SK155799A3

SK155799A3 - Cachexia remedy

Info

Publication number: SK155799A3
Application number: SK1557-99A
Authority: SK
Inventors: Koh Sato; Toshiaki Tsunenari; Kimie Ishii
Original assignee: Chugai Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 1997-05-15
Filing date: 1998-05-13
Publication date: 2000-06-12
Also published as: WO1998051329A1; TR199902800T2; ES2285769T3; EP1004313A1; EP1004313A4; ATE361099T1; US7468184B2; UA74130C2; PL193575B1; DE69837707D1; PL336797A1; AU750021C; CN1255858A; BR9809629A; EP1004313B1; AU7236998A; US20020165363A1; CN1329080C; KR100508338B1; TWI227140B

Description

Oblasť techniky

Predkladaný vynález sa týka liečiva na kachexiu, ktoré obsahuje ako aktívnu zložku látku, schopnú inhibície väzby medzi parathormónu príbuzným proteínom (PTHrP) a jeho receptorom.

Doterajší stav techniky

Kachexia, ku ktorej dochádza u pacientov v terminálnom štádiu rakoviny, je jedným z bežných, zhubných, paraneoplastických syndrómov a je charakterizovaná systemickými poruchami, ktoré majú ako hlavné príznaky anorexiu, stratu hmotnosti, anémiu, elektrolytickú nerovnováhu a zhoršené imunitné funkcie. Vývoj kachexie u pacientov, ktorí trpia rakovinou, vedie k smrteľným a terminálnym príznakom; zhoršuje kvalitu života (QOL) pacientov; a má silný psychologický, fyzický a sociálny dopad na pacientov a ich rodiny a ľudí v ich okolí.

Nedávno sa zistilo, že kachektín, ktorý sa považuje za činidlo, ktoré vyvoláva kachexiu pri rakovine, je identický s faktorom nekrotizujúcim nádory (TNF). Potom sa zistilo, že tiež cytokíny (napríklad interleukín (IL)-l, IL-6, LIF, IFN) pôsobia rovnako ako kachektín a teda, že kachexia je indukovaná spoločným pôsobením viacerých faktorov.

Je známe, že bunková línia OCC-1, odvodená z ľudského karcinómu ústnej dutiny, produkuje rôzne typy tekutých faktorov, zahrnutých v kachexii pri rakovine. U nahej myši s implantovanými bunkami OCC-1 dochádza k vývoju rôznych syndrómov vrátane kachexie (Kajimura N. a kol., Cancer Chemother. Pharmacol., 1996, 38. dodatok, str. 48-52; Tanaka R. a kol., Jpn. J. Clin. Oncology, apríl 1996, 26(2), str. 8894). Predpokladá sa, že k tomu dochádza, pretože bunková línia OCC-1, implantovaná nahej myši, produkuje s rastom týchto buniek rôzne cytokíny (napríklad G-CSF, IL-6, LIF, IL-11,

PTHrP) a tieto faktory pôsobia v nahej spôsobujú takéto príznaky.

myši spoločne a

Príznaky, ktoré sa nachádzajú u nahej myši s implantovanou bunkovou líniou OCC-1, sa zdajú byť veľmi podobné tým, ktoré sa objavujú u ľudských pacientov v terminálnom štádiu rakoviny. Zatiaľ však nebol žiadny článok, ktorý sa týka liekov alebo liečiv na kachexiu.

Podstata vynálezu

Predmetom predkladaného vynálezu je poskytnutie liečiva na kachexiu, ktoré obsahuje ako aktívnu zložku látku, schopnú inhibície väzby medzi parathormónu príbuzným proteínom (PTHrP) a jeho receptorom.

Predkladatelia uskutočnili rozsiahle a intenzívne štúdie s cieľom objavenia takého liečiva. Ako výsledok zistili, že tento predmet sa môže dosiahnuť vyvinutím látky, ktorá môže inhibovať väzbu medzi PTHrP a jeho receptorom. Toto zistenie vedie k vytvoreniu tohto vynálezu.

T. j., predkladaný vynález sa týka liečiva na kachexiu, ktoré obsahuje ako aktívnu zložku látku, schopnú inhibície väzby medzi PTHrP a jeho receptorom.

V predkladanom vynáleze zahŕňa termín ktoré sú indukované rakovinou.

kachexie tie,

Predkladaný vynález sa týka liečiva na kachexiu, ktoré obsahuje ako aktívnu zložku látku, schopnú inhibície väzby medzi parathormónu príbuzným proteínom (ďalej označovaným ako PTHrP) a jeho receptorom (ďalej označovaným ako receptor PTHrP). Keď je tu použitý, označuje termín receptor PTHrP akýkoľvek receptor, ktorý viaže PTHrP (ako tie, ktoré sú opísané v Japanese National Phase Laid-open Publication No. 65065598), bez ohľadu na to, či je tento receptor PTHrP prítomný v cieľovom orgáne (napríklad kosť, oblička) alebo nie.

Keď je tu použitý, označuje termín látka schopná inhibície väzby medzi PTHrP a jeho receptorom (receptorom

J-v ϋ-,ΐ ' v »

PTHrP) akúkoľvek látku, ktorá sa môže viazač na PTHrP, aby bránila väzbe PTHrP na jeho receptor, ako napríklad protilátka proti PTHrP; akúkoľvek látku, ktorá sa môže viazač na receptor PTHrP, aby bránila väzbe receptoru PTHrP na PTHrP, ako napríklad nejaký antagonista proti receptoru PTHrP (antagonista PTHrP), konkrétne nejaký peptid, ktorý má substitúciu alebo deléciu aspoň jedného aminokyselinového zvyšku v peptide PTHrP alebo čiastočnej sekvencii peptidu PTHrP; alebo ich kombináciu.

Medzi akéhokoľvek protilátka, protilátka 228089) a protilátky proti PTHrP patria protilátky známeho typu, ako napríklad humanizovaná ľudská protilátka (WO 96/33735) alebo chimérna (Japanese Patent Application Laid-open No. 4protilátka použitá ako príklad v predkladanom vynáleze (protilátka #23-57-137-1) . Táto protilátka môže byč monoklonáIného alebo polyklonálneho typu, ale prednostne monoklonáIného typu. Medzi antagonisty PTHrP patria polypeptidy s nízkou molekulovou hmotnosčou. Medzi antagonisty PTHrP patria látky, ktoré sa viažu na receptor PTHrP antagonistickým spôsobom proti PTHrP, ako napríklad nejaký polypeptid s PTHrP antagonistickou aktivitou, ako je opísané v Japanese Patent Application Laid open No. 7-166790; Peptides (USA), 1995, 16 (6), 1031-1037; Biochemistry (USA) 28. apríla

1992, 31 (16) 4026-4033; a Japanese National Phase Laid-open

Publication No. 5-509098. Tieto polypeptidy môžu mač deléciu, substitúciu alebo inzerciu aspoň jedného aminokyseli-nového zvyšku, pokiaľ môžu vykazovač zodpovedajúcu úroveň PTHrP antagonistickej aktivity, a sú tiež zahrnuté v antagonistoch PTHrP predkladaného vynálezu.

Ďalej bude predkladaný vynález opísaný v detailných príkladoch, s použitím protilátky proti PTHrP, ako látky schopnej inhibície väzby medzi PTHrP a receptorom PTHrP.

1. Protilátka proti PTHrP

Protilátkou proti PTHrP, použitou v predkladanom vynáleze, môže byč ktorákoľvek protilátka, pokiaľ vykazuje liečebný účinok pri kachexii, bez ohľadu na jej zdroj, typ (monoklonálny alebo polyklonálny) a štruktúru.

Protilátka proti PTHrP, použitá v predkladanom vynáleze, sa môže vytvoriť ktoroukoľvek známou metódou, ako polyklonálna alebo monoklonálna protilátka.

Prednostne je protilátkou proti PTHrP protilátka odvodená z nejakého cicavca.

z cicavca zahŕňajú tie, ktoré sú protilátky hybridómom a inžinierstva, vektorom nesúcim gén pre protilátku.

monoklonálna

Monoklonálne produkované tie, ktoré sú vytvorené technikou génového z hostiteľskej bunky, transformovanej expresným

Protilátkou, použitou v predkladanom vynáleze, je taká protilátka, ktorá sa môže viazač na PTHrP a tým brániť väzbe PTHrP na receptor PTH/PTHrP, teda blokovať signálnu trandukciu PTHrP a následne inhibovať biologickú aktivitu PTHrP.

Konkrétnym príkladom takej protilátky je protilátka #2357-137-1, ktorá sa môže produkovač hydridómovým klonom #23-57137-1.

Hybridómový kloň #23-57-137-1 bol označený ako hybridom myš-myš #23-57-137-1 a bol uložený podľa Budapeštianskej dohody, 15. augusta 1996 v National Inštitúte of Bioacience and Human-technology, Agency of Industrial Science and Technology, Japonsko (1-3, Higashi 1-chome, Tsakuba-shi, Ibaraki, Japonsko) pod prístupovým číslom FERM BP-5631.

2. Protilátku produkujúci hybridom

Monoklonálnu protilátku produkujúci hybridom môže byť v zásade vytvorený akoukoľvek známou technikou. T.j., PTHrP je použitý ako antigén na imunizáciu podľa nejakej bežnej imunizačnéj metódy. Výsledné imunocyty sú fúzované so známymi rodičovskými bunkami pomocou bežných metód bunkovej fúzie a monoklonálne protilátky produkujúce bunky sú z fúzovaných buniek vybrané pomocou bežných prehľadávacích metód.

Konkrétnejšie, monoklonálne protilátky produkujúce bunky sa môžu pripraviť nasledovne.

Po prvé, ľudský PTHrP, ktorý je použitý ako antigén na tvorbu protilátky, je pripravený expresiou génu PTHrP; aminokyselinová sekvencia je opísaná v Suva, L. J. a kol., Science (1987) 237, 893. T.j., aminokyselinová sekvencia, kódujúca PTHrP, je inzerovaná do ktoréhokoľvek známeho expresného vektora a týmto expresným vektorom je transformovaná vhodná hostiteľská bunka. Proteín PTHrP je potom izolovaný a purifikovaný z transformovaných hostiteľských buniek alebo z kultivačného supernatantu transformovaných hostiteľských buniek ktoroukoľvek známou metódou.

Po druhé, purifikovaný proteín PTHrP je použitý ako antigén. Alternatívne sa môže ako antigén použiť 34aminokyselinový peptid N-terminálnej časti PTHrP, ktorý sa môže syntetizovať chemicky.

Cicavčí druh, ktorý bude týmto antigénom imunizovaný, nie je konkrétne obmedzený. Pri výbere tohto cicavca sa však prednostne berie do úvahy kompatibilita s rodičovskou bunkou, použitou k fúzii. Vo všeobecnosti sa môže použiť hlodavec (napríklad myš, krysa, škrečok, králik) alebo opica.

Imunizácia cicavca týmto antigénom sa môže uskutočniť podľa ktorejkoľvek známej metódy, napríklad injikovaním tohto antigénu cicavcovi intrapcritoneálne alebo subkutánne. Konkrétnejšie, tento antigén je zriedený a riadne rozpustený vo fosfátom pufrovanom roztoku NaCl (PBS) alebo normálnom roztoku NaCl. Výsledná suspenzia sa potom zmieša s vhodným množstvom adjuvans (napríklad Freundovo kompletné adjuvans), aby vznikla emulzia. Táto emulzia sa cicavcovi injikuje niekoľkokrát v intervaloch 4 až 21 dní. Pri imunizácii môže byú antigén viazaný na vhodný nosič.

Po imuzizácii sa kontroluje množstvo protilátok v sére. Keď sa potvrdí, že toto množstvo dosiahlo požadovanú výšku, izolujú sa z tohto cicavca imunocyty a tie sa potom podrobia bunkovej fúzii. Uprednostňovaným imunocytom je bunka sleziny.

Rodičovskou bunkou, použitou na bunkovú fúziu (t. j. náprotivkom bunkovej fúzie s imunocytom), je myelomová bunka odvodená z cicavca. Myelomová bunka je z ktorejkoľvek známej bunkovej línie a napríklad P3 (P3x63Ag8.653) (J. Immunol. (1979) 123, 1548-1550), P3x63Ag8U.l (Current Topics in Microbiology and Immunology (1978) 81, 1-7), NS-1 (Kohler G. a Milstein C., Eur. J. Immunol. (1976) 6, 551-549), MPC-11 (Margulies D. H. a kol., Celí (1976) 8, 405-415), SP2/0 (Shulman M. a kol., Náture (1978), 276, 269-270), FO (de °

Groth S. F. a kol., J. Immumol. Methods (1980) 35, 1-21), S194 (Trowbridge I. S., J. Exp. Med. (1978) 148, 313-323) alebo

R210 (Galfre G. a kol., Náture (1979) 277, 131-133).

Bunková fúzia imunocytu s myelomovou bunkou sa v zásade uskutoční podľa ktorejkoľvek známej metódy. Prednostne sa môže použiť napríklad metóda Milsteina a kol. (Kohler G. a Milstein C., Methods Enzymol. (1981) 73, 3-46).

Konkrétnejšie, bunková fúzia sa môže uskutočniť napríklad v bežnom živnom médiu v prítomnosti látky, ktorá uľahčuje bunkovú fúziu. Látkou, ktorá uľahčuje bunkovú fúziu, môže byť polyetylénglykol (PEG) alebo Sendai vírus (hemaglutinačný vírus z Japonska, HVJ) . Ak sa to požaduje, môže sa s cieľom zlepšenia účinnosti pridať tiež nejaká prísada, ako napríklad dimetylsulfoxid.

Pomer medzi imunocytmi a myelomovými bunkami na bunkovú fúziu môže byť akýkoľvek. Napríklad, imunocyty sú použité v 1 až 10 krát vyššom množstve ako myelomové bunky. Kultivačným médiom, použitým na bunkovú fúziu, je napríklad RPMI 1640 médium alebo MEM médium, vhodné pre rast línií myelomových bunkových línií, alebo iné médium, bežne používané na kultiváciu takýchto buniek. Ak sa to požaduje, môže sa do kultivačného média pridať sérový doplnok, ako napríklad fetálne teľacie sérum (FCS).

Bunková fúzia sa uskutoční dobrým premiešaním daných množstiev imunocytov a myelomových buniek v kultivačnom médiu, pridaním roztoku PEG (napríklad s priemernou molekulovou hmotnosťou: okolo 1000 až 6000) (ktorý sa predtým ohrial na asi 37 °C) , obvykle do 30 až 60 % koncentrácie (hmotn./obj .) , a potom premiešaním výsledného roztoku, čím vznikajú fúzované bunky (hybridómy). Následne sa ku kultivačnému roztoku pridá vhodné kultivačné médium a je centrifugovaný s cieľom odstránenia supernatantu. Tento postup sa niekoľkokrát opakuje s cieľom odstránenia látky, ktorá uľahčuje bunkovú fúziu a pod., ktorá je nežiadúca pre rast hybridómov v kultivačnom médiu.

Získané hybridómy sa môžu selektovať pomocou kultivácie v bežnom selektívnom médiu, ako je hypoxantín-aminopteríntymidínové (HAT) médium. Kultivácia hybridómov v HAT médiu sa uskutočňuje počas takého obdobia, ktoré je dostatočné na spôsobenie smrti iných buniek, ako sú požadované hybridómy (t.j. buniek, ktoré nefúzovali), obvykle počas niekoľkých dní až týždňov. Následne sa uskutoční bežná metóda limitujúceho riedenia, s ciel'om vyhľadania a klonovania hybridómov, ktoré sekretujú požadovanú protilátku.

Alternatívne sa môže lymfocytu PTHrP in vitro lymfocytu bunkovej fúzii s pomocou scitlivenia ľudského a potom podrobenia citlivého myelomovou bunkou, odvodenou z človeka (Japanese Patent Publication No. 1-59878), schopnou nekonečného rastu, pripraviť ľudská protilátka, ktorá má väzbovú aktivitu proti PTHrP. Alternatívne sa môže pripravil: protilátka proti PTHrP pomocou injikovania PTHrP, ako antigénu, do transgénneho živočícha, ktorý má celý repertoár ľudských génov pre protilátky, s cieľom vzniku buniek, ktoré produkujú protilátky proti PTHrP, a imortalizovaním týchto buniek, takže táto ľudská protilátka sa môže produkovať imortalizovanou bunkou (International Publication No. WO 94/25585, WO 93/12227, WO 93/03918 a WO 94/022602).

Monoklonálnu protilátku produkujúci hybridom, pripravený ako je opísané vyššie, sa môže subkultivovať v bežnom kultivačnom médiu a uložif v kvapalnom dusíku počas dlhého obdobia.

Na produkciu monoklonálnej protilátky hybridómom sa môže použiť metóda, ktorá zahŕňa kultiváciu hybridómu podľa nejakej bežnej metódy a zhromaždenie monoklonálnej protilátky z kultivačného supernatantu, alebo metóda, ktorá zahŕňa injikovanie hybridómu nejakému cicavcovi, kompatibilnému s hybridómom, s cieľom rastu hybridómu v tele cicavca, a zhromaždenie hybridómu z ascites tohto cicavca. Prvá metóda je vhodná na produkciu protilátky s vysokou čistotou, zatiaľ čo druhá metóda je vhodná na produkciu protilátky vo veľkom množstve.

3. Rekombinantná protilátka

V predkladanom vynáleze sa môže použiť monoklonálna protilátka rekombinantného typu, ktorá sa môže vytvoriť klonovaním protilátkového génu z hybridómu, začlenením tohto protilátkového génu do vhodného vektora, zavedením tohto vektora do hostiteľa a produkovaním tejto protilátky hostiteľom podľa nejakej bežnej genetickej rekombinačnej techniky (viď. napríklad Vandamme A. M. a kol., Eur. J. Biochem. (1990) 192, 767-775).

Konkrétnejšie, mRNA, kódujúca variabilnú (V) oblasť protilátky proti PTHrP, je izolovaná z hybridómu, ktorý produkuje túto protilátku proti PTHrP. Izolácia mRNA sa uskutoční prípravou totálnej RNA akoukoľvek známou metódou, ako je guanidiová ultracentrifugačná metóda (Chirgwin J. M. a kol., Biochemistry (1979) 18, 5294-5299) a AGPC metóda (Chomczynski P. a kol., Anál. Biochem. (1987) 162, 156-159), a potom získaním požadovanej mRNA z totálnej RNA s použitím mRNA Purification Kitu (Pharmacia) a pod. Alternatívne sa môže mRNA tiež pripraviť priamo, s použitím QuickPrep mRNA Purification Kitu (Pharmacia).

Ďalej sa z mRNA reverznou transkriptázou syntetizuje cDNA pre V-oblasť protilátky. Syntéza cDNA sa uskutoční s použitím AMV Reverse Transcriptase First-strand cDNA Synthesis Kitu (Seikagaku Corporation) a pod.

cDNA sa môže tiež syntetizovať alebo amplifikovať pomocou 5'-RAČE metódy (Frohman M. A. a kol., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1988) 85, 8998-9002; Belyavsky A. a kol., Nucleic Acids Res. (1989), 17, 2919-2932) s použitím 5'-Ampli FINDER RAČE Kitu (Clontech) v kombinácii s metódou PCR a pod.

Žiadaný DNA fragment sa izoluje a purifikuje z výsledného PCR produktu a potom sa ligu j e do vektorovej DNA za vzniku rekombinantného vektora. Rekombinantný vektor je zavedený do hostiteľa obsahuj e sekvencia potvrdená reťazca.

ako je E. požadovaný požadovanej coli, a selektuje sa rekombinantný vektor, kolónia, ktorá Nukleotidová

DNA v rekombinantnom vektore je napríklad metódou dideoxynukleotidovej terminácie

Keď sa DNA, kódujúca V-oblasť protilátky proti PTHrP získa, vloží sa do expresného vektora, ktorý obsahuje DNA, kódujúcu konštantnú (C) oblasť protilátky.

Na prípravu protilátky proti PTHrP, použitej v predkladanom vynáleze, sa protilátkový gén vloží do expresného vektora tak, že sa tento protilátkový gén môže exprimovať pod kontrolou oblastí riadiacich expresiu (napríklad enhancéru, promótora). Hostiteľská bunka sa transformuje expresným vektorom s cieľom expresie protilátky.

Pri expresii protilátkového génu sa môžu DNA, kódujúca ťažký (H) reťazec a DNA, kódujúca ľahký (L) reťazec protilátky, vložiť do samostatných expresných vektorov a potom sa hostiteľská bunka kotransformuje výslednými expresnými vektormi. Alternatívne sa môžu DNA, kódujúca H-reťazec a DNA, kódujúca L-reťazec protilátky, vložiť spoločne do jediného expresného vektora a potom sa hostiteľská bunka transformuje výsledným expresným vektorom (WO 94/11523).

Pri produkcii rekombinantnej protilátky sa môže ako hostiteľ použiť okrem vyššie uvedených hostiteľských buniek tiež transgénny živočích. Napríklad, protilátkový gén sa môže inzerovať do vopred určeného miesta v géne, kódujúceho proteín, ktorý sa prirodzene produkuje v mlieku cicavca (napríklad kozí β-kazeín) , aby vznikol fúzny proteín. DNA fragment, ktorý obsahuje fúzny gén s obsahom protilátkového génu, sa injikuje do embrya kozy a toto embryo sa zavedie do kozy. Koza, ktorá obsahuje toto embryo, porodí transgénnu kozu. Požadovaná protilátka je sekretovaná v mlieku transgénnej kozy alebo jej potomstva. S cieľom zvýšenia množstva mlieka, ktoré obsahuje protilátku, sa môže transgénnej koze podávať príslušný hormón (Ebert K. M. a kol., Bio/Technology (1994) 12, 699-702).

4. Modifikovaná protilátka

V predkladanom vynáleze sa môže, s cieľom zníženia heterogenicity voči ľudskému telu a pod., použiť umelo modifikovaná rekombinantná protilátka, vrátane chimérnej a humanizovanej protilátky. Tieto modifikované rekombinantné protilátky sa môžu pripraviť ktoroukoľvek známou metódou.

Chimérna protilátka, použiteľná v tomto vynáleze, sa môže pripraviť ligovaním DNA, kódujúcej V-oblasť protilátky, pripravená ako je uvedené vyššie, s DNA, kódujúcou C-oblasť ľudskej protilátky, vložením tohto ligačného produktu do expresného vektora a zavedením výsledného rekombinantného expresného vektora do hostiteľa, s cieľom produkcie chimérnej protilátky.

Humanizovaná protilátka sa tiež nazýva ako pretvarovaná ľudská protilátka, v ktorej sú komplementaritu určujúce úseky (CDR) protilátky cicavca, ktorým nie je človek (napríklad myš), prenesené na ľudskú protilátku. Všeobecný genetický rekombinačný postup na tvorbu takejto humanizovanej protilátky je tiež známy (EP 125023; WO 96/02576).

Konkrétne, je navrhnutá DNA sekvencia, v ktorej sú CDR myšie protilátky ligované cez úseky základnej štruktúry (FR) , a syntetizuje sa pomocou PCR metódy s použitím príslušných oligonukleotidov ako primárov, ktoré boli navrhnuté tak, aby mali úseky, ktoré presahujú terminálne úseky CDR a FR. Výsledná DNA je liqovaná s DNA, kódujúcou C-oblasť ľudskej protilátky, a ligačný produkt sa vloží do expresného vektora. Výsledný rekombinantný vektor sa zavedie do hostiteľa a tým sú produkované humanizované protilátky (EP 239044, WO 96/02576).

FR ligované cez CDR sú vybrané tak, že CDR môžu vytvárať postačujúce väzbové miesto pre antigén. Ak je to nutné, môže sa v FR V-oblasti protilátky nahradiť aminokyselina(y) tak, aby CDR pretvarovanéj ľudskej protilátky mohol vytvárať príslušné väzbové miesto pre antigén (Sato K. a kol., Cancer Res. (1993) 53, 851-856).

C-oblasťou chimérnej alebo humanizovanej protilátky môže byť ktorákoľvek C-oblasť ľudskej protilátky, ako je Cyl, Cy2, Cy3 alebo Cy4 pre H-reťazce a Ck alebo Cl pre L-reťazce. Coblasti ľudskej protilátky sa môžu modifikovať s cieľom zlepšenia stability protilátky alebo zabezpečenia stabilnej produkcie tejto protilátky.

Chimérna protilátka je zložená z V-oblastí, odvodených z protilátky cicavca, ktorým nie je človek, a C-oblast£, odvodených z ľudskej protilátky. Humanizovaná protilátka je

- 11 zložená z CDR, odvodených z protilátky cicavca, ktorým nie je človek a FR a C-oblastí, odvodených z ľudskej protilátky. Humanizovaná protilátka je mimoriadne užitočná ako aktívna látka pre liečivo predkladaného vynálezu, pretože antigenicita protilátky proti ľudskému telu je znížená.

Konkrétnym príkladom humanizovanej protilátky, použitej v predkladanom vynáleze, je humanizovaná protilátka #23-57-1371; u ktorej sú CDR odvodené z protilátky #23-57-137-1, odvodenej z myši; a L-reťazec je zložený z CDR, ligovaných cez FR (FR1, FR2 a FR3) , odvodené z ľudskej protilátky HSU 03868 (GEN-BANK, Deftos M. a kol., Scand. J. Immunol., 39, 95-103, 1994) a FR (FR4), odvodený z ľudskej protilátky S25755 (NBRFPDB); a H-reťazec je zložený z CDR, ligovaných cez FR, odvodené z ľudskej protilátky S31679 (NBRF-PBD, Cuisinier A. M. a kol., Eur. J. Immunol. 23, 110-118, 1993), v ktorej je časť aminokyselinových zvyškov v FR nahradená tak, aby pretvarovaná humanizovaná protilátka mohla vykazovať antigénväzbovú aktivitu.

Kmene E. coli s obsahom plazmidov, ktoré majú jednotlivo DNA, kódujúce H-reťazec a L-reťazec humanizovanej protilátky #23-57-137-1, sú jednotlivo označené ako Escherichia coli JM109 (hMBClHcDNA/pUC19) (pre H-reťazec) a Escherichia coli JM109 (hMBClLqXDNA/pUC19) (pre L-reťazec). Tieto kmene boli uložené podľa Budapeštianskej dohody, 15. augusta 1996 v National Inštitúte of Bioscience and Human-technology, Agency of Industrial Science and Technology, Japonsko (1-3, Higashi 1-chome, Tsakuba-shi, Ibaraki, Japonsko) pod prístupovým číslom FERM BP-5629 pre Escherichia coli JM109 (hMBClHcDNA/pUC19) a pod prístupovým číslom FERM BP-5630 pre Escherichia coli JM109 (hMBClLqXDNA/pUC19).

5. Varianty protilátky

Protilátkou, použitou v predkladanom vynáleze, môže byt akýkoľvek jej fragment alebo modifikovaný produkt tohto fragmentu, pokiaľ môže viazať PTHrP a inhibovať aktivitu PTHrP. Napríklad, medzi tieto fragmenty protilátky patria Fab, F(ab')₂, Fv alebo jednoreťazcový Fv (scFv), zložený z Hreťazcového Fv fragmentu alebo L-retazcového Fv fragmentu, spojených spolu cez vhodný linker. Konkrétne, takéto fragmenty protilátok sa môžu vytvoriť štepením protilátky enzýmom (napríklad papaínom, pepsínom) na protilátkové fragmenty, alebo vytvorením génu kódujúceho fragment protilátky a vložením tohto génu do expresného vektora a zavedením výsledného rekombinantného expresného vektora do vhodnej hostiteľskej bunky, čím sa exprimuje tento fragment protilátky (viď. napríklad Co M. S., a kol., J. Immunol. (1994), 152, 2968-2976; Better M. & Horwitz A. H., Methods in Enzymology (1989), 178, 476-496, Academic Press, Inc.; Plueckthun A. & Skerra A., Methods in Enzymology (1989) 178, 476-496, Academic Press, Inc.; Lemoyi E., Methods in Enzymology (1989) 121, 652663; Rousseaux J. a kol., Methods in Enzymology (1989) 121, 663-669; a Bird R. E. a kol., TIBTECH (1991) 9, 132-137).

scFv sa môže vytvoriť spojením H-reťazcovej V-oblasti s L-reťazcovou V-oblasčou cez linker, prednostne nejaký peptidový linker (Huston J. S. a kol., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1988) 85, 5879-5883). H-reťazcová V-oblasť a L-reťazcová V-oblasť v cvFv sa môžu odvodiť z akejkoľvek z tu opísaných protilátok. Peptidovým linkerom, ktorý viaže tieto V-oblasti, môže byť akýkoľvek jednoreťazcový peptid, napríklad z 12 až 19 aminokyselinových zvyškov.

DNA, kódujúca SCFv, sa môže pripraviť najskôr oddelenou amplifikáciou DNA, kódujúcej H-retazcovú V-oblasť, a DNA, kódujúcej L-reťazcovú V-oblasť protilátky, s použitím DNA fragmentu, kódujúceho celý úsek H-reťazca alebo jeho časť, ktorá zahŕňa V-oblasť, a DNA fragmentu, kódujúceho celý úsek L-reťazca alebo jeho časť, ktorá zahŕňa V-oblasť, ako templátu a párov primérov, ktoré určujú terminálne konce DNA fragmentov; a potom amplifikáciou DNA, kódujúcej peptidový linker, s použitím DNA fragmentu, kódujúceho tento peptidový linker, ako templátu a párov primérov, ktoré určujú terminálne konce DNA fragmentu tak, aby obidva konce peptidového linkera boli jednotlivo spojené s H-reťazcovou V-oblasťou a Lreťazcovou V-oblasťou.

Keď je DNA, kódujúca scFv, pripravená, môže sa bežnými metódami pripraviť expresný vektor, ktorý nesie túto DNA, a hostiteľ, transformovaný týmto expresným vektorom.

Protilátkové fragmenty, použité v predkladanom vynáleze, sa môžu vytvoriť pomocou pripravenia génov pre tieto fragmenty a exprimovaním týchto génov vo vhodných hostiteľoch, ako je opísané vyššie. Tieto protilátkové fragmenty sú tiež zahrnuté v termíne protilátka predkladaného vynálezu.

Ako modifikovaná forma vyššie uvedených protilátok sa tiež môže použiť napríklad protilátka proti PTHrP, spojená s akoukoľvek molekulou (napríklad polyetylénglykolom). Takéto modifikované protilátky sú tiež zahrnuté v termíne protilátka predkladaného vynálezu. Modifikované protilátky sa môžu pripraviť chemickými modifikáciami protilátok. Techniky chemických modifikácií, vhodných na tento účel, boli už v odbore zavedené.

6. Expresia a produkcia rekombinantnej protilátky alebo modifikovanej protilátky

Frotilátkový gén, zostavený tak, ako je opísané vyššie, sa môže vytvoriť a exprimovať známymi metódami. Na expresiu v bunke cicavca sú operatívne spojené bežný užitočný promótor, protilátkový gén, ktorý sa má exprimovať, a poly(A) signál (umiestnený na 3' konci protilátkového génu). Napríklad, ako užitočný promótor/enhancérový systém sa môže použiť promótor/enhancérový systém skorej rannej fázy cytomegalovírusu.

Na expresiu protilátky predkladaného vynálezu sa môžu tiež použiť iné promótor/enhancérové systémy, napríklad tie, ktoré sú odvodené z vírusov (napríklad retrovírusu, polyomavírusu, adenovírusu a opičieho vírusu 40 (SV 40)), a tie, ktoré sú odvodené z buniek cicavcov (napríklad ľudského elongačného faktora la (HEFla)).

Keď sa použije promótor/enhancérový systém SV 40, môže sa génová expresia uskutočniť ľahko podľa metódy Mulligana a kol., (Náture (1979) 277, 108).

Keď sa použije promótor/enhancérový systém HEFla, môže sa génová expresia uskutočniť ľahko podľa metódy Mizushimu a kol., (Nucleic Acids Res. (1990) 18, 5322).

Na expresiu v E. coli sa môžu operatívne spojiť bežný užitočný promótor, signálna sekvencia na sekréciu požadovanej protilátky a protilátkový gén. Ako promótor sa môže použiť lacZ promótor alebo araB promótor.

Keď sa použije lacZ promótor, môže sa génová expresia uskutočniť podľa metódy Warda a kol., (Náture (1998) 341, 544546) ; Fabse J. (1992) 6, 2422-2427) , zatiaľ čo keď sa použije araB promótor, môže sa génová expresia uskutočniť podľa metódy Bettera a kol., (Batter a kol., Science (1988) 240, 10411043) .

Čo sa týka signálnej sekvencie na sekréciu protilátky, keď sa požaduje sekrécie tejto protilátky do periplazmatického priestoru E. coli, môže sa použiť signálna sekvencia pelB (Lei S. P. a kol., J. Bacteriol. (1987) 169, 4379). Protilátka, sekretovaná do periplazmatického priestoru, sa izoluje a potom znova zloží tak, aby získala príslušnú šcruktúru.

Môže sa použiť replikačný počiatok, odvodený z vírusov (napríklad SV 40, polyomavírusu, adenovírusu, papilomavírusu dobytka (BPV) a pod.). S cieľom zvýšenia počtu kópii génu v hostiteľskom bunkovom systéme, môže expresný vektor ďalej obsahovať gén pre selekčný marker, ako je napríklad gén pre aminoglykozidfosfotransferázu (ΑΡΗ), gén pre tymidínkinázu (TK), gén E. coli pre xantín-guanínfosforibozyltransferázu (Ecogpt) a gén pre dihydrofloatreduktázu (dhfr).

Na produkciu protilátky, použitej v predkladanom vynáleze, sa môže použiť akýkoľvek expresný systém, vrátane systému eukariotických a prokariotických buniek. Eukariotické bunky zahŕňajú zavedené bunkové línie živočíchov (napríklad cicavcov, hmyzu, pliesní a húb, kvasiniek). Prokariotické bunky zahŕňajú bunky, ako napríklad bunky E. coli.

Uprednostňuje sa, keď sa protilátka, použitá v predkladanom vynáleze, exprimuje v bunke cicavca, ako sú bunky CHO, COS, myelomové bunky, bunky BHK, Vero a HeLa.

Ďalej sa transformovaná hostiteľská bunka kultivuje in vitro alebo in vivo, s cieľom produkcie požadovanej protilátky. Kultivácia hostiteľskej bunky sa môže uskutočniť podľa ktorejkoľvek známej metódy. Kultivačné médium, tu použiteľné, môže byť médium DMEM, MEM, RPMI 1640 alebo IMDM. Kultivačné médium môže ďalej obsahovať sérový doplnok, ako je fetálne teľacie sérum (FCS).

7. Izolácia a purifikácia protilátky

Protilátka produkovaná a exprimovaná tak, ako je opísané vyššie, sa môže izolovať z buniek alebo tela hostiteľského živočícha a purifikovať do čistoty. Izolácia a purifikácia protilátky, použitej v predkladanom vynáleze, sa môže uskutočniť na afinitnej kolóne. Príklady proteínovej A kolóny zahŕňajú Hyper D, POROS a Sepharose F.F. (Pharmacia) . Použiť, sa môžu tiež iné metódy, bežne používané na izoláciu a purifikáciu protilátok; metóda teda nie je žiadnym spôsobom konkrétne obmedzená.

Na izolovanie a purifikovanie požadovanej protilátky sa môžu použiť samostatne alebo v kombinácii napríklad rôzne chromatografy, ktoré uvedených afinitných vysolovanie a dialýza.

využívajú kolóny, kolón, filtrácia, vrátane vyššie ultrafiltráčia, (Antibodies A Laboratory Manual. Ed.

HArlow, Davis Lane, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988) .

8. Určenie aktivity protilátky

Určenie antigén-väzbovéj aktivity (Antibodies A Laboratory Manual. Ed. Harlow, Dávid Lane, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988) alebo inhibičnej aktivity proti receptoru ligandu (Harada A. a kol., International Immunology (1993) 5, 681-890) protilátky, použitej v predkladanom vynáleze, sa môže uskutočniť podľa ktorýchkoľvek známych metód.

Ako metóda na určenie antigén-väzbovéj aktivity protilátky proti PTHrP, použitej v predkladanom vynáleze, sa môže napríklad použiť ELISA (enzýme-linked immunosorbing assay), EIA (enzýme immunoassay), RIA (radioimmunoassay) alebo fluorescenčná protilátková technika. Napríklad, keď sa použije

EIA, testovaný vzorkový roztok, ktorý obsahuje protilátku proti PTHrP (napríklad kultivačný supernatant buniek, ktoré produkujú protilátku proti PTHrP, alebo protilátka proti PTHrP per sa v purifikovanej forme) sa pridá na misku, ktorá sa predtým pokryla PTHrP (1-34) . Na misku sa ďalej pridá sekundárna protilátka, značená enzýmom (napríklad alkalickou fosfatázou). Miska sa inkubuje a premyje. Na misku sa pridá substrát pre tento enzým (napríklad kyselina pnitrofenylfosforečná) a meria sa absorbancia roztoku na miske s cieľom stanovenia antigén-väzbovej aktivity tejto protilátky.

Na potvrdenie aktivity protilátky, použitej v predkladanom vynáleze, sa určí neutralizačná aktivita tejto protilátky (napríklad protilátky proti PTHrP).

9. Spôsoby podávania a farmaceutické prostriedky

Liečivo podľa tohto vynálezu sa môže použiť na liečenie kachexie alebo zmiernenie kachexie. Kachexia, liečená alebo zmierňovaná predkladaným vynálezom, môže byť akéhokoľvek typu, vrátane rakovinou indukovaného typu. Medzi príklady rakovinou indukovanej kachexie patria tie, ktoré sú opísané v J. Urol. (USA) marec 1995, 153 (3 Pt 1), str. 854-857; Langebecks Árch. Chir. Suppl II Vehr Dtsch Ges Chir (Nemecko) 1990, str. 261265; Oncology (Švajčiarsko) 1990, 47 (1), str. 87-91, Int. J. Pancreatol. (USA) august-september 1990, 7 (1-3) str. 141-150; J. Natl. Cancer Inst. (USA) 19. decembra 1990, 82 (24) str. 1922-1926.

Medzi príklady inej kachexie, ako je rakovinou indukovaná kachexia, patria tie, ktoré sú opísané v JPEN J. Parenter. Enteral Nur (USA) október-december 1990, 14 (6) str. 605-609; Chest (USA) október 1990, 98 (5) str. 1091-1094; Bone Marrow Transplant. (Anglicko) júl 1990, 6 (1) str. 53-57.

Liečivo podľa predkladaného vynálezu, ktoré obsahuje ako aktívnu látku protilátku proti PTHrP, sa môže podávať orálne alebo parenterálne, ale prednostne parenterálne. Toto liečivo môže byt v akejkoľvek dávkovej forme, ako napríklad transpulmorálne liečivo (napríklad liečivo podávané pomocou nejakého prístroja ako je rozprašovač), nasogastrálne liečivo, transdermálne liečivo (napríklad masť, krém) alebo injekcia. Medzi príklady injekcií patrí intravenózna injekcia (napríklad kvapky), intramuskulárna injekcia, intraperitoneálna injekcia a subkutánna injekcia na systemické alebo miestne podávanie. Spôsob podávania sa môže vhodne vybrať v závislosti na veku pacienta a podmienkach choroby. Účinná samostatná dávka sa môže vybrať z rozsahu 0,001 až 1,000 mg na kg telesnej hmotnosti. Alternatívne sa môže dávka pre pacienta vybrať z rozsahu 0,01 až 100000 mg/telo. Dávka liečiva podľa predkladaného vynálezu, ktorá obsahuje protilátku proti PTHrP, však nie je vyššie uvedenými rozsahmi žiadnym spôsobom obmedzená.

Toto liečivo sa môže pacientovi podávať v akomkoľvek štádiu, vrátane štádií pred a po rozvinutí kachexie. Alternatívne sa môže liečivo podávať v štádiu, kde sa predpovedá rozvoj straty hmotnosti.

Liečivo podľa predkladaného vynálezu, ktoré obsahuje ako aktívnu zložku protilátku proti PTHrP, sa môže vytvoriť akoukoľvek bežnou metódou (Remington's Pharmaceutícal Science, posledné vydanie, Mark Publishing Company, Easton, USA) . Prípravok môže ďalej obsahovať farmaceutický prijateľné nosiče a prísady. Medzi príklady takýchto nosičov patria voda, farmaceutický prijateľné organické rozpúšťadlá, kolagén, polyvinylalkohol, polyvinylpyrolidón, karboxyvinylový polymér, karboxylmetylcelulóza sodíka, poly(akrylát sodný), arginát sodný, vo vode rozpustný dextrán, karboxymetylškrob sodíka, pektín, metylcelulóza, etylcelulóza, xantánová guma, arabská guma, kazeín, agar, polyetylénglykol, diglycerín, glycerín, propylénglykol, vazelína, parafín, stearylalkohol, ľudský sérový albumín (HSA), manitol, sorbitol, laktóza a surfaktanty, prijateľné ako farmaceutické prísady.

V praktickom použití sa táto prísada vhodne vyberie z vyššie uvedených látok samostatne alebo v kombinácii, v závislosti na použitej dávkovej forme, ale inak nie je obmedzená. Napríklad, môže sa použiť injekcia, ktorá je pripravená rozpustením protilátky proti PTHrP v purifikovanej forme v nejakom rozpúšťadle (napríklad normálnom roztoku NaCl, nejakom pufri, roztoku hroznového cukru) a potom pridaním adsorbcii-brániaceho činidla (napríklad Tween 80, Tween 20, nejaká želatína, ľudský sérový albumín.)

Liečivo podľa predkladaného vynálezu môže byť tiež v rekonštituovanej, vymrazenej forme, ktorá je pred použitím rozpustená. Na prípravu vymrazenej dávkovej formy sa môže pridať nejaké vehikulum, ako je cukrový alkohol (napríklad manitol, hroznový cukor) a cukor.

Prehlad obrázkov na výkresoch

Obr.	1	je	grafickým znázornením	liečebného	účinku
protilátky	proti	PTHrP pri kachexii.
Obr.	2	je	grafickým znázornením	liečebného	účinku
protilátky	proti	PTHrP pri kachexii.
Obr.	3	je	grafickým znázornením	liečebného	účinku
protilátky	proti	PTHrP pri kachexii.
Obr.	4	je	grafickým znázornením	liečebného	účinku

protilátky proti PTHrP pri	kachexii.
Obr. 5	je grafickým	znázornením	výsledkov	merania	anti-
gén-väzbovéj	aktivity.
Obr. 6	je grafickým	znázornením	výsledkov	merania	anti-
gén-väzbovéj	aktivity.
Obr. 7	je grafickým	znázornením	výsledkov	merania	anti-
gén-väzbovej	aktivity.
Obr. 8	je grafickým	znázornením	výsledkov	merania	anti -
gén-väzbovej	aktivity.
Obr. 9	je grafickým	znázornením	výsledkov	merania	anti-
gén-väzbovej	aktivity.

Obr. 10 je grafickým znázornením výsledkov merania antigén-väzbovej aktivity.

Obr. 11 je grafickým antigén-väzbovéj aktivity.

znázornením výsledkov merania

Obr. 12 je grafickým znázornením výsledkov merania antigén-väzbovej aktivity.

Obr. 13 je grafickým znázornením neutralizačnej aktivity humanizovanej protilátky.

Obr. 14 je grafickým znázornením neutralizačnej aktivity humanizovanej protilátky.

Obr. 15 je grafickým znázornením neutralizačnej aktivity

humanizovanej protilátky.
Obr. 16	je grafickým	znázornením	liečebného	účinku
humanizovanej	protilátky pri	kachexii.
Obr. 17	je grafickým	znázornením	liečebného	účinku
humani zovanej	protilátky pri	kachexii.
Obr. 18	je grafickým	znázornením	liečebného	účinku
humani zovanej	protilátky pri	kachexii.
Obr. 19	je grafickým	znázornením	liečebného	účinku
humani zovanej	protilátky pri '	kachexii.

Ďalej bude predkladaný vynález opísaný detailnejšie, vzhľadom na nasledujúce príklady, ktoré by sa nemali chápať ako obmedzujúci technický rozsah tohto vynálezu.

Príklady uskutočnenia vynálezu

Príklad 1

Farmakologický test, ktorý využíva zvierací model kachexie

Myšia monoklonálna protilátka proti PTHrP sa testovala na svoj liečebný účinok pri kachexii, s použitím zvieracieho modelu kachexie (nahej myši s implantovaným ľudským nádorom).

Ako zvierací model kachexie sa použila nahá myš s implantovaným ľudským karcinómom ústnej dutiny OCC-1 (zakúpeným od Central Inštitúte for Experimental Animals). Je známe, že nahá myš s implantovaným ľudským karcinómom ústnej dutiny OCC-1 vykazuje zvýšenú hladinu kalcia v krvi, ako dochádza k zväčšovaniu objemu nádoru, a dochádza u nej k vývoju príznakov kachexie, ako je strata hmotnosti a zníženie pohyblivosti. V tomto teste sa hodnotilo zmierňovanie takýchto príznakov kachexie, indukovanej ľudským karcinómom ústnej dutiny OCC-1, myšou monoklonálnou protilátkou, vzhľadom na hladinu kalcia v krvi, stratu hmotnosti a vplyv na predĺženie času prežitia.

Ľudský karcinóm ústnej dutiny OCC-1 sa pasážoval in vivo s použitím BALB/c-nu/nu nahých myší (Japan CLEA Co., Inc.). Na hodnotenie farmakologického účinku sa zakúpili 6 týždňov starý samci BALB/c-nu/nu nahých myší (Japan CLEA Co., Inc.), ktorý sa nechali aklimatizovať 1 týždeň, aby tak vznikli 7 týždňov staré myši, ktoré sa poskytli na použitie pri meraní.

Myšie modely kachexie sa pripravili a rozdelili do skupín nasledujúcim spôsobom. Pasážovaný ľudský karcinóm ústnej dutiny OCC-1 sa z nahej myši vybral a potom sa narezal na 3 mm kocky. Výsledné nádorové kocky sa podkožné implantovali z boku do každej z myší, v dávke jeden kus na myš. Desať dní po implantácii, keď sa potvrdilo, že sa objem nádoru u každej z myší dostatočne zväčšil, myši sa rozdelili do skupín, ktoré sa poskytli na použitie ako zvieracie modely kachexie tak, aby boli hladiny kalcia v krvi, telesné hmotnosti a nádorové objemy myší v jednotlivých skupinách priemerne rovnaké.

Testovanie liečebného účinku pri kachexii sa uskutočnilo nasledovne.

sa myšiam protilátka (1) Sledovanie času prežitia

Pri testovaní predĺženia času prežitia testovanej skupiny podala myšia monoklonálna dvakrát za týždeň a pozoroval sa čas prežitia každej z myší. Myšiam druhej testovanej skupiny sa chvostovou žilou podala, v dávkovom množstve 15 mg/kg, jedna dávka existujúcej látky, na liečenie hyperkalcémie, pamidronatu (pamidronat sodíka;

tomto teste sa myšiam kontrolnej

Aredia). Ako kontrola v skupiny chvostovou žilou podal pufrovaný roztok NaCl (PBS), v dvakrát za týždeň fosfátom dávkovom množstve 0,2 ml na myš. Výsledky sú ukázané na obr. 1.

(2) Sledovanie hladiny kalcia v krvi

Myšia monoklonálna protilátka proti PTHrP sa podala myším modelom kachexie testovanej skupiny chvostovou žilou, dvakrát, v intervaloch dvoch dní, v dávkovom množstve buď 10 pg alebo 100 pg na myš na každé podanie. Myšiam druhej testovanej skupiny sa chvostovou žilou podala, v dávkovom množstve 15 mg/kg, jedna dávka existujúcej látky, na liečenie hyperkalcémie, pamidronatu (pamidronat sodíka; Aredia). Ako kontrola v tomto teste sa myšiam kontrolnej skupiny chvostovou žilou podal dvakrát, v intervaloch dvoch dní, fosfátom pufrovaný roztok NaCl (PBS), v dávkovom množstve 0,2 ml na myš, na každé podanie.

(3) Určenie hladiny kalcia v krvi

Jeden a štyri dni po podaní myšej monoklonálnej protilátky, sa s cieľom stanovenia farmakologickej účinnosti protilátky, určila hladina kalcia v krvi každej z týchto myší. Hladina kalcia v krvi sa určila ako celková hladina ionizovaného kalcia v krvi, pomocou odobratia krvi z každej myši cez očnicu, s použitím hematokritovej trubice a vnesenia krvi do 643 Automatic Ca/pH Analyzéru (CIBA-CORNING). Telesná hmostnosč každej z myší sa vážila každý deň do štvrtého dňa po podaní protilátky. Výsledky sú ukázané na obr. 2 a 3.

(4) Určenie objemu nádoru

Objem nádoru sa určoval štyri dni po podaní protilátky, zmeraním najdlhšej osi (a mm) a najkratšej osi (b mm) nádoru a dosadením obidvoch nameraných hodnôt do Galantovej rovnice [ab²/2] . Výsledky sú ukázané na obr. 4.

Ako je zjavné z týchto výsledkov, aj keď vykázali myši, ktorým bola podaná protilátka v dávkovom množstve 10 gg, ekvivalentné hladiny kalcia v krvi ako myši, ktorým bol podaný pamidronat, u myší, ktorým bola podaná protilátka, sa pozorovalo zamedzenie straty hmotnosti, pretože strata hmotnosti nebola tak výrazná, ako u myší, ktorým bol podaný pamidronat. U myší, ktorým bola podaná protilátka v dávkovom množstve 100 gg, došlo k zabráneniu zvýšenia hladiny kalcia v krvi a zamedzeniu straty hmotnosti na vyššej úrovni, v porovnaní s myšami, ktorým bol podaný pamidronat, a kontrolnými myšami. U myší, ktorým bola podaná neutralizačná protilátka proti PTHrP v dávkovom množstve 100 pg dvakrát za týždeň, sa v porovnaní s myšami, ktorým bol podaný pamidronat, a kontrolnými myšami, pozorovala významná úroveň predĺženia času prežitia (p = 0,0003: Log Rank Test). Ako výsledok sa zistilo, že má neutralizačná myšia monoklonálna protilátka proti PTHrP vynikajúci účinok, ktorý nevykazuje žiadna existujúca látka na liečenie hyperkalcémie, ako je zamedzenie straty hmotnosti a predĺženie času prežitia. Tieto výsledky ukazujú, že protilátka, použitá v tomto teste, je užitočná ako liečivo na kachexiu spojenú so zhubným bujnením.

Príklad 2

Farmakologický test, ktorý využíva zvierací model hyperkalcémie a kachexie

Humanizovaná protilátka verzie q proti PTHrP sa testovala na svoj liečebný účinok pri kachexii, s použitím zvieracieho modelu kachexie (nahej myši s implantovaným ľudským nádorom).

Ako zvierací model kachexie sa použila nahá myš s implantovaným ľudským karcinómom ústnej dutiny OCC-1 (zakúpeným od Central Inštitúte for Experimental Animals). Je známe, že nahá myš s implantovaným ľudským karcinómom úscnej dutiny OCC-1 vykazuje zvýšenú hladinu kalcia v krvi, ako dochádza k zväčšovaniu objemu nádoru, a dochádza u nej k vývoju príznakov kachexie, ako je strata hmotnosti a zníženie pohyblivosti. V tomto teste sa hodnotilo zmierňovanie takýchto príznakov kachexie, indukovanej ľudským karcinómom ústnej dutiny OCC-1, humanizovanou protilátkou verzie q, vzhľadom na hladinu kalcia v krvi, stratu hmotnosti a vplyv na predĺženie času prežitia.

Subkultivácia ľudského karcinómu ústnej dutiny OCC-1 sa uskutočnila in vivo s použitím BALB/c-nu/nu nahých myší (Japan CLEA Co., Inc.). Na hodnotenie farmakologického účinku sa zakúpili 6 týždňov starý samci BALB/c-nu/nu nahých myší (Japan CLEA Co., Inc.), ktorí sa nechali aklimatizovať 1 týždeň, aby tak vznikli 7 týždňov staré myši, ktoré sa poskytli na použitie pri meraní.

Testovanie liečebného účinku pri kachexii sa uskutočnilo nasledovne.

(1) Sledovanie času prežitia

Pri testovaní predĺženia času prežitia sa myšiam testovanej skupiny podala humanizovaná protilátka verzie q dvakrát za týždeň a pozoroval sa čas prežitia každej z myší. Ako kontrola v tomto teste sa myšiam kontrolnej skupiny chvostovou žilou podal dvakrát za týždeň fosfátom pufrovaný roztok NaCl (PBS), v dávkovom množstve 0,1 ml na myš. Výsledky sú ukázané na obr. 16.

(2) Sledovanie hladiny kalcia v krvi

Humanizovaná protilátka verzie q sa podala myším modelom kachexie testovanej skupiny chvostovou žilou, dvakrát, v intervaloch dvoch dní, v dávkovom množstve buď 10 pg alebo 100 gg na myš na každé podanie. Ako kontrola v tomto teste sa myšiam kontrolnej skupiny chvostovou žilou podal dvakrát, v intervaloch dvoch dní, fosfátom pufrovaný roztok NaCl (PBS), v dávkovom množstve 0,1 ml na myš, na každé podanie.

(3) Určenie hladiny kalcia v krvi

Jeden a štyri dni po podaní humanizovanej protilátky verzie q, sa s cieľom stanovenia farmakologickej účinnosti tejto protilátky, určila hladina kalcia v krvi každej z týchto myší. Hladina kalcia v krvi sa určila ako celková hladina ionizovaného kalcia v krvi, pomocou odobratia krvi z každej myši cez očnicu, s použitím hematokritovej trubice a vnesenia krvi do 643 Automatic Ca/pH Analyzéru (CIBA-CORNING). Telesná hmostnosť každej z myší sa vážila každý deň do štvrtého dňa po podaní protilátky. Výsledky sú ukázané na obr. 17 a 18.

(4) Určenie objemu nádoru

Objem nádoru sa určoval štyri dni po prvom podaní protilátky, zmeraním najdlhšej osi (a mm) a najkratšej osi (b mm) nádoru a dosadením obidvoch nameraných hodnôt do Galantovej rovnice [ab²/2]. Výsledky sú ukázané na obr. 19.

Ako je zjavné z týchto výsledkov, došlo u myší, ktorým bola podaná humanizovaná protilátka verzie q v dávkovom množstve buď 10 gg alebo 100 gg, k zabráneniu zvyšovania hladiny kalcia v krvi a u myší, ktorým bola podaná protilátka, sa pozorovalo zamedzenie straty hmotnosti, pretože strata hmotnosti nebola tak výrazná, ako u kontrolných myší. U myší, ktorým bola podaná humanizovaná protilátka verzie q v dávkovom množstve 100 μ<3 dvakrát týždenne, sa v porovnaní s kontrolnými myšami, pozorovala významná úroveň predĺženia času prežitia (p = 0,0108: Log Rank test). Účinnosť humanizovanej protilátky verzie q u modelových zierat s kachexiou spojenou so zhubným bujnením b^la podobná ako účinnosť vyššie testovanej myšej monoklonálnej protilátky. Tieto výsledky ukazujú, že protilátka, použitá v tomto teste, je užitočná ako liečivo na kachexiu spojenú so zhubným bujnením.

Príklad 3

Príprava hybridómov, ktoré produkujú myšiu monoklonálnu protilátku proti PTHrP (1-34)

Hybridómy, schopné produkcie monoklonálnej protilátky proti ľudskému PTHrP (1-34) (SEQ I. Č.: 75), #23-57-154 a #2357-137-1, sa pripravili podľa metódy, opísanej v Kanji Sato a kol. (Sato K. a kol., J. Bone Miner. Res. 8, 849-860, 1993).

Použitým imunogénom bol PTHrP (1-34) (Penisula), ku ktorému sa karbodiimidom pripojil nosičový proteín thyreoglobulín (Dojinn). S thyreoglobulínom spojený PTHrP (134) sa dialyzoval, aby sa získal roztok, s obsahom koncentrácie proteínu 2 gg/ml.

Výsledný roztok sa zmiešal s Freundovým adjuvans (Difco) v pomere 1 : 1, aby vznikla emulzia. Táto sa inj ikovala 16 samiciam myší BALB/c, 11 krát subkutánne na chrbtovej strane alebo intraperitoneálne, v dávkovom množstve 100 μ$ na myš na každú injekciu, čím sa tieto myši imunizovali. Na prvotnú imunizáciu sa použilo Freundove kompletné adjuvans, zatiaľ čo na zosilňovaciu imunizáciu sa použilo Freundove nekompletné adj uvans.

U každej myši sa nasledujúcim spôsobom určil titer protilátky v sére. T. j., každej z týchto myší sa z jej chvostovej žily odobrala krv a antisérum sa oddelilo od krvi. Antisérum sa zriedilo RIA pufrom a zmiešalo sa s PTHrP (1-34), značeným ¹²⁵I, s cieľom určenia väzbovej aktivity. Myšiam, u ktorých sa potvrdilo, že majú dostatočne zvýšený titer, sa intraperitoneálne injikoval PTHrP (1-34) bez nosičového proteínu, v dávkovom množstve 50 p.g na myš na konečnú imunizáciu.

Tri dni po konečnej imunizácii sa myš utratila a odobrala sa z nej slezina. Bunky sleziny sa podrobili fúzii s myšou myelomovou bunkovou líniou P3x63Ag8U.l, podľa ktorejkoľvek bežne známej metódy, s použitím 50 % polyetylénglykolu 4000. Takto pripravené fúzované bunky sa vysiali do každej z 85 jamiek 96 jamkových doštičiek v množstve 2 x 10⁴ na jamku. Hybridómy sa preverovali v HAT médiu nasledovne.

Preverovanie hybridómov sa uskutočňovalo tak, že sa zisúovala prítomnosť PTHrP-rozpoznávacej protilátky v kultivačnom supernatante jamiek, v ktorých sa v HAT médiu pozoroval bunkový rast, pomocou RIA metódy v tuhej fáze. Hybridómy sa zhromaždili z jamiek, v ktorých sa potvrdila väzbová schopnosť PTHrP-rozpoznávacej protilátky. Takto získané hybridómy sa rozpustili v médiu RPMI-1640, s obsahom 15 % FSC, doplnené OPI doplnkom (Sigma). Nasledovalo zjednotenie týchto hybridómov metódou limitovaného zriedenia. Takto sa mohli získať dva typy hybridómových klonov, #23-57154 a #23-57-137-1, z ktorých obidva mali silnú väzbovú aktivitu k PTHrP (1-34).

Hybridómový kloň #23-57-137-1 bol označený ako hybridom myš-myš #23-57-137-1 a bol uložený podľa Budapeštianskej dohody, 15. augusta 1996 v National Inštitúte of Bioscience .‘l f * • r í

and Human-technology, Agency of Industrial Science and Technology, Japonsko (1-3, Higashi 1-chome, Tsakuba-shi, Ibaraki, Japonsko) pod prístupovým číslom FERM BP-5631.

Príklad 4

Klonovanie DNA, kódujúcej V-oblast myšej monoklonálnej protilátky proti ľudskému PTHrP (1-34) .

Klonovanie DNA, kódujúcej V-oblasť myšej monoklonálnej protilátky proti ľudskému PTHrP (1-34) #23-57-137-1 sa uskutočnilo nasledujúcim spôsobom.

(1) Príprava mRNA mRNA z hybridómu #23-57-137-1 sa pripravila s použitím Quick Prep mRNA Purification Kitu (Pharmacia Biotech) . T.j., bunky hybridómu #23-57-137-1 sa úplne homogenizovali extrakčným pufrom a na kolóne oligo(dT)-Cellulose Spun Collumn sa z nich podľa priložených inštrukcií izolovala a purifikovala mRNA. Výsledný roztok sa podrobil etanolovému zrážaniu s cieľom získania mRNA vo forme zrazeniny. Zrazenina mRNA sa rozpustila v elučnom pufri.

(2) Vytvorenie a amplifikácia cDNA pre gén, kódujúci myšiu Hreťazcovú V-oblasť (i) Klonovanie cDNA pre H-reťazcovú V-oblasť protilátky #2357-137-1.

Gén, kódujúci H-reťazcovú V-oblasť myšej monoklonálnej protilátky proti PTHrP, sa klonoval pomocou 5' RAČE metódy (Frohman M. A. a kol., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85, 89989002, 1988; Belyavsky A. a kol., Nucleic Acids Res. 17, 29192932, 1989). 5' RAČE metóda sa uskutočnila s použitím S'-Ampli FINDER RAČE Kitu (Clonetech) podľa inštrukcií, ktoré sa nachádzajú v tejto súprave. Pri tejto metóde bol primérom na syntézu cDNA primér MHC2 (SEQ I. Č. : 1) , ktorý je schopný hybridizácie s myšou H-reťazcovou C-oblasťou. Vyššie pripravená mRNA (asi 2 /xg) , ktorá bola templátom na syntézu cDNA, sa zmiešala s MHC2 primérom (10 pmol) . Výsledná zmes sa nechala reagovať s reverznou transkriptázou pri 52 °C počas 30 min, s cieľom uskutočnenia reverznej transkripcie mRNA na cDNA.

K výslednému reakčnému roztoku sa pridal 6N NaOH, s cieľom hydrolýzy zvyšnej RNA v roztoku (pri 65 °C počas 3 0 min) a potom sa podrobil etanolovému zrážaniu, s cieľom izolácie a purifikácie cDNA ako zrazeniny. Purifikovaná cDNA sa ligovala s Ampli FINDER Anchor (SEQ I. Č.: 42) na 5' konci reakciou s T4 RNA ligázou pri 37 °C počas 6 hodín a navyše pri izbovej teplote počas 16 hodín. Ako priméry na amplifikáciu cDNA pomocou metódy PCR sa použili Anchor primér (SEQ I. Č.:

2) a MHC-G1 primér (SEQ I. Č.: 3) (S. T. Jones a kol.,

Biotechnology 9, 88, 1991).

PCR roztok obsahoval (na 50 μΐ) 10 mM Tris-HCl (pH 8,3), 50 mM KC1, 0,2 5 mM dNTP (dATP, dGTP, dCTP, dTTP) , 1,5 mM MgCl₂, 2,5 jednotiek TaKaRa Taq (TaKaRa Shuzo Co., Ltd.), 10 pmol Anchor priméru a 1 μΐ reakčnej zmesi cDNA, s ktorou sa ligoval MHC-G1 primér a Ampli FINDER Anchor primér. Roztok sa prevrstvil minerálnym olejom (50 μΐ). PCR sa uskutočnilo v prístroji Thermal Cycler Model 480J (Perkin Elmer) 30 cyklami, za podmienok: 94 °C - 45 s; 60 °C - 45 s; a 72 °C - 2 min.

(ii) Klonovanie cDNA pre L-reťazcovú V-oblasč

Gén, kódujúci L-reťazcovú V-oblasť myšej monoklonálnej protilátky proti PTHrP, sa klonoval pomocou 5' RAČE metódy (Frohman M. A. a kol., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85, 89989002, 1988; Belyavsky A. a kol., Nucleic Acids Res. 17, 29192932, 1989). 5' RAČE metóda sa uskutočnila s použitím 5¹-Ampli

Finder RAČE Kitu (Clonetech) podľa inštrukcií, ktoré sa nachádzajú v tejto súprave. Pri tejto metóde sa ako primér na syntézu cDNA použil primér oligo-dT. Vyššie pripravená mRNA (asi 2 μg), ktorá bola templátom na syntézu cDNA, sa zmiešala s oligo-dT primérom. Výsledná zmes sa nechala reagovať s reverznou transkriptázou pri 52 °C počas 30 min, s cieľom uskutočnenia reverznej transkripcie mRNA na cDNA. K výslednému reakčnému roztoku sa pridal 6N NaOH, s cieľom hydrolýzy zvyšnej mRNA v roztoku (pri 65 °C počas 30 min) . Výsledný roztok sa podrobil etanolovému zrážaniu s cieľom izolácie a purifikácie cDNA ako zrazeniny. Takto syntetizovaná cDNA sa ligovala s Ampli FINDER Anchor na 5' konci reakciou s T4 RNA ligázou pri 37 °C počas 6 hodín a navyše pri izbovej teplote počas 16 hodín.

Bol navrhnutý PCR primér MLC (SEQ I. Č.: 4), na základe konzervovanej sekvencie myšej LX-rečazcovej C-oblasti, a syntetizoval sa s použitím prístroja 394 DNA/RNA Synthesizer (ABI) . PCR roztok obsahoval (na 100 μΐ) 10 mM Tris-HCl (pH

8,3), 50 mM KC1, 0,25 mM dNTP (dATP, dGTP, dCTP, dTTP) , 1,5 mM MgCl₂, 2,5 jednotiek AmpliTaq (PERKIN ELMER), 50 pmol Anchor priméru (SEQ I. Č.: 2) a 1 μΐ reakčnej zmesi cDNA, s ktorou sa ligoval MLC (SEQ I.Č.: 4) a Ampli FINDER Anchor primér. Roztok sa prevrstvil minerálnym olejom (50 μΐ) . PCR sa uskutočnilo v prístroji Thermal Cycler Model 480J (Perkin Elmer) 30 cyklami, za podmienok: 94 °C - 45 s; 60 °C - 45 S; a 72 °C - 2 min.

(3) Purifikácia a fragmentácia PCR produktov

Každý z DNA fragmentov, amplifikovaných vyššie opísanými metódami PCR, sa oddelil pomocou elektroforézy na agarózovom géli z 3 % Nu Sieve GTG agarózy (FMC Bio. Products) . Pre Hreúazcovú V-oblasč aj L-rečazcovú V-oblasú sa z gélu vyrezala časú agarózového gélu, ktorý obsahuje DNA fragment s veľkosúou asi 550 bp. Každá z týchto častí gélu sa podrobila purifikácii požadovaného DNA fragmentu, s použitím GENECLEAN II Kitu (BIO101), podľa inštrukcií, ktoré boli súčasúou tejto súpravy. Purifikovaná DNA sa vyzrážala etanolom a tento DNA precipitát sa rozpustil v 20 μΐ roztoku, s obsahom 10 mM Tris-HCl (pH

7,4) a 1 mM EDTA. Časú (1 μΐ) tohto DNA roztoku sa štepila reštrikčným enzýmom Xmal (New England Biolabs) pri 37 °C počas 1 hodiny a ďalej sa štepila reštrikčným enzýmom EcoRI (Takara Shuzo Co., Ltd.) pri 37 °C počas 1 hodiny. Tento roztok sa extrahoval fenolom a chloroformom a potom sa vyzrážal etanolom, s cieľom zhromaždenia DNA.

Týmto spôsobom sa získali DNA fragmenty, ktoré obsahujú jednotlivo gén, kódujúci myšiu H-rečazcovú V-oblasč, a gén, kódujúci myšiu L-rečazcovú V-oblasč, z ktorých obidva mali

EcoRI rozpoznávanú sekvenciu na 5¹ konci a Xmal rozpoznávanú sekvenciu na 3' konci.

EcoRI-Xmal DNA fragmenty, ktoré obsahujú jednotlivo gén, kódujúci myšiu H-reťazcovú V-oblasť, a gén, kódujúci myšiu Lreťazcovú V-oblasť, sa oddelene ligovali do vektora pUC19, ktorý sa štepil EcoRI a Xmal pri 16 °C počas 1 hodiny, s použitím DNA Ligation Kitu ver. 2 (Takara Shuzo Co., Ltd.), podľa inštrukcií, ktoré boli súčasťou tejto súpravy. Časť (10 μΐ) tejto ligačnej zmesi sa pridala k 100 μΐ roztoku, s obsahom kompetentnej bunky E. coli, JM 109 (Nippon Gene Co. , Ltd.). Bunková zmes sa nechala stáť v ľade počas 15 minút, pri 42 °C počas 1 minúty a navyše počas 1 minúty v ľade. K výslednej bunkovej zmesi sa pridalo 300 μΐ SOC média (Molecular Cloning: A Laboratory manual, Sambrook a kol., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989) a potom sa inkubovala pri 37 °C počas 30 minút. Výsledný bunkový roztok sa naniesol na LB agarové médium alebo na 2xYT agarové médium (Molecular Cloning: A Laboratory manual, Sambrook a kol., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989), s obsahom buď 100 alebo 50 μ9/πι1 ampicilínu, 0,1 mM IPTG a 20 μ9/ιη± X-galu, a jnkubovai sa pri 3 7 °C cez noc. Týmto spôsobom sa pripravili E. coli transformanty.

Tieto transformanty sa kultivovali cez noc pri 37 °C v 2 ml LB alebo 2xYT média, s obsahom buď 100 alebo 50 μ9/πι1 ampicilínu. Na získanie plazmidovej DNA z bunkovej frakcie sa použil Plazmid Extracter PI-100 (Kurabo Industries Ltd.) alebo Qiaprep Spin Plasmid Kit (QIAGEN). Takto získaná DNA sa sekvenovala.

(4) Sekvenovanie génu, kódujúceho V-oblasť myšej protilátky

Nukleotidová sekvencia cDNA kódujúceho úseku, neseného na plazmide, sa určila v DNA Sequencéri 373A (ABI; Perkin-Elmer), s použitím Dye Terminátor Cycle Seguencing Kitu (PerkinElmer) . Pri tomto sekvenovaní sa použili priméry M13 Primer M4 (Takara Shuzo Co., Ltd.) (SEQ I. Č.: 5) a M13 Primer RV (Takara Shuzo Co., Ltd.) (SEQ I. Č.: 6) a nukleotidová sekvencia bola potvrdená v obidvoch smeroch.

- 30 ~γ·»ηρ

Plazmid, ktorý obsahuje gén, kódujúci H-retazcovú Voblasť odvodenú z hybridómu #23-57-137-1, bol označený ako MBC1H04 a plazmid, ktorý obsahuje gén, kódujúci L-reťazcovú V-oblasť odvodenú z hybridómu #23-57-137-1, bol označený ako MBC1L24. Nukleotidové sekvencie (vrátane zodpovedajúcich aminokyseli-nových sekvencií) DNA, kódujúce H-reťazcovú Voblast odvodenú z myšej protilátky #23-57-137-1, v plazmide MBC1H04 a génu, kódujúceho L-reťazcovú V-oblasť odvodenú z myšej protilátky #23-57-137-1, v plazmide MBC1H24, sú jednotlivo ukázané v SEQ I. Č.: 57 a 65. Obidva polypeptidy pre fragment H-reťazcovej V-oblasti a pre fragment Lreťazcovej V-oblasti začínali jednotlivo od 58. nukleotidu (ktorý kóduje glutamín) v DNA sekvenciách, ukázaných jednotlivo v SEQ I. Č.: 57 a 65. Amino kyselinové sekvencie polypeptidov H-reťazcovej V-oblasti a L-reťazcovej V-oblasti sú tiež jednotlivo ukázané v SEQ I. Č.: 46 a 45.

Kmeň E. coli, ktorý obsahuje plazmid MBC1H04, a kmeň E. coli, ktorý obsahuje plazmid MBC1L24, boli jednotlivo označené ako Escherichia coli JM109 (MBC1H04) a Escherichia coli JM109 (MBC1L24) . Tieto kmene E. coli boli uložené podľa Budapeštianskej dohody, v National Inštitúte of Bioscience and Human-Technology, Agency of Industrial Science and Technology, Japonsko (1-3, Higashi 1-chome, Tsakuba-shi, Ibaraki, Japonsko) 15. augusta 1996 pod prístupovým číslom FERM BP-5628 pre Escherichia coli JM109 (MBC1H04) a FERM BP-5627 pre Escherichia coli JM109 (MBC1L24).

(5) Určenie CDR myšej monoklonálnej protilátky #23-57-137-1 proti ľudskému PTHrP

H-reťazcová V-oblasť a L-reťazcová V-oblasť majú vzájomne podobné niektoré všeobecné štruktúry, v ktorých sú štyri úseky základnej štruktúry (FR) spojené cez hypervariabilné úseky (t. j. komplementaritu určujúce úseky; CDR). Aminokyselinové sekvencie FR sú relatívne dobre konzervované, zatiaľ čo aminokyselinové sekvencie CDR majú extrémne vysokú variabilitu (Kabat: A. a kol., Sequence of proteins of Immunological Interest US Dept. Health a Human Service, 1983). Vzhľadom k týmto faktom sa homológia aminokyselín medzi V-oblasťami myšej monoklonálnej protilátky proti ľudskému PTHrP určila vzhľadom na databázy aminokyselinových sekvencií pre protilátky, vytvorené Rabatom a kol. CDR V-oblastí sa teda určili, ako ukazuje tabuľka 1.

Aminokyselinové sekvencie CDR 1-3 L-reťazcovej V-oblasti sú jednotlivo ukázané v SEQ I. Č.: 59 až 61; a aminokyselinové sekvencie CDR 1-3 H-reťazcovej V-oblasti sú jednotlivo ukázané v SEQ I. Č.: 62 až 64.

Tabuľka 1

V-oblasč	SEQ I. Č.	CDR1	CDR2	CDR3
H-rečazcová V-oblasč	57	21-35	50-66	99-107
L-rečazcová V-oblasč	65	23-34	50-60	93-105

Príklad 5

Vyvorenie chimérnej protilátky (1) Vytvorenie H-reťazca chimérnej protilátky (i) Vytvorenie H-reťazcovej V-oblasti

S cieľom ligovania do expresného vektora, nesúceho genómovú DNA ľudskej H-reťazcovej C-oblasti Cyl, sa klonovaná DNA, nesúca myšiu H-reťazcovú V-oblasč, modifikovala metódou PCR. Spätný primér MBC-S1 (SEQ I. Č.: 7) bol navrhnutý tak, aby hybridizoval s DNA sekvenciou, kódujúcou 5' úsek vedúcej sekvencie V-oblasti, a aby obsahoval ako Kozákovu konsenzus sekvenciu (Kozák M. a kol., J. Mol. Biol., 196, 947-950, 1987), tak aj HindIII-rozpoznávanú sekvenciu. Predný primér MBCl-a (SEQ I. Č.: 8) bol navrhnutý tak, aby hybridizoval s DNA sekvenciou, kódujúcou 3' úsek vedúcej sekvencie J-úseku, a aby obsahoval ako sekvenciu pre 5' zostrih, tak aj BamHIrozpoznávanú sekvenciu. PCR reakcia sa uskutočnila s použitím Ex Taq (TaKaRa Shuzo Co. , Ltd.) a k nej patriaceho pufra. PCR roztok obsahoval (na 50 μΐ) 0,07 pg plazmidu MBC1H04 ako templátovej DNA, 50 pmol MBCl-a a 50 pmol MBC1-S1 ako priméry, 2,5 U TaKaRa Ex Taq a 0,25 mM dNTP v pufri, na ktorý sa navrstvilo 50 μΐ minerálneho oleja. PCR sa uskutočnilo 30 cyklami, za podmienok: 94 °C - 1 min; 55 °C - 1 min; a 72 °C 2 min.

DNA fragmenty, takto amplifikované metódou PCR, sa oddelili pomocou elektroforézy na agarózovom géli z 3 % Nu Sieve GTG agarózy (FMC Bio. Products).

Potom sa vyrezala časť agarózového gélu, s obsahom DNA fragmentu s veľkosťou 437 bp a tento DNA fragment sa z nej purifikoval s použitím GENECLEAN II Kitu (BIO101), podľa inštrukcií, ktoré boli súčasťou tejto súpravy. Purifikovaná DNA sa zhromaždila etanolovým zrážaním a potom sa rozpustila v 20 μΐ roztoku, s obsahom 10 mM Tris-HCl (pH 7,4) a 1 mM EDTA. Časť (1 μΐ) výsledného DNA roztoku sa štepila reštrikčnými enzýmami BamHi a HindlII (Takara Shuzo Co., Ltd.) pri 37 °C počas 1 hodiny. Tento roztok sa extrahoval fenolom a chloroformom a potom sa vyzrážal etanolom, s cieľom zhromaždenia požadovanej DNA.

Získaný HindlII-BamHI DNA fragment, ktorý obsahoval gén, kódujúci myšiu H-reťazcovú V-oblasť, sa subklonoval do vektora pUC19, ktorý sa štepil HindlII a BamHi. Výsledný plazmid sa sekvenoval na DNA Sequencéri 373A (Perkin-Elmer) , s použitím primérov M13 Primer M4 a M13 Primer RV a Dye Terminátor Cycle Sequencing Kitu (Perkin-Elmer). Ako výsledok sa získal plazmid, ktorý niesol gén správnej nukleotidovej sekvencie, kódujúcej H-reťazcovú V-oblasť, odvodenú z hybridómu #23-57137-1, a obsahujúci HindlII-rozpoznávanú sekvenciu a Kozákovu sekvenciu vo svojom 5' úseku a BamHi-rozpoznávanú sekvenciu vo svojom 3' úseku a ktorý bol označený ako MBClH/pUC19.

(ii) Vytvorenie H-reťazcovej V-oblasti pre DNA chimérneho Hreťazca myš-človek

S cieľom ligovania s cDNA pre ľudskú H-reťazcovú C-oblasť Cyl, sa DNA, kódujúca myšiu H-reťazcovú V-oblasť, vytvorila tak, ako je opísané vyššie, modifikovanou metódou PCR. Spätný primér MBC1HVS2 (SEQ I. Č.: 9) bol navrhnutý tak, aby spôsobil nahradenie druhej aminokyseliny (asparagínu) v sekvencii, kódujúcej prednú časť vedúcej sekvencie pre H-reťazcovú Voblasč, za glycín a aby obsahoval Kozákovu konsenzus sekvenciu (Kozák M. a kol., J. Mol. Biol., 196, 947-950, 1987) a HindlII- a EcoRI-rozpoznávanú sekvenciu. Predný primár MBC1HVR2 (SEQ I. Č.: 10) pre H-reťazcovú V-oblasť bol navrhnutý tak, aby hybridizoval s DNA sekvenciou, kódujúcou 3' úsek J-úseku, aby kódoval 5' úsek C úseku a aby obsahoval Apal- a SrnaI-rozpoznávanú sekvenciu.

PCR reakcia sa uskutočnila s použitím TaKaRa Ex Taq (TaKaRa Shuzo Co. , Ltd.) a k nej patriaceho pufra. PCR roztok obsahoval (na 50 μΐ) 0,6 μg plazmidu MBClH/pUC19 ako templátovej DNA, 50 pmol MBC1HVS2 a 50 pmol MBC1HVR2 ako priméry, 2,5 U TaKaRa Ex Taq a 0,25 mM dNTP v pufri, na ktorý sa navrstvilo 50 μΐ minerálneho oleja. PCR reakcia sa uskutočnila 30 cyklami, za podmienok: 94 °C - 1 min; 55 °C - 1 min; a 72 °C - 1 min.

DNA fragmenty, amplifikované touto PCR reakciou, sa oddelili pomocou elektroforézy na agarózovou géli z 1 % Sea Kem GTG Agarózy (FMC Bio. Products) . Potom sa vyrezala časť agarózového gélu, s obsahom DNA fragmentu s veľkosťou 456 bp a tento DNA fragment sa z nej purifikoval s použitím GENECLEAN II Kitu (BIO101), podľa inštrukcií, ktoré boli súčasťou tejto súpravy. Purifikovaná DNA sa vyzrážala etanolom a potom sa rozpustila v 20 μΐ roztoku, s obsahom 10 mM Tris-HCl (pH 7,4) a 1 mM EDTA.

Výsledný DNA roztok (1 μg) sa štepil reštrikčnými enzýmami EcoRI a Smal (Takara Shuzo Co., Ltd.) pri 37 °C počas 1 hodiny. Tento roztok sa extrahoval fenolom a chloroformom a potom sa vyzrážal etanolom, s cieľom zhromaždenia DNA.

Získaný EcoRI-Smal DNA fragment, ktorý obsahoval gén, kódujúci myšiu H-reťazcovú V-oblasť, sa subklonoval do vektora pUC19, ktorý sa štepil EcoRI a Smal. Výsledný plazmid sa sekvenoval na DNA Sequencéri 373A (Perkin-Elmer) , s použitím primérov M13 Primer M4 a M13 Primer RV a Dye Terminátor Cycle Sequencing Kitu (Perkin-Elmer). Ako výsledok sa získal plazmid, ktorý niesol gén správnej nukleotidovej sekvencie, kódujúcej H-reťazcovú V-oblasť, odvodenú z hybridómu #23-5734

137-1, a obsahujúcej EcoRI- a HindlII-rozpoznávanú sekvenciu a Kozákovu sekvenciu vo svojom 5' úseku a Apa- a Smalrozpoznávanú sekvenciu vo svojom 3' úseku a ktorý bol označený ako MBClHv/pUC19.

(iii) Vytvorenie expresného vektora pre H-reťazec chimérnej protilátky cDNA, s obsahom DNA pre H-reťazcovú C-oblasť Cyl, sa pripravila nasledovne. Z buniek CHO, do ktorých sa zaviedol ako expresný vektor DHFR-AE-RVh-PM-l-f (viď. WO 92/19759), kódujúci genómové DNA H-reťazcové V-oblasti humanizovanej protilátky PM1 a H-reťazcové C-oblasti ľudskej protilátky IgGl (N. Takahashi a kol., Celí 29, 671-679, 1982), tak aj expresný vektor RVl-PMla (viď. WO 92/19759), kódujúci genómové DNA Lreťazcové V-oblasti humanizovanej protilátky PM1 a LK-reťazcové C-oblasti ľudskej protilátky, sa pripravila mRNA. S použitím tejto mRNA, sa pomocou RT-PCR metódy klonovala cDNA, ktorá obsahovala H-reťazcovú V-oblasť humanizovanej protilátky PM1 a C-oblasť Cll ľudskej protilátky, a potom sa subklonovala do vektora pUC19 do miest HindlII a BamHI. Po sekvenovaní sa získal plazmid, ktorý mal správnu nukleotidovú sekvenciu a ktorý bol označený ako pRVh-PMlf-cDNA.

Na prípravu expresného vektora pre cDNA, ktorý obsahuje gén pre H-reťazcovú V-oblasť humanizovanej protilátky PM1 a gén pre C-oblasť Cll ľudskej protilátky, sa pripravil expresný vektor DHFR-AE-RVh-PM-l-f, v ktorom sa deletovali obidve HindlII miesta medzi SV40 promótorom a DHFR génom a EcoRI miesto medzi EF-Ια promótorom a génom pre H-reťazcovú V-oblasť humanizovanej protilátky PM1.

Získaný plazmid (pRVh-PMlf-cDNA) sa štepil BamHI, zatupil sa Klenowovým fragmentom a ďalej sa štepil HindlII, čím sa získal zatupený HindlII-BamHI fragment. Tento zatupený HindlII-BamHI fragment sa ligoval do vyššie uvedeného expresného vektora DHFR-AE-RVh-PM-l-f, v ktorom sa deletovali miesta HindlII a EcoRI, ktorým sa štepil HindlII a BamHI. Takto sa vytvoril expresný vektor RVh-PMlf-cDNA, ktorý obsahoval cDNA, kódujúcu H-reťazcovú V-oblasť humanizovanej protilátky PM1 a C-oblasť CXl ľudskej protilátky.

Expresný vektor RVh-PMlf-cDNA, s obsahom cDNA, kódujúcej H-rečazcovú V-oblasú humanizovanej protilátky PM1 a C-oblasč CXl ľudskej protilátky, sa štepil Apal a BamHI a zhromaždil sa z neho DNA fragment, s obsahom H-reťazcovej C-oblasti. Výsledný DNA fragment sa zaviedol do vyššie uvedeného plazmidu MBClHv/pUC19, ktorý sa štepil Apal a BamHI. Takto pripravený plazmid bol označený ako MBClHcDNA/pUC19. Tento plazmid obsahoval cDNA, kódujúcu H-reúazcovú V-oblasú myšej protilátky a C-oblasú Cll ľudskej protilátky a obsahoval EcoRI- a HindlIIrozpoznávanú sekvenciu v jej 5' úseku a BamHI-rozpoznávanú sekvenciu vo svojom 3' úseku.

Plazmid MBClHcDNA/pUC19 sa štepil EcoRI a BamHI, s cielom získania DNA fragmentu, s obsahom nukleotidovej sekvencie, kódujúcej chimérny protilátkový H-reúazec. Výsledný DNA fragment sa zaviedol do expresného vektora pCOSl, ktorý sa štepil EcoRI a BamHI, čím vznikol expresný vektor pre chimérnu protilátku, ktorý bol označený ako MBCIHcDNA/pCOSI. Expresný vektor pCOSl tu bol vytvorený s použitím HEF-PMh-gyl (viď. WO 92/19759), z ktorého sa štepením EcoRI a Smal deletovali protilátkové gény a ktorý sa potom ligoval s EcoRI-Nôti-BamHI Adaptorom (Takara Shuzo Co., Ltd.).

Na prípravu plazmidu na expresiu v bunkách CHO sa plazmid MBClHcDNA/pUC19 štepil EcoRI a BamHI, s cieľom získania DNA fragmentu, ktorý obsahuje nukleotidovú sekvenciu, kódujúcu chimérny protilátkový H-reúazec. DNA fragment sa zaviedol do expresného vektora pCHOl, ktorý sa štepil EcoRI a BamHI, čím vznikol expresný vektor pre chimérnu protilátku, ktorý bol označený ako MBCIHcDNA/pCHOl. Expresný vektor pCHOl sa tu vytvoril s použitím DHFR-AE-RVh-PM-l-f (viď. WO 92/19579), z ktorého sa štepením EcoRI a Smal deletovali protilátkové gény a ktorý sa potom ligoval s EcoRI-Nôti-BamHI Adaptorom (Takara Shuzo Co., Ltd.).

(2) Vytvorenie ľudskej L-reúazcovej C-oblasti (i) Príprava klonovacieho vektora

S cielom pripravenia vektora pUC19, ktorý obsahuje gén pre L-reúazcovú C-oblasú, sa pripravil vektor pUC19 s deletovaným HindlII miestom. Vektor pUC19 (2 gg) sa štepil v μΐ reakčného roztoku, s obsahom 20 mM Tris-HCl (pH 8,5), 10 mM MgCl₂, lmM DTT, 100 mM KC1, 8 U HindlII (Takara Shuzo Co.,

Ltd.), pri 37 °C počas 1 hodiny. Výsledný reakčný roztok sa extrahoval fenolom a chloroformom a potom sa podrobil etanolovému zrážaniu, s cieľom zhromaždenia požadovanej DNA.

Zhromaždená DNA sa nechala reagovať v 50 μΐ reakčného roztoku, s obsahom 50 mM Tris-HCl (pH 7,5), 10 mM MgCl₂, 1 mM

DTT, 100 mM NaCl, 0,5 mM dNTP a 6 U Klenowovho fragmentu (Gibco BRL), pri izbovej teplote počas 20 minút, čím sa terminálne konce DNA zatupili. Tento reakčný roztok sa extrahoval fenolom a chloroformom a potom sa podrobil etanolovému zrážaniu, s cieľom zhromaždenia vektorovej DNA.

Takto zhromaždená vektorová DNA sa nechala reagovať v 10 μΐ reakčného roztoku, s obsahom 50 mM Tris-HCl (pH 7,6), 10 mM

MgCl₂, 1 mM ATP, 1 mM DTT, 5 % (obj./obj.) polyetylénglykol8000 a 0,5 U T4 DNA ligázy (Gibco BRL) , pri 16 °C počas 2 hodín, s cieľom samoligovania tejto vektorovej DNA. Tento reakčný roztok (5 μΐ) sa pridal k 100 μΐ roztoku, s obsahom kompetentnej bunky E. coli, JM109 (Nippon Gene Co., Ltd.), a výsledný reakčný roztok sa nechal stáť v ľade počas 30 minút, pri 42 °C počas 1 minúty a ďalej počas 1 minúty v ľade. K reakčnému roztoku sa prodalo SOC médium (500 μΐ) a potom sa inkuboval pri 37 °C počas 1 hodiny. Výsledný roztok sa naniesol na 2xYT agarové médium (s obsahom 50 Mg/ml ampicilínu), na ktorého povrch sa aplikoval X-gal a IPTG (Molecular Cloning: A Laboratory manual, Sambrook a kol., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989), a potom sa inkuboval pri 37 °C cez noc. Týmto spôsobom sa pripravili E. coli transformanty.

Tieto transformanty sa kultivovali v 2xYT médiu (20 ml) , s obsahom ampicilínu (50 Mg/ml), pri 37 °C cez noc. Z bunkovej frakcie kultivačného média sa izolovala a purifikovala plazmidová DNA, s použitím Plazmid Mini Kitu (QIAGEN), podľa inštrukcií, ktoré boli súčasťou tejto súpravy. Purifikovaný plazmid sa štepil HindlII. Plazmid, u ktorého sa potvrdilo, že obsahuje deléciu HindlII miesta, sa označil ako pUC19 AHindlII.

(ii) Vytvorenie DNA, kódujúcej ľudskú LX-reťazcovú C-oblasť

O LX-reťazcovej C-oblasti ľudskej protilátky je známe, že má aspoň 4 izotypy, ktoré zahŕňajú Mcg*Ke⁺Oz', Mcg'Ke'Oz, Mcg Ke' Oz*a Mcg'Ke⁺Oz' (P. Dariavach a kol., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84, 9074-9078, 1987). V EMBL databáze sa hľadala LX-reťazcová

C-oblasť ľudskej protilátky, homológna s myšou #23-57-137-1 LXrečazcovou C-oblasťou. Výsledkom bolo zistenie, že s myšou #23-57-137-1 LX-reťazcovou C-oblasťou vykazuje vysoký stupeň homológie, so 64,4 % homológiou v aminokyselinej sekvencii a

73,4 % homológiou v nukleotidovej sekvencii, izotyp Mcg⁺Ke^tOz LX-reťazca ľudskej protilátky (prístupové číslo X57819) (P.

Dariavach a 1987) .

kol., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84, 9074-9078,

Potom sa gén, kódujúci LX-reťazcovú C-oblasé ľudskej protilátky, vytvoril pomocou PCR metódy. Primér pre PCR sa syntetizoval s použitím 394 DNA/RNA Synthetizéru (ABI). Syntetizované priméry boli nasledujúce: HLAMB1 (SEQ I. Č.: 11) a HLAMB3 (SEQ I. Č.: 13), obidva majú senzia sekvenciu DNA, HLAMB2 (SEQ I. Č.: 12) a HLAMB4 (SEQ I. Č.: 14), obidva majú antisenzia sekvenciu DNA. Každý primér obsahuje komplementárnu sekvenciu 20-23 bp na obidvoch terminálnych koncoch.

Externé priméry HLAMBS (SEQ I. Č.: 15) a HLAMBR (SEQ I. Č. : 16) majú jednotlivo homológne sekvencie s primérmi HLAMB1 a HLAMB4. HLAMBS obsahoval EcoRI-, HindlII- a Blnlrozpoznávané sekvencie a HLAMBR obsahoval EcoRI-rozpoznávanú sekvenciu. V prvej PCR reakcii sa uskutočnili reakcie medzi HLAMB1 a HLAMB2 a medzi HLAMB3 a HLAMB4. Po dokončení reakcií sa obidva výsledné PCR produkty zmiešali v rovnakých množstvách a potom sa použili spoločne v nasledujúcej, druhej PCR reakcii. K reakčnému roztoku sa pridali priméry HLAMBS a HLAMBR. Táto reakčná zmes sa podrobila tretej PCR reakcii, s cieľom amplifikácie DNA s úplnom dĺžkou.

PCR reakcie sa uskutočnili s použitím TaKaRa Ex Taq (TaKaRa Shuzo Co., Ltd.) podľa inštrukcií, ktoré boli súčasťou tejto súpravy. V prvej PCR reakcii sa použilo buď 100 μΐ reakčného roztoku, s obsahom 5 pmol HLAMB1, 0,5 pmol HLAMB2 a

U TaKaRa Ex Taq (TaKaRa Shuzo Co., Ltd.), alebo reakčného roztoku, s obsahom 0,5 pmol HLAMB3, 5 pmol HLAMB4 a 5 U TaKaRa Ex Taq (TaKaRa Shuzo Co., Ltd.), ktorý sa prevrstvil 50 gl minerálneho oleja. PCR reakcia sa uskutočnila 5 cyklami, za podmienok: 94 °C - 1 min; 60 °C - 1 min; a 72 °C - 1 min.

V druhej PCR reakcii sa použila zmes obidvoch reakčných roztokov (50 gl každého), ktorá sa prevrstvila 50 gl minerálneho oleja. PCR reakcia sa uskutočnila 3 cyklami, za podmienok: 94 °C - 1 min; 60 °C - 1 min; a 72 °C - 1 min.

V tretej PCR reakcii sa použil tento reakčný roztok, ku ktorému sa pridali externé priméry HLAMBS a HLAMBR (50 pmol každého). PCR reakcia sa uskutočnila 30 cyklami, za podmienok: 94 °C - 1 min; 60 °C - 1 min; a 72 °C - 1 min.

DNA fragment, získaný treťou PCR reakciou, sa podrobil elektroforéze na 3 % low-melting agarózovom géli (Nu Sieve GTG Agarose, FMC) . Oddelil sa z neho a purifikoval s použitím GENECLEAN II Kitu (BIO101), podľa inštrukcií, ktoré boli súčasťou tejto súpravu.

Získaný DNA fragment sa štepil v reakčnom roztoku (20 gl), s obsahom 50 mM Tris-HCl (pH 7,5), 10 mM MgCl₂, 1 mM DTT,

100 mM NaCl, 8 U EcoRI (Takara Shuzo Co. , Ltd.), pri 37 °C počas 1 hodiny. Tento roztok sa extrahoval fenolom a chloroformom a DNA sa z neho zhromaždila etanolovým zrážaním. DNA sa rozpustila v roztoku (8 gl) , s obsahom 10 mM Tris-HCl (pH 7,4) a 1 mM EDTA.

Vyššie pripravený plazmid pUC19AHindIII (0,8 gg) sa štepil EcoRI rovnakým spôsobom, ako je uvedené vyššie. Štepiaci roztok sa podrobil fenol/chloroformovej extrakcii a etanolovému zrážaniu, čím sa získal štepený plazmid pUC19AHindIII. Štepený plazmid sa nechal reagovať v reakčnom roztoku (50 gl), s obsahom 50 mM Tris-HCl (pH 9,0), 1 mM MgCl₂ a alkalickej fosfatázy (E. coli C75; Takara Shuzo Co., Ltd.), pri 37 °C počas 30 min, s cieľom def osf orylácie (t.j. BAPupravenia) tohto plazmidu. Reakčný roztok sa podrobil fenol/chloroformovej extrakcii a DNA z neho sa zhromaždila etanolovým zrážaním. Takto získaná DNA sa rozpustila v roztoku (10 gl), s obsahom 10 mM Tris-HCl (pH 7,4) a 1 mM EDTA.

BAP-upravený plazmid pUC19AHindIII (1 μΐ) sa ligoval s vyššie získaným PCR produktom (4 μΐ) , s použitím DNA Ligation Kit Ver. 2 (Takara Shuzo Co., Ltd.). Výsledný plazmid sa zaviedol do kompetentných buniek E. coli JM109, s cieľom získania transformantov. Tieto transformanty sa cez noc kultivovali v 2xYT médiu (2 ml) , s obsahom 50 μg/ml ampicilínu. Z bunkovej frakcie sa izoloval plazmid, s použitím QIAprep Spin Plasmid Kitu (QIAGEN).

V získanom plazmide sa sekvenovala časť klonovanej DNA.

Sekvenovanie sa uskutočnilo v 373 DNA Sequencéri (ABI), s použitím primárov M13 Primer M4 a M13 Primer RV (Takara Shuzo Co., Ltd.). Výsledkom bolo zistenie, že klonovaná DNA obsahovala deléciu 12-bp. Plazmid sa označil ako CXA/pUC19. Potom sa, s cieľom nahradenia deletovanej časti, znova syntetizovali priméry HCLMS (SEQ I. Č.: 17) a HLCMR (SEQ I.

Č.: 18) a správna DNA sa vytvorila metódou PCR s použitím týchto primárov.

V prvej PCR reakcii sa ako templát použil plazmid CÄA/pUC19, ktorý obsahuje DNA deléciu, a reakcia sa uskutočnila s dvojicami primérov HLAMBS a HCLMS a HCLMS a HLAMB4. PCR produkty sa oddelene purifikovali. V druhej PCR reakcii sa tieto PCR produkty znovu spojili. V tretej PCR reakcii sa k reakčnému produktu druhej PCR reakcie pridali externé priméry HLAMBS a HLAMB4 a amplifikovala sa DNA s úplnou dĺžkou.

V prvej PCR reakcii sa použil reakčný roztok (100 μΐ) , s obsahom 0,1 μg plazmidu CÄA/pUC19 ako templátu, buď 50 pmol každého z primérov HLAMBS a HCLMR alebo 50 pmol každého z primérov HCLMS a HLAMB4 a 5 U TaKaRa Ex Taq (TaKaRa Shuzo Co., Ltd.), ktorý sa prevrstvil 50 μΐ minerálneho oleja. PCR reakcia sa uskutočnila 30 cyklami, za podmienok: 94 °C - 1 min; 60 °C - 1 min; a 72 °C - 1 min.

PCR produkty prvej PCR reakcie HLAMBS-HCLMR (236 bp) a HCLMS-HLAMB4 (147 bp) sa jednotlivo podrobili elektroforéze na 3 % low-melting agarózovom géli, s cieľom izolovania týchto

DNA fragmentov. Tieto DNA fragmenty sa z tohto gélu zhromaždili a purifikovali sa s použitím GENECLEAN II Kitu (BIO101).

V druhej PCR reakcii sa použilo 20 μΐ reakčného roztoku, s obsahom 40 ng každého z purifikovaných DNA fragmentov a 1 U TaKaRa Ex Taq (TaKaRa Shuzo Co., Ltd.), ktorý sa prevrstvil 25 μΐ minerálneho oleja. PCR reakcia sa uskutočnila 5 cyklami, za podmienok: 94 °C - 1 min; 60 °C - 1 min; a 72 °C - 1 min.

V tretej PCR reakcii sa použil reakčný roztok, s obsahom 2 μΐ reakčného roztoku, získaného druhou PCR reakciou, 50 pmol každého z externých primérov HLAMBS a HLAMB4 a 5 U TaKaRa Ex Taq (TaKaRa Shuzo Co., Ltd.), ktorý sa prevrstvil 50 μΐ minerálneho oleja. PCR reakcia sa uskutočnila 30 cyklami, za podmienok: 94 °C - 1 min; 60 °C - 1 min; a 72 °C - 1 min, čím sa získal DNA fragment s veľkosťou 357 bp (produkt tretej PCR). Tento DNA fragment sa podrobil elektroforéze na 3 % lowmelting agarózovom géli, s cieľom izolovania tohto fragmentu. Výsledný DNA fragment sa zhromaždil a purifikoval sa s použitím GENECLEAN II Kitu (ΒΙΘ101).

Časť (0,1 μ<3) takto získaného DNA fragmentu sa štepila EcoRI a potom sa subklonovalla do plazmidu pUC19AHindIII, ktorý bol BAP-upravený. Výsledný plazmid sa zaviedol do kompetentných buniek E. coli JM109, s cieľom vytvorenia transformantov. Tieto transformanty sa kultivovali v 2 ml 2xYT média, s obsahom 50 μ9/πι1 ampicilínu, cez noc. Z bunkovej frakcie sa izoloval plazmid, s použitím QIAprep Spin Plasmid Kitu (QIAGEN).

Purifikovaný plazmid sa sekvenoval v 373 DNA Sequencéri (ABI) , s použitím primérov M13 Primer M4 a M13 Primer RV (Takara Shuzo Co. , Ltd.). Plazmid, u ktorého sa zistilo, že obsahuje nukleotidovú sekvenciu bez akejkoľvek delécie, sa označil ako CÄ/pUC19.

(iii) Vytvorenie génu, kódujúceho ľudskú LK-reťazcovú C-oblasť

DNA, kódujúca ľudskú LK-reťazcovú C-oblasť, sa klonovala z plazmidu HEF-PMl-gk (WO 92/19759) metódou PCR. Predný primér HKAPS (SEQ I. Č.: 19) bol navrhnutý tak, aby obsahoval EcoRI-, HindlII- a Blnl-rozpoznávanú sekvenciu, a spätný primér HPAKA (SEQ I. Č.: 20) bol navrhnutý tak, aby obsahoval EcoRIrozpoznávanú sekvenciu. Tieto priméry sa syntetizovali v 934 DNA/RNA Synthetizéri (ABI).

ϊ Ml ΐ ľí--:· 'SJSgS • *7?

9& Ϊ

I-^L

PCR reakcia sa uskutočnila s použitím 100 μΐ reakčného roztoku, s obsahom 0,1 μ% plazmidu HEF-PMl-gk ako templátu, 50 pmol každého z primárov HKAPS a HKAPA a 5 U TaKaRa Ex Taq (TaKaRa Shuzo Co., Ltd.), ktorý sa prevrstvil 50 μΐ minerálneho oleja. PCR reakcia sa uskutočnila 30 cyklami, za podmienok: 94 °C - 1 min; 60 °C - 1 min; a 72 °C - 1 min, čím vznikol PCR produkt s veľkosťou 3 60 bp. Tento DNA fragment sa izoloval a purifikoval elektroforézou na 3 % low-melting agarózovom géli a potom sa zhromaždil a purifikoval s použitím GENECLEAN II Kitu (BIO101).

Takto získaný DNA fragment sa štepil EcoRI a potom sa subklonoval do plazmidu pUC19AHindIII, ktorý bol BAP-upravený.

Výsledný plazmid sa zaviedol do kompetentných buniek E. coli JM109, s cieľom vytvorenia transformantov. Tieto transformanty sa kultivovali v 2 ml 2xYT média, s obsahom 50 gg/ml ampicilínu, cez noc. Z bunkovej frakcie sa purifikoval plazmid, s použitím QIAprep Spin Plasmid Kitu (QIAGEN).

Získaný plazmid sa sekvenoval v 373 DNA Sequencéri (ABI), s použitím primárov M13 Primer M4 a M13 Primer RV (Takara Shuzo Co., Ltd.). Plazmid, u ktorého sa zistilo, že obsahuje správnu nukleotidovú sekvenciu, sa označil ako CK/pUC19.

(3) Vytvorenie expresného vektora pre L-reťazec chimérnej protilátky

Vytvoril sa expresný vektor pre L-reťazec chimérnej protilátky #23-57-137-1. Gén, kódujúci L-reťazcovú V-oblasť protilátky #23-57-137-1, sa ligoval do HindlII-Blnl miesta (umiestneného hneď pred C-oblasťou ľudskej protilátky) každého z plazmidov CX/pUC19 a CK/pUC19, čím sa získali vektory, s obsahom DNA, kódujúcej L-reťazcovú V-oblasť chimérnej protilátky #23-57-137-1 a buď Lk-reťazcovú C-oblasť alebo Lkreťazcovú C-oblast. Každý z týchto výsledných vektorov sa potom štepil EcoRI, s cieľom oddelenia génu pre L-reťazec chimérnej protilátky. Tento gén sa subklonoval do expresného vektora HEF.

T. j., DNA fragment, kódujúci L-reťazcovú V-oblasť protilátky #23-57-137-1, sa klonoval z plazmidu MBC1L24 metódou PCR. Priméry, použité v tejto metóde PCR, sa oddelene syntetizovali s použitím 394 DNA/RNA Synthetizéru (ABI). Spätný primér MCCHL1 (SEQ I. Č.: 21) bol navrhnutý tak, aby obsahoval HindlII-rozpoznávanú sekvenciu a Kozákovu sekvenciu (Kozák M. a kol., J. Mol. Biol., 196, 947-950, 1987), a predný primér MBCCHL3 (SEQ I. Č.: 22) bol navrhnutý tak, aby obsahoval BglII- a EcoRI-rozpoznávanú sekvenciu.

PCR reakcia sa uskutočnila s použitím 100 μΐ reakčného roztoku, s obsahom 10 mM Tris-HCl (pH 8,3), 50 mM KCl, 1,5 mM

MgCl₂, 0,2 mM dNTP, 0,1 gg plazmidu MBC1L24, 50 pmol každého z primárov MBCCHL1 a MBCCHL3 a 1 μΐ AmpliTaq, na ktorý sa navrstvilo 50 μΐ minerálneho oleja. PCR reakcia sa uskutočnila 30 cyklami, za podmienok: 94 °C - 45 s; 60 °C - 45 s; a 72 °C - 2 min.

PCR produkt s veľkoťou 444 bp sa podrobil elektroforéze na 3 % low-melting agarózovom géli a potom sa zhromaždil a purifikoval s použitím GENECLEAN II Kitu (BIO101). Purifikovaný PCR produkt sa rozpustil v 20 μΐ roztoku, s obsahom 10 mM Tris-HCL (pH 7,4) a 1 mM EDTA. Tento PCR produkt (1 μΐ) sa štepil v 20 μΐ reakčného produktu, s obsahom 10 mM

Tris-HCl (pH 7,5), 10 mM MgCl₂, 1 mM DTT, 50 mM NaCl, 8 U

HindlII (Takara Shuzo Co., Ltd.) a 8 U EcoRI (Takara Shuzo

Co., Ltd.), pri 37 °C počas 1 hodiny. Štepiaci roztok sa podrobil fenol/chloroformovej extrakcii a požadovaná DNA sa z neho zhromaždila etanolovým zrážaním. Táto DNA sa rozpustila v 8 μΐ roztoku, s obsahom 10 mM Tris-HCl (pH 7,4) a 1 mM EDTA.

Plazmid pUC19 (1 μg) sa štepil HindlII a EcoRI, podrobil sa fenol/chloroformovej extrakcii a potom etanolovému zrážaniu rovnakým spôsobom. Získaný štepený plazmid bol BAP-upravený alkalickou fosfatázou (E. coli C75; Takara Shuzo Co., Ltd.). Výsledný reakčný roztok sa extrahoval fenolom a chloroformom a DNA sa z neho zhromaždila etanolovým zrážaním. Táto DNA sa rozpustila v 10 μΐ roztoku, s obsahom 10 mM Tris-HCl (pH 7,4) a 1 mM EDTA.

BAP-upravený plazmid pUC19 (1 μΐ) sa ligoval s vyššie získaným PCR produktom (4 μΐ), s použitím DNA Ligation Kitu Ver. 2 (Takara Shuzo Co. , Ltd.). Výsledný plazmid sa zaviedol

Ú<L?3 do kompetentných buniek E. coli JM109 (Nippon Gene Co., Ltd.), rovnakým spôsobom ako je uvedené vyššie, s cieľom vytvorenia transformantov. Tieto transformanty sa vysiali na 2xYT agarové médium, s obsahom 50 Mg/ml ampicilínu, a kultivovali sa pri 37 °C cez noc. Výsledné transformanty sa potom kultivovali pri 37 °C cez noc v 2 ml 2xYT média, s obsahom 50 Mg/ml ampicilínu. Z bunkovej frakcie sa izoloval plazmid, s použitím QIAprep Spin Plasmid Kitu (QIAGEN). Po určení nukleotidovej sekvencie sa plazmid, u ktorého sa zistilo, že obsahuje správnu nukleotidovú sekvenciu, označil ako CHL/pUC19.

Každý z plazmidov CÄ/pUC19 a CK/pUC19 (1 μΐ každého) sa štepil v 20 μΐ reakčného roztoku, s obsahom 20 mM Tris-HCl (pH

8,5), 10 mM MgCl₂, 1 mM DTT, 100 mM KCl, 8 U HindlII (Takara Shuzo Co., Ltd.) a 2 U Blnl (Takara Shuzo Co., Ltd.) pri 37 °C počas 1 hodiny. Tento roztok sa extrahoval fenolom a chloroformom a DNA sa z neho zhromaždila etanolovým zrážaním. DNA bola BAP-upravená pri 37 °C počas 30 min. Tento reakčný roztok sa extrahoval fenolom a chloroformom a DNA z neho sa zhromaždila etanolovým zrážaním. Táto DNA sa rozpustila v 10 Ml roztoku, s obsahom 10 mM Tris-HCl (pH 7,4) a 1 mM EDTA.

Plazmid CHL/pUC19, ktorý obsahoval DNA, kódujúcu Lreťazcovú V-oblasť #23-57-137-1 (8 M9)> ^sa štepil HindlII a Blnl rovnakým spôsobom, ako je uvedené vyššie, aby vznikol fragment s veľkosťou 409 bp.

Tento DNA fragment sa podrobil elektroforéze na 3 % lowmelting agarózovom gél i a potom sa z tohto gélu zhromaždil a purifikoval s použitím GENECLEAN II Kitu (BIO101). Táto DNA sa rozpustila v 10 m! roztoku, s obsahom 10 mM Tris-HCl (pH 7,4) a 1 mM EDTA.

DNA pre L-reťazcovú V-oblasť (4 μΥ sa subklonovala do 1 μΐ každého z BAP-upravených plazmidov CX/pUC19 a Cx/pUC19 a potom sa zaviedla do kompetentných buniek E. coli JM109, s cieľom vytvorenia transformantov. Tieto transformanty sa kultivovali cez noc v 3 ml 2xYT média, s obsahom 50 Mg/ml ampicilínu. Z bunkovej frakcie sa izoloval a purifikoval plazmid, s použitím QIAprep Spin Plasmid Kitu (QIAGEN). Dva takto pripravené plazmidy sa jednotlivo označili ako MBC1L(λ)/pUC19 a MBC1L(k)/pUC19.

Každý z týchto plazmidov MBC1L(λ)/pUC19 a MBC1L(k)/pUC19 sa štepil EcoRI a potom sa podrobil elektroforéze na 3 % lowmelting agarózovom géli. DNA fragment s veľkosťou 743 bp sa z tohto gélu izoloval a purifikoval s použitím GENECLEAN II Kitu (BIO101) a potom sa rozpustil v 10 μΐ roztoku, s obsahom 10 mM Tris-HCI (pH 7,4) a 1 mM EDTA.

Expresný vektor (plazmid HEF-PMlk-gk) (2,7 μg) sa štepil EcoRI a potom sa extrahoval fenolom a chloroformom a DNA sa z neho zhromaždila etanolovým zrážaním. Tento DNA fragment bol BAP-upravený a potom sa podrobil elektroforéze na 1 % lowmelting agarózovom géli. Z tohto gélu sa s použitím GENECLEAN II Kitu (BIO101) izoloval a purifikoval DNA fragment s veľkosťou 6561 bp. Tento purifikovaný DNA fragment sa potom rozpustil v 10 μΐ roztoku, s obsahom 10 mM Tris-HCl (pH 7,4) a 1 mM EDTA.

BAP-upravený HEF-vektor (2 μΐ) sa ligoval s EcoRI fragmentom (3 μΐ) každého z plazmidov MBC1L(λ)/pUC19 a MBC1L(k)/pUC19. Ligačný produkt sa zaviedol do kompetentných buniek E. coli JM109, s cieľom vytvorenia transformantov. Tieto transformanty sa kultivovali v 2 ml 2xYT média, s obsahom 50 μg/ml ampicilínu. Z bunkovej frakcie sa izoloval a purifikoval plazmid, s použitím QIAprep Spin Plasmid Kitu (QIAGEN).

Purifikovaný plazmid sa štepil v 20 μΐ reakčného roztoku, s obsahom 20mM Tris-HCl (pH 8,5), 10 mM MgCl₂, 1 mM DTT, 100 mM KC1, 8 U HindlII (Takara Shuzo Co., Ltd.) a 2 U Pvul (Takara Shuzo Co., Ltd.), pri 37 °C počas 1 hodiny. Touto reakciou vznikli fragmenty s veľkosťou 5104/2195 bp, keď sa fragment vložil v správnej orientácii, alebo fragmenty s veľkosťou 4378/2926 bp, keď sa fragment vložil v obrátenej orientácii. Plazmid, u ktorého sa potvrdilo, že má fragent v správnej orientácii, bol označený ako MBC1L(λ)/neo pre plazmid MBC1L(λ)/pUC19 alebo MBC1L(k)/neo pre plazmid MBC1L(k)/pUC19.

(5) Transfekcia buniek COS-7

S cieľom určenia antigén-väzbovej aktivity a neutralizačnej aktivity chimérnych protilátok, sa vyššie pripravené expresné plazmidy oddelene prechodne exprimovali v bunkách COS-7. Prechodná expresia chimérnych protilátok sa uskutočnila s použitím každej z kombinácii plazmidov MBCIHcDNA/pCOSI a MBClL(X)/neo a plazmidov MBCIHcDNA/pCOSI a MBC1L(k)/neo, kotransfekciou buniek COS-7 týmito plazmidmi pomocou Gene Pulseru (Bio Rad). T.j. plazmidy (10 μg každého) sa pridali k bunkovej suspenzii COS-7 buniek (0,8 ml; 1 x 10⁷buniek/ml) v PBS(-). Na výsledný roztok sa pôsobilo pulzami pri elektrostatickej kapacite 15000 V a 25 μΡ, aby došlo k elekroporizácii. Po 10 minútach regenerácie pri izbovej teplote sa elektroporizované bunky rozpustili v DMEM médiu (GIBCO) , s obsahom 2 % Ultra Low IgG fetálneho teľacieho séra (GIBCO), a potom sa kultivovali s použitím 10 cm kultivačnej Po kultivácii počas 72 hodín, sa ktorý sa centrifugoval, aby sa odstránil bunkový debris. Takto pripravené roztoky sa poskytli na použitie ako vzorky pre následnú metódu ELISA. V tomto postupe sa punfikácia chimérnych protilátok z kultivačných supernatantov buniek COS-7 uskutočnila s použitím Affigel Protein A MAPSII Kitu (BIO Rad), podľa inštrukcií, ktoré boli súčasťou tejto súpravy.

nádoby v CO₂ inkubátore zhromaždil supernatant, (5) ELISA (i) Určenie koncentrácie protilátky

ELISA doštička na určenie koncentrácie protilátky sa pripravila nasledovne. Každá jamka 96 jamkovej ELISA doštičky (Maxisorp NUNC) sa obalila 100 μΐ obalovacieho pufra (1,0 M NaHCO₃, 0,02 % NaN₃) , doplneného 1 μg/ml kozej protiľudskej IgG protilátky (TÁGO) , a potom sa blokovala 200 μΐ zried'ovacieho pufra (50 mM Tris-HCl, 1 mM MgCl₂, 0,1 M NaCl, 0,05 % Tween 20, 0,02 % NaN₃, 1 % hovädzí sérový albumín (BSA) ; pH 7,2). Do každej z týchto jamiek sa zvlášť pridalo každé zo zriedení riediaceho radu kultivačného supernatantu buniek COS-7, v ktorom sa exprimovala zvlášť každá z chimérnych protilátok, alebo sa do nej zvlášť pridalo každé zo zriedení riediaceho radu každej z chimérnych protilátok per se v purifikovanej

:4¹

forme. Doštička sa inkubovala pri izbovej teplote počas 1 hodiny a premyla sa PBS-Tween 20. Do každej z jamiek tejto doštičky sa pridalo 100 μΐ roztoku kozích protiľudských IgG protilátok spojených s alkalickou fosfatázou (TÁGO). Doštička sa inkubovala pri izbovej teplote počas 1 hodiny a premyla sa PBS-Tween 20. Do každej z jamiek sa pridal 1 mg/ml substrátového roztoku (Sigma 104, kyselina pnitrofenylfosforečná, SIGMA). V roztoku sa s cieľom určenia koncentrácie protilátky merala jeho absorbancia pri 405 nm, s použitím Microplate Readera (Bio Rad). Pri tomto meraní sa ako štandard použil Hu IgGlX Purified (The Binding Site).

(ii) Určenie antigén-väzbovej aktivity

ELISA doštička na určenie antigén-väzbovej aktivity sa pripravila nasledovne. Každá jamka 96 jamkovej ELISA doštičky (Maxisorp NUNC) sa obalila 100 μΐ obalovacieho pufra, s obsahom 1 μg/ml ľudského PTHrP (1-34) (Peptide Research Inštitúte) , a potom sa blokovala 200 μΐ zried'ovacieho pufra. Do každej z týchto jamiek sa zvlášč pridalo každé zo zriedení riediaceho radu kultivačného supernatantu buniek COS-7, v ktorom sa exprimovala zvlášú každá z chimérnych protilátok, alebo sa do nej zvlášú pridalo každé zo zriedení riediaceho radu každej z chimérnych protilátok per se v purifikovanej forme. Potom, čo sa doštička inkubovala pri izbovej teplote počas 1 hodiny a premyla sa PBS-Tween 20, sa do každej z jamiek pridalo 100 μΐ roztoku kozích protiľudských IgG protilátok spojených s alkalickou fosfatázou (TÁGO). Potom, čo sa doštička inkubovala pri izbovej teplote počas 1 hodiny a premyla sa PBS-Tween 20, sa do každej z jamiek pridal 1 mg/ml substrátového roztoku (Sigma 104, kyselina pnitrofenylfosforečná, SIGMA). V roztoku sa merala jeho absorbancia pri 405 nm, s použitím Microplate Readera (Bio Rad) .

Ako výsledok sa zistilo, že chimérne protilátky majú schopnosč viazač ľudský PTHrP (1-34) a že klonované V-oblasti myšej protilátky mali správnu štruktúru (obr. 5) . Tiež sa zistilo, že nie je žiadny rozdiel medzi schopnosčou viazač PTHrP (1-34) medzi chimérnou protilátkou s LÁ-rečazcovou C47 oblasčou a chimérnou protilátkou s Lx-rečazcovou C-oblasčou. Humanizovaná L-rečazcová C-oblasč sa teda vytvorila s použitím LX-rečazca humanizovanej protilátky.

(6) Založenie bunkovej línie CHO, schopnej stabilnej produkcie protilátky

Na založenie bunkovej línie, schopnej produkovač chimérne protilátky stabilne, sa vyššie pripravené expresné plazmidy zaviedli do buniek CHO (DXB11).

Na založenie bunkovej línie, schopnej produkovač chimérne protilátky stabilne, sa použila jedna z nasledujúcich kombinácií expresných plazmidov pre bunky CHO: MBCIHcDNA/pCHOl a MBC1L(λ)/neo,· a MBCIHcDNA/pCHOl a MBCIL(k)/neo. Bunky CHO sa týmito plazmidmi kotransfekovali elektroporizáciou s použitím Gene Pulseru (Bio Rad). Tieto expresné vektory sa oddelene štepili reštrikčným enzýmom Pvul, aby vznikli lineárne DNA. Výsledné DNA sa extrahovali fenolom a chloroformom a vyzrážali sa etanolom. Takto pripravené DNA fragmenty sa podrobili elektroporizácii.

elektrostatickej regenerácie pri

GENETICINU selektovali

T.j., každá z plazmidových DNA (100 μg každej) sa pridaJa k 0,8 ml bunkovej suspenzie buniek CHO v PBS (-) (1 x 10⁷ buniek/ml). Na výsledný roztok sa pôsobilo pulzami pri kapacite 15000 V a 25 pF. Po 10 minútach izbovej teplote sa elektroporizované bunky rozpustili v MEM-α médiu (GIBCO), s obsahom 10 % fetálneho teľacieho séra (GIBCO). Výsledná suspenzia sa kultivovala v C0₂inkubátore s použitím troch 96 jamkových doštičiek (Falcon). Jeden deň po začatí kultivácie sa médium nahradilo selektívnym médiom [MEM-α bez ribonukleozidov či deoxyribonukleozidov (GIBCO) ] , s obsahom 10 % fetálneho teľacieho séra a 500 mg/ml (G418Sulfate; GIBCO).

bunky, do ktorých antibiotikum. Selektívne médium sa nahradilo čerstvým médiom. Asi dva týždne po nahradení média sa bunky pozorovali pod mikroskopom. Keď bol pozorovaný vhodný bunkový rast, určilo sa u týchto buniek množstvo produkovaných protilátok metódou ELISA, ako je uvedené vyššie. Medzi týmito bunkami sa hľadali tie, ktoré produkujú väčšie množstvo protilátok.

Z kultivačného sa zaviedol média sa gén pre

Potom sa kultivácia založenej bunkovej línie, schopnej stabilnej produkcie protilátok, uskutočnila vo valcovej nádobe, s použitím MEM média bez ribonukleožidov či deoxyribonukleozidov, s obsahom 2 % Ultra Low IgG fetálneho teľacieho séra. Tretí a štvrtý deň kultivácie sa zhromaždil supernatant, ktorý sa filtroval s použitím 0,2 gm filtra (Millipore), aby sa z neho odstránil bunkový debris.

Purifikácia chimérnych protilátok z kultivačného supernatantu buniek CHO sa uskutočnila s použitím POROS Protein A Column (PerSeptive Biosystems) na ConSep LC100 (Millipore), podľa priložených inštrukcií. Purifikované chimérne protilátky sa poskytli na použitie ako vzorky pri určovaní neutralizačnej aktivity a testovaní liečebnej účinnosti na hyperkalcemických modelových zvieratách. Koncentrácia a antigén-väzbová aktivita purifikovaných chimérnych protilátok sa určila rovnakým systémom ELISA, ako je uvedené vyššie.

Príklad 6

Vytvorenie humanizovanej protilátky (1) Vytvorenie H-reťazca humanizovanej protilátky (i) Vytvorenie humanizovanej H-reťazcovej V-oblasti

H-reťazec humanizovanej protilátky #23-57-137-1 bol vytvorený technikou vkladania CDR pomocou metódy PCR. Na vytvorenie H-reťazca humanizovanej protilátky #23-57-137-1 (verzia a), ktorý má FR odvodené z ľudskej protilátky S31679 (NBRF-PBD; Cuisinier A. M. a kol., Eur. J. Immunol. , 23, 110118, 1993), sa použilo nasledujúcich šesť PCR primérov: CDRvkladajúce priméry: MBC1HGP1 (SEQ I. Č.: 23) a MBC1HGP3 (SEQ

I. Č.: 24) (obidva s obsahom senzia sekvencií) a MBC1HGP2 (SEQ

I. Č.: 25) a MBC1HGP4 (SEQ I. Č.: 26) (obidva s obsahom antisenzia sekvencií), z ktorých všetky obsahujú komplementárnu sekvenciu 15-21 bp na obidvoch terminálnych .1 .

.

koncoch; a externé priméry: MBC1HSV1 (SEQ I. Č.: 27) a MBC1HVR1 (SEQ I. Č.: 28), ktoré majú homológiu jednotlivo s CDR-vkladajúcimi primérmi MBC1HGP1 a MBC1HGP4.

CDR-vkladajúce priméry MBC1HGP1, MBC1HGP2, MBC1HGP3 a MBC1HGP4 sa oddelili na močovinou denaturovanom polyakrylamidovom géli (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Sambrook a kol., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989) a z neho sa extrahovali metódou crash and soak (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Sambrook a kol., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989) nasledujúcim spôsobom.

Každý z CDR-vkladajúcich primérov (1 nmol) sa oddelil na 6 % denaturovanom polyakrylamidovom géli za vzniku DNA fragmentov. Z výsledných DNA fragmentov sa na silikagélovej tenkej vrstve, ožiarením UV lúčmi, vybral ten, ktorý mal požadovanú dĺžku, a z neho sa zhromaždil metódou crash and soak. Výsledná DNA sa rozpustila v 20 μΐ roztoku, s obsahom 10 mM Tris-HCl (pH 7,4) a 1 mM EDTA. PCR reakcia sa uskutočnila s použitím TaKaRa ExTaq (TaKaRa Shuzo Co. , Ltd.) . PCR reačkný roztok (100 μΐ) obsahoval 1 μΐ každého z vyššie uvedených CDR-vkladajúcich primérov MBC1HGP1, MBC1HGP2, MBC1HGP3 a MBC1HGP4, 0,25 mM dNTP a 2,5 U TaKaRa Ex Taq v pufri. PCR reakcia sa uskutočnila 5 cyklami, za podmienok: 94 °C - 1 min; 55 °C - 1 min; a 72 °C - 2 min. K výslednému reakčnému roztoku sa pridali externé priméry MBC1HVS a MBCHVR1 (50 pmol každý). S použitím tejto reakčnej zmesi prebiehala PCR reakcia ďalších 30 cyklov, za rovnakých podmienok. Takto amplifikovaný DNA fragment sa oddelil elektroforézou na agarózovom géli zo 4 % Nu Sieve GTG agarose (FMC Bio.

Products).

Agarózová časť, s obsahom DNA fragmentu s veľkosťou 421 bp, sa vyrezala a tento DNA fragment sa z nej purifikoval s použitím GENECLEAN II Kitu (BIO101), podľa inštrukcií, ktoré boli súčasťou tejto súpravy. Takto purifikovaný DNA fragment sa vyzrážal etanolom a rozpustil sa v 20 μΐ roztoku, s obsahom 10 mM Tris-HCl (pH 7,4) a 1 mM EDTA. Výsledná PCR reakčná zmes sa použila na subklonovanie tohto DNA fragmentu do plazmidu

- 50 t;•««HM?

; ŕr pUC19, ktorý sa štepil BamHI a HindlII, a následne sa určila nukleotidová sekvencia výsledného plazmidu.

Plazmid, ktorý mal správnu nukleotidovú sekvenciu, sa označil ako hMBCHv/pUC19.

(ii) Vytvorenie H-rečazcovej V-oblasti pre cDNA humanizovaného H-rečazca

S cieľom ligovania s cDNA pre humanizovanú H-rečazcovú Coblasč Cyl, sa DNA pre humanizovanú H-rečazcovú V-oblasč, vytvorená tak, ako je opísané vyššie, modifikovala metódou PCR. Pre túto metódu PCR bol navrhnutý spätný primér MBC1HVS2 tak, aby hybridizoval so sekvenciou, kódujúcou 5' úsek vedúcej sekvencie pre V-oblasč, a aby obsahoval Kozákovu konsenzus sekvenciu (Kozák M. a kol., J. Mol. Biol., 196, 947-950, 1987) a HindlII- a EcoRI-rozpoznávanú sekvenciu; a predný primér MBC1HVR2 bol navrhnutý tak, aby hybridizoval ako s DNA sekvenciou, kódujúcou 3' úsek J-oblasti, tak aj s DNA sekvenciou, kódujúcou 5' úsek C-oblasti, a aby obsahoval Apala SrnaI-rozpoznávanú sekvenciu.

PCR reakcia sa uskutočnila s použitím TaKaRa Ex Taq (TaKaRa Shuzo Co., Ltd.) a k nej patriaceho pufra. PCR reakčný roztok obsahoval 0,4 μg plazmidu hMBCHv/pUC19 ako templátovej DNA, 50 pmol každého z MBC1HVS2 a MBC1HVR2 ako priméry, 2,5 U TaKaRa Ex Taq a 0,25 mM dNTP v pufri. PCR reakcia sa uskutočnila 30 cyklami, za podmienok: 94 °C - 1 min; 55 °C - 1 min; a 72 °C - 1 min. Takto amplif ikovaný DNA fragment sa oddelil pomocou elektroforézy na agarózovom géli z 3 % Nu Sieve GTG Agarose (FMC Bio. Products).

Potom sa vyrezala časč agarózového gélu, s obsahom DNA fragmentu s veľkosčou 456 bp a tento DNA fragment sa z nej purifikoval s použitím GENECLEAN II Kitu (BIO101), podľa inštrukcií, ktoré boli súčasčou tejto súpravy. Takto purifikovaný DNA fragment sa vyzrážal etanolom a potom sa rozpustil v 20 μΐ roztoku, s obsahom 10 mM Tris-HCl (pH 7,4) a 1 mM EDTA. Takto získaný PCR reakčný roztok sa použil na subklonovanie tohto DNA fragmentu do plazmidu pUC19, ktorý sa štepil EcoRI a Smal, a potom sa výsledný plazmid sekvenoval. Ako výsledok sa získal plazmid, ktorý obsahoval DNA, kódujúcu ·»Λί*-Ί^ 1 ..ďi X ·

r «rf“ myšiu H-rečazcovú V-oblasť, odvodenú z hybridómu #23-57-137-1, a obsahujúci EcoRI- a HindlII-rozpoznávanú sekvenciu a Kozákovu sekvenciu vo svojom 5' úseku a Apa- a Smalrozpoznávanú sekvenciu vo svojom 3' úseku, ktorý bol označený ako hMBCÍHv/pUCI9.

(2) Vytvorenie expresného vektora pre H-reťazec humanizovanej protilátky

Plazmid RVh-PMlf-cDNA, nesúci cDNA sekvenciu pre Hreťazec protilátky hPMl, sa štepil Apal a BamHI, aby vznikol DNA fragment, s obsahom DNA fragmentu, ktorý obsahuje DNA, kódujúcu H-reťazcovú C-oblasť. Tento DNA fragment sa zaviedol do plazmidu hMBClv/pUC19, ktorý sa štepil Apal a BamH. Získaný plazmid bol označený ako hMBClHcDNA/pUC19. Tento plazmid obsahoval ako DNA, kódujúcu H-rečazcovú V-oblast humanizovanej protilátky #23-57-137-1, tak aj DNA, kódujúcu H-reťazcovú Coblasť Cyl a mal EcoRI- a HindlII-rozpoznávanú sekvenciu vo svojom 5' úseku a BamHI-rozpoznávanú sekvenciu vo svojom 3' úseku. Nukleotidová sekvencia a zodpovedajúca aminokyselinová sekvencia pre humanizovaný H-reťazec verzie a, nesený na plazmide hMBClcDNA/pUC19, sú jednotlivo ukázané v SEQ I. Č.: 58 a SEQ I. Č. : 56 .

Plazmid hMBClHcDNA/pUC19 sa štepil EcoRI a BamHI, aby vznikol DNA fragment, s obsahom DNA, kódujúcej H-reťazec. Tento DNA fragment sa zaviedol do expresného vektora pCOSl, ktorý sa štepil EcoRI a BamHI. Ako výsledok sa získal expresný plazmid pre humanizovanú protilátku, ktorý bol označený ako hMBCIHcDNA/pCOSI.

S cieľom vytvorenia plazmidu, použitého na expresiu v CHO bunkách, sa plazmid hMBClHcDNA/pUCI9 štepil EcoRI a BamHI, aby vznikol DNA fragment, s obsahom DNA, kódujúcej H-reťazec. Tento DNA fragment sa zaviedol do expresného vektora pCHOl, ktorý sa štepil EcoRI a BamHI. Ako výsledok sa získal expresný plazmid pre humanizovanú protilátku, ktorý bol označený ako hMBCIHcDNA/pCHOl.

(3) Vytvorenie L-reťazcovej hybridnej V-oblasti (i) Príprava FR1,2/FR3,4 hybridnej protilátky

--r tr.

., ľ

Bol vytvorený gén pre FR hybridný L-reťazec, ktorý má ako FR z humanizovanej protilátky tak aj FR z myšej (chimérnej) protilátky, a u každého úseku sa posúdila humanizácia. V tomto kroku sa hybridná protilátka, ktorá má FR1 a FR2 odvodené z ľudskej protilátky a FR3 a FR4 odvodené z myšej protilátky, pripravila s použitím AflII reštrikčného miesta, umiestneného na CDR2.

Plazmidy MBClL(X)/neo a hMBCIL(λ)/neo (10 μg každého) sa oddelene štepili v 100 μΐ reakčného roztoku, s obsahom 10 mM Tris-HCl (pH 7,5), 10 mM MgCl₂, 1 mM DTT, 50 mM NaCl, 0,01 % (hmotn./obj.) BSA a 10 U AflII (Takara Shuzo Co. Ltd.), pri 37 °C počas 1 hodiny. Reakčný roztok sa podrobil elektroforéze na 2 % low-melting agarózovom géli, čím vznikli DNA fragmenty s veľkosťou 6282 bp (označený ako cl) a 1022 bp (označený ako c2) z plazmidu MBC1L (λ)/neo alebo DNA fragmenty s veľkosťou 6282 bp (označený ako hl) a 1022 bp (označený ako h2) z plazmidu hMBCIL (λ)/neo. Tieto DNA fragmenty sa z gélov zhromaždili a purifikovali s použitím GENECLEANII Kitu (BI0101).

Každý z fragmentov cl a hl (1 Mg) bol BAP-upravený. Tento DNA fragment sa extrahoval fenolom a chloroformom, zhromaždil sa etanolovým zrážaním a rozpustil v 10 μΐ roztoku, s obsahom 10 mM Tris-HCl (pH 7,4) a 1 mM EDTA.

BAP-upravené fragmenty cl a hl (1 μ± každého) sa jednotlivo ligovali fragmentárni s h2 a c2 (4 μΐ každého) (pri 4 °C cez noc). Každý z ligačných produktov sa zaviedol do kompetentných buniek E. coli JM109, s cieľom vytvorenia transformantov. Tieto transformanty sa kultivovali v 2 ml 2xYT média, s obsahom 50 μg/ml ampicilínu. Z bunkovej frakcie sa purifikoval plazmid, s použitím QIAprep Spin Plasmid Kitu (QIAGEN).

Purifikovaný plazmid sa štepil v 20 μΐ reakčného roztoku, s obsahom 10 mM Tris-HCl (pH 7,5), 10 mM MgCl₂, 1 mM DTT, a buď 2 U ApaLI (Takara Shuzo Co., Ltd.) alebo 8 U BamHI (Takara Shuzo Co., Ltd.) a HindlII (Takara Shuzo Co., Ltd.), pri 37 °C počas 1 hodiny. Ak sa cl-h2 ligoval správne, vznikli týmto štepením fragmenty 5560/1246/498 bp (štepením ApaLI) alebo fragmenty 7134/269 bp (štepením BamH/HindlII). Na základe tohto predpokladu sa požadované plazmidy identifikovali.

Expresný vektor, kódujúci ľudský L-reťazec ľudskej FRl,2/myšej FR3,4 hybridnej protilátky, bol označený ako h/mMBCIL(λ)/neo. Na druhej strane, sa nepodarilo získať kloň pre hl-cl. Preto sa uskutočnila rekombinácia na vektore pUC a potom sa výsledný rekombinant klonoval do vektora HEF. Pri tomto postupe sa ako templáty použili plazmid hMBClLaÄ/pUC19, ktorý obsahoval DNA, kódujúcu L-reťazcovú V-oblasť humanizovanej protilátky, bez akýchkoľvek aminokyselinových zámien, a plazmid hMBClLdÄ/pUC19, ktorý obsahoval DNA, kódujúcu L-reťazcovú V-oblasú humanizovanej protilátky, s aminokyselinovou zámenou aminokyseliny tyrozínu v pozícii 91 (t. j. 87. aminokyseliny podľa Kabatovho pravidla) za izoleucín.

Plazmidy hMBCIL(λ)/pUC19, hMBClLaX/pUC19 a hMBClLdX/pUC19 (10 μΐ každého) sa oddelene štepili v 30 μΐ reakčného roztoku, s obsahom 10 mM Tris-HCl (pH 7,5), 10 mM MgCl₂, 1 mM DTT, 50 mM NaCl, 0,01 % (hmotn./obj .) BSA, 16 U Hindlll a 4 U AflII, pri 37 °C počas 1 hodiny. Reakčné roztoky sa podrobili elektroforéze na 2 % low-melting agarózovom géli, čím vznikol DNA fragment s veľkosťou 215 bp z plazmidu MBC1L(λ)/pUC19 (označený ako ¹¹ c2) a DNA fragment s veľkosťou 3218 bp pre každý z plazmidov hMBClLaI/pUC19 a hMBClLdX/pUC19 (označené jednotlivo ako hal' a hdľ). Tieto DNA fragmenty sa zhromaždili a purifikovali s použitím GENECLEANII Kitu (BIO101).

Každý z fragmentov haľ a hdl¹ sa ligoval s fragmentom c2 a potom sa zaviedol do kompetentných buniek E. coli JM109, s cieľom vytvorenia transformantov. Tieto transformanty sa kultivovali v 2 ml 2xYT média, s obsahom 50 μg/ml ampicilínu. Z bunkovej frakcie sa purifikoval plazmid, s použitím QIAprep Spin Plasmid Kitu (QIAGEN). Takto pripravené plazmidy boli označené ako m/hMBClLaX/pUC19 pre plazmid s obsahom fragmentu hal' a m/hMBClLdX/pUC19 pre plazmid s obsahom fragmentu hdl'.

Každý z plazmidov m/hMBClLaX/pUC19 a m/hMBClLdX/pUC19 sa štepil EcoRI. DNA fragment s veľkosťou 743 bp sa podrobil

-t elektroforéze na 2 % low-melting agarózovom géli a potom sa z neho zhromaždil a purifikoval s použitím GENECLEANII Kitu (ΒΙΘ101). Výsledný DNA fragment sa rozpustil v 20 μΐ roztoku, s obsahom 10 mM Tris-HCl (pH 7,4) a 1 mM EDTA.

Každý z týchto DNA fragmentov (4 μΐ každého) sa ligoval s vyššie získaným, BAP-upraveným HEF vektorom (1 μΐ). Ligačný produkt sa zaviedol do kompetentných buniek E. coli JM109, s cieľom vytvorenia transformantov. Tieto transformanty sa kultivovali v 2 ml 2xYT média, s obsahom 50 μg/ml ampicilínu. Z bunkovej frakcie sa purifikoval plazmid, s použitím QIAprep Spin Plasmid Kitu (QIAGEN).

Každý z týchto purifikovaných plazmidov sa štepil v 20 μΐ reakčného roztoku, s obsahom 20 mM Tris-HCl (pH 8,5), 10 mM MgCl₂, 1 mM DTT, 100 mM KCl, 8 U HindlII (Takara Shuzo Co., Ltd.) a 2 U Pvul (Takara Shuzo Co. , Ltd. ) , pri 37 °C počas 1 hodiny. Plazmidová DNA sa identifikovala na základe očakávania, že ak je DNA fragment vložený do plazmidu v správnej orientácii, vznikol by týmto štepením fragment s veľkosťou 5104/2195 bp, zatiaľ čo, ak je DNA fragment vložený do plazmidu v obrátenej orientácii, vznikol by týmto štepením fragment s veľkosťou 4378/2926 bp. Takto získané plazmidy boli expresnými vektormi, kódujúcimi L-reťazec myšej FR1,2/ľudskéj FR3,4 hybridnej protilátky, ktoré boli jednotlivo označené ako expresné vektory m/hMBCILal/neo a m/hMBCldX/neo.

(ii) Príprava FR1/FR2 hybridnej protilátky

FR1/FR2 hybridná protilátka sa pripravila rovnakým spôsobom, ako je uvedené vyššie, s použitím SnaBI reštrikčného miesta umiestneného na CDR1.

Plazmidy MBClL(X)/neo a h/MBCIL(λ)/neo (10 μg každého) sa oddelene štepili v 20 μΐ reakčného roztoku, s obsahom 10 mM Tris-HCl (pH 7,9), 10 mM MgCl₂, 1 mM DTT, 50 mM NaCl, 0,01 % (hmotn./obj . ) BSA a 6 U SnaBI (Takara Shuzo Co., Ltd.), pri 37 °C počas 1 hodiny. Výsledné reakčné roztoky sa ďalej štepili v 50 μΐ reakčného roztoku, s obsahom 20 mM Tris-HCl (pH 8,5), 10 mM MgCl₂, 1 mM DTT, 100 mM KCl, 0,01 % (hmotn./obj. ) BSA a 6 U Pvul (Takara Shuzo Co., Ltd.), pri 37 °C počas 1 hodiny.

Výsledné reakčné roztoky sa oddelene podrobili elektroforéze na 1,5 % low-melting agarózovom géli, čím vznikli DNA fragmenty s veľkosťou 4955 bp (ml) a 2349 bp (m2) z plazmidu MBClL(X)/neo a DNA fragmenty s veľkosťou 4955 bp (hml) a 234 9 bp (hm2) z plazmidu h/MBCIL (λ)/neo. Tieto DNA fragmenty sa z gélov zhromaždili a purifikovali s použitím GENECLEANII Kitu (BIO101). Každý zo získaných DNA fragmentov sa rozpustil v 40 gl roztoku, s obsahom 10 mM Tris-HCl (pH 7,4) a 1 mM EDTA.

Fragmenty ml a hml (1 gg) sa jednotlivo ligovali s fragmentárni hm2 a m2 (4 gl každého). Každý z výsledných ligačných produktov sa zaviedol do kompetentných buniek E. coli JM109, s cieľom vytvorenia transformantov. Tieto transformanty sa kultivovali v 2 ml 2xYT média, s obsahom 50 gg/ml ampicilínu. Z bunkovej frakcie sa purifikoval plazmid, s použitím QIAprep Spin Plasmid Kitu (QIAGEN).

Každý z purifikovaných plazmidov sa štepil v 20 gl reakčného roztoku, s obsahom 10 mM Tris-HCl (pH 7,5), 10 mM

MgCl₂, 1 mM DTT, a buď 8 U Apal (Takara Shuzo Co., Ltd.) alebo 2 U ApaLI (Takara Shuzo Co., Ltd.), pri 37 °C počas 1 hodiny.

Ak sa tieto fragmenty ligovali správne, vznikol týmto štepením fragment 7304 bp (štepením Apal) alebo fragmenty 5560/1246/498 bp (štepením ApaLI), pre ml-m2, a fragmenty 6538/766 (štepením Apal) alebo fragmenty 3535/2025/1246/498 (štepením ApaLI), pre hml-m2. Na základe tohto predpokladu sa plazmidy identifikovali. Ako výsledok sa získal expresný vektor, kódujúci L-reťazec ľudskej FRl/myšej FR2,3,4 hybridnej protilátky (označený ako hmmMBCIL(λ)/neo), a expresný vektor, kódujúci L-reťazec myšej FRl/ľudskej FR2,3,4 hybridnej protilátky (označený ako mhmMBCIL(λ)/neo).

(4) Vytvorenie L-reťazca humanizovanej protilátky

L-reťazec humanizovanej protilátky #23-57-137-1 sa pripravil technikou vkladania CDR pomocou metódy PCR. Na vytvorenie L-reťazca humanizovanej protilátky #23-57-137-1 (verzia a), ktorý má FR1, FR2 a FR3 odvodené z ľudskej protilátky HSU03868 (GEN-BANK, Deftos M. a kol., Scand J.

7:3' if

Immunol., 39, 95-103, 1994) a FR4, odvodený z ľudskej protilátky S25755 (MBRF-PBD), sa použilo šesť primérov.

Týchto šesť primérov vyzeralo nasledovne: CDR-vkladajúce priméry: MBC1LGP1 (SEQ I. Č.: 29) a MBC1LGP3 (SEQ I. Č.: 30), obidva s obsahom senzia sekvencie DNA, CDR-vkladajúce priméry: MBC1LGP2 (SEQ I. Č.: 31) a MBC1LGP4 (SEQ I. Č.: 32), obidva s obsahom antisenzia sekvencie DNA, z ktorých všetky obsahujú komplementárnu sekvenciu 15-21 bp na obidvoch terminálnych koncoch; a externé priméry: MBC1LVS1 (SEQ I. Č.: 33) a MBC1LVR1 (SEQ I. Č.: 34), ktoré majú homológiu jednotlivo s CDR-vkladajúcimi primérmi MBC1LGP1 a MBC1LGP4.

CDR-vkladajúce priméry MBC1LGP1, MBC1LGP2, MBC1LGP3 a MBC1LGP4 boli oddelené na močovinou denaturovanom polyakrylamidovom géli (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Sambrook a kol., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989) a z neho sa extrahovali metódou crash and soak (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Sambrook a kol., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989).

Každý z CDR-vkladajúcich primérov (1 nmol) bol oddelený na 6 % denaturovanom polyakrylamidovom géli za vzniku DNA fragmentov. Identifikácia DNA fragmentu, ktorý mal požadovanú dĺžku, sa uskutočnila na silikagélovej tenkej vrstve, ožiarením UV lúčmi. Požadovaný DNA fragment sa z gélu zhromaždil metódou crash and soak. Výsledná DNA sa rozpustila v 20 μΐ roztoku, s obsahom 10 mM Tris-HCl (pH 7,4) a 1 mM EDTA.

PCR reakcia sa uskutočnila s použitím TaKaRa Ex Taq (TaKaRa Shuzo Co. , Ltd.) a jej zodpovedajúceho pufra. PCR reakčný roztok (na 100 μΐ) obsahoval 1 μΐ každého z vyššie uvedených CDR-vkladajúcich primérov MBC1LGP1, MBC1LGP2, MBC1LGP3 a MBC1LGP4, 0,25 mM dNTP a 2,5 U TaKaRa Ex Taq v pufri. PCR sa uskutočnila 5 cyklami, za podmienok: 94 °C - 1 min; 55 °C - 1 min; a 72 °C - 2 min. K výslednému reakčnému roztoku sa pridali externé priméry MBC1LVS1 a MBCLVR1 (50 pmol každého) . S použitím tejto reakčnej zmesi bežala PCR reakcia ďalších 30 cyklov, za rovnakých podmienok. Takto amplifikovaný

DNA fragment sa oddelil elektroforézou na agarózovom géli z 3 % Nu Sieve GTG agarose (FMC Bio. Products).

Agarózová časť, s obsahom DNA fragmentu s veľkosťou 421 bp, sa vyrezala a tento DNA fragment sa z nej purifikoval s použitím GENECLEAN II Kitu (BIO101) , podľa inštrukcií, ktoré boli súčasťou tejto súpravy. Takto získaná PCR reakčná zmes sa použila na subklonovanie tohto DNA fragmentu do plazmidu pUC19, ktorý sa štepil BamHI a HindlII. Výsledný plazmid sa sekvenoval. Takto pripravený plazmid sa označil ako hMBCL/pUC19. V tomto plazmide sa však 104. aminokyselina (zodpovedajúca 96. aminokyseline podľa Kabatovho pravidla) CDR4 nahradila arginínom. Na náhradu tejto aminokyseliny za tyrozín bol navrhnutý a syntetizovaný opravný primér I. Č.: 35). PCR reakcia sa uskutočnila s

Ex Taq (TaKaRa Shuzo Co., Ltd.) a k nej patriaceho pufra. PCR reakčný roztok obsahoval (na 100 μΐ) 0,6 μφ plazmidu hMBL/pUC19 ako templátovej DNA, 50 pmol každého z primérov MBC1LVS1 a MBC1LGP10R, 2,5 U TaKaRa Ex Taq (TaKaRa Shuzo Co., Ltd.) a 0,25 mM dNTP v pufri, na ktorý sa navrstvil minerálny olej (50 μΐ). PCR reakcia sa uskutočnila 30 cyklami, za podmienok: 94 °C - 1 min; 55 °C - 1 min; a 72 °C - 2 min. Takto amplifikované DNA fragmenty sa oddelili pomocou elektroforézy na agarózovom géli z 3 % Nu Sieve GTG agarose (FMC Bio. Products).

MBC1LGP10R (SEQ použitím TaKaRa

Potom sa vyrezala časť agarózového gélu, s obsahom DNA fragmentu s veľkosťou 421 bp, a tento DNA fragment sa z nej purifikoval s použitím GENECLEAN II Kitu (BIO101), podľa inštrukcií, ktoré boli súčasťou tejto súpravy. Takto pripravená PCR reakčná zmes sa použila na subklonovanie tohto DNA fragmentu do plazmidu pUC19, ktorý sa štepil BamHI a HindlII.

Tento plazmid sa sekvenoval s použitím primérov M13 Primér M4 a M13 Primér RV. Ako výsledok sa potvrdilo, že tento plazmid má správnu sekvenciu. Tento plazmid sa potom štepil HindlII a Blnl a DNA fragment s veľkosťou 416 bp sa oddelil elektroforézou na 1 % agarózovom géli. Tento DNA fragment sa purifikoval s použitím GENECLEAN II Kitu (BI0101), podľa

-í

- 58 inštrukcií, ktoré boli súčasúou tento súpravy, a potom sa zaviedol do plazmidu CX/pUC19, ktorý sa štepil HindlII a Blnl. Výsledný plazmid sa označil ako hMBClLaX/pUC19. Tento plazmid sa štepil EcoRI, aby vznikol DNA fragment, kódujúci humanizovaný L-reúazec. Tento DNA fragment sa zaviedol do plazmidu pCOSl tak, aby bol iniciačný kodón pre humanizovaný L-reúazec umiestnený downstream od EFla promótora. Takto získaný plazmid bol označený ako hMBCILaX/pCOSI. DNA sekvencia (vrátane zodpovedajúcej aminokyselinovej sekvencie) humanizovaného L-reúazca verzie a je ukázaná v SEQ I. Č.: 66. Aminokyselinová sekvencia verzie a je tiež ukázaná v SEQ I. Č.: 47.

Humanizovaný L-reúazec verzie b sa pripravil s použitím techniky mutagenézie metódou PCR. Verzia b bola navrhnutá tak, aby sa vo verzii a aminokyselina glycín v 43. pozícii (zodpovedajúca 43. aminokyseline podľa Kabatovho pravidla) nahradila prolínom a aminokyselina lyzín v 49. pozícii (zodpovedajúca 49. aminokyseline podľa Kabatovho pravidla) kyselinou asparagovou. PCR reakcia sa uskutočnila s použitím plazmidu hMBClLaX/pUC19 ako templátu, s mutagénnym pnmérom MBC1LGP5R (SEQ I. Č.: 36) a primérom MBC1LVS1. Získaný DNA fragment sa štepil BamHI a HindlII a fragment po štepení sa subklonoval do BamHI-HindlII miesta pUC19. Po sekvenovaní sa plazmid štepil HindlII a AflII a výsledný fragment sa ligoval s plazmidom hMBClLaX/pUC19, ktorý sa štepil HindlII a AflII.

Takto získaný plazmid sa označil ako hMBClLbl/pUC19. Tento plazmid sa štepil EcoRI, aby vznikol DNA fragment, kódujúci humanizovaný L-reúazec. Tento DNA fragment sa zaviedol do plazmidu pCOSl tak, aby bol iniciačný kodón pre humanizovaný L-reúazec umiestnený downstream od EFla promótora. Takto získaný plazmid sa označil ako hMBCILbÄ/pCOSl.

Humanizovaný L-reúazec verzie c sa pripravil s použitím techniky mutagenézie metódou PCR. Verzia c bola navrhnutá tak, aby sa aminokyselina serín v 84. pozícii (zodpovedajúca 80. aminokyseline podľa Kabatovho pravidla) nahradila prolínom. PCR reakcia sa uskutočnila s použitím plazmidu hMBClLaX/pUC19 ako templátu, s mutagénnym primérom MBC1LGP6S (SEQ I. Č.: 37) a primérom M13 Primer RV. Získaný DNA fragment sa štepil BamHI a HindlII a potom sa subklonoval do pUC19, ktorý sa štepil BamHI a HindlII. Po sekvenovaní sa plazmid štepil BstPI a Aor51HI a výsledný fragment sa ligoval s plazmidom hMBClLaX/pUC19, ktorý sa štepil BstPI a Aor51HI.

Takto získaný plazmid sa označil ako hMBClLcX/pUC19. Tento plazmid sa štepil EcoRI, aby vznikol DNA fragment, kódujúci humanizovaný L-reťazec. Tento DNA fragment sa zaviedol do EcoRI miesta plazmidu pCOSl tak, aby bol iniciačný kodón pre humanizovaný L-reťazec umiestnený downstream od EFla promótora. Takto získaný plazmid sa označil ako hMBCILcX/pCOSI.

Humanizované L-reťazce verzie d, e a f sa tiež pripravili s použitím techniky mutagenézie metódou PCR. Verzie d, e a f boli navrhnuté tak, aby sa aminokyselina tyrozín v 91. pozícii (zodpovedajúca 87. aminokyseline podľa Kabatovho pravidla) nahradila izoleucínom, jednotlivo vo verziách a, b a c. Pre každú z verzií d, e a f sa uskutočnila PCR reakcia s použitím plazmidu hMBClLaX/pUC19 (pre verziu d), hMBClLbX/pUC19 (pre verziu e) a hMBClLcI/pUC19 (pre verziu f) ako templátu, mutagénneho priméru MBC1LGP11R (SEQ I. Č.: 38) a priméru M-Sl (SEQ I. Č.: 44). Takto získaný DNA fragment sa štepil BamHI a HindlII a potom sa subklonoval do pUC19, ktorý sa štepil BamHI a HindlII. Po sekvenovaní sa plazmid štepil HindlII a Blnl a výsledný fragment sa ligoval s plazmidom CX/pUC19, ktorý sa štepil HindlII a Blnl.

Takto získané plazmidy sa jednotlivo označili ako hMBClLdX/pUC19 (pre verziu d), hMBClLeX/pUC19 (pre verziu e) a hMBClLfI/pUC19 (pre verziu f). Každý z týchto plazmidov sa štepil EcoRI, aby vznikol DNA fragment, kódujúci humanizovaný L-reťazec. Tento DNA fragment sa zaviedol do EcoRI miesta plazmidu pCOSl tak, aby bol iniciačný kodón pre humanizovaný L-reťazec umiestnený downstream od EFla promótora. Takto získané plazmidy sa jednotlivo označili ako hMBClLdX/pCOSl (pre verziu d), hMBCILeX/pCOSI (pre verziu e) a hMBCILfX/pCOSI (pre verziu f).

Humanizované L-reťazce verzie g a h sa tiež pripravili s použitím techniky mutagenézie metódou PCR. Verzie g a h boli navrhnuté tak, aby sa jednotlivo vo verziách a a d aminokyselina histidín v 36. pozícii (zodpovedajúca 36. aminokyseline podľa Kabatovho pravidla) nahradila tyrozínom. PCR reakcia sa uskutočnila s použitím mutagénneho priméru MBC1LGP9R (SEQ I. Č.: 39), priméru M13 Primer RV a plazmidu hMBClLak/pUC19. Ďalšie PCR sa uskutočnilo s použitím takto získaného produktu a M13 Primer M4 ako priméru a hMBClLaX/pUC19 ako templátu. Získaný DNA fragment sa štepil Blnl a HindlII a potom sa subklonoval do Ck/pUC19, ktorý sa štepil HindlII a Blnl. S použitím tohto plazmidu ako templátu sa uskutočnila PCR reakcia s primérmi MBC1LGP13R (SEQ I. Č.: 40) a MBC1LVS1. Získaný DNA fragment sa štepil Apal a HindlII a potom sa zaviedol buď do plazmidu hMBClLaX/pUC19 alebo hMBClLdX/pUC19, ktoré sa štepili Apal a HindlII. Získané plazmidy sa sekvenovali. Plazmidy, u ktorých sa potvrdilo, že obsahujú správnu sekvenciu, sa označili ako hMBClLgX/pUC19 (pre verziu g) a hMBClLhX/pUC19 (pre verziu h). Každý z týchto plazmidov sa štepil EcoRI, aby vznikol DNA fragment, kódujúci humanizovaný L-reťazec. Tento DNA fragment sa zaviedol do EcoRI miesta plazmidu pCOSl tak, aby bol iniciačný kodón pre humanizovaný L-reťazec umiestnený dowmnstream od EFla promótora. Takto získaný plazmid sa označil ako hMBCILgX/pCOSI (pre verziu g) a hMBCILhX/pCOSI (pre verziu h).

Humanizované L-reťazce verzie i, j, k, 1, m, n a o sa tiež pripravili s použitím techniky mutagenézie metódou PCR. PCR reakcia sa uskutočnila s použitím plazmidu hMBClLaÄ/pUC19 ako templátu, s mutagénnym primérom MBC1LGP14S (SEQ I. Č.: 41) a primérom V1RV (λ) (SEQ I. Č.: 43). Výsledný DNA fragment sa štepil Apal a Blnl a potom sa subklonoval do plazmidu hMBClLgk/pUC19, ktorý sa štepil Apal a Blnl. Získaný plazmid sa sekvenoval a potom sa vybrali klony, do ktorých sa zaviedla mutácia pre každú verziu. Tento plazmid sa štepil EcoRI, aby vznikol DNA fragment, kódujúci humanizovaný Lreťazec. Tento DNA fragment sa zaviedol do EcoRI miesta plazmidu pCOSl tak, aby bol iniciačný kodón pre humanizovaný

L-rečazec umiestnený downstream od EFla promótora. Takto získaný plazmid sa jednotlivo označil ako hMBCILxÄ/pCOSI (x = i, j, k, 1, m, n alebo o). DNA sekvencie (vrátane zodpovedajúcich aminokyselinových sekvencií) verzií j, 1, m a o sú jednotlivo ukázané v SEQ I. Č.: 67, 68, 69 a 70. Aminokyselinové sekvencie týchto verzií sú tiež jednotlivo ukázané v SEQ I. Č.: 48, 49, 50 a 51.

Humanizované L-rečazce verzie p, q, r boli navrhnuté tak, aby jednotlivo vo verziách i 1 a o sa aminokyselina (tyrozín) v 87. pozícii nahradila izoleucínom. Tieto verzie sa pripravili s reštrikčného miesta pre Aor51MI v FR3 a miesta v každej z verzií i, j miestom z verzie h. T.j. Aor51HI reštrikčný fragment (514 bp) , ktorý obsahuje CDR3, časč FR3 a celý FR4 sa odstránili z expresných plazmidov hMBCILxX/pCOSI (x = i, j, m, 1, alebo o). Do tohto rozdeleného miesta sa ligoval Aor51HI reštrikčný fragment (514 bp) z expresného plazmidu hMBCILhX/pCOSI, ktorý obsahuje CDR3, časú FR3 a celý FR4, takže sa aminokyselina tyrozín v 91. pozícii (zodpovedajúca 87. aminokyseline podľa Kabatovho pravidla) nahradila izoleucínom. Získaný plazmid sa sekvenoval. Vybral sa kloň každej verzie i, j, m, 1 a o, v ktorom sa aminokyselina tyrozín v 91. pozícii (zodpovedajúca 87. aminokyseline podľa Kabatovho pravidla) nahradila izoleucínom. Tieto modifikované verzie, jednotlivo zodpovedajúce verziám i, j, m, 1 a o, sa jednotlivo označili ako verzie p, q, r, s a t. Získaný plazmid sa jednotlivo označil ako hMBClLxX/pCOSl (x = p, q, s, r alebo t). DNA sekvencie (vrátane zodpovedajúcich aminokyselinových sekvencií) verzií p, q, r, sú jednotlivo ukázané v SEQ I. Č.: 71, 72, sekvencie týchto verzií sú tiež Č. : 52, 53, 54 a 55.

Aminokyselinové ukázané v SEQ I

II J II

II f- II m, použitím nahradením tohto h n mu „mu, „ i u _a h_oh týmto s a t a 74. jednotlivo

Plazmid hMBCILqX/pCOSI sa štepil HindlII a EcoRI a potom sa subklonoval do plazmidu pUC19, ktorý sa štepil HindlII a EcoRI. Takto získaný plazmid sa označil ako hMBC!LqX/pUC19.

Pozície nahradených aminokyselín v jednotlivých verziách humanizovaného L-rečazca sú ukázané nižšie, v tabuľke 2.

Tabuľka 2

Pozícia nahradených aminokyselín v sekvenciách (číslovanie aminokyselín podľa Kabatovho pravidla)

Verzia 36

47 49 a

b c

d e

f g

h i

j k

m n

o

P q

r s

t

Y

I

K

K V

K

K V

V

D

I

V tabuľke 2 predstavujú veľké písmená nasledujúce aminokyseliny: Y tyrozín, P prolín, K lyzín, V valín, D kyselina asparagová a I izoleucín.

Kmene E. coli, z ktorých každý obsahuje hMBClHcDNA/pUC19 a hMBClLqX/pUC19 sa jednotlivo označili ako Escherichia coli JM109 (hMBClHcDNA/pUC19) a Escherichia coli JM109 hMBClLqX/pUC19, a boli uložené podľa Budapeštianskej dohody v National Inštitúte of Bioscience and Human-Technology, Agency of Industrial Science and Technology, Japonsko (1-3, Higashi 1-chome, Tsakuba-shi, Ibaraki, Japonsko), 15. augusta 1996 pod prístupovým číslom FERM BP-5629 pre Escherichia coli JM109 (hMBClHcDNA/pUC19) a FERM BP-5630 pre Escherichia coli JM 109 hMBClLqX/pUC19.

(5) Transfekcia do buniek COS-7

S cieľom určenia antigén-väzbovej aktivity a neutralizačnej aktivity hybridných protilátok a humanizovaných protilátok #23-57-137-1, sa vyššie pripravené expresné plazmidy piechodne exprimovali v bunkách COS-7. Ma prechodnú expresiu L-reťazcových hybridných protilátok sa do buniek COS7, s použitím Gene Pulseru (Bio Rad), kotransfekovala každá z nasledujúcich kombinácii plazmidov: hMBCIHcDNA/pCOSI a h/mMBCIL(λ)/neo; hMBCIHcDNA/pCOSI a m/hMBCILaX/neo;

hMBCIHcDNA/pCOSI a m/hMBCILdX/neo; hMBCIHcDNA/pCOSI a hmmMBCIL(λ)/neo; a hMBCIHcDNA/pCOSI a mhmMBCIL(λ)/neo. T.j., k bunkovej suspenzii (0,8 ml) buniek COS-7 v PBS (-) (1 x 10⁷ buniek/ml) sa pridala každá kombinácia plazmidových DNA (10 gg každej). Na výsledný roztok sa pôsobilo pulzami pri elektrostatickej kapacite 15000 V a regenerácie pri izbovej teplote sa rozpustili v DMEM médiu, s obsahom 2 % Ultra Low IgG fetálneho teľacieho séra (GIBCO), a potom sa kultivovali s použitím 10 cm kultivačnej nádoby v CO₂ inkubátore. Po kultivácii počas 72 hodín sa zhromaždil supernatant, ktorý sa centrifugoval, aby /zF. Po 10 minútach elektroporizované bunky sa odstránil bunkový debris. Takto pripravené roztoky sa poskytli na použitie v ELISA, nižšie.

Na prechodnú expresiu humanizovaných protilátok #23-57137-1 sa do buniek COS-7, s použitím Gene Pulseru (Bio Rad), kontransfekovala kombinácia plazmidov hMBCIHcDNA/pCOSI a hMBCILx/pCOSI (x = a-t) rovnakým spôsobom, ako je opísané vyššie pre hybridné protilátky. Kultivačné supernatanty sa pripravili a poskytli na použitie v ELISA, nižšie.

Purifikácia hybridných protilátok a humanizovaných protilátok z kultivačných supernatantov buniek COS-7 sa uskutočnili s použitím AffiGel Proteín A MAPSII Kitu (BioRad), podľa inštrukcií, ktoré boli súčasťou tejto súpravy.

(6) ELISA (i) Určenie koncentrácie protilátky

ELISA doštička na určenie koncentrácie protilátky sa pripravila nasledovne. Každá jamka 96 jamkovej ELISA doštičky (Maxisorp NUNC) sa obalila 100 gl obalovacieho pufra (1,0 M NaHCO₃, 0,02 % NaN₃) , s obsahom 1 Mg/ml kozej protiľudskej IgG protilátky (TÁGO) , a potom sa blokovala 200 μΐ zried'ovacieho pufra (50 mM Tris-HCl, 1 mM MgCl₂, 0,1 M NaCl, 0,05 % Tween 20, 0,02 % NaN₃, 1 % hovädzí sérový albumín (BSA); pH 7,2) . Do každej z týchto jamiek sa zvlášť pridalo každé zo zriedení riediaceho radu kultivačného supernatantu buniek COS-7, v ktorom sa exprimovala zvlášť každá z hybridných protilátok alebo humanizovaných protilátok, alebo sa do nej zvlášť pridalo každé zo zriedení riediaceho radu každej z hybridných protilátok alebo humanizovaných protilátok v purifikovanej forme. Doštička sa inkubovala pri izbovej teplote počas 1 hodiny a premyla sa PBS-Tween 20. Následne sa do každej z jamiek pridalo 100 μΐ kozej protiľudskej IgG protilátky spojenej s alkalickou fosfatázou (TÁGO). Doštička sa inkubovala pri izbovej teplote počas 1 hodiny a premyla sa PBS-Tween 20. Následne sa do každej z jamiek pridal 1 mg/ml substrátového roztoku (Sigma 104, kyselina pnitrofenylfosforečná, SIGMA). V roztoku v každej z jamiek sa s cieľom určenia koncentrácie protilátky merala jeho absorbancia pri 405 nm, s použitím Microplate Readera (Bio Rad). Pri tomto meraní sa ako štandard použil Hu IgGlX Purified (The Binding Site).

(ii) Určenie antigén-väzbovéj aktivity

ELISA doštička na určenie antigén-väzbovej aktivity sa pripravila nasledovne. Každá jamka 96 jamkovej ELISA doštičky (Maxisorp NUNC) sa obalila 100 μΐ obalovacieho pufra, s obsahom 1 Mg/ml ľudského PTHrP (1-34), a potom sa blokovala 200 μΐ zrieďovacieho pufra. Následne sa do každej jamiek zvlášč pridalo každé zo zriedení kultivačného supernatantu buniek COS-7, z hybridných z týchto riediaceho radu v ktorom sa protilátok alebo exprimovala zvlášt každá humanizovaných protilátok, alebo sa do nej zvlášč pridalo každé zo zriedení riediaceho radu každej z hybridných protilátok alebo humanizovaných protilátok v purifikovanej izbovej teplote počas 1 Následne sa do každej z kozej protiľudskej IgG forme. Doštička sa inkubovala pri hodiny a premyla sa PBS-Tween 20. jamiek pridalo 100 μΐ roztoku protilátky spojenej s alkalickou fosfatázou (TÁGO). Doštička sa inkubovala pri izbovej teplote počas 1 hodiny a premyla sa PBS-Tween 20. Následne sa do každej z jamiek pridal 1 mg/ml substrátového roztoku (Sigma 104, kyselina pnitrofenylfosforečná, SIGMA). V roztoku sa merala jeho absorbancia pri 405 nm, s použitím Microplate Readera (Bio Rad) .

(7) Potvrdenie aktivít (i) Hodnotenie humanizovaného H-režazca

Zistilo sa, že protilátka, ktorá má humanizovaný Hrečazec verzie a a chimérny L-rečazec, vykazuje rovnakú úroveň PTHrP-väzbovej aktivity ako chimérna protilátka (viď.

obr. 6) . Tento výsledok naznačuje, humanizáciu H-rečazcovej V-oblasti na meranie humanizácie, sa teda poskytol na že verzia a dosahuje na úrovni, ktorá je Humanizovaný H-rečazec použitie ako H-rečazec postačujúca verzie a humanizovanej protilátky v nasledujúcich pokusoch, (ii) Aktivita hybridných protilátok (ii-a) FR1,2/FR3,4 hybridná protilátka

Keď bol L-reťazcom h/mMBClL(X), nebola pozorovaná žiadna antigén-väzbová aktivita. Naopak, keď bol L-reťazcom buď m/hMBCILaX alebo m/hMBCILdX, bola pozorovaná rovnaká úroveň antigén-väzbovej aktivity ako u chimérnej protilátky #23-57137-1 (obr. 7). Tieto výsledky naznačujú, že tu nie sú problémy vzhľadom na FR3 a FR4, ale že existuje aminokyselinový zvyšok (zvyšky), ktorý je potrebný na prípravu humanizovanej protilátky zameniť v FR1 a FR2.

(ii-b) FR1/FR2 hybridné protilátky

Keď bol L-retazcom mhmMBCIL(λ), nebola pozorovaná žiadna antigén-väzbová aktivita. Naopak, keď bol L-reťazcom hmmMBClL(X) , bola pozorovaná rovnaká úroveň antigén-väzbovej aktivity ako u chimérnej protilátky #23-57-137-1 (obr. 8) . Tieto výsledky naznačujú, že tu nie sú problémy vzhľadom na FR1, ale že existuje aminokyselinový zvyšok (zvyšky), ktorý je potrebný na prípravu humanizovanej protilátky zameniť FR2.

(iii) Aktivita humanizovaných protilátok

U humanizovaných protilátok, ktoré majú jednotlivo Lretazec verzie a až t, sa určovala antigén-väzbová aktivita. Ako výsledok sa zistilo, že humanizované protilátky, ktoré majú L-retazec verzie j, 1, m, o, q,r, s a t vykazujú rovnakú úroveň PTHrP-väzbovéj aktivity ako chimérna protilátka (obr. 9 až 12).

(8) Založenie bunkovej línie CHO, schopnej stabilnej produkcie protilátky

Na založenie bunkovej línie, schopnej stabilnej produkcie humanizovaných protilátok, sa každý z vyššie pripravených expresných plazmidov zaviedol do buniek CHO (DXB11).

T.j., založenie bunkovej línie, schopnej stabilnej produkcie humanizovanej protilátky, sa uskutočnilo s použitím každej z nasledujúcich kombinácii plazmidov, ako expresných vektorov pre bunky CHO: hMBCIHcDNA/pCHOl a hMBCILmX/pCOSI; hMBCIHcDNA/pCHOl a hMBCILqX/pCOSI; a hMBCIHcDNA/pCHOl a hMBCILrX/pCOSI. Plazmidy sa do buniek CHO kotransfekovali elektroporizáciou s použitím Gene Pulseru (Bio Rad) . Následne sa tieto expresné vektory oddelene štepili reštrikčným enzýmom

Pvul, aby vznikli lineárne fragmenty. Výsledné DNA fragmenty sa extrahovali fenolom a chloroformom a potom sa vyzrážali etanolom. Takto pripravené DNA fragmenty sa použili v následnej elektroporizácii.

T.j., fragmenty plazmidovéj DNA (10 μg každej) sa pridali k 0,8 ml bunkovej suspenzie buniek CHO v PBS(-) (1 x 10⁷ buniek/ml). Na elektrostatickej regenerácie pri rozpustili v MEM-α médiu sa pôsobilo pulzami pri a 25 μι. Po 10 minútach upravené bunky sa takto s obsahom 10 % fetálneho výsledný roztok kapacite 15000 V izbovej teplote (GIBCO), teľacieho séra (GIBCO), a potom sa kultivovali v C0₂ inkubátore s použitím 96 jamkových doštičiek (Falcon). Nasledujúci deň po kultivácii sa médium nahradilo MEM-α selektívnym médiom bez ribonukleozidov či deoxyribonukleozidov, s obsahom 10 % fetálneho teľacieho séra (GIBCO) a 500 mg/ml GENETICINU (G418Sulfate; GIBCO). Z kultivačného média sa bunky, do ktorých sa zaviedol gén pre antibiotikum médium sa nahradilo čerstvým médiom. Asi dva nahradení média sa bunky pozorovali pod mikroskopom. Keď bol pozorovaný vhodný bunkový rast, určilo sa u týchto buniek množstvo produkovanej protilátky bežnou metódou ELISA na určovanie koncentrácie protilátky, ako je uvedené vyššie. Medzi týmito bunkami sa hľadali tie, ktoré produkujú väčšie množstvo protilátok.

selektovali Kultivačné týždne po

Kultivácia založenej bunkovej línie, schopnej stabilnej produkcie protilátok, použitím MEM-a deoxyribonukleozidov, sa uskutočnila vo valcovej nádobe, s média bez ribonukleozidov či s obsahom 2 % Ultra Low IgG fetálneho teľacieho séra. Tretí a štvrtý deň kultivácie sa zhromaždil supernatant, ktorý sa filtroval s použitím 0,2 μπι filtra aby sa z neho odstránil bunkový debris.

humanizovaných protilátok z kultivačného buniek CHO sa uskutočnila s použitím POROS Column (PerSeptive Biosystems) na ConSep LC100 (Millipore), podľa priložených inštrukcií. Humanizované protilátky sa poskytli na použitie pri určovaní neutralizačnej aktivity a testovaní farmakologickej účinnosti na hyperkalcemických modelových zvieratách. Koncentrácia a (Millipore) , Punf ikácia supernatantu Proteín A antigén-väzbová aktivita purifikovaných humanizovaných protilátok sa určila systémom ELISA, ako je uvedené vyššie.

Príklad 7

Určenie neutralizačnej aktivity

Určenie neutralizačnej aktivity myších protilátok, chimérnych protilátok a humanizovaných protilátok sa uskutočnilo s použitím buniek krysej myelomovej bunkovej línie ROS17/2,8-5. Bunky ROS17/2,8-5 sa kultivovali v Ham'S F-12 médiu (GIBCO) , s obsahom 10 % fetálneho teľacieho séra (GIBCO) v CO₂ inkubátore. Bunky ROS17/2,8-5 sa vysiali do každej jamky 96 jamkovej doštičky v množstve 10“ buniek/100 μΐ/jamka a kultivovali sa 1 deň. Po dokončení kultivácie sa kultivačné médium nahradilo Ham'S F-12 médiom (GIBCO), s obsahom 4 mM hydrokortizónu a 10 % fetálneho teľacieho séra. Po kultivácii počas troch až štyroch dní sa kultivované bunky premyli 260 μΐ Ham'S F-12 média (GIBCO) a potom sa pridalo 80 μΐ Ham'S F-12 média, s obsahom 1 mM izobutyl-l-metylxantínu (IBMX, SIGMA), 10 % fetálneho teľacieho séra a 10 mM HEPES. Výsledná zmes sa inkubovala pri 37 °C počas 30 min.

Kultivačné média myších protilátok, chimérnych protilátok a humanizovaných protilátok na testovanie na neutralizačnú akivitu sa najskôr sériovo zriedili v nasledujúcich skupinách: [10 μg/ml, 3,3 μg/ml, 1,1 μg/ml a 0,37 μg/ml] , [10 μg/ml, 2 μg/ml, 0,5 μg/ml a 0,01 μg/ml] a [10 μg/ml, 1,25 μg/ml, 0,63 μg/ml a 0,31 μg/ml]. Každý zo vzorkových roztokov zriedenej protilátky sa zmiešal s ekvivalentným množstvom 4 ng/ml PTHrP (1-34). Výsledný premiešaný roztok (80 μΐ) sa pridal do každej z jamiek. V každej jamke sa konečná koncentrácia zmenila na štvrtinovú v porovnaní s vyššie uvedenou koncentráciou protilátok a podľa toho sa aj koncentrácia PTHrP (1-34) zmenila na 1 ng/ml. Po pôsobení pri izbovej teplote počas 10 min sa kultivačný supernatant odstránil a zvyšok sa trikrát premyl PBS. Následne sa z buniek 100 μΐ 0,3 % HCl-95 % etanolom extrahovalo cAMP a potom sa zahustilo s použitím vodnej vývevy, aby sa odstránil HCl-etanol. Zvyšok sa rozpustil v 120 μΐ EIA pufra, ktorý bol súčasťou cAMP EIA Kitu (CAYMAN CHEMICALS), aby sa z neho extrahovalo cAMP. cAMP bolo určené s použitím cAMP EIA Kitu (CAYMAN CHEMICALS) podľa inštrukcií, ktoré boli súčasťou tejto súpravy. Ako výsledok sa zistilo, že medzi humanizovanými protilátkami, ktoré majú rovnakú úroveň antigén-väzbovéj aktivity ako chimérne protilátky, vykazovali najbližšiu neutralizačnú aktivitu k aktivite chimérnych protilátok tie, ktoré majú L-reťazec verzie g, r, s a t (kde bol tyrozín v pozícii 91 nahradený izoleucínom) a tie, ktoré majú L-reťazec verzie q vykázali najsilnejšiu neutralizačnú aktivitu (obr. 15 až 15).

Priemyselná využiteľnosť

Ako liečivo schopnú je opísané vyššie, poskytuje na kachexiu, ktoré obsahuje ako inhibíce väzby medzi PTHrP a jeho predkladaný vynález aktívnu zložku látku, receptorom.

V testoch farmakologickej účinnosti, ktoré využívajú zvieracie modely kachexie, môže takáto látka zabraňovať strate hmotnosti a môže predĺžiť čas prežitia v porovnaní s kontrolou. Táto látka je teda užitočná na liečenie kachexie.

Zoznam sekvencii (2) INFORMÁCIE O SEQ I. Č.: 1:

(i) CHARAKTERISTIKY SEKVENCIE:

(A) DĹŽKA: 20 párov báz (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET REŤAZCOV: jeden (D) TOPO1ÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: iná nukleová kyselina (A) OPIS: /opis = syntetická DNA (xi) OPIS SEKVENCIE: SEQ I. Č.: 1:

AAATAGCCCT TGACCAGGCA (2) INFORMÁCIE O SEQ I. Č.: 2:

(i) CHARAKTERISTIKY SEKVENCIE:

(A) DĹŽKA: 38 párov báz (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET REŤAZCOV: jeden (D) TOPO1ÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: iná nukleová kyselina (A) OPIS: /opis = syntetická DNA (xi) OPIS SEKVENCIE: SEQ I. Č.: 2:

CTGGTTCGGC CCACCTCTGA AGGTTCCAGA ATCGATAG (2) INFORMÁCIE O SEQ I. Č.: 3:

(i) CHARAKTERISTIKY SEKVENCIE:

(A) DĹŽKA: 28 párov báz (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET REŤAZCOV: jeden (D) TOPO1ÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: iná nukleová kyselina (A) OPIS: /opis = syntetická DNA (xi) OPIS SEKVENCIE: SEQ I. Č.: 3: GGATCCCGGG CCAGTGGATA GACAGATG (2) INFORMÁCIE O SEQ I. Č.: 4:

(i) CHARAKTERISTIKY SEKVENCIE:

(A) DĹŽKA: 29 párov báz (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET REŤAZCOV: jeden (D) TOPO1ÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: iná nukleová kyselina (A) OPIS: /opis = syntetická DNA (xi) OPIS SEKVENCIE: SEQ I. Č.: 4:

GGATCCCGGG TCAGRGGAAG GTGGRAACA (2) INFORMÁCIE O SEQ I. Č.: 5:

(i) CHARAKTERISTIKY SEKVENCIE:

(A) DĹŽKA: 17 párov báz (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET REŤAZCOV: jeden (D) TOPO1ÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: iná nukleová kyselina (A) OPIS: /opis = syntetická DNA (xi) OPIS SEKVENCIE: SEQ I. Č.: 5:

GTTTTCCCAG TCACGAC (2) INFORMÁCIE O SEQ I. Č.: 6:

(i) CHARAKTERISTIKY SEKVENCIE:

(A) DĹŽKA: 17 párov báz (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET REŤAZCOV: jeden (D) TOPO1ÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: iná nukleová kyselina • ' *<**£,·» _f

T?H^:ŕr r^. ^j **'

- 72 (A) OPIS: /opis = syntetická DNA (xi) OPIS SEKVENCIE: SEQ I. Č.: 6: CAGGAAACAG CTATGAC (2) INFORMÁCIE 0 SEQ I. Č.: 7:

(i) CHARAKTERISTIKY SEKVENCIE:

(A) DĹŽKA: 31 párov báz (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET REŤAZCOV: jeden (D) TOPO1ÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: iná nukleová kyselina (A) OPIS: /opis = syntetická DNA (xi) OPIS SEKVENCIE: SEQ I. Č.: 7: GTCTAAGCTT CCACCATGAA ACTTCGGGCT C (2) INFORMÁCIE O SEQ I. Č.: 8:

(i) CHARAKTERISTIKY SEKVENCIE:

(A) DĹŽKA: 30 párov báz (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET REŤAZCOV: jeden (D) TOPO1ÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: iná nukleová kyselina (A) OPIS: /opis = syntetická DNA (xi) OPIS SEKVENCIE: SEQ I. Č.: 8:

TGTTGGATCC CTGCAGAGAC AGTGACCAGA (2) INFORMÁCIE O SEQ I. Č.: 9:

(i) CHARAKTERISTIKY SEKVENCIE:

(A) DĹŽKA: 36 párov báz (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET REŤAZCOV: jeden (D) TOPO1ÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: iná nukleová kyselina (A) OPIS: /opis = syntetická DNA (xi) OPIS SEKVENCIE: SEQ I. Č.: 9:

GTCTGAATTC AAGCTTCCAC CATGGGGTTT GGGCTG (2) INFORMÁCIE 0 SEQ I. Č.: 10:

(i) CHARAKTERISTIKY SEKVENCIE:

(A) DĹŽKA: 41 párov báz (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET REŤAZCOV: jeden (D) TOPO1ÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: iná nukleová kyselina (A) OPIS: /opis = syntetická DNA (xi) OPIS SEKVENCIE: SEQ I. Č.: 10:

TTTCCCGGGC CCTTGGTGGA GGCTGAGGAG ACGGTGACCA G (2) INFORMÁCIE O SEQ I. Č.: 11:

(i) CHARAKTERISTIKY SEKVENCIE:

(A) DĹŽKA: 109 párov báz (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET REŤAZCOV: jeden (D) TOPO1ÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: iná nukleová kyselina (A) OPIS: /opis = syntetická DNA (xi) OPIS SEKVENCIE: SEQ I. Č.: 11:

GTCTGAATTC AAGCTTAGTA CTTGGCCAGC CCAAGGCCAA CCCCACGGTC ACCCTGnCC 60

CGCCCTCCTC TGAGGAGCTC CAAGCCAACAAGGCCACACT AGTGTGTCT 109 (2) INFORMÁCIE O SEQ I. Č.: 12:

(i) CHARAKTERISTIKY SEKVENCIE:

(A) DĹŽKA: 110 párov báz (B) TYP: nukleová kyselina

- 74 (C) POČET REŤAZCOV: jeden (D) TOPO1ÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: iná nukleová kyselina (A) OPIS: /opis = syntetická DNA (xi) OPIS SEKVENCIE: SEQ I. Č.: 12:

GGTTTGGTGG TCTCCACTCC CGCCTTGACG GGGCTGCCAT CTGCCTTCCA GGCCACTGTC ACAGCTCCCG GGTAGAAGTC ACTGATCAGA CACACTAGTG TGGCCTTGTT (2) INFORMÁCIE O SEQ I. Č.: 13:

(i) CHARAKTERISTIKY SEKVENCIE:

(A) DĹŽKA: 98 párov báz (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET REŤAZCOV: jeden (D) TOPO1ÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: iná nukleová kyselina (A) OPIS: /opis = syntetická DNA (xi) OPIS SEKVENCIE: SEQ I. Č.: 13:

GGAGTGGAGA CCACCAAACC CTCCAAACAG AGCAACAACA AGTACGCGGC CAGCAGCTAC CTGAGCCTGA CGCCCGAGCA CTGGAAGTCC CACAGAAG (2) INFORMÁCIE O SEQ I. Č.: 14:

(i) CHARAKTERISTIKY SEKVENCIE:

(A) DĹŽKA: 106 párov báz (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET REŤAZCOV: jeden (D) TOPO1ÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: iná nukleová kyselina (A) OPIS: /opis = syntetická DNA (xi) OPIS SEKVENCIE: SEQ I. Č.: 14:

110

TGITGAATTC TTACTATGAA CATTCTGTAG GGGCCACTCT CTTCTCCACG CTGCTCCCTT 60 CATGCGTGAC CTGGCAGCTG TAGCTTCTCT GGGACTTCCA CTGCTC 106

-Š:.·

- 75 (2) INFORMÁCIE O SEQ I. Č.: 15:

(i) CHARAKTERISTIKY SEKVENCIE:

(A) DĹŽKA: 43 párov báz (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET REŤAZCOV: jeden (D) TOPO1ÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: iná nukleová kyselina (A) OPIS: /opis = syntetická DNA (xi) OPIS SEKVENCIE: SEQ I. Č.: 15:

GTCTGAATTC AAGCTTAGTA CTTGGCCAGC CCAAGGCCAA CCC (2) INFORMÁCIE O SEQ I. Č.: 16:

(i) CHARAKTERISTIKY SEKVENCIE:

(A) DĹŽKA: 20 párov báz (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET REŤAZCOV: jeden (D) TOPO1ÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: iná nukleová kyselina (A) OPIS: /opis = syntetická DNA (xi) OPIS SEKVENCIE: SEQ I. Č.: 16:

TGTTGAATTC TTACTATGAA (2) INFORMÁCIE O SEQ I. Č.: 17:

(i) CHARAKTERISTIKY SEKVENCIE:

(A) DĹŽKA: 39 párov báz (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET REŤAZCOV: jeden (D) TOPO1ÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: iná nukleová kyselina (A) OPIS: /opis = syntetická DNA (xi) OPIS SEKVENCIE: SEQ I. Č.: 17:

- 76 CAACAAGTAC GCGGCCAGCA GCTACCTGAG CCTGACGCC (2) INFORMÁCIE O SEQ I. Č.: 18:

(i) CHARAKTERISTIKY SEKVENCIE:

(A) DĹŽKA: 39 párov báz (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET REŤAZCOV: jeden (D) TOPO1ÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: iná nukleová kyselina (A) OPIS: /opis = syntetická DNA (xi) OPIS SEKVENCIE: SEQ I. Č.: 18:

GTAGCTGCTG GCCGCGTACT TGTTGTTGCT CTGTTTGGA (2) INFORMÁCIE O SEQ I. Č.: 19:

(i) CHARAKTERISTIKY SEKVENCIE:

(A) DĹŽKA: 46 párov báz (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET REŤAZCOV: jeden (D) TOPO1ÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: iná nukleová kyselina (A) OPIS: /opis = syntetická DNA (xi) OPIS SEKVENCIE: SEQ I. Č.: 19:

GTCTGAATTC AAGCTTAGTC CTAGGTCGAA CTGTGGCTGC ACCATC (2) INFORMÁCIE O SEQ I. Č.: 20:

(i) CHARAKTERISTIKY SEKVENCIE:

(A) DĹŽKA: 34 párov báz (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET REŤAZCOV: jeden (D) TOPO1ÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: iná nukleová kyselina (A) OPIS: /opis syntetická DNA

II i

(xi) OPIS SEKVENCIE: SEQ I. Č.: 20:

TGTTGAATTC TTACTAACAC TCTCCCCTGT TGAA (2) INFORMÁCIE O SEQ I. Č.: 21:

(i) CHARAKTERISTIKY SEKVENCIE:

(A) DĹŽKA: 35 párov báz (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET REŤAZCOV: jeden (D) TOPO1ÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: iná nukleová kyselina (A) OPIS: /opis = syntetická DNA (xi) OPIS SEKVENCIE: SEQ I. Č.: 21:

GTCTAAGCTT CCACCATGGC CTGGACTCCT CTCTT (2) INFORMÁCIE O SEQ I. Č.: 22:

(i) CHARAKTERISTIKY SEKVENCIE:

(A) DĹŽKA: 48 párov báz (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET REŤAZCOV: jeden (D) TOPO1ÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: iná nukleová kyselina (A) OPIS: /opis = syntetická DNA (xi) OPIS SEKVENCIE: SEQ I. Č.: 22:

TGTTGAATTC AGATCTAACT ACTTACCTAG GACAGTGACC TTGGTCCC (2) INFORMÁCIE O SEQ I. Č.: 23:

(i) CHARAKTERISTIKY SEKVENCIE:

(A) DĹŽKA: 128 párov báz (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET REŤAZCOV: jeden (D) TOPO1ÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: iná nukleová kyselina (A) OPIS: /opis = syntetická DNA (xi) OPIS SEKVENCIE: SEQ I. Č.: 23:

GTCTAAGCTT CCACCATGGG GTTTGGGCTG AGCTQGGTTT TCCTCGTTGC TCTTTTAAGA 60 GGTGTCCAGT GTCAGGTGCA GCTGCTGGAG TCTGGGGGAG GCCTGCTCCA GCCTGGGAGG 120 TCCCTGAG 128 (2) INFORMÁCIE O SEQ I. Č.: 24:

(i) CHARAKTERISTIKY SEKVENCIE:

(A) DĹŽKA: 125 párov báz (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET REŤAZCOV: jeden (D) TOPO1ÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: iná nukleová kyselina (A) OPIS: /opis = syntetická DNA (xi) OPIS SEKVENCIE: SEQ I. Č.: 24:

ACCATTAGTA CTGCTGCTAG TTACACCTAC TATCCAGACA GTGTGAAGGG GCGAľľCACC G0 ATCTCCAGAG ACAATTCCAA GAACACGCTG TATCTGCAAA TGAACAGCCT GAGAGCTGAG 120 GACAC ¹²⁵ (2) INFORMÁCIE O SEQ I. Č.: 25:

(i) CHARAKTERISTIKY SEKVENCIE:

(A) DĹŽKA: 132 párov báz (B) TYP.- nukleová kyselina (C) POČET REŤAZCOV: jeden (D) TOPO1ÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: iná nukleová kyselina (A) OPIS: /opis = syntetická DNA (xi) OPIS SEKVENCIE: SEQ I. Č.: 25:

CTACCACCAC TACTAATGCT TGCCACCCAC TCCAGCCCCT TGCCTGGAGC CTGGCGGACC 60 CAAGACATGC CATAGCTACT GAAGCTGAAT CCAGAGGCTG CACAGGAGAG TCTCAGGGAC 120 CTCCCAGGCT GG ¹³² (2) INFORMÁCIE O SEQ I. Č.: 26:

(i) CHARAKTERISTIKY SEKVENCIE:

(A) DĹŽKA: 110 párov báz

4*

- 79 (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET REŤAZCOV: jeden (D) TOPO1ÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: iná nukleová kyselina (A) OPIS: /opis = syntetická DNA (xi) OPIS SEKVENCIE: SEQ I. Č.: 26:

TGTľGGATCC CTGAGGAGAC GGTGACCAGG GTTCCCTGGC CCCAGTAAGC AAAGTAAGTC ATAGTAGTCT GTCTCGCACA GTAATACACA GCCGTGTCCT CAGCTCTCAG (2) INFORMÁCIE O SEQ I. Č.: 27:

(i) CHARAKTERISTIKY SEKVENCIE:

(A) DĹŽKA: 30 párov báz (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET REŤAZCOV: jeden (D) TOPO1ÓGIA: lineárna (u) TYP MOLEKÚL!: iná nukleová kyselina (A) OPIS: /opis = syntetická DNA (xi) OPIS SEKVENCIE: SEQ I. Č.: 27:

GTCTAAGCTT CCACCATGGG GTTTGGGCTG (2) INFORMÁCIE O SEQ I. Č.: 28:

(i) CHARAKTERISTIKY SEKVENCIE:

(A) DĹŽKA: 30 párov báz (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET REŤAZCOV: jeden (D) TOPO1ÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: iná nukleová kyselina (A) OPIS: /opis = syntetická DNA (xi) OPIS SEKVENCIE: SEQ I. Č.: 28: TGTTGGATCC CTGAGGAGAC GGTGACCAGG (2) INFORMÁCIE O SEQ I. Č.: 29:

110 (i) CHARAKTERISTIKY SEKVENCIE:

(A) DĹŽKA: 133 párov báz (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET REŤAZCOV: jeden (D) TOPO1ÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: iná nukleová kyselina (A) OPIS: /opis = syntetická DNA (xi) OPIS SEKVENCIE: SEQ I. Č.: 29:

ACAAAGCITC CACCATGGCC TGGACTCCTC TCTTCTTCTT CTTTGTTCTT CATTGCTCAG 60 gttctttctc ccagcttgtg ctgactcaat OGCCCTCTGC CTCTGCCTCC CTGGGAGCCT 120 CGGTCAAGCT CAC 133 (2) INFORMÁCIE O SEQ I. Č.: 30:

(i) CHARAKTERISTIKY SEKVENCIE:

(A) DĹŽKA: 118 párov báz (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET REŤAZCOV: jeden (D) TOPO1ÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: iná nukleová kyselina (A) OPIS: /opis = syntetická DNA (xi) OPIS SEKVENCIE: SEQ I. Č.: 30:

AGCAAGATGG AAGCCACAGC ACAGCTCATG GGAITCCTGA TCGCTTCTCA GGCTCCAGCT 60 CTGGGGCTGA GCGCTACCTC ACCATCTCCA GCCTCCAGTC TGAGGATGAG GCTGACTA 118 (2) INFORMÁCIE O SEQ I. Č.: 31:

(i) CHARAKTERISTIKY SEKVENCIE:

(A) DĹŽKA: 128 párov báz (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET REŤAZCOV: jeden (D) TOPO1ÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: iná nukleová kyselina (A) OPIS: /opis = syntetická DNA

I (xi) OPIS SEKVENCIE: SEQ I. Č.: 31:

CTGTGGCTTC CATCTTGCTT AAGTTTCATC AAGTACCGAG GGCCCTTCTC TGGCTGCTGC 60 TGATGCCATT CAATGCTÚTA CGTACTGTGC TGACTACTCA AGGTGCAGGT GAGCITGACC 120 GAGGCTCC 128 (2) INFORMÁCIE O SEQ I. Č.: 32:

(i) CHARAKTERISTIKY SEKVENCIE:

(A) DĹŽKA: 114 párov báz (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET REŤAZCOV: jeden (D) TOPO1ÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: iná nukleová kyselina (A) OPIS: /opis = syntetická DNA (xi) OPIS SEKVENCIE: SEQ I. Č.: 32:

CTTGGATCCG GGCTGACCTA GGACGGTCAG TTTGGTCCCT CCGCCGAACA CCCTCACAAA 60 TTGTTCCTTA ATTGTATCAC CCACACCACA GTAATAGTCA GCCTCATCCT CAGA 114 (2) INFORMÁCIE O SEQ 1. Č.: 33:

(i) CHARAKTERISTIKY SEKVENCIE:

(A) DĹŽKA: 17 párov báz (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET REŤAZCOV: jeden (D) TOPO1ÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: iná nukleová kyselina (A) OPIS: /opis = syntetická DNA (xi) OPIS SEKVENCIE: SEQ I. Č.: 33:

ACAAAGCTTC CACCATG (2) INFORMÁCIE O SEQ I. Č.: 34:

(i) CHARAKTERISTIKY SEKVENCIE:

(A) DĹŽKA: 19 párov báz (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET REŤAZCOV: jeden (D) T0P01ÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: iná nukleová kyselina (A) OPIS: /opis = syntetická DNA (xi) OPIS SEKVENCIE: SEQ I. Č.: 34:

CTTGGATCCG GGCTGACCT (2) INFORMÁCIE O SEQ I. Č.: 35:

(i) CHARAKTERISTIKY SEKVENCIE:

(A) DĹŽKA: 75 párov báz (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET REŤAZCOV: jeden (D) TOPO1ÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: iná nukleová kyselina (A) OPIS: /opis = syntetická DNA (xi) OPIS SEKVENCIE: SEQ I. Č.: 35:

CTTGGATCCG GGCTGACCTA CGACGGTCAG TTTGGTCCCT CCGCCGAACA COTACACAAA 60 TTGTTCCTTA ATTGT ⁷⁵ (2) INFORMÁCIE O SEQ I. Č.: 36:

(i) CHARAKTERISTIKY SEKVENCIE:

(A) DĹŽKA: 43 párov báz (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET REŤAZCOV: jeden (D) TOPO1ÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: iná nukleová kyselina (A) OPIS: /opis = syntetická DNA (xi) OPIS SEKVENCIE: SEQ I. Č.: 36:

AAAGGATCCT TAAGATCCAT CAAGTACCGA GGGGGTTCT CTG (2) INFORMÁCIE O SEQ I. Č.: 37:

(i) CHARAKTERISTIKY SEKVENCIE:

(A) DĹŽKA: 46 párov báz (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET REŤAZCOV: jeden (D) TOPO1ÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: iná nukleová kyselina (A) OPIS: /opis = syntetická DNA (xi) OPIS SEKVENCIE: SEQ I. Č.: 37: ACAAAGCTTA GCGCTACCTC ACCATCTCCA GCCTCCAGCC (2) INFORMÁCIE O SEQ I. Č.: 38:

(i) CHARAKTERISTIKY SEKVENCIE:

(A) DĹŽKA: 111 párov báz (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET REŤAZCOV: jeden (D) TOPO1ÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: iná nukleová kyselina (A) OPIS: /opis = syntetická DNA (xi) OPIS SEKVENCIE: SEQ I. Č.: 38:

CTTGGATCCG GGCTGACCTA GGACGGTCAG TTTGGTCCCT CCGCCGAACA CGTACACAAA

TTGTTCCTTA ATTGTATCAC CCACACCACA GATATAGTCA GCCTCATCCT C (2) INFORMÁCIE O SEQ I. Č.: 39:

(i) CHARAKTERISTIKY SEKVENCIE:

(A) DĹŽKA: 42 párov báz (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET REŤAZCOV: jeden (D) TOPO1ÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: iná nukleová kyselina (A) OPIS: /opis = syntetická DNA (xi) OPIS SEKVENCIE: SEQ I. Č.: 39:

TGAGGA

111

CTTCTCTGGC TGCTGCTGAT ACCATTCAAT GGTGTACGTA CT (2) INFORMÁCIE O SEQ I. Č.: 40:

(i) CHARAKTERISTIKY SEKVENCIE:

(A) DĹŽKA: 26 párov báz (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET REŤAZCOV: jeden (D) TOPO1ÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: iná nukleová kyselina (A) OPIS: /opis = syntetická DNA (xi) OPIS SEKVENCIE: SEQ I. Č.: 40: CGAGGGCCCT TCTCTGGCTG CTGCTG (2) INFORMÁCIE O SEQ I. Č.: 41:

(i) CHARAKTERISTIKY SEKVENCIE:

(A) DĹŽKA: 35 párov báz (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET REŤAZCOV: jeden (D) TOPO1ÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: iná nukleová kyselina (A) OPIS: /opis = syntetická DNA (xi) OPIS SEKVENCIE: SEQ I. Č.: 41: GAGAAGGGCC CTARGTACST GATGRAWCTT AAGCA (2) INFORMÁCIE O SEQ I. Č.: 42:

(i) CHARAKTERISTIKY SEKVENCIE:

(A) DĹŽKA: 35 párov báz (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET REŤAZCOV: jeden (D) TOPO1ÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: iná nukleová kyselina (A) OPIS: /opis = syntetická DNA (xi) OPIS SEKVENCIE: SEQ I. Č.: 42: CACGAATTCA CTATCGATTC TGGAACCTTC AGAGG

¢.: > J (2) INFORMÁCIE O SEQ I. Č.: 43:

(i) CHARAKTERISTIKY SEKVENCIE:

(A) DĹŽKA: 18 párov báz (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET REŤAZCOV: jeden (D) TOPO1ÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: iná nukleová kyselina (A) OPIS: /opis = syntetická DNA (xi) OPIS SEKVENCIE: SEQ I. Č.: 43:

GGCTTGGAGC TCCTCAGA (2) INFORMÁCIE O SEQ I. Č.: 44:

(i) CHARAKTERISTIKY SEKVENCIE:

(A) DĹŽKA: 20 párov báz (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET REŤAZCOV: jeden (D) TOPO1ÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: iná nukleová kyselina (A) OPIS: /opis = syntetická DNA (xi) OPIS SEKVENCIE: SEQ I. Č.: 44: GACAGTGGTT CAAAGTTTTT (2) INFORMÁCIE O SEQ I. Č.: 45:

(i) CHARAKTERISTIKY SEKVENCIE:

(A) DĹŽKA: 118 aminokyselín (B) TYP: aminokyselina (D) TOPO1ÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: proteín (xi) OPIS SEKVENCIE: SEQ I. Č.: 45:

i ^;ττ;'-Γ ’ S3ú«:·

Gin Leu Val Leu Thr Gin Ser Ser Ser Ala Ser Phe Ser Leu Gly

10 15

Ala Ser Ala Lys Leu Thr Cys Thr Leu Ser Ser Gin His Ser Thr 20 25 30

Tyr Thr Íle Glu Trp Tyr Gin Gin Gin Pro Leu Lys Pro Pro Lys 35 40 45

Tyr Val Met Asp Leu Lys Gin Asp Gly Ser His Ser Thr Gly Asp 50 55 60

Gly íle Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Ser Ser Gly Ala Asp Arg 65 70 75

Týr Leu Ser íle Ser Asn íle Gin Pro Glu Asp Glu Ala Met Tyr 80 85 90 íle Cys Gly Val Gly Asp Thr íle Lys Glu Gin Phe Val Tyr Val 95 100 105

Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Thr Val Leu Gly Gin Pro 110 115 (2) INFORMÁCIE O SEQ I. Č.: 46:

(i) CHARAKTERISTIKY SEKVENCIE:

(A) DĹŽKA: 118 aminokyselín (B) TYP: aminokyselina (D) TOPO1ÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: proteín (xi) OPIS SEKVENCIE: SEQ I. Č.: 46:

Glu Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Asp Leu Val Lys Pro Gly 15 10 15

Gly Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser 20 25 30

Ser Tyr Gly Met Ser Trp 1le Arg Gin Thr Pro Asp Lys Arg Leu 35 40 45

Glu Trp Val Ala Thr íle Ser Ser Gly Gly Ser Tyr Thr Tyr Tyr 50 55 60

Pro Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr íle Ser Arg Asp Asn Ala 65 70 75

Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gin Met Ser Ser Leu Lys Ser Glu Asp 80 85 90

Thr Ala Met Phe Tyr Cys Ala Arg Gin Thr Thr Met Thr Tyr Phe 95 100 105

Ala Týr Trp Gly Gin Gly Thr Leu Val Ihr Val Ser Ala HO 115 (2) INFORMÁCIE O SEQ I. Č.: 47:

(i) CHARAKTERISTIKY SEKVENCIE:

(A) DĹŽKA: 116 aminokyselín (B) TYP: aminokyselina (D) TOPO1ÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: proteín (Xi) OPIS SEKVENCIE: SEQ I. Č.: 47:

Gin

Leu

Val

Leu

Thr

Gin

Ser

Pro

Ser

Ala

Ser

Ala

Ser

Leu

Gly

1

5

10

15

Ala

Ser

Val

Lys

Leu

Thr

Cys

Thr

Leu

Ser

Gin

His

Ser

Thr

20

25

30

Tyr

Thr

Íle

Glu

Trp

His

Gin

Pro

Glu

Lys

Gly

Pro

Arg

35

40

45

Tyr

Leu

Met

Lys

Leu

Lys

Gin

Asp

Gly

Ser

His

Ser

Thr

Gly

Asp

50

55

G0

Gly

Íle

Pro

Asp

Arg

Phe

Ser

Gly

Ser

Gly

Ala

Glu

Arg

65

70

75

Tyr

Leu

Thr

Íle

Ser

Leu

Gin

Ser

Glu

Asp

Glu

Ala

Asp

Tyr

80

85

90

Tyr

Cys

Gly

Val

Gly

Asp

Thr

11c

Lys

Glu

Gin

Phe

Val

Tyr

Val

95

100

105

Phe

Gly

Thr

Lys

Leu

Thr

Val

Leu

Gly

110 115 (2) INFORMÁCIE O SEQ I. Č.: 48:

(i) CHARAKTERISTIKY SEKVENCIE:

(A) DĹŽKA: 118 aminokyselín (B) TYP: aminokyselina (D) TOPO1ÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: proteín (xi) OPIS SEKVENCIE: SEQ I. Č.: 48:

Gin Leu Yal Leu Thr Gin Ser Pro Ser Ala Ser Ala Ser Leu Gly 15 10 15

Ala Ser Val Lys Leu Thr Cys Thr Leu Ser Ser Gin His Ser Thr 20 25 30

Tyr Thr íle Glu Trp Tyr Gin Gin Gin Pro Glu Lys Gly Pro Lys 35 40 45

Tyr Leu Met Asp Leu Lys Gin Asp Gly Ser His Ser Thr Gly Asp 50 55 60

Gly íle Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Ser Ser Gly Ala Glu Arg 65 70 75

Tyr Leu Thr íle Ser Ser Leu Gin Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr 80 85 90

Tyr Cys Gly Val Gly Asp Thr íle Lys Glu Gin Phe Val Tyr Val 95 100 105

Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Gin Pro 110 115 (2) INFORMÁCIE O SEQ I. Č.: 49:

(i) CHARAKTERISTIKY SEKVENCIE:

(A) DĹŽKA: 118 aminokyselín (B) TYP: aminokyselina (D) TOPO1ÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: proteín (xi) OPIS SEKVENCIE: SEQ I. Č.: 49:

Gin Leu Val Leu Thr Gin Ser Pro Ser Ala Ser Ala Ser Leo Gly 15 10 15

Ala Ser Val Lys Leu Thr Cys Thr Leu Ser Ser Gin His Ser Thr 20 25 30

Tyr Thr íle Glu Trp Tyr Gin Gin Gin Pro Glu Lys Gly Pro Lys 35 40 45

Tyr Val Met Asp Leu Lys Gin Asp Gly Ser His Ser Thr Gly Asp 50 55 60

Gly íle Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Ser Ser Gly Ala Glu Arg

70 75

Tyr Leu Thr Íle Ser Ser Leu Gin Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr

85 90

Tyr Qys Gly Val Gly Asp Thr íle Lys Glu Gin Phe Val Tyr Val

100 105

Phe Gly Gly Gly Ihr Lys Leu Thr Val Leu Gly Gin Pro

110 115

- 89 (2) INFORMÁCIE O SEQ I. Č.: 50:

(i) CHARAKTERISTIKY SEKVENCIE:

(A) DĹŽKA: 118 aminokyselín (B) TYP: aminokyselina (D) TOPO1ÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: proteín (xi) OPIS SEKVENCIE: SEQ I. Č.: 50:

Gin Leu Val Leu Thr Gin Ser Pro Ser Ala Ser Ala Ser Leu Gly 15 10 15

Ala Ser Val Lys Leu Thr Cys Thr Leu Ser Ser Gin His Ser Thr 20 25 30

Tyr Thr Íle Glu Trp Tyr Gin Gin Gin Pro Glu Lys Gly Pro Arg 35 40 45

Tyr Leu Met Asp Leu Lys Gin Asp Gly Ser His Ser Thr Gly Asp 50 55 60

Gly íle Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Ser Ser Gly Ala Glu Arg 65 70 75

Tyr Leu Thr íle Ser Ser Leu Gin Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr 80 85 90

Tyr Cys Gly Val Gly Asp Thr Íle Lys Glu Gin Phe Val Tyr Val 95 100 105

Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Gin Pro 110 115 (2) INFORMÁCIE O SEQ I. Č.: 51:

(i) CHARAKTERISTIKY SEKVENCIE:

(A) DĹŽKA: 118 aminokyselín (B) TYP: aminokyselina (D) TOPO1ÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: proteín (xi) OPIS SEKVENCIE: SEQ I. Č.: 51:

Gin Leu Val Leu Thr Gin Ser Pro Ser Ala Ser Ala Ser Leu Gly 15 10 !5

Ala Ser Val Lys Leu Thr Cys Thr Leu Ser Ser Gin His Ser Thr 20 25 30

Tyr Thr Íle Glu Trp Tyr Gin Gin Gin Pro Glu Lys Gly Pro Arg 35 40 45

Tyr Val Met Asp Leu Lys Gin Asp Gly Ser His Ser Ihr Gly Asp 50 55 60

Gly íle Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Ser Ser Gly Ala Glu Arg 65 70 75

Tyr Leu Thr íle Ser Ser Leu Gin Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr

85 90

Tyr Cys Gly Val Gly Asp Thr íle Lys Glu Gin Phe Val Tyr Val

100 105

Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Gin Pro 110 115 (2) INFORMÁCIE O SEQ I. Č.: 52:

(i) CHARAKTERISTIKY SEKVENCIE:

(A) DĹŽKA: 118 aminokyselín (B) TYP: aminokyselina (D) TOPO1ÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: proteín (xi) OPIS SEKVENCIE: SEQ I. Č.: 52:

Gin Leu Val Leu Thr Gin Ser Pro Ser Ala Ser Ala Ser Leu Gly 15 10 15

Ala Ser Val Lys Leu Thr Cys Thr Leu Ser Ser Gin His Ser Tlir 20 25 30

Tyr Thr íle Glu Trp Tyr Gin Gin Gin Pro Glu Lys Gly Pro Lys 35 40 45

Tyr Leu Met Asp Leu Lys Gin Asp Gly Ser His Ser Thr Gly Asp 50 55 60

Gly Íle Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Ser Ser Gly Ala Glu Arg

70 75

Tyr Leu Thr íle Ser Ser Leu Gin Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr 80 85 90 íle Cys Gly Val Gly Asp Thr íle Lys Glu Gin Phe Val Tyr Val 95 100 105

Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Gin Pro 110 115 (2) INFORMÁCIE O SEQ I. Č.: 53:

(i) CHARAKTERISTIKY SEKVENCIE:

(A) DĹŽKA: 118 aminokyselín (B) TYP: aminokyselina (D) TOPO1ÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: proteín

(xi)

OPIS

SEKV

ENCIE

: SEQ

I. C

• :

53

J

Gin

Leu

Val

Leu

Thr

Gin

Ser

Pro

Ser

Ala Ser

Ala

Ser

Leu

Gly

1

5

10

15

Ala

Ser

Val

Lys

Leu

Thr

Cys

Thr

Leu

Ser Ser

Gin

His

Ser

Thr

20

25

30

Tyr

Thr

Íle

Glu

Trp

Tyr

Gin

Pro Glu

Lys

Gly

Pro

Arg

35

40

45

Tyr

Leu

Met

Asp

Leu

Lys

Gin

Asp

Gly

Ser His

Ser

Thr

Gly

Asp

50

55

60

Gly

íle

Pro

Asp

Arg

Phe

Ser

Gly

Ser

Ser Ser

Gly

Ala

Glu

Arg

70 7b

Tyr Leu Thr íle Ser Ser Leu Gin Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr

85 90 íle Cys Gly Val Gly Asp Thr Íle Lys Glu Gin Phe Val Tyr Val , 95 100 105

Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Gin Pro

110 115 (2) INFORMÁCIE O SEQ I. Č.: 54:

(l) CHARAKTERISTIKY SEKVENCIE:

(A) DĹŽKA: 118 aminokyselín (B) TYP: aminokyselina (D) TOPO1ÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: proteín (xi) OPIS SEKVENCIE: SEQ I. Č.: 54:

Gin Leu Val Leu Thr Gin Ser Pro Ser Ala Ser Ala Ser Leu Gly 15 10 15

Ala Ser Val Lys Leu Hir Cys Thr Leu Ser Ser Gin His Ser Thr 20 25 30

Tyr Thr íle Glu Trp Tyr Gin Gin Gin Pro Glu Lys Gly Pro Lys 35 40 45

Tyr Val Met Asp Leu Lys Gin Asp Gly Ser His Ser Thr Gly Asp 50 55 60

Gly Íle Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Ser Ser Gly Ala Glu Arg 65 70 75

Tyr Leu Thr Íle Ser Ser Leu Gin Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr 80 85 90

IIe Cys Gly Val Gly Asp Thr Íle Lys Glu Gin Phe Val Tyr Val 95 100 105

Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Gin Pro 110 115 (2) INFORMÁCIE O SEQ I. Č.: 55:

(i) CHARAKTERISTIKY SEKVENCIE:

(A) DĹŽKA: 118 aminokyselín (B) TYP: aminokyselina (D) TOPO1ÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: proteín (xi) OPIS SEKVENCIE: SEQ I. Č.: 55:

Gin Leu Val Leu Thr Gin Ser Pro Ser Ala Ser Ala Ser Leu Gly 15 10 15

Ala Ser Val Lys Leu Thr Cys Thr Leu Ser Ser Gin His Ser Thr 20 25 30

Tyr Thr íle Glu Trp Tyr Gin Gin Gin Pro Glu Lys Gly Pro Arg 35 40 45

Tyr Val Met Asp Leu Lys Gin Asp Gly Ser His Ser Thr Gly Asp 50 55 60

Gly íle Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Ser Ser Gly Ala Glu Arg 65 70 75

Tyr Leu Thr íle Ser Ser Leu Gin Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr 80 85 90 íle Cys Gly Val Gly Asp Thr Íle Lys Glu Gin Phe Val Tyr Val

100

Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Gin Pro 110 115 (2) INFORMÁCIE O SEQ I. Č.: 56:

(i) CHARAKTERISTIKY SEKVENCIE:

(A) DĹŽKA: 118 aminokyselín (B) TYP: aminokyselina (D) TOPO1ÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: proteín (xi) OPIS SEKVENCIE: SEQ I. Č.: 56:

Gin Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gin Pro Gly 15 10 15

Arg Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser 20 25 30

Ser Tyr Gly Met Ser Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu 35 40 45

Glu Trp Val Ala Thr íle Ser Ser Gly Gly Ser Tyr Thr Tyr Tyr 50 55 θθ

Pro Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Íle Ser Arg Asp Asn Ser 65 70 ⁷⁵

Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp 80 85 90

Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Gin Thr Thr Met Thr Tyr Phe 95 100 105

Ala Tyr Trp Gly Gin Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 110 115 (2) INFORMÁCIE O SEQ I. Č.: 57:

(i) CHARAKTERISTIKY SEKVENCIE:

(A) DĹŽKA: 411 párov báz (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET REŤAZCOV: dva (D) TOPO1ÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY; cDNA na mRNA (xi) OPIS SEKVENCIE: SEQ I. Č.: 57:

ATG AAC TTC GGG CTC AGC TTG ATT TTC CTT GCC CTC ATT TTA AAA 45

Met Asn Phe Gly Leu Ser Leu Íle Phe Leu Ala Leu íle Leu Lys

-15 -10 -5

GGT GTC CAG TGT GAG GTG CAA CTG GTG GAG TCT GGG GGA GAC TTA 90

Gly Val Gin Cys Glu Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Asp Leu

5 10

GTG AAG CCT GGA GGG TCC CTG AAA CTC TCC TGT GCA GCC TCT GGA 135 Val Lys Pro Gly Gly Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly

20 25

KC ACT TTC ACT AGC TAT GGC ATG TCT TGG ATT CGC CAG ACT CCA 180 Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Gly Met Ser Trp íle Arg Gin Thr Pro

35 40

GAC AAG AGG CTG GAG TGG CTC GCA ACC ATT AGT ACT GCT GCT ACT 225 Asp Lys Arg Leu Glu Trp Val Ala Thr Íle Ser Ser Gly Gly Ser

50 55

TAC ACC TAC TAT CCA GAC AGT GTG AAG GGG CGA TTC ACC ATC TCC 270 Tyr Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Íle Ser

G5 70

AGA GAC AAT GCC AAG AAC ACC CTA TAC CTG CAA ATG AGC AGT CTG 315 Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gin Met Ser Ser Leu

80 85

AAG TCT GAG GAC ACA GCC ATG TTT TAC TGT GCA AGA CAG ACT ACT 360 Lys Ser Glu Asp Thr Ala Met Phe Tyr Cys Ala Arg Gin Thr Thr

95 100 t

ATG ACT TAC TTT GCT TAC TGG GGC CAA GGG ACT CTG GTC ACT CTC 405 Met Thr Tyr Phe Ala Tyr Trp Gly Gin Gly Thr Leu Yal Thr Val

105 110 115

TCT GCA 411 Ser Ala (2) INFORMÁCIE O SEQ I. Č.: 58:

(i) CHARAKTERISTIKY SEKVENCIE:

(A) DĹŽKA: 411 párov báz (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET REŤAZCOV: dva (D) TOPO1ÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: CDNA na mRNA (xi) OPIS SEKVENCIE: SEQ I. Č.: 58:

ATG GGG TTT GGG CTG AGC TGG CTT TTC CTC GTT GCT CTT TTA AGA 45

Met Gly Phe Gly Leu Ser Trp Val Phe Leu Val Ala Leu Leu Arg

-15 -10 -5

GCT GTC CAG TCT CAG GTC CAG CTG GTG GAG TCT GGG GGA GGC GTC 90

Gly Val Gin Cys Gin Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Vai

5 10

CTC CAG CCT GGG AGG TCC CTG AGA CTC TCC TGT GCA GCC TCT GGA 135

Val Gin Pro Gly Arg Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly

20 25

TTC ACC TTC ACT AGC TAT GGC ATG TCT TGG GTC CGC CAG GCT CCA 180 Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Gly Met Ser Trp Val Arg Gin Ala Pro

35 40

GGC AAG GGG CTG GAG TGG GTG GCA ACC ATT ACT ACT GCT GCT ACT 225 Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala Thr íle Ser Ser Gly Gly Ser

50 55

TAC ACC TAC TAT CCA GAC ACT CTG AAG GGG CGA TTC ACC ATC TCC 270

Tyr Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr íle Ser

65 70

AGA GAC AAT TCC AAG AAC ACG CTG TAT CTG CAA ATG AAC AGC CTG 315 Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gin Met Asn Ser Leu

80 85

AGA GCT GAG GAC ACG GCT GTG TAT TAC TCT GCG AGA CAG ACT ACT 3G0 Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Gin Thr Thr

95 100

ATG ACT TAC TTT GCT TAC TGG GGC CAG GGA ACC CTG CTC ACC GTC 405 Met Thr Tyr Phe Ala Tyr Trp Gly Gin Gly Thr Leu Val Thr Val

105 110 115

TCC TCA 411

Ser Ser

- 95 (2) INFORMÁCIE O SEQ I. Č.: 59:

(i) CHARAKTERISTIKY SEKVENCIE:

(A) DĹŽKA: 11 aminokyselín (B) TYP: aminokyselina (D) TOPO1ÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: peptid (xi) OPIS SEKVENCIE: SEQ I. Č.: 59:

Lys Ala Ser Gin Asp Val Asn Thr Ala Val Ala 1 5 10 (2) INFORMÁCIE O SEQ I. Č.: 60:

(i) CHARAKTERISTIKY SEKVENCIE:

(A) DĹŽKA: 7 aminokyselín (B) TYP: aminokyselina (D) TOPO1ÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: peptľid (xi) OPIS SEKVENCIE: SEQ I. Č.: 60:

Ser Ala Ser Asn Arg Tyr Thr 1 5 (2) INFORMÁCIE O SEQ I. Č.: 61:

(i) CHARAKTERISTIKY SEKVENCIE:

(A) DĹŽKA: 9 aminokyselín (B) TYP: aminokyselina (D) TOPO1ÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: peptid (xi) OPIS SEKVENCIE: SEQ I. Č.: 61:

Gin Gin His Tyr Ser Tlir Pro Phe Thr 1 5 (2) INFORMÁCIE O SEQ I. Č.: 62:

(i) CHARAKTERISTIKY SEKVENCIE:

(A) DĹŽKA: 5 aminokyselín (B) TYP: aminokyselina (D) TOPO1ÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: peptid (xi) OPIS SEKVENCIE: SEQ I. Č.: 62:

Pro Tyr Trp Met Gin I 5 (2) INFORMÁCIE O SEQ I. Č.: 63:

(i) CHARAKTERISTIKY SEKVENCIE:

(A) DĹŽKA: 16 aminokyselín (B) TYP: aminokyselina (D) TOPO1ÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: peptid (xi) OPIS SEKVENCIE: SEQ I. Č.: 63:

Ser íle Plie Gly Asp Gly Asp Thr Arg Tyr Ser Gin Lys Phe Lys Gly 15 10 *5 (2) INFORMÁCIE O SEQ I. Č.: 64:

(l) CHARAKTERISTIKY SEKVENCIE:

(A) DĹŽKA: 11 aminokyselín (B) TYP: aminokyselina (D) TOPO1ÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: peptid (Xl) OPIS SEKVENCIE: SEQ I. Č.: 64:

Gly Leu Arg Arg Gly G!y Tyr Tyr Phe Asp Tyr

5 W (2) INFORMÁCIE O SEQ I. Č.: 65:

(l) CHARAKTERISTIKY SEKVENCIE:

(A) DĹŽKA: 411 párov báz (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET REŤAZCOV: dva

9Ί (D) T0P01ÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: cDNA na mRNA (xi) OPIS SEKVENCIE: SEQ I. Č.: 65:

ATG GCC TGG ACT CCT CTC TTC TTC TTC TTT GTT CTT CAT TGC TCA 45 Met Ala Trp Thr Pro Leu Phe Phe Phe Phe Val Leu His Cys Ser

-15 -10 -5

GCT TCT TTC TCC CAA CTT GTG CTC ACT CAG TCA TCT TCA GCC TCT 90

Gly Ser Phe Ser Gin Leu Val Leu Thr Gin Ser Ser Ser Ala Ser

5 10

TTC TCC CTG GGA CCC TCA GCA AAA CTC AOG TGC ACC TTG ACT ACT 135

Phe Ser Leu Gly Ala Ser Ala Lys Leu Thr Cys Thr Leu Ser Ser

20 25

CAG CAC AGT ACG TAC ACC ATT GAA TGG TAT CAG CAA CAG CCA CTC 180

Gin His Ser Thr Tyr Thr íle Glu Trp Tyr Gin Gin Gin Pro Leu

35 40

AAG CCT CCT AAG TAT GTG ATG GAT CTTAAG CAA GAT GGA AGC CAC 225

Lys Pro Pro Lys Tyr Val Met Asp Leu Lys Gin Asp Gly Ser His

50 55

AGC

ACA

GGT

GAT

GGG

ATT

CCT

GAT

CGC

TTC

TCT

GGA

TCC

AGC

TCT

Ser

Thr

Gly

Asp

Gly

íle

Pro

Asp

Arg

Phe

Ser

Gly

Ser

60

65

70

GCT

GAT

CGC

TAC

cn

AGC

ATT

TCC

AAC

ATC

CAG

CCA

GAA

GAT

Gly

Ala

Asp

Arg

Tyr

Leu

Ser

11c

Ser

Asn

íle

Gin

Pro

Glu

Asp

75

80

85

GAA

GCA

ATG

TAC

ATC

TGT

GCT

GTG

GGT

GAT

ACA

ATT

AAG

GAA

CAA

Glu

Ala

Met

Tyr

Íle

Cys

Gly

Val

Gly

Asp

Tlu

íle

Lys

Glu

Gin

90

95

100

TTT

GTG

TAT

GTT

TTC

GGC

GGT

GGG

ACC

AAG

CTC

ACT

CTC

CTA

GCT

Phe

Val

Tyr

Val

Phe

Gly

Thr

Lys

Val

Thr

Val

Leu

Gly

105

110

115

CAG CCC 411 Gin Pro (2) INFORMÁCIE O SEQ I. Č.: 66:

(i) CHARAKTERISTIKY SEKVENCIE:

(A) DĹŽKA: 405 párov báz (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET REŤAZCOV: dva (D) TOPO1ÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: cDNA na mRNA (xi) OPIS SEKVENCIE: SEQ I. Č.: 66:

ATG GCC TGG ACT CCT CTC TTC TTC TTC TTT GTT CTT CAT TGC TCA 45

Met Ala Trp Thr Pro Leu Phe Phe Phe Phe Val Leu His Cys Ser

-15 -10 -5

Gfff TCT TTC TCC CAG CTT GTG CTG ACT CAA TCG CCC TCT GCC TCT 90

Gly Ser Phe Ser Gin Leu Val Leu Thr Gin Ser Pro Ser Ala Ser

5 10

GCC TCC CTG GGA GCC TCG GTC AAG CTC ACC TGC ACC TTG AGT ACT 135

Ala Ser Leu Gly Ala Ser Val Lys Leu Thr Cys Thr Leu Ser Ser

20 25

CAG CAC AGT ACG TAC ACC ATT GAA TGG CAT CAG CAG CAG CCA GAG 180

Gin His Ser Thr Tyr Thr íle Glu Trp His Gin Gin Gin Pro Glu

35 40

AAG GGC CCT CGG TAC TTG ATG AM CTT AAG CAA GAT GGA AGC CAC 225

Lys Gly Pro Arg Tyr Leu Met Lys Leu Lys Gin Asp Gly Ser His

50 55

AGC ACA GCT GAT GGG ATT CCT CAT CCC TTC TCA GGC TCC AGC TCT 270

Ser Thr Gly Asp Gly íle Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Ser Ser

65 70

CCC GCT GAG CGC TAC CTC ACC ATC TCC AGC CTC CAG TCT GAG GAT 315

Gly Ala Glu Arg Tvr Leu Thr íle Ser Ser Leu Gin Ser Glu Asp

80 85

GAG’ gCT GAC TAT TAC TffT GGT ffTG GCT GAT ACA ATT AAG GAA CAA 360

Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gly Val Gly Asp Thr íle Lys Glu Gin

95 100

TTT GTG TAC GTG TTC GGC GGA GGG ACC ΛΑΑ CTG ACC CTC CTA GCT 405

Phe Val Tyr Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly

105 110 115 (2) INFORMÁCIE O SEQ I. Č.: 67:

(i) CHARAKTERISTIKY SEKVENCIE:

(A) DĹŽKA: 411 párov báz (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET REŤAZCOV: dva (D) TOPO1ÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: cDNA na mRNA (xi) OPIS SEKVENCIE: SEQ I. Č.: 67:

ATG GCC TGG ACT CCT CTC TTC	TO	TO	TTT	GTT	CIT	CAT	TGC	TCA
Met Ala Trp Thr Pro Leu Phe	Phe	Phe	Phe	Val	Leu	His	Cys	Ser
-15			-10					-5
GGT TCT TTC TCC CAG CIT GTG	CTG	ACT	CAA	TCG	CCC	TCT	GCC	TCT
Gly Ser Phe Ser Gin Leu Val	Leu	Thr	Gin	Ser	Pro	Ser	Ala	Ser
1		5					10
GCC TCC CTG GGA GCC TCG GTC	AAG	CTC	ACC	TGC	ACC	TO	ACT	AGT

Ala Ser Leu Gly Ala Ser Val Lys Leu Thr Cys Thr Leu Ser Ser 15 20 25

CAG CAC AGT ACG TAC ACC ATT GAA TGG TAT CAG CAG CAG CCA GAG 180

Gin His Ser Thr Tyr Thr íle Glu Trp Tyr Gin Gin Gin Pro Glu

35 40

AAG GGC CCT AAG TAC CTG ATG GAT CH AAG CAA GAT GGA AGC CAC 225

Lys Gly Pro Lys Tyr Leu Met Asp Leu Lys	Gin	Asp	Gly	Ser	His
45 50				55
AGC ACA GGT GAT GGG ATT CCT GAT CGC TO	TCA	GGC	TCC	AGC	TCT	270
Ser Thr Gly Asp Gly íle Pro Asp Are Phe	Ser	Gly	Ser	Ser	Ser
60 65				70
GGG GCT GAG CGC TAC CTC ACC ATC TCC ACC	CTC	CAG	TCT	GAG	GAT	315
Gly Ala Glu Arg Tyr Leu Thr íle Ser Ser	Leu	Gin	Ser	Glu	Asp
75 80				85
GAG GCT GAC TAT TAC TGT GGT GTG GGT GAT	ACA	ΛΤΓ	MG	GAA	CAA	360
Glu Ala Asp Tyr lýr Cys Gly Val Gly A;p	TKr1 IH	1 le	I.vs	Glu	Gin
90 95				100
TTT GTG TAC CTG TTC GGC GGA GGG ACC AAA	crc	ACC	GTC	CTA	GCC	405
Phe Val Tyr Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys	Leu	Thr	Val	Leu	Gly
105 110				115

CAG CCC 411 Gin Pro (2) INFORMÁCIE O SEQ I. Č.: 68:

(i) CHARAKTERISTIKY SEKVENCIE:

(A) DĹŽKA: 411 párov báz (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET REŤAZCOV: dva (D) TOPO1ÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: cDNA na mRNA (xi) OPIS SEKVENCIE: SEQ I. Č.: 68:

-15 -10 -5 . h'í;

100

GGT TCT TTC TCC CAG CIT GTG CTG ACT CAA TCG CCC TCT GCC TCT 90

Gly Ser Phe Ser Gin Leu Val Leu Thr Gin Ser Pro Ser Ala Ser

5 10

GCC TCC CTG GGA GCC TCG GTC AAG CTC ACC TGC ACC HG ACT AGT 135

Ala Ser Leu Gly Ala Ser Val Lys Leu Thr Cys Thr Leu Ser Ser

20 25

CAG CAC AGT ACC TAC ACC ATT GAA TGG TAT CAG CAG CAG CCA GAG 180

Gin His Ser Thr lýr Thr Íle Glu Trp Tyr Gin Gin Gin Pro Glu

35 40

AAG GGC CCT AAG TAC GTG ATG GAT CTT AAG CAA GAT GGA AGC CAC 225

Lys Gly Pro Lys Tyr Val Met Asp Leu Lys Gin Asp Gly Ser His

50 55

AGC ACA GGT GAT GGG ATT CCT GAT CGC TTC TCA GGC TCC AGC TCT 270

Ser Thr Gly Asp Gly íle Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Ser Ser

65 70

GGG GCT GAG CGC TAC CTC ACC ATC TCC AGC CTC CAG TCT GAG GAT 315

Gly Ala Glu Arg Tyr Leu Thr íle Ser Ser Leu Gin Ser Glu Asp

80 85

GAG GCT GAC TAT TAC TCT GGT CTG GGT GAT ACA ATT AAG GAA CAA 360

Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gly Val Gly Asp Thr íle Lys Glu Gin

95 100

ITT CTG TAC CTG TTC GGC GGA GGG ACC AAA CTG ACC CTC CTA GGC 405 ľbč Val Tyr Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly

105 110 115

CAG CCC 411 Gin Pro (2) INFORMÁCIE O SEQ I. Č.: 69:

(i) CHARAKTERISTIKY SEKVENCIE:

(A) DĹŽKA: 411 párov báz (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET REŤAZCOV: dva (D) TOPO1ÓGIA: lineárna (n) TYP MOLEKULY: cDNA na mRNA (xi) OPIS SEKVENCIE: SEQ I. Č.: 69:

ATG

GCC

TGG

ACT

CCT

CTC

TTC

ΠΤ

CTT

CAT

TGC

TCA

Met

Ala

Trp

Thr

Pro

Leu

Phe

Val

Leu

His

Cys

Ser

-15

-10

-5

GCT

TCT

TTC

TCC

CAG

CTT

CTG

ACT

CAA

TCG

CCC

TCT

GCC

TCT

Gly

Ser

Phe

Ser

Gin

Leu

Val

Leu

Thr

Gin

Ser

Pro

Ser

Ala

Ser

5 10

101

GCC TCC CTG GGA GCC TCG GTC AAG CTC ACC TGC ACC TTG AGT AGT 135 Ala Ser Leu Gly Ala Ser Val Lys Leu Thr Cys Thr Leu Ser Ser

20 25

CAG CAC AGT ACG TAC ACC AH GAA TGG TAT CAG CAG CAG CCA GAG 180

Gin His Ser Thr Tyr Thr Íle Glu Trp Tyr Gin Gin Gin Pro Glu

35 40

AAG GGC CCT AGG TAC CTG ATG GAT CTT AAG CAA GAT GGA AGC CAC 225

Lys Gly Pro Arg Tyr Leu Met Asp Leu Lys Gin Asp Gly Ser His

50 55

AGC ACA GCT GAT GGG ATT CCT GAT CGC TTC TCA GGC TCC AGC TCľ 270

Ser Thr Gly Asp Gly íle Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Ser Ser

65 70

GGG GCT GAG CGC TAC CTC ACC ATC TCC AGC CTC CAG TCT GAG GAT 315

Gly Ala Glu Arg Tyr Leu Thr íle Ser Ser Leu Gin Ser Glu Asp

80 85

GAG GCT GAC TAT TAC TGT GGT GTG GGT GAT ACA ATT AAG GAA CAA 360

Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gly Val Gly Asp Thr íle Lys Glu Gin

95 100

TTT GTG TAC GTG TTC GGC GGA GGG ACC AAA CTG ACC GTC CTA GGC 405

Phe Val Tyr Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly

105 110 115

CAG CCC 411 Gin Pro (2) INFORMÁCIE O SEQ I. Č.: 70:

(i) CHARAKTERISTIKY SEKVENCIE:

(A) DĹŽKA: 411 párov báz (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET REŤAZCOV: dva (D) TOPO1ÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: cDNA na mRNA (xi) OPIS SEKVENCIE: SEQ I. Č.: 70:

ATG GCC TGG ACT CCT CTC TTC TTC TTC TTT GIT CTT CAT TGC TCA 45 Met Ala Trp Thr Pro Leu Phe Phe Phe Phe Val Leu His Cys Ser

-10 -5

GCT TCT TTC TCC CAG CIT GTG CTG ACT CAA TCG CCC TCT GCC TCT 90 Gly Ser Phe Ser Gin Leu Val Leu Thr Gin Ser Pro Ser Ala Ser ¹ 5 io

20 25

- 102 CAG CAC AGT ACG TAC ACC AH GAA TGG TAT GAG CAG CAG CCA GAG 180

Gin His Ser Thr Tyr Thr íle Glu Trp Tyr Gin Gin Gin Pro Glu

35 40

AAG GGC CCT AGG TAC GTG ATG GAT CTT AAG CAA GAT GGA AGC CAC 225 Lys Gly Pro Arg Tyr Val Met Asp Leu Lys Gin Asp Gly Ser His

50 55

AGC ACA GGT GAT GGG AH CCT GAT CGC HC TCA GGC TCC AGC TCT 270

Ser Thr Gly Asp Gly íle Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Ser Ser

65 70

GGG GCT GAG CGC TAC CTC ACC ATC TCC AGC CTC CAG TCT GAG GAT 315

Gly Ala Glu Arg Tyr Leu Thr Íle Ser Ser Leu Gin Ser Glu Asp

80 85

GAG GCT GAC TAT TAC TCT GCT GTG GGT GAT ACA AH AAG GAA CAA 360

Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gly Val Gly Asp Thr IIe Lys Glu Gin

95 100

TH GTG TAC CTG HC GGC GGA GGG ACC AAA CTG ACC GTC CTA GGC 405

Phe Val Tyr Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly

105 110 115

CAGCCC 411 Gin Pro (2) INFORMÁCIE O SEQ I. Č.: 71:

(i) CHARAKTERISTIKY SEKVENCIE:

(A) DĹŽKA: 411 párov báz (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET REŤAZCOV: dva (D) TOPO1ÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: cDNA na mRNA (xi) OPIS SEKVENCIE: SEQ I. Č.: 71:

-15 -10 -5

GGT TCT HC TCC CAG CH GTG CTG ACT CAA TCG CCC TCT GCC TCT 90

Gly Ser Phe Ser Gin Leu Val Leu Thr Gin Ser Pro Ser Ala Ser

5 10

GCC TCC CTG GGA GCC TCG GTC AAG CTC ACC TGC ACC HG ACT ACT 135

Ala Ser Leu Gly Ala Ser Val Lys Leu Thr Cys Thr Leu Ser Ser

20 25

CAG CAC AGT ACG TAC ACC AH GAA TGG TAT CAG CAG CAG CCA GAG 180

Gin His Ser Thr Tyr Thr íle Glu Trp Tyr Gin Gin Gin Pro Glu

35 40

103

AAG GGC CCT AAG TAC CTG ATG GAT CIT AAG CAA GAT GGA AGC CAC 225 Lys Gly Pro Lys Tyr Leu Met Asp Leu Lys Gin Asp Gly Ser His 'iô 50 55

AGC ACA GCT GAT GGG ATT CCT GAT CGC TTC TCA GGC TCC AGC TCT 270

Ser Thr Gly Asp Gly íle Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Ser Ser

65 70

GGG GCT GAG CGC TAC CľC ACC ATC TCC AGC CTC CAG TCT GAG GAT 315

Gly Ala Glu Arg Tyr Leu Thr íle Ser Ser Leu Gin Ser Glu Asp

80 85

GAG GCT GAC TAT ATC TCT GCT CTG GCT GAT ACA AH AAG GAA CAA 360

Glu Ala Asp Tyr íle Cys Gly Val Gly Asp Thr íle Lys Glu Gin

95 100

ΠΤ CTG TAC CTG HC GGC GGA GGG ACC AAA CTG ACC CTC CTA GGC 405

Phe Val Tyr Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly

105 110 115

CAGCCC 411 Gín Pro (2) INFORMÁCIE O SEQ I. Č.: 72:

(i) CHARAKTERISTIKY SEKVENCIE:

(A) DĹŽKA: 411 párov báz (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET REŤAZCOV: dva (D) TOPO1ÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: cDNA na mRNA (xi) OPIS SEKVENCIE: SEQ I. Č.: 72:

ATG GCC TQG ACT CCT CTC TTC TTC TTC TTT GTT CTT CAT TGC TCA 45 Met Ala Trp Thr Pro Leu Phe Phe Phe Phe Val Leu His Cys Ser

-15 -10 -5

GCT TCT TTC TCC CAG CTT CTG CTG ACT CAA TCG CCC TCT GCC TCT 90 Gly Ser Phe Ser Gin Leu Val Leu Thr Gin Ser Pro Ser Ala Ser

5 10

GCC TCC CTG GGA GCC TCG CTC AAG CTC ACC TGC ACC TTG ACT ACT 135 Ala Ser Leu Gly Ala Ser Val Lys Leu Thr Cys Thr Leu Ser Ser

20 25

CAG CAC ACT ACG TAC ACC ATT GAA TGG TAT CAG CAG CAG CCA GAG 180 Gin His Ser Thr Tyr Thr íle Glu Trp Tyr Gin Gin Gin Pro Glu

35 40

AAG GGC CCT AGG TAC CTG ATG GAT CTT AAG CAA GAT GGA AGC CAC 225 Lys Gly Pro Arg Tyr Leu Met Asp Leu Lys Gin Asp Gly Ser His

50 55

104

AGC ACA GGT GAT GGG ATT OCT GAT CGC TTC TCA GGC TCC AGC TCT 270

Ser Thr Gly Asp Gly íle Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Ser Ser

65 70

GGG GCT GAG CGC TAC CTC ACC ATC TCC AGC CTC CAG TCT GAG GAT 315

Gly Ala Glu Arg Tyr Leu Thr íle Ser Ser Leu Gin Ser Glu Asp

80 85

GAG GCT GAC TAT ATC TGT GGT GTG GGT GAT ACA AH AAG GAA CAA 360

Glu Ala Asp Tyr íle Cys Gly Val Gly Asp Thr íle Lys Glu Gin

95 100

TTT GTG TAC GTG TTC GGC GGA GGG ACC ΑΛΑ CTG ACC CTC CTA GGC 405

Phe Val Tyr Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly

105 110 115

CAG CCC 411 Gin Pro (2) INFORMÁCIE O SEQ I. Č.: 73:

(i) CHARAKTERISTIKY SEKVENCIE:

(A) DĹŽKA: 411 párov báz (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET REŤAZCOV: dva (D) TOPO1ÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: cDNA na mRNA (xi) OPIS SEKVENCIE: SEQ I. Č.: 73:

ATG GCC TGG ACT CCT CTC TTC TTC TTC TTT GTT CH CAT TGC TCA 45

Met Ala Trp Thr Pro Leu Phe Phe Phe Phe Val Leu His Cys Ser

-15 -10 -5

GCT TCT HC TCC CAG CH GTG CTG ACT CAA TCG CCC TCT GCC TCT 90

Gly Ser Phe Ser Gin Leu Val Leu Thr Gin Ser Pro Ser Ala Ser

5 10

GCC TCC CTG GGA GCC TCG GTC AAG CTC ACC TGC ACC TTG AGT ACT 135

Ala Ser Leu Gly Ala Ser Val Lys Leu Thr Cys Thr Leu Ser Ser

20 25

CAG CAC AGT AOG TAC ACC ATT GAA TGG TAT CAG CAG CAG CCA GAG 180

Gin His Ser Thr Tyr Thr íle Glu Trp Tyr Gin Gin Gin Pro Glu

35 40

AAG GGC CCT AAG TAC GTG ATG GAT CTT AAG CAA GAT GGA AGC CAC 225

Lys Gly Pro Lys Tyr Val Met Asp Leu Lys Gin Asp Gly Ser His

50 55

AGC ACA GCT GAT GGG ATT CCT GAT CGC TTC TCA GGC TCC AGC TCT 270

Ser Thr Gly Asp Gly íle Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Ser Ser

65 70 “{·* i*«

- 105 GGGGCTGAGCGC TAC CTC AOC ATC TCC AGC CTC CAG TCT GAG GAT 315 Gly Ala Glu Arg Tyr Leu Thr íle Ser Ser Leu Gin Ser Glu Asp

80 85

GAG GCT GAC TAT ATC TCT GGT GTG GGT GAT ACA ATT AAG GAA CAA 360

Glu Ala Asp Tyr íle Cys Gly Val Gly Asp Thr íle Lys Glu Gin

95 100

TTT GTG TAC GTG TTC GGC GGA GGG ACC AAA CTG ACC GTC CTA GGC 405

Phe Val Tyr Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly

105 110 115

CAG CCC 411 Gin Pro (2) INFORMÁCIE O SEQ I. Č.: 74:

(i) CHARAKTERISTIKY SEKVENCIE:

(A) DĹŽKA: 411 párov báz (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET REŤAZCOV: dva (D) TOPO1ÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: CDNA na mRNA (xi) OPIS SEKVENCIE: SEQ I. Č.: 74:

ATG GCC TGG ACT CCT CTC TTC TTC TTC TTT CTT CTT CAT TGC TCA 45 Met Ala Trp Thr Pro Leu Phe Phe Phe Phe Val Leu His Cys Ser

-15 -10 -5

CCT TCT TTC TCC CAG CTT GTG CTG ACT CAA TCG CCC TCT GCC TCT 90

Gly Ser Phe Ser Gin Leu Val Leu Thr Gin Ser Pro Ser Ala Ser

5 10

GCC TCC CTG GGA GCC TCG GTC AAG CTC ACC TGC ACC HG ACT AGT 135

Ala Ser Leu Gly Ala Ser Val Lys Leu Thr Cys Thr Leu Ser Ser

20 25

CAG CAC AGT ACG TAC ACC AH GAA TGG TAT CAG CAG CAG CCA GAG 180

Gin His Ser Thr Tyr Thr íle Glu Trp Tyr Gin Gin Gin Pro Glu

35 40

AAG GGC CCT AGG TAC GTG ATG GAT CTT AAG CAA GAT GGA AGC CAC 225

Lys Gly Pro Arg Tyr Val Met Asp Leu Lys Gin Asp Gly Ser His

50 55

AGC ACA GGT GAT GGG ATT CCT GAT CGC TTC TCA GGC TCC AGC TCT 270 Ser Thr Gly Asp Gly íle Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Ser Ser . 65 70

GGG GCT GAG CGC TAC CTC ACC ATC TCC AGC CTC CAG TCT GAG GAT 315 Gly Ala Glu Arg Tyr Leu Ihr íle Ser Ser Leu Gin Ser Glu Asp

80 85

GAG GCT GAC TAT ATC TCT GGT GTG GCT GAT ACA ATT AAG GAA CAA 360 Glu Ala Asp Tyr íle Cys Gly Val Gly Asp Thr Íle Lys Glu Gin

95 100 ľ'I: · .1 .

106 TTT GTG TAC GTG TTC GGC GGA GGG ACC AAA CTG ACC GTC CTA GGC Phe Val Tyr Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly

105 110 115

CAG CCC 411 Gin Pro (2) INFORMÁCIE O SEQ I. Č.: 75:

(i) CHARAKTERISTIKY SEKVENCIE:

(A) DĹŽKA: 34 aminokyselín (B) TYP: aminokyselina (D) TOPO1ÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: peptid (xi) OPIS SEKVENCIE: SEQ I. Č.: 75:

Ala Val Ser Glu His Gin Leu Leu His Asp Lys Gly Lys Ser íle

10 15

Gin Asp Leu Arg Arg Arg Phe Phe Leu His His Leu íle Ala Glu

ZO 25 30

405 íle His Thr Ala

Claims

PATENTOVÉ NÁROKY

1. Liečivo na kachexiu, vyznačujúce sa tým, že ako aktívnu zložku obsahuje látku, schopnú inhibície väzby medzi parathormónu príbuzným proteínom (PTHrP) a jeho receptorom.
2. Liečivo na kachexiu podľa nároku 1, vyznačujúce sa tým, že touto látkou je nejaký antagonista proti PTHrP.
3. Liečivo na kachexiu podľa nároku 1, vyznačujúce sa tým, že touto látkou je protilátka proti PTHrP.
4. Liečivo na kachexiu podľa nároku 1, vyznačujúce sa tým, že touto látkou je nejaký fragment protilátky proti PTHrP a/alebo nejaký jej modifikovaný fragment.
5. Liečivo na kachexiu podľa nárokov 3 a 4, vyznačujúce sa tým, že touto protilátkou je nejaká humanizovaná alebo chimérna protilátka.
6. Liečivo na kachexiu podľa nároku 5, vyznačujúce sa tým, že touto humanizovanou protilátkou je humanizovaná protilátka #23-57-137-1.
7. Liečivo na kachexiu podľa nárokov 3 a 4, vyznačujúce sa tým, že táto protilátka je monoklonáIného typu.
8. Liečivo na kachexiu podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 7, vyznačujúce sa tým, že táto kachexia je kachexia indukovaná rakovinou.