TWI227140B

TWI227140B - Therapeutic agent for cachexia comprising a substance capable of inhibiting the binding between a parathyroid hormone related peptide and a receptor thereof as an active ingredient

Info

Publication number: TWI227140B
Application number: TW087107554A
Authority: TW
Inventors: Koh Sato; Toshiaki Tsunenari; Kimie Ishii
Original assignee: Chugai Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 1997-05-15
Filing date: 1998-05-15
Publication date: 2005-02-01
Also published as: WO1998051329A1; TR199902800T2; ES2285769T3; EP1004313A1; EP1004313A4; ATE361099T1; US7468184B2; UA74130C2; PL193575B1; SK155799A3; DE69837707D1; PL336797A1; AU750021C; CN1255858A; BR9809629A; EP1004313B1; AU7236998A; US20020165363A1; CN1329080C; KR100508338B1

Description

1227140 A7 B7 五、發明説明（1 ) 技術範疇本發明係關於副甲狀腺激素相關胜肽（PTHrp)，以及以阻告其與受斋結合之物質爲有效成分之惡病質治療劑。背景技術於癌症末期患者所見到之惡病質爲惡性腫瘤伴隨性症候群中之一種，其會引起以食慾不振、體重減少、貧血、水電解質異常、免疫異常等爲主要症狀之全身狀態不適。對癌症患者而吕’惡病質之發作不僅造成威脅生命之終末期症狀’而且會顯著損及患者之生活品質，給患者本身、其家族及周圍的人帶來精神上、身體上及社會上之強大影響。近年，被認爲係癌惡病質之原因物質之惡病質素 (cachectin)，已明白其爲與腫瘤壞死因子（Tnf)相同之因子。其後，了解間白素l(IL-l)及IL_6、LIF、IFN等組織介素（cytokin)也有同樣的作用，以及了解癌惡病質爲藉複數個因子之複合作用所導致之病態。已知來自人類口腔底癌之0CC-1細胞株會產生與此種癌惡病質有關之種種液性因子，若將OCC-1細胞移植至裸鼠，將使惡病質等諸症狀出現（Kajimura N.等人，Cancer Chemother. Pharmacol·，1996，3 8 Suppl. pS 48-52 ; Tanaka R.等人，Jpn. J. Clin. Oncology Apr. 1996，26(2)p 88-94) 。關於此，咸認爲被移植至裸鼠之〇 c C -1細胞株在增殖之同時，產生種種組織介素（G-CSF、IL-6、、LIF、IL-11、 PTHrP等），此等因子複合作用而使上述諸症狀出現。移植有該細胞株之裸鼠之症狀被認爲與人類末期癌患者 -4- 本纸張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（21〇><297公釐） (請先閱讀池

訂經濟部中央標準局員工消費合作社印製 1227140 A7 B7 五、發明説明（2 之症狀有極高之共通性。但是，至現在爲止，尚不知有對抗此種惡病質之藥劑之報告。發明之揭示本發明之目的爲提供一種以阻害PTHrP與受器結合之物質爲有效成分之惡病質治療劑。本發明者爲了提供這樣的治療劑而反覆深入研究，結果發現藉著對副甲狀腺激素相關胜肽與受器結合有阻害作用之物質可以達成該目的，本發明於是完成。亦即，本發明爲以阻害PTHrP與受器結合之物質爲有效成分之惡病質治療劑。上述惡病質例如爲來自癌者。本發明爲一種以阻害副甲狀腺激素相關胜肽（PTHrP)與受器（PTHrP受器）結合之物質爲有效成分之惡病質治療劑。在本發明中，PTHrP受器係指例如特表平6-506598號公報所記載之與PTHrP結合之受器，而不管其是否爲存在於標的器官（例如骨或腎臟）上之PTHrP受器。又，「阻害PTHrP與PTHrP受器結合之物質」係指藉著與PTHrP結合而阻害PTHrP與PTHrP受器結合之物質（例如抗PTHrP抗體），以及藉著與PTHrP受器結合而阻害 PTHrP與PTHrP受器結合之物質[例如對PTHrP受器有拮抗作用之物質（亦稱爲PTHrP拮抗劑），具體而言，係指將 PTHrP胜肽之至少一個胺基酸予以置換或(刪除者，及PTHrP 胜肽之部分序列等]中之任一者或二者。做爲抗PTHrP抗體者，除人型化抗體、人類抗體（W0 96/ -5- 本纸張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） (請先閱讀

t- .¾濟部中央標準局員工消費合作社印製 1227140 A7 B7 五、發明説明（3 ) 33735)或嵌合抗體（特開平4-228089號公報）等公知之抗體之外，尚有本發明中之抗體（#23-57-137-1抗體）等。再者，抗體可爲多株抗體，但以單株抗體爲較佳。又做爲PTHrP 拮抗劑者，包含多肽及低分子化合物等，例如與PTHrP受器結合而對PTHrP有拮抗作用之物質，其例爲特開平7-165790 號公報，胜肽（美國）1995 ， 16(6)103 1-1037 ，

Biochemistry(美國）Apr. 281992，3 1(16) 4026-4033，特表平5-5 09098號公報所記載之有PTHrP拮抗活性之多肽。又，上文例示之多肽之中，至少一個胺基酸被删除、置換、附加或插入之多肽且具有同等之PTHrP拮抗活性者亦被包含在本發明之PTHrP拮抗劑中。下文舉例説明在本發明中做爲「阻害ΡΤΗιΤ與PTHrP受器結合之物質」之抗PTHrP抗體。 1.抗PTHrP抗體本發明所使用之抗PTHrP抗體只要具有惡病質之治療效果者即可，而不管其之由來、種類（單株、多株）及形狀。經濟部中央標準局員工消費合作社印製本發明所用之抗PTHrP抗體爲用公知方法得到之多株抗體或單株抗體。本發明所用之抗PTHrP抗體以來自哺乳動物之單株抗體爲特佳。來自哺乳動物之單株抗體包含雜交瘤所產生者，以及藉基因工程方法用含有抗體基因之表現載體轉形之宿主所產生者。該抗體藉著與PTHrP結合，阻害PTHrP結合至PTH/PTHrP受器上，而遮斷PTHrP之訊號傳達及阻害PTHrP之生物活性。做爲此種抗體者，例如藉雜交瘤#23-57-137-1所產生之 -6 - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Λ4規格（210X 297公釐）經濟部中央標準局員工消費合作社印製 1227140 Α7 >^一____— B7_ 五、發明説明（4 ) #23-57- 137-1 抗體。再者，雜交瘤純系#23-57-137-1，稱爲鼠-鼠雜交瘤#23-57-13 7-1，於1997年9月24曰寄存於食品工業發展研究所 (新竹食品路33 1號），寄存編號爲CCRC960069。 2·產生抗體之雜交瘤產生抗體之雜父瘤’基本上使用公知技術，以下述方法製作。亦即’使用P T H r P做爲起敏抗原，將其按照一般的免疫方法免疫，將所得之免疫細胞藉一般的細胞融合法與公知的親細胞融合，然後藉一般的篩選方法篩選產生單株抗體之細胞而製造。具體而Τ ’可以按照下述方法製造單株抗體。首先，做爲取得抗體之起敏抗原之pTHrP，藉著Suva，L j 等人在Science( 1987) 237,893所揭示之PTHrP基因將胺基酸序列予以表現而得到。亦即將編碼PTHrP之基因序列插入公知之表現載體及使適當宿主轉形後，用公知之方法精製來自該宿主細胞或培養上清液中之目的PTHrp蛋白質。接下來，用該精製之PTHrP蛋白質做爲起敏抗原。另— 方面’關於N終端之3 4個胺基酸之胜肽，可以藉化學合成製造’以及可以將其做爲起敏抗原使用。用起敏抗原免疫之哺乳動物沒有特別限制，不過以選擇與細胞融合所用之親代細胞具相容性者爲較佳；一般而士 ’ σΓ以使用齧齒動物例如小鼠、家鼠或甶鼠，或者兔、猿猴等。用起敏抗原使動物免疫係依照公知之方法進行。例本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（2丨0Χ 297公釐 (請先閱讀%面之注僉事項再本頁) —裝訂 1227140 A7 B7 五、發明説明（5 ) —般方法爲將起敏抗原注射入哺乳動物之腹腔内或皮下而進行。具體而言，將起敏抗原用適當量之磷酸鹽緩衝食鹽水（PBS)及生理食鹽水等稀釋，如果期望，將該懸浮物與一般的佐劑，例如弗洛因德氏（Freund)完全佐劑適量混合，乳化後，每日投與至哺乳動物數次，共計4_2 1日。又，用起敏抗原進行免疫時，可以使用適當的載體。如此進行免疫及確認血清中所期望之抗體濃度上升後，從哺乳動物採取免疫細胞，及進行細胞融合；做爲免疫細胞者，以脾細胞爲特佳。與前述免疫細胞融合之其他親代細胞可用哺乳動物之骨髓瘤細胞。關於該骨聽瘤細胞，宜使用公知之種種細胞，例如 P3(P3x63Ag8.653)(J· Immunol.(1979)123 ， 1548- 1550)，P3x63Ag8U.l (微生物及免疫學之當今課題（1978) 81 ， 1-7)， NS-l(Kohler. G. and Milstein, C. Eur. J. 經濟部中央標準局員工消費合作社印製

Immunol. (1976)6 ^ 511-519) ^ MPC-11 (Margulies. D. H. et al·，Cell (1976)8，405-415)，SP 2/0 (Shulman，M. et al.， Nature (1978)276，269-270)，FO (de St. Groth，S· F. et al·， J. Immunol. Methods (1980)35，1-21)，S 194 (Trowbridge, I.S.J· Exp· Med· (1978)148，3 13-323)，R210(Galfre，G.et al·，Nature (1979)277，131-133) 〇前述免疫細胞與骨髓細胞之細胞融合，基本上依照公知之方法，例如米爾史丹等人之方法（Kohleh G· and Milstein， C.，Methods Enzymol· (198 1)73，3-46)進行。更具體而言，前述細胞融合，例如在細胞融合促進劑存 -8 - 本纸張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） 1227140 A7 B7 五、發明説明（6 在下’在一般的營養培養液中進行。融合促進劑例如可用聚乙一醇（PEG)、山達病毒（sendai virus ; HVJ)等，如果期望更進一步提高融合效率，可以添加二甲基亞砜等補助劑。免疫細胞與骨髓瘤細胞之使用比率可以任意設定。例如，免疫細胞較佳爲骨髓瘤細胞之卜i 〇倍。前述細胞融合所用之培養液，例如可使用適於骨髓瘤細胞增殖之PRMI 1640 培養液，MEM培養液以及其他該種細胞培養所用之一般培養液，以及可以併用牛胎兒血清（FCS)等之血清補助液。細胞融合藉下法進行：將前述免疫細胞與骨髓瘤細胞之預定量在前述細胞培養液中充分混合，添加預先加溫至約 3 7且濃度爲30-60°/。（w/v)之PEG溶液（例如平均分子量爲約1000-6000)中並加以混合，以形成目的融合細胞。接下來逐次添加適當的培養液，藉著反覆進行離心及除去上清液之操作，以除去對雜交瘤發育不利之細胞融合劑等。如此得到之雜交瘤藉著在一般之選擇培養基，例如HAT 培養液（含次黃嘌呤、胺基蝶呤及胸腺嘧咬之培養液）中培養而選擇。爲了讓目的雜交瘤以外之細胞（非融合細胞）死亡，在上述HAT培養液中之培養需持續一段頗長時間（通常爲數日至數週），隨後，實施一般的界限稀釋法及進行產生目的抗體之雜交瘤之篩選及單一選殖。又，除了用抗原將人類以外之動物免疫而得到上述雜交瘤外，在試管中使人類淋巴球對PTHrP起敏，將起敏淋巴球與來自人類具有永久分裂能力之骨髓瘤細胞融合，可以 -9 - 本纸張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（21 Οχ 297公釐） (請先閱讀¾面之：江意事項再本頁} —裝· ^一本經濟、郅中央標準局員工消費合作社印製 1227140 Α7 Β7 五、發明説明（7 經濟部中央標隼局員工消費合作社印製得到所期望之具有PTHrP結合活性之抗體（參照特公平1-5 98 78號公報）。再者，將做爲抗原之PTHrP投與至具有全部人類抗體基因庫之基因轉移動物而取得抗PTHrP抗體產生細胞，並將其不死化，從該不死化之細胞可以取得抗 PTHrP抗體（參照國際專利申請案公開公報W0 94/25585號公報、W0 93/12227 號公報、W0 92/03918 號公報、W0 94/02602 號公報）。產製如此製成之單株抗體之雜交瘤可以在一般之培養液中進行繼代培養，又，可以在液態氮中長期保存。在從雜交瘤取得單株抗體上，可以採用將該雜交瘤依照一般之方法培養及取得其培養上清液之方法，或者將該雜交瘤投與至與其相容之哺乳動物體内並使之增殖，然後取得其腹水之方法等。前者之方法，適合取得高純度之抗體，而後者之方法則適於大量生產抗體。 3.重組型抗體在本發明中，可以使用重組型抗體做爲單株抗體，該重組型抗體係藉著從雜交瘤選殖抗體基因，將該基因組合入適當載體中及將該重組載體導入宿主體内之基因重組技術而製造（例如參照 Vandamme，A.M. et al.，Eur· J. Biochem. (1990)192 ， 767-775 ， 1990)。具體而言，從產製抗PTHrP抗體之雜交瘤將編碼抗 PTHrP抗體之可變領域之mRNA予以單離。mRNA之單離可藉公知之方法，例如胍超離心法（Chirgwin，J. M· et al·, Biochemistry(1979)18，5294-5299)、AGPC 法（Chomczynski， -10 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Λ4規格（210Χ 297公釐）請先閱讀 It 1¾ 之 .注

I Η 書訂 1227140 A7 ____B7 五、發明説明（8 ) ^ 一· P· et al·’ Anal· Biochem. (1987)162，156-159)等進行而二周製全部之RNA，以及使用mRNA純化套組（法瑪西亞公司製）調製做爲目的物之mRNA 。又，也可以藉著使％ QuickPrep mRNA純化套組（法瑪西亞公司製）而直接調製 mRNA 〇抗體V領域之cDNA從所得之mRNA用反錄酶來合成。 cDNA之合成係使用AMV反錄第一股cDNA合成套組（生化學工業股份有限公司製）等進行。又，在進行cDNA之合成及增幅方面，可以使用採用5，-Ampli FINDER RACE套組（克龍技術公司製）及PCR之5，_RACE法等（Frohman，M.A. et al·，Proc. Natl· Acad· Sci. USA (1988)85，8998-9002， Belyavsky，A. et al.，Nucleic Acids Res. (1989)17，2919_ 2932) 〇從所得之PCR產物精製做爲目的物之DNA片段並與載體DNA連結。繼而從其製造重組載體，導入大腸桿菌等並選擇純系而調製所期望之重組載體。然後，藉著公知的方法’例如二去氧核菩酸鏈終端法，確認目的DN A之鹼基序列。經濟部中央標準局員工消費合作社印製得到編碼目的物抗PTHrP抗體之V領域之DNA後，將其組合入含有編碼所期望之抗體定常領域（C領域）之DNA之表現載體中。於製造本發明所用之抗PTHrP抗體時，、將抗體基因，以把在表現控制領域（例如啓動子、啓動子）之控制下表現之万式’組合入表現载體中。最後，藉著該表現載體將宿主本紙張尺度咖巾 11 - (210X 297公釐） 1227140 A7 B7 五、發明説明（9 ) 細胞轉形，而表現抗體。關於抗體基因之表現，可以將表現抗體重鏈（H鏈）或輕鏈（L鏈）之DNA組合入不同之表現載體中，然後同時轉形宿主細胞；也可以將表現抗體重鏈（H鏈）及輕鏈（L鏈）之 DNA組合入單一之表現載體中，然後轉形宿主細胞（參照 W0 94/1 1523 號公報）。又重組型抗體之產生，不僅可以使用上述宿主細胞，而且可以使用基因轉移動物。例如，將抗體基因插入編碼乳汁原本產生之蛋白質（山羊β酪蛋白）之基因中而調製成融合基因。將包含插有抗體基因之融合基因之DNA片段注入山羊之胚中，將該胚導入雌山羊體内。從收納該胚之山羊生出之基因轉移動物或其子孫所產製之乳汁中，可以得到所期望之抗體。又，爲了使基因轉移山羊產製之含有期望抗體之乳汁量增加，亦可以給予基因轉移山羊適當的激素 (Ebert, K. M. et al.? Bio/Technology (1994) 12，699-702) 〇 4.變異抗體經濟部中央標準局員工消費合作社印製在本發明中，除了上述抗體之外，可以使用以降低對人類之異種抗原性等爲目的之人爲改變之基因重組型抗體，例如嵌合抗體、人型化抗體。該等變異抗體可以用已知之方法製造。嵌合抗體，藉著將編碼如前述所得抗體V領域之DNA與編碼人類抗體C領域之DNA連結，然後將其组合入表現載體並導入宿主體内而製造。使用該已知之方法，可以得到在本發明中有用之嵌合抗體。 -12- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Λ4規格（210X 297公釐） 1227140 A7 B7 五、發明説明（10) 人型化抗體，亦被稱爲再構成人類抗體，其係將人類以外之哺乳動物（例如小鼠）抗體之互補性決定領域（CDR)移植入人類抗體之互補性決定領域，所用之一般基因重組方法亦爲已知（參照歐洲專利申請案公開公報EP 125023號， WO 96/02576 號公報）。具體而言，將小鼠抗體之CDR與人類抗體之譯碼領域連結而設計成之DNA序列，係使用能使CDR及FR兩者之終端領域以具有重疊部分之方式製成之數個寡核苷酸做爲引子，並利用PCR法合成。將所得DNA與編碼人類抗體C 領域之DN A連結，接下來組合入表現載體中，然後將其導入宿主並使之生產抗體，而得到人型化之抗體（參照EP 239400 號公報，WO 96/02576 號公報）。經由CDR連結之人類抗體之譯碼領域，係選擇互補性決定領域形成良好抗原結合部位者。需要時，也可以藉著置換抗體可變領域中譯碼領域之胺基酸，以使再構成人類抗體之互補性決定領域形成適當的抗原結合部位（Sato，K. et al.5 Cancer Res. (1993) 53，85 1-856) 〇經濟部中央標準局員工消費合作社印製在嵌合抗體及人型化抗體之C領域中，人類抗體之C領域被使用，例如Η鏈可以使用C r 1、C r 2、C r 3及C 厂4，L鏈可以使用C%及CA。又，爲了改善抗體或其產生之安定性，也可以修飾人類抗體C領域。後合抗體係由來自人類以外之哺乳動物抗體之可變領域與來自人類抗體之定常領域所組成。另一方面，人型化抗體係由來自人類以外之哺乳動物抗體之互補性決定領域與 -13- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） 1227140 A7 B7 五、發明説明（11 ) 來自人類抗體之譯碼領域及C領域所組成。人型化抗體由於在人體中之抗原性低，所以可做爲本發明治療劑之有效成分。可用於本發明之人型化抗體例如有人型化#23-57-137_1 抗體。人型化#23-57-137-1抗體，係將來自小鼠之#23-5 7-1 3 7_1抗體之互補性決定領域，在L鏈方面與來自人類抗體 HSU03868(GEN-BANK， Deftos Μ 等人， Scand. J. Immunol.，39，95-103，1 994)之 3 個 FR 片段（FR1，FR2 及FR3)及來自人類抗體S25755(NBRF-PDB)之FR片段 (FR4)連結，在Η鏈方面與人類抗體之S3 1679(NBRF-PDB ，Cuisinier AM 等人，Eur. J. Immunol.，23，110-118， 1993)之譯碼領域連結，並以具有抗原結合活性之方式將譯碼領域之胺基酸殘基之一部分置換。又，具有包含編碼人型化#23-57-137-1抗體之L鏈或Η 鏈之DNA之質體之大腸桿菌，於1997年9月24日寄存於食品工業發展研究所（台灣新竹市食品路33 1號），具有包含編碼Η鏈之DNA之質體之大腸桿菌爲大腸捍菌 JM109(hMBClHcDNA/pUC19)，寄存編號爲 CCRC940178 ;具有包含編碼L鏈之DNA之質體之大腸桿菌爲大腸桿菌 JM109(hMBClLq λ /pUC19)，寄存編號爲 CCRC940178。 5.抗體修飾物本發明所用之抗體，可爲能與PTHrP結合並阻害PTHrP 活性之抗體片段或其修飾物。舉例言之，做爲抗體之片段者，例如有Fab、F(ab’）2、Fv、或者Η鍵或L鍵之Fv用 -14- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（2l〇X 297公釐） (請先閱讀脊面之；¾意事項本頁) 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 1227140 經濟部中央標準局員工消费合作社印製 A7 B7 五、發明説明（12) 適當連結子連結而成之單鏈Fv(scFv)。具體而言，用酶（例如木瓜酶或胃蛋白酶）處理抗體以生成抗體片段，或是構築編碼此等抗體片段之基因，將其導入表現載體後，在適當之宿主細胞中使之表現。（例如參照Co，M. S. et al·，J· Immunol. (1994) 152，2968-2976，Better，Μ. & Horwitz， A. H. Methods in Enzymology (1989)178 ， 476-496 ，

Academic Press，Inc·，Plueckthun，A· & Skerra, A· Methods in Enzymology (1989)178，476-496，Academic Press，Inc.， Lamoyi，E·，Methods in Enzymology (1989) 12 1，652- 663 ’ Rousseaux，J. et al.，Methods in Enzymology (1989) 12 1 ，663_669，Bird，R· E. et al·，TIBTECH (1991)9，132-137)。 scFv係藉抗體之H鏈V領域與L鏈V領域連結而得。在該scFv中，Η鏈V領域與L鏈V領域經由連結子，較佳爲胜肽連結子而連結（Huston，J.S. et al.，Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A· (1988)85，5879-5883)。在 scFv 中之 H 鏈 V領域與 L鏈V領域也可以來自本説明書所記載之做爲抗體者之任一個0 編碼scFv之DNA藉下法得到：在編碼前述抗體之η鏈或Η鏈V領域之DNA以及編碼L鏈或L鏈V領域之DNA 之中’用此等序列之全部或編碼所期望胺基酸序列之Dna 部分做爲模板，用規定其兩端之引子對並藉PCR法增幅，接下來，以將編碼胜肽連結子部分之DNA與其兩端各個H 鏈、L鍵連結之方式組合規定的引子對並增幅，而得到編 15-

1 \ 广 7 +' Μ. 公 1227140 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A7 B7 五、發明説明（13 ) 碼 scFv 之 DNA。再者，編碼scFv之DNA —旦被製成，可以依照常法得到含有該DNA之表現載體及藉該表現載體轉形而得到之宿主，又，藉著使用該宿主，依照常法可以得到sCFv。此等抗體片段’可以藉著與前述同樣之方式取得其之基因並使之表現而由宿主產生。關於抗體之修飾物，可以使用與聚乙二醇（PEG)等各種分子結合之抗PTHrP抗體。此等抗體修飾物亦被包含在本發明之「抗體」中。此等抗體修飾物可以藉著對所得到之抗體施行化學修飾而得到。又，抗體之修飾方法在其分類上已被確JL。 6 ·重組型抗體或變異抗體之表現及產生如前述構築之抗體基因可以藉著公知之方法使之表現而得到。在哺乳類細胞之場合，可以將常被使用之有用啓動子’欲被表現之抗體基因，其3，端下游之聚A訊號予以功能性地結合並使之表現。舉例言之，做爲啓動子/促進子者例如可爲人類巨細胞病毒前期啓動子/促進子。又’在本發明中能被用於抗體表現之啓動子/促進子，例如爲逆病毒、多瘤病毒、腺病毒、猿猴病毒4〇(SV4〇)等病毒啓動子/促進子，或者來自人類延長因子la(HEF 1〇〇等哺乳動物細胞之啓動子/促進子。使用SV40啓動子/促進子之場合藉由^^丨丨化犯等人之方法（Nature (1979) 277，108)，使用 HEF la 啓動子 /促進子之場合藉由 Mizushima 等之方法（Nuceic Acids Res· (1990) ____ · 16· 本纸張尺度適用巾關緖準（CNS ) Μ規格（训^了公楚） (請先閱讀t.面之注#事項本頁) —裝本

、1T 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 1227140 A7 _______ B7 五、發明説明（14 ) 18，5322)，可以容易地進行基因表現。在大知4干囷之％合’可以將常被使用之有用啓動子，供才几肢为/必用之訊號序列及欲表現之抗體基因予以功能性地結合並使該基因表現。做爲啓動子者，例如有lacz啓動子及araB啓動子。使用lacz啓動子之場合，可藉瓦德（Ward)

等人之方法（Nature (1098) 341 ， 544-546 ; FASEB J (I992) 6 ’ 2422_2427)進行表現，使用araB啓動子之場合可藉拜特（Better)等人之方法（Science (1988) 240， 1041· 1043)進行表現。關於供抗體分泌用之訊號序列，在產於大腸捍菌之核外漿之場合，可以使用pelB訊號序列（Lei, s p et al】 Bacteriol.(1987)169，4379)。將產於核外漿之抗體分離後，將抗體之構造適當地再摺疊（refold)使用。關於複製起源，可以使用來自SV40、多瘤病毒、腺病毒、牛乳頭瘤病毒（BPV)等者，再者，爲了在宿主細胞系中使基因複本數增幅’表現載體可以包含做爲選擇標記之胺基糖施轉移酶（ΑΡΗ)基因、胸腺核菩激酶（τκ)基因、大腸桿菌黃嗓呤·鳥嘌呤磷酸核糖基轉移酶（Ec〇gpt)基因及二氫葉酸還原酶等。爲了製造本發明所用之抗體’可以使用任意之表現系，例如眞核細胞或原核細胞。做爲眞核細胞者，例如有被確立之哺乳類細胞系、昆蟲細胞系、眞菌細胞及酵母細胞等動物細胞’做爲原核細胞者’例如有大腸桿菌細胞等細菌細胞。 -17- 一__________ 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS 見格（^T〇X 297公H —---

1227140 A7 —— ___^ _ B7 五、發明説明（15 ) ^~~ ' '— - 本發明所用之抗體較佳在哺乳類細胞，例如ch〇、c〇s :骨髓瘤、ΒΗΚ、V⑽、Hela細胞中被表現。接下來，將：轉形之宿主細胞在試管或活體内培養以產生目的抗體 ;主、..田胞依胆公知之方法進行。例如，可以使用〇μΕΜ 、mem、RPMI164〇&imdm做爲培養液，也可以併用牛胎免血清（FCS)等血清之補充液。 7·抗體之分離及精製如前文所述被表現及產生之抗體從細胞或宿主動物完全分離並精製。本發明所用之抗體之分離及精製，可以用親和管柱進行。舉例言之，使用蛋白質A管柱做爲管柱者，例如有Hyper D、P〇ROS、Sephar〇se F F (法瑪西亞公司製）等。此外，可以使用一般蛋白質所用之分離、精製方法而沒有任何限制。舉例言之，可以藉著適當選擇及組合上述親和管柱以外之層析管柱、濾器、限外過濾、鹽析、透析等’而分離、精製抗體（Antibodies A Laboratory Manual. Ed Harlow, David Lane, Cold Spring Harbor Laboratory ? 1988) 〇 8 ·抗體活性之確認經濟部中央標準局員工消費合作社印製本發明所用之抗體之抗原結合活性（Antibodies A Laboratory Manual. Ed Harlow, David Lane, Cold Spring HarborLaboratory，1988)，可藉使用公知之手段測定其對配位子與受器結合之阻害活性而得知。< 關於測定本發明所用抗PTHrP抗體之抗原結合活性之方法’可以使用ELISA(酶結合免疫吸附檢定法）、EIA(酶免 -18- 本紙張尺度適财_家標準（CNS ) M規格（別心了公鐘）經蒗部中央標準局員工消費合作社印製 1227140 A7 ________B7 五、發明説明（16 ) ~ " 疫測定法）、RIA(放射免疫測定法）或螢光抗體法。舉例言之，使用酶免疫測定法之場合，將包含抗PTHrP抗體之試料，例如抗PTHrP抗體產生細胞之培養上清液或精製抗體加到塗佈PTHrP之平皿中。添加用鹼性磷酸酶標記之二次抗姐，培育平孤及洗淨後，藉著加入騎酸對_硝基苯基酯等酶基質並測定吸光度而評價抗原結合活性。爲了確έ忍本發明所用抗體之活性，測定抗pTjjrp抗體之中和活性。 9.投與方法及製劑本發明之治療劑係以治療或改善惡病質爲目的而使用。惡病湍之種類則不論是否來自癌皆可。來自癌者例如爲下列文獻所記載者，：J.Urol.(美國）Marl995，153(3Ptl)p. 854-857，Langenbecks Arch. Chir.Suppl II VerhDtschGes

Chir(德國）l99〇p 261-265，Oncology(瑞典）l99〇，47(i)p 87-91，Int. J· panCreatol(美國）Aug-Nov 1990，7(1-3) p 141-150，J.Natl· Cancer Inst.(美國）Dec 19，1990，82 (24) p 1922-1926 等。又，非來自癌者，例如爲下列文獻所記載者：JPEN J.

Parenter. Enteral Nutr.(美國）Nov-Dec 1990，14 (6) p605-609 ’ Chest (美國）Nov 1990，98 (5) p 1091-1094，Bone Marrow Transplant，（英國）Jul. 1990，6 (1) p53-57 等。以本發明之抗P T H r P抗體做爲有效成分之治療劑可以經口或不經口投與，以不經口投與爲較佳，具體而言，例如經肺劑型（例如使用噴霧器等器具之經肺投與劑）、經鼻投 -19 ·* 本紙張尺度適則7關家轉（CNS ) M規格（2lGX 297公楚） - (請先閱讀—面之注奮事項^^寫本頁)

、1T 1227140 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A7 B7 五、發明説明（17 與劑型、經皮投與劑型（例如軟膏 ’ ’ ，用：ϋ守。關於注射劑型之例，例如可以經由點滴等靜脈内注射、肌肉内注射、腹腔内注射、皮下注射等投與至全身或局部。又，依據患者之年齡、症狀選擇適當的投與方法。有效的投與量，在0·001毫克〜1〇〇〇毫克/公斤/次之範圍内選擇。或者，對每人而言，可以選擇在〇 (^〜丨〇〇〇〇〇毫克之範圍内之投與量。不過，含有本發明之抗PTHrp抗體之治療劑之投與量不限於此。 " 又，關於投與時期，不論在惡病質產生之前或之後皆可技與’或者在體重減少被預測到時投與。以本發明之抗pTHrP抗體做爲有效成分之治療劑可以依照常法做成製劑（Remington，s Pharmaceutical latest edition，Mark Publishing Company，East〇n，美國），’ 亦可以同時含有醫藥上容許之载體及添加物。做爲此等載體及醫藥添加物之例者例如有水、醫藥上容許之有機溶劑、膠原、|乙晞醇、聚乙晞峨洛錢、幾= 浠聚合物、竣甲基纖維素鈉、聚丙缔酸鋼、海藻酸納、水溶性葡聚糖、I甲基澱㈣、果膠、甲基纖料、乙基纖維素、黃原膠、阿拉伯膠、酶蛋白、；東遭脂、聚乙二醇、二聚甘油、甘油、丙二醇、凡士林、石蠟、硬脂醇、硬脂酸、人類血清白蛋白（HSA)、甘露醇、山梨醇、乳糖、以及容許做爲醫藥添加物之界面活性劑等。、 ^ =添加物，雖然係依據本發明㈣劑之劑型從上述者l擇早獨或通當組合，但不用說並非限於此 ____ _20_ ( cnsTm^ (210x297^!—-

1227140 Λ7 B7 五、發明説明（18) ，做爲注射劑I場合，可以藉著將被精製之抗PTHrp抗體溶解於溶劑，例如生理食鹽水、缓衝液、葡萄糖溶液等並在其中添加吸附防止劑，例如吐溫80(Tween 80)、吐溫 20(Tween 20)、明膠、人類血清白蛋白等而得。另外，也可以採用供使用前溶解而再構成劑型之凍結乾燥劑型，供凍結乾燥之賦形劑，例如可以使用甘露醇、葡萄糖等糖醇及糖類。圖式之簡單説明圖1爲顯示抗PTHrP抗體對於惡病質之治療效果之圖。圖2爲顯示抗PTHrP抗體對於惡病質之治療效果之圖。圖3爲顯示抗PTHrP抗體對於惡病質之治療效果之圖。圖4爲顯示抗PTHrP抗體對於惡病質之治療效果之圖。圖5爲顯示抗體結合活性之測定結果之_。圖6爲顯示抗體結合活性之測定結果之_。圖7爲顯示抗體結合活性之測定結果之圖。圖8爲顯示抗體結合活性之測定結果之圖。圖9爲顯示抗體結合活性之測定結果之圖。圖10爲顯示抗體結合活性之測定結果之圖。經濟部中央標準局員工消費合作社印策圖11爲顯示抗體結合活性之測定結果之圖。圖12爲顯示抗體結合活性之測定結果之w。圖13爲顯示人型化抗體之中和活性之圖。圖14爲顯示人型化抗體之中和活性之圖。圖15爲顯示人型化抗體之中和活性之圖。圖16爲顯示人型化抗體對於惡病質之治療效果之圖。 -21 - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） 1227140 A7 ----- - B7 - — 1 — _ - - 五、發明説明（19 ) 圖17爲顯示人型化抗體對於惡病質之治療效果之圖。圖18爲顯示人型化抗體對於惡病質之治療效果之圖。圖19爲顯示人型化抗體對於惡病質之治療效果之圖。實施本發明之最佳形態以下，參照參考例及實例具體地説明本發明。但是，本發明之技術範圍非限於此等實例等。 [實例1 ]在惡病質模型動物中之藥效試驗使用人類腫瘤-裸鼠移植系之惡病質模型動物來檢討對抗PTHrP之鼠單株抗體對於惡病質之治療效果。使用移植有人類口腔底癌0CC_1(購自財團法人實驗動物中央研究所）之裸鼠做爲模型動物。移植有人類口腔底癌 OCC-1之裸鼠隨著腫瘤之增加，血舞濃度上升且出現體重減少及運動量低下等惡病質症狀。鼠單株抗體改善人類口腔底癌OCC-1所引起之惡病質症狀之能力，係以血鈣濃度、體重及延命效果做爲指標而評價。經濟部中央標準局員工消費合作社印製人類口腔底癌OCC-1之繼代，係用BALB/C_nu/nu裸鼠（曰本克雷亞公司）在活體中進行。在藥效評價方面，購入6 週齡BALB/c-nu/nu裸鼠（曰本克雷亞公司），經1星期之馴化後，使用7週齡之動物。惡病質模型動物之製作及分群按照下述方法進行。亦即，取出繼代之人類口腔底癌OCC-1，將切碎成3 mm角塊之腫瘤塊移植至裸鼠之腋下之皮下，每隻移植一個。移植腫瘤塊後，於第1 0日確認腫瘤體積變得十分大後，以血鈣濃度、體重及腫瘤體積做爲指標並以各指標平均化之方式 ____ -22- 本紙張尺韻财關家鮮（CNS ) Μ規格（21〇Χ 297ϋ ' ' " '^ 1227140 A7 ~ ______B7 ^ ^ (20) —' 分群，以做爲惡病質模型動物。對惡病負之治療效果之檢討如下述進〆一 (1) 生存期間之觀察在延命效果之檢討上，每週投與藏單株抗體二次並進行生存期間之觀察。又，將被處方做爲高鈣血症治療藥之帕米得羅内特[pamidr〇nate(Aredia)]，以15毫克/公斤之劑量 ’單次投與至尾靜脈内。做爲對照群者，係將磷酸緩衝食鹽水（PBS)以0.2毫升/鼠之量投與至尾靜脈内，每週二次。將其結果示於圖1中。 (2) 血鈣濃度之觀察對於如上述製作、分群之惡病質模型動物，將1〇叫或 100 pg之對抗PTHrP之鼠單株抗體投與至每隻小鼠之尾靜脈内，每隔2日投與2次。又，將被處方做爲高鈣血症治療藥之帕米得羅内特（Aredia)，以15毫克/公斤之劑量，單次投與至尾靜脈内。做爲對照群者，係將磷酸緩衝食鹽水 (PBS)以0.2毫升/鼠之量投與至尾靜脈内，每隔2日投與2 (3 )血劈之測定 M濟部中央標準局員工消費合作社印製鼠單株抗體投與後，於第1日及第4日測定血鈣濃度，並進行各抗體之藥效評價。血鈣濃度，係用分血器管自眼窩採血，並使用643自動Ca/pH分析器（汽巴-康寧公司）測足全血#5離子濃度。體重係每日測定，直至抗體投與後之第4日。其結果被示於圖2及圖3。 (4)腫瘤重量之測定 ______ -23- 本纸張尺度顧巾0¾縣 1227140 A7 B7 五、發明説明（21 腫瘤體積，於抗體投與後第4日測定腫瘤之長 = 並藉加南之計算式ab2/2計算出腫；體積。八、'，口果被示於圖4。 :^上〈結果可知，雖然在血_濃度方面，於抗體濃度馬…時，與帕米得羅内特投與群沒有差異，但是比帕米知内特投與群及對照群更會抑制惡性腫瘤所伴隨之^ 重減少。投與之抗體濃度爲1〇〇叫之群，比帕米得羅内^ 投與群及對照群更會抑制血_濃度之上升，也比帕米得羅内特投與群及對照群更會抑制體重減少。又每週投與=次杬PTHrP中和抗體1〇〇㈣之群已被確認比帕米得羅内特投與群及對照群更能有意義地延長生存期間（ρ = 〇〇〇们' Log Rank試驗）。從此可知，抗pTHrp中和鼠單株抗體具 1抑制體重減少、延長生存期間等已知高鈣血症治療藥所沒有 < 效果。因而顯示本抗體在做爲惡性腫瘤所伴隨之惡病質之治療藥上具有用性。 “ 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 [實施例2]在高鈣血症、惡病質模型動物中之藥效試驗使用人類腫瘤-裸鼠移植系之惡病質模型動物來檢討對抗PTHrP之人型化抗體變型q對於惡病質之治療效果: 使用移植有人類口腔底癌〇cc_1(購自財團法人實驗動物中央研冤所）之裸鼠做爲模型動物。移植有人類口腔底癌 0CC-1之裸鼠隨著腫瘤之增加，血鈣濃度上升且出現體重減少及運動量低下等惡病質症狀。人型化抗體變型q改善人類口腔底癌0CC-1所引起之惡病質症狀之能力，係以血雀弓k度、體重及延命效果做爲指標而評價。 ______ _ 本纸張尺度適财關家辟（CNS )八4規格（21Gx29：^_jy 1227140 A7 B7 五、發明説明（22 ) 人類口腔底癌〇CC -1之繼代，係用BALB/c-nu/nu裸鼠（曰本克雷亞公司）在活體中進行。在藥效評價方面，購入6 週齡B ALB/c-nu/nu裸鼠（日本克雷亞公司），經1星期之馴化後，使用7週齡之動物。惡病質模型動物之製作及分群按照下述方法進行。亦即，取出繼代之人類口腔底癌0CC-1，將切碎成3 mm角塊之腫瘤塊移植至裸鼠之腋下之皮下，每隻移植一個。移植腫瘤塊後，於第1 〇日確認腫瘤體積變得十分大後，以血鈣濃度、體重及腫瘤體積做爲指標並以各指標平均化之方式分群，以做爲惡病質模型動物。對惡病質之治療效果之檢討如下述進行。 (1) 生存期間之觀察在延命效果之檢討上，將人型化抗體變型q每週二次投與至尾靜脈内並進行生存期間之觀察。做爲對照群者，係將磷酸緩衝食鹽水（PBS)以0.1毫升/鼠之量投與至尾靜脈内，每週二次。將其結果示於圖16中。 (2) 血鈣濃度之觀察對於如上述製作、分群之惡病質模型動物，將1〇 Mg或 1 00 tug之人型化抗體變型q投與至每隻小鼠之尾靜脈内，每隔2日投與2次。做爲對照群者，係將磷酸緩衝食鹽水 (PBS)以0.1毫升/鼠之量以同樣方式投與。 (3) 血鈣之測定 < 投與人型化抗體變型q後，於第1日及第4日測定血鈣濃度，並進行抗體之藥效評價。血鈣濃度，係用分血器管 25 本纸張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐）請先閲讀背， ιέ 之 i 事項

會經濟部中央標準局員工消費合作社印製 1227140 Α7 Β7 五、發明説明（23 ) ^~— 自眼窩採血，並使用643自動Ca/pH分析器（汽巴_康寧公司）測疋全血鈣離子濃度。體重係每日測定，直至抗體投與後之第4曰爲止。其結果被示於圖17及圖18。 (4)腫瘤重量之測定腫瘤體積，於初次投與及第4日時測定腫瘤之長徑（a mm) 及短徑（b mm)，並藉加南之計算式ab2/2計算出腫瘤體積。其結果被不於圖19 〇 k以上之結果可知，投與10 或l00 gg之人型化抗體變型q者，比對照群更會抑制惡性腫瘤所伴隨之血鈣濃度上升及體重減少。又每週投與2次人型化抗體變型q 1〇〇叫之場合，已被確認比對照群更能有意義地延長生存期間（p = 0·0108，LogRank試驗）。該人型化抗體變型q對於惡性腫瘤伴隨之惡病質模型動物之效果，與前面所報告之鼠單株抗體之效果相同。從此可知，本抗體在做爲惡性腫瘤所伴隨之高鈣血症及惡病質之治療藥上具有用性。 [參考例1] 生產抗PTHrP( 1-34)鼠單株抗體之雜交瘤之製作生產抗PTHrP(l_34)鼠單株抗體之雜交瘤#23-57-154及經濟部中央標準局員工消費合作社印製 #23-57-137- 1 由佐藤幹二等人製作（Sat〇, K et al，j Bone

Miner. Res. 8，849-860，1993) 〇供免疫原用者，係將PTHrP( 1-34)(潘寧斯拉公司製）與爲載體蛋白質之曱狀腺球蛋白用碳化二亞胺（都金公司製）結合。將與甲狀腺球蛋白結合之PTHrP( 1-3 4)透析，並將蛋白質濃度調製成2 pg/ml後，與夫羅因德氏佐劑（狄夫可公司 -26- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS ) A4規格丨〇'χΥ97公楚）一 1227140 A7 ____________B7 五、發明説明（24 ) 製）以1 : 1之比例混合，製成乳液後，將其注入16隻雌性 BALB/C小鼠之背邵皮下或腹腔内，每隻動物1〇〇叩，斗免疫11次。初次免疫使用夫羅因德氏完全佐劑，第二次以後之追加免疫使用夫羅因德氏不完全佐劑。經免疫之小鼠之血清中抗體價之測定，以下述方法進^ 。亦即從小鼠尾靜脈採血，分離血清後將用RIA緩衝液稀釋之抗血清與1251標記之PTHrP(l-34)混合並測定結合浩性。將未與載體蛋白質結合之PTHrP(1_34)注入抗體價上升之小鼠之腹腔内，每隻動物5 〇 pg，以進行最終免疫。最終免疫後第3日屠殺小鼠，取出脾臟後，將脾臟細胞與骨髓瘤細胞株P3x63Ag8U,l用50%聚乙二醇4000依照常法予以細胞融合。將細胞融合所得之細胞以2 X 1 〇4/孔之細胞數接種在96孔平m之85孔中。雜交瘤之選別用Hat 培養基進行。經濟部中央標準局員工消費合作社印製雜交瘤之篩選，係將確認在Η AT培養基中會發育之孔中之培養上清液，用固相化RIA法測定有無PTHrP認識抗體而選別。從與抗體之結合能力已被確認之孔中回收雜交瘤 ’將其懸浮於添加有OPI-補充物（西格瑪公司製）之含有 15%FCS之PRMI-164·0培養基中，用限界稀釋法實施雜交瘤之單一化。得到與PTHrP(l-34)結合力強之雜交瘤#23-57-154 及#23-57-137-1 〇又’邊·又瘤純系#23-57-1 37-1 ，即鼠'鼠雜交瘤 137-1，於1997年9月24日，根據布達佩斯條約國際寄存於食品工業發展研究所（台灣新竹市食品路331號），寄存 -27- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 1227140 A7 _________B7 五、發明説明（25 ) 编號爲 CCRC960069。 [參考例2]編碼抗人類PTHrP( 1-34)鼠單株抗體之V領域之D N A之選殖編碼抗人類PTHrP(l-34)鼠單株抗體#23^74374之可變領域之DNA按照下述方法進行選殖。 (1) mRNA之調製

來自雜父瘤 #23-57-137-1 之 mRNA 用 Quick Prep mRNA 純化套組（法瑪西亞生物科技公司製）來調製。將雜交瘤 #23-5 7-13 7-1之細胞用萃取緩衝液予以完全均質化，然後依照套組所附之處方，在寡〇丁）_纖維素纺成管柱中精製 mRN A ’繼而進行乙醇沉澱。將A沉澱物溶解於溶析缓衝液中。 (2) 編碼鼠Η鏈V領域之基因之cDNA之製作及增幅 (ι)#23_5 7_13 7-1抗體Η鏈V領域cdNA之選殖經濟部中央標準局員工消費合作社印製編碼抗人類PTHrP( 1-34)鼠單株抗體之η鏈V領域之基因之選殖藉 5’-RACE 法（Frohman，M. A. et al” Proc. Natl. Acad. Sci. USA，85，8998-9002，1988 ; Belyavsky，A. et al·，Nucleic Acids Res. 17，2919-2932，1989)進行。5’-RACE法係用5’_Ampli FINDER RACE套組（選殖科技公司製），依照套組所附之處方進行操作。cDNA所用之引子係採用與鼠Η鏈定常領域（C領域）雜交之MHC2引子（序列編號1)。藉著用如前述調製之mRNA2 pg做爲模板，添加1〇 pmoleMHC2引子，以及於52 °C與反錄酶反應30分鐘而反錄成c D Ν A。 _ -28- 本紙張尺度適用中國if家標準（CNS ) Λ4規格（210X 297公楚） " ' 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 1227140 A7 ___ B7 五、發明説明（26 ) 用6N NaOH將RNA加水分解（65 C ’ 30分鐘）後，藉著乙醇沉澱而精製cDNA。藉著使用T4RNA粘接酶，於37 °C反應6小時，於室溫反應16小時，而將Ampli FINDER Anchor(序列編號42)連結至合成之cDNA之y端。爲了用其作爲模板及藉PCR增幅，使用Anchor引子（序列編號2) 及 MHC-G1 引子（序歹ij 編號 3)(S.T. J0nes，et al.， Biotechnology，9，88，1991)做爲引子。 PCR 溶液於其 50μ1 中含有 10mMTds-HCl(pH8.3)，50 mMKCl，0.25 mM dNTPs (dATP，dGTP，dCTP，dTTP) ，1.5 mM MgCl2，2.5 單位之 TaKaRa Taq(寶酒公司製）， 10 pmole之Anchor引子，以及連結有MHC_G1引子及Ampli FINDER Anchor之cDNA之反應混合物1 μΐ 〇將50 μΐ礦油加至該溶液作爲上層。PCR，係用熱循環器1480J型（帕金艾摩公司）進行9 4 °C 4 5秒，6 0 °C 4 5秒及7 2 °C 2分鐘之溫度循環30次而達成。 (ii) #23-57-13 7-1抗體L鏈V領域之cDNA之選殖編碼抗人類PTHrP( 1-34)鼠單株抗體之L鏈V領域之基因之選殖藉 5’-RACE 法（Frohman，M. A. et al.，Proc. Natl. Acad. Sci. USA，85 ’ 8998-9002，1988 ; Belyavsky，A· et al., Nucleic Acids Res· 17，2919-2932，1989)進行。5，-RACE法係用5’-Ampli FINDER RACE套組（選殖科技公司製），依照套組所附之處方進行操作。CDNA所用之引子係採用寡-dT，引子。藉著用如前述調製之mRNA 2 pg做爲模板，添加寡-dT引子，以及於52 °C與反錄酶反應30分鐘而 __ -29- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210x^97公釐)~ -- (請先閱讀^面之注*:事項\^^寫本頁) 裝· 訂 1227140 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A7 B7五、發明説明（27 ) 反錄成cDNA。用6 N NaOH將RNA力π水分解（65 Γ，30 分鐘）後，藉著乙醇沉澱而精製cDNA。藉著使用T4RNA 粘接酶，於3 7 °C反應6小時，於室溫反應16小時，而將 Ampli FINDER Anchor連結至合成之cDNA之5’端。從鼠L鏈λ鏈定常領域之保存序列設計PCR引子MLC( 序列編號4)，並用394 DNA/RNA合成酶（ABI公司）合成。 PCR 溶液於其 100 μΐ 中含有 10 mM Tris-HCl (pH 8.3)，50 mMKCl，0.25mMdNTPs(dATP，dGTP，dCTP，dTTP) ，1.5 mM MgCl2，2.5單位之AmpliTaq (帕金艾摩公司製），5 0 pmole之Anchor引子（序歹丨J編號2)，以及連結有MLC( 序列編號4)及Ampli FINDER Anchor之cDNA之反應混合物1 μΐ。將50 μΐ礦油加至該溶液作爲上層。PCR，係用熱循環器1480J型（帕金艾摩公司）進行94 °C 45秒，60 °C 45秒及72 °C 2分鐘之溫度循環3 5次而達成。 (3)PCR生成物之精製及片段化將如前述藉PCR法增幅之DNA片段藉使用3% Nu Sieve GTG瓊脂糖（FMC Bio· Products)之瓊脂糖凝膠電泳而分離。切取含有做爲Η鏈V領域之約550 bp長之DNA片段及做爲L鏈V領域之約550 bp長之DNA片段之瓊脂糖片，用 GENECLEAN II套組（BIO101)，依照套組所附之處方精製 DNA片段。將已精製之DNA用乙醇沉澱後，將其溶解於含 10 mM Tris-HCl(pH 7.4)及 1 mM EDTA 之溶液 20 μΐ 中。將所得DNA溶液1 μΐ用限制酶Xmal(新英格蘭生物實驗室）於37 °C消化1小時，接下來用限制酶EcoRI(寶酒公司製造 -30- 本纸張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） 1227140

五、發明説明（28 ) ))於3 7 C消化1小時。將該消彳p、、e7人仏耵必坰化，比合物用酚及氯仿萃取，然後藉乙醇沉澱而回收DNA。 (請先閱讀t面之參事項再痛馬本買如此，得到在5，_端有EcoRI鑑識序列及在3，端有鑑識序列之含有編碼鼠Η鏈V領域及1鏈v領域之基因之 DNA片段。訂經濟部中央標準局員工消費合作社印製將如上述調製I含有編碼鼠Η鏈ν領域及L鏈V領域之基因之EcoRI-Xmal DNA片段與藉用Ec〇RI及XmaI消化而凋製成之pUC 19載體，用dnA枯接套組（寶酒公司製），依照隨附之處方’於16 C反應1小時而連結。接下來，將J 〇 μΐ之上述連結混合物加到大腸菌JM 1 〇9勝任細胞（日本基因公司）100 μΐ中，將該細胞靜置於冰上15分鐘，靜置於 42 C 1分鐘’再靜置於冰上1分鐘。繼而，加入3〇〇 μ1之 soc培養基（分子選殖：實驗室手册，Sanibrook等人，冷泉港實驗出版公司，1989)並於37 °C培育30分鐘後，將該大腸桿菌接種於含有100 )ag/ml或50 pg/ml安比西林 (Ampicillin)、0.1 mM 之 IPTG 及 20 pg/ml 之 X-gal 之 LB 瓊脂培養基或2xYT瓊脂培養基（分子選殖：實驗室手册， Sambrook等人，冷泉港實驗出版公司，ι989)上，於37°c 培育一夜而得到大腸桿菌轉形體。將該轉形體在含有1〇〇 pg/ml或5 〇 pg/ml安比西林之LB 瓊脂培養基或2xYT瓊脂培養基2 ml中，於37 °C培養一夜 ’用質體萃取機ΡΙ-100 Σ (克拉寶公司製）或QIAprep Spin Plasmid Kit (QIAGEN)從菌體調製質體DNA，並進行鹼基序列之決定。 -31 - . 本纸張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公藶) 1227140 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 Α7 Β7 五、發明説明（29) (4) 編碼鼠抗體v領域之基因之鹼基序列之決定上述質體中之cDNA編碼領域之鹼基序列用染料終端循環定序套組（帕金-艾摩公司製），藉DNA定序器373A(ABI 社，帕金-艾摩公司）來決定。使用MI3引子M4(寶酒公司製）（序列編號5)及Μ 13引子RV(寶酒公司製）（序列編號6) 做爲序列決定用引子，並藉確認兩方向之鹼基序列而決定序列。將如此所得之含有編碼來自雜交瘤#23-57-137-1之鼠Η 鏈V領域之基因之質體命名爲MBC1H04，將含有編碼L 鏈V領域之基因之質體命名爲MBC1L24。將質體MBC1H04 及MBC1L24所含之編碼鼠#23_57-137·1抗體之H鏈V領域及L鏈V領域之基因之鹼基序列（包含對應之胺基酸序列）各以序列編號5 7及6 5表示。Η鏈V領域及L鏈V領域片段之胜肽皆是從序列編號57及65所表示之鹼基序列之第 5 8個驗基（編碼殼胺酿胺者）開始。此等胺基酸序列中，η 鍵V領域之片段以序列編號46表示，L鍵V領域之片段以序列編號45表示。又，具有前述質體MBC1H04及MBC1L24之大腸桿菌，於1997年9月24曰被寄存於食品工業發展研究所（台灣新竹市食品路33 1號），做爲大腸桿菌；?^1〇9(]\〇(：1^104)及大腸桿菌 JM109(MBC1L24)，大腸桿菌 jmi〇9(MBC1H04)之寄存編號爲CCRC940180，大腸桿菌jm<1〇9(mbC1L24)之寄存編號爲CCRC940179。 (5) 抗人類PTHrP之鼠單株抗體#23-57_137-1之cdr之決 -32- ^紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Λ4規格（-- (請先閱讀背面之注*意事項^^寫本頁) 裝. 訂 1227140 B7 五、發明説明（3〇 ) 定 Η鏈V領域及L鏈V領域之全部構造彼此具有類似性，其各4個之譯碼區部分藉由3個超可變領域，即互補性決定領域（CDR)而被連結。譯碼區之胺基酸序列雖然較常被保存，但CDR領域之胺基酸序列之變異性極高（Kabat，Ε. Α. et al·，「具免疫特性之蛋白質之序列」，US Dept. Health and Human Services ， 1983)。由於該事實，將抗人類pTHrP 之鼠單株抗體之可變領域之胺基酸序列，套用Kabat等人做成之抗體之胺基酸序列之資料庫而調查相同性，藉此決定如表1所示之CDR領域。又，L鏈V領域之CDR1〜3之胺基酸序列各以序列編號 59〜61表示，Η鏈V領域之CDR1〜3之胺基酸序列各以序列編號62〜64表示。表1 V領域序列編號 CDR1 CDR2 CDR3 Η鏈V領域 57 31-35 50-66 99-107 L鏈V領域 65 23-34 50-60 93-105 [參考例3]嵌合抗體之構築 (請先閱讀^面之注意事項\^^寫本頁) .裝· "口線經濟部中央標準局員工消費合作社印策 (1)嵌合抗體Η鏈之構築 (i)H鏈V領域之構築 < 爲了連結至含有人類Η鏈C領域Cr 1之染色體組DNA 之表現載體上，將選殖之小鼠H鏈V領域藉PCR法修飾。後方引子MBC1-S1 (序列編號7)被設計成與编碼V領域之 -33- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（21 OX 297公釐） 1227140 A7 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 B7 五、發明説明（31 ) 前導序列之5-側之DNA雜交，而且具有Kozak相合序列 (Kozak，M. et ai.，j. Mol· Biol.，196，947-950，1987)以及限制酶Hind III之鑑識序列。前方引子MBCl-a(序列編號8)被設計成與編碼j領域之3’_側之DNa雜交，而且具有绞接供給者序列以及限制酶BamHI之鑑識序列。PCR係按照下述方法進行：採用TaKaRa Ex Tag(寶酒公司製），於50 μΐ反應混合液含有做爲模板DNA之0.07 gg質體MBC1H04 、做爲引子之MBCl-a及MBCn-Sl各50 pmole、2.5單位 TaKaRa Ex Tag及0.25 mM dNTP之條件下，使用隨附之緩衝液，並且將50 μΐ礦油加至該溶液作爲上層，然後進行 94 °C 45秒，55 °C 1分鐘及72 °C 2分鐘之溫度循環30次。將如前述藉PCR法增幅之DNA片段藉使用3% Nu Sieve GTG瓊脂糖（FMC Bio· Products)之瓊脂糖凝膠電泳而分離。切取含有437 bp長之DNA片段之瓊脂糖片，用。£湘(：1^八们1套組（61〇101)，依照套組所附之處方精製 DNA片段。將已精製之DNA用乙醇沉澱回收後，將其溶解於含 10 mM Tris-HCl (pH 7.4)及 1 mM EDTA 溶液 20 μΐ 中。將所得DNA溶液1 μΐ用限制酶BamHI、Hind III(寶酒公司製）於37 °C消化1小時。將該消化混合物用酚及氯仿萃取，然後藉乙醇沉澱而回收DNA。將如上述調製之含有編碼鼠Η鏈V領域及L鏈V領域之基因之Hind ΠΙ-BamHI DNA片段次選殖、入用Hind III及 BamHI消化而調製成之PUC 19載體中。爲了確認該質體之鹼基序列，用M13引子M4以及M13引子RV做爲引子， (請先閱讀-^面之注/思事項^^寫本頁} --装寫本、=口線 -34- 1227140 A7 ______B7_ 五、發明説明（32 ) ~~~" 採用染料終端循環定序套組（帕金-艾摩公司製），藉DNA 定序器373 A(帕金-艾摩公司）決定驗基序列。將含有具正確鹼基序列之編碼來自之雜交瘤#23-57-137-1之鼠Η鏈V領域之基因，且在5’-側具Hind III鑑識序列及Kozak序列及在3，-侧具BamHI鑑識序列之質體命名爲MBClH/pUCl9。 (ii)供cDNA型之鼠-人嵌合Η鏈之製作用之Η鏈V領域之構築爲了與人類Η鏈C領域Cr 1之cDNA連結，將如上述構築之小鼠Η鏈V領域藉PCR法修飾。供Η鏈V領域用之後方引子MBC1HVS2(序列編號9)被設計成編碼V領域之前導序列之最初部分之序列之第2號天冬醯胺已變換成甘胺酸，而且具有1^〇2&1<:相合序列（1^〇2&1:，]^1,6{&1.，1.^1〇1.

Biol·，196，947-950，1987)以及限制酶 Hind III 及 EcoRI 之鑑識序列。供Η鏈V領域用之前方引子MBC1HVR2(序列編號10)被設計成與編碼J領域之3’-侧之DNA雜交，而且編碼C領域之5’-側之序列及具有Apal及Smal鑑識序列。經濟部中央標準局員工消費合作社印製 (請先閱讀^面之注*意事項\^寫本頁) PCR係按照下述方法進行··採用TaKaRa Ex Tag(寶酒公司製），於50 μΐ反應混合液中，於含有做爲模板〇ΝA之0.6 pg質體MBClH/pUCl9 、做爲引子之MBC1HVS2及 MBC1HVR2 各 50 pmole、2.5 單位 TaKaRa Ex Tag 及 0.25 mM dNTP之條件下使用隨附之緩衝液，並且將50 μΐ礦油加至該溶液作爲上層，然後進行94 °C 1分(鐘，55 °C 1分鐘及72 °C 1分鐘之溫度循環30次。將如前述藉PCR法增幅之DNA片段，藉著使用1% Sea Kem GTG瓊脂糖（FMC Bio· _____-35- 本纸張尺度適用中國國家標準（CNS ) Λ4規^297公t丨~"" 一 1227140 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A7 〜——---— — B 7 五、發明説明（33 ) ' _

Products)之瓊知糖凝膠電泳而分離。切取含有0長之 DNA片段之瓊脂糖片，用GENECLEANII套組（BIO101)，依照套組所附之處方精製DNA片段。將已精製之DNA用乙醇/几澱後，將其溶解於含1〇 Tris_HCi (pH 7.4)及1 mM EDTA之溶液20 μ1中。將所得DNA溶液1 μΐ用限制酶EcoRI及Smal(寶酒公司製）於3 7 C消化1小時。將該消化混合物用撤及氯仿萃取 ’然後藉乙醇沉澱而回收DNA。將如上述調製之含有編碼鼠Η鏈V領域之基因之EC0Ri-SmaI DNA片段次選殖入用 EcoRI及Smal消化而調製成之pUC19載體中。爲了確認該質體之驗基序列，用Μ13引子M4以及Μ13引子RV做爲引子’採用染料終端循環定序套組（帕金-艾摩公司製），藉 DNA定序器373Α(帕金-艾摩公司）決定鹼基序列。將含有具正確鹼基序列之編碼來自雜交瘤#23-57· 137-1之鼠Η鏈 V領域之基因，且在側具Hind III鑑識序列及Kozak序列及在3、侧具Apal及Smal鑑識序列之質體命名爲 MBClHv/pUC19。 (iii)嵌合抗體Η鏈之表現載體之構築含有人類抗體Η鏈C領域C r 1之cDNA如下述調製。亦即藉著導入有編碼人型化PM 1抗體Η鏈V領域及人類抗體 Η 鏈 C 領域 IgGl 之染色體組 DNA(N. Takajashi，et al.， Cell 29，671-679，1982)之表現載體 DHFR-Λ E-RVh-PM-l-f(參照w〇 92/19759)、以及編碼人型化PM1抗體L 鏈V領域及人類抗體l鏈χ鏈C領域染色體組DN A之表現 -36- 本紙張尺i適用中國準（CNS ) Λ4規格（210X 297公釐） "' (請先閲讀背面之注>拳項\^^馬本頁) 裝· 1227140 A7 B7 五、發明説明（34 請先閱讀背. 冬 i 事項本頁載體RVl-PMla(參照W0 92/19759)之CHO細胞而調製 mRNA，藉RT-PCR法選殖含有人型化PM1抗體Η鏈V領域及人類抗體C領域C r 1之cDNA，以及次選殖入pUC19 之Hindlll及BamHI部位。確認鹼基序列後，保有正確序列之質體被命名爲pRVh-PMlf-cDNA。製作在DHFR-ZX E-RVh-PM-1-f上欠缺位於SV40啓動子與DHFR基因間之Hind III部位，以及位於EF-Ια啓動子與人型化ΡΜ1抗體Η鏈V領域間之EcoRI部位之表現載體，以供構築包含人型化PM 1抗體Η鏈V領域及人類抗體C 領域C r 1之cDNA之表現載體。 PRVh-PMlf-cDNA 用 BamHI 消化後，用 Klenow 片段平滑化，然後用Hind III消化，而調製Hind III_BamHI平滑化片段。將該Hind III-BamHI平滑化片段，與上述欠缺Hind III 部位及 EcoRI 部位之 DHFR-△ E-RVh-PM-1-f 用 Hind III 及Smal消化所調製成之表現載體予以連結，以構築包含編碼人型化PM 1抗體Η鏈V領域及人類抗體C領域C r 1之 cDNA 之表現載體 PRVh-PMlf-cDNA。經滴部中央標準局員工消費合作社印製

將包含編碼人型化PM 1抗體Η鏈V領域及人類抗體C領域C r 1之cDNA之表現載體PRVh-PMlf-cDNA用Apal及 BamHI消化後，回收包含Η鏈C領域之DNA片段，然後將其導入用Apal及BamHI消化所調製成之MBCIHv/ pUC19 中。如此製作之質體被命名爲MBCIHcDNA/ pUC19。該質體包含編碼鼠抗體之Η鏈V領域及人類抗體C領域C r 1 之cDNA，以及具有在5’-端之EcoRI及Hind III鑑識序歹|J -37 本纸張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） 1227140 A7 B7 五、發明説明（35) 及在3 ^端之Bam HI鑑識序歹J。質體 MBC lHcDNA/pUC19 用 EcoRI 及 BamHI 消化，將得到之包含編碼嵌合抗體之Η鏈之鹼基序列之DNA片段導入用EcoRI及BamHI消化所調製成之表現載體pCOSl中。將如此得到之嵌合抗體之表現質體命名爲 MBCIHcDNA/pCOSI。又，表現載體 pCOSl 係藉 EcoRI 及 Smal消化而從HEF-PMh-g r 1(參照WO 92/19759)刪除抗體基因，然後連結EcoRI-Notl-BamHI Adaptor(寶酒公司製 )而構築。再者爲了製作在CHO細胞中表現用之質體，將質體 MBClHcDNA/pUC19用EcoRI及BamHI消化，將所得包含嵌合抗體Η序列之DNA片段導入藉用EcoRI及BamHI消化所調製成之表現質體pCHO 1中。如此得到之表現載體被命名爲MBCIHcDNA/ pCHOl。又，表現載體pCHOl係藉EcoRI 及 Smal 消化而從 DHER- △ E-rvH-PMl-f(參照 W0 92/19759)删除抗體基因，然後連結EcoRI-Notl-BamHI A dap tor(寶酒公司製）而構築。經濟部中央標準局員工消f合作社印製 (2)人類L鏈定常領域之構築 (i)選殖載體之製作爲了構築包含人類L鏈定常領域之pUC 19載體，製作欠缺Hind III部位之pUC19載體。將pUC19載體在含有20 mM Tris-HCl (pH 8.5)、10 mM MgCl2、1 mM DTT、100 mM KC1及8U之Hind III(寶酒公司製）之反應混合液20 μΐ中，於37 °C消化1小時。將消化混合液用酚及氯仿萃取，載體 -38- 本纸張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） 1227140 Α7 Β7 五、發明説明（36) DNA藉乙醇沉澱而回收。

將回收之 DNA 在含有 50 mM Tris-HCl (pH 7.5)、10 mM

MgCl2、1 mM DTT、100 mM NaCl、0.5 mM dNTP、6U 之Klenow片段（GIBCO BRL)之反應混合液50 μΐ中，於室溫反應2 0分鐘’以使終端平滑化。反應混合液用紛及氯仿萃取，載體DNA藉乙醇沉澱而回收。回收之載體 DNA 在含有 50 mM Tris-HCl (pH 7.6)、1〇 mM MgCl2、1 mM ATP > 1 mM DTT、5%(v/v)聚乙二蹲 8000、0.5U之T4DNA粘接酶（GIBCO BRL)之反應混合液 10 μΐ中，於16 °C反應2小時，以自行連結。將反應混合液5 μΐ加到大腸菌JM 109勝任細胞（日本基因公司）10〇 μΐ 中，將該細胞靜置於冰上3 0分鐘，靜置於42 °C 1分鐘，再靜置於冰上1分鐘。繼而，加入500 μΐ之SOC培養基並於37°C培育1小時後，將其接種於表面塗佈有X-gal及IPTG 之2xYT瓊脂培養基（含有50 gg/ml安比西林）（分子選殖：實驗室手册，Sambrook等人，冷泉港實驗出版公司， 1989)上，於37 °C培育一夜而得到轉形體。經滴部中央標準局員工消費合作社印製將該轉形體在含有50 pg/ml安比西林之2xYT瓊脂培養基 20 ml 中，於 37 °C 培養一夜，用 Plasmid Mini Kit (QIAGEN) ，依照隨附之處方，從菌體精製質體DNA。將精製之質體用Hind III消化，被確認欠缺Hind III部位之質體被命名爲 pUC19 △ Hind III 〇 \ (ii)編碼人類L鏈λ鏈定常領域之基因之構築關於人類L鏈λ鏈C領域，已知至少有4種同位型： -39 - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210X 297公釐Ί ~ 1227140 Α7 Β7 五、發明説明（37 )

Mcg + Ke + Oz·、Mcg Ke Oz·、Mcg_Ke_Oz+、 Mcg-Ke + Oz-(P. Dariavach，et al·，Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84，9074-9078，198 7)。依據與#23-5 7-137-1鼠L鏈；l鏈C領域具有相同性之人類抗體L鏈A鏈C領域用EMBL資料庫檢索之結果，同位型 Mcg + Ke + Oz-(寄存編號 X57819)(P· Dariavach， et al.? Proc. Natl.ad. Sci. USA, 84，9074-9078，1987)之人類抗體L鏈λ鏈顯示最高相同性，#23-57-137-1鼠L鏈 λ鏈C領域之相同性在胺基酸序列爲64.4%，在鹼基序列爲 73.4% 〇關於此，用PCR法構築編碼該人類抗體L鏈λ鏈C領域之基因。各引子之合成，用394 DNA/RNA合成機（ΑΒΙ社）進行。HLAMB1 (序列編號11)及HLAMB3(序列編號13)具有意義DNA序列，HLAMB2(序列編號12)及HLAMB4(序列編號14)具有意義DNA序列，在其各個之引子之兩端具 .有20至23 bp之互補序列。外部引子HLAMBS(序列編號15)及HLAMBR(序列編號 16)具有各與HLAMB1及HLAMB4相同之序列，又， HLAMBS 含有 EcoRI 、 Hind III 及 Blnl 鑑識序列， HLAMBR含有EcoRI鑑識序列。用第一 PCR進行HLAMB1-HLAMB2與HLAMB3- HLAMB4之反應。反應後，將其等量混合，然後用第二PCR進行組合。然後再添加外部引子 HLAMBS及HLAMBR，並藉第三PCR增幅全長DNA。 PCR係使用TaKaRa Ex Taq(寶酒公司製），依照隨附之處方進行。第一 PCR，係採用含有5 pmole之HLAMB1及0.5 40- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210X 297公釐）請閲讀 i 事項

經濟部中央標隼局員工消費合作社印製 1227140 A7 B7 五、發明説明（38) pmole之HLAMB2及5U之TaKaRa Ex Taq(寶酒公司製）之 100 μΐ之反應混合液，或含有〇 5 pmole之HLAMB3及5 pmole 之 HLAMB4 及 5U 之 TaKaRa Ex Taq (寶酒公司製）之100 μΐ之反應混合液，加入50 μΐ礦油做爲上層，然後進行94 °C 1分鐘，60 °C 1分鐘及72 °C 1分鐘之溫度循環5 次0 第二PCR係將各反應液50 μΐ予以混合，加入50 μΐ礦油做爲上層，然後進行94 °C 1分鐘，60 °C 1分鐘及72。(： 1 分鐘之溫度循環3次。第三PCR係將外部引子HLAMBS及HLAMBR各50pm〇ie 添加至各反應液，然後進行94 °C 1分鐘，60 °C 1分鐘及 72 °C 1分鐘之溫度循環3 0次。第三PCR產物之DNA片段，用3%低熔點瓊脂糖凝膠 (NuSieve GTG Agarose FMC)電泳後，用 GENECLEAN II 套組（BIΟ 10 1 )，依照套組所附之處方從凝膠回收、精製。將所得到之DNA片段在含有50 mM Tris-HCl (pH 7.5) 經濟部中央標準局員工消費合作社印製、10mMMgCl2、ImMDTT、lOOmMNaCl 及 8U 之 EcoRI (寶酒公司製）之反應混合液20 μΐ中，於37 Ό消化1小時。將消化混合液用酚及氣仿萃取，DNΑ藉乙醇沉澱而回收後，將其溶解於含 10 mM Tris-HCl (pH7.4)及 1 mM EDTA 之溶液8 μΐ中。

質體pUC19 △ Hind III 0·8 pg同樣地用EcoRI消化，用驗及氯仿萃取，然後藉乙醇沉澱而回收。將被消化之質體 pUC 19 △ Hind III 在在含有 50 mM Tris-HCl (pH 9.0)、1 mM -41 - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（2l0X 297公釐） 1227140 A7 B7 五、發明説明（39

MgCl2及鹼性磷酸酶（大腸桿菌C75，寶酒公司製）之反應混合液50 μΐ中，於37 °C反應30分鐘而進行脱磷酸處理（BAP 處理）。將反應液用酚及氯仿萃取，DNA藉乙醇沉澱而回收後，將其溶解於含10mMTris-HCl(pH7.4)及ImMEDTA 之溶液1 〇 μ 1中。將上述經ΒΑΡ處理之質體pUC19 △ Hind III 1 μΐ與前述之PCR產物4 μΐ用DNA粘接套組Ver.2(寶酒公司製）連結，並用其轉形大腸桿菌JM 109勝任細胞。將所得之轉形體在含有50 pg/ml安比西林之2xYT培養基2 ml中培養一夜，用 QIAprep Spin Plasmid Kit (QIAGEN)，從菌體精製質體。對於上述質體進行被選殖DNA之鹼基序列之確認。鹼基序列之決定係採用373A DNA定序器（ABI公司），引子係採用Μ 13引子M4及Μ 1 3引子RV(寶酒公司製）。結果判明被選殖之DNA之内部欠缺12 bp(含有該DNA之質體被命名爲C λ △ /pUC 19)。因此，新合成供補入該部分之引子 HCLMS(序列編號17)及HCLMR(序列編號18)，然後藉PCR 再次構築正確之DNA。在第一 PCR中，用含有欠缺DNA之質體C λ ZX/pUCD 做爲模板，進行引子HLAMBS與HCLMR，以及HCLMS 與HLAMB4之反應。將各PCR產物精製，在第二PCR中進行組合。然後再添加外部引子HLAMBS及HLAMB4，並藉第三PCR增幅全長DNA。第一 PCR，係以0.1 pg之C λ △/pUCB做爲模板，用含 -42- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Λ4規格（210X 297公釐）請先閱讀面之 I 事項

P 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 1227140 A7 ________B7 五、發明説明（40 ) 有引子 HLAMBS 及 HCLMR 各 50 pm〇le，或 HCLMS 及 HLAMB4 各 50 pmole，以及 5U 之 TaKaRa Ex Taq (寶酒公司製）之100 μΐ之反應混合液，加入50 μι礦油做爲上層，然後進行94 °C 1分鐘，60 °C 1分鐘及72r 1分鐘之溫度循環3 0次。 PCR 產物 HLAMBS-HCLMR(236 bp)及 HCLMS-HLAMB4 (147 bp)各用3%低熔點瓊脂糖凝膠（NuSieve gTG Agai:c)se FMC)電泳後，用GENECLEANII套組（BIO101)，依照套組所附之處方從凝膠回收、精製。在第二P C R中，使用含有精製DNA片段各40 ng，以及1U之TaKaRa Ex Taq(寶酒公司製）之20 μΐ之反應混合液，加入25 μΐ礦油做爲上層，然後進行94 °C 1分鐘，60 °C 1分鐘及72 °C 1分鐘之溫度循環5次。在第三PCR中，使用含有第二PCR反應液2 μΐ，外部引子 HLAMBS 及 HLAMB4 各 50 pmole，以及 5U 之 TaKaRa Ex 經濟部中央標準局員工消費合作社印製

Taq (寶酒公司製）之100 μΐ之反應混合液，並加入25 μΐ礦油做爲上層。PCR係以94 °C 1分鐘，60 °C 1分鐘及72 Ό 1分鐘之溫度循環進行30次。爲第三pCR產物之357 bp 之DNA片段，用3%低熔點瓊脂糖凝膠電泳後，用 GENECLEAN II套組（BIO101)，從凝膠回收、精製。將所得到之DNA片段〇· 1 pg用EcoRI消化後，將其次選殖入經BAP處理之質體pUC 19 A Hind III中。轉形大腸桿菌JM 109勝任細胞。將所得之轉形體在含有5 0 pg/ml安比西林之2xYT培養基2ml中培養一夜，用QiAprep Spin -43- 本紙張尺度適用中國國家標隼（CNS ) A4規格（210X 297公釐"7 1227140 A7 B7 五、發明説明（41

Plasmid Kit (QIAGEN)，從菌體精製質體。已精製質體中之鹼基序列，用M13引子M4及M13引子 RV(寶酒公司製），在373A DNA定序器（ABI公司）中決定。被確認具有無欠缺之正確鹼基序列之質體被命名爲C λ /pUC19。 (iii)編碼人類L鏈％鏈定常領域之基因之構築用？0尺法從質體11£?-??411^§]^(\¥092-1975 9)選殖編碼[ 鏈冗鏈C領域之DNA片段。用394DNA/RNA合成機（ABI 社）合成之前方引子HKAPS(序列編號19)被設計成具有 EcoRI、Hind III、Blnl鑑識序列，後方引子HKAPA(序列編號20)具有EcoRI鑑識序列。使用含有做爲模板之質體HEF-PMlk-gk 0.1 pg ，引子 HKAPS 及 HKAPA 各 50 pmole，以及 5U 之 TaKaRa Ex Taq (寶酒公司製）之100 μΐ之反應混合液，並加入50 μΐ礦油做爲上層。進行94 °C 1分鐘，60 °C 1分鐘及72 °C 1分鐘之反應30循環。360 bp之PCR產物用3%低溶點瓊脂糖凝膠電泳後，用GENECLEANII套組（BIO101)，從凝膠回收、精製。將所得到之DNA片段用EcoRI消化後，將其次選殖入經 BAP處理之質體puci9A Hindlll中。轉形大腸桿菌JM109 勝任細胞。將所得之轉形體在含有50 .ug/ml安比西林之 2乂丫丁培養基2 1111中培養一夜，用〇1八01外3卩111?1351111(1{^ (QIAGEN)，從菌體精製質體。已精製質體中之鹼基序列，用M13引子M4及Μ 13引子 44 本纸張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（2】〇χ297公釐）讀閱面之 r 事項再填寫本頁經濟部中央標準局員工消費合作社印製 1227140 A7 B7 五、發明説明（42) RV(寶酒公司製），在373ADNA定序器（ABI公司）中決定。被確認具有正確驗基序列之質體被命名爲C X /pUC 1 9。 (3)嵌合抗體L鏈表現載體之構築構築嵌合#23-5 7-13 7-1抗體L鏈表現載體。藉著將編碼 #23-5 7-13 7-1抗體L鏈V領域之基因，連結至在質體C A /pUC19、C x /pUC 19之人類抗體之正前方之Hind III及 Blnl部位，而製作各編碼嵌合#23-5 7-13 7-1抗體L鏈V領域以及L鏈λ鏈或L鏈X鏈定常領域之pUC 19載體。藉 EcoRI消化切出嵌合抗體L鏈基因，並對HEF表現載體進行次選殖。亦即，用？011法從質體^16(：1[24選殖#23-57-137-1抗體 L鏈V領域。各引子之合成用394DNA/RNA合成機（ABI社 )進行。後方引子MBCCHL1 (序列編號21)被設計成具有 HIND III 鑑識序列及 Kozak 序列（Kozak，M. et al.，J· Mol· Biol., 196，947-950，1987)以及前方引子 MBCCHL3(序列編號22)被設計成具有Bglll、EcoRI之鑑識序列。 PCR 係使用含有 20 mM Tris-HCl (pH 8.3)、50 mM KC1 、1.5 mM MgCL、0.2 mM dNTP、0.1 pg 之 MBC1L24、做爲引子之MBCCHL1及MBCCHL3各50 pmole、以及1 μΐ 之AmpliTaq (柏金艾摩公司）之反應混合液1 〇〇 μΐ，並加入 50 μΐ礦油做爲上層，然後進行94 °C 45秒，60 °C 45秒及 72 °C 2分鐘之溫度循環3 0次。、 444 bp之PCR產物用3%低熔點瓊脂糖凝膠電泳後，用 GENECLEAN II套組（BIO101)，從凝膠回收、精製。將其 -45- 本紙張尺度適用中國國家標準（ CNS ) A4規格（2丨0X 297公釐) (請先閱讀^面之注奮事項再^^舄本頁再經濟部中央標準局員工消費合作社印製 1227140 A7 B7 五、發明説明（43 ) 溶解於含 10 mM Tris-HCl (pH 7.4)及 ImM EDTA 之溶液 20 μΐ 中。將 PCR 產物 1 μΐ 在含有 i〇 mM Tns-HCl (pH 7·5)、 10 mM MgCl2、1 mM DTT、50 mM NaCl 及 8U 之 Hind III (寶酒公司製）之反應混合液20 μΐ中，於3 7 °C消化1小時。將消化混合液用驗及氯仿萃取，DNA藉乙醇沉澱而回收後，將其溶解於含 10 mM Tris-HCl (pH7.4)及 1 mM EDTA 之溶液8 μΐ中。質體pUC19 1 pg同樣地用Hind III及EcoRI消化，用酚及氯仿萃取，藉乙醇沉澱而回收，然後用鹼性磷酸酶（大腸桿菌C75，寶酒公司製）進行BAP處理。將反應液用驗及氯仿萃取，DNA藉乙醇沉澱而回收後，將其溶解於含1 〇 mM Tris，HCl (pH7.4)及 1 mM EDTA 之溶液 10 μΐ 中。經濟部中央標準局員工消費合作社印製 (請先閲讀參面之注^事項\^^寫本頁將上述經BAP處理之質體pUC 19 1 μΐ與前述之PCR產物4 μΐ用DNA粘接套組Ver.2(寶酒公司製）連結，並用與前述相同之方法轉形大腸桿菌JM 109勝任細胞（日本基因公司）。將其接種於含有50 pg/ml安比西林之2xYT凍瓊脂培養基中並於37 °C培養一夜。將所得之轉形體在含有50 pg/ml安比西林之2xYT培養基2 ml中，於37。(3培養一夜。用 QIAprep Spin Plasmid Kit (QIAGEN)，從菌體精製質體。決定鹼基序列後，將具有正確鹼基序列之質體命名爲 CHL/pUC19。將質體C λ /pUC19及C % /pUC19各1叫，各在含20mM Tris-HCl (pH 8.5) ^ 10 mM MgCl2、1 mM DTT、100 mM KC1、8U之Hind III (寶酒公司製）及2U之Blnl (寶酒公司 -46- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（21 Ox 297公釐） ""~ ^ 1227140 Α7 Β7 五、發明説明（44 ) 製）之反應混合液20 μΐ中，於37 °C消化1小時。將消化混合液用酚及氯仿萃取，DN A藉乙醇沉澱而回收後，於3 7 °C進行BAP處理30分鐘。反應液用酚及氯仿萃取，DNA 藉乙醇沉澱而回收，然後將其溶解於含10 mM Tris-HCl (pH7.4)及 1 mM EDTA 之溶液 10 μΐ 中。含有#23-5 7-137-1 L鏈V領域之質體CHL/pUC19 8 pg以同樣之方式用Hind III及Blnl消化。得到之409 bp之DNA 片段，用3%低熔點瓊脂糖凝膠電泳後，用GENECLEAN II 套組（ΒΙΟΙ01)從凝膠回收、精製，然後將其溶解於含10 mM Tris-HCl (pH7.4)及 1 mM EDTA 之溶液 10 μΐ 中。將該L鏈V領域DNA 4 μΐ次選殖入經BAP處理之質體C λ /pUC19或C % /pUC19各1 μΐ中，並用其轉形大腸桿菌 JM 109勝任細胞。將轉形體在含有50 pg/ml安比西林之 2乂丫1[培養基3 1111中培養一夜。用（51八卩^卩8卩111?1&51111(11(^ (QIAGEN)，從菌體精製質體。彼等各被命名爲質體MBC1L( 几）/pUC19 及 MBClL〇 )/pUC19。質體 MBC1LU )/pUC19 及 MBClL〇 )/pUC19 各用 EcoRI 消化，將其用3%低熔點瓊脂糖凝膠電泳後，用GENECLEAN II套組（BIO 101)從凝膠回收、精製，然後將其溶解於含1〇 mM Tris-HCl (pH 7.4)及 1 mM EDTA 之溶液 10 μΐ 中。做爲表現載體之質體HEF-PMlk-gk 2.7 pg用EcoRI消化，用酚及氯仿萃取，然後藉乙醇沉澱回收、DNA。將回收之 DNA片段進行BAP處理，用1%低熔點瓊脂糖凝膠電泳後，65 6 1 bp 之 DNA 片段用 GENECLEAN II 套組（ΒΙΟΙ 01)從 -47- 本纸張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210X 297公釐） (請先閱讀背面之注^事項再填寫本頁 II裝 ί:填寫太、\'$ 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 1227140 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A7 B7 五、發明説明（45 ) 凝膠回收、精製，然後將其溶解於含10 rnM Tris-HCl (pH 7.4) 及1 mM EDTA之溶液l〇 μΐ中。將經BAP處理之^^卩載體2抖1與上述質體^18(：11^凡）或MBClL〇 )EcoRI片段各3 μΐ連結，並用其轉形大腸桿菌JM 109勝任細胞。將轉形體在含有50 pg/ml安比西林之 2xYT 培養基 2ml 中培養一夜，用 QIAp rep Spin Plasmid Kit (QIAGEN)，從菌體精製質體。將精製之質體，在含 20 mM Tris-HCl (pH 8.5)、10 mM MgCl2、1 mM DTT、100 mM KC1、8U 之 Hind III (寶酒公司製）及2U之Pvul (寶酒公司製）之反應混合液20 μΐ中，於3 7 °C消化1小時。片段被插在正確方向者生成 5 104/2195 bp之消化片段，片段被插在逆方向者生成 43 7 8/2 926 bp之消化片段，被插在正確方向之質體各被稱做 MBC1L(A )/neo 及 MBClL〇 )/neo 〇 (4)COS-7細胞之轉染爲了評價嵌合抗體之抗原結合活性及中和活性，將前述表現載體用C0S-7細胞過渡性表現。亦即嵌合抗體之過渡性表現藉下法進行：將質體 MBC lHcDNA/pCOS 1 與 MBC 1 L(几）/neo 組合，或者將 MBCIHcDNA/pCOSI 與 MBClL(；i )/neo 組合，用 GenePulser 裝置（BioRad)藉電穿孔同時將其導入COS-7細胞。在COS·7 細胞以1 X 1〇7之細胞濃度懸浮於PBS〇)之懸浮液0.8 ml 中，加入各質體DNAlOpg，並於1，500V，25pF之靜電容量施加脈衝。於在室溫之1 〇分鐘回復時間後，將被電穿 -48- 本紙張尺度適用f國國家標準（CNS ) Λ4規格（210X 297公釐^-- (請先閱讀舍面之注.意事項寫本頁) 裝·

、1T 1227140 經濟部中央標準局員Η;消費合作社印製 A7 ______B7 五、發明説明（46 ) ^ 孔之細胞懸浮於含有2%之Ultra Low IgG牛胎兒血清 (〇16<：〇)之〇“£“培養基（〇16(：〇)中，使用10(：111培養耻，在C〇2培育器中培養。培養72小時之後，收集培養上清液，藉著遠心分離除去細胞破片，並供應至ELIS A之試料中。又，從COS-7細胞之培養上清液精製嵌合抗體，係用 AffiGel Protein A MAPSII 套組（BioRad)，依照隨附之處方進行。

(5)ELISA (i) 抗體濃度之測定將供抗體測定用之ELIS A平皿按照下述調製。將ELIS A 用之96孔平皿（Maxisorp，NUNC)之各孔，用以固相化緩衝劑（0.1MNaHCO3、0.02%NaN3)調製成 lpg/ml 濃度之山羊抗人類IgG抗體（塔格公司）1〇〇 μ1固相化，用2〇〇 μ1之稀釋緩衝液（50mM Tris-HCl、1 mM MgCl2、0.1Μ NaCl、〇·〇5% Tween 20、0.02% NaN3、1%牛血清白蛋白（BSA) 、pH 7.2)封阻後，將表現嵌合抗體之c〇S細胞之培養上清液或精製嵌合抗體予以系列稀釋並加到各孔中。於室溫培育1小時並用PBS-Tween 20洗淨後，加入與鹼性磷酸酶結合之山羊抗人類IgG抗體（塔格公司）ι〇〇μΐ。於室溫立立育1 小時並用PBS-Tween 20洗淨後，加入1 mg/ml之基質溶液 (西格瑪104，對-硝基苯磷酸，西格瑪公司），接下來用微皿雷達（BioRad)測定在405nm之吸光度。、用純化人類IgG1 λ (結合部位）做爲濃度測定之標準。 (ii) 抗原結合能力之測定 -49- 準（CNS ) A4規格（210X 297公釐 j~^- (請先S'讀#^之事本頁j -裴_

、1T 1227140 A7 B7 五、發明説明（47 請先閱讀背'^ 1¾ 之 t 事項 P 本頁在供抗原結合測定之ELISA平皿中，如下述調製。將 ELISA用之96孔平m之各孔，用以固相化緩衝劑調製成1 pg/ml濃度之人類ΡΤΗι*Ρ(1·3 4)(胜肽研究所）100 μΐ固相化，用200 μΐ之稀釋緩衝液封阻後，將表現嵌合抗體之COS 細胞之培養上清液或精製嵌合抗體系列稀釋並加到各孔中。於室溫培育1小時並用PBS-Tween20洗淨後，力π入與驗性磷酸酶結合之山羊抗人類IgG抗體（塔格公司）100 μΐ。於室溫培育並用PBS-Tween20洗淨後，加入1 mg/ml之基質溶液（西格瑪104，對-硝基苯磷酸，西格瑪公司），接下來用微m雷達（BioRad)測定在405 nm之吸光度。結果顯示嵌合抗體具有結合於人類PTHrP(l_34)之能力，以及具有選殖之鼠抗體V領域之正確構造（圖5)。又’由於嵌合抗體中之L鏈C領域縱使爲λ鏈或X鏈中之任一者，抗體與PTHrP(l-3 4)之結合能力也沒有變化，所以人型化抗體之L鏈C領域用人型化抗體L鏈；I鏈構築。 (6)CH0安定產生細胞株之建立爲了建立嵌合抗體之安定產生細胞株’將前述衣現質體導入CHO細胞（DXB11)。經濟部中央標準局員工消費合作社印製亦即嵌合抗體之安定產生細胞株係藉下法建立：將CHO 細胞用表現質體MBCIHcDNA/pCHOl與MBC1L( λ )/neo組合，或者將 MBCIHcDNA/pCHOl 與 MBClL〇 )/neo 組合，用GenePulser裝置（BioRad)藉電芽孔將其同時導入CHO細胞。各個表現載體用限制酶Pvul切斷而形成直鏈DNA，用酚及氯仿萃取後，藉乙醇沉澱回收DNA以備用於電穿孔 -50 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） 1227140 Α7 Β7 經濟部中央標準局員工消費合作社印製五、發明説明（48 ) 。在CHO細胞以1 X 107之細胞濃度懸浮於PBS(-)之懸浮液0.8 ml中，加入各質體DNA 10 pg，並於1,500 V，25 pF 之靜電容量施加脈衝。於在室溫之1 〇分鐘回復時間後，將被電穿孔之細胞懸浮於添加有10%牛胎兒血清（GIBCO)之 ΜΕΜ-α培養基（GIBCO)中，使用3個96孔平m(Falcon)，在co2培育器中培養。在培養開始後第二日，添加10%牛胎兒血清（GIBCO)及 500 mg/ml 之 GENETICIN (G418 硫酸鹽，GIBCO)，更換不含核糖核苷酸或去氧核糖核茹酸之 ΜΕΜ-α培養基（GIBCO)之選擇培養基，以選擇導入抗體基因之細胞。更換選擇培養基後，於2星期前後在顯微鏡下觀察細胞，確認細胞增殖良好後，用上述抗體濃度測定 ELISA測定抗體產生量，然後選別抗體產生量多之細胞。擴大所建立之抗體之安定產產生細胞株之培養，將2% 之Ultra Low IgG牛胎兒血清（GIBCO)添加至口-今示卜A 中，使用不含核糖核甞酸或去氧核糖核苷酸之mem培養基，進行大量培養。於培養第3至4曰回收培養上清液，藉 0.2 μιη之遽器（Millipore)除去細胞破片。嵌合抗體從CHO細胞之培養上清液中之精製，係使用 POROS蛋白質A管柱（PerSeptive生物系統），並遵照ConSep LC100 (Millipore)所附之處方進行，然後進行中和活性之測定及在高鈣血症模型動物中之藥效試驗。所得精製嵌合抗體之濃度及抗原結合活性以上述ELIS A測定。 [參考例4]人型化抗體之構築 (1)人型化抗體Η鏈之構築 -51 - 本纸張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210X 297公釐）請先閲面之注意，事項

ί 1227140 A7 B7 五、發明説明（49 (i)人型化抗體Η鏈V領域之構築請先閱讀背* 1¾ 之 i 事項 P 本頁人型化抗體#2 3-5 7- 13 7-1抗體Η鏈用PCR法藉CDR-接枝製作。爲了製作具有來自人類抗體S3 1679(NBRF-PDB ， Cuisinier Α·Μ·等，Eur. J. Immunol.，23，110-118 ^ 1993) 之FR之人型化#23-57-137-1抗體H鏈（變型’’a”），使用6個 PCR引子。CDR-接枝引子MBC1HGP1(序歹ij編號23)及 MBC1HGP3(序列編號24)具備有意義之DNA序列，而CDR 接枝引子-MBC1HGP2 (序列編號25)及MBC1HGP4 (序列編號26)具有反義DNA序列，在各引子之兩端具有從15至21 bp之互補序列。外部引子MBC1HVS1(序列編號27)及 MBC1HVR1(序列編號28)與CDR接枝引子MBC1HGP1及 MBC1HGP4具有同源性。 CDR-接枝引子 MBC1HGP1、MBC1HGP2、MBC1HGP3 及MBC1HGP4用尿素變性聚丙晞醯胺凝膠分離（分子選殖 :實驗室手册，Sambrook等人，冷泉港實驗出版公司’ 1989)，自凝膠之萃取以壓碎及浸泡法（分子選殖：實驗室手册，Sambrook等人，冷泉港實驗出版公司，1989)進行。經濟部中央標準局員工消費合作社印製亦即，將各lnmole之CDR-接枝引子用6%變性聚丙烯醯胺凝膠分離，做爲目的物之大型DNA片段之固定係在矽膠薄膜板上照射紫外線而進行，用壓碎及浸泡法從凝膠回收，並溶於 20 μΐ 含 10mM Tris-HCl (pH 7.4)及 ImM EDTA 之溶液中。PCR，係採用TaKaRa Ex Tag(賓酒公司製），於 100 μΐ反應混合液含有如上述調製之CDR-接枝引子 MBC1HGP1 、 MBC1HGP2 、 MBC1HGP3及 MBC1HGP4各 -52 本纸張尺度適用中國國家標率（CNS ) A4規格（210X 297公釐） 1227140 A7 B7 五、發明説明（50 ) 1 μΐ、0.25 mM dNTP 及 2·5 單位 TaKaRa Ex Tag 之條件下，使用隨附之緩衝液，然後進行94 °C 1分鐘，55 °C 1分鐘及72 C 1分鐘之溫度循環5次，再添加50 pmole之外部引子MBC1HVS1及MBC1HVR1，進行同樣的溫度循環30次。將藉PCR法增幅之DNA片段藉著使用4% Nu Sieve GTG 瓊脂糖（FMC Bio· Products)之瓊脂糖凝膠電泳而分離。切取含有421 bp長之DNA片段之瓊脂糖片，用 GENECLEAN II套組（BIO101)，依照套組所附之處方精製 DNA片段。將已精製之DNA用乙醇沉澱回收後，將其溶解於含 10 mM Tris-HCl (pH 7.4)及 1 mM EDTA 之溶液 20 μΐ 中。將所得PCR反應混合物次選殖入藉BamHI及Hind消化所調製成之pUC 19中，並決定鹼基序列。具有正確序列之質體被命名爲hMBCHWpUC19。 (ii)供人型化Η鏈cDNA用之Η鏈V領域之構築爲了與人類Η鏈C領域C r 1之cDNA連結，藉pCR法修飾如上述構築之人型化Η鏈V領域。後方引子MBC1-H VS2被設計成與編碼V領域之前導序列之5-侧之序列雜經濟部中央標準局員工消費合作社印製交，而且具有 Kozak 相合序列（Kozak, M. et al.，J. Mol. Biol.， 196，947-950，1987)以及 Hind III 及 EcoRI 之鐘識序列。供H鏈V領域用之前方引子MBC1HVR2被設計成與編碼 J領域之3’-側之DNA序列雜交，而且具有編碼c領域之5, 侧之序列及Apal及Smal鑑識序列。供給者序列以及限制酶BamHI之鏗識序列。 PCR係按照下述方法進行：採用TaKaRa Ex Tag(寶酒公 -53- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Λ4規格（210X 297公釐） 1227140 A7 B7 五、發明説明（51 ) 司製），用0.4 pg之hMBCHv/pUC19做爲模板DNA，於含有做爲引子之 MBC1HSV2 及 MBC1HVR2 各 50pmole、2.5 單位TaKaRa Ex Tag及0.25 mM dNTP之條件下，使用隨附之緩衝液，進行94 °C 1分鐘，55 °C 1分鐘及72 °C 1分鐘之溫度循環30次。將藉PCR法增幅之DNA片段藉使用3% Nu Sieve GTG瓊脂糖（FMC Bio. Products)之瓊脂糖凝膠電泳而分離。切取含有456 bp長之DNA片段之瓊脂糖片，用 GENECLEAN II套組（BIO101)，依照套組所附之處方精製 DNA片段。將已精製之DNA用乙醇沉澱回收後，將其溶解於含 10 mM Tris-HCl (pH 7.4)及 1 mM EDTA 之溶液 20 μΐ 中。將所得PCR反應混合物次選殖入藉EcoRI及Smal消化所調製成之pUC 19中，並決定鹼基序列。如此所得之含有編碼來自雜交瘤#23-57-137-1之鼠Η鏈V領域之基因，以及在5,側具有EcoRI及Hind III鑑識序列及Kozak序列，以及在3’侧具有Apal及Smal鑑識序列之質體被命名爲 hMBClHv/pUC19 〇 (2)人型化抗體Η鏈之表現載體之構築經濟部中央標隼局員工消費合作社印製

含有hPMl抗體Η鏈cDNA之序列之質體RVh-PMlf-cDNA用Apal及BamHI消化，回收含Η鏈C領域之DNA 片段，將其導入用 Apal及BamHI消化所調製成之 hMBClHv/pUC19 中。將如此製作之質體命名爲 hMBCIHcDNA/pUC 19。該質體含有人型化 #23-57- 137-1 抗體之Η鏈V領域及Η鏈C領域C r 1，以及在5’侧具有EcoRI -54- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） 1227140 A7 B7 五、發明説明（52) 及Hind III鑑識序列，及在3’側具有BamHI鑑識序列。質體hMBClHcDNA/pUC19所含之人型化Η鏈變型”a"之鹼基序列及對應之胺基酸序列以序列編號5 8表示。又，變型a 之胺基酸序列以序列編號5 6表示。將 hMBClHcDNA/pUC19 用 EcoRI 及 BamHI 消化，將得到之含有Η鏈序列之DNA片段導入用EcoRI及BamHI消化所調製成之表現質體pCOS 1中。將如此得到之人型化抗體之表現質體命名爲hMBCIHcDNA/pCOSI。再者，爲了製作在CHO細胞中表現用之載體，用EcoRI 及BamHI消化hMBClHcDNA/pUC19，將得到之含有Η鏈序列之DNA片段導入用EcoRI及BamHI消化所調製成之表現質體pCHO 1中。將如此得到之人型化抗體之表現質體命名爲 hMBCIHcDNA/pCHOl。 (3)L鏈雜交可變領域之構築 (i)FRl，2/FR3，4雜交抗體之製作經濟部中央標準局員工消費合作社印製構築人型化抗體與鼠抗體之FR領域交換之L鏈基因，進行供人型化用之各領域之評價。藉著利用在CDR2内之限制酵素ΑΠΙΙ切斷部位，製作來自人類抗體之FR1及2與來自鼠抗體之FR3及4之雜交抗體。將質體MBC1L( λ )/neo 及 hMBClL(A )/neo 各 10pg 在含有 10mMTris-HCl(pH7.5) 、10 mM MgCl2 、 1 mM DTT 、 50 mM NaCl 、 0.01%(w/v)BSA及10U Aflll(寶酒公司製）之反應混合液 100 μΐ中，於37 °C消化1小時。將反應液在2%低熔點瓊脂糖凝膠中電泳，將來自質體MBC1L( λ )/neo之6282 bp -55- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 1227140 A7 B7 五、發明説明（53 ) —' 片段（做爲cl)及1022 bp片段（做爲c2)，以及來自質體 hMBCILU )/neo之6282 bp片段（做爲叫及Μ。矸片段（做爲h2)，用GENECLEAN II套組（BIO101)回收及精製。將回收之cl及hi片段各1料進行bap處理。dNA用驗及氯仿萃取，藉乙醇沉澱而回收後，將其溶解於含丨〇 mM Tris-HCl (ρΗ7·4)及 1 mM EDTA 之溶液 1〇 μΐ 中。將經 BAp 處理之cl及hi片段1 μΐ各連結至h2、c2片段（4 °c、一夜 )，並用其轉形大肪_干囷J Μ 1 0 9勝任細胞。將所得之轉形體在含有50 pg/ml安比西林之2χΥΤ培養基2ml中培養，用 QIAprep Spin Plasmid Kit (QIAGEN)，從菌體精製質體。將精製之質體在含有10 mM Tris-HCl (pH 7.5)、1〇 mM MgCl2、1 mM DTT、2U之ApaLl (寶酒公司製）或gu之 BamHI(寶酒公司製）、8U之Hindlll (寶酒公司製）之反應混合液20 μΐ中，於37 °C消化1小時。cl-h2若被正確地連結，藉著用ApaLI則生成5560/1246/498 bp之消化片段，及用BamHI/Hind III則生成7134/269 bp之消化片段，來進行質體之確認。經濟部中央標準局員工消費合作社印製編碼人類FR1，2/鼠FR3，4鼠雜交抗體L鏈之表現載體被命名爲h/mMBClL( A )/neo 。另一方面，由於沒得到 hl-c2之純系，經由在PUC上重組而選殖HEF載體。此時，用含有胺基酸沒有被取代之人型化抗體L鏈V領域之質體hMBClLa( λ )/pUC19 ，以及含有FR3内之91位（依據

Kab at之規定，胺基酸編號爲87位）之路胺酸被置換成異白胺酸之人型化抗體L鏈V領域之質體hMBCIL d λ /pUC19 -56- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Λ4規格（21 OX 297公釐） 1227140 Α7 Β7 五、發明説明（54 ) 做爲模板。將質體 MBC1L(几）/pUC19 、 hMBC 1 La(几）/pUC 1 9 及 hMBClLd(A )/pUC19 各 10 pg 在含有 10 mM Tris-HCl (pH 7.5)、 10 mM MgCl2 、 1 mM DTT 、 50mMNaCl 、 0.01%(w/v)BSA、6U 之 Hindlll 及 4U 之 AflII4U 之反應混合液3 0 μΐ中，於3 7 °C消化1小時。將反應液在2%低熔點瓊脂糖凝膠中電泳，將來自質體MBC1LU )/pUC19之215 bp片段（c2，），以及各來自質體hMBCILa λ /pUC19及 hMBCILd Λ /pUC19 之 3218 bp(hal’， hdl，）之 DNA 片段，用GENECLEANII套組（BIO101)回收及精製。將hal’及hdl’片段各連結至c2f片段，用其轉形大腸桿菌 JM 109勝任細胞。將所得之轉形體在含有50 .ug/ml安比西林之 2xYT 培養基 2ml 中培養，用 QIAprep SpinPlasmidKit (QIAGEN)，從菌體精製質體。彼等各被命名爲質體 m/hMBCILa λ /pUC19 及 m/hMBCILd Λ /pUC19 。將所得到之質體m/hMBCILa λ /pUC19及m/hMBCILd入 /pUC19用EcoRI消化。將各個之743 bp之DNA片段用2% 低熔點瓊脂糖凝膠電泳後，用GENECLEAN II套組（ΒΙΟΙ01) 回收及精製，然後將其溶於含10mMTris-HCl(pH7.4)及1 mM EDTA之溶液20 μΐ中。將各DNA片段4 μΐ連結至經前述ΒΑΡ處理之HEF載體1 μΐ上，並用其轉形大腸桿菌JM 109勝任細胞。將所得之轉形體在含有50 pg/ml安比西林之2χΥΤ培養基2 ml中培養，用 QIAprep Spin Plasmid Kit (QIAGEN)，從菌體精製質 57 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210X 297公釐）請先閱讀背， ιέ 之 ί 事項

尝經濟部中央標準局員工消費合作杜印製 1227140 A7 ____B7 五、發明説明（55 ) 體。將精製之各質體在含有含有20 mM Tris-HCl (pH 8.5)、 10 mM MgCl2、1 mM DTT、100 mM KC1、6U 之 Hind III( 寶酒公司製）及2U之Pvul(寶酒公司製）之反應混合液20 μΐ 中，於3 7 °C消化1小時。藉著片段若以正確方向插入則生成5 104/2195 bp之消化片段，若以逆方向插入則生成 43 78/2926 bp之消化片段，來進行質體之確認。將編碼鼠 FR1，2/人類FR3，4雜交抗體L鏈之表現載體各被稱爲 m/hMBC lLa λ /neo 及 m/hMBC ILd λ /neo o (ii)FRl/FR2雜交抗體之製作藉著利用在CDR1内之SnaBI切斷部位，以同樣方式製作FR1與FR2之雜交抗體。將質體 MBC1L( λ )/neo 及 h/mMBClL( λ )/neo 各 10 pg 在含有 10 mM Tris-HCl (pH 7.9)、10 mM MgCl2、1 mM DTT 、50mMNaCl、0.01%(w/v)BSA 及 6U 之 SnaBI 之反應混合液20 μΐ中，於37 °C消化1小時。接下來，在含有20 mM Tris-HCl(pH 8·5)、10 mM MgCl2、1 mM DTT、100 mM KC1、0.01%(w/v)BSA及6U之Pvul之反應混合液50μ1中，於3 7 °C消化1小時。

將反應液用1.5%低熔點瓊脂糖凝膠中電泳後，將來自質體 MBC1L( λ )/neo 之 495 5 bp(ml)及 23 49 bp(m2)，以及來自質體 h/mMBClL( λ )/neo 之 4955 bp(hml)及 2349 bp(hm2) 之各DNA片段，用GENECLEANII套組（BIO101)回收及精製，然後將其溶解於含10 mM Tris-HCl(pH 7.4)及1 mM -58- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Λ4規格（210X 297公釐）請先閱讀背. 1¾ 意· 事項

經濟部中央標隼局員工消費合作社印製 1227140 A7 ----- B7 五、發明説明（56 ) EDTA之溶液40 μΐ中。知ml及hml片段4 μΐ各連結至hm2及m2片段4 μΐ，然後用其轉形大腸桿菌JM 109勝任細胞。將所得之轉形體在含有50 pg/ml安比西林之2χΥΤ培養基2 ^1中培養，用 QIAprep Spin Plasmid Kit (QIAGEN)，從菌體精製質體。將精製之各質體在含有1〇 mM Tris-ΗCl (pH 7.5)、10 mM MgCl2、1 mM DTT、8ϋ 之 Apal(寶酒公司製）或 2ϋ 之 ApaLI(寶酒公司製）之反應混合液2〇 μ1中，於37 t消化i 小時。藉著各片段若被正確地連結，用Apal則生成73 04 bp ，用 ApaLI 則生成 5560/1246/498 bp(ml-hm2)，用 Apal 則生成 6538/766 bp，用 ApaLI 則生成 3535/2.25/1246 /498 bp(hml-m2)之消化片段，來進行質體之確認。將编碼人fri/ 鼠FR2，3，4雜交抗體L鏈之表現載體稱爲hmmMBClL( Λ )/neo，以及編碼鼠FR1/人FR2/鼠FR3，4雜交抗體L 鏈之表現載體被稱爲mhmMBClL(A )/neo。 (1)人型化抗體L鏈之構築經濟部中央標準局員工消費合作社印製 (請先閱讀^面之注**事項^^^舄本頁) 依照PCR法，藉CDR_接枝製作人型化#23-57_137-1抗體 L鏈。爲了製作具有來自人類抗體HSU03868(GEN-BANK ’ DeftosM·等，Scand.. J. Immunol.，3 9，95-103，1994) 之FR1、FR2及FR3，以及來自人類抗體S25755(NBRF-PDB)之FR4之人型化#23-57-137-1抗體L鏈（變型”a”），使用6個PCR引子。（ CDR-接枝引子MBC1LGP1(序列編號29)及MBC1LGP3( 序列編號30)具備有意義之DNA序列，而CDR接枝引子- ___ -59- Λ張尺度適削7S1S家標準（CNS ) A4規格（21(^ 297公釐1 一 "" ~ 1227140 A7 B7 五、發明説明（57 請閱讀背. 面之注意，事項本頁 MBC1LGP2(序列編號31)及MBC1LGP4(序列編號32)具有反義DNA序列，在各引子之兩端具有從15至21 bp之互補序列。外部引子MBC1LVS1(序列編號33)及MBC1LVR1( 序列編號34)與CDR接枝引子MBC1LGP1及MBC1LGP4具有同源性。 CDR-接枝引子 MBC1HGP1、MBC1HGP2 > MBC1HGP3 及MBC1HGP4用尿素變性聚丙烯醯胺凝膠分離（分子選殖 :實驗室手册，Sambrook等人，冷泉港實驗出版公司， 1989)，自凝膠之萃取以壓碎及浸泡法（分子選殖：實驗室手册，Sambrook等人，冷泉港實驗出版公司，1989)進行。經濟部中央標準局員工消費合作社印製亦即，將各1 nmole之CDR-接枝引子用6%變性聚丙烯醯胺凝膠分離，做爲目的物之大型DNA片段之固定係在矽膠薄膜板上照射紫外線而進行，用壓碎及浸泡法從凝膠回收，並溶於 20 μΐ 含 10mM Tris-HCl (pH 7.4)及 1 mM EDTA 之溶液中。PCR，係採用TaKaRa Ex Tag(寶酒公司製），於100 μΐ反應混合液中，在含有如上述調製之CDR-接枝引子 MBC1HGP1、MBC1HGP2、MBC1HGP3 及 MBC1HGP4 各 1 μΐ、0.2 5 mM dNTP 及 2·5 單位 TaKaRa Ex Tag 之條件下，使用隨附之緩衝液，然後進行94 °C 1分鐘，55 °C 1 分鐘及72 °C 1分鐘之溫度循環5次，再添加50 pm ole之外部引子MBC1HVS1及MBC1HVR1，進行同樣的溫度循環 30次。將藉PCR法增幅之DNA片段藉著W吏用4% Nu Sieve GTG瓊脂糖（FMC Bio. Products)之瓊脂糖凝膠電泳而分離。切取含有421 bp長之DNA片段之瓊脂糖片，用 -60- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） 1227140 A7 B7 經濟部中央標準局員工消費合作社印製五、發明説明（58 ) GENECLEAN II套組（BIO101)，依照套組所附之處方精製 DNA片段。將所得到之PCR混合物次選殖入用BamHI及 Hindlll消化所調製之pUC19。用M13引子-M4引子及M13 引子-RV引子決定鹼基序列，由於得到正確之序列，將該質體用Hind III及Blnl消化，然後將416 bp之片段藉1% 瓊脂糖凝膠電泳而分離。用GENECLEAN II套組（ΒΙΟΙ 01) ，依照套組所附之處方精製DNA片段。將所得到之PCR 混合物次選殖入用Hind III及Blnl消化所調製之質體C Λ /pUC19，並將其命名爲質體hMBClLa λ /pUC19。將該質體用EcoRI消化，將含有編碼人型化L鏈之序列導入質體 pCOSl中，並使人型化L鏈之開始密碼子位於EFla啓動子之下游。將如此所得之質體命名爲hMBCILa几/pCOSl。人型化L鏈變型”a’’之鹼基序列（包含對應之胺基酸）以序列編號66表示。又，變型a之胺基酸序列以序列編號47表示。依照PCR法用變異導入製作變型”b”。將變型”b’’設計成其中之43位（依照Kabat之規定，爲胺基酸編號43位）之甘胺酸更換爲脯胺酸，49位（依照Kabat之規定，爲胺基酸編號49位）之離胺酸更換爲天冬酿胺。藉著變異原引子 MBC1LGP5R(序列編號36)及引子MBC1LVS1 ，用質體 hMBCILa λ /pUC19做爲模板而進行PCR ，所得之DNA 片段用BamHI及Hindlll消化，然後次選殖入pUC19之 BamHI及Hindlll部位。決定鹼基序歹後，、用限制酶Hindlll 及Aflll消化，然後與經Hindlll及Aflll消化之hMBCILa λ /pUC19 連結。 -61 - 本纸張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） 1227140 Α7 Β7 五、發明説明（59 ) 請先閱讀背面之注·意事項本頁如此得到之質體稱爲hMBCILb凡/pUC19，將該質體用 EcoRI消化，繼而將含有編碼人型化L鏈之DNA之片段導入質體pCOSl，並使人型化L鏈之開始密碼子位於EFla 啓動子之下游。將如此所得之質體命名爲hMBClLb Λ /pCOSl 〇、\吕依照PCR法用變異導入製作變型nc”。將變型nc”設計成其中之84位（依照Kabat之規定，爲胺基酸編號80位）之絲胺酸更換爲脯胺酸。藉著變異原引子MBC1LGP6S(序列編號37)及引子以13-引子尺¥，用質體11以3<：11^几/?1；(：19做爲模板而進行PCR，所得到之DNA片段用BamHI及Hindlll 消化，然後次選殖入藉用BamHI及Hindlll消化所調製成之pUC19中。決定鹼基序列後，用限制酶BstPI及Aor51HI消化，然後與經BstPI及Aor51HI消化之hMBCILa λ /pUC19連結。如此得到之質體稱爲hMBCILc λ /pUC19 ，將該質體用 EcoRI消化，將含有編碼人型化L鏈之序列導入質體pCOSl 之EcoRI部位，並使人型化L鏈之開始密碼子位於EFloc啓動子之下游。將如此所得之質體命名爲hMBCILc又/pCOSl。經濟部中央標準局員工消費合作社印製依照PCR法用變異導入製作變型”d”、”e”及’’Γ。各變型依次被設計成將變型”a”，”b”及”c”之91位（依照Kabat之規定，爲胺基酸編號87位）之酪胺酸更換爲異白胺酸。藉著變異原引子MBC1LGP11R(序列（編號38)及引子 MSI(序列編號44)，各用質體hMBCILa又/pCOSl 、 hMB Cl Lb λ /pCOSl 及 hMBCILc λ /pCOSl ί故爲模板而進行 -62- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Λ4規格（210X297公釐） 1227140 A7 B7 五、發明説明（6〇 ) PCR，所得到之DNA片段用BamHI及Hindlll消化，然後次選殖入藉用BamHI及Hindlll消化所調製成之pUC19中。決定鹼基序列後，用限制酶Hindlll及Blnl消化，然後與經Hindlll及Blnl消化而調製成之C λ /pUC19連結。如此得到之質體依次稱爲hMBCILd λ /pUC19 ， hMBCILd儿/pUC19及hMBCILd几/pUC19。將此等質體用 EcoRI消化，將含有編碼人型化L鏈之序列之序列導入質體pCOSl之EcoRI部位，並使人型化L鏈之開始密碼子位於EF 1 α啓動子之下游。將如此所得之質體依次命名爲 hMBCILd λ /pCOSl 、 hMBCILe λ /pCOSl Ά. hMBCILf λ /pCOSl 〇經濟部中央標準局員工消費合作社印製依照PCR法用變異導入製作變型”g"及’’h”。各變型依次被設計成將變型’’a”，及’’d”之36位（依照Kabat之規定，爲胺基酸編號36位）之組胺酸更換爲酪胺酸。藉著使用變異原引子MBC1LGP9R(序列編號39)及M13引子RV做爲引子，用hMBCILa λ /pUC19做爲模板而進行PCR，用所得到之PCR產物及M13引子M4做爲引子，用質體hMBCILa λ /pUC 19做爲模板而再進行PCR。所得到之DNA片段用 Hindlll及Blnl消化，然後次選殖入藉用Hindlll及Blnl消化所調製成之C λ /pUC 19中。用該質體做爲模板，以及用引子^^〇(：11^?1311(序列編號40)及1^6(：11^51做爲引子而進行PCR。得到之PCR片段用Apal及Hindlll消化，然後導入經Apal及Hindlll消化之質體hMBCILa几/pUC 19及 hMBCILd λ /pUC19中。決定鹼基序列，將含有正確序列 -63- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Λ4規格（210X 297公釐） 1227140 Α7 Β7 經濟部中央標準局員工消費合作社印製五、發明説明（61 ) 之質體依次稱爲 hMBCILg λ /pUC19 及 hMBCILh λ /pUC19 。將此等質體用EcoRI消化，將含有人型化L鏈编碼序列之序列導入質體pCOSl之EcoRI部位，並使人型化L鏈之開始密碼子位於EF 1 α啓動子之下游。將如此所得之質體依次命名爲 hMBCILg λ /pCOSl 及 hMBCILh 又 /pCOSl 。依照PCR法用變異導入製作變型nin、nj”、”k”、”Γ、”m” 、” η”及”〇”。藉著使用變異原引子MBC1LGP14S(序列編號 41)及引子V1RV(A)(序列編號43)，用質體hMBCILa Λ /Puc 19做爲模板而進行PCR，所得到之DNΑ片段用Apal 及Blnl消化，然後次選殖入藉用Apal及Blnl消化所調製成之質體hMBCILg λ /pUC19中。決定鹼基序列，選擇對應於各變型之變異被導入之純系。如此得到之質體稱爲 hMBC lLx Λ /pUC 19(x = i，j，1，m，n，o)，將該質體用EcoRI消化，將含有編碼人型化L鏈之序列之序列導入質體pCOSl之EcoRI部位，並使人型化L鏈之開始密碼子位於EF 1 α啓動子之下游。將如此所得之質體依次命名爲 hMBC lLx λ /pCOS l(x = i，j，1，m，η，〇)。變型 ” j，，、"1，，、，，m，，及，，〇，，之鹼基序歹(包含對應之胺基酸）各以序列編號67，68，69及70表示。又，此等變型之胺基酸序列各以序列編號4 8，4 9，5 0及5 1表示。變型”p”、”q”、”r”、”s”、及”t”，爲變型 ”i”、"j”、”m” 、”Γ或之胺基酸序列之87位之酪胺酸置換爲異白胺酸之變型，其係利用在FR3内之限制酶Aor5 1Μ 1切斷部位，藉著將變型，，:h”與各變型”i”、”j，’、”πΓ、”1"或”〇”換接而製 -64 - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210X297公釐） (請先閲讀1面之注|事項^^^馬本頁 -裝、\二口 1227140 A7 -------B7__ 五、發明説明（62 ) 作。亦即藉著將表現載體hMBCILx A /pCOSl(x二i，j， m，1，〇)中之含有CDR3及FR3之一部份及FR4之 Aor51Hl片段514 bp去除，以及將表現質體hMBCILh λ /pCOSl中之含有CDR3及FR3之一部份及FR4之Aor51Hl 片段5 14 bp連接至該處，而將91位（依照Kabat之規定爲胺基酸序列編號87位）之酪胺酸更換爲異白胺酸。進行鹼基序列之決定，選擇各變型"i”、，，j，，、，，m”、，，1，，及之91 位（依照Kabat之規定爲胺基酸序列編號87位）之酪胺酸更換爲異白胺酸之純系，對應之變型各稱爲變型’’p”、”q"、 ”r”、，，s，，、及，，t”，所得之質體被命名爲hMBCILx又/pCOSl(x =p，q，s，I*，t)。將變型”q”、，，r”、，，s，，、及 ”t”之鹼基序列（包含對應之胺基酸）各以序列編號71，72，73及74 表示。又此等變型之胺基酸序列各以序列編號5 2，5 3， 54及55表示。將質體 hMBCILq λ /pCOSl 用 Hindlll 及 EcoRI 消化，並次選殖入用Hindlll及EcoRI消化之質體pUCl9中，將其命名爲質體 hMBCILq λ /pUC19。人型化L鏈之各變型中取代胺基酸之位置被示於表2中。經濟部中央標準局負工消費合作社印製 -65- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐"j 1227140 A7 B7 經濟部中央標準局員工消費合作社印製五、發明説明（63 ) 表2序列表中取代胺基酸之位置 (依照Kabat規定之胺基酸編號）

變型 36 43 45 47 49 80 87 a b P D c P d I e P D I f P I g Y h Y I i Y K j Y K D k Y K V 1 Y K V D m Y D n Y V 0 Y V D P Y K I q Y K D I r Y D I s Y K V D I t Y V D I -66- 本纸張尺度適用中國國家標準（CNS ) Λ4規格（210X 297公釐） 1227140 • A7 B7 五、發明説明（64 ) 表中，Y表示酪胺酸，P表示脯胺酸，κ表示離胺酸， V表示纈胺酸，D表示天冬醯胺及I表示異白胺酸。又，具有前述質體 hMBClHcDNA/pUC19 及 hMBCILq Λ /pUC19 之大腸桿菌稱爲大腸桿菌 JM109(hMBClHcDNA/pUC19)及大腸桿菌 JM109 (hMBCILq入/pUC19)，彼等於1997年9月24曰寄存於食品工業發展研究所（台灣省新竹市食品路33 1號）， JM109(hMBClHcDNA/pUC19)之寄存編號爲 CCRC940178 ，及 JM109(hMBClLq λ /pUC19)之寄存編號爲 CCRC940177 〇 (5)COS-7細胞之轉染爲了評價雜交抗體及人型化#23-5 7-13 7-1抗體之抗原結合活性及中和活性，使前述表現載體在C Ο S - 7細胞中進行過渡性表現。亦即在L鏈雜交抗體之一過渡性表現中，將質體 hMBCIHcDNA/pCOSI 與 mMBClL( Λ )/neo ， hMBCIHcDNA/pCOSI 與 m/hMBCILa λ /neo ， hMBCIHcDNA/pCOSI 與 hMBCILd λ /neo ，經濟部中央標準局員工消費合作社印？4 hMBCIHcDNA/pCOSI 與 hmmMBClL( λ )/neo 或者 hMBCIHcDNA/pCOSI 與 mhmMBCILa 几 /neo 加以組合，用 GenePulser裝置（BioRad)，藉電穿孔將其同時導入c〇S-7 細胞中。在COS-7細胞以1 X 107細胞/毫升之細胞濃度懸浮於PBS(_)之懸浮液中，加入各質體DNA、10 pg，並以1,500 V，25 pF之靜電容量施予脈衝。於室溫1〇分鐘之回復期間後，將被電穿孔之細胞懸浮於含有2%Ultra Low IgG牛 -67- ^紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210Χ297/^"Ϊ " — 1227140 經濟部中央標準局員工消費合作社印54 A7 -------B7__ 五、發明説明（65 ) —^ 胎兒血清（吉伯可公司）之DMEM培養液（吉伯可公司）中，用10 cm培養皿在C〇2培育器中培養。培養72小時後，收集培養上清液，藉離心分離除去細胞破片，然後供鹿至 ELISA之試料。在人型化#23-57-137-1抗體之過渡性表現上，將質體 hMBClHcDNA/pCOSl 與 hMBCILx A /pCOSl(x 二 a〜t)之任一者之組合，用Gene Pulser裝置（BioRad)，以與在前述雜交抗體之場合相同之方法轉形COS-7細胞，將得到之培養上清液供應至ELISA。又，雜交抗體或人型化抗體從COS-7細胞之培養上清液之精製，用 Affigel Protein A MAPSII 套組（BioRad)，依照套組隨付之處方進行。

(6)ELISA (i)抗體濃度之測定供抗體濃度測定用之ELISA平皿如下述調製。將供 ELIS A用之96孔平皿（Maxisorp, NUNC)之各孔，用以固相化緩衝劑（0.1M NaHC03、0.02% NaN3)調製成 1 pg/ ml 濃度之山羊抗人類IgG抗體（塔格公司）1〇〇 μΐ固相化，用200 μΐ 之稀釋緩衝液（50mM Tris-HCl、1 mM MgCl2、0.1M NaCl、0.05% Tween 20、0,02% NaN3、1% 牛血清白蛋白 (BSA)、pH7.2)封阻後，將表現雜交抗體或人型化抗體之 COS-7細胞之培養上清液或精製之雜交抗體或人型化抗體予以系列稀釋並加到各孔中。於室溫培育1小時並用 PBS-Tween20洗淨後，加入與鹼性磷酸酶結合之山羊抗人 -68- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（2丨0X 297公釐） (、請先閲讀^面之"意事項^^^寫本頁} 、=t 1227140 A7 B7 五、發明説明（66 ) 類IgG抗體（塔格公司）100 μΐ 。於室溫培育1小時並用 PBS-Tween 20洗淨後，加入1 mg/ml之基質溶液（西格瑪1〇4 ’對-硝基苯麟酸，西格瑪公司），接下來用微皿雷達 (BioRad)測定在405 nm之吸光度。用純化人類igGi ;[(結合部位）做爲濃度測定之標準。 (ii)抗原結合能力之測定在供抗原結合測定之ELISA平皿中，如下述調製。將 ELISA用之96孔平皿之各孔，用以固相化緩衝劑調製成i Kg/ml濃度之人類PTHrP(l-34)100 μΐ固相化，用200 μΐ之稀釋緩衝液封阻後，將表現雜交抗體或人型化抗體之 COS-7細胞之培養上清液或精製雜交抗體或人型化抗體予以系列稀釋並加到各孔中。於室溫培育並用PBS-Tween 20 洗淨後，加入與鹼性磷酸酶結合之山羊抗人類IgG抗體（塔格公司）100 μΐ。於室溫培育並用PBS-Tween 20洗淨後，加入1 mg/ml之基質溶液（西格瑪1〇4，對-硝基苯磷酸，西格瑪公司），接下來用微皿雷達（Bi〇Rad)測定在405 nm 之吸光度。 (7)活性確認 ⑴人型化Η鏈之評價將人型化Η鏈變型ff a”與嵌合L鏈組合而成之抗體與嵌合抗體具有同等之PTHrP結合能力（圖6)。該結果顯示Η鏈V 領域之人型化爲變型"a”。以下用人型化（η鏈變型”af，做爲人型化抗體之Η鏈。 (ii)雜交抗體之活性 ___ -69- 不紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210^7公釐） (請先閱讀背面之注^事項\^^馬本頁) 丨ri裝· 本訂經濟部中央標準局員工消費合作社印製 1227140 A7 B7 五、發明説明（67 ) (ii-a)FRl，2/FR3,4 雜交抗體請閱讀背· 1¾ 之注意事項 L鏈雖然在h/mMBClL( λ )之場合被認爲全無活性，但在 m/hMBCILa λ與hMBCILd凡之任一場合顯示與嵌合#23-57-1 37-1抗體具有同等的結合活性（圖7)，此等結果暗示 FR3，4在做爲人型化抗體上沒有問題，而在FR1，2内存在可取代之胺基酸殘基。 (ii-b)FRl/FR2 雜交抗體 L鏈雖然在mhmMBCILU )之場合被認爲全無活性，但在11111111^13(：11^(；1)之場合顯示與嵌合#23-5 7-13 7-1抗體具有同等的結合活性（圖8)。此等結果暗示FR1，2中之FR1 在做爲人型化抗體上沒有問題，而在FR2内存在可取代之胺基酸殘基。 (iii)人型化抗體之活性使用變型”a”至”t”之各個做爲L鏈之人型化抗體，並測定抗原活性。其結果顯示具有L鏈變型”j”、’T、”m”、”〇”、 ”q”、”r”、”s”、”t”之人型化抗體具有與嵌合抗體同等之PTHrP 結合能力（圖9〜12)。 (8)CH0安定產生細胞株之建立經濟部中央標準局員工消費合作社印製爲了建立人型化抗體之安定產生細胞株，將CH0細胞用表現質體 hMBCIHcDNA/pCHOl 與 MBCILm λ /pCOSl ’ hMBCIHcDNA/pCHOl 與 MBCILq λ /pCOSl ，或者 hMBCIHcDNA/pCHOl 與 hMBClLr 几 /pCOSl 力口以組合，用 GenePulser裝置（BioRad)藉電穿孔將其同時導入CH0細胞。各個表現載體用限制酶Pvul切斷而形成直鏈DNA，用 -70- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Λ4規格（210X 297公釐）經濟部中央標準局員工消費合作社印製 1227140 A7 五、發明説明（68 ) 〜紛及氯仿萃取後，藉乙醇沉澱回收DNA以備用於電穿孔。在CHO細胞以1 X丨〇7之細胞濃度懸浮於pBs(-)之懸浮液 ml 中，加入各質體〇νΑ 10 pg，並於 1,500 V，25 之靜電容量施加脈衝。於在室溫之10分鐘回復時間後，將被電穿孔之細胞懸浮於添加有10%牛胎兒血清（吉伯可公司）之MEM-α培養基（吉伯可公司）中，使用％孔平耻 (Falcon)，在C〇2培育器中培養。在培養開始後第二曰，添加10%牛胎兒血清（吉伯可公司）及500 mg/ml之 GENETICIN(G418硫酸鹽，吉伯可公司），更換不含核糖核甞酸或去氧核糖核甞酸之ΜΕΜ-α培養基（吉伯可公司）之選擇培養基’以選擇導入抗體基因之細胞。更換選擇培養基後，於2星期前後在顯微鏡下觀察細胞，確認細胞增殖良好後，用上述抗體濃度測定ELISA測定抗體產生量，然後選別抗體產生量多之細胞。擴大所建立之抗體之安定產產生細胞株之培養，將2〇/〇之Ultra Low IgG牛胎兒血清（GIBCO)添加至口-今-求卜；1/ 中，使用不含核糖核：y：酸或去氧核糖核苷酸之ΜΕΜ-α培養基，進行大量培養。於培養第3至4日後回收培養上清液，藉0.2 μηι之濾器（Millip0re)除去細胞破片。人型化抗體從CHO細胞之培養上清液中之精製，係使用p〇R〇S蛋白質A管柱（PerSeptive生物系統），並遵照ConSep LC 100 (Millipore)所附之處方進行，然後進行中、和活性之測定及在高#5血症模型動物中之藥效試驗。所得精製人型化抗體之濃度及抗原結合活性以上述ELIS A測定。 _____ -71 - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公楚） f請先閱讀背面之注^事項^4^^舄本頁j 裝，一=6 A7 B7 1227140 五、發明説明（69 ) [參考例5 ]中和活性之測定鼠抗體、嵌合抗體及人型化抗體之中和活性之測定係採用家鼠骨肉瘤細胞株ROS17/2.8_5來進行。亦即將 ROS17/2.8-5細胞在含1〇%牛胎兒血清（吉伯可公司）之 Ham’s F-12培養基（吉伯可公司）中，於c〇2培育器中培養。將ROS 17/2.8-5細胞以1〇4細胞/1〇〇)^/孔之量接種於96 孔平皿中並培養1日，然後更換成含4 mM氫化可的松及 iO%牛胎兒血清之Ham’S F-12培養基（吉伯可公司）。再培養3至4日後，在260 μΐ之Ham’s F-12培養基（吉伯可公司 )中洗淨，加入含有ImM異丁基-1-甲基黃嘌呤（IBMX，西格瑪公司）以及10%牛胎兒血清及10mM HEPES之Ham’s F_ 12，然後於37 °C培育30分鐘。

將測定中和活性之鼠抗體、嵌合抗體或人型化抗體系列 # 釋成 10 pg/ml、3.3 pg/ml、1.1 pg/ml 及 Ο · 3 7 pg/ml 之群’ 1〇 pg/ml、2 pg/ml、0.5 pg/ml 及 0.01 pg/ml 之群，或者 10pg/ml、5pg/ml、1.25pg/ml、0.63pg/ml 及 0.31 Pg/ml之群，然後與調製成4 ng/ml之PTHrP(l-3 4)等量混合，並將各抗體與PTHrP(l-34)之混合液80 μΐ添加至各孔中。各抗體之最終濃度爲上述抗體濃度之四分之一，卩丁沿？（1-3 4)之濃度爲11^/1111。於室溫處理30分鐘後，捨棄培養上清液，用PBS洗淨3次後，將細胞内之cAMP萃取至100 μΐ之0.3%鹽酸-95%乙醇中。在水流抽吸器中使鹽酸乙醇蒸發，添加cAMP ΕΙΑ套組（CAYMANCHEMICAL’S) 附屬之EIA缓衝液120 μΐ及萃取出cAMP後，依照cAMP EIA -72 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐）請先閱讀背 ιδ 冬 i 事項 ί 經濟部中央標準局員工消f合作社印製 1227140 A7 B7 五、發明説明（7〇 ) 套組（0八丫乂八1^(：11£1^1€八1^)隨附之處方測定〇八^^。結果，具有與嵌合抗體同等之抗原結合能力之L鏈變型之中，具有將91位之酪胺酸置換成異白胺酸之變型” q”，’V’，’’s” 及”t”之人型化抗體顯示近似於嵌合抗體之中和能力，其中變型q顯示更強之中和能力（圖13〜15)。產業上之利用可能性藉著本發明，可以提供阻害副曱狀腺激素相關胜肽 (PTHrP)與受器結合之物質做爲有效成分之惡病質治療劑。上述物質在惡病質模型動物之藥效試驗中，與對照群相較，顯示可以抑制體重減少，以及具有生存期間之延長效果，在做爲惡病質治療劑上有用。序列表序列編號：1 序列之長度：20 序列之類型：核酸股數··單股構型：直缝狀序列之種類：其他核酸（合成DNA) 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 (請先閱讀背面之注·意事項\^^寫本頁) 序列： AAATAGCCCT TGACCAGGCA 20 序列編號：2 、序列之長度：3 8 序列之類型：核酸 -73- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Λ4規格（210X 297公釐） 1227140 A7 B7 五、發明説明（71 ) 股數：單股構型：直鏈狀序列之種類：其他核酸（合成DNA) 序列： CTGGTTCGGC CCACCTCTGA AGGTTCCAGA ATCGATAG 38 序列編號：3 序列之長度：28 序列之類型·_核酸股數：單股構型：直鏈狀序列之種類：其他核酸（合成DNA) 序列： GGATCCCGGG CCAGTGGATA GACAGATG 28 經濟部中央標準局員工消費合作社印製序列編號：4 序列之長度：29 序列之類型：核酸股數：單股構型：直鏈狀序列之種類：其他核酸（合成DNA) 序列·· < GGATCCCGGG TCAGRGGAAG GTGGRAACA 29 -74- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） 1227140 A7 B7 經濟部中央標準局員工消費合作社印製五、發明説明（72 ) 序列編號：5 序列之長度·· 1 7 序列之類型：核酸股數：單股構型：直鍵狀序列之種類：其他核酸（合成DNA) 序列： CTTTTCCCAG TCACGAC 17 序列編號：6 序列之長度：17 序列之類型：核酸股數：單股構型：直鏈狀序列之種類··其他核酸（合成DNA) 序列： CAGGAAACAG CTATGAC 17 序列編號：7 序列之長度：3 1 序列之類型：核酸股數：單股構型：直鍵狀序列之種類：其他核酸（合成DNA) -75- 本纸張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） 1227140 A7 B7 五、發明説明（73 ) 序列： GTCTAAGCTT CCACCATGAA ACTTCGGGCT C 31 序列編號：8 序列之長度：3 0 序列之類型：核酸股數：單股構型：直鏈狀序列之種類：其他核酸（合成DNA) 序列： TGTTGGATCC CTGCAGAGAC AGTGACCAGA 30 序列編號：9 序列之長度：3 6 序列之類型：核酸股數：單股構型：直鏈狀序列之種類：其他核酸（合成DNA) 序列： · 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 GTCTGAATTC AAGCT丁CCAC CATGGGGTTT GGGC丁G 36 序列編说：1 〇 ' 序列之長度·· 4 1 序列之類型：核酸 -76- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） 1227140 A7 B7 五、發明説明（74 ) 股數：單股構型：直鏈狀序列之種類：其他核酸（合成DNA) 序列： TTTCCCGGGC CCTTGGTGGA GGCTGAGGAG ACGGTGACCA G 41 序列編號：11 序列之長度：109 序列之類型：核酸股數：單股構型：直鏈狀序列之種類：其他核酸（合成DNA) 序列： GTCTGAATTC AAGCTTAGTA CTTGGCCAGC CCAAGGCCAA CCCCACGGTC ACCCTGTTCC 60 CGCCCTCCTC TGAGGAGCTC CAAGCCAACA AGGCCACACT AGTGTGTCT 109 經濟部中央標隼局員工消費合作社印製序列編號：12 序列之長度：110 序列之類型：核酸股數：單股構型：直鍵狀序列之種類：其他核酸（合成DNA) 、序列： -77- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） 1227140 A7 B7 五、發明説明（75 ) GGTTTGGTGG TCTCCACTCC CGCCTTGACG GGGCTGCCAT CTGCCTTCCA GGCCACTGTC 60 ACAGCTCCCG GGTAGAAGTC ACTGATCAGA CACACTAGTG TGGCCTTGTT 110 序列編號：：13 序列之長度： 98 序列之類型： :核酸股數：單股構型__直鍵狀序列之種類：其他核酸（合成DNA) 序列： GGAGTGGAGA CCACCAAACC CTCCAAACAG AGCAACAACA AGTACGCGGC CAGCAGCTAC 60 CTGAGCCTGA CGCCCGAGCA GTGGAAGTCC CACAGAAG 98 序列編號： :14 序列之長度： 106 序列之類型：核酸股數：單股構型：直鏈狀序列之種類：其他核酸（合成DNA) 經濟部中央標準局員工消費合作社印製序列： TGTTGAATTC TTACTATGAA CATTCTGTAG GGGCCACTGT CTTCTCCACG GTGCTCCCTT 60 CATGCGTGAC CTGGCAGCTG TAGCTTCTGT GGGACTTCCA CTGCTO 106 序列編號：15 序列之長度：43 -78- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） 1227140 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A7 B7 五、發明説明（76 ) 序列之類型：核酸股數：單股構型：直鍵狀序列之種類··其他核酸（合成DNA) 序列： GTCTGAATTC AAGCTTAGTA CTTGGCCAGC CCAAGGCCAA CCC 43 序列編號：16 序列之長度：20 序列之類型：核酸股數：單股構型：直鏈狀序列之種類：其他核酸（合成DNA) 序列： TGTTGAATTC TTACTATGAA 20 序列編號：17 序列之長度：3 9 序列之類型··核酸股數：單股構型：直鏈狀序列之種類：其他核酸（合成DNA) ( 序列： CAACAAGTAC GCGGCCAGCA GCTACCTGAG CCTGACGCC 39 -79- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） (請先閲讀背面之注意事項本頁 -裝_ 訂 1227140 r 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A7 B7 五、發明説明（77) 序列編號：1 8 序列之長度：3 9 序列之類型··核酸股數：單股構型：直鏈狀序列之種類：其他核酸（合成DNA) 序列： GTAGCTGCTG GCCGCGTACT TGTTGTTGCT CTGTTTGGA 39 序列編號：19 序列之長度：46 序列之類型：核酸股數：單股構型：直鏈狀序列之種類：其他核酸（合成DNA) 序列： GTCTGAATTC AAGCTTAGTC CTAGGTCGAA CTGTGGCTGC ACCATC 46 序列編號·· 20 序列之長度：34 序列之類型：核酸股數：單股、構型：直鏈狀序列之種類：其他核酸（合成DNA) -80- 本纸張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 裝· 訂 1227140 A7 B7 五、發明説明（78 ) 序列： TGTTGAATTC TTACTAACAC TCTCCCCTGT TGAA 34 序列編號：21 序列之長度：3 5 序列之類型：核酸股數：單股構型：直鏈狀序列之種類：其他核酸（合成DNA) 序列： GTCTAAGCTT CCACCATGGC CTGGACTCCT CTCTT 35 序列編號：22 序列之長度：48 序列之類型：核酸股數：單股構型：直鏈狀序列之種類：其他核酸（合成DNA) 序列：經濟部中央標隼局員工消費合作社印製 TGTTGAATTC AGATCTAACT ACTTACCTAG GACAGTGACC TTGGTCCC 48 序列編號：2 3 序列之長度：128 序列之類型：核酸 -81 - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） 1227140 A7 B7 五、發明説明（79) 股數：單股構型：直鏈狀序列之種類：其他核酸（合成DNA) 序列： GTCTAAGCTT CCACCATGGG GTTTGGGCTG AGCTGGGTTT TCCTCGTTGC TCTTTTAAGA 60 GGTGTCCAGT GTCAGGTGCA GCTGGTGGAG TCTGGGGGAG GCGTGGTCCA GCCTGGGAGG 120 TCCCTGAG 128 序列編號：24 序列之長度：125 序列之類型：核酸股數：單股構型：直鍵狀序列之種類：其他核酸（合成DNA) 序列： ACCATTAGTA GTGGTGGTAG TTACACCTAC TATCCAGACA GTGTGAAGGG GCGATTCACC 60 ATCTCCAGAG ACAATTCCAA GAACACGCTG TATCTGCAAA 丁GAACAGCCT GAGAGCTGAG 120 GACAC 125 經濟部中央標準局員工消f合作社印製序列編號：25 序列之長度：132 序列之類型：核酸股數：單股構型：直鏈狀序列之種類：其他核酸（合成DNA) -82- 本紙張尺度適州中國國家標準（CNS ) Λ4規格（210X 297公釐） 1227140 A7 B7 五、發明説明（80 ) 序列： CTACCACCAC TACTAATGGT TGCCACCCAC 丁CCAGCCCC丁 TGCC丁GGAGC C丁GGCGGACC 60 CAAGACATGC CATAGCTACT GAAGGTGAAT CCAGAGGCTG CACAGGAGAG TCTCAGGGAC 120 CTCCCAGGCT GG 132 序列編號·· 26 序列之長度：11 〇序列之類型：核酸股數：單股構型：直鏈狀序列之種類：其他核酸（合成DNA) 序列： TGTTGGATCC CTGAGGAGAC GGTGACCAGG GTTCCCTGGC CCCAGTAAGC AAAGTAAGTC 60 ATAGTAGTCT GTCTCGCACA GTAATACACA GCCGTGTCCT CAGCTCTCAG 11〇經濟部中央標準局員工消費合作社印製序列編號：27 序列之長度·· 30 序列之類型：核酸股數：單股構型：直鏈狀序列之種類：其他核酸（合成DNA) 序列： GTCTAAGCTT CCACCATGGG GTTGGGCTG 30 序列編號：28 -83- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 1227140 A7 B7 五、發明説明（81 ) 序列之長度：3 0 序列之類型：核酸股數：單股構型：直鍵狀序列之種類：其他核酸（合成DNA) 序列： TGTTGGATCC CTGAGGAGAC GGTGACCAGG 30 序列編號：29 序列之長度：133 序列之類型：核酸股數··單股構型：直鏈狀序列之種類：其他核酸（合成DNA) 序列： ACAAAGCTTC CACCATGGCC TGGACTCCTC TCTTCTTCTT CTTTGTTCTT CATTGCTCAG 60 GTTCTTTCTC CCAGCTTGTG CTGACTCAAT CGCCCTCTGC CTCTGCCTCC CTGGGAGCCT 120 CGGTCAAGCT CAC 133 經濟部中央標準局員工消費合作社印製序列編號：3 0 序列之長度：11 8 序列之類型：核酸、股數：單股構型：直鏈狀序列之種類：其他核酸（合成DNA) -84- 本纸張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） 1227140 A7 B7 經濟部中央標隼局員工消費合作社印製五、發明説明（82) 序列： AGCAAGATGG AAGCCACAGC ACAGGTGATG GGATTCCTGA TCGCTTCTCA GGCTCCAGCT 60 CTGGGGCTGA GCGCTACCTC ACCATCTCCA GCCTCCAGTC TGAGGATGAG GCTGACTA 118 序列編號：3 1 序列之長度：128 序列之類型：核酸股數：單股構型：直鏈狀序列之種類：其他核酸（合成DNA) 序列： CTGTGGCTTC CATCTTGCTT AAGTTTCATC AAGTACCGAG GGCCCTTCTC TGGCTGCTGC 60 TGATGCCATT CAATGGTGTA CGTAC丁GTGC TGACTACTCA AGGTGCAGGT GAGCTTGACC 120 GAGGCTCC 128 序列編號：32 序列之長度：114 序列之類型：核酸股數：單股構型：直鍵狀序列之種類：其他核酸（合成DNA) 序列： CTTGGATCCG GGCTGACCTA GGACGGTCAG TTTGGTCCCT CCGCCGAACA CCCTCACAAA 60 TTGTTCCTTA ATTGTATCAC CCACACCACA GTAATAGTCA GCCTCATCCT CAGA 114 -85- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Λ4規格（210\ 297公釐) (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁填寫‘ 裝訂 1227140 經濟部中央標準局負工消費合作社印製 A7 B7 五、發明説明（83 ) 序列編號：3 3 序列之長度：1 7 序列之類型：核酸股數：單股構型：直鍵狀序列之種類：其他核酸（合成DNA) 序列： ACAAAGCTTC CACCATG 17 序列編號：3 4 序列之長度：19 序列之類型：核酸股數：單股構型：直鏈狀序列之種類：其他核酸（合成DNA) 序列： CTTGGATCCG GGCTGACCT 19 序列編號：3 5 序列之長度：7 5 序列之類型：核酸股數：單股、構型：直鏈狀序列之種類：其他核酸（合成DNA) 序列： -86- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） --------裝I (請先閲讀背面之注·意事項再填寫本頁訂經濟部中央標準局員工消費合作社印製 1227140 A7 B7 五、發明説明（84 ) CTTGGATCCG GGCTGACCTA GGACGGTCAG TTTGGTCCCT CCGCCGAACA GGTACACAAA 60 TTGTTCCTTA ATTGT 75 序列編號：36 序列之長度：43 序列之類型：核酸艰:數：單股構型：直鍵狀序列之種類：其他核酸（合成DNA) 序列： AAAGGATCCT TAAGATCCAT CAAGTACCGA GGGGGCTTCT CTG 43 序列編號：3 7 序列之長度：46 序列之類型：核酸股數：單股構型：直鏈狀序列之種類：其他核酸（合成DNA) 序列： ACAAAGCTTA GCGCTACCTC ACCATCTCCA GCCTCCAGCC TGAGGA 46 序列編號：3 8 序列之長度：111 ' 序列之類型··核酸股數：單股 -87- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） (請先閱讀如面之注•意事項寫本頁裝·

，1T 1227140 A7 B7 五、發明説明（85 ) 構型：直鏈狀序列之種類··其他核酸（合成DNA) 序列： CTTGGATCCG GGCTGACCTA GGACGGTCAG TTTGGTCCCT CCGCCGAACA CGTACACAAA 60 TTGTTCCTTA ATTGTATCAC CCACACCACA GATATAGTCA GCCTCATCCT C 111 序列編號：3 9 序列之長度：42 序列之類型：核酸股數：單股構型：直鏈狀序列之種類：其他核酸（合成DNA) 序列： CTTCTCTGGC TGCTGCTGAT ACCATTCAAT GGTGTACGTA CT 42 經濟部中央標準局員工消費合作社印製序列編號：40 序列之長度：26 序列之類型：核酸股數：單股構型：直鏈狀序列之種類：其他核酸（合成DNA) 序列：乂 CGAGGGCCCT TCTCTGGCTG CTGCTG 26 序列編號：41 -88- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） 1227140 A7 B7 五、發明説明（86 ) 序列之長度：3 5 序列之類型··核酸股數：單股構型：直鏈狀序列之種類：其他核酸（合成DNA) 序列： GAGAAGGGCC CTARGTACST GATGRAWCTT AAGCA 35 序列編號：42 序列之長度：3 5 序列之類型：核酸股數：單股構型：直鏈狀序列之種類：其他核酸（合成DNA) 序列： CACGAATTCA CTATCGATTC TGGAACCTTC AGAGG 35 經濟部中央標隼局員工消費合作社印製序列編號：43 序列之長度：18 序列之類型：核酸股數：單股構型：直鍵狀 \ 序列之種類：其他核酸（合成DNA) 序列： -89- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） 1227140 A7 B7 五、發明説明（87 )

GGCTTGGAGC TCCTCAGA 序列編號：44 序列之長度：20 序列之類型：核酸股數：單股構型：直鏈狀序列之種類：其他核酸（合成DNA) 序列：

GACAGTGGTT CAAAGTTTTT 序列編號：45 序列之長度：11 8 序列之類型：胺基酸構型：直鏈狀序列之種類：蛋白質序列：經濟部中央標隼局員工消費合作社印製

Gin Leu Val Leu Thr Gin Ser Ser Ser Ala Ser Phe Ser Leu Glv 1 5 10 15

Ala Ser Ala Lys Leu Thr Cys Thr Leu Ser Ser Gin His Ser Thr 2〇 25 30

Tyr Thr lie Glu Trp Tyr Gin Gin Gin Pro Leu Lys Pro Pro Lys 35 40 45

Tyr Val iMet Asp Leu Lys Gin Asp Gly Ser His Ser Thr Gly Asp 5〇 55 60 -90- 本纸張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） 1227140 A7 B7 五、發明説明（88 )

Gly He Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Ser Ser Gly Ala Asp Arg 65 70 7δ

Tyr Leu Ser He Ser Asn lie Gin Pro Glu Asp Glu Ala Met Tyr 80 85 -90

He Cys Gly Val Gly Asp Thr lie Lys Glu Gin Phe Val Tyr Val 95 100 105

Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Thr Val Leu Gly Gin Pro HO 115 序列編號：4 6 序列之長度：11 8 序列之類型：胺基酸構型：直鍵狀序列之種類：蛋白質序列：、

Glu Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Asp Leu Val Lys Pro Gly 1 5 10 15 經濟部中央標準局員工消費合作社印製

Gly Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser 20 25 30

Ser Tyr Gly Met Ser Trp lie Arg Gin Thr Pro Asp Lys Arg Leu 35 40 K 45

Glu Trp Val Ala Thr lie Ser Ser Gly Gly Ser Tyr Thr Tyr Tyr 50 55 60 -91 - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） 1227140 A7 B7 五、發明説明（89)

Pro Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr He Ser Arg Asp Asn Ala 65 70 75

Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gin Met Ser Ser Leu Lys Ser Glu Asp 8〇 85 90

Thr Ala Met Phe Tyr Cys Ala Arg Gin Thr Thr Met Thr Tyr Phe 95 100 105

Ala Tyr Trp Gly Gin Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala 110 115 序列編號：47 序列之長度：116 序列之類型：胺基酸構型：直鏈狀序列之種類··蛋白質序列：

Gin Leu Val Leu Thr Gin Ser Pro Ser Ala Ser Ala Ser Leu Gly 1 5 10 15 經滴部中央標隼局員工消費合作社印製

Ala Ser Val. Lys Leu Thr Cys Thr Leu Ser Ser Gin His Ser Thr 2〇 25 30

Tyr Thr He Glu Trp His Gin Gin Gin Pro Glu Lys Gly Pro Arg 35 40 { 45

Tyr Leu iMet Lys Leu Lys Gin Asp Gly Ser His Ser Thr Gly Asp 5〇 55 60 -92- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） 1227140 A7 B7 五、發明説明（9〇 ) •Gly lie Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Ser Ser Gly Ala Glu Arg 65 70 75

Tyr Leu Thr He Ser Ser Leu Gin Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr 80 85 90

Tyr Cys Gly Val Gly Asp Thr He Lys Glu Gin Phe Val Tyr Val 95 100 L05

Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly 110 115 序列編號：48 序列之長度：.1 1 8 序列之類型：胺基酸構型：直鏈狀序列之種類：蛋白質序列：

Gin Leu Val Leu Thr Gin Ser Pro Ser Alai Ser Ala Ser Leu Gly 1 5 l〇 15

Ala Ser Val Lys Leu Thr Cys Thr Leu Ser Ser Gin His Ser Thr 經濟部中央標隼局員工消費合作社印製 20 25 30

Tyr Thr He Glu.Trp Tyr Gin Gin Gin Pro Glu Lys Gly Pro Lys 35 40 45

Tyr Leu Met Asp Leu Lys Gin Asp Gly Ser His Ser Thr Gly Asp 5〇 55 60 -93- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） 1227140 A7 B7 五、發明説明（91 )

Gly lie Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Ser Ser Gly Ala Glu Arg 65 70 75

Tyr Leu Thr He Ser Ser Leu Gin Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr 80 85 90

Tyr Cys Gly Val Gly Asp Thr lie Lys Glu Gin Phe Val Tyr Val 95 100 105

Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Gin Pro no 115 序列編號：49 序列之長度：1 1 8 序列之類型：胺基酸構型：直鏈狀序列之種類：蛋白質序列：

Gin Leu Val Leu Thr Gin Ser Pro Ser Ala Ser Ala Ser Leu Gly 1 5 10 15

Ala Ser Val Lys Leu Thr Cys Thr Leu Ser Ser Gin His Ser Thr 2〇 25 30 經濟部中央標隼局員工消費合作社印製

Tyr Thr ΙΙθ Glu Trp Tyr Gin Gin Gin Pro Glu Lys Gly Pro Lys 35 40 45

Tyr Val· Met Asp Leu Lys Gin Asp Gly Ser His Se^ Thr Gly Asp 5〇 55 60

Gly lie Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Ser Ser Gly Ala Glu Arg -94 - 本纸張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） 1227140 A7 B7 五、發明説明（92) • 65 70 75

Tyr Leu Thr lie Ser Ser Leu Gin Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr 80 85 90

Tyr Cys Gly Val Gly Asp Thr He Lys Glu Gin Phe Val Tyr Val 95 100 105

Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Gin Pro 110 115 序列编號：50 序列之長度：11 8 序列之類型：胺基酸構型：直鏈狀序列之種類：蛋白質序列：

Gin Leu Val Leu Thr Gin Ser Pro Ser Ala Ser Ala Ser Leu Gly 1 . 5 10 15

Ala Ser Val Lys Leu Thr Cys Thr Leu Ser Ser Gin His Ser Thr 20 25 30 經濟部中央標準局員工消費合作社印繁丨 yr ’Ihr （;lu Trp Tyr (;ln Gin C!ln l)r() (;lu Lys (Hy f)r() Arg 35 40 45

Tyr Leu iVlet Asp Leu Lys Gin Asp Gly Ser His Se^： Thr Gly Asp 50 55 60

Gly lie Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Ser Ser Gly Ala Glu Arg 65 70 75 -95- &張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐) 1227140 A7 B7____ 五 I 經濟部中央標隼局員工消費合作社印製發明説明（93 ) ,Tyr Leu Thr lie Ser Ser Leu Gin Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr 80 85 90 Tyr Cys Gly Val Gly Asp Thr lie Lys Glu Gin Phe Val Tyr Veil 95 100 105

Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Gin Pro no 115 序列編號：5 1 序列之長度：Π8 序列之類型：胺基酸構型：直鏈狀序列之種類：蛋白質序列：

Gin Leu Val Leu Thr Gin Ser Pro Ser Ala Ser Ala Ser Leu Gly 15 10 15

Ala Ser Val Lys Leu Thr Cys Thr Leu Ser Ser Gin His Ser Thr 20 25 30

Tyr Thr He Glu Trp Tyr Gin Gin Gin Pro Glu Lys Gly Pro Arg 35 40 45

Tyr Vul Me'L Asp Leu Lys (;l.n Asp (;ly S(jr His Sc?r Thr (;ly Asp 50 55 60

Gly lie Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Ser Ser Gly《Ala Glu Arg 65 70 75

Tyr Leu Thr lie Ser Ser Leu Gin Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr 80 85 90 -96- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） 1227140 A7 B7 經濟部中央標準局0貝工消費合作社印製五、發明説明（ 94 ) .Tyr Cys Gly Val Gly Asp Thr lie Lys Glu Gin Phe Val Tyr Val - 95 100 105 Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Gin Pro 110 115 序列編號： 52 序列之長度： 118 序歹 J之類型：胺基酸構型：直鏈狀序歹 J之種類：蛋白質序歹 J : Gin Leu Val Leu Thr Gin Ser Pro Ser Ala Ser Ala Ser Leu Gly 1 5 1( ) 15 Ala Ser Val Lys Leu Thr Cys Thr Leu Ser Ser Gin His Ser Thr 20 25 30 Tyr Thr He Glu Trp Tyr Gin Gin Gin Pro Glu Lys Gly Pro Lys 35 40 45 Tyr Leu Met Asp Leu Lys Gin Asp Gly Ser His Ser Thr Gly Asp 50 55 60 (]I y lie Pro A.sp Arg Phe Ser U1 y wSer Ser Sur (；1 y Λ la (；1 u Arg 65 70 75 Tyr Leu Thr lie Ser Ser Leu Gin Ser Glu Asp Glu^ Ala Asp Tyr 80 85 90 lie Cys Gly Val Gly Asp Thr lie Lys Glu Gin Phe Val Tyr Val 95 100 105 - 97- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） 1227140 A7 B7 經濟部中央標準局員工消費合作社印製五、發明説明（95 ) Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Gin Pro '110 115 序列編號： 53 序列之長度： 118 序列之類型：胺基酸構型：直鏈狀序列之種類：蛋白質序列： Gin Leu Val Leu Thr Gin Ser Pro Ser Ala Ser Ala Ser Leu Gly 1 δ 10 15 Ala Ser Val Lys Leu Thr Cys Thr Leu Ser Ser Gin His Ser Thr 20 25 30 Tyr Thr lie Glu Trp Tyr Gin Gin Gin Pro Glu Lys Gly Pro Arg 35 40 45 Tyr Leu Met Asp Leu Lys Gin Asp Gly Ser His Ser Thr Gly Asp 50 55 60 Gly lie Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Ser Ser Gly Ala Glu Arg 65 70 75 Tyr Leu Thr lie Ser Ser Leu Gin Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr 80 85 90 lie Cys Gly Val Gly Asp Thr lie Lys Glu Gin Phe ' Val Tyr Val 95 100 105 Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Gin Pro 110 115 -98- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） 1227140 A7 B7 五、發明説明（96) 序列編號：54 序列之長度：1 1 8 序列之類型：胺基酸構型：直鏈狀序列之種類：蛋白質序列：

Gin Leu Val Leu Thr Gin Ser Pro Ser Ala Ser Ala Ser Leu Gly 1 δ 10 15

Ala Ser Val Lys Leu Thr Cys Thr Leu Ser Ser Gin His Ser Thr 20 25 30

Tyr Thr lie Glu Trp Tyr Gin Gin Gin Pro Glu Lys Gly Pro Lys 35 40 45

Tyr Val Met Asp Leu Lys Gin Asp Gly Ser His Ser Thr Gly Asp 50 55 - 60

Gly lie Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Ser Ser Gly Ala Glu Arg 65 70 75

Tyr Leu Thr Ι1θ Ser Ser Leu Gin Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr 80 85 90 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 lie Cys Gly Val Gly Asp Thr He Lys Glu Gin Phe Val Tyr Val 95 100 105

Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Gin Pro 110 115 ' 序列編號：55 -99- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） 1227140 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A7 B7 五、發明説明（97) 序列之長度：11 8 序列之類型：胺基酸構型：直鏈狀序列之種類：蛋白質序列：

Gin Leu Val Leu Thr Gin Ser Pro Ser Ala Ser Ala Ser Leu Gly 1 5 10 15

Ala Ser Val Lys Leu Thr Cys Thr Leu Ser Ser Gin His Ser Thr 20 25 30

Tyr Thr He Glu Trp Tyr Gin Gin Gin Pro Glu Lys Gly Pro Arg 3o 40 45

Tyr Val Met Asp Leu Lys Gin Asp Gly Ser His Ser 丁hr Gly Asp 50 55 60

Gly lie Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Ser Ser Gly Ala Glu Arg 65 70 75

Tyr Leu Thr lie Ser Ser Leu Gin Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr 80 85 90 lie Cys Gly Val Gly Asp Thr He Lys Glu Gin Phe Val Tyr Val 95 100· 105

Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Gin Pro 110 115 . \ 序列编號：56 序列之長度：Π8 _-100- _ 本纸張尺度適用中國國家標準（CNS) A4規格（210x 297公釐1 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) -裝· 訂 1227140 A7 B7 五、發明説明（98 ) 序列之類型：胺基酸構型：直鏈狀序列之種類：蛋白質序列：

Gin Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gin Pro Gly 15 10 15

Arg Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser 20 25 30

Ser Tyr Gly Met Ser Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu 35 40 45

Glu Trp Val Ala Thr He Ser Ser Gly Gly Ser Tyr Thr Tyr Tyr 50 55 60

Pro Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr lie Ser Arg Asp Asn Ser 65 70 75

Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp 80 85 90

Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Gin Thr Thr Met Thr Tyr Phe 95 100 105 經濟部中夾標準局工消费合作社印裝

Ala Tyr Trp Gly Gin Gly Thr Lou Val Thr Val Ser Ser 110 115 . 序列編號：5 7 序列之長度：4 1 1 序列之類型：核酸 -101 - 長尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐) 1227140 A7 B7 經濟部中央標準局員工消费合作社印餐五、發明説明 (99 ) 股數：雙股構型：直鏈狀序列之種類：從 mRNA反錄之 cDNA 序列： ATG AAC TTC GGG CTC AGC TTG ATT TTC CTT GCC CTC ATT TTA AAA 45 Met Asn Phe Gly Leu Ser Leu lie Phe Leu Ala Leu lie Leu Lys -15 -10 -5 GGT GTC CAG TGT GAG GTG CAA CTG GTG GAG TCT GGG GGA GAC TTA 90 Gly Val Gin Cys Glu Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Asp Leu 1 10 GTG AAG CCT GGA GGG TCC CTG AAA CTC TCC TGT GCA GCC TCT GGA 135 Val Lys Pro Gly Gly Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly 15 20 25 TTC ACT TTC AGT AGC TAT GGC ATG TCT TGG ATT CGC CAG ACT CCA 180 Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Gly Met Ser Trp lie Arg Gin Thr Pro 30 35 40 GAC AAG AGG CTG GAG TGG GTC GCA ACC ATT AGT. AGT GGT GGT AGT 225 Asp Lys Arg Leu Glu Trp Val Ala Thr He Ser Ser Gly Gly Ser 45 h() 55 TAC ACC I'AC 'm， (ΧΛ GAC Λ(/Γ GTG AAG GGG CGA I'TC ACC ATC TCC 270 Tyr Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr lie Ser 60 65 70 AGA GAC AAT GCC AAG AAC ACC CTA TAC CTG CAA ATG AGC AGT CTG 315 Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gin Met Ser Ser Leu 75 80 85 • _ 102 瞒本紙張尺度適用中國國家標準（（:NS ) Λ4規格（21 OX 297公釐） 1227140 A7 B7 五、發明説明（100) AAG TCT GAG GAC ACA GCC ATG TTT TAC TGT GCA AGA CAG ACT ACT 360

Lys Ser Glu Asp Thr Ala Met Phe Tyr Cys Ala Arg Gin Thr Thr 90 95 100 ATG ACT TAC TTT GCT TAC TGG GGC CAA GGG ACT CTG GTC ACT GTC 405

Met Thr Tyr Phe Ala Tyr Trp Gly Gin Gly Thr Leu Val Thr Val 105 110 115 TCT GCA 411 Ser Ala 序列編號：5 8 序列之長度：4 11 序列之類型：核酸股數：雙股構型：直鏈狀序列之種類：從mRNA反錄之cDNA 序列： ATG GGG TTT GGG CTG AGC TGG GTT TTC CTC GTT GCT CTT TTA AGA 45

Met Gly Phe Gly Leu Ser Trp Val Phe Leu Val Ala Leu Leu Arg -15 -10 ~5 經濟部中央標準局員工消费合作社印製 (;(;T (;TC TCT CAG CTG CAG CTO (;π; (;Λ(; 丁(;(;Λ (;(;C GTG ；)()

Gly Val Gin Cys Gin Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val 1 5 10 GTC CAG CCT GGG AGG TCC CTG AGA CTC TCC TGT GCA GCC TCT GGA 135

Val Gin Pro Gly Arg Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly 15 20 25 -103- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） 1227140 A7 B7 經濟部中央標準局员工消費合作社印製五、發明説明 (101) TTC ACC TTC AGT AGC TAT GGC ATG TCT TGG GTC CGC CAG GCT CCA 180 Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Gly Met Ser Trp Val Arg Gin Ala Pro 30 35 40 GGC AAG GGG CTG GAG TGG GTG GCA ACC ATT AGT AGT GGT GGT AGT 225 Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala Thr lie Ser Ser Gly Gly Ser 45 50 55 TAC ACC TAC TAT CCA GAC AGT GTG AAG GGG CGA TTC ACC ATC TCC 270 Tyr Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr lie Ser 60 65 70 AGA GAC AAT TCC AAG AAC ACG CTG TAT CTG CAA ATG AAC AGC CTG 315 Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gin Met Asn Ser Leu 75 80 85 AGA GCT GAG GAC ACG GCT GTG TAT TAC TGT GCG AGA CAG ACT ACT 360 Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Gin Thr Thr 90 95 100 ATG ACT TAC TTT GCT TAC TGG GGC CAG GGA ACC CTG GTC ACC GTC 405 Met Thr Tyr Phe Ala Tyr Trp Gly Gin Gly Thr Leu Val Thr Val 105 110 115 TCC TCA 411 Sor Sor 序列編號： 59 序列之長度： 11 序列之類型：胺基酸 -104 - 本纸張尺度適用中國國家標準（CNS ) Λ4規格（2丨OX 297公釐） 1227140 A7 B7 經濟部中央標準局員工消費合作社印製五、發明説明（1〇2) 構型：直鏈狀序列之種類：胜肽序列： Lys Ala Ser Gin Asp Val Asn Thr Ala Val Ala 1 5 1() 序列編號：60 序列之長度：7 序列之類型··胺基酸構型：直鏈狀序列之種類：胜肽序列： Ser Ala Ser Asn Arg Tyr Thr 1 5 序列編號：61 序列之長度：9 序列之類型：胺基酸構型：直鏈狀序列之種類：胜肽序列： Gin Gin His Tyr Ser Thr Pro Phe Thr 1 5 -105- (請先閱讀背面之注r事項再^一馬本頁裝- 、-口本纸張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） 1227140 A7 B7 五、發明説明（) •序列編號：62 序列之長度：5 序列之類型：胺基酸構型：直鏈狀序列之種類：胜肽序列：

Pro Tyr Trp Met Gin 1 5 序列編號·· 63 序列之長度：16 序列之類型：胺基酸構型：直鏈狀序列之種類：胜肽序列：

Ser He Phe Gly Asp Gly Asp Thr Arg Tyr Ser Gin Lys Phe Lys Gly 1 5 10 15 經滴部中央標準局員工消費合作社印製序列編號：64 序列之長度：11 序列之類型··胺基酸構型：直鍵狀序列之種類：胜肽序列： -106- 本纸張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） 1227140 A7 B7__ 五、發明説明（1〇4) *Gly Leu Arg Arg Gly Gly Tyr Tyr Phe Asp Tyr 1 5 l〇序列編號：65 序列之長度：4 11 序列之類型：核酸股數：雙股構型：直鏈狀序列之種類··從mRNA反錄之cDNA 序列： ATG GCC TGG ACT CCT CTC TTC TTC TTC TTT GTT CTT CAT TGC TCA 45

Met Ala Trp Thr Pro Leu Phe Phe Phe Phe Val Leu His Cys Ser -15 -10 - 5 GGT TCT TTC TCC CAA CTT GTG CTC ACT CAG TCA TCT TCA GCC TCT 90

Gly Ser Phe Ser Gin Leu Val Leu Thr Gin Ser Ser Ser Ala Ser 1 5 10 TTC TCC CTG GGA GCC TCA GCA AAA CTC ACG TGC ACC TTG AGT AGT 135

Phe Ser Leu Gly Ala Ser Ala Lys Leu Thr Cys Thr Leu Ser Ser 經濟部中央標隼局員工消費合作社印製 15 20 L)r)

CAG CAC AGT ACG TAC ACC ATT GAA TGG TAT CAG CAA CAG CCA CTC ISO

Gin His Ser Thr Tyr Thr lie Glu Trp Tyr Gin Gin Gin Pro Leu 30 35 40 AAG CCT CCT AAG TAT GTG ATG GAT CTT AAG CAA GAT GGA AGC CAC · 225

Lys Pro Pro Lys Tyr Val Met Asp Leu Lys Gin Asp Gly Ser His 45 50 55 -107 - 尺度適則7國醉辦·（ CNS ) Λ4規格（2lQx 297公潑） 1227140 A7 B7 五、發明説明（1〇5) AGC ACA GGT GAT GGG ATT CCT GAT CGC TTC TCT GGA TCC AGC TCT 270

Ser Thr Gly Asp Gly lie Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Ser Ser 60 65 70 GGT GCT GAT CGC TAC CTT AGC ATT TCC AAC ATC CAG CCA GAA GAT 315

Gly Ala Asp Arg Tyr Leu Ser lie Ser Asn lie Gin Pro Glu Asp 75 80 85 GAA GCA ATG TAC ATC TGT GGT GTG GGT GAT ACA ATT AAG GAA CAA 360

Glu Ala Met Tyr He Cys Gly Val Gly Asp Thr He Lys Glu Gin 90 95 100 TTT GTG TAT GTT TTC GGC GGT GGG ACC AAG GTC ACT GTC CTA GGT 405

Phe Val Tyr Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Thr Val Leu Gly 105 110 115 · CAG CCC 411 Gin Pro 經濟部中央標準局員工消費合作社印製序列編號：66 序列之長度：405 序列之類型··核酸股數：雙股構型：直鏈狀序列之種類：從mRNA反錄之cDNA 序歹: -108 - 本紙張尺度埼用中國國家標準（CNS ) Λ4規格（210X 297公釐） 1227140 A7 B7 經濟部中央標準局員工消費合作社印製五、發明説明 (106) ATG GCC TGG ACT CCT CTC TTC TTC TTC TTT GTT CTT CAT TGC TCA 45 Met Ala Trp Thr Pro Leu Phe Phe Phe Phe Val Leu His Cys Ser -15 -10 -δ GGT TCT TTC TCC CAG CTT GTG CTG ACT CAA TCG CCC TCT GCC TCT 90 Gly Ser Phe Ser Gin Leu Val Leu Thr Gin Ser Pro Ser Ala Ser 1 j 5 10 GCC TCC CTG GGA GCC TCG GTC AAG CTC ACC TGC ACC TTG AGT AGT 135 Ala Ser Leu Gly Ala Ser Val Lys Leu Thr Cys Thr Leu Ser Ser 15 20 25 CAG CAC AGT ACG TAC ACC ATT GAA TGG CAT CAG CAG CAG CCA GAG 180 Gin His Ser Thr Tyr Thr lie Glu Trp His Gin Gin Gin Pro Glu 30 35 40 AAG GGC CCT- CGG TAC TTG ATG AAA CTT AAG CAA GAT GGA AGC CAC 225 Lys Gly Pro Arg Tyr Leu Met Lys Leu Lys Gin Asp Gly Ser His 45 50 55 AGC ACA GGT GAT GGG ATT CCT GAT CGC TTC TCA GGC TCC AGC TCT 270 Ser Thr Gly Asp Gly lie Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Ser Ser 60 65 70 GGG GCT GAG CGC TAC CTC ACC ATC TCC AGC CTC CAG TCT GAG GAT 315 Gly Λ1 a Glu Ari? Tyr Leu Thr Tie Sor Ser Leu Gin Ser Glu Asp 75 80 85 GAG GCT GAC TAT TAC TGT GGT GTG GGT GAT ACA ATT AAG GAA CAA 360 Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gly Val Gly Asp Thr lie Lys Glu 1 Gin 90 95 100 109 本纸張尺度適用中國國家標準（CNS ) Λ4規格（21 OX 297公釐） 1227140 A7 B7 五、發明説明（1〇7) TTT GTG TAC GTG TTC GGC GGA GGG ACC AAA CTG ACC GTC CTA GGT 405

Phe Val Tyr Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly 105 110 115 序列編號：67 序列之長度：4 11 序列之類蜇：核酸股數：雙股構型：直鏈狀序列之種類：從mRNA反錄之cDNA 序列： ATG GCC TGG ACT CCT CTC TTC TTC TTC TTT GTT CTT CAT TGC TCA 45 iVIet Ala Trp Thr Pro Leu Phe Phe Phe Phe Val Leu His Cys Ser -15 -10 -5 GGT TCT TTC TCC CAG CTT GTG CTG ACT CAA TCG CCC TCT GCC TCT 90

Gly Ser Phe Ser Gin Leu Val Leu Thr Gin Ser Pro Ser Ala Ser 1 5 10 GCC TCC CTG GGA GCC TCG GTC AAG CTC ACC TGC ACC TTG AGT AGT 135 經濟部中央標準局員工消費合作社印製

Ala Ser Leu Gly Ala Sor Val Lys Leu Thr Cys Thr Leu Ser Ser 15 20 25 CAG CAC AGT ACG TAC ACC ATT GAA TGG TAT CAG CAG CAG CCA GAG 180

Gin His Ser Thr Tyr Thr lie Glu Trp Tyr Gin Gin Gin Pro Glu 30 35 40 -110- _ 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 1227140 A7 B7 五、發明説明（1〇8) AAG GGC CCT AAG TAC CTG ATG GAT CTT AAG CAA GAT GGA AGC CAC 225

Lys Gly Pro Lys Tyr Leu Met Asp Leu Lys Gin Asp Gly Ser His 45 50 55 AGC ACA GGT GAT GGG ATT CCT GAT CGC TTC TCA GGC TCC AGC TCT 270

Ser Thr Glv Asp Gly lie Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Ser Ser 60 65 70 GGG GCT GAG CGC TAC CTC ACC ATC TCC AGC CTC CAG TCT GAG GAT 315

Gly Ala Glu Arg Tyr Leu Thr lie Ser Ser Leu Gin Ser Glu Asp 75 80 85 GAG GCT GAC TAT TAC TGT GGT GTG GGT GAT ACA ATT AAG GAA CAA 360

Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gly Val Gly Asp Thr lie Lys Glu Gin 90 95 100 TTT GTG TAC GTG TTC GGC GGA GGG ACC AAA CTG ACC GTC CTA GGC 405

Phe Val Tyr Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly 105 110 115 CAG CCC - 411

Gin Pro 經濟部中央標隼局員工消費合作社印序列編號：68 序列之長度：4 1 1 序列之類型：核酸股數：雙股構型：直鏈狀序列之種類：從mRNA反錄之cDNA 序列： -111- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Λ4規格（210X 297公釐） 1227140 A7 B7 經濟部中央標隼局員工消费合作社印製五、發明説明（109) ATG GCC TGG ACT CCT CTC TTC TTC TTC TTT GTT CTT CAT TGC TCA 45

Met Ala Trp Thr Pro Leu Phe Phe Phe Phe Val Leu His Cys Ser 一 15 -10 一 5 GGT TCT TTC TCC CAG CTT GTG CTG ACT CAA TCG CCC ：TCT GCC TCT 90 Gly Ser Phe Ser Gin Leu Val Leu Thr Gin Ser Pro Ser Ala Ser 1 5 10 GCC TCC CTG GGA GCC TCG GTC AAG CTC ACC TGC ACC TTG AGT AGT 135 Ala Ser Leu Gly Ala Ser Val Lys Leu Thr Cys Thr Leu Ser Ser 15 20 25 CAG CAC AGT ACG TAC ACC ATT GAA TGG TAT CAG •CAG CAG CCA GAG ISO Gin His Ser Thr Tyr Thr lie Glu Trp Tyr Gin Gin Gin Pro Glu 30 35 40 AAG GGC CCT AAG TAC GTG ATG GAT CTT AAG CAA GAT GGA AGC CAC 225 Lys Gly Pro Lys Tyr Val Met Asp Leu Lys Gin Asp Gly Ser His 45 50 55 AGC ACA GGT GAT GGG ATT CCT GAT CGC TTC TCA GGC TCC AGC TCT 270 Ser Thr Gly Asp Gly lie Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Ser Ser 60 65 70 GGG GCT GAG CGC TAC CTC ACC ATC TCC AGC CTC CAG TCT GAG GAT 315 G1 y Ala Glu Arg Tyr Leu Thr He Sor Sor Lou Gin Ser Glu Asp 75 80 85 GAG GCT GAC TAT TAC TGT GGT GTG GGT GAT ACA ATT AAG GAA CAA 360 Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gly Val Gly Asp Thr lie Lys Glu丨 Gin 90 95 100 -112- 本纸張尺度適用中國國家標率（CNS ) Λ4規格（2l〇X 297公釐) 1227140 A7 B7 五、發明説明（11〇) TTT GTG TAC GTG TTC GGC GGA GGG ACC AAA CTG ACC GTC CTA GGC 405

Phe Val Tyr Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly 105 110 115 CAG CCC 411 Gin Pro 序列編號：69 序列之長度：4 11 序列之類型：核酸股數：雙股構型：直鏈狀序列之種類··從mRNA反錄之cDNA 序列： ATG GCC TGG ACT CCT CTC TTC TTC TTC TTT GTT CTT CAT TGC TCA 45

Met 八la Trp Thr Pro Leu Phe Phe Phe Phe Val Leu His Cys Ser -15 f -10 -5 GGT TCT TTC TCC CAG CTT GTG CTG ACT CAA TCG CCC TCT GCC TCT 90

Gly Ser Phe Ser Gin Leu Val Leu Thr Gin Ser Pro Ser Ala Ser 經濟部中夾標準局負工消費合作社印製 1 5 10 TCC CT(; (;ΓΜ (;CC TCG CTC ΛΛ(; CTC 135

Ala Ser Leu Gly Ala Ser Val Lys Leu Thr Cys Thr Leu Ser Ser 15 * 20 25 ' CAG CAC AGT ACG TAC ACC ATT GAA TGG TAT CAG CAG CAG CCA GAG 180

Gin His Ser Thr Tyr Thr lie Glu Trp Tyr Gin Gin Gin Pro Glu ' 30 35 40 _^_-113- _ 本纸張尺度適用中國國家標準（CNS ) Λ4規格（2lOX 297公釐） 1227140 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A7 B7五、發明説明（111) AAG GGC CCT AGG TAC CTG ATG GAT CTT AAG CAA GAT GGA AGC CAC 225 Lys Gly Pro Arg Tyr Leu Met Asp Leu Lys Gin Asp Gly Ser His 45 50 55 AGC ACA GGT GAT GGG ATT CCT GAT CGC TTC TCA GGC TCC AGC TCT 270 Ser Thr Gly Asp Gly lie Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Ser Ser 60 65 70 GGG GCT GAG CGC TAC CTC ACC ATC TCC AGC CTC CAG TCT GAG GAT 315 Gly Ala Glu· Arg Tyr Leu Thr lie Ser Ser Leu Gin Ser Glu Asp 75 80 85 GAG GCT GAC TAT TAC TGT GGT GTG GGT GAT ACA ATT AAG GAA CAA 360 Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gly Val Gly Asp Thr He Lys Glu Gin 90 95 100 TTT GTG TAC GTG TTC GGC GGA GGG ACC AAA CTG ACC GTC CTA GGC 405 Phe Val Tyr Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly 105 110 115 CAG CCC 411 Gin Pro 序列編號：70 序列之長度：4 1 1 序列之類型：核酸股數：雙股構型：直鏈狀序列之種類：從mRNA反錄之cDNA 序列： -114- 本紙張尺度適用中國國家標準fcNS ) Λ4規格（210X 297公釐) 1227140 A7 B7 五、發明説明（112) ATG GCC TGG ACT CCT CTC TTC TTC TTC TTT GTT CTT CAT TGC TCA 45

Met Ala Trp Thr Pro Leu Phe Phe Phe Phe Val Leu His Cys Ser -15 -10 -5 GGT TCT TTC TCC CAG CTT GTG CTG ACT CAA TCG CCC TCT GCC TCT 90

Gly Ser Phe Ser Gin Leu Val Leu Thr Gin Ser Pro Ser Ala Ser 1 5 l〇 GCC TCC CTG GGA GCC TCG GTC AAG CTC ACC TGC ACC TTG AGT AGT 135

Ala Ser Leu Gly Ala Ser Val Lys Leu Thr Cys Thr Leu Ser Ser 15 20 25 CAG CAC AGT ACG TAC ACC ATT GAA TGG TAT CAG CAG CAG CCA GAG 180

Gin His Ser Thr Tyr Thr lie Glu Trp Tyr Gin Gin Gin Pro Glu 30 35 40 AAG GGC CCT AGG TAC GTG ATG GAT CTT AAG CAA GAT GGA AGC CAC 225

Lys Gly Pro Arg Tyr Val Met Asp Leu Lys Gin Asp Gly Ser His 45 50 55 AGC ACA GGT GAT GGG ATT CCT GAT CGC TTC TCA GGC TCC AGC TCT 270

Ser Thr Gly Asp Gly lie Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Ser Ser 60 65 70 GGG GCT GAG CGC TAC CTC ACC ATC TCC AGC CTC CAG TCT GAG GAT 315 經濟部中央標隼局員工消費合作社印製

Gly Λ la Glu Arg Tyr Leu Thr lie Ser Ser Leu Gin Ser Glu Asp 75 80 85. GAG GCT GAC TAT TAC TGT GGT GTG GGT GAT ACA ATT AAG GAA CAA 360

Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gly Val Gly Asp Thr lie Lys Glu Gin 90 95 100 -115- 本纸張尺度適用中國國家標準（CNS ) Λ4規格（210X 297公釐） 1227140 A7 ____ B7 五、發明説明（113) TTT GTG TAC GTG TTC GGC GGA GGG ACC AAA CTG ACC GTC CTA GGC 405

Phe Val Tyr Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly 105 110 115 CAG CCC 411 Gin Pro 序列編號：71 序列之長度：4 11 序列之類型：核酸股數：雙股構型：直鏈狀序列之種類：從mRNA反錄之cDNA 序列： -— _______________ ATG GCC TGG ACT CCT CTC TTC TTC TTC TTT GTT CTT CAT TGC TCA 45

Met Ala Trp Thr Pro Leu Phe Phe Phe Phe Val Leu His Cys Ser -15 * -10 -5 GGT TCT TTC TCC CAG CTT GTG CTG ACT CAA TCG CCC TCT GCC TCT 90

Gly Ser Phe Ser Gin Leu Val Leu Thr Gin Ser Pro Ser Ala Ser 1 5 10 經濟部中央標準局貨工消費合作社印製 (;CC TCC CTG GGA GCC TCG GTC ΛΛΓ; CTC ACC TGC ACC TTG ACT AGT 135

Gin His Ser Thr Tyr Thr lie Glu Trp Tyr Gin Gin Gin Pro Glu 30 35 40 -116-___ 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Λ4ϋ格（2l〇X297公f ) 1227140 A7 B7 五、發明説明（114) • AAG GGC CCT AAG TAC CTG ATG GAT CTT AAG CAA GAT GGA AGC CAC 225 Lys Gly Pro Lys Tyr Leu Met Asp Leu Lys Gin Asp Gly Ser His 45 50 55 AGC ACA GGT GAT GGG ATT CCT GAT CGC TTC TCA GGC TCC AGC TCT 270 Ser Thr Gly Asp Gly lie Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Ser Ser 60 65 70 GGG GCT GAG CGC TAC CTC ACC ATC TCC AGC CTC CAG TCT GAG GAT 315 Gly Ala Glu Arg Tyr Leu Thr lie Ser Ser Leu Gin Ser Glu Asp 75 80 85 GAG GCT GAC TAT ATC TGT GGT GTG GGT GAT ACA ATT AAG GAA CAA 360 Glu Ala Asp Tyr lie Cys Gly Val Gly Asp Thr lie Lys Glu Gin 90 95 100 TTT GTG TAC GTG TTC GGC GGA GGG ACC AAA CTG ACC GTC CTA GGC 405 Phe Val Tyr Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly 105 110 115 CAG CCC 411 、

Gin Pro 經滴部中央標隼局貨工消費合作社印製序列編號：72 序列之長度：4 11 序列之類型：核酸股數：雙股構型：直鏈狀序列之種類：從mRNA反錄之cDNA 序歹|J : _____ -117- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Λ4規格（210X 297公釐） 1227140 A7 B7 五、發明説明（115) 經濟部中央標準局負工消f合作社印製 ATG GCC TGG ACT CCT CTC TTC TTC TTC TTT GTT CTT CAT TGC TCA 45 Met Ala Trp Thr Pro Leu Phe Phe Phe Phe Val Leu His Cys Ser -15 -10 -5 GGT TCT TTC TCC CAG CTT GTG CTG ACT CAA TCG CCC TCT GCC TCT 90 Gly Ser Phe Ser Gin Leu Val Leu Thr Gin Ser Pro Ser Ala Ser 1 ) 10 GCC TCC CTG GGA GCC TCG GTC AAG CTC ACC TGC ACC TTG AGT AGT 135 Ala Ser Leu Gly Ala Ser Val Lys Leu Thr Cys Thr Leu Ser Ser 15 20 25 CAG CAC AGT ACG TAG ACC ATT GAA TGG TAT CAG CAG CAG CCA GAG 180 Gin His Ser Thr Tyr Thr lie Glu Trp Tyr Gin Gin Gin Pro Glu 30 35 40 AAG GGC CCT AGG TAC CTG ATG GAT CTT AAG CAA GAT GGA AGC CAC 225 Lys Gly Pro Arg Tyr Leu Met Asp Leu Lys Gin Asp Gly Ser His 45 50 55 AGC ACA GGT GAT GGG ATT CCT GAT CGC TTC TCA GGC TCC AGC TCT 270 Ser Thr Gly Asp Gly lie Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Ser Ser 60 65 70 GGG GCT GAG CGC TAC CTC ACC ATC TCC AGC CTC CAG TCT GAG GAT 315 01 y Ala Glu Arg Tyr Leu Thr lie Ser Ser Leu Gin Ser Glu Asp 75 80 85 GAG GCT GAC TAT ATC TGT GGT GTG GGT丨 GAT ACA ATT AAG GAA CAA 360 Glu Ala Asp Tyr lie Cys Gly Val Gly ▲ A.sp Thr lie Lys Glu丨 Gin 90 95 100 -118- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） 1227140 A7 B7 五、發明説明（116) TTT GTG TAC GTG TTC GGC GGA GGG ACC AAA CTG ACC GTC CTA GGC 405

Phe Val Tyr Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly 105 110 115 CAG CCC 411 Gin Pro 序列編號：73 序列之長度：411 序列之類型：核酸股數：雙股構型：直鏈狀序列之種類：從mRNA反錄之cDNA 序列： ATG GCC TGG ACT CCT CTC TTC TTC TTC TTT GTT CTT CAT TGC TCA 45

Gly Ser Phe Ser Gin Leu Val Leu Thr Gin Ser Pro Ser Ala Ser 經濟部中夾標準局員工消費合作社印製 1 5 10 GCC TCC CTG GGA GCC TCG GTC AAG CTC ACC TGC ACC TTG AGT AGT 135

Ala Ser Leu Gly Ala Ser Val Lys Leu Thr Cys Thr Leu Ser Ser - 15 20 25 · CAG CAC AGT ACG TAC ACC ATT GAA TGG TAT CAG CAG CAG CCA GAG 180

Gin His Ser Thr Tyr Thr He Glu Trp Tyr Gin Gin Gin Pro Glu -119- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Λ4規格（210X 297公釐） 1227140 A7 B7 五、發明説明（117) 30 35 40 AAG.GGC CCT AAG TAC GTG ATG GAT CTT AAG CAA GAT GGA AGC CAC 225 Lys Gly Pro Lys Tyr Val Met Asp Leu Lys Gin Asp Gly Ser His 45 50 55 AGC ACA GGT GAT GGG ATT CCT GAT CGC TTC TCA GGC TCC AGC TCT 270

Ser Thr Gly Asp Gly lie Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Ser Ser 60 65 70 GGG GCT GAG CGC TAC CTC ACC ATC TCC AGC CTC CAG TCT GAG GAT 315

Gly Ala Glu Arg Tyr Leu Thr lie Ser Ser Leu Gin Ser Glu Asp 75 80 85 GAG GCT GAC TAT ATC TGT GGT GTG GGT GAT ACA ATT AAG GAA CAA 360

Glu Ala Asp Tyr lie Cys Gly Val Gly Asp Thr lie Lys Glu Gin 90 95 100 TTT GTG TAC GTG TTC GGC GGA GGG ACC AAA CTG ACC GTC CTA GGC 405

Phe Val Tyr Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly 10δ 1Ί0 115 CAG CCC 411 Gin Pro 經濟部中央標準局負工消费合作社印繁序列编號：7 4 序列之長度：4 1 1 序列之類型：核酸股數：雙股構型··直鏈狀 __-120-_ 用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐) 1227140 A7 B7___ 五、發明説明（118) 序列之種類：從mRNA反錄之cDNA 序列： ATG GCC TGG ACT CCT CTC TTC TTC TTC TTT GTT CTT CAT TGC TCA 45

Gly Ser Phe Ser Gin Leu Val Leu Thr Gin Ser Pro Ser Ala Ser 1 5 10 GCC TCC CTG GGA GCC TCG GTC AAG CTC ACC TGC ACC TTG AGT AGT 135

Lys Gly Pro Arg Tyr Val Met Asp Leu Lys Gin Asp Gly Ser His 45 50 55 ' AGC ACA GGT GAT GGG ATT CCT GAT CGC TTC TCA GGC TCC AGC TCT 270 經濟部中央標準局負工消費合作社印製 ‘S()r Thr (;ly A.sp (;ly Pro Arg l)h。Scr Gly S〇r Slt Sur 60 65 70 GGG GCT GAG CGC TAC CTC ACC ATC TCC AGC CTC CAG TCT GAG GAT 315

Gly Ala Glu Arg Tyr Leu Thr lie Ser Ser .Leu Gin Ser Glu Asp 75 80 85 -121 - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Λ4規格（210X 297公釐） 1227140 A7 B7__ 五、發明説明（119) GAG GCT GAC TAT ATC TGT GGT GTG GGT GAT ACA ATT AAG GAA CAA 360

Phe Val Tyr Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly 105 110 115 CAG CCC 411 Gin Pro 序列編號：75 序列之長度：34 序列之類型：胺基酸構型：直鏈狀序列之種類：胜肽序列：經濟部中央標準局貝工消費合作社印製

Ala Val Ser Glu His Gin Leu Leu His Asp Lys Gly Lys Ser lie 1 5 10 15 Gin Asp Leu Arg Arg Arg Phe Phe Leu His His Leu lie Ala Glu 20 25 30 lie His Thr Ala -122- 適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐）

Claims

/X /X A8 B8 C8 D8 93. 8. 12 1227140 韋087107554號專利申請案中文申請專利範圍替換本(93年8月）六、申請專利範圍 1. 一種惡病質治療劑，其係含有抗副甲狀腺激素相關胜肽抗體做為有效成分，其中該抗體係具有以下性質者： (a) 對於惡病質之預防或治療顯示活性； (b) 對於阻害OCC-1腫瘤細胞之增殖未顯示有意義之活性。 . 2. 根據申請專利範圍第1項之惡病質治療劑，其中該物質為抗副甲狀腺激素相關胜肽抗體片段及/或其之修飾物。 3. 根據申請專利範圍第1或2項之惡病質治療劑，其中該抗體為人類型化或嵌合化者。 4. 根據申請專利範圍第3項之惡病質治療劑，其中該人型化抗體為人類型化#23-57- 1 37- 1抗體。 5. 根據申請專利範圍第1或2項之惡病質治療劑，其中該抗體為單株抗體。 6. 根據申請專利範圍第1或2項之惡病質治療劑，其中該惡病質為衍生自癌症者。 7. 根據申請專利範圍第3項之惡病質治療劑，其中該惡病質為衍生自癌症者。 8. 根據申請專利範圍第4項之惡病質治療劑，其中該惡病質為衍生自癌症者。 9. 根據申請專利範圍第5項之惡病質治療劑，其中該惡病質為衍生自癌症者。 52%6-^>30812 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐）