CN1329080C - 恶病质的治疗剂 - Google Patents

恶病质的治疗剂 Download PDF

Info

Publication number
CN1329080C
CN1329080C CNB988050951A CN98805095A CN1329080C CN 1329080 C CN1329080 C CN 1329080C CN B988050951 A CNB988050951 A CN B988050951A CN 98805095 A CN98805095 A CN 98805095A CN 1329080 C CN1329080 C CN 1329080C
Authority
CN
China
Prior art keywords
antibody
ser
gly
chain
dna
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Expired - Fee Related
Application number
CNB988050951A
Other languages
English (en)
Other versions
CN1255858A (zh
Inventor
佐藤功
恒成利明
石井公惠
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Chugai Pharmaceutical Co Ltd
Original Assignee
Chugai Pharmaceutical Co Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Chugai Pharmaceutical Co Ltd filed Critical Chugai Pharmaceutical Co Ltd
Publication of CN1255858A publication Critical patent/CN1255858A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN1329080C publication Critical patent/CN1329080C/zh
Anticipated expiration legal-status Critical
Expired - Fee Related legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/22—Hormones
    • A61K38/29—Parathyroid hormone, i.e. parathormone; Parathyroid hormone-related peptides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/575—Hormones
    • C07K14/635—Parathyroid hormone, i.e. parathormone; Parathyroid hormone-related peptides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/26—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against hormones ; against hormone releasing or inhibiting factors
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/24—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin containing regions, domains or residues from different species, e.g. chimeric, humanized or veneered
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Valve Device For Special Equipments (AREA)
  • Confectionery (AREA)
  • Massaging Devices (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Medicines Containing Plant Substances (AREA)
  • Acyclic And Carbocyclic Compounds In Medicinal Compositions (AREA)
  • Polymerisation Methods In General (AREA)

Abstract

本文公开了一种恶病质治疗剂，它含有作为活性成分的能抑制甲状旁腺素相关肽和其受体结合的物质。所述的抑制性物质的例子包括甲状旁腺素相关肽受体的拮抗剂、甲状旁腺素相关肽抗体、抗体片段和被改性的抗体。

Description

恶病质的治疗剂
技术领域
本发明涉及恶病质的治疗剂，它包括作为活性组分的能抑制甲状旁腺素(PTHrP)与其受体之间结合的物质。
背景技术
在晚期癌患者中可见的恶病质是恶性肿瘤的一种常见综合症，其特征为系统紊乱，主要症状为厌食、体重减轻、贫血、电解质失衡和免疫功能降低。癌患者中恶病质的发展导致死亡和晚期症状、损害患者的生活质量(QOL)并对患者及其家属和周围的人们带来强烈的心理、物质和社会的影响。
最近发现被认为是癌症恶病质的致病因素的恶病质素与肿瘤坏死因子(TNF)相同。其后发现细胞因子(如白介素(IL)-1、IL-6、LTF、IFN)也具有与恶病质素同样的作用，因而恶病质是由多种因子的组合作用所诱导。
已知从人口腔癌得到的OCC-1细胞系能产生涉及肿瘤恶病质的多种液体因子。注射OCC-1细胞的裸鼠发展出包括恶病质的多种症状(Kajimura N.et al.，Cancer Chemother.Pharmacol.，1996，38 Suppl.pS48-52；Tanaka R.et al.，Jpn.J.Clin.Oncology Apr.1996，26(2)p88-94)。据信这是因为注射进裸鼠的OCC-1细胞系在细胞的生长中产生了多种细胞因子(如G-CSF、IL-6、LTF、IL-11、PTHRP)，这些因子在裸鼠中的组合作用导致了这些症状。
在注射OCC-1细胞系的裸鼠中发现的症状与人晚期癌症患者表现出的症状高度相似。然而，还没有涉及恶病质的药物和治疗剂的报告。
发明内容
本发明的目的是要提供恶病质的治疗剂，它包括作为活性组分的能抑制甲状旁腺素(PTHrP)与其受体之间结合的物质。
本发明人为发现这些治疗剂进行了广泛和深入的研究。他们发现能抑制PTHrP与其受体之间结合的物质能达到如此效果。该发现导致本发明的完成。
也就是，本发明涉及恶病质的治疗剂，它包括作为活性组分的能抑制PTHrP与其受体之间结合的物质。
在本发明中，“恶病质”包括由癌症带来的那些症状。
本发明涉及恶病质的治疗剂，它包括作为活性组分的能抑制甲状旁腺素(此后称为“PTHrP”)与其受体(此后称为“PTHrP受体”)之间结合的物质。
在此使用的“PTHrP受体”是指能与PTHrP结合的任何受体(例如那些在日本国家阶段公开的No.6-506598中描述的那些受体)，而不管PTHrP受体是否在靶器官(如骨、肾)上。
在此使用的“能抑制PTHrP与其受体(PTHrP受体)之间结合的物质”是指能结合到PTHrP上以阻止PTHrP与PTHrP受体结合的任何物质如抗-PTHrP抗体、能结合到PTHrP受体上以阻止PTHrP受体与PTHrP结合的任何物质如对抗PTHrP受体的拮抗剂(PTHrP拮抗剂)，特别是由PTHrP肽置换或缺失至少一个氨基酸残基而得的肽或由部分PTHrP肽序列组成的肽，或它们的组合。
抗-PTHrP抗体包括那些已知的任何种类，如人源化抗体、人抗体(WO96/33735)或嵌合抗体(日本专利申请公开No.4-228089)。抗体可是多克隆型或单克隆型，但优选为单克隆型。PTHrP拮抗剂包括多肽或低分子量物质。PTHrP拮抗剂包括以对抗PTHrP的拮抗方式与PTHrP受体结合的物质，如在日本专利申请公开No.7-165790；肽(Peptides)(美国)，1995，6(6)1031-1037；生物化学(Biochemistry)(美国)Apr.281992，31(16)4026-4033和日本国家阶段公开No.5-509098中描述的具有PTHrP拮抗活性的一种多肽。这些多肽可以有至少一个氨基酸残基的缺失、置换、增加或插入，只要它们能保持相当的PTHrP拮抗活性，也被包括在本发明的PTHrP拮抗剂之中。
下面，本发明将要在用一种抗-PTHrP抗体作为“能抑制PTHrP与PTHrP受体之间的结合的物质”的示范中被详细描述。
1.抗-PTHrP抗体
在本发明中应用的抗-PTHrP抗体可以是能表现对恶病质的治疗效果的任何一种抗体，不管它的来源、类型(单克隆或多克隆)和构型。
在本发明中应用的抗-PTHrP抗体可以由任何已知的多克隆或单克隆抗体方法生产。优选地，抗-PTHrP抗体是来自哺乳动物的单克隆抗体。从哺乳动物来的单克隆抗体包括那些从杂交瘤中和通过基因工程技术从用载有此抗体基因的重组表达载体转化的宿主中生产的抗体。在本发明中应用的抗体能结合到PTHrP上以阻止PTHrP与PTH/PTHrP受体的结合，因而阻止PTHrP的信号传导，其结果是阻止PTHrP的生物学活性。
此类抗体的一个具体例子是#23-57-137-1抗体，它可从杂交瘤克隆#23-57-137-1中被生产出来。
杂交瘤克隆#23-57-137-1被命名为“鼠-鼠杂交瘤#23-57-137-1”并按照《布达佩斯条约》于1996年8月15日被保存在日本的日本国立生命科学和人体技术研究所(1-3，Higashi 1-chome，Tsukuba-shi，Ibaraki，Japan)，其保藏编号为No.FERM BP-5631。
2.产生抗体的杂交瘤
产生单克隆抗体的杂交瘤可由任何已知技术生产。那就是，依据通常的免疫方法，将PTHrP用作抗原而进行免疫反应。得到的免疫细胞与已知的亲本细胞按通常的细胞融合方法融合，用通常的筛选方法从融合细胞中筛选产生单克隆抗体的细胞。
更具体地讲，产生单克隆抗体的细胞可以下述的程序来制备。
第一步，被用作用于生产抗体的致敏抗原的人PTHrP通过表达由Suva，L.J.等在Science(1987)237,893中公开的PTHrP基因/氨基酸序列而得到。即将编码PTHrP的核苷酸序列嵌入到任何已知的表达载体中去，再用此表达载体转化合适的宿主细胞。从转化的宿主细胞中或从被转化宿主细胞的培养上清液中用已知方法分离和纯化PTHrP蛋白质。
第二步，把纯化的PTHrP蛋白质用作致敏抗原。或者，可将PTHrPN-末端的34个氨基酸的肽用作致敏抗原，该肽可被化学合成。
可用致敏抗原免疫的哺乳动物不被特别地限制。然而，由于考虑到其与用于融合的亲代细胞的相容性而优先选择哺乳动物。一般地，啮齿类动物(如小鼠、大鼠、仓鼠、兔)或猴可被应用。
用致敏抗原免疫哺乳动物，可按任何已知的方法完成，例如，腹腔内或皮下注射致敏抗原给哺乳动物。更具体地，将致敏抗原用磷酸盐缓冲液(PBS)或生理盐水适度稀释并悬浮于其中，接着把得到的悬浮液与适量的佐剂(如弗氏完全佐剂)混合得到乳浊液。以4到21天的间隔几次注射乳浊液给哺乳动物。在此免疫中，可将致敏抗原连接到合适载体上。
免疫后，检测血清抗体水平。当血清抗体水平被确定已达到期望的水平时，从哺乳动物中分离出免疫细胞并用于细胞融合。优选的免疫细胞为脾细胞。
用作细胞融合的亲本细胞(即与免疫细胞融合的细胞)是从哺乳动物而来的骨髓瘤细胞。骨髓瘤细胞可是任何一种已知的细胞系，例如可以是P3(P3x63Ag8.653)(免疫学杂志(J.Immnol.(1979)123，1548-1550)、P3X63Ag8U.1(当前微生物学和免疫学中的论题Current Topicsin Microbiology and Immunology)(1978)81，1-7)、NS-1(Kohler，G.AndMilstein，C.Eur.J.Immunol.(1976)6，511-519)、  MPC-11(Margulies，D.H.et al.，细胞(Cell)(1976)8，405-415)、SP2/0(Shulman，M.et al.，自然(Nature)(1978)276，269-270)、FO(de St.Groth，S.F.et al.，免疫学方法杂志(J.Immunol.Methods)(1980)35，1-21)、S194(Trowbridge，I.S.，J.Exp.Med.(1978)148，313-323)或R210(Galfre，G.et al.，自然(Nature)(1979)277，131-133)。
免疫细胞与骨髓瘤细胞的细胞融合基本依据任何已知的方法进行，如Milstein等的方法(Kohler，G.and Milstein，C.，Methods Enzymol.(1981)73，3-46)就可被优选应用。
更具体地讲，例如，使细胞融合在有细胞融合促进剂存在的普通营养培养基中进行。细胞融合促进剂可以是聚乙二醇或仙台病毒(日本血凝病毒，HVJ)。如果需要，为提高融合效率，也可加入二甲亚砜。
用于细胞融合的免疫细胞和骨髓瘤细胞间的比例可以是任意的。例如，所用的免疫细胞比骨髓瘤细胞多1-10倍。用于细胞融合的培养基是例如适合骨髓瘤细胞生长的RPMI1640培养基或MEM培养基或其他通常被用来培养这些细胞的培养基。如果需要，血清如胎牛血清可被加到培养基中。
细胞融合如下进行：在培养基中将给定量的免疫细胞和骨髓瘤细胞很好地混合，加入PEG溶液(例如，平均分子量为大约1000-6000)(已被事先预热到大约37℃)通常致其浓度为30-60％(w/v)，接着混合得到的溶液以得到融合细胞(杂交瘤)。接着，加入合适的培养基到培养溶液中，离心除去上清。重复本程序几次以除去培养基中的对杂交瘤生长不利的细胞融合促进剂或类似物。
得到的杂交瘤可通过在通常的选择培养基中培养而选择，如次黄嘌呤-氨基蝶呤-胸苷培养基(HAT)。杂交瘤在HAT培养基中应培养足够的时间以使不是期望的杂交瘤的细胞(即没能杂交的细胞)死亡，通常是培养几天到几个星期。接着，应用通常的限度稀释方法来筛选和单克隆分泌目的抗体的杂交瘤。
另外，对PTHrP具有结合活性的人抗体，可在体外通过应用PTHrP将人淋巴细胞致敏，接着再把致敏的淋巴细胞与能无限增长的来自人的骨髓瘤细胞(日本专利No.1-59878)杂交而得到。或者，抗-PTHrP的人抗体可如下制备，即注射作为抗原的PTHrP到具有人抗体基因的全部组成的转基因动物中，以得到生产抗-PTHrP抗体的细胞，再把细胞无限增殖化，从而可从无限增殖化的细胞中得到人抗体(国际申请公开号Nos.WO94/25585、WO93/12227、WO92/03918和WO94/02602)。
由上述方法制备的产生单克隆抗体的杂交瘤可在通常的培养基中亚培养并在液氮中长期保存。
为从杂交瘤中生产单克隆抗体，可用包括依据通常方法培养杂交瘤和从培养液上清中收集单克隆抗体的方法，或包括注射杂交瘤到与杂交瘤相容以使杂交瘤在其体内生长的哺乳动物和从所用的哺乳动物的腹水中收集杂交瘤的方法。前一种方法适合用来生产高纯度的抗体，而后一种方法适合用来生产大量的抗体。
3.重组抗体
在本发明中，也可应用重组类型的单克隆抗体。这种抗体可依据通常的基因重组技术(参见，例如Vandamme，A.M.et al.，Eur.J.Biochem.(1990)192，767-775)来生产，包括从杂交瘤中克隆出抗体基因，把抗体基因整合到合适的载体中，把载体引入宿主，再从宿主中生产出抗体。
更具体地讲，从产生抗-PTHrP抗体的杂交瘤中分离出编码抗-PTHrP抗体的可变区的mRNA。该mRNA的分离程序为，用任何已知的方法制备总RNA，例如胍超离心方法(Chirgwin，J.M.et al.，Biochemistry(1979)18，5294-5299)和AGPC方法(Chomczynski，P.et al.，Anal.Biochem.(1987)162，156-159)，接着用mRNA纯化试剂盒(Pharmacia)或其类似物从总RNA中得到目的mRNA。或者，该mRNA也可应用mRNA快速纯化试剂盒(Pharmacia)直接制备。
下一步，应用逆转录酶从mRNA合成抗体V-区域的cDNA。应用AMV逆转录酶第一链cDNA合成试剂盒(Seikagaku公司)或其类似物来合成cDNA。也可使用5′-Ampli Finder Race Kit(Clontech)通过5′-RACE方法(Frohman，M.A.et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1988)85.8998-9002；Belyavsky，A.et al.，Nucleic Acids Res.(1989)17，2919-2932)并与PCR方法相结合，或其类似方法来合成和扩增cDNA。
将目的DNA片段从得到的PCR产物中分离和纯化出来，并被连接DNA载体上去，形成重组载体。将重组载体导入宿主如大肠杆菌中，选择含有期望的重组载体的菌落。用如双脱氧核苷酸链终止方法来确认在重组载体中的目的DNA片段。
一旦得到编码抗-PTHrP抗体的V-区域的DNA，就把DNA整合到包含编码抗体恒定区(C)的DNA的表达载体中去。
为生产在本发明中应用的抗-PTHrP抗体，将抗体基因整合到表达载体上去，因而抗体基因可在表达控制区域(如增强子、启动子)的控制下表达。用表达载体转化宿主细胞以表达抗体。
在抗体基因的表达中，编码抗体重链(H)的DNA与编码抗体轻链(L)的DNA可以被整合到不同的表达载体上，接着将宿主细胞用得到的重组表达载体共转化。或者，编码抗体H-链和L-链的DNA可被整合到同一的表达载体中，接着用得到的此重组表达载体(WO94/11523)转化宿主细胞。
在重组抗体的生产中，除了上述的宿主细胞外，转基因动物也可被用作宿主。例如，将抗体基因整合到编码动物奶中的固有蛋白(如羊β-酪蛋白)的基因的预定位点上以得到融合基因。将包括引入了抗体基因的融合基因的DNA片段注射到羊胚胎中，接着把胚胎引入雌羊中。有此胚胎的雌羊就怀有转基因羊。目的抗体就从转基因羊或其后代的奶中分泌出来。为增加含有抗体的奶量，可给转基因羊施用适合的激素(Ebert，K.M.et al.，Bio/Technology(1994)12，699-702)。
4.被修饰的抗体
在本发明中，为了降低对人体或其类似体的异源性，可以应用人工修饰的重组抗体，包括嵌合抗体和人源化的抗体。这些修饰的抗体可通过已知的方法来制备。
在本发明中可用的嵌合抗体的制备可如下完成：连接用上述方法制备的编码抗体V-区的DNA和编码人抗体C-区的DNA，把连接产物整合到表达载体上去，并把得到的重组表达载体引入宿主中来产生嵌合抗体。
人源化抗体也被称为“改形的人抗体”，其中非人哺乳动物(如小鼠)的抗体的互补决定区(CDRs)被嫁接到人的抗体上。生产这种人源化抗体的一般基因重组程序是已知的(EP125023；WO96/02576)。
具体地讲，设计出一个小鼠抗体CDRs通过框架区(FRs)连接起来的DNA序列，并通过应用以几个寡核苷酸为引物的PCR方法来合成，该引物被设计含有与CDRs和FRs的末端区相重叠的区域。将得到的DNA与编码人抗体C-区的DNA连接，连接产物被整合到表达载体上去。把得到的重组表达载体引入宿主中以生产人源化的抗体(EP239044，WO96/02576)。对通过CDRs连接的FRs加以选择以使CDRs能形成令人满意的抗原结合区。如果需要，可将抗体V-区的FRs中的一个(或几个)氨基酸置换以使改形的人抗体能形成适合的抗原结合位点(Sato，K.et al.，Cancer Res.(1993)53，851-856)。
嵌合抗体或人源化抗体的C-区可是任何人抗体的C-区，如H-链的Cγ1、Cγ2、Cγ3或Cγ4，和L-链的Cκ或Cλ。为了提高抗体的稳定性或为了保证抗体的稳定产生，人抗体的C-区可被修饰。
嵌合抗体由来自非人的哺乳动物抗体的V-区和来自人抗体的C-区组成。人源化的抗体由来自非人的哺乳动物抗体的CDRs和来自人抗体的FRs与C-区组成。人源化的抗体对于本发明的治疗剂来说是特别有用的活性成分，因为此抗体对人体的抗原性已被减低。
在本发明中应用的人源化抗体的一个具体例子是人源化抗体#23-57-137-1；其CDRs来自源于小鼠产生的抗体#23-57-137-1，其L-链由通过三个来自人抗体HSU03868(GEN-BANK，Deftos，M.et al.，Scan.J.Immunol.，39，95-103，1994)的FRs(FR1、FR2和FR3)连接的CDRs和来自人抗体S25755(NBRF-PDB)的FR(FR4)组成；其H-链由通过来自人抗体S31679(NBRF-PDB，Guisinier，A.M.et al.，Eur.J.Immunol.23，110-118，1993)的FRs连接的CDRs组成，其中FRs中氨基酸残基的一部分被置换以使该被改形的人源化抗体能表现出抗原结合活性。
分别含有编码人源化抗体#23-57-137-1的H-链和L-链的DNA的质粒的大肠杆菌菌株，分别被命名为大肠杆菌JM109(hMBC1HcDNA/pUC19)(为H-链)和大肠杆菌JM109(hMBC1Lqλ/pUC19)(为L-链)。这些菌株按照《布达佩斯条约》于1996年8月15日被保存在日本的日本国立生命科学和人体技术研究所(1-3，Higashi 1-chome，Tsukuba-shi，Ibaraki，Japan)，其中大肠杆菌JM109(hMBC1HcDNA/pUC19)编号为No.FERM BP-5629，大肠杆菌JM109(hMBC1Lqλ/pUC19)的编号为No.FERM BP-5630。
5.抗体变异体
在本发明中应用的抗体可以是其任何片段或此片段的修饰物，只要它能结合PTHrP并抑制PTHrP的活性即可。例如，该抗体片段包括Fab、F(ab’)2、Fv或由通过一个适合的连接子连接的H-链Fv片段或L-链Fv片段组成的单链Fv(scFv)。具体地讲，这些抗体片段可通过用酶(如木瓜蛋白酶、胃蛋白酶)把抗体切割成抗体片段来得到，或者通过重组构建编码抗体片段的基因、把基因插入到表达载体、将得到的重组表达载体引入合适的宿主细胞而表达出抗体片段(参见，例如Co，M.S.，et al.，免疫学杂杂(J.Immunol.)(1994)，152，2968-2976；Better，M.& Horwitz，A.H.，酶学方法(Methods in Enzymology)(1989)，178，476-496，Academic Press，Inc.；Plueckthun，A.& Skerra，A.，酶学方法(1989)178，476-496，Academic Press，Inc.；Lamoyi，E.，酶学方法(1989)121，652-663；Rousseaux，J.et al.，酶学方法(1989)121，663-669；and Bird，R.E.et al.，TIBTECH(1991)9，132-137)。
scFv可通过连接子连接H-链V-区和L-链V-区而得到，所述连接子优选为肽连接子(Huston，J.S.et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1988)85，5879-5883)。在scFv中的H-链V-区和L-链V-区可从在此描述的任何一个抗体中得到。联结V-区的肽连接子可以是任何单链肽，例如12-19个氨基酸残基的肽。
编码scFv的DNA可通过以下步骤制备：首先分别扩增编码抗体H-链V-区和L链V-区的DNA，应用编码抗体H-链全部或其部分(包括V-区)的DNA片段和编码L-链全部或其部分(包括V-区)的DNA片段做为模板和决定DNA片段末端的引物对；其次扩增编码肽连接子的DNA，应用编码肽连接子的DNA片段做为模板和决定DNA片段末端的引物对，从而肽连接子的两末端都分别与H链V-区和L链V-区相连。
一旦制备了编码scFv的DNA，就可应用通常的方法来制备载有DNA的表达载体和用此表达载体转化的宿主。可用任何通常的方法从被转化的宿主中制备scFv。
如上所述，在本发明中应用的抗体片段可以通过制备此片段的基因和在适合的宿主中表达此基因来得到。这些抗体片段也被包括在本发明的“抗体”之中。
作为上述抗体的被修饰形式，例如，与任何分子(如聚乙二醇)偶联的抗-PTHrP抗体也可被应用。这些被修饰的抗体也被包括在本发明的“抗体”之中。被修饰的抗体可通过对抗体的化学修饰来制备。适于本目的的化学修饰技术已为本领域所建立。
6.重组抗体和被修饰抗体的表达与生产
如上述所构建的抗体基因可由已知的方法来生产与表达。为了在哺乳动物细胞中表达，需操作性地连接一个通常有用的启动子、要表达的抗体基因和poly(A)信号(位于抗体基因的3′-端下游)。例如，做为有用的启动子/增强子系统，人巨细胞病毒即刻早期启动子/增强子系统可被应用。
其他的启动子/增强子系统，例如那些来自病毒(如逆病毒、多瘤病毒、腺病毒和猴病毒40(SV40))和那些来自哺乳动物细胞(如人延长因子1α(HEF1α))的系统也可被用来表达本发明的抗体。
当应用SV40启动子/增强子系统时，可以直接应用Mulligan等的方法(Nature(1979)277，108)进行基因表达。当应用HEF1α启动子/增强子系统时，可以直接应用Mizushima等的方法(Nucleic Acids Res.(1990)18，5322)进行基因表达。
当在大肠杆菌中表达时，可将一种有用的启动子、一种用于分泌目的抗体的信号序列和抗体基因操作性地连接。作为启动子，lacZ启动子和araB启动子可被应用。当lacZ启动子被应用时，可以用Ward等的方法(Nature(1098)341，544-546；FASBE J.(1 992)6，2422-2427)进行基因表达，而当araB启动子被应用时，可以用Better等的方法(Betteret al.，Science(1988)240，1041-1043)进行基因表达。
对于用于抗体分泌的信号序列来说，当目的抗体要被分泌到大肠杆菌的周质腔中时，pelB信号序列(Lei，S.P.et al.，J.Bacteriol.(1987)169，4379)可被应用。分泌到周质腔中的抗体被分离并接着被重叠以使抗体具有适当的构型。
从病毒(如SV40、多瘤病毒、腺病毒、牛乳头瘤病毒(BPV))来的复制起点或其类似物可被应用。为了提高在宿主系统中的基因拷贝数，表达载体可进一步包含一个选择性的标记基因，如氨基苷磷酸转移酶(APH)基因、胸苷激酶(TK)基因、大肠杆菌黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(Ecogpt)基因和二氢叶酸还原酶(dhfr)基因。
为生产在本发明中应用的抗体，包括真核和原核细胞系统的任何表达系统都可被应用。真核细胞包括已建立的动物(如哺乳动物、昆虫、霉菌和真菌、酵母)细胞系。原核细胞包括细菌细胞如大肠杆菌细胞。
在本发明中应用的抗体优选在哺乳动物细胞中表达，如在CHO、COS、骨髓瘤、BHK、Vero和HeLa细胞中表达。
下一步，被转化的宿主细胞在体外或在体内培养以生产目的抗体。可用任何已知的方法进行宿主细胞培养。在此应用的培养基可是DMEM、MEM、RPMI 1640或IMDM培养基。培养基可含有血清补充物，如胎牛血清。
7.抗体的分离和纯化
如上述所表达与生产的抗体可从细胞或宿主动物体内被分离并被纯化到均一程度。在本发明中应用的抗体的分离与纯化可在亲和柱上进行。蛋白A柱的例子包括Hyper D、POROS、SepharoseF.F.(Pharmacia)。其他分离和纯化抗体的常用方法也可被应用；因而此方法并非特别地被限定。例如，应用包括上述亲和柱的不同的色谱方法、过滤、超过滤、盐析和透析都可被单独或结合应用以分离和纯化目的抗体((抗体-实验室手册Antibodies A Laboratory Manual)，Ed.Harlow，David Lane，冷泉港实验室，1988)。
8.抗体活性的测定
可用任何已知的方法测定在本发明中应用的抗体的抗原结合活性((抗体-实验室手册Antibodies A Laboratory Manual)，Ed.Harlow，David Lane，冷泉港实验室，1988)或对配体受体的抑制活性(Harada，A.et al.，国际免疫学(International Immunology)(1993)5，681-690)。
作为测定在本发明中应用的抗-PTHrP抗体的抗原结合活性的方法，例如，ELISA(酶联免疫吸收测定)、EIA(酶标免疫测定)、RIA(放射免疫测定)或荧光抗体技术均可被应用。例如，当应用酶标免疫测定时，含有抗-PTHrP抗体的样品溶液(例如产生抗-PTHrP抗体的细胞的培养上清或单独以纯化形式存在的抗-PTHrP抗体)被加到用PTHrP(1-34)预先铺被的平板上。再将用酶(如碱性磷酸酶)标记的第二抗体加到平板上。将平板温育和洗涤。将酶的底物(如对-硝基苯磷酸)加到平板上，测定板上溶液的光吸收，以评估抗体的抗原结合活性。
为确定在本发明中应用的抗体的活性，测定抗体(如抗-PTHrP抗体)的中和活性。
9.给药途径和药物制剂
本发明的治疗剂可用于治疗或改善恶病质。可被本发明治疗或改善的恶病质可以是任何形式的恶病质，包括由癌症带来的恶病质。由癌症导致的恶病质的例子包括被描述在J.Urol.(美国)1995年3月，153(3Pt1)p.854-857；Langenbecks Arch.Chir.Suppl II Verh Dtsch Ges Chir(德国)1990，P261-265；Oncology(瑞典)1990，47(1)p.87-91；Iht.J.Pancreatol.(美国)1990年8-11月，7(1-3)p.141-150；J.Natl.Cancer Inst.(美国)1990年12月9日，82(24)p.1922-1926中的那些。
癌症导致的恶病质之外的恶病质的例子包括被描述在JPEN J.Parenter.Enteral Nutr.(美国)1990年11-12月，14(6)p.605-609；Chest(美国)1990年11月，98(5)p.1091-1094；骨髓移植(Bone MarrowTransplant)(英国)1990年7月，6(1)p.53-57中的那些恶病质。
包含抗PTHrP抗体作为活性成分的本发明的治疗剂可口服或肠胃外给药，但肠胃外给药是优选的。所述治疗剂可采用任何制剂形式，如透肺剂(即，一种需在一种装置如雾化器的帮助下给药的试剂)、鼻胃剂(nasogastric agent)、透皮剂(如，膏、霜)或注射剂。注射剂的例子包括用于全身或局部给药的静脉内注射剂(如，滴剂)、肌肉内注射剂、腹膜内注射剂和皮下注射剂。根据患者的年龄和疾病的状况可适当选择给药途径。有效的单一剂量可在0.001-1000mg/kg体重的范围内选择。另外，施给患者的单剂量可在0.01-100000mg/个体的范围内选择。然而，包含本发明的抗PTHrP抗体的治疗剂的剂量不受上面提到的范围的具体限制。
本发明的治疗剂可在任何阶段施用给患者，包括在恶病质发生之前或之后。或者，可在预示着患者要发生体重减轻的阶段施给本发明的治疗剂。
可用任何常规的方法(Remington药物科学，最新版，Mark出版公司，Easton，USA)来配制包含抗PTHrP抗体作为活性成分的本发明的治疗剂。配方中还可包含可药用载体和添加剂。
所述载体和添加剂的例子包括水、可药用的有机溶剂、胶原、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、羧乙烯基聚合物、羧甲基纤维素钠、聚丙烯酸钠、海藻酸钠、水溶性葡聚糖、羧甲基淀粉钠、果胶、甲基纤维素、乙基纤维素、黄原胶、阿拉伯胶、酪蛋白、琼脂、聚乙二醇、二甘油、甘油、丙二醇、凡士林、石蜡、硬脂醇、硬脂酸、人血清白蛋白(HSA)、甘露醇、山梨醇、乳糖和可以作为药物添加剂的表面活性剂。
在实际应用中，添加剂可根据所用的剂型在上述成员中适当选择，可使用其中的一种或多种，但不限于此。例如，可使用通过将纯化形式的抗PTHrP抗体溶解于一种溶剂(如，生理盐水、缓冲液、葡萄糖溶液)中然后再向其中添加抗吸附剂(如，土温80、土温20、明胶、人血清白蛋白)而制成的注射剂。
本发明的治疗剂还可以是需在使用前再-配制的冻干剂形式。对于冻干剂型的制备，可掺入赋形剂如糖醇(如，甘露醇、葡萄糖)和糖。
附图说明
图1是显示抗PTHrP抗体对恶病质的治疗效果的图；
图2是显示抗PTHrP抗体对恶病质的治疗效果的图；
图3是显示抗PTHrP抗体对恶病质的治疗效果的图；
图4是显示抗PTHrP抗体对恶病质的治疗效果的图
图5是抗原结合活性测量结果的显示图；
图6是抗原结合活性测量结果的显示图；
图7是抗原结合活性测量结果的显示图；
图8是抗原结合活性测量结果的显示图；；
图9是抗原结合活性测量结果的显示图；
图10是抗原结合活性测量结果的显示图；
图11是抗原结合活性测量结果的显示图；
图12是抗原结合活性测量结果的显示图；
图13是人源化抗体的中和活性的显示图；
图14是人源化抗体的中和活性的显示图；
图15是人源化抗体的中和活性的显示图；
图16是显示人源化抗体对恶病质的治疗效果的图；
图17是显示人源化抗体对恶病质的治疗效果的图；
图18是显示人源化抗体对恶病质的治疗效果的图；
图19是显示人源化抗体对恶病质的治疗效果的图；
具体实施方式
下文将结合下列参考实施例和实施例详细描述本发明，但不应将这些参考实施例和实施例看成对本发明范围的限制。
实施例1使用恶病质动物模型的药理学试验
使用恶病质动物模型(一种被植入了人肿瘤的裸鼠)，来检验抗PTHrP的鼠单克隆抗体对恶病质的治疗效果。
使用植入了人口腔癌OCC-1(从Central Institute for ExperimentalAnimal购得)的裸鼠作为恶病质动物模型。人们已经知道随着肿瘤体积的增大，植入了人口腔癌OCC-1的裸鼠表现出血钙水平升高，并发展出恶病质症状如体重减轻和活动减少。在该试验中，就所述的鼠单克隆抗体对上述由人口腔癌OCC-1诱导的恶病质的血钙水平、体重改善和存活时间延长的效果进行了评定。
使用BALB/c-nu/nu裸鼠(Japan CLEA Co.，Inc.)将人口腔癌OCC-1在体内传代。对于药学效果的评定，购买6周龄的BALB/c-nu/nu裸鼠(Japan CLEA Co.，Inc.)并使之适应环境一周，以得到在该评价试验中使用的7周龄小鼠。
按以下方式制备恶病质模型小鼠并分组。从裸鼠中取出被传代的人口腔癌OCC-1，然后将之精细地切成3mm3的小块。将所得的肿瘤块皮下植入小鼠的侧面区域，每只小鼠植入一块。在植入后十天，在证实了各小鼠中的肿瘤体积已变得足够大时，将小鼠分组，以便测定各组小鼠的血钙水平、体重和肿瘤体积的平均值，这些小鼠用作恶病质动物模型。
如下进行对恶病质疗效的试验。
(1)存活时间的观察
在存活时间延长效果的试验中，对试验组小鼠每周给药两次鼠单克隆抗体，并观察各鼠的存活时间。以15mg/kg的剂量经尾静脉对另一组试验小鼠给药一剂现有治疗高钙血的药剂-pamidronate(pamidronate钠；Aredia)。作为该试验中的对照，以0.2ml/鼠的剂量经尾静脉给对照组小鼠施用磷酸盐缓冲液(PBS)，每周两次。结果示于图1。
(2)血钙水平的观察
以每只鼠每次10μg或100μg的剂量经尾静脉对试验组的恶病质模型小鼠给药两次抗PTHrP的鼠单克隆抗体，两次给药间隔两天。以15mg/kg的剂量经尾静脉对另一组试验小鼠给药一剂现有治疗高钙血的药剂-pamidronate(pamidronate钠；Aredia)。作为该试验中的对照，以0.2ml/鼠的剂量经尾静脉给对照组小鼠施用两次磷酸盐缓冲液(PBS)，两次给药间隔两天。
(3)血钙水平的测定
对小鼠给药鼠单克隆抗体后第一天或四天，测定各只小鼠的血钙水平以评价抗体的药效。用hematocrit管从各只小鼠的眼眶采血，并用643型自动Ca/pH分析仪(CIBA-CORNING)分析所采的血样，以全血的钙离子水平来确定血钙水平。每天称量各只小鼠的体重，直至给药抗体后的第四天。结果示于图2和3中。
(4)肿瘤体积的测定
通过测量肿瘤的最长轴(a，mm)和最短轴(b，mm)并将所得的两测量值套入Galant’s方程(ab2/2)，定出给药抗体后第四天的肿瘤体积。结果示于图4。
从这些结果可明显看出，虽然以10μg的剂量被给药抗体的小鼠的血钙水平与被给药了pamidrorate的小鼠的血钙水平相当，但是观察到被给药了抗体的小鼠的体重减轻受到抑制，因其体重减轻不如被给药了pamidronate的小鼠的那样明显。与被给药了pamidronate的小鼠和对照小鼠相比，被以100μg的剂量给药了抗体的小鼠防止了血钙水平的升高并以更大的程度抑制了体重减轻。与被给药了pamidronate的小鼠和对照小鼠相比，在以100μg每周两次的剂量给药了抗-PTHrP中和性抗体的小鼠，其存活时间显著延长(p＝0.0003，Log Rank测验)。结果，发现中和性抗-PTHrP的鼠单克隆抗体具有任何现有的治疗高钙血的药剂所没有的优异效果，如防止体重减轻和延长存活时间。这些结果证明本试验所用的抗体可用作恶性(肿瘤)相关性恶病质的治疗剂。实施例2使用高钙血和恶病质动物模型的药理学试验
使用恶病质动物模型(一种被植入了人肿瘤的裸鼠)，来检验“q”型抗PTHrP的人源化抗体对恶病质的治疗效果。
使用植入了人口腔癌OCC-1(从Central Institute for ExperimentalAnimal购得)的裸鼠作为恶病质动物模型。人们已经知道随着肿瘤体积的增大，植入了人口腔癌OCC-1的裸鼠表现出血钙水平升高，并发展出恶病质症状如体重减轻和活动减少。在该试验中，就所述的“q”型抗PTHrP的人源化抗体对上述由人口腔癌OCC-1诱导的恶病质的血钙水平、体重改善和存活时间延长的效果进行了评定。
使用BALB/c-nu/nu裸鼠(Japan CLEA Co.，Inc.)将人口腔癌OCC-1在体内进行亚培养。对于药学效果的评定，购买6周龄的BALB/c-nu/nu裸鼠(Japan CLEA Co.，Inc.)并使之适应环境一周，以得到在该评价试验中使用的7周龄小鼠。
按以下方式制备恶病质模型小鼠并分组。从裸鼠中取出被传代的人口腔癌OCC-1，然后将之精细地切成3mm3的小块。将所得的肿瘤块皮下植入小鼠的侧面区域，每只小鼠植入一块。在植入后十天，在证实了各小鼠中的肿瘤体积已变得足够大时，将小鼠分组，以便测定各组小鼠的血钙水平、体重和肿瘤体积的平均值，这些小鼠用作恶病质动物模型。
如下进行对恶病质疗效的试验。
(1)存活时间的观察
在存活时间延长效果的试验中，对试验组小鼠每周给药两次“q”型人源化抗体抗体，并观察各鼠的存活时间。作为该试验中的对照，以0.1ml/鼠的剂量经尾静脉给对照组小鼠施用磷酸盐缓冲液(PBS)，每周两次。结果示于图16。
(2)血钙水平的观察
以每只鼠每次10μg或100μg的剂量经尾静脉对试验组小鼠给药两次“q”型抗PTHrP的人源化抗体，两次给药间隔两天。作为该试验中的对照，以0.1ml/鼠的剂量经尾静脉两次给对照组小鼠施用磷酸盐缓冲液(PBS)，两次施用间隔2天。
(3)血钙水平的测定
对小鼠给药“q”型抗PTHrP的人源化抗体后第一天或四天，测定各只小鼠的血钙水平以评价抗体的药效。用hematocrit管从各只小鼠的眼眶采血，并用643型自动Ca/pH分析仪(CIBA-CORNING)分析所采的血样，以全血的钙离子水平来确定血钙水平。每天称量各只小鼠的体重，直至给药抗体后的第四天。结果示于图17和18中。
(4)肿瘤体积的测定
通过测量肿瘤的最长轴(a，mm)和最短轴(b，mm)并将所得的两测量值套入Galant’s方程(ab2/2)，定出第一次给药抗体后第四天的肿瘤体积。结果示于图19。
从这些结果可明显看出，被以10μg或100μg的剂量给药抗体的小鼠，其血钙水平的升高得到了防止，其体重减轻受到抑制，因其体重减轻不如对照小鼠的那样明显。与对照鼠相比，被以100μg的剂量一周两次给药了“q”型抗PTHrP的人源化抗体的小鼠，其存活时间显著延长(p=0.0108，Log Rank测验)。这些“q”型抗PTHrP的人源化抗体对恶性(肿瘤)相关性恶病质的作用效果与上述受试的鼠单克隆抗体的作用效果类似。这些结果证明本试验所用的抗体可用作恶性(肿瘤)相关性恶病质的治疗剂。
参考实施例1
产生抗-PTHrP(1-34)鼠单克隆抗体的杂交瘤的制备能够产生抗人PTHrP(1-34)(SEQ ID NO：75)、#23-57-154和#23-57-137-1单克隆抗体的杂交瘤按照Kanji Sato等报道的方法制备(Sato，K.等，J.Bone Miner.Res.，8，849-860，1993)。
使用的免疫原是PTHrP(1-34)(Peninsula)，用碳二亚胺(Dojinn)将所述PTHrP键合到载体蛋白甲状腺球蛋白上。透析甲状腺球蛋白键合的PTHrP(1-34)，获得蛋白浓度为2μg/毫升的溶液。将得到的溶液与弗氏佐剂(Difco)以1∶1的比例混合得到乳剂。该乳剂以100μg/只鼠的剂量分别对16只BALB/C雌鼠背部皮下注射或腹膜内注射11次以免疫接种鼠。第一次免疫注射时使用弗氏完全佐剂，在随后的加强免疫注射中，使用弗氏不完全佐剂。
以下列方式测定每只免疫接种鼠血清中的抗体滴度。从每只鼠尾静脉取血，然后离心该血样获得抗血清。该抗血清用RIA缓冲液稀释，与125I-标记的PTHrP(1-34)混合，然后测定其结合活性。对已被确定具有足够高的抗体滴度的鼠以50μg/只鼠的剂量腹膜内注射无载体蛋白的PTHrP(1-34)，进行最后的免疫接种。
上述最后免疫接种后三天，处死鼠，切下它们的脾。然后，按照已知的常规方法用50％聚乙二醇4000使脾细胞与鼠骨髓瘤细胞系P3x63Ag8U.1进行细胞融合。如此制备的融合细胞在96孔的平板中以2×104/孔的量在85个孔中接种。杂交瘤通过HAT培养如下述进行筛选。
观察到细胞在HAT培养基中生长的孔的培养物上清液中通过固相RIA法确定有PTHrP-识别抗体的存在来筛选杂交瘤。从已被确实具有PTHrP-识别抗体结合能力的孔中收集杂交瘤。将获得的杂交瘤悬浮于含15％FCS并添加OPI-补充物(Sigma)的RPMI-1640培养基中，随后采用限制稀释法匀化杂交瘤，因此获得两种杂交瘤克隆类型，#23-57-154和#23-57-137-1，均对PTHrP(1-34)表现强结合能力。
被命名为“鼠-鼠杂交瘤#23-57-137-1”的杂交瘤克隆#23-57-137-1已经按照布达佩斯条约的条款于1996年8月15日保藏在日本国立生命科学和人体技术研究所(1-3，Higashi 1-chome，Tsukuba-shi，Ibaragi-ken，日本)，登记号为FERM BP-5631。
参考实施例2
编码鼠抗人PTHrP(1-34)的鼠单克隆抗体v区DNA的克隆
编码上述从#23-57-137-1获得的鼠抗人PTHrP(1-34)单克隆抗体V区的DNA，按照下列方式进行克隆。
(1)mRNA的制备
从杂交瘤#23-57-137-1用Quick Prep mRNA纯化试剂盒(Pharmacia Biotech)如下述制备mRNA。也就是，将上述获得的杂交瘤#23-57-137-1细胞用提取缓冲液完全匀化，用低聚(dT)-纤维素旋转柱按照试剂盒生产商规定的程序从其中分离并提取mRNA。所得提取溶液用乙醇沉淀，获得作为沉淀的mRNA。将mRNA沉淀溶解于洗脱缓冲液中。
(2)编码鼠H链V区基因的cDNA的制备和扩增
(i)#23-57-137-1抗体H链V区的cDNA的克隆
编码抗人PTHrP鼠单克隆抗体H链V区的DNA通过5′-RACE法克隆(Frohman，M.A.等，美国国家科学院年报，85，8998-9002，1988；Belyavsky，A.等，核酸研究17，2919-2932，1989)。该5′-RACE法用5′-Ampli FINDER RACE试剂盒(CLONETECH)按照核试剂盒所附的说明进行。该方法中，用于合成cDNA的引物是MHC2引物(SEQ ID NO：1)，其可与鼠H链C区杂交。将作为cDNA合成模板的上述获得的mRNA(2μg)与10pmoles MHC2引物混合。得到的混合物与逆转录酶在52℃反应30分钟以实现从mRNA到cDNA的逆转录。
将所得的反应溶液与6N NaOH混合以水解其中残存的mRNA(65℃反应30分钟)，然后进行乙醇沉淀，分离纯化作为沉淀的cDNA。将如此分离到的cDNA与T4 RNA连接酶在37℃反应6小时再另外于室温反应16小时，以使cDNA连接到Ampli FINDER Anchor(SEQ IDNO：42)的5′末端上。使用了锚引物(SEQ ID NO：2)和MHC-G1引物(SEQ ID NO：3)作为PCR法扩增cDNA的引物(S.T.Jones等，生物技术，9，88，1991)。
该方法中使用的PCR溶液(每50μl)包括10mM Tris-HCl(pH8.3)、50mM KCl、0.25mM dNTP(dATP、dGTP、dCTP、dTTP)、1.5mM MgCl2、  2.5单位TaKaRa Taq(Takara Shuzo株式会社)、10pmoles锚引物和1μl MHC-G1引物和Ampli FINDER Anchor引物连接在其上的cDNA反应混合物，并且该PCR溶液上用50μl矿物油液封。用480J型热循环仪(Perkin Elmer)进行PCR反应30个循环：94℃45秒；60℃45秒；72℃2分钟。
(ii)#23-57-137-1抗体L链V区的cDNA的克隆
编码抗人PTHrP的鼠单克隆抗体L链V区的基因通过5′-RACE法克隆(Frohman，M.A.等，美国国家科学院年报，85，8998-9002，1988；Belyavsky，A.等，核酸研究17，2919-2932，1989)。该5′-RACE法用5′-Ampli FINDER RACE试剂盒(Clonetech)按照该试剂盒所附的说明进行。该方法中，将低聚-dT引物用作合成cDNA的引物。2μg如上述制备的mRNA(作为cDNA合成模板)与低聚-dT引物混合。得到的混合物与逆转录酶在52℃反应30分钟以实现从mRNA到cDNA的逆转录。所得反应溶液与6N NaOH混合以水解其中残存的任何RNA(65℃反应30分钟)，得到的反应溶液用乙醇沉淀，分离并纯化作为沉淀的cDNA。如此合成的cDNA与T4 RNA连接酶在37℃反应6小时再另外于室温反应16小时，以使cDNA连接到Ampli FINDER Anchor的5′末端上。
在鼠L链λ链C区保守序列的基础上设计PCR引物MLC(SEQ IDNO：4)，然后用394DNA/RNA合成仪(ABI)合成该引物。用于合成引物的PCR溶液(每100μl)包括10mM Tris-HCl(pH8.3)、50mM KCl、0.25mM dNTP(dATP、dGTP、dCTP、dTTP)、1.5mM MgCl2、2.5单位AmpliTaq(Perkin Elmer)、50pmoles锚引物(SEQ ID NO：2)和1μl MLC(SEQ ID NO：4)引物和Ampli FINDER锚引物连接在其上的cDNA反应混合物，上面覆盖50μl矿物油。用480J型热循环仪(PerkinElmer)进行35个PCR反应循环：94℃45秒；60℃45秒；72℃2分钟。
(3)PCR产物的纯化和裂解成片段
上述PCR法扩增的每种DNA片段用3％Nu Sieve GTG琼脂糖(FMC Bio.产品)通过琼脂糖凝胶电泳分离。为了得到每种H链V区和L链V区，分别从凝胶上切下包含长度约为550碱基对DNA片段的琼脂糖凝胶段。所获得的每种凝胶段用GENECLEAN II试剂盒(BIO101)按照试剂盒所附的说明纯化其中的目的DNA片段。纯化的DNA用乙醇沉淀出来，然后溶解于含10mM Tris-HCl(pH7.4)和1mMEDTA的20μl溶液中。这样制备的DNA溶液的一部分(1μl)用限制性酶XmaI(New England Biolabs)于37℃消化1小时，另外用限制性酶EcoRI(Takara Shuzo株式会社)于37℃消化1小时。将消化溶液用苯酚和氯仿提取，然后用乙醇沉淀，收集DNA。
按照这种方式分别获得了编码鼠H链V区的DNA和编码鼠L链V区的DNA，它们都具有5′末端的EcoRI识别序列和3′末端的XmaI识别序列。
使用DNA连接试剂盒ver.2(Takara Shuzo株式会社)按照该试剂盒所附的说明于16℃反应1小时，而将包含编码鼠H链V区DNA或编码鼠L链V区DNA的EcoRI-XmaI DNA片段分别连接到事先用EcoRI和XmaI消化的pUC19载体上。将获得的连接混合物的一部分(10μl）加入100μl含大肠杆菌JM109(Nippon Gene株式会社)感受态细胞的溶液中。冰上静置细胞混合物15分钟，42℃静置1分钟，然后再于冰上静置1分钟。所得细胞混合物与300μl SOC培养基混合(分子克隆：实验室手册，Sambrook，等，Cold Spring Harbor Laborarory Press，1989)，于37℃保温30分钟。将得到的细胞溶液铺板接种到添加有100或50μg/毫升氨苄青霉素、0.1mM IPTG和20μg/毫升X-gal的LB或2xYT琼脂培养基上(分子克隆：实验室手册，Sambrook，等，Cold Spring HarborLaborarory Press，1989)，然后于37℃保温过夜。按照这种方式，即可制备大肠杆菌转化体。
将该转化体在含100或50μg/毫升氨苄青霉素的2毫升LB或2xYT培养基上于37℃培养过夜，然后用质粒提取仪PI-100∑(Kurabou工业株式会社)或QIAprep Spin质粒试剂盒(QIAGEN)从细胞碎片制备质粒DNA。测序确定所获得的质粒DNA的序列。
(4)编码鼠抗体V区的cDNA序列
承载于质粒上的编码区cDNA序列用染料终止子循环测序试剂盒(Perkin-Elmer)由DNA测序仪373A(ABI；Perkin-Elmer)确定。在该测序中，使用了M13引物M4(Takara Shuzo株式会社)(SEQ ID NO：5)和M13引物RV(Takara Shuzo株式会社)(SEQ ID NO：6)，在两个方向上测定碱基序列。
将所获得的包含编码来源于杂交瘤#23-57-137-1的鼠H链V区基因的质粒命名为“MBC1H04”，将包含编码来源于杂交瘤#23-57-137-1的鼠L链V区基因的质粒命名为“MBC1L24”。编码鼠#23-57-137-1抗体H链V区的承载于质粒MBC1H04上的DNA序列和编码鼠#23-57-137-1抗体L链V区的承载于质粒MBC1L24上的DNA序列(包括相应的氨基酸序列)分别如SEQ ID NO：57和65所示。H链V区片段和L链V区片段的多肽分别从SEQ ID NO：57和65所示DNA序列的第58个碱基(编码谷氨酰胺)开始翻译。H链V区和L链V区的氨基酸序列分别如SEQ ID NO：46和45所示。
具有质粒MBC1H04的大肠杆菌和具有质粒MBC1L24的大肠杆菌分别被命名为“大肠杆菌JM109(MBC1H04)”和“大肠杆菌JM109(MBC1L24)”。这些大肠杆菌株系已经按照布达佩斯条约的条款于1996年8月15日保藏在日本国立生命科学和人体技术研究所(1-3，Higashi 1-chome，Tsukuba-shi，Ibaragi-ken，日本)，大肠杆菌JM109(MBC1H04)的登记号为FERM BP-5628，大肠杆菌JM109(MBC1L24)的登记号为FERM BP-5627。
(5)抗人PTHrP鼠单克隆抗体#23-57-137-1的CDR的确定
H链V区和L链V区的一般结构彼此相似。即，两者都有通过三个高可变区(即，互补决定区(CDR))连接的四个框架区的结构。框架区的氨基酸序列相对保守，而CDR区的氨基酸序列表现出相当高的可变性(Kabat，E.A.等，“具有免疫活性的蛋白序列”，美国健康和人服务部门，1983)。基于上述事实，可以参考Kabat，E.A.等建立的抗体氨基酸序列数据库通过检索抗人PTHrP的鼠单克隆抗体V区氨基酸序列的同源性来确定CDR。
L链V区中CDR1-3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO：59-61所示，H链V区中CDR1-3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO：62-64所示。
                          表1
 V区 SEQ ID NO     CDR1     CDR2     CDR3
 H链V区L链V区     5765     31-3523-34     50-6650-60     99-10793-105
参考实施例3
嵌合抗体的构建
(1)嵌合抗体H链的构建
(i)H链V区的构建
编码鼠H链V区的克隆cDNA用PCR法修饰，以将其连接到携带人H链V区Cγ1基因组DNA的表达载体上。所使用的反向引物MBC1-S1(SEQ ID NO：7)被设计为可以与编码V区引导序列5′-末端区的DNA杂交，并具有Kozak共有序列(Kozak，M等，分子生物学杂志，196，947-950，1987)和HindIII-识别序列。使用的正向MBC1-a(SEQID NO：8)被设计为可以与编码J区3′-末端区的DNA杂交，并具有供体剪接序列和BamHI-识别序列。使用TaKaRa Ex Taq(Takara Shuzo株式会社)及所附的缓冲液进行PCR反应。使用的PCR溶液(每50μl)包括0.07μg的作为模版DNA的质粒MBC1H04，50pmole作为引物的MBCl-a和50pmole的MBC1-S1，添加到缓冲液中2.5U的TaKaRa ExTaq和0.25mM的dNTP；液面用50μl矿物油覆盖。PCR反应进行30次循环，循环温度为94℃1分钟；55℃1分钟；72℃2分钟。如此PCR反应扩增的DNA片段使用3％Nu Sieve GTG琼脂糖(FMC Bio.产品)通过琼脂糖电泳分离。
然后，切下含长度为437碱基对DNA片段的琼脂糖凝胶片段，用GENECLEAN II试剂盒(BIO101)按照试剂盒所附的说明纯化DNA片段。纯化的DNA通过乙醇沉淀收集，然后溶解于20μl含10mMTris-HCl(pH7.4)和1mM EDTA的溶液中。得到的DNA溶液的一部分(1μl)用限制性酶BamHI和HindIII(Takara Shuzo株式会社)于37℃消化1小时。消化溶液用苯酚和氯仿提取，然后乙醇沉淀收集目的DNA。
将所获得的包含编码鼠H链V区DNA的HindIII-BamHI DNA片段亚克隆到用HindIII和BamHI消化过的pUC19载体上。得到的质粒使用M13引物M4和M13引物RV作为引物，并使用染料终止子循环测序试剂盒(Perkin-Elmer)通过DNA测序仪373A(Perkin-Elmer)测序。结果，包含编码来源于杂交瘤#23-57-137-1的鼠H链V区的正确碱基序列的DNA并在其5′末端区具有HindIII识别序列和Kozak序列以及在其3′末端区具有BamHI识别序列的质粒被命名为“MBC1H/pUC19”。
(ii)用于制备鼠-人嵌合H链cDNA型的H链V区的构建
上述步骤构建的编码鼠H链V区的DNA用PCR法修饰，以使其连接到人H链C区Cγ1的cDNA上。设计了用于修饰H链V区的反向引物MBC1HVS2(SEQ ID NO：9)以便用甘氨酸替代编码H链V区引导序列前面部分序列的第二个氨基酸(即，天冬氨酸)，并使之具有Kozak共有序列(Kozak，M等，分子生物学杂志，196，947-950，1987)及HindIII-和EcoRI-识别序列。同时设计了用于修饰H链V区的正向引物MBC1HVR2(SEQ ID NO：10)以便其可与编码J区3′末端区的DNA序列和编码C区5′末端区的DNA杂交，并具有ApaI-和SmaI-识别序列。
使用TaKaRa Ex Taq(Takara Shuzo株式会社)及所附的缓冲液进行PCR反应。使用的PCR溶液(每50μl)包括0.6μg的质粒MBC1H/pUC19作为模版DNA，50pmole的MBC1HVS2和50pmole的MBC1HVR2作为引物，缓冲液中的2.5U的TaKaRa Ex Taq和0.25mM的dNTP；液面用50μl矿物油覆盖。PCR反应进行30次循环，循环温度为94℃1分钟；55℃1分钟；72℃1分钟。PCR反应扩增的DNA片段使用1％Sea Kem GTG琼脂糖(FMC Bio.产品)通过琼脂糖电泳分离。然后，切下含长度为456碱基对DNA片段的琼脂糖凝胶片段，用GENECLEAN II试剂盒(BIO101)按照试剂盒所附的说明纯化其中的DNA片段。纯化的DNA乙醇沉淀收集，然后溶解于20μl含10mMTris-HCl(pH7.4)和1mM EDTA的溶液中。
得到的DNA溶液(1微升)用限制性酶EcoRI和SmaI(Takara Shuzo株式会社)于37℃消化1小时。消化混合溶液用苯酚和氯仿提取，然后乙醇沉淀收集DNA。将所获得的包含编码鼠H链V区基因的EcoRI-SmaI DNA片段亚克隆到用EcoRI和SmaI消化过的质粒pUC19载体上。得到的质粒使用M13引物M4和M13引物RV作为引物，并使用染料终止子循环测序试剂盒(Perkin-Elmer)通过DNA测序仪373A(Perkin-Elmer)测序。结果，包含编码来源于杂交瘤#23-57-137-1的鼠H链V区的正确碱基序列的DNA并在其5′末端区具有HindIII识别序列和Kozak序列以及在其3′末端区具有ApaI和SmaI识别序列的质粒被命名为“MBC1Hv/pUC19”。
(iii)嵌合抗体H链表达载体的构建
包含人抗体H链C区Cγ1的cDNA按照如下方法制备。从被导入了编码人源化PM1抗体H链V区和人抗体H链C区IgG1的基因组DNA的表达载体DHFR-ΔE-RVh-PM-1-f(见WO92/19759)和编码人源化PM1抗体L链V区和人抗体L链κ链C区的基因组DNA的表达载体RV1-PM1a(见WO92/19759)的CHO细胞中制备mRNA。通过获得的mRNA，用RT-PCR法克隆包含人源化PM1抗体H链V区和人抗体C区Cγ1的cDNA，然后亚克隆到质粒pUC19的HindIII-BamHI位点。确定亚克隆质粒的DNA序列，具有正确碱基序列的质粒被命名为“pRVh-PM1 f-cDNA”。
制备了具有在SV40启动子和DHFR基因之间HindIII位点缺失和EF-1α启动子和人源化PM1抗体H链V区之间EcoRI位点缺失的表达载体，用于构建包含人源化PM1抗体H链V区和人抗体C区Cγ1基因的cDNA的表达载体。
获得的质粒pRVh-PM1f-cDNA用BamHI消化，用Klenow片段使末端平齐化，进一步用HindIII消化，从而获得平端HindIII-BamHI片段。这种平端HindIII-BamHI片段被分别连接到上述已经用HindIII和BamHI消化过的有HindIII位点和BamHI位点缺失的表达载体DHFR-ΔE-RVh-PM1-f上因此，构建出了包含编码人源化PM1抗体H链V区和人抗体C区Cγ1的cDNA的表达载体RVh-PM1f-cDNA。
包含编码人源化PM1抗体H链V区和人抗体C区Cγ1的cDNA的表达载体RVh-PM1f-cDNA用ApaI和BamHI消化，从其中收集包含H链C区的DNA片段。将得到的DNA片段导入上述用ApaI和BamHI消化过的质粒MBC1Hv/pUC19中。如此制备的质粒被命名为“MBC1HcDNA/pUC19”。这种质粒是分别包含编码鼠抗体H链V区和人抗体C区Cγ1的cDNA的质粒，并在其5′端具有EcoRI-和HindIII-识别序列以及在其3′端具有BamHI-识别序列。
质粒MBC1HcDNA/pUC19用EcoRI和BamHI消化以获得编码嵌合抗体H链的DNA片段。将得到的DNA片段导入预先用EcoRI和BamHI消化的表达载体pCOS1中。这样获得的编码嵌合抗体的表达载体被命名为“MBC1HcDNA/pCOS1”。其中，用EcoRI和SamI消化使HEF-PMh-gγ1(见WO92/19759)抗体基因缺失，然后将它连接到EcoRI-NotI-BamHI接合物(Takara Shuzo株式会社)上，而构建出表达载体pCOS1。
为制备在CHO细胞中表达的质粒，质粒MBC1HcDNA/pUC19用EcoRI和BamHI消化以获得编码嵌合抗体H链的DNA，然后其被导入预先用EcoRI和BamHI消化的表达质粒pCHO1中。这样获得的编码嵌合抗体的表达质粒指定为“MBC1HcDNA/pCHO1”。其中，用EcoRI和SamI消化使DHFR-ΔE-RVh-PM1-f(见WO92/19759)抗体基因缺失，然后将它连接到EcoRI-NotI-BamHI接合体上(Takara Shuzo株式会社)上，以构建表达载体pCHO1。
(2)人L链C区的构建
(i)克隆载体的制备
为构建包含人L链C区基因的pUC19载体，制备了HindIII位点缺失的pUC19载体。2μg的pUC19载体在20μl包含20mM Tris-HCl(pH8.5)、10mM MgCl2、1mM DTT、100mM KCl、8U HindIII(TakaraShuzo株式会社)反应液于37℃消化1小时。得到的消化混合溶液用苯酚和氯仿提取，然后用乙醇沉淀，收集目的DNA。
将收集到的DNA在50μl包含50mM Tris-HCl(pH7.5)、10mMMgCl2、1mM DTT、100mM NaCl、0.5mM dNTP和6U Klenow片段(GIBCO BRL)的反应液中于室温反应20分钟，生成平齐化DNA末端。这种反应混合物用苯酚和氯仿提取，然后用乙醇沉淀收集载体DNA。
这样收集到的载体DNA在10μl包含50mM Tris-HCl(pH7.6)、10mM MgCl2、  1mM ATP、1mM DTT、5％(v/v)聚乙二醇-8000和0.5U T4 DNA连接酶(GIBCO BRL)的反应液中16℃反应2小时以使载体DNA自主连接。将5μl反应液加入100μl包含感受态大肠杆菌JM109细胞(日本基因株式会社)的溶液中，得到的溶液在冰上静置30分钟，42℃静置1分钟，进一步置于冰上1分钟。向反应溶液中加入了500微升SOC培养基，37℃培养1小时。得到的溶液在表面添加有X-gal和IPTG的2xYT琼脂培养基(包含50μg/毫升的氨苄青霉素)上铺板(分子克隆：实验室手册，Sambrook，等，Cold Spring Harbor LaboratoryPress，1989)，然后37℃培养过夜，由此获得转化体。
转化体在包含氨苄青霉素(50μg/毫升)2xYT琼脂培养基中37℃培养过夜。从培养基的细胞碎片用质粒Mini试剂盒(QIAGEN)按照试剂盒上的介绍分离并纯化质粒DNA。纯化的质粒用HindIII消化。证实具有HindIII位点缺失的质粒被命名为“pUC19 ΔHindIII”。
(ii)编码人L链λ链C区DNA的构建
已经知道人抗体L链λ链C区具有至少四种同种型，包括Mcg+Ke+Oz-，Mcg-Ke-Oz-，Mcg-Ke-Oz+和Mcg-Ke+Oz-(P.Dariavach，等，美国国家科学院年报，84，9074-9078，1987)。基于EMBL数据库检索与#23-57-137-1鼠L链λ链C区同源的人抗体L链λ链C区。结果发现人抗体L链λ链的同种型Mcg+Ke+Oz-(保藏编号为X57819)(P.Dariavach，等，美国国家科学院年报，84，9074-9078，1987)表现出与#23-57-137-1鼠L链λ链C区有最高的同源性，氨基酸序列为64.4％的同源性，DNA序列为73.4％的同源性。
然后，用PCR法构建编码人抗体L链λ链C区的DNA。下列使用的每种引物均通过394DNA/RNA合成仪(ABI)合成。合成的引物HLAMB1(SEQ ID NO：11)和HLAMB3(SEQ ID NO：13)均具有有义DNA序列，引物HLAMB2(SEQ ID NO：12)和HLAMB4(SEQ ID NO：14)均具有反义DNA序列，每种引物的两个末端均包含长度为20-23碱基对的互补序列。
外部引物HLAMBS(SEQ ID NO：15)和HLAMBR(SEQ ID NO：16)分别具有与引物HLAMB1和HLAMB4互补的序列。HLAMBS包含EcoRI-，HindIII-和BlnI-识别序列，HLAMBR包含EcoRI-识别序列。在第一次PCR反应中进行了HLAMB1-HLAMB2间的反应和HLAMB3-HLAMB4间的反应。反应完成后，将这两种生成物等量混合，然后进入第二次PCR反应。向反应物中加入外部引物HLAMBS和HLAMBR。使反应混合物进行第三PCR反应用于扩增全长DNA。
PCR反应用TaKaRa Ex Taq(Takara Shuzo株式会社)按照该试剂盒所附的说明进行。第一次PCR反应中，使用了100μl包含5pmoleHLAMB 1、0.5pmole HLAMB2和5U TaKaRa Ex Taq(Takara Shuzo株式会社)的反应液或者包含0.5pmole HLAMB3、5pmole HLAMB4和5U TaKaRa Ex Taq(Takara Shuzo株式会社)的反应液，液面用50μl矿物油覆盖，PCR反应进行5次循环，温度循环程序为94℃1分钟；60℃1分钟；72℃1分钟。
第二次PCR反应中，使用两种反应液(各50μl)的混合物，液面用50μl矿物油覆盖。PCR反应进行3个循环，温度循环程序为94℃1分钟；60℃1分钟；72℃1分钟。
第三次PCR反应中，向反应液中加入外部引物HLAMBS和HLAMBR各50pmole，PCR反应进行30个循环，温度循环程序为94℃1分钟；60℃1分钟；72℃1分钟。
第三次PCR反应获得的DNA片段用3％低熔点琼脂糖凝胶(NuSieve GTG Agarose，FMC)进行电泳，用GENECLEAN II试剂盒(BIO101)按照试剂盒上介绍的程序从凝胶中收集和纯化。
将这样获得的DNA片段在20μl包含50mM Tris-HCl(pH7.5)、10mM MgCl2、1mM DTT、100mM NaCl、和8U EcoRI(Takara Shuzo株式会社)的反应液中37℃消化1小时。消化液用苯酚和氯仿提取，然后用乙醇沉淀并从中收集DNA。将收集到的DNA溶解于8μl含10mMTris-HCl(pH7.4)和1mM EDTA的溶液中。
如上制备的0.8μg的质粒pUC19 ΔHindIII用EcoRI按照上述同样方式消化。消化液用苯酚和氯仿提取，随后用乙醇沉淀，获得经消化的质粒pUC19 ΔHindIII。这样消化获得的质粒在50μl包含50mMTris-HCl(pH9.0)、1mM MgCl2和碱性磷酸酶(大肠杆菌C75；TakaraShuzo株式会社)的反应液中于37℃反应30分钟以使质粒脱磷酸化(即，BAP-处理)。反应液用苯酚和氯仿提取，用乙醇沉淀并从中收集DNA。这样获得的DNA溶解于10μl含10mM Tris-HCl(pH7.4)和1mM EDTA的溶液中。
这样制备的经BAP-处理的质粒pUC19 ΔHindIII(1μl)与4μl上述PCR反应获得的DNA混合，利用DNA连接试剂盒Ver.2 (Takara Shuzo株式会社)将二者连接起来。将得到的质粒导入感受态大肠杆菌JM109细胞中形成转化体。转化体在2毫升含氨苄青霉素(50μg/毫升)的2xYT培养基中培养过夜。用QIAprep Spin质粒试剂盒(QIAGEN)从细胞碎片分离质粒。
对于所获得的上述质粒，测定克隆DNA的序列。确定DNA序列时，使用了373A DNA测序仪(ABI)和引物“M13引物M4”和“M13引物RV”(Takara Shuzo株式会社)。结果发现克隆DNA中具有长度为12碱基对的缺失部分。该质粒被命名为“CλΔ/pUC19”。然后，为了弥补缺失的这一部分，重新合成了引物HCLMS(SEQ ID NO：17)和HCLMR(SEQ ID NO：18)，并且通过PCR法重新构建了正确的DNA。
用包含缺失DNA的质粒cλΔ/pUC19作为模版以及HLAMBS和HCLMS引物对或引物HCLMS和HLAMB4引物对进行了第一次PCR反应。分别纯化每一个PCR反应产物。在第二次PCR反应中，PCR产物彼此组合在一起。向第二PCR反应产物中加入外部引物HLAMBS和HLAMB4，随后进行第三次PCR反应，以扩增全长DNA。
第一次PCR反应中，使用了100μl包含0.1μg cλΔ/pUC19作为模版、各50pmole的引物HLAMBS和HCLMR或者各50pmole的引物HCLMS和HLAMB4，以及5U TaKaRa Ex Taq(Takara Shuzo株式会社)的反应液，液面用50μl矿物油覆盖，PCR反应进行30个循环，其中温度循环程序为94℃1分钟；60℃1分钟；72℃1分钟。
第一PCR的反应产物，HLAMBS-HCLMR(236碱基对)和HCLMS-HLAMB4(147碱基对)用3％低熔点琼脂糖凝胶进行电泳以分离DNA片段。然后用GENECLEAN II试剂盒(BIO101)从凝胶中收集和纯化DNA片段。第二次PCR反应中，使用了20μl包含40纳克纯化的DNA片段和1U TaKaRa Ex Taq(Takara Shuzo株式会社)的反应液，液面用25μl矿物油覆盖，以温度循环程序为94℃1分钟；60℃1分钟；72℃1分钟进行5个PCR反应循环。
第三次PCR反应中，使用了100μl包含2μl第二次PCR反应得到的反应液、外部引物HLAMBS和HLAMB4各50pmole以及5UTaKaRa Ex Taq(Takara Shuzo株式会社)的反应液，液面用50μl矿物油覆盖，PCR反应进行30个循环，其中温度循环程序为94℃1分钟；60℃1分钟；72℃1分钟，由此得到长度为357碱基对的DNA片段(第三次PCR产物)。用3％低熔点琼脂糖凝胶电泳分离DNA片段。用GENECLEAN II试剂盒(BIO101)收集和纯化产生的DNA片段。
0.1μg这样获得的DNA片段用EcoRI消化，然后亚克隆到预先用BAP处理过的质粒pUC19 ΔHindIII中。得到的质粒导入感受态大肠杆菌JM109细胞以形成转化体。这样制备的转化体在2毫升含氨苄青霉素(50μg/毫升)的2xYT培养基中培养过夜。用QIAprep Spin质粒试剂盒(QIAGEN)从细胞碎片中分离并纯化质粒。
用M13引物M4和M13引物RV(Takara Shuzo株式会社)在373ADNA测序仪(ABI)测定了如此获得的质粒的DNA序列。证明确实无任何缺失的正确DNA序列的质粒被命名为“Cλ/pUC19”。
(iii)编码人L链κ链C区DNA的构建
用PCR法从质粒HEF-PM1k-gk(WO92/19759)克隆了编码L链κ链C区的DNA片段。设计正向引物HKAPS(SEQ ID NO：19)，使之包含EcoRI-、HindIII-以及BlnI-识别序列，并设计反向引物HKAPA(SEQID NO：20)，使之包含EcoRI-识别序列，二者均使用394DNA/RNA合成仪(ABI)合成。
用100μl包含0.1μg质粒HEF-PM1k-gk作为模版、各50pmole引物HKAPS和HKAPA，以及5U TaKaRa Ex Taq(Takara Shuzo株式会社)的反应液进行PCR反应，液面覆盖50μl矿物油，进行PCR反应。PCR反应进行30个循环，其中温度循环为94℃1分钟；60℃1分钟；72℃1分钟，由此得到长度为360碱基对的PCR产物。DNA片段用3％低熔点琼脂糖凝胶电泳分离，然后用GENECLEAN II试剂盒(BIO101)收集和纯化。
这样获得的DNA片段用EcoRI消化，然后克隆到已经用BAP处理过的质粒pUC19 ΔHindIII中。得到的质粒导入感受态大肠杆菌JM109细胞中以形成转化体。这样制备的转化体在2毫升含氨苄青霉素(50μg/毫升)的2xYT培养基中培养过夜。用QIAprep Spin质粒试剂盒(QIAGEN)从细胞碎片中纯化质粒。
纯化的质粒DNA用M13引物M4和M13引物RV(Takara Shuzo株式会社)在373A DNA测序仪(ABI)上测序。证实了具有正确碱基序列的质粒被命名为“Cκ/pUC19”。
(3)嵌合抗体L链表达载体的构建
构建了嵌合#23-57-137-1抗体L链表达载体。将编码#23-57-137-1抗体L链V区的DNA连接到各个质粒Cλ/pUC19和Cκ/pUC19的HindIII和BlnI位点(位于人抗体C区之前)，由此得到包含编码嵌合#23-57-137-1抗体L链V区和L链λ链或κ链C区DNA的pUC19载体。然后用EcoRI消化每种得到的载体以便切出编码嵌合抗体L链的DNA，将该DNA亚克隆到HEF表达载体中。
用PCR法从质粒MBC1L24克隆编码#23-57-137-1抗体L链V区的DNA片段。用394DNA/RNA合成仪(ABI)独立地合成引物。使用的反向引物MBCCHL1(SEQ ID NO：21)被设计为包含Hind III-识别序列和Kozak序列(Kozak，M等，分子生物学杂志，196，947-950，1987)，正向引物MBCCHL3(SEQ ID NO：22)被设计为包含BglII-和RcoRI-识别序列。
用100μl包含10mM Tris-HCl(pH8.3)、50mM KC1、1.5mMMgCl2、0.2mM dNTP、0.1μg MBClL24，各50pmole引物MBCCHLl和MBCCHL3以及1μl AmpliTaq(PERKIN ELMER)的反应液进行PCR反应，液面覆盖50μl矿物油。PCR反应进行30个循环，其中温度循环为94℃45秒；60℃45秒；72℃2分钟。
用3％低熔点琼脂糖凝胶电泳分离出长度为444碱基对的PCR产物，然后用GENECLEAN II试剂盒(BIO101)收集和纯化。纯化的DNA片段溶解于20μl包含10mM Tris-HCl(pH7.4)和1mM EDTA的溶液中。1μl PCR产物在20μl包含10mM Tris-HCl(pH7.5)、10mMMgCl2、1mM DTT、50mM NaCl、8U HindIII(Takara Shuzo株式会社)和8U EcoRI(Takara Shuzo株式会社)的反应液中于37℃消化1小时。消化液用苯酚氯仿提取，随后用乙醇沉淀并从中收集目的DNA。如此获得的DNA溶解于8μl包含10mM Tris-HCl(pH7.4)和1mMEDTA的溶液中。
1μg的质粒pUC19用HindIII和EcoRI按照上述同样方式消化。然后用苯酚和氯仿提取，随后用乙醇沉淀。所获得的被消化的质粒用BAP(即，碱性磷酸酶(大肠杆菌C75；Takara Shuzo株式会社))处理，然后所得反应溶液用苯酚和氯仿提取，用乙醇沉淀并从中收集DNA。这样获得的DNA溶解于10μl含10mM Tris-HCl(pH7.4)和1mMEDTA的溶液中。
将BAP-处理的质粒pUC19(1μl)与4μl上述PCR产物混合，用DNA连接试剂盒Ver.2(Takara Shuzo株式会社)将二者连接起来。得到的质粒导入感受态大肠杆菌JM109细胞(日本基因株式会社)，以上述同样的方式形成转化体。转化体在含氨苄青霉素(50μg/毫升)的2xYT琼脂培养基上于37℃培养过夜。用QIAprep Spin质粒试剂盒(QIAGEN)纯化细胞碎片中的质粒。DNA测序后，证实具有正确DNA序列的质粒被命名为“CHL/pUC19”。
各1μg的质粒Cλ/pUC19和Cκ/pUC19分别在20μl包含20mMTris-HCl(pH8.5)、10mM MgCl2、1mM DTT、100mM KCl、8UHindIII(Takara Shuzo株式会社)和2U BlnI(Takara Shuzo株式会社)的反应液中于37℃消化1小时。消化液用苯酚和氯仿提取，随后用乙醇沉淀，并从中收集DNA。DNA用BAP在37℃处理30分钟，然后用苯酚和氯仿提取，随后用乙醇沉淀并从中收集DNA。将得到的DNA溶解于10μl包含10mM Tris-HCl(pH7.4)和1mM EDTA的溶液中。
8μg包含编码#23-57-137-1 L链V区DNA的质粒CHL/pUC19用HindIII和BlnI以上述同样方式消化，以得到409 bp的DNA片段。利用3％低熔点琼脂糖凝胶电泳该DNA片段，然后用GENECLEAN II试剂盒(BIO101)从凝胶中收集和纯化该DNA片段。将该DNA片段溶解于10μl含10mM Tris-HCl(pH7.4)和1mM EDTA的溶液中。
将4μl L链V区的DNA分别亚克隆到1μl经BAP-处理的质粒Cλ/pUC19或Cκ/pUC19上，然后导入感受态大肠杆菌JM109细胞中以形成转化体。转化体在3毫升含氨苄青霉素(50μg/毫升)的2xYT培养基中培养过夜。用QIAprep Spin质粒试剂盒(QIAGEN)分离和纯化细胞碎片中的质粒。将由此制备的质粒分别命名为“MBC1L(λ)/pUC19”和“MBC1L(κ)/pUC19”。
质粒MBC1L(λ)/pUC19和MBC1L(κ)/pUC19分别用EcoRI消化，然后用3％低熔点琼脂糖凝胶电泳。用GENECLEAN II试剂盒(BIO101)从凝胶中分离和纯化长度743碱基对的DNA片段，并将该DNA片段溶解于10μl含10mM Tris-HCl(pH7.4)和1mM EDTA的溶液中。
2.7μg的表达载体(质粒HEF-PMlk-gk)用EcoRI消化，然后用苯酚和氯仿提取，随后用乙醇沉淀，并从中收集DNA片段。DNA片段用BAP处理，然后用1％低熔点琼脂糖凝胶电泳。用GENECLEAN II试剂盒(BIO101)从凝胶中分离和纯化长度为6561碱基对的DNA片段。将该DNA片段溶解于10μl含10mM Tris-HCl(pH7.4)和1mMEDTA的溶液中。
将BAP-处理的HEF载体(2μl)与3μl质粒MBC1L(λ)/pUC19或MBC1L(κ)/pUC19的EcoRI片段连接起来。连接产物导入感受态大肠杆菌JM109细胞中以形成转化体。转化体在2毫升含氨苄青霉素(50μg/毫升)的2xYT培养基中培养。用QIAprep Spin质粒试剂盒(QIAGEN)纯化细胞碎片中的质粒。
这样纯化的质粒DNA在20μl包含20mM Tris-HCl(pH8.5)、10mM MgCl2、1mM DTT、100mM KCl、8U HindIII(Takara Shuzo株式会社)和2U PvuI(Takara Shuzo株式会社)的反应液中于37℃消化1小时。在这一消化反应中，如果上述DNA片段以正确方向插入载体，则得到5104/2195碱基对的消化片段，如果上述DNA片段反向插入载体，则得到4387/2926碱基对的消化片段。证实具有正向插入片段的质粒被分别命名为“MBC1L(λ)/neo”(来自质粒MBC1L(λ)/pUC19)和“MBC1L(κ)/neo”(来自质粒MBC1L(k)/pUC19)。
(4)COS-7细胞的转染
上述制备的表达质粒分别用COS-7细胞短暂表达以便评价嵌合抗体对抗原的结合活性和中和活性。
通过Gene Pulser(Bio Rad)电穿孔将质粒MBC1HcDNA/pCOS1和MBC1L(λ)/neo或者质粒MBC1HcDNA/pCOS1和MBC1L(κ)/neo的组合共转染到COS-7细胞中，进行嵌合抗体的短暂表达。即，向0.8毫升细胞悬浮液(其中COS-7细胞悬浮于PBS(-)，浓度为1×107个细胞/毫升)中加入每种质粒DNA各10μl。得到的溶液应用1500 V和2μF静电容量的脉冲进行电穿孔。室温恢复10分钟后，将细胞悬浮于包含2％Ultra Low IgG胎牛血清(GIBCO)的DMEM培养基中，然后用10cm的培养皿在CO2培养箱中培养。培养72小时后，收集培养上清液，离心除去细胞碎片，以此作为ELISA分析的样品。该程序中，嵌合抗体从COS-7细胞上清液中的纯化通过AffiGel Protein A MAPSII试剂盒(Bio Rad)按照试剂盒上介绍的方法进行。
(5)ELISA分析
(i)抗体浓度的确定
确定抗体浓度的ELISA平板如下制备。用于ELISA的96孔平板(Maxisorp，NUNC)的每个孔都用100μl补加有1μg/毫升的山羊抗人IgG抗体(TAGO)的包被缓冲液(0.1M NaHCO3，0.02％NaN3)包被，然后用200μl稀释缓冲液[50mM Tris-HCl、1mM MgCl2、  0.1M NaCl、0.05％Tween20、0.02％NaN3、1％牛血清白蛋白(BSA)；pH7.2]封闭。每孔加入其中嵌合抗体得以表达的COS-7细胞培养上清的系列稀释液或者逐步稀释的纯化嵌合抗体。室温培养1小时并用PBS-Tween20冲洗后，每孔加入100μl与碱性磷酸酶偶合的山羊抗人IgG抗体(TAGO)。室温培养1小时并用PBS-Tween20冲洗后，每孔加入1毫克/毫升的底物溶液(“Sigma104”，对-硝基苯磷酸，SIGMA)。用微平板读数仪(Bio Rad)于405nm测量溶液的吸收值。纯化的Hu IgG1λ(结合位点)用作该测定的标准样品。
(ii)抗原结合能力的确定
确定抗原结合能力的ELISA平板如下制备。用于ELISA分析的96孔平板的每个孔都用100μl补加有1μg/毫升的人PTHrP(1-34)(肽研究所)的包被缓冲液包被，然后用200μl稀释缓冲液封闭。每孔加入其中嵌合抗体得以表达的COS-7细胞培养上清的系列稀释液或者逐步稀释的纯化嵌合抗体。室温培养并用PBS-Tween20冲洗后，每孔加入100μl与碱性磷酸酶偶合的山羊抗人IgG抗体(TAGO)溶液。室温培养并用PBS-Tween20冲洗后，每孔加入1毫克/毫升的底物溶液(“Sigma104”，对-硝基苯磷酸，SIGMA)。用微平板读数仪(Bio Rad)于405nm测量溶液的吸收值。
结果发现嵌合抗体具有对人PTHrP(1-34)的结合能力，克隆的鼠抗体V区(图5)也具有的正确结构。还发现具有L链λ链C区的嵌合抗体和具有L链κ链C区的嵌合抗体对PTHrP(1-34)的结合能力没有差异。因此，通过人源化抗体L链λ链构建了人源化抗体L链C区。
(6)能稳定产生嵌合抗体的CHO细胞系的建立
为了建立能稳定产生嵌合抗体的细胞系，将上述表达质粒导入CHO细胞(DXB11)。
为建立能稳定产生嵌合抗体的细胞系，使用用于CHO细胞的下列表达质粒的任一组合：质粒MBC1HcDNA/pCHO1和MBC1L(λ)/neo；或者MBC1HcDNA/pCHO1和MBC1L(κ)/neo。这些质粒组合通过Gene Pulser(Bio Rad)电穿孔分别如下共转染到CHO细胞中。每种表达载体独立地用限制性酶PvuI切开成为线型DNA。得到的DNA用苯酚和氯仿提取并用乙醇沉淀收集。这样制备的质粒DNA分别用于电穿孔。即，将质粒DNA各10μg加入0.8毫升包含CHO细胞(浓度为1×107个细胞/毫升)的PBS(-)细胞悬浮液中。得到的混合液应用静电容量为1500V和2μF的脉冲进行电穿孔。室温恢复10分钟后，将电穿孔的细胞悬浮于添加有10％胎牛血清(GIBCO)的MEM-α培养基中。得到的悬浮液用三个96孔平板(Falcon)在CO2培养箱中培养。在培养当天，培养基用选择性培养基[添加10％胎牛血清(GIBCO)和500毫克/毫升GENETICIN(G418Sulfate；GIBCO)的不含核糖核苷或脱氧核糖核苷的MEM-α培养基]替换。从培养基中选择导入了抗体基因的细胞。用新鲜培养基替换选择性培养基。在置换该培养基约2周，当观察到细胞生长时，显微镜下观察用上述ELISA分析法确定产生的抗体量。在这些细胞中筛选产生大量抗体的细胞。
将已建立的能稳定产生抗体稳定细胞系在摇瓶中用添加2％UltraLow IgG胎牛血清但不含核糖核苷或脱氧核糖核苷的MEM培养基大规模培养。培养第3到4天，收集培养基上清液，然后用孔径为0.2μm(Millipore)的滤器过滤以除去其中的细胞碎片。
随后，用POROS Protein A柱(PerSeptive Biosystems)在ConSepLC100(Millipore)上按照其上介绍的方法纯化CHO细胞培养上清液中的嵌合抗体。纯化的嵌合抗体作为确定中和活性和检验对高钙血症模型动物的效能的样品。纯化的嵌合抗体的浓度和抗原结合活性用上述同样的ELISA系统确定。
参考实施例4
人源化抗体的构建
(1)人源化抗体H链的构建
(i)人源化H链V区的构建
通过PCR法用CDR-移植技术制备人源化#23-57-137-1抗体H链。为制备具有来源于人抗体S31679(NBRF-PDB；Cuisinier，A.M.等，欧洲免疫杂志，23，110-118，1993)的FR的人源化#23-57-137-1抗体H链(“a”型)使用了下列六种类型PCR引物：CDR-移植引物：MBC1HGP1(SEQ ID NO：23)和MBC1HGP3(SEQ ID NO：24)(均包含有义DNA序列)以及MBC1HGP2(SEQ ID NO：25)和MBC1HGP4(SEQID NO：26)(均包含反义DNA序列)，它们的每个末端均包含长度为15-21碱基对的互补序列；以及外部引物：MBC1HVS1(SEQ ID NO：27)和MBC1HVR1(SEQ ID NO：28)，它们分别具有与CDR-移植引物MBC1HGP1和MBC1HGP4的同源性。
CDR-移植引物MBC1HGP1、MBC1HGP2、MBC1HGP3和MBC1HGP4按照下列方式用尿素变性的聚丙烯酰胺凝胶分离(分子克隆：实验室手册，Sambrook等，Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)，并用压碎浸泡法(分子克隆：实验室手册，Sambrook等，ColdSpring Harbor Laboratory Press，1989)按下列方式从凝胶片段中提取。
每种CDR-移植引物各1nmole用6％变性聚丙烯酰胺凝胶分离得到DNA片段。用UV照射硅胶薄层平板从所得DNA片段中鉴定所需长度的DNA片段，然后用压碎浸泡法收集。将所得DNA溶解于20μl含10mM Tris-HCl(pH7.4)和1mM EDTA的溶液中。用TaKaRa Ex Taq(Takara Shuzo株式会社)进行PCR反应。用于PCR反应的反应液(100μl)包含上述CDR-移植引物MBC1HGP1、MBC1HGP2、MBC1HGP3和MBC1HGP4各1μl、0.25mM dNTP和2.5U TaKaRa Ex Taq的缓冲液。PCR反应进行5个循环，其中温度循环为94℃1分钟；55℃1分钟；72℃1分钟。将外部引物MBC1HVS1和MBC1HVR1各50pmole加入反应混合物。利用这种反应混合物再用同样的温度循环进行PCR反应另外30个循环。这样扩增得到的DNA片段用4％Nu Sieve GTG琼脂糖(FMC Bio.Products)凝胶进行电泳分离。
切下包含长度为421碱基对DNA片段的琼脂糖片段，用GENECLEAN II试剂盒(BIO101)按照试剂盒上指示的方法纯化DNA片段。纯化的DNA片段用乙醇沉淀，然后溶于20μl含10mM Tris-HCl(pH7.4)和1mM EDTA的溶液中。获得的PCR反应混合物用于将DNA片段亚克隆到预先用BamHI和HindIII消化的质粒pUC19上；随后确定所得质粒的碱基序列。具有正确序列的质粒被命名为“hMBCHv/pUC19”。
(ii)用于人源化H链cDNA的H链V区的构建
为了连接到人源化H链C区Cγ1的cDNA上，上述步骤构建的人源化H链V区的DNA用PCR法修饰。该方法中，使用的反向引物MBC1HVS2被设计为可以与编码V区引导序列5′-末端区的序列杂交并携带Kozak共有序列(Kozak等，分子生物学杂志，196，947-950，1987)以及HindIII-和EcoRI-识别序列。所用的正向引物MBC1HVR2被设计为可以与编码J区3′-末端区的DNA序列和编码C区5′-末端区的DNA序列杂交并携带ApaI-和SamI-识别序列。
用TaKaRa Ex Taq(Takara Shuzo株式会社)和所附的缓冲液进行PCR反应。用于PCR反应的反应液为包含0.4μghMBCHv/pUC19作为DNA模版，MBC1HVS2和MBC1HVR2各50pmole作为引物、2.5UTaKaRa Ex Taq和缓冲液中的0.25mM dNTP。PCR反应进行30个循环，其中温度循环为94℃1分钟；55℃1分钟；72℃1分钟。这样由PCR法扩增得到的DNA片段用3％Nu Sieve GTG琼脂糖(FMC Bio.Products)凝胶电泳分离。
切下含有长度为456碱基对的DNA片段的凝胶，用GENECLEANII试剂盒(BIO101)按照试剂盒上指示的方法从中纯化DNA片段。纯化的DNA片段用乙醇沉淀，然后溶于20μl含10mM Tris-HCl(pH7.4)和1mM EDTA的溶液中。获得的PCR反应混合物用于将DNA片段亚克隆到预先用EcoRI和SamI消化的质粒pUC19上；随后确定所得到质粒的碱基序列。结果，由此制备出包含编码来源于杂交瘤#23-57-137-1的鼠H链V区的DNA并也包含5′-末端区HindIII-和EcoRI-识别序列和Kozak序列以及3′-末端区ApaI-和SamI-识别序列的质粒，并被命名为“hMBC1Hv/pUC19”。
(2)人源化抗体H链表达载体的构建
包含hPM1抗体H链的cDNA序列的质粒RVh-PM1f-cDNA用ApaI和BamHI消化以获得包含H链C区碱基序列的DNA片段。该DNA片段导入预先用ApaI和BamHI消化过的质粒hMBC1Hv/pUC19中。由此制备的质粒被命名为“hMBC1HcDNA/pUC19”。该质粒包含编码人源化#23-57-137-1抗体H链V区的DNA和编码人H链C区Cγ1的DNA并具有5′-末端区HindIII-和EcoRI-识别序列以及3′-末端区BamHI-识别序列。质粒hMBC1HcDNA/pUC19中包含的人源化“a”型H链的碱基序列和对应的氨基酸序列分别如SEQ ID NO：58和SEQID NO：56所示。
质粒hMBC1HcDNA/pUC19用EcoRI和BamHI消化以获得包含编码H链碱基序列的DNA片段。将该DNA片段导入预先用EcoRI和BamHI消化过的表达质粒pCOS1中。结果获得了人源化抗体的表达质粒，并被命名为“hMBC1HcDNA/pCOS1”。
为制备在CHO细胞中表达的质粒，质粒hMBC1HcDNA/pUC19用EcoRI和BamHI消化以获得包含编码H链DNA的DNA片段。该DNA片段导入预先用EcoRI和BamHI消化过的表达载体pCHO1上。由此获得了人源化抗体的表达质粒并被命名为“hMBC1HcDNA/pCHO1”。
(3)L链杂合可变区的构建
(i)FR1、2/FR3、4杂合抗体的制备
构建了具有人源化抗体的FR区和鼠(嵌合)抗体的FR区的FR杂合L链的基因，并评价了该区人源化作用的适宜性。该步骤中，包含来源于人抗体的FR1和FR2以及来源于鼠抗体的FR3和FR4的杂合抗体是利用存在于CDR2中的Afl II限制性位点来制备的。
质粒MBC1L(λ)/neo和hMBC1L(λ)/neo各10μg分别在100μl包含10mM Tris-HCl(pH 7.5)、10mM MgCl2、1mM DTT、50mMNaCl、0.01％(w/v)BSA和10U Afl II(Takara Shuzo株式会社)的反应液中37℃消化1小时。反应液用2％低熔点琼脂糖凝胶电泳，由此从质粒MBC1L(λ)/neo中得到长度为6282碱基对的DNA片段(称为“c1”)和长度为1022碱基对的DNA片段(称为“C2”)，并从质粒hMBC1L(λ)/neo中得到长度为6282bp的DNA片段(称为“h1”)和1022bp的DNA片段(称为“h2”)。
获得的c1和h1片段各1μg用BAP处理。用苯酚和氯仿提取，乙醇沉淀收集DNA片段，然后溶于10μl含10mM Tris-HCl(pH7.4)和1mM EDTA的溶液中。
BAP-处理的c1和h1 DNA片段各1μl分别与4μl h2和c2 DNA片段混合，以使彼此连接(4℃过夜)。将各连接产物导入感受态大肠杆菌JM109细胞以形成转化体。转化体在2毫升包含氨苄青霉素(50μg/毫升)的2xYT培养基中培养。用QIAprep Spin质粒试剂盒(QIAGEN)从细胞碎片中纯化质粒。
纯化的质粒DNA在20μl包含10mM Tris-HCl(pH7.5)、10mMMgCl2、1mM DTT、2U ApaLI(Takara Shuzo株式会社)或8UBamHI(Takara Shuzo株式会社)和HindIII(Takara Shuzo株式会社)的反应液中37℃消化1小时。该步骤中，如果c1-h2片段正确连接到质粒上，该连接获得5560/1246/498碱基对的ApaLI消化片段或者7134/269碱基对的BamHI/HindIII消化片段。基于这一假定，鉴定出了所需的质粒。
编码人FR1、2/鼠FR3、4杂合抗体L链的表达载体被命名为“h/mMBC1L(λ)/neo”。另一方面，没有获得h1-c1的克隆。因此，在pUC载体上进行了重组，随后将重组产物克隆到HEF载体上。其中，用做模版的是包含编码无氨基酸替换的人源化抗体L链V区DNA的质粒hMBC1Laλ/pUC19，和包含编码FR3中第91位(即，按照Kabat定义的第87号氨基酸)酪氨酸由异亮氨酸取代的人源化抗体L链V区DNA的质粒hMBC1Ldλ/pUC19。
质粒MBC1L(λ)/pUC19、hMBC1Laλ/pUC19和hMBC1Ldλ/pUC19各10微升分别在30μl包含10mM Tris-HCl(pH7.5)、10mMMgCl2、1mM DTT、50mM NaCl、0.01％(w/v)BSA、16U HindIII和4U Afl II的反应液中37℃消化1小时。反应液用2％低熔点琼脂糖凝胶电泳，从质粒MBC1L(λ)/pUC19中得到长度为215碱基对的DNA片段(称为“c2”)或者分别从质粒hMBC1Laλ/pUC19和hMBC1Ldλ/pUC19中得到长度为3218碱基对的DNA片段(分别称为“hal”和“hdl”)。然后用GENECLEANII试剂盒(BIO101)收集并纯化这些DNA片段。
将每种hal’和hdl’片段分别连接到c2’片段上，然后导入感受态大肠杆菌JM109细胞以形成转化体。转化体在2毫升包含氨苄青霉素(50μg/毫升)的2xYT培养基中培养。用QIAprep Spin质粒试剂盒(QIAGEN)从细胞碎片中纯化质粒。得到的包含hal’片段和hdl’片段的质粒DNA被分别命名为“m/hMBC1Laλ/pUC19”和“m/hMBC1Ldλ/pUC19”。
质粒m/hMBC1Laλ/pUC19和m/hMBC1Ldλ/pUC19分别用EcoRI消化。2％低熔点琼脂糖凝胶电泳，然后用GENECLEANII试剂盒(BIO101)从凝胶中收集和纯化长度为743碱基对的DNA片段。产物溶于20μl含10mM Tris-HCl(pH7.4)和1mM EDTA的溶液中。
将获得的各DNA片段(每个4μl)与上述BAP-处理的HEF载体1μl混合以彼此连接。连接产物导入感受态大肠杆菌JM109细胞以形成转化体。转化体在2毫升包含氨苄青霉素(50μg/毫升)的2xYT培养基中培养。用QIAprep Spin质粒试剂盒(QIAGEN)从细胞碎片中纯化质粒DNA。
纯化的各质粒DNA在20μl包含20mM Tris-HCl(pH8.5)、10mM MgCl2、1mM DTT、100mM KCl、8U HindIII(Takara Shuzo株式会社)和2U PvuI(Takara Shuzo株式会社)的反应液中37℃消化1小时。该步骤中，基于如下的设想鉴定了质粒DNA，即如果DNA片段正向插入质粒，该连接反应得到5104/2195碱基对的消化片段，而如果DNA片段反向插入质粒，该连接反应得到4378/2926碱基对的消化片段。由此获得的质粒是编码鼠FR1、2/人FR3、4杂合抗体L链的表达载体，它们被分别命名为表达载体“m/hMBC1Laλ/neo”和“m/hMBC1Ldλ/neo”。
(ii)FR1/FR2杂合抗体的制备
按照上述同样的方式利用存在于CDR1中的SnaBI限制性位点制备FR1/FR2杂合抗体。
质粒MBC1L(λ)/neo和mMBC1L(λ)/neo各10μg分别在20μl包含10mM Tris-HCl(pH7.9)、10mM MgCl2、1mM DTT、50mMNaCl、0.01％(w/v)BSA和6U SnaBI(Takara Shuzo株式会社)的反应液中37℃消化1小时。将得到反应液进一步在50μl包含20mM Tris-HCl(pH8.5)、10mM MgCl2、1mM DTT、100mM KCl、0.01％(w/v)BSA和6U PvuI的反应液中37℃消化1小时。
得到的反应液用1.5％低熔点琼脂糖凝胶电泳，由此从质粒MBC1L(λ)/neo中得到4955bp的DNA片段(ml)和2349bp的DNA片段(m2)，并从质粒h/mMBC1L(λ)/neo中得到4955bp的DNA片段(hm1)和2349bp的DNA片段(bm2)。然后用GENECLEANII试剂盒(BIO101)从凝胶中收集和纯化这些DNA片段。获得的每种DNA片段均溶于20μl含10mM Tris-HCl(pH7.4)和1mM EDTA的溶液中。
ml和hm1片段各1μl分别连接到bm2和m2片段(各4μl)上，然后导入感受态大肠杆菌JM109细胞以形成转化体。获得的转化体在2毫升包含氨苄青霉素(50μg/毫升)的2xYT培养基中培养。用QIAprepSpin质粒试剂盒(QIAGEN)从细胞碎片中纯化质粒DNA。
纯化的质粒DNA在20μl包含10mM Tris-HCl(pH7.5)、10mMMgCl2、1mM DTT和8U ApaI(Takara Shuzo株式会社)或者2UApalI(Takara Shuzo株式会社)的反应液中37℃消化1小时。
基于下述设想鉴定了由此制备的质粒(m1-hm2和hm1-m2)，即如果每种DNA片段以正确方向连接到质粒上，用ApaI和ApaLI消化的质粒(m1-hm2)将分别得到7304碱基对的消化片段和5560/1246/498碱基对的消化片段，用ApaI和ApaLI消化的质粒(hm1-m2)将分别得到6538/766碱基对的片段和3535/2025/1246/498碱基对的片段。结果，获得了编码人FR1/鼠FR2、3、4杂合抗体L链的表达载体(被命名为“hmmMBC1L(λ)/neo”)和编码鼠FR1/人FR2/鼠FR3、4杂合抗体L链的表达载体(被命名为“mhmMBC1L(λ)/neo”)。
(4)人源化抗体L链的构建
通过PCR法用CDR-移植技术制备了人源化#23-57-137-1抗体L链。为制备包含来源于人抗体HSU03868(GEN-BANK，Deftos M.等，Scand.免疫学杂志，39，95-103，1994)的FR1、FR2、FR3以及来源于人抗体S25755(NBRF-PDB)FR4的人源化#23-57-137-1抗体L链(“a”型)使用了下述六种类型的PCR引物：
具有有义DNA序列的CDR-移植引物：MBC1LGP1(SEQ ID NO：29)和MBC1LGP3(SEQ ID NO：30)，具有反义DNA序列的CDR-移植引物：MBC1LGP2(SEQ ID NO：31)和MBC1LGP4(SEQ ID NO：32)，所有这些CDR-移植引物的每个末端都具有15-21碱基对的互补序列；以及分别与CDR-移植引物MBC1LGP1和MBC1LGP4同源的外部引物MBC1LVS1(SEQ ID NO：33)和MBC1LVR1(SEQ ID NO：34)。
CDR-移植引物MBC1LGP1、MBC1LGP2、MBC1LGP3和MBC1LGP4用尿素变性的聚丙烯酰胺凝胶分离(分子克隆：实验室手册，Sambrook等，Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)，并用压碎浸泡法从凝胶片段中提取(分子克隆：实验室手册，Sambrook等，Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)。
每种CDR-移植引物各1nmole用6％变性聚丙烯酰胺凝胶分离。用UV射线照射的硅胶薄层平板鉴定需要长度的DNA片段，然后用压碎浸泡法从凝胶中收集所需的DNA片段。将收集到的DNA片段溶解于20μl含10mM Tris-HCl(pH7.4)和1mM EDTA的溶液中。
用TaKaRa Ex Taq(Takara Shuzo株式会社)缓冲液进行PCR反应。用于PCR反应的反应液(每100μl)包含CDR-移植引物MBC1LGP1、MBC1LGP2、MBC1LGP3和MBC1LGP4各1μl、0.25mMdNTP、缓冲液中的2.5U TaKaRa Ex Taq。PCR反应进行5个循环，其中温度循环为94℃1分钟；55℃1分钟；72℃1分钟。向反应混合物中加入外部引物MBC1LVS1和MBC1LVR1各50pmole。利用这种反应混合物再用同样的温度循环进行PCR反应另外30个循环。这样扩增得到的DNA片段用3％Nu Sieve GTG琼脂糖(FMC Bio.Products)凝胶电泳分离。
切下包含长度为421碱基对DNA片段的琼脂糖片段，用GENECLEAN II试剂盒(BIO101)按照试剂盒上指示的方法从中纯化DNA片段。由此制备的PCR反应混合物用于将DNA片段亚克隆到预先用BamHI和HindIII消化的质粒pUC19上。测定得到质粒的DNA序列。由此制备的质粒被命名为“hMBCL/pUC19”。然而发现该质粒CDR4的第104位氨基酸(按照Kabat确定的第96号氨基酸)由精氨酸取代。为了将这个氨基酸校正为酪氨酸，设计和合成了引物MBC1LGP10R(SEQ ID NO：35)。然后用TaKaRa Ex Taq(Takara Shuzo株式会社)和所附的缓冲液进行PCR反应。用于PCR反应的反应液(每100μl)包含0.6μg的质粒hMBCL/pUC19为模版DNA、引物MBC1LVS1和MBC1LGP10R各50pmole、2.5U TaKaRa Ex Taq(TakaraShuzo株式会社)和缓冲液中的0.25mM dNTP，液面覆盖矿物油(50μl)。PCR反应进行30个循环，其中温度循环为94℃1分钟；55℃1分钟；72℃1分钟。这样扩增得到的DNA片段用3％Nu Sieve GTG琼脂糖(FMC Bio.Products)凝胶电泳分离。
切下含有长度为421碱基对的DNA片段的凝胶片段，用GENECLEAN II试剂盒(BIO101)按照试剂盒上指示的方法纯化DNA片段。由此制备的PCR反应混合物用于将该DNA片段亚克隆到预先用BamHI和HindIII消化的质粒pUC19上。
用M13引物M4和M13引物RV确定该质粒的DNA序列。结果证实该质粒具有正确的序列。然后该质粒用HindIII和BlnI消化，用1％的琼脂糖凝胶电泳从中分离到416碱基对的DNA片段。该DNA片段用GENECLEAN II试剂盒(BIO101)按照试剂盒上指示的方法纯化。然后导入预先用HindIII和BlnI消化的质粒Cλ/pUC19上。得到的质粒被命名为“hMBC1Laλ/pUC19”。该质粒用EcoRI消化，得到编码人源化L链的DNA片段。该DNA片段导入质粒pCOS1以至人源化L链的起始密码子定位于EF1α启动子的下游。这样获得的质粒被命名为“hMBC1Laλ/pCOS1”。“a”型人源化L链的DNA序列(包括对应氨基酸序列)如SEQ ID NO：66所示。“a”型的氨基酸序列如SEQ ID NO：47所示。
“b”型人源化的L链通过PCR法用诱变导入技术制备。“b”型被设计为用脯氨酸替换“a”型第43位的甘氨酸(相当于按Kabat定义的第43号氨基酸)并用天冬氨酸替换49位的赖氨酸(相当于按Kabat定义的第49号氨基酸)。用质粒hMBC1Laλ/pUC19作模版，用突变引物MBC1LGP5R(SEQ ID NO：36)和引物MBC1LVS1进行PCR反应。获得的DNA片段用BamHI和HindIII消化，消化片段亚克隆到pUC19的BamHI-HindIII位点。测序后，获得的质粒DNA用HindIII和AflII消化，产生的消化片段连接到预先用HindIII和AflII消化过的质粒hMBC1Laλ/pUC19上。
由此获得的质粒被命名为“hMBC1Lbλ/pUC19”。该质粒DNA用EcoRI消化，获得包含编码人源化L链DNA的DNA片段。该DNA片段导入质粒pCOS1以至于人源化L链的起始密码子定位于EF1α启动子的下游。由此获得的质粒被命名为“hMBC1Lbλ/pCOS1”。
“c”型人源化的L链通过PCR法用诱变导入技术制备。将“c”型设计为用脯氨酸替换84位的丝氨酸(相当于按Kabat定义的第80号氨基酸)。用质粒hMBC1Laλ/pUC19作模版，用突变引物MBC1LGP6S(SEQ ID NO：37)和引物M13引物RV进行PCR反应。获得的DNA片段用BamHI和HindIII消化，然后亚克隆到预先用BamHI和HindIII消化过的pUC19上。
测序后，获得的质粒用BstPI和Aor51HI消化，产生的DNA片段连接到预先用BstPI和Aor51 HI消化过的质粒hMBC1Laλ/pUC19上。由此获得的质粒被命名为“hMBC1Lcλ/pUC19”。该质粒DNA用EcoRI消化，获得包含编码人源化L链序列的DNA片段。该片段导入质粒pCOS1的EcoRI位点以至于人源化L链的起始密码子定位于EF1α启动子的下游。由此获得的质粒被命名为“hMBC1Lcλ/pCOS1”“d”、“e”、“f”型人源化的L链也通过PCR法用诱变导入技术制备。“d”、“e”、“f”型被设计为在91位分别用“a”、“b”、“c”型的异亮氨酸替换酪氨酸(相当于按Kabat定义的第87号氨基酸)。分别用质粒hMBC1Laλ/pCOS1作为“d”型的模版，质粒hMBC1Lbλ/pUC19作为“e”型的模版，质粒hMBC1Lcλ/pUC19作为“f”型的模版，用突变引物MBC1LGP11R(SEQ ID NO：38)和引物M-S1(SEQ IDNO：44)分别进行“d”、“e”、“f”各型的PCR反应。获得的DNA片段用BamHI和HindIII消化，然后亚克隆到预先用BamHI和HindIII消化过的pUC19上。测序后，质粒用HindIII和BlnI消化，产生的消化片段连接到预先用HindIII和BlnI消化过的质粒Cλ/pUC19上。
由此获得的质粒分别被命名为“hMBC1Ldλ/pUC19”(对应于“d”型)、“hMBC1Leλ/pUC19”(对应于“e”型)和“bMBC1Lfλ/pUC19”(对应于“f”型)。每种质粒用EcoRI消化，获得包含编码人源化L链DNA的DNA片段。该DNA片段导入质粒pCOS1的EcoRI位点以至于人源化L链的起始密码子定位于该质粒EF1α启动子的下游。由此获得的质粒分别被命名为“hMBC1Ldλ/pCOS1”(对应于“d”型)，“hMBC1Leλ/pCOS1”(对应于“e”型)和“hMBC1Lfλ/pCOS1”(对应于“f”型)。
“g”、“h”型人源化L链也通过PCR法用诱变导入技术制备。设计“g”、“h”型以在36位分别用“a”和“d”型的酪氨酸替换组氨酸(相当于按Kabat定义的第36号氨基酸)。用突变引物MBC1LGP9R(SEQ ID NO：39)和引物M13引物RV，并用质粒hMBC1Laλ/pUC19作为模版进行PCR反应。该PCR产物用M13引物M4作为引物以及质粒hMBC1Laλ/pUC19作为模版再次进行另一个PCR反应。获得的DNA片段用HindIII和BlnI消化，然后亚克隆到预先用HindIII和BlnI消化过的质粒Cλ/pUC19上。用该质粒作为模版，用引物MBC1LGP13R(SEQ ID NO：40)和MBC1LVS1再次进行PCR反应。获得的PCR片段用ApaI和HindIII消化，然后分别导入预先用ApaI和HindIII消化过的质粒hMBC1Laλ/pUC19和hMBC1Ldλ/pUC19上。确定获得的质粒的DNA序列。证实含有正确序列的质粒分别被命名为“hMBC1Lgλ/pUC19”(对应于“g”型)和“hMBC1Lhλ/pUC19”(对应于“h”型)。每种质粒用EcoRI消化，获得包含编码人源化L链序列的DNA片段。该DNA片段导入质粒pCOS1的EcoRI位点以至于人源化L链的起始密码子定位于EF1α启动子的下游。由此获得的质粒分别被命名为“hMBC1Lgλ/pCOS1”和“hMBC1Lhλ/pCOS1”。
“i”、“j”、“k”、“l”、“m”、“n”、“o”型人源化L链也通过PCR法用诱变导入技术制备。用突变引物MBC1LGP14S(SEQID NO：41)和引物V1RV(λ)(SEQ ID NO：43)，并用质粒hMBC1Laλ/pUC19作为模版进行PCR反应。产生的DNA片段用ApaI和BlnI消化，然后亚克隆到预先用ApaI和BlnI消化过的质粒hMBC1Lgλ/pUC19上。确定获得的质粒的碱基序列，筛选出对应每种类型而导入了突变的克隆。由此获得的质粒被命名为“hMBC1Lxλ/pUC19(x＝i，j，k，l，m，n或o)”。该质粒用EcoRI消化，获得包含编码人源化L链序列的DNA片段。该DNA片段导入质粒pCOS1的EcoRI位点以至于人源化L链的起始密码子定位于EF1α启动子的下游。由此获得的质粒被命名为“hMBC1Lxλ/pCOS1(x＝i，j，k，l，m，n或o)”。“j”、“l”、“m”、和“o”型的DNA序列(包括对应的氨基酸序列)分别如SEQ IDNO：67、68、69和70所示。这些类型的氨基酸序列分别如SEQ ID NO：48、49、50和51所示。
“p”、“q”、“r”、“s”和“t”型的人源化L链分别被设计为“i”、“j”、“m”、“l”和“o”型的第87位酪氨酸被异亮氨酸替代的修饰型。这些类型按照下列方式利用FR3中的Aor51MI限制性位点并用“h”型的该位点替换“i”、“j”、“m”、“l”或“o”型的该位点而制备。从表达质粒hMBC1Lxλ/pCOS1(x＝i，j，m，l，或o)中缺失包含CDR3、部分FR3和全部FR4的Aor51HI限制性片段(514碱基对)。为去除这一位点，将表达质粒hMBC1Lhλ/pCOS的Aor51HI限制性片段(514碱基对，包含CDR3、部分FR3和全部FR4)连接到表达质粒上，从而用异亮氨酸替换了第91位的酪氨酸(相当于按Kabat定义的87号氨基酸)。确定产生的质粒的DNA序列，选择91位酪氨酸(相当于按Kabat定义的87号氨基酸)被异亮氨酸替换的各种“i”、“j”、“m”、“l”或“o”型克隆。对应于“i”、“j”、“m”、“l”或“o”型的这些修蚀类型分别被命名为“p”、“q”、“r”、“s”和“t”型，这些类型的质粒被命名为“hMBC1Lxλ/pCOS1(x＝p，q，s，r或t)”。“q”、“r”、“s”和“t”型的DNA序列(包括对应的氨基酸序列)分别如SEQ ID NO：71、72、73、74所示。这些类型的氨基酸序列分别如SEQ ID NO：52、53、54、55所示。
质粒hMBC1Lqλ/pCOS1用HindIII和EcoRI消化，然后亚克隆到预先用HindIII和EcoRI消化的质粒pUC19上。获得的质粒被命名为“hMBC1Lqλ/pUC19”。
每种人源化L链类型中取代氨基酸的位置如表2所示。
                                  表2
        序列表中取代氨基酸的位置(按照Kabat定义的氨基酸编号)
    型     36     43     45     47     49     80     87
    abcdefghijklmnopqrst YYYYYYYYYYYYYY PP KKKKKKK VVVVVV DDDDDDDDDD pP IIIIIIIII
上表2中，大写字母代表下列氨基酸：Y：酪氨酸；P：脯氨酸；K：赖氨酸；V：缬氨酸；D：天冬氨酸；I：异亮氨酸。
包含质粒hMBC1HcDNA/pUC19的大肠杆菌株系和包含质粒hMBC1Lqλ/pUC19的大肠杆菌株系分别被命名为“大肠杆菌JM109(hMBC1HcDNA/pUC19)”和“大肠杆菌JM109(hMBC1Lqλ/pUC19)”，它们已经按照布达佩斯条约的条款于1996年8月15日保藏在日本国立生命科学和人体技术研究所(1-3，Higashi 1-chome，Tsukuba-shi，Ibaragi-ken，日本)，大肠杆菌JM109(hMBC1HcDNA/pUC19)的登记号为FERM BP-5629，大肠杆菌JM109(hMBC1Lqλ/pUC19)的登记号为FERM BP-5630。
(5)转染到COS-7细胞
为确定杂合抗体和人源化#23-57-137-1抗体的抗原结合活性和中和活性，使上述表达质粒在COS-7细胞中短暂表达。为短暂表达杂合抗体L链，将下列各质粒的组合用Gene Pulser(Bio Rad)通过电穿孔共转染COS-7细胞：hMBC1HcDNA/pCOS1和h/mMBC1L(λ)/neo；hMBC1HcDNA/pCOS1和m/hMBC1Laλ/neo；hMBC1HcDNA/pCOS1和m/hMBC1Ldλ/neo；hMBC1HcDNA/pCOS1和hmmMBC1L(λ)/neo；hMBC1HcDNA/pCOS1和mhmMBC1L(λ)/neo。即，将各质粒DNA10微克加入0.8毫升COS-7细胞悬浮于PBS(-)浓度为1×107个细胞/毫升的细胞悬浮液。对得到的溶液应用静电容量为1500V和25μF的脉冲。室温恢复10分钟，电穿孔处理的细胞悬浮于添加2％Ultra Low IgG胎牛血清(GIBCO)的DMEM培养基中，然后用10cm的培养皿在CO2培养箱中培养。培养72小时后，收集培养上清液，并离心除去细胞碎片。如此制备的溶液用于下文的ELISA分析。
为实现人源化#23-57-137-1抗体的短暂表达，各质粒组合hMBC1HcDNA/pCOS1或hMBC1Lxλ/pCOS1(x＝a-t)以上述杂合抗体同样的方式用Gene Pulser(Bio Rad)转染到COS-7细胞中。获得的培养上清液作为用于下文ELISA分析的样品。
其中，COS-7细胞培养上清液中的杂合抗体或人源化抗体用AffiGel Protein A MAPSII试剂盒(Bio Rad)按照试剂盒上指示的方法进行纯化。
(6)ELISA分析
(i)抗体浓度的确定
确定抗体浓度的ELISA平板如下制备。用于ELISA的96孔平板(Maxisorp，NUNC)的每个孔都用100μl添加有1μg/毫升的山羊抗人IgG抗体(TAGO)的包被缓冲液(0.1M NaHCO3，0.02％NaN3)包被，然后用200μl稀释缓冲液[50mM Tris-HCl，1mM MgCl2，0.1M NaCl，0.05％Tween20，0.02％NaN3，1％牛血清白蛋白(BSA)；pH7.2]封闭。每孔加入表达杂合抗体或人源化抗体的COS-7细胞培养上清的系列稀释液或者逐步稀释的纯化杂合抗体或人源化抗体溶液。室温培养1小时并用PBS-Tween20冲洗后，每孔加入100μl与碱性磷酸酶偶合的山羊抗人IgG抗体(TAGO)。室温培养1小时并用PBS-Tween20冲洗后，每孔加入1毫克/毫升的底物溶液(“Sigma104”，对-硝基苯磷酸，SIGMA)。用微平板读数仪(Bio Rad)于405nm测量溶液的吸收值。纯化的Hu IgG1λ(结合位点)用作抗体浓度测定的标准样品。
(ii)抗原结合能力的确定
确定抗原结合能力的ELISA平板如下制备。用于ELISA的96孔平板(Maxisorp，NUNC)的每个孔均用100μl添加有1μg/毫升人PTHrP(1-34)的包被缓冲液包被，然后用200μl稀释缓冲液封闭。每孔加入杂合抗体或人源化抗体得以表达的COS-7细胞培养上清的系列稀释液或者逐步稀释的纯化杂合抗体或人源化抗体溶液。室温培养并用PBS-Tween20冲洗后，每孔加入100μ1与碱性磷酸酶偶合的山羊抗人IgG抗体(TAGO)。室温培养并用PBS-Tween20冲洗后，每孔加入1毫克/毫升的底物溶液(“Sigma104”，对-硝基苯磷酸，SIGMA)。用微平板读数仪(Bio Rad)于405nm测量溶液的吸收值。
(7)活性的确定
(i)人源化H链的评价
发现包含“a”型人源化H链和嵌合L链的抗体表现与嵌合抗体(见图6)同样水平的PTHrP结合活性。该结果表明“a”型成功地实现了H链V区的足够程度的人源化。因此，“a”型人源化H链用做下列实验中的人源化抗体H链。
(ii)杂合抗体的活性
(ii-a)FR1、2/FR3、4杂合抗体
当L链为h/mMBC1L(λ)时，抗体不表现抗原结合活性。然而，当杂合抗体的L链为m/hMBC1Laλ或m/hMBC1Ldλ时，抗体表现与嵌合#23-57-137-1抗体同样水平的抗原结合活性(图7)。这些结果表明FR3和FR4没有问题，但FR1和FR2在制备人源化抗体时存在一些氨基酸残基需要被替换。
(ii-b)FR1/FR2杂合抗体
当杂合抗体的L链为mhmMBC1L(λ)时，抗体不表现抗原结合活性。然而，当杂合抗体的L链为hmmMBC1L(λ)时，抗体表现与嵌合#23-57-137-1抗体同样水平的抗原结合活性(图8)。这些结果表明FR1在制备人源化抗体时没有问题，但FR2存在一些氨基酸残基需要被替换。
(iii)人源化抗体的活性
确定了每种“a”型到“t”型用做L链的人源化抗体的抗原结合活性。结果发现，具有“j”，“l”，“m”，“o”，“q”，“r”，“s”和“t”型L链的人源化抗体表现与嵌合抗体同样水平的PTHrP-结合活性(图9-12)。
(8)能稳定地生产抗体的CHO细胞系的建立
为建立能稳定生产人源化抗体的细胞系，将上述表达质粒导入CHO细胞(DXB11)。
采用下列质粒的各组合来建立能稳定表达人源化抗体的细胞系：hMBC1HcDNA/pCHO1和hMBC1Lmλ/pCOS1；hMBC1HcDNA/pCHO1和hMBC1Lqλ/pCOS1；hMBC1HcDNA/pCHO1和hMBC1Lrλ/pCOS1。质粒用Gene Pulser(Bio Rad)通过电穿孔共转染到CHO细胞中。随后，每种表达载体用限制性酶PvuI裂解，以获得线型DNA片段。得到的DNA片段用苯酚和氯仿提取，然后用乙醇沉淀。制备的DNA分别如下述用于电穿孔。即，每种质粒DNA各10微克加入0.8毫升包括COS-7细胞悬浮于PBS(-)浓度为1×107个细胞/毫升的细胞悬浮液中。对得到的溶液应用静电容量为1500V和25μF的脉冲。室温恢复10分钟后，电穿孔处理的细胞悬浮于添加10％胎牛血清(GIBCO)的MEM-α培养基(GIBCO)中，然后用96孔平板(Falcon)在CO2培养箱中培养。培养当天，用添加10％胎牛血清(GIBCO)和500毫克/毫升GENETICIN(硫酸G418；GIBCO)但无核糖核苷和脱氧核糖核苷的MEM-α选择培养基替换原培养基。从培养基中筛选导入了抗体基因的细胞。用新鲜培养基替换原培养基。在置换该培养基后约两周，显微观察细胞。当观察到满意的细胞生长后，用如上述确定抗体浓度的常规ELISA分析法确定细胞产生的抗体量。从这些细胞中筛选大量产生抗体的那些细胞。
用添加2％Ultra Low IgG胎牛血清但无核糖核苷或脱氧核糖核苷的MEM-α培养基在摇瓶中大规模培养这样建立的能稳定生产抗体的细胞系。培养后第3天和第4天收集培养基上清液，并用0.2μm的滤器(Millipore)过滤以除去其中的细胞碎片。CHO细胞培养上清液中的人源化抗体用POROS Protein A柱(PerSeptive Biosystems)在ConSepLC100(Millopore)上按照包括于其中的指导方法进行纯化。该人源化抗体用做确定中和活性和检查对高钙血症模型动物药理效能的样品。用上述ELISA系统确定纯化的人源化抗体的浓度和抗原结合活性。
参考实施例5
中和活性的确定
鼠抗体、嵌合抗体和人源化抗体的中和活性的测定通过大鼠骨髓瘤细胞系ROS17/2.8-5细胞进行。在CO2培养箱中，将ROS17/2.8-5细胞培养在添加10％胎牛血清(GIBCO)的Ham′s F-12培养基中，将ROS17/2.8-5细胞接种到用96孔平板的每孔中培养1天，细胞浓度为104个细胞/100μl/孔。培养基用添加4mM氢化可的松和10％胎牛血清的Ham′s F-12培养基(GIBCO)更换。培养三到四天后，培养细胞用260μl Ham′s F-12培养基(GIBCO)冲洗，然后其中加入80μl添加有1mM异丁基-1-甲基黄嘌呤(IBMX，SIGMA)、10％胎牛血清和10mM HEPES的Ham′s F-12培养基。得到的混合物于37℃保温30分钟。
用于检测中和活性的鼠抗体、嵌合抗体和人源化抗体预先按照下列各组逐步稀释：[10μg/毫升，3.3μg/毫升，1.1μg/毫升和0.37v/毫升]，[10μg/毫升，2μg/毫升，0.5μg/毫升和0.01μg/毫升]和[10μg/毫升，5μg/毫升，1.25μg/毫升，0.63μg/毫升和0.31μg/毫升]。每种稀释的抗体样品溶液与等量4纳克/毫升PTHrP(1-34)混合。得到的混合溶液80μl加入各孔。每种抗体的终浓度为上述抗体浓度的四分之一，因此PTHrP(1-34)的浓度成为1纳克/毫升。室温处理十分钟后，除去培养上清液，残留物用PBS冲洗三次。从产物中用100μl 0.3％HCl-95％乙醇提取细胞中的cAMP，然后用水蒸汽吸收器蒸发除去HCl-乙醇。残留物溶解于120μl cAMP EIA试剂盒(CAYMAN CHEMICAL’S)所附的EIA缓冲液中以提取其中的cAMP。用cAMP EIA试剂盒(CAYMAN CHEMICAL’S)按照其中指示的方法确定cAMP的水平。结果发现，在具有与嵌合抗体表现同样水平抗原结合活性的人源化抗体中，具有在91位酪氨酸被异亮氨酸取代的“q”，“r”，“s”和“t”型L链人源化抗体表现与嵌合抗体最接近的中和活性，尤其L链为“q”型的人源化抗体表现最强的中和活性(图13-15)。
工业实用性
如上所述，本发明提供了包含能抑制PTHrP和其受体相结合的物质作为活性成分的恶病质治疗剂。
在使用恶病质模型动物的药学试验中，上述物质可使试验动物与对照相比防止体重减轻并使存活时间延长。因此，所述物质可用于治疗恶病质。
序列表
(2)SEQ ID NO：1的信息：
(i)序列特征：
(A)长度：20个碱基对
(B)类型：核酸
(C)链型：单链
(D)拓扑学：线性
(ii)分子类型：其他核酸
(A)说明：/desc＝″合成DNA″
(xi)SEQ ID NO：1的序列描述：
AAATAGCCCT TGACCAGGCA                                                20
(2)SEQ ID NO：2的信息：
(i)序列特征：
(A)长度：38个碱基对
(B)类型：核酸
(C)链型：单链
(D)拓扑学：线性
(ii)分子类型：其他核酸
(A)说明：/desc＝″合成DNA″
(xi)SEQ ID NO：2的序列描述：
CTGGTTCGGC CCACCTCTGA AGGTTCCAGA ATCGATAG                            38
(2)SEQ IDNO：3的信息：
(i)序列特征：
(A)长度：28个碱基对
(B)类型：核酸
(C)链型：单链
(D)拓扑学：线性
(ii)分子类型：其他核酸
(A)说明：/desc＝″合成DNA″
(xi)SEQ ID NO：3的序列描述：
GGATCCCGGG CCAGTGGATA GACAGATG                                       28
(2)SEQ ID NO：4的信息：
(i)序列特征：
(A)长度：29个碱基对
(B)类型：核酸
(C)链型：单链
(D)拓扑学：线性
(ii)分子类型：其他核酸
(A)说明：/desc＝″合成DNA″
(xi)SEQ ID NO：4的序列描述：
GGATCCCGGG TCAGRGGAAG GTGGRAACA                                      29
(2)SEQ ID NO：5的信息：
(i)序列特征：
(A)长度：17个碱基对
(B)类型：核酸
(C)链型：单链
(D)拓扑学：线性
(ii)分子类型：其他核酸
(A)说明：/desc＝″合成DNA″
(xi)SEQ ID NO：5的序列描述：
GTTTTCCCAG TCACGAC                                                   17
(2)SEQ IDNO：6的信息：
(i)序列特征：
(A)长度：17个碱基对
(B)类型：核酸
(C)链型：单链
(D)拓扑学：线性
(ii)分子类型：其他核酸
(A说明：/desc＝″合成DNA″
(xi)SEQ ID NO：6的序列描述：
CAGGAAACAG CTATGAC                                                   17
(2)SEQIDNO：7的信息：
(i)序列特征：
(A)长度：31个碱基对
(B)类型：核酸
(C)链型：单链
(D)拓扑学：线性
(ii)分子类型：其他核酸
(A)说明：/desc＝″合成DNA″
(xi)SEQ ID NO：7的序列描述：
GTCTAAGCTT CCACCATGAA ACTTCGGGCTC                                    31
(2)SEQ ID NO：8的信息：
(i)序列特征：
(A)长度：30个碱基对
(B)类型：核酸
(C)链型：单链
(D拓扑学：线性
(ii)分子类型：其他核酸
(A)说明：/desc＝″合成DNA″
(xi)SEQ ID NO：8的序列描述：
TGTTGGATCC CTGCAGAGAC AGTGACCAGA                                     30
(2)SEQ ID NO：9的信息：
(i)序列特征：
(A)长度：36个碱基对
(B)类型：核酸
(C)链型：单链
(D)拓扑学：线性
(ii)分子类型：其他核酸
(A)说明：/desc＝″合成DNA″
(xi)SEQ ID NO：9的序列描述：
GTCTGAATTC AAGCTTCCAC CATGGGGTTT GGGCTG                               36
(2)SEQ ID NO：10的信息：
(i)序列特征：
(A)长度：41个碱基对
(B)类型：核酸
(C)链型：单链
(D)拓扑学：线性
(ii)分子类型：其他核酸
(A)说明：/desc＝″合成DNA″
(xi)SEQ ID NO：10的序列描述：
TTTCCCGGGC CCTTGGTGGA GGCTGAGGAG ACGGTGACCAG                         41
(2)SEQ ID NO：11的信息：
(i)序列特征：
(A)长度：109个碱基对
(B)类型：核酸
(C)链型：单链
(D)拓扑学：线性
(ii)分子类型：其他核酸
(A)说明：/desc＝″合成DNA″
(xi)SEQIDNO：11的序列描述：
GTCTGAATTC AAGCTTAGTA CTTGGCCAGC CCAAGGCCAA CCCCACGGTC ACCCTGTTCC    60
CGCCCTCCTC TGAGGAGCTC CAAGCCAACA AGGCCACACT AGTGTGTCT                109
(2)SEQ ID NO：12的信息：
(i)序列特征：
(A)长度：110个碱基对
(B)类型：核酸
(C)链型：单链
(D)拓扑学：线性
(ii)分子类型：其他核酸
(A)说明：/desc＝″合成DNA″
(xi)SEQ ID NO：12的序列描述：
GGTTTGGTGG TCTCCACTCC CGCCTTGACG GGGCTGCCAT CTGCCTTCCA GGCCACTGTC    60
ACAGCTCCCG GGTAGAAGTC ACTGATCAGA CACACTAGTG TGGCCTTGTT               110
(2)SEQ ID NO：13的信息：
(i)序列特征：
(A)长度：98个碱基对
(B)类型：核酸
(C)链型：单链
(D)拓扑学：线性
(ii)分子类型：其他核酸
(A)说明：/desc＝″合成DNA″
(xi) SEQ ID NO：13的序列描述：
GGAGTGGAGA CCACCAAACC CTCCAAACAG AGCAACAACA AGTACGCGGC CAGCAGCTAC    60
CTGAGCCTGA CGCCCGAGCA GTGGAAGTCC CACAGAAG                            98
(2)SEQ ID NO：14的信息：
(i)序列特征：
(A)长度：106个碱基对
(B)类型：核酸
(C)链型：单链
(D)拓扑学：线性
(ii)分子类型：其他核酸
(A)说明：/desc＝″合成DNA″
(xi)SEQ ID NO：14的序列描述：
TGTTGAATTC TTACTATGAA CATTCTGTAG GGGCCACTGT CTTCTCCACG GTGCTCCCTT    60
CATGCGTGAC CTGGCAGCTG TAGCTTCTGT GGGACTTCCA CTGCTC                   106
(2)SEQ ID NO：15的信息：
(i)序列特征：
(A)长度：43个碱基对
(B)类型：核酸
(C)链型：单链
(D)拓扑学：线性
(ii)分子类型：其他核酸
(A)说明：/desc＝″合成DNA″
(xi)SEQ ID NO：15的序列描述：
GTCTGAATTC AAGCTTAGTA CTTGGCCAGC CCAAGGCCAA CCC                      43
(2)SEQ ID NO：16的信息：
(i)序列特征：
(A)长度：20个碱基对
(B)类型：核酸
(C)链型：单链
(C)拓扑学：线性
(ii)分子类型：其他核酸
(A)说明：/desc＝″合成DNA"
(xi)SEQ IDNO：16的序列描述：
TGTTGAATTC TTACTATGAA                                                20
(2)SEQ ID NO：17的信息：
(i)序列特征：
(A)长度：39个碱基对
(B)类型：核酸
(C)链型：单链
(D)拓扑学：线性
(ii)分子类型：其他核酸
(A)说明：/desc＝″合成DNA″
(xi)SEQ ID NO：17的序列描述：
CAACAAGTAC GCGGCCAGCA GCTACCTGAG CCTGACGCC                           39
(2)SEQ ID NO：18的信息：
(i)序列特征：
(A)长度：39个碱基对
(B)类型：核酸
(C)链型：单链
(D)拓扑学：线性
(ii)分子类型：其他核酸
(A)说明：/desc＝″合成DNA″
(xi)SEQ ID NO：18的序列描述：
GTAGCTGCTG GCCGCGTACT TGTTGTTGCT CTGTTTGGA                           39
(2)SEQ ID NO：19的信息：
(i)序列特征：
(A)长度：46个碱基对
(B)类型：核酸
(C)链型：单链
(D)拓扑学：线性
(ii)分子类型：其他核酸
(A说明：/desc＝″合成DNA″
(xi)SEQ ID NO：19的序列描述：
GTCTGAATTC AAGCTTAGTC CTAGGTCGAA CTGTGGCTGC ACCATC                   46
(2)SEQ ID NO：20的信息：
(i)序列特征：
(A)长度：34个碱基对
(B)类型：核酸
(C)链型：单链
(D拓扑学：线性
(ii)分子类型：其他核酸
(A)说明：/desc＝″合成DNA″
(xi)SEQ ID NO：20的序列描述：
TGTTGAATTC TTACTAACAC TCTCCCCTGT TGAA                                34
(2)SEQ IDNO：21的信息：
(i)序列特征：
(A)长度：35个碱基对
(B)类型：核酸
(C)链型：单链
(D)拓扑学：线性
(ii)分子类型：其他核酸
(A)说明：/desc＝″合成DNA″
(xi)SEQ ID NO：21的序列描述：
GTCTAAGCTT CCACCATGGC CTGGACTCCT CTCTT                               35
(2)SEQ ID NO：22的信息：
(i)序列特征：
(A)长度：48个碱基对
(B)类型：核酸
(C)链型：单链
(D)拓扑学：线性
(ii)分子类型：其他核酸
(A)说明：/desc＝″合成DNA″
(xi)SEQ ID NO：22的序列描述：
TGTTGAATTC AGATCTAACT ACTTACCTAG GACAGTGACC TTGGTCCC                 48
(2)SEQ ID NO：23的信息：
(i)序列特征：
(A)长度：128个碱基对
(B)类型：核酸
(C)链型：单链
(D)拓扑学：线性
(ii)分子类型：其他核酸
(A)说明：/desc＝″合成DNA″
(xi)SEQ ID NO：23的序列描述：
GTCTAAGCTT CCACCATGGG GTTTGGGCTG AGCTGGGTTT TCCTCGTTGC TCTTTTAAGA    60
GGTGTCCAGT GTCAGGTGCA GCTGGTGGAG TCTGGGGGAG GCGTGGTCCA GCCTGGGAGG    120
TCCCTGAG                                                             128
(2)SEQ ID NO：24的信息：
(i)序列特征：
(A)长度：125个碱基对
(B)类型：核酸
(C)链型：单链
(D)拓扑学：线性
(ii)分子类型：其他核酸
(A)说明：/desc＝″合成DNA″
(xi)SEQ ID NO：24的序列描述：
ACCATTAGTA GTGGTGGTAG TTACACCTAC TATCCAGACA GTGTGAAGGG GCGATTCACC    60
ATCTCCAGAG ACAATTCCAA GAACACGCTG TATCTGCAAA TGAACAGCCT GAGAGCTGAG    120
GACAC                                                                125
(2)SEQIDNO：25的信息：
(i)序列特征：
(A)长度：132个碱基对
(B)类型：核酸
(C)链型：单链
(D)拓扑学：线性
(ii)分子类型：其他核酸
(A)说明：/desc＝″合成DNA″
(xi)SEQ ID NO：25的序列描述：
CTACCACCAC TACTAATGGT TGCCACCCAC TCCAGCCCCT TGCCTGGAGC CTGGCGGACC    60
CAAGACATGC CATAGCTACT GAAGGTGAAT CCAGAGGCTG CACAGGAGAG TCTCAGGGAC    120
CTCCCAGGCT GG                                                        132
(2)SEQ ID NO：26的信息：
(i)序列特征：
(A)长度：110个碱基对
(B)类型：核酸
(C)链型：单链
(D)拓扑学：线性
(ii)分子类型：其他核酸
(A)说明：/desc＝″合成DNA″
(xi)SEQ ID NO：26的序列描述：
TGTTGGATCC CTGAGGAGAC GGTGACCAGG GTTCCCTGGC CCCAGTAAGC AAAGTAAGTC    60
ATAGTAGTCT GTCTCGCACA GTAATACACA GCCGTGTCCT CAGCTCTCAG               110
(2)SEQ ID NO：27的信息：
(i)序列特征：
(A)长度：30个碱基对
(B)类型：核酸
(C)链型：单链
(D)拓扑学：线性
(ii)分子类型：其他核酸
(A)说明：/desc＝″合成DNA″
(xi)SEQ ID NO：27的序列描述：
GTCTAAGCTT CCACCATGGG GTTTGGGCTG                                     30
(2)SEQ ID NO：28的信息：
(i)序列特征：
(A)长度：30个碱基对
(B)类型：核酸
(C)链型：单链
(D)拓扑学：线性
(ii)分子类型：其他核酸
(A)说明：/desc＝″合成DNA″
(xi)SEQ ID NO：28的序列描述：
TGTTGGATCC CTGAGGAGAC GGTGACCAGG                                     30
(2)SEQ ID NO：29的信息：
(i)序列特征：
(A)长度：133个碱基对
(B)类型：核酸
(C)链型：单链
(D)拓扑学：线性
(ii)分子类型：其他核酸
(A)说明：/desc＝″合成DNA″
(xi)SEQ ID NO：29的序列描述：
ACAAAGCTTC CACCATGGCC TGGACTCCTC TCTTCTTCTT CTTTGTTCTT CATTGCTCAG    60
GTTCTTTCTC CCAGCTTGTG CTGACTCAAT CGCCCTCTGC CTCTGCCTCC CTGGGAGCCT    120
CGGTCAAGCT CAC                                                       133
(2)SEQ ID NO：30的信息：
(i)序列特征：
(A)长度：118个碱基对
(B)类型：核酸
(C)链型：单链
(D)拓扑学：线性
(ii)分子类型：其他核酸
(A)说明：/desc＝″合成DNA″
(xi)SEQ ID NO：30的序列描述：
AGCAAGATGG AAGCCACAGC ACAGGTGATG GGATTCCTGA TCGCTTCTCA GGCTCCAGCT    60
CTGGGGCTGA GCGCTACCTC ACCATCTCCA GCCTCCAGTC TGAGGATGAG GCTGACTA      118
(2)SEQ ID NO：31的信息：
(i)序列特征：
(A)长度：128个碱基对
(B)类型：核酸
(C)链型：单链
(D)拓扑学：线性
(ii)分子类型：其他核酸
(A)说明：/desc＝″合成DNA″
(xi)SEQ ID NO：31的序列描述：
CTGTGGCTTC CATCTTGCTT AAGTTTCATC AAGTACCGAG GGCCCTTCTC TGGCTGCTGC    60
TGATGCCATT CAATGGTGTA CGTACTGTGC TGACTACTCA AGGTGCAGGT GAGCTTGACC    120
GAGGCTCC                                                             128
(2)SEQ ID NO：32的信息：
(i)序列特征：
(A)长度：114个碱基对
(B)类型：核酸
(C)链型：单链
(D)拓扑学：线性
(ii)分子类型：其他核酸
(A)说明：/desc＝″合成DNA″
(xi)SEQ ID NO：32的序列描述：
CTTGGATCCG GGCTGACCTA GGACGGTCAG TTTGGTCCCT CCGCCGAACA CCCTCACAAA    60
TTGTTCCTTA ATTGTATCAC CCACACCACA GTAATAGTCA GCCTCATCCT CAGA          114
(2)SEQ ID NO：33的信息：
(i)序列特征：
(A)长度：17个碱基对
(A)类型：核酸
(C)链型：单链
(D)拓扑学：线性
(ii)分子类型：其他核酸
(A)说明：/desc＝″合成DNA″
(xi)SEQ ID NO：33的序列描述：
ACAAAGCTTC CACCATG                                                   17
(2)SEQ ID NO：34的信息：
(i)序列特征：
(A)长度：19个碱基对
(B)类型：核酸
(C)链型：单链
(D)拓扑学：线性
(ii)分子类型：其他核酸
(A)说明：/desc＝″合成DNA″
(xi)SEQ ID NO：34的序列描述：
CTTGGATCCG GGCTGACCT                                                 19
(2)SEQ ID NO：35的信息：
(i)序列特征：
(A)长度：75个碱基对
(B)类型：核酸
(C)链型：单链
(D)拓扑学：线性
(ii)分子类型：其他核酸
(A)说明：/desc＝″合成DNA″
(xi)SEQ ID NO：35的序列描述：
CTTGGATCCG GGCTGACCTA GGACGGTCAG TTTGGTCCCT CCGCCGAACA CGTACACAAA    60
TTGTTCCTTA ATTGT                                                     75
(2)SEQ ID NO：36的信息：
(i)序列特征：
(A)长度：43个碱基对
(B)类型：核酸
(C)链型：单链
(D)拓扑学：线性
(ii)分子类型：其他核酸
(A)说明：/desc＝″合成DNA″
(xi)SEQ ID NO：36的序列描述：
AAAGGATCCT TAAGATCCAT CAAGTACCGA GGGGGCTTCT CTG                      43
(2)SEQ ID NO：37的信息：
(i)序列特征：
(A)长度：46个碱基对
(B)类型：核酸
(C)链型：单链
(D)拓扑学：线性
(ii)分子类型：其他核酸
(A)说明：/desc＝″合成DNA″
(xi)SEQ ID NO：37的序列描述：
ACAAAGCTTA GCGCTACCTC ACCATCTCCA GCCTCCAGCC TGAGGA                   46
(2)SEQ ID NO：38的信息：
(i)序列特征：
(A)长度：111个碱基对
(B)类型：核酸
(C)链型：单链
(D)拓扑学：线性
(ii)分子类型：其他核酸
(A)说明：/desc＝″合成DNA″
(xi)SEQ ID NO：38的序列描述：
CTTGGATCCG GGCTGACCTA GGACGGTCAG TTTGGTCCCT CCGCCGAACA CGTACACAAA    60
TTGTTCCTTA ATTGTATCAC CCACACCACA GATATAGTCA GCCTCATCCT C             111
(2)SEQ ID NO：39的信息：
(i)序列特征：
(A)长度：42个碱基对
(B)类型：核酸
(C)链型：单链
(D)拓扑学：线性
(ii)分子类型：其他核酸
(A)说明：/desc＝″合成DNA″
(xi)SEQ ID NO：39的序列描述：
CTTCTCTGGC TGCTGCTGAT ACCATTCAAT GGTGTACGTA CT                       42
(2)SEQ ID NO：40的信息：
(i)序列特征：
(A)长度：26个碱基对
(B)类型：核酸
(C)链型：单链
(D)拓扑学：线性
(ii)分子类型：其他核酸
(A)说明：/desc＝″合成DNA″
(xi)SEQ ID NO：40的序列描述：
CGAGGGCCCT TCTCTGGCTG CTGCTG                                         26
(2)SEQ IDNO：41的信息：
(i)序列特征：
(A)长度：35个碱基对
(B)类型：核酸
(C)链型：单链
(D)拓扑学：线性
(ii)分子类型：其他核酸
(A)说明：/desc＝″合成DNA″
(xi)SEQ ID NO：41的序列描述：
GAGAAGGGCC CTARGTACST GATGRAWCTT AAGCA                               35
(2)SEQ ID NO：42的信息：
(i)序列特征：
(A)长度：35个碱基对
(B)类型：核酸
(C)链型：单链
(D)拓扑学：线性
(ii)分子类型：其他核酸
(A)说明：/desc＝″合成DNA″
(xi)SEQ ID NO：42的序列描述：
CACGAATTCA CTATCGATTC TGGAACCTTC AGAGG                               35
(2)SEQ ID NO：43的信息：
(i)序列特征：
(A)长度：18个碱基对
(B)类型：核酸
(C)链型：单链
(D)拓扑学：线性
(ii)分子类型：其他核酸
(A)说明：/desc＝″合成DNA″
(xi)SEQ ID NO：43的序列描述：
GGCTTGGAGC TCCTCAGA                                                  18
(2)SEQ ID NO：44的信息：
(i)序列特征：
(A)长度：20个碱基对
(B)类型：核酸
(C)链型：单链
(D)拓扑学：线性
(ii)分子类型：其他核酸
(A)说明：/desc＝″合成DNA″
(xi)SEQ ID NO：44的序列描述：
GACAGTGGTT CAAAGTTTT                                                 20
(2)SEQ ID NO：45的信息：
(i)序列特征：
(A)长度：118个氨基酸
(B)类型：氨基酸
(D)拓扑学：线性
(ii)分子类型：蛋白质
(xi)SEQ ID NO：45的序列描述：
Gln Leu Val Leu Thr Gln Ser Ser Ser Ala Ser Phe Ser Leu Gly
  1               5                    10                15
Ala Ser Ala Lys Leu Thr Cys Thr Leu Ser Ser Gln His Ser Thr
                 20                  25                  30
Tyr Thr Ile Glu Trp Tyr Gln Gln Gln Pro Leu Lys Pro Pro Lys
                 35                  40                  45
Tyr Val Met Asp Leu Lys Gln Asp Gly Ser His Ser Thr Gly Asp
                 50                  55                  60
Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Ser Ser Gly Ala Asp Arg
                 65                  70                  75
Tyr Leu Ser Ile Ser Asn Ile Gln Pro Glu Asp Glu Ala Met Tyr
                 80                  85                  90
 Ile Cys Gly Val Gly Asp Thr Ile Lys Glu Gln Phe Val Tyr Val
                  95                  100                105
 Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Thr Val Leu Gly Gln Pro
                  110                 115
(2)SEQ ID NO：46的信息：
(i)序列特征：
(A)长度：118个氨基酸
(B)类型：氨基酸
(D)拓扑学：线性
(ii)分子类型：蛋白质
(xi)SEQ ID NO：46的序列描述：
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Asp Leu Val Lys Pro Gly
  1               5                  10                  15
Gly Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser
                 20                  25                  30
Ser Tyr Gly Met Ser Trp Ile Arg Gln Thr Pro Asp Lys Arg Leu
                 35                  40                   45
Glu Trp Val Ala Thr Ile Ser Ser Gly Gly Ser Tyr Thr Tyr Tyr
                 50                  55                  60
Pro Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala
                 65                   70                 75
Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Ser Ser Leu Lys Ser G1u Asp
                 80                   85                 90
Thr Ala Met Phe Tyr Cys Ala Arg Gln Thr Thr Met Thr Tyr Phe
                 95                  100                105
Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala
                110                 115
(2)SEQ ID NO：47的信息：
(i)序列特征：
(A)长度：116个氨基酸
(B)类型：氨基酸
(D)拓扑学：线性
(ii)分子类型：蛋白质
(xi)SEQ ID NO：47的序列描述：
Gln Leu Val Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ala Ser Ala Ser Leu Gly
  1               5                  10                  15
Ala Ser Val Lys Leu Thr Cys Thr Leu Ser Ser Gln His Ser Thr
                 20                  25                  30
Tyr Thr Ile Glu Trp His Gln Gln Gln Pro Glu Lys Gly Pro Arg
                 35                  40                  45
Tyr Leu Met Lys Leu Lys Gln Asp Gly Ser His Ser Thr Gly Asp
                 50                  55                  60
Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Ser Ser Gly Ala Glu Arg
                 65                  70                  75
Tyr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr
                 80                  85                  90
Tyr Cys Gly Val Gly Asp Thr Ile Lys Glu Gln Phe Val Tyr Val
                 95                 100                 105
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly
                l10                 115
(2)SEQ ID NO：48的信息：
(i)序列特征：
(A)长度：118个氨基酸
(B)类型：氨基酸
(D)拓扑学：线性
(ii)分子类型：蛋白质
(xi)SEQ ID NO：48的序列描述：
Gln Leu Val Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ala Ser Ala Ser Leu Gly
  1               5                  10                  15
Ala Ser Val Lys Leu Thr Cys Thr Leu Ser Ser Gln His Ser Thr
                 20                      25              30
Tyr Thr Ile Glu Trp Tyr Gln Gln Gln Pro Glu Lys Gly Pro Lys
                 35                  40                  45
Tyr Leu Met Asp Leu Lys Gln Asp Gly Ser His Ser Thr Gly Asp
                 50                  55                  60
Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Ser Ser Gly Ala G1u Arg
                 65                  70                  75
Tyr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr
                 80                  85                  90
Tyr Cys Gly Val Gly Asp Thr Ile Lys Glu Gln Phe Val Tyr Val
                 95                  100                 105
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Gln Pro
                 110                 115
(2)SEQ ID NO：49的信息：
(i)序列特征：
(A)长度：118个氨基酸
(B)类型：氨基酸
(D)拓扑学：线性
(ii)分子类型：蛋白质
(xi)SEQ ID NO：49的序列描述：
Gln Leu Val Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ala Ser Ala Ser Leu Gly
  1               5                  10                  15
Ala Ser Val Lys Leu Thr CyS Thr Leu Ser Ser Gln His Ser Thr
                 20                  25                  30
Tyr Thr Ile Glu Trp Tyr Gln Gln Gln Pro Glu Lys Gly Pro Lys
                 35                  40                  45
Tyr Val Met Asp Leu Lys Gln Asp Gly Ser His Ser Thr Gly Asp
                 50                  55                  60
Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Ser Ser Gly Ala Glu Arg
                 65                  70                  75
Tyr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr
                 80                  85                  90
Tyr Cys Gly Val Gly Asp Thr Ile Lys Glu Gln Phe Val Tyr Val
                 95                  100                 105
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Gln Pro
                 110                 115
(2)SEQ ID NO：50的信息：
(i)序列特征：
(A)长度：118个氨基酸
(B)类型：氨基酸
(D)拓扑学：线性
(ii)分子类型：蛋白质
(xi)SEQ ID NO：50的序列描述：
Gln Leu Val Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ala Ser Ala Ser Leu Gly
  1               5                  10                  15
 Ala Ser Val Lys Leu Thr Cys Thr Leu Ser Ser Gln His Ser Thr
                  20                  25                  30
 Tyr Thr Ile Glu Trp Tyr Gln Gln Gln Pro Glu Lys Gly Pro Arg
                  35                  40                  45
 Tyr Leu Met Asp Leu Lys Gln Asp Gly Ser His Ser Thr Gly Asp
                  50                  55                  60
 Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Ser Ser Gly Ala Glu Arg
                  65                  70                  75
 Tyr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr
                  80                  85                  90
 Tyr Cys Gly Val Gly Asp Thr Ile Lys Glu Gln Phe Val Tyr Val
                  95                 100                 105
 Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Gln Pro
                 110                 115
(2)SEQ ID NO：51的信息：
(i)序列特征：
(A)长度：118个氨基酸
(B)类型：氨基酸
(D)拓扑学：线性
(ii)分子类型：蛋白质
(xi)SEQ ID NO：51的序列描述：
Gln Leu Val Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ala Ser Ala Ser Leu Gly
  1               5                  10                  15
Ala Ser Val Lys Leu Thr Cys Thr Leu Ser Ser Gln His Ser Thr
                 20                  25                  30
Tyr Thr Ile Glu Trp Tyr Gln Gln Gln Pro Glu Lys Gly Pro Arg
                 35                  40                  45
Tyr Val Met Asp Leu Lys Gln Asp Gly Ser His Ser Thr Gly Asp
                 50                  55                  60
Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Ser Ser Gly Ala Glu Arg
                 65                  70                  75
Tyr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr
                 80                  85                  90
Tyr Cys Gly Val Gly Asp Thr Ile Lys Glu Gln Phe Val Tyr Val
                 95                 100                 105
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Gln Pro
                110                 115
(2)SEQ ID NO：52的信息：
(i)序列特征：
(A)长度：118个氨基酸
(B)类型：氨基酸
(D)拓扑学：线性
(ii)分子类型：蛋白质
(xi)SEQ ID NO：52的序列描述：
Gln Leu Val Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ala Ser Ala Ser Leu Gly
  l               5                  10                  15
Ala Ser Val Lys Leu Thr Cys Thr Leu Ser Ser Gln His Ser Thr
                 20                  25                  30
Tyr Thr Ile Glu Trp Tyr Gln Gln Gln Pro Glu Lys Gly Pro Lys
                 35                  40                  45
Tyr Leu Met Asp Leu Lys Gln Asp Gly Ser His Ser Thr Gly Asp
                 50                  55                  60
Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Ser Ser Gly Ala Glu Arg
                 65                  70                  75
Tyr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr
                 80                  85                  90
Ile Cys Gly Val Gly Asp Thr Ile Lys Glu Gln Phe Val Tyr Val
                 95                 100                 105
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Gln Pro
                110                 115
(2)SEQ ID NO：53的信息：
(i)序列特征：
(A)长度：118个氨基酸
(B)类型：氨基酸
(D)拓扑学：线性
(ii)分子类型：蛋白质
(xi)SEQ ID NO：53的序列描述：
Gln Leu Val Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ala Ser Ala Ser Leu Gly
  1               5                  10                  15
Ala Ser Val Lys Leu Thr Cys Thr Leu Ser Ser Gln His Ser Thr
                 20                  25                  30
Tyr Thr Ile Glu Trp Tyr Gln Gln Gln Pro Glu Lys Gly Pro Arg
                 35                  40                  45
Tyr Leu Met Asp Leu Lys Gln ASp Gly Ser His Ser Thr Gly Asp
                 50                  55                  60
Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Ser Ser Gly Ala Glu Arg
                 65                  70                  75
Tyr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr
                 80                  85                  90
Ile Cys Gly Val Gly Asp Thr Ile Lys Glu Gln Phe Val Tyr Val
                 95                 100                 105
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Gln Pro
                110                 115
(2)SEQ ID NO：54的信息：
(i)序列特征：
(A)长度：118个氨基酸
(B)类型：氨基酸
(D)拓扑学：线性
(ii)分子类型：蛋白质
(xi)SEQ ID NO：54的序列描述：
Gln Leu Val Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ala Ser Ala Ser Leu Gly
   1              5                  10                 l5
Ala Ser Val Lys Leu Thr Cys Thr Leu Ser Ser Gln His Ser Thr
                 20                  25                  30
Tyr Thr Ile Glu Trp Tyr Gln Gln Gln Pro Glu Lys Gly Pro Lys
                 35                  40                  45
Tyr Val Met Asp Leu Lys Gln Asp Gly Ser His Ser Thr Gly Asp
                 50                  55                  60
Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Ser Ser Gly Ala Glu Arg
                 65                  70                  75
Tyr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr
                 80                  85                  90
Ile Cys Gly Val Gly Asp Thr Ile Lys Glu Gln Phe Val Tyr Val
                 95                 100                 105
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Gln Pro
                110                 115
(2)SEQ ID NO：55的信息：
(i)序列特征：
(A)长度：118个氨基酸
(B)类型：氨基酸
(D)拓扑学：线性
(ii)分子类型：蛋白质
(xi)SEQ ID NO：55的序列描述：
Gln Leu Val Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ala Ser Ala Ser Leu Gly
  1               5                 10                   15
Ala Ser Val Lys Leu Thr Cys Thr Leu Ser Ser Gln His Ser Thr
                 20                  25                  30
Tyr Thr Ile Glu Trp Tyr Gln Gln Gln Pro Glu Lys Gly Pro Arg
                 35                  40                  45
Tyr Val Met Asp Leu Lys Gln Asp Gly Ser His Ser Thr Gly Asp
                 50                  55                  60
Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Ser Ser Gly Ala Glu Arg
                 65                  70                  75
Tyr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr
                 80                  85                  90
Ile Cys Gly Val Gly Asp Thr Ile Lys Glu Gln Phe Val Tyr Val
                 95                 100               105
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Gln Pro
                110                 115
(2)SEQ ID NO：56的信息：
(i)序列特征：
(A)长度：118个氨基酸
(B)类型：氨基酸
(D)拓扑学：线性
(ii)分子类型：蛋白质
(xi)SEQ ID NO：56的序列描述：
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly
  1               5                  10                  15
Arg Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser
                 20                  25                  30
Ser Tyr Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu
                 35                  40                  45
Glu Trp Val Ala Thr Ile Ser Ser Gly Gly Ser Tyr Thr Tyr Tyr
                 50                  55                  60
Pro Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser
                 65                  70                  75
Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Ash Ser Leu Arg Ala Glu Asp
                 80                  85                  90
Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Gln Thr Thr Met Thr Tyr Phe
                 95                 100                 105
Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
                110                 115
(2)SEQ ID NO：57的信息：
(i)序列特征：
(A)长度：411个碱基对
(B)类型：核酸
(C)链型：双链
(D)拓扑学：线性
(ii)分子类型：cDNA到mRNA
(xi)SEQ ID NO：57的序列描述：
ATG AAC TTC GGG CTC AGC TTG ATT TTC CTT GCC CTC ATT TTA AAA  45
Met Asn Phe Gly Leu Ser Leu Ile Phe Leu Ala Leu Ile Leu Lys
                -15                 -10                  -5
GGT GTC CAG TGT GAG GTG CAA CTG GTG GAG TCT GGG GGA GAC TTA  90
Gly Val Gln Cys Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Asp Leu
                  1               5                  10
GTG AAG CCT GGA GGG TCC CTG AAA CTC TCC TGT GCA GCC TCT GGA  135
Val Lys Pro Gly Gly Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly
                 15              20                  25
TTC ACT TTC AGT AGC TAT GGC ATG TCT TGG ATT CGC CAG ACT CCA  180
Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Gly Met Ser Trp Ile Arg Gln Thr Pro
                 30              35                  40
GAC AAG AGG CTG GAG TGG GTC GCA ACC ATT AGT AGT GGT GGT AGT  225
Asp Lys Arg Leu Glu Trp Val Ala Thr Ile Ser Ser Gly Gly Ser
                 45              50                  55
TAC ACC TAC TAT CCA GAC AGT GTG AAG GGG CGA TTC ACC ATC TCC  270
Tyr Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser
                 60              65                  70
AGA GAC AAT GCC AAG AAC ACC CTA TAC CTG CAA ATG AGG AGT CTG  315
Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Ser Ser Leu
                 75              80                  85
AAG TCT GAG GAC ACA GCC ATG TTT TAC TGT GCA AGA CAG ACT ACT  360
Lys Ser Glu Asp Thr Ala Met Phe Tyr Cys Ala Arg Gln Thr Thr
                 90              95                 100
ATG ACT TAC TTT GCT TAC TGG GGC CAA GGG ACT CTG GTC ACT GTC  405
Met Thr Tyr Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val
            105                 110                 115
TCT GCA   411
Ser Ala
(2)SEQ ID NO：58的信息：
(i)序列特征：
(A)长度：411个碱基对
(B)类型：核酸
(C)链型：双链
(D)拓扑学：线性
(ii)分子类型：cDNA到mRNA
(xi)SEQ ID NO：58的序列描述：
ATG GGT TTT GGG CTG AGC TGG GTT TTC CTC GTT GCT CTT TAA AGA  45
Met Gly Phe Gly Leu Ser Trp Val Phe Leu Val Ala Leu Leu Arg
                 -15                 -10                 -5
GGT GTC CAG TGT CAG GTG CAG CTG GTG GAG TCT GGG GGA GGC GTG  90
Gly Val Gln Cys Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val
                  1               5                  10
GTC CAG CCT GGG AGG TCC CTG AGA CTC TCC TGT GCA GCC TCT GGA  135
Val Gln Pro Gly Arg Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly
             15                  20                  25
TTC ACC TTC AGT AGC TAT GGC ATG TCT TGG GTC CGC CAG GCT CCA  180
Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro
             30                  35                  40
GGC AAG GGG CTG GAG TGG GTG GCA ACC ATT AGT AGT GGT GGT AGT  225
Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala Thr Ile Ser ser Gly Gly Ser
             45                  50                  55
TAC ACC TAC TAT CCA GAC AGT GTG AAG GGG CGA TTC ACC ATC TCC  270
Tyr Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser
             60                  65                  70
AGA GAC AAT TCC AAG AAC ACG CTG TAT CTG CAA ATG AAC AGC CTG  315
Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu
             75                  80                  85
AGA GCT GAG GAC ACG GCT GTG TAT TAC TGT GCG AGA CAG ACT ACT  360
Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Gln Thr Thr
             90                  95                 100
ATG ACT TAC TTT GCT TAC TGG GGC CAG GGA ACC CTG GTC ACC GTC  405
Met Thr Tyr Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val
            105                 110                 115
TCC TCA                                                      411
Ser Ser
(2)SEQ ID NO：59的信息：
(i)序列特征：
(A)长度：11个氨基酸
(B)类型：氨基酸
(D)拓扑学：线性
(ii)分子类型：肽
(xi)SEQ ID NO：59的序列描述：
Lys Ala Ser Gln Asp Val Asn Thr Ala Val Ala
  1               5                  10
(2)SEQ ID NO：60的信息：
(i)序列特征：
(A)长度：7个氨基酸
(B)类型：氨基酸
(D)拓扑学：线性
(ii)分子类型：肽
(xi)SEQ ID NO：60的序列描述：
Ser Ala Ser Asu Arg Tyr Thr
  1               5
(2)SEQ ID NO：61的信息：
(i)序列特征：
(A)长度：9个氨基酸
(B)类型：氨基酸
(D)拓扑学：线性
(ii)分子类型：肽
(xi)SEQ ID NO：61的序列描述：
Gln Gln His Tyr Ser Thr Pro Phe Thr
  1               5
(2)SEQ ID NO：62的信息：
(i)序列特征：
(A)长度：5个氨基酸
(B)类型：氨基酸
(D)拓扑学：线性
(ii)分子类型：肽
(xi)SEQ ID NO：62的序列描述：
Pro Tyr Trp Met Gln
  1               5
(2)SEQ ID NO：63的信息：
(i)序列特征：
(A)长度：16个氨基酸
(B)类型：氨基酸
(D)拓扑学：线性
(ii)分子类型：肽
(xi)SEQ ID NO：63的序列描述：
Ser Ile Phe Gly Asp Gly Asp Thr Arg Tyr Ser Gln Lys Phe Lys Gly
  1                5                 10                  15
(2)SEQ ID NO：64的信息：
(i)序列特征：
(A)长度：11个氨基酸
(B)类型：氨基酸
(D)拓扑学：线性
(ii)分子类型：肽
(xi)SEQ ID NO：64的序列描述：
Gly Leu Arg Arg Gly Gly Tyr Tyr Phe Asp Tyr
  1               5                  10
(2)INFORMATION FOR SFO ID NO：65：
(2)SEQ ID NO：65的信息：
(i)序列特征：
(A)长度：411个碱基对
(B)类型：核酸
(C)链型：双链
(D)拓扑学：线性
(ii)分子类型：cDNA到mRNA
(xi)SEQ ID NO：65的序列描述：
ATG GCC TGG ACT CCT CTC TTC TTC TTC TT T GTT CTT CAT TGC TCA 45
Met Ala Trp Thr Pro Leu Phe Phe Phe Phe Val Leu His Cys Ser
                 -15                 -10                 -5
GGT TCT TTC TCC CAA CTT GTG CTC ACT CAG TCA TCT TCA GCC TCT   90
Gly Ser Phe Ser Gln Leu Val Leu Thr Gln Ser Ser Ser Ala Ser
                  1               5                  10
TTC TCC CTG GGA GCC TCA GCA AAA CTC ACG TGC ACC TTG AGT AGT   135
Phe Ser Leu Gly Ala Ser Ala Lys Leu Thr Cys Thr Leu Ser Ser
             15                  20                  25
CAG CAC AGT ACG TAC ACC ATT GAA TGG TAT CAG CAA CAG CCA CTC   180
Gln His Ser Thr Tyr Thr Ile Glu Trp Tyr Gln Gln Gln Pro Leu
             30                 35                   40
AAG CCT CCT AAG TAT GTG ATG GAT CTT AAG CAA GAT GGA AGC CAC   225
Lys Pro Pro Lys Tyr Val Met Asp Leu Lys Gln Asp Gly Ser His
             45                  50                  55
AGC ACA GGT GAT GGG ATT CCT GAT CGC TTC TCT GGA TCC AGC TCT   270
Ser Thr Gly Asp Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Ser Ser
             60                  65                  70
GGT GCT GAT CGC TAC CTT AGC ATT TCC AAC ATC CAG CCA GAA GAT   315
Gly Ala Asp Arg Tyr Leu Ser Ile Ser Asn Ile Gln Pro Glu Asp
             75                  80                  85
GAA GCA ATG TAC ATC TGT GGT GTG GGT GAT ACA ATT AAG GAA CAA   360
Glu Ala Met Tyr Ile Cys Gly Val Gly Asp Thr Ile Lys Glu Gln
             90                  95                 100
TTT GTG TAT GTT TTC GGC GGT GGG ACC AAG GTC ACT GTC CTA GGT   405
Phe Val Tyr Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Thr Val Leu Gly
            105                 110                 115
CAG CCC                                                       411
Gln Pro
(2)SEQ ID NO：66的信息：
(i)序列特征：
(A)长度：405个碱基对
(B)类型：核酸
(C)链型：双链
(D)拓扑学：线性
(ii)分子类型：cDNA到mRNA
(xi)SEQ IDNO：66的序列描述：
ATG GCC TGG ACT CCT CTC TTC TTC TTC TTT GTT CTT CAT TGC TCA  45
Met Ala Trp Thr Pro Leu Phe Phe Phe Phe Val Leu His Cys Ser
                -15                 -10                  -5
GGT TCT TTC TCC CAG CTT GTG CTG ACT CAA TCG CCC TCT GCC TCT  90
Gly Ser Phe Ser Gln Leu Val Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ala Ser
                  1               5                  10
GCC TCC CTG GGA GCC TCG GTC AAG CTC ACC TGC ACC TTG AGT AGT 135
Ala Ser Leu Gly Ala Ser Val Lys Leu Thr Cys Thr Leu Ser Ser
             15                  20                  25
CAG CAC AGT ACG TAC ACC ATT GAA TGG CAT CAG CAG GAG CCA GAG 180
Gln His Ser Thr Tyr Thr Ile Glu Trp His Gln Gln Gln Pro Glu
             30                  35                  40
AAG GGC CCT CGG TAC TTG ATG AAA CTT AAG CAA GAT GGA AGC CAC 225
Lys Gly Pro Arg Tyr Leu Met Lys Leu Lys Gln Asp Gly Ser His
             45                  50                  55
AGC ACA GGT GAT GGG ATT CCT GAT CGC TTC TCA GGC TCC AGC TCT 270
Ser Thr Gly Asp Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Ser Ser
             60                  65                  70
GGG GCT GAG CGC TAC CTC ACC ATC TCC AGC CTC CAG TCT GAG GAT 315
Gly Ala Glu Arg Tyr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ser Glu Asp
             75                  80                  85
GAG GCT GAC TAT TAC TGT GGT GTG GGT GAT ACA ATT AAG GAA CAA 360
Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gly Val Gly Asp Thr Ile Lys Glu Gln
             90                  95                 100
TTT GTG TAC GTG TTC GGC GGA GGG ACC AAA CTG ACC GTC CTA GGT 405
Phe Val Tyr Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly
            105                 110                 115
(2)SEQ ID NO：67的信息：
(i)序列特征：
(A)长度：411个碱基对
(B)类型：核酸
(C)链型：双链
(D)拓扑学：线性
(ii)分子类型：cDNA到mRNA
(xi)SEQ ID NO：67的序列描述：
ATG GCC TGG ACT CCT CTC TTC TTC TTC TTT GTT CTT CAT TGC TCA 45
Met Ala Trp Thr Pro Leu Phe Phe Phe Phe Val Leu His Cys Ser
                -15                 -10                  -5
GGT TCT TTC TCC CAG CTT GTG CTG ACT CAA TCG CCC TCT GCC TCT 90
Gly Ser Phe Ser Gln Leu Val Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ala Ser
                  1               5                  10
GCC TCC CTG GGA GCC TCG GTC AAG CTC ACC TGC ACC TTG AGT AGT 135
Ala Ser Leu Gly Ala Ser Val Lys Leu Thr Cys Thr Leu Ser Ser
             15                  20                  25
CAG CAC AGT ACG TAC ACC ATT GAA TGG TAT CAG CAG CAG CCA GAG  180
Gln His Ser Thr Tyr Thr Ile Glu Trp Tyr Gln Gln Gln Pro Glu
             30                  35                  40
AAG GGC CCT AAG TAC CTG ATG GAT CrT AAG CAA GAT GGA AGC CAC  225
Lys Gly Pro Lys Tyr Leu Met Asp Leu Lys Gln Asp Gly Ser His
             45                  50                  55
AGC ACA GGT GAT GGG ATT CCT GAT CGC TTC TCA GGC TCC AGC TCT  270
Ser Thr Gly Asp Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Ser Ser
             60                  65                  70
GGG GCT GAG CGC TAC CTC ACC ATC TCC AGC CTC CAG TCT GAG GAT  315
Gly Ala Glu Arg Tyr Leu Thr lle Ser Ser Leu Gln Ser Glu Asp
             75                  80                  85
GAG GCT GAC TAT TAC TGT GGT GTG GGT GAT ACA ATT AAG GAA CAA  360
Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gly Val Gly Asp Thr Ile Lys Glu Gln
             90                  95                 100
TTT GTG TAC GTG TTC GGC GGA GGG ACC AAA CTG ACC GTC CTA GGC  405
Phe Val Tyr Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly
            105                 110                 115
CAG CCC                                                      411
Gln Pro
(2)SEC ID NO：68的信息：
(i)序列特征：
(A)长度：411个碱基对
(B)类型：核酸
(C)链型：双链
(D)拓扑学：线性
(ii)分子类型：cDNA到mRNA
(xi) SEQ ID NO：68的序列描述：
ATG GCC TGG ACT CCT CTC TTC TTC TTC TTT GTT CTT CAT TGC TCA  45
Met Ala Trp Thr Pro Leu Phe Phe Phe phe Val Leu His Cys Ser
                -15                 -10                  -5
GGT TCT TTC TCC CAG CTT GTG CTG ACT CAA TCG CCC TCT GCC TCT  90
Gly Ser Phe Ser Gln Leu Val Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ala Ser
                  1               5                  10
GCC TCC CTG GGA GCC TCG GTC AAG CTC ACC TGC ACC TTG AGT AGT  135
Ala Ser Leu Gly Ala Ser Val Lys Leu Thr Cys Thr Leu Ser Ser
             15                  20                  25
CAG CAC AGT ACG TAC ACC ATT GAA TGG TAT CAG CAG CAG CCA GAG  180
Gln His Ser Thr Tyr Thr Ile Glu Trp Tyr Gln Gln Gln Pro Glu
             30                  35                  40
AAG GGC CCT AAG TAC GTG ATG GAT CTT AAG CAA GAT GGA AGC CAC  225
Lys Gly Pro Lys Tyr Val Met Asp Leu Lys Gln Asp Gly Ser His
             45                  50                  55
AGC ACA GGT GAT GGG ATT CCT GAT CGC TTC TCA GGC TCC AGC TCT  270
Ser Thr Gly Asp Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Ser Ser
             60                  65                  70
GGG GCT GAG CGC TAC CTC ACC ATC TCC AGC CTC CAG TCT GAG GAT  315
Gly Ala Glu Arg Tyr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ser Glu Asp
             75                  80                  85
GAG GCT GAC TAT TAC TGT GGT GTG GGT GAT ACA ATT AAG GAA CAA  360
Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gly Val Gly Asp Thr Ile Lys Glu Gln
             90                  95                 100
TTT GTG TAC GTG TTC GGC GGA GGG ACC AAA CTG ACC GTC CTA GGC  405
Phe Val Tyr Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly
            105                 110                115
CAG CCC                                                      411
Gln Pro
(2)SEQ IDNO：69的信息：
(i)序列特征：
(A)长度：411个碱基对
(B)类型：核酸
(C)链型：双链
(D)拓扑学：线性
(ii)分子类型：cDNA到mRNA
(xi)SEQ ID NO：69的序列描述：
ATG GCC TGG ACT CCT CTC TTC TTC TTC TTT GTT CTT CAT TGC TCA   45
Met Ala Trp Thr Pro Leu Phe Phe Phe Phe Val Leu His Cys Ser
                -15                  -10                  -5
GGT TCT TTC TCC CAG CTT GTG CTG ACT CAA TCG CCC TGT GCC TCT   90
Gly Ser Phe Ser Gln Leu Val Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ala Ser
                  1               5                  10
GCC TCC CTG GGA GCC TCG GTC AAG CTC ACC TGC ACC TTG AGT AGT  135
Ala Ser Leu Gly Ala Ser Val Lys Leu Thr Cys Thr Leu Ser Ser
              15                 20                  25
CAG CAC AGT ACG TAC ACC ATT GAA TGG TAT CAG CAG CAG CCA GAG  180
Gln His Ser Thr Tyr Thr Ile Glu Trp Tyr Gln Gln Gln Pro Glu
             30                  35                  40
AAG GGC CCT AGG TAC CTG ATG GAT CTT AAG CAA GAT GGA AGC CAC  225
Lys Gly Pro Arg Tyr Leu Met Asp Leu Lys Gln Asp Gly Ser His
             45                  50                  55
AGC ACA GGT GAT GGG ATT CCT GAT CGC TTC TCA GGC TCC AGC TCT  270
Ser Thr Gly Asp Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Ser Ser
             60                  65                  70
GGG GCT GAG CGC TAC CTC ACC ATC TCC AGC CTC CAG TCT GAG GAT  315
Gly Ala Glu Arg Tyr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ser Glu Asp
             75                  80                  85
GAG GCT GAC TAT TAC TGT GGT GTG GGT GAT ACA ATT AAG GAA CAA  360
Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gly Val Gly Asp Thr Ile Lys Glu Gln
             90                  95                 100
TTT GTG TAC GTG TTC GGC GGA GGG ACC AAA CTG ACC GTC CTA GGC  405
Phe Val Tyr Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly
            105                 110                 115
CAG CCC                                                      411
Gln Pro
(2)SEQ ID NO：70的信息：
(i)序列特征：
(A)长度：411个碱基对
(B)类型：核酸
(C)链型：双链
(D)拓扑学：线性
(ii)分子类型：cDNA到mRNA
(xi)SEQ ID NO：70的序列描述：
ATG GCC TGG ACT CCT CTC TTC TTC TTC TTT GTT CTT CAT TGC TCA  45
Met Ala Trp Thr Pro Leu Phe Phe Phe Phe Val Leu His Cys Ser
                -15                 -10                  -5
GGT TCT TTC TCC CAG CTT GTG CTG ACT CAA TCG CCC TCT CCC TCT  90
Gly Ser Phe Ser Gln Leu Val Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ala Ser
                  1               5                  10
GCC TCC CTG GGA GCC TCG GTC AAG CTC ACC TGC ACC TTG AGT AGT  135
Ala Ser Leu Gly Ala Ser Val Lys Leu Thr Cys Thr L eu Ser Ser
             15                  20                  25
GAG CAC AGT ACG TAC ACC ATT GAA TGG TAT CAG CAG CAG CCA CAG  180
Gln His Ser Thr Tyr Thr Ile Glu Trp Tyr Gln Gln Gln Pro Glu
            30                  35                  40
AAG GGC CCT AGG TAC GTG ATG GAT CTT AAG CAA GAT GGA AGC CAC  225
Lys Gly Pro Arg Tyr Val Met Asp Leu Lys Gln Asp Gly ser His
             45                  50                  55
AGC ACA GGT GAT GGG ATT CCT GAT CGC TTC TCA GGC TCC AGC TCT  270
Ser Thr Gly Asp Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Ser Ser
             60                  65                  70
GGG GCT GAG CGC TAC CTC ACC ATC TCC AGC CTC CAG TCT GAG GAT  315
Gly Ala Glu Arg Tyr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ser Glu Asp
             75                  80                  85
GAG GCT GAC TAT TAC TGT GGT GTG GGT GAT ACA ATT AAG GAA CAA  360
Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gly Val Gly Asp Thr Ile Lys Glu Gln
             90                  95                 100
TTT GTG TAC GTG TTC GGC GGA GGG ACC AAA CTG ACC GTC CTA GGC  405
Phe Val Tyr Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly
            105                 110                 115
CAG CCC                                                      411
Gln Pro
(2)SEQ IDNO：71的信息：
(i)序列特征：
(A)长度：411个碱基对
(B)类型：核酸
(C)链型：双链
(D)拓扑学：线性
(ii)分子类型：cDNA到mRNA
(xi)SEQ ID NO：71的序列描述：
ATG GCC TGG ACT CCT CTC TTC TTC TTC TTT GTT CTT CAT TGC TCA  45
Met Ala Trp Thr Pro Leu Phe Phe Phe Phe Val Leu His Cys Ser
                -15                 -10                  -5
GGT TCT TTC TCC CAG CTT GTG CTG ACT CAA TCG CCC TCT GCC TCT  90
Gly Ser Phe Ser Gln Leu Val Leu Thr Gln Ser Pro ser Ala Ser
                  1               5                  10
GCC TCC CTG CGA GCC TCG GTC AAG CTC ACC TGC ACC TTG AGT AGT  135
Ala Ser Leu Gly Ala ser Val Lys Leu Thr Cys Thr Leu ser Ser
             15                  20                  25
CAG CAC AGT ACG TAC ACC ATT GAA TGG TAT CAG CAG CAG CCA GAG  180
Gln His ser Thr Tyr Thr Ile Glu Trp Tyr Gln Gln Gln Pro Glu
             30                  35                  40
AAG GGC CCT AAG TAC CTG ATG GAT CTT AAG CAT GAT GGA AGC CAC  225
Lys Gly Pro Lys Tyr Leu Met Asp Leu Lys Gln Asp Gly Ser His
             45                  50                  55
AGC ACA GGT GAT GGG ATT CCT GAT CGC TTC TCA GGC TCC AGC TCT  270
Ser Thr Gly Asp Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Ser Ser
             60                  65                  70
GGG GCT GAG CGC TAC CTC ACC ATC TCC AGC CTC CAG TCT GAG GAT  315
Gly Ala Glu Arg Tyr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ser Glu Asp
             75                  80                  85
GAG GCT GAC TAT ATC TGT GGT GTG GGT GAT ACA ATT AAG GAA CAA  360
Glu Ala Asp Tyr Ile Cys Gly Val Gly Asp Thr Ile Lys Glu Gln
             90                  95                 100
TTT GTG TAC GTG TTC GGC GGA GGG ACC AAA CTG ACC GTC CTA GGC  405
Phe Val Tyr Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly
            105                 110                 115
CAG CCC                                                      411
Gln Pro
(2)SEQ ID NO：72的信息：
(i)序列特征：
(A)长度：411个碱基对
(B)类型：核酸
(C)链型：双链
(D)拓扑学：线性
(ii)分子类型：cDNA到mRNA
(xi)SEQ ID NO：72的序列描述：
ATG GCC TGG ACT CCT CTC TTC TTC TTC TTT GTT CTT CAT TGC TCA  45
Met Ala Trp Thr Pro Leu Phe Phe Phe Phe Val Leu His Cys Ser
                -15                 -10                  -5
GGT TCT TTC TCC CAG CTT GTG CTG ACT CAA TCG CCC TCT GCC TCT  90
Gly Ser Phe Ser Gln Leu Val Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ala Ser
                  1               5                  10
GCC TCC CTG GGA GCC TCG GTC AAG CTC ACC TGC ACC TTG AGT AGT  135
Ala Ser Leu Gly Ala Ser Val Lys Leu Thr Cys Thr Leu Ser Ser
             15                  20                  25
CAG CAC AGT ACG TAC ACC ATT GAA TGG TAT CAG CAG CAG CCA GAG  180
Gln His Ser Thr Tyr Thr Ile Glu Trp Tyr Gln Gln Gln Pro Glu
             30                  35                  40
AAG GGC CCT AGG TAC CTG ATG GAT CTT AAG CAA GAT GGA AGC CAC 225
Lys Gly Pro Arg Tyr Leu Met Asp Leu Lys Gln Asp Gly Ser His
             45                  50                  55
AGC ACA GGT GAT GGG ATT CAT GAT CGC TTC TCA GGC TCC AGC TCT 270
Ser Thr Gly Asp Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Ser Ser
             60                 65                  70
GGG GCT GAG CGC TAC CTC ACC ATC TCC AGC CTC CAG TCT GAG GAT 315
Gly Ala Glu Arg Tyr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ser Glu Asp
             75                  80                  85
GAG GCT GAC TAT ATC TGT GGT GTG GGT GAT ACA ATT AAG GAA CAA 360
Glu Ala Asp Tyr Ile Cys Gly Val Gly Asp Thr Ile Lys Glu Gln
             90                  95                 100
TTT GTG TAC GTG TTC GGC GGA GGG ACC AAA CTG ACC GTC CTA GGC 405
Phe Val Tyr Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly
            105                 110                 115
CAG CCC                                                     411
Gln Pro
(2)SEQ ID NO：73的信息：
(i)序列特征：
(A)长度：411个碱基对
(B)类型：核酸
(C)链型：双链
(D)拓扑学：线性
(ii)分子类型：cDNA到mRNA
(xi)SEQ ID N0：73的序列描述：
ATG GCC TGG ACT CCT CTC TTC TTC TTC TTT GTT CTT CAT TGC TCA 45
Met Ala Trp Thr Pro Leu Phe Phe Phe Phe Val Leu His Cys Ser
                -15                 -10                  -5
GGT TCT TTC TCC CAG CTT GTG CTG ACT CAA TCG CCC TCT GCC TCT 90
Gly Ser Phe Ser Gln Leu Val Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ala Ser
                  1                   5                  10
GCC TCC CTG GGA GCC TCG GTC AAG CTC ACC TGC ACC TTG AGT AGT 135
Ala Ser Leu Gly Ala Ser Val Lys Leu Thr Cys Thr Leu Ser Ser
             15                  20                      25
CAG CAC ACT ACG TAC ACC ATT GAA TGG TAT CAG CAG CAG CCA GAG 180
Gln His Ser Thr Tyr Thr Ile Glu Trp Tyr Gln Gln Gln Pro Glu
             30                  35                  40
AAG GGC CCT AAG TAC GTG ATG GAT CTT AAG CAA GAT GGA AGC CAC 225
Lys Gly PTo Lys Tyr Val Met Asp Leu Lys Gln Asp Gly Ser His
             45                  50                  55
AGC ACA GGT GAT GGG ATT CCT GAT CCC TTC TCA GGC TCC AGC TCT  270
Ser Thr Gly Asp Gly lle Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Ser Ser
             60                  65                  70
GGG GCT GAG CGC TAC CTC ACC ATC TCC AGC CTC CAG TCT GAG GAT  315
Gly Ala Glu Arg Tyr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ser Glu Asp
             75                  80                  85
GAG GCT GAG TAT ATC TGT GGT GTG GGT GAT ACA ATT AAG GAA GAA  360
Glu Ala Asp Tyr Ile Cys Gly Val Gly Asp Thr Ile Lys Glu Gln
             90                  95                 100
TTT GTG TAC GTG TTC GGC GGA GGG ACC AAA CTG ACC GTC CTA GGC 405
Phe Val Tyr Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly
            105                 110                 115
CAG CCC                                                     411
Gln Pro
(2)SEQ ID NO：74的信息：
(i)序列特征：
(A)长度：411个碱基对
(B)类型：核酸
(C)链型：双链
(D)拓扑学：线性
(ii)分子类型：cDNA到mRNA
(xi)SEQ ID NO：74的序列描述：
ATG GCC TGG ACT CCT CTC TTC TTC TTC TTT GTT CTT CAT TGC TCA  45
Met Ala Trp Thr Pro Leu Phe Phe Phe Phe Val Leu His Cys Ser
                -15                 -10                 -5
GGT TCT TTC TCC CAG CTT GTG CTG ACT CAA TCC CCC TCT GCC TCT  90
Gly Ser Phe Ser Gln Leu Val Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ala Ser
                  1               5                  10
GCC TCC CTG GGA GCC TCG GTC AAG CTC ACC TGC ACC TTG AGT AGT  135
Ala Ser Leu Gly Ala Ser Val Lys Leu Thr Cys Thr Leu Ser Ser
             15                  20                  25
CAG CAC AGT ACG TAC ACC ATT GAA TGG TAT CAG CAG CAG CCA GAG  180
Gln His Ser Thr Tyr Thr Ile Glu Trp Tyr Gln Gln Gln Pro Glu
             30                  35                  40
AAG GGC CCT AGG TAC GTG ATG GAT CTT AAG CAA GAT GGA AGC CAC  225
Lys Gly Pro Arg Tyr Val Met Asp Leu Lys Gln Asp Gly Ser His
             45                  50                  55
AGC ACA GGT GAT GGG ATT CCT GAT CGC TTC TCA GGC TCC AGC TCT 270
Ser Thr Gly Asp Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Ser Ser
             60                  65                  70
GGG GCT GAG CGC TAC CTC ACC ATC TCC AGC CTC CAG TCT GAG GAT 315
Gly Ala Glu Arg Tyr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ser Glu Asp
             75                  80                  85
GAG GCT GAC TAT ATC TGT GGT GTG GGT GAT ACA ATT AAG GAA CAA 360
Glu Ala Asp Tyr Ile Cys Gly Val Gly Asp Thr Ile Lys Glu Gln
             90                  95                 100
TTT GTG TAC GTG TTC GGC GGA GGG ACC AAA CTG ACC GTC CTA GGC 405
Phe Val Tyr Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly
            105                 110                 115
CAG CCC                                                     411
Gln Pro
(2)SEQ ID NO：75的信息：
(i)序列特征：
(A)长度：34个碱基对
(b)类型：核酸
(C)链型：双链
(D)拓扑学：线性
(ii)分子类型：肽
(Xi)SEQ ID NO：75的序列描述：
Ala Val Ser Glu His Gln Leu Leu His Asp Lys Gly Lys Ser Ile
  1               5                  10                  15
Gln Asp Leu Arg Arg Arg Phe Phe Leu His His Leu Ile Ala Glu
             20                       25                 30
Ile His Thr Ala

Claims (5)

1.抗甲状旁腺素相关肽(PTHrP)的人源化抗体作为活性成分在制备由癌症诱导的恶病质的治疗剂中的应用，其中所述的人源化抗体包含：
具有SEQ ID NOs：52-55之一所示氨基酸序列的L链V区；和
具有SEQ ID NO：56所示氨基酸序列的H链V区。
2.权利要求1的应用，其中所述的人源化抗体还包含人抗体L链C区和/或H链C区。
3.权利要求1的应用，其中所述的人源化抗体是包含以下结构的片段或其修饰片段，所述片段能抑制PTHrP的活性：
具有SEQ ID NOs：52-55之一所示氨基酸序列的L链V区；和
具有SEQ ID NO：56所示氨基酸序列的H链V区。
4.权利要求1-3任一项的应用，其中所述的人源化抗体是人源化的#23-57-137-1抗体。
5.权利要求1-3任一项的应用，其中所述的人源化抗体是单克隆型抗体。
CNB988050951A 1997-05-15 1998-05-13 恶病质的治疗剂 Expired - Fee Related CN1329080C (zh)

Applications Claiming Priority (6)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP125505/1997 1997-05-15
JP12550597 1997-05-15
JP125505/97 1997-05-15
JP194445/1997 1997-07-18
JP19444597 1997-07-18
JP194445/97 1997-07-18

Related Child Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN 200510129774 Division CN1824308A (zh) 1997-05-15 1998-05-13 恶病质的治疗剂

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN1255858A CN1255858A (zh) 2000-06-07
CN1329080C true CN1329080C (zh) 2007-08-01

Family

ID=26461935

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CNB988050951A Expired - Fee Related CN1329080C (zh) 1997-05-15 1998-05-13 恶病质的治疗剂

Country Status (19)

Country Link
US (2) US20020165363A1 (zh)
EP (1) EP1004313B1 (zh)
KR (1) KR100508338B1 (zh)
CN (1) CN1329080C (zh)
AT (1) ATE361099T1 (zh)
AU (1) AU750021C (zh)
BR (1) BR9809629A (zh)
CA (1) CA2289910A1 (zh)
DE (1) DE69837707T2 (zh)
ES (1) ES2285769T3 (zh)
HK (1) HK1029047A1 (zh)
IL (1) IL132896A0 (zh)
NO (1) NO995558L (zh)
PL (1) PL193575B1 (zh)
SK (1) SK155799A3 (zh)
TR (1) TR199902800T2 (zh)
TW (1) TWI227140B (zh)
UA (1) UA74130C2 (zh)
WO (1) WO1998051329A1 (zh)

Families Citing this family (44)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
SK40599A3 (en) 1996-09-26 2000-06-12 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Antibody against human parathormone related peptides
US20020137890A1 (en) * 1997-03-31 2002-09-26 Genentech, Inc. Secreted and transmembrane polypeptides and nucleic acids encoding the same
CA2289910A1 (en) 1997-05-15 1998-11-19 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Therapeutic agent for cachexia
WO2001002011A1 (fr) * 1999-07-02 2001-01-11 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha REMEDES CONTRE LES MALADIES CAUSEES PAR PTH OU PTHrP
TWI255718B (en) 1999-07-02 2006-06-01 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Ameliorative agent for low vasopressin concentration
EP1987842A1 (en) * 2000-04-28 2008-11-05 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Cell proliferation inhibitor
US20040067231A1 (en) * 2000-08-16 2004-04-08 Hideki Yoshikawa Agents for ameliorating symtoms caused by joint diseases
JP2003021631A (ja) * 2001-05-10 2003-01-24 Chugai Pharmaceut Co Ltd 骨転移抑制剤のスクリーニング方法
DOP2006000277A (es) 2005-12-12 2007-08-31 Bayer Pharmaceuticals Corp Anticuerpos anti mn y métodos para su utilización
ES2610607T3 (es) 2007-05-21 2017-04-28 Alderbio Holdings Llc Anticuerpos contra IL-6 y usos de los mismos
US8252286B2 (en) 2007-05-21 2012-08-28 Alderbio Holdings Llc Antagonists of IL-6 to prevent or treat thrombosis
US9701747B2 (en) 2007-05-21 2017-07-11 Alderbio Holdings Llc Method of improving patient survivability and quality of life by anti-IL-6 antibody administration
US8178101B2 (en) 2007-05-21 2012-05-15 Alderbio Holdings Inc. Use of anti-IL-6 antibodies having specific binding properties to treat cachexia
US8404235B2 (en) 2007-05-21 2013-03-26 Alderbio Holdings Llc Antagonists of IL-6 to raise albumin and/or lower CRP
US8062864B2 (en) 2007-05-21 2011-11-22 Alderbio Holdings Llc Nucleic acids encoding antibodies to IL-6, and recombinant production of anti-IL-6 antibodies
US20090238825A1 (en) * 2007-05-21 2009-09-24 Kovacevich Brian R Novel rabbit antibody humanization methods and humanized rabbit antibodies
US7906117B2 (en) * 2007-05-21 2011-03-15 Alderbio Holdings Llc Antagonists of IL-6 to prevent or treat cachexia, weakness, fatigue, and/or fever
WO2009120836A1 (en) * 2008-03-26 2009-10-01 Neurosigma, Inc. Methods for identifying and targeting autonomic brain regions
US8992920B2 (en) 2008-11-25 2015-03-31 Alderbio Holdings Llc Anti-IL-6 antibodies for the treatment of arthritis
US8323649B2 (en) * 2008-11-25 2012-12-04 Alderbio Holdings Llc Antibodies to IL-6 and use thereof
US8420089B2 (en) 2008-11-25 2013-04-16 Alderbio Holdings Llc Antagonists of IL-6 to raise albumin and/or lower CRP
US9212223B2 (en) 2008-11-25 2015-12-15 Alderbio Holdings Llc Antagonists of IL-6 to prevent or treat thrombosis
US9452227B2 (en) 2008-11-25 2016-09-27 Alderbio Holdings Llc Methods of treating or diagnosing conditions associated with elevated IL-6 using anti-IL-6 antibodies or fragments
US8337847B2 (en) 2008-11-25 2012-12-25 Alderbio Holdings Llc Methods of treating anemia using anti-IL-6 antibodies
US9724410B2 (en) 2009-11-24 2017-08-08 Alderbio Holdings Llc Anti-IL-6 antibodies or fragments thereof to treat or inhibit cachexia, associated with chemotherapy toxicity
US9775921B2 (en) 2009-11-24 2017-10-03 Alderbio Holdings Llc Subcutaneously administrable composition containing anti-IL-6 antibody
CA2789125A1 (en) 2010-02-10 2011-08-18 Novartis Ag Methods and compounds for muscle growth
AU2011332817A1 (en) 2010-11-23 2013-06-13 Alder Biopharmaceuticals, Inc. Anti-IL-6 antibodies for the treatment of anemia
CN103327977B (zh) 2011-01-31 2016-05-04 东丽株式会社 恶液质的治疗或预防剂
JP6262721B2 (ja) 2012-05-11 2018-01-17 ジェムバックス アンド カエル カンパニー，リミティド 敗血症の予防用または治療用の組成物
CN108841802B (zh) 2012-05-11 2023-06-09 珍白斯凯尔有限公司 抗炎性肽及包含其的组合物
WO2014010971A1 (ko) 2012-07-11 2014-01-16 주식회사 카엘젬백스 세포 투과성 펩티드, 그를 포함한 컨쥬게이트 및 그를 포함한 조성물
KR102258864B1 (ko) 2013-04-19 2021-06-01 주식회사 젬백스앤카엘 허혈성 손상 치료 및 예방용 조성물
WO2014196841A1 (en) 2013-06-07 2014-12-11 Kael-Gemvax Co., Ltd. Biological markers useful in cancer immunotherapy
CN105324123B (zh) 2013-06-21 2022-02-08 珍白斯凯尔有限公司 激素分泌调节剂、包含该调节剂的组合物、和利用其控制激素分泌的方法
JP6382972B2 (ja) 2013-10-23 2018-08-29 ジェムバックス アンド カエル カンパニー，リミティド 前立腺肥大治療用及びその予防用の組成物
JP6553605B2 (ja) 2013-11-22 2019-07-31 ジェムバックス アンド カエル カンパニー，リミティド 血管新生抑制活性を有するペプチド、及びそれを含む組成物
ES2809251T3 (es) 2013-12-17 2021-03-03 Gemvax & Kael Co Ltd Composición para tratar cáncer de próstata
EP3130345B9 (en) 2014-04-11 2022-05-04 Gemvax & Kael Co., Ltd. Peptide having fibrosis inhibitory activity and composition containing same
KR102232320B1 (ko) 2014-04-30 2021-03-26 주식회사 젬백스앤카엘 장기, 조직 또는 세포 이식용 조성물, 키트 및 이식 방법
KR102413243B1 (ko) 2014-12-23 2022-06-27 주식회사 젬백스앤카엘 안질환 치료 펩티드 및 이를 포함하는 안질환 치료용 조성물
US10835582B2 (en) 2015-02-27 2020-11-17 Gemvax & Kael Co. Ltd. Peptide for preventing hearing loss, and composition comprising same
EP3318265B1 (en) 2015-07-02 2021-08-18 Gemvax & Kael Co., Ltd. Peptide having anti-viral effect and composition containing same
CN109328068A (zh) 2016-04-07 2019-02-12 珍白斯凯尔有限公司 具有增加端粒酶活性和延长端粒的效果的肽以及包含该肽的组合物

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH04228089A (ja) * 1990-05-15 1992-08-18 Kanegafuchi Chem Ind Co Ltd 高カルシウム血症治療・予防剤
WO1996022790A1 (en) * 1995-01-23 1996-08-01 Xenotech Incorporated Composition to ameliorate osteolysis and metastasis

Family Cites Families (34)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0293130A3 (en) * 1987-05-26 1990-06-13 Merck & Co. Inc. Dimers of parathyroid hormone antagonists
US4771124A (en) * 1987-05-26 1988-09-13 Merck & Co., Inc. Parathyroid hormone antagonists with simplified synthetic methodology
EP0293158A3 (en) 1987-05-26 1990-05-09 Merck & Co. Inc. Parathyroid hormone antagonists
US5001223A (en) 1987-05-26 1991-03-19 Merck & Co., Inc. Parathyroid hormone antagonists with enhanced metabolic properties
JPH03504605A (ja) 1988-05-27 1991-10-09 セントカー・インコーポレーテツド 抗体産生物の凍結乾燥した配合物
EP0417191B1 (en) 1988-05-27 1993-03-10 Centocor, Inc. Formulation for antibody reagents
IL162181A (en) 1988-12-28 2006-04-10 Pdl Biopharma Inc A method of producing humanized immunoglubulin, and polynucleotides encoding the same
US5217896A (en) * 1988-12-30 1993-06-08 Oncogene Science, Inc. Monoclonal antibodies recognizing parathyroid hormone-like protein
JPH02207099A (ja) 1989-02-07 1990-08-16 Tonen Corp ＰＴＨｒＰ関連ペプチド、その製造法及び用途
CA2035179C (en) 1990-01-31 2001-08-14 Gerald S. Brenner Pharmaceutical compositions containing insoluble salts of bisphosphonic acids
GB9009548D0 (en) 1990-04-27 1990-06-20 Celltech Ltd Chimeric antibody and method
CA2087190A1 (en) 1990-07-13 1992-01-14 Fred E. Cohen Parathyroid hormone analogues modified at positions
WO1992017602A1 (en) 1991-04-05 1992-10-15 The General Hospital Corporation Office Of Technology Affairs Parathyroid hormone receptor and dna encoding same
DK0628639T3 (da) 1991-04-25 2000-01-24 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Rekonstitueret humant antistof mod human interleukin-6-receptor
DE69232669T2 (de) 1991-12-20 2003-02-27 Protein Design Labs, Inc. Mit gp11b/iiia reaktive humane antikörper
US5648267A (en) 1992-11-13 1997-07-15 Idec Pharmaceuticals Corporation Impaired dominant selectable marker sequence and intronic insertion strategies for enhancement of expression of gene product and expression vector systems comprising same
US5849695A (en) 1993-01-13 1998-12-15 The Regents Of The University Of California Parathyroid hormone analogues useful for treatment of osteoporosis and disorders of calcium meatabolism in mammals
JP3504697B2 (ja) 1993-09-30 2004-03-08 株式会社先端生命科学研究所 ＰＴＨｒＰアンタゴニスト活性を有するポリペプチド及びそれを含むカルシウム代謝治療薬
JPH07316195A (ja) 1994-05-25 1995-12-05 Nippon Kayaku Co Ltd 新規なＰＴＨｒＰ関連ペプチド及びその用途
CO4410206A1 (es) * 1994-07-28 1997-01-09 Sandoz Ag DERIVADOS DE PTH o PTHrP, SU PREPARACION Y COMPOSICIONES FARMACEUTICAS QUE LAS COMPRENDEN
US5993817A (en) 1995-01-23 1999-11-30 Xenotech Method to ameliorate osteolysis and metastasis
US5626845A (en) * 1995-01-23 1997-05-06 Xenotech Incorporated Method to ameliorate osteolysis and metastasis
ATE363289T1 (de) 1995-02-20 2007-06-15 Yukio Kato Heilmittel für arthrosis deformans und entzündliche gelenkerkrankungen
AU713222B2 (en) 1995-03-01 1999-11-25 Stryker Corporation Morphogen-induced dentine regeneration
CA2761116A1 (en) 1995-04-27 1996-10-31 Amgen Fremont Inc. Human antibodies derived from immunized xenomice
US5660826A (en) 1995-06-06 1997-08-26 The Regents Of The University Of California Therapeutic sepsis treatment using antagonists to PTHrP
DE69713485T2 (de) 1996-02-01 2003-01-30 Chugai Seiyaku K.K., Tokio/Tokyo Medikamente für die Behandlung oder Vorbeugung von Thrombocytopenie
SK40599A3 (en) 1996-09-26 2000-06-12 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Antibody against human parathormone related peptides
JP4372240B2 (ja) 1997-05-15 2009-11-25 中外製薬株式会社 悪液質治療剤
CA2289910A1 (en) 1997-05-15 1998-11-19 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Therapeutic agent for cachexia
JP4414494B2 (ja) 1998-02-03 2010-02-10 旭化成ファーマ株式会社 白血球減少症の予防剤および治療剤
EP1075491B1 (en) 1998-05-05 2008-04-16 Societe De Conseils De Recherches Et D'applications Scientifiques S.A.S. Pth2 receptor selective compounds
JP2000080100A (ja) 1998-06-17 2000-03-21 Japan Tobacco Inc 副甲状腺ホルモン関連タンパクに対するヒトモノクローナル抗体
EP1090643A4 (en) 1998-06-26 2004-05-26 Chugai Pharmaceutical Co Ltd REMEDIES FOR HYPERCALCEMIA CRISIS

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH04228089A (ja) * 1990-05-15 1992-08-18 Kanegafuchi Chem Ind Co Ltd 高カルシウム血症治療・予防剤
WO1996022790A1 (en) * 1995-01-23 1996-08-01 Xenotech Incorporated Composition to ameliorate osteolysis and metastasis

Also Published As

Publication number Publication date
WO1998051329A1 (fr) 1998-11-19
TR199902800T2 (xx) 2000-04-21
ES2285769T3 (es) 2007-11-16
EP1004313A1 (en) 2000-05-31
EP1004313A4 (en) 2005-01-19
ATE361099T1 (de) 2007-05-15
US7468184B2 (en) 2008-12-23
UA74130C2 (uk) 2005-11-15
PL193575B1 (pl) 2007-02-28
SK155799A3 (en) 2000-06-12
DE69837707D1 (de) 2007-06-14
PL336797A1 (en) 2000-07-17
AU750021C (en) 2003-10-16
CN1255858A (zh) 2000-06-07
BR9809629A (pt) 2000-07-04
EP1004313B1 (en) 2007-05-02
AU7236998A (en) 1998-12-08
US20020165363A1 (en) 2002-11-07
KR100508338B1 (ko) 2005-08-17
TWI227140B (en) 2005-02-01
NO995558D0 (no) 1999-11-12
AU750021B2 (en) 2002-07-11
NO995558L (no) 2000-01-12
US20030138424A1 (en) 2003-07-24
IL132896A0 (en) 2001-03-19
CA2289910A1 (en) 1998-11-19
DE69837707T2 (de) 2008-01-10
KR20010012613A (ko) 2001-02-15
HK1029047A1 (en) 2001-03-23

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN1329080C (zh) 恶病质的治疗剂
US20030124119A1 (en) Stable antibody compositions and injection preparations
AU744146B2 (en) Antibody against human parathormone related peptides
AU753131B2 (en) Remedies for hypercalcemic crisis
JPH1180025A (ja) 悪液質治療剤
US20040067231A1 (en) Agents for ameliorating symtoms caused by joint diseases
EP1197225A1 (en) REMEDIES FOR DISEASES CAUSED BY PTH OR PTHrP
US7655227B1 (en) Agents for ameliorating low vasopressin level
CN1817906B (zh) 抗人副甲状腺激素相关蛋白的抗体
AU2003203622B2 (en) Cachexia remedy
US20030049211A1 (en) Remedies and preventives for dental diseases
CZ398499A3 (cs) Léčivo proti kachexii
MXPA99010364A (en) Cachexia remedy
EP1195164A1 (en) Remedies for drug-resistant hypercalcemia
AU3824702A (en) Antibody against human parathormone related peptides
JP2006306895A (ja) 悪液質治療剤

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
REG Reference to a national code

Ref country code: HK

Ref legal event code: GR

Ref document number: 1069797

Country of ref document: HK

C14 Grant of patent or utility model
GR01 Patent grant
C19 Lapse of patent right due to non-payment of the annual fee
CF01 Termination of patent right due to non-payment of annual fee