KR20230009446A - Il-2 융합 폴리펩티드 조성물 및 그의 제조 및 사용 방법 - Google Patents

Abstract

본원은 IL-2Rα 사슬의 세포외 부분에 융합된 원형으로 순열된 인터루킨-2(IL-2)를 포함하는 폴리펩티드를 포함하는 조성물, 및 그러한 조성물의 제조 및 사용 방법을 제공한다.

Description

IL-2 융합 폴리펩티드 조성물 및 그의 제조 및 사용 방법

관련 출원에 대한 상호 참조

본 출원은 2020년 5월 11일에 출원된 미국 가출원 일련 번호 63/022,853의 우선권을 주장하며, 그의 전체 개시내용이 본원에 참고로 포함된다.

발명의 분야

본 개시물은 IL-2Rα 사슬의 세포외 부분에 융합된 원형으로 순열된(circularly permuted) 인터루킨-2(IL-2)를 포함하는 폴리펩티드를 포함하는 조성물, 및 그러한 조성물의 제조 및 사용 방법에 관한 것이다.

배경

IL-2Rα 사슬 인터루킨-2(IL-2) 인터루킨-2 수용체 알파(IL-2Rα)의 세포외 부분에 융합된 원형으로 순열된 인터루킨-2(IL-2)를 포함하는 폴리펩티드는 항암제로서 큰 가능성을 가진다. 이들 폴리펩티드는 기억 CD8+ T 세포 및 자연살해(NK) 세포에서 발현되는 중간 친화성 IL-2R 복합체를 통해 신호를 전달하는 완전한 능력을 보유하지만, CD4+ FOXP3+ 조절 T 세포(CD4+ Tregs) 및 내피 세포에서 우선적으로 발현되는 고친화성 IL-2R 복합체에 결합하는 것이 입체적으로 방지된다. 이 선택적 IL-2R 결합의 결과로, 폴리펩티드는 CD8+ T 세포 및 NK 세포를 선택적으로 활성화하고, 이렇게 함으로써 종양 세포 사멸을 촉진한다. 내피 세포 상의 고친화성 IL-2R을 활성화할 수 없는 능력은 또한 IL-2 요법의 알려진 위험인 모세혈관 누출 증후군으로 인한 독성 위험을 감소시킬 수 있다.

인간 대상체의 치료에 사용될 때, 전술한 폴리펩티드는 사용 전에 저장되어야 하고 투여 지점으로 운반되어야 한다. 대상체에서 요망되는 수준의 폴리펩티드를 재현가능하게 달성하는 것은 폴리펩티드가 폴리펩티드의 생체활성을 유지하는 제제로 저장되어야 한다는 것을 요구한다. 따라서, 폴리펩티드의 안정한 조성물이 관련 분야에 필요하다. 바람직하게는, 그러한 조성물은 긴 저장 수명을 나타낼 것이고, 저장되고 운반될 때 안정할 것이다.

요약

본 개시내용은 IL-2Rα 사슬의 세포외 부분에 융합된 원형으로 순열된 IL-2를 포함하는 폴리펩티드를 포함하는 조성물, 및 그러한 조성물의 제조 및 사용 방법을 제공한다. 이들 조성물은 그 안에 함유된 폴리펩티드의 안정성 및 저장 수명을 개선하도록 특별히 제제화된다.

한 측면에서, 본 개시내용은

a) IL-2Rα 사슬의 세포외 부분에 융합된 원형으로 순열된 IL-2를 포함하는 약 1 mg 내지 약 50 mg의 폴리펩티드;

b) 수크로스;

c) 시트레이트 완충제; 및

d) 폴리소르베이트 20

을 포함하는 조성물을 제공한다.

특정 실시양태에서, 폴리펩티드는 서열번호: 1과 적어도 95% 동일성을 갖는 아미노산을 포함한다. 특정 실시양태에서, 폴리펩티드는 서열번호: 1의 아미노산 서열을 포함한다. 특정 실시양태에서, 폴리펩티드는 서열번호: 1의 아미노산 서열로 이루어진다.

특정 실시양태에서, 조성물은 약 100 mg 내지 약 120 mg의 수크로스를 포함한다. 특정 실시양태에서, 조성물은 약 110 mg의 수크로스를 포함한다.

특정 실시양태에서, 조성물은 약 4.0 mg 내지 약 6.0 mg의 시트레이트를 포함한다. 특정 실시양태에서, 조성물은 약 5.0 mg의 시트레이트를 포함한다. 특정 실시양태에서, 시트레이트 완충제는 수용액 중의 2.03 mg/mL의 시트르산나트륨 삼염기성 이수화물 및 0.97 mg/mL의 시트르산 일수화물의 조합에 의해 형성된다. 특정 실시양태에서, 시트레이트 완충제는 수용액 중의 2.91 mg/mL의 시트르산나트륨 삼염기성 이수화물 및 0.34 mg/mL의 시트르산 일수화물의 조합에 의해 형성된다.

특정 실시양태에서, 조성물은 시트르산 및 시트르산나트륨 삼염기성 이수화물을 약 1:10 내지 약 1:2 (즉, 약 1:10, 약 1:9, 약 1:8, 약 1:7, 약 1:6, 약 1:5, 약 1:4, 약 1:3, 및 약 1:2)의 시트르산:시트르산나트륨 삼염기성 이수화물의 질량비로 포함한다. 특정 실시양태에서, 조성물은 시트르산 및 시트르산나트륨 삼염기성 이수화물을 약 1:9의 시트르산:시트르산나트륨 삼염기성 이수화물의 질량비로 포함한다. 특정 실시양태에서, 조성물은 시트르산 및 시트르산나트륨 삼염기성 이수화물을 약 1:2의 시트르산:시트르산나트륨 삼염기성 이수화물의 질량비로 포함한다.

특정 실시양태에서, 조성물은 약 0.20 mg 내지 약 0.24 mg의 폴리소르베이트 20을 포함한다. 특정 실시양태에서, 조성물은 약 0.22 mg의 폴리소르베이트 20을 포함한다.

특정 실시양태에서, 조성물은 약 2.2 mg의 폴리펩티드를 포함한다. 특정 실시양태에서, 조성물은 약 11 mg의 폴리펩티드를 포함한다. 특정 실시양태에서, 조성물은 약 33 mg의 폴리펩티드를 포함한다.

특정 실시양태에서, 조성물은 동결건조된 케이크이다. 특정 실시양태에서, 물에 동결건조된 케이크의 용해는 pH가 약 5.5 내지 약 6.5인 수용액을 생성한다. 특정 실시양태에서, 물에 동결건조된 케이크의 용해는 pH가 약 6.1인 수용액을 생성한다.

특정 실시양태에서, 물에 동결건조된 케이크의 용해는 약 160 내지 약 230 mOsm/kg의 삼투질농도를 갖는 수용액을 생성한다. 특정 실시양태에서, 물에 동결건조된 케이크의 용해는 약 179 mOsm/kg의 삼투질농도를 갖는 수용액을 생성한다.

특정 실시양태에서, 염화나트륨 용액에 동결건조된 케이크의 용해는 약 240 내지 약 340 mOsm/kg의 삼투질농도를 갖는 수용액을 생성한다.

특정 실시양태에서, 수용액은 물 또는 염화나트륨 용액으로 추가로 희석된다.

특정 실시양태에서, 수용액은 약 0.03 mg/mL의 폴리펩티드 내지 약 0.2 mg/mL의 폴리펩티드를 포함한다.

특정 실시양태에서, 조성물은 수용액이다.

특정 실시양태에서, 조성물은 2.2 mg의 폴리펩티드를 포함하는 2.2 ml의 수용액이다. 특정 실시양태에서, 조성물은 11 mg의 폴리펩티드를 포함하는 2.2 ml의 수용액이다. 특정 실시양태에서, 조성물은 33 mg의 폴리펩티드를 포함하는 2.2 ml의 수용액이다. 특정 실시양태에서, 조성물은 44 mg의 폴리펩티드를 포함하는 2.2 ml의 수용액이다.

특정 실시양태에서, 용액의 pH는 약 6.1이다.

특정 실시양태에서, 조성물은 폴리펩티드의 단일 단위 용량이다.

한 측면에서, 본 개시내용은

a) IL-2Rα 사슬의 세포외 부분에 융합된 원형으로 순열된 IL-2를 포함하는 약 1 mg 내지 약 50 mg(예를 들어, 약 2, 11 또는 33 mg)의 폴리펩티드;

b) 약 100 mg 내지 약 120 mg의 수크로스;

c) 약 4.0 mg 내지 약 6.0 mg의 시트레이트 음이온; 및

d) 약 0.20 mg 내지 약 0.24 mg의 폴리소르베이트 20

을 포함하는 조성물을 제공한다.

특정 실시양태에서, 폴리펩티드는 서열번호: 1과 적어도 95% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 특정 실시양태에서, 폴리펩티드는 서열번호: 1의 아미노산 서열을 포함한다.

특정 실시양태에서, 조성물은 약 110 mg의 수크로스를 포함한다. 특정 실시양태에서, 조성물은 약 5.0 mg의 시트레이트 음이온을 포함한다. 특정 실시양태에서, 조성물은 약 0.22 mg의 폴리소르베이트 20을 포함한다.

특정 실시양태에서, 조성물은 약 2.2 mg의 폴리펩티드를 포함한다. 특정 실시양태에서, 조성물은 약 11 mg의 폴리펩티드를 포함한다. 특정 실시양태에서, 조성물은 약 33 mg의 폴리펩티드를 포함한다. 특정 실시양태에서, 조성물은 약 44 mg의 폴리펩티드를 포함한다.

특정 실시양태에서, 조성물은 동결건조된 케이크이다. 특정 실시양태에서, 동결건조된 케이크는

a) 서열번호: 1의 아미노산 서열을 포함하는 약 2.2 mg의 폴리펩티드;

b) 약 110 mg의 수크로스;

c) 약 5.0 mg의 시트레이트 음이온; 및

d) 약 0.22 mg의 폴리소르베이트 20

을 포함한다.

특정 실시양태에서, 동결건조된 케이크는

a) 서열번호: 1의 아미노산 서열을 포함하는 약 11 mg의 폴리펩티드;

b) 약 110 mg의 수크로스;

c) 약 5.0 mg의 시트레이트 음이온; 및

d) 약 0.22 mg의 폴리소르베이트 20

을 포함한다.

특정 실시양태에서, 동결건조된 케이크는

a) 서열번호: 1의 아미노산 서열을 포함하는 약 33 mg의 폴리펩티드;

b) 약 110 mg의 수크로스;

c) 약 5.0 mg의 시트레이트 음이온; 및

d) 약 0.22 mg의 폴리소르베이트 20

을 포함한다.

특정 실시양태에서, 조성물은 수용액이다. 특정 실시양태에서, 조성물은

a) 서열번호: 1의 아미노산 서열을 포함하는 약 2.2 mg의 폴리펩티드;

b) 약 110 mg의 수크로스;

c) 약 5.0 mg의 시트레이트 음이온; 및

d) 약 0.22 mg의 폴리소르베이트 20

을 포함하는 2.2 ml의 수용액이다.

특정 실시양태에서, 조성물은

a) 서열번호: 1의 아미노산 서열을 포함하는 약 11 mg의 폴리펩티드;

b) 약 110 mg의 수크로스;

c) 약 5.0 mg의 시트레이트 음이온; 및

d) 약 0.22 mg의 폴리소르베이트 20

을 포함하는 2.2 ml의 수용액이다.

특정 실시양태에서, 조성물은

a) 서열번호: 1의 아미노산 서열을 포함하는 약 33 mg의 폴리펩티드;

b) 약 110 mg의 수크로스;

c) 약 5.0 mg의 시트레이트 음이온; 및

d) 약 0.22 mg의 폴리소르베이트 20

을 포함하는 2.2 ml의 수용액이다.

특정 실시양태에서, 수용액의 pH는 약 6.1이다.

특정 실시양태에서, 조성물은 폴리펩티드의 단일 단위 용량이다.

또 다른 측면에서, 본 개시내용은

a) IL-2Rα 사슬의 세포외 부분에 융합된 원형으로 순열된 IL-2를 포함하는 약 1 mg/mL 내지 약 20 mg/mL의 폴리펩티드;

b) 약 45 mg/mL 내지 약 55 mg/mL의 수크로스;

c) 약 10 mM 내지 약 20 mM (예를 들어, 약 10 mM 내지 약 13 mM)의 시트레이트; 및

d) 약 0.09 mg/mL 내지 약 1.1 mg/mL의 폴리소르베이트 20

을 포함하고, 여기서 용액의 pH가 약 5.5 내지 약 6.5인 수성 조성물을 제공한다.

특정 실시양태에서, 폴리펩티드는 서열번호: 1과 적어도 95% 동일성을 갖는 아미노산을 포함한다. 특정 실시양태에서, 폴리펩티드는 서열번호: 1의 아미노산 서열을 포함한다.

특정 실시양태에서, 수성 조성물은 약 50 mg/mL의 수크로스를 포함한다. 특정 실시양태에서, 수성 조성물은 약 12 mM의 시트레이트를 포함한다.

특정 실시양태에서, 수성 조성물은 약 0.1 mg/mL의 폴리소르베이트 20을 포함한다. 특정 실시양태에서, 수성 조성물은 약 6.1의 pH를 갖는다.

특정 실시양태에서, 조성물은 약 1 mg/mL의 폴리펩티드를 포함한다. 특정 실시양태에서, 조성물은 약 5 mg/mL의 폴리펩티드를 포함한다. 특정 실시양태에서, 조성물은 약 15 mg/mL의 폴리펩티드를 포함한다. 특정 실시양태에서, 조성물은 약 20 mg/mL의 폴리펩티드를 포함한다.

또 다른 측면에서, 본 개시내용은

a) 서열번호: 1의 아미노산 서열을 포함하는 약 1, 5, 또는 15 mg/mL의 폴리펩티드;

b) 약 50 mg/mL 내지 약 55 mg/mL의 수크로스;

c) 약 12 mM의 시트레이트 완충제; 및

d) 약 0.1 mg/mL의 폴리소르베이트 20

을 포함하고, 여기서 조성물의 pH가 약 6.1인 수성 조성물을 제공한다.

특정 실시양태에서, 수성 조성물은

a) 서열번호: 1의 아미노산 서열을 포함하는 약 1 mg/mL의 폴리펩티드;

b) 약 50 mg/mL의 수크로스;

c) 약 12 mM (예를 들어, 11.95 mM)의 시트레이트; 및

d) 약 0.1 mg/mL의 폴리소르베이트 20

을 포함하고, 여기서 용액의 pH는 약 6.1이다.

특정 실시양태에서, 수성 조성물은

a) 서열번호: 1의 아미노산 서열을 포함하는 약 5 mg/mL의 폴리펩티드;

b) 약 50 mg/mL의 수크로스;

c) 약 12 mM (예를 들어, 11.95 mM)의 시트레이트; 및

d) 약 0.1 mg/mL의 폴리소르베이트 20

을 포함하고, 여기서 용액의 pH는 약 6.1이다.

특정 실시양태에서, 수성 조성물은

a) 서열번호: 1의 아미노산 서열을 포함하는 약 15 mg/mL의 폴리펩티드;

b) 약 50 mg/mL의 수크로스;

c) 약 12 mM (예를 들어, 11.95 mM)의 시트레이트; 및

d) 약 0.1 mg/mL의 폴리소르베이트 20

을 포함하고, 여기서 용액의 pH는 약 6.1이다.

또 다른 측면에서, 본 개시내용은 임의의 전술한 조성물을 포함하는 제조 물품을 제공한다. 특정 실시양태에서, 물품은 유리 바이알이다.

또 다른 측면에서, 본 개시내용은 임의의 전술한 수용액을 동결건조함으로써 제조된 동결건조된 조성물을 제공한다.

또 다른 측면에서, 본 개시내용은 임의의 전술한 수용액을 동결건조하는 단계를 포함하는 동결건조된 조성물의 제조 방법을 제공한다.

또 다른 측면에서, 본 개시물은 수성 용매 중에 임의의 전술한 동결건조된 조성물을 용해하는 단계를 포함하는 수성 조성물의 제조 방법을 제공한다.

특정 실시양태에서, 수성 용매는 주사용수이다. 특정 실시양태에서, 수성 용매는 염화나트륨 용액이다. 특정 실시양태에서, 염화나트륨 용액은 약 0.1% NaCl 내지 약 0.5% NaCl을 포함한다. 특정 실시양태에서, 염화나트륨 용액은 약 0.12% NaCl 내지 약 0.41% NaCl을 포함한다. 특정 실시양태에서, 염화나트륨 용액은 약 0.02 M NaCl 내지 약 0.07 M NaCl을 포함한다. 특정 실시양태에서, 수성 조성물은 약 240 내지 약 340 mOsm/kg의 삼투질농도를 포함한다.

특정 실시양태에서, 수성 조성물의 pH는 약 6.1로 조정된다. 특정 실시양태에서, 수성 조성물의 pH는 염기를 이용하여 약 6.1로 조정된다. 특정 실시양태에서, 염기는 수산화나트륨이다.

특정 실시양태에서, 수성 조성물은 약 1%(w/w)의 계면활성제를 포함하는 수용액으로 추가로 희석된다. 특정 실시양태에서, 계면활성제는 폴리소르베이트 20이다. 특정 실시양태에서, 수용액은 약 0.1%(w/w)의 시트르산 일수화물, 0.2%(w/w)의 시트르산나트륨 삼염기성 이수화물, 및 98.7%(w/w)의 주사용수를 추가로 포함한다.

특정 실시양태에서, 조성물은 제약 조성물을 포함한다.

또 다른 측면에서, 본 개시내용은 대상체에게 유효량의 임의의 전술한 조성물을 투여하는 단계를 포함하는, 대상체에서 자연 살해 세포(NK) 세포를 활성화시키는 방법을 제공한다.

또 다른 측면에서, 본 개시내용은 암 치료를 필요로 하는 대상체에게 유효량의 임의의 전술한 조성물을 투여하는 단계를 포함하는 암 치료를 필요로 하는 대상체에서 암을 치료하는 방법을 제공한다. 특정 실시양태에서, 암은 신세포 암종, 흑색종, 난소암 또는 폐암이다. 특정 실시양태에서, 암은 불응성 고형 종양을 포함한다.

본 발명의 상기 및 다른 특징 및 이점은 첨부된 도면과 함께 취해진 예시적인 실시양태의 다음 상세한 설명으로부터 더욱 완전하게 이해될 것이다. 특허 또는 출원 파일은 컬러로 수행된 적어도 하나의 도면을 함유한다. 컬러 도면(들)과 함께 이 특허 또는 특허 출원 공개의 사본은 요청 및 필요한 수수료 지불시 특허청에서 제공될 것이다.
도 1 은 재구성된 생성물 또는 동결건조된 생성물로서의 여러 제형에서 폴리펩티드 A의 활성을 묘사한다. 활성은 pSTAT5 ELISA 검정으로 측정되었다.
도 2 는 동결건조된 생성물로서의 여러 제형에서 폴리펩티드 A의 크기 배제 크로마토그래피 결과를 묘사한다.
도 3 은 재구성된 생성물로서의 여러 제형에서 폴리펩티드 A의 크기 배제 크로마토그래피 결과를 묘사한다.
도 4 는 완충제 조성의 함수로서 폴리펩티드 A의 시차 주사 열량측정법(differential scanning calorimetry) 연구를 묘사한다. Tm의 비폴딩(unfolding) 결과를 나타낸다. 모든 오차 막대는 삼중 실험으로부터의 표준편차이다.
도 5 는 완충제 조성의 함수로서 72℃에서 폴리펩티드 A의 시간에 따른 OD350 연구를 묘사한다. 72℃에서 8 시간 후의 평균 OD350을 나타낸다. 모든 오차 막대는 삼중 실험으로부터의 표준편차이다.
도 6 은 300 RPM에서 3일의 진탕 후의 완충제 조성의 함수로서 폴리펩티드 A의 마이크로-플로우 이미징 연구를 묘사한다. 육안으로 보이지 않는 입자의 총 농도를 나타내고, 오차 막대는 삼중 실험으로부터의 표준편차이다.
도 7 은 진탕 스트레스(shaking stress) 및 완충제 조성의 함수로서 폴리펩티드 A의 마이크로-플로우 이미징 연구를 묘사한다. 육안으로 보이지 않는 입자의 총 농도를 나타내고, 오차 막대는 삼중 실험으로부터의 표준편차이다.

IL-2Rα 사슬의 세포외 부분에 융합된 원형으로 순열된 IL-2를 포함하는 폴리펩티드를 포함하는 조성물, 및 그러한 조성물의 제조 및 사용 방법이 본원에서 제공된다.

본원에 개시된 제형은 그 안에 함유된 폴리펩티드의 개선된 안정성 및 저장 수명을 제공한다. 특히, 열거된 제형으로 동결건조되고 주사용수(WFI) 또는 유사하게 허용되는 희석제에서 재구성된 후를 포함하여 폴리펩티드 생성물은 생물학적 활성을 보유한다. 중요하게는, 본원에 기재된 제형은 동결건조된 생성물이 환자 또는 보건의료 제공자가 쉽게 입수가능한 WFI에서 재구성되는 것을 허용하도록 설계되었다.

본원에서 제공되는 제형은 또한 바람직한 외관을 갖는 동결건조된 케이크를 생성한다. 구체적으로, 케이크는 원상태 그대로이고(파편화되지 않고), 용기(예를 들어, 유리 바이알)로부터 수축이 거의 또는 전혀 없으며, 평탄한 오목 표면을 갖는다.

선택된 정의

본원에서 달리 정의되지 않는 한, 본원에서 사용되는 과학 및 기술 용어는 관련 분야에서 통상의 기술을 가진 자에 의해 흔히 이해되는 의미를 갖는다. 임의의 잠재적 모호성이 있는 경우에는, 본원에 제공된 정의가 사전적 또는 외적 정의보다 우선한다. 문맥상 달리 요구되지 않는 한, 단수 용어는 복수를 포함할 것이고, 복수 용어는 단수를 포함할 것이다. "또는"의 사용은 달리 언급되지 않는 한 "및/또는"을 의미한다. 용어 "포함하는"(including) 뿐만 아니라 다른 형태 예컨대 "포함한다"(includes) 및 "포함되는"(included)의 사용은 제한적인 것이 아니다.

본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "포함하는"(comprising), "포함하는"(including), "갖는" 및 그의 문법적 변이형은 언급된 특징, 정수, 단계 또는 구성요소를 명시하는 것으로 간주되어야 하지만, 하나 이상의 추가 특징, 정수, 단계, 구성요소 또는 그의 그룹의 추가를 배제하지 않는다. 이들 용어는 "로 이루어진" 및 "로 본질적으로 이루어진"이라는 용어를 포함한다.

본원에서 사용되는 바와 같이 용어 "원형 순열" 및 "원형으로 순열된"은 선형 단백질 또는 그의 동족 핵산 서열을 취하고, 네이티브(native) N- 및 C-말단을 융합하여(직접적으로 또는 링커를 통해, 단백질 또는 재조합 DNA 방법을 사용하여) 원형 분자를 형성한 다음, 원형 분자를 상이한 위치에서 절단(개방)하여 원래 분자의 말단과 상이한 말단을 갖는 새로운 선형 단백질 또는 동족 핵산 분자를 형성하는 과정을 지칭한다. 따라서 원형 순열은 단백질의 서열, 구조 및 기능을 보존하고, 한편 상이한 위치에서 새로운 C- 및 N-말단을 생성하며, 그 결과로 원래 분자와 비교하여 요망되는 폴리펩티드 융합 파트너를 융합하기 위한 개선된 배향을 초래한다.

본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "약"은 관련 분야의 통상의 기술을 가진 자에 의해 이해될 것이고, 그것이 사용되는 문맥에 따라 어느 정도 달라질 것이다. 측정가능한 값, 예컨대 양, 시간적 지속기간 등과 관련 있을 때, 용어 "약"은 명시된 값으로부터 ±5%, ±1% 및 ±0.1%를 포함하여 최대 ±5%의 변동을 포함하는 것을 의도하고, 그 이유는 그러한 변동은 개시된 방법을 수행하는 데 적당하기 때문이다.

본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "치료하다", "치료되는", "치료하는" 또는 "치료"는 치료되는 상태, 장애 또는 질병과 관련되거나 또는 그에 의해 야기되는 적어도 하나의 증상의 감소 또는 완화를 포함한다.

본원에서 사용되는 바와 같이, 대상체에 대한 요법의 투여와 관련하여 용어 "유효량"은 요망되는 예방적 또는 치료적 효과를 달성하는 요법의 양을 지칭한다.

본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "환자", "개체" 또는 "대상체"는 인간 또는 비인간 포유동물을 지칭한다. 비인간 포유동물은 예를 들어 가축 및 애완동물, 예컨대 양, 소, 돼지, 개, 고양이 및 쥐과 포유동물을 포함한다. 특정 실시양태에서, 대상체는 인간이다.

IL-2 융합 폴리펩티드

한 측면에서, 본 개시물은 IL-2Rα 사슬의 세포외 부분에 융합된 원형으로 순열된 인터루킨-2(IL-2)를 포함하는 폴리펩티드의 조성물을 제공한다. 본원에 개시된 조성물에 이용된 폴리펩티드는 고친화성 IL-2R 복합체(IL-2Rα, IL-2Rβ 및 IL-2Rγ를 포함함)에 비해 IL-2Rβ 및 공통 감마 사슬 IL-2Rγ를 포함하는 중간 친화성 IL-2R 복합체에 우선적 결합을 나타내고, 중간 친화성 IL-2R 복합체의 선택적 효능제로서 거동한다. 그러한 폴리펩티드의 설계 및 생성은 미국 특허 번호 9,359,415에 기재되어 있고, 이는 그 전체가 본원에 참고로 포함된다.

본원에 개시된 조성물에 포함시키기에 유용한 전형적인 폴리펩티드는 하기 서열번호: 1에 제시된다:

SKNFHLRPRDLISNINVIVLELKGSETTFMCEYADETATIVEFLNRWITFSQSIISTLTGGSSSTKKTQLQLEHLLLDLQMILNGINNYKNPKLTRMLTFKFYMPKKATELKHLQCLEEELKPLEEVLNLAQGSGGGSELCDDDPPEIPHATFKAMAYKEGTMLNCECKRGFRRIKSGSLYMLCTGNSSHSSWDNQCQCTSSATRNTTKQVTPQPEEQKERKTTEMQSPMQPVDQASLPGHCREPPPWENEATERIYHFVVGQMVYYQCVQGYRALHRGPAESVCKMTHGKTRWTQPQLICTG (서열번호: 1)

따라서, 특정 실시양태에서, 폴리펩티드의 아미노산 서열은 서열번호: 1의 아미노산 서열을 포함한다. 특정 실시양태에서, 폴리펩티드의 아미노산 서열은 서열번호: 1의 아미노산 서열로 이루어진다.

숙련된 종사자는 서열번호: 1의 아미노산 서열 변이체가 또한 본원에 개시된 조성물에 이용될 수 있다는 것을 이해할 것이다. 예를 들어, 특정 실시양태에서, 폴리펩티드의 아미노산 서열은 서열번호: 1의 아미노산 서열과 적어도 80%(예를 들어, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 또는 99%) 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나 또는 그것으로 이루어진다. 특정 실시양태에서, 폴리펩티드의 아미노산 서열은 서열번호: 1의 아미노산 서열과 적어도 95% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나 또는 그것으로 이루어진다.

숙련된 종사자는 또한 본원에 개시된 조성물에 이용되는 폴리펩티드의 아미노산 서열이 유도체화될 수 있거나 또는 개질될 수 있고, 예를 들어 페길화, 아미드화 등이 수행될 수 있다는 것을 이해할 것이다.

특정 실시양태에서, 제제 중 폴리펩티드의 양은 약 1 mg 내지 약 50 mg (예를 들어, 약 1 mg, 약 2 mg, 약 3 mg, 약 4 mg, 약 5 mg, 약 6 mg, 약 7 mg, 약 8 mg, 약 9 mg, 약 10 mg, 약 11 mg, 약 12 mg, 약 13 mg, 약 14 mg, 약 15 mg, 약 16 mg, 약 17 mg, 약 18 mg, 약 19 mg, 약 20 mg, 약 25 mg, 약 30 mg, 약 33 mg, 약 40 mg, 약 44 mg, 약 45 mg, 또는 약 50 mg)이다. 특정 실시양태에서, 폴리펩티드의 양은 약 2.2 mg이다. 특정 실시양태에서, 폴리펩티드의 양은 약 11 mg이다. 특정 실시양태에서, 폴리펩티드의 양은 약 33 mg이다. 특정 실시양태에서, 폴리펩티드의 양은 약 44 mg이다.

특정 실시양태에서, 수성 제형 중 폴리펩티드의 농도는 약 1 mg/mL 내지 약 50 mg/mL이다. 특정 실시양태에서, 폴리펩티드의 농도는 약 1 mg/mL 내지 약 20 mg/mL(예를 들어, 약 1 mg/mL, 약 2 mg/mL, 약 3 mg/mL, 약 4 mg/mL, 약 5 mg/mL, 약 6 mg/mL, 약 7 mg/mL, 약 8 mg/mL, 약 9 mg/mL, 약 10 mg/mL, 약 11 mg/mL, 약 12 mg/mL, 약 13 mg/mL, 약 14 mg/mL, 약 15 mg/mL, 약 16 mg/mL, 약 17 mg/mL, 약 18 mg/mL, 약 19 mg/mL, 약 20 mg/mL, 약 25 mg/mL, 약 30 mg/mL, 약 35 mg/mL, 약 40 mg/mL, 약 45 mg/mL, 또는 약 50 mg/mL)이다. 특정 실시양태에서, 폴리펩티드의 농도는 약 1 mg/mL이다. 특정 실시양태에서, 폴리펩티드의 농도는 약 5 mg/mL이다. 특정 실시양태에서, 폴리펩티드의 농도는 약 15 mg/mL이다. 특정 실시양태에서, 폴리펩티드의 농도는 약 20 mg/mL이다.

특정 실시양태에서, 수성 제형은 물 또는 염화나트륨 용액으로 추가로 희석되고, 이렇게 함으로써 제형 중 폴리펩티드의 농도를 감소시킨다. 특정 실시양태에서, 수용액은 약 0.03 mg/mL의 폴리펩티드 내지 약 0.2 mg/mL의 폴리펩티드 (예를 들어, 약 0.03 mg/mL, 약 0.04 mg/mL, 약 0.05 mg/mL, 약 0.06 mg/mL, 약 0.07 mg/mL, 약 0.08 mg/mL, 약 0.09 mg/mL, 약 0.10 mg/mL, 약 0.11 mg/mL, 약 0.12 mg/mL, 약 0.13 mg/mL, 약 0.14 mg/mL, 약 0.15 mg/mL, 약 0.16 mg/mL, 약 0.17 mg/mL, 약 0.18 mg/mL, 약 0.19 mg/mL, 또는 약 0.2 mg/mL)를 포함한다.

특정 실시양태에서, 수성 제형은 약 1%(w/w)의 계면활성제를 포함하는 수용액으로 추가로 희석된다. 특정 실시양태에서, 계면활성제는 폴리소르베이트 20이다. 특정 실시양태에서, 수용액은 약 0.1%(w/w)의 시트르산 일수화물, 0.2%(w/w)의 시트르산나트륨 삼염기성 이수화물, 및 98.7%(w/w)의 주사용수를 추가로 포함한다.

부형제 및 완충제

특정 실시양태에서, 본원에 개시된 조성물은 하나 이상의 부형제 및/또는 완충제를 포함한다.

본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "부형제"는 요망되는 점조도, 점도 또는 안정화 효과를 제공하기 위해 조성물 또는 제형에 첨가되는 임의의 비치료제를 지칭한다. 본원에 개시된 조성물에 사용하기 위한 적합한 부형제는 예를 들어 점도 향상제, 안정화제, 가용화제 등으로서 작용할 수 있다. 부형제는 이온성 또는 비이온성일 수 있다. 적합한 이온성 부형제는 염 예컨대 NaCl 또는 아미노산 구성요소 예컨대 아르기닌-HCl을 포함한다. 적합한 비이온성 부형제는 당, 예를 들어 단당류(예를 들어, 프럭토스, 말토스, 갈락토스, 글루코스, D-만노스, 소르보스 등); 이당류(예를 들어, 락토스, 수크로스, 트레할로스, 셀로비오스 등); 다당류(예를 들어, 라피노스, 멜레지토스, 말토덱스트린, 덱스트란, 전분 등); 및 당 알콜(예를 들어, 만니톨, 자일리톨, 말티톨, 락티톨, 자일리톨 소르비톨(글루시톨) 등)을 포함한다. 예를 들어, 당은 수크로스, 트레할로스, 라피노스, 말토스, 소르비톨 또는 만니톨일 수 있다. 추가로 또는 대안적으로, 당은 당 알콜 또는 아미노 당일 수 있다. 특정 실시양태에서, 당은 수크로스이다.

특정 실시양태에서, 제형 중 부형제(예를 들어, 수크로스)의 양은 약 1 mg 내지 약 150 mg(예를 들어, 약 1 mg, 약 10 mg, 약 20 mg, 약 30 mg, 약 40 mg, 약 50 mg, 약 60 mg, 약 70 mg, 약 80 mg, 약 90 mg, 약 100 mg, 약 110 mg, 약 120 mg, 약 130 mg, 약 140 mg, 또는 약 150 mg)이다. 특정 실시양태에서, 제형 중 부형제(예를 들어, 수크로스)의 양은 약 90 mg 내지 약 130 mg이다. 특정 실시양태에서, 제형 중 부형제(예를 들어, 수크로스)의 양은 약 99 mg 내지 약 121 mg이다. 특정 실시양태에서, 제형 중 부형제(예를 들어, 수크로스)의 양은 약 110 mg이다.

특정 실시양태에서, 수성 제형 중 부형제(예를 들어, 수크로스)의 농도는 약 1 mg/mL 내지 약 100 mg/mL(예를 들어, 약 1 mg/mL, 약 10 mg/mL, 약 20 mg/mL, 약 30 mg/mL, 약 40 mg/mL, 약 45 mg/mL, 약 50 mg/mL, 약 55 mg/mL, 약 60 mg/mL, 약 70 mg/mL, 약 80 mg/mL, 약 90 mg/mL, 또는 약 100 mg/mL)이다. 특정 실시양태에서, 부형제(예를 들어, 수크로스)의 농도는 약 30 mg/mL 내지 약 70 mg/mL이다. 특정 실시양태에서, 부형제(예를 들어, 수크로스)의 농도는 약 45 mg/mL 내지 약 55 mg/mL이다. 특정 실시양태에서, 부형제(예를 들어, 수크로스)의 농도는 약 50 mg/mL이다.

본원에 개시된 조성물에 사용하기 위한 적합한 완충 작용제는 유기 산 및 염, 예컨대 시트르산, 아스코르브산, 글루콘산, 탄산, 타르타르산, 숙신산, 아세트산 또는 프탈산의 염; 트리스, 트로메타민 염산염 또는 인산염 완충제를 포함한다. 또한, 아미노산 구성요소가 완충 작용제로 사용될 수 있다. 그러한 아미노산 구성요소는 글리신, 히스티딘 및 메티오닌을 포함한다. 특정 실시양태에서, 완충제는 시트레이트 완충제이다. 본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "시트레이트 완충제"는 시트레이트 이온을 이용하는 pH 완충 시스템(수성 또는 동결건조된 형태)을 지칭한다. 시트레이트 완충제는 (i) 시트르산, 시트르산 삼나트륨 이수화물 및 시트르산 일수화물; 또는 (ii) 시트르산 일수화물, 이염기성 인산나트륨 및 시트르산의 조합을 포함하여 임의의 관련 분야에서 인정된 방법을 사용하여 제조될 수 있다. 특정 실시양태에서, 시트레이트 완충제는 시트르산나트륨 이수화물 및 시트르산을 사용하여 제조된다.

특정 실시양태에서, 제형 중 완충 작용제(예를 들어, 시트레이트)의 양은 약 1 mg 내지 약 10 mg(예를 들어, 약 1 mg, 약 2 mg, 약 3 mg, 약 4 mg, 약 5 mg, 약 6 mg, 약 7 mg, 약 8 mg, 약 9 mg, 약 10 mg)이다. 특정 실시양태에서, 완충 작용제(예를 들어, 시트레이트)의 양은 약 5.9 mg 내지 약 7.2 mg(예를 들어, 약 5.9 mg, 약 6.0 mg, 약 6.1 mg, 약 6.2 mg, 약 6.3 mg, 약 6.4 mg, 약 6.5 mg, 약 6.6 mg, 약 6.7 mg, 약 6.8 mg, 약 6.9 mg, 약 7.0 mg, 약 7.1 mg, 또는 약 7.2 mg)이다. 특정 실시양태에서, 완충 작용제(예를 들어, 시트레이트)의 양은 약 6.6 mg이다. 특정 실시양태에서, 완충 작용제(예를 들어, 시트레이트) 중 시트레이트 음이온의 양은 약 4.0 mg 내지 약 6.0 mg이다. 특정 실시양태에서, 완충 작용제(예를 들어, 시트레이트) 중 시트레이트 음이온의 양은 약 5.0 mg이다.

특정 실시양태에서, 본원에 개시된 수성 제제 중 완충 작용제(예를 들어, 시트레이트)의 농도는 약 1 mM 내지 약 50 mM(예를 들어, 약 1 mM, 약 2 mM, 약 3 mM, 약 4 mM, 약 5 mM, 약 6 mM, 약 7 mM, 약 8 mM, 약 9 mM, 약 10 mM, 약 11 mM, 약 12 mM, 약 13 mM, 약 14 mM, 약 15 mM, 약 16 mM, 약 17 mM, 약 18 mM, 약 19 mM, 약 20 mM, 약 25 mM, 약 30 mM, 약 35 mM, 약 40 mM, 약 45 mM, 또는 약 50 mM)이다. 특정 실시양태에서, 완충 작용제(예를 들어, 시트레이트)의 농도는 약 11 mM 내지 약 13 mM(예를 들어, 약 11.1 mM, 11.2 mM, 11.3 mM, 11.4 mM, 11.5 mM, 11.6 mM, 11.7 mM, 11.8 mM, 11.9 mM, 12.1 mM, 12.2 mM, 12.3 mM, 12.4 mM, 12.5 mM, 12.6 mM, 12.7 mM, 12.8 mM, 또는 12.9 mM)이다. 특정 실시양태에서, 완충 작용제(예를 들어, 시트레이트)의 농도는 약 12 mM이다. 특정 실시양태에서, 완충 작용제(예를 들어, 시트레이트)의 농도는 약 11.95 mM이다. 특정 실시양태에서, 시트레이트 완충제는 2.03 mg/mL(6.90 mM) 시트르산나트륨 삼염기성 이수화물 및 0.97 mg/mL(5.05 mM) 시트르산을 함유한다.

특정 실시양태에서, 본원에 개시된 조성물은 약 5.0 내지 약 8.0, 약 5.5 내지 약 7.5, 약 5.0 내지 약 7.0, 약 6.0 내지 약 8.0, 또는 약 6.0 내지 약 7.0의 pH를 갖는다. 특정 실시양태에서, 조성물은 약 5.5 내지 약 6.5의 pH를 갖는다. 특정 실시양태에서, 조성물은 약 5.8 내지 약 6.4의 pH를 갖는다. 특정 실시양태에서, 조성물은 약 6.1의 pH를 갖는다. 특정 실시양태에서, 조성물의 pH는 약 6.1의 pH로 조정된다. 특정 실시양태에서, pH는 염기로 조정된다. 특정 실시양태에서, 염기는 수산화물 염, 예컨대 수산화나트륨(NaOH) 또는 수산화칼륨(KOH)이다. 특정 실시양태에서, 조성물은 수성 조성물이고, 수성 조성물의 pH는 약 6.1의 pH로 조정된다.

본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "계면활성제"는 양친매성 구조를 갖는 유기 물질을 지칭하고; 즉, 그들은 용해도 경향이 반대인 그룹, 대표적으로 유용성(oil-soluble) 탄화수소 사슬 및 수용성 이온 그룹으로 구성된다. 계면활성제는 표면 활성 모이어티의 전하에 의존하여 다양한 제약학적 조성물 및 생물학적 물질의 제제를 위한 음이온성, 양이온성 및 분산 작용제로 분류될 수 있다. 본원에 개시된 조성물에 사용하기 위한 적합한 계면활성제는 비이온성 계면활성제, 이온성 계면활성제 및 쯔비터이온성 계면활성제를 포함한다. 본 발명과 함께 사용하기 위한 대표적인 계면활성제는 소르비탄 지방산 에스테르(예를 들어, 소르비탄 모노카프릴레이트, 소르비탄 모노라우레이트, 소르비탄 모노팔미테이트), 소르비탄 트리올레에이트, 글리세린 지방산 에스테르(예를 들어, 글리세린 모노카프릴레이트, 글리세린 모노미리스테이트, 글리세린 모노스테아레이트), 폴리글리세린 지방산 에스테르(예를 들어, 데카글리세릴 모노스테아레이트, 데카글리세릴 디스테아레이트, 데카글리세릴 모노리놀레에이트), 폴리옥시에틸렌 소르비탄 지방산 에스테르(예를 들어, 폴리옥시에틸렌 소르비탄 모노라우레이트, 폴리옥시에틸렌 소르비탄 모노올레에이트, 폴리옥시에틸렌 소르비탄 모노스테아레이트, 폴리옥시에틸렌 소르비탄 모노팔미테이트, 폴리옥시에틸렌 소르비탄 트리올레에이트, 폴리옥시에틸렌 소르비탄 트리스테아레이트), 폴리옥시에틸렌 소르비톨 지방산 에스테르(예를 들어, 폴리옥시에틸렌 소르비톨 테트라스테아레이트, 폴리옥시에틸렌 소르비톨 테트라올레에이트), 폴리옥시에틸렌 글리세린 지방산 에스테르 (예를 들어, 폴리옥시에틸렌 글리세릴 모노스테아레이트), 폴리에틸렌 글리콜 지방산 에스테르 (예를 들어, 폴리에틸렌 글리콜 디스테아레이트), 폴리옥시에틸렌 알킬 에테르 (예를 들어, 폴리옥시에틸렌 라우릴 에테르), 폴리옥시에틸렌 폴리옥시프로필렌 알킬 에테르(예를 들어, 폴리옥시에틸렌 폴리옥시프로필렌 글리콜, 폴리옥시에틸렌 폴리옥시프로필렌 프로필 에테르, 폴리옥시에틸렌 폴리옥시프로필렌 세틸 에테르), 폴리옥시에틸렌 알킬페닐 에테르(예를 들어, 폴리옥시에틸렌 노닐페닐 에테르), 폴리옥시에틸렌 수소화된 피마자유(예를 들어, 폴리옥시에틸렌 피마자유, 폴리옥시에틸렌 수소화된 피마자유), 폴리옥시에틸렌 밀랍 유도체(예를 들어, 폴리옥시에틸렌 소르비톨 밀랍 등), 폴리옥시에틸렌 라놀린 유도체(예를 들어, 폴리옥시에틸렌 라놀린 등), 및 폴리옥시에틸렌 지방산 아미드(예를 들어, 폴리옥시에틸렌 스테아르산 아미드 등); C10-C18 알킬 설페이트(예를 들어, 나트륨 세틸 설페이트, 나트륨 라우릴 설페이트, 나트륨 올레일 설페이트), 평균 2 내지 4 mole의 에틸렌 옥사이드 단위가 첨가된 폴리옥시에틸렌 C10-C18 알킬 에테르 설페이트(예를 들어, 나트륨 폴리옥시에틸렌 라우릴 설페이트), 및 C1-C18 알킬 설포숙시네이트 에스테르 염(예를 들어, 나트륨 라우릴 설포숙시네이트 에스테르); 및 천연 계면활성제, 예컨대 레시틴, 글리세로인지질, 스핑고인지질(예를 들어, 스핑고미엘린), 및 C12-C18 지방산의 수크로스 에스테르를 포함한다. 조성물은 이들 계면활성제 중 하나 이상을 포함할 수 있다. 특정 실시양태에서, 본원에 개시된 조성물은 폴리옥시에틸렌 소르비탄 지방산 에스테르, 예를 들어 폴리소르베이트 20, 40, 60 또는 80을 포함한다. 특정 실시양태에서, 본원에 개시된 조성물은 폴리소르베이트 20을 포함한다.

특정 실시양태에서, 제형 중 계면활성제(예를 들어, 폴리소르베이트 20)의 농도는 약 0.1 mg 내지 약 1 mg(예를 들어, 약 0.1 mg, 약 0.15 mg, 약 0.2 mg, 약 0.25 mg, 약 0.3 mg, 약 0.35 mg, 약 0.4 mg, 약 0.45 mg, 약 0.5 mg, 약 0.55 mg, 약 0.6 mg, 약 0.65 mg, 약 0.7 mg, 약 0.75 mg, 약 0.8 mg, 약 0.85 mg, 약 0.9 mg, 약 0.95 mg, 또는 약 1 mg)이다. 특정 실시양태에서, 계면활성제(예를 들어, 폴리소르베이트 20)의 농도는 약 0.15 mg 내지 약 0.3 mg(예를 들어, 약 0.16 mg, 약 0.17 mg, 약 0.18 mg, 약 0.19 mg, 약 0.21 mg, 약 0.22 mg, 약 0.23 mg, 약 0.24 mg, 약 0.26 mg, 약 0.27 mg, 약 0.28 mg, 또는 약 0.29 mg)이다. 특정 실시양태에서, 계면활성제(예를 들어, 폴리소르베이트 20)의 농도는 약 0.20 mg 내지 약 0.24 mg이다. 특정 실시양태에서, 수성 제형 중 계면활성제(예를 들어, 폴리소르베이트 20)의 농도는 약 0.22 mg이다.

특정 실시양태에서, 수성 제형 중 계면활성제(예를 들어, 폴리소르베이트 20)의 농도는 약 0.01 mg/mL 내지 약 1 mg/mL(예를 들어, 약 0.01 mg/mL, 약 0.1 mg/mL, 약 0.2 mg/mL, 약 0.3 mg/mL, 약 0.4 mg/mL, 약 0.5 mg/mL, 약 0.6 mg/mL, 약 0.7 mg/mL, 약 0.8 mg/mL, 약 0.9 mg/mL, 또는 약 1 mg/mL)이다. 특정 실시양태에서, 계면활성제(예를 들어, 폴리소르베이트 20)의 농도는 약 0.05 mg/mL 내지 약 0.15 mg/mL(예를 들어, 약 0.05 mg/mL, 약 0.06 mg/mL, 약 0.07 mg/mL, 또는 약 0.08 mg/mL 약 0.09 mg/mL, 약 0.1 mg/mL, 약 0.11 mg/mL, 약 0.12 mg/mL, 약 0.13 mg/mL, 약 0.14 mg/mL, 또는 약 0.15 mg/mL)이다. 특정 실시양태에서, 계면활성제(예를 들어, 폴리소르베이트 20)의 농도는 약 0.09 mg/mL 내지 약 0.11 mg/mL이다. 특정 실시양태에서, 수성 제형 중 계면활성제(예를 들어, 폴리소르베이트 20)의 농도는 약 0.1 mg/mL이다.

관련 분야의 기술을 가진 자는 본 발명의 조성물의 구성요소 및 조성물이 mg/mL 이외의 단위로 기재될 수 있다는 것을 이해할 것이다. 예를 들어, 본 발명의 조성물의 구성요소 및 조성물은 몰 농도 단위로 기재될 수 있다. 본 발명의 조성물의 구성요소 및 조성물은 중량 또는 질량 퍼센트 단위로 추가로 기재될 수 있다.

동결건조

한 측면에서, 본 개시내용은 본원에 개시된 폴리펩티드의 동결건조된 조성물 (예를 들어, 동결건조된 케이크), 및 그의 제조 방법을 제공하였다.

동결건조는 일반적으로 동결, 1차 건조 및 2차 건조의 세 주요 단계를 포함한다. 동결은 물을 얼음으로 또는 일부 무정형 제형 구성요소를 결정질 형태로 전환시키기 위해 필요하다. 1차 건조는 낮은 압력 및 온도에서 직접 승화에 의해 동결된 생성물에서 얼음을 제거하는 공정 단계이다. 2차 건조는 잔류 물을 증발 표면으로 확산시키는 것을 이용하여 생성물 매트릭스에서 결합수(bounded water)를 제거하는 공정 단계이다. 2차 건조 동안의 생성물 온도는 정상적으로 1차 건조 동안보다 높다. Tang X. et al. (2004) "Design of freeze-drying processes for pharmaceuticals: Practical advice," Pharm. Res., 21:191-200; Nail S.L. et al. (2002) "Fundamentals of freeze-drying," in Development and manufacture of protein pharmaceuticals. Nail SL editors. New York: Kluwer Academic/Plenum Publishers, pp 281-353; Wang et al. (2000) "Lyophilization and development of solid protein pharmaceuticals," M J Pharm., 203:1-60; Williams NA et al. (1984) "The lyophilization of pharmaceuticals; A literature review." J. Parenteral Sci. Technol, 38:48-59; 및 WO 2010/148337 A1을 참조한다.

동결건조 공정을 통한 온도 및 압력의 변화 때문에, 본원에 개시된 폴리펩티드가 동결건조 및 저장 동안에 분해(예를 들어, 단백질 응집, 탈아미드화 및/또는 산화)되는 것을 방지하기 위해 부형제 또는 다른 구성요소, 예컨대 안정제, 완충 작용제, 증량제(bulking agent) 및 계면활성제의 적절한 선택이 필요하다. 본원에 개시된 동결건조된 조성물은 IL-2Rα 사슬의 세포외 부분에 융합된 원형으로 순열된 인터루킨-2(IL-2)를 포함하는 본원에 개시된 폴리펩티드의 안정한 장기 저장을 허용하는 구성성분들의 특별한 조합을 함유한다.

또 다른 측면에서, 개시내용은 IL-2Rα 사슬의 세포외 부분에 융합된 원형으로 순열된 인터루킨-2(IL-2)를 포함하는 본원에 개시된 수성 조성물 중 임의의 하나를 동결건조시킴으로써 제조된 동결건조된 조성물을 제공한다. 특정 실시양태에서, 동결건조된 조성물은 동결건조된 케이크이다. 특정 실시양태에서, 동결건조된 조성물은 표 2, 표 3, 또는 표 4에 열거된 동결건조 프로토콜에 따라 본원에 개시된 수성 조성물 중 임의의 하나를 동결건조시킴으로써 제조된다.

또 다른 측면에서, 본 개시내용은 IL-2Rα 사슬의 세포외 부분에 융합된 원형으로 순열된 인터루킨-2(IL-2)를 포함하는 본원에 개시된 수성 조성물 중 임의의 하나를 동결건조시키는 단계를 포함하는 동결건조된 조성물의 제조 방법을 제공한다. 특정 실시양태에서, 동결건조된 조성물의 제조 방법은 표 2, 표 3, 또는 표 4에 열거된 동결건조 프로토콜을 따르는 것을 포함한다.

또 다른 측면에서, 본 개시내용은 IL-2Rα 사슬의 세포외 부분에 융합된 원형으로 순열된 인터루킨-2(IL-2)를 포함하는 본원에 개시된 동결건조된 조성물 중 임의의 하나를 수성 용매에 용해시키는 단계를 포함하는 수성 조성물의 제조 방법을 제공한다. 특정 실시양태에서, 동결건조된 조성물은 동결건조된 케이크이다. 특정 실시양태에서, 동결건조된 조성물은 2.2 ml의 물에 용해된다. 특정 실시양태에서, 동결건조된 조성물은 염화나트륨 용액에 용해된다. 특정 실시양태에서, 염화나트륨 용액은 약 0.1% NaCl 내지 약 0.5% NaCl을 포함한다. 특정 실시양태에서, 염화나트륨 용액은 약 0.12% NaCl 내지 약 0.41% NaCl을 포함한다. 특정 실시양태에서, 염화나트륨 용액은 약 0.10%, 0.11%, 0.12%, 0.13%, 0.14%, 0.15%, 0.16%, 0.17%, 0.18%, 0.19%, 0.20%, 0.21%, 0.22%, 0.23%, 0.24%, 0.25%, 0.26%, 0.27%, 0.28%, 0.29%, 0.30%, 0.31%, 0.32%, 0.33%, 0.34%, 0.35%, 0.36%, 0.37%, 0.38%, 0.39%, 0.40%, 0.41%, 0.42%, 0.43%, 0.44%, 0.45%, 0.46%, 0.47%, 0.48%, 0.49%, 또는 0.50% NaCl을 포함한다. 특정 실시양태에서, 염화나트륨 용액은 약 0.02 M NaCl 내지 약 0.07 M NaCl을 포함한다. 특정 실시양태에서, 염화나트륨 용액은 약 0.02 M, 0.03 M, 0.04 M, 0.05 M, 0.06 M, 또는 0.07 M NaCl을 포함한다. 특정 실시양태에서, 수성 조성물은 염화나트륨 용액에 용해될 때 약 240 내지 약 340 mOsm/kg의 삼투질농도를 포함한다. 특정 실시양태에서, 염화나트륨 용액에 용해된 수성 조성물은 피하 투여를 통해 환자에게 투여될 수 있다.

폴리펩티드 조성물의 용도

본원에 개시된 조성물은 인터루킨 2 수용체 신호전달과 관련된 임의의 질병 또는 장애의 치료, 예방 또는 호전에 특히 유용하다.

한 측면에서, IL-2Rα 사슬의 세포외 부분에 융합된 원형으로 순열된 IL-2를 포함하는 본원에 개시된 조성물 중 임의의 하나의 유효량을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는 대상체에서 자연 살해 세포(NK) 세포를 활성화시키는 방법이 제공된다.

또 다른 측면에서, IL-2Rα 사슬의 세포외 부분에 융합된 원형으로 순열된 IL-2를 포함하는 본원에 개시된 조성물 중 임의의 하나의 유효량을 암 치료를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는 암 치료를 필요로 하는 대상체에서 암을 치료하는 방법이 제공된다. 본원에 개시된 조성물을 사용한 치료에 적합한 암 은 신세포 암종, 흑색종, 난소암 및 폐암을 포함한다. 특정 실시양태에서, 암은 불응성 고형 종양을 포함한다.

특정 실시양태에서, 조성물은 정맥내 투여된다.

특정 실시양태에서, 조성물은 약 1 μg/kg 내지 약 15 μg/kg의 용량으로 정맥내 투여된다. 특정 실시양태에서, 조성물은 약 1 μg/kg, 약 2 μg/kg, 약 3 μg/kg, 약 4 μg/kg, 약 5 μg/kg, 약 6 μg/kg, 약 7 μg/kg, 약 8 μg/kg, 약 9 μg/kg, 약 10 μg/kg, 약 11 μg/kg, 약 12 μg/kg, 약 13 μg/kg, 약 14 μg/kg, 또는 약 15 μg/kg의 용량으로 정맥내 투여된다.

특정 실시양태에서, 조성물은 연속 5일 동안 매일 정맥내 투여된다.

특정 실시양태에서, 조성물은 연속 5일 동안 매일 정맥내 투여되고, 이어서 연속 9일 동안 조성물의 정맥내 투여가 없다.

특정 실시양태에서, 조성물은 연속 5일 동안 매일 정맥내 투여되고, 이어서 연속 16일 동안 조성물의 정맥내 투여가 없다.

특정 실시양태에서, 조성물은 1) 연속 5일 동안 매일 조성물의 정맥내 투여, 이어서 연속 9일 동안 조성물의 정맥내 투여 없음을 포함하는 제1 사이클; 및 2) 연속 5일 동안 매일 조성물의 정맥내 투여, 이어서 연속 16일 동안 조성물의 정맥내 투여 없음을 포함하는 제2 사이클로 투여된다.

특정 실시양태에서, 방법은 적어도 하나의 추가의 투여 사이클을 포함하고, 여기서 각 추가의 사이클은 연속 5일 동안 매일 조성물의 정맥내 투여, 이어서 연속 16일 동안 조성물의 정맥내 투여 없음을 포함한다.

특정 실시양태에서, 조성물은 피하 투여된다

특정 실시양태에서, 방법은 약 240 내지 약 340 mOsm/kg의 삼투질농도를 포함하는 위에서 기재된 수성 조성물의 피하 투여를 포함한다.

특정 실시양태에서, 조성물은 약 1 mg 내지 약 15 mg의 용량으로 피하 투여된다. 특정 실시양태에서, 조성물은 약 1 mg의 용량으로 피하 투여된다. 특정 실시양태에서, 조성물은 약 2 mg의 용량으로 피하 투여된다. 특정 실시양태에서, 조성물은 약 3 mg의 용량으로 피하 투여된다. 특정 실시양태에서, 조성물은 약 4 mg의 용량으로 피하 투여된다. 특정 실시양태에서, 조성물은 약 5 mg의 용량으로 피하 투여된다. 특정 실시양태에서, 조성물은 약 6 mg의 용량으로 피하 투여된다. 특정 실시양태에서, 조성물은 약 7 mg의 용량으로 피하 투여된다. 특정 실시양태에서, 조성물은 약 8 mg의 용량으로 피하 투여된다. 특정 실시양태에서, 조성물은 약 9 mg의 용량으로 피하 투여된다. 특정 실시양태에서, 조성물은 약 10 mg의 용량으로 피하 투여된다. 특정 실시양태에서, 조성물은 약 11 mg의 용량으로 피하 투여된다. 특정 실시양태에서, 조성물은 약 12 mg의 용량으로 피하 투여된다. 특정 실시양태에서, 조성물은 약 13 mg의 용량으로 피하 투여된다. 특정 실시양태에서, 조성물은 약 14 mg의 용량으로 피하 투여된다. 특정 실시양태에서, 조성물은 약 15 mg의 용량으로 피하 투여된다.

특정 실시양태에서, 조성물은 1주마다 1회(Q1W), 2주마다 1회(Q2W), 또는 3주마다 1회(Q3W) 피하 투여된다.

특정 실시양태에서, 조성물은 약 1 mg 내지 약 15 mg의 용량으로 1주마다 1회(Q1W), 2주마다 1회(Q2W), 또는 3주마다 1회(Q3W) 투여된다.

특정 실시양태에서, 조성물은 약 3 mg의 용량으로 1주마다 1회(Q1W) 피하 투여된다. 특정 실시양태에서, 조성물은 약 6 mg의 용량으로 3주마다 1회(Q3W) 피하 투여된다.

특정 실시양태에서, 흑색종은 점막 흑색종 또는 진행성 피부 흑색종 중 하나 또는 둘 모두이다.

본원에 기재된 방법의 다른 적합한 변형 및 개조가 본원에 개시된 실시양태의 범위에서 벗어남이 없이 적합한 등가물을 사용하여 이루어질 수 있다는 것이 관련 분야의 숙련자에게 용이하게 명백할 것이다. 이제 특정 실시양태를 상세히 기재하였지만, 이는 하기 실시예를 참고하여 더욱 명확하게 이해될 것이고, 하기 실시예는 단지 예시의 목적으로 포함되고 제한하는 것을 의도하지 않는다.

실시예

본 발명은 하기 실시예에 의해 추가로 예시되고, 이는 추가의 제한으로 해석되지 않아야 한다. 본 발명의 실시는 달리 지시되지 않는 한, 관련 분야의 기술 내에 있는 유기 합성, 세포 생물학, 세포 배양, 분자 생물학, 트랜스제닉 생물학, 미생물학 및 면역학의 통상적인 기술을 이용할 것이다.

실시예 1 - 폴리펩티드 조성물의 설계 및 시험

폴리펩티드 A(서열번호: 1의 아미노산을 포함하는 IL-2Rα 사슬의 세포외 부분에 융합된 원형으로 순열된 IL-2)의 최적의 제형을 결정하기 위한 노력으로, 폴리펩티드 A의 여러 제형을 단백질 안정성, pH 안정성, 물리화학적 거동, 동결건조된 케이크 균일성 및 동결건조 후 저장 바이알에 대한 접착 저항성에 미치는 영향에 대해 시험하였다. 하기 표 1은 시험된 각 제제의 구체적인 구성요소 및 그들의 농도를 열거한다. 상이한 조성물을 하기 표 2-4에 열거된 동결건조 사이클 프로토콜 중 하나로 처리하였다.

물리화학적 시험

제형 1-6에서의 폴리펩티드 A의 물리화학적 거동은 전기 저항을 측정하고, 동결건조 현미경검사를 수행하고, 시차 주사 열량측정법을 수행함으로써 저온에서 특성화하였다.

전기 저항

0 내지 20 메가옴 저항 기기, 및 세라믹 플레이트 상의 2 개의 평행한 금 스트립으로 이루어진 세라믹 저항 프로브를 사용하여 20 mm 유리 샘플 튜브의 대략 1.8 mL의 샘플에 대해 저항을 측정하였다. 세라믹 프로브에 금 플레이트의 반대쪽에 위치한 32-게이지 T형 열전대를 사용하여 온도를 측정하였다. 측정 및 기록 기기는 미국표준기술연구소(National Institute of Standards and Technology, NIST) 추적가능한 참조 표준물을 사용하여 분석에 사용된 온도 범위에서 보정하였다. 시스템의 정확성은 표준 참조물 용액을 사용하여 검증하였다.

표준 방법을 사용하여, 물질 특이적 상전이를 확립하기 위해서 물질을 분당 0.5℃의 평균 제어 속도로 냉각 및 가온하여 이의 열 특성을 평가하였다. 저항 샘플은 대기 조건에서 분석하였다. 가온할 때 상전이의 시작을 결정하기 위해 저항 편차를 사용하였다. Collect 프로그램으로 Kaye Validator 기기를 사용하여 전체 분석 동안 10 초마다 온도 측정값을 기록하였다.

동결건조 현미경검사

대략 0.15 mL의 용액을 유리 셀에 분배하였다. 그 다음, 셀을 온도 제어 동결 건조 스테이지에 두었다. 샘플 셀에는 샘플 온도를 모니터링하기 위해 셀의 바닥 및 중심에서 물질 안에 직접 넣은 2개의 32-게이지 T형 열전대를 장착하였다. 액체 샘플을 분당 0.5℃의 평균 제어 속도로 -50℃ 이하의 목표 설정점까지 냉각시켰다. 동결이 완료될 때, 스테이지 챔버를 진공배기하여 얼음의 승화를 시작하였다. 그 다음, 승화 및 건조 동안 스테이지를 분당 0.5℃의 평균 제어 속도로 가온하였다. 동결 및 건조 동안의 샘플의 거동을 Super WDR CCD 카메라에 커플링된 16 내지 330 X 확대할 수 있는 Infinivar Microscope를 사용하여 관찰하였다. 상전이를 초과하는 물질을 반영하는 샘플의 동결 및 건조 부분에서 관찰된 변화는 샘플 온도와 상관관계가 있었다. Collect 프로그램과 함께 Kaye Validator 기기를 사용하여 완전한 분석 동안 10 초마다 온도 측정값을 기록하였다.

시차 주사 열량측정법

상전이를 결정하기 위해 동결 및 가온 동안의 물리화학적 거동을 평가하는 수단으로서 위에 기재된 분석들과 함께 저온 시차 주사 열량측정법(LT DSC)을 사용하였다. LT DSC 분석은 현재 USP<891>를 따르고, 분석을 TA Instruments Q200 DSC를 사용하여 수행하였다. TA Instruments Q200 DSC를 냉동식 냉각장치(Refrigerated Cooling System)와 함께 작동시켰다. 시험 매개변수를 TA Advantage 소프트웨어(v5.0.4)를 사용하여 구현하였다. 스캔 데이터를 TA Universal Analysis 소프트웨어(v4.5A)를 사용하여 기록하고 그래프로 작성하였다. 샘플 크기의 19.4 mg의 용액을 제자리에 크림핑된 뚜껑이 있는 알루미늄 샘플 팬에 넣었다. 질소, NF를 사용하여 50 ml/분의 유속으로 연속으로 샘플을 퍼징(purge)하였다. 기기를 Lyophilization Technology, Inc.의 보정 프로그램에 따라 보정하였다. 냉각 및 가온 동안, 샘플의 열 발생 또는 흡수는 샘플이 열 이벤트를 겪을 때의 에너지의 차이를 반영하였다. 이 열 에너지의 차이를 결과 분석을 위해 기록하였다.

물리화학적 거동 특징화 결과

물리화학적 거동 특징화의 결과는 제형 4가 뒤집힘 및 충돌(jarring)시에 여전히 원상태 그대로인 균일한 외관을 갖는 동결건조된 케이크의 생성을 초래하고, 동결건조시 바이알의 측면 및 바닥에 최소의 잔류 물질이 부착되고, 가장 높은 유리 전이 특성을 갖는다는 것을 밝혀냈다. 제형 4의 결과는 시험된 다른 모든 제형보다 우수하였다. 더욱이, 시험된 다른 제형들은 동결건조된 폴리펩티드 A 조성물을 생성하기 위한 안정한 동결건조 사이클을 생성하지 못하였다.

안정성 시험

제형 1-6에서의 폴리펩티드 A의 안정성을 모세혈관 등전점 전기영동법(cIEF), 크기 배제 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC), SDS-PAGE 및 활성 검정을 사용하여 특징화하였다.

모세혈관 등전점 전기영동법(cIEF)

cIEF를 사용하여 시험된 제형에서 전하 변이체의 존재를 측정하였다. 약물 생성물 샘플은 2.2 mL 주사용수(WFI)에서 샘플을 재구성함으로써 제조하였다. 내용물에 육안으로 보이는 미립자가 없음을 보장하기 위해 샘플을 육안으로 검사하였다. 다음 방정식을 사용하여 하기 표로부터 요구되는 각 시약의 부피를 계산하여 마스터 믹스를 제조함으로써 분석을 위한 참조 표준물, 샘플 및 블랭크를 제조하였다: "시약의 부피" = [("n+2") × "V" ] 여기서: n = 샘플 수; V = 샘플 당 시약의 부피(μL)(하기 표 5 참조).

계산된 부피의 시약을 적절한 크기의 튜브에 첨가하고 볼텍싱하여 혼합하였다. 블랭크는 158 μL의 마스터 믹스를 1.5 mL 마이크로원심분리 튜브에 옮김으로써 제조하였고, 242 μL의 WFI를 튜브에 첨가하고 온화하게 볼텍싱하여 혼합하였다. 폴리펩티드 A 참조 표준물은 블랭크와 동일한 방법으로 제조하였다. 샘플은 79 μL의 마스터 믹스를 각 샘플의 1.5 mL 튜브에 옮김으로써 제조하였고, 121 μL의 샘플을 튜브에 첨가하고 온화하게 볼텍싱하여 혼합하였다. 사용된 주입 순서 및 분석 조건을 각각 표 6 및 7에 제시한다. 분석을 위해, pI 마커 사이의 모든 피크를 통합하였다. ≥0.05%의 모든 피크의 pI 및 면적%를 보고함으로써 결과를 계산하였다.

크기 배제 HPLC

크기 배제 HPLC를 사용하여 시험 제제의 순도를 측정하였다. 2.2 mL의 WFI에서 샘플을 재구성함으로써 약물 생성물 샘플을 제조하였다. 내용물에 육안으로 보이는 미립자가 없음을 보장하기 위해 샘플을 육안으로 검사하였다. 참조 표준물, 샘플 및 블랭크를 각각 표 8 및 9에 제시된 다음 분석 조건 및 주입 순서를 사용하여 분석을 위해 시험하였다.

결과를 0.05% 초과 면적의 모든 통합된 피크의 면적% 및 용리 시간으로 보고하였다. 도 2 및 도 3은 시험된 각 제형의 SEC 피크를 묘사한다.

세포 기반 활성 검정

각 제형에서 폴리펩티드 A의 활성은 HH 세포(표면에 존재하는 βγIL2 수용체 이소형을 갖는 인간 T 림프구 세포주)에 대한 제형의 결합을 측정함으로써 평가하였다. ELISA 검정을 사용하여 각 제형과 접촉 후 HH 세포에 존재하는 포스포릴화된 STAT5(포스포-STAT5 또는 pSTAT5)의 양을 결정함으로써 폴리펩티드 A 결합을 측정하였다. Invitrogen InstantOne ELISA 포스포르-STAT5 알파/베타(pTyr694/pTyr699) 키트를 사용하여 ELISA 검정을 수행하였다.

약물 생성물 샘플을 2.2 mL의 WFI 중 샘플을 재구성하여 제조하였다. 내용물에 육안으로 보이는 미립자가 없음을 보장하기 위해 샘플을 육안으로 검사하였다.

샘플 희석제는 5% FBS의 최종 농도를 위해 25 mL의 소태아혈청(FBS)을 500 mL의 항크스 평형 염류 완충액(Hanks Balanced Salt Solution, HBSS)에 첨가함으로써 제조하였고, 37℃로 가온하였다. 0.05% 트윈 20을 갖는 인산 완충 생리식염수(PBS)를 포함하는 세척 완충제를 사용하였다.

샘플 및 표준물을 검정에서 750 ng/mL, 250 ng/mL, 83 ng/mL, 28 ng/mL, 9.3 ng/mL, 3.1 ng/mL, 1.0 ng/mL 및 0.3 ng/mL의 최종 단백질 농도로 희석하였다. 대략 1.2 x 10⁶ 개 세포/mL의 밀도의 HH 세포의 스톡 용액을 제조하고, 50 μl의 세포 스톡 용액을 희석된 샘플 또는 표준물을 함유하는 96-웰 플레이트의 각 웰에 첨가하였다. 세포를 37℃에서 30 분 동안 인큐베이션하였다. 인큐베이션 후, 세포를 세포 용해 완충제에 10 분 동안 용해시켰다. 용해 후, 50 μl의 용해된 세포 혼합물을 ELISA 플레이트에 옮긴 후, 50 μl의 포스포-STAT5 A/B 항체 칵테일을 옮겼다. 이어서, 혼합물을 1 시간 동안 인큐베이션한 다음, 세척 완충제로 3회 세척하였다. 그 다음, 100 μl의 검출 시약을 각 웰에 첨가하고, 플레이트를 15 분 동안 인큐베이션하였다. 그 다음, 100 μl의 정지 용액을 각 웰에 첨가하고, 플레이트를 마이크로플레이트 판독기로 450 nm에서 판독하였다.

개별 EC50 값을 측정하고, 참조 표준물 EC50 값 및 대조군 EC50 값에 대해 % 상대 표준편차(RSD)를 계산하였다.

참조 표준물(참조 표준물 EC50GM)의 3개 EC50 값의 기하 평균 및 대조군(대조군 EC50)의 3개 EC50 값의 기하 평균을 계산하였다. 대조군에 대한 상대 효력을 다음 방정식을 사용하여 계산하였다. 상대 효력 = (참조 표준물 EC50GM)/(대조군 EC50)×100%.

동일한 방식으로 샘플을 계산하였다. 검정 결과를 다음 방정식에 의해 결정하였다: 상대 효력 = (참조 표준물 EC50GM)/(시험 샘플 EC50) x 100%.

HH 세포주 기반 활성 검정의 결과는 폴리펩티드 A가 시험된 다양한 제형에서 활성을 유지한다는 것을 입증하였다(도 1).

안정성 시험 결과

전술한 안정성 특징화의 결과는 제형 4가 pH 및 폴리펩티드 A의 단백질 안정성을 유지함에 있어서 시험된 다른 제형보다 우수하다는 것을 밝혀냈다.

실시예 2 - 상이한 완충제 구성요소의 스크린 및 안정성에 대한 그의 영향

pH 범위 6.0 - 7.0의 제약학적 용도에 적당한 여러 완충제를 시차 주사 열량측정법 및 열 응력에 기반한 스크리닝을 위한 OD350 시간 경과 검정, 및 진탕 스트레스에 기반한 스크리닝을 위한 마이크로-플로우 이미징을 사용하여 폴리펩티드 A에 대한 안정화 영향에 대해서 스크리닝하였다.

폴리펩티드 A(초기에는 PBS 완충제 중 11.6 mg/mL)를 pH 6.0의 5가지 완충제 10 mM 히스티딘, 10 mM 시트레이트, 100 mM 시트레이트, 10 mM 포스페이트 또는 10 mM 숙시네이트 중 하나로 투석하였다. 투석은 4℃에서 10,000 Da 분자량 컷오프 및 3 mL의 캐패시티(capacity)의 Slide-A-Lyzer 카세트에서 그리고 1:500+ 투석액 부피 대 완충제 부피 비율로 수행되었으며, 4+ 시간 간격으로 2회의 완충제 교체하였고, 투석액 회수 전 밤새 인큐베이션하였다. 투석액을 여과된(0.2μm) 투석 완충제로 1.0 mg/mL의 폴리펩티드 A까지 희석하였다. 그 다음, 이들 샘플에 대해 검정을 삼중으로 수행하였다. 마이크로-플로우 이미징을 위해, 이중으로 3 mL의 각 샘플을 5 mL 바이알에 첨가하고, 바이알을 300 RPM에서 3일 동안 진탕한 다음, 이중시료(duplicate)를 풀링(pooling)하였다. 또한 3 mL의 완충제를 동일한 조건 하에서 완충제 감산 및 블랭킹(blanking)을 위해 진탕시켰다.

시차 주사 열량측정법(DSC)

자동 샘플러가 장착된 MicroCal 모세혈관 시차 주사 열량측정계를 사용하여 1 mg/mL의 폴리펩티드 A 농도로 모든 샘플에 대해 DSC 실험을 삼중으로 수행하였다. 샘플을 60℃/시간의 속도로 10℃에서 90℃까지 가열하고, 써모그램(thermogram)을 기록하였다. 샘플 및 참조 셀을 각 주입 사이에서 세척하였다. Origin 7에서 MicroCal 분석 패키지 애드온(add-on)을 사용하여 데이터를 분석하고, 동일한 x-축 값으로 내삽함으로써 평균화를 수행할 수 있었다.

도 4는 완충제 조성의 함수로서 써모그램의 T_m 값을 나타낸다. 10 mM의 시트레이트의 T_m 값이 모든 샘플 중에서 가장 높았고, 10 mM의 히스티딘 완충제가 상대적으로 낮은 T_m 값을 가졌다.

OD350 시간 경과 (운동역학적) 검정

큐벳 당 부피 260 μL의 단백질 용액을 사용하여 Cary 100 UV-가시선 분광광도계로 OD350 시간 경과 (운동역학적) 검정을 삼중으로 수행하였다. 온도를 72℃의 일정한 값으로 유지하는 동안에, 350 nm에서의 광학 밀도를 5 분마다 측정하였고 평균화 시간은 2 초이었다. 모든 데이터를 Origin lab으로 임포트(import)하고, 동일한 x-축 값으로 내삽함으로써 평균화를 수행할 수 있었다.

72℃의 일정한 온도에서 8 시간 동안 5 분마다 폴리펩티드 A 샘플에 대해 OD350 값을 삼중으로 수집하였다. 도 5는 8 시간 후의 평균 OD350 값을 나타낸다. 72℃에서 8 시간 후, 시트레이트 완충제를 함유하는 샘플이 가장 낮은 OD350 값을 가졌다.

마이크로-플로우 이미징

100 μm의 실란 코팅된 플로우 셀이 있는 MFI DPA-4200(Protein Simple, Santa Clara, CA) 시스템을 사용하여 2 내지 70 μm 범위의 육안으로 보이지 않는 입자를 검사하였다. 측정 전에 10 μm의 폴리스티렌 입자 표준물(Duke)을 사용하여 기기를 보정하였다. 측정은 모든 샘플에 대해 주위 온도에서 삼중으로 수행하였다. 셀을 입자가 없는 물로 플러쉬(flush)하고, 모든 측정 전에 입자가 없는 물을 사용하여 조도를 최적화하였다. 샘플을 단백질 결합이 낮은 필터-팁 피펫(Neptune Scientific) 안으로 조심스럽게 끌어올리고, 0.2 mL/분의 유속을 사용하여 분석하였다. 각 측정의 퍼지 부피는 0.4 mL였고, 0.6 mL의 샘플을 분석하였다.

300 RPM에서 3일 동안 진탕 후 모든 폴리펩티드 A 샘플에 대해 MFI를 삼중으로 수행하였고, 그 결과를 도 6에 나타내었다. 10 mM 히스티딘 중의 샘플이 3일 동안의 진탕 후 육안으로 보이지 않는 입자의 총 농도가 가장 높았고, 10 mM 시트레이트 중의 샘플이 육안으로 보이지 않는 입자의 총 농도가 가장 낮았다.

완충제 스크리닝의 결론

10 mM의 히스티딘 중 폴리펩티드 A의 샘플은 열 안정성이 가장 낮았고, 72℃에서 시간 경과에 따라 초기 OD350이 가장 높았고, 3일 동안의 진탕 스트레스 후 육안으로 보이지 않는 입자의 총 농도가 가장 높았다. 시트레이트 완충제 중 샘플은 72℃에서 시간 경과에 따라 OD350이 가장 낮았고, 3일 동안의 진탕 응력 후 총 입자 농도가 가장 낮았고, DSC 데이터에서 샘플들 중 열 안정성이 가장 높았다.

실시예 3 - 수크로스를 갖는 시트레이트 및 수크로스 및 폴리소르베이트 20를 갖는 시트레이트 에 대한 히스트딘 완충제의 비교

진탕 스트레스의 함수로서 육안으로 보이지 않는 입자의 총 농도에 미치는 pH 6.1의 3 mg/mL의 시트레이트, 50 mg/mL의 수크로스 중 폴리소르베이트 20의 존재의 영향을 결정하기 위한 노력의 일환으로, 마이크로-플로우 이미징을 수행하였다. 시험된 완충제는 10 mM의 히스티딘, 50 mg/mL의 수크로스를 갖는 3 mg/mL의 시트레이트, 및 50 mg/mL의 수크로스 및 0.01%의 폴리소르베이트 20를 갖는 3 mg/mL의 시트레이트이었다. 육안으로 보이지 않는 입자의 총 농도를 300 RPM에서 3일 동안의 진탕 후 마이크로플로우 이미징에 의해 모든 폴리펩티드 A 샘플에 대해 삼중으로 측정하였고; 결과를 도 7에 나타내었다. 육안으로 보이지 않는 입자의 총 농도는 폴리소르베이트 20을 갖는 샘플에서 가장 낮았다.

Claims (65)

1. a) IL-2Rα 사슬의 세포외 부분에 융합된 원형으로 순열된(circularly permuted) IL-2를 포함하는 약 1 mg 내지 약 50 mg의 폴리펩티드;
   b) 수크로스;
   c) 시트레이트 완충제; 및
   d) 폴리소르베이트 20
   을 포함하는 조성물.
2. 제1항에 있어서, 상기 폴리펩티드가 서열번호: 1과 적어도 95% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 것인, 조성물.
3. 제1항에 있어서, 상기 폴리펩티드가 서열번호: 1의 아미노산 서열을 포함하는 것인, 조성물.
4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물이 약 2.2 mg의 폴리펩티드를 포함하는 것인, 조성물.
5. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물이 약 11 mg의 폴리펩티드를 포함하는 것인, 조성물.
6. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물이 약 33 mg의 폴리펩티드를 포함하는 것인, 조성물.
7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물이 약 100 mg 내지 약 120 mg의 수크로스를 포함하는 것인, 조성물.
8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물이 약 110 mg의 수크로스를 포함하는 것인, 조성물.
9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물이 약 4.0 mg 내지 약 6.0 mg의 시트레이트 음이온을 포함하는 것인, 조성물.
10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물이 약 5.0 mg의 시트레이트 음이온을 포함하는 것인, 조성물.
11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물이 시트르산 및 시트르산나트륨 삼염기성 이수화물을 약 1:10 내지 약 1:2의 시트르산:시트르산나트륨 삼염기성 이수화물의 질량비로 포함하는 것인, 조성물.
12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물이 시트르산 및 시트르산나트륨 삼염기성 이수화물을 약 1:9의 시트르산:시트르산나트륨 삼염기성 이수화물의 질량비로 포함하는 것인, 조성물.
13. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물이 시트르산 및 시트르산나트륨 삼염기성 이수화물을 약 1:2의 시트르산:시트르산나트륨 삼염기성 이수화물의 질량비로 포함하는 것인, 조성물.
14. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물이 약 0.20 mg 내지 약 0.24 mg의 폴리소르베이트 20을 포함하는 것인, 조성물.
15. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물이 약 0.22 mg 폴리소르베이트 20을 포함하는 것인, 조성물.
16. 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물이 동결건조된 케이크인, 조성물.
17. 제16항에 있어서, 물에 상기 동결건조된 케이크의 용해가 pH가 약 5.5 내지 약 6.5인 수용액을 생성하는 것인, 조성물.
18. 제17항에 있어서, 물에 상기 동결건조된 케이크의 용해가 pH가 약 6.1인 수용액을 생성하는 것인, 조성물.
19. 제16항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 물에 상기 동결건조된 케이크의 용해가 약 160 내지 약 230 mOsm/kg의 삼투질농도를 갖는 수용액을 생성하는 것인, 조성물.
20. 제19항에 있어서, 물에 상기 동결건조된 케이크의 용해가 약 179 mOsm/kg의 삼투질농도를 갖는 수용액을 생성하는 것인, 조성물.
21. 제16항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 염화나트륨 용액에 상기 동결건조된 케이크의 용해가 약 240 내지 약 340 mOsm/kg의 삼투질농도를 갖는 수용액을 생성하는 것인, 조성물.
22. 제21항에 있어서, 상기 염화나트륨 용액이 약 0.1% NaCl 내지 약 0.5% NaCl을 포함하는 것인, 조성물.
23. 제21항에 있어서, 상기 염화나트륨 용액이 약 0.12% NaCl 내지 약 0.41% NaCl을 포함하는 것인, 조성물.
24. 제21항에 있어서, 상기 염화나트륨 용액이 약 0.02 M NaCl 내지 약 0.07 M NaCl을 포함하는 것인, 조성물.
25. 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물이 수용액인, 조성물.
26. 제25항에 있어서, 상기 조성물이 약 1 mg/mL의 폴리펩티드를 포함하는 것인, 조성물.
27. 제26항에 있어서, 상기 조성물이 약 2.2 mg의 폴리펩티드를 포함하는 2.2 ml의 수용액인, 조성물.
28. 제25항에 있어서, 상기 조성물이 약 5 mg/mL의 폴리펩티드를 포함하는 것인, 조성물.
29. 제28항에 있어서, 상기 조성물이 약 11 mg의 폴리펩티드를 포함하는 2.2 ml의 수용액인, 조성물.
30. 제25항에 있어서, 상기 조성물이 약 15 mg/mL의 폴리펩티드를 포함하는 것인, 조성물.
31. 제30항에 있어서, 상기 조성물이 약 33 mg의 폴리펩티드를 포함하는 2.2 ml의 수용액인, 조성물.
32. 제25항 내지 제31항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물이 약 45 mg/mL 내지 약 55 mg/mL의 수크로스를 포함하는 것인, 조성물.
33. 제32항에 있어서, 상기 조성물이 약 50 mg/mL의 수크로스를 포함하는 것인, 조성물.
34. 제25항 내지 제33항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물이 약 10 mM 내지 약 20 mM의 시트레이트 완충제를 포함하는 것인, 조성물.
35. 제34항에 있어서, 상기 조성물이 약 12 mM의 시트레이트 완충제를 포함하는 것인, 조성물.
36. 제25항 내지 제35항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 시트레이트 완충제가 수용액 중 2.03 mg/mL의 시트르산나트륨 삼염기성 이수화물 및 0.97 mg/mL의 시트르산 일수화물의 조합에 의해 형성되는 것인, 조성물.
37. 제25항 내지 제36항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물이 약 0.09 mg/mL 내지 약 0.11 mg/mL의 폴리소르베이트 20을 포함하는 것인, 조성물.
38. 제37항에 있어서, 상기 조성물이 약 0.1 mg/mL의 폴리소르베이트 20을 포함하는 것인, 조성물.
39. 제25항 내지 제38항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물의 pH가 약 5.5 내지 약 6.5인, 조성물.
40. 제36항에 있어서, 상기 조성물의 pH가 약 6.1인, 조성물.
41. 제25항 내지 제40항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물의 삼투질농도가 약 160 내지 약 230 mOsm/kg인, 조성물.
42. 제41항에 있어서, 상기 조성물의 삼투질농도가 약 179 mOsm/kg인, 조성물.
43. 제25항 내지 제42항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 수용액이 약 0.03 mg/mL의 폴리펩티드 내지 약 0.2 mg/mL의 폴리펩티드를 포함하는 것인, 조성물.
44. 제25항 내지 제44항 중 어느 한 항의 조성물을 동결건조함으로써 제조된 동결건조된 조성물.
45. 제1항 내지 제44항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물이 단일 단위 용량의 폴리펩티드인, 조성물.
46. 제1항 내지 제45항 중 어느 한 항의 조성물을 포함하는 제조 물품.
47. 제46항에 있어서, 상기 물품이 유리 바이알인, 물품.
48. 제25항 내지 제43항 중 어느 한 항의 수용액을 동결건조하는 단계를 포함하는 동결건조된 조성물의 제조 방법.
49. 제16항 또는 제44항의 조성물을 수성 용매에 용해시키는 단계를 포함하는 수성 조성물의 제조 방법.
50. 제49항에 있어서, 상기 수성 용매가 주사용수를 포함하는 것인, 방법.
51. 제49항에 있어서, 상기 수성 용매가 염화나트륨 용액을 포함하는 것인, 방법.
52. 제51항에 있어서, 상기 염화나트륨 용액이 약 0.1% NaCl 내지 약 0.5% NaCl을 포함하는 것인, 방법.
53. 제51항에 있어서, 상기 염화나트륨 용액이 약 0.12% NaCl 내지 약 0.41% NaCl을 포함하는 것인, 방법.
54. 제51항에 있어서, 상기 염화나트륨 용액이 약 0.02 M NaCl 내지 약 0.07 M NaCl을 포함하는 것인, 방법.
55. 제51항 내지 제54항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 수성 조성물이 약 240 내지 약 340 mOsm/kg의 삼투질농도를 포함하는 것인, 방법.
56. 제49항 내지 제55항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 수성 조성물의 pH가 약 6.1로 조정되는 것인, 방법.
57. 제49항 내지 제56항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 수성 조성물의 pH가 염기를 이용하여 약 6.1로 조정되는 것인, 방법.
58. 제57항에 있어서, 상기 염기가 수산화나트륨인, 방법.
59. 제49항 내지 제58항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 수성 조성물이 약 1%(w/w)의 계면활성제를 포함하는 수용액으로 추가로 희석되는 것인, 방법.
60. 제59항에 있어서, 상기 계면활성제가 폴리소르베이트 20인, 방법.
61. 제59항에 있어서, 상기 수용액이 약 0.1%(w/w)의 시트르산 일수화물, 0.2%(w/w)의 시트르산나트륨 삼염기성 이수화물, 및 98.7%(w/w)의 주사용수를 추가로 포함하는 것인, 방법.
62. 제25항 내지 제43항 중 어느 한 항의 유효량의 조성물을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는 대상체에서 자연 살해 세포(NK) 세포를 활성화시키는 방법.
63. 치료를 필요로 하는 대상체에서 암을 치료하는 방법으로서, 제25항 내지 제43항 중 어느 한 항의 유효량의 조성물을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
64. 제63항에 있어서, 상기 암이 신세포 암종, 흑색종, 난소암 또는 폐암인, 방법.
65. 제63항 또는 제64항에 있어서, 상기 암이 불응성 고형 종양을 포함하는 것인, 방법.

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