JPH03504605A - 抗体産生物の凍結乾燥した配合物 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 新しいタンパク質薬物の分野に存在する主要な挑戦は、タンパク質溶解性および 生物学的活性の両者を維持する、タンパク質の溶液産生物の配合においてである 。精製したモノクローナル抗体は、例えば、物理学的または化学的ストレスに暴 露されるとき、あるいは経時的に溶液から沈澱する傾向があることはよ（知られ ている。多数のタンパク質調製物は溶液で不安定であり、そして不安定性は溶液 中の不溶性粒子の形成において発現される。これらの粒子の形成は、しばしば、 物理学的ストレス、例えば、長期間の貯蔵および輸送により、および化学的スト レス、例えば、希釈または添加剤との混合により増加する。このような粒子は産 生物の外観または米国薬局方規格書により許容されえず、そして静脈内注射に意 図するモノクローナル抗体の適当な液体配合物の開発において非常な困難を引き 起こす。 水溶液からのタンパク質の沈澱は、よ（知られている現象である。とくに、免疫 グロブリンは溶液中で粒子を発生する傾向がある特性を有するので、免疫グロブ リン溶液は一般に濾過した後静脈内注射に使用しなくてはならない。免疫グロブ リンの沈澱を増加する条件は、長期間の貯蔵、自動化装置を使用するバイアルの 充填および輸送を包含する。 タンパク賀調製物を安定化する種々の方法が使用されてきており、これらは溶液 中の濃度の増加または追加のタンパク質、例えば、ヒト血清アルブミンの添加を 包含する。しかしながら、このような調製物は治療の目的に許容されえない。 種々の炭水化物は、ある種の生物学的に活性な調製物を安定化しおよび／または その安定性を増強ことが知られている。ランドブラッド（Ｌｕｎｄｂｌａｄ）ら への米国特許第４，１８６．１９２号は、マルトースを使用して、筋肉内または 静脈内の投与のための免疫血清グロブリン調製物の安定性を増加することを開示 している。Ｔ、アラカワ（Ａｒａｋａｖａ）およびＳ、　Ｎ、チマシェフ（Ｔｉ ｍａｓｈｅｆｆ）は、旦１ｏｃｈｅｍｉｓｔｒ　　、２１：６５３６−６５４４ （１９８２）において、ラクトースおよびグルコースによるタンパク質構造の安 定化を記載している。ガッゼイ（Ｇａｚｚｅｉ）ら、欧州特許出願第２２１．５ ０５号において免疫グロブリンの配合物へのサッカロースの添加を記載している 。 マルトースは、溶液中のタンパク質の安定性を増強しそして等強性を溶液に付与 するために、タンパク質溶液に添加されてきている。マルトースは、純粋な形態 における利用可能性および水溶液中の抗生物質を包含する、多数の利点を有する 。マルトースを含有する調製物は、溶液を褐色化しないでオートクレーブ処理す ることができる。マルトースは少量で事実上生理学的に不活性である。非経口的 に投与するとき、それは酵素マルターゼにより徐々にグルコースに転化される： しかしながら、グルコースへの転化は徐々であり、そして血清グルコースの測定 のときに、しばしば検出することができない。したがって、循環するインスリン レベルの増加は検出できない。米国特許第４．４４９，０７３号において、テノ ルド（Ｔｅｎｏｌｄ）は調製物に生理学的に許容されつる等強性を付与するため に、免疫血清グロブリンの調製物中にマルトースをに１０％重量／容量のマルト ースを特定している。ランドブラッド（Ｌｕｎｄｂｌａｄ）らは、米国特許第４ ．１８６．１９２号において、免疫血清グロブリンの溶液の安定性がマルトース を５〜１８重量％の濃度で添加することによって増加することを報告している。 フエルナデス（Ｆｅｒｎａｎｄｅｓ）らは、Ｖｏｘ　　Ｓａｎｇｓ　３旦：１０ １−１１２　（１ｅ゛８０）において、沈澱を最小にしかつ゛生体外貯蔵′安定 性を改良するために、マルトースで安定化された静脈内ガンマグロブリンの調製 物を記載している。 この問題を回避するために使用された１つのアプローチは、凍結乾燥された薬物 形態の開発である。凍結乾燥は生物学的材料の凍結乾燥である。一般に、材料を まず凍結し、次いで高い真空中に配置し、こうして水（氷の形態で）は真空中に 昇華し、そして非水成分は損傷されない状態で残る。生ずる産生物はケーク様物 質であり、これは次いで劣化せずに長期間貯蔵することができる。粉末は使用の ときに水、生理的塩類溶液または他の希釈剤の添加により、液体生成物に再構成 される。次いで、再構成した溶液はすぐに患者に投与される状態にある。 発明の要約 本発明は、非経口的投与に意図する、モノクローナル抗体、緩衝剤およびマルト ースを含有する、凍結乾燥した組成物に関する。さらに、本発明は、凍結乾燥し た生成物を調製する方法に関する。本発明の凍結乾燥した組成物は、モノクロー ナル抗体の生物学的活性を保存し、そして凍結乾燥生成物の再構成のときのモノ クローナル抗体の沈澱または凝集により引き起こされる粒子の形成を最小にする 。再構成された溶液は粒与することができる。 図面の簡単な説明 第１図は、９５日間ある範囲のストレス温度に暴露した、ＩｇＧの凍結乾燥試料 および液状試料を比較する、ゲル濾過ＨＰＬＣの結果を示す。 東２図は、９５日間ある範囲のストレス温度に暴露した、ＩｇＧの凍結乾燥した 試料および１０％のマルトースの液体試料の両者を比較する、免疫反応性のアッ セイの結果を示す。 第３図は、５２日間ある範囲のストレス温度に暴露した、ＩｇＧの凍結乾燥２％ のマルトースの試料のＨＰＬＣゲル濾過の結果を示す。 第４図は、５２日間ある範囲のストレス温度に暴露した、ＩｇＧの凍結乾燥した ２％のマルトースの試料についての免疫反応性のアッセイの結果を示す。 発明の詳細な説明 配合物は、低いｐＨの緩衝剤、炭水化物成分および抗体または抗体断片を含有す る、凍結乾燥された組成物からなる。液体組成物を調製し、次いで凍結乾燥して ケーク様生成物を形成する。凍結乾燥した生成物は長期間、高温において、生物 学的活性を損失しないで、貯蔵することができ、そして水、生理的塩類溶液また は他の希釈剤の添加により、容易に粒子不含溶液に再構成される。　　　　　　 　　、・凍結乾燥は、生物学的活性を保存するために製剤学的生成物の調製にお いてしばしば使用される凍結乾燥法である。この方法は、一般に、前以て凍結し た試料を真空中で乾燥して氷を除去し、非水成分を無傷で、粉末またはケーク連 鎖物質の形態で残すことを包含する。次いで、乾燥した生成物を使用のとき水、 生理的塩類溶液、緩衝剤または他の適当な液体のにより再構成して、抗体の溶液 を生成する。凍結乾燥の利点は、抗体の生物学的活性が保存され、そして変化す る温度、剪断力および輸送への暴露により引き起こされる溶液のストレスが回避 されることである。凍結乾燥生成物は容易に再構成されかつ粒子を含まないので 、前以て濾過しないで静脈内に投与することができる。　□本発明の１つの実施 態様は、緩衝剤、マルトースおよびネズミモノクローナル抗体または抗体断片、 例えば、免疫グロブリンＧ（Ｉｇｄ）を含有する溶液を凍結乾燥してケーク様生 成物に形成したものである。 免疫グロブリンＧのすべてのサブクラス、例えば、免疫グロブリンＧｌ、Ｇｌ、 ＧｇｍおよびＧ３を使用することができる。抗体または抗体断片を誘導化して、 それが放射性金属、例えば、テクネチウム−９９ｍまたはインジウム−１１１と 結合するようにすることができる。抗体は、その活性部位を変化させて、放射性 金属がタンパク質に直接結合することができるようにするか、あるいはキレート 剤９例えば、ジエチレントリアミンペンタ酢酸（ＤＴＰＡ）を使用することによ って、誘導化することができる。誘導化された抗体は、抗体タンパク質へ放射性 重金属（例えば、インジウム−１１１またはテクネチウム−９９ｍ）を結合して 、タンパク質−放射性金属複合体を形成するか、あるいは、キレート剤の場合に おいて、タンパク質−キレート−放射性金属複合体を形成する誘導化された抗体 の能力のために、放射性製剤とじて使用することができる。次いで、放射線標識 した抗体は、イムノシンチグラフィー、例′えば、腫瘍または病気の状態の生体 内の診断の像形成において使用できる。放射線源、例えば、Ｔｃ’−９９ｍで標 識したＩｇＧを被検体に投与することができる。標識した抗体は抗１＝、ｇＧに より定められた部位に局在化し、次いでその部位をガンマ線カメラで走査し、そ して像を得ることができる。 本発明の好ましい実施態様は、低いｐＨ（３〜６）を有する緩衝剤、マルトース およびＩｇＧを含有する配合物である。好ましい緩衝剤は、酢酸ナトリウム、リ ン酸塩およびクエン酸塩の緩衝剤を包含する。より好ましい実施態様は、約５〜 １００ミリモルの酢酸ナトリウム、ｐＨ３〜６．２〜１０％のマルトースおよび １〜２５ｍｇ／ｍｌのＩｇＧを含有する配合物である。 液体配合物は、適当な乾燥パラメーターを使用して凍結乾燥することができる。 次の乾燥パラメーターは好ましい：温度が約−４０℃〜−４２℃であり、そして 圧力が約５０ミリトル〜８０ミリトルである、−次乾燥相、および温度が周囲温 度であり、そして圧力が約５０ミリトル〜８０ミリトルである、二次乾燥相。 マルトースは、抗体溶液の安定化に使用し、例えば、メルク・インデックス（Ｍ ｅｒｃｋ　　Ｉｎｄｅｘ）、第１０版、メルク・アンド・カンパニー・インコー ホレーテッド（Ｍｅｒｃｋ　　ａｎｄ　　Ｃｏ、、Ｉｎｃ、）、ニュージャーシ イ州ロウウェイ（１９８３）に詳細に記載されている。 マルトースは、一般式ＣＩ！Ｈ２！０１１を有する三糖類（４−０−Ｄ−グルコ ピラノシル−Ｄ−グルコピラノシル）であり、免疫グロブリン溶液の安定化に有 用であることが確立されている。［参照、テノルド（Ｔｅｎ０１ｄ）への米国特 許第４．４９９．０７３号およびランドブラッド（Ｌｕｎｄｂｌａｄ）らへの米 国特許第４．１８６．１９２号］。マルトースは、静脈内に投与したときヒトに より代謝されず、そしてマルトースとして分泌され、見掛けの血液グルコースレ ベルの上昇またはインスリンの解放は存在しない。 凍結乾燥した生成物は使用のとき希釈剤（例えば、無菌の水または生理的塩類溶 液）中で再構成され、そして粒子不含溶液を生ずる。再構成された抗体溶液は、 凍結乾燥されたケークを３７℃において長期間貯蔵した後でさえ、粒子不含であ る。次いで、再構成された溶液は非経口的に、好ましくは静脈内に被検体に投与 される。 次の実施例によって、本発明をさらに説明する。 ０．１モルの水酸化ナトリウム中で充填された３、３１のセファデックス（Ｓｅ ｐｈａｄｅｘ）Ｇ−２５媒質カラム［ファーマシア（Ｐｈａｒｍａｃ　ｉａ）］ を、タンパク質適用前に、１０ミリモルの酢酸ナトリウム（ｐＨ４，５）および １０％Ｗ／Ｖのマルトースの溶液と平衡化した。５００ｍ１のＩｇＧ［セントコ ル・インコーホレーテッド（Ｃｅｎｔｏｃｏｒ、Ｉｎｃ、）、ペンシルベニア州 マルベルン］を１１．５４ｍｇ／ｍｌ（合計５．６９３ｇ）の濃度で、カラムに ５５０ｍ１／時間の流速で適用した。タンパク質のピークを集め、モしてＹＭ３ ０−膜［アミコン（Ａｍｉｃｏｎ）］をもつ撹拌したセルを経て１０ｍｇ／ｍｌ に濃縮した。 全体のロフトを半分に分割し、そして１つの部分を液体状態に維持し、そして他 方を凍結乾燥に使用した。各部分は２５バイアルから成り、これらは凍結乾燥プ ロセスが完結したとき、温度のストレスの試験に付しＩｇＧ配合物の凍結乾燥 ２０ｍ１のバイアル［ウェスト・カンパニー（Ｗｅｓｔ　　Ｃｏ、）］に１１０ ｍの配合物を充填し、そしてフリーザードライヤー（ＦＴＳ）内に入れた。凍結 乾燥は無菌条件下でなかったので、１００μｍの１０％のアジ化ナトリウムを静 菌剤として凍結乾燥した試料に添加した。 プラシーボのバイアルは、同一の緩衝剤およびマルトースを充填したが、抗体を 欠如し、また、凍結乾燥器に入れた。配合物の超冷却の程度は一６℃であり、そ して均一なマトリックスを形成した。生成物は最初ん一４５℃に凍結した。この 温度に凍結後、棚の表面温度を一４０℃〜−４２℃に調節し、圧力を５０ミリト ル（ｍＴｏ、ｒｒ）に減少して一次乾燥相を開始した。 一次乾燥相がいったん完結すると、棚の表面温度を＋２０℃に上げて、二次乾燥 相を開始した。室内の気体の組成は、窒素が室の種として水蒸気で置換されるま で、残留気体の質量スペクトルを経て監視した。二次乾燥相は約８時間を要した 。 この点に到達した後、室を乾燥窒素で逆充填し、そしてバイアルに栓をした。 この手順は２５バイアルの凍結乾燥生成物を、１０ｍ１／バイアル、１０．０ｍ ｇ／ｍｌで生じた。 温度のストレスの研究 液体の配合物および凍結乾燥した配合物お両者からの代表的なバイアルを、４． ２２．３７および５０℃の温度に暴露した。 このような条件下に９５日後、各温度における各配合物からの１つのバイアルを 分析のために取り出した。凍結乾燥生成物を１０ｍ１の水で再構成した。再構成 の時間を下表１に示す。 表１ 再構成時間（凍結乾燥生成物） 試料　　　　　　　　　　　　　再構成時間（分）ｔｏ試料　　　　　　　　　 　　　　　　１９５日の試料 ４℃　　　　　　　　　　　　　　　　　２２２℃　　　　　　　　　　　　　 　　　２３７℃　　　　　　　　　　　　　　　　２．５５０℃　　　　　　　 　　　　　　　　　２次いで、各バイアルを粒子について視的に検査した。バイ アルはそれを黒いパックグラウンドの前に直接保持し、そしてバイアルを下から 照らすことによって検査した。再構成した凍結乾燥生成物と液体試料との視的比 較は、凍結乾燥生成物の優越性を実証した。液体試料のすべては多少の程度の粒 子を含有したが、再構成した試料は透明であり、そして粒子を含有しなかった。 液体試料は、また、温度が高くなるにつれて、黄色化が増加した。視的検査の結 果を表２に示す。 表２ Ｔ℃　　　配合物　　　　　　　観察 ４　　　　液体　　　　　　　　　小さいフレーク２２　　　液体　　　　　　 　　小さいフおよび微細な沈澱３７　　　液体　　　　　　　　微細な沈澱、わ ずかに黄色の液体５０　　　液体　　　　　　　　中程度の沈澱、黄色液体４　 　　　凍結乾燥　　　　　　透明 ２２　　　凍結乾燥　　　　　　透明 ３７　　　凍結乾燥　　　　　　透明 ５０　　　凍結乾燥　　　　　　透明 液体含有粒子の分析 次いで、バイアルを液体含有（１１ｑｕｉｄｂｏｒｎｅ）粒子分析装置［クライ メット（Ｃ１ｉｍｅ　ｔ）　］で分析した。試料は５〜５０ミクロンの大きさの 領域の粒子について分析した。可視より小さい液体含有粒子の分析は、液体試料 を越えた再構成した凍結乾燥試料の多少の優越性を示した。結果を表３に示す。 可視より小さい粒子の分析 （粒子／ｍｌ） 示差　　　　　　　　　　　　合計 π配合物　　　５ｕ　　１０ｕ　　２０ｕ　　２５ｕ　　３０ｕ　　５０ｕ　　 ５ｕ　　１０ｕ　　２０ｕ　　２５ｕ　　３０ｕ　　５０ｕ４　液体　　　１８ ８　９２　１８　１２　５０　１７２　５３２　３４４　２４２　２３４　２２ ２　１？２２２液体　　　１８２　５０　　６　　２　　６　　０　２４６　６ ４　１４　　８　　６　　０３７液体　　　２８２　１０２　１２　　４　１０ 　　２　４２１　１３０　２８　１６　１２　　２５０液体　　　２０４　９２ 　１４　　６　１０　　４　３３０　１２６　３４　２０　１４　　４４　凍結 乾燥　２３０　６４　　４　　２　　０　　０　３００　７０　　６　　２　　 ０　　０２２凍結乾燥　２３６　４２　　４　　２　　２　　０　２５６　５０ 　　８　　４　　２　　０１７凍結乾燥　１９４　２８　　４　　２　　２　　 ０　２３０　３６　　８　　４　　２　　０５０凍結乾燥　５５０　８２　１４ 　１０　　８　　０　６６４　１１４　３２　１８　　８　　０試料をＨＰＬＣ ゲル濾過クロマトグラフィーにかけた。ＨＰＬＣユニット［デュポン・ゾルバル クス（ＤｕＰｏｎｔ　　Ｚｏｒｂａｒｘ）ＧＦ　−２５０ＨＰＬＣ）を、０．２ モルのリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６゜８）と１ｍｌ／分の流速で平衡化した 。吸収波長を２１４ｎｍにセットした。結果は、液体試料および再構成試料の両 者が４℃および２２℃のストレス条件下に比較的安定であることを示した。３７ ℃および５０℃において、液体試料は二量体の濃度の増加を示し、３７℃におい て１０゜４８％の二量体および５０℃において９０．０５％の二量体を発生した 。 再構成した試料は、３７℃および５０℃において二量体のレベルの増加を示さな かった。結果を第１図に示す。 免疫反応性のアッセイ 試料中のＩｇＧの相対的免疫反応性を決定するために、試料についてアッセイを 実施した。活性の分析は、抗体の活性が液体試料および凍結乾燥試料の両者にお いて維持されることを示した。結果を第２図に示す。 抗体の免疫反応性の決定に使用した手順は次の通りである：「抗原」と表示した ポリビニルクロライド（ＰＶＣ）板において、５０μｌの希釈した抗原を９６ウ ヱルの各に分配した。板を蓋をしないで３７℃において配置して、４時間空気乾 燥した。すべての溶液がウェルから蒸発した後、各ウェルを１００μｌのリン酸 塩緩衝液（ＰＢＳ）で２回洗浄した。各ウェルに、２００μｌのＰＢＳ中の５％ のウシ血清アルブミン（Ｂ　Ｓ　Ａ）を分配し、そして室温において２時間イン キュベーションした。 「抗体」と表示した別のＰＶＣ板において、７５μｍのＰＢＳ中の１０％のＢＳ Ａを列２〜１２のウェル中に分配した。１００μｍの再構成した試料および４０ ０μｇ／ｍＩに予備希釈した標準抗体溶液を列１のウェルに分配した。ピペット 装置で、２５μｍを列１から取り出し、列２に分配し、そして混合した。この分 配を列３〜１１のウェルについて反復した。列１２は１００％の結合の列であっ た。 「抗原」と表示するＰＶＣ板を２００μｌのＰＢＳで２回洗浄した。 新しいピペットの先端を各回に使用して、５０μｍの予備希釈した抗体を「抗体 」と表示するＰＶＣ板から「抗原」板上の対応するウェルに移した。５０μｌの 予備希釈した抗体を含有する「抗原」板上の各ウェルに、５０μｍのＰＢＳ中の １％のＢＳＡ中の２０ナノグラムの１２６１標識抗体を添加した。板にカバーを し、そして４℃において２０時間インキュベーションした。４℃において２０時 間後、過剰の放射線標識を板からＰＢＳを使用する３回の洗浄で除去し、モして ガンマカウンターで計数した。 データを二重反復試験の計数を平均することによって分析した。計数７分（ｃｐ ｍ）対低温抗体のマイナス対数をプロットした。各抗体の希釈系列の列１２から 、１００％の結合を表す、見いだされたｃｐｍの数を計算した。この数を２で割 って、５０％の最大結合値を得た。各抗体希釈系列についての５０％最大結合値 を、５０％の最大点を表す各抗体滴定についての曲線の点と比較した。タンパク 質濃度をこの点から決定した。 ＳＤＳ　：　ＰＡＧＥクロマトグラフィ一種々の温度においてストレス後、試料 をＳＤＳ　：　ＰＡＧＥクロマトグラフィーにかけて、ＩｇＧの分子の一体性を 決定した。非還元試料を、マイクロフージ（ｍｉｃｒｏｆｕｇｅ）管中で調製し た。タンパク質試料、ＰＢＳ、およびＳＤＳおよびクーマツジ−ストック（ｃｏ ｏｍａｓＳｉｅ　　５ｔｏｃｋ）を混合して、２ｍｇ／ｍｌのタンパク質濃度を 得た。５０μｍのタンパク質溶液を５μｌのβ−メルカプトエタノールの添加に より還元した。管中の試料を沸騰水に２分間暴露した。１μｍのアプリケーター のコンブ（ｃｏｍｂ）を使用して、各調製試料をゲル［ファーマシア・ファスト ・ゲル（Ｐｈａｓｔ　　Ｇｅ１）ＳＤＳ　　Ｐａｇｅ　　、。 Ｇｅｔｓ（８−２５％）］に適用した。ゲルを製造業者の指示に従い展開した。 ＳＤＳ　：　ＰＡＧＥクロマトグラフィーは、ストレス温度を通じて凍結乾燥材 料の分子の一体性を実証した。液体配合物は４℃および２２℃においてその構造 を維持したが、３７℃および５０℃にねいて断片化が増試料をネイティブ（Ｎａ 　ｔ　１ｖｅ）ＰＡＧＥクロマトグラフィーを使用して試験した。試料をＰＢＳ 　（リン酸塩緩衝液）で希釈し、そしてネイティブＰＡＧＥゲル（ファーマシア ・ファスト・ゲル・ネイティブ・ＰＡＧＥゲル　７．５％および１２．５％の均 質性）に適用した。ゲルを、製造業者の指示に従い、展開し、染色し、そして保 存した。ネイティブＰＡＧＥの結果は、再構成した凍結乾燥試料および液体試料 の両者について、異なる温度に暴露したタンパク質において多少の変更を示した 。 液体試料中のタンパク質は、より高い温度においてより多く負に帯電するように なる。陰性の増加は２２℃および３７℃において貯蔵した液体試料で観測するこ とができ、タンパク質は５０℃においてゲルに入らず、広範なタンパク質の変性 を示した。再構成した凍結乾燥試料は温度範囲を通じてゲル中で観測可能であり 、そして凍結乾燥した５０℃の試料は液体の３７℃の試料より陰性が低かった。 この現象は７．５％および１２．５％の均質性の両者のゲルにおいて一致し、１ ２．５％のゲルはよりよく定められたバンドとして現れた。 等電点電気泳動 等電点電気泳動を実施して、液体試料および凍結乾燥試料の間のタンパク質の等 電点（ｐｌ）の変化を決定した。試料をＰＢＳで希釈し、そして等電点電気泳動 ゲル（ファーマシア・ファスト・ガル　ｐＨ３−９等電点電気泳動ゲル）に適用 した。ゲルを、製造業者の指示に従い、展開し、固定し、染色し、そして脱色し た。結果は、凍結乾燥生成物についていずれのストレス温度においてもタンパク 質のｐｌの変更を示さなかった。液体試料は４℃および２２℃において変更を示 さなかったが、より低いｐＨ範囲に向かって３７℃において化なりの動き、およ び５０℃において変性を示した。 残留湿分の分析 残留湿分の分析は、ブラシーボの凍結乾燥試料について実施して、タンパク質を 含まない溶液に寄与する残留湿分を決定する。ブラシーボのバイアルは１０ミリ モルの酢酸ナトリウム（ｐＨ４，５）および１０％のマルトースを含有した。プ ラシーボのバイアルを抗体を含有するバイアルと一緒に同一条件下に凍結乾燥し た。残留湿分の分析のために、プラシーボのバイアルの内容物を取り出して、前 以て乾燥不活性ガスでパージしたグローブの袋内の乾燥した前以て風袋を秤量し た秤量ボート（ＶＷＲサイエンティフィック）に入れた。試料を秤量してブラシ ーポの初期の重量を得た。次いで、ブラシーポ物質を有する秤量ボートを真空炉 （ＶＷＲサイエンティフィック）に６０℃において入れ、そして真空炉内の圧力 を２４時間減少した。次いで、秤量ボートを炉から取り出して乾燥窒素ガスでパ ージしたグローブ袋の中に入れ、そして室温に平衡化した。次いで、試料を再秤 量した。この順序は、試料が一定重量となる（それ以上の重量の減少が存在しな くなるまで）、反復した。最終の一定重量を元の重量で割って残留湿分を計算し た。結果を表４に示す。 残留湿分の分析（凍結乾燥した） １　　　１．５７３８７　　　２．４１０１５　　　０．８３６２８　　０．８ １６９８　　　Ｇ、０１９３０　　２．３１２　　　１．５４６９５　　　２． ４２７０４　　　０．８８００９　　０．８６０３４　　０．０１９７５　　２ ．２４３　　　１．５ｇ５５２　　　２．４４３６２　　　０．８５８１０　　 ０．８３Ｂ６７　　０．０１９４３　　２．２６平均値＝２．２７％ 免疫グロブリンＧの溶液を、実施例１に記載する手順に従い調製し、そして試験 したが、配合物中のマルトースの量を１０％から２％に減少した。この配合物は １０ミリモルの酢酸ナトリウム（ＤＨ４，５）　、２％Ｗ／Ｖのマルトースおよ びＩｇＧから成うていた。 凍結乾燥 ２９ｍ１のバイアルを調製し、１０ｍ１の減少したマルトースの配合物を充填し 、そしてフリーザードライヤーに入れた。ブラシーボのノくイアルは、緩衝剤お よびマルトースの同一溶液を充填したが、抗体を欠如し、また、フリーザードラ イヤーに入れた。凍結乾燥は実施例１に記載するようにして実施した。 凍結乾燥生成物およびプラシーポのバイアルの１度のストレスの訟験は、ストレ ス試料を４．２２および４０℃において５２日間貯蔵することによって実施した 。再構成した時間を表５に示す。 表５ 再構成時間（凍結乾燥生成物） ５２日の試料 ４℃　　　　　　　０．６７ ２２℃　　　　　　　０．７５ ４０℃　　　　　　　０．８３ 次いで、粒子についてバイアルの視的検査を実施した。視的検査は、再構成した 凍結乾燥試料中に粒子を示さなかった。結果を表６に示す。 表６ 視的検査 Ｔ℃　　　　配合物　　　観察 ４　　　凍結乾燥　　　透明 ２２　　　凍結乾燥　　　透明 ４０　　　凍結乾燥　　　透明 液体含有粒子の分析 液体含有粒子の分析は、すべての試料が１０および２５ミクロンの粒子について の米国薬局方規格内にあることを示した。結果を表７に示す。 ７℃５ｕ　　１０ｕ　　２０ｕ　　２５ｕ　　３０ｕ　　５０ｕ　　５ｕ　　１ ０ｕ　　２０ｕ　　２５ｕ　　３０ｕ　　５０ｕ４　　　３１ｇ５４　　２　　 ２　　０　　０３７６５ｇ　　　４　　２　　０　　０４０　　　６７６１０８ 　　４　　２　　２　　　Ｇ７９４１１８　１０　　６　　４　　０ＨＰＬＣゲ ル濾過クロマトグラフイー ゲル濾過は、４℃および２２℃でストレスを加えた再構成試料が出発物質と同一 であることを示した。しかしながら、４０℃において、多少の二量体の形成が明 らかであった（２．１２％）。結果を第３図に示す。 免疫反応性のアッセイ 免疫反応性のアッセイの結果は、すべての試料がこのアッセイについての規格内 の性能をもち、そして標準に匹敵する活性を有することを示した。結果を第４図 に示す。 ＳＤＳ　：　ＰＡＧＥクロマトグラフィーすべての試料についての５Ｏ８−ＰＡ ＧＥゲルは、非還元および還元したゲルに２μｇ／ｍｌで適用したとき、同一で あるように見えた。試料を１μｇ／ｍｌで適用したとき、多少の凝集した物質が ４０℃の試料についてのみ観察された。 ネイティブＰＡＧＥクロマトグラフィーネイティブ：　ＰＡＧＥゲル（７，５％ および１２．５％の両者の均質性）は、４０℃のストレスを与えた試料において 表面変化を示した。 等電点電気泳動 凍結乾燥した試料の等電点電気泳動は、いずれの温度条件においてもバンドのパ ターンの変化を示さなかった。 残留湿分 ３つのプラシーボのバイアルについて実施した残留湿分の分析は、１゜２４％の 平均の残留湿分値を示した。結果を表８に示す。 表８ 残留湿分の分析 １　　　１．５８８３９　　　１．７７７５３　　　０．１８９１４　　０．１ ｇ５５５　　０．００３５９　　１．９０２　　　１．５４９５９　　　１．７ ４６４５　　　０．１９６８６　　０．１９４７１　　　Ｇ、００２１５　　１ ．０９３　　　１．５５４７６　　　１．７１３１８　　　０．１５４８２　　 ０．１５７２６　　０．００１１６　　０．７３平均値＝１．２４％ 同等の実施態様 当業者は、日常の実験をこえない実験を使用して、ここに記載した特定の物質お よび手順と同等のものを認識するか、あるいは確認することができるであろう。 このような同等の実施態様は本発明の範囲内に入ると考えられ、そして次の請求 の範囲により包含される。 ゾルシｒｌ＃Ｌ ｊ良イ岑　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　壕ａれ淳歳体　　　　　 　　　　　　Ｉ蝋虐 ＦＩＧ、　　１ ＦＩＧ、　ｌ　（最々） ３に４哩の７・１セイ ＦＩＧ、　　２ 医直」ユＪ」Ｌ−（５２日　） ＦＩＧ、　　３ 活す王句’Ｔｙ　ｔＬイ 桿１−　　　　　４＠ｃｚ２ｃ　　　　　　４ｅｃＦ工Ｇ、　　４ 補正書の写しく翻訳文）提出書　（特許法第１８４条の８）平成２年１１月２７ 日 １、特許出願の表示 ＰＣＴ／ＵＳ　８９１０２２５２ ３、特許出願人 名　称　セントカー・インコーホレーテッド４、代理人　〒１０７ 電話　５８５−２２５６ ５、補正書の提出年月日 １９９０年５月２９日 ６、添付書類の目録 免疫グロブリンの沈澱を増加する条件は、長期間の貯蔵、自動化装置を使用する バイアルの充填および輸送を包含する。 タンパク質調製物を安定化する種々の方法が使用されてきており、これらは溶液 中の濃度の増加または追加のタンパク質、例えば、ヒト血清アルブミンの添加を 包含する。しかしながら、このような調製物は治療の目的に許容されえない。 種々の炭水化物は、ある種の生物学的に活性な調製物を安定化しおよび／または その安定性を増強ことか知られている。参照、ＥＰＯ１２４０１８、ランドブラ ッド（Ｌｕｎｄｂｌａｄ）ら（１９８４）およびＣＨ６４５，５３７、ウニムラ ら（１９８１）。例えば、ランドブラッド（Ｌｕｎｄｂｌａｄ）らへの米国特許 第４，１８６，１９２号は、マルトースを使用して、筋肉内または静脈内の投与 のための免疫血清グロブリン調製物の安定性を増加することを開示している。Ｔ 、アラカワ（Ａｒａｋａｗａ）およびＳ、　Ｎ、チマシェフ（Ｔｉｍａｓｈｅｆ 　ｆ）は、Ｂ　ｉｏｃｈｅｍｉ　ｓ　ｔ　ｒｙ、　２１　：　６５３６−６５４ ４　（１９８２）において、ラクトースおよびグルコースによるタンパク質構造 の安定化を記載している。ガッゼイ（Ｇａｚｚｅｉ）ら、欧州特許出願第２２１ ゜５０５号において免疫グロブリンの配合物へのサッカロースの添加を記載して いる。 マルトースは、溶液中のタンパク質の安定性を増強しそして等強性を溶液に付与 するために、タンパク質溶液に添加されてきている。マルトースは、純粋な形態 における利用可能性および水溶液中の抗生物質を包含する、多数の利点を有する 。マルトースを含有する調製物は、溶液を褐色化しないでオートクレーブ処理す ることができる。マルトースは少とができるようにするか、あるいはキレート剤 １例えば、ジエチレントリアミンペンタ酢酸（ＤＴＰＡ）を使用することによっ て、誘導化することができる。誘導化された抗体は、抗体タンパク質へ放射性重 金属（例えば、インジウム−１１１またはテクネチウム−９９ｍ）を結合して、 タンパク質−放射性金属複合体を形成するか、あるいは、キレート剤の場合にお いて、タンパク質−キレート−放射性金属複合体を形成する誘導化された抗体の 能力のために、放射性製剤として使用することができる。次いで、放射線標識し た抗体は、イムノシンチグラフィー、例えば、腫瘍または病気の状態の生体内の 診断の像形成において使用できる。放射線源、例えば、Ｔｃ−９９ｍで標識した ＩｇＧを被検体に投与することができる。標識した抗体は抗１ｇＧにより定めら れた部位に局在化し、次いでその部位をガンマ線カメラで走査し、そして像を得 ることができる。 本発明の好ましい実施態様は、低いｐＨ（３〜６）を有する緩衝剤、マルトース およびＩｇＧを含有する配合物である。好ましい緩衝剤は、酢酸ナトリウム、リ ン酸塩およびクエン酸塩の緩衝剤を包含する。より好ましい実施態様は、５〜１ ００ミリモルの酢酸ナトリウム、ｐＨ３〜６．２〜１０％のマルトースおよび１ 〜２５ｍｇ／ｍｌのＩｇＧを含有する配合物である。 液体配合物は、適当な乾燥パラメーターを使用して凍結乾燥することができる。 次の乾燥パラメーターは好ましい：温度が一４０℃〜−４２℃であり、そして圧 力が０．０５ミリメートルの水銀（ｍｍＨｇ）〜領０８ｍｍＨｇ（５０ミリトル 〜８０ミリトル）である、−次乾燥相、および温度が周囲温度であり、そして圧 力が０．Ｏ５ｍｍＨｇ〜０．０８ｍｍＨｇ（５０ミリトル〜８０ミリトル）であ る、二次乾燥相。 マルトースは、抗体溶液の安定化に使用し、例えば、メルク・インデックス（Ｍ ｅｒｃｋ　　Ｉｎｄｅｘ）、第１０版、メルク・アント・カンハニー・インコー ホレーテッド（Ｍｅｒｃｋ　　ａｎｄ　　Ｃｏ、、Ｉｎｃ、）、ニュージャーシ イ州ロウウェイ（１９８３）に詳細に記載されている。 マルトースは、一般式ＣＢＨＨＯＩ＋を有する三糖類（４−０−Ｄ−グルコピラ ノシル−Ｄ−グルコピラノシル）であり、免疫グロブリン溶液の安定化に有用で あることが確立されている。［参照１、テノルド（Ｔｅｎｏｌｄ）への米国特許 第４．４９９．０７３号およびランドブラッド（Ｌｕｎｄｂｌａｄ）らへの米国 特許第４．１８６，１９２号］。マルトースは、静脈内に投与したときヒトによ り代謝されず、そしてマルトースとして分泌され、見掛けの血液グルコースレベ ルの上昇またはインスリンの解放は存在しない。 凍結乾燥した生成物は使用のとき希釈剤（例えば、無菌の水または生理的塩類溶 液）中で再構成され、そして粒子不含溶液を生ずる。再構成された抗体溶液は、 凍結乾燥されたケークを３７℃において長期間貯蔵した後でさえ、粒子不含であ る。次いで、再構成された溶液は非経口的に、好ましくは静脈内に被検体に投与 される。 次の実施例によって、本発明をさらに説明する。 が、抗体を欠如し、また、凍結乾燥器に入れた。配合物の超冷却の程度は一６℃ であり、そして均一なマトリックスを形成した。生成物は最初ん一４５℃に凍結 した。この温度に凍結後、棚の表面温度を一４０℃〜−４２℃に調節し、圧力を ０．Ｏ５ｍｍＨｇ　（５０ミリトル）に減少して一次乾燥相を開始した。 一次乾燥相がいったん完結すると、棚の表面温度を＋２０℃に上げて、二次乾燥 相を開始した。室内の気体の組成は、窒素が室の種として水蒸気で置換されるま で、残留気体の質量スペクトルを経て監視した。二次乾燥相は約８時間を要した 。 この点に到達した後、室を乾燥窒素で逆充填し、そしてバイアルに栓をした。 この手順は２５バイアルの凍結乾燥生成物を、１０ｍ１／バイアル、１０．０ｍ ｇ／ｍ＋で生じた。 温度のストレスの研究 液体の配合物および凍結乾燥した配合物お両者からの代表的なバイアルを、４． ２２．３７および５０℃の温度に暴露した。 このような条件下に９５日後、各温度における各配合物からの１つのバイアルを 分析のために取り出した。凍結乾燥生成物を１０ｍ１の水で再構成した。再構成 の時間を下表１に示す。 残留湿分の分析 １　　　１．５８８３９　　１．７７７５３　　　０．１８９１４　０．１８５ ５５　０．００３５９　１．９０２　　　１．５４９５９　　１．７４６４５　 　　０．１９６８６　０．１９４７１　０．００２１５　１．０９３　　　１． ５５４７６　　１．７１３１８　　　０．１５４８２　０．１５７２６　０．０ ０１１６　０．７３平均値＝１．２４％ 請求の範囲 ９、成分： （ａ）ｐＨ３〜６の酢酸ナトリウム、 （ｂ）マルトース、および （Ｃ）モノクローナル免疫グロブリンＧまたはその断片、の凍結乾燥した配合物 からなる、免疫グロブリンＧの非経口的投与のためのモノクローナル抗体組成物 。 １０、酢酸ナトリウムの量は約５〜約１０ミリモルである、上記第９項記載の組 成物。 １１、モノクローナル免疫グロブリンＧの量は約１〜約２５ｍｇ／ｍＩである、 上記第９項記載の組成物。 １２、モノクローナル免疫グロブリンＧは免疫グロブリンＧ！ｍからなる、上記 第９項記載の組成物。 １３、モノクローナル免疫グロブリンＧの抗体または断片は放射線標識されてい る、上記第９項記載の組成物。 １４、マルトースの量は約２〜１０重量％である、上記第９項記載の組成物。 １５、改良は前記組成物を凍結乾燥して凍結乾燥されたケークを形成することか らなり、前記ケークは再構成して免疫グロブリンＧの注射可能な溶液を生成する ことができる、酢酸ナトリウム、マルトースおよび免疫グロブリンＧを含有する 、上記第９項記載のモノクローナル免疫グロブリンＧ組成物。 １６、再構成して注射可能な溶液を生成することができる凍結乾燥されたケーク を形成するために適当な条件下に、モノクローナル免疫グロプリンＧ、酢酸ナト リウムおよびマルトースを含有する免疫グロブリンＧの配合物を凍結乾燥するこ とからなる、上記第９項記載のモノクローナル免疫グロブリンＧ組成物を調製す る方法。 １８、組成物は、 （ａ）　約５〜１０ミリモルのｐＨ約３〜６の酢酸ナトリ、ウム、（ｂ）約２〜 １０重量％の？／ｌｚドース・および（Ｃ）約１〜２５ｍｇ／ｍｌのモノクロー ナル免疫グロブリンＧ１からなる、上記第１７項記載の方法。 １９、凍結乾燥条件は、温度が約−４０℃〜−４２℃であり、そして圧力が０． ０５〜０．Ｏ８ｍｍＨｇ　　ミリトルである、−次乾燥相、および温度が周囲温 度であり、そして圧力が０．０５ミリトル〜０．Ｏ８ｍｍＨｇである、二次乾燥 相からなる、上記第１６項記載の方法。 ２０、前記ケークは再構成してモノクローナル免疫グロブリンＧの溶液を生成す ることができ、前記溶液は約１５０粒子／ｍｌより少ない１０ミクロンまたはそ れより大きい粒子および約１５粒子／ｍｌより小さい２０ミクロンまたはそれよ り大きい粒子の粒子計数を有する、モノクローナル免疫グロブリンＧの安定な組 成物からなる、上記第１６項記載の凍結乾燥されたケーク。 ２１、ケークは水または生理的塩類溶液で再槙成令れる、上記第２０項記載の凍 結乾燥されたケーク。 国際調査報告 ＵＳ　８９０２２５２ ＳＡ　　２９２３９

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、緩衝剤、モノクローナル抗体または抗体断片、およびマルトースの凍結乾燥 した配合物からなるモノクローナル抗体組成物。 ２、モノクローナル抗体は免疫グロブリンＧである、上記第１項記載の組成物。 ３、免疫グロブリンＧは量は約１〜約２６ｍｇ／ｍｌである、上記第２項記載の 組成物。 ４、抗体断片は免疫グロブリンＧから誘導化される、上記第１項記載の組成物。 ５、抗体または抗体断片は放射線標識されている、上記第１項記載の組成物。 ６、マルトースの量は約２〜約１０重量％である、上記第１項記載の組成物。 ７、緩衝剤は、酢酸ナトリウム、リン酸塩およびクエン酸塩の緩衝剤から成る群 より選択される、上記第１項記載の組成物。 ８、緩衝剤はｐＨ約３．０〜６．０を有する酢酸ナトリウムである、上記第７項 記載の組成物。 ９、成分： （ａ）酢酸ナトリウム、 （ｂ）マルトース、 （ｃ）免疫グロブリンＧまたはその断片、の凍結乾燥した配合物からなる、非経 口的投与のための免疫グロブリンＧ組成物。 １０、酢酸ナトリウムの量は約５〜約１０ミリモルであり、そしてｐＨ約３〜６ である、上記第９項記載の組成物。 １１、免疫グロブリンＧの量は約１〜約２５ｍｇ／ｍｌである、上記第９項記載 の組成物。 １２、免疫グロブリンＧは免疫グロブリンＧ２ａからなる、上記第９項記載の組 成物。 １３、免疫グロブリンＧ断片は放射線標識されている、上記第９項記載の組成物 １４、マルトースの量は約２〜１０重量％である、上記第９項記載の組成物。 １５、酢酸ナトリウム、マルトースおよび免疫グロブリンＧを含有する改良され た免疫グロブリンＧ組成物であって、改良は前記組成物を凍結乾燥して凍結乾燥 されたケークを形成することからなり、前記ケークは再構成して免疫グロブリン Ｇの注射可能な溶液を生成することができる、改良された免疫グロブリンＧ組成 物。 １６、再構成して注射可能な溶液を生成することができる凍結乾燥されたケーク を形成するために適当な条件下に、配合物を凍結乾燥することからなる、モノク ローナル抗体の配合物を調製する方法。 １７、配合物は酢酸ナトリウム、マルトースおよび免疫グロブリンＧからなる、 上記第１６項記載の方法。 １８、配合物は： （ａ）約５〜１０ミリモルのｐＨ約３〜６の酢酸ナトリウム、（ｂ）約２〜１０ 重量％のマルトース、および（ｃ）約１〜２５ｍｇ／ｍｌの免疫グロブリンＧ、 からなる、上記第１７項記載の方法。 １９、凍結乾燥条件は、温度が均一４０℃〜−４２℃であり、そして圧力が約５ ０ミリトル〜８０ミリトルである、一次乾燥相、および温度が周囲温度であり、 そして圧力が約５０ミリトル〜８０ミリトルである、二次乾燥相からなる、上記 第１６項記載の方法。 ２０、免疫グロブリンＧの安定な組成物からなる凍結乾燥されたケークであって 、前記ケークは再構成して免疫グロブリンＧの溶液を生成することができ、前記 溶液は約１５０粒子／ｍｌより少ない１０ミクロンまたはそれより大きい粒子お よび約１５粒子／ｍｌより小さい２０ミクロンまたはそれより大きい粒子の粒子 計数を有する、凍結乾燥されたケーク。 ２１、ケークは水または生理的塩類溶液で再構成される、上記第２０項記載の凍 結乾燥されたケーク。