본원에 기재된 바와 같은 신호 펩티드가 결여된 아미노산 서열, 본원에 기재된 바와 같은 신호 펩티드를 갖거나 갖지 않는 막횡단 단백질의 세포외 도메인, 또는 본원에 기재된 바와 같은 전장 아미노산 서열의 임의의 다른 특별하게 정의된 단편을 갖는 PRO 폴리펩티드의 아미노산 서열과 비교할 때 약 80 % 이상의 양성, 바람직하게는 약 81 % 이상의 양성, 더욱 바람직하게는 약 82 % 이상의 양성, 더욱 바람직하게는 약 83 % 이상의 양성, 더욱 바람직하게는 약 84 % 이상의 양성, 더욱 바람직하게는 약 85 % 이상의 양성, 더욱 바람직하게는 약 86 % 이상의 양성, 더욱 바람직하게는 약 87 % 이상의 양성, 더욱 바람직하게는 약 88 % 이상의 양성, 더욱 바람직하게는 약 89 % 이상의 양성, 더욱 바람직하게는 약 90 % 이상의 양성, 더욱 바람직하게는 약 91 % 이상의 양성, 더욱 바람직하게는 약 92 % 이상의 양성, 더욱 바람직하게는 약 93 % 이상의 양성, 더욱 바람직하게는 약 94 % 이상의 양성, 더욱 바람직하게는 약 95 % 이상의 양성, 더욱 바람직하게는 약 96 % 이상의 양성, 더욱 바람직하게는 약 97 % 이상의 양성, 더욱 바람직하게는 약 98 % 이상의 양성, 더욱 바람직하게는 약 99 % 이상의 양성을 기록하는 아미노산 서열을 포함하는 단리된 PRO 폴리펩티드에 관한 것이다.
구체적인 측면에서, 본 발명은 본원에 기재된 바와 같은 상기 아미노산 서열을 코딩하는 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩되며 N-말단 신호 펩티드 및(또는) 개시 메티오닌을 갖지 않는 단리된 PRO 폴리펩티드를 제공한다. 또한 상기한 단리된 PRO 폴리펩티드의 제조 방법도 본원에 기재하며, 이들 방법은 적절한 코딩 핵산 분자를 포함하는 벡터를 포함하는 숙수 세포를 PRO 폴리펩티드의 발현에 적합한 조건하에 배양하고, 이 세포 배양물로부터 PRO 폴리펩티드를 회수하는 것을 포함한다.
다른 측면에서 본 발명은 막횡단 도메인이 결실되거나 막횡단 도메인이 불활성화된 단리된 PRO 폴리펩티드를 제공한다. 또한 상기한 단리된 PRO 폴리펩티드의 제조 방법도 본원에 기재하며, 이들 방법은 적절한 코딩 핵산 분자를 포함하는 벡터를 포함하는 숙수 세포를 PRO 폴리펩티드의 발현에 적합한 조건 하에 배양하고, 이 세포 배양물로부터 PRO 폴리펩티드를 회수하는 것을 포함한다.
또 다른 실시양태에서, 본 발명은 상기 정의한 바와 같은 천연 PRO 폴리펩티드의 아고니스트 및 길항제에 관한 것이다. 특정한 실시양태에서, 아고니스트 또는 길항제는 항-PRO 항체 또는 소분자이다.
추가의 실시양태에서, 본 발명은 PRO 폴리펩티드를 후보 분자와 접촉시켜 이 PRO 폴리펩티드에 의해 매개되는 생물학적 활성을 모니터링하는 것을 포함하는 PRO 폴리펩티드에 대한 아고니스트 또는 길항제의 확인 방법에 관한 것이다. 바람직하게는, PRO 폴리펩티드는 천연 PRO 폴리펩티드이다.
또한 추가의 실시양태에서, 본 발명은 PRO 폴리펩티드 또는 상기 정의한 바와 같은 PRO 폴리펩티드의 아고니스트 또는 길항제 또는 항-PRO 항체를 담체와 함께 포함하는 조성물에 관한 것이다. 경우에 따라, 상기 담체는 제약상 허용되는 담체이다.
본 발명의 다른 실시양태는 PRO 폴리펩티드, 그의 아고니스트 또는 길항제 또는 항-PRO 항체에 반응성인 질환의 치료용 의약의 제조에 있어서 PRO 폴리펩티드, 또는 상기한 바와 같은 그의 아고니스트 또는 길항제, 또는 항-PRO 항체의 용도에 관한 것이다.
본 발명은 일반적으로 신규 DNA의 확인 (identification) 및 분리와 신규 폴리펩티드의 재조합적 제조 방법에 관한 것이다.
도 1은 천연 서열 PRO241 cDNA의 뉴클레오티드 서열 (서열 1)을 도시하며, 여기서 서열 1은 본원에서 "DNA34392-1170"로 지칭되는 클론이다.
도 2는 도 1에 나타낸 서열 1의 코딩 서열로부터 유도된 아미노산 서열 (서열 2)이다.
도 3은 천연 서열 PRO243 cDNA의 뉴클레오티드 서열 (서열 6)을 도시하며, 여기서 서열 6은 본원에서 "DNA35917-1207"로 지칭되는 클론이다.
도 4는 도 3에 나타낸 서열 6의 코딩 서열로부터 유도된 아미노산 서열 (서열 7)이다.
도 5는 천연 서열 PRO299 cDNA의 뉴클레오티드 서열 (서열 14)을 도시하며, 여기서 서열 14는 본원에서 "DNA39976-1215"로 지칭되는 클론이다.
도 6은 도 5에 나타낸 서열 14의 코딩 서열로부터 유도된 아미노산 서열 (서열 15)이다.
도 7은 본원에서 DNA28847 (서열 18)로 지칭되는 뉴클레오티드 서열이다.
도 8은 본원에서 DNA35877 (서열 19)로 지칭되는 뉴클레오티드 서열이다.
도 9는 천연 서열 PRO323 cDNA의 뉴클레오티드 서열 (서열 23)을 도시하며, 여기서 서열 23은 본원에서 "DNA35595-1228"로 지칭되는 클론이다.
도 10은 도 9에 나타낸 서열 23의 코딩 서열로부터 유도된 아미노산 서열 (서열 24)이다.
도 11은 PRO323에서 유도된 폴리펩티드와 IgG 불변 도메인 일부가 융합된 키메라 융합 단백질의 뉴클레오티드 서열 (뉴클레오티드 79-1416)를 포함하는 단일 가닥 뉴클레오티드 서열 (서열 29)이며, 여기서 이 키메라 융합 단백질은 본원에서 "PRO454"로 지칭된다. PRO323/IgG 융합 단백질 (PRO454)을 코딩하는 단일 가닥 뉴클레오티드 서열 (서열 29)은 본원에서 "DNA35872"로 지칭된다.
도 12는 도 11에 나타낸 뉴클레오티드 서열 중 뉴클레오티드 79-1416에서 유도된 아미노산 서열 (서열 30)이다. PRO323에서 유도된 서열 및 IgG에서 유도된 서열 사이의 PRO454 아미노산 서열 연결부를 이 도의 아미노산 415-416에 나타냈다.
도 13은 천연 서열 PRO327 cDNA의 뉴클레오티드 서열 (서열 31)을 도시하며, 여기서 서열 31는 본원에서 "DNA38113-1230"로 지칭되는 클론이다.
도 14는 도 13에 나타낸 서열 31의 코딩 서열로부터 유도된 아미노산 서열 (서열 32)이다.
도 15는 천연 서열 PRO233 cDNA의 뉴클레오티드 서열 (서열 36)을 도시하며, 여기서 서열 36는 본원에서 "DNA34436-1238"로 지칭되는 클론이다.
도 16은 도 15에 나타낸 서열 36의 코딩 서열로부터 유도된 아미노산 서열 (서열 37)이다.
도 17은 천연 서열 PRO344 cDNA의 뉴클레오티드 서열 (서열 41)을 도시하며, 여기서 서열 41는 본원에서 "DNA40592-1242"로 지칭되는 클론이다.
도 18은 도 17에 나타낸 서열 41의 코딩 서열로부터 유도된 아미노산 서열 (서열 42)이다.
도 19는 천연 서열 PRO347 cDNA의 뉴클레오티드 서열 (서열 49)을 도시하며, 여기서 서열 49는 본원에서 "DNA44176-1244"로 지칭되는 클론이다.
도 20은 도 19에 나타낸 서열 49의 코딩 서열로부터 유도된 아미노산 서열 (서열 50)이다.
도 21은 천연 서열 PRO354 cDNA의 뉴클레오티드 서열 (서열 54)을 도시하며, 여기서 서열 54는 본원에서 "DNA44192-1246"로 지칭되는 클론이다.
도 22는 도 21에 나타낸 서열 54의 코딩 서열로부터 유도된 아미노산 서열 (서열 55)이다.
도 23은 천연 서열 PRO355 cDNA의 뉴클레오티드 서열 (서열 60)을 도시하며, 여기서 서열 60는 본원에서 "DNA39518-1247"로 지칭되는 클론이다.
도 24는 도 23에 나타낸 서열 60의 코딩 서열로부터 유도된 아미노산 서열 (서열 61)이다.
도 25는 천연 서열 PRO357 cDNA의 뉴클레오티드 서열 (서열 68)을 도시하며, 여기서 서열 68은 본원에서 "DNA44804-1248"로 지칭되는 클론이다.
도 26은 도 25에 나타낸 서열 68의 코딩 서열로부터 유도된 아미노산 서열 (서열 69)이다.
도 27은 천연 서열 PRO715 cDNA의 뉴클레오티드 서열 (서열 75)을 도시하며, 여기서 서열 75는 본원에서 "DNA52722-1229"로 지칭되는 클론이다.
도 28은 도 27에 나타낸 서열 75의 코딩 서열로부터 유도된 아미노산 서열 (서열 76)이다.
도 29는 천연 서열 PRO353 cDNA의 뉴클레오티드 서열 (서열 77)을 도시하며, 여기서 서열 77는 본원에서 "DNA41234-1242"로 지칭되는 클론이다.
도 30은 도 29에 나타낸 서열 77의 코딩 서열로부터 유도된 아미노산 서열 (서열 78)이다.
도 31은 천연 서열 PRO361 cDNA의 뉴클레오티드 서열 (서열 82)을 도시하며, 여기서 서열 82는 본원에서 "DNA45410-1250"으로 지칭되는 클론이다.
도 32는 도 31에 나타낸 서열 82의 코딩 서열로부터 유도된 아미노산 서열 (서열 83)이다.
도 33은 천연 서열 PRO365 cDNA의 뉴클레오티드 서열 (서열 90)을 도시하며, 여기서 서열 90은 본원에서 "DNA46777-1253"로 지칭되는 클론이다.
도 34는 도 33에 나타낸 서열 90의 코딩 서열로부터 유도된 아미노산 서열 (서열 91)이다.
용어 "PRO 폴리펩티드" 및 "PRO"란 본원에 사용된 바와 같이 바로 뒤에 숫자가 붙어서 다양한 폴리펩티드를 의미하는데, 완전한 명칭 (즉, PRO/숫자)은 본원에 기재된 특정 폴리펩티드 서열을 의미하는 용어이다. 본원에 사용된 "PRO/숫자 폴리펩티드" 및 "PRO/숫자" (여기서 숫자 부분은 실제 수로 나타냄)는 천연 서열 폴리펩티드 및 폴리펩티드 변이체 (본원에서 추가로 정의됨)를 포함하는 용어이다. 본원에 기재된 PRO 폴리펩티드는 인간 조직 또는 다른 출처와 같은 다양한 출처에서 단리되거나 재조합 또는 합성 방법으로 제조될 수 있다.
"천연 서열 PRO 폴리펩티드"는 자연으로부터 유래한 대응하는 PRO 폴리펩티드와 동일한 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 포함한다. 이러한 천연 서열 PRO 폴리펩티드는 자연으로부터 단리할 수 있거나 재조합 또는 합성 방법으로 제조될 수 있다. 용어 "천연 서열 PRO 폴리펩티드"는 구체적으로는 특정 PRO 폴리펩티드의 자연발생적 말단 절단 (truncated) 형태 또는 분비 형태 (예를 들어 세포외 도메인 서열), 이러한 폴리펩티드의 자연발생적 변이체 형태 (예를 들면, 다르게 스프라이싱된 형태) 및 자연발생적 대립 변이체를 포함한다. 본 발명의 다양한 실시양태에서, 본원에서 기재된 천연 서열 PRO 폴리펩티드는 첨부된 도면에 나타낸 전장 아미노산 서열을 포함하는 성숙 또는 전장 천연 서열 폴리펩티드이다. 개시 및 중지 코돈은 도면에서 굵은 글씨 및 밑줄로 표시된다. 그러나, 본원에 첨부된 도면에 개시된 PRO 폴리펩티드는 도면에서 아미노산 위치 1로 지정된 메티오닌 잔기로 시작하는 것으로 나타나 있지만, 도면에서 아미노산 위치 1로부터 상류 또는 하류에 위치한 다른 메티오닌 잔기가 PRO 폴리펩티드의 출발 아미노산 잔기로 이용될 수 있음을 생각할 수 있으며 또한 가능하다.
PRO 폴리펩티드 "세포외 도메인" 또는 "ECD"란 본질적으로 막횡단 및 세포질 도메인이 없는 PRO 폴리펩티드 형태를 의미한다. 통상적으로 PRO 폴리펩티드 ECD는 막횡단 및(또는) 세포질 도메인을 1 % 미만으로 포함할 것이며, 바람직하게는 상기 도메인들을 0.5 % 미만으로 포함할 것이다. 본 발명의 PRO 폴리펩티드에서 확인된 모든 막횡단 도메인은 당업계에서 소수성 도메인 유형을 밝히는데 통상적으로 사용되는 기준에 따라 확인된 것임을 이해해야 할 것이다. 막횡단 도메인의 정확한 경계선은 달라질 수 있지만, 대부분은 본원에서 처음 확인된 바와 같이 막횡단 도메인의 어느쪽 말단이든지 약 5 개 아미노산 범위 내에 존재한다. 따라서, PRO 폴리펩티드의 세포외 도메인은 경우에 따라 실시예 또는 상세한 설명에서 확인된 막횡단 도메인/세포외 도메인의 어느쪽 경계면이든지 약 5 개 이하의 아미노산을 포함할 수 있고, 수반되는 신호 펩티드가 있거나 없는 이러한 폴리펩티드, 및 이들을 코딩하는 핵산은 본 발명에 포함된다.
본원에 기재된 다양한 PRO 폴리펩티드의 "신호 펩티드"의 대략적인 위치는 본원 및(또는) 첨부된 도면에 나타나 있다. 그러나 염두에 두어야 할 것은, 신호 펩티드의 C-말단 경계가 달라질 수 있지만, 대부분은 본원에서 처음 확인된 신호 펩티드 C-말단의 어느쪽 경계면이든지 아미노산은 약 5 개 이하라는 점이며, 여기서 신호 펩티드의 C-말단 경계는 당업계에서 아미노산 서열 요소의 타입을 확인하는데 통상적으로 이용되는 기준에 따라 확인될 수 있다 (예를 들어, Nielsen et al., Prot. Eng. 10: 1-6 (1997) 및 von Heinje et al., Nucl. Acids. Res. 14: 4683-4690 (1986)). 게다가, 일부 경우에는 분비 폴리펩티드의 신호 서열의 절단이 전체적으로 동일하지 않아 1 종 이상의 분비된 폴리펩티드를 생성시킨다는 것을 인지해야 한다. 본원에서 확인된 신호 펩티드의 C-말단의 어느쪽 경계면이든지에 있는 약 5 개 이하의 아미노산 범위 내에서 신호 펩티드가 절단된 이들 성숙 폴리펩티드, 및 이들을 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 본 발명에 포함된다.
"PRO 폴리펩티드 변이체"는 본원에 기재된 전장 천연 서열 PRO 폴리펩티드서열, 본원에 기재된 바와 같이 신호 펩티드가 없는 전장 천연 서열 PRO 폴리펩티드, 본원에 기재된 바와 같이 신호 펩티드가 있거나 없는 PRO 폴리펩티드의 세포외 도메인, 또는 본원에 기재된 전장 PRO 폴리펩티드 서열의 임의의 다른 단편과 약 80 % 이상의 아미노산 서열 동일성을 갖는, 앞서 또는 뒤에 정의된 활성 PRO 폴리펩티드을 의미한다. 이러한 PRO 폴리펩티드 변이체로는 예를 들어 전장 천연 아미노산 서열의 N-말단 또는 C-말단에 하나 이상의 아미노산 잔기가 첨가되거나 결실된 PRO 폴리펩티드 등이 있다. 통상, PRO 폴리펩티드 변이체는 본원에서 개시된 전장 천연 서열 PRO 폴리펩티드 서열, 본원에 기재된 바와 같이 신호 펩티드가 없는 PRO 폴리펩티드 서열, 본원에 기재된 바와 같이 신호 펩티드가 있거나 없는 PRO 폴리펩티드의 세포외 도메인, 또는 본원에 기재된 전장 PRO 폴리펩티드 서열의 임의의 다른 특별히 정의된 단편과의 아미노산 서열 동일성이 약 80 % 이상, 바람직하게는 약 81 % 이상, 더 바람직하게는 약 82 % 이상, 더 바람직하게는 약 83 % 이상, 더 바람직하게는 약 84 % 이상, 더 바람직하게는 약 85 % 이상, 더 바람직하게는 약 86 % 이상, 더 바람직하게는 약 87 % 이상, 더 바람직하게는 약 88 % 이상, 더 바람직하게는 약 89 % 이상, 더 바람직하게는 약 90 % 이상, 더 바람직하게는 약 91 % 이상, 더 바람직하게는 92 % 이상, 더 바람직하게는 약 93 % 이상, 더 바람직하게는 약 94 % 이상, 더 바람직하게는 약 95 % 이상, 더 바람직하게는 약 96 % 이상, 더 바람직하게는 약 97 % 이상, 더 바람직하게는 약 98 % 이상, 가장 바람직하게는 약 99 % 이상이다. 통상적으로, PRO 변이체 폴리펩티드는 그 길이가 약 10 개 이상의 아미노산, 흔히 약 20 개 이상의 아미노산, 더 흔히는 약 30 개 이상의 아미노산, 더 흔히는 약 40 개 이상의 아미노산, 더 흔히는 약 50 개 이상의 아미노산, 더 흔히는 약 60 개 이상의 아미노산, 더 흔히는 약 70 개 이상의 아미노산, 더 흔히는 약 80 개 이상의 아미노산, 더 흔히는 약 90 개 이상의 아미노산, 더 흔히는 약 100 개 이상의 아미노산, 더 흔히는 약 150 개 이상의 아미노산, 더 흔히는 약 200 개 이상의 아미노산, 더 흔히는 약 300 개 이상의 아미노산 또는 그 이상이다.
본원에서 밝혀진 PRO 폴리펩티드 서열에 대한 "아미노산 서열 동일성 (%)"은 특정 PRO 폴리펩티드 서열과 후보 서열을 정렬하고, 필요한 경우 서열 동일성 퍼센트의 최대치를 얻기 위해 갭을 도입한 후 어떠한 보존적 치환도 서열 동일성의 일부로서 간주하지 않은 상태에서 특정 PRO 폴리펩티드 서열의 아미노산 잔기와 동일한, 후보 서열의 아미노산 잔기의 비율로서 정의된다. 아미노산 서열 동일성 (%)을 측정하기 위한 정렬은 당업계에 공지된 다양한 방법, 예를 들어 BLAST, BLAST-2, ALIGN 또는 Megalign (DNASTAR) 소프트웨어와 같은 공개적으로 입수할 수 있는 컴퓨터 소프트웨어를 사용하여 달성할 수 있다. 당업계의 숙련가는 비교되는 서열들의 전체 길이에 걸쳐 최대로 정렬시키기 위해 필요한 임의의 알고리즘을 비롯하여 정렬을 측정하기에 적합한 파라미터를 정할 수 있다. 그러나, 본원의 목적상 아미노산 서열 동일성 값 (%)은 서열 비교 컴퓨터 프로그램 ALIGN-2를 이용하여 얻을 수 있는데, 상기 ALIGN-2 프로그램에 대한 완전한 원시 코드는 하기 표 1에 기재되어 있다. ALIGN-2 서열 비교 컴퓨터 프로그램은 제넨테크, 인크사가 개발하였으며, 표 1에 나타낸 원시 코드는 미국 저작권청 (미국 20559 워싱톤 D.C. 소재)에사용자 문서와 함께 제출되었으며 미국 저작권 등록 제TXU510087호로서 등록되어 있다. ALIGN-2 프로그램은 제넨테크, 인크사 (미국 캘리포니아주 사우스 샌 프란시스코 소재)를 통해 공개적으로 입수할 수 있거나, 하기 표 1에 기재된 원시 코드로부터 컴파일될 수 있다. ALIGN-2 프로그램은 UNIX 운영체제, 바람직하게는 디지탈 UNIX V4.0D에서 컴파일되어 이용될 수 있다. 모든 서열 비교 파라미터는 ALIGN-2 프로그램으로 설정되며 변경되지 않는다.
ALIGN-2가 아미노산 서열 비교를 위해 사용되는 경우, 주어진 아미노산 서열 B에, B와, 또는 B에 대한 주어진 아미노산 서열 A의 아미노산 서열 동일성 (%) (또는 주어진 아미노산 서열 B에, B와, 또는 B에 대한 특정 아미노산 서열 동일성 (%)을 갖거나 포함하는 주어진 아미노산 서열 A로 달리 표현할 수 있음)은 하기와 같이 계산한다:
X/Y ×100
여기서, X는 A와 B의 프로그램 정렬에서 서열 정렬 프로그램 ALIGN-2에 의해 동일하게 매치되는 것으로 기록되는 아미노산 잔기의 수이고, Y는 B에 있는 아미노산 잔기의 총 수이다. 아미노산 서열 A의 길이가 아미노산 서열 B의 길이와 같지 않는 경우, B에 대한 A의 아미노산 서열 동일성 (%)은 A에 대한 B의 아미노산 서열 동일성 (%)와 같지 않을 것임을 인지해야 할 것이다. 이 방법을 이용한 아미노산 서열 동일성 계산의 예로서, 표 2 및 표 3은 "PRO"로 지칭하는 아미노산 서열에 대한 "비교 단백질"로 지칭하는 아미노산 서열의 아미노산 서열 동일성 (%)을 계산하는 방법을 나타내며, 여기서, "PRO"는 관심있는 가정의 PRO 폴리펩티드의 아미노산서열을 나타내고, "비교 단백질"은 관심있는 "PRO" 폴리펩티드와 비교될 폴리펩티드의 아미노산 서열을 나타내며, "X", "Y" 및 "Z"는 각각 상이한 가정의 아미노산 잔기를 나타낸다.
달리 구체적으로 언급하지 않는 한, 본원에 이용된 모든 아미노산 서열 동일성 값 (%)은 바로 앞선 단락에 기재된 바와 같이 ALIGN-2 컴퓨터 프로그램을 이용하여 얻는다. 그러나, 아미노산 서열 동일성 값 (%)은 하기한 바와 같이 WU-BLAST-2 컴퓨터 프로그램 (Altschul et al., Methods in Enzymology 266: 460-80 (1996))을 이용하여 얻을 수도 있다. WU-BLAST-2 검색 파라미터 대부분은 디폴트값으로 설정된다. 디폴트값으로 설정하지 않은 것들 즉, 조정가능한 파라미터는 다음 값으로 설정된다: 오버랩 스팬 = 1, 오버랩 분획 = 0.125, 워드 한계 (T) = 11, 및 점수 매트릭스 = BLOSUM62. WU-BLAST-2를 이용하면 아미노산 서열 동일성 값 (%)은, (a) 천연 PRO 폴리펩티드로부터 유도된 서열을 갖는 관심있는 PRO 폴리펩티드의 아미노산 서열과 관심있는 비교 아미노산 서열 (즉, 관심있는 PRO 폴리펩티드와 비교되는 서열로서 PRO 변이체 폴리펩티드일 수 있음)과의 사이에 매치되는 동일한 아미노산 잔기의 수를 WU-BLAST-2로 결정하여 얻고, 이를 (b) 관심있는 PRO 폴리펩티드의 아미노산 총 잔기수로 나누어 결정한다. 예를 들어, 아미노산 서열 B와 80 % 이상의 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열 A를 포함하는 폴리펩티드"라는 말에서, 아미노산 서열 A는 비교하는 관심있는 아미노산 서열이고 아미노산 서열 B는 관심있는 PRO 폴리펩티드의 아미노산 서열이다.
아미노산 서열 동일성 (%)은 서열 비교 프로그램 NCBI-BLAST-2를 이용하여결정할 수도 있다 (Altschul et al., Nucleic Acids Res. 25: 3389-3402 (1997)). 상기 NCBI-BLAST-2 서열 비교 프로그램은 웹 사이트 (http://www.ncbi.nlm.nih.gov.)로부터 다운로드 받을 수 있다. NCBI-BLAST-2는 여러 가지 검색 파라미터를 이용하는데, 이러한 모든 검색 파라미터는 디폴트값으로 설정되며, 예를 들어, 언마스크 = 예, 가닥 = 모두, 기대 발생 = 10, 최소 저복합성 길이 = 15/5, 다중-통과 e-값 = 0.01, 다중-통과에 대한 상수 = 25, 최종 갭 정렬에 대한 드롭오프 = 25 및 점수 매트릭스 = BLOSUM62이다.
NCBI-BLAST-2가 아미노산 서열 비교에 사용되는 경우, 주어진 아미노산 서열 B에, B와, 또는 B에 대한 주어진 아미노산 서열 A의 아미노산 서열 동일성 (%) (주어진 아미노산 서열 B에, B와, 또는 B에 대한 특정 아미노산 서열 동일성 (%)을 갖거나 포함하는 주어진 아미노산 서열 A로 달리 표현할 수 있음)은 하기와 같이 계산한다:
X/Y ×100
여기서, X는 A와 B의 프로그램 정렬에서 서열 정렬 프로그램 NCBI-BLAST-2에 의해 동일하게 매치되는 것으로 기록되는 아미노산 잔기의 수이고, Y는 B에 있는 아미노산 잔기의 총 수이다. 아미노산 서열 A의 길이가 아미노산 서열 B의 길이와 같지 않는 경우, B에 대한 A의 아미노산 서열 동일성 (%)은 A에 대한 B의 아미노산 서열 동일성 (%)과 같지 않을 것임을 인지해야 할 것이다.
"PRO 변이체 폴리뉴클레오티드" 또는 "PRO 변이체 핵산 서열"은 아래 정의된 바와 같은 활성 PRO 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 분자로서, 본원에 기재된 전장 천연 서열 PRO 폴리펩티드 서열, 본원에 기재된 바와 같이 신호 펩티드가 없는 전장 천연 서열 PRO 폴리펩티드 서열, 본원에 기재된 바와 같이 신호 펩티드가 있거나 없는 PRO 폴리펩티드의 세포외 도메인, 또는 본원에 기재된 전장 PRO 폴리펩티드 서열의 여타의 다른 단편 중 어느 하나를 코딩하는 핵산 서열과의 핵산 서열 동일성이 약 80 % 이상인 핵산 분자이다. 보통 PRO 변이체 폴리뉴클레오티드는 본원에 기재된 전장 천연 서열 PRO 폴리펩티드 서열, 본원에 기재된 바와 같이 신호 펩티드가 없는 전장 천연 서열 PRO 폴리핍티드 서열, 본원에 기재된 바와 같이 신호 펩티드가 있거나 없는 PRO 폴리펩티드의 세포외 도메인, 또는 본원에 기재된 전장 PRO 폴리펩티드 서열의 여타의 다른 단편 중 어느 하나를 코딩하는 핵산 서열과의 핵산 서열 동일성이 약 80 % 이상, 바람직하게는 약 81 % 이상, 더 바람직하게는 약 82 % 이상, 더 바람직하게는 약 83 % 이상, 더 바람직하게는 약 84 % 이상, 더 바람직하게는 약 85 % 이상, 더 바람직하게는 약 86 % 이상, 더 바람직하게는 약 87 % 이상, 더 바람직하게는 약 88 % 이상, 더 바람직하게는 약 89 % 이상, 더 바람직하게는 약 90 % 이상, 더 바람직하게는 약 91 % 이상, 더 바람직하게는 약 92 % 이상, 더 바람직하게는 약 93 % 이상, 더 바람직하게는 약 94 % 이상, 더 바람직하게는 약 95 % 이상, 더 바람직하게는 약 96 % 이상, 더 바람직하게는 약 97 % 이상, 더 바람직하게는 약 98 % 이상, 가장 바람직하게는 약 99 % 이상일 것이다. 변이체들은 천연 뉴클레오티드 서열 전체를 포괄하지는 않는다.
보통 PRO 변이체 폴리뉴클레오티드는 그 길이가 약 30 개 이상의 뉴클레오티드, 더 흔히는 약 60 개 이상의 뉴클레오티드, 더 흔히는 약 90 개 이상의 뉴클레오티드, 더 흔히는 약 120 개 이상의 뉴클레오티드, 더 흔히는 약 150 개 이상의 뉴클레오티드, 더 흔히는 약 180 개 이상의 뉴클레오티드, 더 흔히는 약 210 개 이상의 뉴클레오티드, 더 흔히는 약 240 개 이상의 뉴클레오티드, 더 흔히는 약 270 개 이상의 뉴클레오티드, 더 흔히는 약 300 개 이상의 뉴클레오티드, 더 흔히는 약 450 개 이상의 뉴클레오티드, 더 흔히는 약 600 개 이상의 뉴클레오티드, 더 흔히는 약 900 개 이상의 뉴클레오티드 또는 그 이상이다.
본원에서 확인된 PRO 코딩 핵산 서열과 관련하여 "핵산 서열 동일성 (%)"은 특정 PRO 핵산 서열과 후보 서열을 정렬시키고, 필요한 경우 서열 동일성의 최대치를 얻기 위해 갭을 도입한 후 특정 PRO 핵산 서열의 뉴클레오티드와 동일한, 후보 서열의 뉴클레오티드의 비율로서 정의된다. 핵산 서열 동일성 (%)을 측정하기 위한 정렬은 당업계에 공지된 다양한 방법, 예를 들어 BLAST, BLAST-2, ALIGN 또는 Megalign (DNASTAR) 소프트웨어와 같은 공개적으로 입수할 수 있는 컴퓨터 소프트웨어를 사용하여 달성할 수 있다. 그러나, 본원의 목적상 핵산 서열 동일성 값 (%)은 서열 비교 컴퓨터 프로그램 ALIGN-2를 이용하여 얻을 수 있는데, 상기 ALIGN-2 프로그램에 대한 완전한 원시 코드는 하기 표 1에 기재되어 있다. ALIGN-2 서열 비교 컴퓨터 프로그램은 제넨테크, 인크사가 개발하였으며, 표 1에 나타낸 원시 코드는 미국 저작권청 (미국 20559 워싱톤 D.C. 소재)에 사용자 문서와 함께 제출되었으며, 미국 저작권 등록 제TXU510087호로서 등록되어 있다. ALIGN-2 프로그램은 제넨테크, 인크사 (미국 캘리포니아주 사우스 샌 프란시스코 소재)를 통해 공개적으로 입수할 수 있거나, 하기 표 1에 기재된 원시 코드로부터 컴파일될 수있다. ALIGN-2 프로그램은 UNIX 운영체제, 바람직하게는 디지탈 UNIX V4.0D에서 컴파일되어 이용될 수 있다. 모든 서열 비교 파라미터는 ALIGN-2 프로그램으로 설정되며 변경되지 않는다.
ALIGN-2가 핵산 서열 비교를 위해 사용되는 경우, 주어진 핵산 서열 D에, D와, 또는 D에 대한 주어진 핵산 서열 C의 핵산 서열 동일성 (%) (주어진 핵산 서열 D에, D와, 또는 D에 대한 일정한 핵산 서열 동일성 (%)을 갖거나 포함하는 주어진 핵산 서열 C로 달리 표현할 수 있음)은 하기와 같이 계산한다:
W/Z ×100
여기서, W는 C와 D의 프로그램 정렬에서 서열 정렬 프로그램 ALIGN-2에 의해 동일하게 매치되는 것으로 기록되는 뉴클레오티드의 수이고, Z는 D에 있는 뉴클레오티드의 총 수이다. 핵산 서열 C의 길이가 핵산 서열 D의 길이와 같지 않는 경우, D에 대한 C의 핵산 서열 동일성 (%)은 C에 대한 D의 핵산 서열 동일성 (%)과 같지 않을 것임을 인지해야 할 것이다. 핵산 서열 동일성 계산의 예로서, 표 4 및 표 5는 "PRO-DNA"로 지칭하는 핵산 서열에 대한 "비교 DNA"로 지칭하는 핵산 서열의 핵산 서열 동일성 (%)을 계산하는 방법을 나타내며, "PRO-DNA"는 관심있는 가정의 PRO-코딩 핵산 서열을 나타내며, "비교 DNA"는 관심있는 "PRO-DNA" 핵산 분자를 비교할 핵산 분자의 뉴클레오티드 서열을 나타내며, "N", "L" 및 "V"는 각각 상이한 가정의 뉴클레오티드를 나타낸다.
달리 구체적으로 언급하지 않는 한, 본원에 이용된 모든 핵산 서열 동일성 값 (%)은 바로 앞선 단락에 기재된 바와 같이 ALIGN-2 컴퓨터 프로그램을 이용하여얻는다. 그러나, 핵산 서열 동일성 값 (%)은 하기한 바와 같이 WU-BLAST-2 컴퓨터 프로그램 (Altschul et al., Methods in Enzymology 266: 460-80 (1996))을 이용하여 얻는다. WU-BLAST-2 검색 파라미터 대부분은 디폴트값으로 설정된다. 디폴트값으로 설정되지 않은, 즉 조정가능한 파라미터는 다음 값으로 설정되었다: 오버랩 스팬 = 1, 오버랩 분획 = 0.125, 워드 한계 (T) = 11, 및 점수 매트릭스 = BLOSUM62. WU-BLAST-2가 사용된다면, 핵산 서열 동일성 값 (%)은 (a) 천연 PRO 폴리펩티드-코딩 핵산으로부터 유도된 서열을 갖는 관심있는 PRO 폴리펩티드 코딩 핵산 분자의 핵산 서열과 비교되는 핵산 분자 (즉, 관심있는 PRO 폴리펩티드 코딩 핵산 분자와 비교되는 서열로서 PRO 변이체 폴리뉴클레오티드일 수 있음)과의 사이에 매치되는 동일한 뉴클레오티드의 수를 WU-BLAST-2로 얻은 후 이를 (b) 관심있는 PRO 폴리펩티드 코딩 핵산 분자의 총 뉴클레오티드수로 나누어 얻는다. 예를 들어, 핵산 서열 B와 80 % 이상의 핵산 서열 동일성을 갖는 핵산 서열 A를 포함하는 단리된 핵산 분자"라는 말에서, 핵산 서열 A는 비교하는 관심있는 핵산 분자의 서열이고 핵산 서열 B는 PRO 폴리펩티드를 코딩하는 관심있는 핵산 분자의 핵산 서열이다.
핵산 서열 동일성 (%)은 하기 기재된 서열 비교 프로그램 NCBI-BLAST-2를 이용하여 계산할 수도 있다 (Altschul et al., Nucleic Acids Res. 25: 3389-3402 (1997)). 상기 NCBI-BLAST-2 서열 비교 프로그램은 웹 사이트 (http://www.ncbi.nlm.nih.gov.)로부터 다운로드 받을 수 있다. NCBI-BLAST-2는 여러 가지 검색 파라미터를 이용하는데, 이러한 모든 검색 파라미터는 디폴트값으로 설정되며 예를 들어, 언마스크 = 예, 가닥 = 모두, 기대 발생 = 10, 최소 저복합성 길이 = 15/5, 다중-통과 e-값 = 0.01, 다중-통과에 대한 상수 = 25, 최종 갭 정렬에 대한 드롭오프 = 25 및 점수 매트릭스 = BLOSUM62이다.
NCBI-BLAST-2가 핵산 서열 비교에 사용되는 경우, 주어진 핵산 서열 D에, D와, 또는 D에 대한 주어진 핵산 서열 C의 핵산 서열동일성 (%) (주어진 핵산 서열 D에, D와, 또는 D에 대한 일정한 핵산 서열 동일성 (%)을 갖거나 포함하는 주어진 핵산 서열 C로 달리 표현할 수 있음)은 하기와 같이 계산한다:
W/Z ×100
여기서, W는 C와 D의 프로그램 정렬에서 서열 정렬 프로그램 NCBI-BLAST-2에 의해 동일하게 매치되는 것으로 기록되는 뉴클레오티드의 수이고, Z는 D에 있는 뉴클레오티드의 총 수이다. 핵산 서열 C의 길이가 핵산 서열 D의 길이와 같지 않는 경우, D에 대한 C의 핵산 서열 동일성 (%)은 C에 대한 D의 핵산 서열 동일성 (%)과 같지 않을 것임을 인지해야 할 것이다.
다른 실시양태에서 PRO 변이체 폴리뉴클레오티드는 본원에 기재된 전장 PRO 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열에 혼성화할 수 있는 (바람직하게는 엄격한 혼성화 및 세척 조건에서) 활성 PRO 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 분자이다. PRO 변이체 폴리펩티드는 PRO 변이체 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되는 것일 수 있다.
상기한 바와 같이 수행되는 서열 비교와 관련하여 용어 "양성"은 동일하지는 않으나 성질이 유사한 비교되는 서열의 잔기를 의미한다 (예를 들면 보존적 치환의결과로, 하기 표 6 참조). 본원의 목적을 달성하기 위해, 양성 값 (%)은, (a) 천연 PRO 폴리펩티드 서열로부터 유도된 서열을 갖는 관심있는 PRO 폴리펩티드 아미노산 서열과 비교되는 아미노산 서열 (즉, PRO 폴리펩티드 서열이 비교되는 아미노산 서열)과의 사이에서 양성 값을 기록한 아미노산 잔기의 수를 WU-BLAST-2의 BLOSUM 62 매트릭스에서 결정한 후, 이를 (b) 관심있는 PRO 폴리펩티드의 아미노산 잔기의 총 수로 나누어 결정한다.
달리 구체적으로 언급하지 않는 한, 양성값 (%)은 바로 앞선 단락에 기재된 바와 같이 계산한다. 그러나, 상기 ALIGN-2 및 NCBI-BLAST-2에 대해 기재한 바와 같이 수행되는 아미노산 서열 동일성 비교는 동일하지는 않으나 성질이 유사한 비교되는 서열의 아미노산 잔기를 포함한다. 관심있는 아미노산 잔기에 대해 양성값을 기록하는 아미노산 잔기는 관심있는 아미노산 잔기와 동일한 것이거나 관심있는 아미노산 잔기의 바람직한 치환 (하기 표 6에 기재되어 있음)이다.
ALIGN-2 또는 NCBI-BLAST-2를 이용한 아미노산 서열 비교를 위해서는, 주어진 아미노산 서열 B에, B와, 또는 B에 대한 주어진 아미노산 서열 A의 양성값 (%) (주어진 아미노산 서열 B에, B와, 또는 B에 대한 일정한 양성값 (%)을 갖거나 포함하는 주어진 아미노산 서열 A로 달리 표현할 수 있음)은 하기와 같이 계산한다:
X/Y ×100
여기서, X는 A와 B의 프로그램 정렬에서 서열 정렬 프로그램 ALIGN-2 또는 NCBI-BLAST-2에 의해 상기에서 정의된 양성값을 기록하는 아미노산 잔기의 수이고, Y는 B에 있는 아미노산 잔기의 총 수이다. 아미노산 서열 A의 길이가 아미노산 서열 B의 길이와 같지 않는 경우, B에 대한 A의 양성값 (%)은 A에 대한 B의 양성값 (%)과 같지 않을 것임을 인지해야 할 것이다.
본원에 기재된 다양한 폴리펩티드를 기술하기 위해 사용된 "단리된"은 폴리펩티드가 확인되고, 그 자연 환경 요소로부터 분리 및(또는) 회수되었음을 의미한다. 폴리펩티드의 자연 환경의 오염 요소는 이 폴리펩티드의 진단 또는 치료적 사용을 일반적으로 방해하는 물질로서, 효소, 호르몬 및 다른 단백질성 또는 비단백질성 용질 등이 있을 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 폴리펩티드는 (1) 스피닝컵 서열 분석기를 사용하여 N-말단 또는 내부 아미노산 서열의 15 개 이상의 잔기를 얻기에 충분한 정도로 정제되거나, 또는 (2) 쿠마시 블루 또는 바람직하게는 은 염색을 사용하여 비환원 또는 환원 조건 하에 SDS-PAGE에서 하나의 밴드만 나타날 정도로 정제될 것이다. PRO 폴리펩티드 자연 환경의 요소가 하나 이상 존재하지 않을 것이기 때문에 단리된 폴리펩티드는 재조합 세포내의 계내 폴리펩티드를 포함한다. 그러나, 통상 단리된 폴리펩티드는 하나 이상의 정제 단계에 의해 얻어질 것이다.
"단리된" PRO 폴리펩티드 코딩 핵산 또는 기타 폴리펩티드 코딩 핵산이란 그 폴리펩티드 코딩 핵산의 천연 출처에서 통상적으로 결합되어 있는 하나 이상의 오염 핵산 분자로부터 확인 및 분리된 핵산 분자라는 의미이다. 단리된 폴리펩티드 코딩 핵산 분자는 자연에서 발견되는 형태 또는 상태와 다르게 존재한다. 따라서, 단리된 폴리펩티드 코딩 핵산 분자는 천연 세포에 존재하는 특정 폴리펩티드 코딩 핵산 분자와 구별된다. 그러나, 예를 들어, 천연 세포와 상이한 염색체 위치에 존재하며 통상적으로 PRO 폴리펩티드를 발현하는 세포에 포함된 폴리펩티드 코딩 핵산 분자는 단리된 폴리펩티드 코딩 핵산 분자에 포함된다.
용어 "조절 서열"이란 특정 숙주 유기체에서 작동가능하게 연결된 코딩 서열의 발현에 필요한 DNA 서열을 의미한다. 원핵생물에 적절한 조절 서열로는 예컨데 프로모터, 경우에 따라 오퍼레이터 서열, 및 리보솜 결합 부위를 들 수 있다. 진핵세포는 프로모터, 폴리아데닐화 신호 및 인핸서를 이용하는 것으로 알려져 있다.
핵산은 다른 핵산 서열과 기능적 관계로 배치될 때 "작동가능하게 연결"된다. 예를 들면, 전서열 또는 분비 리더 (leader)의 DNA는 해당 폴리펩티드가 분비되기 전의 형태인 전단백질로서 발현되는 경우 그 폴리펩티드의 DNA에 작동가능하게 연결되고, 프로모터 또는 인핸서는 코딩 서열의 전사에 영향을 끼치는 경우 그 코딩 서열에 작동가능하게 연결되며, 리보솜 결합 부위는 번역을 촉진하도록 배치될 때 코딩 서열에 작동가능하게 연결된다. 일반적으로 "작동가능하게 연결된"은 연결될 DNA 서열들이 인접하여 위치함을 의미하며, 분비 리더의 경우 인접하여 위치할 뿐만 아니라 리딩 프레임 내에 존재하는 것을 의미한다. 그러나 인핸서는 인접하여 위치할 필요가 없다. 연결은 편리한 제한 효소 부위에서 라이게이션에 의해 달성된다. 이러한 부위가 존재하지 않는 경우, 합성 올리고뉴클레오티드 어댑터 또는 링커를 통상적인 관행에 따라 사용한다.
용어 "항체"는 가장 넓은 의미로 사용되며, 구체적으로는 하나의 항-PRO 폴리펩티드 모노클로날 항체 (아고니스트, 길항제 및 중화 항체 등), 폴리에피토프 특이성이 있는 항-PRO 항체 조성물, 단쇄 항-PRO 항체 및 항-PRO 항체의 단편 (하기 참조) 등을 통칭한다. 본원에서 사용되는 용어 "모노클로날 항체"는 실질적으로 동종 항체들의 집단으로부터 얻은 항체, 즉, 소량으로 존재할 수 있는 가능한 자연발생적 돌연변이를 제외한, 한 집단을 이루는 동일한 개별 항체를 의미한다.
혼성화 반응의 "엄격도"는 당업자가 용이하게 결정할 수 있으며, 일반적으로 프로브 길이, 세척 온도, 염 농도에 따라 달라지는 실험적 계산값이다. 일반적으로 보다 긴 프로브일수록 적절한 어닐링에 보다 높은 온도를 필요로하며, 보다 짧은 프로브일수록 보다 낮은 온도를 필요로 한다. 혼성화는 일반적으로 상보적 가닥이 자신들의 용융 온도보다 낮은 환경에 존재할 때 재어닐링되는 변성된 DNA의 능력에 따라 달라진다. 프로브와 혼성화가능한 서열 사이의 원하는 상동성의 정도가 높을수록, 사용할 수 있는 상대적인 온도가 높아진다. 따라서, 상대적 온도보다 높아질수록 반응 조건은 더욱 엄격해지는 반면, 상대적 온도가 낮을수록 반응조건은 덜 엄격해진다. 혼성화 반응의 엄격도와 관련한 더 자세한 정보 및 설명은 문헌 (Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Wiley Interscience Publishers (1995))을 참조한다.
본원에서 정의되는 "엄격 조건" 또는 "고엄격 조건"이란 (1) 세척시 이온 세기가 낮고 온도가 높은 조건, 예를 들면 50 ℃에서 0.015 M 염화나트륨/0.0015 M 시트르산나트륨/0.1 % 소듐 도데실 술페이트를 사용하는 조건, 또는 (2) 혼성화시에 포름아미드와 같은 변성제를 사용하는 조건, 예를 들어 42 ℃에서 750 mM 염화나트륨, 75 mM 시트르산나트륨이 포함된 50 mM 인산나트륨 완충액 (pH 6.5)/0.1 % 소 혈청 알부민/0.1 % 피콜/0.1 % 폴리비닐피롤리돈이 포함된 50 % (부피/부피) 포름아미드를 사용하는 조건, (3) 50 % 포름아미드, 5 x SSC (0.75 M NaCl, 0.075 M 시트르산나트륨), 50 mM 인산나트륨 (pH 6.8), 0.1 % 피로인산 나트륨, 5 x Denhardt's 용액, 초음파처리된 연어 정자 DNA (50 ㎍/ml), 0.1 % SDS, 및 10 % 덱스트란 술페이트를 42 ℃에서 사용하고, 42 ℃에서 0.2 x SSC (염화나트륨/시트르산나트륨), 그리고 55 ℃에서 50 % 포름아미드로 세척하며, 55 ℃에서 EDTA가 포함된 0.1 x SSC를 이용한 고엄격 세척을 수행하는 것이다.
"중간정도의 엄격 조건"이란 문헌 (Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, New York: Cold Spring Harbor Press 1989)에 기재된 바와 같고, 상기한 것보다 엄격성이 낮은 혼성화 조건 (예를 들어 온도, 이온 세기 및 % SDS)의 이용을 말한다. 중간정도의 엄격 조건의 예는 20 % 포름아미드, 5 x SSC (150 mM 염화나트륨, 15 mM 시트르산삼나트륨), 50 mM 인산나트륨 (pH 7.6), 5 x Denhardt's 용액, 10 % 덱스트란 술페이트 및 20 mg/ml의 잘린 연어 정자 변성 DNA를 포함하는 용액 중에서 37 ℃로 밤새 인큐베이션한 후 필터를 약 37 내지 50 ℃에서 1 x SSC로 세척하는 조건이다. 당업계의 숙련가는 프로브 길이 등과 같은 요인에 맞추기 위해 필요한 온도, 이온 세기 등을 조절하는 방법을 잘 알 것이다.
본원에 사용된 용어 "에피토프 태그가 부착된"은 "태그 폴리펩티드"에 융합된 PRO 폴리펩티드를 포함하는 키메라 폴리펩티드를 지칭한다. 태그 폴리펩티드는 항체가 만들어질 수 있을 정도의 에피토프를 제공하기에 충분한 잔기를 갖지만 융합되는 PRO 폴리펩티드의 활성을 방해하지 않을 정도로 충분히 짧다. 또한 태그 폴리펩티드는 자신에 대한 항체가 다른 에피토프와는 실질적으로 교차반응하지 않도록 아주 독특한 것이 바람직하다. 적절한 태그 폴리펩티드는 일반적으로 6 개 이상의 아미노산 잔기를 가지며, 통상 약 8 내지 50 개 (바람직하게는 약 10 내지 20 개의 잔기)의 아미노산 잔기를 갖는다 .
본원에 사용된 용어 "면역어드헤신"은 면역글로불린 불변 도메인의 이펙터 기능과 이종 단백질 ("어드헤신")의 결합 특이성을 겸비한 항체 유사 분자를 지칭한다. 구조적으로 보면 면역어드헤신은 항체의 항원 인식 및 결합 부위가 아닌, 원하는 결합 특이성을 갖는 아미노산 서열 (즉, 이종 (heterologous))과 면역글로불린 불변 도메인 서열의 융합체를 포함한다. 면역어드헤신 분자의 어드헤신 부분은 통상적으로 적어도 수용체 또는 리간드의 결합 부위를 포함하는 인접 아미노산 서열이다. 면역어드헤신 중 면역글로불린 불변 도메인 서열은 IgG-1, IgG-2, IgG-3, IgG-4 서브타입, IgA (IgA-1 및 IgA-2 포함), IgE, IgD 또는 IgM과 같은 임의의 면역글로불린으로부터 얻을 수 있다.
본원에서 사용된 "활성의" 또는 "활성"은 천연 또는 자연발생적 PRO의 생물학적 및(또는) 면역학적 활성을 보유하는 PRO 폴리펩티드의 형태(들)을 말하는데, 여기서 "생물학적" 활성이란 천연 또는 자연발생적 PRO에 있는 항원성 에피토프에 대한 항체 생성 유도 능력이외에, 천연 또는 자연발생적 PRO에 의한 생물학적 기능 (억제 또는 촉진능)을 말하며, "면역학적" 활성이란 천연 또는 자연발생적 PRO에 있는 항원성 에피토프에 대한 항체 생성을 유도하는 능력을 말한다.
용어 "길항제"는 가장 넓은 의미로 사용되며, 본원에 기재된 천연 PRO 폴리펩티드의 생물학적 활성을 부분적으로 또는 완전히 차단, 억제 또는 중화시키는 모든 분자를 통칭한다. 이와 비슷하게 용어 "아고니스트"도 가장 넓은 의미로 사용되며, 본원에 기재된 천연 PRO 폴리펩티드의 생물학적 활성을 흉내내는 모든 분자를 통칭한다. 적절한 아고니스트 또는 길항제 분자로는 구체적으로 아고니스트 또는 길항제의 항체 또는 항체의 단편, 천연 PRO 폴리펩티드의 단편 또는 아미노산 서열 변이체, 펩티드, 안티센스 올리고뉴클레오티드, 작은 유기분자 등을 들 수 있다. PRO 폴리펩티드의 아고니스트 또는 길항제를 확인하는 방법은 PRO 폴리펩티드를 후보 아고니스트 분자나 후보 길항제 분자와 접촉시키고, PRO 폴리펩티드와 정상적으로 관련된 하나 이상의 생물학적 활성에서 검출가능한 변화를 측정하는 것을 포함할 수 있다.
"치료 (treatment)"는 표적 병태나 질병을 예방하거나 늦추기 (완화하기) 위한 목적으로 수행되는 치료적 처치 (therapeutic treatment)와 예방 또는 방지 조치를 나타낸다. 치료를 요하는 대상은 이미 질병을 앓고 있는 대상 뿐만 아니라 질병에 걸리기 쉬운 대상 또는 질병을 예방하고자 하는 대상을 포함한다.
"만성" 투여란 급성 방식과 반대로 연속 방식으로 작용제(들)를 투여하여, 초기 치료 효과 (활성)를 장기간 동안 유지하는 것을 말한다. "간헐적" 투여는 중단없이 계속해서 행하는 것이 아니라 성질상 주기적으로 이루어지는 처치를 의미한다.
치료에 맞는 "포유류"는 인간, 가축과 사육 동물, 및 동물원용, 경기용 또는 애완용 동물, 예를 들면, 개, 고양이, 소, 말, 양, 돼지, 염소, 토끼 등을 포함하는 포유류로서 분류되는 모든 동물을 말한다. 바람직한 포유류는 인간이다.
하나 이상의 다른 치료제와 "병행하여" 투여된다는 것은 동시에 (동시다발적으로) 투여하거나 어떤 순서로든 연속하여 투여하는 것을 포괄한다.
본원에서 사용되는 "담체"는 사용되는 투여량 및 농도에 노출되는 세포 또는 포유류에 무독성인 제약상 허용되는 담체, 부형제, 또는 안정화제를 포함한다. 생리학상 허용되는 담체는 pH 완충 수용액이다. 생리학상 허용되는 담체의 예는 포스페이트, 시트레이트 및 다른 유기산과 같은 완충액; 아스코르브산을 포함한 항산화제; 저분자량 (약 10 잔기 미만) 폴리펩티드; 단백질, 예를 들어 혈청 알부민, 젤라틴 또는 면역글로불린; 친수성 중합체, 예를 들어 폴리비닐피롤리돈; 아미노산, 예를 들어 글리신, 글루타민, 아스파라긴, 아르기닌 또는 라이신; 단당류, 이당류 및 글루코스, 만노스 또는 덱스트린을 비롯한 기타 탄수화물; 킬레이팅제, 예를 들어 EDTA; 당 알콜, 예를 들어 만니톨 또는 소르비톨; 염 형성 카운터 이온, 예를 들어 나트륨; 및(또는) 비이온성 계면활성제, 예를 들어 TWEENTM, 폴리에틸렌 글리콜 (PEG) 및 PLURONICSTM를 포함한다.
"항체 단편"은 온전한 항체의 일부, 바람직하게는 온전한 항체의 항원 결합 영역 또는 가변 영역을 포함한다. 항체 단편의 예로는 Fab, Fab', F(ab')2및 Fv 단편; 디아바디; 선형 항체 (Zapata et al., Protein Eng. 8 (10):1057-1062 (1995)); 단쇄 항체 분자; 및 항체 단편으로부터 형성된 다중특이성 항체 등이 있다.
항체를 파파인 (Papain) 분해하면 각각 단일 항원 결합 부위가 있는 2 개의동일한 항원 결합 단편 ("Fab" 단편이라 불림), 및 쉽게 결정화되는 능력을 반영하여 이름 붙여진 나머지 "Fc" 단편이 생성된다. 펩신을 처리하면, 2 개의 항원 결합 부위가 있으며 여전히 항원에 교차결합할 수 있는 F(ab')2단편이 생성된다.
"Fv"는 완전한 항원 인식 및 항원 결합 부위를 포함하는 최소 항체 단편이다. 이 영역은 단단하게 비공유결합된 하나의 중쇄 가변 도메인과 하나의 경쇄 가변 도메인으로 이루어진 이량체로 구성된다. 이 구조에서는 각 가변 도메인에 있는 3 개의 CDR이 상호작용하여 VH-VL이량체의 표면에 항원 결합 부위를 형성한다. 결론적으로 보면, 6 개의 CDR이 항체에 항원 결합 특이성을 부여한다. 그러나, 단일 가변 도메인 (또는 항원에 특이적인 단지 3 개의 CDR만을 포함하는 Fv의 절반) 조차도 전체 결합 부위보다 친화성은 낮지만 항원을 인식하여 항원에 결합하는 능력을 갖는다.
또한, Fab 단편은 경쇄의 불변 도메인 및 중쇄의 제1 불변 도메인(CH1)을 포함한다. Fab 단편은 항체 힌지 (hinge) 영역으로부터 유래한 하나 이상의 시스테인을 포함하는 중쇄 CH1 도메인의 카르복시 말단에 몇 개의 잔기가 첨가되었다는 점에서 Fab' 단편과 상이하다. 본원에서 Fab'-SH는 불변 도메인의 시스테인 잔기(들)이 유리 티올기를 보유하는 Fab'를 지칭한다. F(ab')2항체 단편은 본래 그들 사이에 힌지 시스테인이 있는 몇쌍의 Fab' 단편으로 생성되었다. 항체 단편의 다른 화학적 커플링도 공지되어 있다.
임의의 척추동물종으로부터 유래한 항체 (면역글로불린)의 "경쇄"는 그의 불변 도메인의 아미노산 서열을 기초로 하여 카파 (κ) 및 람다 (λ)로 불리는 2 개의 명백하게 상이한 타입 중의 하나로 분류될 수 있다.
면역글로불린은 그의 중쇄의 불변 도메인의 아미노산 서열에 따라 상이한 클래스로 분류될 수 있다. 면역글로불린에는 IgA, IgD, IgE, IgG 및 IgM의 5 개 주요 클래스가 있고, 이들 중 몇 개는 서브클래스 (이소타입), 예를 들어 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA 및 IgA2로 더 분류될 수 있다.
"단일쇄 Fv" 또는 "sFv" 항체 단편은 단일 폴리펩티드 사슬에 존재하는 항체의 VH및 VL도메인을 포함한다. 바람직하게는, Fv 폴리펩티드는 sFv가 항원 결합에 필요한 구조를 형성하도록 하는 VH및 VL도메인 사이의 폴리펩티드 링커를 추가로 포함한다 (sFv에 관해서는 문헌 (Pluckthan inThe Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg 및 Moore eds., Springer-Verlag, New York, pp. 269-315 (1994)) 참조).
용어 "디아바디 (diabody)"는 동일한 폴리펩티드 사슬 (VH-VL) 내에 경쇄 가변 도메인 (VL)에 연결된 중쇄 가변 도메인 (VH)을 포함하는, 2 개의 항원 결합 부위가 있는 작은 항체 단편을 말한다. 동일한 사슬에 있는 2 개의 도메인을 페어링시키기에는 너무 짧은 링커를 사용함으로써, 도메인을 다른 사슬의 상보성 도메인과 강제로 페어링시켜 2 개의 항원 결합 부위를 생성시킨다. 디아바디는 예를 들어 EP 404,097, WO93/11611 및 Hollinger et al.,Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:6444-6448 (1993)에 보다 상세하게 기재되어 있다.
"단리된" 항체란 자신의 천연 환경의 요소로부터 확인 및 분리 및(또는) 회수된 항체이다. 그의 천연 환경의 오염 요소는 항체의 진단 또는 치료적 사용을 방해하는 물질로서, 효소, 호르몬 및 다른 단백성 또는 비단백성 용질을 포함할 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 항체는 (1) 로우리 (Lowry) 방법에 의해 측정시 95 중량 % 초과, 가장 바람직하게는 99 중량 % 초과의 항체로, 또는 (2) 스피닝 컵 서열 분석기를 사용하여 N-말단 또는 내부 아미노산 서열의 잔기 15 개 이상을 수득하기에 충분한 정도로, 또는 (3) 쿠마시 블루, 또는 바람직하게는 은 염색을 사용하여 환원 또는 비환원 조건 하에 SDS-PAGE에 의해 하나의 밴드로 정제될 것이다. 단리된 항체는 그 항체의 천연 환경의 하나 이상의 성분이 존재하지 않을 것이기 때문에, 재조합 세포내의 계내 항체를 포함한다. 그러나, 단리된 항체는 일반적으로 하나 이상의 정제 단계에 의해 정제될 것이다.
"표지 (label)"란 단어는 본원에서 사용될 때, 항체에 직간접적으로 접합되어 "표지된" 항체를 생성시키는 검출가능한 화합물 또는 조성물을 말한다. 표지는 그 자체로 (방사성동위원소 표지 또는 형광 표지) 검출될 수 있거나, 효소 표지인 경우에는 검출가능한 기질 화합물 또는 조성물의 화학적 변경을 촉매할 수 있다.
"고상 (solid phase)"은 본 발명의 항체가 부착될 수 있는 비수성 매트릭스를 의미한다. 고상의 예는 부분적으로 또는 완전하게 형성된 유리 (예를 들어 세공 조절된 유리), 폴리사카라이드 (예를 들어 아가로스), 폴리아크릴아미드, 폴리스티렌, 폴리비닐 알콜 및 실리콘 등이 있다. 특정 실시양태에서, 내용에 따라 고상은 분석 플레이트의 웰을 포함할 수 있으며, 다른 실시양태에서 고상은 정제 컬럼 (예를 들어 친화성 크로마토그래피 컬럼)이다. 이 용어는 또한 미국 특허 제4,275,149호에 기재된 것과 같은 별개 입자의 비연속적 고상도 포함한다.
"리포좀"은 약물 (예를 들어 PRO 폴리펩티드 또는 이에 대한 항체)을 포유류에게 전달하는데 유용한 여러 형태의 지질, 인지질 및(또는) 계면활성제로 이루어진 작은 베지클 (vesicle)이다. 리포좀의 성분들은 통상적으로 생체막의 지질 정렬과 유사하게 이중층 형태로 정렬된다.
"소분자 (작은 분자)"는 본원에서 분자량이 약 500 달톤 이하인 것으로 정의된다.
II. 본 발명의 조성물 및 방법
본 발명은 본원에서 PRO 폴리펩티드로 언급된 폴리펩티드를 코딩하는 새로이확인되고 단리된 뉴클레오티드 서열에 관한 것이다. 특히, 하기 실시예에 보다 상세히 기재된 바와 같이, 각종 PRO 폴리펩티드를 코딩하는 cDNA를 확인하고 단리하였다. 별도의 발현 라운드에서 생산된 단백질의 PRO 숫자는 다를 수 있지만 UNQ 수는 임의의 주어진 DNA 및 코딩된 단백질 특유의 것이며, 변하지 않을 것이다. 그러나, 본원에서는 간단하게, 본원에 기재된 전장 천연 핵산 분자에 의해 코딩된 단백질, 및 상기 정의에 포함된 PRO의 다른 천연 상동체 및 변이체를 이들의 출처 및 제조 방식과 상관없이 "PRO/숫자"로 언급할 것이다.
하기 실시예에 기재된 바와 같이, 여러가지 cDNA 클론을 ATCC에 기탁하였다. 당업자라면 당업계의 통상적인 방법을 이용하여 기탁된 클론의 서열을 분석함으로써 상기 클론의 실제 뉴클레오티드 서열을 쉽게 결정할 수 있다. 통상의 기술을 사용하여 뉴클레오티드 서열로부터 예상되는 아미노산 서열을 결정할 수 있다. 본원에 기재된 PRO 폴리펩티드 및 이를 코딩하는 핵산의 경우, 본 발명자들은 당시 이용할 수 있었던 서열 정보를 사용하여 가장 잘 확인할 수 있는 리딩 프레임으로 여겨지는 것을 확인하였다.
1.전장 PRO241 폴리펩티드
본 발명은 본원에서 PRO241로 지칭되는 폴리펩티드를 코딩하는 새로이 확인되고 단리된 뉴클레오티드 서열을 제공한다. 특히, 본 발명자들은 하기 실시예에 보다 상세하게 설명된 바와 같이, PRO241 폴리펩티드를 코딩하는 cDNA를 확인하고 단리하였다. BLAST 및 FastA라는 서열 정렬 컴퓨터 프로그램을 이용하여, 본 발명자들은 PRO241 폴리펩티드의 일부분이 다양한 비클리칸 단백질과 특정 상동성이 있음을 밝혀내었다. 따라서, 본원에 개시된 PRO241 폴리펩티드는 새로이 확인된 비글리칸 상동체 폴리펩티드이고, 비글리칸 단백질의 전형적인 활성을 가질 수 있는 것으로 현재 생각된다.
2.전장 PRO243 폴리펩티드
본 발명은 본원에서 PRO243으로 지칭되는 폴리펩티드를 코딩하는 새로이 확인되고 단리된 뉴클레오티드 서열을 제공한다. 특히, 본 발명자들은 하기 실시예에 보다 상세하게 설명된 바와 같이, PRO243 폴리펩티드를 코딩하는 cDNA를 확인하고 단리하였다. BLAST, BLAST-2 및 FastA라는 서열 정렬 컴퓨터 프로그램을 이용하여, 본 발명자들은 전장 천연 서열 PRO243 (도 4 및 서열 7)이 아프리카 발톱 개구리 (African clawed frog) 및 제노푸스 (Xenopus)의 코르딘과 특정 아미노산 동일성을 갖고, 래트의 코르딘과 특정 상동성이 있음을 알아냈다. 따라서, 본원에 개시된 PRO243 폴리펩티드는 새로이 확인된 코르딘 단백질 족의 구성원이며, 중배엽의 등형성 (dorsalization) 작용에 의한 척삭 및 근육 형성에 영향을 끼칠 수 있는 것으로 현재 생각된다.
3.전장 PRO299 폴리펩티드
본 발명은 본원에서 PRO299로 지칭되는 폴리펩티드를 코딩하는 새로이 확인되고 단리된 뉴클레오티드 서열을 제공한다. 특히, 본 발명자들은 하기 실시예에 보다 상세하게 설명된 바와 같이, PRO299 폴리펩티드를 코딩하는 cDNA를 확인하고 단리하였다. BLAST 및 FastA라는 서열 정렬 컴퓨터 프로그램을 이용하여, 본 발명자들은 PRO299 폴리펩티드의 여러 부분이 노치 단백질과 특정 상동성이 있음을 밝혀내었다. 따라서, 본원에 개시된 PRO299 폴리펩티드는 새로이 확인된 노치 단백질 족의 구성원이며, 노치 단백질 족에서 통상 나타나는 신호 전달 특성이 있는 것으로 현재 생각된다.
4.전장 PRO323 폴리펩티드
본 발명은 본원에서 PRO323으로 지칭되는 폴리펩티드를 코딩하는 새로이 확인되고 단리된 뉴클레오티드 서열을 제공한다. 특히, 본 발명자들은 하기 실시예에 보다 상세하게 설명된 바와 같이, PRO323 폴리펩티드를 코딩하는 cDNA를 확인하고 단리하였다. BLAST 및 FastA라는 서열 정렬 컴퓨터 프로그램을 이용하여, 본 발명자들은 PRO323 폴리펩티드의 여러 부분이 다양한 디펩티다제 단백질과 특정 상동성이 있음을 밝혀내었다. 따라서, 본원에 개시된 PRO323 폴리펩티드는 새로이 확인된 디펩티다제 상동체이며, 디펩티다제 활성이 있는 것으로 현재 생각된다.
5.전장 PRO327 폴리펩티드
본 발명은 본원에서 PRO327로 지칭되는 폴리펩티드를 코딩하는 새로이 확인되고 단리된 뉴클레오티드 서열을 제공한다. 특히, 본 발명자들은 하기 실시예에 보다 상세하게 설명된 바와 같이, PRO327 폴리펩티드를 코딩하는 cDNA를 확인하고 단리하였다. BLAST 및 FastA라는 서열 정렬 컴퓨터 프로그램을 이용하여, 본 발명자들은 PRO327 폴리펩티드가 다양한 프로락틴 수용체 단백질과 특정 상동성이 있음을 밝혀내었다. 따라서, 본원에 개시된 PRO327 폴리펩티드는 새로이 확인된 프로락틴 상동체이며, 프로락틴 수용체 단백질의 전형적인 활성을 갖는 것으로 현재 생각된다.
6.전장 PRO233 폴리펩티드
본 발명은 본원에서 PRO233으로 지칭되는 폴리펩티드를 코딩하는 새로이 확인되고 단리된 뉴클레오티드 서열을 제공한다. 특히, 본 발명자들은 하기 실시예에 보다 상세하게 설명된 바와 같이, PRO233 폴리펩티드를 코딩하는 cDNA를 확인하고 단리하였다. BLAST 및 FastA라는 서열 정렬 컴퓨터 프로그램을 이용하여, 본 발명자들은 PRO233 폴리펩티드의 여러 부분이 다양한 리덕타제 단백질과 특정 상동성이 있음을 밝혀내었다. 또한, PRO233 폴리펩티드를 코딩하는 DNA가 세노르하브디티스 엘레강스 (Caenorhabditis elegans)의 해당 DNA와도 상동성이 높음을 밝혀내었다. 따라서, 본원에 개시된 PRO233 폴리펩티드는 새로이 확인된 리덕타제 족의 한 구성원으로서, 리덕타제 족의 전형적인 세포의 산화환원 상태 조절 능력이 있는 것으로 현재 생각된다.
7.전장 PRO344 폴리펩티드
본 발명은 본원에서 PRO344로 지칭되는 폴리펩티드를 코딩하는 새로이 확인되고 단리된 뉴클레오티드 서열을 제공한다. 특히, 본 발명자들은 하기 실시예에 보다 상세하게 설명된 바와 같이, PRO344 폴리펩티드를 코딩하는 cDNA를 확인하고 단리하였다. BLAST 및 FastA라는 서열 정렬 컴퓨터 프로그램을 이용하여, 본 발명자들은 PRO344 폴리펩티드의 여러 부분이 인간 및 마우스의 보체 단백질과 특정 상동성이 있음을 밝혀내었다. 따라서, 본원에 개시된 PRO344 폴리펩티드는 새로이 확인된 보체 단백질 족의 한 구성원이며, 보체 단백질 족의 전형적인 염증 반응 조절 능력이 있는 것으로 현재 생각된다.
8.전장 PRO347 폴리펩티드
본 발명은 본원에서 PRO347로 지칭되는 폴리펩티드를 코딩하는 새로이 확인되고 단리된 뉴클레오티드 서열을 제공한다. 특히, 본 발명자들은 하기 실시예에 보다 상세하게 설명된 바와 같이, PRO347 폴리펩티드를 코딩하는 cDNA를 확인하고 단리하였다. BLAST 및 FastA라는 서열 정렬 컴퓨터 프로그램을 이용하여, 본 발명자들은 PRO347 폴리펩티드가 여러 시스테인 풍부 분비 단백질과 특정 상동성이 있음을 밝혀내었다. 따라서, 본원에 개시된 PRO347 폴리펩티드는 새로이 확인된 시스테인 풍부 분비 단백질이며, 시스테인 풍부 분비 단백질 족의 전형적인 활성을 갖는 것으로 현재 생각된다.
9.전장 PRO354 폴리펩티드
본 발명은 본원에서 PRO354로 지칭되는 폴리펩티드를 코딩하는 새로이 확인되고 단리된 뉴클레오티드 서열을 제공한다. 특히, 본 발명자들은 하기 실시예에 보다 상세하게 설명된 바와 같이, PRO354 폴리펩티드를 코딩하는 cDNA를 확인하고 단리하였다. BLAST 및 FastA라는 서열 정렬 컴퓨터 프로그램을 이용하여, 본 발명자들은 PRO354 폴리펩티드가 인터-알파-트립신 억제제 중쇄 단백질과 특정 상동성이 있음을 밝혀내었다. 따라서, 본원에 개시된 PRO354 폴리펩티드는 새로이 확인된 인터-알파-트립신 억제제 중쇄 상동체라고 현재 생각된다.
10.전장 PRO355 폴리펩티드
본 발명은 본원에서 PRO355로 지칭되는 폴리펩티드를 코딩하는 새로이 확인되고 단리된 뉴클레오티드 서열을 제공한다. 특히, 본 발명자들은 하기 실시예에보다 상세하게 설명된 바와 같이, PRO355 폴리펩티드를 코딩하는 cDNA를 확인하고 단리하였다. BLAST 및 FastA라는 서열 정렬 컴퓨터 프로그램을 이용하여, 본 발명자들은 PRO355 폴리펩티드의 여러 부분이 CRTAM 단백질과 특정 상동성이 있음을 밝혀내었다. 또한, PRO355 폴리펩티드를 코딩하는 DNA가 흉선세포 활성화 및 발생 단백질, H20A 수용체, H20B 수용체, 폴리오바이러스 (poliovirus) 수용체 및 세르코피테쿠스 애티오프스 (Cercopithecus aethiops)의 AGM 델타 1 단백질과도 상동성이 있음을 밝혀내었다. 따라서, 본원에 개시된 PRO355 폴리펩티드는 새로이 확인된 CRTAM 단백질 족의 한 구성원이라고 현재 생각된다.
11.전장 PRO357 폴리펩티드
본 발명은 본원에서 PRO357로 지칭되는 폴리펩티드를 코딩하는 새로이 확인되고 단리된 뉴클레오티드 서열을 제공한다. 특히, 본 발명자들은 하기 실시예에 보다 상세하게 설명된 바와 같이, PRO357 폴리펩티드를 코딩하는 cDNA를 확인하고 단리하였다. BLAST 및 FastA라는 서열 정렬 컴퓨터 프로그램을 이용하여, 본 발명자들은 PRO357 폴리펩티드의 여러 부분이 인슐린 유사 성장 인자의 산 불안정성 서브유닛과 특정 상동성이 있음을 밝혀내었다. 또한, DNA44804-1248의 비코딩 영역이 WO 95/14772호에 기재된 인간 유전자 시그너쳐 (signature)와 정렬됨을 알아냈다. 추가로, DNA44804-1248의 비코딩 영역이 문헌 (Deuring and Doerfler,Gene, 26:283-289 (1983))에 기재된 아데노바이러스 (adenovirus) 유형 12/인간 재조합 바이러스 DNA와 정렬됨을 알아냈다. 코딩 영역 상동성을 기초로 하여, 본원에서 개시된 PRO357 폴리펩티드는 새로이 확인된, 류신 풍부 반복 서열을 포함하는 단백질 족의 한 구성원이며, 특히 인슐린 유사 성장 인자의 산 불안정성 서브유닛과 관련이 있다고 현재 생각된다. 이로써, PRO357은 결합 메카니즘와 관련이 있고 복합체의 일부일 수 있다.
12.전장 PRO715 폴리펩티드
본 발명은 본원에서 PRO715로 지칭되는 폴리펩티드를 코딩하는 새로이 확인되고 단리된 뉴클레오티드 서열을 제공한다. 특히, 본 발명자들은 하기 실시예에 보다 상세하게 설명된 바와 같이, PRO715 폴리펩티드를 코딩하는 cDNA를 확인하고 단리하였다. BLAST 및 FastA라는 서열 정렬 컴퓨터 프로그램을 이용하여, 본 발명자들은 PRO715 폴리펩티드의 여러 부분이 종양 괴사 인자 단백질 족의 다양한 구성원들과 특정 상동성이 있음을 밝혀내었다. 따라서, 본원에 개시된 PRO715 폴리펩티드는 새로이 확인된 종양 괴사 인자 단백질 족의 한 구성원이라고 현재 생각된다.
13.전장 PRO353 폴리펩티드
본 발명은 본원에서 PRO353으로 지칭되는 폴리펩티드를 코딩하는 새로이 확인되고 단리된 뉴클레오티드 서열을 제공한다. 특히, 본 발명자들은 하기 실시예에 보다 상세하게 설명된 바와 같이, PRO353 폴리펩티드를 코딩하는 cDNA를 확인하고 단리하였다. BLAST 및 FastA라는 서열 정렬 컴퓨터 프로그램을 이용하여, 본 발명자들은 PRO353 폴리펩티드의 여러 부분이 인간 및 마우스의 보체 단백질과 특정 상동성이 있음을 밝혀내었다. 따라서, 본원에 개시된 PRO353 폴리펩티드는 새로이 확인된 보체 단백질 족의 한 구성원이며, 보체 단백질 족의 전형적인 염증 반응 조절 능력이 있는 것으로 현재 생각된다.
14.전장 PRO361 폴리펩티드
본 발명은 본원에서 PRO361로 지칭되는 폴리펩티드를 코딩하는 새로이 확인되고 단리된 뉴클레오티드 서열을 제공한다. 특히, 본 발명자들은 하기 실시예에 보다 상세하게 설명된 바와 같이, PRO361 폴리펩티드를 코딩하는 cDNA를 확인하고 단리하였다. BLAST 및 FastA라는 서열 정렬 컴퓨터 프로그램을 이용하여, 본 발명자들은 PRO361 폴리펩티드의 여러 부분이 뮤신 및 키티나제 단백질과 특정 상동성이 있음을 밝혀내었다. 따라서, 본원에 개시된 PRO361 폴리펩티드는 새로이 확인된 뮤신 및(또는) 키티나제 단백질 족의 한 구성원이며, 뮤신 및 키티나제 단백질 족의 전형적인 기능 (각각 암, 식물 발병 또는 수용체 기능)과 관련 있을 수 있다고 현재 생각된다.
15.전장 PRO365 폴리펩티드
본 발명은 본원에서 PRO365로 지칭되는 폴리펩티드를 코딩하는 새로이 확인되고 단리된 뉴클레오티드 서열을 제공한다. 특히, 본 발명자들은 실시예에 보다 상세하게 설명된 바와 같이, PRO365 폴리펩티드를 코딩하는 cDNA를 확인하고 단리하였다. BLAST 및 FastA라는 서열 정렬 컴퓨터 프로그램을 이용하여, 본 발명자들은 PRO365 폴리펩티드의 여러 부분이 인간 2-19 단백질과 특정 상동성이 있음을 밝혀내었다. 따라서, 본원에 개시된 PRO365 폴리펩티드는 새로이 확인된 인간 2-19 단백질 족의 한 구성원으로 현재 생각된다.
B.PRO 폴리펩티드 변이체
본원에서 설명되는 전장 천연 서열 PRO 폴리펩티드 외에도, PRO 변이체를 제조할 수 있는 것으로 생각된다. PRO 변이체는 적합한 뉴클레오티드 변화를 PRO DNA에 도입하고(거나) 목적 PRO 폴리펩티드를 합성함으로써 제조될 수 있다. 당업자라면 글리코실화 부위의 수 또는 위치의 변경 또는 막 앵커링 특성의 변화와 같은 아미노산 변화가 PRO의 번역후 프로세싱을 변경시킬 수 있다는 것을 이해할 것이다.
본원에서 설명되는 전장 천연 서열 PRO 또는 PRO의 여러 도메인에서의 변이는 예를 들어 미국 특허 제5,364,934호에 개시된 보존적 및 비보존적 돌연변이 기술 및 지침을 사용하여 제조할 수 있다. 변이는 PRO를 코딩하는 하나 이상의 코돈의 치환, 결실 또는 삽입일 수 있어서 천연 서열 PRO와 비교시에 PRO의 아미노산 서열을 변화시킨다. 경우에 따라, 변이는 PRO의 하나 이상의 도메인 내의 하나 이상의 아미노산을 임의의 다른 아미노산으로 치환함으로써 생성된다. 목적 활성에 유해한 효과를 주지 않으면서 삽입, 치환 또는 결실될 수 있는 아미노산 잔기는 PRO의 서열을 공지된 상동성 단백질 분자의 서열과 비교하고 상동성이 높은 영역에서 생성된 아미노산 서열 변화의 수를 최소화함으로써 결정할 수 있다. 아미노산 치환은 하나의 아미노산을 유사한 구조 및(또는) 화학적 특성을 갖는 다른 아미노산으로 치환 (예를 들어 류신의 세린으로의 치환), 즉 보존적 아미노산 치환의 결과일 수 있다. 삽입 또는 결실은 경우에 따라 약 1 내지 5 개 범위의 아미노산에서 발생할 수 있다. 허용되는 변이는 서열 내에 아미노산을 체계적으로 삽입, 결실 또는 치환시켜서, 전장 또는 성숙 천연 서열에 의해 나타났던 활성의 변이 결과를 시험함으로써 정할 수 있다.
본원은 PRO 폴리펩티드 단편들을 제공한다. 예를 들어 전장 천연 단백질과 비교하는 경우, 이 단편들은 N-말단 또는 C-말단이 잘리거나 내부 잔기가 결손될 수 있다. 몇몇 단편은 본 발명의 PRO 폴리펩티드의 목적 생물학적 활성에 필수적이지 않은 아미노산 잔기가 결손되어 있다.
PRO 단편은 많은 통상의 기술 중 임의의 기술에 의해 제조될 수 있다. 목적 펩티드 단편은 화학적으로 합성될 수 있다. 다른 방법은 효소적 분해 방법, 예를 들어 이 단백질을 특정 아미노산 잔기로 정의된 부위에서 자르는 것으로 알려진 효소로 처리하거나 이 DNA를 적합한 제한 효소로 잘라냄으로써 PRO 단편을 생성하는 단계 및 이 목적 단편을 단리하는 단계를 포함한다. 그러나, 또다른 적합한 기술은 중합효소 연쇄 반응 (PCR)에 의해 목적 폴리펩티드 단편을 코딩하는 DNA 단편을 단리하고 증폭하는 단계를 포함한다. DNA 단편의 목적 말단부를 정하는 올리고뉴클레오티드는 PCR에서 5' 및 3' 프라이머로 사용된다. 바람직하게는, PRO 폴리펩티드 단편은 본원에서 개시된 천연 PRO 폴리펩티드와 하나 이상의 생물학적 및(또는) 면역학적 활성을 공유한다.
구체적인 실시양태에서, 목적물의 보존적 치환은 바람직한 치환이라는 표제로 표 1에 나타내었다. 이러한 치환에 의해 생물학적 활성이 변화하는 경우, 하기 표 6에서 치환예로서 명명되거나 아미노산 종류에 대해서 하기에서 보다 상세하게 설명된 바와 같이 보다 실질적인 변화를 도입하고 생성물을 스크리닝하였다.
PRO 폴리펩티드의 기능 또는 면역학적 동일성의 실질적인 변형은 (a) 치환 영역에서의 폴리펩티드 백본의 구조를, 예를 들어 시트 또는 나선 형태로서 유지하거나, (b) 표적 부위에서의 분자의 하전 또는 소수성을 유지하거나, 또는 (c) 측쇄의 크기를 유지하는데 미치는 영향을 상당하게 변경시키는 치환을 선택함으로써 수행된다. 자연 발생 잔기는 공통적인 측쇄 특성에 따라 다음과 같은 군으로 구분된다:
(1) 소수성: norleucine, met, ala, val, leu, ile;
(2) 중성 친수성: cys, ser, thr;
(3) 산성: asp, glu;
(4) 염기성: asn, gln, his, lys, arg;
(5) 사슬 배향에 영향을 미치는 잔기: gly, pro; 및
(6) 방향족; trp, tyr, phe.
비보존적 치환은 상기 한 종류의 구성 성분을 다른 종류의 것으로 교환시킬 것이다. 또한, 이렇게 치환되는 잔기는 보존적 치환 부위에 도입될 수 있거나 또는 보다 바람직하게는 나머지 (비보존) 부위에 도입될 수 있다.
변이는 올리고뉴클레오티드 매개 (위치 지정 (site-directed)) 돌연변이 유발법, 알라닌 스캐닝법 및 PCR 돌연변이 유발법과 같은 당업계에 공지된 방법을 사용하여 수행될 수 있다. 위치 지정 돌연변이 유발법 (Carter et al.,Nucl. Acids Res.,13:4331 (1986); Zoller et al.,Nucl. Acids Res.,10:6487 (1987)), 카세트 돌연변이 유발법 (Wells et al.,Gene,34:315 (1985)), 제한 선택 돌연변이 유발법 (Wells et al.,Philos. Trans. R. Soc. London SerA,317:415 (1986)) 또는 다른 공지의 기술을 클로닝된 DNA에 실시하여 PRO 변이체 DNA를 제조할 수 있다.
또한, 스캐닝 아미노산 분석법을 사용하여 인접 서열을 따라 하나 이상의 아미노산을 확인할 수 있다. 바람직한 스캐닝 아미노산은 비교적 작은 중성 아미노산이다. 이러한 아미노산은 알라닌, 글리신, 세린 및 시스테인을 포함한다. 통상적으로, 이 중에서 알라닌이 베타-탄소 밖의 측쇄를 제거하고 변이체의 주쇄 형태를 변경시킬 가능성이 적기 때문에 바람직한 스캐닝 아미노산이다 (Cunningham and Wells,Science,244: 1081-1085 (1989)). 또한, 알라닌은 통상적으로 가장 흔한아미노산이기 때문에 바람직하다. 또한, 알라닌은 파묻힌 위치 및 노출된 위치 모두에서 흔히 발견된다 (Creighton,The Proteins, (W.H. Freeman & Co., N.Y.); Chothia,J. Mol. Biol.,150:1 (1976)). 알라닌 치환이 적당한 양의 변이체를 생성시키지 않으면, 동배체 (isoteric) 아미노산을 사용할 수 있다.
C. PRO의 변형
PRO의 공유결합 변형은 본 발명의 범위에 포함된다. 공유결합 변형의 한 형태는 PRO 폴리펩티드의 선택된 측쇄 또는 N-말단 또는 C-말단 잔기와 반응할 수 있는 유기 유도체화제와 PRO 폴리펩티드의 표적 아미노산 잔기를 반응시키는 것을 포함한다. 이관능성 작용제를 사용한 유도체화는 예를 들어 항-PRO 항체 정제 방법에 사용하기 위한 수불용성 지지체 매트릭스 또는 표면에 PRO를 교차결합시키거나 그 반대로 교차결합시키는데 유용하다. 통상 사용되는 교차결합제는 예를 들어 1,1-비스(디아조아세틸)-2-페닐에탄, 글루타르알데히드, N-히드록시숙신이미드 에스테르, 예를 들어 4-아지도살리실산과의 에스테르, 3,3'-디티오비스(숙신이미딜프로피오네이트)와 같은 디숙신이미딜 에스테르를 포함하는 동종이관능성 이미도에스테르, 비스-N-말레이미도-1,8-옥탄과 같은 이관능성 말레이미드 및 메틸-3-[(p-아지도페닐)디티오]프로피오이미데이트와 같은 물질을 포함한다.
다른 변형은 글루타미닐 및 아스파라기닐 잔기의 각각 대응하는 글루타밀 및 아스파르틸 잔기로의 탈아미드화, 프롤린 및 리신의 히드록실화, 세릴 또는 트레오닐 잔기의 히드록실기의 인산화, 리신, 아르기닌 및 히스티딘 측쇄의 알파-아미노기의 메틸화 (T.E. Creighton,Proteins: Structure and Molecular Properties,W.H. Freeman & Co., San Francisco, pp. 79-86 (1983)), N-말단 아민의 아세틸화 및 C-말단 카르복실기의 아미드화를 포함한다.
본 발명의 범위에 포함되는 PRO 폴리펩티드의 공유결합 변형의 다른 형태는 폴리펩티드의 천연 글리코실화 패턴의 변화를 포함한다. 본원의 목적상 "천연 글리코실화 패턴의 변화"는 천연 서열 PRO에서 발견되는 하나 이상의 탄수화물 부분의 결실 (근원적인 글리코실화 부위를 제거하거나 화학적 및(또는) 효소적 방법에 의해 글리코실화를 결실시킴으로써) 및(또는) 천연 서열 PRO에 존재하지 않는 하나 이상의 글리코실화 부위의 부가를 의미한다. 또한, 이 용어는 존재하는 여러 가지 탄수화물 부분의 특성 및 비율의 변화를 비롯한 천연 단백질의 글리코실화에 있어서의 질적 변화를 포함한다.
PRO 폴리펩티드에 대한 글리코실화 부위의 부가는 아미노산 서열을 변화시킴으로써 달성될 수 있다. 변화는 예를 들어 천연 서열 PRO에 하나 이상의 세린 또는 트레오닌 잔기를 부가 또는 치환시켜 이루어질 수 있다 (O-연결 글리코실화 부위의 경우). PRO 아미노산 서열은 경우에 따라, 특히 원하는 아미노산으로 번역되는 코돈이 생성되도록 PRO 폴리펩티드를 코딩하는 DNA를 미리 선택된 염기에서 돌연변이 시킴으로써, DNA 수준에서의 변화를 통해 변화시킬 수 있다.
PRO 폴리펩티드에 존재하는 탄수화물 부분의 수를 증가시키는 다른 방법은 글리코시드를 폴리펩티드에 화학적으로 또는 효소에 의해 커플링시키는 것이다. 이러한 방법은 예를 들어 1987년 9월 11일 공개된 WO 87/05330 및 문헌 (Aplin and Wriston,CRC Crit. Rev. Biochem., pp. 259-306 (1981))에 기재되어 있다.
PRO 폴리펩티드에 존재하는 탄수화물 부분의 제거는 화학적으로 또는 효소에 의해 달성되거나 글리코실화에 대한 표적으로 기능하는 아미노산 잔기를 코딩하는 코돈의 돌연변이에 의한 치환으로 달성될 수 있다. 화학적 탈글리코실화 기술은 당업계에 공지되어 있고, 예를 들어 문헌 (Hakimuddin, et al.,Arch. Biochem. Biophys.,259:52 (1987) 및 Edge et al.,Anal. Biochem.,118:131 (1981))에 기재되어 있다. 폴리펩티드에 존재하는 탄수화물 부분의 효소에 의한 절단은 문헌 (Thotakura et al.,Meth. Enzymol.,138:350 (1987))에 기재된 바와 같이 다양한 엔도글리코시다제 및 엑소글리코시다제를 사용하여 달성할 수 있다.
PRO의 공유결합 변형의 다른 형태는 미국 특허 제4,640,835호, 동 제4,496,689호, 동 제4,301,144호, 동 제4,670,417호, 동 제4,791,192호 또는 동 제4,179,337호에 기재된 방식으로 다양한 비단백질성 중합체, 예를 들어 폴리에틸렌 글리콜 (PEG), 폴리프로필렌 글리콜, 또는 폴리옥시알킬렌 중의 하나에 PRO 폴리펩티드를 연결시키는 것을 포함한다.
또한, 본 발명의 PRO는 다른 이종 폴리펩티드 또는 아미노산 서열에 융합된 PRO를 포함하는 키메라 분자를 형성하는 방식으로 변형될 수도 있다.
한 실시양태에서, 이러한 키메라 분자는 항-태그 항체가 선택적으로 결합할 수 있는 에피토프를 제공하는 태그 폴리펩티드와 PRO의 융합체를 포함한다. 에피토프 태그는 일반적으로 PRO의 아미노-말단 또는 카르복실-말단에 위치한다. 상기 에피토프 태그가 부착된 형태의 PRO의 존재는 태그 폴리펩티드에 대한 항체를 사용하여 검출될 수 있다. 또한, 에피토프 태그를 도입하면 항-태그 항체 또는 에피토프 태그에 결합하는 다른 형태의 친화성 매트릭스를 사용하는 친화성 정제법으로 PRO를 쉽게 정제할 수 있게 된다. 여러 가지 태그 폴리펩티드 및 이들의 각각의 항체는 당업계에 공지되어 있다. 그 예로는 폴리-히스티딘 (폴리-his) 또는 폴리-히스티딘-글리신 (폴리-his-gly) 태그, flu HA 태그 폴리펩티드 및 그의 항체 12CA5 (Field et al.,Mol. Cell. Biol.,8:2159-2165 (1988)), c-myc 태그 및 이에 대한 8F9, 3C7, 6E10, G4, B7 및 9E10 항체 (Evan et al.,Molecular and Cellular Biology,5:3610-3636 (1985)), 및 단순포진 바이러스 당단백질 D (gD) 태그 및 그의 항체 (Paborsky et al.,Protein Engineering,3(6):547-553 (1990)) 등이 있다. 다른 태그 폴리펩티드는 Flag-펩티드 (Hopp et al.,BioTechnology,6:1204-1210 (1988)), KT3 에피토프 펩티드 (Martin et al.,Science,255:192-194 (1992)), 알파-튜불린 에피토프 펩티드 (Skinner et al.,J. Biol. Chem.,266:15163-15166 (1991)) 및 T7 유전자 10 단백질 펩티드 태그 (Lutz-Freyermuth et al.,Proc. Natl. Acad. Sci. USA,87:6393-6397 (1990))를 포함한다.
다른 실시양태에서, 키메라 분자는 PRO와 면역글로불린 또는 면역글로불린의 특정 영역과의 융합체를 포함한다. 키메라 분자의 2 가 형태 ("면역어드헤신"으로 지칭되기도 함)의 경우, 상기 융합체는 IgG 분자의 Fc 영역과의 융합체일 수 있다. 이 Ig 융합체는 바람직하게는 Ig 분자내 하나 이상의 가변성 영역의 자리에 PRO 폴리펩티드의 가용성 (결실 또는 실활화된 막횡단 도메인) 형태가 치환되어 있는 것을 포함한다. 특히 바람직한 실시양태에서, 면역글로불린 융합체는 IgG1 분자의 힌지, CH2 및 CH3, 또는 힌지, CH1, CH2 및 CH3 영역을 포함한다. 면역글로불린융합체를 생산하는 방법으로는, 1995년 6월 27일 공고된 미국 특허 제5,428,130호를 참조한다.
D. PRO의 제조
하기의 설명은 주로 PRO 핵산을 포함하는 벡터로 형질전환 또는 형질감염된 세포를 배양함으로써 PRO를 제조하는 방법에 관한 것이다. 물론, 당업계에 공지된 다른 방법을 사용하여 PRO를 제조할 수도 있다. 예를 들어, PRO 서열 또는 그의 부분들은 고상 기술을 사용하는 직접 펩티드 합성법에 의해 제조될 수 있다 (문헌 (Stewart et al.,Solid-Phase Peptide Synthesis, W.H. Freeman Co., San Francisco, CA (1969); Merrifield,J. Am. Chem. Soc.,85:2149-2154 (1963)) 참조). 시험관 내 단백질 합성은 수동 기술이나 자동화로 수행될 수 있다. 자동 합성법은 예를 들어 Applied Biosystems Peptide Synthesizer (미국 캘리포니아주 포스터시티 소재)를 제조업자의 지시에 따라 사용하여 수행할 수 있다. PRO의 여러 가지 부분들을 개별적으로 화학적 합성한 후, 화학적 또는 효소에 의한 방법으로 조합함으로써 전장 PRO를 제조할 수 있다.
1. PRO를 코딩하는 DNA의 단리
PRO를 코딩하는 DNA는 PRO mRNA를 보유하여 그를 검출가능한 수준으로 발현할 것으로 생각되는 조직으로부터 제조된 cDNA 라이브러리로부터 얻을 수 있다. 그러므로, 하기 실시예에서 설명되는 바와 같이 인간의 조직으로부터 제조된 cDNA 라이브러리로부터 인간 PRO DNA를 편리하게 얻을 수 있다. 또한 게놈 라이브러리나 공지된 합성 방법 (예를 들어, 자동 핵산 합성법)으로 PRO 코딩 유전자를 얻을수도 있다.
라이브러리는 관심 유전자 또는 이 유전자가 코딩하는 단백질을 확인하기 위해 고안된 프로브 (예를 들어 PRO에 대한 항체 또는 약 20 내지 80 개 이상의 염기로 구성된 올리고뉴클레오티드)로 스크리닝될 수 있다. 선택된 프로브를 사용하는 cDNA 또는 게놈 라이브러리의 스크리닝은 예를 들어 문헌 (Sambrook et al.,Molecular Cloning: A Laboratory Manual(New York: Cold Spring Haror Laboratory Press, 1989))에 기재된 바와 같은 표준 방법을 사용하여 수행될 수 있다. PRO를 코딩하는 유전자를 단리하기 위한 또다른 방법은 PCR 방법을 사용하는 것이다 (Sambrook et al.,상기 문헌; Dieffenbach et al.,PCR Primer: A Laboratory Manual(Cold Spring Haror Laboratory Press, 1995)).
하기 실시예는 cDNA 라이브러리를 스크리닝하는 기술을 설명한다. 프로브로서 선택된 올리고뉴클레오티드 서열은 가양성 (flase positive) 결과를 최소화하기 위해서 충분한 길이를 갖고 충분히 분명한 서열이어야 한다. 올리고뉴클레오티드는 스크리닝되는 라이브러리에서 DNA와의 혼성화 즉시 검출될 수 있도록 표지되는 것이 바람직하다. 표지 방법은 당업계에 공지되어 있고,32P 표지된 ATP와 같은 방사선 표지, 비오티닐화 또는 효소 표지의 사용을 포함한다. 중간정도의 엄격도 및 고엄격도를 비롯한 혼성화 조건은 문헌 (Sambrook et al.,상기 문헌)에서 제공된다.
상기 라이브러리 스크리닝 방법에서 확인된 서열을 젠뱅크 (GenBank)와 같은공공 데이타베이스 또는 다른 민간 서열 데이타베이스에 기탁되어 있고 입수가능한 다른 공지된 서열과 비교하여 정렬시킬 수 있다. 분자의 한정된 영역 내 또는 전장 서열에 걸친 서열 동일성 (아미노산 또는 뉴클레오티드 수준에서)은 선행 기술 공지된 방법 및 본원에서 설명된 방법을 이용하여 결정될 수 있다.
단백질 코딩 서열을 갖는 핵산은 먼저 본원에 개시된 추정 아미노산 서열을 사용하여 (또한, 필요하다면 전구체를 검출하기 위해 문헌 (Sambrook et al.,상기 문헌)에 기재된 통상의 프라이머 신장법을 사용) 선택된 cDNA 또는 게놈 라이브러리를 스크리닝하고, cDNA로 역전사되지 않은 mRNA의 중간체를 프로세싱하여 얻을 수 있다.
2. 숙주 세포의 선택 및 형질전환
숙주 세포는 PRO 생산을 위해 본원에 기재된 발현 벡터나 클로닝 벡터로 형질감염 또는 형질전환되고 프로모터 유도, 형질전환체 선택 또는 원하는 서열을 코딩하는 유전자 증폭에 적합하게끔 개질된 통상의 영양 배지 중에서 배양된다. 당업자라면 과도한 시행착오 없이 배지, 온도, pH 등과 같은 배양 조건을 선택할 수 있다. 일반적으로, 세포 배양물의 생산성을 최대화하기 위한 원칙, 프로토콜 및 실시되는 기술은 문헌 (Mammalian Cell Biotechnology: a Practical Approach, M. Butler, ed. (IRL Press, 1991) 및 Sambrook et al.,상기 문헌)에 기재되어 있다.
진핵세포 형질감염 방법 및 원핵세포 형질전환 방법 (예를 들어 CaCl2, CaPO4, 리포솜-매개 방법 및 일렉트로포레이션)은 당업자에게 공지되어 있다. 사용되는 숙주 세포에 따라, 형질전환은 상기 세포에 적합한 표준 기술을 사용하여 수행된다. 문헌 (Sambrook et al.,상기 문헌)에 기재된 바와 같이 염화칼슘을 사용하는 칼슘 처리법 또는 일렉트로포레이션은 통상적으로 원핵세포에 대해 사용된다. 아그로박테리움 투메파시엔스 (Agrobacterium tumefaciens)를 사용한 감염은 문헌 (Shaw et al.,Gene,23:315 (1983) 및 1989년 6월 29일 공개된 WO 89/05859)에 기재된 바와 같이 특정 식물 세포의 형질전환에 사용된다. 상기 세포벽이 없는 포유류 세포의 경우, 문헌 (Graham and van der Eb,Virology,52:456-457 (1978))의 인산칼슘 침전법을 사용할 수 있다. 포유류 세포 숙주 시스템 형질전환의 일반적인 측면은 미국 특허 제4,399,216호에 기재되어 있다. 효모로의 형질전환은 통상적으로 문헌 (Van Solingen et al.,J. Bact.,130:949 (1977) 및 Hsiao et al.,Proc. Natl. Acad. Sci. (USA),76:3829 (1979))의 방법에 따라 수행된다. 그러나, 세포에 DNA를 도입시키기 위한 다른 방법 (예를 들어 핵내 미세주입, 일렉트로포레이션, 온전한 세포와 세균 프로토플라스트의 융합, 또는 고분자 양이온 (polycation) (예를 들어 폴리브렌, 폴리오르니틴))을 사용할 수도 있다. 포유류 세포를 형질전환 시키기 위한 여러 가지 기술에 대해서는 문헌 (Keown et al.,Methods in Enzymology, 185:527-537 (1990) 및 Mansour et al.,Nature, 336:348-352 (1988))을 참조한다.
본원에서 클로닝하거나 벡터 내 DNA를 발현시키기에 적합한 숙주 세포는 원핵세포, 효모 또는 고등 진핵세포이다. 적합한 원핵세포는 진정세균, 예를 들어 그람-음성 또는 그람-양성 생물 (예를 들어 대장균과 같은 엔테로박테리아세애(Enterobacteriaceae))을 포함하지만, 이에 한정되지 않는다. 여러 가지 대장균 균주, 예를 들어 대장균 K12 균주 MM294 (ATCC 31,446), 대장균 X1776 (ATCC 31,537), 대장균 균주 W3110 (ATCC 27,325) 및 K5 772 (ATCC 53,635)는 쉽게 입수가능하다. 다른 적합한 원핵 숙주 세포는 에셔리키아 (Esherichia)와 같은 엔테로박테리아세애, 예를 들어 대장균, 엔테로박터 (Enterobacter), 에르위니아 (Erwinia), 클렙시엘라 (Klebsiella), 프로테우스 (Proteus), 살모넬라 (Salmonella), 예를 들어 살모넬라 티피무리움 (typhimurium), 세라티아 (Serratia), 예를 들어 세라티아 마르세스칸스 (marcescans) 및 시겔라 (Shigella), 및 바실러스 (Bacillus), 예를 들어 비. 서브틸리스 (B.subtilis) 및 비. 리체니포르미스 (B.licheniformis) (예를 들어 1989년 4월 12일자로 공개된 DD 266,710호에 기재된 비. 리체니포르미스 41P), 슈도모나스 (Pseudomonas), 예를 들어 피. 아에루기노사 (P.aeruginosa) 및 스트렙토마이세스 (Streptomyces)를 포함한다. 이러한 예는 설명을 위한 것이며 이에 제한되는 것은 아니다. 균주 W3110은 재조합 DNA 산물 발효를 위한 통상적인 숙주 균주이기 때문에 특히 바람직한 숙주 또는 모 숙주의 하나이다. 바람직하게는, 숙주 세포는 최소량의 단백질 가수 분해 효소를 분비한다. 예를 들어, 균주 W3110을 변형시켜 숙주의 내생성 단백질을 코딩하는 유전자에서 돌연변이가 일어나도록 할 수 있으며, 이러한 숙주의 예는 완전 유전형tonA를 갖는 대장균 W3110 균주 1A2, 완전 유전형tonA ptr3을 갖는 대장균 W3110 균주 9E4, 완전 유전형tonA ptr3 phoA E15 (argF-lac)169 degP ompTkan r 를 갖는 대장균 W3110 균주 27C7 (ATCC 55,244), 완전 유전형tonA ptr3 phoA E15 (argF-lac)169 degP ompT rbs7 ilvG kan r 를갖는 대장균 W3110 균주 37D6, 비-카나마이신 내성degP결실 돌연변이를 갖는 균주 37D6인 대장균 W3110 균주 40B4, 및 1990년 8월 7일자로 공고된 미국 특허 제4,946,783호에 개시된 페리플라즘 프로테아제 돌연변이체를 갖는 대장균 균주를 포함한다. 별법으로, 시험관내 클로닝 방법, 예를 들어 PCR 또는 다른 핵산 중합효소 반응이 적합하다.
원핵세포에 추가로, 섬유상 진균 또는 효모와 같은 진핵 미생물도 PRO를 코딩하는 벡터를 위한 클로닝 또는 발현 숙주로서 적합하다. 사카로마이세스 세레비지애 (Saccharomyces cerevisiae)가 통상 사용되는 하등 진핵 숙주 미생물이다. 다른 미생물에는 시조사카로마이세스 폼베 (Schizosaccharomyces pombe) (Beach and Nurse,Nature, 290: 140 (1989), 1985년 5월 2일 공개된 EP 139,383), 클루이베로마이세스 (Kluyveromyces) 숙주 (미국 특허 제4,943,529호; Fleer et al.,Bio/Technology, 9:968-975 (1991)), 예를 들어 케이. 락티스 (K.lactis) (MW98-8C, CBS683, CBS4574; Louvencourt et al.,J. Baceriol., 154(2):737-742 (1983)), 케이. 프라길리스 (K.fragilis) (ATCC 12,424), 케이. 불가리쿠스 (K.bulgaricus) (ATCC 16,045), 케이. 위케라미 (K.wickeramii) (ATCC 24,178), 케이. 왈티이 (K.waltii) (ATCC 56,500), 케이. 드로소필라룸 (K.drosophilarum) (ATCC 36,906; Van den Berg et al.,Bio/Technology, 8:135 (1990)), 케이. 테르모톨레란스 (K.thermotolerans) 및 케이. 막시아누스 (K.marxianus)); 야로위아(yarrowia) (EP 402,226); 피치아 파스토리스 (Pichia pastoris) (EP 183,070; Sreekrishna et al.,J. Basic Microbiol., 28:265-278 (1988)); 칸디다 (Candida); 트리코데르마 레에시아 (EP 244,234); 뉴로스포라 크라사 (Neurospora crassa) (Case et al.,Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 76:5259-5263 (1979)); 시와니오마이세스 (Schwanniomyces), 예를 들어 시와니오마이세스 옥시덴탈리스 (occidentalis) (1990년 10월 31일 공개된 EP 394,538); 및 섬유상 진균, 예를 들어 뉴로스포라, 페니실리움 (Penicillium), 톨리포클라디움 (Tolypocladium) (1991년 1월 10일 공개된 WO 91/00357) 및 아스퍼길러스 (Aspergillus) 숙주, 예를 들어 에이. 니둘란스 (A.nidulans) (Ballance et al,,Biochem. Biophys. Res. Commun., 112:284-289 (1983); Tilburn et al.,Gene, 26:205-221 (1983); Yelton et al.,Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81: 1470-1474 (1984)) 및 에이. 니게르 (A.niger) (Kelly and Hynes,EMBO J., 4: 475-479 (1985))가 포함된다. 본 발명에서는 메틸 영양 요구성 효모가 적합하고, 한세눌라 (Hansenula), 칸디다, 클로엑케라 (Kloeckera), 피치아, 사카라로마이세스, 토룰롭시스 (Torulopsis) 및 로도토룰라 (Rhodotorula)로 구성되는 속으로부터 선택된, 메탄올 상에서 성장할 수 있는 효모를 포함하나 이에 한정되지 않는다. 이런 클래스의 효모를 예시하는 구체적인 종의 목록을 문헌 (C. Anthony,The Biochemistry of Methylotrophs, 269 (1982))에서 찾을 수 있다.
글리코실화된 PRO의 발현에 적합한 숙주 세포는 다세포 생물로부터 유래한다. 무척추동물 세포의 예는 드로소필라 (Drosophila) S2 및 스포도프테라(Spodoptera) Sf9와 같은 곤충 세포 및 식물 세포를 포함한다. 유용한 포유류 숙주 세포주의 예는 차이니즈 햄스터 난소 (CHO) 세포 및 COS 세포를 포함한다. 보다 구체적인 예는 SV40으로 형질전환된 원숭이 신장 CV1 라인 (COS-7, ATCC CRL 1651), 인간 배아의 신장 라인 (293 세포 또는 현탁 배양액 중에서 성장하도록 서브클로닝된 293 세포, Graham et al.,J. Gen Virol., 36:59 (1997)), 차이니즈 햄스터 난소 세포/-DHFR (CHO, Urlaub and Chasin,Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:4216 (1980)), 마우스 세르톨리 세포 (TM4, Mather,Biol. Reprod., 23:243-251 (1980)), 인간 폐 세포 (W138, ATCC CCL 75), 인간 간세포 (Hep G2, HB 8065) 및 마우스 유방 종양 (MMT 060562, ATCC CCL51)을 포함한다. 당업자라면 적합한 숙주 세포를 용이하게 선택할 수 있다.
3. 복제가능 벡터의 선택 및 사용
PRO를 코딩하는 핵산 (예를 들어, cDNA 또는 게놈 DNA)을 클로닝 (DNA의 증폭) 또는 발현을 위한 복제가능 벡터에 삽입할 수 있다. 여러 가지 벡터들을 쉽게 구할 수 있다. 예를 들어, 벡터는 플라스미드, 코스미드, 바이러스 입자 또는 파지 형태일 수 있다. 적합한 핵산 서열은 다양한 방법으로 벡터 내에 삽입될 수 있다. 일반적으로, 당업계에 공지된 기술을 사용하여 DNA를 적합한 제한 엔도뉴클레아제 부위(들) 내에 삽입한다. 벡터 성분은 일반적으로 하나 이상의 신호 서열, 복제 기점, 하나 이상의 마커 유전자, 인핸서 요소, 프로모터 및 전사 종결 서열을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 상기 성분을 하나 이상 포함하는 적합한 벡터의 제조는 당업자에게 공지된 표준 라이게이션 기술을 사용한다.
PRO는 재조합 방법에 의해 직접 생산될 수 있을 뿐만 아니라 성숙 단백질 또는 폴리펩티드의 N-말단에 특이적 절단 부위를 갖는 다른 폴리펩티드 또는 신호 서열일 수 있는 이종 폴리펩티드와의 융합 폴리펩티드로서 생산될 수도 있다. 일반적으로,신호 서열은 벡터의 성분일 수 있거나 벡터 내로 삽입되는 PRO를 코딩하는 DNA의 일부일 수 있다. 신호 서열은 예를 들어 알칼리 포스파타제, 페니실리나제, lpp 또는 열안정성 엔테로톡신 II 리더로 구성되는 군으로부터 선택되는 원핵생물 신호 서열일 수 있다. 효모 분비를 위해, 신호 서열은 예를 들어 효모 인버타제 리더, α 인자 리더 (사카로마이세스 및 클루이베로마이세스 α-인자 리더 (미국 특허 제5,010,182호)) 또는 산 포스파타제 리더, 씨. 알비칸스 (C. albicans) 글루코아밀라제 리더 (1990년 4월 4일 공개된 EP 362,179) 또는 1990년 11월 15일 공개된 WO 90/13646에 기재된 신호 서열일 수 있다. 포유류 세포 발현에서, 포유류 신호 서열 (예를 들어 동일하거나 관련된 종의 분비 폴리펩티드로부터의 신호 서열 및 바이러스 분비 리더)은 단백질의 분비를 지시하기 위해 사용될 수 있다.
발현 벡터와 클로닝 벡터 모두 그 벡터를 1 종 이상의 선택된 숙주 세포에서 복제가능하게 하는 핵산 서열을 포함한다. 이러한 서열은 다양한 세균, 효모 및 바이러스에 대해 공지되어 있다. 플라스미드 pBR322로부터의 복제 기점은 대개의 그람-음성 세균에 적합하고, 2μ 플라스미드 기점은 효모에 적합하고, 여러 가지 바이러스 기점 (SV40, 폴리오마, 아데노바이러스, VSV 또는 BPV)은 포유류 세포에서 벡터를 클로닝하는데 유용하다.
발현 벡터와 클로닝 벡터는 통상적으로 선택 유전자 (선택가능한 마커라고도불림)를 포함할 것이다. 통상적인 선택 유전자는 (a) 항생제 또는 다른 독소, 예를 들어 앰피실린, 네오마이신, 메토트렉세이트 또는 테트라사이클린에 내성을 부여하는 단백질을 코딩하거나, (b) 영양요구성 결함을 보완하는 단백질을 코딩하거나, 또는 (c) 복합 배지로부터 이용할 수 없는 중요한 영양물질을 공급하는 단백질을 코딩 (예를 들어 바실러스 (Bacillus)의 경우 D-알라닌 라세마제를 코딩하는 유전자)한다.
포유류 세포에 적합한 선택가능한 마커의 예는 PRO를 코딩하는 핵산을 수용할 수 있는 세포 성분의 확인을 가능하게 하는 것, 예를 들어 DHFR 또는 티미딘 키나제이다. 야생형 DHFR이 이용될 경우, 적합한 숙주 세포는 DHFR 활성이 결핍된 CHO 세포주이며, 문헌 (Urlaub et al,Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:4216 (1980))에 기재된 바와 같이 제조되고 증식된다. 효모에서 사용되기에 적합한 선택 유전자는 효모 플라스미드 YRp7에 존재하는 trp1 유전자이다 (Stinchcomb et al.,Nature, 282:39 (1979); Kingsman et al.,Gene, 7:141 (1979); Tschemper et al.,Gene, 10:157 (1980)). trp1 유전자는 트립토판으로의 성장능이 결여된 효모의 돌연변이주 (예를 들어 ATCC 44076 또는 PEP4-1)에 대한 선택 마커를 제공한다 (Jones,Genetics, 85: 12 (1977)).
발현 벡터와 클로닝 벡터는 RNA 합성을 지시하는, PRO를 코딩하는 핵산 서열에 작동가능하게 연결된 프로모터를 포함하는 것이 보통이다. 다양한 잠재적 숙주 세포에 의해 인식되는 프로모터는 공지되어 있다. 원핵생물 숙주에 사용하기 위한 적합한 프로모터는 β-락타마제 및 락토스 프로모터 시스템 (Chang et al.,Nature, 275:615 (1978); Goeddel et al.,Nature, 281:544 (1979)), 알칼리 포스파타제, 트립토판 (trp) 프로모터 시스템 (Goeddel,Nucleic acid Res., 8:4057 (1980); EP 36,776), 및 하이브리드 프로모터, 예를 들어 tac 프로모터 (deBoer et al.,Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 80:21-25 (1983))를 포함한다. 또한, 세균계에서 사용하기 위한 프로모터는 PRO를 코딩하는 DNA에 작동가능하게 연결된 샤인-달가노 (S.D.) 서열도 포함할 것이다.
효모 숙주에 사용하기 위한 적합한 프로모터 서열의 예는 3-포스포글리세레이트 키나제 (Hitzeman et al.,J. Biol. Chem., 255:2073 (1980)) 또는 다른 당분해 효소 (Hess et al.,J. Adv. Enzyme Reg., 7:149 (1968); Holland,Biochemistry, 17:4900 (1978)), 예를 들어 에놀라제, 글리세르알데히드-3-포스페이트 디히드로게나제, 헥소키나제, 피루베이트 디카르복실라제, 포스포프룩토키나제, 글루코스-6-포스페이트 이소머라제, 3-포스포글리세레이트 뮤타제, 피루베이트 키나제, 트리오스포스페이트 이소머라제, 포스포글루코스 이소머라제 및 글루코키나제에 대한 프로모터를 포함한다.
성장 조건에 의해 조절되는 추가의 전사 잇점을 갖는 유도가능한 프로모터인 다른 효모 프로모터는 알코올 디히드로게나제 2, 이소시토크롬 C, 산 포스파타제, 질소 대사에 관련된 분해 효소, 메탈로티오네인, 글리세르알데히드-3-포스페이트 디히드로게나제, 및 말토스와 갈락토스의 이용을 담당하는 효소에 대한 프로모터 영역이다. 효모 발현에 사용하기 위한 적합한 벡터 및 프로모터는 추가로 EP 제73,657호에 기재되어 있다.
포유류 숙주 세포에 있는 벡터의 PRO 전사는 바이러스 (예를 들어 폴리오마 바이러스, 계두 바이러스 (1989년 7월 5일 공개된 UK 2,211,504호), 아데노바이러스 (예를 들어, 아데노바이러스 2), 소 유두종 바이러스, 조류 육종 바이러스, 사이토메갈로바이러스, 레트로바이러스, B형 간염 바이러스 및 원숭이 바이러스 40 (SV40))의 게놈, 이종 포유류 프로모터 (예를 들어 액틴 프로모터 또는 면역글로불린 프로모터), 열-충격 프로모터로부터 얻어진 프로모터들이 숙주 세포계에 적합하다면, 이들 프로모터에 의해 조절된다.
고등 진핵세포에 의한 PRO를 코딩하는 DNA의 전사는 인핸서 서열을 벡터에 삽입함으로써 증가될 수 있다. 인핸서는 DNA의 시스-액팅 요소로서 보통 약 10 내지 300 bp 길이이며 프로모터에 작용하여 그 DNA의 전사를 증가시킨다. 포유류 유전자 (글로빈, 엘라스타제, 알부민, α-페토단백질 및 인슐린)로부터의 많은 인핸서 서열이 현재 알려져 있다. 그러나, 통상적으로 진핵세포 바이러스로부터 유래한 인핸서를 사용할 것이다. 그 예로는 복제 기점 뒷쪽에 있는 SV40 인핸서 (bp 100-270), 사이토메갈로바이러스 초기 프로모터 인핸서, 복제 기점 뒷쪽에 있는 폴리오마 인핸서, 및 아데노바이러스 인핸서가 포함된다. 인핸서는 PRO를 코딩하는 서열의 5' 또는 3' 위치에서 벡터로 스플라이싱될 수 있지만, 프로모터의 5' 부위에 위치하는 것이 바람직하다.
또한, 진핵 숙주 세포 (효모, 진균, 곤충, 식물, 동물, 인간 또는 다른 다세포 생물로부터의 유핵 세포)에 사용되는 발현 벡터는 전사 종결 및 mRNA 안정화에 필요한 서열도 포함할 것이다. 이러한 서열은 공통적으로 진핵세포나 바이러스의DNA 또는 cDNA의 5' 및 때로는 3'의 비번역 영역에서 구할 수 있다. 이들 영역은 PRO를 코딩하는 mRNA의 비번역 부분에서 폴리아데닐화 단편으로 전사되는 뉴클레오티드 세그먼트를 포함한다.
재조합 척추동물 세포 배양에서 PRO의 합성에 적용하기에 적합한 다른 방법, 벡터 및 숙주 세포는 문헌 (Gething et al.,Nature, 293:620-625 (1981); Mantei et al.,Nature, 281:40-46 (1979); EP 117,060 및 EP 117,058)에 기재되어 있다.
4. 유전자 증폭/발현의 검출
유전자 증폭 및(또는) 발현은 예를 들어 통상의 서던 블럿팅, mRNA의 전사를 정량하기 위한 노던 블럿팅 (Thomas,Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:5201-5205 (1980)), 도트 블럿팅 (DNA 분석) 또는 본원에서 제공된 서열을 기초로 적절하게 표지된 프로브를 사용한 계내 혼성화에 의해 시료에서 직접 측정할 수 있다. 별법으로, DNA 이중나선, RNA 이중나선 및 DNA-RNA 혼성 이중나선 또는 DNA-단백질 이중나선를 포함하는 특정 이중나선을 인식할 수 있는 항체를 사용할 수 있다. 그리고 나서, 항체를 표지한 후, 상기 이중나선이 표면에 결합하는 분석법을 수행할 수 있어서, 표면상에 이중나선이 형성되면 이중나선에 결합한 항체의 존재를 검출할 수 있다.
별법으로, 유전자 발현은 세포 또는 조직 절편의 면역조직화학적 염색과 같은 면역학적 방법 및 유전자 산물의 발현을 직접 정량하기 위한 세포 배양물 또는 체액의 분석에 의해 측정할 수 있다. 면역조직화학적 염색 및(또는) 시료 유체의 분석에 유용한 항체는 모노클로날 또는 폴리클로날 항체일 수 있고, 어떤 포유류에서도 제조할 수 있다. 편리하게는, 천연 서열 PRO 폴리펩티드 또는 본원에서 제공되는 DNA 서열을 기초로 한 합성 펩티드 또는 PRO DNA에 융합되고 특정 항체 에피토프를 코딩하는 외인성 서열에 대한 항체를 제조할 수 있다.
5. 폴리펩티드의 정제
여러 형태의 PRO는 배양 배지 또는 숙주 세포 용균물로부터 회수될 수 있다. 막 결합 형태라면, 적절한 세정제 용액 (예를 들어 Triton-X 100)을 사용하거나 효소에 의한 절단으로 막으로부터 방출시킬 수 있다. PRO의 발현에 사용된 세포는 동결-해동 주기, 초음파 처리, 기계적 분쇄 또는 세포 용균제와 같은 여러 가지 물리적 또는 화학적 방법으로 분쇄시킬 수 있다.
재조합 세포 단백질 또는 폴리펩티드로부터 PRO를 정제하고자 할 수 있다. 적합한 정제 방법의 예로는 이온 교환 컬럼 상에서의 분획화, 에탄올 침전법, 역상 HPLC, 실리카 또는 양이온 교환 수지 (예를 들어 DEAE) 상에서의 크로마토그래피, 크로마토포커싱, SDS-PAGE, 황산암모늄 침전법, 예를 들어 Sephadex G-75를 사용하는 겔 여과법, IgG와 같은 오염물질을 제거하기 위한 단백질 A 세파로스 컬럼, 및 PRO의 에피토프 태그가 부착된 형태를 결합시키기 위한 금속 킬레이트 컬럼 등이 있다. 여러 가지 단백질 정제 방법을 사용할 수 있으며, 이러한 방법은 당업계에 공지되어 있으며, 예를 들어 문헌 (Deutscher,Methods in Enzymology, 182 (1990); Scopes,Protein Purification: Principles and Practice, Springer-Verlag, New York (1982))에 기재되어 있다. 선택되는 정제 단계(들)은 예를 들어 사용되는 생산 방법 및 생산되는 특정 PRO의 특성에 따라 결정될 것이다.
E. PRO의 용도
PRO를 코딩하는 뉴클레오티드 서열 (또는 그의 상보체)는 혼성화 프로브로서의 용도를 비롯한 분자생물학 분야, 염색체 및 유전자 맵핑 및 안티센스 RNA 및 DNA의 제조에서 여러 가지 용도를 갖는다. 또한, PRO 핵산은 본원에 기재된 재조합 기술에 의한 PRO 폴리펩티드의 제조에도 유용할 것이다.
전장 천연 서열 PRO 유전자 또는 그의 부분들은 본원에서 개시된 천연 PRO 서열과 원하는 서열 동일성을 갖는 전장 PRO cDNA 또는 다른 cDNA (예를 들어 PRO의 자연 발생 변이체 또는 다른 종으로부터의 PRO를 코딩하는 유전자)를 단리하기 위한 cDNA 라이브러리에 대한 혼성화 프로브로 사용될 수 있다. 경우에 따라, 프로브의 길이는 약 20 내지 약 50 개의 염기일 것이다. 혼성화 프로브는 전장 천연 뉴클레오티드 서열의 적어도 부분적으로는 새로운 영역 (여기서, 이 영역은 과도한 시행착오 없이도 결정할 수 있음) 또는 천연 서열 PRO의 프로모터, 인핸서 성분 및 인트론을 포함하는 게놈 서열로부터 유도될 수 있다. 예를 들면, 스크리닝 방법은 약 40 염기의 선택된 프로브를 합성하기 위해서 공지된 DNA 서열을 사용하여 PRO 유전자의 코딩 영역을 단리하는 것을 포함할 것이다. 혼성화 프로브는32P 또는35S와 같은 방사선 뉴클레오티드 또는 아비딘/비오틴 커플링 시스템을 통하여 프로브에 커플링된 알칼리 포스파타제와 같은 효소 표지를 비롯한 다양한 표지로 표지할 수 있다. 본 발명의 PRO 유전자 서열에 상보적인 서열을 갖는 표지된 프로브는 인간 cDNA, 게놈 DNA 또는 mRNA의 라이브러리를 스크리닝하여 상기 라이브러리의 어떤 구성원에 프로브가 혼성화하는지를 결정하는데 사용될 수 있다. 혼성화 기술은 하기 실시예에서 보다 상세하게 설명된다.
본원에 기재된 어떤 EST 서열도 본원에 기재된 방법을 사용하여 프로브로서 유사하게 사용될 수 있다.
다른 유용한 PRO 핵산의 단편으로는 표적 PRO mRNA (센스) 또는 PRO DNA (안티센스) 서열에 결합할 수 있는 단일-가닥 핵산 서열 (RNA 또는 DNA)을 포함하는 안티센스 또는 센스 올리고뉴클레오티드가 포함된다. 본 발명에 따른 안티센스 또는 센스 올리고뉴클레오티드는 PRO DNA의 코딩 영역의 단편을 포함한다. 이 단편은 일반적으로 약 14 개 이상의 뉴클레오티드, 바람직하게는 약 14 개 내지 30 개의 뉴클레오티드를 포함한다. 주어진 단백질을 코딩하는 cDNA 서열을 기초로하는 안티센스 또는 센스 올리고뉴클레오티드를 유도하는 능력은 예를 들어 문헌 (Stein and Cohen (Cancer Res.48:2659, 1988) 및 van der Krol et al. (BioTechniques6:958, 1988))에 기재되어 있다.
안티센스 또는 센스 올리고뉴클레오티드와 표적 핵산 서열의 결합은 이중나선의 분해 증가, 전사 또는 번역의 조기 종결을 비롯한 여러 방법 중 하나 또는 다른 방법에 의해 표적 서열의 전사 또는 번역을 차단하는 이중나선을 형성시킨다. 따라서, 안티센스 올리고뉴클레오티드를 사용하여 PRO 단백질의 발현을 차단할 수 있다. 또한, 안티센스 또는 센스 올리고뉴클레오티드는 변형된 당-포스포디에스테르 백본 (또는 WO 91/06629에 기재된 것과 같은 다른 당 연쇄)을 갖는 올리고뉴클레오티드를 추가로 포함하며, 여기서 이러한 당 연쇄는 내인성 뉴클레아제에 대한내성이 있다. 내성이 있는 당 연쇄를 갖는 이러한 올리고뉴클레오티드는 생체내 안정하지만 (즉, 효소에 의한 분해에 대해 내성이 있음), 표적 뉴클레오티드 서열과 결합할 수 있는 서열 특이성을 보유한다.
센스 또는 안티센스 올리고뉴클레오티드의 다른 예에는 유기 부분 (예를 들어 WO 90/10048에 개시된 부분), 및 표적 핵산 서열에 대한 올리고뉴클레오티드의 친화성을 증가시키는 다른 잔기 (예를 들어 폴리-(L-라이신))에 공유결합으로 연결된 올리고뉴클레오티드가 포함된다. 또한, 엘립티신과 같은 인터칼레이트제 및 알킬화제 또는 금속 복합체를 센스 또는 안티센스 올리고뉴클레오티드에 연결하여 표적 뉴클레오티드 서열에 대한 안티센스 또는 센스 올리고뉴클레오티드의 결합 특이성을 변화시킬 수 있다.
예를 들어, CaPO4-매개 DNA 형질감염법, 엘렉트로포레이션을 비롯한 임의의 유전자 전달 방법에 의하거나 엡스타인-바르 (Epstein-Barr) 바이러스와 같은 유전자 전달 벡터를 사용함으로써 표적 핵산 서열을 포함하는 세포에 안티센스 또는 센스 올리고뉴클레오티드를 도입할 수 있다. 바람직한 방법은 안티센스 또는 센스 올리고뉴클레오티드를 적합한 레트로바이러스 벡터에 삽입하는 것이다. 표적 핵산 서열을 포함하는 세포를 생체내 또는 생체외에서 재조합 레트로바이러스 벡터와 접촉시킨다. 적합한 레트로바이러스 벡터에는 쥐과 레트로바이러스 M-MuLV, N2 (M-MuLV로부터 유도된 레트로바이러스), 또는 DCT5A, DCT5B 및 DCT5C로 지칭되는 이중 카피 벡터로부터 유도된 벡터가 포함되나 이에 한정되지 않는다 (WO 90/13641 참조).
또한, 센스 또는 안티센스 올리고뉴클레오티드는 WO 91/04753에 개시된 바와 같이 리간드 결합 분자와 접합체를 형성함으로써 표적 뉴클레오티드 서열을 포함하는 세포에 도입될 수도 있다. 적합한 리간드 결합 분자에는 세포 표면 수용체, 성장 인자, 다른 사이토킨, 또는 세포 표면 수용체에 결합하는 다른 리간드가 포함되나 이에 한정되지 않는다. 리간드 결합 분자의 접합이 리간드 결합 분자가 상응하는 분자 또는 수용체와 결합하는 능력을 실질적으로 방해하지 않거나, 또는 센스 또는 안티센스 올리고뉴클레오티드 또는 그의 접합체 형태가 세포내로 진입하는 것을 차단하지 않는 것이 바람직하다.
별법으로, 센스 또는 안티센스 올리고뉴클레오티드는 WO 90/10448에 개시된 바와 같이, 올리고뉴클레오티드-지질 복합체를 형성함으로써 표적 핵산 서열을 포함하는 세포내로 도입될 수 있다. 이러한 센스 또는 안티센스 올리고뉴크레오티드-지질 복합체는 바람직하게는 세포내에서 내인성 리파제에 의해 분리된다.
안티센스 또는 센스 RNA 또는 DNA 분자의 길이는 통상적으로 약 5 염기 이상, 약 10 염기 이상, 약 15 염기 이상, 약 20 염기 이상, 약 25 염기 이상, 약 30 염기 이상, 약 35 염기 이상, 약 40 염기 이상, 약 45 염기 이상, 약 50 염기 이상, 약 55 염기 이상, 약 60 염기 이상, 약 65 염기 이상, 약 70 염기 이상, 약 75 염기 이상, 약 80 염기 이상, 약 85 염기 이상, 약 90 염기 이상, 약 95 염기 이상, 약 100 염기 이상 또는 그 이상이다.
또한, 밀접하게 관련된 PRO를 코딩하는 서열을 확인하기 위한 일군의 서열을 생성하기 위해 상기 프로브를 PCR 기술에서 사용할 수도 있다.
또한, PRO를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 사용하여 PRO를 코딩하는 유전자의 맵핑 및 유전 질환이 있는 개체의 유전자 분석을 위한 혼성화 프로브를 제조할 수도 있다. 본원에서 제공되는 뉴클레오티드 서열은 계내 혼성화, 공지된 염색체 마커에 대한 연쇄 (linkage) 분석 및 라이브러리를 사용한 혼성화 스크리닝과 같이 공지된 기술을 사용하여 염색체 및 염색체의 특정 영역에 맵핑시킬 수 있다.
PRO를 코딩하는 서열이 다른 단백질과 결합하는 단백질을 코딩하는 경우 (예를 들어, PRO가 수용체인 경우), PRO는 이러한 결합 상호작용에 관여하는 다른 단백질 또는 분자를 확인하기 위한 분석에 사용될 수 있다. 이런 방법으로 수용체/리간드 결합 상호작용의 억제제를 확인할 수 있다. 또한, 상기 결합 상호작용에 관여하는 단백질을 사용하여 결합 상호작용의 펩티드 또는 소분자 억제제 또는 아고니스트를 스크리닝할 수도 있다. 또한, 수용체 PRO를 사용하여 서로 관련있는 리간드(들)를 단리할 수도 있다. 천연 PRO 또는 PRO에 대한 수용체의 생물학적 활성을 모방하는 리드 화합물을 발견하도록 스크리닝 분석법을 고안할 수 있다. 이러한 스크리닝 분석법은 화학 물질 라이브러리의 고처리량 스크리닝에 용이하고 이것을 소분자 약물 후보물질의 확인에 특히 적합하게 만들 분석법을 포함할 것이다. 가능한 소분자는 합성 유기 또는 무기 화합물을 포함한다. 상기 분석은 당업계에서 특성화된 단백질-단백질 결합 분석법, 생화학적 스크리닝 분석법, 면역분석법 및 세포 기재 분석법을 비롯한 다양한 포맷으로 수행될 수 있다.
또한, PRO 또는 그의 변형된 형태를 코딩하는 핵산은 유용한 치료제 개발 및 스크리닝에 유용한 트랜스제닉 (transgenic) 동물 또는 "녹아웃 (knock out)" 동물을 만드는데 사용될 수도 있다. 트랜스제닉 동물 (예를 들어 마우스 또는 래트)은 형질도입유전자 (transgene)를 포함하는 세포를 갖는 동물인데, 형질도입유전자는 태아 단계 (예를 들어 배 단계) 때 동물 또는 그 동물의 조상에 도입된다. 형질도입유전자는 세포의 게놈내에 통합되는 DNA이며, 이 세포로부터 트랜스제닉 동물이 발달한다. 한 실시양태에서, PRO를 코딩하는 cDNA를 사용하여 확립된 기술에 따라 PRO를 코딩하는 게놈 DNA를 클로닝할 수 있고, 이 게놈 서열을 사용하여 PRO를 코딩하는 DNA를 발현하는 세포를 포함하는 트랜스제닉 동물을 만들 수 있다. 트랜스제닉 동물 (특히 마우스 또는 래트)을 만드는 방법은 당업계에서 통상적인 방법이며, 예를 들어 미국 특허 제4,736,866호 및 동 제4,870,009호에 기재되어 있다. 통상적으로, 조직 특이적 인핸서를 갖춘 PRO 형질도입유전자를 도입하기 위해서는 특정 세포가 표적이 된다. 배 단계에서 동물의 생식계열에 도입된 PRO를 코딩하는 형질도입유전자 한 카피를 포함하는 트랜스제닉 동물을 사용하여 PRO를 코딩하는 DNA의 발현 증가 효과를 조사할 수 있다. 이러한 동물은 예를 들어 PRO 폴리펩티드의 과다발현과 관련된 병리학적 증상으로부터 보호할 것으로 생각되는 시약에 대한 시험 동물로서 사용될 수 있다. 본 발명의 이러한 측면에 따라, 상기 시약을 동물에 처리하여, 형질도입유전자를 갖는 미처리 동물에 비해 병리학적 증상의 발명이 저하되면, 이는 상기 병리학적 증상에 대한 강력한 치료적 개입을 의미하는 것이다.
별법으로, PRO의 비인간 상동체를 사용하여 PRO를 코딩하는 내인성 유전자와 그 동물의 배아 간세포에 도입된 PRO를 코딩하는 변형된 게놈 DNA 사이의 상동성 재조합의 결과로, 그 동물을 PRO를 코딩하는 결함 또는 변형 유전자를 갖는 PRO "녹아웃" 동물로 만들 수 있다. 예를 들어, PRO를 코딩하는 cDNA를 사용하여 확립된 기술에 따라 PRO를 코딩하는 게놈 DNA를 클로닝할 수 있다. PRO를 코딩하는 게놈 DNA의 일부는 결실되거나, 통합을 모니터링하는데 사용될 수 있는 선택가능한 마커를 코딩하는 유전자와 같은 다른 유전자로 치환될 수 있다. 일반적으로, 수천 개 염기의 비변형된 플랭킹 DNA (5' 및 3' 말단 모두에서)가 벡터에 포함된다 (예를 들어, 상동성 재조합 벡터에 대해서는 문헌 (Thomas and Capecchi,Cell, 51:503 (1987)) 참조). 이 벡터는 배아 간세포주에 도입 (예를 들어 일렉트로포레이션에 의해)되고, 도입된 DNA와 내인성 DNA 사이에 상동성 재조합이 일어난 세포가 선택된다 (예를 들어, 문헌 (Li et al.,Cell, 69:915 (1992)) 참조). 선택된 세포는 이어서 동물 (예를 들어 마우스 또는 래트)의 배반포에 주입되어 응집 키메라를 형성한다 (예를 들어, 문헌 (Bradley, Teratocarcinomas and Embryonic Stem Cells: A Practical Approach, E.J. Robertson, ed. (IRL, Oxford, 1987), pp. 113-152) 참조). 그 다음에, 키메라 배는 적합한 가임신 대리모 동물에 이식될 수 있으며 이 배가 "녹아웃" 동물을 생성하게 된다. 생식 세포내에 상동성 재조합 DNA를 보유하는 프로제니를 표준 기술로 확인할 수 있고 그를 사용하여 모든 세포가 상동성 재조합된 DNA를 포함하는 동물을 육종할 수 있다. 녹아웃 동물은 예를 들어 특정 병리학적 증상에 대한 방어 능력 및 PRO 폴리펩티드의 부재로 인한 병리학적 증상의 발생을 특징으로 할 수 있다.
PRO 폴리펩티드를 코딩하는 핵산은 유전자 치료법에도 사용될 수 있다. 유전자 치료법에 사용될 경우, 유전자는 치료상 유효한 유전자 산물의 생체내 합성을 달성하기 위해 (예를 들면 결함있는 유전자를 대체하기 위해) 세포내로 도입된다. "유전자 치료법"은 단일 처치에 의해 지속 효과가 달성되는 통상적인 유전자 치료법 및 치료상 유효한 DNA 또는 mRNA의 일회 또는 반복 투여를 포함하는 유전자 치료제의 투여를 모두 포함한다. 안티센스 RNA 및 DNA는 특정 유전자의 생체내 발현을 차단하기 위한 치료제로 사용될 수 있다. 세포막에 의한 짧은 안티센스 올리고뉴클레오티드의 흡수가 제한적이어서 이런 올리고뉴클레오티드의 세포내 농도가 낮음에도 불구하고, 이들이 세포내로 들어가 억제제로 작용할 수 있음이 이미 밝혀져 있다 (Zamecnik et al.,Proc. Natl. Acad., Sci. USA83, 4143-4146 (1986)). 이러한 올리고뉴클레오티드를 변형 (예를 들어 이들의 음으로 대전된 포스포디에스테르기를 비대전 기로 치환함)시켜 그 흡수를 증대시킬 수 있다.
핵산을 살아있는 세포로 도입하는데 사용될 수 있는 다양한 기술이 있다. 이 기술은 핵산이 배양된 세포로 시험관내 전달되는가 또는 목적하는 숙주 세포로 생체내 전달되는가에 따라 달라진다. 시험관내 포유류 세포로 핵산을 전달하기에 적합한 기술은 리포솜, 엘렉트로포레이션, 미세주입, 세포 융합, DEAE-덱스트란, 인산칼슘 침전법 등을 포함한다. 생체내 유전자 전이 기술로 현재 바람직한 것으로는 바이러스 (통상 레트로바이러스) 벡터를 사용한 형질감염 및 바이러스 코트 단백질-리포솜 매개 형질감염 등이 있다 (Dzau et al.,Trends in Biotechnology11, 205-210 (1993)). 어떤 경우에는, 표적 세포를 표적화하는 작용제, 예컨대 세포 표면 막 단백질 또는 표적 세포에 특이적인 항체, 표적 세포 상의 수용체에 대한 리간드 등을 핵산 공급원에 제공하는 것이 바람직하다. 리포솜이 사용되는 경우에는, 엔도사이토시스에 관련된 세포 표면 막 단백질과 결합하는 단백질을 사용하여 표적화시키고(거나) 흡수를 촉진시킬 수 있는데, 그러한 단백질의 예로는, 특정 세포 유형에 향성 (向性)이 있는 캡시드 단백질 또는 그의 단편, 순환시 내부화를 경험하는 단백질에 대한 항체, 세포내 위치를 표적화하고 세포내 반감기를 증대시키는 단백질 등이 있다. 수용체 매개 엔도사이토시스 기술은 예를 들면 문헌 (Wu et al.,J. Biol. Chem.262, 4429-4432 (1987), 및 Wagner et al.,Proc. Natl. Acad. Sci. USA87, 3410-3414 (1990))에 기재되어 있다. 유전자 마킹 및 유전자 치료법 프로토콜의 검토를 위해서는, 문헌 (Anderson et al.,Science256, 808-813 (1992))을 참조한다.
본원에 기재된 PRO 폴리펩티드를 단백질 전기영동을 위한 분자량 마커로 사용할 수도 있고, 단리된 핵산 서열을 사용하여 이런 마커를 재조합적으로 발현시킬 수 있다.
본원에 기재된 PRO 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 분자 또는 그의 단편은 염색체의 확인에 유용하다. 이런 점에서, 새로운 염색체 마커를 계속 확인할 필요가 있는데, 이는 실제 서열 데이타를 기초로 하는 이용가능한 염색체 마킹 시약이 현재로서는 비교적 적기 때문이다. 본 발명의 PRO 핵산 분자 각각은 염색체 마커로 사용할 수 있다.
본 발명의 PRO 폴리펩티드 및 핵산 분자는 조직 유형화 (tissue typing)에 사용될 수도 있는데, 여기서 본 발명의 PRO 폴리펩티드는 다른 조직에 비해 한 조직에서 차별적으로 발현될 수 있다. PRO 핵산 분자는 PCR, 노던 분석, 서던 분석 및 웨스턴 분석용 프로브를 생성하는데 사용될 것이다.
본원에 기재된 PRO 폴리펩티드를 치료제로 사용할 수도 있다. 공지된 방법에 따라 본 발명의 PRO 폴리펩티드를 제제화하여 제약상 유용한 조성물을 제조할 수 있는데, 여기서 이 PRO 생성물은 제약상 허용가능한 담체 비히클과의 혼합물에 배합된다. 치료 제제는 원하는 순도를 갖는 활성 성분을 임의의 생리적으로 허용가능한 담체, 부형제 또는 안정화제와 혼합함으로써 동결건조 제제 또는 수용액 형태의 보관용으로 제조된다 (Remington's Pharmaceutical Sciences16th edition, Osol, A. Ed. (1980)). 허용가능한 담체, 부형제 또는 안정화제는 사용되는 투여량과 농도에서 환자에게 무독성이며, 인산염, 시트르산염 및 다른 유기산 등의 완충액, 아스코르브산 등의 항산화제, 저분자량 (약 10 개 미만의 잔기) 폴리펩티드, 혈청 알부민, 젤라틴 또는 면역글로불린 등의 단백질, 폴리비닐피롤리돈 등의 친수성 중합체, 글리신, 글루타민, 아스파라긴, 아르기닌 또는 라이신 등의 아미노산, 글루코스, 만노스, 또는 덱스트린 등의 단당류, 이당류 및 그밖의 탄수화물, EDTA 등의 킬레이트제, 만니톨 또는 소르비톨 등의 당 알콜, 나트륨 등의 염-형성 카운터이온, 및(또는) 트윈 (TWEENTM), 플루로닉스 (PLURONICTM) 또는 PEG 등의 비이온성 계면활성제 등이 있다.
생체내 투여에 사용되는 제제는 멸균처리되어야 한다. 이는 동결건조 및 재용해 (reconstitution) 전 또는 후에 멸균 여과막을 통해 여과시킴으로써 용이하게 수행된다.
본원의 치료 조성물은 일반적으로 멸균 접근 출입구 (access port)가 있는 용기, 예를 들면 정맥내 용액제 백 또는 피하 주사 바늘로 뚫을 수 있는 마개가 있는 바이알에 담을 수 있다.
투여 경로는 공지된 방법, 예를 들면 정맥내, 복강내, 뇌내, 근육내, 안내, 동맥내 또는 병소내 경로에 의한 주사 또는 주입, 국소 투여, 또는 서방계에 의한 방법 등에 따른다.
본 발명의 제약 조성물의 투여량 및 원하는 약물 농도는 계획된 특정 용도에 따라 변할 수 있다. 당업자라면 적합한 투여량 및 투여 경로를 잘 결정할 것이다. 동물 실험 결과는 인간 치료에 효과적인 투여량을 결정하는데 믿을만한 지침을 제공한다. 종 사이의 효과적 투여량 결정은 문헌 (Mordenti, J. and Chappell, W. "The use of interspecies scaling in toxicokinetics" In Toxicokinetics and New Drug Development, Yacobi et al., Eds., Pergamon Press, New York 1989, pp. 42-96)의 원리에 따라 수행될 수 있다.
PRO 폴리펩티드 또는 그의 아고니스트 또는 그의 길항제의 생체내 사용시, 일반적인 투여량은 투여 경로에 따라 좌우되며, 포유류의 체중 1 kg당 약 10 ng 내지 100 mg 이하, 또는 일당으로는 바람직하게는 약 1 ㎍/kg/일 내지 10 mg/kg/일일 수 있다. 특정 투여량 및 전달 방법에 대한 지침은 문헌 (예를 들어 미국 특허제4,657,760호, 동 제5,206,344호 또는 동 제5,225,212호 참조)에 제시되어 있다. 다른 치료 화합물 및 다른 질환에 대해서는 다른 제제가 효과적일 것이며, 한가지 기관 또는 조직을 표적으로 하는 투여는 예를 들어 또다른 기관 또는 조직에 대한 투여와는 다른 방식으로의 전달을 필요로할 것으로 예상된다.
PRO 폴리펩티드의 서방형 투여가 PRO 폴리펩티드의 투여를 필요로 하는 임의의 질병 또는 질환의 치료에 적합한 방출 특성을 갖는 제제에 요구되는 경우, PRO 폴리펩티드의 마이크로캡슐화가 고려된다. 지연 방출을 위한 재조합 단백질의 마이크로캡슐화는 인간 성장 호르몬 (rhGH), 인터페론- (rhIFN-), 인터루킨-2 및 MN rgp120의 경우 성공적으로 수행된 바 있다 (Johnson et al.,Nat. Med., 2:795-799 (1996); Yasuda,Biomed. Ther., 27:1221-1223 (1993); Hora et al.,Bio/Technology, 8:755-758 (1990); Cleland, "Design and Production of Single Immunization Vaccines Using Polyactide Polyglycolide Microsphere Systems," inVaccine Design: The Subunit and Adjuvant Approach, Powell and Newman, eds, (Plenum Press: New York, 1995), pp. 439-462: WO 97/03692, WO 96/40072, WO 96/07399 및 미국 특허 제5,654,010호).
상기 단백질의 서방형 제제는 그의 생체적합성 및 광범위한 생분해성 특성으로 인해, 폴리-락트산-co-글리콜산 (PLGA) 중합체를 사용하여 개발되었다. PLGA의 분해 산물인 락트산 및 글리콜산은 인체내에서 신속하게 제거될 수 있다. 또한, 상기 중합체의 분해능은 그의 분자량 및 조성에 따라 수 개월 내지 수 년으로 조정될 수 있다 (Lewis, "Controlled release of bioactive agents fromlactide/glycolide polymer," in: M. Chasin and R. Langer (Eds.),Biodegradable Polymers as Drug Delivery Systems(Marcel Dekker: New York, 1990), pp. 1-41).
본 발명은 PRO 폴리펩티드를 모방하는 화합물 (아고니스트) 또는 PRO 폴리펩티드의 영향을 방해하는 화합물 (길항제)을 밝혀내기 위한, 화합물들의 스크리닝 방법을 포함한다. 본원에서 확인된 유전자에 의해 코딩된 PRO 폴리펩티드와 결합하거나 복합체를 이루거나, 또는 코딩된 폴리펩티드와 다른 세포내 단백질의 상호작용을 방해하는 화합물을 확인하기위해 길항제 약물 후보물질에 관한 스크리닝 분석법을 고안한다. 이러한 스크리닝 분석법은 화학 물질 라이브러리의 고처리량 스크리닝에 스크리닝에 용이하고 이것을 소분자 약물 후보물질의 확인에 특히 적합하게 만들 분석법을 포함할 것이다.
상기 분석은 당업계에서 특성화된 단백질-단백질 결합 분석법, 생화학적 스크리닝 분석법, 면역분석법 및 세포 기재 분석법을 비롯한 다양한 포맷으로 수행될 수 있다.
길항제에 관한 모든 분석법의 공통점은 상호작용하기에 충분한 조건 및 시간 동안 약물 후보물질와 본원에서 확인된 핵산에 의해 코딩된 PRO 폴리펩티드의 접촉을 요구한다는 점이다.
결합 분석법에서, 상호작용은 결합하는 것이며, 형성된 복합체를 단리하거나 반응 혼합물에서 검출할 수 있다. 특정 실시양태에서, 본원에서 확인된 유전자에 의해 코딩된 PRO 폴리펩티드 또는 약물 후보물질은 공유적 부착 또는 비공유적 부착에 의해 고체상, 예를 들어 마이크로타이터 플레이트에 고정된다. 비공유적 부착은 일반적으로 고체 표면을 PRO 폴리펩티드 용액으로 코팅하고 건조함으로써 달성된다. 별법으로, 고정화 항체, 예를 들어 고정된 PRO 폴리펩티드에 특이적인 모노클로날 항체를 사용하여 그를 고체 표면에 앵커링할 수 있다. 이 분석은 검출가능한 표지로 표지될 수 있는 비고정 성분을 고정 성분, 예를 들어 앵커링된 성분을 포함하는 코딩 표면에 첨가함으로써 수행할 수 있다. 반응이 종결되었을 때, 반응하지 않은 성분은 예를 들어 세척에 의해 제거되며, 고체 표면에 앵커링된 복합체는 검출된다. 본래 고정되지 않은 성분이 검출가능한 표지를 갖고 있는 경우, 표면에 고정된 표지의 검출은 복합화 반응이 일어났음을 의미한다. 본래 고정되지 않은 성분이 표지를 갖고 있지 않는 경우에는 예를 들어 고정된 복합체와 특이적으로 결합하는 표지된 항체를 사용하여 복합화 반응을 검출할 수 있다.
후보 화합물이 본원에서 확인된 유전자에 의해 코딩된 특정 PRO 폴리펩티드와 상호작용하지만 결합하지 않는 경우, 후보 화합물과 이 폴리펩티드의 상호작용은 단백질-단백질 상호작용 검출용으로 잘 알려진 방법으로 분석될 수 있다. 이러한 분석법에는 통상의 방법, 예를 들어 교차형성법, 공동면역침전법, 및 구배 또는 크로마토그래피 컬럼을 통한 공동정제법이 포함된다. 또한, 단백질-단백질 상호작용은 문헌 (Chevray and Nathans,Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:5789-5793 (1991))에 기재된 바와 같이 문헌 (Fields and Song,Nature (London), 340:245-246 (1989); Chien et al.,Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88:9578-9582 (1991))에 기재된 효모 기재 유전자 시스템을 사용하여 모니터링할 수 있다. 많은 전사 활성자 (예를 들어 효모 GAL4)는 물리적으로 구별되는 2 개의 모듈형 도메인으로 이루어져 있는데, 한 도메인은 DNA-결합 도메인으로 작용하고, 나머지 한 도메인은 전사-활성 도메인으로 작용한다. 상기 간행물에 기재된 효모 발현계 (통상적으로, "2-하이브리드계"라고 지칭됨)는 이러한 특성을 활용하며, 2 가지 하이브리드 단백질을 사용하는데, 이 중 하나는 표적 단백질이 GAL4의 DNA-결합 도메인과 융합된 것이며, 다른 하나는 후보 활성 단백질이 활성화 도메인과 융합된 것이다. GAL4-활성 프로모터의 조절하에 GAL1-lacZ 리포터 유전자의 발현은 단백질-단백질 상호작용을 통한 GAL4 활성의 재구성에 따라 좌우된다. 상호작용하는 폴리펩티드를 포함하는 콜로니는 β-갈락토시다제에 대한 색소생산성 기질을 사용하여 검출된다. 2-하이브리드 기술을 사용하여 2 종의 특이적인 단백질사이의 단백질-단백질 상호작용을 확인하는 완성형 키트 (MATCHMAKERTM)는 클론테크사에서 구입할 수 있다. 또한, 이 시스템을 확장하여 특이적 단백질 상호작용에 관여하는 단백질 도메인을 매핑할 수 있을뿐 아니라, 이러한 상호작용에 결정적인 아미노산 잔기의 위치를 정확하게 나타낼 수 있다.
하기의 방법으로, 본원에서 확인된 PRO 폴리펩티드를 코딩하는 유전자와 다른 세포내 또는 세포외 성분의 상호작용을 방해하는 화합물을 시험할 수 있다. 유전자의 산물과 세포내 또는 세포외 성분을 포함하는 반응 혼합물을 두 생성물의 상호작용 및 결합을 허용하는 조건 및 시간하에 제조한다. 후보 화합물의 결합을 저해하는 능력을 시험하기 위해, 시험 화합물의 존재 및 부재하에 반응을 수행한다. 추가로, 양성 대조군 역할을 하는 제3의 반응 혼합물에 위약을 첨가할 수 있다.혼합물에 존재하는 시험 화합물과 세포내 또는 세포외 성분사이의 결합 (복합체 형성)을 상기 기재된 바와 같이 모니터링한다. 대조 반응물에서는 복합체가 형성되나 시험 화합물을 포함하는 반응 혼합물에서는 복합체가 형성되지 않는다는 것은 시험 화합물이 시험 화합물과 그의 반응 대응물의 상호작용을 방해함을 의미한다.
길항제를 분석하기 위해, PRO 폴리펩티드를 화합물과 함께 세포에 첨가하여 특정 활성을 스크리닝할 수 있으며, PRO 폴리펩티드의 존재하에 관심있는 활성을 저해하는 화합물의 능력은 이 화합물이 PRO 폴리펩티드에 대한 길항제임을 의미한다. 별법으로는, 경쟁적 저해 분석을 위해 적절한 조건하에 PRO 폴리펩티드 및 잠재적인 길항제를 막-결합 PRO 폴리펩티드 수용체 또는 재조합 수용체와 함께 결합시킴으로써 길항제를 검출할 수 있다. PRO 폴리펩티드를 예를 들어 방사 활성 동위원소로 표지하여, 수용체와 결합하는 PRO 폴리펩티드 분자의 수를 이용하여 잠재적인 길항제의 효과를 결정할 수 있다. 당업자에게 공지된 여러 방법, 예를 들어 리간드 패닝법 및 FACS 분류법 (Coligan et al.,Current Protocols in Immun., 1(2): Chapter 5 (1991))에 의해 수용체를 코딩하는 유전자를 확인할 수 있다. 바람직하게는, 발현 클로닝법이 사용되는데, 여기서 폴리아데닐화된 RNA는 PRO 폴리펩티드에 대해 반응성인 세포로부터 제조되며, 이 RNA로부터 생성된 cDNA 라이브러리는 푸울 (pool)로 나뉘어져 PRO 폴리펩티드에 대해 비반응성인 COS 세포 또는 다른 세포를 형질감염시키는데 사용된다. 유리 슬라이드에서 성장하는 형질감염된 세포는 표지된 PRO 폴리펩티드에 노출된다. 부위-특이적 단백질 키나제에 관한 인식 부위의 요오드화 또는 봉입화를 비롯한 다양한 방법으로 PRO 폴리펩티드를 표지할 수 있다. 고정화하고 인큐베이션한 다음, 슬라이드를 오토라디오그래피법으로 분석한다. 양성 푸울을 확인하여 서브-푸울을 제조하고, 상호작용 서브-푸울링 및 재스크리닝 방법을 이용하여 재형질감염시킴으로써, 결국 추정적인 수용체를 코딩하는 단일 클론을 산출한다.
수용체를 확인하는 다른 방법으로, 표지된 PRO 폴리펩티드를 세포막 또는 수용체 분자를 발현시키는 추출물 시료에 광친화성-연결을 시킬 수 있다. PAGE로 교차 물질을 분석하고 엑스선 필름에 노출시킨다. 수용체를 포함하는 표지 복합체를 자르고 펩티드 단편으로 분해하여 단백질 마이크로-시퀀싱처리할 수 있다. 마이크로-시퀀싱으로 얻어진 아미노산 서열은 추정적인 수용체를 코딩하는 유전자를 확인하기 위해 cDNA 라이브러리를 스크리닝하기 위한 축퇴 올리고뉴클레오티드 프로브 한 세트를 고안하는데 사용되곤 한다.
다른 길항제 분석 방법으로, 수용체를 발현하는 포유류 세포 또는 막 시료를 표지된 PRO 폴리펩티드와 함께 후보 화합물의 존재하에 인큐베이션하였다. 그 후에, 상기 상호작용을 강화 또는 차단하는 화합물의 능력을 측정할 수 있었다.
잠재적인 길항제의 보다 구체적인 예에는 면역글로불린과 PRO 폴리펩티드의 융합체에 결합하는 올리고뉴클레오티드, 및 특히 폴리- 및 모노클로날 항체, 및 항체 단편, 단쇄 항체, 항-이디오타입 항체, 및 이러한 항체 또는 그의 단편의 키메라 형태 또는 인간화 형태, 및 인간 항체 및 항체 단편을 비롯한 항체가 포함되나 이에 한정되지 않는다. 별법으로, 잠재적인 길항제는 밀접하게 관련된 단백질, 예를 들어 수용체를 인식하지만 영향을 주지는 않으며, 따라서 PRO 폴리펩티드의 작용을 경쟁적으로 저해하는 PRO 폴리펩티드의 변이된 형태일 수 있다.
또다른 잠재적인 PRO 폴리펩티드 길항제는 안티센스 기술을 사용하여 제조된 안티센스 RNA 또는 DNA 구조물인데, 예를 들어 안티센스 RNA 또는 DNA 분자는 표적 mRNA와 혼성화하여 단백질 번역을 방지함으로써 mRNA의 번역을 직접 차단하는 작용을 한다. 안티센스 기술을 사용하여 삼중나선 형성 또는 안티센스 DNA 또는 RNA를 통한 유전자 발현을 조절할 수 있는데, 이 방법들은 모두 폴리뉴클레오티드가 DNA 또는 RNA에 결합하는 것을 기초로 한다. 예를 들어, 본원에서 성숙 PRO 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열의 5' 코딩 부분을 사용하여 염기쌍 약 10 내지 40 개 길이의 안티센스 RNA 올리고뉴클레오티드를 고안한다. DNA 올리고뉴클레오티드를 전사에 관여하는 유전자 영역에 대해 상보적이도록 고안하여 (삼중나선-문헌 (Lee et al.,Nucl. Acids Res., 6:3073 (1979); Cooney et al,,Science, 241:456 (1988); Dervan et al.,Science, 251:1360 (1991)) 참조) 전사 및 PRO 폴리펩티드의 생산을 방지한다. 안티센스 RNA 올리고뉴클레오티드는 생체내에서 그의 mRNA와 혼성화하여 mRNA 분자의 PRO 폴리펩티드로의 번역을 차단한다 (안티센스-Okano,Neurochem., 56:560 (1991);Oligodeoxynucleotides as Antisense Inhibitors of Gene Expression(CRC Press: Boca Raton, FL, 1988)). 또한, 상기 기재된 올리고뉴클레오티드를 세포에 전달하여 안티센스 RNA 또는 DNA를 생체내 발현시킴으로써 PRO 폴리펩티드의 생산을 억제할 수도 있다. 안티센스 DNA가 사용되는 경우, 전사-개시 부위, 예를 들어 표적 유전자 뉴클레오티드 서열의 약 -10 내지 +10 위치로부터 유도된 올리고데옥시리보뉴클레오티드가 바람직하다.
잠재적인 길항제에는 활성 부위, 수용체 결합 부위와 결합하거나, 또는 PRO 폴리펩티드의 성장 인자 또는 다른 관련 결합 부위와 결합하여 PRO 폴리펩티드의 정상적인 생물학적 활성을 차단하는 소분자가 포함된다. 소분자의 예에는 작은 펩티드 또는 펩티드-유사 분자, 바람직하게는 가용성 펩티드, 및 합성 비펩티딜 유기 또는 무기 화합물이 포함되나 이에 한정되지 않는다.
리보자임은 RNA의 특이적인 절단을 촉매할 수 있는 효소 RNA 분자이다. 리보자임은 그와 상보적인 표적 RNA와 서열-특이적 혼성화한 다음, 엔도뉴클레아제성 절단을 함으로써 작용한다. 공지된 기술로 잠재적인 RNA 표적내의 특이적인 리보자임 절단 부위를 확인할 수 있다. 보다 자세한 사항은 문헌 (예를 들어 Rossi,Current Biology, 4:469-471 (1994) 및 PCT 공개 No. WO 97/33551 (1997년 9월 18일 공개))을 참조한다.
전사를 억제하는데 사용되는 삼중나선 형태의 핵산 분자는 단일-가닥이어야하며, 데옥시뉴클레오티드로 구성되어 있어야 한다. 이러한 올리고뉴클레오티드의 염기 조성은 그가 훅스틴 (Hoogsteen) 염기쌍 규칙을 통해 삼중나선 형성을 촉진하게끔 고안되어 있는데, 삼중나선의 형성은 통상적으로 이중나선 중 한 쇄에 상당한 크기의 퓨린 또는 피리미딘 스트레치를 필요로 한다. 보다 자세한 사항은 문헌 (예를 들어 PCT 공개 WO 97/33551, 상기 문헌)을 참조한다.
상기 소분자들은 상기 논의된 한 가지 이상의 스크리닝 분석법 및(또는) 당업자에게 잘 알려진 다른 스크리닝 기술 어느 것에 의해서도 확인될 수 있다.
내인성 비글리칸 단백질의 생물학적 활성과 관련된 생물학적 활성을 갖는 본 발명의 PRO241 폴리펩티드는 치료 목적으로 생체내 사용될 수도 있고 생체외 사용될 수도 있다. 당업자라면 본 발명의 PRO241 폴리펩티드를 상기 목적에 사용하는 방법을 잘 알고 있을 것이다.
코르딘은 독특한 안면부 특징 (낮은 전방 헤어라인, 미모밀생, 비강 기형, 상악돌출증, 긴 인중, '잉어'입), 태아기 및 출생후 성장 지체, 정신 지체 및 항상 그렇지는 않지만 흔히 상지의 기형으로 특성화되는 코르넬리아 드 랑즈 증후군 (Cornelia de Lange Syndrome) (CDL)이라고 알려진 형태장애 증후군에 대한 후보 유전자이다. 또한, CDL이 혈소판감소증과 관련되어 나타나는 드문 경우도 있다. CDL 유전자는 3q26.3 (OMIM #122470)에 연관 (linkage)되어 있는 것으로 맵핑된 바 있다. 제노푸스의 초기 패턴형성 및 신경계 발생에 Xchd가 연관되어 있다는 사실로 인해 CHD는 흥미로운 후보 유전자가 되었다. CHD는 염색체 3의 적합한 영역에 맵핑된다. 이는 THPO와 매우 근접해 있고, THPO와 CHD를 모두 포함하는 결실은 혈소판감소증 및 발생상 기형을 유발하는 드문 경우를 초래할 수 있다. CD의 계내 분석 결과, 거의 모든 성인 조직은 CHD의 발현에 음성이고, 유일한 양성 신호는 대퇴 두부 및 관골구 사이 (고관절)에 나타나는 발생중인 활액 관절 분열선에서만 관찰되는 것으로 보아 CHD의 기능을 발생 및 추정적으로는 긴 뼈의 성장에 관련시킬 수 있다. 상기 기능이 붕괴되면 성장 지체를 초래할 수 있다.
cDNA로부터 예측되는 인간 CHD 아미노산 서열은 Xchd에 50 % 동일성 (및 66 % 보존성)이 있다. 4 개의 시스테인 풍부 도메인에 있는 40 개의 모든 시스테인이보존된다. 상기 시스테인 풍부 도메인은 트롬보스폰딘 (thrombospondin), 프로콜라겐 (procollagen) 및 윌브랜드 인자 (von Willebrand factor)에서 발견되는 것과 유사하다 (Bornstein, P.,FASEB J 6: 3290-3299 (1992) 및 Hunt, L. and Barker, W.,Biochem. Biophys. Res. Commun. 144: 876-882 (1987)).
인간 CHD의 유전자좌 (게놈 PRO243)는 9.6 kb의 게놈 DNA 내에 23 개의 엑손을 포함한다. 개시 메티오닌은 엑손 1에 있고 종료 코돈은 엑손 23에 있다. CpG 도 (island)는 유전자의 5' 말단에 위치하고, 엑손 1의 5'의 약 100 bp 위치에서 시작하여 첫번째 엑손을 통해 신장되다가 첫번째 인트론에서 종료된다. THPO 및 CHD 유전자좌는 서로의 전사 개시 부위가 약 2.2 kb만큼 떨어져 머리와 머리가 마주보는 형태로 형성되어 있다. 단백질 수준에서, PRO243은 제노푸스의 코르딘 (Xchd)에 51 % 동일성이 있다. 1 개의 아미노 말단 및 3 개의 카르복시 말단에 존재하는 시스테인 풍부 클러스터에 존재하는 40 개의 모든 시스테인은 보존되어 있다.
PRO243은 잔기 1 내지 약 23에 신호 서열을 갖고 있는 954 개 아미노산의 폴리펩티드이다. 4 개의 시스테인 클러스터가 있는데, (1) 잔기 약 51 내지 약 125, (2) 잔기 약 705 내지 약 761, (3) 잔기 약 784 내지 약 849, 및 (4) 잔기 약 897 내지 약 931에 위치한다. 잔기 약 315 내지 약 396에 잠재적인 류신 지퍼 (leucine zipper)가 있고, 잔기 217, 351, 365 및 434에 N-글리코실화 부위가 있다.
노치 단백질과 상동성이 있는 PRO299 폴리펩티드 및 그의 부분들은 생체내치료 목적 뿐만 아니라 여러 가지 다른 적용에도 유용할 수 있다. 신규 노치 단백질 및 그와 관련된 분자를 확인하는 것은 발생에 영향을 끼치는 것과 같은 많은 인간 질환과 관련되어 있을 수 있다. 따라서, 신규 노치 단백질 및 노치 유사 분자를 확인하는 것은, 상기 단백질이 다양한 인간 질환의 잠재적인 치료제로 기능할 수 있기 때문에 특히 중요하다. 또한, 상기 폴리펩티드는 생물 공학 및 의학 연구 뿐만 아니라 여러 가지 산업적 적용에서도 중요한 역할을 한다. 결과적으로, PRO299와 같은 신규 분자는 과학적 및 의학적으로 특별한 흥미가 있다.
하나 이상의 내인성 디펩티다제 단백질의 생물학적 활성과 관련된 생물학적 활성을 갖는 본 발명의 PRO323 폴리펩티드는 치료 목적으로 생체내 사용될 수도 있고 생체외 사용될 수도 있다. 당업자라면 본 발명의 PRO323 폴리펩티드를 상기 목적에 사용하는 방법을 잘 알고 있을 것이다.
내인성 프로락틴 수용체 단백질의 생물학적 활성과 관련된 생물학적 활성을 갖는 본 발명의 PRO327 폴리펩티드는 치료 목적으로 생체내 사용될 수도 있고 생체외 사용될 수도 있다. 당업자라면 본 발명의 PRO327 폴리펩티드를 상기 목적에 사용하는 방법을 잘 알고 있을 것이다. 프로락틴과의 결합력을 갖는 PRO327 폴리펩티드는 프로락틴 길항제로서 시험관내 및 생체내 둘다에서 기능할 수 있다.
리덕타제와 상동성이 있는 PRO233 폴리펩티드 및 그의 부분들은 생체내 치료 목적 뿐만 아니라 여러 가지 다른 적용에도 유용할 수 있다. 신규 리덕타제 단백질 및 그와 관련된 분자를 확인하는 것은 염증 질환, 기관의 기능 부전, 아테롬성 동맥경화증, 심장 손상, 불임, 출생 결함, 조기 노화, AIDS, 암, 당뇨 합병증 및통상의 돌연변이와 같은 많은 인간 질환과 관련되어 있을 수 있다. 산소 유리 라디칼 및 산화방지제가 많은 질병 과정에서 중요한 역할을 하는 것으로 보이기 때문에 신규 리덕타제 단백질 및 리덕타제 유사 분자를 확인하는 것은, 상기 단백질이 다양한 인간 질환의 잠재적인 치료제로 기능할 수 있기 때문에 특히 중요하다. 또한, 상기 폴리펩티드는 생물 공학 및 의학 연구 뿐만 아니라 여러 가지 산업적 적용에서도 중요한 역할을 한다. 결과적으로, PRO233와 같은 신규 분자는 과학적 및 의학적으로 특별한 흥미가 있다.
보체 단백질과 상동성이 있는 PRO344 폴리펩티드 및 그의 부분들은 생체내 치료 목적 뿐만 아니라 여러 가지 다른 적용에도 유용할 수 있다. 신규 보체 단백질 및 그와 관련된 분자를 확인하는 것은 면역계 세포의 염증 반응에 영향을 주는 것과 같은 많은 인간 질환과 관련되어 있을 수 있다. 따라서, 신규 보체 단백질 및 보체 유사 분자를 확인하는 것은, 상기 단백질이 다양한 인간 질환의 잠재적인 치료제로 기능할 수 있기 때문에 특히 중요하다. 또한, 상기 폴리펩티드는 생물 공학 및 의학 연구 뿐만 아니라 여러 가지 산업적 적용에서도 중요한 역할을 한다. 결과적으로, PRO344와 같은 신규 분자는 과학적 및 의학적으로 특별한 흥미가 있다.
시스테인 풍부 분비 단백질의 생물학적 활성과 관련된 생물학적 활성을 갖는 본 발명의 PRO347 폴리펩티드는 치료 목적으로 생체내 사용될 수도 있고 생체외 사용될 수도 있다. 당업자라면 본 발명의 PRO347 폴리펩티드를 상기 목적에 사용하는 방법을 잘 알고 있을 것이다.
인터-알파-트립신 억제제 단백질 중쇄의 생물학적 활성과 관련된 생물학적 활성을 갖는 본 발명의 PRO354 폴리펩티드는 치료 목적으로 생체내 사용될 수도 있고 생체외 사용될 수도 있다. 당업자라면 본 발명의 PRO354 폴리펩티드를 상기 목적에 사용하는 방법을 잘 알고 있을 것이다.
CRTAM과 상동성이 있는 PRO355 폴리펩티드 및 그의 부분들은 생체내 치료 목적 뿐만 아니라 여러 가지 다른 적용에도 유용할 수 있다. T 세포와 관련된 신규 분자를 확인하는 것은 통상의 면역계와 관계된 증상과 같은 많은 인간 질환과 관련되어 있을 수 있다. CRTAM 단백질이 많은 질병 과정에서 중요한 역할을 하는 항체에 결합하기 때문에, 신규 CRTAM 단백질 및 CRTAM 유사 분자를 확인하는 것은, 상기 단백질이 다양한 인간 질환의 잠재적인 치료제로 기능할 수 있기 때문에 특히 중요하다. 또한, 상기 폴리펩티드는 생물 공학 및 의학 연구 뿐만 아니라 여러 가지 산업적 적용에서도 중요한 역할을 한다. 결과적으로, PRO355와 같은 신규 분자는 과학적 및 의학적으로 특별한 흥미가 있다.
PRO357은 ALS와의 경쟁적 결합 분석에 사용되어 ALS에 대한 활성을 측정할 수 있다. 게다가, PRO357은 PRO357과 복합체를 형성할 수 있는 폴리펩티드를 연장시켜 더 긴 생체내 반감기를 갖게 하는 지를 측정하기 위한 분석에 사용될 수 있다. PRO357은 역시 상동성을 갖는 카르복시펩티다제와의 분석에 유사하게 사용될 수 있다. 결과는 그에 알맞게 적용될 수 있다.
단백질 중 종양 괴사 인자족의 생물학적 활성과 관련된 생물학적 활성을 갖는 본 발명의 PRO715 폴리펩티드는 치료 목적으로 생체내 사용될 수도 있고 생체외사용될 수도 있다. 당업자라면 본 발명의 PRO715 폴리펩티드를 상기 목적에 사용하는 방법을 잘 알고 있을 것이다. PRO715 폴리펩티드는 자신의 특이적 수용체와 결합하여 그 수용체를 활성화시킬 것으로 기대될 것이다. 본 발명의 PRO715 폴리펩티드의 변형체는 그의 특이적 수용체 활성에 대한 아고니스트 또는 길항제로 기능할 수 있다.
보체 단백질과 상동성이 있는 PRO353 폴리펩티드 및 그의 부분들은 생체내 치료 목적 뿐만 아니라 여러 가지 다른 적용에도 유용할 수 있다. 신규 보체 단백질 및 그와 관련된 분자를 확인하는 것은 면역계 세포의 염증 반응에 영향을 주는 것과 같은 많은 인간 질환과 관련되어 있을 수 있다. 따라서, 신규 보체 단백질 및 보체 유사 분자를 확인하는 것은, 상기 단백질이 다양한 인간 질환의 잠재적인 치료제로 기능할 수 있기 때문에 특히 중요하다. 또한, 상기 폴리펩티드는 생물 공학 및 의학 연구 뿐만 아니라 여러 가지 산업적 적용에서도 중요한 역할을 한다. 결과적으로, PRO353와 같은 신규 분자는 과학적 및 의학적으로 특별한 흥미가 있다.
뮤신 및(또는) 키티나제 단백질과 상동성이 있는 PRO361 폴리펩티드 및 그의 부분들은 생체내 치료 목적 뿐만 아니라 여러 가지 다른 적용에도 유용할 수 있다. 신규 뮤신 및(또는) 키티나제 단백질 및 그와 관련된 분자를 확인하는 것은 암 또는 세포 표면의 분자 또는 수용체와 관련된 질병과 같은 많은 인간 질환과 관련되어 있을 수 있다. 따라서, 신규 뮤신 및(또는) 키티나제 단백질을 확인하는 것은, 상기 단백질이 다양한 인간 질환의 잠재적인 치료제로 기능할 수 있기 때문에 특히중요하다. 또한, 상기 폴리펩티드는 생물 공학 및 의학 연구 뿐만 아니라 여러 가지 산업적 적용에서도 중요한 역할을 한다. 결과적으로, PRO361와 같은 신규 분자는 과학적 및 의학적으로 특별한 흥미가 있다.
인간 2-19 단백질과 상동성이 있는 PRO365 폴리펩티드 및 그의 부분들은 생체내 치료 목적 뿐만 아니라 여러 가지 다른 적용에도 유용할 수 있다. 신규 인간 2-19 단백질 및 그와 관련된 분자를 확인하는 것은 면역계 세포의 결합 또는 활성을 변화시키는 것과 같은 많은 인간 질환과 관련되어 있을 수 있다. 따라서, 신규 인간 2-19 단백질 및 인간 2-19 단백질 유사 분자를 확인하는 것은, 상기 단백질이 다양한 인간 질환의 잠재적인 치료제로 기능할 수 있기 때문에 특히 중요하다. 또한, 상기 폴리펩티드는 생물 공학 및 의학 연구 뿐만 아니라 여러 가지 산업적 적용에서도 중요한 역할을 한다. 결과적으로, PRO365와 같은 신규 분자는 과학적 및 의학적으로 특별한 흥미가 있다.
F. 항-PRO 항체
본 발명은 항-PRO 항체를 추가로 제공한다. 항체의 예로는 폴리클로날, 모노클로날, 인간화, 이중특이적 및 이종접합 (heteroconjugate) 항체가 포함된다.
1. 폴리클로날 항체
항-PRO 항체는 폴리클로날 항체를 포함할 수 있다. 폴리클로날 항체의 제조 방법은 당업자에게 공지되어 있다. 폴리클로날 항체는 예를 들어 면역화제 및 필요한 경우 아쥬반트를 포유류에 1 회 이상 주사함으로써 생성시킬 수 있다. 통상적으로, 면역화제 및(또는) 아쥬반트를 피하 또는 복강내로 여러 번 포유류에 주사할 것이다. 면역화제는 PRO 폴리펩티드 또는 그의 융합 단편을 포함할 수 있다. 면역처리되는 포유류에 면역원성인 것으로 공지된 단백질에 면역화제를 접합시키는 것이 유용할 수 있다. 상기 면역원성 단백질의 예로는 키홀 림펫 헤모시아닌, 혈청 알부민, 소 티로글로불린 및 대두 트립신 억제제를 포함하지만, 이에 한정되지 않는다. 사용될 수 있는 아쥬반트의 예로는 프로인트 (Freund's) 완전 아쥬반트 및 MPL-TDM 아쥬반트 (모노포스포릴 지질 A, 합성 트레할로스 디코리노미콜레이트)가 포함된다. 당업자라면 과도한 시행착오 없이 면역화 프로토콜을 선택할 수 있다.
2. 모노클로날 항체
별법으로, 항-PRO 항체는 모노클로날 항체일 수 있다. 모노클로날 항체는 문헌 (Kohler and Milstein,Nature,256:495 (1975))에 기재된 바와 같은 하이브리도마 방법을 사용하여 제조될 수 있다. 하이브리도마 방법에서, 마우스, 햄스터 또는 다른 적절한 숙주 동물을 통상적으로 면역화제로 면역화시켜 면역화제에 특이적으로 결합할 항체를 생산하거나 생산할 수 있는 림프구를 유도한다. 별법으로, 림프구를 시험관내 면역화시킬 수 있다.
면역화제는 통상적으로 PRO 폴리펩티드 또는 그의 융합 단백질을 포함할 것이다. 통상적으로, 말초 혈액 림프구 ("PBL")를 사용하거나 (인간 기원의 세포를 원할 경우), 비장 세포 또는 림프절 세포를 사용 (비인간 포유류 공급원을 원할 경우)한다. 이어서, 폴리에틸렌 글리콜과 같은 적합한 융합제를 사용하여 림프구와 불멸화된 세포주를 융합시켜 하이브리도마 세포를 형성시킨다 (Goding,MonoclonalAntibodies: Principle and Practice, Academic Press, (1986) pp. 59-103). 불멸화된 세포주는 보통 형질전환된 포유류 세포, 특히 설치류, 소 및 인간 기원의 골수종 세포이다. 통상적으로 래트 또는 마우스 골수종 세포주가 사용된다. 하이브리도마 세포는 바람직하게는 비융합된 불멸화된 세포의 성장 또는 생존을 저해하는 1 종 이상의 물질을 포함하는 적합한 배양 배지에서 배양될 수 있다. 예를 들면, 모세포가 히포크잔틴 구아닌 포스포리보실 트랜스퍼라제 (HGPRT 또는 HPRT) 효소가 결핍된 경우, 하이브리도마용 배양 배지는 통상적으로 히포크잔틴, 아미노프테린 및 티미딘 ("HAT 배지")을 포함할 것이며, 이들 물질은 HGPRT-결핍 세포의 성장을 억제시킨다.
바람직한 불멸화된 세포주는 효율적으로 융합되고, 선택된 항체-생산 세포에 의한 항체의 높은 수준의 안정한 생산을 지지하며, HAT 배지와 같은 배지에 감수성이 있는 것이다. 보다 바람직한 불멸화된 세포주는 예를 들어 솔크 인스티튜트 셀 디스트리뷰션 센터 (Salk Institute Cell Distribution Center, 미국 캘리포니아주 샌디에고) 및 아메리칸 타입 컬쳐 컬렉션 (American Type Culture Collection, 미국 버지니아주 만사스)으로부터 입수가능한 쥐과 골수종 세포주이다. 또한, 인간 모노클로날 항체의 생산을 위한 인간 골수종 세포주 및 마우스-인간 헤테로골수종 세포주도 기술되어 있다 (Kozbor,J. Immunol., 133: 3001 (1984); 및 Brodeur et al.,Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, Marcel Dekker, Inc., New York, (1987) pp. 51-63).
하이브리도마 세포가 배양된 배양 배지가 PRO에 대해 지시된 모노클로날 항체의 존재에 대해 분석될 수 있다. 바람직하게는, 하이브리도마 세포에 의해 생산된 모노클로날 항체의 결합 특이성을 면역침강법으로, 또는 방사선면역분석법 (RIA) 또는 효소 결합 면역 흡수 분석법 (ELISA)과 같은 시험관내 결합 분석법으로 측정한다. 이러한 기술 및 분석법은 당업계에 공지되어 있다. 모노클로날 항체의 결합 친화성은 예를 들어 스캐차르드 (Scatchard) 분석법 (Munson and Pollard,Anal. Biochem.,107:220 (1980))으로 결정될 수 있다.
원하는 하이브리도마 세포를 확인한 후, 클론을 제한희석법으로 서브클로닝하고 표준 방법 (Goding,상기문헌)으로 배양할 수 있다. 이러한 목적에 적합한 배양 배지는 예를 들면, Dulbecco's Modified Eagle's Medium 및 RPMI-1640 배지를 포함한다. 별법으로, 하이브리도마 세포를 포유류에서 생체내 복수 (腹水)로 배양할 수 있다.
서브클론에 의해 분비된 모노클로날 항체는 예를 들면, 단백질 A-세파로스 (Sepharose), 히드록실아파티트 크로마토그래피, 겔 전기영동, 투석 또는 친화성 크로마토그래피와 같은 통상적인 면역글로불린 정제법에 의해 배양 배지 또는 복수액으로부터 단리되거나 정제될 수 있다.
또한, 모노클로날 항체는 미국 특허 제4,816,567호에 기재된 것과 같은 재조합 DNA 방법에 의해 제조할 수 있다. 본 발명의 모노클로날 항체를 코딩하는 DNA는 통상적인 방법를 이용하여 (예를 들면, 쥐과 동물 항체의 중쇄 및 경쇄를 코딩하는 유전자에 특이적으로 결합할 수 있는 올리고뉴클레오티드 프로브를 이용함) 쉽게 단리하고 서열 분석할 수 있다. 본 발명의 하이브리도마 세포는 그러한 DNA의 바람직한 공급원으로 작용한다. 일단 단리하면, DNA를 발현 백터 내로 넣을 수 있고, 그 다음에 이것을 별도로 면역글로불린 단백질을 생산하지 않는 원숭이 COS 세포, 차이니즈 햄스터 난소 (CHO) 세포, 또는 골수종 세포와 같은 숙주 세포에 형질감염시켜 재조합 숙주 세포에서 모노클로날 항체를 합성시킬 수 있다. 또한, 예를 들어 상동성 쥐과 동물 서열 대신에 인간 중쇄 및 경쇄 불변 도메인에 대한 코딩 서열을 치환하거나 (미국 특허 제4,816,567호; Morrison et al.,상기 문헌), 또는 비-면역글로불린 폴리펩티드에 대한 코딩 서열의 전체 또는 일부를 면역글로불린 코딩 서열에 공유 결합시켜 DNA를 변형시킬 수도 있다. 이러한 비-면역글로불린 폴리펩티드를 본 발명의 항체의 불변 도메인에 대해 치환시키거나, 본 발명의 항체의 한 항체-결합 부위의 가변 도메인에 대해 치환시켜 키메라 2 가 항체를 생성시킬 수 있다.
항체는 1 가 항체일 수 있다. 1 가 항체를 제조하는 방법은 당업계에 공지되어 있다. 예를 들어 한 방법은 면역글로불린 경쇄 및 변형된 중쇄의 재조합 발현을 포함한다. 중쇄는 중쇄 교차결합을 방지하기 위해 일반적으로 Fc 영역 임의의 지점에서 말단이 절단된다. 별법으로, 관련 시스테인 잔기는 교차결합을 방지하기 위해서 다른 아미노산 잔기로 치환되거나 결실된다.
또한, 시험관내 방법도 1 가 항체의 제조에 적합하다. 항체 단편, 특히 Fab 단편을 제조하기 위한 항체의 절단은 당업계에 공지된 통상적인 기술을 사용하여 수행될 수 있다.
3. 인간 항체 및 인간화 항체
본 발명의 항-PRO 항체는 인간화 항체 또는 인간 항체를 추가로 포함할 수 있다. 비인간 (예를 들어, 쥐과 동물) 항체의 인간화 형태는 키메라 면역글로불린, 비인간 면역글로불린으로부터 유래한 최소 서열을 포함하는 면역글로불린 사슬 또는 그의 단편 (예를 들어, Fv, Fab, Fab', F(ab')2또는 항체의 다른 항원 결합 서브서열)이다. 인간화 항체는, 수용체의 상보성 결정 영역 (CDR)의 잔기를 원하는 특이성, 친화성 및 능력을 갖는 마우스, 래트 또는 토끼와 같은 비인간 종 (공여 항체)의 CDR의 잔기로 치환시킨 인간 면역글로불린 (수용 항체)을 포함한다. 몇몇 경우에, 인간 면역글로불린의 Fv 프레임워크 잔기는 대응하는 비인간 잔기로 치환된다. 또한, 인간화 항체는 수용 항체 또는 도입되는 CDR 또는 프레임워크 서열 어느 것에서도 발견되지 않는 잔기를 포함할 수도 있다. 일반적으로, 인간화 항체는 하나 이상, 일반적으로 둘 이상의 가변 도메인을 실질적으로 모두 포함할 것이며, 여기서 모든 또는 실질적으로 모든 CDR 영역이 비인간 면역글로불린의 영역에 대응하고 모든 또는 실질적으로 모든 FR 영역이 인간 면역글로불린 컨센서스 서열의 영역에 대응한다. 또한, 인간화 항체는 경우에 따라 면역글로불린 불변 영역 (Fc), 일반적으로 인간 면역글로불린의 불변 영역의 적어도 일부를 포함할 것이다 (Jones et al.,Nature,321: 522-525 (1986); Riechmann et al.,Nature,332: 323-327 (1988); 및 Presta,Curr. Op. Struct. Biol. 2:593-596 (1992)).
비인간 항체를 인간화하는 방법은 당업계에 잘 알려져 있다. 일반적으로, 인간화 항체는 비인간 기원으로부터의 그에 도입된 하나 이상의 아미노산 잔기를갖는다. 이들 비인간 아미노산 잔기는 종종 "임포트 (import)" 잔기라고 불리며, 통상적으로 "임포트" 가변 도메인으로부터 얻어진다. 인간화는 본질적으로 윈터 (Winter) 등의 방법 (Jones et al.,Nature,321: 522-525 (1986); Riechmann et al.,Nature,332: 323-327 (1988); Verhoeyen et al.,Science,239: 1534-1536 (1988))을 사용하여 설치류 CDR 또는 CDR 서열로 인간 항체의 대응하는 서열을 치환함으로써 수행될 수 있다. 따라서, 그러한 "인간화" 항체는 실질적으로 보다 적은 무손상 인간 가변 도메인이 비인간 종의 대응하는 서열로 치환된 키메라 항체 (미국 특허 제4,816,567호)이다. 실제로, 인간화 항체는 통상적으로 일부 CDR 잔기 및 가능하게는 일부 FR 잔기가 설치류 항체의 유사 부위의 잔기로 치환된 인간 항체이다.
인간 항체는 파지 디스플레이 라이브러리를 비롯한 당업계에 공지된 여러 가지 기술을 사용하여 제조할 수도 있다 (Hoogenboom et al.,J. Mol. Biol.,227: 381 (1991); Marks et al.,J. Mol. Bio.,222: 581-597 (1991)). 또한, 코울 (Cole) 등 및 보에르너 (Boerner) 등의 기술도 인간 모노클로날 항체의 제조에 사용할 수 있다 (Cole et al.,Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, p. 77 (1985); 및 Boerner et al.,J. Immunol.,147(1):86-95 (1991)). 유사하게, 내인성 면역글로불린 유전자가 부분적으로 또는 전체적으로 불활성화된 트랜스제닉 동물 (예를 들어 마우스)에 인간 면역글로불린 유전자좌를 도입하여 인간 항체를 제조할 수 있다. 항원투여 후, 유전자 재배열, 어셈블리 및 항체 목록을 비롯한 모든 면이 인간에서 관찰되는 바와 매우 유사한 인간 항체 생산이 관찰된다. 상기 사항은 문헌 (예를 들어 미국 특허 제5,545,807호, 동 제5,545,806호, 동 제5,569,825호, 동 제5,625,126호, 동 제5,633,425호, 동 5,661,016호 및 과학 간행물 (Marks et al.,Bio/Technology 10, 779-783 (1992); Lonberg et al.,Nature 368, 856-859 (1994), Morrison,Nature 368, 812-13 (1994); Fishwild et al.,Nature Biotechnology 14, 845-51 (1996); Neuberger,Nature Biotechnology 14, 826 (1996); Lonberg and Huszar,Intern. Rev. Immunol. 1365-93 (1995)))에 기재되어 있다.
4. 이중특이적 항체
이중특이적 항체는 2 개 이상의 상이한 항원에 대해 결합 특이성을 갖는 모노클로날, 바람직하게는 인간 또는 인간화 항체이다. 이 경우에, 결합 특이성 중 하나는 PRO에 대한 것이고, 다른 하나는 임의의 다른 항원, 바람직하게는 세포 표면 단백질 또는 수용체 또는 수용체 서브유닛에 대한 것이다.
이중특이적 항체의 제조 방법은 당업계에 공지되어 있다. 통상적으로, 이중특이적 항체의 재조합 생산은 2 개의 면역글로불린 중쇄/경쇄 쌍의 동시발현에 기초하며, 여기에서, 2 개의 중쇄는 상이한 특이성을 갖는다 (Millstein and Cuello,Nature,305: 537-539 (1983)). 면역글로불린 중쇄 및 경쇄의 랜덤 분류로 인해, 이들 하이브리도마 (쿼드로마)는 10 가지의 상이한 항체 분자 혼합물이 가능하며, 이 중 하나만이 올바른 이중특이적 구조를 갖는다. 올바른 분자의 정제는 통상적으로 친화성 크로마토그래피 단계로 수행된다. 유사한 방법이 문헌 (1993년 5월 13일 공개된 WO 제93/08829호, 및 Traunecker et al.,EMBO J., 10: 3655-3659(1991))에 기재되어 있다.
원하는 결합 특이성을 갖는 항체 가변 도메인 (항체-항원 결합 부위)을 면역글로불린 불변 도메인 서열에 융합시킬 수 있다. 이 융합은 바람직하게는 적어도 힌지의 일부와, CH2 및 CH3 영역을 포함하는 면역글로불린 중쇄 불변 도메인과의 융합이다. 경쇄 결합에 필요한 부위를 포함하는 제1 중쇄 불변 영역 (CH1)이 적어도 하나의 융합체에 존재하는 것이 바람직하다. 면역글로불린 중쇄 융합체, 및 필요하다면 면역글로불린 경쇄를 코딩하는 DNA를 별개의 발현 벡터에 삽입하고, 적당한 숙주 생물에 동시형질감염시킨다. 이중특이적 항체를 생산하기 위한 보다 상세한 내용은 문헌(예를 들면, Suresh et al.,Methods in Enzymmology,121: 210 (1986))을 참조한다.
WO 96/27011에 개시된 다른 방법에 따르면, 한 쌍의 항체 분자사이의 인터페이스를 조작하여 재조합 세포 배양물로부터 회수되는 헤테로다이머의 백분율을 최대화할 수 있다. 바람직한 인터페이스는 적어도 항체 불변 도메인의 CH3 영역의 일부를 포함한다. 이 방법에서, 제1 항체 분자 인터페이스로부터 1 개 이상의 작은 아미노산 측쇄를 보다 큰 측쇄 (예를 들어, 티로신 또는 트립토판)로 대체한다. 큰 아미노산 측쇄를 좀더 작은 것 (예를 들어, 알라닌 또는 트레오닌)으로 대체함으로써 큰 측쇄(들)과 동일하거나 유사한 크기의 보충적 "공동 (cavity)"이 제2 항체 분자의 인터페이스에 생성된다. 이는 헤테로다이머의 수율을 호모다이머와 같은 다른 원치 않는 최종-생성물보다 높게 증가시키는 메카니즘을 제공한다.
이중특이적 항체는 전장 항체 또는 항체 단편 (예를 들어, F(ab')2이중특이적 항체)으로 제조될 수 있다. 항체 단편으로부터 이중특이적 항체를 제조하는 기술은 문헌에 기재되어 있다. 예를 들어, 화학적 결합을 사용하여 이중특이적 항체를 제조할 수 있다. 문헌 (Brennan et al.,Science229:81 (1985))에는 무손상 항체를 단백질 가수분해로 절단하여 F(ab')2단편을 생성하도록 하는 방법이 기재되어 있다. 이러한 단편은 디티올 착화제인 소듐 아르세니트의 존재하에 환원되어 근처 디티올을 안정화시키고 분자간의 디술피드 형성을 방지한다. 그 후에, 생성된 Fab' 단편을 티오니트로벤조에이트 (TNB) 유도체로 전환시킨다. 그 후에, Fab'-TNB 유도체 중 하나를 머캅토에틸아민으로 환원시켜 Fab'-티올로 재전환시키고 동몰량의 다른 Fab'-TNB 유도체와 혼합하여 이중특이적 항체를 형성시킨다. 생성된 이중특이적 항체는 효소의 선택적 고정화를 위한 물질로 사용될 수 있다.
대장균으로부터 Fab' 단편을 직접 회수하여 화학적으로 커플링시켜 이중특이적 항체를 형성시킬 수 있다. 문헌 (Shalaby et al.,J. Exp. Med.175:217-225 (1992))에는 완전한 인간화 이중특이적 항체 F(ab')2분자가 개시되어 있다. 각각의 Fab' 단편은 대장균으로부터 별도로 분비되었으며 지시된 시험관내 화학적 커플링으로 이중특이적 항체를 형성하였다. 이와 같이 형성된 이중특이적 항체는 ErbB2 수용체를 과다발현하는 세포 및 정상적인 인간 T 세포와 결합할 수 있을 뿐 아니라, 인간 유방 종양 표적에 대한 인간 세포독성 림프구의 용균 활성을 촉발시킬 수 있었다.
또한, 재조합 세포 배양물로부터 직접 이중특이적 항체 단편을 만들고 단리하는 여러 가지 기술도 개시되어 있다. 예를 들면, 이중특이적 항체는 류신 지퍼를 사용하여 제조되었다 (Kostelny et al.,J. Immunol. 148(5):1547-1553 (1992)). Fos 및 Jun 단백질로부터의 류신 지퍼 펩티드를 2 종의 상이한 항체의 Fab' 부분에 유전자 융합으로 연결시켰다. 항체 호모다이머를 힌지 영역에서 환원시켜 모노머를 형성하게 한 다음, 이를 재산화시켜 항체 헤테로다이머를 형성시켰다. 또한, 이 방법은 항체 호모다이머의 제조에도 이용될 수 있다. 문헌 (Hollinger et al.,Proc. Natl. Acad. Sci. USA90:6444-6448 (1993))에 기재된 "디아바디 (diabody)" 기술은 이중특이적 항체 단편을 만드는 별도의 메카니즘을 제공한다. 이 단편에는 너무 짧아서 동일 쇄상의 두 도메인을 짝지을 수는 없는 링커로 경쇄 가변 도메인 (VL)에 연결된 중쇄 가변 도메인 (VH)이 포함된다. 따라서, 한 단편의 VL및 VH도메인은 다른 단편의 상보적인 VH및 VL도메인과 쌍을 이루게 되어, 2 개의 항원 결합 부위를 형성한다. 단쇄 Fv (sFv) 다이머를 사용하여 이중특이적 항체 단편을 만드는 또다른 전략이 보고되었다 (문헌 (Gruber et al.,J. Immunol.152:5368 (1994)) 참조). 2 가 이상의 결합가를 갖는 항체가 고려 대상이다. 예를 들어, 삼중특이적 항체를 제조할 수 있다 (Tutt et al.,J. Immunol.147:60 (1991)).
예를 들어 이중특이적 항체는 주어진 PRO 폴리펩티드상의 2 가지 상이한 에피토프와 결합할 수 있다. 별법으로, 특정 PRO 폴리펩티드를 발현시키는 세포에대한 세포내 방어 메카니즘에 초점을 맞추기 위해, 항-PRO 폴리펩티드 팔 (arm)을 백혈구상의 촉발 분자, 예를 들어 T-세포 수용체 분자 (예를 들어, CD2, CD3, CD28 또는 B7), 또는 IgG의 Fc 수용체 (FcγR), 예를 들어 FcγRI (CD64), FcγRII (CD32) 및 FcγRIII (CD16)와 결합하는 팔에 연결시킬 수 있다. 또한, 이중특이적 항체를 사용하여 특정 PRO 폴리펩티드를 발현하는 세포에 세포독성제를 국소화시킬 수 있다. 이러한 항체는 PRO-결합 팔과 세포독성제 또는 방사선핵종 킬레이트제, 예를 들어 EOTUBE, DPTA, DOTA 또는 TETA와 결합하는 팔을 가지고 있다. 관심있는 또다른 이중특이적 항체는 PRO 폴리펩티드와 결합하며 추가로 조직 인자 (TF)와 결합한다.
5. 이종접합 항체
이종접합 항체도 본 발명의 범위에 포함된다. 이종접합 항체는 2 개의 공유결합으로 연결된 항체로 구성된다. 이러한 항체는 예를 들어 면역계 세포를 원하지 않는 세포에 표적화시키고 (미국 특허 제4,676,980호), HIV 감염의 치료를 위해 (WO 제91/00360호, 동 제92/200373호, 및 EP 제03089호) 제안되었다. 이종접합 항체는 교차결합제를 사용하는 방법을 포함하여 합성 단백질 화학에 공지된 방법을 이용하여 시험관내 제조할 수 있는 것으로 생각된다. 예를 들어, 면역독소는 디술피드 교환 반응을 사용하거나 티오에테르 결합을 형성시킴으로써 제조될 수 있다. 상기 목적에 적합한 시약의 예로는 이미노티올레이트 및 메틸-4-머캅토부티르이미데이트 및 미국 특허 제4,676,980호에 개시된 시약이 포함된다.
6. 이펙터 기능 조작
이펙터 기능에 대해 본 발명의 항체를 변형하는 것 (예를 들어 암치료에 있어 항체의 효과를 증대시키기 위해)이 바람직할 수 있다. 예를 들어, 시스테인 잔기(들)를 Fc 영역에 도입하여 이 영역에서 쇄간의 디술피드 결합을 형성시킬 수 있다. 이렇게 생성된 호모다이머 항체는 내부화 능력이 향상되고(거나) 보체-매개 세포 사멸 및 항체-의존성 세포내 세포독성 (ADCC)이 증대될 수 있다 (문헌 (Caron et al.,J. Exp Med., 176:1191-1195 (1992) 및 Shopes,J. Immunol., 148:2918-2922 (1992)) 참조). 또한, 문헌 (Wolff et al.Cancer Research,53: 2560-2565 (1993))에 기재된 바와 같이 헤테로이관능성 교차결합제를 사용하여 항-종양 활성이 증대된 호모다이머 항체를 제조할 수도 있다. 별법으로, 이중의 Fc 영역을 갖는 항체를 조작하여 보체 용균성 및 ADCC 능력을 증대시킬 수 있다 (문헌 (Stevenson et al.,Anti-Cancer Drug Design, 3:219-230 (1989)) 참조).
7. 면역접합체
본 발명은 또한 세포독성제, 예를 들어 화학요법제, 독소 (예를 들어, 효소적 활성 박테리아, 진균, 식물 또는 동물성 독소, 또는 그의 단편) 또는 방사선동위원소 (즉, 방사선접합체)와 결합된 항체를 포함하는 면역접합체에 관한 것이다.
이러한 면역접합체의 생성에 유용한 화학요법제는 상기에 기재되어 있다. 사용될 수 있는 효소적 활성 독소 및 그의 단편에는 디프테리아 A 쇄, 디프테리아 독소의 비결합 활성 단편, 외독소 A 쇄 (슈도모나스 애루기노사 (Pseudomonas aeruginosa) 유래), 리신 A 쇄, 아브린 A 쇄, 모데크신 A 쇄, 알파-사르신, 알레우리테스 포르디 (Aleurites fordii) 단백질, 디안틴 단백질, 피톨라카 아메리카나(Phytolaca americana) 단백질 (PAPI, PAPII 및 PAP-S), 쓴 멜론 (momordica charantia) 억제제, 쿠르신, 크로틴, 사파오나리아 오피시날리스 (sapaonaria officinalis) 억제제, 겔로닌, 미토겔린, 레스트릭토신, 페노마이신, 에노마이신, 및 트리코테세네스가 포함된다. 다양한 방사선핵종을 방사선접합된 항체의 제조에 이용할 수 있다. 예를 들면212Bi,131I,131In,90Y 및186Re가 포함된다.
다양한 이관능성 단백질-커플링제, 예를 들어 N-숙신이미딜-3-(2-피리딜디티올)프로피오네이트 (SPDP), 이미노티올란 (IT), 이미도에스테르의 이관능성 유도체 (예를 들어, 디메틸 아디프이미데이트 HCL), 활성 에스테르 (예를 들어, 디숙신이미딜 수베레이트), 알데히드 (예를 들어, 글루타르알데히드), 비스-아지도 화합물 (예를 들어, 비스(p-아지도벤조일)헥산디아민), 비스-디아조늄 유도체 (예를 들어, 비스-(p-디아조늄벤조일)-에틸렌디아민), 디이소시아네이트 (예를 들어, 톨리엔 2,6-디이소시아네이트), 및 비스-활성 플루오르 화합물 (예를 들어, 1,5-디플루오로-2,4-디니트로벤젠)을 사용하여 항체와 세포독성제의 접합체를 만들 수 있다. 예를 들어, 문헌 (Vitetta et al.,Science,238:1098 (1987))에 기재된 바와 같이 리신 면역독소를 제조할 수 있다. 탄소-14-표지된 1-이소티오시아네이토벤질-3-메틸디에틸렌 트리아민펜타아세트산 (MX-DTPA)은 방사선뉴클레오디드와 항체를 연결하는 통상적인 킬레이트제이다 (WO 94/11026 참조).
또다른 실시양태에서, 종양 예비표적화에 사용하기 위해서 항체를 "수용체" (예를 들어, 스트렙타비딘)에 접합시키고, 이 항체-수용체 접합체를 투여 대상에게투여한 다음, 제거제를 사용하여 순환계로부터 결합되지 않은 접합체를 제거하고 세포독성제 (예를 들어, 방사선뉴클레오티드)에 접합된 "리간드" (예를 들어, 아비딘)를 투여한다.
8. 면역리포좀
본원에 개시된 항체를 면역리포좀으로 제제화할 수도 있다. 이 항체를 포함하는 리포좀은 당업계에 공지된 방법, 예를 들어 문헌 (Epstein et al.,Proc. Natl. Acad. Sci. USA,82:3688 (1985); Hwang et al.,Proc. Natl Acad. Sci. USA,77:4030 (1980); 및 미국 특허 제4,485,045호 및 동 제4,544,545호)에 기재된 방법으로 제조된다. 순환 시간이 증대된 리포좀은 문헌 (미국 특허 제5,013,556호)에 개시되어 있다.
특히 유용한 리포좀은 포스파티딜콜린, 콜레스테롤 및 PEG-유도체화 포스파티딜에탄올아민 (PEG-PE)을 포함하는 지질 조성물을 사용하여 역상 증발법에 의해 제조될 수 있다. 규정된 공극 크기의 필터를 통해 리포좀을 밀어내어 원하는 직경을 갖는 리포좀을 수득한다. 문헌 (Martin et al.,J. Biol. Chem.,257:286-288 (1982))에 기재된 바와 같이 디술피드-상호교환 반응을 통해 본 발명의 항체의 Fab' 단편을 리포좀에 접합시킬 수 있다. 경우에 따라, 화학요법제 (예를 들어, 독소루비신 (Doxorubicin))를 리포좀에 포함시킨다 (문헌 (Gabizon et al.,J. National Cancer Inst.,81(19):1484 (1989)) 참조).
9. 항체 제약 조성물
여러 가지 질환을 치료하기 위해, 본원에서 확인된 PRO 폴리펩티드와 특이적으로 결합하는 항체 및 상기 기재된 스크리닝 분석법으로 확인된 다른 분자를 제약 조성물 형태로 투여할 수 있다.
PRO 폴리펩티드가 세포내에 있고 모든 항체들이 억제제로 사용되는 경우, 내부화 항체가 바람직하다. 그러나, 리포펙션 또는 리포좀을 사용하여 항체 또는 항체 단편을 세포내에 전달할 수도 있다. 항체 단편이 사용되는 경우, 표적 단백질의 결합 도메인에 특이적으로 결합하는 최소의 저해성 단편이 바람직하다. 예를 들어, 항체의 가변-영역 서열을 기초로, 표적 단백질 서열과 결합하는 능력을 지닌 펩티드 분자를 고안할 수 있다. 이러한 펩티드는 화학적으로 합성되고(거나) 재조합 DNA 기술에 의해 제조될 수 있다 (예를 들어, 문헌 (Marasco et al.,Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:7889-7893 (1993)) 참조). 또한, 본원의 제제는 특정 증상을 치료하기 위해 필요한 1 종 이상의 활성 화합물, 바람직하게는 서로 악영향을 주지 않는 상보적인 활성을 지닌 화합물을 포함할 수도 있다. 별법으로, 또는 추가로, 이 조성물은 그의 기능을 증대시키는 작용제, 예를 들어 세포독성제, 사이토킨, 화학요법제, 또는 증식-억제제를 포함할 수 있다. 이러한 분자는 의도된 목적에 효과적인 양으로 배합물에 존재하는 것이 적합하다.
활성 성분은 예를 들어 각각 콜로이드성 약물 전달 시스템 (예를 들어 리포좀, 알부민 마이크로스피어, 마이크로에멀젼, 나노입자 및 나노캡슐) 또는 마크로에멀젼 중에서 예를 들어 코아세르베이션 (coacervation) 기술 또는 계면 중합, 예를 들어 히드록시메틸셀룰로스 또는 젤라틴-마이크로캡슐 및 폴리-(메틸메타크릴레이트) 마이크로캡슐에 의해 제조된 마이크로캡슐에 봉입될 수도 있다. 상기 기술은 문헌 (Remington'sPharmaceutical Sciences, 상기 문헌)에 개시되어 있다.
생체내 투여용으로 사용되는 제제는 멸균처리되어야 한다. 이것은 멸균 여과막을 통한 여과에 의해 쉽게 수행된다.
서방형 제제를 제조할 수 있다. 서방형 제제의 적합한 예는 항체를 포함하는 고체 소수성 중합체의 반투과성 매트릭스 (상기 매트릭스는 성형품 형태 (예를 들어 필름 또는 마이크로캡슐) 임)를 포함한다. 서방형 매트릭스의 예로는 폴리에스테르, 히드로겔 (예를 들어, 폴리(2-히드록시에틸-메타크릴레이트) 또는 폴리(비닐알콜)), 폴리락티드 (미국 특허 제3,773,919호), L-글루탐산과 γ 에틸-L-글루타메이트의 공중합체, 비분해성 에틸렌-비닐 아세테이트, 분해성 락트산-글리콜산 공중합체, 예를 들어 LUPRON DEPOTTM(락트산-글리콜산 공중합체 및 루프롤리드 아세테이트로 구성된 주입가능한 마이크로스피어), 및 폴리-D-(-)-3-히드록시부티르산 등이 있다. 에틸렌-비닐 아세테이트 및 락트산-글리콜산과 같은 중합체는 100일 이상 동안 분자를 방출할 수 있지만, 특정 히드로겔은 보다 짧은 기간 동안 단백질을 방출한다. 캡슐화된 항체가 오랫 동안 체내에 남아있는 경우, 이것들은 37 ℃에서 습기에 노출된 결과로 변성 또는 응집되어 생물학적 활성이 손실되고 면역원성이 변할 수 있다. 안정화를 위해 관련된 메카니즘에 따라 합리적인 전략을 고안해낼 수 있다. 예를 들어, 응집 메카니즘이 티오-디술피드 상호교환을 통한 분자간의 S-S 결합 형성인 것으로 밝혀진다면, 술프히드릴 잔기의 변형, 산성 용액으로부터의 동결건조, 수분 함량 조절, 적절한 첨가제 사용 및 특이적인 중합체 매트릭스 조성물의 개발에 의해 안정화를 달성할 수 있다.
G. 항-PRO 항체의 용도
본 발명의 항-PRO 항체는 다양한 유용성을 갖는다. 예를 들어, 항-PRO 항체는 PRO에 대한 진단 분석 (예를 들어 특정 세포, 조직 또는 혈청에서 PRO의 발현 검출)에 사용될 수 있다. 당업계에 공지된 여러 가지 진단 분석 기술, 예를 들어 이종상 또는 동종상에서 수행되는 경쟁적 결합 분석법, 직접 또는 간접 샌드위치 분석법 및 면역침전 분석법 (Zola,Monoclonal Antibodies: A Manual of Techniques, CRC Press, Inc. (1987) pp. 147-158)을 사용할 수 있다. 진단 분석에 사용되는 항체는 검출가능한 잔기로 표지될 수 있다. 검출가능한 잔기는 직접 또는 간접적으로 검출가능한 신호를 생성시킬 수 있어야 한다. 예를 들어, 검출가능한 잔기는 방사선동위원소, 예를 들어3H,14C,32P,35S 또는125I, 형광 또는 화학발광 화합물, 예를 들어 플루오레세인 이소티오시아네이트, 로다민 또는 루시페린, 또는 효소, 예를 들어 알칼리 포스파타제, 베타-갈락토시다제 또는 양고추냉이 페록시다제일 수 있다. 문헌 (Hunter et al,Nature,144:945 (1962); David et al.,Biochemistry,13:1014 (1974); Pain et al.,J. Immunol. Meth.,40:219 (1981); 및 Nygren,J. Histochem. and Cytochem.,30:407 (1982))에 기재된 방법을 비롯하여 항체를 검출가능한 잔기에 접합시키기 위한 당업계에 공지된 임의의 방법을 사용할 수 있다.
또한, 항-PRO 항체는 재조합 세포 배양액 또는 천연 공급원으로부터 PRO를친화성 정제하는데에도 유용하다. 이 방법에서, PRO에 대한 항체는 당업계에 공지된 방법을 사용하여 세파덱스 수지 또는 필터 페이퍼와 같은 적합한 지지체에 고정된다. 그 후에, 고정된 항체는 정제될 PRO를 포함하는 시료와 접촉시킨 후, 고정된 항체에 결합한 PRO를 제외한 시료 내의 모든 물질을 실질적으로 제거할 적합한 용매로 지지체를 세척한다. 최종적으로, 항체로부터 PRO 폴리펩티드를 방출시킬 다른 적합한 용매로 지지체를 세척한다.
다음의 실시예는 단지 예시의 목적으로 제공될 뿐이며, 어떤 식으로든 본 발명의 범위를 한정하려는 것이 아니다.
본 명세서에 인용된 모든 특허와 문헌은 본 명세서에 포함되는 것으로 한다.
실시예에서 언급한 시판 시약들은 달리 지시하지 않는 한 제조업자의 지시에 따라 사용하였다. 하기 실시예와 명세서 전반에서 ATCC 기탁 번호로 확인되는 세포들의 입수원은 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션 (American Type Culture Collection, 버지니아주 마나사스)이다.
실시예 1: 신규 폴리펩티드 및 이를 코딩하는 cDNA를 확인하기 위한 세포외 도메인 상동성 스크리닝
스위스-프롯 (Swiss-Prot) 공공 데이타베이스로부터 약 950 개의 공지된 분비 단백질로부터의 세포외 도메인 (ECD) 서열 (분비 신호 서열이 존재하는 경우에는 이를 포함함)을 사용하여 EST 데이타베이스를 조사했다. EST 데이타베이스는 공공 데이타베이스 (예를 들면, 데이호프 (Dayhoff), 젠뱅크)와 민간 데이타베이스(예를 들면, LIFESEQ™, 미국 캘리포니아주 팔로 알토 소재의 인사이트 파마슈티컬 (Incyte Pharmaceuticals))를 포함했다. EST 서열의 6 개 프레임 번역에 대한 ECD 단백질 서열의 비교로서 컴퓨터 프로그램 BLAST 또는 BLAST-2 (Altschul et al.,Methods in Enzymology266: 460-480 (1996))를 이용하여 조사를 수행했다. 공지된 단백질을 코딩하지 않는 70 (또는 몇몇 경우 90) 또는 그 이상의 BLAST 스코어를 갖는 비교물을 클러스터시키고, 프로그램 "phrap" (Phil Green, University of Washington, 미국 워싱턴주 시애틀)을 사용하여 컨센서스 DNA 서열로 조립했다.
본 세포외 도메인 상동성 스크리닝을 이용하여, 컨센서스 DNA 서열을 phrap을 사용하여 확인된 다른 EST 서열에 대해 조립했다. 또한, 수득된 컨센서스 DNA 서열을 종종 (항상은 아니지만) 상기 논의한 EST 서열의 공급원을 사용하여 가능한 한 컨센서스 서열을 신장시키기 위해 BLAST 또는 BLAST-2와 phrap의 반복 사이클을 이용하여 이 컨센서스 서열을 신장시켰다.
그 후, 상기한 바와 같이 수득된 컨센서스 서열을 기준으로 올리고뉴클레오티드를 합성하여, PCR에 의해 관심있는 서열을 포함하는 cDNA 라이브러리를 확인하기 위해 사용하고 PRO 폴리펩티드에 대한 전장 코딩 서열의 클론을 단리하기 위한 프로브로서 사용하였다. 전방향 및 역방향 PCR 프라이머는 일반적으로 20 내지 30 개 뉴클레오티드 범위이고, 종종 약 100 내지 1000 bp 길이의 PCR 산물을 제공하도록 고안된다. 프로브 서열의 길이는 통상적으로 40 내지 55 bp이다. 몇몇 경우, 컨센서스 서열이 약 1 내지 1.5 kbp보다 큰 경우 추가의 올리고뉴클레오티드가 합성된다. 전장 클론을 위한 몇 개의 라이브러리를 스크리닝하기 위해, 이들 라이브러리로부터의 DNA를 PCR 프라이머 쌍을 사용하여 문헌 (Ausubel et al.,Current Protocols in Molecular Biology)에 따라 PCR 증폭에 의해 스크리닝했다. 그 후, 양성 라이브러리를 사용함으로써 프로브 올리고뉴클레오티드 및 프라이머 쌍들 중 하나를 이용하여 관심있는 유전자를 코딩하는 클론을 단리했다.
cDNA 클론을 단리하기 위해 사용되는 cDNA 라이브러리는 인비트로젠 (Invitrogen, 미국 캘리포니아주 샌디에고)으로부터의 시약들과 같은 시판 시약을 사용하여 표준 방법으로 제작했다. cDNA를 NotI 부위를 갖는 올리고 dT로 프라이밍시키고, 헤미키나제 처리된 SalI 어댑터에 평활 말단으로 연결시키고, NotI로 절단하고, 겔 전기영동으로 크기에 따라 적절하게 분류하고, 적당한 클로닝 벡터 (예를 들면, pRKB 또는 pRKD; pRK5B는 SfiI 부위를 포함하지 않는 pRK5D의 전구체임; 문헌 (Holmes et al.,Science,253: 1278-1280 (1991)) 참조)내의 유일한 XhoI 및 NotI 부위에 정해진 방향으로 클로닝했다.
실시예 2: 아밀라제 스크리닝에 의한 cDNA 클론의 단리
1. 올리고 dT 프라이밍된 cDNA 라이브러리의 제조
인비트로젠 (미국 캘리포니아주 샌디에고)사의 시약 및 프로토콜 (Fast Track 2)을 사용하여 관심 있는 인간 조직으로부터 mRNA를 단리했다. 미국 메릴랜드주 게터스버그 소재의 Life Technologies사의 시약 및 프로토콜 (Super Script Plasmid System)을 이용하여, 상기 RNA를 사용하여 벡터 pRK5D에 올리고 dT 프라이밍된 cDNA 라이브러리를 생성시켰다. 이 과정에서, 이중 가닥 cDNA의 크기를 1000 bp보다 크게 만들고, SalI/NotI 링커 부착 cDNA를 XhoI/NotI 절단 벡터에 클로닝했다. pRK5D는 sp6 전사 개시 부위, SfiI 제한 효소 부위, XhoI/NotI cDNA 클로닝 부위를 순서대로 포함하는 클로닝 벡터이다.
2. 랜덤 프라이밍된 cDNA 라이브러리의 제조
1 차 cDNA 클론의 5' 말단을 우선적으로 제공하기 위해 2 차 cDNA 라이브러리를 생성시켰다. 1 차 라이브러리 (상기한 바와 같음)로부터 sp6 RNA를 생성시키고, Life Technologies사의 시약 및 프로토콜 (Super Script Plasmid System, 상기한 바와 같음)을 이용하여 상기 RNA를 사용하여 벡터 pSST-AMY.0에 랜덤 프라이밍된 cDNA 라이브러리를 생성시켰다. 이 과정에서, 이중가닥 cDNA를 500 내지 1000 bp의 크기로 만들고, NotI 어댑터에 평활 말단으로 연결시키고, SfiI로 절단하여 SfiI/NotI 절단 벡터에 클로닝했다. pSST-AMY.0은 cDNA 클로닝 부위 및 마우스 아밀라제 서열 (분비 신호 없는 성숙 서열) 앞에 효모 알콜 디히드로게나제 프로모터를 갖고 클로닝 부위 뒤에 효모 알콜 디히드로게나제 터미네이터를 갖는 클로닝 벡터이다. 따라서, 프레임 내에 아밀라제 서열과 융합된, 상기 벡터 내에 클로닝된 cDNA는 적절하게 형질감염된 효모 콜로니로부터 아밀라제를 분비할 것이다.
3. 형질전환 및 검출
상기 단락 2에 기재된 라이브러리로부터의 DNA를 빙냉시키고 전기수용성 (electorcompetent) DH10B 세균 (Life Technologies) 20 ml을 첨가했다. 세균 및 벡터 혼합물을 제조업자의 지시대로 일렉트로포레이션시켰다. 그 후, SOC 배지 (Life Technologies) 1 ml을 첨가하고 혼합물을 30 분 동안 37 ℃에서 인큐베이션했다. 그 후에, 형질전환체를 앰피실린을 포함하는 표준 150 mm LB 플레이트 20개에 플레이팅하고 16 시간 동안 (37℃)에서 인큐베이션했다. 양성 콜로니를 플레이트로부터 떼어 내어 표준 프로토콜, 예를 들어 CsCL-구배법을 사용하여 DNA를 세균 펠렛으로부터 단리했다. 정제된 DNA를 사용하여 다음과 같은 효모 프로토콜을 수행했다.
효모 방법은 다음 세 개의 카테고리로 분류되었다: 1) 플라스미드/cDNA 조합 벡터를 사용하여 효모를 형질전환시키는 단계, 2) 아밀라제를 분비하는 효모 클론을 검출하고 단리하는 단계, 및 3) 효모 콜로니로부터 삽입체를 직접 PCR 증폭시키고 서열 분석 및 추가의 분석을 위해 DNA를 정제하는 단계.
사용된 효모 균주는 HD56-5A (ATCC-90785)였다. 이 균주는 MAT 알파, ura3-52, leu2-3, leu2-112, his3-11, his3-15, MAL+, SUC+, GAL+의 유전형을 갖는다. 바람직하게는, 번역 후 경로가 결여된 효모 변이체를 사용할 수 있다. 이러한 변이체는 sec71, sec72, sec62, 바람직하게는 말단이 잘린 sec71에서 전좌 (translocation)로 인한 결핍 대립유전자를 가질 수 있다. 별법으로, 상기 유전자의 정상적인 작동을 방해하거나 상기 번역 후 경로에 관련된 다른 단백질 (예를 들어 SEC61p, SEC72p, SEC62p, SEC63p, TDJ1p 또는 SSA1p-4p) 또는 이들 단백질의 복합체 형성을 방해하는 길항제 (안티센스 뉴클레오티드 및(또는) 리간드 포함)를 아밀라제 발현 효모와 함께 사용하는 것도 바람직할 수 있다.
형질전환은 문헌 (Gietz et al.,Nucl. Acid. Res., 20:1425 (1992))에 개관된 프로토콜에 기초하여 수행했다. 그 후, 형질전환된 세포를 아가로부터 YEPD 복합 배지 브로쓰 100 ml에 접종하고 30 ℃에서 밤새 성장시켰다. YEPD 브로쓰를 문헌 (Kaiser et al.,Methods in Yeast Genetics, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY, p. 207 (1994))에 기재된 바와 같이 제조했다. 철야 배양물을 신선한 YEPD 브로쓰 500 ml로 약 2 x 106세포/ml (약 OD600= 0.1)가 되도록 희석하고 약 1 x 107세포/ml (약 OD600= 0.4 - 0.5)가 되도록 재성장시켰다.
세포를 회수한 다음, Sorval GS3 로터의 GS3 로터 바틀로 옮겨서 5,000 rpm에서 5 물분 동안 원심분리하고, 상층물을 버리고, 멸균수로 재현탁시켜 Beckman GS-6KR 원심분리기에서 3,500 rpm으로 50 ml 팔콘 튜브에서 다시 원심분리함으로써 형질전환을 준비했다. 상층물을 버리고, 세포를 LiAc/TE (10 ml, 10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA pH 7.5, 100 mM Li2OOCCH3)로 세척하고 LiAc/TE (2.5 ml)에 재현탁했다.
마이크로 원심분리 튜브에서, 준비한 세포 100 ㎕를 신선한 변성 단일 가닥 연어 고환 DNA (미국 메릴랜드주 게이터스버그 소재 Lofstrand Lab) 및 형질전환 DNA 1 ㎍ (부피 < 10 ㎕)와 혼합하여 형질전환을 수행했다. 혼합물을 볼텍싱에 의해 잠깐 혼합한 후, 40 % PEG/TE 600 ㎕ (40 % 폴리에틸렌 글리콜-4000, 10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, 100 mM Li2OOCCH3, pH 7.5)를 첨가했다. 상기 혼합물을 완만하게 혼합하고 30 분 동안 교반하면서 30 ℃에서 인큐베이션했다. 그 다음에 세포를 42 ℃에서 15 분 동안 열 쇼크를 가하고, 반응 용기를 마이크로원심분리기에서 12,000 rpm으로 5 내지 10 초 동안 원심분리하여 상층물을 따라내 버리고, TE 500㎕ (10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, pH 7.5)에 재현탁시킨 후 재원심분리했다. 세포를 TE 1 ml로 희석하고 분액 200 ㎕를 150 mm 성장 플레이트 (VWR)에서 미리 제조한 선택 배지 상에 도말했다.
별법으로는 작은 다수 회의 반응 대신, 시약량을 증가시키면서 1 회의 대규모 반응으로 형질전환을 수행했다.
사용된 선택 배지는 문헌 (Kaiser et al.,Methods in Yeast Genetics, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY, p. 208-210 (1994))에 기재된 바와 같이 제조된 우라실 결여된 합성 완전 덱스트로스 아가 (SCD-Ura)였다. 형질전환체를 30 ℃에서 2 내지 3 일 동안 성장시켰다.
아밀라제를 분비하는 콜로니의 검출은 선택 성장 배지 중에 적색 전분을 포함시켜 수행했다. 문헌 (Biely et al.,Anal. Biochem.,172:176-179 (1988))에 기재된 바와 같은 방법에 따라 전분을 적색 염료 (반응성 Red-120, Sigma)와 커플링시켰다. 커플링된 전분을 최종 농도 0.15 % (w/v)로 SCD-Ura 아가 플레이트에 첨가하고, 인산칼륨을 써서 pH 7.0으로 완충시켰다 (최종 농도 50 내지 100 mM).
양성 콜로니를 선택하여 신선한 선택 배지 (150 mm 플레이트 상)에 스트리킹하여 잘 단리되며 확인가능한 단일 콜로리를 수득했다. 적색 전분을 완충된 SCD-Ura 아가에 직접 첨가하여 아밀라제 분비 양성인 잘 단리된 단일 콜로니를 검출했다. 양성 콜로니는 전분 분해력 (그 콜로니 주위에 직접 육안으로 확인할 수 있는 투명 원광 (halo)이 생성됨)으로 결정되었다.
4. PCR 증폭에 의한 DNA의 단리
양성 콜로니를 단리할 때, 그 일부를 이쑤시개로 떠내어 96 웰 플레이트 내의 멸균수 30 ㎕ 중에 희석했다. 이때, 양성 콜로니를 동결시켜 후속 분석을 위해 보관하거나 즉시 증폭시켰다. 0.5 ㎕ Klentaq (미국 캘리포니아주 팔로 알토 소재의 Clontech), 10 mM dNTP 4.0 ㎕ (Perkin Elmer-Cetus), Kentaq 완충액 (Clontech) 2.5 ㎕, 전방향 올리고뉴클레오티드-1 0.25 ㎕, 역방향 올리고뉴클레오티드-2 0.25 ㎕, 증류수 12.5 ㎕를 포함하는 25 ㎕ 부피의 PCR 반응의 주형으로서 세포 분액 5 ㎕를 사용하였다. 전방향 올리고뉴클레오티드-1의 서열은 다음과 같았다:
5'-TGTAAAACGACGGCCAGTTAAATAGACCTGCAATTATTAATCT-3' (서열 16)
역방향 올리고뉴클레오티드-2 의 서열은 다음과 같았다:
5 '-CAGGAAACAGCTATGACCACCTGCACACCTGCAAATCCATT-3' (서열 17)
그 후, PCR을 다음과 같이 수행했다.
a. 92 ℃에서 5 분 동안 변성시킴,
b. 92 ℃에서 30 초 동안 변성, 59 ℃에서 30 초 동안 어닐링, 72 ℃에서 60 초간 신장시키는 과정을 3 회 실시,
c. 92 ℃에서 30 초 동안 변성, 57 ℃에서 30 초 동안 어닐링, 72 ℃에서 60 초간 신장시키는 과정을 3 회 실시,
d. 92 ℃에서 30 초 동안 변성, 55 ℃에서 30 초 동안 어닐링, 72 ℃에서 60 초간 신장시키는 과정을 25 회 실시,
e. 4 ℃에서 유지시킴.
올리고뉴클레오티드의 밑줄친 영역은 각각 ADH 프로모터 영역 및 아밀라제 영역에 어닐링되고, 삽입체가 존재하지 않을 경우 벡터 pSST-AMY.O으로부터 307 bp 영역을 증폭시켰다. 통상적으로, 상기 올리고뉴클레오티드의 5' 말단의 처음 18 개의 뉴클레오티드는 서열 분석 프라이머의 어닐링 부위를 포함했다. 따라서, 빈 벡터로부터 PCR 반응의 총 생성물은 343 bp였다. 그러나, 신호 서열이 융합된 cDNA는 상당히 더 긴 뉴클레오티드 서열을 생성시켰다.
PCR 후에, 반응물의 분액 5 ㎕를 문헌 (Sambrook et al.,상기 문헌)에 기재된 바와 같이 Tris-Borate-EDTA (TBE) 완충계를 사용하여 1 % 아가로스 겔에서의 아가로스 겔 전기영동에 의해 조사했다. 400 bp보다 큰 강력한 하나의 PCR 산물을 생성시키는 클론을 96 Qiaquick PCR clean-up 컬럼 (미국 캘리포니아주 채스워쓰 소재의 Qiagen Inc.)으로 정제한 후 DNA 서열 분석으로 추가로 분석했다.
실시예 3: 인간 PRO241을 코딩하는 cDNA 클론의 단리
상기 실시예 1에서 기재된 바와 같이 컨센서스 DNA 서열을 다른 EST 서열에 대해 조립했다. 이 컨센서스 서열은 본원에서 DNA30876로 지칭된다. DNA30876 컨센서스 서열을 기초로 하여, 1) 관심 서열을 포함하는 cDNA 라이브러리를 PCR에 의해 확인하고, 2) PRO241의 전장 코딩 서열의 클론을 단리하기 위한 프로브로서 사용하기 위해 올리고뉴클레오티드를 합성했다.
전방향 PCR 프라이머5'-GGAAATGAGTGCAAACCCTC-3' (서열 3)
역방향 PCR 프라이머5'-TCCCAAGCTGAACACTCATTCTGC-3' (서열 4)
추가로 다음의 뉴클레오티드 서열을 갖는 합성 올리고뉴클레오티드 혼성화프로브를 컨센서스 서열 DNA30876로부터 제조했다.
혼성화 프로브
5'-GGGTGACGGTGTTCCATATCAGAATTGCAGAAGCAAAACTGACCTCAGTT-3' (서열 5)
전장 클론의 공급원을 찾을 목적으로 몇 개의 라이브러리를 스크리닝하기 위해 상기 확인한 PCR 프라이머쌍을 사용한 PCR 증폭에 의해 라이브러리의 DNA를 스크리닝했다. 그 후, 양성 라이브러리를 사용함으로써 프로브 올리고뉴클레오티드 및 PCR 프라이머들 중 하나로 PRO241 유전자를 코딩하는 클론을 단리했다. cDNA 라이브러리 제조용 RNA는 인간 태아의 신장 조직 (LIB29)으로부터 단리했다.
상기한 바와 같이 단리된 클론의 DNA 서열 분석을 통하여 PRO241 (본원에서 DNA34392-1170이라 지칭됨)의 전장 DNA 서열 (서열 1) 및 이로부터 유도된 PRO241의 단백질 서열을 수득했다.
DNA34392-1170의 전체 뉴클레오티드 서열을 도 1 (서열 1)에 도시한다. 클론 DNA34392-1170은 뉴클레오티드 위치 234 내지 236에 명백한 번역 개시 부위를 가지며 뉴클레오티드 위치 1371 내지 1373의 정지 코돈에서 종결되는 단일 오픈 리딩 프레임을 포함한다 (도 1). 예상되는 폴리펩티드 전구체는 아미노산 379 개 길이이다 (도 2). 도 2에 나타낸 전장 PRO241 단백질의 추정 분자량은 약 43,302 달톤이고, 추정 pI는 약 7.30이다. 클론 DNA34392-1170을 ATCC에 기탁하여 ATCC 기탁 번호 ATCC 209526를 배정받았다.
전장 PRO241 폴리펩티드의 아미노산 서열 분석 결과, 이 서열은 다양한 비글리칸 프로테오글리칸 단백질과 상당한 상동성이 있음을 시사하며 이는 PRO241이 신규 비글리칸 상동체 폴리펩티드일 수 있음을 의미한다.
실시예 4: 게놈 워킹에 의한 인간 PRO243을 코딩하는 cDNA 클론의 단리
도입:인간 트롬보포이에틴 (THPO)은 2 개의 도메인으로 이루어진 352 개 아미노산의 글리코실화 호르몬이다. 에리쓰로포이에틴과 50 % 유사성이 있는 N-말단 도메인이 생물 활성을 수행했다. C-말단은 분비에 필요하다. 트롬보포이에틴 (THPO)의 유전자는 인간 염색체 3q27-q28에 있고, 이 유전자의 6 개 엑손은 게놈 DNA의 7 킬로베이스 염기쌍에 걸쳐 있다 (Gurney et al.,Blood 85: 981-988 (1995)). THPO 가까이 위치하는 THPO 상동체를 코딩하는 임의의의 유전자가 있는지를 결정하기 위해, 이 영역의 게놈 DNA 단편을 확인하고 서열 분석을 했다. THPO 유전자좌를 포함하는 P1 클론 3 개 및 PAC 클론 1 개 (Genome Systems Inc., St. Louis, MO, 카탈로그 번호 P1-2535 및 PAC-6539)를 단리하고 140 kb 영역을 PCR을 이용하여 갭을 채우는 연구와 순차적 샷건 전략 (ordered shotgun strategy)을 병행하여, 서열 분석했다. 분석 결과, 이 영역은 THPO에 매우 가까이 위치하는 부가적인 유전자 4 개 (종양 괴사 인자 수용체 유형 1과 관련된 단백질 2 (TRAP2), 신장 개시 인자 감마 (elF4g), 클로라이드 채널 2 (CLCN2) 및 RNA 중합효소 2 서브유닛 hRP17)을 갖는, 유전자가 풍부한 영역인 것으로 나타났다. THPO 상동체가 이 영역에서 발견되지 않아도, 4 개의 신규 유전자가 컴퓨터-보조 유전자 검출 (GRAIL) (Xu et al.,Gen. Engin. 16: 241-253 (1994)), CpG 도의 존재 (Cross, S. and Bird, A.,Curr. Opin. Gene. & Devel. 5:109-314 (1995)) 및 공지된 유전자와의 상동성 (WU-BLAST-2.0에 의해 검출된 바와 같음) (Altschul and Gish,MethodsEnzymol. 266: 460-480 (1996)) (http://blast.wustl.edu/blast/README.html)에 의해 예견되었다.
P1 및 PAC 클론:THPO 게놈 서열로부터 고안된 PCR 프라이머로 스크리닝된 게놈 P1 라이브러리로부터 최초의 인간 P1 클론을 단리했다 (A.L.Gurney et al.,Blood 85: 981-88 (1995)). 상기 P1 클론에서 유래한 말단 서열로부터 PCR 프라이머를 고안한 후에, P1 및 PAC 라이브러리를 스크리닝하는데 사용하여 중복되는 클론을 확인했다 (Genome Systems, 카탈로그 번호 P1-2535 및 PAC-6539).
순차적 샷건 전략:순차적 샷건 전략 (OSS) (Chen et al.,Genomics 17: 651-656 (1993))은 체계적인 방식으로 큰 게놈 DNA 클론의 맵핑 및 서열 분석하는 것을 포함했다. P1 또는 PAC 클론을 초음파처리하여 분해하고 단편을 람다 벡터 (λBluestar)에 서브클로닝했다 (Novagen, Inc., Madison, WI, 카탈로그 번호 69242-3). 긴 길이 PCR에 의해 람다 서브클론 삽입체를 단리하고 그 말단을 서열 분석했다 (Barnes, W.,Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91: 2216-2220 (1994)). 람다-말단 서열을 중복시켜 최초 클론의 부분적인 맵을 작성했다. 중복 말단-서열을 갖는 이 람다 클론을 확인하고, 삽입체를 플라스미드 벡터 (pUC9 or pUC18)에 서브클로닝하고 플라스미드 서브클론의 말단을 서열 분석하고 조립하여 인접하는 서열을 생성했다. 이렇게 지시된 서열 전략에 의해서는 관심있는 영역을 조사하고 집중할 수 있으면서도 필요한 여분의 실험을 최소화했다.
THPO 유전자좌를 더 잘 정의하고 헤마토포이에틴 족에 관련된 다른 유전자를 연구하기 위해, 인간 P1 및 PAC 라이브러리를 PCR 스크리닝하여 4 개의 게놈 클론을 이 영역으로부터 단리했다 (Genome System, Inc., 카탈로그 번호 Pl-2535 및 PAC6539). 게놈 단편의 크기가 Pl.t는 40 kb이고, Pl.g는 70 kb이고, Pl.u는 70 kb이며, PAC.z는 200 kb였다. 200 kb 게놈 DNA의 약 80 %가 순차적 샷건 전략 (OSS) (Chen et al.,Genomics17: 651-56 (1993))에 의해 서열 분석되었고 오토어셈블러TM(AutoAssemblerTM) (Applied Biosystems, Perkin Elmer, Foster City, CA, 카탈로그 번호 903227)를 이용하여 인접하는 서열 (콘티그, contigs)로 조립했다. 수동 분석에 의해 상기 콘티그의 예비 순서를 결정했다. 콘티그는 46 종이었고 갭을 채우는 방법을 사용하였다. 표 7에는 갭의 수 및 크기가 요약되어 있다.
140 kb 영역 내의 갭 요약
갭의 크기 수
< 50 bp 13
50 - 150 bp 7
150 - 300 bp 7
300 - 1000 bp 10
1000 - 5000 bp 7
> 5000 bp 2(15,000 bp)
DNA 서열 분석:ABI DYE-프라이머TM화학 (PE Applied Biosystems, 미국 캘리포니아주 포스터시티 소재; 카탈로그 번호 402112)을 사용하여 람다 및 플라스미드 서브클론의 말단을 서열 분석했다. ABI DYE-터미네이터TM화학 (PE Applied Biosystems, 미국 캘리포니아주 포스터시티 소재, 카탈로그 번호 403044)을 사용하여 그의 각 PCR 프라이머를 가진 PCR 산물을 서열 분석했다. 이 서열을 ABI377 장치를 사용하여 수집했다. 1 kb 이상의 PCR 산물에는, 워킹 프라이머를 사용하였다. 서열의 중복 확인 및 편집을 위해, 오토어셈블러TM(PE Applied Biosystems, 미국 캘리포니아주 포스터시티 소재, 카탈로그 번호 903227)의 OSS 전략에 의해 생성된 콘티그의 서열 및 갭을 채우는 서열 흔적 파일을 시퀀서TM(SequencherTM) (Gene Codes Corp., Ann Arbor, MI)에 넣었다.
PCR-을 이용한 갭 삽입 전략:반복적이고 질이 낮은 서열 영역을 피해 각 콘티그의 5'- 및 3'- 말단 서열을 기준으로 프라이머를 고안했다. 모든 프라이머가 50 내지 70 % G/C 함량을 가진 19 내지 24 머가 되도록 고안했다. 올리고를 합성하고 표준 방법으로 겔-정제했다.
콘티그의 방향과 순서를 모르기 때문에, 증폭 반응에서 프라이머의 조합을 순차적으로 사용하였다. 두 PCR 키트를 사용하였다. 즉, 합성 시간이 약 10분인 XL PCR 키트 (Perkin Elmer, Norwalk, CT, 카탈로그 번호 N8080205) 및 엄격 조건하에 XL PCR 키트로는 PCR 산물의 밴드가 끌리거나 다수의 생성물이 관찰되는 경우 사용하는 택 (Taq) 중합효소 PCR 키트 (Qiagen Inc., Valencia, CA, 카탈로그 번호 201223). 상기 두 반응 중 결과가 잘 나온 반응의 주요 PCR 산물을 0.9 %의 저온 용융 아가로오스 겔로부터 추출하고 서열 분석에 앞서 진클린 (Geneclean) DNA 정제 키트로 정제했다.
분석:코딩 영역의 확인 및 특성화를 하기와 같이 수행했다. 먼저, 반복 요소의 라이브러리에 대해 파스타 (FastA) 포맷의 DNA 서열을 스크리닝하고 차폐된 질의 서열을 회복시키는 리피트마스커 (RepeatMasker) (A.F.A. Smit & P. Green,http://ftp.genome.washington.edu/RM/RM_details.html)를 이용하여 반복 서열을 차폐했다. WUBLAST (Altschul, S. and Gish, W.,Methods Enzymol.266: 460-480 (1996))를 이용하여 이 서열과 진뱅크 (Genbank) 데이타베이스를 비교하여 차폐되지 않은 반복 서열을 확인하고 수동으로 차폐시켰다.
다음에, WUBLAST-2.0 알고리즘을 이용하여 제넨테크 (Genentech)의 단백질 데이타베이스에 대해 게놈 영역을 비교하여 공지된 유전자를 밝혀낸 후에, 게놈 및 각 유전자에 대한 cDNA 서열을 각각 배열하여 주석을 달고, Needleman-Wunch 알고리즘 (Needleman and Wunsch,J. Mol. Biol.48: 443453 (1970))을 사용하여 거의 유사하지 않은 서열 사이의 국소적으로 동일한 영역을 발견했다. 상기 전략으로 이 영역의 다섯가지 공지된 유전자인 THPO, TRAP2, elF4g, CLCN2 및 hRPB17 (표 8)의 모든 엑손을 검출했다.
분석된 140 kb 영역에 위치한 공지된 유전자 요약
공지된 유전자 맵에서의 위치
진핵생물 번역 개시 인자 4 감마 3q27-qter
트롬보포이에틴 3q26-q27
클로라이드 채널 2 3q26-qter
TNF 수용체 관련 단백질 2 종래에 맵핑되지 않음
RNA 중합효소 2 서브유닛 hRPB17 종래에 맵핑되지 않음
마지막으로, 많은 연구를 통해 신규 전사 유니트를 예견했다. CpG 도 (S. Cross and Bird, A.,Curr. Opin. Genet. Dev. 5: 109-314 (1995))를 사용하여 프로모터 영역을 정의하였고, 이 영역은 GC가 풍부한, 6 내지 8-머 회문구조 서열을 인식하는 효소에 의한 절단 부위의 절편으로 확인되었다. 진뱅크에 대해 짧은 게놈 영역 (10 내지 20 kb)을 WBLAST-2.0으로 분석한 결과 EST에 상응하는 부분을 밝혀냈다. 각 EST 서열 (또는 가능한 그의 서열 크로마토그램 파일)을 회복하고 시퀀서로 조립하여 이론상의 cDNA 서열 (본원에서 DNA34415라 지칭됨)을 제공했다. 그레일 (GRAIL)2 (ApoCom Inc., Knoxville, TN, DEC 알파용 명령 라인 (command line) 버전)를 사용하여 신규 엑손을 예측했다. 이 영역의 다섯가지 공지된 유전자는 그레일 알고리즘의 수행에 있어서의 내부 대조군 역할을 했다.
단리:올리고 dT로 프라이밍되는 인간 태아의 폐 라이브러리로부터 코르딘 cDNA 클론을 단리했다. 인간 태아 폐의 폴리아데닐화 RNA를 클론테크 (Clontech) (카탈로그 번호 6528-1, 제조 번호 43777)에서 구입하여 pKR5B (Genentech, LIB26)의 cDNA 라이브러리를 만들기 위해 5 mg을 사용하였다. SalI 및 NotI 제한 부위를 도입하도록 3'-프라이머 (pGACTAGTTCTAGATCGCGAGCGGCCGCCCTTTTTTTTTTTTTTT) (서열 8) 및 5'-링커 (pCGGACGCGTGGGGCCTGCGCACCCAGCT) (서열 9)를 고안했다. 유전자의 제안된 게놈 엑손과 함께 수동 "스플라이싱"에 의해 추론되는 추정적 인간 코르딘 cDNA 서열 (DNA34415)로부터 고안된 올리고뉴클레오티드 프로브로 클론을 스크리닝했다. 프로브를 합성하는 PCR 프라이머를 사용하여 서열 분석에 앞서 cDNA 클론의 동일성을 확인했다.
스크리닝 올리고뉴클레오티드 프로브는 하기와 같았다.
OLI5640 34415.pl 5'-GCCGCTCCCCGAACGGGCAGCGGCTCCTTCTCAGAA-3'(서열 10) 및
OLI5642 34415.p2 5'-GGCGCACAGCACGCAGCGCATCACCCCGAATGGCTC-3' (서열 11).
사용된 플랭킹 프로브는 하기와 같았다.
OLI5639 34415.fl 5'-GTGCTGCCCATCCGTTCTGAGAAGGA-3' (서열 12) 및
OLI5643 34415.r 5'-GCAGGGTGCTCAAACAGGACAC-3' (서열 13).
실시예 5: PRO243의 노던 블럿팅 및 계내 RNA 혼성화 분석
노던 블럿팅 분석으로 인간 조직으로부터 유래한 PRO243 mRNA를 분석했다.
인간 태아 및 성인의 조직으로부터 유래한 폴리 아데닐화 RNA 블럿 (Clontech, Palo Alto, CA, 카탈로그 번호 7760-1 및 7756-1)을 전장 PRO243 cDNA를 기재로 하는32P-표지된 cDNA 단편에 혼성화했다. 혼성화 완충액 (5X SSPE, 2X Denhardt's 용액, 100 mg/mL의 변성 분해된 연어 정자 DNA, 50 % 포름아미드 및 2 % SDS)에서 프로브를 42 ℃에서 60 시간 동안 블럿 위에서 인큐베이션했다. 2X SSC로 몇 차례 블럿팅을 세척하고, 실온에서 1 시간 동안 0.05 % SDS로 세척한 후에, 0.1X SSC 중에 30 분 동안 엄격 조건으로 세척하고, 50 ℃에서 0.1 % SDS로 세척하였으며 오토라디오그래피했다. 밤새 노출시킨 후에, 포스포이미저 분석 (phosphorimager analysis) (Fuji)에 의해 블럿팅했다.
PRO243 mRNA 전사체를 검출했다. 발현 패턴 분석 결과, 성인 및 태아의 간에 예상된 4.0 kb 전사체의 강한 신호 및 성인 신장에 매우 희미한 신호가 나타났다. 태아 뇌, 폐 및 신장은 성인의 심장, 뇌, 폐 및 췌장에서와 같이 음성이었다. 좀더 작은 전사체가 태반 (2.0 kb), 성인의 골격근 (1.8 kb) 및 태아의 간 (2.0 kb)에서 관찰되었다.
인간 성인 조직 중의 PRO243의 계내 혼성화로 대퇴 두부 및 관골구 사이에 나타나는 발생중인 활액관절 분열선에 양성 신호가 나타났다. 모든 다른 조직은음성이었다. 인간 태아의 안면, 머리, 사지 및 마우스 배 (embryo)의 다른 부분을 검사했다. 인간 태아 조직에서는 간충직의 사지 및 안면부의 뼈가 발생하는 부위 주변에서 발현됨이 관찰되었다. 이 발현은 고도로 특이적이고 종종 혈관 형성을 수행하는 부위 주변에서 관찰되었다. 또한, 태아 뇌의 발생중인 측두엽 및 후두엽에서 발현되지만, 뇌의 다른 곳에서는 발현되지 않는 것을 관찰했다. 또한, 발생중인 내이의 신경절에서도 발현을 관찰했다. 인간 프로브로 임의의 마우스 조직을 조사한 결과, 어떤한 발현도 관찰하지 못했다.
PCR로 생성된32P-표지된 리보프로브를 이용하여 최적의 프로토콜로 계내 혼성화를 수행했다 (Lu and Gillett,Cell Vision 1:169-176 (1994)). 포르말린으로 고정시키고 파라핀에 묻힌 인간 태아 및 성인 조직을 절단하고, 파라핀을 제거한 후, 37 ℃에서 15 분 동안 프로테이나제 K (20 g/ml)로 단백질을 제거하고, 문헌 (Lu and Gillett (1994))에 기재된 바와 같이 계내 혼성화를 위해 추가의 처리를 했다. PCR 산물로 생성된 (33P) UTP-표지된 안티센스 리보프로브로 55 ℃에서 밤새 혼성화했다. 상기 슬라이드를 코닥 (Kodak) NTB2 핵 트랙 에멀젼 (nuclear track emulsion) 중에 담그고 4 주 동안 노출시켰다.
실시예 6: 인간 PRO299을 코딩하는 cDNA 클론의 단리
상기 실시예 2에 기재된 바와 같이, 본원에서 DNA28847 (도 7, 서열 18)이라 지칭되는 cDNA를 단리했다. 추가 분석 후에, DNA28847의 3' 말단이 절단된 형태가 발견되어, 이것은 DNA35877 (도 8, 서열 19)이라 지칭된다. DNA35877 컨센서스 서열을 기초로 하여, 1) 관심 서열을 포함하는 cDNA 라이브러리를 PCR에 의해 확인하고, 2) PRO299의 전장 코딩 서열의 클론을 단리하기 위한 프로브로서 사용하기 위해 올리고뉴클레오티드를 합성했다. 전방향 및 역방향 PCR 프라이머는 일반적으로 20 내지 30 개 뉴클레오티드 범위이고, 종종 약 100 내지 1000 bp 길이의 PCR 산물을 제공하도록 고안된다. 프로브 서열의 길이는 통상적으로 40 내지 55 bp이다. 몇몇 경우, 컨센서스 서열이 약 1 내지 1.5 kbp보다 큰 경우 추가의 올리고뉴클레오티드가 합성된다. 전장 클론을 위한 몇 개의 라이브러리를 스크리닝하기 위해, 이들 라이브러리로부터의 DNA를 PCR 프라이머 쌍을 사용하여 문헌 (Ausubel et al.,Current Protocols in Molecular Biology)에 따라 PCR 증폭에 의해 스크리닝했다. 그 후, 양성 라이브러리를 사용함으로써 프로브 올리고뉴클레오티드 및 프라이머 쌍들 중 하나를 이용하여 관심 유전자를 코딩하는 클론을 단리했다.
하기의 전방향 및 역방향 PCR 프라이머를 합성했다.
전방향 PCR 프라이머5'-CTCTGGAAGGTCACGGCCACAGG-3' (서열 20)
역방향 PCR 프라이머5'-CTCAGTTCGGTTGGCAAAGCTCTC-3' (서열 21)
추가로 다음의 뉴클레오티드 서열을 갖는 합성 올리고뉴클레오티드 혼성화 프로브를 컨센서스 서열 DNA35877로부터 제조했다.
혼성화 프로브
5'-CAGTGCTCCCTCATAGATGGACGAAAGTGTGACCCCCCTTTCAGGCGAGAGCTTTGCCAACCGAACTGA-3' (서열 22)
전장 클론의 공급원을 찾을 목적으로 몇 개의 라이브러리를 스크리닝하기 위해 상기 확인한 PCR 프라이머쌍 중 하나를 사용한 PCR 증폭에 의해 라이브러리의 DNA를 스크리닝했다. 프로브 올리고뉴클레오티드를 사용하여 PRO299 유전자를 코딩하는 클론을 단리하는데 양성 라이브러리를 이용했다.
cDNA 라이브러리 제조용 RNA는 인간 태아의 뇌조직으로부터 단리했다. cDNA 클론을 단리하기 위해 사용되는 cDNA 라이브러리는 인비트로젠 (Invitrogen, 미국 캘리포니아주 샌디에고)으로부터의 시약들과 같은 시판 시약을 사용하여 표준 방법으로 제작했다. cDNA를 NotI 부위를 갖는 올리고 dT로 프라이밍시키고, 헤미키나제 처리된 SalI 어댑터에 평활 말단으로 연결시키고, NotI로 절단하고, 겔 전기영동로 크기에 따라 적절하게 분류하고, 적당한 클로닝 벡터 (예를 들면, pRKB 또는 pRKD; pRK5B는 SfiI 부위를 포함하지 않는 pRK5D의 전구체임; 문헌 (Holmes et al.,Science,253: 1278-1280 (1991)) 참조)내의 유일한 XhoI 및 NotI 부위에 정해진 방향으로 클로닝했다.
상기한 바와 같이 단리된 클론의 DNA 서열 분석을 통하여 PRO299 (본 원에서 DNA39976-1215이라 지칭)의 전장 DNA 서열 (서열 14) 및 이로부터 유도된 PRO299의 단백질 서열을 수득했다.
DNA39976-1215의 전체 뉴클레오티드 서열을 도 5 (서열 14)에 나타내었다. 클론 DNA39976-1215은 뉴클레오티드 위치 111 내지 113에 명백한 번역 개시 부위를 가지며 뉴클레오티드 위치 2322 내지 2324의 정지 코돈에서 종결되는 단일 오픈 리딩 프레임을 포함한다 (도 5). 예상되는 폴리펩티드 전구체는 아미노산 737 개 길이이다 (도 6). 클론 DNA39976-1215에 의해 코딩된 폴리펩티드 서열의 중요한 영역이 확인되었고, 하기 서열을 포함한다: 아미노산 1 내지 28에 상응하는 단일 펩티드 서열, 아미노산 638 내지 662에 상응하는 추정적 막횡단 영역, 각각 아미노산 80 내지 106, 121 내지 203, 336 내지 360, 378 내지 415, 416 내지 441, 454 내지 490, 491 내지 528, 529 내지 548, 567 내지 604, 605 내지 622에 상응하는 10 개의 EGF 반복부 및 각각 아미노산 107 내지 120, 204 내지 207, 208 내지 222, 223 내지 285, 286 내지 304, 361 내지 374, 375 내지 377, 442 내지 453, 549 내지 563 및 564 내지 566에 상응하는 10 개의 잠재적인 N-글리코실화 부위. 클론 DNA39976-1215를 ATCC에 기탁하여 ATCC 기탁번호 ATCC 209524를 배정받았다.
전장 PRO299 폴리펩티드의 아미노산 서열 분석 결과, 이 서열은 노치 단백질과 상당한 상동성이 있음을 시사하며 이는 PRO299가 신규 노치 상동 단백질일 수 있고, 노치 단백질의 전형적인 활성을 가질 수 있음을 의미한다.
실시예 7: 인간 PRO323를 코딩하는 cDNA 클론의 단리
상기 실시예 1에서 기재된 바와 같이 컨센서스 DNA 서열을 다른 EST 서열에 대해 조립했다. 이 컨센서스 서열은 본원에서 DNA30875로 지칭된다. DNA30875 컨센서스 서열을 기초로 하여, 1) 관심 서열을 포함하는 cDNA 라이브러리를 PCR에 의해 확인하고, 2) PRO323의 전장 코딩 서열의 클론을 단리하기 위한 프로브로서 사용하기 위해 올리고뉴클레오티드를 합성했다.
하기의 전방향 (2 개) 및 역방향 (1 개) PCR 프라이머를 합성했다.
전방향 PCR 프라이머1 5'-AGTTCTGGTCAGCCTATGTGCC-3' (서열 25)
전방향 PCR 프라이머2 5'-CGTGATGGTGTCTTTGTCCATGGG-3' (서열 26)
역방향 PCR 프라이머5' -CTCCACCAATCCCGATGAACTTGG-3' (서열 27)
추가로, 다음 뉴클레오티드 서열을 갖는 합성 올리고뉴클레오티드 혼성화 프로브를 컨센서스 DNA30875 서열로부터 제조했다.
혼성화 프로브
5'-GAGCAGATTGACCTCATACGCCGCATGTGTGCCTCCTATI'CTGAGCTGGA-3' (서열 28)
전장 클론의 공급원을 찾을 목적으로 몇 개의 라이브러리를 스크리닝하기 위해 상기 확인한 PCR 프라이머쌍을 사용한 PCR 증폭에 의해 라이브러리의 DNA를 스크리닝했다. 그 후, 양성 라이브러리를 사용함으로써 프로브 올리고뉴클레오티드 및 프라이머들 중 하나를 이용하여 PRO323 유전자를 코딩하는 클론을 단리했다. cDNA 라이브러리 제조용 RNA는 인간 태아의 간 조직 (LIB6)으로부터 단리했다.
상기한 바와 같이 단리된 클론의 DNA 서열 분석을 통하여 PRO323 (본원에서 DNA35595-1228이라 지칭됨)의 전장 DNA 서열 (서열 23) 및 이로부터 유도된 PRO323의 단백질 서열을 수득했다.
DNA35595-1228의 전체 뉴클레오티드 서열을 도 9 (서열 23)에 도시했다. 클론 DNA35595-1228은 뉴클레오티드 위치 110 내지 112에 명백한 번역 개시 부위를 가지며 뉴클레오티드 위치 1409 내지 1411의 정지 코돈에서 종결되는 단일 오픈 리딩 프레임을 포함했다 (도 9). 예상되는 폴리펩티드 전구체는 아미노산 433 개 길이이다 (도 10). 도 10에 나타낸 전장 PRO241 단백질의 추정 분자량은 약 47,787 달톤이고, 추정 pI는 약 6.11이다. 클론 DNA35595-1228을 ATCC에 기탁하여 ATCC 기탁 번호 ATCC 209528을 배정받았다.
전장 PRO323 폴리펩티드의 아미노산 서열 분석 결과, 이 서열은 여러 가지 디펩티다제 단백질과 상당한 상동성이 있음을 시사하며 이는 PRO323이 신규 디펩티다제 단백질일 수 있음을 의미한다.
실시예 8: 인간 PRO327을 코딩하는 cDNA 클론의 단리
발현 서열 태그 (EST) DNA 데이타베이스 (LIFESEQ™, 미국 캘리포니아주 팔로 알토 소재의 인사이트 파마슈티컬)를 조사하고 인간 프로락틴 수용체 단백질과 어느 정도 상동성을 나타내는 여러 가지 EST 서열을 확인했다. 상기 EST 서열을 phrap으로 정렬시켜, 컨센서스 서열을 수득했다. 상기 논의한 EST 서열의 공급원을 사용하여 가능한 한 컨센서스 서열을 신장시키기 위해 BLAST 및 phrap의 반복 사이클을 이용하여 이 컨센서스 서열을 신장시켰다. 신장된 조립 서열은 본원에서 DNA38110이라 지칭된다. 컴퓨터 프로그램 BLAST 또는 BLAST-2 (Altschul et al.,Methods in Enzymology266: 460-480 (1996))를 이용하여 조사를 수행했다. 공지된 단백질을 코딩하지 않는 70 (또는 몇몇 경우 90) 또는 그 이상의 BLAST 스코어를 갖는 비교물을 클러스터시키고, 프로그램 "phrap" (Phil Green, University of Washington, 미국 워싱턴주 시애틀)을 사용하여 컨센서스 DNA 서열로 조립했다.
상기와 같이 수득된 DNA38110 컨센서스 서열을 기초로 하여, 1) 관심 서열을 포함하는 cDNA 라이브러리를 PCR에 의해 확인하고, 2) PRO327의 전장 코딩 서열의 클론을 단리하기 위한 프로브로서 사용하기 위해 올리고뉴클레오티드를 합성했다.
하기의 전방향 및 역방향 PCR 프라이머를 합성했다.
전방향 PCR 프라이머5'-CCCGCCCGACGTGCACGTGAGCC-3' (서열 33)
역방향 PCR 프라이머5'-TGAGCCAGCCCAGGAACTGCTTG-3' (서열 34)
추가로, 다음 뉴클레오티드 서열을 갖는 합성 올리고뉴클레오티드 혼성화 프로브를 컨센서스 DNA38110 컨센서스 서열로부터 제조했다.
혼성화 프로브
5'-CAAGTGCGCTGCAACCCCTTTGGCATCTATGGCTCCAAGAAAGCCGGGAT-3' (서열 35)
전장 클론의 공급원을 찾을 목적으로 몇 개의 라이브러리를 스크리닝하기 위해 상기 확인한 PCR 프라이머쌍을 사용한 PCR 증폭에 의해 라이브러리의 DNA를 스크리닝했다. 그 후, 양성 라이브러리를 사용함으로써 프로브 올리고뉴클레오티드 및 프라이머들 중 하나를 이용하여 PRO327 유전자를 코딩하는 클론을 단리했다. cDNA 라이브러리 제조용 RNA는 인간 태아의 폐 조직 (LIB26)으로부터 단리했다.
상기한 바와 같이 단리된 클론의 DNA 서열 분석을 통하여 PRO327 (본원에서 DNA38113-1230이라 지칭됨)의 전장 DNA 서열 (서열 16) 및 이로부터 유도된 PRO327의 단백질 서열을 수득했다.
DNA38113-1230의 전체 뉴클레오티드 서열을 도 13 (서열 31)에 도시했다. 클론 DNA38113-1230은 뉴클레오티드 위치 119 내지 121에 명백한 번역 개시 부위를 가지며 뉴클레오티드 위치 1385 내지 1387의 정지 코돈에서 종결되는 단일 오픈 리딩 프레임을 포함했다 (도 13). 예상되는 폴리펩티드 전구체는 아미노산 422 개 길이이다 (도 14). 도 14에 나타낸 전장 PRO327 단백질의 추정 분자량은 약 46,302 달톤이고, 추정 pI는 약 9.42이다. 클론 DNA38113-1230을 ATCC에 기탁하여 ATCC 기탁 번호 ATCC 209530을 배정받았다.
전장 PRO327 폴리펩티드의 아미노산 서열 분석 결과, 그가 인간 프로락틴 수용체 단백질과 상당한 상동성이 있음을 시사하며 이는 PRO327이 신규 프로락틴 결합 단백질일 수 있음을 의미한다.
실시예 9: 인간 PRO233를 코딩하는 cDNA 클론의 단리
상기 실시예 1에서 기재된 바와 같이 컨센서스 DNA 서열을 다른 EST 서열에 대해 조립했다. 이 컨센서스 서열은 본원에서 DNA30945로 지칭된다. DNA30945 컨센서스 서열을 기초로 하여, 1) 관심 서열을 포함하는 cDNA 라이브러리를 PCR에 의해 확인하고, 2) PRO233의 전장 코딩 서열의 클론을 단리하기 위한 프로브로서 사용하기 위해 올리고뉴클레오티드를 합성했다.
하기의 PCR 프라이머를 합성했다.
전방향 PCR 프라이머5'-GGTGAAGGCAGAAATTGGAGATG-3' (서열 38)
역방향 PCR 프라이머5'-ATCCCATGCATCAGCCTGTTTACC-3' (서열 39)
추가로, 다음 뉴클레오티드 서열을 갖는 합성 올리고뉴클레오티드 혼성화 프로브를 컨센서스 DNA30945 서열로부터 제조했다.
혼성화 프로브
5 ' -GCTGGTGTAGTCTATACATCAGATTTGTTTGCTACACAAGATCCTCAG-3 ' (서열 40)
전장 클론의 공급원을 찾을 목적으로 몇 개의 라이브러리를 스크리닝하기 위해 상기 확인한 PCR 프라이머쌍을 사용한 PCR 증폭에 의해 라이브러리의 DNA를 스크리닝했다. 그 후, 양성 라이브러리를 사용함으로써 프로브 올리고뉴클레오티드 및 프라이머 쌍들 중 하나를 이용하여 PRO233 유전자를 코딩하는 클론을 단리했다.cDNA 라이브러리 제조용 RNA는 인간 태아의 뇌 조직으로부터 단리했다.
상기한 바와 같이 단리된 클론의 DNA 서열 분석을 통하여 PRO233 (본원에서 DNA34436-1238이라 지칭됨)의 전장 DNA 서열 (서열 36) 및 이로부터 유도된 PRO233의 단백질 서열을 수득했다.
DNA34436-1238의 전체 뉴클레오티드 서열을 도 15 (서열 36)에 도시했다. 클론 DNA34436-1238은 뉴클레오티드 위치 101 내지 103에 명백한 번역 개시 부위를 가지며 뉴클레오티드 위치 1001 내지 1003의 정지 코돈에서 종결되는 단일 오픈 리딩 프레임을 포함했다 (도 15). 예상되는 폴리펩티드 전구체는 아미노산 300 개 길이이다 (도 16). 도 16에 나타낸 전장 PRO233 단백질의 추정 분자량은 약 32,964 달톤이고, 추정 pI는 약 9.52이다. 또한, 신호 펩티드 및 추정적 옥시도리덕타제 활성 부위를 포함하는 관심 영역이 도 16에 도시되어 있다. 클론 DNA34436-1238을 ATCC에 기탁하여 ATCC 기탁 번호 209523를 배정받았다.
전장 PRO233 폴리펩티드의 아미노산 서열 분석 결과, 이 서열은 여러 가지 리덕타제와 상당한 상동성이 있음을 시사하며 이는 PRO233이 신규 리덕타제일 수 있음을 의미한다.
실시예 10: 인간 PRO344을 코딩하는 cDNA 클론의 단리
상기 실시예 1에서 기재된 바와 같이 컨센서스 DNA 서열을 다른 EST 서열에 대해 조립했다. 이 컨센서스 서열은 본원에서 DNA34398로 지칭된다. DNA34398 컨센서스 서열을 기초로 하여, 1) 관심 서열을 포함하는 cDNA 라이브러리를 PCR에 의해 확인하고, 2) PRO344의 전장 코딩 서열의 클론을 단리하기 위한 프로브로서 사용하기 위해 올리고뉴클레오티드를 합성했다.
DNA34398 컨센서스 서열을 기초로 하여, 하기의 전방향 및 역방향 PCR 프라이머를 합성했다.
전방향 PCR 프라이머(34398.f1) 5'-TACAGGCCCAGTCAGGACCAGGGG-3' (서열 43)
전방향 PCR 프라이머(34398.f2) 5'-AGCCAGCCTCGCTCTCGG-3' (서열 44)
전방향 PCR 프라이머(34398.f3) 5'-GTCTGCGATCAGGTCTGG-3' (서열 45)
역방향 PCR 프라이머(34398.r1) 5'-GAAAGAGGCAATGGATTCGC-3' (서열 46)
역방향 PCR 프라이머(34398.r2) 5'-GACTTACACTTGCCAGCACAGCAC-3' (서열 47)
추가로, 다음 뉴클레오티드 서열을 갖는 합성 올리고뉴클레오티드 혼성화 프로브를 DNA34398 컨센서스 서열로부터 제조했다.
혼성화 프로브(34398.p1)
5 '-GGAGCACCACCAACTGGAGGGTCCGGAGTAGCGAGCGCCCCGAAG-3' (서열 48)
전장 클론의 공급원을 찾을 목적으로 몇 개의 라이브러리를 스크리닝하기 위해 상기 확인한 PCR 프라이머쌍들 중 하나를 사용한 PCR 증폭에 의해 라이브러리의 DNA를 스크리닝했다. 그 후, 양성 라이브러리를 사용함으로써 프로브 올리고뉴클레오티드 및 프라이머들 중 하나를 이용하여 PRO344 유전자를 코딩하는 클론을 단리했다. cDNA 라이브러리 제조용 RNA는 인간 태아의 신장 조직으로부터 단리했다.
상기한 바와 같이 단리된 클론의 DNA 서열 분석을 통하여 PRO344 (본원에서 DNA40592-1242이라 지칭됨)의 전장 DNA 서열 (서열 41) 및 이로부터 유도된 PRO344의 단백질 서열을 수득했다.
DNA40592-1242의 전체 뉴클레오티드 서열을 도 17 (서열 41)에 도시했다. 클론 DNA40592-1242은 뉴클레오티드 위치 227 내지 229에 명백한 번역 개시 부위를 가지며 뉴클레오티드 위치 956 내지 958의 정지 코돈에서 종결되는 단일 오픈 리딩 프레임을 포함했다 (도 17). 예상되는 폴리펩티드 전구체는 아미노산 243 개 길이이다 (도 18). 천연 PRO344 아미노산 서열의 중요한 영역은 도 18에 나타낸 바와 같이 신호 펩티드, 성숙 단백질의 개시 및 2 곳의 잠재적 N-미리스토일화 부위를 포함했다. 클론 DNA40592-1242을 ATCC에 기탁하여 ATCC 기탁 번호 ATCC 209492를 배정받았다.
전장 PRO344 폴리펩티드의 아미노산 서열 분석 결과, 이 서열은 여러 가지 인간 및 쥐의 보체 단백질과 상당한 상동성이 있음을 시사하며 이는 PRO344가 신규 보체 단백질일 수 있음을 의미한다.
실시예 11: 인간 PRO347을 코딩하는 cDNA 클론의 단리
상기 실시예 1에서 기재된 바와 같이 컨센서스 DNA 서열을 다른 EST 서열에 대해 조립했다. 이 컨센서스 서열은 본원에서 DNA39499로 지칭된다. DNA39499 컨센서스 서열을 기초로 하여, 1) 관심 서열을 포함하는 cDNA 라이브러리를 PCR에 의해 확인하고, 2) PRO347의 전장 코딩 서열의 클론을 단리하기 위한 프로브로서 사용하기 위해 올리고뉴클레오티드를 합성했다.
하기의 PCR 프라이머 (전방향 및 역방향)를 합성했다.
전방향 PCR 프라이머5'-AGGAACTTCTGGATCGGGCTCACC-3' (서열 51)
역방향 PCR 프라이머5'-GGGTCTGGGCCAGGTGGAAGAGAG-3' (서열 52)
추가로, 다음 뉴클레오티드 서열을 갖는 합성 올리고뉴클레오티드 혼성화 프로브를 컨센서스 DNA39499 서열로부터 제조했다.
혼성화 프로브
5'-GCCAAGGACTCCTTCCGCTGGGCCACAGGGGAGCACCAGGCCTTC-3' (서열 53)
전장 클론의 공급원을 찾을 목적으로 몇 개의 라이브러리를 스크리닝하기 위해 상기 확인한 PCR 프라이머쌍을 사용한 PCR 증폭에 의해 라이브러리의 DNA를 스크리닝했다. 그 후, 양성 라이브러리를 사용함으로써 프로브 올리고뉴클레오티드 및 프라이머들 중 하나를 이용하여 PRO347 유전자를 코딩하는 클론을 단리했다. cDNA 라이브러리 제조용 RNA는 인간 태아의 신장 조직 (LIB228)으로부터 단리했다.
상기한 바와 같이 단리된 클론의 DNA 서열 분석을 통하여 PRO347 (본원에서 DNA44176-1244이라 지칭됨)의 전장 DNA 서열 (서열 49) 및 이로부터 유도된 PRO347의 단백질 서열을 수득했다.
DNA44176-1244의 전체 뉴클레오티드 서열을 도 19 (서열 49)에 도시했다. 클론 DNA44176-1244은 뉴클레오티드 위치 123 내지 125에 명백한 번역 개시 부위를 가지며 뉴클레오티드 위치 1488 내지 1490의 정지 코돈에서 종결되는 단일 오픈 리딩 프레임을 포함했다 (도 19). 예상되는 폴리펩티드 전구체는 아미노산 455 개 길이이다 (도 20). 도 20에 나타낸 전장 PRO347 단백질의 추정 분자량은 약 50,478 달톤이고, 추정 pI는 약 8.44이다. 클론 DNA44176-1244을 ATCC에 기탁하여 ATCC 기탁 번호 ATCC 209532를 배정받았다.
전장 PRO347 폴리펩티드의 아미노산 서열 분석 결과, 이 서열은 여러 가지시스테인 풍부 분비 단백질과 상당한 상동성이 있음을 시사하며 이는 PRO347이 신규 시스테인 풍부 분비 단백질일 수 있음을 의미한다.
실시예 12: 인간 PRO354를 코딩하는 cDNA 클론의 단리
발현 서열 태그 (EST) DNA 데이타베이스 (LIFESEQ™, 미국 캘리포니아주 팔로 알토 소재의 인사이트 파마슈티컬)를 조사하고 인터-알파-트립신 억제제 중쇄 및 서로와 어느 정도 상동성을 나타내는 여러 가지 EST 서열을 확인했다. 상기 상동성 EST 서열을 정렬시켜, 컨센서스 서열을 수득했다. 공공 EST 데이타베이스 (예를 들면, 젠뱅크)와 민간 EST 데이타베이스 (LIFESEQ™, 미국 캘리포니아주 팔로 알토 소재의 인사이트 파마슈티컬) 둘 다로부터 유추된 상동성 EST 서열을 사용하여 가능한 한 컨센서스 서열을 신장하기 위해 BLAST 및 phrap의 반복 사이클을 이용하여 이 수득된 컨센서스 DNA 서열을 신장했다. 본원에서는, 상기 합성된 조립 서열은 DNA39633이라 지칭된다. 컴퓨터 프로그램 BLAST 또는 BLAST-2 (Altschul et al.,Methods in Enzymology266: 460-480 (1996))를 이용하여 조사를 수행했다. 공지된 단백질을 코딩하지 않는 70 (또는 몇몇 경우 90) 또는 그 이상의 BLAST 스코어를 갖는 비교물을 클러스터시키고, 프로그램 "phrap" (Phil Green, University of Washington, 미국 워싱턴주 시애틀)을 사용하여 컨센서스 DNA 서열로 조립했다.
DNA39633 컨센서스 서열을 기초로 하여, 1) 관심 서열을 포함하는 cDNA 라이브러리를 PCR에 의해 확인하고, 2) PRO354의 전장 코딩 서열의 클론을 단리하기 위한 프로브로서 사용하기 위해 올리고뉴클레오티드를 합성했다. 전방향 및 역방향PCR 프라이머는 일반적으로 20 내지 30 개 뉴클레오티드 범위이고, 종종 약 100 내지 1000 bp 길이의 PCR 산물을 제공하도록 고안된다. 프로브 서열의 길이는 통상적으로 40 내지 55 bp이다. 몇몇 경우, 컨센서스 서열이 약 1 내지 1.5 kbp보다 큰 경우 추가의 올리고뉴클레오티드가 합성된다. 전장 클론을 위한 몇 개의 라이브러리를 스크리닝하기 위해, 이들 라이브러리로부터의 DNA를 PCR 프라이머 쌍을 사용하여 문헌 (Ausubel et al.,Current Protocols in Molecular Biology)에 따라 PCR 증폭에 의해 스크리닝했다. 그 후, 양성 라이브러리를 사용함으로써 프로브 올리고뉴클레오티드 및 프라이머 쌍들 중 하나를 이용하여 관심있는 유전자를 코딩하는 클론을 단리했다.
하기의 PCR 프라이머를 합성했다.
전방향 PCR 프라이머 1(39633.fl) 5'-GTGGGAACCAAACTCCGGCAGACC-3' (서열 56)
전방향 PCR 프라이머 2(39633.f2) 5'-CACATCGAGCGTCTCTGG-3' (서열 57)
역방향 PCR 프라이머(39633.rl) 5'-AGCCGCTCCTTCTCCGGTTCATCG-3' (서열 58)
추가로, 다음 뉴클레오티드 서열을 갖는 합성 올리고뉴클레오티드 혼성화 프로브를 컨센서스 DNA39633 서열로부터 제조했다.
혼성화 프로브
5'-TGGAAGGACCACTTGATATCAGTCACTCCAGACAGCATCAGGGATGGG-3' (서열 59)
전장 클론의 공급원을 찾을 목적으로 몇 개의 라이브러리를 스크리닝하기 위해 상기 확인한 PCR 프라이머쌍들을 사용한 PCR 증폭으로 라이브러리의 DNA를 스크리닝했다. 그 후, 양성 라이브러리를 사용함으로써 프로브 올리고뉴클레오티드 및프라이머 쌍들 중 하나를 이용하여 PRO354 유전자를 코딩하는 클론을 단리했다.
cDNA 라이브러리 제조용 RNA는 인간 태아의 신장 조직 (LIB227)으로부터 단리했다. cDNA 클론을 단리하기 위해 사용되는 cDNA 라이브러리는 인비트로젠 (Invitrogen, 미국 캘리포니아주 샌디에고)으로부터의 시약들과 같은 시판 시약을 사용하여 표준 방법으로 제작했다. cDNA를 NotI 부위를 갖는 올리고 dT로 프라이밍시키고, 헤미키나제 처리된 SalI 어댑터에 평활 말단으로 연결시키고, NotI로 절단하고, 겔 전기영동로 크기에 따라 적절하게 분류하고, 적당한 클로닝 벡터 (예를 들면, pRKB 또는 pRKD; pRK5B는 SfiI 부위를 포함하지 않는 pRK5D의 전구체임; 문헌 (Holmes et al.,Science,253: 1278-1280 (1991)) 참조)내의 유일한 XhoI 및 NotI 부위에 정해진 방향으로 클로닝했다.
상기한 바와 같이 단리된 클론의 DNA 서열 분석을 통하여 PRO354 (본원에서 DNA44192-1246이라 지칭됨)의 전장 DNA 서열 (서열 54) 및 이로부터 유도된 PRO354의 단백질 서열을 수득했다.
DNA44192-1246의 전체 뉴클레오티드 서열을 도 21 (서열 54)에 도시했다. 클론 DNA44192-1246은 뉴클레오티드 위치 72 내지 74에 명백한 번역 개시 부위를 가지며 뉴클레오티드 위치 2154 내지 2156의 정지 코돈에서 종결되는 단일 오픈 리딩 프레임을 포함했다 (도 21). 예상되는 폴리펩티드 전구체는 아미노산 694 개 길이이다 (도 22). 도 22에 나타낸 전장 PRO354 단백질의 추정 분자량은 약 77,400 달톤이고, 추정 pI는 약 9.54이다. 클론 DNA44192-1246을 ATCC에 기탁하여 ATCC 기탁 번호 ATCC 209531을 배정받았다.
전장 PRO354 폴리펩티드의 아미노산 서열 분석 결과, 그가 인터-알파-트립신 중쇄 단백질과 상당한 상동성이 있음을 시사하며 이는 PRO354가 신규 인터-알파-트립신 억제제 중쇄 단백질 상동체일 수 있음을 의미한다.
실시예 13: 인간 PRO355를 코딩하는 cDNA 클론의 단리
상기 실시예 1에서 기재된 바와 같이 BLAST 및 phrap을 이용하여 컨센서스 DNA 서열을 다른 EST 서열에 대해 조립했다. 이 컨센서스 서열은 본원에서 DNA35702로 지칭된다. DNA35702 컨센서스 서열을 기초로 하여, 1) 관심 서열을 포함하는 cDNA 라이브러리를 PCR에 의해 확인하고, 2) PRO355의 전장 코딩 서열의 클론을 단리하기 위한 프로브로서 사용하기 위해 올리고뉴클레오티드를 합성했다.
하기의 전방향 및 역방향 PCR 프라이머를 합성했다.
전방향 PCR 프라이머5'-GGCTTCTGCTGITGCTCTTCTCCG-3' (서열 62)
전방향 PCR 프라이머5'-GTACACTGTGACCAGTCAGC-3' (서열 63)
전방향 PCR 프라이머5'-ATCATCACAGATTCCCGAGC-3' (서열 64)
역방향 PCR 프라이머5'-TTCAATCTCCTCACCTTCCACCGC-3' (서열 65)
역방향 PCR 프라이머5'-ATAGCTGTGTCTGCGTCTGCTGCG-3' (서열 66)
추가로, 다음 뉴클레오티드 서열을 갖는 합성 올리고뉴클레오티드 혼성화 프로브를 컨센서스 DNA35702 서열로부터 제조했다.
혼성화 프로브
5 '-CGCGGCACTGATCCCCACAGGTGATGGGCAGAATCTGTTTACGAAAGACG-3' (서열 67)
전장 클론의 공급원을 찾을 목적으로 몇 개의 라이브러리를 스크리닝하기 위해 상기 확인한 PCR 프라이머쌍들 중 하나를 사용한 PCR 증폭에 의해 라이브러리의 DNA를 스크리닝했다. 그 후, 양성 라이브러리를 사용함으로써 프로브 올리고뉴클레오티드 및 프라이머 쌍들 중 하나를 이용하여 PRO355 유전자를 코딩하는 클론을 단리했다. cDNA 라이브러리 제조용 RNA는 인간 태아의 간 조직으로부터 단리했다.
상기한 바와 같이 단리된 클론의 DNA 서열 분석을 통하여 PRO355 (본원에서 DNA39518-1247이라 지칭됨)의 전장 DNA 서열 (서열 60) 및 이로부터 유도된 PRO355의 단백질 서열을 수득했다.
DNA39518-1247의 전체 뉴클레오티드 서열을 도 23 (서열 60)에 도시했다. 클론 DNA39518-1247은 뉴클레오티드 위치 22 내지 24에 명백한 번역 개시 부위를 가지며 뉴클레오티드 위치 1342 내지 1344의 정지 코돈에서 종결되는 단일 오픈 리딩 프레임을 포함했다 (도 23). 예상되는 폴리펩티드 전구체는 아미노산 440 개 길이이다 (도 24). 도 24에 나타낸 전장 PRO355 단백질의 추정 분자량은 약 48,240 달톤이고, 추정 pI는 약 4.93이다. 추가로, 신호 펩티드, 세포외 도메인의 Ig 반복부, 잠재적 N-글리코실화 부위 및 잠재적 막횡단 도메인을 포함하는 관심 영역이 도 24에 나타나 있다. 클론 DNA39518-1247을 ATCC에 기탁하여 ATCC 기탁 번호 ATCC 209529를 배정받았다.
전장 PRO355 폴리펩티드의 아미노산 서열 분석 결과, 이 서열은 CRTAM 단백질과 상당한 상동성이 있음을 시사하며 이는 PRO355가 CRTAM 단백질일 수 있음을 의미한다.
실시예 14: 인간 PRO357을 코딩하는 cDNA 클론의 단리
서열 발현 태그 클론 번호 "2452972" (캘리포니아주 팔로 알토 소재의 인사이트 파마슈티컬에서 시판함)를 사용하여 데이타베이스를 조사를 시작했다. 스위스-프롯 (Swiss-Prot) 공공 데이타베이스로부터 약 950 개의 공지된 분비 단백질로부터의 세포외 도메인 (ECD) 서열 (분비 신호 서열이 존재하는 경우에는 이를 포함함)을 사용하여 발현 서열 태그 (EST) 데이타베이스를 조사하였는데, 이는 인사이트 EST 클론 번호 "2452972"의 일부와 중복된다. EST 데이타베이스는 공공 데이타베이스 (예를 들면, 젠뱅크)와 민간 데이타베이스 (LIFESEQ™, 미국 캘리포니아주 팔로 알토 소재의 인사이트 파마슈티컬)를 포함했다. EST 서열의 6 개 프레임 번역에 대한 ECD 단백질 서열의 비교로서 컴퓨터 프로그램 BLAST 또는 BLAST-2 (Altschul et al.,Methods in Enzymology266: 460-480 (1996))를 이용하여 조사를 수행했다. 공지된 단백질을 코딩하지 않는 70 (또는 몇몇 경우 90) 또는 그 이상의 BLAST 스코어를 갖는 비교물을 클러스터시키고, 프로그램 "phrap" (Phil Green, University of Washington, 미국 워싱턴주 시애틀)을 사용하여 컨센서스 DNA 서열로 조립했다.
그 후에, phrap을 이용하여 컨센서스 DNA 서열을 다른 EST 서열에 대해 조립했다. 이 컨센서스 서열은 본원에서 DNA37162라고 지칭된다. 이 경우, 상기 논의한 EST 서열의 공급원을 사용하여 가능한 한 컨센서스 서열을 신장시키기 위해 BLAST 및 phrap의 반복 사이클을 이용하여 이 컨센서스 서열을 신장시켰다.
DNA37162 컨센서스 서열을 기초로 하여, 1) 관심 서열을 포함하는 cDNA 라이브러리를 PCR에 의해 확인하고, 2) PRO357의 전장 코딩 서열의 클론을 단리하기 위한 프로브로서 사용하기 위해 올리고뉴클레오티드를 합성했다. 전방향 및 역방향 PCR 프라이머는 일반적으로 20 내지 30 개 뉴클레오티드 범위이고, 종종 약 100 내지 1000 bp 길이의 PCR 산물을 제공하도록 고안된다. 프로브 서열의 길이는 통상적으로 40 내지 55 bp이다. 몇몇 경우, 컨센서스 서열이 약 1 내지 1.5 kbp보다 큰 경우 추가의 올리고뉴클레오티드가 합성된다. 전장 클론을 위한 몇 개의 라이브러리를 스크리닝하기 위해, 이들 라이브러리로부터의 DNA를 PCR 프라이머 쌍을 사용하여 문헌 (Ausubel et al.,Current Protocols in Molecular Biology)에 따라 PCR 증폭에 의해 스크리닝했다. 그 후, 양성 라이브러리를 사용함으로써 프로브 올리고뉴클레오티드 및 프라이머 쌍들 중 하나를 이용하여 관심있는 유전자를 코딩하는 클론을 단리했다.
하기의 PCR 프라이머를 합성했다.
전방향 프라이머 15'-CCCTCCACTGCCCCACCGACTG-3' (서열 70),
역방향 프라이머 15'-CGGTTCTGGGGACGTTAGGGCTCG-3' (서열 71) 및
전방향 프라이머 25'-CTGCCCACCGTCCACCTGCCTCAAT-3' (서열 72).
추가로, 다음 뉴클레오티드 서열을 갖는 2 개의 합성 올리고뉴클레오티드 혼성화 프로브를 컨센서스 DNA37162 서열로부터 제조했다.
혼성화 프로브 1
5' -AGGACTGCCCACCGTCCACCTGCCTCAATGGGGGCACATGCCACC-3'(서열 73) 및
혼성화 프로브 2
5'-ACGCAAAGCCCTACATCTAAGCCAGAGAGAGACAGGGCAGCTGGG-3'(서열 74).
전장 클론의 공급원을 찾을 목적으로 몇 개의 라이브러리를 스크리닝하기 위해 상기 확인한 PCR 프라이머쌍을 사용한 PCR 증폭에 의해 라이브러리의 DNA를 스크리닝했다. 그 후, 양성 라이브러리를 사용함으로써 프로브 올리고뉴클레오티드 및 프라이머 쌍들 중 하나를 이용하여 PRO357 유전자를 코딩하는 클론을 단리했다.
cDNA 라이브러리 제조용 RNA는 인간 태아의 간 조직으로부터 단리했다. cDNA 클론을 단리하기 위해 사용되는 cDNA 라이브러리는 인비트로젠 (Invitrogen, 미국 캘리포니아주 샌디에고)으로부터의 시약들과 같은 시판 시약을 사용하여 표준 방법으로 제작했다. cDNA를 NotI 부위를 갖는 올리고 dT로 프라이밍시키고, 헤미키나제 처리된 SalI 어댑터에 평활 말단으로 연결시키고, NotI로 절단하고, 겔 전기영동로 크기에 따라 적절하게 분류하고, 적당한 클로닝 벡터 (예를 들면, pRKB 또는 pRKD; pRK5B는 SfiI 부위를 포함하지 않는 pRK5D의 전구체임; 문헌 (Holmes et al.,Science,253: 1278-1280 (1991)) 참조)내의 유일한 XhoI 및 NotI 부위에 정해진 방향으로 클로닝했다.
상기한 바와 같이 단리된 클론의 DNA 서열 분석을 통하여 PRO357 (본원에서 DNA44804-1248이라 지칭됨)의 전장 DNA 서열 (서열 68) 및 이로부터 유도된 PRO357의 단백질 서열을 수득했다.
DNA44804-1248의 전체 뉴클레오티드 서열을 도 25 (서열 68)에 도시했다. 클론 DNA44804-1248은 뉴클레오티드 위치 137 내지 139에 명백한 번역 개시 부위를 가지며 뉴클레오티드 위치 1931 내지 1933의 정지 코돈에서 종결되는 단일 오픈 리딩 프레임을 포함했다 (도 25). 예상되는 폴리펩티드 전구체는 아미노산 598 개길이이다 (도 26). 클론 DNA44804-1248을 ATCC에 기탁하여 ATCC 기탁 번호 ATCC 209527을 배정받았다.
따라서, 전장 PRO357의 아미노산 서열 분석 결과, 이 서열은 ALS와 상당한 상동성이 있음을 시사하며 이는 PRO357이 ALS에 관련된 신규 류신 풍부 반복부 단백질일 수 있음을 의미한다.
실시예 15: 인간 PRO715을 코딩하는 cDNA 클론의 단리
인간 TNF-α와 상동성이 있는 폴리펩티드를 코딩하는 EST 서열을 찾기 위해 민간 EST DNA 데이타베이스 (LIFESEQ™, 미국 캘리포니아주 팔로 알토 소재의 인사이트 파마슈티컬)를 조사했다. 상기 조사 결과, 인사이트 발현 서열 태그 (Incyte Expressed Sequence Tag) 번호 2099855가 확인되었다.
그 후에, 시퀘스트 (seqext) 및 "phrap" (Phil Green, University of Washington, 미국 워싱턴주 시애틀)을 사용하여 컨센서스 DNA 서열을 다른 EST 서열에 대해 조립했다. 상기 컨센서스 서열은 본원에서 DNA52092이라 지칭된다. 상기 조립체에서 확인된 여러 가지 EST 클론의 정렬을 기초로 하여, 머크 워싱턴 대학 EST 세트로부터 단일 EST 클론 (EST 클론 번호 725887, Acession No. AA292358)을 얻어 그의 삽입체 서열을 분석했다. 그 후에, EST 클론 번호 725887로부터 삽입체 DNA의 서열을 분석하여 전장 DNA52722-1229 서열을 수득했다.
DNA52722-1229의 전체 뉴클레오티드 서열을 도 27 (서열 75)에 도시했다. 클론 DNA52722-1229은 뉴클레오티드 위치 114 내지 116에 명백한 번역 개시 부위를 가지며 뉴클레오티드 위치 864 내지 866의 정지 코돈에서 종결되는 단일 오픈 리딩프레임을 포함했다 (도 27). 예상되는 폴리펩티드 전구체는 아미노산 250 개 길이이다 (도 28). 도 28에 나타낸 전장 PRO715 단백질의 추정 분자량은 약 27,433 달톤이고, 추정 pI는 약 9.85이다.
전장 PRO715의 아미노산의 분석 결과, 그가 단백질 중 종양 괴사 인자 족의 구성원과 상당한 상동성이 있음을 시사하며 이는 PRO715가 신규 종양 괴사 인자 단백질임을 의미한다.
실시예 16: 인간 PRO353를 코딩하는 cDNA 클론의 단리
상기 실시예 1에서 기재된 바와 같이 phrap을 이용하여 컨센서스 DNA 서열을 다른 EST 서열에 대해 조립했다. 이 컨센서스 서열은 본원에서 DNA36363이라 지칭된다. 상기 논의한 EST 서열의 공급원을 사용하여 가능한 한 컨센서스 서열을 신장시키기 위해 BLAST 및 phrap의 반복 사이클을 이용하여 이 컨센서스 서열을 신장시켰다. DNA36363 컨센서스 서열을 기초로 하여, 1) 관심 서열을 포함하는 cDNA 라이브러리를 PCR에 의해 확인하고, 2) PRO353의 전장 코딩 서열의 클론을 단리하기 위한 프로브로서 사용하기 위해 올리고뉴클레오티드를 합성했다.
DNA36363 컨센서스 서열을 기초로 하여, 하기의 전방향 및 역방향 PCR 프라이머를 합성했다.
전방향 PCR 프라이머5'-TACAGGCCCAGTCAGGACCAGGGG-3' (서열 79)
역방향 PCR 프라이머5'-CTGAAGAAGTAGAGGCCGGGCACG-3' (서열 80).
추가로, 다음 뉴클레오티드 서열을 갖는 합성 올리고뉴클레오티드 혼성화 프로브를 DNA36363 컨센서스 서열로부터 제조했다.
혼성화 프로브
5 '-CCCGGTGCTTGCGCTGCTGTGACCCCGGTACCTCCATGTACCCGG-3' (서열 81)
전장 클론의 공급원을 찾을 목적으로 몇 개의 라이브러리를 스크리닝하기 위해 상기 확인한 PCR 프라이머쌍을 사용한 PCR 증폭에 의해 라이브러리의 DNA를 스크리닝했다. 그 후, 양성 라이브러리를 사용함으로써 프로브 올리고뉴클레오티드 및 프라이머 쌍들 중 하나를 이용하여 PRO353 유전자를 코딩하는 클론을 단리했다. cDNA 라이브러리 제조용 RNA는 인간 태아의 신장 조직으로부터 단리했다.
상기한 바와 같이 단리된 클론의 DNA 서열 분석을 통하여 PRO353 (본원에서 DNA41234-1242이라 지칭됨)의 전장 DNA 서열 (서열 77) 및 이로부터 유도된 PRO353의 단백질 서열을 수득했다.
DNA41234-1242의 전체 뉴클레오티드 서열을 도 29 (서열 77)에 도시했다. 클론 DNA41234-1242은 뉴클레오티드 위치 305 내지 307에 명백한 번역 개시 부위를 가지며 뉴클레오티드 위치 1148 내지 1150의 정지 코돈에서 종결되는 단일 오픈 리딩 프레임을 포함했다 (도 29). 예상되는 폴리펩티드 전구체는 아미노산 281 개 길이이다 (도 30). PRO353에 의해 코딩된 폴리펩티드 서열의 중요한 영역은 아미노산 1 내지 26에 상응하는 신호 펩티드, 아미노산 위치 27의 성숙 단백질의 시작부, 아미노산 93 내지 98에 상응하는 잠재적 N-글리코실화 부위 및 아미노산 99 내지 281에 상응하는 30 kd 지방세포 보체-관련 단백질 전구체와 상동성이 있는 영역을 포함했다. 클론 DNA41234-1242을 ATCC에 기탁하여 ATCC 기탁 번호 ATCC 209618을 배정받았다
전장 PRO353 폴리펩티드의 아미노산 서열 분석 결과, 이 서열은 인간 및 쥐의 보체 단백질 일부와 상당한 상동성이 있음을 시사하며 이는 PRO353이 신규 보체 단백질일 수 있음을 의미한다.
실시예 17: 인간 PRO361을 코딩하는 cDNA 클론의 단리
상기 실시예 1에서 기재된 바와 같이 phrap을 이용하여 컨센서스 DNA 서열을 다른 EST 서열에 대해 조립했다. 이 컨센서스 서열은 본원에서 DNA40654로 지칭된다. DNA40654 컨센서스 서열을 기초로 하여, 1) 관심 서열을 포함하는 cDNA 라이브러리를 PCR에 의해 확인하고, 2) PRO361의 전장 코딩 서열의 클론을 단리하기 위한 프로브로서 사용하기 위해 올리고뉴클레오티드를 합성했다.
하기의 전방향 및 역방향 PCR 프라이머를 합성했다.
전방향 PCR 프라이머5'-AGGGAGGATTATCCTTGACCTTTGAAGACC-3' (서열 84)
전방향 PCR 프라이머5'-GAAGCAAGTGCCCAGCTC-3' (서열 85)
전방향 PCR 프라이머5'-CGGGTCCCTGCTCTTTGG-3' (서열 86)
역방향 PCR 프라이머5'-CACCGTAGCTGGGAGCGCACTCAC-3' (서열 87)
역방향 PCR 프라이머5'-AGTGTAAGTCAAGCTCCC-3' (서열 88)
또한, 하기 뉴클레오티드 서열을 갖는 컨센서스 DNA40654 서열로부터 합성 올리고뉴클레오티드 혼성화 프로브를 만들었다.
혼성화 프로브
5'-GCTTCCTGACACTAAGGCTGTCTGCTAGTCAGAATTGCCTCAAAAAGAG-3' (서열 89)
전장 클론의 공급원을 찾을 목적으로 몇 개의 라이브러리를 스크리닝하기 위해 상기 확인한 PCR 프라이머쌍 중 하나를 사용한 PCR 증폭으로 라이브러리의 DNA를 스크리닝했다. 그 후, 양성 라이브러리를 사용함으로써 프로브 올리고뉴클레오티드 및 프라이머 쌍들 중 하나를 이용하여 PRO361 유전자를 코딩하는 클론을 단리했다. cDNA 라이브러리 제조용 RNA는 인간 태아의 신장 조직으로부터 단리했다.
상기한 바와 같이 단리된 클론의 DNA 서열 분석을 통하여 PRO361 (본원에서 DNA45410-1250이라 지칭됨)의 전장 DNA 서열 (서열 82) 및 이로부터 유도된 PRO361의 단백질 서열을 수득했다.
DNA45410-1250의 전체 뉴클레오티드 서열을 도 31 (서열 82)에 도시했다. 클론 DNA45410-1250은 뉴클레오티드 위치 226 내지 228에서 명백한 번역 개시 부위를 가지며 뉴클레오티드 위치 1519 내지 1521의 정지 코돈에서 종결되는 단일 오픈 리딩 프레임을 포함했다 (도 31). 예상되는 폴리펩티드 전구체는 아미노산 431 개 길이이다 (도 32). 도 32에 나타낸 전장 PRO361 단백질의 추정 분자량은 약 46,810달톤이고, 추정 pI는 약 6.45이다. 또한, 막횡단 도메인 (아미노산 380 내지 409) 및 아르기나제 족 단백질의 전형적인 서열 (아미노산 3 내지 14 및 39 내지 57)을 포함하는 관심있는 영역이 도 32에 표시되어 있다. 클론 DNA45410-1250을 ATCC에 기탁하여 ATCC 기탁 번호 ATCC 209621를 배정받았다.
전장 PRO361 폴리펩티드의 아미노산 서열 분석 결과, 이 서열은 뮤신 및(또는) 키티나제 단백질과 상당한 상동성이 있음을 시사하며 이는 PRO361이 신규 뮤신 및(또는) 키티나제 단백질일 수 있음을 의미한다.
실시예 18: 인간 PRO365를 코딩하는 cDNA 클론의 단리
상기 실시예 1에서 기재된 바와 같이 phrap을 이용하여 컨센서스 DNA 서열을 다른 EST 서열에 대해 조립했다. 이 컨센서스 서열은 본원에서 DNA35613로 지칭된다. DNA35613 컨센서스 서열을 기초로 하여, 1) 관심 서열을 포함하는 cDNA 라이브러리를 PCR에 의해 확인하고, 2) PRO365의 전장 코딩 서열의 클론을 단리하기 위한 프로브로서 사용하기 위해 올리고뉴클레오티드를 합성했다.
하기의 전방향 및 역방향 PCR 프라이머를 합성했다.
전방향 PCR 프라이머5'-AATGTGACCACTGGACTCCC-3' (서열 92)
전방향 PCR 프라이머5'-AGGCTTGGAACTCCCTTC-3' (서열 93)
역방향 PCR 프라이머5'-AAGATTCTTGAGCGATTCCAGCTG-3' (서열 94)
추가로, 다음 뉴클레오티드 서열을 갖는 합성 올리고뉴클레오티드 혼성화 프로브를 컨센서스 DNA35613 서열로부터 제조했다.
혼성화 프로브
5'-AATCCCTGCTCTTCATGGTGACCTATGACGACGGAAGCACAAGACTG-3' (서열 95)
전장 클론의 공급원을 찾을 목적으로 몇 개의 라이브러리를 스크리닝하기 위해 상기 확인한 PCR 프라이머쌍을 사용한 PCR 증폭에 의해 라이브러리의 DNA를 스크리닝했다. 그 후, 양성 라이브러리를 사용함으로써 프로브 올리고뉴클레오티드 및 프라이머들 중 하나를 이용하여 PRO365 유전자를 코딩하는 클론을 단리했다. cDNA 라이브러리 제조용 RNA는 인간 태아의 신장 조직으로부터 단리했다.
상기한 바와 같이 단리된 클론의 DNA 서열 분석을 통하여 PRO365 (본원에서 DNA46777-1253이라 지칭됨)의 전장 DNA 서열 (서열 90) 및 이로부터 유도된 PRO365의 단백질 서열을 수득했다.
DNA46777-1253의 전체 뉴클레오티드 서열을 도 33 (서열 90)에 도시했다. 클론 DNA46777-1253은 뉴클레오티드 위치 15 내지 17에 명백한 번역 개시 부위를 가지며 뉴클레오티드 위치 720 내지 722의 정지 코돈에서 종결되는 단일 오픈 리딩 프레임을 포함했다 (도 33). 예상되는 폴리펩티드 전구체는 아미노산 235 개 길이이다 (도 34). 클론 DNA46777-1253에 의해 코딩된 폴리펩티드 서열의 중요한 영역이 확인되었고, 하기 서열을 포함했다: 아미노산 1 내지 20에 상응하는 신호 펩티드, 아미노산 21에 상응하는 성숙 단백질의 시작부 및 도 34에 나타난 바와 같이 다수의 근원적인 N-글리코실화 부위. 클론 DNA46777-1253을 ATCC에 기탁하여 ATCC 기탁번호 ATCC 209619를 배정받았다.
전장 PRO365 폴리펩티드의 아미노산 서열 분석 결과, 이 서열은 인간 2-19 단백질과 상당한 상동성이 있음을 시사하며 이는 PRO365가 신규 인간 2-19 단백질의 상동체일 수 있음을 의미한다.
실시예 19: PRO 폴리펩티드를 코딩하는 핵산의 혼성화 프로브로의 용도
다음 방법은 PRO를 코딩하는 뉴클레오티드 서열의 혼성화 프로브로서의 용도를 기술한다.
인간 조직 cDNA 라이브러리 또는 인간 조직 게놈 라이브러리에서 상동성 DNA (예를 들면, PRO의 천연 변종을 코딩하는 것)를 스크리닝하기 위한 프로브로 본원에 기술한 바와 같이 전장 또는 성숙 PRO 폴리펩티드의 코딩 서열을 포함하는 DNA가 사용된다.
이들 라이브러리 DNA를 포함하는 필터의 혼성화 및 세척을 다음의 고엄격 조건 하에 수행한다. 방사선 표지된 PRO 유도 프로브의 필터로의 혼성화를 42 ℃에서 50 % 포름아미드, 5×SSC, 0.1 % SDS, 0.1 % 피로인산나트륨, 50 mM 인산나트륨, pH 6.8, 2×덴하르트 (Denhardt's) 용액 및 10 % 덱스트란 술페이트 용액 중에 20 시간 동안 수행한다. 필터의 세척을 42 ℃에서 0.1×SSC 및 0.1 % SDS의 수용액 중에 수행한다.
그 후, 전장 천연 서열 PRO 폴리펩티드를 코딩하는 DNA와 원하는 서열 동일성을 갖는 DNA를 당업계에 공지된 표준 방법으로 확인한다.
실시예 20: 대장균에서 PRO 폴리펩티드의 발현
본 실시예는 대장균 내의 재조합 발현에 의해 PRO를 비글리코실화된 형태로 제조하는 방법을 설명한다.
먼저 선택된 PCR 프라이머를 이용하여 PRO를 코딩하는 DNA 서열을 증폭시킨다. 프라이머는 선택된 발현 벡터 상의 제한 효소 부위에 해당하는 제한 효소 부위를 포함해야만 한다. 다양한 발현 벡터가 사용될 수 있다. 적합한 벡터의 예로는 앰피실린 및 테트라사이클린 내성 유전자를 포함하는 pBR322 (대장균에서 유래; 문헌 (Bolivar et al., Gene 2:95 (1977)) 참조)가 있다. 벡터를 제한 효소로 절단하고 탈인산화시킨다. 그 후, PCR 증폭된 서열을 벡터에 라이게이션시킨다. 벡터는 바람직하게는 항생제 내성 유전자, trp 프로모터, 폴리his 리더 (처음 6 개의 STII 코돈, 폴리his 서열 및 엔테로키나제 절단 부위를 포함), PRO 코딩 영역, 람다 전사 터미네이터 및 argU 유전자를 코딩하는 서열을 포함할 것이다.
그 후, 라이게이션 혼합물을 사용하여 문헌 (Sambrook et al., 상기 문헌)에 기재된 방법으로 선택된 대장균 균주를 형질전환시킨다. LB 플레이트에서의 성장 능력으로 형질전환체를 확인하고 항생제 내성을 갖는 콜로니를 선택한다. 플라스미드 DNA를 제한 분석법 및 DNA 서열 분석을 이용하여 단리하고 확인할 수 있다.
선택된 클론을 항생제가 보충된 LB 브로스와 같은 액체 배양 배지에서 밤새 배양한다. 이 철야 배양물을 더 큰 규모의 배지에 접종할 수 있다. 그 후, 세포를 발현 프로모터가 작동되는 동안 원하는 광학 밀도까지 배양시킨다.
수시간 이상 동안 세포를 배양한 후에 원심분리로 세포를 회수할 수 있다. 원심분리로 얻어진 세포 펠렛을 당업계에 공지된 여러가지 시약을 사용해서 용해시킬 수 있고, 용해된 PRO 단백질을 단백질이 강하게 결합하도록 하는 조건 하에 금속 킬레이트 컬럼을 사용하여 정제할 수 있다.
다음 방법을 사용하면 대장균에서 폴리-his 태그가 부착된 형태로 PRO를 발현시킬 수 있다. 먼저 선택된 PCR 프라이머를 이용하여 PRO를 코딩하는 DNA 서열을 증폭시킨다. 프라이머는 선택된 발현 벡터 상의 제한 효소 부위에 해당하는 제한 효소 부위, 및 효율적이고 신뢰할 만한 번역 개시, 금속 킬레이트 컬럼을 통한 빠른 정제, 엔테로키나제를 사용한 단백질 가수 분해 제거를 제공하는 다른 유용한 서열을 포함할 것이다. 그 후 PCR 증폭된, 폴리-his 태그가 부착된 서열을 발현 벡터에 라이게이션시키고 이것을 사용하여 대장균 숙주 (균주 52 (W3110fuhA (tonA) lon galE rpoHts (htpRts) clpP (lacIq))를 형질전환시킨다. 우선 형질전환체를 50 ㎎/㎖의 카르베니실린 (carbenicillin)을 포함하는 LB에서 O.D.600이 3내지 5에 도달할 때까지 30 ℃에서 진탕 배양한다. 그 후, 배양물을 CRAP 배지 (물 500 ㎖ 중에 3.57 g의 (NH4)2SO4, 0.71 g의 시트르산나트륨·2H2O, 1.07 g의 KCl, 5.36 g의 Difco 효모 추출물, 5.36 g의 쉐필드 히카제 (Sheffield hycase) SF 뿐 아니라 110 mM MPOS, pH 7.3, 0.55 % (w/v) 글루코스 및 7 mM MgSO4을 혼합하여 제조함)로 50 내지 100 배 희석하고, 약 20 내지 30 시간 동안 30 ℃에서 진탕 배양시킨다. 시료를 취해 SDS-PAGE 분석법으로 발현을 확인하고 대량 배양물을 원심분리하여 세포를 펠렛으로 만든다. 정제하고 리폴딩시킬 때까지 세포 펠렛을 냉동시킨다.
0.5 내지 1 ℓ 발효액으로부터 얻은 대장균 페이스트 (펠렛 6 내지 10 g)를 10 배 부피 (w/v)의 7 M 구아니딘, 20 mM Tris, pH 8 완충액에 재현탁시킨다. 고체 아황산나트륨 및 테트라티온산나트륨을 각각 최종 농도 0.1 M과 0.02 M이 되도록 첨가하고 이 용액을 4 ℃에서 밤새 교반한다. 이 단계에서 모든 시스테인 잔기가 아황산염화에 의해 차단된 변성 단백질이 생성된다. 이 용액을 벡크만 (Beckman) 초원심 분리기로 40,000 rpm에서 30 분간 원심분리한다. 상층액을 3 내지 5 배 부피의 금속 킬레이트 컬럼 완충액 (6 M 구아니딘, 20 mM Tris, pH 7.4)으로 희석하고 0.22 마이크론 필터로 여과시켜 정화한다. 정화된 추출물을 금속 킬레이트 컬럼 완충액으로 평형화된 5 ㎖ Qiagen Ni-NTA 금속 킬레이트 컬럼에 로딩한다. 컬럼을 50 mM 이미다졸 (Calbiochem, Utrol grade)을 포함하는 추가의 완충액 (pH 7.4)으로 세척한다. 단백질을 250 mM 이미다졸을 포함하는 완충액으로 용출시킨다. 목적 단백질을 포함하는 분획을 모아 4 ℃에 보관한다. 아미노산 서열을 기초로 계산된 흡광 계수를 이용하여 280 nm에서의 흡광도로 단백질 농도를 측정한다.
새로 제조한 리폴딩 완충액 (20 mM Tris, pH 8.6, 0.3 M NaCl, 2.5 M 우레아, 5 mM 시스테인, 20 mM 글리신 및 1 mM EDTA로 구성됨)으로 시료를 천천히 희석시켜 단백질을 리폴딩시킨다. 리폴딩 부피는 최종 단백질 농도가 50 내지 100 ㎍/㎖가 되도록 정한다. 리폴딩 용액을 4 ℃에서 12 내지 36 시간 동안 완만하게 교반한다. 최종 농도가 0.4 % (약 pH 3)가 되도록 TFA를 첨가하여 리폴딩 반응을 정지시킨다. 추가로 단백질을 정제하기 전에, 용액을 0.22 마이크론 필터로 여과시키고 아세토니트릴을 최종 농도 2 내지 10 %가 되도록 첨가한다. 리폴딩된 단백질을 0.1 % TFA의 이동 완충액을 사용하는 Poros R1/H 역상 컬럼에 크로마토그래피시켜 10 내지 80 %의 아세토니트릴 구배로 용출시킨다. A280 흡광도를 보이는 분획의 분액을 SDS 폴리아크릴아미드 겔로 분석하여 균질하게 리폴딩된 단백질을 포함하는 분획을 모은다. 일반적으로, 리폴딩된 단백질은 역상 수지와의 상호작용으로부터 가려지는 소수성 내부를 가져서 가장 압축되어 있기 때문에, 대부분의 단백질중에서 적절하게 리폴딩된 단백질 종 (species)은 아세토니트릴의 가장 낮은 농도에서 용출된다. 응집된 종은 보통 좀더 높은 아세토니트릴 농도에서 용출된다. 역상 단계는 원하는 형태의 단백질로부터 잘못 폴딩된 형태의 단백질을 분리해 낼 뿐 아니라, 시료로부터 내독소를 제거하기도 한다.
원하는 폴딩된 PRO 폴리펩티드를 포함하는 분획을 모으고, 이 용액으로 질소기류를 흘려주어 아세토니트릴을 제거한다. 투석법, 또는 제제화 완충액으로 평형화되고 멸균 여과된 G25 Superfine (Pharmacia) 수지를 사용한 겔 여과법을 사용하여 단백질을 0.14 M 염화나트륨 및 4 % 만니톨을 포함하는 20 mM Hepes, pH 6.8로 제제화한다.
본원에 개시된 많은 PRO 폴리펩티드가 상기 기재된 바와 같이 성공적으로 발현되었다.
실시예 21: 포유류 세포에서 PRO 폴리펩티드의 발현
본 실시예는 포유류 세포내의 재조합 발현에 의해 잠재적 글리코실화된 형태의 PRO를 제조하는 방법을 설명한다.
벡터 pRK5 (1989년 3월 15일 공개된 EP 307,247 참조)를 발현 벡터로 사용한다. 경우에 따라, 문헌 (Sambrook et al., 상기 문헌)에 기재된 바와 같은 라이게이션 방법처럼 PRO DNA를 선택된 제한 효소를 사용하여 pRK5에 라이게이션시켜, PRO DNA를 삽입되도록 한다. 생성 벡터는 pRK5-PRO 폴리펩티드라고 지칭된다.
한 실시양태에서, 선택된 숙주 세포는 293 세포일 수 있다. 인간 293 세포 (ATCC CCL 1573)를 소 태아 혈청 및 경우에 따라 영양소 및(또는) 항생제가 보충된 DMEM과 같은 배지 중에 조직 배양 플레이트에서 전면 생장할 때까지 배양한다. pRK5-PRO DNA 약 10 ㎍을 VA RNA 유전자를 코딩하는 DNA (Thimmappaya et al., Cell, 31: 543 (1982)) 약 1 ㎍과 혼합하고, 1 mM Tris-HCl, 0.1 mM EDTA, 0.227 M CaCl2500 ㎕ 중에 용해시킨다. 이 혼합물에 50 mM HEPES (pH 7.35), 280 mMNaCl, 1.5 mM NaPO4를 500 ㎕ 적가하고 25 ℃에서 10 분간 침전물을 형성하게 한다. 침전물을 현탁시켜 293 세포에 첨가하고 37 ℃에서 약 4 시간 동안 침강시킨다. 배양 배지를 흡인 제거하고 PBS 중의 20 % 글리세롤 2 ㎖를 30 초 동안 첨가한다. 그 후, 293 세포를 무혈청 배지로 세척하고 신선한 배지를 첨가하여 약 5 일 동안 인큐베이션한다.
형질감염 약 24 시간 후에 배양 배지를 제거하고 배양 배지 (단독) 또는 200 μCi/㎖35S-시스테인 및 200 μCi/㎖35S-메티오닌을 포함하는 배양 배지로 교체한다. 12 시간의 인큐베이션 후, 조정배지를 모아 스핀 필터로 농축시켜 15 % SDS 겔에 로딩한다. 처리된 겔을 건조시키고 적절한 시간동안 필름에 노출시켜 PRO 폴리펩티드의 존재를 확인할 수 있다. 형질감염된 세포를 포함하는 배양물을 추가로 인큐베이션할 수 있고 (무혈청 배지 중에), 선택한 생물분석법으로 배지를 시험한다.
별법의 기술로, 문헌 (Somparyrac et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 12:7575 (1981))에 기재되어 있는 덱스트란 술페이트 방법을 이용하여 PRO를 293 세포에 일시적으로 도입시킬 수도 있다. 293 세포를 스핀 플라스크에서 최고 밀도가 되도록 배양하고 700 ㎍의 pRK5-PRO DNA를 첨가한다. 우선, 세포를 원심분리하여 스핀 플라스크로부터 농축하고 PBS로 세척한다. DNA-덱스트란 침전물을 4 시간 동안 세포 펠렛 상에서 인큐베이션한다. 세포를 20 % 글리세롤로 90 초 동안 처리하고 조직 배양 배지로 세척한 후, 조직 배양 배지, 5 ㎍/㎖의 소 인슐린 및 0.1 ㎍/㎖의 소트랜스페린을 포함하는 스핀 플라스크에 다시 넣었다. 약 4 일 후에 조정배지를 원심분리하고 여과시켜 세포와 부스러기를 제거한다. 발현된 PRO를 포함하는 시료를 농축시켜, 선택한 방법 (예를 들어 투석 및(또는) 컬럼 크로마토그래피)으로 정제할 수 있다.
다른 실시양태에서, PRO를 CHO 세포에서 발현시킬 수 있다. pRK5-PRO를 공지된 시약 (예를 들어 CaPO4또는 DEAE-덱스트란)을 사용하여 CHO 세포로 형질감염시킬 수 있다. 상기한 바 같이, 세포 배양물을 인큐베이션할 수 있고, 배지를 배양 배지 (단독) 또는35S-메티오닌과 같은 방사선 표지를 포함하는 배지로 교체할 수 있다. 발현된 폴리펩티드의 존재를 확인한 후, 배양 배지를 무혈청 배지로 교체할 수 있다. 바람직하게는, 배양물을 약 6 일 동안 인큐베이션하고 조정 배지를 회수한다. 발현된 PRO를 포함하는 배지를 농축하여 선택한 어떤 방법으로도 정제할 수 있다.
에피토프 태그가 부착된 PRO 폴리펩티드도 CHO 숙주세포에서 발현시킬 수 있다. PRO 폴리펩티드를 pRK5 벡터로부터 서브클로닝할 수 있다. 서브클론 삽입체를 PCR을 통해 폴리-his 태그와 같은 선택된 에피토프 태그가 부착된 형태로 바쿨로바이러스 발현 벡터에 융합시킬 수 있다. 폴리-his 태그가 부착된 PRO 삽입체를 안정한 클론 선택을 위해 DHFR과 같은 선택 마커를 포함하는 SV40 유도 벡터로 서브클로닝할 수 있다. 최종적으로, CHO 세포에 (상기에서와 같이) SV40 유도 벡터를 형질감염시킬 수 있다. 발현을 확인하기 위해서 상기와 같은 방법으로 표지할수 있다. 그 후, 폴리-his 태그가 부착된 PRO의 발현물을 포함하는 배양 배지를 농축시켜 Ni2+-킬레이트 친화성 크로마토그래피와 같이 선택된 어떤 방법으로도 정제할 수 있다.
또한 PRO를 일시적 발현 방법으로 CHO 및(또는) COS 세포에서 발현시키거나 다른 안정된 발현 방법으로 CHO 세포에서 발현시킬 수 있다.
CHO 세포에서의 안정한 발현은 다음의 실험 방법으로 수행된다. 단백질은 각 단백질의 가용성 형태 (예를 들어 세포외 도메인)에 대한 코딩 서열이 힌지, CH2 및 CH2 도메인을 포함하는 IgG1 불변 영역 서열에 융합된 IgG 구조물 (면역어드헤신)로 발현되고(거나) 폴리-his 태그가 부착된 형태로 발현된다.
PCR 증폭후에 문헌 (Ausubel et al.,Current Protocols of Molecular Biology, Unit 3.16, Johnn Wiley and Sons (1997))에 의해 기재된 바와 같은 표준 방법으로 각 DNA를 CHO 발현 벡터에 서브클로닝한다. CHO 발현 벡터는 관심 DNA의 5' 및 3'에 적합한 제한 부위를 갖도록 제조되어 있어서 cDNA가 편리하게 셔틀되도록 한다. CHO 세포에서의 발현에 사용되는 벡터는 문헌 (Lucas et al.,Nucl. Acids Res.24:9 1774-1779 (1996))에 의해 기재된 바와 같으며, 관심있는 cDNA와 디히드로폴레이트 리덕타제 (DHFR)를 발현시키기 위해 SV40 초기 프로모터/인핸서를 사용한다. DHFR 발현으로 형질감염된 후에 이를 안정적으로 유지하고 있는 플라스미드를 선별할 수 있다.
시판되는 형질감염 시약 수퍼펙트 (Superfect) (등록상표) (Qiagen), 도스퍼(Dosper) (등록상표) 또는 푸게네 (Fugene) (등록상표) (Boehringer Mannheim)을 사용하여 원하는 플라스미드 DNA 12 ㎍을 약 1000만 개의 CHO 세포에 도입한다. 상기 문헌 (Lucas et al., 상기 문헌)에 기재된 바와 같이 세포를 배양한다. 하기에 기재된 바와 같이 추후에 세포를 배양하고 생산하기 위해 약 3 x 10-7세포를 앰플에 동결시켜 둔다.
플라스미드 DNA를 포함하는 앰플을 수조에 넣어 녹인 후 볼텍싱하여 혼합한다. 내용물을 배지 10 ㎖가 들어있는 원심분리 튜브에 피펫으로 넣고 1000 rpm에서 5 분간 원심분리한다. 상층액을 흡입해 내고 세포를 10 ㎖의 선택 배지 (0.2 ㎛ 투석 여과된 5 % 소 태아 혈청을 포함하는 0.2 ㎛ 여과된 PS20) 중에 재현탁시킨다. 세포를 90 ㎖의 선택 배지가 들어있는 100 ㎖ 스피너에 분취한다. 1 내지 2 일 후 세포를 150 ㎖의 선택 성장 배지로 채워진 250 ㎖ 스피너로 옮겨 37 ℃에서 인큐베이션한다. 2 내지 3 일 후에 250 ㎖, 500 ㎖ 및 2000 ㎖ 스피너에 3 x 105세포/㎖를 접종한다. 세포 배지를 원심 분리하고 생산 배지에서 재현탁하여 신선한 배지로 교환한다. 어떤 적합한 CHO 배지도 사용될 수 있지만, 미국 특허 제5,122,469호 (1992년 6월 16일)에 기재된 생산 배지가 실제 사용될 수 있다. 3 ℓ 생산 스피너에 1.2 x 106세포/㎖가 되도록 접종한다. 제0일에 세포 수와 pH를 측정한다. 제1일에 스피너에서 시료를 취하고 여과된 공기를 살포하기 시작한다. 제2일에 스피너에서 시료를 취하고 온도를 33 ℃로 바꾸고 글루코스 (500 g/ℓ) 30 ㎖ 및 10 % 소포제 (예를 들면 35 % 폴리디메틸실록산 에멀젼, Dow Corning 365 의약 등급 에멀젼) 0.6 ㎖을 첨가한다. 생산 기간 내내, pH를 필요에 따라 조절하여 약 7.2에서 유지되도록 한다. 10 일 후 또는 생존률이 70 % 미만으로 떨어질 즈음 세포 배양물을 원심분리하고 0.22 ㎛ 필터에 여과시켜 회수한다. 여과액을 4 ℃에 보관하거나 바로 정제 컬럼에 로딩한다.
폴리-his 태그가 부착된 구조물의 경우, Ni-NTA 컬럼 (Qiagen)을 사용하여 단백질을 정제한다. 정제하기 전에 이미다졸을 5 mM 농도로 조정 배지에 첨가한다. 조정 배지를 0.3 M NaCl 및 5 mM 이미다졸을 포함하는 20 mM Hepes (pH 7.4) 완충액으로 평형화된 6 ㎖ Ni-NTA 컬럼에 4 ℃에서 4 내지 5 ㎖/분의 유속으로 주입한다. 로딩 후에 컬럼을 추가의 평형 완충액으로 세척하고 단잭질을 0.25 M 이미다졸을 포함하는 평형 완충액으로 용출한다. 이어서 고도로 정제된 단백질을 25 ㎖의 G25 수퍼파인 (Pharmacia) 컬럼을 사용하여 10 mM Hepes, 0.14 M NaCl 및 4 % 만니톨을 포함하는 저장 완충액 (pH 6.8)에서 염을 제거하고 -80 ℃에서 보관한다.
면역어드헤신 (Fc 포함) 구조물은 조정 배지로부터 다음과 같이 정제된다. 조정 배지를 20 mM 인산 나트륨 완충액 (pH 6.8)으로 평형화된 5 ㎖ 단백질 A 컬럼 (Pharmacia)에 주입한다. 로딩 후에 컬럼을 평형 완충액으로 충분히 세척하고 100 mM 시트르산 (pH 3.5)으로 용출시킨다. 용출되는 단백질을 275 ㎕의 1 M Tris 완충액 (pH 9)이 들어있는 튜브에 1 ㎖ 분획으로 모아 즉시 중화시킨다. 이어서 고도로 정제된 단백질을 폴리-his 태그가 부착된 단백질에 대해 상기 기재한 바와 같이 저장 완충액 (pH 6.8)에서 염을 제거한다. 동질성을 SDS-폴리아크릴아미드 겔 및 에드만 분해법에 의한 N-말단 아미노산 서열 분석으로 확인한다.
본원에 개시된 많은 PRO 폴리펩티드가 상기 기재된 바와 같이 성공적으로 발현되었다.
실시예 22: 효모에서 PRO 폴리펩티드의 발현
다음 방법은 효모에서 원하는 PRO의 재조합 발현에 대해 기술한다.
우선, ADH2/GAPDH 프로모터로부터 PRO를 세포내 생산 또는 분비하도록 효모 발현 벡터를 구축한다. PRO 및 프로모터를 코딩하는 DNA를 PRO의 세포내 발현을 위해 선택한 플라스미드의 적합한 제한 효소 부위에 삽입한다. 분비의 경우, PRO를 코딩하는 DNA를 PRO 발현을 위해 ADH2/GAPDH 프로모터, 천연 PRO 신호 펩티드 또는 기타의 포유류 신호 펩티드 또는 예를 들어 효모 알파-인자 또는 인버타제 분비 신호/리더 서열, 및 링커 서열 (필요한 경우)을 코딩하는 DNA와 함께 선택된 플라스미드에 클로닝할 수 있다.
그 후, 효모 세포 (예를 들어 효모 균주 AB110)를 상기 기재된 발현 플라스미드로 형질전환시키고 선택된 발효 배지에서 배양할 수 있다. 형질전환된 효모 상층액을 10 % 트리클로로아세트산으로 침전시키고 SDS-PAGE로 분리한 후 겔을 쿠마시 블루로 염색하여 분석할 수 있다.
이어서, 원심분리로 발효 배지로부터 효모 세포를 제거하고 선택된 카트리지 필터를 사용하여 배지를 농축시켜 재조합 PRO를 단리하고 정제할 수 있다. PRO를 포함하는 농축액을 선택된 컬럼 크로마토그래피 수지를 사용해서 더 정제할 수 있다.
본원에 개시된 많은 PRO 폴리펩티드가 상기 기재된 바와 같이 성공적으로 발현되었다.
실시예 23: 바쿨로바이러스로 감염된 곤충 세포에서 PRO의 발현
다음 방법은 바쿨로바이러스로 감염된 곤충 세포에서 PRO의 재조합 발현에 대해 기술한다.
PRO를 코딩하는 서열을 바쿨로바이러스 발현 벡터에 포함되어 있는 에피토프 태그의 상류에 융합시킨다. 상기 에피토프 태그는 폴리-his 태그 및 면역글로블린 태그 (IgG의 Fc 영역과 같이)를 포함하고 있다. 시판되는 플라스미드, 예를 들어 pVL1393 (Novagen)에서 유도된 플라스미드를 포함하여 여러 가지 플라스미드를 사용할 수 있다. 간략하게, PRO를 코딩하는 서열 또는 PRO를 코딩하는 서열의 원하는 부분 (예를 들어 막횡단 단백질의 세포외 도메인을 코딩하는 서열 또는 단백질이 세포외 단백질이라면 성숙 단백질을 코딩하는 서열)을 5' 및 3' 영역에 상보적인 프라이머를 사용하여 PCR로 증폭한다. 5' 프라이머는 인접한 (선택된) 제한 효소 부위를 포함할 수 있다. 그 후 생산물을 선택된 제한 효소로 절단하여 발현 벡터에 서브클로닝한다.
재조합 바쿨로바이러스는 리포펙틴 (GIBCO-BRL로부터 구입)을 이용하여 상기 플라스미드 및 BaculoGold™ 바이러스 DNA (Phamingen)를 스포돕테라 프루기페르다 (Spodoptera frugiperda) ("Sf9") 세포 (ATCC CRL 1711)에 동시에 형질감염시켜 생성된다. 28 ℃에서 4 내지 5 일 동안 인큐베이션한 후에, 방출된 바이러스를 회수하여 이후의 증폭에 사용한다. 바이러스 감염 및 단백질 발현은 문헌 (O'Reilley et al.,Baculovirus Expression vectors: A laboratory Manual, Oxford: OxfordUniversity Press (1994))에 기재된 바와 같이 수행된다.
그 후, 발현된 폴리-his 태그가 부착된 PRO는 예를 들어 Ni2+-킬레이트 친화성 크로마토그래피로 다음과 같이 정제될 수 있다. 문헌 (Rupert et al.,Nature,362: 175-179 (1993))에 기재된 바와 같이 재조합 바이러스로 감염된 Sf9 세포로부터 추출액을 제조한다. 간략하게, Sf9 세포를 세척하여 초음파 처리 완충액 (25 ㎖ Hepes, pH 7.9; 12.5 mM MgCl2; 0.1 mM EDTA; 10 % 글리세롤; 0.1 % NP-40; 0.4 M KCl)에 재현탁시키고 빙상에서 20 초 동안 두 번 초음파 처리한다. 초음파 처리물을 원심분리로 제거하고 상층액을 로딩 완충액 (50 mM 인산, 300 mM NaCl, 10 % 글리세롤, pH 7.8)에 50 배 희석하여 0.45 ㎛ 필터로 여과시킨다. Ni2+-NTA 아가로스 컬럼 (Quiagen으로부터 구입)을 5 ㎖ 충진 부피로 준비하여 물 25 ㎖로 세척하고 로딩 완충액 25 ㎖로 평형화시킨다. 여과시킨 세포 추출물을 분당 0.5 ㎖로 컬럼에 로딩한다. 컬럼을 로딩 완충액으로 A280이 기준선에 도달할 때까지 세척하고, 점 분획 회수를 시작한다. 다음으로, 2 차 세척 완충액 (50 mM 인산; 300 mM NaCl, 10 % 글리세롤, pH 6.0)으로 컬럼을 세척하여 비특이적으로 결합된 단백질을 용출시킨다. A280이 기준선에 다시 도달하면, 컬럼을 2 차 세척 완충액 중의 0 내지 500 mM의 이미다졸 구배로 전개시킨다. 1 ㎖ 분획들을 모아 SDS-PAGE 및 은 염색 또는 알칼리 포스파타제에 결합된 Ni2+-NTA (Qiagen)로 웨스턴 블럿팅하여 분석한다. 용출된 His10태그가 부착된 PRO를 포함하는 분획을 모아 로딩 완충액으로 투석한다.
별법으로, IgG 태그가 부착된 (또는 Fc 태그가 부착된) PRO의 정제는 공지된 크로마토그래피 기술 (예를 들어 단백질 A 또는 단백질 G 컬럼 크로마토그래피)을 사용하여 수행될 수도 있다.
본원에 개시된 많은 PRO 폴리펩티드가 상기 기재된 바와 같이 성공적으로 발현되었다.
실시예 24: PRO에 결합하는 항체의 제조
본 실시예는 PRO에 특이적으로 결합할 수 있는 모노클로날 항체의 제조 방법을 설명한다.
모노클로날 항체의 생산 기술은 당업계에 공지되어 있으며 문헌 (예를 들어 Goding, 상기 문헌)에 기재되어 있다. 이용할 수 있는 면역원으로는 정제된 PRO, PRO를 포함하는 융합 단백질 및 세포 표면에서 PRO를 발현하는 세포가 포함된다. 당업자는 과도한 시행착오 없이도 면역원을 선택할 수 있다.
프로인드 (Freund's) 완전 아쥬반트에 에멀젼화시킨 PRO 면역원을 1 내지 100 ㎍의 양으로 피하 또는 복강내 주사하여 마우스 (예를 들어 Balb/c)를 면역화시킨다. 별법으로는 면역원을 MPL-TDM 아쥬반트 (Ribi Immunochemical Research, Hamilton, MT)에 에멀젼화시켜 동물의 뒷발바닥에 주사한다. 면역화된 마우스를 10 내지 12 일 후에, 선택된 아쥬반트에 에멀젼화시킨 추가의 면역원으로 부스팅한다. 그 이후, 수 주 동안 마우스를 추가의 면역화 주사로 부스팅할 수도 있다. 역회전 출혈법 (retro-orbital bleeding)으로 마우스로부터 혈청 시료를 주기적으로 채취하여, ELISA 분석법을 시험하여 항-PRO 항체를 검출할 수 있다.
적합한 항체 역가가 검출되면, 항체에 대해 "양성"인 동물에게 PRO를 최종 정맥주사한다. 3 내지 4 일 후, 마우스를 희생시켜 비장 세포를 회수한다. 그 후, 비장 세포를 선택된 쥐의 골수종 세포주 (예를 들어 ATCC 번호 CRL 1597로부터 입수가능한 P3X63AgU.1)와 융합시킨다 (35 % 폴리에틸렌 글리콜 사용). 융합체는 비 융합 세포, 골수종 하이브리드 및 비장세포 하이브리드의 증식을 억제하는 HAT (히포크산틴, 아미노프테린 및 티미딘) 배지가 들어있는 96 웰 조직 배양 플레이트에 플레이팅될 수 있는 하이브리도마 세포를 생성한다.
하이브리도마 세포는 PRO에 대한 반응성 때문에 ELISA로 스크리닝될 것이다. PRO에 대한 원하는 모노클로날 항체를 분비하는 "양성" 하이브리도마 세포를 결정하는 방법은 당업자에게 잘 알려져 있다.
동계의 Balb/c 마우스가 항-PRO 모노클로날 항체를 포함하는 복수 (腹水)를 생산하도록 양성 하이브리도마 세포를 복강 내에 주사할 수 있다. 별법으로, 하이브리도마 세포를 조직 배양 플라스크 또는 롤러병에서 배양할 수도 있다. 황산암모늄 침전법에 이어 겔 배제 크로마토그래피를 수행하여 복수에서 생성된 모노클로날 항체를 정제할 수 있다. 별법으로, 항체의 단백질 A 또는 단백질 G에 대한 결합을 기초로 하는 친화성 크로마토그래피를 이용할 수도 있다.
실시예 25: 특이적 항체를 사용한 PRO 폴리펩티드의 정제
천연 또는 재조합 PRO 폴리펩티드는 단백질 정제 분야의 여러 가지 표준 기술로 정제될 수 있다. 예를 들면, 프로 (pro)-PRO 폴리펩티드, 성숙 PRO 폴리펩티드 또는 프리 (pre)-PRO 폴리펩티드를 관심있는 PRO 폴리펩티드에 특이적인 항체를 사용하는 면역친화성 크로마토그래피로 정제한다. 일반적으로, 면역친화성 컬럼은 항-PRO 폴리펩티드 항체를 활성화된 크로마토그래피 수지에 공유 결합으로 커플링시켜 제작된다.
폴리클로날 면역글로불린은 황산암모늄 침전법이나 고정화 Protein A (뉴저지주 피츠카타웨이 소재의 Pharmacia LKB Biotechnology) 상에서의 정제법을 사용하여 면역 혈청으로부터 제조된다. 유사하게, 모노클로날 항체는 황산암모늄 침전법 또는 고정화 Protein A 상에서의 크로마토그래피법을 사용하여 마우스 복수액으로부터 제조된다. 부분 정제된 면역글로불린을 CnBr-활성화 SEPHAROSE™ (Pharmacia LKB Biotechnology)와 같은 크로마토그래피 수지에 공유 결합으로 부착시킨다. 항체를 수지에 커플링시키고, 수지를 블록킹시키고, 유도된 수지를 제조업자의 지시에 따라 세척한다.
이러한 면역친화성 컬럼은 PRO 폴리펩티드를 가용성 형태로 포함하는 세포로부터 분획을 제조함으로써 PRO 폴리펩티드의 정제에 이용된다. 상기 제제는 세정제의 첨가 또는 당업계에 잘 알려져 있는 다른 방법으로 세포 전체를 가용화시키거나 또는 차등 원심분리를 통해 수득한 세포 분획을 가용화시켜 유도된다. 별법으로는 신호 서열을 포함하는 가용성 PRO 폴리펩티드가 세포가 배양되고 있는 배지에 유용한 양으로 분비될 수 있다.
가용성 PRO 폴리펩티드를 포함하는 제제를 면역친화성 컬럼에 통과시키고, PRO 폴리펩티드의 우선적인 흡착을 허용하는 조건 (예를 들면, 세정제가 존재하는고이온세기 완충액) 하에 컬럼을 세척한다. 그 후, 컬럼을 항체/PRO 폴리펩티드 결합을 파괴시키는 조건 (예를 들면, 약 pH 2 내지 3과 같이 pH가 낮은 완충액 또는 고농도의 카오트로프 (chaotrope) (예를 들어 우레아 또는 티오시아네이트 이온)) 하에 용출시키고, PRO 폴리펩티드를 회수한다.
실시예 26: 약물 스크리닝
본 발명은 여러 가지 약물 스크리닝 기법의 어느 것으로도 PRO 폴리펩티드 또는 그의 결합 단편을 사용하여 화합물을 스크리닝하는데 특히 유용하다. 이러한 시험에 사용되는 PRO 폴리펩티드 또는 단편은 용액 중에 유리되어 있거나, 고상 지지체에 고착되어 있거나, 세포 표면에 있거나, 세포내에 위치하는 것일 수 있다. 약물 스크리닝의 한 방법에서는 PRO 폴리펩티드 또는 단편을 발현하는 재조합 핵산으로 안정하게 형질전환된 진핵 또는 원핵 숙주 세포를 이용한다. 약물을 경쟁적 결합 분석법으로 상기 형질전환된 세포에 대해 스크리닝한다. 생존형 또는 고정형의 상기 세포는 표준 결합 분석법에 사용될 수 있다. 예를 들면, PRO 폴리펩티드 또는 단편과 시험되는 약제 사이의 복합체 형성을 측정할 수 있다. 별법으로는 시험되는 약제의 의해 유발된 PRO 폴리펩티드와 그의 표적 세포 또는 표적 수용체 사이의 복합체 형성의 감소를 검사할 수 있다.
따라서, 본 발명은 PRO 폴리펩티드-관련 질병 또는 질환에 영향을 끼칠 수 있는 약물 또는 임의의 다른 약제를 스크리닝하는 방법을 제공한다. 이들 방법은 그러한 약제를 PRO 폴리펩티드 또는 그의 단편과 접촉시키는 단계 및, 당업계에 잘 알려진 방법으로 (i) 약제와 PRO 폴리펩티드 또는 단편 사이의 복합체의 존재 또는(ii) PRO 폴리펩티드 또는 단편과 세포 사이의 복합체의 존재에 대해 분석하는 단계를 포함한다. 이러한 경쟁적 결합 분석법에서, 일반적으로 PRO 폴리펩티드 또는 단편을 표지화시킨다. 적당한 인큐베이션 후에, 유리 PRO 폴리펩티드 또는 단편을 결합형으로 존재하는 것으로부터 분리해 내는데, 유리되거나 복합체를 형성하지 않은 표지의 양은 특정 약제의 PRO 폴리펩티드에 대한 결합력 또는 PRO 폴리펩티드/세포 복합체에 대한 저해력의 척도가 된다.
또다른 약물 스크리닝 기법은 폴리펩티드에 적합한 결합 친화도를 갖는 화합물에 대한 고처리량 (high throughput) 스크리닝을 제공하며, WO84/03564 (1984년 9월 13일 공개)에 상세히 기재되어 있다. 간단히 서술하면, 다수의 상이한 작은 펩티드 시험 화합물을 고체 기판 (예를 들어 플라스틱 핀 또는 어떤 다른 표면) 상에 합성한다. PRO 폴리펩티드에 적용시켜, 펩티드 시험 화합물을 PRO 폴리펩티드와 반응시키고 세척한다. 결합된 PRO 폴리펩티드는 당업계에 잘 공지된 방법으로 검출한다. 정제된 PRO 폴리펩티드를 상기 언급한 약물 스크리닝 기법에 직접 사용하기 위해 플레이트 상에 직접 코팅할 수도 있다. 추가로, 비중화 항체를 사용하여 펩티드를 포획하고 이를 고체 기판 상에 고정시킬 수 있다.
본 발명은 또한 PRO 폴리펩티드에 결합할 수 있는 중화 항체가 PRO 폴리펩티드 또는 그의 단편에 결합하는데 있어서 시험 화합물과 특이적으로 경쟁하는 경쟁적 약물 스크리닝 분석법의 사용을 고려한다. 이러한 방식으로, 항체를 PRO 폴리펩티드와 하나 이상의 항원 결정자를 공유하는 임의의 펩티드의 존재를 검출하는데 사용할 수 있다.
실시예 27: 합리적인 (Rational) 약물 디자인
합리적인 약물 디자인의 목표는 관심있는 생물학적 활성 폴리펩티드 (즉, PRO 폴리펩티드) 또는 이들과 상호작용하는 소분자 (예를 들면, 아고니스트, 길항제 또는 억제제)의 구조적 상동체를 생산하는 것이다. 이러한 예들 중 어떤 것이라도 PRO 폴리펩티드의 보다 활성적이거나 보다 안정한 형태인 약물, 또는 생체내 PRO 폴리펩티드의 기능을 강화하거나 저해하는 약물을 형성하는데 이용할 수 있다 (문헌 (Hodgson,Bio/Technology,9: 19-21 (1991)) 참조).
한 방법으로, PRO 폴리펩티드 또는 PRO 폴리펩티드-억제제 복합체의 3 차원 구조를 x-선 결정법, 컴퓨터 모델링, 또는 가장 통상적으로는 상기 두 방법을 조합한 방법으로 결정한다. 분자의 구조를 밝히고 활성 부위(들)을 결정하기 위해서는 PRO 폴리펩티드의 모양과 전하 모두를 확인해야 한다. 더 적은 빈도이지만, PRO 폴리펩티드의 구조에 관한 유용한 정보는 상동성 단백질의 구조를 기초로 모델링함으로써 얻을 수 있다. 두 경우 모두, 관련 구조 정보를 동족 PRO 폴리펩티드 유사 분자를 디자인하거나 유효한 억제제를 확인하는데 사용한다. 합리적인 약물 디자인의 유용한 예는 문헌 (Braxton and Wells,Biochemistry, 31:7796-7801 (1992))에 기재된 바와 같이 활성 또는 안정성을 증진시킨 분자, 또는 문헌 (Athauda et al.,J. Biochem.,113:742-746 (1993))에 기재된 바와 같이 천연 펩티드의 억제제, 아고니스트 또는 길항제로 작용하는 분자를 포함할 수 있다.
상기한 바와 같이 기능 분석법으로 선택한 표적-특이적 항체를 단리한 후에 그의 결정 구조를 해석하는 것도 가능하다. 이 방법은 원칙적으로 후속적인 약물디자인의 기초가 될 수 있는 파마코어(pharmacore)를 제공한다. 기능성 약리 활성 항체에 대한 항-이디오타입 항체 (항-id)를 생산함으로써 단백질 결정법을 생략하는 것도 가능하다. 거울상의 거울상으로서, 항-id의 결합 부위는 원래 수용체의 상동체라고 기대될 것이다. 그 후, 항-id를 사용하여 화학적 또는 생물학적으로 생산된 펩티드 뱅크로부터 펩티드를 확인하고 단리할 수 있다. 단리된 펩티드는 파마코어로 작용할 것이다.
본 발명에 의해, x-선 결정법과 같은 분석적 연구를 수행하기에 충분한 양의 PRO 폴리펩티드를 이용가능하게 할 수 있다. 추가로, 본원에 제공된 PRO 폴리펩티드 아미노산 서열 정보는 x-선 결정법 대신 또는 그에 덧붙여 컴퓨터 모델링 기법을 이용하는데 지침을 제공할 것이다.
실시예 28: 유전자 증폭
본 실시예는 여러 PRO327, PRO344, PRO347, PRO357 및 PRO715를 코딩하는 유전자가 특정 인간 폐암, 결장암 및(또는) 유방암 및(또는) 세포주의 게놈에서 증폭된다는 것을 보여준다. 증폭은 유전자 산물의 과다 발현과 관련이 있으며, 이는 상기 폴리펩티드들이 특정 암, 예를 들어 결장암, 폐암, 유방암 및 기타 암의 치료적 개입에 유용한 표적이라는 것을 의미한다. 치료제는 PRO327, PRO344, PRO347, PRO357 또는 PRO715 폴리펩티드의 길항제 형태를 취할 수 있으며, 예를 들어 PRO327, PRO344, PRO347, PRO357 또는 PRO715 폴리펩티드에 대한 쥐-인간 키메라 항체, 인간화 항체 또는 인간 항체일 수 있다.
스크리닝을 위한 출발 물질은 여러 암으로부터 단리된 게놈 DNA였다. DNA는정확하게, 예를 들어 형광측정법으로 정량된다. 음성 대조구로, 건강한 정상인 10 명의 세포로부터 DNA를 단리하여 모은 후, 건강한 사람들의 유전자 카피의 분석 대조구로 사용하였다 (결과를 제시하지는 않음).
5' 뉴클레아제 분석법(예를 들어 TaqManTM) 및 실시간 정량 PCR (예를 들면 ABIPrizm 7700 Sequence Detection SystemTM(Perkin Elmer, Applied Biosystems Division, 미국 캘리포니아주 포스터시티 소재))을 이용하여 특정 암에서 증폭될 가능성이 있는 유전자를 발견하였다. 그 결과를 사용하여, PRO327, PRO344, PRO347, PRO357 또는 PRO715를 코딩하는 DNA가 스크리닝된 원발성 폐 또는 결장암 또는 암 세포주 또는 유방암 세포주의 어느 것에서 과다하게 나타나는가를 결정하였다. 원발 폐암은 표 9에 나타낸 유형 및 단계의 종양이 있는 사람들로부터 얻었다. 표 9에 열거한 원발 종양을 지칭하기 위해 사용한 약자에 대한 설명 및 이 실시예 전체에서 거명된 원발 종양 및 세포주를 하기에 제시하였다.
TaqManTM의 결과는 델타 (Δ) Ct 단위로 나타낸다. 1 단위는 PCR 1 사이클에 상응하거나 또는 정상에 비해 약 2 배 증폭에 상응하며, 2 단위는 4 배, 3 단위는 8 배 증폭에 상응된다. 정량에는 PRO327, PRO344, PRO347, PRO357 또는 PRO715를 코딩하는 유전자로부터 유도된 프라이머 및 TaqManTM형광 프로브를 이용하였다. PRO327, PRO344, PRO347, PRO357 또는 PRO715의, 고유의 핵산 서열을 포함할 가능성이 가장 크고 인트론이 스플라이싱되었을 가능성이 가장 작은 영역이 (예를 들어3' 비번역 영역) 프라이머 및 프로브 유도에 바람직하다. PRO327, PRO344, PRO347, PRO357 또는 PRO715 유전자 증폭 분석에 사용된 프라이머 및 프로브 (전방향, 역방향 및 프로브)의 서열은 다음과 같았다.
PRO327 (DNA38113-1230)
전방향5'-ctcaagaagcacgcgtactgc-3' (서열 96)
프로브5'-ccaacctcagcttccgcctctacga-3' (서열 97)
역방향5'-catccaggctcgccactg-3' (서열 98)
PRO344 (DNA40592-1242)
전방향5'-tggcaaggaatgggaacagt-3' (서열 99)
프로브5'-atgctgccagacctgatcgcagaca-3' (서열 100)
역방향5'-gggcagaaatccagccact-3' (서열 101)
PRO347 (DNA44176-1244)
전방향5'-cccttcgcctgcttttga-3' (서열 102)
프로브5'-gccatctaattgaagcccatcttccca-3' (서열 103)
역방향5'-ctggcggtgtcctctcctt-3' (서열 104)
DNA357 (DNA44804-1248)
전방향5'-cctcggtctcctcatctgtga-3' (서열 105)
프로브5'-tggcccagctgacgagccct-3' (서열 106)
역방향5'-ctcataggcactcggttctgg-3' (서열 107)
PRO715 (DNA52722-1229)
전방향5'-tggctcccagcttggaaga-3' (서열 108)
프로브5'-cagctcttggctgtctccagtatgtaccca-3' (서열 109)
역방향5'-gatgcctctgttcctgcacat-3' (서열 110)
5' 뉴클레아제 분석 반응은 Taq DNA 중합효소의 5' 엑소뉴클레아제 활성을 이용하여 증폭을 실시간으로 모니터링하는 형광 PCR계 기술이다. 2 개의 올리고뉴클레오티드 프라이머를 사용하여 PCR 반응에 통상적인 앰플리콘을 생성한다. 제3 올리고뉴클레오티드 또는 프로브는 2 개의 PCR 프라이머 사이에 위치한 뉴클레오티드 서열을 검출하도록 고안된다. 프로브는 Taq DNA소 중합효소에 의해 신장될 수 없으며 리포터 형광 염료 및 켄쳐 (quencher) 형광 염료로 표지된다. 레이져로 유도된 리포터 염료로부터의 방출은 2 개의 염료가 프로브 상에 함께 가까이 위치할 때 켄칭 염료에 의해 켄칭된다. 증폭 반응 동안, Taq DNA 중합효소는 주형 의존적 방식으로 프로브를 절단한다. 이렇게 생성된 프로브 단편을 용액 중에서 해리시키고, 방출된 리포터 염료의 신호를 2 차 형광단의 켄칭 영향으로부터 자유롭게 한다. 합성된 새로운 분자 각각에 대해 리포터 염료 분자가 하나씩 방출되며, 비켄칭 리포터 염료의 검출은 데이타의 정량적 해석의 기초를 제공한다.
5' 뉴클레아제 방법은 실시간 정량 PCR 장비, 예를 들어 ABI Prism 7700TM Sequence Detection에서 실시된다. 이 시스템은 주기적 가열기, 레이저, 하전-커플 장비(CCD) 카메라 및 컴퓨터로 구성된다. 본 시스템은 주기적 가열기에서 96 웰 포맷으로 시료를 증폭시킨다. 증폭시키는 동안 레이저로 유도된 형광 신호가 광섬유 케이블을 통해 96 웰에 실시간으로 모아져 CCD에서 검출된다. 본 시스템은장치를 작동하고 데이타를 분석하기 위한 소프트웨어를 포함한다.
5' 뉴클레아제 분석 데이타는 초기에는 Ct 또는 임계 사이클 (threshold cycle)로 표현된다. 이것은 리포터 신호가 형광의 기본 수준 이상으로 축적될 때의 사이클로 정의된다. ΔCt 값은 암 DNA 결과를 정상적인 인간 DNA 결과와 비교할 때 핵산 시료 내 특정 표적 서열의 출발 카피의 상대적 수치의 양적인 측정치로서 이용된다.
표 9는 본 발명의 PRO327, PRO344, PRO347, PRO357 및 PRO715 화합물을 스크리닝하는데 사용되었던 여러 가지 원발 종양의 단계, T 단계 및 N 단계를 설명한다.
DNA 정제
DNA를 배양 세포주, 원발 종양, 정상적인 인간 혈액으로부터 정제하였다. 이러한 DNA 단리는 퀴아젠 (Quiagen)사의 정제 키트, 완충액 세트, 프로테아제 등을 사용하여 하기한 바와 같이 제조업자의 지시 및 설명에 따라서 수행하였다.
세포 배양물 세포용해 (lysis):
세포를 세척하고 1 팁 당 7.5 x 108의 농도로 트립신을 처리하고, 5 분 동안 4 ℃에서 1000 rpm으로 원심분리하여 펠렛화한 후, 1/2 부피의 PBS 재원심분리로 다시 세척하였다. 펠렛을 3 회 세척하고, 현탁된 세포를 수집하고 PBS로 2 회 세척하였다. 그 다음에, 세포를 PBS 10 ml에 현탁시켰다. 완충액 C1를 4 ℃에서 평형화시켰다. 퀴아젠 프로테아제 #19155를 차가운 ddH2O 6.25 ml에 희석하고 (최종 농도 20 mg/ml) 4 ℃에서 평형화시켰다. G2 완충액 10 ml를 퀴아젠 RNAse A 스톡 (100 mg/ml)을 사용하여 최종 농도 200 ㎍/ml가 되게 희석하여 준비하였다.
그 다음에 완충액 C1 (10 ml, 4 ℃) 및 ddH2O (40 ml, 4 ℃)를 10 ml의 세포 현탁액에 첨가하고, 뒤집으면서 혼합하고 10 분 동안 빙상에서 인큐베이션시켰다. 베크만 (Beckman) 스윙 버켓 로터로 원심분리 (2500 rpm, 4 ℃, 15 분)시켜 세포 핵을 펠렛화시켰다. 상층물을 폐기하고, 핵을 2 ml 완충액 C1 (4 ℃) 및 6 ml ddH2O 내로 볼텍싱을 통해 현탁시킨 후, 제2 원심분리 (2500 rpm, 4 ℃, 15 분)를 수행하였다. 그 다음에, 핵을 잔류 완충액 (1 팁 당 200 ㎕)으로 재현탁시켰다. G2 완충액 (10 ml)을 현탁된 핵에 첨가하면서 완만하게 볼텍싱하였다. 완충액 첨가를 완료한 후, 30 초 동안 격렬하게 볼텍싱하였다. 퀴아젠 프로테아제 (200 ㎕, 상기한 바와 같이 제조됨)를 첨가하고 60 분 동안 50 ℃에서 인큐베이션시켰다. 인큐베이션 및 원심분리를 용해물 (lysate)이 투명해질 때까지 반복하였다 (예를 들어 30 내지 60 분을 더 인큐베이션하고 4 ℃에서 10 분 동안 3000 x g으로 펠렛화함).
인간 충실성종양 시료 제조 및 세포용해:
종양 시료의 무게를 달고 50 ml 원뿔형 튜브에 넣고 빙상에 방치하였다. 1 회 제조시 조직 250 mg으로 제한하여 처리하였다 (1 팁/1 회 제조). 프로테아제 용액을 차가운 ddH2O 6.25 ml 내로 희석시켜 새로 제조 (최종 농도 20 mg/ml)한 후 4 ℃에 보관하였다. DNAse A의 최종 농도가 200 mg/ml가 되도록 희석 (100 mg/ml 스톡으로부터 희석됨)시킨 G2 완충액 (20 ml)을 제조하였다. 에어로졸의 흡입을 방지하기 위해서 라미나-플로우 TC 후드 중에서 폴리트론의 큰 팁을 사용하여, 종양 조직을 G2 완충액 19 ml 중에서 60 초 동안 균질화하고 실온에 두었다. 시료와 시료 사이마다 폴리트론을 ddH2O 2 ℓ 중에서 30 초씩 2 번 스피닝하여 세정한 후 G2 완충액 (50 ml)으로 세정하였다. 생성기 팁 상에 조직이 남아있던 경우에는 기기를 분해하여 세정하였다.
퀴아젠 프로테아제 (상기한 바와 같이 제조됨, 1.0 ml)를 첨가한 후 볼텍싱하고 3 시간 동안 50 ℃에서 인큐베이션하였다. 인큐베이션 및 원심분리를 용해물이 투명해질 때까지 반복하였다 (예를 들어 30 내지 60 분을 더 인큐베이션하고 4℃에서 10 분 동안 3000 x g으로 펠렛화함).
인간 혈액 제조 및 세포용해:
표준 감염제 프로토콜을 사용하여 건강한 지원자로부터 혈액을 뽑고 10 ml 시료/1 팁 중으로 시트르산을 처리하였다. 퀴아젠 프로테아제를 차가운 ddH2O 6.25 ml 내로 희석하여 새로 제조 (최종 농도 20 mg/ml)한 후 4 ℃에 보관하였다. RNAse A의 최종 농도가 200 ㎍/ml가 되도록 희석 (100 mg/ml 스톡으로부터 희석됨)시킨 G2 완충액을 제조하였다. 혈액 (10 ml)을 50 ml 원뿔형 튜브에 넣고 10 ml C1 완충액 및 30 ml ddH2O (둘다 미리 4 ℃로 평형화됨)를 첨가하고, 뒤집으면서 성분들을 혼합하고 10 분 동안 빙상에 두었다. 베크만 스윙 버켓 로터로 원심분리 (2500 rpm, 4 ℃, 15 분)시켜 핵을 펠렛화하고 상층물을 폐기하였다. 볼텍싱을 통해 핵을 2 ml C1 완충액 (4 ℃) 및 6 ml ddH2O (4 ℃)내로 현탁시켰다. 펠렛이 백색이 될때가지 볼텍싱을 반복하였다. 그 다음에, 핵을 잔류 완충액 (1 팁 당 200 ㎕)으로 재현탁시켰다. G2 완충액 (10 ml)을 현탁된 핵에 첨가하면서 완만하게 볼텍싱한 후, 30 초 동안 격렬하게 볼텍싱하였다. 퀴아젠 프로테아제를 첨가 (200 ㎕)하고, 60 분 동안 50 ℃에서 인큐베이션시켰다. 인큐베이션 및 원심분리를 용해물이 투명해질 때까지 반복하였다 (예를 들어 30 내지 60 분을 더 인큐베이션하고 4 ℃에서 10 분 동안 3000 x g로 펠렛화함).
투명한 용해물의 정제:
(1)게놈 DNA의 단리
게놈 DNA를 10 ml QBT 완충액으로 평형화시켰다 (1 시료/최대형 팁 제조). QF 용출 완충액을 50 ℃에서 평형화시켰다. 시료를 30 초 동안 볼텍싱한 후, 평형화된 팁으로 로딩하고 중력을 이용해 배수하였다. 팁을 15 ml QC 완충액으로 2 번 세척하였다. DNA를 15 ml QF 완충액을 사용하여 용출하여, 30 ml 실란 처리하고 오토클레이브된 30 ml Corex 튜브 내에 얻었다. 이소프로판올 (10.5 ml)을 각 시료에 첨가하고 튜브를 파라핀으로 씌우고, DNA가 침전될 때까지 여러 번 뒤집으면서 혼합하였다. 시료를 SS-34 로터 중에서 원심분리 (15,000 rpm, 10 분, 4 ℃)하여 펠렛화시켰다. 펠렛 위치를 표시하고 상층물을 폐기하고 70 % 에탄올 (4 ℃) 10 ml를 첨가하였다. 시료를 SS-34 로터로 원심분리 (10,000 rpm, 10 분, 4 ℃)하여, 재펠렛화시켰다. 펠렛 위치를 표시하고 상층물을 폐기하였다. 이들 튜브를 다시 건조시킨 랙 (rack) 중의 그들 쪽에 놓고 시료가 과도하게 건조되지 않도록 주의하면서 37 ℃에서 10 분 동안 건조시켰다.
건조시킨 후 펠렛을 1.0 ml TE (pH 8.5)중에 용해시키고 1 내지 2 시간 동안 50 ℃에 두었다. 계속 용해시키면서 시료를 4 ℃에서 밤새 두었다. 그 다음에, 26 게이지의 바늘이 있는 튜버쿨린 주사기를 사용하여 DNA 용액을 1.5 ml 튜브로 옮겼다. DNA를 자르기 위해 이와 같은 DNA 용액 이전을 5 회 반복하였다. 시료를 1 내지 2 시간 동안 50 ℃에 두었다.
(2)유전자 증폭 분석을 위한 게놈 DNA의 정량 및 제조
벡크만 DU640 분광기 중의 0.1 ml 석영 큐벳을 사용하여 표준 A260, A280분광법을 통해 1 : 20 희석물 (5 ㎕ DNA + 95 ㎕ ddH2O)에 대해 각 튜브의 DNA 양을 정량하였다. A260/A280 비율은 1.8 내지 1.9 범위였다. 그 후, 각 DNA 시료를 TE (pH 8.5) 중에서 대략 200 ng/ml 농도로 더 희석하였다. 본래 물질이 고농축된 것이었다면 (약 700 ng/㎕), 이 물질은 재현탁될 때까지 수 시간 동안 50 ℃에 두었다.
그 다음에, 희석된 물질 (20 - 600 ng/ml)에 대해 제조업자의 지침을 아래와 같이 변용하여 형광측정에 의한 DNA 정량을 수행하였다. 이는 Hoeffer DyNA Quant 200 형광측정기를 약 15 분 동안 가온시켜서 수행하였다. Hoechst 염료 작업액 (#H33258, 10 ㎕, 사용하기 12 시간 이내에 제조)을 100 ml 1×TNE 완충액 내로 희석하였다. 2 ml 큐벳을 형광측정기 용액으로 채우고 형광측정기 안에 넣고 이 기계를 0점화하였다. pGEM 3Zf(+) (2 ㎕, 제품번호 #360851026)를 형광측정기 용액 2 ml에 첨가하고 200 유닛에서 측정하였다. pGEM 3Zf(+) DNA 2 ㎕를 더 시험하고 측정 결과를 400 +/-10 유닛에서 확인하였다. 그 다음에, 각 시료를 적어도 3 벌로 측정하였다. 3 개의 시료가 서로 10 % 이내에 있음을 발견했을 때, 이들의 평균을 구하고 이 값을 정량값으로 사용하였다.
형광측정에 의해 결정된 농도를 사용하여 각 시료를 ddH2O 중에 10 ng/㎕로 희석하였다. 하나의 TaqMan 플레이트 분석을 위해서 모든 템플레이트 시료에 대해 위와 같은 희석을 동시에 수행하였고, 이 때 물질은 500 내지 1000 회 분석을 수행할 정도로 충분했다. 시료를 TaqmanTM프라이머를 사용하여 3 벌로 시험했고, 정상적인 인간 DNA 및 템플레이트가 아닌 대조구를 사용하여 단일 플레이트 상에서 B-액틴 및 GAPDH 둘다를 탐침시켰다. 정상적인 인간 DNA의 CT 값을 시험 DNA로부터 뺀 값이 +/-1 Ct라면 희석된 시료를 사용하였다. 분류하여 표시한, 희석된 게놈 DNA를 1.0 ml씩 나누어 -80 ℃에 보관하였다. 나중에 유전자 증폭 분석에 사용할 분취액은 4 ℃에 보관하였다. 각 1 ml 분취액은 64 회 시험 또는 8 내지 9 플레이트를 채울만큼 충분했다.
유전자 증폭 분석:
본 발명의 PRO327, PRO344, PRO347, PRO357 및 PRO715 화합물을 다음의 원발 종양에서 스크리닝하였고, 이로 얻은 1.0 이상의 ΔCt 값을 표 10에 나타냈다.
PRO327:
상기의 초기 스크리닝에서 선택된 종양에 대해서 프레임워크 맵핑을 통해 PRO327 (DNA38113-1230)을 재검사하였다. 표 11에는 PRO327 (DNA38113-1230)과 함께 사용되었던 프레임워크 마커를 기재하였다. 프레임워크 마커는 염색체 19를 따라 대략 매 20 메가염기마다 위치하며, 이수성 (異數性, aneuploidy)을 조사하는데 사용하였다. PRO327 (DNA38113-1230)에 대한 염색체 19에서의 하기한 프레임워크 마커에 대한 ΔCt값을 표 13의 선택된 종양에 대해 나타냈다.
상기의 초기 스크리닝에서 선택된 종양에 대해서 에피센터 맵핑을 통해 PRO327 (DNA38113-1230)을 재검사하였다. 표 12에는 PRO327 (DNA38113-1230)과 함께 사용되었던 에피센터 마커를 기재하였다. 에피센터 마커는 DNA38113-1230에 인접하여 위치하며, 염색체 19에서 DNA38113-1230이 위치하는 영역의 증폭 상태를 평가하는데 사용된다. 마커들 간의 거리는 센티레이 (cR)로 측정하는데, 센티레이는 두 마커간의 파손의 1 % 가능성에 대략 일치하는 방사선 파손 유닛이다. 1 cR은 20 킬로염기에 대강 일치한다.
표 14는 DNA38113-1230에 대한 에피센터 맵핑 결과의 ΔCt 값을 나타내며, 이는 염색체 19에서의 DNA38113-1230의 실제 위치에 바로 인접한 영역에서의 상대적 증폭을 의미한다.
PRO715 (DNA52722-1229):
PRO715 역시 프레임워크 및 에피센터 맵핑 둘다를 통해 재검사하였다. 표 15는 이 방법에 사용된 프레임워크 마커의 염색체 위치를 나타낸다. 프레임워크 마커는 대략 매 20 메가염기마다 위치하며, 이수성을 조사하는데 사용되었다. 표 16은 이 방법에 사용된 에피센터 맵핑 마커를 나타낸다. 에피센터 마커는 DNA52722-1229와 매우 인접하여 위치하여, DNA52722-1229의 바로 인접한 부분에서의 상대적인 DNA 증폭을 결정하는데 사용된다. 개별 마커들 사이의 거리는 센티레이로 측정하였는데, 센티레이는 두 마커 사이의 파손의 1 % 가능성에 대량 일치하는 방사선 파손 유닛이다. 1 cR은 약 20 킬로염기에 대강 일치한다. 표 16에서 "BAC"는 세균성 인조 염색체를 의미한다. 관심 유전자가 포함된 BAC 클론의 말단을 서열 분석하였다. 이 서열로부터 TaqMan 프라이머 및 프로브를 제조하였고, 이를 표에 나타냈다. BAC 클론은 일반적으로 100 내지 150 Kb이므로, 이들 프라이머 및 프로브는 종양으로부터 DNA를 탐침하는 근접 마커 (nearby marker)로 사용될 수 있다. 표 16에서 마커 SHGC-31370은 염색체 17에서 DNA52722-1229가 맵핑된 위치에 가장 근접한 것으로 발견된 마커이다.
표 17은 선택된 종양의 경우, 염색체 17에서 DNA52722-1229에 대한 상기 프레임워크 마커들의 ΔCt값을 나타낸다.
표 18은 해당하는 에피센터 마커의 ΔCt 값을 나타내며, 염색체 17에서 DNA52722-1229의 바로 인접한 영역에서 상대적 증폭이 일어났음을 의미한다.
PRO357 (DNA44804-1248):
상기의 초기 스크리닝에서 선택된 종양에 대해서 프레임워크 맵핑을 통해 PRO357을 재검사하였다. 표 19는 본 실시예에 사용되었던 프레임워크 마커의 염색체 맵핑을 나타낸다. 프레임워크 마커는 대략 매 20 메가염기마다 위치하며, 이수성을 조사하는데 사용되었다.
또한, 에피센터 맵핑을 통해서도 PRO357을 검사하였다. 표 20에 나타낸 마커들은 DNA44804-1248과 인접하여 위치하며 (게놈에서), 염색체 16에서 DNA44804-1248이 위치하는 바로 인접 영역에서의 상대적인 증폭을 평가하는데 사용된다. 개별 마커들 간의 거리는 센티레이 (cR)로 측정되는데, 센티레이는 두 마커간의 파손의 1 % 가능성에 대략 일치하는 방사선 파손 유닛이다. 1 cR은 20 킬로염기에 대강 일치한다. 마커 SHGC-6154는 염색체 16에서 DNA44804-1248의 위치와 가장 가까운 것으로 발견된 마커이다.
표 21에는 염색체 16에서 DNA44804-1248에 대한 상기 프레임워크 마커들의 ΔCt 값이 기재되어 있다.
표 22는 DNA44804-1248에 대한 에피센터 맵핑 결과의 ΔCt 값을 나타내며, 이는 염색체 16에서 DNA44804-1248의 실제 위치에 매우 인접한 영역에서 상대적 증폭이 일어났음을 의미한다.
결론:
각종 종양에서의 상기 DNA들의 ΔCt 값을 보고한다. 1보다 큰 ΔCt는 이중의 유전자 카피를 의미하기 때문에 일반적으로 증폭 수치의 임계치로 사용되었다. 상기 데이타는 시험한 핵산의 상당한 증폭이 원발 폐 종양 및(또는) 원발 결장 종양에서 일어났음을 나타낸다. 증폭은 프레임워크 맵핑에 의해 확인되었다. 프레임워크 마커 분석 결과는 해당 종양에서의 특정 염색체 영역의 상대적 증폭을 의미하며, 에피센터 마커 분석으로 관심 유전자에 바로 인접한 영역에서의 상대적 증폭에 대한 더욱 정밀한 해독이 제공된다.
증폭을 에피센터 맵핑으로 확인하였고, 데이타는 원발 결장 종양 및(또는) 원발 폐 종양에서의 상당한 증폭을 입증하였다. 즉, 가장 가까운, 알고 있는 에피센터 마커의 증폭은 시험한 DNA의 것보다는 크게 일어나지 않는다. 이는 시험한 DNA가 각 염색체 상에서 특정 영역의 증폭에 관여한다는 것을 의미한다.
시험한 DNA의 증폭이 여러 폐 및 결장 종양에서 일어나기 때문에, 이들 DNA가 종양의 생성이나 성장에 상당한 역할을 할 가능성이 매우 높다. 결과적으로, 시험한 DNA가 코딩하는 단백질에 대한 길항제 (예를 들어 항체)가 암 치료에 사용되거나 유용한 진단제로 사용될 수 있다고 기대된다. 시험한 DNA가 코딩하는 폴리펩티드는 폐 및(또는) 결장 조직 시료에서 종양 세포의 존재를 결정하는 진단 마커로 유용성이 있다. 이들 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 서열은 이와 같은 진단 방법을 수행하기 위한 핵산 프로브의 공급원으로서 유용성이 있다.
실시예 29: 연골로부터 프로테오글리칸의 방출을 촉진하는 PRO241의 능력 (분석 97)
연골로부터 프로테오글리칸의 방출을 촉진하는 PRO241의 능력을 하기와 같이 시험하였다. 이 분석에서의 양성 결과는 PRO241 폴리펩티드가 여러 가지 연골 및(또는) 뼈 손상 또는 관절염 등의 질환의 치료적 처치에 사용될 수 있음을 입증한다.
4 내지 6 개월된 피그 (pig)의 중수수지 관절을 무균 절개하고, 그 아래의 뼈를 주의하여 피하면서 프리 핸드 슬라이싱 (free hand slicing)에 의해 관절 연골을 제거하였다. 연골을 잘게 썰고 95 % 대기 및 5 % CO2의 분위기 하에, 0.1 % BSA 및 100 U/ml 페니실린 및 100 ㎍/ml 스트렙토마이신를 포함하는 무혈청 (SF) 배지 (DME/F12 1:1)에서 24 시간 동안 대량으로 배양하였다. 세번 세척한 후에, 관절 연골 약 100 mg을 마이크로닉스 튜브 내로 분취해 넣고 상기 SF 배지에서 24 시간 동안 추가로 인큐베이션시켰다. 그 후에 단독으로 또는 18 ng/ml 인터루킨-1α (연골 조직으로부터 프로테오글리칸의 방출을 촉진하는 공지된 촉진제)와 함께 PRO241 폴리펩티드를 1 %로 첨가하였다. 그 후에, 상층물을 수거하고 1,9-디메틸-메틸렌 블루 (DMB) 비색 분석법을 이용하여 프로테오글리칸의 양을 분석하였다 (Farndale and Buttle,Biochem. Biophys. Acta883:173-177 (1985)). 이 분석에서 양성 결과는 시험 폴리펩티드가 예를 들면, 스포츠 관련 관절 문제, 관절 연골 결핍, 골관절염 또는 류마티스성 관절염 치료에 사용될 수 있음을 나타낸다.
상기 분석으로 PRO241 폴리펩티드를 시험했을 때, 상기 폴리펩티드는 기본적으로나 인터루킨-1α으로 자극한 후에 모두, 처치한 지 24 시간 및 72 시간 후에 연골 조직으로부터 프로테오글리칸의 방출을 촉진시키는 두드러진 능력이 있음이 증명되었으며, 이는 연골조직으로부터 프로테오글리칸 방출을 촉진시키는데 PRO241 폴리펩티드가 유용하다는 것을 의미한다. 따라서 PRO241 폴리펩티드는 스포츠 관련 관절 문제, 관절 연골 결핍, 골관절염 또는 류마티스성 관절염의 치료에 유용하다.
실시예 30: PRO344를 이용한 시험관내 항암 분석 (분석 161)
PRO344 폴리펩티드의 항증식 활성은 본질적으로 문헌 (Skehan et al., J. Natl. Cancer Inst. 82: 1107-1112 (1990))에 기재되어 있는 바와 같은 술포르호다민 B (SRB) 염료 결합 분석법을 이용하여, 미국립암연구소 (NCI)의 연구용 질병 오리엔티드 시험관내 항암 의약 개발 분석으로 결정하였다. 이 연구에 사용된 종양 세포주 60 개 (NCI 패널) 및 이들의 시험관내 유지 및 배양 조건들은 문헌 (Monks et al., J. Natl. Cancer Inst. 83: 757-766 (1991))에 기재되어 있다. 이 스크리닝의 목적은 여러 유형의 종양에 대한 시험 화합물의 세포독성 및(또는) 세포정지 활성을 처음으로 평가하는 것이다 (Monks et al., 상기 문헌; Boyd, Cancer: Princ. Pract. Oncol. Update 3 (10): 1-12 1989).
트립신/EDTA (Gibco)를 사용하여 인간 종양 세포주 대략 60 개로부터 세포를 수거하고 1 회 세척하고 IMEM 중에 재현탁하고 이들의 생존성을 결정하였다. 세포 현탁물을 피펫 (100 ㎕ 부피)으로 별도의 96-웰 마이크로타이터 플레이트에 첨가하였다. 6 일간의 인큐베이션 동안 세포 밀도는 과다성장을 방지한 2 일간의 인큐베이션의 경우보다 적었다. 접종물을 37 ℃에서 24 시간의 예비인큐베이션 기간 동안 두어 안정화시켰다. 의도한 시험 농도의 2 배 희석물을 100 ㎕ 분취액으로 0 시에 마이크로타이터 플레이트 웰 (1 : 2 희석)에 첨가하였다. 시험 화합물을 5 1/2-로그 희석물 (1000 내지 100,000 배)에서 평가하였다. 2 일 동안 및 6 일 동안 5 % CO2분위기 및 100 % 습도에서 인큐베이션시켰다.
인큐베이션 후에 배지를 제거하고 세포를 40 ℃에서 10 % 삼염화아세트산 0.1 ml 중에 고정시켰다. 플레이트를 탈이온수로 5 회 헹구고 건조시키고 1 % 아세트산 중에 용해한 0.4 % 술포르호다민 B 염료 (Sigma 제품) 0.1 ml로 30 분 동안 염색하고, 1 % 아세트산으로 4 회 헹궈 비결합 염료를 제거하였고, 10 mM 트리스 염기 (트리스(히드록시메틸)아미노메탄) 0.1 ml (pH 10.5)로 5 분 동안 염색을 추출하였다. 492 nm에서의 술포르호다민 B의 흡광도 (OD)를 컴퓨터에 연결된 96-웰 마이크로타이터 플레이트 판독기를 사용하여 측정하였다.
시험 시료가 한 가지 이상의 농도에서 50 % 이상의 성장 억제 효과를 나타낸다면 양성으로 간주한다. 결과를 다음 표 23에 나타냈으며 약자는 다음과 같다.
NSCL = 비소세포 폐암종
CNS = 중추신경계
이 분석의 결과는 PRO344 폴리펩티드가 많은 상이한 종양 세포 유형에서 신생물 성장을 억제하는데 유용하며 여기에 치료적으로 사용될 수 있음을 증명한다. PRO344에 대한 항체는 이런 유용한 폴리펩티드의 친화성 정제에 유용하다. PRO344 폴리펩티드를 코딩하는 핵산은 이들 폴리펩티드의 재조합적 제조에 유용하다.
실시예 31: 혈관 내피 성장 인자 (VEGF)에 의해 자극된 내피세포 증식의 억제능 (분석 9)
VEGF에 의해 자극된 내피세포 증식에 대한 여러 PRO 폴리펩티드의 억제능을 시험하였다. 이 분석에서 양성으로 시험된 폴리펩티드는 포유류에서 내피세포 증식을 억제하는데 유용하며, 이러한 효과는 예컨데 종양 성장을 억제하는데 유리할 것이다.
구체적으로는, 소의 부신피질 모세혈관 내피세포 (ACE) (초대 배양, 최대 12-14 계대)를 96-웰 플레이트에 100 ㎕ 당 500 세포/웰의 농도로 플레이팅하였다. 분석 배지는 저농도 글루코스 DMEM, 10 % 송아지 혈청, 2 mM 글루타민 및 1 X 페니실린/스트렙토마이신/푼기존을 포함하였다. 대조구 웰은 (1) ACE 세포가 첨가되지 않은 것, (2) ACE 세포만 있는 것, (3) ACE 세포 + 5 ng/ml FGF, (4) ACE 세포 + 3 ng/ml VEGF, (5) ACE 세포 + 3 ng/ml VEGF + 1 ng/ml TGF-베타, (6) ACE 세포 + 3 ng/ml VEGF + 5 ng/ml LIF 등이었다. 그 후에 시험 시료인 폴리-his 태그가 부착된 PRO 폴리펩티드 (100 ㎕ 부피 중)를 웰에 첨가하였다 (각각 1 %, 0.1 % 및 0.01 %의 희석물로 첨가함). 세포 배양물을 6 내지 7 일 동안 37 ℃/5 % CO2에서인큐베이션시켰다. 인큐베이션 후 웰의 배지를 흡입해 내고, 세포를 1 x PBS로 세척하였다. 그 후에 산 포스파타제 반응 혼합물 (100 ㎕, 0.1 M 아세트산 나트륨, pH 5.5, 0.1 % 트리톤 X-100, 10 mM p-니트로페닐 포스페이트)을 각 웰에 첨가하였다. 37 ℃에서 2 시간 인큐베이션한 후 10 ㎕ 1N NaOH를 첨가하여 반응을 정지시켰다. 마이크로플레이트 판독기로 405 nm에서의 흡광도 (OD)를 측정하였다.
PRO 폴리펩티드의 활성은 자극을 주지 않은 세포에 대한 VEGF (3 ng/ml) 자극 증식 (OD 405 nm에서 산 포스파타제 활성을 측정하여 결정함)의 억제율 (%)로서 계산하였다. TGF-베타는 VEGF에 의해 자극된 ACE 세포 증식의 70 내지 90 %를 차단하기 때문에 이를 1 ng/ml에서 활성 기준물질로서 사용하였다. 결과는 암 치료 및 구체적으로는 종양 혈관생성을 억제하는데 PRO 폴리펩티드의 유용성을 지시한다. 수치 (상대적 억제율)는 자극을 주지 않은 세포에 대해 PRO 폴리펩티드에 의한 VEGF에 의해 자극된 증식의 억제율 (%)을 계산하고 이 백분율값을 VEGF 자극 세포 증식의 70 내지 90 %를 억제하는 것으로 알려진 1 ng/ml TGF-베타에 의해 얻어지는 억제율 (%)로 나누어 계산한다. PRO 폴리펩티드가 내피세포 성장의 VEGF 자극을 30 % 이상 억제한다면 (상대적 억제율 30 % 이상) 그 결과를 양성으로 간주한다.
이 분석에서는 PRO323 폴리펩티드가 양성인 것으로 시험되었다.
실시예 32: 간상체 광수용체 세포 생존 (분석 56)
이 분석은 본 발명의 특정 폴리펩티드가 간상체 광수용체 세포의 생존/증식을 향상시키는 작용을 하므로 망막 질환 또는 손상의 치료적 처치에 유용하여, 예를 들어 색소성 망막염, AMD 등에 기인한 포유류의 시력 상실을 처치하는데 유용함을 보여준다. 생후 7 일 된 스프라그 돌리 래트 새끼 (혼합 집단: 신경교 및 망막 신경 세포 유형)를 CO2마취시킨 후 목을 베어 죽이고 무균 조건 하에 눈을 제거하였다. 망막 신경을 색소 상피와 다른 안 조직으로부터 절개해 낸 다음, Ca2+,Mg2+가 없는 PBS 중 0.25 % 트립신을 사용하여 단세포 현탁액으로 분리시켰다. 망막을 37 ℃에서 7 내지 10분 동안 인큐베이션시킨 후, 1 ㎖의 대두 트립신 억제제를 첨가하여 트립신을 불활성화시켰다. 세포를 96 웰 플레이트에 웰 당 100,000 세포의 농도로, N2를 보충한 DMEM/F12 중에 플레이팅시켰다. 모든 실험을 위한 세포는 37 ℃에서 5 % CO2의 수 포화 분위기에서 배양하였다. 2 내지 3 일 동안 배양한 후, 세포를 4 % 파라포름알데히드를 사용하여 고정시킨 다음, 셀트랙커 그린 (CellTracker Green) CMFDA를 사용하여 염색하였다. 시각 색소 로돕신에 대한 모노클로날 항체인 Rho 4D2 (복수 또는 IgG 1:100)를 사용하여 간접 면역형광에 의해 간상체 광수용체 세포를 검출하였다. 결과를 생존 %로서 계산한다: 배양한 지 2 내지 3 일째의 칼세인-로돕신 양성 세포 총 개수를 배양 2 내지 3 일째의 로돕신 양성 세포 총 개수로 나눈 값. 전체 세포 (형광)를 매킨토시 (MacIntosh)용 CCD 카메라 및 NIH 화상 소프트웨어를 사용하여 20×대물 배율에서 정량하였다. 웰 중의 필드는 랜덤하게 선택되었다.
이 분석에서 PRO243 폴리펩티드가 양성인 것으로 시험되었다.
실시예 33: 혈관주위세포에서의 c-Fos 유도 (분석 93)
이 분석은 본 발명의 특정 폴리펩티드가 혈관주위세포에서 c-fos의 발현을 유도하는 작용을 하기 때문에 특정 형태의 혈관주위세포와 관련된 종양의 진단 마커로서 뿐 아니라 혈관주위세포와 관련된 종양의 치료적 처치에 유용할 것으로 기대되는 길항제를 생성하는데에도 유용하다는 것을 보여준다. 구체적으로는, 1 일에 VEC Technologies사로부터 혈관주위세포를 얻고 플라스크에서 5 ml의 배지만 남기고 모두 제거한다. 2 일에 혈관주위세포를 트립신 처리하고 세척하고, 스피닝한 후, 96 웰 플레이트에 플레이팅하였다. 7 일에 배지를 제거하고 혈관주위세포를 PRO 폴리펩티드 시험 시료 및 대조구 100 ㎕로 처리한다 (양성 대조구 = DME + 5 % 혈청 +/- PDGF (500 ng/ml), 음성 대조구 = 단백질 32). 반복된 시험 결과를 평균내고, SD/CV를 결정한다. 주파수에 대해 화학발광 유닛 (RLU) 발광측정기 판독결과 나타난 단백질 32 (완충액 대조구)의 값을 넘는 곱 증가값을 막대그래프로 나타낸다. 단백질 32의 값보다 2 배 큰 값을 이 분석에서의 양성으로 간주한다. ASY 매트릭스: 성장 배지 = 저 글루코스 DMEM = 20 % FBS + 1 X 펜 스트렙 + 1 X 푼기존, 분석 배지 = 저 글루코스 DMEM + 5 % FBS.
이 분석에서 PRO241이 양성으로 시험되었다.
실시예 34: 혼합 림프구 반응 (MLR) 분석에서의 억제 활성 분석 (분석 67)
이 실시예는 본 발명의 폴리펩티드 하나 이상이 자극된 T-림프구의 증식 억제제로서 활성이 있음을 보여준다. 림프구의 증식을 억제하는 화합물은 면역반응의 억제가 유리한 경우에 치료상 유용하다.
이 분석의 기본적인 프로토콜은 문헌 (Current Protocols in Immunology,unit 3.12; edited by J E Coligan, A M Kruisbeek, D H Marglies, E M Shevach, W Strober, National Insitutes of Health, Published by John Wiley & Sons, Inc.)에 기재되어 있다.
더 구체적으로는, 한 변형 분석법에서는 말초혈 단핵 세포 (PBMC)를 포유류 개체, 예를 들어 인간 지원자로부터 류코페레시스 (leukopheresis)를 통해 단리한다 (한 공여자는 자극세포 PBMC를 공급할 것이고, 다른 공여자는 반응세포 PBMC를 공급할 것임). 필요하다면, 이들 세포를 단리한 후에 소 태아 혈청 및 DMSO 중에 냉동시킨다. 냉동 세포를 분석 배지 (37 ℃, 5 % CO2) 중에서 밤새 해동시키고 세척하고 분석 배지 (RPMI; 10 % 소 태아 혈청, 1 % 페니실린/스트렙토마이신, 1 % 글루타민, 1 % HEPES, 1 % 불필수 아미노산, 1 % 피루브산염)에 3 x 106세포/ml의 농도로 재현탁할 수 있다.
이 분석은 1 % 또는 0.1 %로 희석된 시험 시료 100 : 1, 조사된 자극세포 50 : 1 및 반응세포 PBMC의 혼합물을 3 벌 웰에 플레이팅하여 준비한다.
대조구로서 세포 배양 배지 100 ㎕ 또는 CD4-IgG 100 ㎕를 사용한다. 그 후, 웰을 37 ℃, 5 % CO2에서 4 일 동안 인큐베이션시킨다. 5 일에 각 웰을 적정된 티미딘 (1.0 mC/웰, Amersham)으로 펄싱한다. 6 시간 후에 세포를 3 회 세척한 후 이 표지가 흡수된 양을 측정한다.
이 분석의 다른 변형법에서는 PBMC를 Balb/c 마우스 및 C57B6 마우스의 비장으로부터 단리한다. 새로 수거된 비장으로부터 이들 세포를 떼어내어 분석 배지(RPMI; 10 % 소 태아 혈청, 1 % 페니실린/스트렙토마이신, 1 % 글루타민, 1 % HEPES, 1 % 불필수 아미노산, 1 % 피루브산염)에 넣고, PBMC를 Lympholyte M (Organon Teknika 제품) 상에 올려놓고 2000 rpm으로 20 분 동안 원심분리하고, 수집하고 단핵 세포층을 분석 배지 중에서 세척하고 이들 세포를 분석 배지에 1 x 107세포/ml의 농도로 재현탁시킴으로써 단리한다. 그 다음에, 이 분석을 상기한 바와 같이 수행한다.
대조구 미만으로의 감소는 억제성 화합물에 대한 양성 결과로 간주되며, 80 % 이하의 감소가 바람직하다. 그러나 대조구 미만의 값이라면 어떤 값이든 시험 단백질의 억제 효과를 지시한다.
이 분석에서는 PRO361이 양성인 것으로 시험되었다.
실시예 35: 조직 발현 분포
올리고뉴클레오티드 프로브를 정량적 PCR 증폭 반응에 사용하기 위해 첨부한 도면에서 보인 바와 같이 PRO 폴리펩티드 코딩 핵산 서열로부터 제작하였다. 올리고뉴클레오티드 프로브는 표준 PCR 반응에서 관련 주형의 3' 말단으로부터 대략 200 내지 600 염기쌍의 단편이 증폭되도록 선택되었다. 이들 올리고뉴클레오티드 프로브를 여러 인간 성인 및(또는) 태아 조직 공급원으로부터 단리한 cDNA 라이브러리와 함께 표준 정량적 PCR 증폭 반응에 사용하고, 아가로스 겔 전기영동에 의해 분석하여 시험한 여러 조직에서의 PRO 폴리펩티드 코딩 핵산의 발현 정도를 정량적으로 측정하였다. 여러 상이한 인간 조직 유형에서의 PRO 폴리펩티드 코딩 핵산발현 패턴 또는 차별적 발현에 대해 알 수 있다면 전이 종양의 원발 조직원 등을 결정하는데 있어서, 다른 조직 특이적 마커과 함께 또는 그러한 마커 없이도 조직 유형분류에 유용한 진단 마커를 제공할 수 있다. 이런 분석 결과를 아래 표 24에 나타냈다.
핵산 상당한 발현이 일어나는 조직 의미있는 정도의 발현이 나타나지 않는 조직
DNA34392-1170 간, 신장, 뇌, 폐 태반
DNA39976-1215 뇌 폐
DNA35595-1228 췌장, 뇌, 신장, 간
DNA34436-1238 폐, 태반, 뇌 고환
DNA44176-1244 간 뇌, 폐
DNA44192-1246 신장 간
DNA44804-1248 폐, 뇌
DNA41234-1242 폐, 간, 신장 뇌
DNA45410-1250 폐, 뇌, 신장, 간
DNA46777-1253 간, 태반, 뇌
실시예 36: 적아구 세포주에서의 태아 헤모글로빈 유도 (분석 107)
이 분석은 PRO 폴리펩티드가 적아구 세포주에서 성인 헤모글로빈으로부터 태아 헤모글로빈으로의 전환을 유도할 수 있는가를 스크리닝하는데 유용하다. 이 분석에서 시험한 분자가 양성이라면, 이 분자는 각종 지중해빈혈 등의 포유동물 헤모글로빈 관련 여러 질환을 치료적으로 처치하는데 유용할 것으로 기대된다. 이 분석은 다음과 같이 수행된다. 적아구 세포를 96 웰 포맷에 1 웰 당 1000 개의 세포씩 표준 성장 배지 중에 플레이팅한다. PRO 폴리펩티드를 0.2 % 또는 2 % 농도로 성장 배지에 첨가하고 세포를 37 ℃에서 5 일간 인큐베이션한다. 양성 대조구로서는 세포를 100 μM 헤민으로 처리하고 음성 대조구로서는 세포를 처리하지 않는다. 5 일 후에, 세포 용해물을 제조하여 감마 글로빈 (태아 마커)의 발현 여부를 분석한다. 이 분석에서의 양성이란 음성 대조구에 비해 적어도 2 배 이상 높은 감마 글로빈의 양을 의미한다.
PRO243 폴리펩티드가 이 분석에서 양성인 것으로 시험되었다.
실시예 37: 계내 혼성화
계내 혼성화는 세포 및 조직 표본 내 핵산 서열의 검출 및 위치 파악을 위한 강력한 다용도 기술이다. 예를 들면, 유전자 발현 부위 확인, 전사의 조직 분포 분석, 바이러스 감염 확인 및 위치 파악, 특정 mRNA 합성의 변화 추적 및 염색체 맵핑에 유용할 수 있다.
PCR로 생성된33P-표지된 리보프로브를 이용하여 문헌 (Lu and Gillett,Cell division1:169-176 (1994))에 따른 최적 버전의 프로토콜로 계내 혼성화를 수행하였다. 간략하게, 포르말린으로 고정시키고 파라핀에 묻힌 인간 조직을 절단하고, 파라핀을 제거한 후, 37 ℃에서 15 분 동안 프로테이나제 K (20 g/ml)로 단백질을 제거하고, 문헌 (Lu and Gillett, 상기 문헌)에 기재된 바와 같이 계내 혼성화를 위해 추가의 처리를 하였다. PCR 산물로 생성된 (33P) UTP-표지된 안티센스 리보프로브로 55 ℃에서 밤새 혼성화시켰다. 상기 슬라이드를 코닥 (Kodak) NTB2 핵 트랙 에멀젼 (nuclear track emulsion) 중에 담그고 4 주 동안 노출시켰다.
33 P-리보프로브 합성
6.0 ㎕ (125 mCi)의33P-UTP (Amersham BF 1002, SA < 2000 Ci/mMol)를 고속진공 (speed vac) 건조시켰다. 건조된33P-UTP가 들어있는 각 튜브마다 하기의 성분들을 첨가하였다:
2.0 ㎕ 5x 전사 완충액
1.0 ㎕ DTT (100 mM)
2.0 ㎕ NTP 혼합물 (2.5 mM: 10 mM GTP, CTP 및 ATP 각각 10 μ+ 10 ㎕ H2O)
1.0 ㎕ UTP (50 μM)
1.0 ㎕ RNasin
1.0 ㎕ DNA 주형 (l ㎍)
1.0 ㎕ H20
1.0 ㎕ RNA 중합효소 (PCR 산물로는 통상 T3 = AS, T7 = S)
37 ℃에서 1 시간 동안 상기 튜브를 인큐베이션하였다. 1.0 ㎕의 RQ1 DNase를 첨가한 후에 37 ℃에서 15 분 동안 인큐베이션하였다. 90 ㎕의 TE (10 mM Tris (pH 7.6)/l mM EDTA (pH 8.0))를 첨가하고 상기 혼합물을 DE81 페이퍼에 피펫으로 가하였다. 마이크로콘 (Microcon)-50 초미세여과 유니트에 잔류 용액을 로딩하고 프로그램 10으로 6 분 동안 스피닝했다. 여과 유니트를 제2튜브로 옮기고 프로그램 2로 3 분 동안 스피닝했다. 마지막 회수 (recovery) 스피닝 후에, 100 ㎕의 TE를 첨가하였다. DE81 페이퍼 상에 최종 생성물 1 ㎕를 피펫으로 가하고 6 ml의 바이오플라워 (Bioflour) Ⅱ로 계수하였다.
TBE/우레아 겔 상에 프로브를 전기영동시켰다. 3 ㎕의 로딩 완충액에 1 내지 3 ㎕의 프로브 또는 5 ㎕의 RNA Mrk Ⅲ를 첨가하였다. 95 ℃의 가열 블록 (heat block)에서 3 분 동안 가열한 후에, 즉시 겔을 빙상으로 옮겼다. 겔의 웰을 세척한 후, 시료를 로딩하여 180 내지 250 볼트에서 45 분 동안 전기영동시켰다. 사란 (saran) 랩으로 겔을 싸고, 이를 -70 ℃의 냉동실에서 1 시간 내지 밤새도록 신호 증강 스크린 상에서 XAR 필름에 노출시켰다.
33 P-혼성화
A.동결 절편의 예비처리
냉동실에서 슬라이드를 꺼내 알루미늄 트레이에 놓고 실온에서 5 분 동안 녹였다. 응축 감소를 위해, 트레이를 55 ℃ 인큐베이터에 5 분 동안 넣어 두었다. 슬라이드를 발연 후드 (fume hood)에서 빙상 4 % 파라포름알데히드 중에 10 분 동안 고정시키고, 실온에서 0.5x SSC (25 ml 20x SSC + 975 ml SQ H2O)로 5 분 동안 세척하였다. 0.5 ㎍/ml의 프로테이나제 K로 37 ℃에서 10 분 동안 단백질을 제거한 후에 (RNase가 없는 예열된 RNase 완충액 250 ml 중 10 mg/ml 스톡 12.5 ㎕), 실온에서 10 분 동안 0.5x SSC로 절편을 세척하였다. 70 %, 95 %, 100 % 에탄올로 각각 2 분 동안 절편을 탈수시켰다.
B.파라핀에 묻힌 절편의 예비처리
슬라이드의 파라핀을 제거해 SQ H2O 중에 놓고 실온에서 2x SSC 로 5 분씩 2 번 헹궈내었다. 20 ㎕/ml의 프로테이나제 K (RNase가 없는 RNase 완충액 250 ml 중 10 mg/ml, 500 ㎕, 37 ℃, 15 분) (인간 배 (embryo)), 또는 8x 프로테이나제 K(RNase 완충액 250 ml 중 100 ㎕, 37 ℃, 30 분) (포르말린 조직)으로 절편의 단백질을 제거하였다. 이어서, 상기 기재된 바와 같이 0.5x SSC로 헹궈내고 탈수화시켰다.
C.예비혼성화
박스 (Box) 완충액 (4x SSC, 50 % 포름아미드)으로 포화된 필터 페이퍼가 놓여진 플라스틱 상자에 슬라이드를 얹어 놓았다. 조직을 50 ㎕의 혼성화 완충액 (3.75 g의 덱스트란 술페이트 + 6 ml의 SQ H2O)으로 덮고 볼텍싱 후, 뚜껑을 느슨하게 한 상태로 2 분 동안 극초단파로 가열하였다. 빙냉 후에, 18.75 ml의 포름아미드, 3.75 ml의 20x SSC 및 9 ml의 SQ H2O를 첨가하고 조직을 잘 볼텍싱한 후, 42 ℃에서 1 내지 4 시간 동안 인큐베이션했다.
D. 혼성화
슬라이드마다 1.0 x 106cpm의 프로브 및 1.0 ㎕의 tRNA (50 mg/ml 스톡)를 넣고 95 ℃에서 3 분 동안 가열하였다. 빙냉 후에, 슬라이드마다 48 ㎕의 혼성화 완충액을 첨가하였다. 볼텍싱한 후에, 슬라이드 상의 50 ㎕의 예비혼성화 시료에 50 ㎕의33P 혼합물을 첨가하였다. 이 슬라이드를 55 ℃에서 밤새 인큐베이션했다.
E. 세척
실온에서 2x SSC, EDTA로 10 분씩 2 번 세척한 후에 (400 ml의 20x SSC + 16 ml의 0.25 M EDTA, 최종 부피=4 ℓ), 37 ℃에서 30 분 동안 RNase A를 처리하였다 (RNase 완충액 250 ml 중 10 mg/ml, 500 ㎕ = 20 ㎍/ml). 슬라이드를 실온에서 2xSSC, EDTA로 10 분씩 2 번 세척하였다. 엄격한 세척 조건은 다음과 같다: 0.1x SSC 및 EDTA로 55 ℃에서 2 시간 (20 ml의 20x SSC + 16 ml의 EDTA, 최종 부피 = 4 ℓ).
F. 올리고뉴클레오티드
본원에 개시된 여러 가지 DNA 서열에 대한 계내 분석을 수행하였다. 분석에 사용된 올리고뉴클레오티드는 하기와 같다.
(1)DNA44804-1248 (PRO357)
pl 5'-GGATTCTAATACGACTCACTATAGGGCTGCCCGCAACCCCTTCAACTG-3' (서열 번호 111)
p2 5'-CTATGAAATTAACCCTCACTAAAGGGACCGCAGCTGGGTGACCGTGTA-3' (서열 번호 112)
(2)DNA5272-1229 (PRO715)
pl 5 '-GGATTCTAATACGACTCACTATAGGGCCGCCCCGCCACCTCCT-3' (서열 번호 113)
p2 5'-CTATGAAATTAACCCTCACTAAAGGGACTCGAGACACCACCTGACCCA-3' (서열 번호 114)
p3 5'-GGATTCTAATACGACTCACTATAGGGCCCAAGGAAGGCAGGAGACTCT-3' (서열 번호 115)
p4 5'-CTATGAAATTAACCCTCACTAAAGGGACTAGGGGGTGGGAATGAAAAG-3' (서열 번호 116)
(3)DNA38113-1230 (PRO327)
pl 5'-GGATTCTAATACGACTCACTATAGGGCCCCCCTGAGCTCTCCCGTGTA-3' (서열 번호 117)
p2 5'-CTATGAAATTAACCCTCACTAAAGGGAAGGCTCGCCACTGGTCGTAGA-3' (서열 번호 118)
(4)DNA35917-1207 (PR0243)
pl 5'-GGATTCTAATACGACTCACTATAGGGCAAGGAGCCGGGACCCAGGAGA-3' (서열 번호 119)
p2 5'-CTATGAAATTAACCCTCACTAAAGGGAGGGGGCCCTTGGTGCTGAGT-3' (서열 번호 120)
G. 결과
본원에 개시된 여러 가지 여러 가지 DNA 서열에 대한 계내 분석을 수행하였다. 분석 결과는 하기와 같다.
(1)DNA44804-1248 (PRO357)
태아 조직 및 골육종의 악성 세포의 골형성 부위에서 낮은 수준 내지 중간 수준으로 발현되었다. 가능한 신호는 태반 및 인대에서 나타났다. 모든 다른 조직은 음성이었다.
검사한 태아 조직 (E12-E16 주)은 다음과 같다: 간, 신장, 부신, 폐, 심장, 주요 혈관, 식도, 위, 비장, 생식선, 뇌, 척추 및 체벽.
검사한 성인 인간의 조직은 다음과 같다: 간, 신장, 위, 비장, 부신, 췌장, 폐, 결장암, 신장 세포암 및 골육종. 아세토미노펜은 간 손상 및 간경변을 유도했다.
검사한 침팬지 조직은 다음과 같다: 갑상선, 부갑상선, 림프절, 신경, 혀, 흉선, 부신, 위점막 및 침샘.
검사한 벵골 원숭이 조직은 다음과 같다: 대뇌 및 소뇌.
(2)DNA52722-1229 (PRO715)
많은 조직에서 일반화된 강한 신호가 나타났다. 태반, 조골 세포, 손상된 세뇨관, 손상된 간, 결장직장의 간암 전이 및 담낭에서 신호가 가장 강했다.
검사한 태아 조직 (E12-E16 주)은 다음과 같다: 태반, 제대, 간, 신장, 부신, 갑상선, 폐, 심장, 주요 혈관, 식도, 위, 소장, 비장, 흉선, 췌장, 뇌, 눈, 척수, 체벽, 골반 및 하지.
검사한 성인 인간의 조직은 다음과 같다: 간, 신장, 부신, 심근, 대동맥, 비장, 폐, 피부, 연골 육종, 눈, 위, 결장, 결장암, 전립선, 방광 점막 및 담낭. 아세토미노펜은 간손상 및 간경변을 유도했다.
검사한 벵골 원숭이 조직은 다음과 같다: 대뇌 피질 (rm), 해마 (rm).
검사한 침팬지 조직은 다음과 같다: 갑상선, 부갑상선, 림프절, 신경, 혀, 흉선, 부신, 위점막 및 침샘.
(3)DNA38113-1230 (PRO327)
발생중인 마우스 및 인간 태아의 폐에서 높은 수준으로 발현됨이 관찰되었다. 기관지 표피를 포함하는 정상 성인의 폐에서는 음성이었다. 인간 태아 기관지의 점막하, 가능하게는 평활근 세포에서 발현되었다. 인간 태반의 분명치 않은 조직발생의 비영양 세포에서도 발현됨이 관찰되었다. 마우스에서는 발생중인 코 및 발생중인 혀에서 발현됨이 관찰되었다. 기타의 모든 조직에서는 음성이었다. 기관지 발생에서 역할을 할 것이 가능하다고 생각된다.
검사한 태아 조직 (E12-E16 주)은 다음과 같다: 태반, 제대, 간, 신장, 부신, 갑상선, 폐, 심장, 주요 혈관, 식도, 위, 소장, 비장, 흉선, 췌장, 뇌, 눈 척수, 체벽, 골반 및 하지.
검사한 성체 조직은 다음과 같다: 간, 신장, 부신, 심근, 대동맥, 비장, 림프절, 췌장, 폐, 피부, 대뇌 피질 (rm), 해마 (rm), 소뇌 (rm), 음경, 눈, 방광, 위, 위암, 결장, 결장암, 갑상선 (침팬지), 부갑상선 (침팬지), 난소 (침팬지) 및연골 육종.
(4)DNA35917-1207 (PR0243)
코르넬리아 드 랑즈 증후군 (CdLS)은 선천성 증후군이다. 즉, 태어날 때부터 증세가 있음을 의미한다. CdLS는 신체 발달, 지적 발달 및 언어 발달의 지체를 일으키는 질환이다. CdLS에 걸린 어린이의 대다수가 정신 지체가 있고, 정신 지체는 보통 내지 심한 정도이다. 보고된 IQ는 30 내지 85이다. 평균 IQ는 53이다. 머리 및 안면부 특징은 작은 머리 크기, 종종 미간이 붙은 얇은 눈썹, 긴 속눈썹, 짧고 들린 코, 얇고 처진 입술, 낮게 달린 귀 및 고도의 아치형 구개 또는 언청이를 포함한다. 다른 특징은 언어 지체, 가장 경미한 영향에서도, 성장 지체 및 작은 신장, 낮은 음역의 울음 소리, 작은 손발, 제5수지 내굴, 시미안선 및 과다한 체모를 포함할 수 있다. 진단은 상기 특징이 복합적으로 나타나는 것에 따른다. 상기 특징들의 많은 것들이 다양한 정도로 나타난다. 어떤 경우에는, 상기 특징이 나타나지 않거나 또는 경미하기 때문에, 숙련된 유전학자나 이 증상을 잘 알고 있는 사람만이 구별할 수 있을 것이다. CdLS에 대한 것이 많이 공지되어 있지만, 최근 연구로 배워야 할 것이 훨씬 더 많음을 알 수 있다.
상기 연구에서, 인간 태아의 안면, 머리, 사지 및 마우스 배 (embryo)의 추가적 절편을 검사하였다. 어떤 마우스 조직에서도 발현이 나타나지 않았다. 발현은 안티센스 프로브로만 조사할 때만 나타났다.
발현은 간충직의 발생중인 사지 및 안면부 뼈 부근에서 관찰되었다. 발현은 고도로 특이적이며 종종 혈관신생이 일어나는 부위 근처에서 나타났다. 이러한 분포는 코르넬리아 드 랑즈 증후군에서 관찰되는 뼈의 비정상성과 일치하는 것이었다. 또한, 발현은 태아 뇌의 발생중인 측두엽 및 후두엽에서 관찰되었으나, 다른 곳에서는 관찰되지 않았다. 추가로, 발현은 발생중인 내이의 신경절에서 나타났지만, 이런 발견의 중요성은 분명하지 않다.
이런 데이타가 기능적인 정보를 제공하는 것은 아니지만, 상기 분포는 이 증후군에서 가장 심하게 영향을 받는다고 알려져 있는 부위와 일치한다.
추가로, 대퇴 두부 및 관골구 사이 (고관절)에 나타나는 발생중인 활액 관절 분열선에서 약간 발현됨이 관찰되었다. 그밖의 관절 형성 부위에서 이런 양상의 발현이 관찰된다면, 코르넬리아 드 랑즈 증후군에서 관찰되는 안면 및 사지 비정상을 설명할 수 있을 것이다.
실시예 38: 제노푸스 난모세포의 PRO243 mRNA 활성
PRO243을 코딩하는 인간의 코르딘 클론 (DNA35917-1207)이 기능적이고, 제노푸스코르딘및 초파리sog유전자에 의해 예측되는 방식으로 작용한다는 것을 증명하기 위해, 퀴아젠 (Quiagen)을 사용하여 DNA35917-1207로부터의 수퍼코일 플라스미드 DNA를 제조하고 제노푸스 래비스 (Xenopus laevis)의 배 (embryo)에 주입했다. 제노푸스코르딘mRNA를 배쪽 식물극 (ventrovegetal) 할구에 미세주입하면 제2축 (쌍을 이룸)을 유도하고 (Sasai et al.,Cell79:779-790 (1994)), 초파리sog역시 제노푸스 배의 복부 측면 상의 비정상적 위치에서 발현되면 제2축을 유도한다 (Holley et al.,Nature376:249-253 (1995) 및 Schmidt et al.,Development121:4319-4328 (1995)). 제노푸스 난모세포에sog이 기능한다는 것은 등배 패턴형성에 관련되는 과정이 진화 동안에 보존되어 왔음을 암시한다.
방법
제노푸스 배 (embryo) 조작:
삽입 3 일 전에는 임신한 암컷 혈청 200 I.U.로 암컷 성체 개구리를 부스팅시키고, 삽입 전날 밤에는 인간 융모막의 생식선자극호르몬 800 I.U.로 추가 부스팅했다. 다음날 아침 암컷 개구리로부터 신선한 난모세포를 짜내고, 도살한 수컷 개구리의 잘게 썬 고환과 난모세포를 혼합하여 체외수정시켰다. 문헌 (Nieuwkoop and Faber, Normal Table of Xenopus laevis, N.-H. P. Co., ed. (Amsterdam, 1967))에 따라 발생된 배를 유지하고 단계를 구분했다.
2 % 시스테인 (pH 7.8)을 10 분 동안 처리하여 수정란의 젤리층을 제거하고, 증류수로 1 번 세척한 후, 5 % 피콜 (Ficoll)을 포함하는 0.1x MBS로 옮겼다. 5 % 피콜을 포함하는 0.1x MBS가 들어있는 삽입 트레이에 수정란을 정렬시켰다. 야생형 코르딘 (DNA35917-1207)을 포함하는 pRK5 200 pg 또는 대조군으로서 삽입체가 없는 pRK5 200 pg으로 가지고 2-세포 단계 발생중인 제노푸스 배에 삽입하였다. DNA가 삽입된 배를 트레이에서 6 시간 더 배양한 후에, 뉴쿠프 단계 37 내지 38에 도달할 때까지 젠타마이신 50 mg/ml을 포함하는 0.1x MBS로 옮겨 배양하였다.
결과:
인간 코르딘 cDNA를 한 할구에 삽입시킨 결과 올챙이 배를 발생시켰다. 올챙이의 배 발생은 꼬리의 단축 및 비틀림 및 백악질 선의 확장으로 나타난다. 인간의 코르딘이 제노푸스에서 배 형성제로 작용할 수 있다는 것은 DNA35917-1207가코딩하는 단백질이 기능적이며 개구리에서의 등배 패턴 형성에 영향을 준다는 것을 나타내며, 인간, 파리 및 개구리 사이의 공통된 메카니즘으로 진화 동안 보존되어왔음을 암시한다.
물질의 기탁
다음 물질들은 미국 버지니아주 20110-2209 마나사스 유니버시티 불바드 10801에 소재하는 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션 (ATCC)에 기탁되었다.
물질 ATCC 기탁번호 기탁일
DNA34392-1170 ATCC 209526 1997년 12월 10일
DNA35917-1207 ATCC 209508 1997년 12월 3일
DNA39976-1215 ATCC 209524 1997년 12월 10일
DNA35595-1228 ATCC 209528 1997년 12월 10일
DNA38113-1230 ATCC 209530 1997년 12월 10일
DNA34436-1238 ATCC 209523 1997년 12월 10일
DNA40592-1242 ATCC 209492 1997년 11월 21일
DNA44176-1244 ATCC 209532 1997년 12월 10일
DNA44192-1246 ATCC 209531 1997년 12월 10일
DNA39518-1247 ATCC 209529 1997년 12월 10일
DNA44804-1248 ATCC 209527 1997년 12월 10일
DNA52722-1229 ATCC 209570 1998년 1월 7일
DNA41234-1242 ATCC 209618 1998년 2월 5일
DNA45410-1250 ATCC 209621 1998년 2월 5일
DNA46777-1253 ATCC 209619 1998년 2월 5일
이들 기탁은 특허 절차상 미생물 기탁의 국제적 승인에 관한 부다페스트 조약 및 그의 규칙 (부다페스트 조약 (Budapest Treaty))의 규정 하에 이루어졌다. 이는 기탁일로부터 30 년 동안 기탁물의 생존 배양물의 유지를 보장한다. 기탁물은 부다페스트 조약의 협약 하에 ATCC로부터 제넨테크 인크와 ATCC 사이의 협정에 따라 분양될 것이며, 이는 관련 미국 특허의 허여시 또는 미국 또는 외국 특허 출원의 공개시 (이 중 먼저인 때) 공공에 대한 기탁물의 배양 프로제니의 영구적이고 비제한적인 분양을 보장하고, 미국 특허 및 상표청장에 의해 35 USC §122 및 그에 따른 미국 특허 및 상표청장의 규칙 (37 CFR §1.14 포함, 특히 886 OG 638 참조)에 따라 권리가 있는 것으로 결정한 이에게 프로제니의 분양을 보장한다.
본 출원의 양수인은 적합한 조건 하에 배양할 때 기탁 물질의 배양물이 사멸하거나 손실되거나 파손된 경우, 그 통지시 물질을 다른 동일한 물질로 즉시 교체할 것임을 동의하였다. 기탁 물질의 분양은 각국 정부의 권한으로 그 특허법에 따라 승인된 권리에 위배하여 본 발명을 실시하도록 허가하는 것으로서 해석되어서는 안된다.
앞서 기술한 명세서는 당업자가 본 발명을 실시할 수 있도록 하기에 충분한 것으로 생각된다. 본 발명은 기탁된 실시양태는 본 발명의 특정 측면의 한 예시로서 의도되는 것이므로 기탁된 구조물의 범위에 제한되지 않고, 기능적으로 동등한 임의의 구조물은 본 발명의 범위 내에 있다. 본원에서 물질의 기탁은 본원에 포함된 기재 내용이 본 발명의 최선의 양식을 포함한 임의의 측면을 실시하기에 부적절하다는 것을 의미하지는 않으며, 특허 청구 범위의 범위를 명세서에서 나타내는 구체적인 설명에 제한하려는 것으로 해석되어서는 안된다. 실제로, 앞서의 상세한 설명으로부터 본원에 나타내고 기술된 것 이외에 본 발명의 다양한 변형이 당업자에게는 명백하고, 이는 첨부된 특허 청구의 범위 내에 있을 것이다.

Claims (21)

  1. 도 2 (서열 2), 도 4 (서열 7), 도 6 (서열 15), 도 10 (서열 24), 도 14 (서열 32), 도 16 (서열 37), 도 18 (서열 42), 도 20 (서열 50), 도 22 (서열 55), 도 24 (서열 61), 도 26 (서열 69), 도 28 (서열 76), 도 30 (서열 78), 도 32 (서열 83) 및 도 34 (서열 91)에 나타낸 아미노산 서열로 구성된 군에서 선택된 아미노산 서열을 코딩하는 뉴클레오티드 서열과의 핵산 서열 동일성이 80 % 이상인 단리된 핵산.
  2. 도 1 (서열 1), 도 3 (서열 6), 도 5 (서열 14), 도 9 (서열 23), 도 13 (서열 31), 도 15 (서열 36), 도 17 (서열 41), 도 19 (서열 49), 도 21 (서열 54), 도 23 (서열 60), 도 25 (서열 68), 도 27 (서열 75), 도 29 (서열 77), 도 31 (서열 82) 및 도 33 (서열 90)에 나타낸 뉴클레오티드 서열로 구성된 군에서 선택된 뉴클레오티드 서열과의 핵산 서열 동일성이 80 % 이상인 단리된 핵산.
  3. 도 1 (서열 1), 도 3 (서열 6), 도 5 (서열 14), 도 9 (서열 23), 도 13 (서열 31), 도 15 (서열 36), 도 17 (서열 41), 도 19 (서열 49), 도 21 (서열 54), 도 23 (서열 60), 도 25 (서열 68), 도 27 (서열 75), 도 29 (서열 77), 도 31 (서열 82) 및 도 33 (서열 90)에 나타낸 뉴클레오티드 서열의 전장 코딩 서열로 구성된 군에서 선택된 뉴클레오티드 서열과의 핵산 서열 동일성이 80 % 이상인 단리된핵산.
  4. ATCC 209526, ATCC 209508, ATCC 209524, ATCC 209528, ATCC 209530, ATCC 209523, ATCC 209492, ATCC 209532, ATCC 209531, ATCC 209529, ATCC 209527, ATCC 209570, ATCC 209618, ATCC 209621 또는 ATCC 209619로 기탁된 DNA의 전장 코딩 서열과의 핵산 서열 동일성이 80 % 이상인 단리된 핵산.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 따른 핵산을 포함하는 벡터.
  6. 제5항에 있어서, 형질전환될 숙주 세포에 의해 인식되는 조절 서열에 작동가능하게 연결된 벡터.
  7. 제5항의 벡터를 포함하는 숙주 세포.
  8. 제7항에 있어서, CHO 세포인 숙주 세포.
  9. 제7항에 있어서, 대장균 (E. coli.)인 숙주 세포.
  10. 제7항에 있어서, 효모 세포인 숙주 세포.
  11. 제7항의 숙주 세포를 PRO 폴리펩티드의 발현에 적합한 조건으로 배양하고 이 세포 배양물로부터 PRO 폴리펩티드를 회수하는 것을 포함하는 PRO 폴리펩티드의 제조 방법.
  12. 도 2 (서열 2), 도 4 (서열 7), 도 6 (서열 15), 도 10 (서열 24), 도 14 (서열 32), 도 16 (서열 37), 도 18 (서열 42), 도 20 (서열 50), 도 22 (서열 55), 도 24 (서열 61), 도 26 (서열 69), 도 28 (서열 76), 도 30 (서열 78), 도 32 (서열 83) 및 도 34 (서열 91)에 나타낸 아미노산 서열로 구성된 군에서 선택된 아미노산 서열과의 아미노산 서열 동일성이 80 % 이상인 단리된 폴리펩티드.
  13. 도 2 (서열 2), 도 4 (서열 7), 도 6 (서열 15), 도 10 (서열 24), 도 14 (서열 32), 도 16 (서열 37), 도 18 (서열 42), 도 20 (서열 50), 도 22 (서열 55), 도 24 (서열 61), 도 26 (서열 69), 도 28 (서열 76), 도 30 (서열 78), 도 32 (서열 83) 및 도 34 (서열 91)에 나타낸 아미노산 서열로 구성된 군에서 선택된 아미노산 서열과 비교할 때, 80 % 이상의 양성을 기록하는 단리된 폴리펩티드.
  14. ATCC 209526, ATCC 209508, ATCC 209524, ATCC 209528, ATCC 209530, ATCC 209523, ATCC 209492, ATCC 209532, ATCC 209531, ATCC 209529, ATCC 209527, ATCC 209570, ATCC 209618, ATCC 209621 또는 ATCC 209619로 기탁된 DNA의 전장 코딩 서열이 코딩하는 아미노산 서열과의 아미노산 서열 동일성이 80 % 이상인 단리된 폴리펩티드.
  15. 이종 아미노산 서열에 융합된 제12항 내지 제14항의 어느 한 항에 따른 폴리펩티드를 포함하는 키메라 분자.
  16. 제15항에 있어서, 상기 이종 아미노산 서열이 에피토프 태그 (tag) 서열인 키메라 분자.
  17. 제15항에 있어서, 상기 이종 아미노산 서열이 면역글로불린의 Fc 영역인 키메라 분자.
  18. 제12항 내지 제14항 중 어느 한 항에 따른 폴리펩티드에 특이적으로 결합하는 항체.
  19. 제18항에 있어서, 모노클로날 항체, 인간화 항체 또는 단쇄 항체인 항체.
  20. (a) 수반하는 신호 펩티드가 없고, 도 2 (서열 2), 도 4 (서열 7), 도 6 (서열 15), 도 10 (서열 24), 도 14 (서열 32), 도 16 (서열 37), 도 18 (서열 42), 도 20 (서열 50), 도 22 (서열 55), 도 24 (서열 61), 도 26 (서열 69), 도 28 (서열 76), 도 30 (서열 78), 도 32 (서열 83) 또는 도 34 (서열 91)에 나타낸 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열, 또는
    (b) 수반하는 신호 펩티드를 가지며, 도 2 (서열 2), 도 4 (서열 7), 도 6 (서열 15), 도 10 (서열 24), 도 14 (서열 32), 도 16 (서열 37), 도 18 (서열 42), 도 20 (서열 50), 도 22 (서열 55), 도 24 (서열 61), 도 26 (서열 69), 도 28 (서열 76), 도 30 (서열 78), 도 32 (서열 83) 또는 도 34 (서열 91)에 나타낸 폴리펩티드의 세포외 도메인을 코딩하는 뉴클레오티드 서열, 또는
    (c) 수반하는 신호 펩티드가 없고, 도 2 (서열 2), 도 4 (서열 7), 도 6 (서열 15), 도 10 (서열 24), 도 14 (서열 32), 도 16 (서열 37), 도 18 (서열 42), 도 20 (서열 50), 도 22 (서열 55), 도 24 (서열 61), 도 26 (서열 69), 도 28 (서열 76), 도 30 (서열 78), 도 32 (서열 83) 또는 도 34 (서열 91)에 나타낸 폴리펩티드의 세포외 도메인을 코딩하는 뉴클레오티드 서열과의 핵산 서열 동일성이 80 % 이상인 단리된 핵산.
  21. (a) 수반하는 신호 펩티드가 없고, 도 2 (서열 2), 도 4 (서열 7), 도 6 (서열 15), 도 10 (서열 24), 도 14 (서열 32), 도 16 (서열 37), 도 18 (서열 42), 도 20 (서열 50), 도 22 (서열 55), 도 24 (서열 61), 도 26 (서열 69), 도 28 (서열 76), 도 30 (서열 78), 도 32 (서열 83) 또는 도 34 (서열 91)에 나타낸 폴리펩티드, 또는
    (b) 수반하는 신호 펩티드를 가지며, 도 2 (서열 2), 도 4 (서열 7), 도 6 (서열 15), 도 10 (서열 24), 도 14 (서열 32), 도 16 (서열 37), 도 18 (서열 42),도 20 (서열 50), 도 22 (서열 55), 도 24 (서열 61), 도 26 (서열 69), 도 28 (서열 76), 도 30 (서열 78), 도 32 (서열 83) 또는 도 34 (서열 91)에 나타낸 폴리펩티드의 세포외 도메인, 또는
    (c) 수반하는 신호 펩티드가 없고, 도 2 (서열 2), 도 4 (서열 7), 도 6 (서열 15), 도 10 (서열 24), 도 14 (서열 32), 도 16 (서열 37), 도 18 (서열 42), 도 20 (서열 50), 도 22 (서열 55), 도 24 (서열 61), 도 26 (서열 69), 도 28 (서열 76), 도 30 (서열 78), 도 32 (서열 83) 또는 도 34 (서열 91)에 나타낸 폴리펩티드의 세포외 도메인과의 아미노산 서열 동일성이 80 % 이상인 단리된 폴리펩티드.
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