CZ398499A3 - Léčivo proti kachexii - Google Patents

Abstract

Toto řešení se týká léčiva pro kachexii, obsahujícíjako aktivní složku látku, schopnou inhibice vazby mezi parathormonu příbuznýmproteinem(PTHrP) ajeho receptorem.

Description

Léčivo pro kachexii

Oblast techniky

Předkládaný vynález se týká léčiva pro kachexii, obsahujícího jako aktivní složku látku, schopnou inhibice vazby mezi parathormonu příbuzným proteinem (PTHrP) a jeho receptorem.

Dosavadní stav techniky

Kachexie, k níž dochází u pacientů v terminálním stádiu rakoviny, je jedním z běžných, zhoubných, paraneoplastických syndromů a je charakterizována systemickými poruchami, které mají jako hlavní příznaky anorexii, ztrátu hmotnosti, anemii, elektrolytickou nerovnováhu a zhoršené imunitní funkce. Vývoj kachexie u pacientů, trpících rakovinou, vede ke smrtelným a terminálním příznakům; zhoršuje kvalitu života (QOL) pacientů; a má silný psychologický, fyzický a sociální dopad na pacienty a jejich rodiny a lidi v jejich okolí.

Nedávno bylo zjištěno, že kachektin, o kterém se má za to, že je činidlem, vyvolávajícím kachexii při rakovině, je identický s faktorem nekrotizujícím nádory (TNF). Poté bylo zjištěno, že také cytokiny (např. interleukin (IL)-l, IL-6, LIF, IFN) působí stejně jako kachektin a tedy že je kachexie indukována společným působením více faktorů.

Je známo, že buněčná linie OCC-1, odvozená od lidského karcinomu ústní dutiny, produkuje různé typy tekutých faktorů, zahrnutých v kachexii při rakovině. U nahé myši s implantovanými buňkami OCC-1 dochází k vývoji různých syndromů včetně kachexie (Kajimura N. et al., Cancer Chemother. Pharmacol., 1996, 38. Dodatek, str. 48-52; Tanaka R. et al., Jpn. J. Clin. Oncology duben 1996, 26 (2) str. 88-94). Má se za to, že k tomu dochází, protože buněčná linie OCC-1, implantovaná nahé myši, produkuje s růstem těchto buněk různé cytokiny (např. G-CSF, IL-6, LIF, IL-11, PTHrP) a tyto faktory působí v nahé myši společně a způsobují takovéto příznaky.

Příznaky, nacházející se u nahé myši s implantovanou buněčnou linií OCC-1, se jeví býti vysoce podobné těm, které se objevují u lidských pacientů v • ·

terminálním stádiu rakoviny. Zatím však nebyl žádný článek, týkající se léků nebo léčiv pro kachexii.

Podstata vynálezu

Předmětem předkládaného vynálezu je poskytnutí léčiva pro kachexii, obsahujícího jako aktivní složku látku, schopnou inhibice vazby mezi parathormonu příbuzným proteinem (PTHrP) a jeho receptorem.

Předkladatelé provedly rozsáhlé a intenzivní studie za účelem objevení takovéhoto léčiva. Jako výsledek zjistili, že tohoto předmětu lze dosáhnout vyvinutím látky, která může inhibovat vazbu mezi PTHrP a jeho receptorem. Toto zjištění vede k vytvoření tohoto vynálezu.

To jest, předkládaný vynález se týká léčiva pro kachexii, obsahujícího jako aktivní složku látku, schopnou inhibice vazby mezi PTHrP a jeho receptorem.

V předkládané vynálezu zahrnuje termín „kachexie“ ty, indukované rakovinou. Předkládaný vynález se týká léčiva pro kachexii, obsahujícího jako aktivní složku látku, schopnou inhibice vazby mezi parathormonu příbuzným proteinem (dále označovaným jako „PTHrP“) a jeho receptorem (dále označovaným jako „receptor PTHrP“. Když je zde použit, označuje termín „receptor PTHrP“ jakýkoliv receptor, který váže PTHrP (jako jsou ty, popsané v Japanese National Phase Laid-open Publication No. 6-5065598), bez ohledu na to, jestli je tento receptor PTHrP přítomen v cílovém orgánu (např. kost, ledvina) či ne.

Když je zde použit, označuje termín „látka, schopná inhibice vazby mezi PTHrP ajeho receptorem (receptorem PTHrP)“ jakoukoliv látku, která se může vázat na PTHrP, aby bránila vazbě PTHrP na jeho receptor, jako např. protilátka proti PTHrP; jakoukoliv látku, která se může vázat na receptor PTHrP, aby bránila vazbě receptoru PTHrP na PTHrP, jako např. nějaký antagonista proti receptoru PTHrP (antagonista PTHrP), konkrétně nějaký peptid, který má substituci nebo deleci alespoň jednoho aminokyselinového zbytku v peptidu PTHrP nebo částečné sekvenci peptidu PTHrP; nebo jejich kombinaci.

Mezi protilátky proti PTHrP patří protilátky jakéhokoliv známého typu, jako např. humanizovaná protilátka, lidská protilátka (WO 96/33735) nebo chimerní protilátka (Japanese Patent Application Laid-open No. 4-228089) a protilátka použitá jako příklad v předkládaném vynálezu (protilátka #23-57-137-1). Tato • · protilátka může být monoklonálního nebo polyklonálního typu, ale přednostně monoklonálního typu. Mezi antagonisty PTHrP patří polypeptidy nízké molekulové hmotnosti. Mezí antagonisty PTHrP patří látky, které se váží na receptor PTHrP antagonistickým způsobem proti PTHrP, jako např. nějaký polypeptid mající PTHrP antagonistickou aktivitu, jak je popsáno v Japanese Patent Application Laid open No. 7-166790; Peptides (SPOJENÉ STÁTY), 1995, 16 (6), 1031-1037; Biochemistry (SPOJENÉ STÁTY) 28. dubna 1992, 31 (16) 4026-4033; a Japanese National Phase Laid-open Publication No. 5-509098. Tyto polypeptidy mohou mít deleci, substituci nebo inzerci alespoň jednoho aminokyselinového zbytku, pokud mohou vykazovat odpovídající úroveň PTHrP antagonistické aktivity, a jsou také zahrnuty v antagonistech PTHrP předkládaného vynálezu.

Dále bude předkládaný vynález popsán v detailních příkladech, za použití protilátky proti PTHrP, jako látky schopné inhibice vazby mezi PTHrP a receptorem PTHrP.

1. Protilátka proti PTHrP

Protilátkou proti PTHrP, použitou v předkládaném vynálezu, může být kterákoliv protilátka, pokud vykazuje léčebný účinek u kachexie, bez ohledu na její zdroj, typ (monoklonální nebo polyklonální) a strukturu.

Protilátka proti PTHrP, použitá v předkládaném vynálezu, může být vytvořena kteroukoliv známou metodou, jako polyklonální nebo monoklonální protilátka. Přednostně je protilátkou proti PTHrP monoklonální protilátka odvozená od nějakého savce. Monoklonální protilátky ze savce zahrnují ty, produkované hybridomem, a ty, vytvořené technikou genové inženýrství, z hostitelské buňky, transformované expresním vektorem nesoucím gen pro protilátku.

Protilátkou, použitou v předkládaném vynálezu, je taková protilátka, která se může vázat na PTHrP a tím bránit vazbě PTHrP na receptor PTH/PTHrP, tedy blokovat signální transdukci PTHrP a následně inhibovat biologickou aktivitu PTHrP.

Konkrétním příkladem takovéto protilátky je protilátka #23-57-137-1, která může být produkována hybridomovým klonem #23-57-137-1.

Hybridomový klon #23-57-137-1 byl označen jako „hybridom myš-myš #23-57137-1“ a byl uložen podle Budapešťské dohody, 15. srpna 1996 v National ····· · ·· ·· ·· ♦ · · ···· 9 9 9 9

9 99 9 · 9 · · · • · 9 · · · 999999 • · « 9 9 9

999 999 999 9999 <9 99

Institute of Bioscience and Human-technology, Agency of Industrial Science and Technology, Japonsko (1-3, Higashi 1-chome, Tsakuba-shi, Ibaraki, Japonsko) pod přístupovým číslem FERM BP-5631.

2. Protilátku produkující hybridom

Monoklonální protilátku produkující hybridom může být v zásadě vytvořen jakoukoliv známou technikou. To jest, PTHrP je použit jako antigen pro imunizaci podle nějaké běžné imunizační metody. Výsledné imunocyty jsou fúzovány se známými rodičovskými buňkami pomocí běžných metod buněčné fúze a monoklonální protilátky produkující buňky jsou z fúzovaných buněk vybrány pomocí běžných prohledávacích metod.

Konkrétněji, monoklonální protilátky produkující buňky mohou být připraveny následovně.

Za prvé, lidský PTHrP, který je použit jako antigen pro tvorbu protilátky, je připraven expresí genu PTHrP; aminokyselinová sekvence je popsána v Sůva, L.

J. et al., Science (1987) 237, 893. To jest, aminokyselinová sekvence, kódující PTHrP, je inzerována do kteréhokoliv známého expresního vektoru a tímto expresním vektorem je transformována vhodné hostitelské buňka. Protein PTHrP je poté izolován a purifikován z transformovaných hostitelských buněk nebo z kultivačního supernatantu transformovaných hostitelských buněk kteroukoliv známou metodou.

Za druhé, purifikovaný protein PTHrP je použit jako antigen. Alternativně může být jako antigen použit 34-aminokyselinový peptid N-terminální části PTHrP, který může syntetizován chemicky.

Savčí druh, který bude tímto antigenem imunizován, není konkrétně omezen. Při výběru tohoto savce je však přednostně brána v úvahu kompatibilita s rodičovskou buňkou, použitou k fúzi. Obecně může být použit hlodavec (např. myš, krysa, křeček, králík) nebo opice.

Imunizace savce tímto antigenem může být provedena podle kterékoliv známé metody, např. injikováním tohoto antigenu savci intraperitonealně nebo subkutánně. Konkrétněji, tento antigen je zředěn a řádně rozpuštěn ve fosfátem pufrovaném roztoku NaCl (PBS) nebo normálním roztoku NaCl. Výsledná suspenze je poté smíchána a vhodným množstvím adjuvans (např. Freundovo kompletní adjuvans), aby vznikla emulze. Tato emulze je savci injikována • · · 4 · 4» ·· ··

několikrát v intervalech 4 až 21 dní. Při imunizaci může být antigen vázán na vhodný nosič.

Po imunizaci je kontrolováno množství protilátek v séru. Když je potvrzeno, že toto množství dosáhlo požadované výše, jsou z tohoto savce izolovány imunocyty a ty jsou poté podrobeny buněčné fúzi. Upřednostňovaným imunocytem je buňka sleziny.

Rodičovskou buňkou, použitou pro buněčnou fúzi (to jest protějškem buněčné fúze s imunocytem), je myelomová buňka odvozená ze savce. Myelomová buňka je z kterékoliv známé buněčné linie a např. P3 (P3x63 Ag8.653) (J. Immunol. (1979) 123, 1548-1550), P3x63Ag8U.l (Current Topics in Microbiology and Immunology (1978) 81, 1-7), NS-1 (Kohler G. a Milstein C., Eur. J. Immunol. (1976) 6, 551-549), MPC-11 (Margulies D. H. et al., Cell (1976) 8, 405-415), SP2/0 (Shulman M. et al., Nátuře (1978), 276, 269-270), FO (de St. Groth S. F. et al., J. Immunol. Methods (1980) 35, 1-21), S194 (Trowbridge I. S., J. Exp. Med. (1978) 148, 313-323) nebo R210 (Galfre G. et al., Nátuře (1979) 277, 131133).

Buněčná fúze imunocytu s myelomovou buňkou je v zásadě provedena podle kterékoliv známé metody. Přednostně může být použita např. metoda Milsteina et al. (Kohler G. a Milstein C., Methods Enzymol. (1981) 73, 3-46).

Konkrétněji, buněčná fúze být provedena např. v běžném živném mediu v přítomnosti látky, usnadňující buněčnou fúzi. Látkou, usnadňující buněčnou fúzi, může být polyethylenglykol (PEG) nebo Sendai virus (hemaglutinační virus z Japonska, HVJ). Je-li to požadováno, může být za účelem zlepšení účinnosti fúze přidána také nějaké přísada, jako např. dimethylsulfoxid.

Poměr mezi imunocyty a myelomovými buňkami pro buněčnou fúzi může být jakýkoliv. Například, imunocyty jsou použity v 1-10 krát vyšším množství než myelomové buňky. Kultivačním mediem, použitým pro buněčnou fúzi, je například RPMI 1640 medium nebo MEM medium, vhodné pro růst linií myelomových buněčných linií, nebo jiné medium, běžně používané pro kultivaci takovýchto buněk. Je-li to požadováno, může být do kultivačního media přidán sérový doplněk, jako např. fetální telecí sérum (FCS).

Buněčná fúze je provedena dobrým promícháním daných množství imunocytů a myelomových buněk v kultivačním mediu, přidáním roztoku PEG (např. průměrné molekulové hmotnosti : okolo 1000-6000) (který byl předtím zahřátý • · · · · · 9 · · ·

9 9999 999

9 99 9 9 999

9 9 9 · 9 9 9 9

9 9 9 9

9 9 999 ····*·· · · na asi 37 °C), obvykle do 30-60% koncentrace(w/v), a poté promícháním výsledného roztoku, čímž vznikají fúzované buňky (hybridomy). Následně je ke kultivačnímu roztoku přidáno vhodné kultivační medium a je centrifugován za účelem odstranění supernantantu. Tento postup je několikrát opakován za účelem odstranění látky usnadňující buněčnou fúzi apod., která je nežádoucí pro růst hybridomů v kultivačním mediu.

Získané hybridomy mohou být selektovány pomocí kultivace v běžném selektivním mediu, jako je hypoxantin-aminopterin-thymidinové (HAT) medium. Kultivace hybridomů v HAT mediu se provádí po takovou dobu, která je dostatečná pro způsobení smrti jiných buněk, než jsou požadované hybridomy (to jest buněk, které nefúzovaly), obvykle po několik dní až týdnů. Následně je provedena běžná metoda limitujícího ředění, za účelem vyhledání a klonování hybridomů, které sekretují požadovanou protilátku.

Alternativně může být pomocí zcitlivění lidského lymfocytu PTHrP in vitro a poté podrobení citlivého lymfocytu buněčné fúzi s myelomovou buňkou, odvozenou z člověka (Japanese Patent Publication No. 1-59878), schopnou nekonečného růstu, připravena lidská protilátka, mající vazebnou aktivitu proti PTHrP. Alternativně může být připravena protilátka proti PTHrP pomocí injikování PTHrP, jako antigenu, do transgenního živočicha, který má celý repertoár lidských genů pro protilátky, za účelem vzniku buněk produkujících protilátky proti PTHrP, a imortalizováním těchto buněk, takže tato lidská protilátka může být produkována imortalizovanou buňkou (International Publication No. WO 94/25585, WO 93/12227, WO 93/03918 a WO 94/022602). Monoklonální protilátku produkující hybridom, připravený jak je popsáno výše, může být subkultivován v běžném kultivačním mediu a uložen v kapalném dusíku po dlouhou dobu.

Pro produkci monoklonální protilátky hybridomem může být použita metoda, zahrnující kultivaci hybridomů podle nějaké běžné metody a shromáždění monoklonální protilátky z kultivačního supernatantu, nebo metoda, zahrnující injikování hybridomů nějakému savci, kompatibilnímu s hybridomem, za účelem růstu hybridomů v savčím těle, a shromáždění hybridomů z ascites tohoto savce. První metoda je vhodná pro produkci protilátky vysoké čistoty, zatímco druhé metoda je vhodná pro produkci protilátky ve velkém množství.

3. Rekombinantní protilátka

V předkládaném vynálezu může být použita monoklonální protilátka rekombinantního typu, která může být vytvořena klonováním protilátkového genu z hybridomu, začleněním tohoto protilátkového genu do vhodného vektoru, zavedením tohoto vektoru do hostitele a produkování této protilátky hostitelem podle nějaké běžné genetické rekombinační techniky (viz např. Vandamme A. M. et al., Eur. J. Biochem. (1990) 192, 767-775).

Konkrétněji, mRNA, kódující variabilní (V) oblast protilátky proti PTHrP, je izolována z hybridomu, produkujícího tuto protilátku proti PTHrP. Izolace mRNA je provedena připravením totální RNA jakoukoliv známou metodou, jako je guanidiová ultracentrifugační metoda (Chirgwin J. M. et al., Biochemistry (1979) 18, 5294-5299). a AGPC metoda (Chomczynski P. et al., Anal. Biochem. (1987) 162, 156-159), a poté získáním požadované mRNA z totální RNA za použití mRNA Purification Kitu (Pharmacia) apod. Alternativně může být mRNA také připravena přímo, za použití QuickPrep mRNA Purification Kitu (Pharmacia).

Déle je z mRNA reverzní transkriptázou syntetizována cDNA pro V-oblast protilátky. Syntéza cDNA je provedena za použití AMV Reverse Transcriptase First-strand cDNA Synthesis Kitu (Seikagaku Corporation) apod.

cDNA může být také syntetizována nebo amplifikována pomocí 5'-RACE metody (Frohman M. A. et al., Proč. Nati. Acad. Sci. USA (1988) 85, 89989002; Belyavsky A. et al., Nucleic Acids Res. (1989), 17, 2919-2932) za použití 5'-Ampli FINDER RACE Kitu (Clontech) v kombinaci s metodou PCR apod. Žádaný DNA fragment je izolován a purifikován z výsledného PCR produktu a poté ligován do vektorové DNA za vzniku rekombinantního vektoru. Rekombinantní vektor je zaveden do hostitele jako je E. coli, a je selektována kolonie, obsahující požadovaný rekombinantní vektor. Nukleotidová sekvence požadované DNA v rekombinantním vektoru je potvrzena např. metodou dideoxynukleotidové terminace řetězce.

Když je DNA, kódující V-oblast protilátky proti PTHrP, získána, je vložena do expresního vektoru, obsahujícího DNA, kódující konstantní (C) oblast protilátky.

Pro přípravu protilátky proti PTHrP, použité v předkládaném vynálezu, je protilátkový gen vložen do expresního vektoru tak, že může být tento • · · · · · « · · · · « • · · · · • * ·«· ·«· • · · • · ·« « » · · protilátkový gen exprimován pod kontrolou oblastí řídících expresi (např. enhanceru, promotoru). Hostitelská buňka je transformována expresním vektorem za účelem exprese protilátky.

Při expresi protilátkového genu mohou být DNA, kódující těžký (H) řetězec, a DNA, kódující lehký (L) řetězec protilátky, vloženy do samostatných expresních vektorů a poté je hostitelská buňka kotransformována výslednými expresními vektory. Alternativně mohou být DNA, kódující H-řetězec, a DNA, kódující Lřetězec protilátky vloženy společně do jediného expresního vektoru a poté je hostitelská buňka transformována výsledným expresním vektorem (WO 94/11523).

Při produkci rekombinantní protilátky může být jako hostitel použit kromě výše zmíněných hostitelských buněk také transgenní živočich. Například, protilátkový gen může být inzerován do předem určeného místa v genu, kódujícího protein, který je přirozeně produkován v mléku savce (např. kozí βkasein), aby vznikl fúzní protein. DNA fragment, obsahující fúzní gen obsahující protilátkový gen je injikován do embrya kozy a toto embryo je zavedeno do kozy. Koza, obsahující toto embryo, porodí transgenní kozu. Požadovaná protilátka je sekretována v mléku transgenní kozy nebo jejího potomstva. Za účelem zvýšení množství mléka obsahujícího protilátku, může být transgenní koze podáván příslušný hormon (Ebert K. M. et al., Bio/Technology (1994) 12, 699-702).

4. Modifikovaná protilátka

V předkládaném vynálezu může být, za účelem snížení heterogenicity vůči lidskému tělu apod., použita uměle modifikovaná rekombinantní protilátka, včetně chimerní a humanizované protilátky. Tyto modifikované rekombinantní protilátky mohou být připraveny kteroukoliv známou metodou.

Chimerní protilátka, použitelná v tomto vynálezu, může být připravena ligováním DNA, kódující V-oblast protilátky, připravená jak je uvedeno výše, s DNA, kódující C-oblast lidské protilátky, vložením tohoto ligačního produktu do expresního vektoru a zavedením výsledného rekombinantního expresního vektoru do hostitele, za účelem produkce chimerní protilátky.

Humanizovaná protilátka je také nazývána jako „přetvařovaná lidská protilátka“, ve které jsou komplementaritu určující úseky (CDR) protilátky savce, kterým • 9

9 · · 9 · 9 · 9 9

999 9999 9

9999 9 9 9999

99 9 9 9 999999 není člověk, (např. myš) přeneseny na lidskou protilátku. Obecný genetický rekombinační postup pro tvorbu takovéto humanizované protilátky je také znám (EP 125023; WO 96/02576).

Konkrétně, je navržena DNA sekvence, ve které jsou CDR myší protilátky ligovány přes úseky základní struktury (FR), a je syntetizována pomocí PCR metody za použití příslušných oligonukleotidů jako primerů, které byly navrženy tak, aby měly úseky, přesahující terminální úseky CDR a FR. Výsledná DNA je ligována s DNA, kódující C-oblast lidské protilátky, a ligační produkt byl vložen do expresního vektoru. Výsledný rekombinantní vektor je zaveden do hostitele a tím jsou produkovány humanizované protilátky (EP 239044, WO 96/02576).

FR ligované přes CDR jsou vybrány tak, že CDR mohou vytvářet dostačující vazebné místo pro antigen. Je-li to nutné může být v FR V-oblasti protilátky nahrazena aminokyselina(y) tak, aby CDR přetvařované lidské protilátky mohl vytvářet příslušné vazebné místo pro antigen (Sáto K. et al., Cancer Res. (1993) 53, 851-856).

C-oblastí chimerní nebo humanizované protilátky může být kterákoliv C-oblast lidské protilátky, jako je Cyl, Cy2, Cy3 nebo Cy4 pro H-řetězce a Ck nebo C7 pro L-řetězce. C-oblasti lidské protilátky mohou být modifikovány za účelem zlepšení stability protilátky nebo zajištění stabilní produkce této protilátky. Chimerní protilátka je složena z V-oblastí, odvozených od protilátky savce, kterým není člověk, a C-oblastí, odvozených od lidské protilátky. Humanizovaná protilátka je složena z CDR, odvozených od protilátky savce, kterým není člověk a FR a C-oblastí, odvozených od lidské protilátky. Humanizovaná protilátka je obzvláště užitečná jako aktivní látka pro léčivo předkládaného vynálezu, protože antigenicita protilátky proti lidskému tělu je snížena.

Konkrétním příkladem humanizované protilátky, použité v předkládaném vynálezu, je humanizovaná protilátka #23-57-137-1; u které jsou CDR odvozeny od protilátky #23-57-137-1, odvozené z myši; a L-řetězec je složen z CDR, ligovaných přes FR (FR1, FR2 a FR3), odvozené od lidské protilátky HSU 03868 (GEN-BANK, Deftos M. et al., Scand. J. Immunol., 39, 95-103, 1994) a FR (FR4), odvozený od lidské protilátky S25755 (NBRF-PDB); a H-řetězec je složen z CDR, ligovaných přes FR, odvozené od lidské protilátky S31679 ♦ * 9 · 9 • 99 (NBRF-PBD, Cuisinier A. M. et al., Eur. J. Immunol. 23, 1 10-1 18, 1993), ve které je část aminokyselinových zbytků v FR nahrazena tak, aby přetvařovaná humanizovaná protilátka mohla vykazovat antigen-vazebnou aktivitu.

Kmeny E. coli, obsahující plazmidy, mající jednotlivě DNA, kódující H-řetězec a L-řetězec humanizované protilátky #23-57-137-1, jsou jednotlivě označeny jako Escherichia coli JM109 (hMBClHcDNA/pUC19) (pro H-řetězec) a Escherichia coli JM109 (hMBClLq/DNA/pUC19) (pro L-řetězec). Tyto kmeny byly uloženy podle Budapešťské dohody, 15. srpna 1996 v National Institute of Bioscience and Human-technology, Agency of Industrial Science and Technology, Japonsko (1-3, Higashi 1-chome, Tsakuba-shi, Ibaraki, Japonsko) pod přístupovým číslem FERM BP-5629 pro Escherichia coli JMI 09 (hMBClHcDNA/pUC19) a pod přístupovým číslem FERM BP-5630 pro Escherichia coli JM109 (hMBClLqXDNA/pUC19).

5. Varianty protilátky

Protilátkou, použitou v předkládaném vynálezu, může být jakýkoliv její fragment nebo modifikovaný produkt tohoto fragmentu, pokud může vázat PTHrP a inhibovat aktivitu PTHrP. Například, mezi tyto fragmenty protilátky patří Fab, F(ab')2, Fv nebo jednořetězcový Fv (scFv), složený z H-řetězcového Fv fragmentu nebo L-řetězcového Fv fragmentu, spojených spolu přes vhodný linker. Konkrétně, takovéto fragmenty protilátek mohou být vytvořeny štěpením protilátky enzymem (např. papainem, pepsinem) na protilátkové fragmenty, nebo vytvořením genu kódujícího fragment protilátky a vložením tohoto genu do expresního vektoru a zavedením výsledného rekombinantního expresního vektoru do vhodné hostitelské buňky, čímž je exprimován tento fragment protilátky (viz např. Co M. S., et al., J. Immunol. (1994), 152, 2968-2976; Better M. & Horwitz A. H., Methods in Enzymology (1989), 178, 476-496, Academie Press, lne,; Plueckthun A. & Skerra A., Methods in Enzymology (1989) 178, 476-496, Academie Press, lne.; Lemoyi E., Methods in Enzymology (1989) 121, 652-663; Rousseaux J. et al., Methods in Enzymology (1989) 121, 663-669; a Bird R. E. et al., TIBTECH (1991) 9, 132- 137).

scFv může být vytvořen spojením H-řetězcové V-oblasti s L-řetězcovou Voblastí přes linker, přednostně nějaký peptidový linker (Huston J. S. et al., Proč. Nati. Acad. Sci. USA (1988) 85, 5879-5883). H-řetězcová V-oblast a L• · 9 řetězcová V-oblast v cvFv mohou být odvozeny od jakékoliv ze zde popsaných protilátek. Peptidovým linkerem, který váže tyto V-oblasti, může být jakýkoliv jednořetězcový peptid, např. - z 12-19 aminokyselinových zbytků.

DNA, kódující SCFv, může být připravena nejprve oddělenou amplifikací DNA, kódující H-řetězcovou V-oblast, a DNA, kódující L-řetězcovou V-oblast protilátky, za použití DNA fragmentu, kódujícího celý úsek H-řetězce nebo jeho část, která zahrnuje V-oblast, a DNA fragmentu, kódujícího celý úsek L-řetězce nebo jeho část, která zahrnuje V-oblast, jako templátu a párů primerů, které určují terminální konce DNA fragmentů; a poté amplifikací DNA, kódující peptidový linker, za použití DNA fragmentu, kódujícího tento peptidový linker, jako templátu a párů primerů, které určují terminální konce DNA fragmentu tak, aby oba konce peptidového linkeru byly jednotlivě spojeny s H-řetězcovou Voblastí a L-řetězcovou V-oblastí.

Když je DNA, kódující scFv, připravena, může být běžnými metodami připraven expresní vektor, nesoucí tuto DNA, a hostitel, transformovaný tímto expresním vektorem.

Protilátkové fragmenty, použité v předkládaném vynálezu, mohou být vytvořeny pomocí připravení genů pro tyto fragmenty a exprimováním těchto genů ve vhodných hostitelových, jak je popsáno výše. Tyto protilátkové fragmenty jsou také zahrnuty v termínu „protilátka“ předkládaného vynálezu.

Jako modifikovaná forma výše zmíněných protilátek může být také použita například protilátka proti PTHrP, spojená s jakoukoliv molekulou (např. polyethylenglykolem). Takovéto modifikované protilátky jsou také zahrnuty v termínu „protilátka“ předkládaného vynálezu. Modifikované protilátky mohou být připraveny chemickými modifikacemi protilátek. Techniky chemických modifikací, vhodných pro tento účel, byly již v oboru zavedeny.

6. Exprese a produkce rekombinantní protilátky nebo modifikované protilátky Protilátkový gen, sestavený tak, jak je popsáno výše, může být vytvořen a exprimován známými metodami. Pro expresi v savčí buňce jsou operativně spojeny běžný užitečný promotor, protilátkový gen, který má být exprimován, a poly(A) signál (umístněný na 3' konci protilátkového genu). Například, jako užitečný promotor/enhancerový systém může být použit promotor/enhancerový systém brzké rané fáze cytomegaloviru.

• ··· · · ·· φφ φφ φφφ * φ · φ φφφφ φ · ·· φ φ φφφφ φ · · · φφφφφφφφ φφφφ φ φ • ΦΦ ··« ·ΦΦ ···· φφ φφ

Pro expresi protilátky předkládaného vynálezu mohou být také použity jiné promotor/enhancerové systémy, např. ty, odvozené od virů (např. retroviru, polyomaviru, adenoviru a opičího viru 40 (SV 40), a ty, odvozené od savčích buněk (např. lidského elongačního faktoru la (HEFla).

Když je použit promotor/enhancerový systém SV40, může být genová exprese provedena snadno podle metody Mulligana et al., (Nátuře (1979) 277, 108). Když je použit promotor/enhancerový systém HEFla, může být genová exprese provedena snadno podle metody Mizushimy et al., (Nucleic Acids Res. (1990)

18, 5322).

Pro expresi v E. coli mohou být operativně spojeny běžný užitečný promotor, signální sekvence pro sekreci požadované protilátky a protilátkový gen. Jako promotor může být použit lacZ promotor nebo araB promotor.

Když je použit lacZ promotor, může být genová exprese provedena podle metody Warda et al., (Nátuře (1998) 341, 544-546); Fabse J. (1992) 6, 24222427, zatímco když je použit araB promotor, může být genová exprese provedena podle metody Bettera et al., (Batter et al., Science (1988) 240, 10411043).

Co se týká signální sekvence pro sekreci protilátky, když je požadována sekrece této protilátky do periplazmatického prostoru E. coli, může být použita signální sekvence pelB (Lei S. P. et al,, J. Bacteriol. (1987) 169, 4379). Protilátka, sekretovaná do periplazmatického prostoru, je izolována a poté znovu složena tak, aby získala příslušnou strukturu.

Může být použit replikaění počátek, odvozený od virů (např. SV40, polyomaviru, adenoviru, papilomaviru skotu (BPV) apod.). Za účelem zvýšení počtu kopií genu v hostitelském buněčném systému, může expresní vektor dále obsahovat gen pro selekční markér, jako je např. gen pro aminoglykosidfosfotransferázu (APH), gen pro thymidinkinázu (TK), gen E. coli pro xantin-guaninfosforibosyltransferázu (Ecogpt) a gen pro dihydrofloatreduktázu (dhfr).

Pro produkci protilátky, použité v předkládaném vynálezu, může být použit jakýkoliv expresní systém, včetně systému eukariotických a prokariotických buněk. Eukariotické buňky zahrnují zavedené buněčné linie živočichů (např. savců, hmyzu, plísní a hub, kvasinek). Prokariotické buňky zahrnují buňky, jako např. buňky E. coli.

• * · · » ·4 « 44 44 44 ·4· 4 « · · · • 4 4 4 4 4 · 4 444 444

4 4 4 ····«·· 44 4·

Je upřednostňováno, když je protilátka, použitá v předkládaném vynálezu, exprimována v savčí buňce, jako jsou buňky CHO, COS, myelomové buňky, buňky BHK, Věro a HeLa.

Dále je transformovaná hostitelská buňka kultivována in vitro nebo in vivo, za účelem produkce požadované protilátky. Kultivace hostitelské buňky může být provedena podle jakékoliv známé metody. Kultivační medium, zde použitelné, může být medium DMEM, MEM, RPMI 1640 nebo IMDM. Kultivační medium může dále obsahovat sérový doplněk, jako je fetální telecí sérum (FCS).

7. Izolace a purifikace protilátky

Protilátka produkovaná a exprimovaná tak, jak je popsáno výše, může být izolována z buněk nebo těla hostitelského živočicha a purifikována do čistoty. Izolace a purifikace protilátky, použité v předkládaném vynálezu, může být provedena na afinitní koloně. Příklady proteinové A kolony zahrnují Hyper D, POROS a Sepharose F.F. (Pharmacia). Použity mohou být také jiné metody, běžně používané pro izolaci a purifikaci protilátek; metoda tedy není nijak konkrétně omezena.

Pro izolování a purifikování požadované protilátky mohou být použity samostatně nebo v kombinaci např. různé chromatografy, využívající kolony, včetně výše zmíněných afinitních kolon, filtrace, ultrafiltrace, vysolování a dialýza. (Antibodies A Laboratory Manual. Ed. Harlow, David Lané, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988).

8. Určení aktivit protilátky

Určení antigen-vazebné aktivity (Antibodies A Laboratory Manual. Ed. Harlow, David Lané, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988) nebo inhibiční aktivity proti receptoru ligandu (Harada A. et al., International Immunology (1993) 5, 681890) protilátky, použité v předkládaném vynálezu, může být provedeno podle kterýchkoliv známých metod.

Jako metoda pro určení antigen-vazebné aktivity protilátky proti PTHrP, použité v předkládaném vynálezu, může být například použita ELISA (enzyme-linked immunosorbing assay), EIA (enzyme immunoassay), RIA (radioimmunoassay) nebo fluorescenční protilátková technika. Například, když je použita EIA, je testovaný vzorkový roztok, obsahující protilátku proti PTHrP (např. kultivační

44

4 4 4

4 4 4

444 444

4 ♦* supernatant buněk, produkujících protilátku proti PTHrP, nebo protilátka proti PTHrP per se v purifikované formě) přidán na misku, která bylo před tím pokryta PTHrP (1-34). Na misku je dále přidána sekundární protilátka, značená enzymem (např. alkalickou fosfatázou). Miska je inkubována a promyta. Na misku je přidán substrát pro tento enzym (např. kyselina p-nitrofenylfosforečná) a je měřena absorbance roztoku na misce za účelem stanovení antigen-vazebné aktivity této protilátky.

Pro potvrzení aktivity protilátky, použité v předkládaném vynálezu, je určena neutralizační aktivita této protilátky (např. protilátky proti PTHrP).

9. Způsoby podávání a farmaceutické prostředky

Léčivo tohoto vynálezu může být použito pro léčení kachexie nebo zmírnění kachexie. Kachexie, léčená nebo zmírňovaná předkládaným vynálezem, může být jakéhokoliv typu, včetně rakovinou indukovaného typu. Mezi příklady rakovinou indukované kachexie patří ty, které jsou popsány v J. Urol. (SPOJENÉ STÁTY) březen 1995, 153 (3 Pt 1), str. 854-857; Langebecks Arch. Chir. Suppl II Vehr Dtsch Ges Chir (NĚMECKO) 1990, str. 261-265; Oncology (ŠVÝCARSKO) 1990, 47 (1) str. 87-91, Int. J. Pancreatol. (SPOJENÉ STÁTY) spren-říjen 1990, 7 (1-3) str. 141-150; J. Nati. Cancer Inst. (SPOJENÉ STÁTY)

19. prosince, 1990, 82 (24) str. 1922-1926.

Mezi příklady jiné kachexie, než je rakovinou indukovaná kachexie, patří ty, které jsou popsány v JPEN J. Parenter. Enteral Nur (SPOJENÉ STÁTY) říjenprosinec 1990, 14 (6) str. 605-609; Chest (SPOJENÉ STÁTY) říjen 1990, 98 (5) str. 1091-1094; Bone Marrow Transplant. (ANGLIE) červenec 1990, 6 (1) str. 53-57.

Léčivo předkládaného vynálezu, obsahující jako aktivní látku protilátku proti PTHrP, může být podáváno orálně nebo parenterálně, ale přednostně parenterálně. Toto léčivo může být v jakékoliv dávkové formě, jako např. transpulmonární léčivo (např. léčivo podávané pomocí nějakého přístroje jako je rozprašovač), nasogastrální léčivo, transdermální léčivo (např. mast, krém) nebo injekce. Mezi příklady injekcí patří intravenózní injekce (např. kapky), intramuskulární injekce, íntraperitoneální injekce a subkutánní injekce pro systemické nebo místní podání. Způsob podávání může být vhodně vybrán v závislosti na věku pacienta a podmínkách nemoci. Účinná samostatná dávka může být vybrána z rozmezí 0,001 do 1,000 mg na kg tělesné hmotnosti. Alternativně může být dávka pro pacienta vybrána z rozmezí 0,01 až 100,000 mg/tělo. Dávka léčiva předkládaného vynálezu, obsahující protilátku proti PTHrP, však není výše zmíněnými rozmezími nijak zvláště omezena.

Toto léčivo může být pacientovi podáváno v jakémkoliv stádiu, včetně stádií před a po rozvoji kachexie. Alternativně může být léčivo podáváno ve stádiu, kde je předpovídán rozvoj ztráty hmotnosti.

Léčivo předkládaného vynálezu, obsahující jako aktivní složku protilátku proti PTHrP, může být vytvořeno jakoukoliv běžnou metodou (Remingtonů Pharmaceutical Science, poslední vydání, Mark Publishing Company, Easton, USA). Přípravek může dále obsahovat farmaceuticky přijatelné nosiče a přísady. Mezi příklady takovýchto nosičů a přísad patří voda, farmaceuticky přijatelná organická rozpouštědla, kolagen, polyvinylalkohol, polyvinylpyrolidon, karboxyvinylový polymer, karboxymethylcelulosa sodíku, poly(akrylát sodný), arginát sodný, ve vodě rozpustný dextran, karboxymethylškrob sodíku, pektin, methylcelulosa, ethylcelulosa, xantanová guma, arabská guma, kasein, agar, polyethylenglykol, diglycerin, glycerin, propylenglykol, vaselina, parafin, stearylalkohol, lidský sérový albumin (HSA), mannitol, sorbitol, laktosa a surfaktanty, přijatelné jako farmaceutické přísady.

V praktickém použití je tato přísada vhodně vybrána z výše uvedených látek samostatně nebo v kombinaci, v závislosti na použité dávkové formě, ale jinak není omezena. Například, může být použita injekce, která je připravena rozpuštěním protilátky proti PTHrP v purifikované formě v nějakém rozpouštědlu (např. normálním roztoku NaCl, nějakém pufru, roztoku hroznového cukru) a poté přidáním adsorbci-bránícího činidla (např. Tween 80, Tween 20, nějaké želatina, lidský sérový albumin).

Léčivo předkládaného vynálezu může být také v rekonstituované, vymrazené formě, která je před použitím rozpuštěna. Pro přípravu vymrazené dávkové formy může být přidáno nějaké vehikulum, jako je cukerný alkohol (např. mannitol, hroznový cukr) a cukr.

99 · ·♦ ·· · 9 « • · · ·

99· 999

9 ·9

Přehled obrázků na výkresech

Obr. 1 je grafickým znázorněním léčebného účinku protilátky proti PTHrP u kachexie.

Obr. 2 je grafickým znázorněním léčebného účinku protilátky proti PTHrP u kachexie.

Obr. 3 je grafickým znázorněním léčebného účinku protilátky proti PTHrP u kachexie.

Obr. 4 je grafickým znázorněním léčebného účinku protilátky proti PTHrP u kachexie.

Obr. 5 je grafickým znázorněním výsledků měření antigen-vazebné aktivity.

Obr. 6 je grafickým znázorněním výsledků měření antigen-vazebné aktivity.

Obr. 7 je grafickým znázorněním výsledků měření antigen-vazebné aktivity.

Obr. 8 je grafickým znázorněním výsledků měření antigen-vazebné aktivity.

Obr. 9 je grafickým znázorněním výsledků měření antigen-vazebné aktivity.

Obr. 10 je grafickým znázorněním výsledků měření antigen-vazebné aktivity. Obr. 11 je grafickým znázorněním výsledků měření antigen-vazebné aktivity. Obr. 12 je grafickým znázorněním výsledků měření antigen-vazebné aktivity. Obr. 13 je grafickým znázorněním neutralizační aktivity humanizované protilátky.

Obr. 14 je grafickým znázorněním neutralizační aktivity humanizované protilátky.

Obr. 15 je grafickým znázorněním neutralizační aktivity humanizované protilátky.

Obr. 16 je grafickým znázorněním léčebné účinku humanizované protilátky u kachexie.

Obr. 17 je grafickým znázorněním léčebné účinku humanizované protilátky u kachexie.

Obr. 18 je grafickým znázorněním léčebné účinku humanizované protilátky u kachexie.

Obr. 19 je grafickým znázorněním léčebné účinku humanizované protilátky u kachexie.

• ·«« · ·· » ·« ·· ·· • « » · · • · · · · • · ·· · ··» • · · • ·· ·· ··

Dále bude předkládaný vynález popsán detailněji, s ohledem na následující příklady, které by neměly být chápány jako omezující technický rozsah tohoto vynálezu.

Příklady provedení vynálezu

Příklad 1

Farmakologický test, využívající zvířecího modelu kachexie

Myší monoklonální protilátka proti PTHrP byla testována na svůj léčebný účinek u kachexie, za použití zvířecího modelu kachexie (nahé myši s implantovaným lidským nádorem).

Jako zvířecí model kachexie byla použita nahá myš s implantovaným lidským karcinomem ústní dutiny OCC-1 (zakoupeným od Central Institute for Experimental Animals). Je známo, že nahá myš s implantovaným lidským karcinomem ústní dutiny OCC-1 vykazuje zvýšenou hladinu kalcia v krvi, jak dochází ke zvětšování objemu nádoru, a dochází u ní k vývoji příznaků kachexie, jako je ztráta hmotnosti a snížení hybnosti. V tomto testu bylo hodnoceno zmírňování takovýchto příznaků kachexie, indukované lidským karcinomem ústní dutiny OCC-1, myší monoklonální protilátkou, s ohledem na hladinu kalcia v krvi, ztrátu hmotnosti a vliv na prodloužení doby přežití.

Lidský karcinom ústní dutiny OCC-1 byl pasážován iv vivo za použití BALB/cnu/nu nahých myší (Japan CLEA Co., Inc.). Pro hodnocení farmakologického účinku byli zakoupeni 6 týdnů staří samci BALB/c-nu/nu nahých myší (Japan CLEA Co,, Inc.), kteří se nechali aklimatizovat 1 týden, aby tak vznikly 7 týdnů staré myši, které byly poskytnuty pro použití při měření.

Myší modely kachexie byly připraveny a rozděleny do skupin následujícím způsobem. Pasážovaný lidský karcinom ústní dutiny OCC-1 byl z nahé myši vyjmut a poté byl nařezán na 3-mm kostky. Výsledné nádorové kostky byly podkožně implantovány z boku do každé z myší, v dávce jeden kus na myš. Deset dní po implantaci, když bylo potvrzeno, že se objem nádoru u každé z myší dostatečně zvětšil, byly myši rozděleny do skupin, které byly poskytnuty pro použití jako zvířecí modely kachexie, tak, aby byly hladiny kalcia v krvi, tělesné hmotnosti a nádorové objemy myší v jednotlivých skupinách průměrně stejné.

Testování léčebného účinku u kachexie bylo provedeno následovně.

(1) Sledování doby přežití

Při testování prodloužení doby přežití byla myším testované skupiny podána myší monoklonální protilátka dvakrát za týden a byla pozorována doba přežití každé z myší. Myším druhé testované skupiny byla ocasní žílou podána, v dávkovém množství 15 mg/kg, jedna dávka existující látky, léčící hyperkalcemii, pamidronatu (pamidronat sodíku; Aredia). Jako kontrola v tomto testu byl myším kontrolní skupiny ocasní žílou podán dvakrát za týden fosfátem pufrovaný roztok NaCl (PBS), v dávkovém množství 0,2 ml na myš. Výsledky jsou ukázány na obr.l.

(2) Sledování hladiny kalcia v krvi

Myší monoklonální protilátka proti PTHrP byla podána myším modelům kachexie testované skupiny ocasní žílou, dvakrát, v intervalech dvou dnů, v dávkovém množství buď 10 pg nebo 100 pg na myš na každé podání. Myším druhé testované skupiny byla ocasní žílou podána, v dávkovém množství 15 mg/kg, jedna dávka existující látky, léčící hyperkalcemii, pamidronatu (pamidronat sodíku; Aredia). Jako kontrola v tomto testu byl myším kontrolní skupiny ocasní žílou podán dvakrát, v intervalech dvou dnů, fosfátem pufrovaný roztok NaCl (PBS), v dávkovém množství 0,2 ml na myš, na každá podání.

(3) Určení hladiny kalcia v krvi

Jeden a čtyři dny po podání myší monoklonální protilátky, byla za účelem stanovení farmakologické účinnosti protilátky, určena hladina kalcia v krvi každé z těchto myší. Hladina kalcia v krvi byla určena jako celková hladina ionizovaného kalcia v krvi, pomocí odebrání krve z každé myši přes očnici, za použití hematokritové trubice a vnesení krve do 643 Automatic Ca/pH Analyzeru (CIBA-CORNING). Tělesná hmotnost každé z myší byla vážena každý den do čtvrtého dne po podání protilátky. Výsledky jsou ukázány na obrázcích 2 a 3.

(4) Určení objemu nádoru

Objem nádoru byl určován čtyři dny po podání protilátky, změřením nejdelší osi • 999 • 99 • 99 99 99

9 9 9 9 9 · • 9 9*99 • 9 9 999999 (a mm) a nejkratší osi (b mm) nádoru a dosazením obou naměřených hodnot do Galantovi rovnice [ab²/2j. Výsledky jsou ukázány na obr. 4.

Jak je zjevné z těchto výsledků, ačkoliv vykázaly myši, kterým byla podána protilátka v dávkovém množství 10 pg, ekvivalentní hladiny kalcia v krvi jako myši, kterým byl podán pamidronat, bylo u myší, kterým byla podána protilátka, pozorováno zamezení ztrátě hmotnosti, protože ztráta hmotnosti nebyla tak výrazná, jako u myší, kterým byl podán pamidronat. U myší, kterým byla podána protilátka v dávkovém množství 100 pg, došlo k zabránění zvýšení hladina kalcia v krvi a zamezení ztrátě hmotnosti na vyšší úrovni, ve srovnání s myšmi, kterým byl podán pamidronat, a kontrolními myšmi. U myší, kterým byla podána neutralizační protilátka proti PTHrP v dávkovém množství 100 pg dvakrát za týden, byla ve srovnání s myšmi, kterým byl podán pamidronat, a kontrolními myšmi, pozorována významná úroveň prodloužení doby přežití (p=0,0003 : Log Rank test). Jako výsledek bylo zjištěno, že má neutralizační myší monoklonální protilátka proti PTHrP vynikající účinek, který nevykazuje žádná existují látka na léčení hyperkalcemie, jako je zamezení ztrátě hmotnosti a prodloužení doby přežití. Tyto výsledky ukazují, že protilátka, použitá v tomto testu, je užitečná jako léčivo pro kachexii spojenou se zhoubným bujením.

Příklad 2

Farmakologický test, využívající zvířecího modelu hyperkalcemie a kachexie Humanizovaná protilátka verze „q“ proti PTHrP byla testována na svůj léčebný účinek u kachexie, za použití zvířecího modelu kachexie (nahé myši s implantovaným lidským nádorem).

Jako zvířecí model kachexie byla použita nahá myš s implantovaným lidským karcinomem ústní dutiny OCC-1 (zakoupeným od Central Institute for Experimental Animals). Je známo, že nahá myš s implantovaným lidským karcinomem ústní dutiny OCC-1 vykazuje zvýšenou hladinu kalcia v krvi, jak dochází ke zvětšování objemu nádoru, a dochází u ní k vývoji příznaků kachexie, jako je ztráta hmotnosti a snížení hybnosti. V tomto testu bylo hodnoceno zmírňování takovýchto příznaků kachexie, indukované lidským karcinomem ústní dutiny OCC-1, humanizovanou protilátkou verze „q“, s ohledem na hladinu kalcia v krvi, ztrátu hmotnosti a vliv na prodloužení doby přežití.

• t· »· ··

9 9 9 9 9 9 9 · 9 9 9 9

9 9 999999

9 9 9

9999999 99 99

Subkultivace lidského karcinomu ústní dutiny OCC-1 byla provedena iv vivo za použití BALB/c-nu/nu nahých myší (Japan CLEA Co., Inc.). Pro hodnocení farmakologického účinku byli zakoupeni 6 týdnů staří samci BALB/c-nu/nu nahých myší (Japan CLEA Co., Inc.), kteří se nechali aklimatizovat 1 týden, aby tak vznikly 7 týdnů staré myši, které byly poskytnuty pro použití při měření.

Myší modely kachexie byly připraveny a rozděleny do skupin následujícím způsobem. Pasážovaný lidský karcinom ústní dutiny OCC-1 byl z nahé myši vyjmut a poté byl nařezán na 3-mm kostky. Výsledné nádorové kostky byly podkožně implantovány z boku do každé z myší, v dávce jeden kus na myš. Deset dní po implantaci, když bylo potvrzeno, že se objem nádoru u každé z myší, dostatečně zvětšil, byly myši rozděleny do skupin, které byly poskytnuty pro použití jako zvířecí modely kachexie, tak, aby byly hladiny kalcia v krvi, tělesné hmotnosti a nádorové objemy myší v jednotlivých skupinách průměrně stejné.

Testování léčebného účinku u kachexie bylo provedeno následovně.

(1) Sledování doby přežití

Při testování prodloužení doby přežití byla myším testované skupiny podána humanizovaná protilátka verze „q“ dvakrát za týden a byla pozorována doba přežití každé z myší. Jako kontrola v tomto testu byl myším kontrolní skupiny ocasní žílou podán dvakrát za týden fosfátem pufrovaný roztok NaCl (PBS), v dávkovém množství 0,1 ml na myš. Výsledky jsou ukázány na obr.16.

(2) Sledování hladiny kalcia v krvi

Humanizovaná protilátka verze „q“ byla podána myším modelům kachexie testované skupiny ocasní žílou, dvakrát, v intervalech dvou dnů, v dávkovém množství buď 10 pg nebo 100 pg na myš na každé podání. Jako kontrola v tomto testu byl myším kontrolní skupiny ocasní žílou podán dvakrát, v intervalech dvou dnů, fosfátem pufrovaný roztok NaCl (PBS), v dávkovém množství 0,1 ml na myš, na každá podání.

(3) Určení hladiny kalcia v krvi

Jeden a čtyři dny po podání humanizované protilátky verze „q“, byla za účelem • 9999 9 99 99 99

99« 9· 99 9999 « 999 ♦ · « 9 9 9

99 9 9 9 999999

9 9 9 9 9 stanovení farmakologické účinnosti této protilátky, určena hladina kalcia v krvi každé z těchto myší. Hladina kalcia v krvi byla určena jako celková hladina ionizovaného kalcia v krvi, pomocí odebrání krve z každé myši přes očnici, za použití hematokritové trubice a vnesení krve do 643 Automatic Ca/pH Analyzeru (CIBA-CORNING). Tělesná hmotnost každé z myší byla vážena každý den do čtvrtého dne po podání protilátky. Výsledky jsou ukázány na obrázcích 17 a 18.

(4) Určení objemu nádoru

Objem nádoru byl určován čtyři dny po prvním podání protilátky, změřením nejdelší osi (a mm) a nejkratší osi (b mm) nádoru a dosazením obou naměřených hodnot do Galantovi rovnice [ab²/2j. Výsledky jsou ukázány na obr. 19.

Jak je zjevné z těchto výsledků, došlo u myší, kterým byla podána humanizovaná protilátka verze „q“ v dávkovém množství buď 10 pg nebo 100 pg, k zabránění zvyšování hladiny kalcia v krvi a u myší, kterým byla podána protilátka, bylo pozorováno zamezení ztrátě hmotnosti, protože ztráta hmotnosti nebyla tak výrazná, jako u kontrolních myší. U myší, kterým byla podána humanizovaná protilátka verze „q“ v dávkovém množství 100 pg dvakrát týdně, byla ve srovnání s kontrolními myšmi, pozorována významná úroveň prodloužení doby přežití (ρ^Ο,ΟΙΟδ : Log Rank test). Účinnost humanizované protilátky verze „q“ u modelových zvířat s kachexii spojenou se zhoubným bujením byla podobná jako účinnost výše testované myší monoklonolní protilátky. Tyto výsledky ukazují, že protilátka, použitá v tomto testu, je užitečná jako léčivo pro kachexii spojenou se zhoubným bujením.

Příklad 3

Příprava hybridomů, produkujících myší monoklonální protilátku proti PTHrP (1-34)

Hybridomy, schopné produkce monoklonální protilátky proti lidskému PTHrP (1-34) (SEQ I. Č. : 75), #23-57-154 a #23-57-137-1, byly připraveny podle metody, popsané v Kanji Sáto et al. (Sáto K. et al., J. Bone Miner. Res. 8, 849860, 1993).

Použitým imunogenem byl PTHrP (1-34) (Penisula), ke kterému byl karbodiimidem připojen nosičový protein thyreoglobulin (Dojinn). S • 9»· 9

99

99 99 99

9 9 9 9 9 9

9 «999 • 9 · «·«««« • 9 9 9 *99 9999 99 99 thyreoglobulinem spojený PTHrP (1-34) byl dialyzován, aby byl získán roztok, obsahující koncentraci proteinu 2 pg/ml.

Výsledný roztok byl smíchán s Freundovým adjuvans (Difco) v poměru 1:1, aby vznikla emulze. Tato byla injikována 16 samicím myší BALB/C, 11 krát subkutánně na hřbetní straně nebo intraperitoneálně, v dávkovém množství 100 pg na myš na každou injekci, čímž byly tyto myši imunizovány. Pro prvotní imunizaci bylo použito Freundovo kompletní adjuvans, zatímco pro zesilovací imunizaci bylo použito Freundovo nekompletní adjuvans.

U každé myši byl následujícím způsobem určen titr protilátky v séru. To jest, každé z těchto myší byla z její ocasní žíly odebrána krev a anti-sérum bylo odděleno od krve. Anti-sérum bylo zředěno RIA pufrem a smícháno s PTHrP (134), značeným ¹²⁵I, za účelem určení vazebné aktivity. Myším, u kterých bylo potvrzeno, že mají dostatečně zvýšený titr, byl intraperitoneálně injikován PTHrP (1-34) bez nosičového proteinu, v dávkovém množství 50 pg na myš pro konečnou imunizaci.

Tři dny po konečné imunizaci byla myš utracena a byla z ní odebrána slezina. Buňky sleziny byly podrobeny fúzi s myší myelomovou buněčnou linií P3x63Ag8U.l podle kterékoliv běžně známé metody, za použití 50% polyethylenglykolu 4000. Takto připravené fúzované buňky byly vysety do každé z 85 jamek 96-jamkových destiček v množství 2 x 10⁴ na jamku. Hybridomy byly prověřovány v HAT mediu následovně.

Prověřování hybridomů bylo prováděno tak, že byla zjišťována přítomnost PTHrP-rozpoznávající protilátky v kultivačním supernatentu jamek, ve kterých byl v HAT mediu pozorován buněčný růst, pomocí RIA metody v pevné fázi. Hybridomy byly shromážděny z jamek, ve kterých byla potvrzena vazebná schopnost PTHrP-rozpoznávající protilátky. Takto získané hybridomy byly rozpuštěny v mediu RPMI-1640, obsahujícím 15% FSC, doplněné OPI doplňkem (Sigma). Následovalo sjednocení těchto hybridomů metodou limitovaného zředění. Takto mohly být získány dva typy hybridomových klonů, #23-57-154 a #23-57-137-1, z nichž oba měly silnou vazebnou aktivitu k PTHrP (1-34).

Hybridomový klon #23-57-137-1 byl označen jako „hybridom myš-myš #23-57137-1“ a byl uložen podle Budapešťské dohody, 15. srpna 1996 v National Institute of Bioscience and Human-technology, Agency of Industrial Science ·· · and Technology, Japonsko (1-3, Higashi 1-chome, Tsakuba-shi, Ibaraki, Japonsko) pod přístupovým číslem FERM BP-5631.

Příklad 4

Klonování DNA, kódující V-oblast myší monoklonální protilátky proti lidskému PTHrP (1-34).

Klonování DNA, kódující V- oblast myší monoklonální protilátky proti lidskému PTHrP (1-34) #23-57-137-1 bylo provedeno následujícím způsobem.

(1) Příprava mRNA mRNA z hybridomu #23-57-137-1 byla připravena za použití Quick Prep mRNA Purification Kitu (Pharmacia Biotech). To jest, buňky hybridomu #23-57-137-1 byly plně homogenizovány extrakčním pufrem a na koloně oligo(dT)-Cellulose Spun Collumn z nich byla podle přiložených instrukcí izolována a purifikována mRNA. Výsledný roztok byl podroben ethanolovému srážení za účelem získání mRNA ve formě sraženiny. Sraženina mRNA byl rozpuštěna v eluěním pufru.

(2) Vytvoření a amplifikace cDNA pro gen, kódující myší H-řetězcovou Voblast (i) Klonování cDNA pro H-řetězcovou V-oblast protilátky #23-57-137-1.

Gen, kódující H-řetězcovou V-oblast myší monoklonální protilátky proti PTHrP, byl klonován pomocí 5' RACE metody (Frohman M. A. et al., Proč. Nati. Acad. Sci. USA, 85, 8998-9002, 1988; Belyavsky A. et al., Nucleic Acids Res. 17, 2919-2932, 1989). 5' RACE metoda byla provedena za použití 5'-Ampli FINDER RACE Kitu (Clonetech) podle instrukcí, obsažených v této soupravě. Při této metodě byl primerem pro syntézu cDNA primer MHC2 (SEQ I. Č. : 1), který je schopen hybridizace s myším H-řetězcovou C-oblastí. Výše připravená mRNA (asi 2 pg), která byla templátem pro syntézu cDNA, byla smíchána s MHC2 primerem (10 pmol). Výsledná směs se nechala reagovat s reverzní transkriptázou při 52 °C po dobu 30 min, za účelem provedení reverzní transkripce mRNA na cDNA.

K výslednému reakěnímu roztoku byl přidán 6N NaOH, za účelem hydrolýzy zbylé RNA v roztoku (při 65 °C po dobu 30 min) a poté byl podroben ethanolovému srážení, za účelem izolace a purifikace cDNA jako sraženiny.

• · · · · ··· ··· • · · · · **· ···· w· ··

Purifikovaná cDNA byla ligována s Ampli FINDER Anchor (SEQ I. Č. : 42) na 5' konci reakcí s T4 RNA ligázou při 37 °C po dobu 6 hodin a navíc při pokojové teplotě po dobu 16 hodin. Jako primery pro amplifikaci cDNA pomocí metody PCR byly použity Anchor primer (SEQ I. Č. : 2) a MHC-G1 primer (SEQ I. Č. : 3) (S.T. Jones et al., Biotechnology 9, 88, 1991).

PCR roztok obsahoval (na 50 μΐ) 10 mM Tris-HCl (pH 8,3), 50 mM KC1,

0,25 mM dNTP (dATP, dGTP, dCTP, dTTP), 1,5 mM MgCl₂, 2,5 jednotek TaKaRa Taq (TaKaRa Shuzo Co., Ltd.), 10 pmol Anchor primeru a 1 μΐ reakční směsi cDNA, se kterou byl ligován MHC-G1 primer a Amli FINDER Anchor primer. Roztok byl převrstven minerálním olejem (50 μΐ). PCR bylo provedeno v přístroji Thermal Cycler Model 480J (Perkin Elmer) 30 cykly, za podmínek :

°C - 45 sek.; 60 °C - 45 sek.; a 72 °C - 2 min.

(ii) Klonování cDNA pro L-řetězcovou V- oblast

Gen, kódující L-řetězcovou V-oblast myší monoklonální protilátky proti PTHrP, byl klonován pomocí 5' RACE metody (Frohman M. A. et al., Proč. Nati. Acad.

Sci. USA, 85, 8998-9002, 1988; Belyavsky A. et al., Nucleic Acids Res. 17, 2919-2932, 1989). 5' RACE metoda byla provedena za použití 5'-Ampli Finder RACE Kitu (Clonetech) podle instrukcí, obsažených v této soupravě. Při této metodě byl jako primer pro syntézu cDNA použit primer oligo-dT. Výše připravená mRNA (asi 2 pg), která byla templátem pro syntézu cDNA, byla smíchána s oligo-dT primerem. Výsledná směs se nechala reagovat s reverzní transkriptázou při 52 °C po dobu 30 min, za účelem provedení reverzní transkripce mRNA na cDNA. K výslednému reakčnímu roztoku byl přidán 6N NaOH, za účelem hydrolýzy zbylé RNA v roztoku (při 65 °C po dobu 30 min). Výsledný roztok byl podroben ethanolovému srážení, za účelem izolace a purifikace cDNA jako sraženiny. Takto syntetizovaná cDNA byla ligována s Ampli FINDER Anchor na 5' konci reakcí s T4 RNA ligázou při 37 °C po dobu 6 hodin a navíc při pokojové teplotě po dobu 16 hodin.

Byl navržen PCR primer MLC (SEQ I. Č. : 4), na základě konzervované sekvence myší LX-řetězcové C-oblasti, a byl syntetizován za použití přístroje 394 DNA/RNA Synthesizer (ABI). PCR roztok obsahoval (na 100 μΐ) 10 mM Tris-HCl (pH 8,3), 50 mM KC1, 0,25 mM dNTP (dATP, dGTP, dCTP, dTTP),

1,5 mM MgCl₂, 2,5 jednotek AmpliTaq (PERKIN ELMER), 50 pmol Anchor primeru (SEQ L Č. : 2) a 1 pl reakční směsi cDNA, se kterou byl ligován MLC (SEQ L Č. : 4) a Amli FINDER Anchor primer. Roztok byl převrstven minerálním olejem (50 pl). PCR bylo provedeno v přístroji Thermal Cycler Model 480J (Perkin Elmer) 30 cykly, za podmínek : 94 °C - 45 sek.; 60 °C - 45 sek.; a 72 °C - 2 min.

(3) Purifikace a fragmentace PCR produktů

Každý z DNA fragmentů, amplifikovaných výše popsanými metodami PCR, byl oddělen pomocí elektroforézy na agarózovém gelu z 3% Nu Sieve GTG agarózy (FMC Bio. Products). Pro H-řetězcovou V-oblast i L-řetězcovou V-oblast byla z gelu vyříznuta část agarózového gelu, obsahujícího DNA fragment o velikosti asi 550 bp. Každá z těchto částí gelu byla podrobena purifikací požadovaného DNA fragmentu, za použití GENECLEAN II Kitu (BIO101), podle instrukcí, které byly součástí této soupravy. Purifikovaná DNA byla vysrážena ethanolem a tento DNA precipitát byl rozpuštěn ve 20 pl roztoku, obsahujícího 10 mM Tris-HCl (pH 7,4) a 1 mM EDTA. Část (1 pl) tohoto DNA roztoku byla štěpena restrikčním enzymem Xmal (New England Biolabs) při 37 °C po dobu 1 hodiny a dále byla štěpena restrikčním enzymem EcoRI (Takara Shuzo Co., Ltd.) při 37 °C po dobu 1 hodiny. Tento roztok byl extrahován fenolem a chloroformem a poté byl vysrážen ethanolem, za účelem shromáždění DNA. Tímto způsobem byly získány DNA fragmenty, obsahující jednotlivě gen, kódující myší H-řetězcovou V-oblast, a gen, kódující myší L-řetězcovou V-oblast, z nichž oba měly EcoRI rozpoznávanou sekvenci na 5' konci a Xmal rozpoznávanou sekvenci na 3' konci.

EcoRI-Xmal DNA fragmenty, obsahující jednotlivě gen, kódující myší H-řetězcovou V-oblast, a gen, kódující myší L-řetězcovou V-oblast, byly odděleně ligovány do vektoru pUC19, který byl štěpen EcoRI a Xmal při 16 °C po dobu 1 hodiny, za použití DNA Ligation Kitu ver. 2 (Takara Shuzo Co., Ltd.), podle instrukcí, které byly součástí této soupravy. Část (10 pl) této ligační směsi byla přidána ke 100 pl roztoku, obsahujícího kompetentní kuňky

E. coli, JM 109 (Nippon Gene Co., Ltd). Buněčná směs se nechala stát v ledu po dobu 15 minut, při 42 °C po dobu 1 minuty a navíc po dobu 1 minuty v ledu. K výsledné buněčné směsi bylo přidáno 300 pl SOC media (Molecular Cloning : A Laboratory manual, Sambrook et al., Cold Spring Harbor Laboratory Press, ··

1989) a poté byla inkubována při 37 °C po dobu 30 minut. Výsledný buněčný roztok byl nanesen na LB agarové medium nebo na 2xYT agarové medium (Molecular Cloning : A Laboratory manual, Sambrook et al., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989), obsahující buď 100 nebo 50 pg/ml ampicilinu, 0,1 mM IPTG a 20 pg/ml X-galu, a byl inkubován při 37 °C přes noc. Tímto způsobem byly připraveny E. coli transformanty.

Tyto transformanty byly kultivovány přes noc při 37 °C ve 2 ml LB nebo 2xYT media, obsahujícího buď 100 nebo 50 pg/ml ampicilinu. K získání plazmidové DNA z buněčné frakce byl použit Plazmid Extracter PI-100 (Kurabo Industries Ltd.) nebo Qiaprep Spin Plasmid Kit (QIAGEN). Takto získaná DNA byla sekvenována.

(4) Sekvenování genu, kódujícího V-oblast myší protilátky

Nukleotidová sekvence cDNA kódujícího úseku, neseného na plazmidu, byla určena v DNA Sequenceru 373A (ABI; Perkin-Elmer), za použití Dye Terminátor Cycle Sequencing Kitu (Perkin-Elmer). Při tomto sekvenování byly použity primery M13 Primer M4 (Takara Shuzo Co., Ltd.) (SEQ I. Č. : 5) a M13 Primer RV (Takara Shuzo Co., Ltd.) (SEQ I. Č. : 6) a nukleotidová sekvence byla potvrzena v obou směrech.

Plazmid, obsahující gen, kódující H-řetězcovou V-oblast odvozenou od hybridomu #23-57-137-1, byl označen jako „MBC1H04“ a plazmid, obsahující gen, kódující L-řetězcovou V-obast odvozenou od hybridomu #23-57-137-1, byl označen jako „MBC1L24“. Nukleotidové sekvence (včetně odpovídajících aminokyselinových sekvencí) DNA, kódující H-řetězcovou V-oblast odvozenou od myší protilátky #23-57-137-1, v plazmidu MBC1H04 a genu, kódujícího L-řetězcovou V-oblast odvozenou od myší protilátky #23-57-137-1, v plazmidu MBC1H24, jsou jednotlivě ukázány v SEQ. I. Č. : 57 a 65. Oba polypeptidy pro fragment H-řetězcové V-oblasti a pro fragment L-řetězcové V-oblasti začínaly jednotlivě od 58. nukleotidu (který kóduje glutamin) v DNA sekvencích, ukázaných jednotlivě v SEQ. I. Č. : 57 a 65. Aminokyselinové sekvence polypeptidů H-řetězcové V-oblasti a L-řetězcové V-oblasti jsou také jednotlivě ukázány v SEQ. I. Č. : 46 a 45.

Kmen E. coli, obsahující plazmid MBC1H04, a kmen E. coli, obsahující plazmid MBC1L24, byly jednotlivě označeny jako „Escherichia coli JM109 (MBC1H04)“ • · · 9 • · ·

a „Escherichia coli JM109 (MBC1L24)“. Tyto kmeny E. coli byly uloženy podle Budapešťské dohody, v National Institute of Bioscience and HumanTechnology, Agency of Industrial Science and Technology, Japonsko (1-3, Higashi 1-chome, Tsakuba-shi, Ibaraki, Japonsko) 15. srpna 1996 pod přístupovým číslem FERM BP-5628 pro „Escherichia coli JM109 (MBC1H04)“ a FERM BP-5627 pro „Escherichia coli JM109 (MBC1L24)“.

(5). Určení CDR myší monoklonální protilátky #23-57-137-1 proti lidskému PTHrP

H-řetězcová V-oblast a L-řetězcová V-oblast mají vzájemně podobné některé obecné struktury, ve kterých jsou čtyři úseky základní struktury (FR) spojeny přes hypervariabilní úseky (to jest komplemenatritu určující úseky; CDR). Aminokyselinové sekvence FR jsou relativně dobře konzervované, zatímco aminokyselinové sekvence CDR mají extrémně vysokou variabilitu (Kabat : A. et al., „Sequence of proteins of Immunological Interest“ US Dept. Health a Human Service, 1983). Vzhledem k těmto faktům byla homologie aminokyselin mezi V-oblastmi myší monoklonální protilátky proti lidskému PTHrP určena s ohledem na databázy aminokyselinových sekvencí pro protilátky, vytvořené Kabatem et al. CDR V-oblastí byly tedy určeny, jak ukazuje tabulka 1. Aminokyselinové sekvence CDR 1-3 L-řetězcové V-oblasti jsou jednotlivě ukázány v SEQ I. Č. : 59 až 61; a aminokyselinové sekvence CDR 1-3 H-řetězcové V-oblasti jsou jednotlivě ukázány v SEQ I. Č. : 62 až 64.

Tabulka 1

V-oblast	SEQ I. Č.	CDR1	CDR2	CDR3
H-řetězcová V-oblast	57	31-35	50-66	99-107
L-řetězcová V-oblast	65	23-34	50-60	93-105

Příklad 5 Vytvoření chimerní protilátky (1) Vytvoření H-řetězce chimerní protilátky (i) Vytvoření H-řetězcové V-oblasti

Za účelem ligování do expresního vektoru, nesoucího genomovou DNA lidské • ·

H-řetězcové C-oblasti Cyl, byla klonovaná DNA, nesoucí myší H-řetězcovou V-oblast, modifikována metodou PCR. Zpětný primer MBC-S1 (SEQ I. Č. : 7) byl navržen tak, aby hybridizoval s DNA sekvencí, kódující 5' úsek vedoucí sekvence V-oblasti, a aby obsahoval jak Kozákovu konsensus sekvenci (Kozák M. et al., J. Mol. Biol., 196, 947-950, 1987) tak i HindlII-rozpoznávanou sekvenci. Přední primer MBCl-a (SEQ I. Č. : 8) byl navržen tak, aby hybridizoval s DNA sekvencí, kódující 3' úsek vedoucí sekvence J-úseku, a aby obsahoval jak sekvenci pro 5' sestřih tak i BamHI-rozpoznávanou sekvenci. PCR reakce byla provedena za použití Ex Taq (TaKaRa Shuzo Co., Ltd) a k ní náležejícího pufru. PCR roztok obsahoval (na 50 μΐ) 0,07 pg plazmidu MBC1H04 jako templátové DNA, 50 pmol MBCl-a a 50 pmol MBC1-S1 jako primery, 2,5 U TaKaRa Ex Taq a 0,25 mM dNTP v pufru, na který bylo navrstveno 50 μΐ minerálního oleje. PCR bylo provedeno 30 cykly, za podmínek: 94 °C - 1 min; 55 °C - 1 min; a 72 °C - 2 min.

DNA fragmenty, takto amplifikované metodou PCR, byly odděleny pomocí elektroforézy na agarózovém gelu z 3% Nu Sieve GTG agarózy (FMC Bio. Products).

Poté byla vyříznuta část agarózového gelu, obsahující DNA fragment o velikosti 437 bp a tento DNA fragment z ní byl purifikován za použití GENECLEAN II Kitu (BIO101), podle instrukcí, které byly součástí této soupravy. Purifikovaná DNA shromážděna ethanolovým srážením a poté rozpuštěna ve 20 μΐ roztoku, obsahujícího 10 mM Tris-HCl (pH 7,4) a 1 mM EDTA. Část (1 μΐ) výsledného DNA roztoku byla štěpena restrikčními enzymy BamHI a HindlII (Takara Shuzo Co., Ltd) při 37 °C po dobu 1 hodiny. Tento roztok byl extrahován fenolem a chloroformem a poté byl vysrážen ethanolem, za účelem shromáždění požadované DNA.

Získaný HindlII-BamHI DNA fragment, který obsahoval gen, kódující myší H-řetězcovou V-oblast, byl subklonován do vektoru pUC19, který byl štěpen HindlII a BamFII. Výsledný plazmid byl sekvenován na DNA Sequenceru 373A (Perkin-Elmer), za použití primerů M13 Primer M4 a M13 Primer RV a Dye Terminátor Cycle Sequencing Kitu (Perkin-Elmer). Jako výsledek byl získán plazmid, který nesl gen správné nukleotidové sekvence, kódující H-řetězcovou V-oblast, odvozenou od hybridomu #23-57-137-1, a obsahující HindlIIrozpoznávanou sekvenci a Kozákovu sekvenci ve svém 5' úseku a BamHI• 4

rozpoznávanou sekvenci ve svém 3' úseku a který byl označen jako „MBClH/pUC19“.

(ii) Vytvoření H-řetězcové V-oblasti pro cDNA chimerního H-řetězce myščlověk.

Za účelem ligování s cDNA pro lidskou H-řetězcovou C-oblast Cyl, byla DNA, kódující myší H-řetězcovou V-oblast, vytvořená tak, jak je popsáno výše, modifikována metodou PCR. Zpětný primer MBC1HVS2 (SEQ I. Č. : 9) byl navržen tak, aby způsobil nahrazení druhé aminokyseliny (asparaginu) v sekvenci, kódující přední část vedoucí sekvence pro H-řetězcovou V-oblast, za glycin a aby obsavoval Kozákovu konsensus sekvenci (Kozák M. et al., J. Mol. Biol., 196, 947-950, 1987) a HindlII-a EcoRI-rozpoznávanou sekvenci. Přední primer MBC1HVR2 (SEQ I. Č. : 10) pro H-řetězcovou V-oblast byl navržen tak, aby hybridizoval s DNA sekvencí, kódující 3' úsek J-úseku, aby kódoval 5' úsek C úseku a aby obsahoval Apal- a Smal-rozpoznávanou sekvenci.

PCR reakce byla provedena za použití TaKaRa Ex Taq (TaKaRa Shuzo Co., Ltd) a k ní náležejícího pufru. PCR roztok obsahoval (na 50 pl) 0,6 pg plazmidu MBClH/pUC19 jako templátové DNA, 50 pmol MBC1HVS2 a 50 pmol MBC1HVR2 jako primery, 2,5 U TaKaRa Ex Taq a 0,25 mM dNTP v pufru, na který bylo navrstveno 50 pl minerálního oleje. PCR reakce byla provedena 30 cykly, za podmínek ; 94 °C - 1 min; 55 °C - 1 min; a 72 °C - 1 min.

DNA fragmenty, amplifikované touto PCR reakcí, byly odděleny pomocí elektroforézy na agarózovém gelu z 1% Sea Kem GTG Agarózy (FMC Bio. Products). Poté byla vyříznuta část agarózového gelu, obsahující DNA fragment o velikosti 456 bp a tento DNA fragment z ní byl purifikován za použití GENECLEAN II Kitu (BIO101), podle instrukcí, které byly součástí této soupravy. Purifikovaná DNA vysrážena ethanolem a poté byla rozpuštěna ve 20 pl roztoku, obsahujícího 10 mM Tris-HCl (pH 7,4) a 1 mM EDTA.

Výsledný DNA roztok (1 pg) byl štěpen restrikčními enzymy EcoRI a Smál (Takara Shuzo Co., Ltd) při 37 °C po dobu 1 hodiny. Tento roztok byl extrahován fenolem a chloroformem a poté byl vysrážen ethanolem, za účelem shromáždění DNA.

Získaný EcoRI-Smal DNA fragment, který obsahoval gen, kódující myší H-řetězcovou V-oblast, byl subklonován do vektoru pUC19, který byl štěpen

• « · ·

EcoRI a Smál. Výsledný plazmid byl sekvenován na DNA Sequenceru 373A (Perkin-Elmer), za použití primerů M13 Primer M4 a M13 Primer RV a Dye Terminátor Cycle Sequencing Kitu (Perkin-Elmer). Jako výsledek byl získán plazmid, který nesl gen správné nukleotidové sekvence, kódující H-řetězcovou V-oblast, odvozenou od hybridomů #23-57-137-1, a obsahující EcoRI- a HindlII-rozpoznávanou sekvenci a Kozákovu sekvenci ve svém 5' úseku a Apaa Smal-rozpoznávanou sekvenci ve svém 3' úseku a který byl označen jako „MBClHv/pUC19“.

(iii) Vytvoření expresního vektoru pro H-řetězec chimerní protilátky.

cDNA, obsahující DNA pro H-řetězcovou C-oblast Cyl, byla připravena následovně. Z buněk CHO, do kterých byl zaveden jak expresní vektor DHFRΔΕ-RVh-PM-1-f (viz WO 92/19759), kódující genomové DNA H-řetězcové V-oblasti humanizované protilátky PM1 a H-řetězcové C-oblasti lidské protilátky IgGl (N. Takahashi et al., Cell 29, 671-679, 1982) tak i expresní vektor RVl-PMla (viz WO 92/19759), kódující genomové DNA L-řetězcové V-oblasti humanizované protilátky PM1 a Lic-řetězcové C-oblasti lidské protilátky, byla připravena mRNA. Za použití této mRNA, byla pomocí RT-PCR metody klonována cDNA, obsahující H-řetězcovou V-oblast humanizované protilátky PM1 a C-oblast CXl lidské protilátky, a poté byla subklonována do vektoru pUC19 do míst HindlII a BamHI. Po sekvenování byl získán plazmid, který měl správnou nukleotidovou sekvenci a který byla označen jako „pRVhPMlf-cDNA“.

Pro přípravu expresního vektoru pro cDNA, obsahující gen pro H-řetězcovou V-oblast humanizované protilátky PM1 a gen pro C-oblast CZl lidské protilátky, byl připraven expresní vektor DHFR-AE-RVh-PM-1-f , ve kterém byla deletována obě HindlII místa mezi SV40 promotorem a DHFR genem a EcoRI místo mezi EF-Ια promotorem a genem pro H-řetězcovou V-oblast humanizované protilátky PM1.

Získaný plazmid (pRVh-PMlf-cDNA) byl štěpen BamHI, zatupen Klenowovým fragmentem a dále štěpen HindlII, čímž byl získán zatupený HindlII-BamHI fragment. Tento zatupený HindlII-BamHI fragment byl ligován do výše zmíněného expresního vektoru DHFR-AE-RVh-PM-1-f, ve kterém byla deletována místa HindlII a EcoRI, který byla štěpen HindlII a BamHI. Takto byl • φ · φ φ φ φ φ φ φ φ φ φ · φ φ ΦΦΦ ΦΦΦ vytvořen expresní vektor RVh-PMlf-cDNA, který obsahoval cDNA, kódující Hřetězcovou V-oblast humanizované protilátky PM1 a C-oblast CÁl lidské protilátky.

Expresní vektor RVh-PMlf-cDNA, obsahující cDNA, kódující H-řetězcovou V-oblast humanizované protilátky PM1 a C-oblast CZl lidské protilátky, byl štěpen Apal a BamHI a byl z něho shromážděn DNA fragment, obsahující H-řetězcovou C-oblast. Výsledný DNA fragment byl zaveden do výše zmíněného plazmidu MBClHv/pUC19, který byl štěpen Apal a BamHI. Takto připravený plazmid byl označen jako „MBClHcDNA/pUC19“. Tento plazmid obsahoval cDNA, kódující H-řetězcovou V-oblast myší protilátky a C-oblast CZl lidské protilátky a obsahoval EcoRI- a HindlII-rozpoznávanou sekvenci ve jejím 5' úseku a BamHI-rozpoznávanou sekvenci ve svém 3' úseku.

Plazmid MBClHcDNA/pUC19 byl štěpen EcoRI a BamHI, za účelem získání DNA fragmentu, obsahujícího nukleotidovou sekvenci, kódující chimerní protilátkový H-řetězec. Výsledný DNA fragment byl zaveden do expresního vektoru pCOSl, který byl štěpen EcoRI a BamHI, čímž vznikl expresní vektor pro chimerní protilátku, který byl označen jako „MBCIHcDNA/pCOSI“. Expresní vektor pCOSl zde byl vytvořen za použití HEF-PMh-gyl (viz WO 92/19759), z něhož byly štěpením EcoRI a Smál deletovány protilátkové geny a který byl poté ligován s EcoRI-Notl-BamHI Adaptorem (Takara Shuzo Co., Ltd.).

Pro přípravu plazmidu pro expresi v buňkách CHO byl plazmid MBC 1 HcDNA/pUC 19 štěpen EcoRI a BamHI, za účelem získání DNA fragmentu, obsahujícího nukleotidovou sekvenci, kódující chimerní protilátkový H-řetězec. DNA fragment byl zaveden do expresního vektoru pCHOl, který byl štěpen EcoRI a BamHI, čímž vznikl expresní vektor pro chimerní protilátku, který byl označen jako „MBCIHcDNA/pCHOl“. Expresní vektor pCHOl zde byl vytvořen za použití DHFR-AE-RVh-PM-1-f (viz WO 92/19759), z něhož byly štěpením EcoRI a Smál deletovány protilátkové geny a který byl poté ligován s EcoRI-Notl-BamHI Adaptorem (Takara Shuzo Co., Ltd.).

(2) Vytvoření lidské L-řetězcové C-oblasti (i) Příprava klonovacího vektoru

Za účelem připravení vektoru pUC19, obsahujícího gen pro L-řetězcovou • · • · · · · · · t · · * · · · · · ······ • · » · · ·

.................

C-oblast, byl připraven vektor pUC19 s deletovaným HindlII místem. Vektor pUC19 (2pg) byl štěpen ve 20 μΐ reakčního roztoku, obsahujícího 20 mM TrisHC1 (pH 8,5), 10 mM MgCl₂, 1 mM DTT, 100 mM KC1, 8 U Hind III (Takara Shuzo Co., Ltd.), při 37 °C po dobu 1 hodiny. Výsledný reakční roztok byl extrahován fenolem a chloroformem a poté byl podroben ethanolovému srážení, za účelem shromáždění požadované DNA.

Shromážděná DNA se nechala reagovat v 50 μΐ reakčního roztoku, obsahujícího 50 mM Tris-HCl (pH 7,5), 10 mM MgCl₂, 1 mM DTT, 100 mM NaCl,

0,5 mM dNTP a 6 U Klenowova fragmentu (Gibco BRL), při pokojové teplotě po dobu 20 minut, čímž byly terminální konce DNA zatupeny. Tento reakční roztok byl extrahován fenolem a chloroformem a poté byl podroben ethanolovému srážení, za účelem shromáždění vektorové DNA.

Takto shromážděná vektorová DNA se nechala reagovat v 10 μΐ reakčního roztoku, obsahujícího 50 mM Tris-HCl (pH 7,6), 10 mM MgCl₂, lmM ATP, mM DTT, 5% (v/v) polyethylenglykol-8000 a 0,5 U T4 DNA ligázy (Gibco BRL), při 16 °C po dobu 2 hodin, za účelem samoligování této vektorové DNA.

Tento reakční roztok (5 μΐ) byl přidán ke 100 μΐ roztoku, obsahujícího kompetentní kuňky E. coli, JMI09 (Nippon Gene Co., Ltd), a výsledný reakční roztok se nechal stát v ledu po dobu 30 minut, při 42 °C po dobu 1 minuty a dále po dobu 1 minuty v ledu. K reakčnímu roztoku bylo přidáno SOC medium (500 μΐ) a poté byl inkubován při 37 °C po dobu 1 hodiny. Výsledný roztok byl nanesen na 2xYT agarové medium (obsahující 50 pg/ml ampicilinu), na jehož povrch byl aplikován X-gal a IPTG (Molecular Cloning : A Laboratory manual, Sambrook et al., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989), a poté byl inkubován při 37 °C přes noc. Tímto způsobem byly připraveny E. coli transformanty.

Tyto transformanty byly kultivovány v 2xYT mediu (20 ml), obsahujícím ampicilin (50 pg/ml), při 37 °C přes noc. Z buněčné frakce kultivačního media byla izolována a purifikována plazmidová DNA, za použití Plazmid Mini Kitu (QIAGEN), podle instrukcí, které byly součástí této soupravy. Purifikovaný plazmid byl štěpen HindlII. Plazmid, u kterého bylo potvrzeno, že obsahuje deleci HindlII místa, byl označen jako „pUC19 AHindlII“.

(ii) Vytvoření DNA, kódující lidský LZ-řetězcovou C-oblast • ·

O Ελ-řetězcové C-oblasti lidské protilátky je známo, že má alespoň 4 izotypy, zahrnující Mcg⁺Ke⁺Oz', Mcg'Ke'Oz', Mcg'Ke'Oz⁺ a Mcg’Ke⁺Oz (P. Dariavach et al., Proč. Nati. Acad. Sci. USA 84, 9074-9078, 1987). V EMBL databázy byla hledána Ελ-řetězcová C-oblast lidské protilátky, homologní s myší #23-57-137-1 LZ-řetězcovou C-oblastí. Výsledkem bylo zjištění, že s myší #23-57-137-1 LX-řetězcovou C-oblastí vykazuje vysoký stupeň homologie, s 64,4% homologií v aminokyselinové sekvenci a 73,4% homologií v nukleotidové sekvenci, izotyp Mcg⁺Ke⁺Oz Ελ-řetězce lidské protilátky (přístupové číslo X57819) (P. Dariavach et al., Proč. Nati. Acad. Sci. USA 84, 9074-9078, 1987). Poté byl gen, kódující Ελ-řetězcovou C-oblast lidské protilátky, vytvořen pomocí PCR metody. Primer pro PCR byl syntetizován za použití 394 DNA/RNA Synthesizeru (ABI). Syntetizované primery byly následující : HLAMB1 (SEQ I. Č. : 11) a HLAMB3 (SEQ I. Č. : 13), oba mající sense sekvenci DNA, a HLAMB2 (SEQ I. Č. : 12) a HLAMB4 (SEQ I. Č. : 14), oba mající antisense sekvenci DNA. Každý primer obsahuje komplementární sekvenci 20-23 bp na obou terminálních koncích.

Externí primery HLAMBS (SEQ I. Č. : 15) a HLAMBR (SEQ I. Č. : 16) mají jednotlivě homologní sekvence s primery HLAMB1 a HLAMB4. HLAMBS obsahoval EcoRI-, HindlII- a Blnl-rozpoznávané sekvence a HLAMBR obsahoval EcoRI-rozpoznávanou sekvenci. V první PCR reakci byly provedeny reakce mezi HLAMB1 a HLAMB2 a mezi HLAMB3 a HLAMB4. Po dokončení reakcí byly oba výsledné PCR produkty smíchány ve stejných množstvích a poté byly použity společně v následující, druhé PCR reakci. K reakčnímu roztoku byly přidány primery HLAMBS a HLAMBR. Tato reakční směs byla podrobena třetí PCR reakci, za účelem amplifikace DNA plné délky.

PCR reakce byly provedeny za použití TaKaRa Ex Taq (TaKaRa Shuzo Co., Ltd) podle instrukcí, které byly součástí této soupravy. V první PCR reakci bylo použito buď 100 μΐ reakčního roztoku, obsahujícího 5 pmol HLAMB1, 0,5 pmol HLAMB2 a 5U TaKaRa Ex Taq (TaKaRa Shuzo Co., Ltd), nebo reakčního roztoku, obsahujícího 0,5 pmol HLAMB3, 5 pmol HLAMB4 a 5U TaKaRa Ex Taq (TaKaRa Shuzo Co., Ltd), který byl převrstven 50 μΐ minerálního oleje. PCR reakce byla provedena 5 cykly, za podmínek : 94 °C - 1 min; 60 °C - 1 min; a 72 °C - 1 min.

V druhé PCR reakci byla použita směs obou reakčních roztoků (50 μΐ každého),

44 44 ·«

4 4 4 4 4 4

4 4 4 4 4 • · 4 4 444444 která byla převrstvena 50 μΐ minerálního oleje. PCR reakce byla provedena 3 cykly, za podmínek : 94 °C - 1 min; 60 °C - 1 min; a 72 °C - 1 min.

V třetí PCR reakci byl použit tento reakční roztok, ke kterému byly přidány externí primery HLAMBS a HLAMBR (50 pmol každého). PCR reakce byla provedena 30 cykly, za podmínek : 94 °C - 1 min; 60 °C - 1 min; a 72 °C 1 min.

DNA fragment, získaný třetí PCR reakcí, byl podroben elektroforéze na 3% low-melting agarózovém gelu (NuSieve GTG Agarose, FMC). Byl z něho oddělen a purifikován za použití GENECLEAN II Kitu (BIO 101), podle instrukcí, které byly součástí této soupravy.

Získaný DNA fragment byl štěpen v reakčním roztoku (20 μΐ), obsahujícím 50 mM Tris-HCl (pH 7,5), 10 mM MgCl₂, 1 mM DTT, 100 mM NaCl, 8 U EcoRI (Takara Shuzo Co., Ltd.), při 37 °C po dobu 1 hodiny. Tento roztok byl extrahován fenolem a chloroformem a DNA z něho byla shromážděna ethanolovým srážením. DNA byla rozpuštěna ve roztoku (8 μΐ), obsahujícím 10 mM Tris-HCl (pH 7,4) a 1 mM EDTA.

Výše připravený plazmid pUC19AHindIII (0,8 pg) byl štěpen EcoRI stejným způsobem, jako je uvedeno výše. Štěpící roztok byl podroben fenol/chloroformové extrakci a ethanoiovému srážení, čímž byl získán štěpený plazmid pUC 19AHindIII. Štěpený plazmid se nechal reagovat v reakčním roztoku (50 μΐ), obsahujícím 50 mM Tris-HCl (pH 9,0), 1 mM MgCl₂ a alkalickou fosfatázu (E. coli C75; Takara Shuzo Co., Ltd.), při 37 °C po dobu 30 min, za účelem defosforylace (to jest., BAP-upravení) tohoto plazmidu. Reakční roztok byl podroben fenol/chloroformové extrakci a DNA z něho byla shromážděna ethanolovým srážením. Takto získaná DNA byla rozpuštěna v roztoku (10 μΐ), obsahujícím 10 mM Tris-HCl (pH 7,4) a 1 mM EDTA. BAP-upravený plazmid pUC 19ÁHindIII (1 μΐ) byl ligován s výše získaným

PCR produktem (4 μΐ), za použití DNA Ligation Kit Ver.2 (Takara Shuzo Co., Ltd.). Výsledný plazmid byl zaveden do kompetentních buněk E. coli JM109, za účelem získání transformantů. Tyto transformanty byly přes noc kultivovány v 2xYT mediu (2 ml), obsahujícím 50 pg/ml ampicilinu. Z buněčné frakce byl izolován plazmid, za použití QIAprep Spin Plasmid Kitu (QIAGEN).

V získaném plazmidu byla sekvenována část klonované DNA. Sekvenování bylo provedeno v 373 DNA Sequenceru (ABI), za použití primerů M13 Primer M4 a

9999 9 ·· 9« 99 • ·· · 9 9 9 9 9 • ·« 9 9 9 9 9 9 • · · 9 9 999999 • 9 9 9 9 ··· 9999999 99 99

M13 Primer RV (Takara Shuzo Co., Ltd.). Výsledkem bylo zjištění, že klonovaná DNA, obsahovala deleci 12-bp. Plazmid byl označen jako „CÁA/pUC19“. Poté byly, za účelem nahrazení deletované části, nově syntetizovány primery HCLMS (SEQ I. Č. : 17) a HCLMR (SEQ I. Č. : 18) a správná DNA byla vytvořena metodou PCR za použití těchto primerů.

V první PCR reakci byl jako templát použit plazmid CZA/pUC19, který obsahuje DNA deleci, a reakce byla provedena s dvojicemi primerů HLAMBS a HCLMS a HCLMS a HLAMB4. PCR produkty byly odděleně purifikovány. V druhé PCR reakci byly tyto PCR produkty spolu spojeny. V třetí PCR reakci byly k reakčnímu produktu druhé PCR reakce přidány externí primery HLAMBS a HLAMB4 a byla amplifikována DNA plné délky.

V první PCR reakci byl použit reakční roztok (100 μΐ), obsahující 0,1 pg plazmidu CXA/pUC19 jako templátu, buď 50 pmolů každého z primerů HLAMBS a HCLMR nebo 50 pmolů každého z primerů HCLMS a HLAMB4 a 5U TaKaRa Ex Taq (TaKaRa Shuzo Co., Ltd), který byl převrstven 50 μΐ minerálního oleje. PCR reakce byla provedena 30 cykly, za podmínek : 94 °C 1 min; 60 °C - 1 min; a 72 °C - 1 min.

PCR produkty první PCR reakce HLAMBS-HCLMR (236 bp) a HCLMSHLAMB4 (147 bp) byly jednotlivě podrobeny elektroforéze na 3% lowmelting agarózovém gelu, za účelem izolování těchto DNA fragmentů. Tyto DNA fragmenty byly z tohoto gelu shromážděny a purifikovány za použití GENECLEAN II Kitu (BIO101).

V druhé PCR reakci bylo použito 20 μΐ reakčního roztoku, obsahujícího 40 ng každého z purifikováných DNA fragmentů a 1U TaKaRa Ex Taq (TaKaRa Shuzo Co., Ltd), který byl převrstven 25 μΐ minerálního oleje. PCR reakce byla provedena 5 cykly, za podmínek : 94 °C - 1 min; 60 °C - 1 min; a 72 °C 1 min.

V třetí PCR reakci byl použit reakční roztok, obsahující 2 μΐ reakčního roztoku, získaného druhou PCR reakcí, 50 pmolů každého z externích primerů HLAMBS a HLAMB4 a 5U TaKaRa Ex Taq (TaKaRa Shuzo Co., Ltd), který byl převrstven 50 μΐ minerálního oleje. PCR reakce byla provedena 30 cykly, za podmínek : 94 °C - 1 min; 60 °C - 1 min; a 72 °C - 1 min, čímž byl získán DNA fragment o velikosti 357 bp (produkt třetího PCR). Tento DNA fragment byl podroben elektroforéze na 3% low-melting agarózovém gelu, za účelem izolování tohoto ·· ·· ·· · · 9 · · • · · · © 9 9 999 999 • · · ·©·· ·♦ ·· fragmentu. Výsledný DNA fragment byl shromážděn a purifikován za použití GENECLEAN II Kitu (BIO101).

Část (0,1 pg) takto získaného DNA fragmentu byla štěpena EcoRI a poté subklonována do plazmidu pUC19AHindIII, který byl BAP-upraven. Výsledný plazmid byl zaveden do kompetentních buněk E. coli JM109, za účelem vytvoření transformantů. Tyto transformanty byly kultivovány ve 2ml 2xYT media, obsahujícího 50 pg/ml ampicilinu, přes noc. Z buněčné frakce byl izolován plazmid, za použití QIAprep Spin Plasmid Kitu (QIAGEN).

Purifikovaný plazmid byl sekvenován v 373 DNA Sequenceru (ABI), za použití primerů M13 Primer M4 a M13 Primer RV (Takara Shuzo Co., Ltd.). Plazmid, u kterého bylo zjištěno, že obsahuje nukleotidovou sekvenci bez jakékoliv delece byl označen jako „CZ/pUC19“.

(iii) Vytvoření genu, kódujícího lidskou LK-řetězcovou C-oblast

DNA, kódující lidskou LK-řetězcovou C-oblast, byla klonována z plazmidu HEF-PMl-gk (WO 92/19759) metodou PCR. Přední primer HKAPS (SEQ I. Č. : 19) byl navržen tak, aby obsahoval EcoRI-, HindlII- a Blnlrozpoznávanou sekvenci, a zpětný primer HPAKA (SEQ I. Č. : 20) byl navržen tak, aby obsahoval EcoRI-rozpoznávanou sekvenci. Tyto primery byly syntetizovány v 934 DNA/RNA Synthetizeru (ABI).

PCR reakce byla provedena za použití 100 μΐ reakčního roztoku, obsahujícího 0,1 pg plazmidu HEF-PMl-gk jako templátu, 50 pmolů každého z primerů HKAPS a HKAPA a 5U TaKaRa Ex Taq (TaKaRa Shuzo Co., Ltd), který byl převrstven 50 μΐ minerálního oleje. PCR reakce byla provedena 30 cykly, za podmínek : 94 °C - 1 min; 60 °C - 1 min; a 72 °C - 1 min, čímž vznikl PCR produkt o velikosti 360 bp. Tento DNA fragment byl izolován a purifikován elektroforézou na 3% low-melting agarózovém gelu a poté byl shromážděn a purifikován za použití GENECLEAN II Kitu (BIO101).

Takto získaný DNA fragment byl štěpen EcoRI a poté byl subklonován do plazmidu pUC 1 9AHindIII, který byl BAP-upraven.

Výsledný plazmid byl zaveden do kompetentních buněk E. coli JM109, za účelem vytvoření transformantů. Tyto transformanty byly kultivovány ve 2 ml 2xYT media, obsahujícího 50 pg/ml ampicilinu, přes noc. Z buněčné frakce byl purifikován plazmid, za použití QIAprep Spin Plasmid Kitu (QIAGEN).

···· 9 ·· ·· ·· • ·· * · ·«·· ··· 9 9 9999

Získaný plazmid byl sekvenován v 373 DNA Sequenceru (ABI), za použití primerů M13 Primer M4 a M13 Primer RV (Takara Shuzo Co., Ltd.). Plazmid, u kterého bylo zjištěno, že obsahuje správnou nukleotidovou sekvenci, byl označen jako „CK/pUC19“.

(3) Vytvoření expresního vektoru pro L-řetězec chimerní protilátky

Byl vytvořen expresní vektor pro L-řetězec chimerní protilátky #23-57-137-1. Gen, kódující L-řetězcovou V-oblast protilátky #23-57-137-1, byl ligován do HindlII-Blnl místa (umístěného hned před C-oblastí lidské protilátky) každého z plazmidů CX/pUC19 a CK/pUC19, čímž byly získány vektory, obsahující DNA, kódující L-řetězcovou V-oblast chimerní protilátky #23-57-137-1 a buď LX-řetězcovou C-oblast nebo Lx-řetězcovou C-oblast. Každý z těchto výsledných vektorů byl poté štěpen EcoRI, za účelem oddělení genu pro L-řetězec chimerní protilátky. Tento gen byl subklonován do expresního vektoru HEF.

To jest, DNA fragment, kódující L-řetězcovou V-oblast protilátky #23-57-137-1, byl klonován z plazmidu MBC1L24 metodou PCR. Primery, použité v této metodě PCR, byly odděleně syntetizovány za použití 394 DNA/RNA Synthetizeru (ABI). Zpětný primer MCCHL1 (SEQ I. Č. : 21) byl navržen tak, aby obsahoval HindlII-rozpoznávanou sekvenci a Kozákovu sekvenci (Kozák M. et al., J. Mol. Biol., 196, 947-950, 1987), a přední primer MBCCHL3 (SEQ I. Č. : 22) byl navržen tak, aby obsahoval BglII- a EcoRIrozpoznávanou sekvenci.

PCR reakce byla provedena za použití 100 μΐ reakčního roztoku, obsahujícího mM Tris-HCl (pH 8,3), 50 mM KC1, 1,5 mM MgCl₂, 0,2 mM dNTP, 0,1 pg plazmidu MBC1L24, 50 pmolů každého z primerů MBCCHL1 a MBCCHL3 a Ιμΐ AmpliTaq, na který bylo navrstveno 50 μΐ minerálního oleje, PCR reakce byla provedena 30 cykly, za podmínek : 94 °C - 45 sek.; 60 °C - 1 45 sek; a 72 °C - 2 min.

PCR produkt o velikosti 444 bp byl podroben elektroforéze na 3% low-melting agarózovém gelu a poté byl shromážděn a purifikován za použití GENECLEAN

Kitu (ΒΙΘ101). Purifikovaný PCR produkt byl rozpuštěn ve 20 μΐ roztoku, obsahujícím 10 mM Tris-HCl (pH 7,4) a 1 mM EDTA. Tento PCR produkt (1 μΐ) byl Štěpen ve 20 μΐ reakčního roztoku, obsahujícího 10 mM Tris-HCl (pH 7,5), *♦·· 9 99 99 99 • 9··· 9 · 9 ·

999 9 · 9999 •9 9 9 9 999999 • 9 9 9 9

999 999 9999 99 99 mM MgCl₂, 1 mM DTT, 50 mM NaCl, 8 U HindlII (Takara Shuzo Co., Ltd.) a 8 U EcoRI (Takara Shuzo Co., Ltd.), při 37 °C po dobu 1 hodiny. Štěpící roztok byl podroben fenol/chloroformové extrakci a požadovaná DNA z něho byla shromážděna ethanolovým srážením. Tato DNA byla rozpuštěna v 8 pl roztoku, obsahujícího 10 mM Tris-HCl (pH 7,4) a 1 mM EDTA.

Plazmid pUC19 (1 pg) byl štěpen HindlII a EcoRI, podroben fenol/chloroformové extrakci a poté ethanolovému srážení stejným způsobem. Získaný štěpený plazmid byl BAP-upraven alkalickou fosfatázou (E. coli C75; Takara Shuzo Co., Ltd.). Výsledný reakční roztok byl extrahován fenolem a chloroformem a DNA z něho byla shromážděna ethanolovým srážením. Tato DNA byla rozpuštěna v 10 pl roztoku, obsahujícího 10 mM Tris-HCl (pH 7,4) a 1 mM EDTA.

BAP-upravený plazmid pUC19 (lpi) byl ligován s výše získaným PCR produktem (4 pl), za použití DNA Ligation Kitu Ver.2 (Takara Shuzo Co., Ltd.). Výsledný plazmid byl zaveden do kompetentních buněk E. coli JM109 (Nippon Gene Co., Ltd.), stejným způsob jako je uvedeno výše, za účelem vytvoření transformantů. Tyto transformanty byly vysety na 2xYT agarové medium, obsahující 50 pg/ml ampicilinu, a byly kultivovány při 37 °C přes noc. Výsledné transformanty byly poté kultivovány při 37 °C přes noc ve 2 ml 2xYT media, obsahujícího 50 pg/ml ampicilinu. Z buněčné frakce byl izolován plazmid, za použití QIAprep Spin Plasmid Kitu (QIAGEN). Po určení nukleotidové sekvence byl plazmid, u kterého bylo zjištěno, že obsahuje správnou nukleotidovou sekvenci, označen jako „CHL/pUC19“.

Každý z plazmidů CÁ/pUC19 a CK/pUC19 (1 pl každého) byl štěpen ve 20 pl reakčního roztoku, obsahujícího 20 mM Tris-HCl (pH 8,5), 10 mM MgCl₂, 1 mM DTT, 100 mM KC1, 8 U HindlII (Takara Shuzo Co., Ltd.) a 2 U Blnl (Takara Shuzo Co., Ltd.), při 37 °C po dobu 1 hodiny. Tento roztok byl extrahován fenolem a chloroformem a DNA z něho byla shromážděna ethanolovým srážením. DNA byla BAP-upravena při 37 °C po dobu 30 min. Tento reakční roztok byl extrahován fenolem a chloroformem a DNA z něho byla shromážděna ethanolovým srážením. Tato DNA byla rozpuštěna v 10 pl roztoku, obsahujícího 10 mM Tris-HCl (pH 7,4) a 1 mM EDTA.

Plazmid CHL/pUC19, který obsahoval DNA, kódující L-řetězcovou V-oblast #23-57-137-1 (8 pg), byl štěpen HindlII a Blnl stejným způsobem, jako je ··*· · ·· ·· ·· * ·· · · ···· ··♦ · · · · · · • · · 9 · 999999

9 9 9 9

999 999 9999 99 99 uvedeno výše, aby vznikl fragment o velikosti 409 bp.

Tento DNA fragment byl podroben elektroforéze na 3% low-mellting agarózovém gelu a poté byl z tohoto gelu shromážděn a purifikován za použití GENECLEAN II Kitu (BIO101). Tato DNA byla rozpuštěn v 10 μΐ roztoku, obsahujícího 10 mM Tris-HCl (pH 7,4) a 1 mM EDTA.

DNA pro L-řetězcovou V-oblast (4 μΐ) byl subklonována do 1 μΐ každého z BAP-upravených plazmidů CX/pUC19 a CK/pUC19 a poté byla zavedena do kompetentních buněk E. coli JM109, za účelem vytvoření transformantů. Tyto transformanty byly kultivovány přes noc ve 3 ml 2xYT media, obsahujícího 50 pg/ml ampicilinu. Z buněčné frakce byl izolován a purifikován plazmid, za použití QIAprep Spin Plasmid Kitu (QIAGEN). Dva takto připravené plazmidy byly jednotlivě označeny jako „MBClL(A)/pUC19“ a „MBClL(K)/pUC19“. Každý z těchto plazmidů MBClL(X)/pUC19 a MBClL(K)/pUC19 byl štěpen EcoRI a poté byl podroben elektroforéze na 3% low-melting agarózovém gelu. DNA fragment o velikosti 743 bp byl z tohoto gelu izolován a purifikován za použití GENECLEAN II Kitu (BIO 101) a poté byl rozpuštěn v 10 μΐ roztoku, obsahujícího 10 mM Tris-HCl (pH 7,4) a 1 mM EDTA.

Expresní vektor (plazmid HEF-PMlk-gk) (2,7 pg) byl štěpen EcoRI a poté byl extrahován fenolem a chloroformem a DNA z něho byla shromážděna ethanolovým srážením. Tento DNA fragment byl BAP-upraven a poté byl podroben elektroforéze na 1% low-melting agarózovém gelu. Z tohoto gelu byl za použití GENECLEAN II Kitu (BIO101) izolován a purifikován DNA fragment o velikosti 6561 bp. Tento purifikovaný DNA fragment byl poté rozpuštěn v 10 μΐ roztoku, obsahujícího 10 mM Tris-HCl (pH 7,4) a 1 mM EDTA. BAP-upravený HEF-vektor (2 μΐ) byl ligován s EcoRI fragmentem (3 μΐ) každého z plazmidů MBC 1 L(X)/pUC 19 a MBC 1 L(K)/pUC 1 9. Ligační produkt byl zaveden do kompetentních buněk E. coli JM109, za účelem vytvoření transformantů. Tyto transformanty byly kultivovány ve 2 ml 2xYT media, obsahujícího 50 pg/ml ampicilinu. Z buněčné frakce byl izolován a purifikován plazmid, za použití QIAprep Spin Plasmid Kitu (QIAGEN).

Purifikovaný plazmid byl štěpen ve 20 μΐ reakčního roztoku, obsahujícího 20 mM Tris-HCl (pH 8,5), 10 mM MgCl₂, 1 mM DTT, 100 mM KC1, 8 U HindlII (Takara Shuzo Co., Ltd.) a 2 U Pvul (Takara Shuzo Co., Ltd.), při 37 °C po dobu 1 hodiny. Touto reakcí vznikly fragmenty o velikosti 5104/2195 bp, když

9999 • 99

99 99 99 ·· · · 9*99 • · 9 9 9 9 • 9 9 999999

9 9 9 ··· 9999 99 99 byl fragment vložen ve správné orientaci, nebo fragmenty o velikosti 4378/2926 bp, když byl fragment vložen v obrácené orientaci. Plazmid, u kterého bylo potvrzeno, že má fragment ve správné orientaci byl označen jako „MBC1 L(X)/neo“ pro plazmid MBClL(Á)/pUC19 nebo „MBClL(K)/neo“ pro plazmid MBC1 L(K)/pUC 19.

(5) Transfekce buněk COS-7

Za účelem určení antigen-vazebné aktivity a neutralizační aktivity chimerních protilátek, byly výše připravené expresní plazmidy odděleně přechodně exprimovány v buňkách COS-7. Přechodná exprese chimerních protilátek byla provedena za použití každé z kombinací plazmidů MBCIHcDNA/pCOS 1 a MBClL(Á)/neo a plazmidů MBCIHcDNA/pCOS 1 a MBClL(K)/neo, kotransfekcí buněk COS-7 těmito plazmidy pomocí Gene Pulseru (Bio Rad). To jest plazmidy (10 pg každého) byly přidány k buněčné suspenzi COS-7 buněk (0,8 ml; 1 x 10^{5 * 7} buněk/ml) v PBS(-). Na výsledný roztok bylo působeno pulzy při elektrostatické kapacitě 1 5000 V a 25 pF, aby došlo k elektroporaci. Po 10 minutách regenerace při pokojové teplotě byly elektroporované buňky rozpuštěny v DMEM mediu (GIBCO), obsahujícím 2% Ultra Low IgG fetální telecí sérum (GIBCO), a poté byly kultivovány za použití 10-cm kultivační nádoby v CO₂ inkubátoru. Po kultivaci po dobu 72 hodin, byl shromážděn supernatant, který byl centrifugován, aby byl odstraněn buněčný debris. Takto připravené roztoky byly poskytnuty pro použití jako vzorky pro následnou metodu ELISA. V tomto postupu byla purifikace chimerních protilátek z kultivačních supernatantů buněk COS-7 provedena za použití AffiGel Protein A MAPSII Kitu (Bio Rad), podle instrukcí, které byly součástí této soupravy.

(5) ELISA (i) Určení koncentrace protilátky

ELISA destička pro určení koncentrace protilátky byla připravena následovně. Každá jamka 96 jamkové ELISA destičky (Maxisorp NUNC) bylo obalena 100 μΐ obalovacího pufru (1,0 M NaHCO.3, 0,02% NaN₃), doplněného 1 pg/ml kozí proti-lidské IgG protilátky (TÁGO), a poté byla blokována 200 μΐ zřeďovacího pufru (50 mM Tris-HCl, 1 mM MgCl₂, 0,1 M NaCl, 0,05% Tween 20, 0,02% NaN₃, 1% hovězí sérový albuním (BSA); pH 7,2). Do každé z těchto

BBBB B BB BB BB • BBBB BBBB ··· Β B BBBB • · Β Β Β ΒΒΒΒΒΒ • Β Β Β B

BBB €·· BBBB BB BB jamek bylo zvlášť přidáno každé ze zředění ředící řady kultivačního supernatantu buněk COS-7, ve kterém byla exprimována zvlášť každá z chimerních protilátek, nebo do ní bylo zvlášť přidáno každé ze zředění ředící řady každé z chimerních protilátek per se v purifikované formě. Destička byla inkubována při pokojové teplotě po dobu 1 hodiny a byla promyta PBS-Tween

20. Do každé z jamek této destičky bylo přidáno 100 μΐ roztoku kozích protilidských IgG protilátek spojených s alkalickou fosfatázou (TÁGO). Destička byla inkubována při pokojové teplotě po dobu 1 hodiny a byla promyta PBSTween 20. Do každé z jamek byl přidán 1 mg/ml substrátového roztoku („Sigma 104“, kyselina p-nitrofenylfosforeěná, SIGMA). V roztoku byla za účelem určení koncentrace protilátky měřena jeho absorbance při 405 nm, za použití Microplate Readeru (Bio Rad). Při tomto měření byl jako standard použit Hu IgGlA Purified (The Binding Site).

(ii) Určení antigen-vazebné aktivity

ELISA destička pro určení antigen-vazebné aktivity byla připravena následovně.

Každá jamka 96 jamkové ELISA destičky (Maxisorp NUNC) byla obalena 100 μΐ obalovacího pufru, obsahujícího 1 pg/ml lidského PTHrP (1-34) (Peptide Research Institute), a poté byla blokována 200 μΐ zřeďovacího pufru. Do každé z těchto jamek bylo zvlášť přidáno každé ze zředění ředící řady kultivačního supernatantu buněk COS-7, ve kterém byla exprimována zvlášť každá z chimerních protilátek, nebo do ní bylo zvlášť přidáno každé ze zředění ředící řady každé z chimerních protilátek per se v purifikované formě. Poté, co byla destička inkubována při pokojové teplotě po dobu 1 hodiny a byla promyta PBSTween 20, bylo do každé z jamek přidáno 100 μΐ roztoku kozích proti-lidských IgG protilátek spojených s alkalickou fosfatázou (TÁGO). Poté, co byla destička inkubována při pokojové teplotě po dobu 1 hodiny a byla promyta PBS-Tween 20, byl do každé z jamek přidán 1 mg/ml substrátového roztoku („Sigma 104“, kyselina p-nitrofenylfosforečná, SIGMA). V roztoku byla měřena jeho absorbance při 405 nm, za použití Microplate Readeru (Bio Rad).

Jako výsledek bylo zjištěno, že chimerní protilátky mají schopnost vázat lidský PTHrP (1-34) a že klonované V-oblasti myší protilátky měly správnou strukturu (obr. 5). Bylo také zjištěno, že není žádný rozdíl mezi schopností vázat PTHrP (1-34) mezi chimerní protilátkou s LA-řetězcovou C-oblastí a chimerní

99« 9 protilátkou s LK-řetězcovou C-oblastí. Humanizovaná L-řetězcová C-oblast byla tudíž vytvořena za použití LA-řetězce humanizované protilátky.

(6) Založení buněčné linie CHO, schopné stabilní produkce protilátky

Pro založení buněčné linie, schopné produkovat chimerní protilátky stabilně, byly výše připravené expresní plazmidy zavedeny do buněk CHO (DXB11).

Pro založení buněčné linie, schopné produkovat chimerní protilátky stabilně, byla použita jedna z následujících kombinací expresních plazmidů pro buňky CHO : MBCIHcDNA/pCHOl a MBC lL(X)/neo; a MBCIHcDNA/pCHOl a MBC1 L(K)/neo. Buňky CHO byly těmito plazmidy kotransfekovány elektroporací za použiti Gene Pulseru (Bio Rad). Tyto expresní vektory byly odděleně štěpeny restrikčním emzymem Pvul, aby vznikly lineární DNA. Výsledné DNA byly extrahovány fenolem a chloroformem a vysráženy ethanolem. Takto připravené DNA fragmenty byly podrobeny elektroporací.

To jest, každá z plazmidových DNA (10 pg každé) byla přidána k 0,8 ml buněčné suspenze buněk CHO v PBS(-) (lxlO⁷ buněk/ml). Na výsledný roztok bylo působeno pulzy při elektrostatické kapacitě 1 5000 V a 25 pF. Po 10 minutách regenerace při pokojové teplotě byly elektroporované buňky rozpuštěny v MEM-α mediu (GIBCO), obsahujícím 10% fetální telecí sérum (GIBCO). Výsledná suspenze byla kultivována v CO₂ inkubátoru za použití tří 96 jamkových destiček (Falcon). Jeden den po započetí kultivace bylo medium nahrazeno selektivním mediem [MEM-α bez ribonukleosidů či deoxyribonukleosidů (GIBCO)], obsahujícím 10% fetální telecí sérum a 500 mg/ml GENETICINU (G418Sulfate; GIBCO). Z kultivačního media byly selektovány buňky, do kterých byl zaveden gen pro antibiotikum. Selektivní medium bylo nahrazeno čerstvým mediem. Asi dva týdny po nahrazení media byly buňky pozorovány pod mikroskopem. Když byl pozorován vhodný buněčný růst, bylo u těchto buněk určeno množství produkovaných protilátek metodou ELISA, jak je uvedeno výše. Mezi těmito buňkami byly hledány ty, které produkuji větší množství protilátek.

Poté byla kultivace založené buněčné linie, schopné stabilní produkce protilátek, provedena ve válcové nádobě, za použití MEM media bez ribonukleosidů či deoxyribonukleosidů, obsahujícího 2% Ultra Low IgG fetální telecí sérum. Třetí a čtvrtý den kultivace byl shromážděn supernatant, který byl ··*· filtrován za použití 0,2-μηι filtru (Millipore), aby z něho byl odstraněn buněčný debris.

Purifikace chimerních protilátek z kultivačního supernatantu buněk CHO byla provedena za použití POROS Protein A Column (PerSeptive Biosystems) na ConSep LC100 (Milipore), podle přiložených instrukcí. Purifikované chimerní protilátky byly poskytnuty pro použití jako vzorky při určování neutralizační aktivity a testování léčebné účinnosti na hyperkalcemických modelových zvířatech. Koncentrace a antigen-vazebná aktivita purifikovaných chimerních protilátek byla určena stejným systémem ELISA, jak je uvedeno výše.

Příklad 6

Vytvoření humanizované protilátky (1) Vytvoření H-řetězce humanizované protilátky (i) Vytvoření humanizované H-řetězcové V-oblasti

H-řetězec humanizované protilátky #23-57-137-1 byl vytvořen technikou vkládání CDR pomocí metody PCR. Pro vytvoření H-řetězce humanizované protilátky #23-57-137-1 (verze „a“), majícího FR odvozené od lidské protilátky S31679 (NBRF-PBD; Cuisinier A. M. et al., Eur. J. Immunol., 23, 110-118, 1993), bylo použito následujících šest PCR primerů : CDR-vkládájící primery : MBC1HGP1 (SEQ I. Č. : 23) a MBC1HGP3 (SEQ I. Č. : 24) (oba obsahující sense sekvenci) a MBC1HGP2 (SEQ I. Č. : 25) a MBC1HGP4 (SEQ I. Č. : 26) (oba obsahující antisense sekvenci), z nichž všechny obsahují komplementární sekvenci 15-21 bp na obou terminálních koncích; a externí primery : MBC1HVS1 (SEQ I. Č. : 27) a MBC1HVR1 (SEQ I. Č. : 28), mající homologii jednotlivě s CDR-vkládajícími primery MBC1HGP1 a MBC1HGP4.

CDR-vkládající primery MBC1HGP1, MBC1HGP2, MBC1HGP3 a MBC1HGP4 byly odděleny na močovinou denaturovaném polyakrylamidovém gelu (Molecular Cloning : A Laboratory Manual, Sambrook et al., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989) a z něho byly extrahovány metodou „crash and soak“. (Molecular Cloning : A Laboratory Manual, Sambrook et al., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989) následujícím způsobem.

Každý z CDR-vkládajích primerů (1 nmol) byl oddělen na 6% denaturovaném polyakrylamidovém gelu za vzniku DNA fragmentů. Z výsledných DNA fragmentů byl na silikagelové tenké vrstvě, ozářením UV paprsky, vybrán ten, • ·· · « « ·

·· ·· • · · · • * · « ·· · ··« který měl požadovanou délku, a byl z něho shromážděn metodou „crash and soak“. Výsledná DNA byla rozpuštěna ve 20 μΐ roztoku, obsahujícího 10 mM Tris-HCl (pH 7,4) a 1 mM EDTA. PCR reakce byla provedena za použití TaKaRa Ex Taq (TaKaRa Shuzo Co., Ltd). PCR reakční roztok (100 μΐ) obsahoval 1 μΐ každého z výše zmíněných CDR-vkládajících primerů MBC1HGP1, MBC1HGP2, MBC1HGP3 a MBC1HGP4, 0,25 mM dNTP a 2,5 U TaKaRa Ex Taq v pufru. PCR reakce byla provedena 5 cykly, za podmínek : 94 °C - 1 min; 55 °C - 1 min; a 72 °C - 2 min. K výslednému reakčnímu roztoku byly přidány externí primery MBC1HVS a MBCHVR1 (50 pmol každý). Za použití této reakční směsi běžela PCR reakce dalších 30 cyklů, za stejných podmínek. Takto amplifikovaný DNA fragment byl oddělen elektroforézou na agarózovém gelu z 4% Nu Sieve GTG agarose (FMC Bio. Products).

Agarózová část, obsahující DNA fragment o velikosti 421 bp, byla vyříznuta a tento DNA fragment z ní byl purifikován za použití GENECLEAN II Kitu (BIO 101), podle instrukcí, které byly součástí této soupravy. Takto purifikovaný DNA fragment byl vysrážen ethanolem a rozpuštěn ve 20 μΐ roztoku, obsahujícího 10 mM Tris-HCl (pH 7,4) a 1 mM EDTA. Výsledná PCR reakční směs byla použita pro subklonování tohoto DNA fragmentu do plazmidu pUC19, který byl štěpen BamHI a HindlII, a následně byla určena nukleotidová sekvence výsledného plazmidu.

Plazmid, mající správnou nukleotidovou sekvenci, byl označen jako „hMBCHv/pUC 19“.

(ii) Vytvoření H-řetězcové V-oblasti pro cDNA humanizovaného H-řetězce Za účelem ligování s cDNA pro humanizovanou H-řetězcovou C-oblast Cyl, byla DNA pro humanizovanou H-řetězcovou V-oblast, vytvořená tak, jak je popsáno výše, modifikována metodou PCR. Pro tuto metodu PCR byl navržen zpětný primer MBC1HVS2 tak, aby hybridizoval se sekvencí, kódující 5' úsek vedoucí sekvence pro V-oblast, a aby obsahoval Kozákovu konsensus sekvenci (Kozák M. et al., J. Mol. Biol., 196, 947-950, 1987) a HindlII- a EcoRIrozpoznávanou sekvenci; a přední primer MBC1HVR2 byl navržen tak, aby hybridizoval jak s DNA sekvencí, kódující 3' úsek J-oblasti tak i DNA sekvencí, kódující 5' úsek C-oblasti, a aby obsahoval Apal- a Smalrozpoznávanou sekvenci.

4 4 «444 4444

4444 · · 4··· i 44 4 444444*4

4 4 4 4 4

444 444 444 4444 44 44

PCR reakce byla provedena za použití TaKaRa Ex Taq (TaKaRa Shuzo Co., Ltd) a k ní naléžejícího pufru. PCR reakční roztok obsahoval 0,4 pg plazmidu hMBCHv/pUC19 jako templátové DNA, 50 pmol každého z MBC1HVS2 MBC1HVR2 jako primery, 2,5 U TaKaRa Ex Taq a 0,25 mM dNTP v pufru,

PCR reakce byla provedena 30 cykly, za podmínek : 94 °C - 1 min; 55 °C - 1 min; a 72 °C - 1 min. Takto amplifikovaný DNA fragment byl oddělen pomocí elektroforézy na agarózovém gelu z 3% Nu Sieve GTG Agarose (FMC Bio.

Products).

Poté byla vyříznuta část agarózového gelu, obsahující DNA fragment o velikosti 456 bp a tento DNA fragment z ní byl purifikován za použití GENECLEAN II Kitu (BIO101), podle instrukcí, které byly součástí této soupravy. Takto purifikovaný DNA fragment byl vysrážen ethanolem a byl poté rozpuštěn ve 20 μΐ roztoku, obsahujícího 10 mM Tris-HCl (pH 7,4) a 1 mM EDTA. Takto získaný PCR reakční roztok byl použit pro subklonování tohoto DNA fragmentu do plazmidu pUC19, který byl štěpen EcoRI a Smál, a poté byl výsledný plazmid sekvenován. Jako výsledek byl získán plazmid, který obsahoval DNA, kódující myší H-řetězcovou V-oblast, odvozenou od hybridomu #23-57-137-1, a obsahující EcoRI- a HindlII-rozpoznávanou sekvenci a Kozákovu sekvenci ve svém 5' úseku a Apa- a Smal-rozpoznávanou sekvenci ve svém 3' úseku, který byl označen jako „hMBClHv/pUC19“.

(2) Vytvoření expresního vektoru pro H-řetězec humanizované protilátky

Plazmid RVh-PM 1 f-cDNA, nesoucí cDNA sekvenci pro H-řetězec protilátky hPMl, byl štěpen Apal a BamHI, aby vznikl DNA fragment, obsahující DNA fragment, obsahující DNA, kódující H-řetězcovou C-oblast. Tento DNA fragment byl zaveden do plazmidu hMBC 1 v/pUC 19, který byl štěpen Apal a BamH. Získaný plazmid byl označen jako „hMBClHcDNA/pUC19“. Tento plazmid obsahoval jak DNA, kódující H-řetězcovou V-oblast humanizované protilátky #23-57-137-1 tak i DNA, kódující H-řetězcovou C-oblast Cyl a měl EcoRI- a HindlII-rozpoznávanou sekvenci ve svém 5' úseku a BamHIrozpoznávanou sekvenci ve svém 3' úseku. Nukleotidová sekvence a odpovídající aminokyselinová sekvence pro humanizovaný H-řetězec verze „a“, nesený na plazmidu hMBC 1 cDNA/pUC 19, jsou jednotlivě ukázány v SEQ I. Č. : 58 a SEQ I. Č. : 56.

• · · · ·· · ··· • · ·· ··

Plazmid hMBC 1 HcDNA/pUC 19 byl štěpen EcoRI a BamHI, aby vznikl DNA fragment, obsahující DNA, kódující H-řetězec. Tento DNA fragment byl zaveden do expresního vektoru pCOSl, který byl štěpen EcoRI a BamHI. Jako výsledek byl získán expresní plazmid pro humanizovanou protilátku, který byl označen jako „hMBCIHcDNA/pCOSI“.

Za účelem vytvoření plazmidu, použitého pro expresi v CHO buňkách, byl plazmid hMBC 1 HcDNA/pUC 19 štěpen EcoRI a BamHI, aby vznikl DNA fragment, obsahující DNA, kódující H-řetězec. Tento DNA fragment byl zaveden do expresního vektoru pCHOl, který byl štěpen EcoRI a BamHI. Jako výsledek byl získán expresní plazmid pro humanizovanou protilátku, který byl označen jako „hMBC 1 HcDNA/pCHO 1 “.

(3) Vytvoření L-řetězcové hybridní V-oblasti (i) Příprava FR1,2/FR3,4 hybridní protilátky

Vytvořen byl gen pro FR hybridní L-řetězec, mající jak FR z humanizované protilátky tak i FR z myší (chimerní) protilátky, a u každého úseku byla posouzena humanizace. V tomto kroku byla hybridní protilátka, mající FR1 a FR2 odvozené od lidské protilátky a FR3 a FR4 odvozené od myší protilátky, připravena za použití AflII restrikčního místa, umístěného na CDR2.

Plazmidy MBClL(Z)/neo a hMBClL(Z)/neo (10 pg každého) byly odděleně štěpeny ve 100 μΐ reakčního roztoku, obsahujícího 10 mM Tris-HCl (pH 7,5), 10 mM MgCI₂, 1 mM DTT, 50 mM NaCl, 0,01% (w/v) BSA a 10 U AflII (Takara Shuzo Co., Ltd.), při 37 °C po dobu 1 hodiny. Reakční roztok byl podroben elektroforéze na 2% low-melting agarózovém gelu, čímž vznikly DNA fragmenty o velikosti 6282 bp (označený jako „cl“) a 1022 bp (označený jako „c2“) z plazmidu MBClL(Á)/neo nebo DNA fragmenty o velikosti 6282 bp (označený jako „hl“) a 1022 bp (označený jako „h2“) z plazmidu hMBC 1 L(Á)/neo. Tyto DNA fragmenty byly z gelů shromážděny a purifikovány za použití GENECLEANII Kitu (BIO101).

Každý z fragmentů cl a hl (lpg) byl BAP-upraven. Tento DNA fragment byl extrahován fenolem a chloroformem, shromážděn ethanolovým srážením a rozpuštěna v 10 μΐ roztoku, obsahujícím 10 mM Tris-HCl (pH 7,4) a 1 mM EDTA.

·· ·· • · · 9 9 · ·« · ···

BAP-upravené fragmenty cl a hl (lpi každého) byly jednotlivě ligovány fragmenty s h2 a c2 (4μ1 každého) (při 4 °C přes noc). Každý z ligačních produktů byl zaveden do kompetentních buněk E. coli JM109, za účelem vytvoření transformantů. Tyto transformanty byly kultivovány ve 2 ml 2xYT media, obsahujícího 50 pg/ml ampicilinu. Z buněčné frakce byl purifikován plazmid, za použití QIAprep Spin Plasmid Kitu (QIAGEN).

Purifikovaný plazmid byl štěpen ve 20 μΐ reakčního roztoku, obsahujícího 10 mM Tris-HCl (pH 7,5), 10 mM MgCl₂, 1 mM DTT, a buď 2U ApaLI (Takara Shuzo Co., Ltd.) nebo 8U BamHI (Takara Shuzo Co., Ltd.) a HindlII (Takara Shuzo Co., Ltd.), při 37 °C po dobu 1 hodiny. Jestliže byl cl-h2 ligován správně, vznikly tímto štěpením fragmenty 5560/1246/498 bp (štěpením ApaLI) nebo fragmenty 7134/269 bp (štěpením BamH/HindlII). Na základě tohoto předpokladu byly požadované plazmidy identifikovány.

Expresní vektor, kódující lidský L-řetězec lidské FRl,2/myší FR3,4 hybridní protilátky byl označen jako „h/mMBClL(Z)/neo“. Na druhé straně, se nepodařilo získat klon pro hl-cl. Proto byla provedena rekombinace na vektoru pUC a poté byl výsledný rekombinantní klonován do vektoru HEF. Při tomto postupu byly jako templáty použity plazmid hMBC 1 LaZ/pUC 19, který obsahoval DNA, kódující L-řetězcovou V-oblast humanizované protilátky, bez jakýchkoliv aminokyselinových záměn, a plazmid hMBC 1 LdZ/pUC 19, který obsahoval DNA, kódující L-řetězcovou V-oblast humanizované protilátky, s aminokyselinovou záměnou aminokyseliny tyrosinu v pozici 91 (to jest 87. aminokyseliny podle Kabatova pravidla) za isoleucin.

Plazmidy MBC 1 L(Z)/pUC 1 9, hMBC 1 LaZ/pUC 19 a hMBC 1 LdZ/pUC 19 (10 μΐ každého) byly odděleně štěpeny ve 30 μΐ reakčního roztoku, obsahujícího 10 mM Tris-HCl (pH 7,5), 10 mM MgCl₂, 1 mM DTT, 50 mM NaCI, 0,01% (w/v) BSA, 16U HindlII a 4U AflII, při 37 °C po dobu 1 hodiny. Reakční roztoky byly podrobeny elektroforéze na 2% low-melting agarózovém gelu, čímž vznikl DNA fragment o velikosti 215 bp z plazmidu MBC1 L(Z)/pUC 19 (označený jako „c2“) a DNA fragment o velikosti 3218 bp pro každý z plazmidů hMBC 1 LaZ/pUC 19 a hMBClLdZ/pUC19 (označené jednotlivě jako „hal'“ a „hdl'“). Tyto DNA fragmenty byly shromážděny a purifikovány za použití GENECLEANII Kitu (BIO101).

Každý z fragmentů hal' a hdl' byl ligován s fragmentem c2 a poté byl zaveden • · • ··· » φ · φ φ φ • · · φ ···>····

9 9 9 · 9

999 999 999 9999 99 99 do kompetentních buněk Ε. coli JM109, za účelem vytvoření transformantů.

Tyto transformanty byly kultivovány ve 2 ml 2xYT media, obsahujícího 50 pg/ml ampicilinu. Z buněčné frakce byl purifikován plazmid, za použití QIAprep Spin Plasmid Kitu (QIAGEN). Takto připravené plazmidy byly označené jako „m/hMBClLaZ/pUC19“ pro plazmid obsahující fragment hal^z a „m/hMBClLdZ/pUC19“ pro plazmid obsahující fragment hdl^z.

Každý z plazmidů m/hMBClLaZ/pUC19 a m/hMBClLdZ/pUC19 byl štěpen EcoRI. DNA fragment o velikosti 743 bp byl podroben elektroforéze na 2% lowmelting agarózovém gelu a poté z něho byl shromážděn a purifikován za použití GENECLEANII Kitu (BIO101). Výsledný DNA fragment byl rozpuštěn ve 20 μΐ roztoku, obsahujícím 10 mM Tris-HCl (pH 7,4) a 1 mM EDTA.

Každý z těchto DNA fragmentů (4 μΐ každého) byl ligován s výše získaným,

B AP-upraveným HEF vektorem (1 μΐ). Ligační produkt byl zaveden do kompetentních buněk E. coli JM109, za účelem vytvoření transformantů. Tyto transformanty byly kultivovány ve 2 ml 2xYT media, obsahujícího 50 pg/ml ampicilinu. Z buněčné frakce byl purifikován plazmid, za použití QIAprep Spin Plasmid Kitu (QIAGEN).

Každý z těchto purifikovaných plazmidů byl štěpen ve 20 μΐ reakčního roztoku, obsahujícího 20 mM Tris-HCl (pH 8,5), 10 mM MgCl₂, 1 mM DTT, 100 mM KC1, 8U HindlII (Takara Shuzo Co., Ltd.) a 2U Pvul (Takara Shuzo Co., Ltd.), při 37 °C po dobu 1 hodiny. Plazmidová DNA byla identifikována na základě očekávání, že je-li DNA fragment vložen do plazmidu ve správné orientaci, vznikl by tímto štěpením fragment o velikosti 5104/2195 bp, zatímco je-li DNA fragment vložen do plazmidu v obrácené orientaci, vznikl by tímto štěpením fragment o velikosti 4378/2926 bp. Takto získané plazmidy byly expresními vektory, kódující L-řetězec myší FRl,2/lidské FR3,4 hybridní protilátky, které byly jednotlivě označeny jako expresní vektory „m/hMBC 1 LaZ/neo“ a „m/hMBC 1 LdZ/neo“.

(ii) Příprava FR1/FR2 hybridní protilátky

FR1/FR2 hybridní protilátka byla připravena stejným způsobem jako je uvedeno výše, za použití SnaBI restrikčního místa umístěného na CDR1.

Plazmidy MBClL(Z)/neo a h/MBC 1 L(X)/neo (10 pg každého) byly odděleně štěpeny ve 20 μΐ reakčního roztoku, obsahujícího 10 mM Tris-HCl (pH 7,9), • · · · · · mM MgCl₂, 1 mM DTT, 50 mM NaCl, 0,01% (w/v) BSA a 6 U SnaBI (Takara Shuzo Co., Ltd.), při 37 °C po dobu 1 hodiny. Výsledné reakční roztoky byly dále štěpeny v 50 μΐ reakčního roztoku, obsahujícího 20 mM Tris-HCl (pH 8,5), 10 mM MgCl₂, 1 mM DTT, 100 mM KC1, 0,01% (w/v) BSA a 6 U Pvul (Takara Shuzo Co., Ltd.), při 37 °C po dobu 1 hodiny.

Výsledné reakční roztoky byly odděleně podrobeny elektroforéze na 1,5% lowmelting agarózovém gelu, čímž vznikly DNA fragmenty o velikosti 4955 bp (ml) a 2349 bp (m2) z plazmidu MBClL(Z)/neo a DNA fragmenty o velikosti 4955 bp (hml) a 2349 bp (hm2) z plazmidu h/MBClL(Z)/neo. Tyto DNA fragmenty byly z gelů shromážděny a purifikovány za použití GENECLEANII Kitu (ΒΙΘ101). Každý ze získaných DNA fragmentů byl rozpuštěn ve 40 μΐ roztoku, obsahujícím 10 mM Tris-HCl (pH 7,4) a 1 mM EDTA.

Fragmenty ml a hml (lpg) byly jednotlivě ligovány s fragmenty hm2 a m2 (4μ1 každého). Každý z výsledných ligačních produktů byl zaveden do kompetentních buněk E. coli JM109, za účelem vytvoření transformantů. Tyto transformanty byly kultivovány ve 2 ml 2xYT media, obsahujícího 50 pg/ml ampicilinu. Z buněčné frakce byl purifikován plazmid, za použití QIAprep Spin Plasmid Kitu (QIAGEN).

Každý z purifikovaných plazmidů byl štěpen ve 20 μΐ reakčního roztoku, obsahujícího 10 mM Tris-HCl (pH 7,5), 10 mM MgCl₂, 1 mM DTT, a buď 8U Apal (Takara Shuzo Co., Ltd.) nebo 2U ApaLI (Takara Shuzo Co., Ltd.), při 37 °C po dobu 1 hodiny.

Jestliže byly tyto fragmenty ligovány správně, vznikl tímto štěpením fragment 7304 bp (štěpením Apal) nebo fragmenty 5560/1246/498 bp (štěpením ApaLI), pro ml-m2, a fragmenty 6538/766 (štěpením Apal) nebo fragmenty 3535/2025/1246/498 (štěpením ApaLI), pro hml-m2. Na základě tohoto předpokladu byly plazmidy identifikovány. Jako výsledek byl získán expresní vektor, kódující L-řetězec lidské FRl/myší FR2,3,4 hybridní protilátky (označený jako „hmmMBC 1 L(X)/neo“), a expresní vektor, kódující L-řetězec myší FRl/lidské FR2,3,4 hybridní protilátky (označený jako „mhmMBC 1 L(X)/neo“).

(4) Vytvoření L-řetězce humanizované protilátky

L-řetězec humanizované protilátky #23-57-137-1 byl připraven technikou ····· · «· · · ·· • · 0 ···· ···· • · · · · · · · · · « · « · ········ • · 9 · · · vkládání CDR pomocí metody PCR. Pro vytvoření L-řetězce humanizované protilátky #23-57-137-1 (verze „a“), který má FR1, FR2 a FR3 odvozené od lidské protilátky HSU03868 (GEN-BANK, Deftos M. et al., Scand J. Immunol., 39, 95-103, 1994) a FR4, odvozený od lidské protilátky S25755 (NBRF-PBD), bylo použito šest PCR primerů.

Těchto šest primerů vypadalo následovně ; CDR-vkládájící primery : MBC1LGP1 (SEQ I. Č. : 29) a MBC1LGP3 (SEQ I. Č. : 30), oba obsahující sense sekvenci DNA, CDR-vkládájící primery MBC1LGP2 (SEQ I. Č. : 31) a MBC1LGP4 (SEQ I. Č. : 32), oba obsahující antisense sekvenci DNA, z nichž všechny obsahují komplementární sekvenci 15-21 bp na obou terminálních koncích; a externí primery ; MBC1LVS1 (SEQ I. Č. ; 33) a MBC1LVR1 (SEQ I. Č. : 34), mající homologii jednotlivě s CDR-vkládajícími primery MBC1LGP1 aMBClLGP4.

CDR-vkládajícími primery MBC1LGP1, MBC1LGP2, MBC1LGP3 a MBC1LGP4 byly odděleny na močovinou denaturovaném polyakrylamidovém gelu (Molecular Cloning ; A Laboratory Manual, Sambrook et al., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989) a z něho byly extrahovány metodou a z něho byly extrahovány metodou „crash and soak“. (Molecular Cloning : A Laboratory Manual, Sambrook et al., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989).

Každý z CDR-vkládajích primerů (1 nmol) byl oddělen na 6% denaturovaném polyakrylamidovém gelu za vzniku DNA fragmentů. Identifikace DNA fragmentu, který měl požadovanou délku, byla provedena na silikagelové tenké vrstvě, ozářením UV paprsky. Požadovaný DNA fragment byl z gelu shromážděn metodou „crash and soak“. Výsledná DNA byla rozpuštěna ve 20 μΐ roztoku, obsahujícího 10 mM Tris-HCl (pH 7,4) a 1 mM EDTA.

PCR reakce byla provedena za použití TaKaRa Ex Taq (TaKaRa Shuzo Co., Ltd) a jí odpovídajícímu pufru. PCR reakční roztok (na 100 μΐ) obsahoval 1 μΐ každého z výše zmíněných CDR-vkládajících primerů MBC1LGP1, MBC1LGP2, MBC1LGP3 a MBC1LGP4, 0,25 mM dNTP a 2,5 U TaKaRa Ex Taq v pufru. PCR reakce byla provedena 5 cykly, za podmínek ; 94 °C - 1 min; 55 °C - 1 min; a 72 °C - 2 min. K výslednému reakčnímu roztoku byly přidány externí primery MBC1LVS1 a MBCLVR1 (50 pmol každého). Za použití této reakční směsi běžela PCR reakce dalších 30 cyklů, za stejných podmínek. Takto • · ·· · amplifikovaný DNA fragment byl oddělen elektroforézou na agarózovém gelu z 3% Nu Sieve GTG agarose (FMC Bio. Products).

Agarózová část, obsahující DNA fragment o velikosti 421 bp, byla vyříznuta a tento DNA fragment z ní byl purifikován za použití GENECLEAN II Kitu (BIO101), podle instrukcí, které byly součástí této soupravy. Takto získaná PCR reakční směs byla použita pro subklonování tohoto DNA fragmentu do plazmidu pUC19, který byl štěpen BamHI a HindlII. Výsledný plazmid byl sekvenován. Takto připravený plazmid byla označen jako „hMBCL/pUC19“. V tomto plazmidu však byla 104. aminokyselina (odpovídající 96. aminokyselině podle Kabatova pravidla) CDR4 nahrazena argininem. Pro náhradu této aminokyseliny za tyrosin byl navržen a syntetizován opravný primer MBC1LGP10R (SEQ I. Č. : 35). PCR reakce byla provedena za použití TaKaRa Ex Taq (TaKaRa Shuzo Co., Ltd) a k ní naléžejícího pufru. PCR reakční roztok obsahoval (na 100 μΐ) 0,6 pg plazmidu hMBL/pUC19 jako templátové DNA, 50 pmol každého z primerů MBC1LVS1 a MBC1LGP10R, 2,5 U TaKaRa Ex Taq (TaKaRa Shuzo Co., Ltd) a 0,25 mM dNTP v pufru, na který byl navrstven minerální olej (50 μΐ). PCR reakce byla provedena 30 cykly, za podmínek :

°C - 1 min; 55 °C - 1 min; a 72 °C - 2 min. Takto amplifikované DNA fragmenty byly odděleny pomocí elektroforézy na agarózovém gelu z 3% Nu Sieve GTG agarose (FMC Bio. Products).

Poté byla vyříznuta část agarózového gelu, obsahujícího DNA fragment o velikosti 421 bp, a tento DNA fragment z ní byl purifikován za použití GENECLEAN II Kitu (ΒΙΘ101), podle instrukcí, které byly součástí této soupravy. Takto připravená PCR reakční směs byla použita pro subklonování tohoto DNA fragmentu do plazmidu pUC19, který byl štěpen BamHI a HindlII. Tento plazmid byl sekvenován za použití primerů M13 Primer M4 a Ml 3 Primer RV. Jako výsledek bylo potvrzeno, že tento plazmid má správnou sekvenci. Tento plazmid byl poté štěpen HindlII a Blnl a DNA fragment o velikosti 416 bp byl oddělen elektroforézou na 1% agarózovém gelu. Tento DNA fragment byl purifikován za použití GENECLEAN II Kitu (BIO101), podle instrukcí, které byly součástí této soupravy, a poté byl zaveden do plazmidu CX/pUC19, který byl štěpen HindlII a Blnl. Výsledný plazmid byl označen jako „hMBC 1 Laλ/pUC 19“. Tento plazmid byl štěpen EcoRI, aby vznikl DNA fragment, kódující humanizovaný L-řetězec. Tento DNA fragment byl zaveden

0 0·0 0 00 0· 000 0 0 0 0 000

0000 0 · 000

000 do plazmidu pCOSl tak, aby byl iniciační kodon pro humanizovaný L-řetězec umístěn downstream od EFla promotoru. Takto získaný plazmid byl označen jako „hMBC 1 LaX/pCOS 1 DNA sekvence (včetně odpovídající aminokyselinové sekvence) humanizovaného L-řetězce verze „a“ je ukázána v SEQ I. Č. : 66. Aminokyselinové sekvence verze „a“ je také ukázána v SEQ I. Č. : 47.

Humanizovaný L-řetězec verze „b“ byl připraven za použití techniky mutageneze metodou PCR. Verze „b“ byla navržena tak, aby byla ve verzi „a“ aminokyselina glycin v 43. pozici (odpovídající 43. aminokyselině podle Kabatova pravidla) nahrazena prolinem a aminokyselina lysin v 49. pozici (odpovídající 49. aminokyselině podle Kabatova pravidla) kyselinou asparagovou. PCR reakce byla provedena za použití plazmidu hMBClLaλ/pUC19 jako templátu, s mutagenním primerem MBC1LGP5R (SEQ I. Č. : 36) a primerem MBC1LVS1. Získaný DNA fragment byl štěpen BamHI a HindlII a fragment po štěpení byl subklonován do BamHI-HindlII místa pUC19. Po sekvenování byl plazmid štěpen HindlII a AflII a výsledný fragment byl ligován s plazmidem hMBClLaÁ/pUC19, který byl štěpen HindlII a AflII.

Takto získaný plazmid byl označen jako „hMBClLb\/pUC19“. Tento plazmid byl štěpen EcoRI, aby vznikl DNA fragment, kódujícící humanizovaný L-řetězec. Tento DNA fragment byl zaveden do plazmidu pCOSl tak, aby byl iniciační kodon pro humanizovaný L-řetězec umístěn downstream od EFla promotoru. Takto získaný plazmid byl označen jako „hMBC 1 LbÁ/pCOS 1“. Humanizovaný L-řetězec verze „c“ byl připraven za použití techniky mutageneze metodou PCR. Verze „c“ byla navržena tak, aby byla aminokyselina serin v 84. pozici (odpovídající 80. aminokyselině podle Kabatova pravidla) nahrazena prolinem. PCR reakce byla provedena za použití plazmidu hMBC 1 Laλ/pUC 19 jako templátu, s mutagenním primerem MBC1LGP6S (SEQ I. Č. : 37) a primerem M13 Primer RV. Získaný DNA fragment byl štěpen BamHI a HindlII a poté byl subklonován do pUC19, který byl štěpen BamHI a HindlII. Po sekvenování byl plazmid štěpen BstPI a Aor51HI a výsledný fragment byl ligován s plazmidem hMBC 1 LaZ/pUC 19, který byl štěpen BstPI a Aor51HI.

Takto získaný plazmid byl označen jako „hMBC!LcX/pUC19“. Tento plazmid ·©'· · ·· · · ·· • ·· · · · · · » ··· · · » © · · • « · · » ·«···· • · · · · ··© ····©*· ·· ·· byl štěpen EcoRI, aby vznikl DNA fragment, kódující humanizovaný L-řetězec. Tento DNA fragment byl zaveden do EcoRI místa plazmidu pCOSl tak, aby byl iniciační kodon pro humanizovaný L-řetězec umístěn downstream od EFla promotoru. Takto získaný plazmid byl označen jako ,,ΗΜΒΟΕολ/ρ(ΖΌδ1“. Humanizované L-řetězce verze „d“, „e“ a „f“ byly také připraveny za použití techniky mutageneze metodou PCR. Verze „d“, „e“ a „f“ byly navrženy tak, aby byla aminokyselina tyrosin v 91. pozici (odpovídající 87. aminokyselině podle Kabatova pravidla) nahrazena isoleucinem, jednotlivě ve verzích „a“, „b“ a „c“. Pro každou z verzí „d“, „e“ a „f“ byla provedena PCR reakce za použití plazmidu hMBClLaX/pUC19 (pro verzi „d“), hMBClLbλ/ρUC19 (pro verzi „e“) a hMBClΕολ/ρΙΙ09 (pro verzi „f“) jako templátu, mutagenního primerů MBC1LGP11R (SEQ I. Č. : 38) a primerů M-Sl (SEQ I. Č. : 44). Takto získaný DNA fragment byl štěpen BamHI a HindlII a poté byl subklonován do pUC19, který byl Štěpen BamHI a HindlII. Po sekvenování byl plazmid štěpen HindlII a Blnl a výsledný fragment byl ligován s plazmidem CX/pUC19, který byl štěpen HindlII a Blnl.

Takto získané plazmidy byly jednotlivě označeny jako „hMBClLdÁ/pUC19“ (pro verzi „d“), hMBClLeX/pUC19 (pro verzi „e“) a hMBClLfÁ/pUC19 (pro verzi „f“) . Každý z těchto plazmidů byl štěpen EcoRI, aby vznikl DNA fragment, kódující humanizovaný L-řetězec. Tento DNA fragment byl zaveden do EcoRI místa plazmidu pCOSl tak, aby byl iniciační kodon pro humanizovaný L-řetězec umístěn downstream od EFla promotoru. Takto získané plazmidy byly jednotlivě označeny jako „hMBC lLdÁ/pCOS 1 “ (pro verzi „d“), hMBC 1 Εελ/ρΕΟΞ 1 (pro verzi „e“) a hMBC 1 Lfk/pCOS 1 (pro verzi „f“). Humanizované L-řetězce verze „g“ a „h“ byly také připraveny za použití techniky mutageneze metodou PCR. Verze „g“ a „h“ byly navrženy tak, aby byla jednotlivě ve verzích „a“ a „d“ aminokyselina histidin v 36. pozici (odpovídající

36. aminokyselině podle Kabatova pravidla) nahrazena tyrosinem. PCR reakce byla provedena za použití mutagenního primerů MBC1LGP9R (SEQ I. Č. : 39), primerů M13 Primer RV a plazmidu hMBC 1 LaX/pUC 19. Další PCR bylo provedeno za použití takto získaného produktu a M13 Primer M4 jako primerů a hMBC 1 LaX/pUC 1 9 jako templátu. Získaný DNA fragment byl štěpen Blnl a HindlII a poté byl subklonován do CL/pUC19, který byl štěpen HindlII a Blnl.

9 9 9 ···

99 99 99

9 9 9 9 9«

9 9 9 9 9

9 9 99 9 99«

9 9 9

999 9999 99 99

Za použití tohoto plazmidu jako templátu byla provedena PCR reakce s primery MBC1LGP13R (SEQ I. Č. : 40) a MBC1LVS1. Získaný DNA fragment byl štěpen Apal a HindlII a poté byl zaveden buď do plazmidu hMBClLaX/pUC19 nebo hMBClLdX/pUC19, které byly štěpeny Apal a HindlII. Získané plazmidy byly sekvenovány. Plazmidy, u kterých bylo potvrzeno, že obsahují správnou sekvenci, byly označeny jako hMBClLgÁ/pUC19 (pro verzi „g“) a hMBClLh//pUC19 (pro verzi „h“). Každý z těchto plazmidů byl štěpen EcoRI, aby vznikl DNA fragment, kódující humanizovaný L-řetězec. Tento DNA fragment byl zaveden do EcoRI místa plazmidu pCOSl tak, aby byl iniciační kodon pro humanizovaný L-řetězec umístěn downstream od EFla promotoru. Takto získaný plazmid byl označen jako „hMBCILgX/pCOS 1“ (pro verzi „g“) a „hMBC 1 LhÁ/pCOS 1 “ (pro verzi „h“).

Humanizované L-řetězce verze „i“, „j“, „k“, „1“, „m“, „n“ a „o“ byly také připraveny za použití techniky mutageneze metodou PCR. PCR reakce byla provedena za použití plazmidu hMBC lLaÁ/pUC 19 jako templátu, s mutagenním primerem MBC1LGP14S (SEQ I. Č. : 41) a primerem V1RV (λ) (SEQ I. Č. : 43). Výsledný DNA fragment byl štěpen Apal a Blnl a poté byl subklonován do plazmidu hMBClLgλ/pUC19, který byl štěpen Apal a Blnl. Získaný plazmid byl sekvenován a byly vybrány klony, do kterých byla zavedena mutace pro každou verzi. Tento plazmid byl štěpen EcoRI, aby vznikl DNA fragment, kódující humanizovaný L-řetězec. Tento DNA fragment byl zaveden do EcoRI místa plazmidu pCOSl tak, aby byl iniciační kodon pro humanizovaný L-řetězec umístěn downstream od EFloe promotoru. Takto získaný plazmid byl jednotlivě označen jako „hMBC 1 Εχλ/pCOS 1 “ (x = i, j, k, 1, m, n nebo o). DNA sekvence (včetně odpovídajících aminokyselinových sekvencí) verzí „j“, „1“, „m“ a „o“ jsou jednotlivě ukázány v SEQ I. Č. : 67, 68, 69 a 70. Aminokyselinové sekvence těchto verzí jsou také jednotlivě ukázány v SEQ I. Č. : 48, 49, 50 a 51.

Humanizované L-řetězce verze „p“, „q“, „r“, „s“ a „t“ byly navrženy tak, aby jednotlivě ve verzích „i“, „j“, „m“, „1“ a „o“ byla aminokyselina (tyrosin) v 87. pozici nahrazena isoleucinem. Tyto verze byly připraveny za použití restrikěního místa pro Aor51MI v FR3 a nahrazením tohoto místa každé z verzí „i“, „j“, „m“, „1“ a „o“ tímto místem z verze „h“. To jest Aor51HI restrikění fragment (514 bp) obsahující CDR3, část FR3 a celý FR4 byly odstraněny z

Μ·« 9 99 99 99

99 9 9 9 9 9 9

999 9 9 9999 · 9 9 9 999999

9 9 9 9

999 999 9999 99 99 expresních plazmidů hMBCILxZ/pCOS 1 (x = i, j, m, 1, nebo o). Do tohoto rozděleného místa byl ligován Aor51HI restrikční fragment (514 bp) z expresního plazmidu hMBC 1 LhZ/pCOS 1, obsahující CDR3, část FR3 a celý FR4, takže byla aminokyselina tyrosin v 91. pozici (odpovídající 87. aminokyselině podle Kabatova pravidla) nahrazena isoleucinem. Získaný plazmid byl sekvenován. Byl vybrán klon každé verze „i“, „j“, „m“, „1“ a „o“, ve kterém byla aminokyselina tyrosin v 91. pozici (odpovídající 87. aminokyselině podle Kabatova pravidla) nahrazena isoleucinem. Tyto modifikované verze, jednotlivě odpovídající verzím „i“, „j“, „m“, „1“ a „o“, byly jednotlivě označeny jako verze „p“, „q“, „r“, „s“ a „t“. Získaný plazmid byl jednotlivě označen jako ,,ΗΜΒΟΕχλ/ρ(2081“ (x = p, q, s, r nebo t). DNA sekvence (včetně odpovídajících aminokyselinových sekvencí) verzí „p“, „q“, „r“, „s“ a „t“ jsou jednotlivě ukázány v SEQ I. Č. : 71, 72, 73 a 74. Aminokyselinové sekvence těchto verzí jsou také jednotlivě ukázány v SEQ I.

Č. : 52, 53, 54 a 55.

Plazmid hMBC 1 LqZ/pCOS 1 byl štěpen HindlII a EcoRI a poté byl subklonován do plazmidu pUC19, který byl štěpen HindlII a EcoRI. Takto získaný plazmid byl označen jako hMBClLqZ/pUC19.

Pozice nahrazených aminokyselin v jednotlivých verzích humanizovaného L-řetězce jsou ukázány níže, v tabulce 2.

«

9« » »··· 9 99 99 «9 9 9999 9 9 ·

9·99 9 9 999 · · 9 99 «9«

9 9 9 «9

...... ...........

Tabulka 2

Pozice nahrazených aminokyselin v sekvencích (číslování aminokyselin podle Kabatova pravidla)

Verze	36	43	45	47	49	80	87
a
b		P			D
c						P
d							I
e		P			D		I
f						P	I
g	Y
h	Y						I
i	Y		K
j	Y		K		D
k	Y		K	V
1	Y		K	V	D
m	Y				D
n	Y			V
o	Y			V	D
P	Y		K				I
q	Y		K		D		I
r	Y				D		I
s	Y		K	V	D		I
t	Y			V	D		I

V tabulce 2 představují velká písmena následující aminokyseliny : Y : tyrosin; P rprolin; K : lysin; V : valin; D : kyselina asparagová a I : isoleucin

Kmeny E. coli, z nichž každý obsahuje hMBClHcDNA/pUC19 a hMBC 1 LqÁ/pUC 19 byly jednotlivě označeny jako „Escherichia coli JM109 (hMBC 1 HcDNA/pUC 1 9)“ a „Escherichia coli JM109 hMBC 1 Lq//pUC 19“, byly uloženy podle Budapešťské dohody v National Institute of Bioscience and Human-Technology, Agency of Industrial Science and Technology, Japonsko • AAA A · ·· ·· ·· «· A AA A A A A A fl • · ·· fl · a A a * • · · · ········ a a a A · ·

ΑΑ· AAA AAA AAAA AA AA (1-3, Higashi 1-chome, Tsakuba-shi, Ibaraki, Japonsko), 15. srpna 1996 pod přístupovým číslem FERM BP-5629 pro Escherichia coli JM109 (hMBClHcDNA/pUC19) a FERM BP-5630 pro Escherichia coli JM109 hMBClL^/pUC19.

(5) Transfekce do buněk COS-7

Za účelem určení antigen-vazebné aktivity a neutralizační aktivity hybridních protilátek a humanizovaných protilátek #23-57-137-1, byly výše připravené expresní plazmidy přechodně exprimovány v buňkách COS-7. Pro přechodnou expresi L-řetězcových hybridních protilátek byla do buněk COS-7, za použití Gene Pulseru (Bio Rad), kotransfekována každá z následujících kombinací plazmidů : hMBC 1 HcDNA/pCOS 1 a h/mMBC 1 L(Á)/neo; hMBC 1 HcDNA/pCOS 1 a m/hMBCILaX/neo; hMBCIHcDNA/pCOS 1 a m/hMBCILdX/neo; hMBC 1 HcDNA/pCOS 1 a hmmMBC 1 L(Á)/neo; a hMBCIHcDNA/pCOS 1 a mhmMBC 1 L(Á)/neo. To jest, k buněčné suspenzi (0,8 ml) buněk COS-7 v PBS(-) (1x10 buněk/ml) byla přidána každá kombinace plazmidových DNA (10 pg každé). Na výsledný roztok bylo působeno pulzy při elektrostatické kapacitě 1 5000 V a 25 pF. Po 10 minutách regenerace při pokojové teplotě byly elektroporované buňky rozpuštěny v DMEM mediu, obsahujícím 2% Ultra Low IgG fetální telecí sérum (GIBCO), a poté byly kultivovány za použití 10-cm kultivační nádoby v CO₂ inkubátoru. Po kultivaci po dobu 72 hodin byl shromážděn supernatant, který byl centrifugován, aby byl odstraněn buněčný debris. Takto připravené roztoky byly poskytnuty pro použití v ELISA, níže.

Pro přechodnou expresi humanizovaných protilátek #23-57-137-1 byla do buněk COS-7, za použití Gene Pulseru (Bio Rad), kotransfekována kombinace plazmidů hMBC 1 HcDNA/pCOS 1 a hMBC 1 Lx/pCOS 1 (x = a-t) stejným způsobem, jako je popsáno výše pro hybridní protilátky. Kultivační supernatanty byly připraveny a poskytnuty pro použití v ELISA, níže.

Purifikace hybridních protilátek a humanizovaných protilátek z kultivačních supernatantů buněk COS-7 byly provedeny za použití AffiGel Protein A MAPSII Kitu (Bio Rad), pode instrukcí, které byly součástí této soupravy.

(6) ELISA (í) Určení koncentrace protilátky

9···

9 9 «9 99 99 * 9 9 9 9 *

9 9 9 9 9 * 9 999999

9 9 9

999 9999 «9 99

ELISA destička pro určení koncentrace protilátky byla připravena následovně. Každá jamka 96 jamkové ELISA destičky (Maxisorp NUNC) bylo obalena 100 μΐ obalovacího pufru (1,0 M NaHCO₃, 0,02% NaN₃), obsahujícího 1 pg/ml kozí proti-lidské IgG protilátky (TÁGO), a poté byla blokována 200 μΐ zřeďovacího pufru (50 mM Tris-HCl, 1 mM MgCl₂, 0,1 M NaCl, 0,05% Tween 20, 0,02% NaN₃, 1% hovězí sérový albunim (BSA); pH 7,2). Do každé z těchto jamek bylo zvlášť přidáno každé ze zředění ředící řady kultivačního supernatantu buněk COS-7, ve kterém byla exprimována zvlášť každá z hybridních protilátek nebo humanizovaných protilátek, nebo do ní bylo zvlášť přidáno každé ze zředění ředící řady každé z hybridních protilátek nebo humanizovaných protilátek v purifikované formě. Destička byla inkubována při pokojové teplotě po dobu 1 hodiny a byla promyta PBS-Tween 20. Následně bylo do každé z jamek přidáno 100 μΐ kozí proti-lidské IgG protilátky spojené s alkalickou fosfatázou (TÁGO). Destička byla inkubována při pokojové teplotě po dobu 1 hodiny a byla promyta PBS-Tween 20. Následně byl do každé z jamek přidán 1 mg/ml substrátového roztoku („Sigma 104“, kyselina p-nitrofenylfosforečná, SIGMA). V roztoku v každé z jamek byla za účelem určení koncentrace protilátky měřena jeho absorbance při 405 nm, za použití Microplate Readeru (Bio Rad). Při tomto měření byl jako standard použit Hu IgGIÁ Purified (The Binding Site).

(ii) Určení antigen-vazebné aktivity

ELISA destička pro určení antigen vazebné aktivity byla připravena následovně. Každá jamka 96 jamkové ELISA destičky (Maxisorp NUNC) byla obalena 100 μΐ obalovacího pufru, obsahujícího 1 pg/ml lidského PTHrP (1-34), a poté byla blokována 200 μΐ zřeďovacího pufru. Následně bylo do každé z těchto jamek zvlášť přidáno každé ze zředění ředící řady kultivačního supernatantu buněk COS-7, ve kterém byla exprimována zvlášť každá z hybridních protilátek nebo humanizovaných protilátek, nebo do ní bylo zvlášť přidáno každé ze zředění ředící řady každé z hybridních protilátek nebo humanizovaných protilátek v purifikované formě. Destička byla inkubována při pokojové teplotě po dobu 1 hodiny a byla promyta PBS-Tween 20. Následně bylo do každé z jamek přidáno 100 μΐ kozí proti-lidské IgG protilátky spojené s alkalickou fosfatázou (TÁGO). Destička byla inkubována při pokojové teplotě po dobu ··· · • BB ΒΒ ΒΒ • · · Β · · · ΒΒΒ* • ··· Β Β Β Β Β « • * Β Β Β Β ΒΒΒ ΒΒ«

ΒΒΒΒ Β Β ₅₉ ............. ·♦ ·· hodiny a byla promyta PBS-Tween 20. Následně byl do každé z jamek přidán 1 mg/ml substrátového roztoku („Sigma 104“, kyselina p-nitrofenylfosforečná,

SIGMA). V roztoku byla měřena jeho absorbance při 405 nm, za použití Microplate Readeru (Bio Rad).

(7) Potvrzení aktivit (i) Hodnocení humanizovaného H-řetězce

Bylo zjištěno, že protilátka, mající humanizovaný H-řetězec verze „a“ a chimerní L-řetězec, vykazuje stejnou úroveň PTHrP-vazebné aktivity jako chimerní protilátka (viz obr. 6). Tento výsledek naznačuje, že verze „a“ dosahuje humanizace H-řetězcové V-oblasti na úrovni, která je dostačující pro měření humanizace. Humanizovaný H-řetězec verze „a“ byl tudíž poskytnut pro použití jako H-řetězec humanizované protilátky v následujících pokusech.

(ii) Aktivita hybridních protilátek (ii-a) FR1,2/FR3,4 hybridní protilátka

Když byl L-řetězcem h/mMBClL(X), nebyla pozorována žádná antigen-vazebná aktivita. Naopak, když byl L-řetězcem buď m/hMBCILaA nebo m/hMBCILdX, byla pozorována stejná úroveň antigen-vazebné aktivity jako u chimerní protilátky #23-57-137-1 (obr. 7). Tyto výsledky naznačují, že zde nejsou problémy s ohledem na FR3 a FR4, ale že existuje aminokyselinový zbytek (zbytky), který je třeba pro přípravu humanizované protilátky zaměnit v FR1 a FR2.

(ii-b) FR1/FR2 hybridní protilátky

Když byl L-řetězcem mhmMBClL(A), nebyla pozorována žádná antigen-vazebná aktivita. Naopak, když byl L-řetězcem hmmMBClL(A), byla pozorována stejná úroveň antigen-vazebné aktivity jako u chimerní protilátky #23-57-137-1 (obr.

8). Tyto výsledky naznačují, že zde nejsou problémy s ohledem na FR1, ale že existuje aminokyselinový zbytek (zbytky), který je třeba pro přípravu humanizované protilátky zaměnit FR2.

(iii) Aktivita humanizovaných protilátek

U humanizovaných protilátek, jednotlivě mající L-řetězec verze „a“ až „t“, byla

999« 9 99 99 99

9 99 99 999«

999 9 9 9999

9 · 9 9 9 99 9999

9 9 9 9 9 • 99 999 999 999* 99 99 určována antigen-vazebná aktivita. Jako výsledek bylo zjištěno, že humanizované protilátky, mající L-řetězec verze „j“, „1“, „m“, „o“, „q“, „r“, „s“ a „t“ vykazují stejnou úroveň PTHrP-vazebné aktivity jako chimerní protilátka (obr. 9 až 12).

(8) Založení buněčné linie CHO, schopné stabilní produkce protilátky

Pro založení buněčné linie, schopné stabilní produkce humanizovaných protilátek byl každý z výše připravených expresních plazmidů zaveden do buněk CHO (DXB1 1).

To jest, založení buněčné linie, schopné stabilní produkce humanizované protilátky, bylo provedeno za použití každé z následujících kombinací plazmidů, co by expresních vektorů pro buňky CHO : hMBCIHcDNA/pCHOl a hMBC 1 LmX/pCOS 1; hMBCIHcDNA/pCHOl a hMBClLx^/pCOS 1; a hMBCIHcDNA/pCHOl a hMBC 1 LrÁ/pCOS 1. Plazmidy byly do buněk CHO kotransfekovány elektroporací za použití Gene Pulseru (Bio Rad). Následně byly tyto expresní vektory odděleně štěpeny restrikčním emzymem Pvul, aby vznikly lineární fragmenty. Výsledné DNA fragmenty byly extrahovány fenolem a chloroformem a poté byly vysráženy ethanolem. Takto připravené DNA fragmenty byly použity v následné elektroporací.

To jest, fragmenty plazmidové DNA (10 pg každé) byly přidány k 0,8 ml buněčné suspenze buněk CHO v PBS(-) (lxlO⁷ buněk/ml). Na výsledný roztok bylo působeno pulzy při elektrostatické kapacitě 1 5000 V a 25 pF. Po 10 minutách regenerace při pokojové teplotě byly takto upravené buňky rozpuštěny v MEM-α mediu (GIBCO), obsahujícím 10% fetální telecí sérum (GIBCO), a poté byly kultivovány v CO₂ inkubátoru za použití 96 jamkových destiček (Falcon). Následující den po kultivaci bylo medium nahrazeno MEM-a selektivním mediem bez ribonukleosidů či deoxyribonukleosidů, obsahujícím 10% fetální telecí sérum (GIBCO) a 500 mg/ml GENETICINU (G418Sulfate;

GIBCO). Z kultivačního media byly selektovány buňky, do kterých byl zaveden gen pro antibiotikum. Kultivační medium bylo nahrazeno čerstvým mediem. Asi dva týdny po nahrazení media byly buňky pozorovány pod mikroskopem. Když byl pozorován vhodný buněčný růst, bylo u této buňky určeno množství produkované protilátky běžnou metodou ELISA pro určování koncentrace protilátky, jak jest uvedeno výše. Mezi těmito buňkami byly hledány ty, které

ΦΦ « Φ • ·* φφ φφ φ· Φ · Φ Φ φ 1 • φ φ φ φ « φ φ φ φφ · · φ« • φ · « produkují větší množství protilátek.

Kultivace založené buněčné linie, schopné stabilní produkce protilátek, byla provedena ve válcové nádobě, za použití MEM-oc media bez ribonukleosidů či deoxyribonukleosidů, obsahujícího 2% Ultra Low IgG fetální telecí sérum. Třetí a čtvrtý den kultivace byl shromážděn supernatant, který byl filtrován za použití 0,2-μηι filtru (Millipore), aby byl z něho odstraněn buněčný debris. Purifikace humanizovaných protilátek z kultivačního supernatantu buněk CHO byla provedena za použití POROS Protein A Column (PerSeptive Biosystems) na ConSep LC100 (Milipore), podle přiložených instrukcí. Humanizované protilátky byly poskytnuty pro použití při určování neutralizační aktivity a testování farmakologické účinnosti na hyperkalcemických modelových zvířatech. Koncentrace a antigen-vazebná aktivita purifikovaných humanizovaných protilátek byla určena systémem ELISA, jak je uvedeno výše.

Příklad 7

Určení neutralizační aktivity

Určení neutralizační aktivity myších protilátek, chimerních protilátek a humanizovaných protilátek bylo provedeno za použití buněk krysí myelomové buněčné linie ROS17/2,8-5. Buňky ROS17/2,8-5 byly kultivovány v Ham'S F-12 mediu (GIBCO), obsahujícím 10% fetální telecí sérum (GIBCO) v CO₂ inkubátoru. Buňky ROS17/2,8-5 byly vysety do každé jamky 96-jamkové destičky v množství 10⁴ buněk/100pl/jamka a byly kultivovány 1 den. Po dokončení kultivace bylo kultivační medium nahrazeno Ham'S F-12 mediem (GIBCO), obsahujícím 4 mM Hydrokortison a 10% fetální telecí sérum. Po kultivaci po dobu tří až čtyř dnů byly kultivované buňky promyty 260 μΐ Ham'S F-12 media (GIBCO) a poté bylo přidáno 80 μΐ Ham'S F-12 medium, obsahující 1 mM isobutyl-1 -methylxantin (IBMX, SIGMA), 10% fetální telecí sérum a 10 mM HEPES. Výsledná směs byla inkubována při 37 °C po dobu 30 min. Kultivační media myších protilátek, chimerních protilátek a humanizovaných protilátek pro testování na neutralizační aktivitu byla dříve serialně zředěna v následujících skupinách : [10 pg/ml, 3,3 pg/ml, 1,1 pg/ml a 0,37 pg/ml], [10 pg/ml, 2 pg/ml, 0,5 qg/ml a 0, 01 qg/ml] a [10 gg/ml, 1,25 pg/ml, 0,63 qg/ml a 0, 3 1 pg/ml]. Každý ze vzokrových roztoků zředěné protilátky byl smíchán s ekvivalentním množstvím 4 ng/ml PTHrP (1-34). Výsledný promíchaný roztok » ·· ·· ·· ·· « « · « · « • · · · · fl • · * ·····< • · · « ·«·»··· 99 99 (80 μΐ) byl přidán do každé z jamek. V každé jamce se konečná koncentrace změnila na čtvrtinovou proti výše zmíněné koncentraci protilátek a podle toho se i koncentrace PTHrP (1-34) změnila na 1 ng/ml. Po působení při pokojové teplotě po dobu 10 min byl kultivační supernatant odstraněn a zbytek byl třikrát promyt PBS. Následně bylo z buněk 100 μΐ 0,3% HCl-95% ethanolem extrahováno cAMP a poté bylo zahuštěno za použití vodní vývěvy, aby byl odstraněn HCL-ethanol Zbytek byl rozpuštěn ve 120 μΐ EIA pufru, který byl součástí cAMP EIA Kitu (CAYMAN CHEMICAL'S), aby z něho bylo extrahováno cAMP. cAMP bylo určeno za použití cAMP EIA Kitu (CAYMAN CHEMICAL/S) podle instrukcí, které byly součástí této soupravy. Jako výsledek bylo zjištěno, že mezi humanizovanými protilátkami, majícími stejnou úroveň antigen-vazebné aktivity jako chimerní protilátky, vykazovaly nejbližší neutralizační aktivitu aktivitě chimerních protilátky ty, které mají L-řetězec verze „g“, „r“, „s“ a „t“ (kde byl tyrosin v pozici 91 nahrazen isoleucinem) a ty, mající L-řetězec verze „q“ vykázaly nejsilnější neutralizační aktivitu (obr. 13 až 15).

Průmyslová využitelnost

Jak je popsáno výše, poskytuje předkládaný vynález léčivo pro kachexii, obsahující jako aktivní složku látku, schopnou inhibice vazby mezi PTHrP a jeho receptorem.

V testech farmakologické účinnosti, využívajících zvířecích modelů kachexie, může takováto látka bránit ztrátě hmotnosti a může prodloužit dobu přežití ve srovnání s kontrolou. Tato látka je tudíž užitečná pro léčení kachexie.

»91« · »4 44 44

4444 4449

444 4 4 4441

4 * 4 444 44«

4 4 4 4

444 «44 444« 4« 44

Seznam sekvencí (2) INFORMACE O SEQ I.Č. : 1:

(i) CHARAKTERISTIKY SEKVENCE :

(A) DÉLKA : 20 párů baží (B) TYP : nukleová kyselina (C) POČET ŘETĚZCŮ : jeden (D) TOPOLOGIE : lineární (ii) TYP MOLEKULY : jiná nukleová kyselina (A) POPIS : /popis = „syntetická DNA“ (xi) POPIS SEKVENCE : SEQ. I. Č. : 1: AAATAGCCCT TGACCAGGCA (2) INFORMACE O SEQ I.Č. : 2:

(i) CHARAKTERISTIKY SEKVENCE :

(A) DÉLKA : 38 párů baží (B) TYP : nukleová kyselina (C) POČET ŘETĚZCŮ : jeden (D) TOPOLOGIE : lineární (ii) TYP MOLEKULY : jiná nukleová kyselina (A) POPIS : /popis = „syntetická DNA“ (xi) POPIS SEKVENCE : SEQ. I. Č. : 2:

CTGGTTCGGC CCACCTCTGA AGGTTCCAGA ATCGATAG (2) INFORMACE O SEQ I.Č. : 3:

(i) CHARAKTERISTIKY SEKVENCE :

(A) DÉLKA : 28 párů baží ···· ··· • · ···· • t ·· • · · · • · · · ··· ··« • · ·· ·· (B) TYP : nukleová kyselina (C) POČET ŘETĚZCŮ : jeden (D) TOPOLOGIE ; lineární (ii) TYP MOLEKULY : jiná nukleová kyselina (A) POPIS : /popis· = „syntetická DNA“ (xi) POPIS SEKVENCE ; SEQ. I. Č. : 3: GGATCCCGGG CCAGTGGATA GACAGATG

2) INFORMACE O SEQ I.Č. : 4:

(i) CHARAKTERISTIKY SEKVENCE :

(A) DÉLKA : 29 párů baží (B) TYP : nukleová kyselina (C) POČET ŘETĚZCŮ : jeden (D) TOPOLOGIE : lineární (ii) TYP MOLEKULY : jiná nukleová kyselina (A) POPIS : /popis - „syntetická DNA“ (xi) POPIS SEKVENCE : SEQ. I. Č. : 4: GGATCCCGGG TCAGRGGAAG GTGGRAACA (2) INFORMACE O SEQ I.Č. : 5:

(i) CHARAKTERISTIKY SEKVENCE :

(A) DÉLKA : 17 párů baží (B) TYP : nukleová kyselina (C) POČET ŘETĚZCŮ : jeden (D) TOPOLOGIE : lineární (ii) TYP MOLEKULY : jiná nukleová kyselina (A) POPIS : /popis = „syntetická DNA“ (xi) POPIS SEKVENCE : SEQ. I. Č. : 5: GTTTTCCCAG TCACGAC (2) INFORMACE O SEQ I.Č. : 6:

(i) CHARAKTERISTIKY SEKVENCE :

(A) DÉLKA : 17 párů baží (B) TYP : nukleová kyselina (C) POČET ŘETĚZCŮ : jeden (D) TOPOLOGIE : lineární (ii) TYP MOLEKULY : jiná nukleová kyselina (A) POPIS : /popis = „syntetická DNA“ (xi) POPIS SEKVENCE : SEQ. I. Č. : 6: CAGGAAACAG CTATGAC (2) INFORMACE O SEQ I.Č. : 7:

(i) CHARAKTERISTIKY SEKVENCE :

(A) DÉLKA : 31 párů baží (B) TYP : nukleová kyselina (C) POČET ŘETĚZCŮ : jeden (D) TOPOLOGIE : lineární (ii) TYP MOLEKULY : jiná nukleová kyselina (A) POPIS : /popis = „syntetická DNA“ (xi) POPIS SEKVENCE : SEQ. I. Č. : 7: GTCTAAGCTT CCACCATGAA ACTTCGGGCT C

2) INFORMACE O SEQ I.Č. : 8:

ΦΦΦ • φ (i) CHARAKTERISTIKY SEKVENCE :

(A) DÉLKA ; 30 párů baží (B) TYP : nukléová kyselina (C) POČET ŘETĚZCŮ : jeden (D) TOPOLOGIE : lineární (ii) TYP MOLEKULY : jiná nukléová kyselina (A) POPIS : /popis = „syntetická DNA“ (xi) POPIS SEKVENCE : SEQ. I. Č. : 8: TGTTGGATCC CTGCAGAGAC AGTGACCAGA (2) INFORMACE O SEQ I.Č. : 9:

(i) CHARAKTERISTIKY SEKVENCE :

(A) DÉLKA : 36 párů baží (B) TYP : nukléová kyselina (C) POČET ŘETĚZCŮ ; jeden (D) TOPOLOGIE : lineární (ii) TYP MOLEKULY : jiná nukléová kyselina (A) POPIS : /popis = „syntetická DNA“ (xi) POPIS SEKVENCI : SEQ. I. Č. : 9 :

GTCTGAATTC AAGCTTCCAC CATGGGGTTT GGGCTG (2) INFORMACE O SEQ I.Č. : 10:

(i) CHARAKTERISTIKY SEKVENCE :

(A) DÉLKA : 41 párů baží (B) TYP ; nukléová kyselina (C) POČET ŘETĚZCŮ : jeden (D) TOPOLOGIE : lineární ···· · · · · · ·· • ···· ···· ··· 9 · · · * · • · · · · ······ • · · 9 9 (ii) TYP MOLEKULY : jiná nukleová kyselina (A) POPIS : /popis = „syntetická DNA“ (xi) POPIS SEKVENCE : SEQ. I. Č. : 10:

TTTCCCGGGC CCTTGGTGGA GGCTGAGGAG ACGGTGACCA G (2) INFORMACE O SEQ I.Č. : 11:

(i) CHARAKTERISTIKY SEKVENCE :

(A) DÉLKA : 109 párů baží (B) TYP : nukleová kyselina (C) POČET ŘETĚZCŮ : jeden (D) TOPOLOGIE : lineární (ii) TYP MOLEKULY : jiná nukleová kyselina (A) POPIS : /popis = „syntetická DNA“ (xi) POPIS SEKVENCE : SEQ. I. Č. : 11:

GTCTGAATTC AAGCTTAGTA OTGGCCAGC CCAAGGGCAA CCCCACGGTC ACCCTGITCC 60 CGCCCTCCTC TGAGGAGCTC CAAGCCAACAAGGCCACACT AGTGTGTCT 109 (2) INFORMACE O SEQ I.Č. : 12:

(i) CHARAKTERISTIKY SEKVENCE :

(A) DÉLKA : 1 10 párů baží (B) TYP : nukleová kyselina (C) POČET ŘETĚZCŮ : jeden (D) TOPOLOGIE : lineární (ii) TYP MOLEKULY : jiná nukleová kyselina (A) POPIS : /popis = „syntetická DNA“ • » (xi) POPIS SEKVENCE : SEQ. I. Č. : 12:

GGTITGGTGG TCTCCACTCC CGCCTTGACG GGGCTGCCAT CTGCCTTCCA GGCCACTGTC 60 ACAGCTCCCG GGTAGAAGTC ACTGATCAGA CACACTAGTG TGGCCITGTT 110 (2) INFORMACE O SEQ I.Č. : 13:

(i) CHARAKTERISTIKY SEKVENCE :

(A) DÉLKA : 98 párů baží (B) TYP : nukleová kyselina (C) POČET ŘETĚZCŮ : jeden (D) TOPOLOGIE : lineární (ii) TYP MOLEKULY : jiná nukleová kyselina (A) POPIS : /popis = „syntetická DNA“ (xi) POPIS SEKVENCE : SEQ. I. Č. : 13:

GGAGTGGAGA CCACCAAACC CTCCAAACAG AGCAACAACA AGTACGCGGC CAGCAGCTAC 60 CTGAGCCTGA CGCCCGAGCA GTGGAAGTCC CACAGAAG 9S (2) INFORMACE O SEQ I.Č. : 14:

(i) CHARAKTERISTIKY SEKVENCE :

(A) DÉLKA : 106 párů baží (B) TYP : nukleová kyselina (C) POČET ŘETĚZCŮ : jeden (D) TOPOLOGIE : lineární (ii) TYP MOLEKULY : jiná nukleová kyselina (A) POPIS : /popis = „syntetická DNA“ (xi) POPIS SEKVENCE : SEQ. I. Č. : 14:

TGTTGAATTC TTACTATGAA CATTCTGTAG GGGCCACTGT CTTCTCCACG GTGCTCCCTT 60 CATGCGTGAC CTGGCAGCTG TAGCTTCTGT GGGACTTCCA CTGCTC 106

• · (2) INFORMACE O SEQ I.Č. : 15:

(i) CHARAKTERISTIKY SEKVENCE :

(A) DÉLKA : 43 párů baží (B) TYP : nukleová kyselina (C) POČET ŘETĚZCŮ : jeden (D) TOPOLOGIE : lineární (ii) TYP MOLEKULY : jiná nukleová kyselina (A) POPIS : /popis = „syntetická DNA“ (xi) POPIS SEKVENCE : SEQ. I. Č. : 15:

GTCTGAATTC AAGCTTAGTA CTTGGCCAGC CCAAGGCCAA CCC

2) INFORMACE O SEQ I.Č. : 16:

(i) CHARAKTERISTIKY SEKVENCE :

(A) DÉLKA : 20 párů baží (B) TYP : nukleová kyselina (C) POČET ŘETĚZCŮ : jeden (D) TOPOLOGIE : lineární (ii) TYP MOLEKULY : jiná nukleová kyselina (A) POPIS : /popis = „syntetická DNA“ (xi) POPIS SEKVENCE : SEQ. I. Č. : 16: TGTTGAATTC TTACTATGAA (2) INFORMACE O SEQ I.Č. : 17:

(i) CHARAKTERISTIKY SEKVENCE :

(A) DÉLKA : 39 párů baží (B) TYP : nukleová kyselina (C) POČET ŘETĚZCŮ : jeden • · • · · · · · · ···· • · · · · · · · · · • ·· · · · ·····* • * · · · · ··· ··« ··· ···· ·· ·· 70 (D) TOPOLOGIE : lineární (ii) TYP MOLEKULY : jiná nukleová kyselina (A) POPIS : /popis - „syntetická DNA“ (xi) POPIS SEKVENCE : SEQ. I. Č. : 17:

CAACAAGTAC GCGGCCAGCA GCTACCTGAG CCTGACGCC (2) INFORMACE O SEQ I.Č. : 18:

(i) CHARAKTERISTIKY SEKVENCE :

(A) DÉLKA : 39 párů baží (B) TYP : nukleová kyselina (C) POČET ŘETĚZCŮ : jeden (D) TOPOLOGIE : lineární (ii) TYP MOLEKULY : jiná nukleová kyselina (A) POPIS : /popis = „syntetická DNA“ (xi) POPIS SEKVENCE : SEQ. I. Č. : 18:

GTAGCTGCTG GCCGCGTACT TGTTGTTGCT CTGTTTGGA (2) INFORMACE O SEQ I.Č. : 19:

(i) CHARAKTERISTIKY SEKVENCE :

(A) DÉLKA : 46 párů baží (B) TYP : nukleová kyselina (C) POČET ŘETĚZCŮ : jeden (D) TOPOLOGIE : lineární (ii) TYP MOLEKULY : jiná nukleová kyselina (A) POPIS : /popis = „syntetická DNA“ • ···· 4 4 4 4 · 44 · 4 · 4 · 4 4444

4 · 4 4 4 4444 • 44 · 44444444

4 4 4 4 4

444 444 444 4444 14 «4 (xi) POPIS SEKVENCE : SEQ. I. Č. : 19:

GTCTGAATTC AAGCTTAGTC CTAGGTCGAA CTGTGGCTGC ACCATC

2) INFORMACE O SEQ I.Č. : 20:

(i) CHARAKTERISTIKY SEKVENCE :

(A) DÉLKA : 34 párů baží (B) TYP : nukleová kyselina (C) POČET ŘETĚZCŮ : jeden (D) TOPOLOGIE : lineární (ii) TYP MOLEKULY : jiná nukleová kyselina (A) POPIS : /popis = „syntetická DNA“ (xi) POPIS SEKVENCE : SEQ. I. Č. : 20: TGTTGAATTC TTACTAACAC TCTCCCCTGT TGAA (2) INFORMACE O SEQ I.Č. : 21:

(i) CHARAKTERISTIKY SEKVENCE :

(A) DÉLKA : 35 párů baží (B) TYP : nukleová kyselina (C) POČET ŘETĚZCŮ : jeden (D) TOPOLOGIE : lineární (ii) TYP MOLEKULY : jiná nukleová kyselina (A) POPIS : /popis = „syntetická DNA“ (xi) POPIS SEKVENCE : SEQ. I. Č. : 21: GTCTAAGCTT CCACCATGGC CTGGACTCCT CTCTT (2) INFORMACE O SEQ I.Č. : 22:

• · · (i) CHARAKTERISTIKY SEKVENCE :

(A) DÉLKA : 48 párů baží (B) TYP : nukleová kyselina (C) POČET ŘETĚZCŮ : jeden (D) TOPOLOGIE ; lineární (ii) TYP MOLEKULY : jiná nukleová kyselina (A) POPIS : /popis = „syntetická DNA“ (xi) POPIS SEKVENCE : SEQ. I. Č. : 22:

TGTTGAATTC AGATCTAACT ACTTACCTAG GACAGTGACC TTGGTCCC (2) INFORMACE O SEQ I.Č. : 23:

(i) CHARAKTERISTIKY SEKVENCE :

(A) DÉLKA : 128 párů baží (B) TYP : nukleová kyselina (C) POČET ŘETĚZCŮ : jeden (D) TOPOLOGIE : lineární (ii) TYP MOLEKULY : jiná nukleová kyselina (A) POPIS : /popis = „syntetická DNA“ (xi) POPIS SEKVENCE : SEQ. I. Č. : 23:

GTCTAAGCTT CCACCATGGG GTTTGGGCTG AGCTGGGTTT TCCTCCTTGC TCTTTTAAGA 60 GGTGTCCAGT GTCAGGTGCA GCTGGTGGAG TCTGGGGGAG GCGTGGTCCA GCCTGGGAGG 120 TCCCTGAG 128

2) INFORMACE O SEQ I.Č. : 24:

(i) CHARAKTERISTIKY SEKVENCE :

(A) DÉLKA : 125 párů bázi (B) TYP : nukleová kyselina (C) POČET ŘETĚZCŮ : jeden

120

125 (D) TOPOLOGIE : lineární (ii) TYP MOLEKULY ; jiná nukleová kyselina (A) POPIS : /popis = „syntetická DNA“ (xi) POPIS SEKVENCE : SEQ. I. Č. : 24:

ACCATTAGTA GTGGTGGTAG TTACACCTAC TATCCAGACA GTGTGAAGGG GCGATICACC ATCTCCAGAG ACAAHCCAA GAACACGCTG TATCTGCAAA TGAACAGCCT GAGAGCTGAG GACAC (2) INFORMACE O SEQ I.Č. : 25:

(i) CHARAKTERISTIKY SEKVENCE :

(A) DÉLKA : 132 párů baží (B) TYP : nukleová kyselina (C) POČET ŘETĚZCŮ : jeden (D) TOPOLOGIE : lineární (ii) TYP MOLEKULY : jiná nukleová kyselina (A) POPIS : /popis = „syntetická DNA“ (xi) POPIS SEKVENCI : SEQ. I. Č. : 25 :

CTACCACCAC TAGTAATGGT TGCCACCCAC TCCAGCCCCT TGCCTGGAGC CTGGCGGACC 60 CAAGACATGC CATAGCTACT GAAGGTGAAT CCAGAGGCTG CACAGGAGAG TCTCAGGGAC 120 CTCCGAGGCT GG 132 (2) INFORMACE O SEQ I.Č. : 26:

(i) CHARAKTERISTIKY SEKVENCE :

(A) DÉLKA : 110 párů baží (B) TYP : nukleová kyselina (C) POČET ŘETĚZCŮ : jeden (D) TOPOLOGIE : lineární • ♦ · ·· ·· • · · « · · · · • · · · ♦ · • · · ··· · · * • · · · ·*····· « 9 9 9 (ii) TYP MOLEKULY : jiná nukleová kyselina (A) POPIS : /popis = „syntetická DNA“ (xi) POPIS SEKVENCE : SEQ. I. Č. : 26:

tgítggatcc ctgaggagac ggtgaccagg ghccctggc CCCAGTAAGC AAAGTAAGTC 60 ATAGTAGTCT GTCTCGCACA GTAATACACA GCCGTGTCCT CAGCTCTCAG Π0 (2) INFORMACE O SEQ I.Č. ; 27:

(i) CHARAKTERISTIKY SEKVENCE :

(A) DÉLKA : 30 párů baží (B) TYP : nukleová kyselina (C) POČET ŘETĚZCŮ : jeden (D) TOPOLOGIE : lineární (ii) TYP MOLEKULY : jiná nukleová kyselina (A) POPIS : /popis = „syntetická DNA“ (xi) POPIS SEKVENCE : SEQ. I. Č. : 27: GTCTAAGCTT CCACCATGGG GTTTGGGCTG (2) INFORMACE O SEQ I.Č. : 28:

(i) CHARAKTERISTIKY SEKVENCE :

(A) DÉLKA : 30 párů baží (B) TYP : nukleová kyselina (C) POČET ŘETĚZCŮ : jeden (D) TOPOLOGIE : lineární (ii) TYP MOLEKULY : jiná nukleová kyselina (A) POPIS : /popis = „syntetická DNA“ (xi) POPIS SEKVENCE : SEQ. I. Č. : 28: TGTTGGATCC CTGAGGAGAC GGTGACCAGG

ΦΦΦΦΦ φ Φ· ΦΦ ΦΦ φ· φ φφφφ φ · · ·

ΦΦΦ» φ φ φφφφ • φ* φ φφφφφφφφ (2) INFORMACE Ο SEQ I.Č. : 29:

(i) CHARAKTERISTIKY SEKVENCE :

(A) DÉLKA : 133 párů baží (B) TYP : nukléová kyselina (C) POČET ŘETĚZCŮ : jeden (D) TOPOLOGIE : lineární (ii) TYP MOLEKULY : jiná nukléová kyselina (A) POPIS : /popis = „syntetická DNA“ (xi) POPIS SEKVENCE : SEQ. I. Č. : 29:

ACAAAGCTTC CACCATGGCC TGGACTCCTC TCTTCTTCTT CTTTGTTCTT CATTGCTCAG 60 GTTCHTCTC CCAGCTTGTG CTGACTCAAT CGCCCTCTGC CTCTGCCTCC CTGGGAGCCT 120 CGGTCAAGCT CAC 133 (2) INFORMACE O SEQ I.Č. : 30:

(i) CHARAKTERISTIKY SEKVENCE :

(A) DÉLKA : 118 párů baží (B) TYP : nukléová kyselina (C) POČET ŘETĚZCŮ : jeden (D) TOPOLOGIE : lineární (ii) TYP MOLEKULY : jiná nukléová kyselina (A) POPIS : /popis = „syntetická DNA“ (xi) POPIS SEKVENCE : SEQ. I. Č. : 30:

AGCAAGATGG AAGCCACAGC ACAGGTGATG GGATTCCTGA TCGCTTCTCA GGCTCCAGCT 60 CTGGGGCTGA GCGCTACCTC ACCATCTCCA GCCTCCAGTC TGAGGATGAG GCTGACTA 118 (2) INFORMACE O SEQ I.Č. : 31:

(i) CHARAKTERISTIKY SEKVENCE :

(A) DÉLKA : 128 párů baží (B) TYP : nukleová kyselina (C) POČET ŘETĚZCŮ : jeden (D) TOPOLOGIE : lineární (ii) TYP MOLEKULY : jiná nukleová kyselina (A) POPIS : /popis = „syntetická DNA“ (xi) POPIS SEKVENCE : SEQ. I. Č. : 31:

CrGTGGCTrC βΛΤΟΤΤβΟΓΤ AAGTTTCATC AAGTACCGAG GGCCCTTCTC TGGCTGCTGC 60 TGATGCCAIT CAATGGTGTA CGTACTGTGC TGACTACTCA AGGTGCAGGT GAGC1TGACC 120 GAGGCTCC 128

2) INFORMACE O SEQ I.Č. : 32:

(i) CHARAKTERISTIKY SEKVENCE :

(A) DÉLKA : 114 párů baží (B) TYP : nukleová kyselina (C) POČET ŘETĚZCŮ : jeden (D) TOPOLOGIE : lineární (ii) TYP MOLEKULY : jiná nukleová kyselina (A) POPIS : /popis = „syntetická DNA“ (xi) POPIS SEKVENCE : SEQ. I. Č. : 32:

CTTGGATCCG GGCTGACCTA GGACGGTCAG TITGGTCCCT CCGCCGAACA CCCTCACAAA 60 TTGTTCCTTA ATTGTATCAC CCACACGACA GTAATAGTCA GCCTCATCCT CAGA 114 (2) INFORMACE O SEQ I.Č. : 33:

(i) CHARAKTERISTIKY SEKVENCE :

(A) DÉLKA : 17 párů baží (B) TYP : nukleová kyselina (C) POČET ŘETĚZCŮ : jeden (D) TOPOLOGIE : lineární • 999 * ·· 99 99 * · 9 9 9 9999 •·9 9 9 9999

9· 9 9 9 999999 • · 9 9 9 ·♦· 9999999 9 · «9 (ii) TYP MOLEKULY : jiná nukleová kyselina (A) POPIS : /popis = „syntetická DNA“ (xi) POPIS SEKVENCE : SEQ. I. Č. : 33: ACAAAGCTTC CACCATG (2) INFORMACE O SEQ I.Č. : 34:

(i) CHARAKTERISTIKY SEKVENCE :

(A) DÉLKA : 19 párů baží (B) TYP : nukleová kyselina (C) POČET ŘETĚZCŮ : jeden (D) TOPOLOGIE : lineární (ii) TYP MOLEKULY : jiná nukleová kyselina (A) POPIS : /popis = „syntetická DNA“ (xi) POPIS SEKVENCE : SEQ. I. Č. : 34: CTTGGATCCG GGCTGACCT (2) INFORMACE O SEQ I.Č. : 35:

(i) CHARAKTERISTIKY SEKVENCE :

(A) DÉLKA : 75 párů baží (B) TYP : nukleová kyselina (C) POČET ŘETĚZCŮ : jeden (D) TOPOLOGIE : lineární (ii) TYP MOLEKULY : jiná nukleová kyselina (A) POPIS : /popis = „syntetická DNA“ *··· • ·· • ·9 ·· ·· • · · · · · · · • * · · · · • · · ·♦ · ··· ♦ · · · (xi) POPIS SEKVENCE : SEQ. I. Č. : 35:

CTTGGATCCG GGCTGACCTA GGACGGTCAG TTTGGTCCCT CCGCCGAACA CGTACACAAA 60 TTGTTCCTTA ATTGT 75

2) INFORMACE O SEQ I.Č. : 36:

(i) CHARAKTERISTIKY SEKVENCE :

(A) DÉLKA : 43 párů baží (B) TYP : nukleová kyselina (C) POČET ŘETĚZCŮ : jeden (D) TOPOLOGIE : lineární (ii) TYP MOLEKULY : jiná nukleová kyselina (A) POPIS : /popis = „syntetická DNA“ (xi) POPIS SEKVENCE : SEQ. I. Č. :36:

AAAGGATCCT TAAGATCCAT CAAGTACCGA GGGGGTTCT CTG (2) INFORMACE O SEQ I.Č. : 37:

(i) CHARAKTERISTIKY SEKVENCE :

(A) DÉLKA : 46 párů baží (B) TYP : nukleová kyselina (C) POČET ŘETĚZCŮ : jeden (D) TOPOLOGIE : lineární (ii) TYP MOLEKULY : jiná nukleová kyselina (A) POPIS : /popis = „syntetická DNA“ (xi) POPIS SEKVENCE : SEQ. I. Č. : 37:

ACAAAGCTTA GCGCTACCTC ACCATCTCCA GCCTCCAGCC TGAGGA (2) INFORMACE O SEQ I.Č. : 38:

• ·· BB BB • · · Β Β ΒΒ Β

Β Β ΒΒΒΒ

Β Β Β ΒΒΒ ΒΒΒ • Β Β Β

ΒΒΒ ΒΒΒΒ ΒΒ ΒΒ (i) CHARAKTERISTIKY SEKVENCE :

(A) DÉLKA -.111 párů baží (B) TYP ; nukleová kyselina (C) POČET ŘETĚZCŮ : jeden (D) TOPOLOGIE : lineární (ii) TYP MOLEKULY : jiná nukleová kyselina (A) POPIS : /popis = „syntetická DNA“ (xi) POPIS SEKVENCE : SEQ. I. Č. : 38:

CTTGGATCCG GGCTGACCTA GGACGGTCAG TTTGGTCCCT CCGCCGAACA CGTACACAAA 60 TTGTTCCTTA ATTGTATCAC CCACACCACA GATATAGTCA GCCTCATCCT C 111 (2) INFORMACE O SEQ I.Č. : 39:

(i) CHARAKTERISTIKY SEKVENCE :

(A) DÉLKA : 42 párů baží (B) TYP : nukleová kyselina (C) POČET ŘETĚZCŮ : jeden (D) TOPOLOGIE : lineární (ii) TYP MOLEKULY : jiná nukleová kyselina (A) POPIS : /popis = „syntetická DNA“ (xi) POPIS SEKVENCE : SEQ. I. Č. : 39:

CTTCTCTGGC TGCTGCTGAT ACCATTCAAT GGTGTACGTA CT

2) INFORMACE O SEQ I.Č. : 40:

(i) CHARAKTERISTIKY SEKVENCE :

(A) DÉLKA : 26 párů baží (B) TYP : nukleová kyselina (C) POČET ŘETĚZCŮ : jeden (D) TOPOLOGIE : lineární

4 4 4 4 4
44 4 4	4 4 44 4 4	4
4	4

·· ·· • · · · ·

4 4 4 • · 44 4 • 4 4

4444 44 «4 (ii) TYP MOLEKULY : jiná nukleová kyselina (A) POPIS : /popis = „syntetická DNA“ (xi) POPIS SEKVENCE : SEQ. I. Č. : 40: CGAGGGCCCT TCTCTGGCTG CTGCTG (2) INFORMACE O SEQ I.Č. : 41:

(i) CHARAKTERISTIKY SEKVENCE :

(A) DÉLKA : 35 párů baží (B) TYP : nukleová kyselina (C) POČET ŘETĚZCŮ : jeden (D) TOPOLOGIE : lineární (ii) TYP MOLEKULY : jiná nukleová kyselina (A) POPIS : /popis = „syntetická DNA“ (xi) POPIS SEKVENCI : SEQ. I. Č. : 41 :

GAGAAGGGCC CTARGTACST GATGRAWCTT AAGCA (2) INFORMACE O SEQ I.Č. : 42:

(i) CHARAKTERISTIKY SEKVENCE :

(A) DÉLKA : 35 párů baží (B) TYP : nukleová kyselina (C) POČET ŘETĚZCŮ : jeden (D) TOPOLOGIE : lineární (ii) TYP MOLEKULY : jiná nukleová kyselina (A) POPIS : /popis = „syntetická DNA“ (xi) POPIS SEKVENCE : SEQ. I. Č. : 42:

CACGAATTCA CTATCGATTC TGGAACCTTC AGAGG ••·· 9 99 ·· ·· • ·· · · 9 9 9 9 ··* 9 9 9999 ·· * · 9 999999

9 9 9 9

999 999 9999 99 99 (2) INFORMACE O SEQ I.Č. : 43:

(i) CHARAKTERISTIKY SEKVENCE :

(A) DÉLKA : 18 párů baží (B) TYP : nukleová kyselina (C) POČET ŘETĚZCŮ : jeden (D) TOPOLOGIE : lineární (ii) TYP MOLEKULY : jiná nukleová kyselina (A) POPIS : /popis = „syntetická DNA“ (xi) POPIS SEKVENCE : SEQ. I. Č. : 43: GGCTTGGAGC TCCTCAGA (2) INFORMACE O SEQ I.Č. : 44:

(i) CHARAKTERISTIKY SEKVENCE :

(A) DÉLKA : 20 párů baží (B) TYP : nukleová kyselina (C) POČET ŘETĚZCŮ : jeden (D) TOPOLOGIE : lineární (ii) TYP MOLEKULY : jiná nukleová kyselina (A) POPIS : /popis = „syntetická DNA“ (xi) POPIS SEKVENCE : SEQ. I. Č. : 44: GACAGTGGTT CAAAGTTTTT (2) INFORMACE O SEQ I.Č. : 45:

(i) CHARAKTERISTIKY SEKVENCE :

(A) DÉLKA : 118 aminokyselin (B) TYP : aminokyselina • · · · · 9 9 9 9 • 99 * · 9 9 9 9

9 9 9 999999

9 9 9 9

999 999 9999 99 99 (D) TOPOLOGIE : lineární (ii) TYP MOLEKULY : protein (xi) POPIS SEKVENCE : SEQ. I. Č. : 45:

Gin Leu Val Leu Thr Gin Ser Ser Ser Ala Ser Phe Ser Leu Gly 15 10 15

Ala Ser Ala Lys Leu Thr Cys Thr Leu Ser Ser Gin His Ser Thr 20 25 30

Tyr Thr Ile Glu Trp Tyr Gin Gin Gin Pro Leu Lys Pro Pro Lys 35 40 45

Tyr Val Met Asp Leu Lys Gin Asp Gly Ser His Ser Thr Gly Asp 50 55 60

Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Ser Ser Gly Ala Asp Arg 65 70 75

Tyr Leu Ser Ile Ser Asn Ile Gin Pro Glu Asp Glu Ala Met Tyr 60 85 90

Ile Cys Gly Val Gly Asp Thr Ile Lys Glu Gin Phe Val Tyr Val 95 100 105

Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Thr Val Leu Gly Gin Pro 110 115 (2) INFORMACE O SEQ I.Č. : 46:

(i) CHARAKTERISTIKY SEKVENCE :

(A) DÉLKA : 118 aminokyselin (B) TYP : aminokyselina (D) TOPOLOGIE : lineární (ii) TYP MOLEKULY : protein (xi) POPIS SEKVENCE : SEQ. I. Č. : 46:

Glu Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Asp Leu Val Lys Pro Gly 15 10 15

Gly Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser 20 25 30

Ser Tyr Gly Met Ser Trp Ile Arg Gin Thr Pro Asp Lys Arg Leu 35 40 45

Glu Trp Val Ala Thr Ile Ser Ser Gly Gly Ser Tyr Thr Tyr Tyr ·»··

44

44 44 « ·«·· 4 4 4 4 4

4 444 444 • 4 4

55 60

Pro Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala

70 75

Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gin Met Ser Ser Leu Lys Ser Glu Asp

85 90

Thr Ala Met Phe Tyr Cys Ala Arg Gin Thr Thr Met Thr Tyr Phe

100 105

Ala Tyr Trp Gly Gin Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala

110 115 (2) INFORMACE O SEQ I.Č. : 47:

(i) CHARAKTERISTIKY SEKVENCE :

(A) DÉLKA : 116 aminokyselin (B) TYP : aminokyselina (D) TOPOLOGIE : lineární (ii) TYP MOLEKULY : protein (xi) POPIS SEKVENCE : SEQ. I. Č. : 47:

Gin Leu Val Leu Thr Gin Ser Pro Ser Ala Ser Ala Ser Leu Gly ¹ 5 10 15

Ala Ser Val Lys Leu Thr Cys Thr Leu Ser Ser Gin His Ser Thr

25 30

Tyr Thr Ile Glu Trp His Gin Gin Gin Pro Glu Lys Gly Pro Arg

40 45

Tyr Leu Met Lys Leu Lys Gin Asp Gly Ser His Ser Thr Gly Asp

55 60

Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Ser Ser Gly Ala Glu Arg

70 75

Tyr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gin Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr

85 90

Tyr Cys Gly Val Gly Asp Thr Ile Lys Glu Gin Phe Val Tyr Val 95 100 105

Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly HO 115 (2) INFORMACE O SEQ I.Č. : 48:

Φ··* ♦ ΦΦ ΦΦ ·· * · Φ · · Φ φ φ φ ··· · » φ Φ Φ Φ • · · Φ Φ ΦΦΦ »·· Φ Φ · · Φ • ΦΦ φφφ ·»·» «φ φφ (i) CHARAKTERISTIKY SEKVENCE :

(A) DÉLKA : 118 aminokyselin (B) TYP ; aminokyselina (D) TOPOLOGIE : lineární (ii) TYP MOLEKULY : protein (xi) POPIS SEKVENCE : SEQ. I. Č. : 48:

Gin Leu Val Leu Thr Gin Ser Pro Ser Ala Ser Ala Ser Leu Gly 16 10 15

Ala Ser Val Lys Leu Thr Cys Thr Leu Ser Ser Gin His Ser Thr 20 25 30

Tyr Thr Ile Glu Trp Tyr Gin Gin Gin Pro Glu Lys Gly Pro Lys 35 40 45

Tyr Leu Met Asp Leu Lys Gin Asp Gly. Ser His Ser Thr Gly Asp 50 55 60

Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Ser Ser Gly Ala Glu Arg 65 70 75

Tyr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gin Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr 80 85 90

Tyr Cys Gly Val Gly Asp Thr Ile Lys Glu Gin Phe Val Tyr Val 95 100 105

Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Gin Pro 110 115 (2) INFORMACE O SEQ I.Č. : 49:

(i) CHARAKTERISTIKY SEKVENCE :

(A) DÉLKA : 118 aminokyselin (B) TYP : aminokyselina (D) TOPOLOGIE : lineární (ii) TYP MOLEKULY : protein (xi) POPIS SEKVENCE : SEQ. I. Č. : 49:

Gin Leu Val Leu Thr Gin Ser Pro Ser Ala Ser Ala Ser Leu Gly 15 10 15

Ala Ser Val Lys Leu Thr Cys Thr Leu Ser Ser Gin His Ser Thr 20 25 30

Tyr Thr Ile Glu Trp Tyr GJn Gin Gin Pro Glu Lys Gly Pro Lys • 9999 ·· ·

999 • 9 9 • 9 99 9 »·· • »· • 9 · · • · 9 9 ·

999 9999 ·· 99 • 9 9 9

9 9 9

999 999

9

99

40 45

Tyr Val Met Asp Leu Lys Gin Asp Gly Ser His Ser Thr Gly Asp

55 60

Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Ser Ser Gly Ala Glu Arg

70 75

Tyr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gin Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr

85 90

Tyr Cys Gly Val Gly Asp Thr Ile Lys Glu Gin Phe Val Tyr Val

100 105

Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Gin Pro

110 115 (2) INFORMACE O SEQ I.Č. : 50:

(i) CHARAKTERISTIKY SEKVENCE :

(A) DÉLKA : 118 aminokyselin (B) TYP : aminokyselina (D) TOPOLOGIE : lineární (ii) TYP MOLEKULY : protein (xi) POPIS SEKVENCE : SEQ. I. Č. : 50:

Gin Leu Val Leu Thr Gin Ser Pro Ser Ala Ser Ala Ser Leu Gly 15 10 15

Ala Ser Val Lys Leu Thr Cys Thr Leu Ser Ser Gin His Ser Thr 20 25 30

Tyr Thr Ile Glu Trp Tyr Gin Gin Gin Pro Glu Lys Gly Pro Arg 35 40 45

Tyr Leu Met Asp Leu Lys Gin Asp Gly Ser His Ser Thr Gly Asp 50 55 60

Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Ser Ser Gly Ala Glu Arg 65 70 75

Tyr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gin Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr 80 85 90

Tyr Cys Gly Val Gly Asp Thr Ile Lys Glu Gin Phe Val Tyr Val 95 100 105

Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Gin Pro 110 115 • ·

(2) INFORMACE O SEQ I.Č. : 51:

(i) CHARAKTERISTIKY SEKVENCE :

(A) DÉLKA : 118 aminokyselin (B) TYP : aminokyselina (D) TOPOLOGIE : lineární (ii) TYP MOLEKULY : protein (xi) POPIS SEKVENCE : SEQ. I. Č. : 51:

Gin Leu Val Leu Thr Gin Ser Pro Ser Ala Ser Ala Ser Leu Gly 1 5 10 15

Ala Ser Val Lys Leu Thr Cys Thr Leu Ser Ser Gin His Ser Thr 20 25 30

Tyr Thr Ile Glu Trp Tyr Gin Gin Gin Pro Glu Lys Gly Pro Arg 35 40 45

Tyr Val Met Asp Leu Lys Gin Asp Gly Ser His Ser Thr Gly Asp 50 55 60

Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Ser Ser Gly Ala Glu Arg 65 70 75

Tyr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gin Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr 80 85 90

Tyr Cys Gly Val Gly Asp Thr Ile Lys Glu Gin Phe Val Tyr Val 95 100 105

Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Gin Pro 110 115 (2) INFORMACE O SEQ I.Č. : 52:

(i) CHARAKTERISTIKY SEKVENCE :

(A) DÉLKA : 118 aminokyselin (B) TYP : aminokyselina (D) TOPOLOGIE : lineární (ii) TYP MOLEKULY : protein (xi) POPIS SEKVENCE : SEQ. I. Č. : 52:

Gin Leu Val Leu Thr Gin Ser Pro Ser Ala Ser Ala Ser Leu Gly 1 5 10 15

Ala Ser Val Lys Leu Thr Cys Thr Leu Ser Ser Gin His Ser Thr 20 25 30

Tyr Thr Ile Glu Trp Tyr Gin Gin Gin Pro Glu Lys Gly Pro Lys 35 40 45

Tyr Leu Met Asp Leu Lys Gin Asp Gly Ser His Ser Thr Gly Asp 50 55 60

Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Ser Ser Gly Ala Glu Arg 65 70 75

Tyr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gin Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr 80 85 90

Ile Cys Gly Val Gly Asp Thr Ile Lys Glu Gin Phe Val Tyr Val 95 100 105

Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Gin Pro 110 115 (2) INFORMACE O SEQ I.Č. : 53:

(i) CHARAKTERISTIKY SEKVENCE :

(A) DÉLKA : 118 aminokyselin (B) TYP : aminokyselina (D) TOPOLOGIE : lineární (ii) TYP MOLEKULY : protein (xi) POPIS SEKVENCE : SEQ. I. Č. : 53:

Gin Leu Val Leu Thr Gin Ser Pro Ser Ala Ser Ala Ser Leu Gly 15 10 15

Ala Ser Val Lys Leu Thr Cys Thr Leu Ser Ser Gin His Ser Thr 20 25 30

Tyr Thr Ile Glu Trp Tyr Gin Gin Gin Pro Glu Lys Gly Pro Arg 35 40 45

Tyr Leu Met Asp Leu Lys Gin Asp Gly Ser His Ser Thr Gly Asp 50 55 60

Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Ser Ser Gly Ala Glu Arg 65 70 75

Tyr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gin Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr 80 . 85 90

Ile Cys Gly Val Gly Asp Thr Ile Lys Glu Gin Phe Val Tyr Val , 95 100 105

Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Glu Pro 110 115

• * • · (2) INFORMACE O SEQ I.Č. : 54:

(i) CHARAKTERISTIKY SEKVENCE :

(A) DÉLKA : 118 aminokyselin (B) TYP : aminokyselina (D) TOPOLOGIE : lineární (ii) TYP MOLEKULY : protein (xi) POPIS SEKVENCE : SEQ. I. Č. : 54:

Gin Leu Val Leu Thr Gin Ser Pro Ser Ala Ser Ala Ser Leu Gly 16 10 15

Ala Ser Val Lys Leu Thr Cys Thr Leu Ser Ser Gin His Ser Thr 20 25 30

Tyr Thr Ile Glu Trp Tyr Gin Gin Gin Pro Glu Lys Gly Pro Lys 35 40 45

Tyr Val Met Asp Leu Lys Gin Asp Gly Ser His Ser Thr Gly Asp 50 55 60

Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Ser Ser Gly Ala Glu Arg 65 70 75

Tyr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gin Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr 80 85 90

Ile Cys Gly Val Gly Asp Thr Ile Lys Glu Gin Phe Val Tyr Val 95 100 105

Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Gin Pro 110 115 (2) INFORMACE O SEQ I.Č. : 55:

(i) CHARAKTERISTIKY SEKVENCE :

(A) DÉLKA : 118 aminokyselin (B) TYP : aminokyselina (D) TOPOLOGIE : lineární • « · · « © · ·

• · ·© © ·· ©· (ii) TYP MOLEKULY : protein (xi) POPIS SEKVENCE : SEQ. I. Č. : 55:

Gin Leu Val Leu Thr Gin Ser Pro Ser Ala Ser Ala Ser Leu Gly 15 10 15

Ala Ser Val Lys Leu Thr Cys Thr Leu Ser Ser Gin His Ser Thr 20 25 30

Tyr Thr Ile Glu Trp Tyr Gin Gin Gin Pro Glu Lys Gly Pro Arg 35 40 45

Tyr Val Met Asp Leu Lys Gin Asp Gly Ser His Ser Thr Gly Asp 50 55 60

Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Ser Ser Gly Ala Glu Arg 65 70 75

Tyr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gin Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr 80 85 90

Ile Cys Gly Val Gly Asp Thr Ile Lys Glu Gin Phe Val Tyr Val 95 100

Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Gin Pro 110 115 (2) INFORMACE O SEQ I.Č. : 56:

(i) CHARAKTERISTIKY SEKVENCE :

(A) DÉLKA : 118 aminokyselin (B) TYP : aminokyselina (D) TOPOLOGIE : lineární (ii) TYP MOLEKULY : protein (xi) POPIS SEKVENCE : SEQ. I. Č. : 56:

Gin Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gin Pro Gly 15 10 15

Arg Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser 20 25 30

Ser Tyr Gly Met Ser Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu 35 40 45

Glu Trp Val Ala Thr Ile Ser Ser Gly Gly Ser Tyr Thr Tyr Tyr 50 55 60

Pro Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser 65 70 75

·· · • ·

Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp 80 85 90

Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Gin Thr Thr Met Thr Tyr Phe 95 100 105

Ala Tyr Trp Gly Gin Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 110 US (2) INFORMACE O SEQ I.Č. : 57:

(i) CHARAKTERISTIKY SEKVENCE :

(A) DÉLKA : 411 párů baží (B) TYP : nukleová kyselina (C) POČET ŘETĚZCŮ : dva (D) TOPOLOGIE : lineární (ii) TYP MOLEKULY : cDNA na mRNA (xi) POPIS SEKVENCE : SEQ. I. Č. : 57:

ATG AAC TTC GGG CTC AGC TTG ATT TTC CTT GCC CTC ATT TTA AAA 45 Met Asn Phe Gly Leu Ser Leu líe Phe Leu Ala Leu Ile Leu Lys

-15 -10 -5

GCT CTC CAG TGT GAG CTG CAA CTG GTG GAG TCT GGG GGA GAC TTA 90

Gly Val Gin Cys Glu Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Asp Leu

5 10

GTG AAG CCT GGA GGG TCC CTG AAA CTC TCC TGT GCA GCC TCT GGA 135

Val Lys Pro Gly Gly Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly

20 25

TTC ACT TTC AGT AGC TAT GGC ATG TCT TGG ATT CGC CAG ACT CCA 180

Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Gly Met Ser Trp Ile Arg Gin Thr Pro

35 40

GAC AAG AGG CTG GAG TGG CTC GCA ACC ATT AGT AGT GGT GCT AGT 225

Asp Lys Arg Leu Glu Trp Val Ala Thr Ile Ser Ser Gly Gly Ser

50 55

TAC ACC TAC TAT CCA GAC AGT GTG AAG GGG CGA TO ACC ATC TCC 270

Tyr Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser

65 70

AGA GAC AAT GCC AAG AAC ACC CTA TAC CTG CAA ATG AGC AGT CTG 315

Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gin Met Ser Ser Leu

80 85

AAG TCT GAG GAC ACA GCC ATG TTT TAC TGT GCA AGA CAG ACT ACT 360

Lys Ser Glu Asp Thr Ala Met Phe Tyr Cys Ala Arg Gin Thr Thr

95 100

ATG ACT TAC ΤΤΪ GCT TAC TGG GGC CAA GGG ACT CTG CTC ACT GTC Met Thr Tyr Phe Ala Tyr Trp Gly Gin Gly Thr Leu Val Thr Val

105 110 115

TCT GCA 411 Ser Ala (2) INFORMACE O SEQ I.Č. : 58:

(i) CHARAKTERISTIKY SEKVENCE :

(A) DÉLKA : 411 párů baží (B) TYP : nukleová kyselina (C) POČET ŘETĚZCŮ : dva (D) TOPOLOGIE : lineární (ii) TYP MOLEKULY : cDNA na mRNA (xi) POPIS SEKVENCE : SEQ. I. Č. : 58:

ATG GGG TTT GGG CTG AGC TGG GTT TTC CTC GTT GCT CTT TTA AGA

Met Gly Phe Gly Leu Ser Trp Val Phe Leu Val Ala Leu Leu Arg

-15 -10 -5

GGT GTC CAG TGT CAG GTG CAG CTG GTG GAG TCT GGG GGA GGC GTG

Gly Val Gin Cys Gin Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val

1.5 10

GTC CAG CCT GGG AGG TCC CTG AGA CTC TCC TGT GCA GCC TCT GGA

Val Gin Pro Gly Arg Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly

20 25

TTC ACC TTC ACT AGC TAT GGC ATG TCT TGG GTC CGC CAG GCT CCA

Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Gly Met Ser Trp Val Arg Gin Ala Pro

35 40

GGC AAG GGG CTG GAG TGG GTG GCA ACC ATT ACT AGT GGT GGT ACT

Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala Thr Ile Ser Ser Gly Gly Ser

50 55

TAC ACC TAC TAT CCA GAC ACT GTG AAG GGG CGA TTC ACC ATC TCC Tyr Thr Tyr Týr Pro Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser

65 70

AGA GAC AAT TCC AAG AAC ACG CTG TAT CTG CAA ATG AAC AGC CTG Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gin Met Asn Ser Leu

80 85

AGA GCT GAG GAC ACG GCT GTG TAT TAC TCT GCG AGA CAG ACT ACT Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Gin Thr Thr

95 100

ATG ACT TAC TIT GCT TAC TGG GGC CAG GGA ACC CTG CTC ACC GTC Met Thr Tyr Phe Ala Tyr Trp Gly Gin Gly Thr Leu Val Thr Val

105 110 315

TCC TCA 411 Ser Ser

(2) INFORMACE O SEQ I.Č. : 59:

(i) CHARAKTERISTIKY SEKVENCE :

(A) DÉLKA : 11 aminokyselin (B) TYP : aminokyselina (D) TOPOLOGIE : lineární (ii) TYP MOLEKULY : peptid (xi) POPIS SEKVENCE : SEQ. I. Č. : 59 Lys Ala Ser Gin Asp Val Asn Thr Ala Val Ala

5 10 (2) INFORMACE O SEQ I.Č. : 60:

(i) CHARAKTERISTIKY SEKVENCE :

(A) DÉLKA : 7 aminokyselin (B) TYP : aminokyselina (D) TOPOLOGIE : lineární (ii) TYP MOLEKULY : peptid (xi) POPIS SEKVENCE : SEQ. I. Č. : 60

Ser Ala Ser Asn Arg Tyr Thr 1 5 (2) INFORMACE O SEQ I.Č. : 61:

(i) CHARAKTERISTIKY SEKVENCE :

(A) DÉLKA : 9 aminokyselin (B) TYP : aminokyselina (D) TOPOLOGIE : lineární ·· · · • · ·

·· ·· ·· · • 0 (ii) TYP MOLEKULY : peptid (xi) POPIS SEKVENCE : SEQ. I. Č. : 61:

Gin Gin His Tyr Ser Thr Pro Phe Thr 1 5 (2) INFORMACE O SEQ I.Č. : 62:

(i) CHARAKTERISTIKY SEKVENCE :

(A) DÉLKA : 5 aminokyselin (B) TYP : aminokyselina (D) TOPOLOGIE : lineární (ii) TYP MOLEKULY : peptid (xi) POPIS SEKVENCE : SEQ. I. Č. : 62:

Pro Tyr Trp Met Gin ¹ 5 (2) INFORMACE O SEQ I.Č. : 63:

(i) CHARAKTERISTIKY SEKVENCE :

(A) DÉLKA : 16 aminokyselin (B) TYP : aminokyselina (D) TOPOLOGIE : lineární (ii) TYP MOLEKULY : peptid (xi) POPIS SEKVENCE : SEQ. I. Č. : 63:

Ser Ile Phe Gly Asp Gly Asp Thr Arg Tyr Ser Gin Lys Phe Lys Gly 1 5 10 15 (2) INFORMACE O SEQ I.Č. : 64:

(i) CHARAKTERISTIKY SEKVENCE :

···· * ·· ·· ·· • · * · · · · · · ··· · ····· • · * · · ···<·· • · · · ₉ (A) DÉLKA : 11 aminokyselin (B) TYP : aminokyselina (D) TOPOLOGIE : lineární (ii) TYP MOLEKULY : peptid (xi) POPIS SEKVENCE : SEQ. I. Č. : 64:

Gly Leu Arg Arg Gly Gly Tyr Tyr Phe Asp Tyr ¹ 5 io (2) INFORMACE O SEQ I.Č. : 65:

(i) CHARAKTERISTIKY SEKVENCE :

(A) DÉLKA : 411 párů baží (B) TYP : nukleová kyselina (C) POČET ŘETĚZCŮ : dva (D) TOPOLOGIE : lineární (ii) TYP MOLEKULY : cDNA na mRNA (xi) POPIS SEKVENCE : SEQ. I. Č. : 65:

ATG GCC TGG ACT CCT CTC TTC TTC TO TTT GTT CTT CAT TGC TCA 45 Met Ala Trp Thr Pro Leu Phe Phe Phe Phe Val Leu His Cys Ser

-15 -10 -5

GGT TCT TO TCC CAA CTT GTG CTC ACT CAG TCA TCT TCA GCC TCT 90 Gly Ser Phe- Ser Gin Leu Val Leu Thr Gin Ser Ser Ser Ala Ser

5 10

TTC TCC CTG GGA GCC TCA GCA AAA CTC ACG TGC ACC TTG AGT AGT 135 Phe Ser Leu Gly Ala Ser Ala Lys Leu Thr Cys Thr Leu Ser Ser

20 25

CAG CAC AGT ACG TAC ACC ATT GAA TGG TAT CAG CAA CAG CCA CTC 180 Gin His Ser Thr Tyr Thr Ile Glu Trp Tyr Gin Gin Gin Pro Leu

35 40

AAG CCT CCT AAG TAT GTG ATG GAT CITAAG CAA GAT GGA AGC CAC 225 Lys Pro Pro Lys Tyr Val Met Asp Leu Lys Gin Asp Gly Ser His

50 55

AGC ACA GGT GAT GGG ATT CCT GAT CGC TO TCT GGA TCC AGC TCT 270 Ser Thr Gly Asp Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Ser Ser

65 70

GGT GCT GAT CGC TAC CTT AGC ATT TCC AAC ATC CAG CCA GAA GAT 315 Gly Ala Asp Arg Tyr Leu Ser Ile Ser Asn Ile Gin Pro Glu Asp

80 85

9 9 9 9 • · 9 9 • · 9 9 •99 999 • 9 «9 99

GAA GCA ATG TAC ATC TGT GGT GTG GGT GAT ACA ATT AAG GAA CAA 360

Glu Ala Met Tyr Ile Cys Gly Val Gly Asp Ihr Ile Lys Glu Gin

95 100

TTT GTG TAT GTT TTC GGCGGT GGG ACC AAG GTC ACT GTC CTA GGT 405

Phe Val Tyr Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Thr Val Leu Gly

105 no 115

CAG CCC 411 Gin Pro (2) INFORMACE O SEQ I.Č. : 66:

(i) CHARAKTERISTIKY SEKVENCE :

(A) DÉLKA : 405 párů baží (B) TYP : nukleová kyselina (C) POČET ŘETĚZCŮ : dva (D) TOPOLOGIE : lineární (ii) TYP MOLEKULY : cDNA na mRNA (xi) POPIS SEKVENCE : SEQ. I. Č. : 66:

ATG GCC TGG ACT CCT CTC TTC TTC TTC TTT GTT CTT GAT TGC TCA 45

Met Ala Trp Thr Pro Leu Phe Phe Phe Phe Val Leu His Cys Ser

-15 -10 -5

GGÍ TCT TTC TCC CAG CH GTG CTG ACT CAA TCG CCC TCT GCC TCT 90

Gly Ser Phe Ser Gin Leu Val Leu Thr Gin Ser Pro Ser Ala Ser

5 10

GCC TCC CTG GGA GCC TCG GTC AAG CTC ACC TGC ACC TTG AGT AGT 135

Ala Ser Leu Gly Ala Ser Val Lys Leu Thr Cys Thr Leu Ser Ser

20 25

CAG CAC AGT ACG TAC ACC ATT GAA TGG CAT CAG CAG CAG CCA GAG 180

Gin His Ser Thr Tyr Thr Ile Glu Trp His Gin Gin Gin Pro Glu

35 40

AAG GGC CCT CGG TAC TTG ATG AAA CTT AAG CAA GAT GGA AGC CAC 225

Lys Gly Pro Arg Tyr Leu Met Lys Leu Lys Gin Asp Gly Ser His

50 55

AGC ACA GGT GAT GGG ATT CCT GAT CGC TTC TCA GGC TCC AGC TCT 270

Ser Thr Gly Asp Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Ser Ser

65 70

GGG GCT GAG CGC TAC CTC ACC ATC TCC AGC CTC CAG TCT GAG GAT 315

Gly Ala Glu Arg Tyr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gin Ser Glu Asp

80 85

GAG* GCT GAC TAT TAC TGT GGT GTG GGT GAT ACA ATT AAG GAA CAA 360

Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gly Val Gly Asp Thr Ile Lys Glu Gin

95 100 • Mt *

4 4 » 4 4

I 4 · • 4 ·

4 τπ GTG TAC GTG TTC GGC GGA GGG ACC AAA CTG ACC CTC CTA GCT 405 Phe Val Tyr Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly

105 Π0 H5 (2) INFORMACE O SEQ I.Č. : 67:

(i) CHARAKTERISTIKY SEKVENCE :

(A) DÉLKA : 411 párů baží (B) TYP : nukleová kyselina (C) POČET ŘETĚZCŮ : dva (D) TOPOLOGIE : lineární (ii) TYP MOLEKULY : cDNA na mRNA (xi) POPIS SEKVENCE : SEQ. I. Č. : 67:

ATG GCC TGG ACT CCT CTC TTC TTC TTC TCT GTT CCT CAT TGC TCA 45

Met Ala Trp Thr Pro Leu Phe Phe Phe Phe Val Leu His Cys Ser

-15 -10 -5

GGT TCT TTC TCC CAG CH GTG CTG ACT CAA TCG CCC TCT GCC TCT 90

Gly Ser Phe Ser Gin Leu Val Leu Thr Gin Ser Pro Ser Ala Ser

5 10

GCC TCC CTG GGA GCC TCG GTC AAG CTC ACC TGC ACC CTG AGT AGT 135

Ala Ser Leu Gly Ala Ser Val Lys Leu Thr Cys Thr Leu Ser Ser

20 25

CAG CAC AGT ACG TAC ACC ACT GAA TGG TAT CAG CAG CAG CCA GAG 180

Gin His Ser Thr Tyr Thr Ile Glu Trp Tyr Gin Gin Gin Pro Glu

35 40

AAG GGC CCT AAG TAC CTG ATG GAT CTT AAG CAA GAT GGA AGC CAC 225

Lys Gly Pro Lys Tyr Leu Met Asp Leu Lys Gin Asp Gly Ser His

50 55

AGC ACA GCT GAT GGG ATT CCT GAT CGC CTC TCA GGC TCC AGC TCT 270 Ser Thr Gly Asp Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Ser Ser

65 70

GGG GCT GAG CGC TAC CTC ACC ATC TCC AGC CTC CAG TCT GAG GAT 315 Gly Ala Glu Arg Tyr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gin Ser Glu Asp

80 85

GAG GCT GAC TAT TAC TCT GCT CTG GGT GAT ACA ATT AAG GAA CAA 360 Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gly Val Gly Asp Thr Ile Lys Glu Gin

95 100

TCT CTG TAC CTG CTC GGC GGA GGG ACC AAA CTG ACC CTC CTA GGC 405 Phe Val Tyr Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly

105 110 115

CAG CCC 411 Gin Pro

·· ·· • · · · • · · · ··· »«· * · ·· ·« (2) INFORMACE Ο SEQ I.Č. : 68:

(i) CHARAKTERISTIKY SEKVENCE :

(A) DÉLKA : 411 párů baží (B) TYP : nukleová kyselina (C) POČET ŘETĚZCŮ : dva (D) TOPOLOGIE : lineární (ii) TYP MOLEKULY : cDNA na mRNA (xi) POPIS SEKVENCE : SEQ. I. Č. : 68:

ATG GCC TGG ACT CCT CTC TTC TTC TTC TTT GTT CTT CAT TGC TCA 45 Met Ala Trp Thr Pro Leu Phe Phe Phe Phe Val Leu His Cys Ser

-15 -10 -5

GGT TCT TTC TCC CAG CTT GTG CTG ACT CAA TCG CCC TCT GCC TCT 90

Gly Ser Phe Ser Gin Leu Val Leu Thr Gin Ser Pro Ser Ala Ser

5 10

GCC TCC CTG GGA GCC TCG GTC AAG CTC ACC TGC ACC TTG ACT ACT 135

Ala Ser Leu Gly Ala Ser Val Lys Leu Thr Cys Thr Leu Ser Ser

20 25

CAG CAC AGT ACG TAC ACC ATT GAA TGG TAT CAG CAG GAG CCA GAG 180

Gin His Ser Thr Tyr Thr Ile Glu Trp Tyr Gin Gin Gin Pro Glu

35 40

AAG GGC CCT AAG TAC GTG ATG GAT CTT AAG CAA GAT GGA AGC CAC 225

Lys Gly Pro Lys Tyr Val Met Asp Leu Lys Gin Asp Gly Ser His

50 55

AGC ACA GGT GAT GGG ATT CCT GAT CGC TTC TCA GGC TCC AGC TCT 270

Ser Thr Gly Asp Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Ser Ser

65 70

GGG GCT GAG CGC TAC CTC ACC ATC TCC AGC CTC CAG TCT GAG GAT 315

Gly Ala Glu Arg Tyr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gin Ser Glu Asp

80 85

GAG GCT GAC TAT TAC TGT GGT GTG GCT GAT ACA ATT AAG GAA CAA 360

Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gly Val Gly Asp Thr Ile Lys Glu Gin

95 100

TTT CTG TAC GTG TTC GGC GGA GGG ACC AAA CTG ACC GTC CTA GGC 405

Phé Val Tyr Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly

105 110 115

411

CAG CCC Gin Pro ·♦·· • 9 • 9 »

» ·· (2) INFORMACE O SEQ I.Č. : 69:

(i) CHARAKTERISTIKY SEKVENCE :

(A) DÉLKA : 411 párů baží (B) TYP : nukleová kyselina (C) POČET ŘETĚZCŮ : dva (D) TOPOLOGIE : lineární (ii) TYP MOLEKULY : cDNA na mRNA (xi) POPIS SEKVENCE : SEQ. I. Č. : 69:

ATG GCC TGG ACT CCT CTC TTC TTC TTC TTT GTT CTT CAT TGC TCA 45

Met Ala Trp Thr Pro Leu Phe Phe Phe Phe Val Leu His Cys Ser

-15 -10 -5

GGT TCT TTC TCC CAG CTT GTG CTG ACT CAA TCG CCC TCT GCC TCT 90

Gly Ser Phe Ser Gin Leu Val Leu Thr Gin Ser Pro Ser Ala Ser

5 10

GCC TCC CTG GGA GCC TCG GTC AAG CTC ACC TGC ACC TTG AGT AGT 135

Ala Ser Leu Gly Ala Ser Val Lys Leu Thr Cys Thr Leu Ser Ser

20 25

CAG CAC AGT ACG TAC ACC ATT GAA TGG TAT CAG CAG CAG CCA GAG 180

Gin His Ser Thr Tyr Thr Ile Glu Trp Tyr Gin Gin Gin Pro Glu

35 40

AAG GGC CCT AGG TAC CTG ATG GAT CTT AAG CAA GAT GGA AGC CAC 225

Lys Gly Pro Arg Tyr Leu Met Asp Leu Lys Gin Asp Gly Ser His

50 55

AGC ACA GGT GAT GGG ATT CCT GAT CGC TTC TCA GGC TCC AGC TCT 270

Ser Thr Gly Asp Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Ser Ser

65 70

GGG GCT GAG CGC TAC CTC ACC ATC TCC AGC CTC CAG TCT GAG GAT 315

Gly Ala Glu Arg Tyr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gin Ser Glu Asp

80 85

GAG GCT GAC TAT TAC TGT GGT GTG GGT GAT ACA ATT AAG GAA CAA 360

Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gly Val Gly Asp Thr Ile Lys Glu Gin

95 100

TTT GTG TAC GTG TTC GGC GGA GGG ACC AAA CTG ACC GTC CTA GGC 405

Phe Val Tyr Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly

105 110 115

CAG CCC 411 Gin Pro (2) INFORMACE O SEQ I.Č. : 70:

9999 • · ·

99

9 9 9

9 9 9

999 999

9

99 (1) CHARAKTERISTIKY SEKVENCE :

(A) DÉLKA : 411 párů baží (B) TYP : nukleová kyselina (C) POČET ŘETĚZCŮ : dva (D) TOPOLOGIE : lineární (ii) TYP MOLEKULY : cDNA na mRNA (xi) POPIS SEKVENCE : SEQ. I. Č. : 70:

ATG GCC TGG ACT CCT CTC TTC TTC TTC ITT GTT CTT CAT TGC TCA 45

Met Ala Trp Thr Pro Leu Phe Phe Phe Phe Val Leu His Cys Ser

-15 -10 -5

GGT TCT TTC TCO CAG CTT GTG CTG ACT CAA TCG CCC TCT GCC TCT 90

Gly Ser Phe Ser Gin Leu Val Leu Thr Gin Ser Pro Ser Ala Ser

5 10

GCC TCC CTG GGA GCC TCG GTC AAG CTC ACC TGC ACC ITG AGT AGT 135

Ala Ser Leu Gly Ala Ser Val Lys Leu Thr Cys Thr Leu Ser Ser

20 25

CAG CAC AGT ACG TAC ACC ATT GAA TGG TAT CAG CAG CAG CCA GAG 180 Gin His Ser Thr Tyr Thr Ile Glu Trp Tyr Gin Gin Gin Pro Glu

35 40

AAG GGC CCT AGG TAC GTG ATG GAT CTT AAG CAA GAT GGA AGC CAC 225

Lys Gly Pro Arg Tyr Val Met Asp Leu Lys Gin Asp Gly Ser His

50 55

AGC ACA GGT GAT GGG ATT CCT GAT CGC TTC TCA GGC TCC AGC TCT 270

Ser Thr Gly Asp Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Ser Ser

65 70

GGG GCT GAG CGC TAC CTC ACC ATC TCC AGC CTC CAG TCT GAG GAT 315

Gly Ala Glu Arg Tyr Leu Thr I le Ser Ser Leu Gin Ser Glu Asp

80 85

GAG GCT GAC TAT TAC TGT GGT GTG GGT GAT ACA ATT AAG GAA CAA 360

Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gly Val Gly Asp Thr Ile Lys Glu Gin

95 100

ΤΤΓ GTG TAC GTG TTC GGC GGA GGG ACC AAA CTG ACC GTC CTA GGC 405

Phe Val Tyr Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly

105 110 115

CAG CCC 411 Gin Pro (2) INFORMACE O SEQ I.Č. : 71:

(i) CHARAKTERISTIKY SEKVENCE :

·«··

999

100

9 • 9 9 · 9 · 9 • 9 · 9 9 9 9 · • · 9 9 9 9 • · · 999999 • · 9 9

999 9999 99 99 (A) DÉLKA :411 párů baží (B) TYP : nukleová kyselina (C) POČET ŘETĚZCŮ : dva (D) TOPOLOGIE : lineami (ii) TYP MOLEKULY : cDNA na mRNA (xi) POPIS SEKVENCE : SEQ. I. Č. : 71:

ATG GCC TGG ACT CCT CTC TTC TTC TTC TTT GTT CTT CAT TGC TCA 45 Met Ala Trp Thr Pro Leu Phe Phe Phe Phe Val Leu His Cys Ser

-15 -10 -5

GGT TCT HC TCC CAG CTT GTG CTG ACT CAA TCG CCC TCT GCC TCT 90

Gly Ser Phe Ser Gin Leu Val Leu Thr Gin Ser Pro Ser Ala Ser

5 10

GCC TCC CTG GGA GCC TCG GTC AAG CTC ACC TGC ACC TTG AGT AGT 135

Ala Ser Leu Gly Ala Ser Val Lys Leu Thr Cys Thr Leu Ser Ser

20 25

CAG CAC AGT ACG TAC ACC ATT GAA TGG TAT CAG CAG CAG CCA GAG 180

Gin His Ser Thr Tyr Thr Ile Glu Trp Tyr Gin Gin Gin Pro Glu

35 40

AAG GGC CCT AAG TAC CTG ATG GAT CTT AAG CAA GAT GGA AGC CAC 225

Lys Gly Pro Lys Tyr Leu Met Asp Leu Lys Gin Asp Gly Ser His

50 55

AGC ACA GGT GAT GGG ATT CCT GAT CGC TTC TCA GGC TCC AGC TCT 270

Ser Thr Gly Asp Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Ser Ser

65 70

GGG GCT GAG CGC TAC CTC ACC ATC TCC AGC CTC CAG TCT GAG GAT 315

Gly Ala Glu Arg Tyr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gin Ser Glu Asp

80 85

GAG GCT GAC TAT ATC TGT GGT GTG GGT GAT ACA ATT AAG GAA CAA 360

Glu Ala Asp Tyr Ile Cys Gly Val Gly Asp Thr Ile Lys Glu Gin

95 100

ΤΊΤ GTG TAC GTG TTC GGC GGA GGG ACC AAA CTG ACC GTC CTA GGC 405

Phe Val Tyr Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly

105 110 115

CAG CCC 411 Gin Pro (2) INFORMACE O SEQ I.Č. : 72:

(i) CHARAKTERISTIKY SEKVENCE :

(A) DÉLKA : 41 1 párů baží (B) TYP : nukleová kyselina ··· ·

101 (C) POČET ŘETĚZCŮ : dva (D) TOPOLOGIE : lineární (ii) TYP MOLEKULY : cDNA na mRNA (xi) POPIS SEKVENCE : SEQ. I. Č. : 72:

ATG GCC TGG ACT CCT CTC TTC TTC TTC TTT GTT CTT CAT TGC TCA 45

Met Ala Trp Thr Pro Leu Phe Phe Phe Phe Val Leu His Cys Ser

-15 -10 -5

GGT TCT TTC TCC CAG CTT GTG CTG ACT CAA TCG CCC TCT GCC TCT 90

Gly Ser Phe Ser Gin Leu Val Leu Thr Gin Ser Pro Ser Ala Ser

5 10

GCC TCC CTG GGA GCC TCG GTC AAG CTC ACC TGC ACC TTG AGT AGT 135

Ala Ser Leu Gly Ala Ser Val Lys Leu Thr Cys Thr Leu Ser Ser

20 25

CAG CAC AGT ACG TAC ACC ATT GAA TGG TAT CAG CAG CAG CCA GAG 180

Gin His Ser Thr Tyr Thr He Glu Trp Tyr Gin Gin Gin Pro Glu

35 40

AAG GGC CCT AGG TAC CTG ATG GAT CIT AAG CAA GAT GGA AGC CAC 225

Lys Gly Pro Arg Tyr Leu Met Asp Leu Lys Gin Asp Gly Ser His

50 55

AGC ACA GGT GAT GGG ATT CCT GAT CGC TTC TCA GGC TCC AGC TCT 270

Ser Thr Gly Asp Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Ser Ser

65 70

GGG GCT GAG CGC TAC CTC ACC ATC TCC AGC CTC CAG TCT GAG GAT 315

Gly Ala Glu Arg Tyr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gin Ser Glu Asp

80 85

GAG GCT GAC TAT ATC TGT GGT GTG GGT GAT ACA ATT AAG GAA CAA 360

Glu Ala Asp Tyr Ile Cys Gly Val Gly Asp Thr Ile Lys Glu Gin

95 100

ITT GTG TAC GTG TTC GGC GGA GGG ACC ΑΛΛ CTG ACC GTC CTA GGC 405

Phe Val Tyr Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly

105 110 115

CAG CCC 411 Gin Pro (2) INFORMACE O SEQ I.Č. : 73:

(i) CHARAKTERISTIKY SEKVENCE :

(A) DÉLKA : 411 párů baží (B) TYP : nukleová kyselina (C) POČET ŘETĚZCŮ : dva (D) TOPOLOGIE : lineární

102 • •«9 • ·· ·· ·· ·· • · ♦ · · ♦ • · · · · • * ·· · ··« • · · ···· «» (ii) TYP MOLEKULY : cDNA na mRNA (xi) POPIS SEKVENCE : SEQ. I. Č. : 73:

ATG GCC TGG ACT CCT CTC TTC TTC TTC TTT GTT CTT CAT TGC TCA 45

Met Ala Trp Thr Pro Leu Phe Phe Phe Phe Val Leu His Cys Ser

-15 -10 -5

GGT TCT TTC TCC CAG CTT GTG CTG ACT CAA TCG CCC TCT GCC TCT 90

Gly Ser Phe Ser Gin Leu Val Leu Thr Gin Ser Pro Ser Ala Ser

5 10

GCC TCC CTG GGA GCC TCG GTC AAG CTC ACC TGC ACC TTG AGT AGT 135

Ala Ser Leu Gly Ala Ser Val Lys Leu Thr Cys Thr Leu Ser Ser

20 25

CAG CAC AGT ACG TAC ACC ATT GAA TGG TAT CAG CAG CAG CCA GAG 180

Gin His Ser Thr Tyr Thr Ile Glu Trp Tyr Gin Gin Gin Pro Glu

35 40

AAG GGC CCT AAG TAC GTG ATG GAT CIT AAG CAA GAT GGA AGC CAC 225

Lys Gly Pro Lys Tyr Val Met Asp Leu Lys Gin Asp Gly Ser His

50 55

AGC AGA GGT GAT GGG ATT CCT GAT CGC TTC TCA GGC TCC AGC TCT 270

Ser Thr Gly Asp Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Ser Ser

65 70

GGG GCT GAG CGC TAC CTC ACC ATC TCC AGC CTC CAG TCT GAG GAT 315

Gly Ala Glu Arg Tyr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gin Ser Glu Asp

80 85

GAG GCT GAC TAT ATC TGT GGT GTG GGT GAT ACA ATT AAG GAA CAA 360

Glu Ala Asp Tyr Ile Cys Gly Val Gly Asp Thr Ile Lys Glu Gin .95 100

TTT GTG TAC GTG TTC GGC GGA GGG ACC AAA CTG ACC GTC CTA GGC 405

Phe Val Tyr Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly

105 110 115

CAG CCC 411 Gin Pro (2) INFORMACE O SEQ I.Č. : 74:

(i) CHARAKTERISTIKY SEKVENCE :

(A) DÉLKA : 411 párů baží (B) TYP : nukleová kyselina (C) POČET ŘETĚZCŮ : dva (D) TOPOLOGIE : lineární (ii) TYP MOLEKULY : cDNA na mRNA

BBBB

BBB <

B BBB

BBB · · · · · • * · Β · · * * · Β ΒΒΒΒΒΒ ♦ · · Β (xi) POPIS SEKVENCE : SEQ. I. Č. : 74:

ATG GCC TGG ACT CCT CTC TTC TTC TTC TTT GTT CTT CAT TGC TCA 45

Met Ala Trp Thr Pro Leu Phe Phe Phe Phe Val Leu His Cys Ser

-15 -10 -5

GGT TCT TTC TCC CAG CIT GTG CTG ACT CM TCG CCC TCT GCC TCT 90

Gly Ser Phe Ser Gin Leu Val Leu Thr Gin Ser Pro Ser Ala Ser

5 10

GCC TCC CTG GGA GCC TCG GTC AAG CTC ACC TGC ACC TTG AGT AGT 135

Ala Ser Leu Gly Ala Ser Val Lys Leu Thr Cys Thr Leu Ser Ser

20 25

CAG CAC AGT ACG TAC ACC ATT GM TGG TAT CAG CAG CAG CCA GAG 180

Gin His Ser Thr Tyr Thr Ile Glu Trp Tyr Gin Gin Gin Pro Glu

35 40

AAG GGC CCT AGG TAC CTG ATG GAT CTI' AAG CM GAT GGA AGC CAC 225

Lys Gly Pro Arg Tyr Val Met Asp Leu Lys Gin Asp Gly Ser His

50 55

AGC ACA GCT GAT GGG ATT CCT GAT CGC TTC TCA GGC TCC AGC TCT 270 Ser Thr Gly Asp Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Ser Ser . 65 70

GGG GCT GAG CGC TAC CTC ACC ATC TCC AGC CTC CAG TCT GAG GAT 315

Gly Ala Glu Arg Tyr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gin Ser Glu Asp

80 85

GAG GCT GAC TAT ATC TCT GCT GTG GCT GAT ACA ATT MG GM CM 360

Glu Ala Asp Tyr Ile Cys Gly Val Gly Asp Thr Ile Lys Glu Gin

95 100

TTT GTG TAC GTG TTC GGC GGA GGG ACC AAA CTG ACC GTC CTA GGC 405

Phe Val Tyr Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly

105 110 115

CAG CCC 411 Gin Pro (2) INFORMACE O SEQ I.Č. : 75:

(i) CHARAKTERISTIKY SEKVENCE :

(A) DÉLKA : 34 aminokyselin (B) TYP : aminokyselina (D) TOPOLOGIE : lineární (ii) TYP MOLEKULY : peptid (xi) POPIS SEKVENCE : SEQ. I. Č. : 75:

Ala Val Sér Glu His Gin Leu Leu His Asp Lys Gly Lys Ser Ile 15 10 15

Gin Asp Leu Arg Arg Arg Phe Phe Leu His His Leu Ile Ala Glu 20 25 30

Ile His Thr Ala

Claims (8)

1. PATENTOVÉ NÁROKY

   1. Léčivo pro kachexii, vyznačující se tím, že jako aktivní složku obsahuje látku, schopnou inhibice vazby mezi parathormonu příbuzným proteinem (PTHrP) a jeho receptorem.
2. 2. Léčivo pro kachexii podle nároku 1, vyznačující se tím, že touto látkou je nějaký antagonista proti PTHrP.
3. 3. Léčivo pro kachexii podle nároku 1, vyznačující se tím, že touto látkou je protilátka proti PTHrP.
4. 4. Léčivo pro kachexii podle nároku 1, vyznačující se tím, že touto látkou je nějaký fragment protilátky proti PTHrP a/nebo nějaký její modifikovaný fragment.
5. 5. Léčivo pro kachexii podle nároků 3a 4, vyznačující se tím, že touto protilátkou je nějaká humanizovaná nebo chimerní protilátka.
6. 6. Léčivo pro kachexii podle nároku 5, vyznačující se tím, že touto humanizovanou protilátkou je humanizovaná protilátka #23-57-1 37 -1.
7. 7. Léčivo pro kachexii podle nároků 3a 4, vyznačující se tím, že tato protilátka je monoklonálního typu.
8. 8. Léčivo pro kachexii podle kteréhokoliv z nároků 1 až 7, vyznačující se tím, že tato kachexia je kachexie indukovaná rakovinou.