JP6466833B2

JP6466833B2 - 抗炎症活性を有するペプチド、及びそれを含む組成物

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Publication number: JP6466833B2
Application number: JP2015510686A
Authority: JP
Inventors: サンチェキム; キョンヘキム; キュ−ヨンリ; ソン−ホコ; ヒョン−ヘパク; ソンチンフ; ウチンリ; ポムチュンキム
Original assignee: ジェムバックスアンドカエルカンパニー，リミティド; サンチェキム
Priority date: 2012-05-11
Filing date: 2013-03-15
Publication date: 2019-02-06
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Description

本発明は抗炎症活性を有するペプチド、及びそれを含む組成物に関する。

炎症は、外部の物理的刺激、各種アレルギー誘発物質の接触を例として挙げることができる化学的刺激、あるいはバクテリア、かびまたはウイルスのような微生物の侵入などによって、生体組織が損傷されることを防ぐための生体の防御反応のうち一つである。

炎症信号は、シクロオキシゲナーゼ（ＣＯＸ）経路またはリポキシゲナーゼ（ＬＯＸ）経路を介して作られ、プロスタグランジン、トロンボキサンなどを生成する。炎症信号が伝達されれば、生体内では、さまざまな変化が起こるが、そのうちの一つとして、炎症が、必要な部位の血管を拡張させ、血液供給を旺盛にし、好中球など炎症反応に必要な血液細胞が集中供給される現象を挙げることができる。しかし、そのような生体の防御反応が非正常的に過度に起これば、さまざまな炎症性疾患が発病することになるので、それを防止するために、炎症信号経路の酵素（例えば、ＣＯＸ−１、ＣＯＸ−２、５−ＬＯＸ、１２−ＬＯＸなど）を抑制して炎症信号経路を遮断することにより、過度の炎症反応を抑制することができる薬物が開発されている。

炎症は、反応期間により、急性炎症（acute inflammation；即刻反応、非特異的反応、数日〜数週間）、慢性炎症（chronic inflammation；遅延された反応、特異性反応、数週間以上）、亜急性炎症（subacute inflammation；急性炎症と慢性炎症との中間段階、多核球と単核球との混合型産出物の特徴）に分けられる。

また、炎症を誘発する因子には、ペプチド性因子以外に、プロスタグランジン、ロイコトリエン、血小板活性因子のような脂質性因子、炎症因子合成酵素、ＮＯ（nitric oxide）のような自由ラジカル、さまざまな種類の細胞接着分子、免疫系、凝固因子などが関与する。

現在まで知られた炎症のメカニズムは、外部の生物学的な原因（細菌、ウイルス、寄生虫）、物理学的な原因（機械的な刺激、熱、放射線、電気）、化学的原因などによる細胞損傷により、ヒスタミン及びキニンなどが放出され、血管拡張、毛細管透過性増大、及び炎症部位への大食細胞の集結が起おり、それによって、感染部位の血流量増加、浮腫、兔疫細胞及び抗体の移動、痛症、発熱などの現象が起こる。

現在使用されている炎症の治療剤には、イブプロフェンのような合成医薬品、抗ヒスタミン剤、ステロイド、コティソン、免疫抑制剤、免疫亢進剤などが使用されているが、治療効果が一時的であったり、単純症状緩和であったり、あるいは過敏反応、免疫体系悪化などの副作用が多くあったりして、炎症の根本的な治療が困難である。従って、最近、効果的な炎症緩和のために、前記炎症関連タンパク質の発現を抑制することができる物質に係わる研究が進められている。しかし、そのような研究によって開発された抗炎物質の場合、いくつかの副作用が問題になっている。非ステロイド性抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）とステロイド性抗炎症薬（ＳＡＩＤ）とを始めとした、多様なメカニズムの炎症抑制用薬物が開発されているが、それらは、少なくない副作用を示すだけではなく、炎症反応を根本的に抑制するものではないために、さらに効果的であって安全であり、経済性の高い薬物に対する要求が依然として存在する。一例として、急性関節炎またはリュウマチ性関節炎のような慢性炎症疾患の治療に使用される非ステロイド性消炎薬物は、ＣＯＸ−２酵素を抑制するだけではなく、ＣＯＸ−１酵素も抑制することにより、胃腸管障害のような副作用を示すと知られている。

本発明者らは、テロメラーゼに由来するペプチドが抗炎活性を有するということを見出し、本発明を完成するに至った。

KR2012-013996A KR2012-0133661A KR2011-0060940A US2011-0150873A1

Bonaldi T et al., EMBOJ, (22)5551-60, 2003 Yankner BA et al., Science (New York, N. Y.) [1990, 250(4978): 279-282] Dahlgren KN et al., J. Biol. Chem. 277: 32046-32053, 2002

従って、本発明の目的は、新規ペプチドを提供するところにある。

本発明の他の目的は、新規ペプチドをコードするポリヌクレオチドを提供するところにある。

本発明のさらに他の目的は、抗炎症活性を有するペプチドを提供するところにある。

本発明のさらに他の目的は、抗炎症活性を有するペプチドを有効成分にする抗炎症組成物を提供するところにある。

本発明のさらに他の目的は、抗炎症活性を有するペプチドを有効成分として含む化粧品組成物を提供するところにある。

本発明のさらに他の目的は、抗炎症活性を有するペプチドを有効成分として含む医薬組成物を提供するところにある。

本発明の一側面によれば、抗炎症活性を有するペプチドであって、配列番号２〜１７９のうち少なくとも一つのアミノ酸配列を含むか、または、前記アミノ酸配列と少なくとも８０％の配列同一性を有するか、または前記ペプチドの断片である、前記ペプチドが提供される。

本発明の一側面によれば、抗炎症活性を有するペプチドであって、配列番号１〜１６１のうちいずれか一つ以上のアミノ酸配列を含む（comprising）ペプチド、前記アミノ酸配列と８０％以上の配列相同性を有するペプチド、またはその断片であるペプチドが提供される。

本発明の他の側面によれば、前記断片は、３個以上のアミノ酸からなる断片でもある。例えば、前記断片は、４，５，６，７，８，９，１０，１１，１２，１３，１４，１５，１６，１７，１８，１９，２０，２１，２２，２３，２４，２５または２６個のアミノ酸から構成された断片でもある。

本発明の他の側面によれば、前記ペプチドは、３０個以下のアミノ酸から構成されてもよい。例えば、前記断片は、２９，２８，２７，２６，２５，２４，２３，２２，２１，２０，１９，１８，１７，１６，１５，１４，１３，１２，１１，１０，９または８個のアミノ酸からなる断片でもある。

本発明の他の側面によれば、前記ペプチドは、配列番号２〜１７９のうちいずれか１つのアミノ酸配列からなるペプチドでもある。

本発明の他の側面によれば、前記ペプチドは、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３８、配列番号４２、配列番号４３、配列番号４４、配列番号４５、配列番号４６、配列番号５４、配列番号５５、配列番号５６、配列番号５７、配列番号５８、配列番号６２、配列番号６３、配列番号６４、配列番号６５、配列番号６６、配列番号７０、配列番号７１、配列番号７２、配列番号７３、配列番号７４、配列番号８０、配列番号８１、配列番号８２、配列番号８３、配列番号８４、配列番号８８、配列番号８９、配列番号９０、配列番号９１、配列番号９２、配列番号９６、配列番号９７、配列番号９８、配列番号９９、配列番号１００、配列番号１０１、配列番号１０２、配列番号１０３、配列番号１０４、配列番号１０５、配列番号１０８、配列番号１０９、配列番号１１０、配列番号１１１、配列番号１１２、配列番号１１３、配列番号１１６、配列番号１１７、配列番号１１８、配列番号１１９、配列番号１２４、配列番号１３１、配列番号１４０、配列番号１４１、配列番号１４２、配列番号１４８、配列番号１４９、配列番号１５０、配列番号１５６、配列番号１５７、配列番号１５８、配列番号１５９、配列番号１６４、配列番号１６５、配列番号１６６、配列番号１６７、配列番号１６８、配列番号１７２、配列番号１７３、配列番号１７４、配列番号１７５、配列番号１７６、配列番号１７７及び配列番号１７８からなる群から選択されるいずれか１つのアミノ酸配列を含んでもよい。

本発明の他の側面によれば、前記ペプチドは、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号３３、配列番号３４、配列番号４２、配列番号４３、配列番号４４、配列番号５４、配列番号５５、配列番号５６、配列番号６２、配列番号６３、配列番号６４、配列番号６５、配列番号７０、配列番号７１、配列番号７２、配列番号７３、配列番号８０、配列番号８１、配列番号８２、配列番号８３、配列番号８８、配列番号８９、配列番号９０、配列番号９１、配列番号９６、配列番号９７、配列番号９８、配列番号９９、配列番号１００、配列番号１０１、配列番号１０２、配列番号１０３、配列番号１０８、配列番号１０９、配列番号１１０、配列番号１１６、配列番号１１７、配列番号１４０、配列番号１４８、配列番号１４９、配列番号１５６、配列番号１５７、配列番号１６４、配列番号１６５、配列番号１６６、配列番号１６７、配列番号１７２、配列番号１７３及び配列番号１７４からなる群から選択されるいずれか１つのアミノ酸配列を含んでもよい。

本発明の他の側面によれば、前記ペプチドは、配列番号２、配列番号５、配列番号７、配列番号３６、配列番号３８、配列番号７３、配列番号７５、配列番号７８、配列番号１０７、配列番号１０９及び配列番号１７９からなる群から選択されるいずれか１つのアミノ酸配列を含んでもよい。

本発明の他の側面によれば、前記ペプチドは、配列番号２、配列番号３、配列番号３０、配列番号４１、配列番号１１２及び配列番号１１３からなる群から選択されるいずれか１つのアミノ酸配列を含んでもよい。

本発明の他の側面によれば、前記ペプチドは、配列番号３、配列番号４、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、配列番号４０、配列番号４３、配列番号４５、配列番号４６、配列番号４７、配列番号４８、配列番号５７、配列番号５８、配列番号６１、配列番号６４、配列番号６５、配列番号６６、配列番号６８、配列番号７０、配列番号７３、配列番号７４、配列番号７５、配列番号８２、配列番号８３、配列番号８７、配列番号８８、配列番号８９、配列番号９１、配列番号９３、配列番号９５、配列番号９６、配列番号９８、配列番号１０２、配列番号１０９、配列番号１１０、配列番号１１１、配列番号１１２、配列番号１１３、配列番号１１５、配列番号１１６、配列番号１１７、配列番号１１８、配列番号１１９、配列番号１２０、配列番号１２１、配列番号１２３、配列番号１２７、配列番号１２８、配列番号１３０、配列番号１３２、配列番号１３３、配列番号１３４、配列番号１３５、配列番号１３６、配列番号１４２、配列番号１４３、配列番号１４４、配列番号１４５、配列番号１４７、配列番号１４８、配列番号１４９、配列番号１５３、配列番号１５４、配列番号１５５、配列番号１５７、配列番号１５８、配列番号１６４、配列番号１６５、配列番号１６６、配列番号１６７、配列番号１７０、配列番号１７１、配列番号１７２、配列番号１７３、配列番号１７５、配列番号１７６、配列番号１７７、配列番号１７８及び配列番号１７９からなる群から選択されるいずれか１つのアミノ酸配列を含んでもよい。

本発明の他の側面によれば、前記ペプチドは、ヒトテロメラーゼに由来したものでもある。

本発明の一側面によれば、抗炎症活性を有するペプチドであって、配列番号２〜１７９のうち少なくとも１つのアミノ酸配列を含むペプチド、または前記アミノ酸配列と８０％以上の配列同一性を有するペプチド、または前記ペプチドの断片であるペプチドをコードするポリヌクレオチドが提供される。

本発明の他の側面によれば、前記ペプチドは、３０個以下のアミノ酸をコードするポリヌクレオチドでもある。例えば、前記断片は、２９、２８、２７、２６、２５、２４、２３、２２、２１、２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９または８個のアミノ酸から構成された断片でもある。前記ポリヌクレオチドの別の側面において、前記ペプチドが、配列番号２〜１７９のうちいずれか１つのアミノ酸配列からなるポリヌクレオチドでもある。

本発明の他の側面によるポリヌクレオチドは、前記ペプチドがヒトテロメラーゼに由来したものでもある。

本発明の一側面によれば、配列番号２〜１７９のうちいずれか１つのアミノ酸配列を含むペプチド、前記アミノ酸配列と８０％以上の配列相同性を有するペプチド、またはその断片であるペプチドを有効成分として含む抗炎症組成物が提供される。

本発明の他の側面による組成物において、前記ペプチドは、３０個以下のアミノ酸から構成されたものでもある（前記参照）。

本発明の他の側面による組成物において、前記ペプチドは、配列番号２〜１７９のうちいずれか１つのアミノ酸配列からなることでもある。

本発明の他の側面による組成物において、前記ペプチドは、ヒトテロメラーゼに由来したものでもある。

本発明の他の側面による組成物において、前記組成物は、炎症性疾患の治療用または予防用でもある。

本発明の他の側面による組成物において、前記組成物は、皮膚炎症の改善用または予防用の化粧料組成物でもある。

本発明の他の側面による組成物において、前記組成物は、炎症性疾患の治療または予防のための医薬組成物でもある。

本発明の他の側面による組成物において、前記組成物は、炎症の改善または予防のための食品組成物でもある。

本発明の他の側面による組成物で前記炎症性疾患は、（１）全身または局所の炎症疾患（例えば、アレルギー；免疫複合体疾患；枯草熱；過敏性ショック；耐毒素ショック；悪液質（cachexia）、異常高熱；肉芽腫症；または類肉腫症）；（２）胃腸管系疾患（例えば、虫垂炎；胃潰瘍；十二指腸潰瘍；腹膜炎；膵腸炎；潰瘍性、急性または虚血性の大腸炎；胆管炎；胆嚢炎、脂肪便症、肝炎、クローン病；またはウィップル病）；（３）皮膚関連疾患（例えば、乾癬；火傷；日焼け火傷；皮膚炎；蕁麻疹性のいぼまたは膨疹）；（４）心血管系疾患（例えば、血管炎；脈管炎；心内膜炎；動脈炎；粥状動脈硬化症；血栓静脈炎；心膜炎；鬱血性心不全；心筋炎；心筋虚血症；結節性動脈周囲炎；再発性狭窄症；バーガー氏病；またはリューマチ熱）；（５）呼吸器系疾患（例えば、喘息；喉頭蓋炎；気管支炎；肺気腫（emphysema）；鼻炎；嚢胞性纎維症；癲癇性肺炎；慢性閉鎖性疾患（ＣＯＰＤ）；成人呼吸障害症侯群；塵肺症；肺胞炎；細気管支炎；咽頭炎；肋膜炎；または副鼻腔炎）；（６）骨、関節、筋肉及び結合組織関連疾患（例えば、読み上げ算性肉芽種；関節炎；関節痛；骨髄炎；皮膚筋炎；筋膜炎；パジェット病；通風；歯周疾患；リューマチ性関節炎；重症筋無力症；強直性脊椎炎；または潤滑膜炎）；（７）泌尿生殖系疾患（例えば、副睾丸炎；膣炎；前立腺炎；または尿道炎）；（８）中枢または末梢神経系関連疾患（例えば、アルツハイマー病；髄膜炎；脳炎；多発性硬化症；脳梗塞；脳塞栓症；キラン・バレー症侯群（Guillain-Barre syndrome）；神経炎；神経痛；骨髄外傷；麻痺；またはぶどう膜炎）；（９）ウイルス（例えば、インフルエンザ；呼吸器細胞融合ウイルス；ＨＩＶ；Ｂ型肝炎ウイルス；Ｃ型肝炎ウイルスまたはヘルペスウイルス）感染疾患（例えば、デング熱；または敗血症（septicemia））、真菌感染疾患（例えば、カンジダ症）；またはバクテリア、寄生虫、および類似の微生物感染疾患（例えば、散在性菌血症；マラリア；糸状虫症；またはアメーバ症）；（１０）自己免疫性疾患（例えば、甲状腺炎；ループス；グッドパスチャー症侯群；同種移植拒否反応；移植片対宿主病；または糖尿病）；及び（１１）癌または腫瘍性疾患（例えば、ホジキン病）からなる群から選択されるものでもある。

本発明の一側面によれば、前記言及された抗炎症組成物を投与することを特徴とする炎症性疾患を予防または治療する方法が提供される。

本発明の一側面によれば、配列番号２〜１７９のうちいずれか一つ以上のアミノ酸配列を含むペプチド、前記アミノ酸配列と８０％以上の配列相同性を有するペプチド、またはその断片であるペプチド、またはそれを含む組成物；及びペプチド、またはそれを含む組成物の投与量、投与経路、投与回数及び適応症のうち一つ以上を開示した指示書；を含む炎症性疾患予防または治療用キットが提供される。

本発明による配列番号２〜１７９のうちいずれか１つの配列を有するペプチド、または前記配列と８０％の相同性を有する配列を有するペプチド、または断片であるペプチドは、優秀な炎症の予防効果または抑制効果を有する。従って、本発明のペプチドを含む組成物は、抗炎症効果のための医薬組成物または化粧料組成物として使用され、多様な炎症性疾患の治療及び予防に広く利用される。

ＰＢＭＣ由来モノサイトをＬＰＳ（１０ｎｇ／ｍｌ）で２時間刺激させた後、それぞれのペプチド、ＦＩＴＣ、ＦＩＴＣ−ＴＡＴ、ＰＥＰ１−ＦＩＴＣ及びＦＩＴＣ−ペプチドを２時間処理し、その細胞培養液で、ＴＮＦ−α ＥＬＩＳＡを行った結果を示したグラフである（＊＊Ｐ＜０．０１；陰性対照群との比較（ＦＩＴＣ及びＦＩＴＣ−ＴＡＴ））。ＨＥＫ２９３／null及びＨＥＫ２９３／ＴＬＲ２細胞株に、ＮＦ−ｋＢルシフェラーゼをトレンスフェクションし、リポプロテイン（１０ｎｇ／ｍｌ）、ＦＩＴＣ及びＦＩＴＣ−ＰＥＰ１（４μＭ）で処理して１８時間培養した後、ルシフェラーゼ分析を行った結果を示したグラフである（ルシフェラーゼ結果は、レニラ（renilla）で補正して得られたものである（＊＊Ｐ＜０．０１；陰性対照群（非治療群）及びリポプロテイン処理サンプルとの比較））。モノサイトに対するＴＮＦ−αの阻害効果についてスクリーニングした結果である。モノサイトに対するＴＮＦ−αの阻害効果についてスクリーニングした結果である。モノサイトに対するＴＮＦ−αの阻害効果についてスクリーニングした結果である。モノサイトに対するＴＮＦ−αの阻害効果についてスクリーニングした結果である。モノサイトに対するＴＮＦ−αの阻害効果についてスクリーニングした結果である。モノサイトに対するＴＮＦ−αの阻害効果についてスクリーニングした結果である。モノサイトに対するＴＮＦ−αの阻害効果についてスクリーニングした結果である。モノサイトに対するＴＮＦ−αの阻害効果についてスクリーニングした結果である。モノサイトに対するＴＮＦ−αの阻害効果についてスクリーニングした結果である。モノサイトに対するＴＮＦ−αの阻害効果についてスクリーニングした結果である。モノサイトに対するＴＮＦ−αの阻害効果についてスクリーニングした結果である。モノサイトに対するＴＮＦ−αの阻害効果についてスクリーニングした結果である。モノサイトに対するＴＮＦ−αの阻害効果についてスクリーニングした結果である。モノサイトに対するＴＮＦ−αの阻害効果についてスクリーニングした結果である。モノサイトに対するＴＮＦ−αの阻害効果についてスクリーニングした結果である。モノサイトに対するＴＮＦ−αの阻害効果についてスクリーニングした結果である。モノサイトに対するＴＮＦ−αの阻害効果についてスクリーニングした結果である。モノサイトに対するＴＮＦ−αの阻害効果についてスクリーニングした結果である。モノサイトに対するＴＮＦ−αの阻害効果についてスクリーニングした結果である。モノサイトに対するＴＮＦ−αの阻害効果についてスクリーニングした結果である。モノサイトに対するＴＮＦ−αの阻害効果についてスクリーニングした結果である。細胞株ＴＨＰ−１に対するＴＮＦ−αの阻害効果についてスクリーニングした結果である。細胞株ＴＨＰ−１に対するＴＮＦ−αの阻害効果についてスクリーニングした結果である。細胞株ＴＨＰ−１に対するＴＮＦ−αの阻害効果についてスクリーニングした結果である。細胞株ＴＨＰ−１に対するＴＮＦ−αの阻害効果についてスクリーニングした結果である。細胞株ＴＨＰ−１に対するＴＮＦ−αの阻害効果についてスクリーニングした結果である。細胞株ＴＨＰ−１に対するＴＮＦ−αの阻害効果についてスクリーニングした結果である。細胞株ＴＨＰ−１に対するＴＮＦ−αの阻害効果についてスクリーニングした結果である。細胞株ＴＨＰ−１に対するＴＮＦ−αの阻害効果についてスクリーニングした結果である。細胞株ＴＨＰ−１に対するＴＮＦ−αの阻害効果についてスクリーニングした結果である。細胞株ＴＨＰ−１に対するＴＮＦ−αの阻害効果についてスクリーニングした結果である。細胞株ＴＨＰ−１に対するＴＮＦ−αの阻害効果についてスクリーニングした結果である。細胞株ＴＨＰ−１に対するＴＮＦ−αの阻害効果についてスクリーニングした結果である。細胞株ＴＨＰ−１に対するＴＮＦ−αの阻害効果についてスクリーニングした結果である。細胞株ＴＨＰ−１に対するＴＮＦ−αの阻害効果についてスクリーニングした結果である。細胞株ＴＨＰ−１に対するＴＮＦ−αの阻害効果についてスクリーニングした結果である。細胞株ＴＨＰ−１に対するＴＮＦ−αの阻害効果についてスクリーニングした結果である。細胞株ＴＨＰ−１に対するＴＮＦ−αの阻害効果についてスクリーニングした結果である。細胞株ＴＨＰ−１に対するＴＮＦ−αの阻害効果についてスクリーニングした結果である。細胞株ＴＨＰ−１に対するＴＮＦ−αの阻害効果についてスクリーニングした結果である。細胞株ＴＨＰ−１に対するＴＮＦ−αの阻害効果についてスクリーニングした結果である。細胞株ＴＨＰ−１に対するＴＮＦ−αの阻害効果についてスクリーニングした結果である。細胞株ＴＨＰ−１に対するＴＮＦ−αの阻害効果についてスクリーニングした結果である。細胞株ＴＨＰ−１に対するＴＮＦ−αの阻害効果についてスクリーニングした結果である。それぞれ０，２．５，５．０，１０，４０μＭ濃度のベータアミロイドタンパク質で処理した神経幹細胞の生存力を示すグラフである。それぞれ０，２．５，５．０、１０，４０μＭ濃度のベータアミロイドタンパク質で処理した神経幹細胞の増殖を示すグラフである。それぞれ０，１，１０，５０，１００，２００μＭＰＥＰ１で処理した神経幹細胞の増殖を示すグラフである。それぞれ０，１，１０，５０，１００，２００μＭＰＥＰ１で処理した神経幹細胞の増殖を示すグラフである。２０μＭベータアミロイドタンパク質によって損傷された後、それぞれ異なる濃度のＰＥＰ１（１，１０，５０，１００μＭ）での処理後に測定された神経幹細胞の生存力を示すグラフである（対照群は、ベータアミロイドタンパク質とテロメラーゼ基盤ペプチドとで処理していない集団である）。２０μＭベータアミロイドタンパク質によって損傷された後、それぞれ異なる濃度のＰＥＰ１（１，１０，５０，１００μＭ）での処理後に測定された神経幹細胞の毒性を示すグラフである（対照群は、ベータアミロイドタンパク質とテロメラーゼ基盤ペプチドで処理しない集団である）。２０μＭベータアミロイドタンパク質によって損傷された後、それぞれ異なる濃度のＰＥＰ１（１，１０，５０，１００μＭ）での処理後に測定された神経幹細胞の増殖を示すグラフである（対照群は、ベータアミロイドタンパク質とテロメラーゼ基盤ペプチドとで処理していない集団である）。２０μＭベータアミロイドタンパク質によって損傷された後、それぞれ異なる濃度のＰＥＰ１（１，１０，５０，１００μＭ）での処理後に測定された神経幹細胞の移動を示すグラフである（対照群は、ベータアミロイドタンパク質とテロメラーゼ基盤ペプチドとで処理していない集団である）。２０μＭベータアミロイドタンパク質によって損傷された後、それぞれ異なる濃度のＰＥＰ１（１，１０，５０，１００μＭ）での処理後に測定された神経幹細胞のアポトーシスを示すグラフである（対照群は、ベータアミロイドタンパク質とテロメラーゼ基盤ペプチドとで処理していない集団である）。２０μＭベータアミロイドタンパク質によって損傷された後、それぞれ異なる濃度のＰＥＰ１（１，１０，５０，１００μＭ）での処理後に測定された損傷された神経幹細胞内ＰＥＰ１の活性酸素阻害効果を示すグラフである対照群は、ベータアミロイドタンパク質とテロメラーゼ基盤ペプチドとで処理していない集団である）。２０μＭベータアミロイドタンパク質によって損傷された後、それぞれ異なる濃度のＰＥＰ１（１，１０，５０μＭ）での処理後に測定され、（Ａ）２Ｄ−electrophoresisと、（Ｂ）Antibody Arrayとによって分析されたタンパク質発現程度の結果を示す図面である（対照群は、ベータアミロイドタンパク質とテロメラーゼ基盤ペプチドとで処理していない集団である）。炎症関連タンパク質の発現レベルを示すウェスタンブロットの結果を示す図面である（神経幹細胞は、２０μＭベータアミロイドタンパク質によって損傷された後、それぞれ異なる濃度のＰＥＰ１（１，１０，５０μＭ）で処理）。ベータアミロイドタンパク質凝集に影響を及ぼすＰＥＰ１の阻害効果を示す図面であり、（Ａ）は、１μＭベータアミロイドタンパク質とＰＥＰ１（０．１，１，１０μＭ）とが共に処理されたとき、ベータアミロイドタンパク質が減少したオリゴマー化を示し、（Ｂ）は、すでに凝集が誘導されたベータアミロイドタンパク質にＰＥＰ１を処理した場合を示す。ＰＩ３Ｋ抑制剤であるＬＹ２９４００２がＰＥＰ１で処理されたとき、細胞の生存力に及ぼす効果を示すグラフであり、細胞生存率は、ＰＥＰ１で処理された後で上昇し、ＬＹ２９４００２で処理後で低下した。細胞内ＨＭＧＢ１の蓄積を示す選択されたペプチドのウェスタンブロット分析結果である。細胞内ＨＭＧＢ１の蓄積を示す選択されたペプチドのウェスタンブロット分析結果である。細胞内ＨＭＧＢ１の蓄積を示す選択されたペプチドのウェスタンブロット分析結果である。細胞内ＨＭＧＢ１の蓄積を示す選択されたペプチドのウェスタンブロット分析結果である。細胞内ＨＭＧＢ１の蓄積を示す選択されたペプチドのウェスタンブロット分析結果である。細胞内ＨＭＧＢ１の蓄積を示す選択されたペプチドのウェスタンブロット分析結果である。細胞内ＨＭＧＢ１の蓄積を示す選択されたペプチドのウェスタンブロット分析結果である。細胞内ＨＭＧＢ１の蓄積を示す選択されたペプチドのウェスタンブロット分析結果である。細胞内ＨＭＧＢ１の蓄積を示す選択されたペプチドのウェスタンブロット分析結果である。細胞内ＨＭＧＢ１の蓄積を示す選択されたペプチドのウェスタンブロット分析結果である。細胞内ＨＭＧＢ１の蓄積を示す選択されたペプチドのウェスタンブロット分析結果である。細胞内ＨＭＧＢ１の蓄積を示す選択されたペプチドのウェスタンブロット分析結果である。細胞内ＨＭＧＢ１の蓄積を示す選択されたペプチドのウェスタンブロット分析結果である。細胞内ＨＭＧＢ１の蓄積を示す選択されたペプチドのウェスタンブロット分析結果である。細胞内ＨＭＧＢ１の蓄積を示す選択されたペプチドのウェスタンブロット分析結果である。細胞内ＨＭＧＢ１の蓄積を示す選択されたペプチドのウェスタンブロット分析結果である。細胞内ＨＭＧＢ１の蓄積を示す選択されたペプチドのウェスタンブロット分析結果である。細胞内ＨＭＧＢ１の蓄積を示す選択されたペプチドのウェスタンブロット分析結果である。細胞内ＨＭＧＢ１の蓄積を示す選択されたペプチドのウェスタンブロット分析結果である。細胞内ＨＭＧＢ１の蓄積を示す選択されたペプチドのウェスタンブロット分析結果である。細胞内ＨＭＧＢ１の蓄積を示す選択されたペプチドのウェスタンブロット分析結果である。細胞内ＨＭＧＢ１の蓄積を示す選択されたペプチドのウェスタンブロット分分析結果である。細胞内ＨＭＧＢ１の蓄積を示す選択されたペプチドのウェスタンブロット分析結果である。細胞内ＨＭＧＢ１の蓄積を示す選択されたペプチドのウェスタンブロット分析結果である。細胞内ＨＭＧＢ１の蓄積を示す選択されたペプチドのウェスタンブロット分析結果である。細胞内ＨＭＧＢ１の蓄積を示す選択されたペプチドのウェスタンブロット分析結果である。細胞内ＨＭＧＢ１の蓄積を示す選択されたペプチドのウェスタンブロット分析結果である。細胞内ＨＭＧＢ１の蓄積を示す選択されたペプチドのウェスタンブロット分析結果である。細胞内ＨＭＧＢ１の蓄積を示す選択されたペプチドのウェスタンブロット分析結果である。細胞内ＨＭＧＢ１の蓄積を示す選択されたペプチドのウェスタンブロット分析結果である。細胞内ＨＭＧＢ１の蓄積を示す選択されたペプチドのウェスタンブロット分析結果である。細胞内ＨＭＧＢ１の蓄積を示す選択されたペプチドのウェスタンブロット分析結果である。細胞内ＨＭＧＢ１の蓄積を示す選択されたペプチドのウェスタンブロット分分析結果である。細胞内ＨＭＧＢ１の蓄積を示す選択されたペプチドのウェスタンブロット分析結果である。細胞内ＨＭＧＢ１の蓄積を示す選択されたペプチドのウェスタンブロット分析結果である。細胞内ＨＭＧＢ１の蓄積を示す選択されたペプチドのウェスタンブロット分析結果である。細胞内ＨＭＧＢ１の蓄積を示す選択されたペプチドのウェスタンブロット分析結果である。細胞内ＨＭＧＢ１の蓄積を示す選択されたペプチドのウェスタンブロット分析結果である。細胞内ＨＭＧＢ１の蓄積を示す選択されたペプチドのウェスタンブロット分析結果である。細胞内ＨＭＧＢ１の蓄積を示す選択されたペプチドのウェスタンブロット分析結果である。細胞内ＨＭＧＢ１の蓄積を示す選択されたペプチドのウェスタンブロット分析結果である。細胞内ＨＭＧＢ１の蓄積を示す選択されたペプチドのウェスタンブロット分析結果である。細胞内ＨＭＧＢ１の蓄積を示す選択されたペプチドのウェスタンブロット分析結果である。細胞内ＨＭＧＢ１の蓄積を示す選択されたペプチドのウェスタンブロット分析結果である。細胞内ＨＭＧＢ１の蓄積を示す選択されたペプチドのウェスタンブロット分析結果である。細胞内ＨＭＧＢ１の蓄積を示す選択されたペプチドのウェスタンブロット分析結果である。細胞内ＨＭＧＢ１の蓄積を示す選択されたペプチドのウェスタンブロット分析結果である。細胞内ＨＭＧＢ１の蓄積を示す選択されたペプチドのウェスタンブロット分析結果である。細胞内ＨＭＧＢ１の蓄積を示す選択されたペプチドのウェスタンブロット分析結果である。細胞内ＨＭＧＢ１の蓄積を示す選択されたペプチドのウェスタンブロット分析結果である。細胞内ＨＭＧＢ１の蓄積を示す選択されたペプチドのウェスタンブロット分析結果である。細胞内ＨＭＧＢ１の蓄積を示す選択されたペプチドのウェスタンブロット分析結果である。細胞内ＨＭＧＢ１の蓄積を示す選択されたペプチドのウェスタンブロット分析結果である。細胞内ＨＭＧＢ１の蓄積を示す選択されたペプチドのウェスタンブロット分分析結果である。細胞内ＨＭＧＢ１の蓄積を示す選択されたペプチドのウェスタンブロット分析結果である。細胞内ＨＭＧＢ１の蓄積を示す選択されたペプチドのウェスタンブロット分析結果である。細胞内ＨＭＧＢ１の蓄積を示す選択されたペプチドのウェスタンブロット分析結果である。細胞内ＨＭＧＢ１の蓄積を示す選択されたペプチドのウェスタンブロット分析結果である。細胞内ＨＭＧＢ１の蓄積を示す選択されたペプチドのウェスタンブロット分析結果である。細胞内ＨＭＧＢ１の蓄積を示す選択されたペプチドのウェスタンブロット分析結果である。細胞内ＨＭＧＢ１の蓄積を示す選択されたペプチドのウェスタンブロット分析結果である。細胞内ＨＭＧＢ１の蓄積を示す選択されたペプチドのウェスタンブロット分析結果である。細胞内ＨＭＧＢ１の蓄積を示す選択されたペプチドのウェスタンブロット分析結果である。細胞内ＨＭＧＢ１の蓄積を示す選択されたペプチドのウェスタンブロット分析結果である。細胞内ＨＭＧＢ１の蓄積を示す選択されたペプチドのウェスタンブロット分分析結果である。細胞内ＨＭＧＢ１の蓄積を示す選択されたペプチドのウェスタンブロット分析結果である。細胞内ＨＭＧＢ１の蓄積を示す選択されたペプチドのウェスタンブロット分析結果である。細胞内ＨＭＧＢ１の蓄積を示す選択されたペプチドのウェスタンブロット分析結果である。細胞内ＨＭＧＢ１の蓄積を示す選択されたペプチドのウェスタンブロット分析結果である。細胞内ＨＭＧＢ１の蓄積を示す選択されたペプチドのウェスタンブロット分析結果である。細胞内ＨＭＧＢ１の蓄積を示す選択されたペプチドのウェスタンブロット分析結果である。細胞内ＨＭＧＢ１の蓄積を示す選択されたペプチドのウェスタンブロット分析結果である。細胞内ＨＭＧＢ１の蓄積を示す選択されたペプチドのウェスタンブロット分析結果である。細胞内ＨＭＧＢ１の蓄積を示す選択されたペプチドのウェスタンブロット分析結果である。細胞内ＨＭＧＢ１の蓄積を示す選択されたペプチドのウェスタンブロット分析結果である。細胞内ＨＭＧＢ１の蓄積を示す選択されたペプチドのウェスタンブロット分析結果である。細胞内ＨＭＧＢ１の蓄積を示す選択されたペプチドのウェスタンブロット分析結果である。細胞内ＨＭＧＢ１の蓄積を示す選択されたペプチドのウェスタンブロット分析結果である。細胞内ＨＭＧＢ１の蓄積を示す選択されたペプチドのウェスタンブロット分析結果である。細胞内ＨＭＧＢ１の蓄積を示す選択されたペプチドのウェスタンブロット分析結果である。細胞内ＨＭＧＢ１の蓄積を示す選択されたペプチドのウェスタンブロット分析結果である。細胞内ＨＭＧＢ１の蓄積を示す選択されたペプチドのウェスタンブロット分析結果である。細胞内ＨＭＧＢ１の蓄積を示す選択されたペプチドのウェスタンブロット分析結果である。細胞内ＨＭＧＢ１の蓄積を示す選択されたペプチドのウェスタンブロット分析結果である。細胞内ＨＭＧＢ１の蓄積を示す選択されたペプチドのウェスタンブロット分析結果である。細胞内ＨＭＧＢ１の蓄積を示す選択されたペプチドのウェスタンブロット分析結果である。細胞内ＨＭＧＢ１の蓄積を示す選択されたペプチドのウェスタンブロット分分析結果である。細胞内ＨＭＧＢ１の蓄積を示す選択されたペプチドのウェスタンブロット分析結果である。細胞内ＨＭＧＢ１の蓄積を示す選択されたペプチドのウェスタンブロット分析結果である。細胞内ＨＭＧＢ１の蓄積を示す選択されたペプチドのウェスタンブロット分析結果である。細胞内ＨＭＧＢ１の蓄積を示す選択されたペプチドのウェスタンブロット分析結果である。細胞内ＨＭＧＢ１の蓄積を示す選択されたペプチドのウェスタンブロット分析結果である。細胞内ＨＭＧＢ１の蓄積を示す選択されたペプチドのウェスタンブロット分析結果である。細胞内ＨＭＧＢ１の蓄積を示す選択されたペプチドのウェスタンブロット分析結果である。細胞内ＨＭＧＢ１の蓄積を示す選択されたペプチドのウェスタンブロット分析結果である。細胞内ＨＭＧＢ１の蓄積を示す選択されたペプチドのウェスタンブロット分析結果である。細胞内ＨＭＧＢ１の蓄積を示す選択されたペプチドのウェスタンブロット分析結果である。細胞内ＨＭＧＢ１の蓄積を示す選択されたペプチドのウェスタンブロット分分析結果である。細胞内ＨＭＧＢ１の蓄積を示す選択されたペプチドのウェスタンブロット分析結果である。

本発明は、多様な変換を加えることができ、さまざまな実施例を有するが、以下、本発明についてさらに具体的に説明する。しかし、それは、本発明を特定の実施形態について限定するものではなく、本発明の思想及び技術範囲に含まれる全ての変換、均等物ないし代替物を含むものであると理解されなければならない。本発明について説明するにあたり、関連公知技術に係わる具体的な説明が、本発明の要旨を不明確にすると判断される場合、その詳細な説明を省略する。

テロメア（telomere）は、染色体の末端に反復して存在する遺伝物質であり、当該染色体の損傷や、他の染色体との結合を防止すると知られている。細胞が分裂するたびに、テロメアの長さは少しずつ短くなるが、一定回数以上の細胞分裂があるば、テロメアは非常に短くなり、その細胞は、分裂を止めて死亡する。一方、テロメアを長くすれば、細胞の寿命が延長すると知られており、その例として、癌細胞では、テロメラーゼ（telomerase）という酵素が分泌し、テロメアが短くなることを防ぐために、癌細胞が死亡せず、続けて増殖可能であると知られている。本発明者らは、テロメラーゼに由来する数多くのペプチドが、抗炎活性を有するということを見出し、本発明を完成するに至った。

本発明の一側面によれば、抗炎症活性を有するペプチドであって、配列番号２〜１７９のうちいずれか一つ以上のアミノ酸配列を含むペプチド、前記アミノ酸配列と８０％以上の配列相同性を有するペプチド、またはその断片であるペプチドが提供される。

配列番号２〜配列番号１７９に記載されたペプチドは、下記表１の通りである。配列番号１８０は、ヒトテロメラーゼ全長タンパク質の配列である。配列番号１は、テロメラーゼに由来したペプチドであり、１６個アミノ酸から構成されたペプチドである。配列番号２〜配列番号７７のペプチドは、配列番号１の配列を含むペプチドである。配列番号７８〜配列番号１７９のペプチドは、配列番号１のペプチドの断片である。

下記表１の「名称」は、ペプチドを区別するために命名したものである。本発明の他の一側面によれば、配列番号２〜配列番号１７９に記載されたペプチドのうち一つ以上のペプチドは、テロメラーゼに含まれたペプチドのうち、当該位置のペプチドを選別して合成した「合成ペプチド」を含む。本明細書において「ｐｅｐ」というのは、配列番号２〜配列番号１７９のうちいずれか１つの配列を有するペプチド、またはその配列と８０％以上の配列相同性を有するペプチド、または前記配列の断片を総称する用語である。

本発明の一側面によれば、抗炎症活性を有するペプチドであって、配列番号２〜１７９のうちいずれか一つ以上のアミノ酸配列を含むペプチド、前記アミノ酸配列と８０％以上の配列相同性を有するペプチド、またはその断片であるペプチドをコードするポリヌクレオチドを提供する。前記ポリヌクレオチドを利用して、ペプチドを量産することができる。例えば、ペプチドをコードするポリヌクレオチドを含むベクターを宿主細胞に入れて培養することにより、ペプチドを量産することができる。

本明細書に開示されたペプチドは、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上の配列相同性を有するペプチドを含んでもよい。また、本明細書に開示されたペプチドは、配列番号１を含むペプチド、またはその断片と、１個以上のアミノ酸、２個以上のアミノ酸、３個以上のアミノ酸、４個以上のアミノ酸、５個以上のアミノ酸、６個以上のアミノ酸または７個以上のアミノ酸が変化されたペプチドと、を含んでもよい。

本明細書において「相同性（homology）」及び「配列同一性（sequence identity）」というのは、相互変換可能に使用され、それは、２個のアミノ酸（または、関連したものとして核酸）間で配列のオーバーラップ程度を示す。

本明細書において、ペプチドや核酸に対して「配列同一性」の用語使用にあたって特に使用していないとしても、配列の同一性は、（ｎ_ref−ｎ_dif）＊１００／ｎ_refを使用して計算され、前記計算式で、２つの配列を整列させ、最も多くの一致の数が出てきたとき、ｎ_difは、２つの配列間での、一致残基の総個数を、ｎ_refは、２つの配列において、短い配列の残基の総個数を意味する。例えば、ＤＮＡ配列ａｇｔｃａｇｔｃは、ａａｔｃａａｔｃの配列との配列同一性を前記式で求めれば、７５％である（ｎ_ref＝８、ｎ_dif＝２）。

本明細書の一側面で、配列の同一性は、従来公知の下記の方法で決定された：Smith and Waterman, 1981, Adv. Appl. Math. 2:482, by the search for similarity method of Pearson & Lipman, 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:2444, using the CLUSTAL W algorithm of Thompson et al., 1994, Nucleic Acids Res 22:467380, by computerized implementations of these algorithms (GAP, BESTFIT, FASTA, and TFASTA in the Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group). The BLAST algorithm (Altschul et al., 1990, Mol. Biol. 215:403-10) for which software may be obtained through the National Center for Biotechnology Information (www.ncbi.nlm.nih.gov/) may also be used. When using any of the aforementioned algorithms, the default parameters for "Window" length, gap penaltyなど。

本発明の一側面によれば、アミノ酸変化は、ペプチドの物理化学的特性を変更させる性質に属する。例えば、ペプチドの熱安定性を向上させ、基質特異性を変更させ、最適のｐＨを変化させるようなアミノ酸変化が行われる。

本発明の一側面によれば、配列番号２〜１７９のうちいずれか一つ以上のアミノ酸配列を含むペプチド、前記アミノ酸配列と８０％以上の配列相同性を有するペプチド、またはその断片であるペプチドは、３０個以下のアミノ酸から構成されてもよい。

本発明の一側面によれば、配列番号２〜１７９の配列を有するペプチド、配列番号２〜１７９配列の断片であるペプチド、または前記ペプチド配列と８０％以上の配列相同性を有するペプチドは、テロメラーゼ、具体的には、ヒト（Homo sapiens）テロメラーゼに由来したペプチドを含む。

本明細書において「アミノ酸」とは、自然にペプチドに統合される２２個の標準アミノ酸だけではなく、Ｄ−アイソマー及び変形されたアミノ酸を含む。それによって、本発明の一側面においてペプチドは、Ｄ−アミノ酸を含むペプチドでもある。一方、本発明の他の側面においてペプチドは、翻訳後変形（post-translational modification）された非標準アミノ酸などを含んでもよい。翻訳後変形の例は、リン酸化（phosphorylation）、糖化（glycosylation）、アシル化（acylation）（例えば、アセチル化（acetylation）、ミリストイル化（myristoylation）及びパルミトイル化（palmitoylation）を含む）、アルキル化（alkylation）、カルボキシル化（carboxylation）、ヒドロキシル化（hydroxylation）、糖化反応（glycation）、ビオチニル化（biotinylation）、ユビキチニル化（ubiquitinylation）、化学的性質の変化（例えば、ベータ除去タルイミド化、脱アミド化）及び構造的変化（例えば、二硫化物ブリッジの形成）を含む。また、ペプチドコンジュゲートを形成するための架橋剤（cross linker）との結合過程で起こる化学反応によって生ずるアミノ酸の変化、例えば、アミノ基、カルボン酸基または側鎖での変化のようなアミノ酸の変化を含む。

本明細書に開示されたペプチドは、自然そのままの供給源から同定及び分離された野生型ペプチドでもある。一方、本明細書に開示されたペプチドは、配列番号１の断片であるペプチドと比較し、一つ以上のアミノ酸が置換、欠失及び／または挿入されたアミノ酸配列を含む、人工変異体でもある。人工変異体でだけではなく、野生型ポリペプチドでのアミノ酸変化は、タンパク質のフォールディング（folding）及び／または活性に、有意の影響を及ぼさない保存性アミノ酸置換を含む。保存性置換の例としては、塩基性アミノ酸（アルギニン、リシン及びヒスチジン）、酸性アミノ酸（グルタミン酸及びアスパラギン酸）、極性アミノ酸（グルタミン及びアスパラギン）、疎水性アミノ酸（ロイシン、イソロイシン、バリン及びメチオニン）、芳香族アミノ酸（フェニルアラニン、トリプトファン及びチロシン）及び小アミノ酸（グリシン、アラニン、セリン及びトレオニン）の群の範囲内にある。一般的に、特異的活性を変更させないアミノ酸置換が本分野に公知されている。最も一般的に発生する交換は、Ａｌａ／Ｓｅｒ、Ｖａｌ／Ｉｌｅ、Ａｓｐ／Ｇｌｕ、Ｔｈｒ／Ｓｅｒ、Ａｌａ／Ｇｌｙ、Ａｌａ／Ｔｈｒ、Ｓｅｒ／Ａｓｎ、Ａｌａ／Ｖａｌ、Ｓｅｒ／Ｇｌｙ、Ｔｙｒ／Ｐｈｅ、Ａｌａ／Ｐｒｏ、Ｌｙｓ／Ａｒｇ、Ａｓｐ／Ａｓｎ、Ｌｅｕ／Ｉｌｅ、Ｌｅｕ／Ｖａｌ、Ａｌａ／Ｇｌｕ及びＡｓｐ／Ｇｌｙ、並びにそれらと反対であるものである。保存的置換の他の例は、下記表２の通りである。

ペプチドの生物学的特性における実在的な変形は、（ａ）置換領域内のポリペプチド骨格の構造、例えば、シートまたは螺旋立体構造の維持におけるそれらの効果、（ｂ）標的部位での前記分子の電荷または疎水性の維持におけるそれらの効果、または（ｃ）側鎖のバルク維持におけるそれらの効果が、相当に異なる置換部を選択することによって行われる。天然残基は、一般的な側鎖特性に基づいて、次のグループに区分される：

（１）疎水性：ノルロイシン、ｍｅｔ、ａｌａ、ｖａｌ、ｌｅｕ、ｉｌｅ；
（２）中性親水性：ｃｙｓ、ｓｅｒ、ｔｈｒ；
（３）酸性：ａｓｐ、ｇｌｕ；
（４）塩基性：ａｓｎ、ｇｌｎ、ｈｉｓ、ｌｙｓ、ａｒｇ；
（５）鎖方向に影響を及ぼす残基：ｇｌｙ、ｐｒｏ；及び
（６）芳香（族）性：ｔｒｐ、ｔｙｒ、ｐｈｅ。

非保存的置換は、それら部類のうち１つの構成員を、他の部類で交換することによって行われる。ペプチドの適当な立体構造の維持と関連がないいかなるシステイン残基も、一般的にセリンで置換され、前記分子の酸化的安定性を向上させ、異常な架橋結合を防止することができる。逆に言えば、システイン結合を、前記ペプチドに加え、その安定性を向上させることができる。

ペプチドの他の類型のアミノ酸変異体は、抗体のグリコシル化パターンが変化したもである。変化という意味は、ペプチドで発見された一つ以上の炭水化物残基の欠失、及び（または）ペプチド内に存在しない一つ以上のグリコシル化部位の付加を示す。

ペプチドのグリコシル化は、典型的に、Ｎ−連結されたり、あるいはＯ−連結されたものである。Ｎ−連結されたということは、炭水化物残基がアスパラギン残基の側鎖に付着したということをいう。トリペプチド配列であるアスパラギン−Ｘ−セリン及びアスパラギン−Ｘ−トレオニン（ここで、Ｘは、プロリンを除いた任意のアミノ酸である）は、炭水化物残基をアスパラギン側鎖に酵素的に付着させるための認識配列である。従って、それらトリペプチド配列のうち一つがポリペプチドに存在することにより、潜在的なグリコシル化部位が生成される。Ｏ−連結されたグリコシル化は、糖Ｎ−アセチルガラクトサミン、ガラクトースまたはキシロースのうち一つを、ヒドロキシアミノ酸に付着させることをいう。最も一般的には、セリンまたはトレオニンに付着させることを意味するが、５−ヒドロキシプロリンまたは５−ヒドロキシリシンを使用することもできる。

ペプチドへのグリコシル化部位の付加は、一つ以上の前述のトリペプチド配列を含むように、アミノ酸配列を変化させることによって便利に行われる（Ｎ−連結されたグリコシル化部位の場合）。そのような変化は、一つ以上のセリン残基またはトレオニン残基を、最初の抗体の配列に付加するか、あるいはそれら残基で置換することによってもなされる（Ｏ−連結されたグリコシル化部位の場合）。

本発明の一側面で、ポリヌクレオチドは、核酸分子であり、自然発生的または人工的なＤＮＡ分子またはＲＮＡ分子であり、一本鎖または二本鎖でもある。核酸分子は、一つ以上でもあるが、同一類型の（例えば、同一ヌクレオシド配列を有する）核酸分子、あるいは一つ以上のＤＮＡ、ｃＤＮＡ、decoy ＤＮＡ、ＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｓｔＲＮＡ、ｓｎｏＲＮＡ、ｓｎＲＮＡ、ＰＮＡ、アンチセンスオリゴマー（antisense oligomer）、プラスミド（plasmid）、及びそれ以外の変形された核酸のうち一つ、あるいは一つ以上を含むが、それらに制限されるものではない。

ＨＭＧＢ１タンパク質は、外部刺激によって核内に存在するＨＭＧＢ１タンパク質がアセチル化されて細胞質に移動していて、その後細胞外部に分泌されることによって、炎症誘発サイトカイン（cytokine）の役割を行うと知られている。そのように炎症がある場合、ＨＭＧＢ１タンパク質が細胞外部に分泌されるので、炎症性疾患であるチャーグ・ストラウス症侯群、リューマチ関節炎及びシェーグレン症候群の患者の血清は、正常人よりはるかく多くの量のＨＭＧＢ１タンパク質を有する。従って、炎症が誘発されるいかなる刺激が与えられても、細胞核内のＨＭＧＢ１タンパク質量が多ければ、それは、ＨＭＧＢ１タンパク質が細胞外部に分泌されていないということを意味するので、炎症が抑制されていると見られる。

本発明の一側面によれば、配列番号２〜配列番号１７９のうちいずれか一つ以上のアミノ酸配列を含むペプチド、前記アミノ酸配列と８０％以上の配列相同性を有するペプチド、またはその断片であるペプチドを細胞に処理したとき、細胞核内ＨＭＧＢ１タンパク質量が増加する。それは、前記ペプチドが優秀な炎症の予防効果または抑制効果を有するということを示す。

また、本発明の一側面によれば、配列番号２〜配列番号１７９のうちいずれか一つ以上のアミノ酸配列を含むペプチド、前記アミノ酸配列と８０％以上の配列相同性を有するペプチド、またはその断片であるペプチドは、細胞内毒性が低く、生体内可能性が高いという長所を有する。

本明細書において「炎症性疾患」は、炎症を主な原因にする疾患、または疾患によって炎症が発生する疾患など炎症と係わる疾患をいずれも含む広範囲な概念である。具体的には、炎症性疾患は、（１）全身または局所の炎症疾患（例えば、アレルギー；免疫複合体疾患；枯草熱；過敏性ショック；耐毒素ショック；悪液質（cachexia）、異常高熱；肉芽腫症；または類肉腫症）；（２）胃腸管系疾患（例えば、虫垂炎；胃潰瘍；十二指腸潰瘍；腹膜炎；膵腸炎；潰瘍性、急性または虚血性の大腸炎；胆管炎；胆嚢炎、脂肪便症、肝炎、クローン病；またはウィップル病）；（３）皮膚関連疾患（例えば、乾癬；火傷；日焼け火傷；皮膚炎；蕁麻疹性のいぼまたは膨疹）；（４）心血管系疾患（例えば、血管炎；脈管炎；心内膜炎；動脈炎；粥状動脈硬化症；血栓静脈炎；心膜炎；鬱血性心不全；心筋炎；心筋虚血症；結節性動脈周囲炎；再発性狭窄症；バーガー氏病；またはリューマチ熱）；（５）呼吸器系疾患（例えば、喘息；喉頭蓋炎；気管支炎；肺気腫（emphysema）；鼻炎；嚢胞性纎維症；癲癇性肺炎；慢性閉鎖性疾患（ＣＯＰＤ）；成人呼吸障害症侯群；塵肺症；肺胞炎；細気管支炎；咽頭炎；肋膜炎；または副鼻腔炎）；（６）骨、関節、筋肉及び結合組織関連疾患（例えば、好酸性肉芽種；関節炎；関節痛；骨髄炎；皮膚筋炎；筋膜炎；パジェット病；通風；歯周疾患；リューマチ性関節炎；重症筋無力症；強直性脊椎炎；または潤滑膜炎）；（７）泌尿生殖系疾患（例えば、副睾丸炎；膣炎；前立腺炎；または尿道炎）；（８）中枢または末梢神経系関連疾患（例えば、アルツハイマー病；髄膜炎；脳炎；多発性硬化症；脳梗塞；脳塞栓症；キラン・バレー症侯群（Guillain-Barre syndrome）；神経炎；神経痛；骨髄外傷；麻痺；またはぶどう膜炎）；（９）ウイルス（例えば、インフルエンザ；呼吸器細胞融合ウイルス；ＨＩＶ；Ｂ型肝炎ウイルス；Ｃ型肝炎ウイルスまたはヘルペスウイルス）、感染疾患（例えば、デング熱；または敗血症（septicemia））、真菌感染疾患（例えば、カンジダ症）；またはバクテリア、寄生虫、および類似の微生物感染疾患（例えば、散在性菌血症；マラリア；糸状虫症；またはアメーバ症）；（１０）自己免疫性疾患（例えば、甲状腺炎；ループス；グッドパスチャー症侯群；同種移植拒否反応；移植片対宿主病；または糖尿病）；または（１１）癌または腫瘍性疾患（例えば、ホジキン病）を含むが、それらに制限されるものではない。

そのような疾病の炎症性要素の治療は、数十年間、全世界製薬業界の最も重要な目標であり、数多くの有用な治療法が開発されてきた。その例としては、コルチコステロイド（プレドニソロン、メチルプレドニソロン、デキサメタゾン、ベタメタゾン、フルチカゾンなどを含み、コルチゾールの効果を模倣するように考案された多様な範囲の天然、半合成及び合成の製剤）、シクロオキシゲナーゼ抑制剤（インドメタシン、スルファサラジン及びアスピリンのように、非選択性またはｃｏｘ−１選択性、及びさらに最近のセレコキシブのように、ｃｏｘ−２選択性）、（モンテルカストのような）ロイコトリエン遮断製、及び（サリドマイドのような低分子ＴＮＦ−α合成抑制剤だけではなく、インフリキシマブ（Remicade^TM）及びアダリムマブ（Humira^Tm）を含む改良モノクローナル中和抗体、エタネルセプト（Enbrel^TM）のようなＴＮＦ受容体融合タンパク質のような）抗ＴＮＦを含む。

本発明の一側面によれば、配列番号２〜１７９のうちいずれか一つ以上のアミノ酸配列を含むペプチド、前記アミノ酸配列と８０％以上の配列相同性を有するペプチド、またはその断片であるペプチドを有効成分として含む抗炎組成物を提供する。

本発明の一側面による抗炎組成物は、配列番号２〜１７９のうちいずれか一つ以上のアミノ酸配列を含むペプチド、前記アミノ酸配列と８０％以上の配列相同性を有するペプチド、またはその断片であるペプチドを０．１μｇ／ｍｇ〜１ｍｇ／ｍｇ、具体的には１μｇ／ｍｇ〜０．５ｍｇ／ｍｇ、さらに具体的には１０μｇ／ｍｇ〜０．１ｍｇ／ｍｇの含量で含んでもよい。前記範囲で含む場合、本発明の意図した効果を示すのに適切なだけではなく、組成物の安定性及び安全性をいずれも満足することができ、コスト対比効果の側面で、も前記範囲で含むことが適切である。

本発明の一側面による組成物は、ヒト、犬、ニワトリ、豚、牛、羊、ギニアピッグまたは猿を含む全ての動物に適用されてもよい。

本発明の一側面による組成物は、配列番号２〜１７９からなる群から選択される配列を有するペプチド、配列番号１の配列の断片であるペプチド、または前記ペプチド配列と８０％以上の配列相同性を有するペプチドを有効成分として含む炎症性疾患の治療用または予防用の医薬組成物を提供する。本発明の一側面による医薬組成物は、経口、直腸、経皮、静脈内、筋肉内、腹腔内、骨髄内、硬膜内または皮下などに投与されてもよい。

経口投与のための剤形は、錠剤、丸剤、軟質または硬質のカプセル剤、顆粒剤、散剤、液剤または乳濁剤でもあるが、それらに制限されるものではない。非経口投与のための剤形は、注射剤、点滴剤、ローション、軟膏、ゲル、クリーム、懸濁液剤、乳剤、坐剤、パッチまたは噴霧剤でもあるが、それらに制限されるものではない。

本発明の一側面による医薬組成物は、必要によっては、希釈剤、賦形剤、滑沢剤、結合剤、崩壊剤、緩衝剤、分散剤、界面活性剤、着色剤、香料または甘味剤などの添加剤を含んでもよい。本発明の一側面による医薬組成物は、当業界の一般的な方法によって製造されてもよい。

本発明の一側面による医薬組成物の有効成分は、投与される対象の年齢、性別、体重、病理状態及びその深刻度、投与経路、または処方者の判断によって異なる。そのような因子に基づいた適用量決定は、当業者のレベル内にあり、その１日投与用量は、例えば、０．１μｇ／ｋｇ／日〜１ｇ／ｋｇ／日、具体的には１μｇ／ｋｇ／日〜１０ｍｇ／ｋｇ／日、さらに具体的には１０μｇ／ｋｇ／日〜１ｍｇ／ｋｇ／日、一層具体的には５０μｇ／ｋｇ／日〜１００μｇ／ｋｇ／日になるが、それらに制限されるものではない。本発明の一側面による医薬組成物は、１日１回〜３回投与されるが、それに制限されるものではない。

本発明の一側面によれば、配列番号２〜１７９のうちいずれか一つ以上のアミノ酸配列を含むペプチド、前記アミノ酸配列と８０％以上の配列相同性を有するペプチド、またはその断片であるペプチドを有効成分として含む皮膚炎症の改善用または予防用の皮膚外用剤組成物を提供する。

本発明の他の側面によれば、配列番号２〜１７９のうちいずれか一つ以上のアミノ酸配列を含むペプチド、前記アミノ酸配列と８０％以上の配列相同性を有するペプチド、またはその断片であるペプチドを有効成分として含む皮膚炎症の改善用または予防用の化粧品組成物を提供する。

本発明の一側面による皮膚外用剤組成物または化粧品組成物は、局所適用に適する全ての剤形に提供されてもよい。例えば、溶液、水相に油相を分散させて得たエマルジョン、油相に水相を分散させて得たエマルジョン、懸濁液、固体、ゲル、粉末、ペースト、泡沫（foam）またはエアロゾールの剤形で提供されてもよい。そのような剤形は、当該分野の一般的な方法によって製造されてもよい。

本発明の一側面による化粧品組成物は、主効果を損傷させない範囲内で、望ましくは、主効果に相乗効果を与えることができる他の成分を含んでもよい。また、本発明の一側面による化粧品組成物は、保湿剤、エモリエント剤、界面活性剤、紫外線吸収剤、防腐剤、殺菌剤、酸化防止剤、ｐＨ調整剤、有機または無機の顔料、香料、冷感剤または制汗剤をさらに含んでもよい。前記成分の配合量は、本発明の目的及び効果を損傷させない範囲内で、当業者が容易に選定可能であり、その配合量は、化粧品組成物全体重量を基準に、０．０１〜５重量％、具体的には０．０１〜３重量％でもある。

本発明の一側面による組成物は、配列番号２〜１７９からなる群から選択される配列を有するペプチド、前記ペプチド配列と８０％以上の配列相同性を有するペプチド、あるいはその断片であるペプチドを有効成分として含む炎症予防用または抑制用の食品組成物を提供する。

本発明の一側面による食品組成物の剤形は、特別に限定されるものではないが、例えば、錠剤、顆粒剤、粉末剤、液剤、固形製剤などで剤形化にもなる。各剤形は、有効成分以外に、当該分野で一般的に使用される成分を剤形または使用目的によって、当業者が困難なしに、適宜選定して配合することができ、他の原料と同時に適用する場合、相乗効果が起こるのである。

前記有効成分の投与量決定は、当業者のレベル内にあり、その１日投与用量は、例えば、１μｇ／ｋｇ／日〜１０ｍｇ／ｋｇ／日、さらに具体的には１０μｇ／ｋｇ／日〜１ｍｇ／ｋｇ／日、一層具体的には５０μｇ／ｋｇ／日〜１００μｇ／ｋｇ／日にもなるが、それらに制限されるものではなく、投与する対象の年齢、健康状態、合併症など多様な要因によって異なる。

本発明の一側面によれば、配列番号２〜１７９のうちいずれか一つ以上のアミノ酸配列を含むペプチド、前記アミノ酸配列と８０％以上の配列相同性を有するペプチド、またはその断片であるペプチドの炎症性疾患の予防用途または治療用途を提供する。

本発明の一側面によれば、ペプチドを前記患者に提供することにより、炎症性疾患を予防または治療する方法が提供される。

本発明の一側面によれば、配列番号２〜１７９のうちいずれか一つ以上のアミノ酸配列を含むペプチド、前記アミノ酸配列と８０％以上の配列相同性を有するペプチド、またはその断片であるペプチドまたはそれを含む組成物；及びペプチドまたはそれを含む組成物の投与量、投与経路、投与回数及び適応症のうち一つ以上を開示した指示書；を含む炎症性疾患の予防用または治療用のキットを提供する。

本明細書で使用された用語は、特定具体例について説明するための目的のみに意図されたものであり、本発明を限定する意図ではない。名詞の前に個数が省略された用語は、数量を制限するものではなく、言及された名詞物品が一つ以上存在するということを示すものである。用語「含む」、「有する」、「なる」及び「構成する」は、開かれた用語と解釈される（すなわち、「含むが、それに限定されるものではない」という意味）。

数値の範囲を言及したのは、ただその範囲内に属するそれぞれの別個の数値を個別的に言及することの代わりとする容易な方法だからであり、そうではないということが明示されていない限り、各別個の数値は、まさに個別的に明細書に言及されているように本明細書に統合される。全ての範囲の終値は、その範囲内に含まれ、独立して組み合わせ可能である。

本明細書に言及された全ての方法は、異なって明示されているか、あるいは文脈によって明白に矛盾しない限り、適切な手順で遂行されてもよい。ある一実施例及び全ての実施例、または例示的言語（例えば、「〜のような」）を使用するのは、特許請求の範囲に含まれていない限り、単に本発明をさらに良好に記述するためであり、本発明の範囲を制限するものではない。明細書のいかなる言語も、いかなる非請求の構成要素を、本発明の実施に必須なものであると解釈されてはならない。取り立てての定義がない限り、本明細書に使用される技術的及び科学的な用語は、本発明が属する技術分野で当業者によって、通常理解されるような意味を有する。

本発明の望ましい具体例は、本発明を遂行するために、発明者に知られた最適のモードを含む。望ましい具体例の変動は、先行記載を読めば、当業者に明白になるであろう。本発明者らは、当業者がかような変動を適切に利用することを期待し、本明細書に記載されたところと異なる方式で本発明が実施されることを期待する。従って、本発明は、特許法によって許容されるように、添付された特許請求の範囲で言及された発明の要旨の均等物及び全ての変形を含む。さらに、全ての可能な変動内で、前述の構成要素のいかなる組み合わせでも、ここで反対に明示するか、あるいは文脈上明白に矛盾しない限り、本発明に含まれるものである。本発明は、例示的な具体例を参照し、具体的に示されて記述されたが、当業者であるならば、特許請求の範囲によって定義される発明の精神及び範囲を外れずとも、形態及びディテールにおいて、多様な変化が行われるということを十分に理解するであろう。

腫瘍懐死因子（ＴＮＦ）、特にＴＮＦ−αは、炎症性細胞から放出され、多彩な細胞毒性反応、免疫反応及び炎症反応を起こすと知られている。ＴＮＦ−αは、多くの炎症疾患及び自己免疫疾患の発症や遷延化に関与し、また血液中に放出されて全身に作用すれば、重症の敗血症及び敗血症性ショックを起こということが知られている。そのようにＴＮＦ−αは、生体の免疫系に広範囲に関連する因子であるために、ＴＮＦ−αを抑制する薬剤の開発が活発に実施されている。ＴＮＦ−αは、不活性型に生合成され、プロテアーゼによって切断されて活性型になるが、その活性化に関与する酵素は、腫瘍懐死因子変換酵素（ＴＡＣＥ）と呼ばれている。従って、そのＴＡＣＥを阻害する物質は、ＴＮＦ−αから起因する疾患、病態、異常状態、状態が不良、不良な自覚症状などを治療、改善、予防することができる。

ＨＭＧＢ１（high-mobility group box １）タンパク質は、胸腺、リンパ節、睾丸、胎児の肝臓などで高い濃度で存在し、肝細胞と脳細胞とを除けば、ほとんどの細胞では、主に核内に存在する。そのような前記ＨＭＧＢ１タンパク質は、Ａ−box、Ｂ−box、Ｃ−terminalから構成された３個のドメイン（domain）を有している。

ＨＭＧＢ１タンパク質が炎症を誘発するサイトカインの役割を行うということは、１９９９年、Traceyらによって報告され、前記ＨＭＧＢ１の炎症誘発メカニズムは、外部刺激によって、核内に存在するＨＭＧＢ１がアセチル化された後に細胞質に移動する。その後、細胞外に分泌されるか、あるいは懐死に陥った細胞から外部に分泌されると知られている（Bonaldi Ｔｅｔａｌ．，ＥＭＢＯＪ、（２２）５５５１−６０，２００３）。

以下、実施例及び実験例を挙げ、本発明の構成及び効果についてさらに具体的に説明する。しかし、下記実施例及び実験例は、本発明の理解の一助とするために、例示の目的にのみ提供されたものであり、本発明の範疇及び範囲がそれらによって制限されるものではない。

実施例１：ＰＥＰ１（配列番号１）の合成及び抗炎活性測定
実験例１：ＰＥＰ１（配列番号１）の合成
ヒトテロメラーゼから選別された下記配列ＳＥＱＩＤ：１（ＰＥＰ１）を有する下記化学構造１を有する１６個のアミノ酸から構成されたペプチドを合成した。

配列番号１のペプチド（ＰＥＰ１）は、従来公知の固相ペプチド合成法によって製造することができた。具体的には、ペプチドは、ＡＳＰ４８Ｓ（Peptron、Ｉｎｃ．，大韓民国大田所在）を利用して、Ｆｍｏｃ固相合成法（ＳＰＰＳ：solid phase peptide synthesis）を介して、Ｃ−末端からアミノ酸を一つずつカップリングすることによって合成した。次のように、ペプチドのＣ−末端の最初のアミノ酸が樹脂に付着したものを使用した。例えば、次の通りである：

ＮＨ₂−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−２−chloro−Trityl Resin
ＮＨ₂−Ａｌａ−２−chloro−Trityl Resin
ＮＨ₂−Ａｒｇ（Ｐｂｆ）−２−chloro−Trityl Resin

ペプチド合成に使用した全てのアミノ酸原料は、Ｎ−termがＦｍｏｃによって保護され、残基は、いずれも酸で除去されるＴｒｔ、Ｂｏｃ、ｔ−Ｂｕ（ｔ−butylester）、Ｐｂｆ（２，２，４，６，７−pentamethyl dihydro−benzofuran−５−sulfonyl）などによって保護されたものを使用した。例えば、次の通りである：

Ｆｍｏｃ−Ａｌａ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ａｒｇ（Ｐｂｆ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｐｒｏ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｌｅｕ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｉｌｅ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｐｈｅ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｔｈｒ（ｔＢｕ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｎ（Ｔｒｔ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｔｒｐ（Ｂｏｃ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｍｅｔ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ａｓｎ（Ｔｒｔ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｔｙｒ（ｔＢｕ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ａｈｘ−ＯＨ、Ｔｒｔ−Mercaptoaceticacid

カップリング試薬（coupling reagent）としては、ＨＢＴＵ［２−（１Ｈ−Benzotriazole−１−yl）−１，１，３，３−tetamethylaminium hexafluorophosphate］／ＨＯＢｔ［Ｎ−Hydroxxybenzotriazole］／ＮＭＭ［４−Methylmorpholine］を使用した。Ｆｍｏｃ除去は、２０％のＤＭＦ中のピペリジン（piperidine in ＤＭＦ）を利用した。合成されたペプチドをResinから分離し、残基の保護基を除去するためには、切断カクテル（cleavage cocktail）［ＴＦＡ（trifluoroacetic acid）／ＴＩＳ（triisopropylsilane）／ＥＤＴ（ethanedithiol）／Ｈ₂Ｏ＝９２．５／２．５／２．５／２．５］を使用した。

アミノ酸保護基が結合された出発アミノ酸が固相支持体に結合されている状態を利用して、ここに当該アミノ酸をそれぞれ反応させ、溶媒で洗浄した後、脱保護する過程を反復することにより、各ペプチドを合成した。合成されたペプチドを樹脂から切り取った後、ＨＰＬでに精製し、合成いかんをＭＳで確認して凍結乾燥させた。

ＰＥＰ１の具体的な合成過程について説明すれば、次の通りである。
１）カップリング
ＮＨ₂−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−２−chloro−Trityl Resinに保護されたアミノ酸（８当量）と、カップリング試薬ＨＢＴＵ（８当量）／ＨＯＢｔ（８当量）／ＮＭＭ（１６当量）とをＤＭＦに溶解させて添加した後、常温で２時間反応させ、ＤＭＦ、ＭｅＯＨ、ＤＭＦの順に洗浄した。

２）Ｆｍｏｃ脱保護
２０％のＤＭＦ中のピペリジン（piperidine in ＤＭＦ）を加え、常温で５分間２回反応させ、ＤＭＦ、ＭｅＯＨ、ＤＭＦの順に洗浄した。

３）１及び２の反応を反復して行い、ペプチド基本骨格ＮＨ₂−Ｅ（ＯｔＢｕ）−Ａ−Ｒ（Ｐｂｆ）−Ｐ−Ａ−Ｌ−Ｌ−Ｔ（ｔＢｕ）−Ｓ（ｔＢｕ）−Ｒ（Ｐｂｆ）Ｌ−Ｒ（Ｐｂｆ）−Ｆ−Ｉ−Ｐ−Ｋ（Ｂｏｃ）−２−chloro−Trityl Resin）を作った。

４）切断（cleavage）：合成が完了したペプチドResinに、切断カクテル（cleavage cocktail）を加え、ペプチドをレジンから分離した。

５）得られた混合物（mixture）に、cooling diethyl etherを加えた後、遠心分離して得られたペプチドを沈澱させる。

６）Ｐｒｅｐ−ＨＰＬＣで精製した後、ＬＣ／ＭＳで分子量を確認して凍結させ、パウダーに製造した。

実験例２：ＰＥＰ１の抗炎症活性測定
細胞株培養
韓国細胞株銀行から分譲されたRaw ２６４．７macrophage cell（ＫＣＢＬ、４００７１）は、１０％feta lbovine serum（ＦＢＳ；Gibco Laboratories）と、１００unit／ｍＬのstreptomycin及びpenicillin（Gibco Laboratories）が添加されたDulbecco’s modified Eagle’s medium（ＤＭＥＭ；ＰＡＡ，Austria）培地を使用して、１×１０⁶細胞／ｍｌに調節した後、９６ウェルプレートに接種し、３７゜Ｃ、５％ＣＯ²の条件で前培養した。

翌日、培地を除去し、新たな培地に代替し、実験例１を介して得られたペプチド試料を５μｇ／ｍＬ細胞に加えた。３０分間ＣＯ₂インキュベータで培養した後、５０μｌのＬＰＳ（最終濃度１μｇ／ｍｌ）を含んだ培地を処理し、インキュベータ（５％ＣＯ₂、３７℃）で２４時間培養した。炎症反応モデルは、各ウェル当たり１μｇ／ｍＬリポ多糖（ＬＰＳ：lipopolysaccharide；Sigma，ＵＳＡ）を処理し、対照群は、フォスフェリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ；ｐＨ７．２）処理を行った。ＬＰＳ処理モデル及び対照群から得たそれぞれの細胞培養液は、追加分析のために、エペンドルフチューブ（eppendorf tube）に入れて保管した。

実験２−１．酸化窒素（ＮＯ）分析
酸化窒素の定量は、Raw ２６４．７細胞（１×１０⁶細胞／ｍｌ）を利用して、グリース反応液システム（Griess reagent system；Promega，ＵＳＡ）を使用して測定する方法を使用した。９６−ウェルプレートに培養液５０μｌを入れ、グリース反応液Ｉ（ナフチルエチレンジアミド（ＮＥＤ）溶液）及びグリース反応液ＩＩ（スルファニルアミド溶液）を同量で混合して入れ、１０分間の反応後、３０分以内に、マイクロプレートリーダー（Molecular Devices，ＵＳＡ）を利用して、光学密度５４０ｎｍで測定した。酸化窒素（ＮＯ）の濃度は、亜硝酸ナトリウムの標準曲線（０〜１００μＭ）を利用して計算した。

下記表３に示されているように、ＬＰＳは、ＮＯの生成を増加させたが、ＬＰＳとペプチドＰＥＰ１とを同時に処理した場合、ＮＯ生成量が減少するということを確認することができた。特に、ＰＥＰ１を処理した場合には、炎症の誘発時に生成されるＮＯの生成量が６５％減少したと推し量るとき、炎症誘発が抑制されたということが分かった。

実験２−２．サイトカイン生成抑制効果の分析
ＰＥＰ１の炎症性サイトカイン生成抑制効果を調査するために、RAW ２６４．７cellを、ヒトテロメラーゼ由来ＰＥＰ１５μｇ／ｍＬ濃度でまず処理した後、ＬＰＳ１μｇ／ｍＬ濃度で処理し、２４時間さらに培養した。細胞培養液（culture medium）を含む上澄み液サンプルを採集し、ＥＬＩＳＡキット（ｅBioscience，San Diego）を使用して、サイトカインレベルを分析した。

９６−ウェルプレートは、１００μｌのキャプチャ抗体（capture antibodies；製造社のプロトコルによる推薦濃度によってなるコーティングバッファに溶解されたもの）でコーティングされ、４℃で一晩反応させた。そして、プレートを５回洗浄した後、２００μｌのアッセイ希釈液（diluents）を各ウェルに添加し、ブロッキングの間、室温で１時間反応させた。各ウェルをウォッシュバッファで５回洗浄した後、細胞培養液サンプル、または各サイトカイン標準タンパク質サンプルは希釈され、１００μｌずつ各ウェルに添加された。サンプルを含んだプレートは、４℃で一晩反応させた。その後、プレートをウォッシュバッファで５回洗浄した後、１００μｌの二次抗体と、アビジン（avidin）の接合体（conjugate）とを添加し、室温で１時間反応させた。

二次抗体と共に反応させた後、プレートを５回洗浄し、１００μｌのアビジン−ＨＲＰ（ＢＤ Bioscience）と共に、３０分間室温で反応させた。プレートを７回洗浄した後、１００μｌのＴＭＢ溶液（Pierce）を添加し、１５分間室温で反応させた。反応は、各ウェルに、５０μｌの２Ｎ硫酸（Ｈ₂ＳＯ₄）を添加することによって終了した。４５０ｎｍで、光学密度が、マイクロプレートリーダー（reader）を使用して測定された。統計学的分析は、ＳＰＳＳプログラムのＡＮＯＶＡプロシージャを使用して、変量分析で実施され、分析間の有意点は、Duncan’s multiple range testを使用して検証された。

実験２−３：ＩＬ−６分泌測定
下記表４に示されているように、ＬＰＳは、サイトカインＩＬ−６（interleukin−６）の分泌を増加させたが、ＬＰＳ及びＰＥＰ１を同時に処理した場合、炎症関連サイトカインＩＬ−６の分泌量が減少するということを確認するということができた。特に、ＰＥＰ１を処理した場合には、炎症誘発関連サイトカインの分泌量を７０％以上減少させ、すぐれた抗炎活性を示した。

実験２−４：ＨＭＧＢ１、ＴＮＦ−α、ＣＯＸ−２の発現抑制能測定
タンパク質発現の分析は、ウェスタンブロット分析（Western blot analysis）によって行ったが、ヒトテロメラーゼ由来ペプチドが処理された培地で育った細胞をＰＢＳで洗浄し、０．０５％トリプシン−ＥＤＴＡを処理した後、遠心分離を行って細胞を集めた。そのように集められた細胞に、適量のリシスバッファで溶解させた後、細胞内残渣物を分離させ、同量のタンパク質をＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動で分離した。分離されたタンパク質を、ニトロセルロース膜（nitrocellulose membrane；Schleicherand Schuell，Keene，ＮＨ，ＵＳＡ）に転移させた後、特定タンパク質に対する抗体と、それに対する二次抗体との反応を実施した後、ＥＣＬ（enhanced chemiluminoesence）溶液（Amersham Life Science Ｃｏｒｐ．，Arlington Heights，ＩＬ，ＵＳＡ）を適用させた後、Ｘ線フィルムに感光させ、タンパク質の発現程度を分析した。

ＮＯ生成抑制メカニズムであるＴＮＦ−αと、ＣＯＸ−２タンパク質との関連性を確認するために、ウェスタンブロットを介して、発現量を測定した結果、下記表５に示されているように、ＬＰＳは、サイトカインＨＭＧＢ１、ＴＮＦ−α、ＣＯＸの発現を増加させたが、ＬＰＳ及びＰＥＰ１を同時に処理した場合、炎症関連タンパク質の発現量が減少するということを確認することができた。特に、本発明のＰＥＰ１を処理した場合には、炎症誘発関連サイトカインタンパク質の発現量を７０％以上減少させ、すぐれた抗炎活性を示した。

実験例３：ＰＥＰ１の肝臓癌細胞株でのＴＮＦα阻害活性検証
実験例３−１：細胞株培養
健常者から血液を採血（５０ｍｌ）した後、Ficoll−Paque^TM ＰＬＵＳ（ＧＥ Healthcare Life Sciences，Piscataway，ＮＪ，ＵＳＡ）を使用して、ＰＢＭＣ（peripheral blood mononuclear cell）層を回収した。回収されたＰＢＭＣは、ヒト血清（２０％）が添加されたＲＰＭＩ１６４０培地（Invitrogen／Life Technologies，Carlsbad，ＣＡ，ＵＳＡ）で富化させ、３０分ほどヒト血清をコーティングした１００−ｍｍポリスチレン細胞培養プレートに移し、２時間３７℃、５％ＣＯ₂インキュベータで培養した。その後、細胞培養プレートの底に付着したモノサイトを、冷たいＰＢＳ（Phosphate Buffered Saline）（Gibco／Life Technologies，Carlsbad，ＣＡ，ＵＳＡ）で引き離した後、９６ウェルプレートに、ウェル当たり１×１０⁵セルになるように、ＲＰＭＩ１６４０培地（supplemented with penicillin-streptomycin；１００ｍｇ／ｍｌ、human serum；２０％）で実験前日に培養した。

また、ＴＬＲ２（toll-like receptor ２）が安定して発現されるＨＥＫ２９３（human embryonic kidney ２９３）細胞株（ＨＥＫ２９３／ＴＬＲ２）と、一般的なＨＥＫ２９３（ＨＥＫ２９３／null）細胞株とをソウル大学校歯科大学院から分譲してもらい、ルシフェラーゼ（luciferase）分析に使用した。ＨＥＫ２９３／nullとＨＥＫ２９３／ＴＬＲ２細胞株は、ルシフェラーゼ分析実験前日に、１２ウェルプレートに、ウェル当たり２．５×１０⁵セルになるように、ＤＭＥＭ（Dulbecco’s modified Eagle’s medium）培地（supplemented with blasticidin；１０μｇ／ｍｌ、fetal bovine serum；１０％）（Invitrogen／Life Technologies，Carlsbad，ＣＡ，ＵＳＡ）で富化させて実験前日培養した。

実験例３−２：サイトカインアッセイ（Cytokine assay）
ＰＥＰ１がＴＮＦ−αのタンパク質発現程度に、いかなる影響を及ぼすかということを調べるために、ＥＬＩＳＡ（enzyme linked immunosorbent assay）実験を行った。ＰＢＭＣに由来したモノサイトを、９６ウェルプレートに、ウェル当たり１×１０⁵セルになるように実験前日に培養させた。その後、ＬＰＳ（lipopolysaccharide；１０ｎｇ／ｍｌ、Sigma）を２時間処理し、ＰＢＳで３回洗浄した。ＯＰＴＩ−ＭＥＭ培地（Invitrogen／Life Technologies，Carlsbad，ＣＡ，ＵＳＡ）を入れ、１時間飢餓状態処理（starvation）した後、ＦＩＴＣ（Fluorescein Isothiocyanate）、ＦＩＴＣ−ＴＡＴ、ＰＥＰ１−ＦＩＴＣ及びＦＩＴＣ−ＰＥＰ１の４μＭで処理し、ＴＮＦ−αレベル測定前に２時間培養した。培養が終了した後、細胞培養液を集め、ＥＬＩＳＡ（Ｒ＆Ｄ，Minneapolis，ＭＮ，ＵＳＡ）キットマニュアルによってＴＮＦ−αを定量した。具体的な定量方法は、次の通りである。

ＴＮＦ測定は、サンドイッチ（sandwich）ＥＬＩＳＡ法を利用する。あらかじめコーティングされている９６ウェルプレートに、ＴＮＦα一次抗体（primary antibody）を１００μｌずつ入れ、４℃で前日に培養する。翌日、０．５％tween ２０ウォッシュ溶液で、５分ずつ３回洗浄した後、測定するサンプルと標準溶液とを１００μｌずつ入れ、２時間常温で反応させる。前述のようにプレート洗浄した後、ＨＲＰ結合された検出用二次抗体を、各１００μｌずつ入れ、２時間常温で反応させる。その後、さらにプレート洗浄し、avidin／biotinを添加して発色させ、吸光度を測定する。標準溶液の吸光度を利用して標準曲線を求め、それを利用して、各サンプルのＴＮＦ−αを定量する。

ＰＢＭＣ由来モノサイトを、エンドトキシン（endotoxin）であるＬＰＳ（１０ｎｇ／ｍｌ）で２時間刺激させ、１時間ＯＰＴＩ−ＭＥＭで飢餓状態処理（starvation）した後、ＦＩＴＣ、ＦＩＴＣ−ＴＡＴ、ＰＥＰ１−ＦＩＴＣ及びＦＩＴＣ−ＰＥＰ１で、４μＭの濃度で２時間処理した。反応後、細胞培養液のＴＮＦ−αレベルを、ＥＬＩＳＡで測定した結果、ＦＩＴＣ及びＦＩＴＣ−ＴＡＴの場合、ＬＰＳによって、ＴＮＦ−αレベルが高く測定されたが（６．２及び６．７ｎｇ／ｍｌ）、ＰＥＰ１−ＦＩＴＣ及びＦＩＴＣ−ＰＥＰ１の場合、ＴＮＦ−αレベルが大きく低下した傾向を示し（０．１７及び０．２５ｎｇ／ｍｌ）、その差は、統計学的に有意な結果であると確認された（Ｐ＜０．０１）（図１）。

実験例３−３：ルシフェラーゼ分析（Luciferase Assay）
炎症反応（inflammatory response）でのＰＥＰ１の役割を調査するため、ルシフェラーゼ分析（Luciferase assay）を介して、ＮＦ−ｋＢ発現パターン（expression patterns）を評価した。第一に、１２ウェルプレートに、ウェル当たり２．５ｘ１０⁵セルになるように、ＨＥＫ２９３／nullと、ＨＥＫ２９３／ＴＬＲ２（Graduate School of Dentistry，Seoul National University）を２４時間培養した。プレートをＰＢＳで３回洗浄した後、培地は、ＯＰＴＩ−ＭＥＭ（Invitrogen／Life Technologies，Carlsbad，ＣＡ，ＵＳＡ）に交換して４時間培養した後、３μｌ lipofectamine（Invitrogen／Life Technologies）、１μｌＮＦ−ｋＢルシフェラーゼ、１０ｎｇ renilla luciferase（Promega，Madison，ＷＩ，ＵＳＡ）混合物を各ウェルに加えた後、４時間さらに培養した。陰性対照群を除外した全てのウェルに、Lipoprotein ｐａｍ３ｃｙｓ（１０ｎｇ／ｍｌ、Sigma−Aldrich，Ｓｔ．Louis，ＭＯ，ＵＳＡ）を加え、ＰＢＳで３回洗浄する前に、１８時間ＦＩＴＣ（４μＭ）とＦＩＴＣ−ＰＥＰ１（４μＭ）とで処理した。dual-luciferase reporter assayシステム（Promega）によって提供されることにより、それぞれのウェルに、５０μｌ passive溶解緩衝剤（lysis buffer）を加えて細胞を溶解させた後、ＴＤ−２０／２０ luminometer（Turner designs，Sunnyvale，ＣＡ，ＵＳＡ）を介して、ＮＦ−ｋＢ活性化を確認した。Ｐｃｍｖ−renilla luciferase（Promega）のコトランスフェクションで、トレンスフェクション効能を確認し、ルシフェラーゼ値をcalibrateして結果を分析した。

ＮＦ−ｋＢルシフェラーゼを、ＨＥＫ２９３／nullとＨＥＫ２９３／ＴＬＲ２細胞株とにトランスフェクションした後、合成リポプロテイン、ＦＩＴＣ（４μＭ）、陰性対照群を共に処理し、ｐａｍ３ｃｙｓは、１８時間培養するために、ＦＩＴＣ−ＰＥＰ１（４μＭ）でさらに処理した。Passive溶解緩衝剤を加えた細胞溶解を介して、ルシフェラーゼ強度を利用したＮＦ−ｋＢ発現パターン測定は、dual-luciferase reporter assayシステムによって提供され、リポプロテイン及びＦＩＴＣ−ＰＥＰ１処理、またはＨＥＫ２９３／null非処理に差を示していない。しかし、ＴＬＲ２の亢進剤であるリポプロテインを、ＨＥＫ２９３／ＴＬＲ２細胞株で処理した場合（Ｐ＜０．０１）、処理していない場合よりＮＦ−ｋＢ発現が増大し、それを介して、抗炎反応を確認することができた。また、ＮＦ−ｋＢ発現は、ＦＩＴＣ−ＰＥＰ１で共に処理した場合、処理していない場合より増大し、リポプロテインとＦＩＴＣとが共に処理された陰性対照群の場合（Ｐ＜０．０１）より低下した（図２）。結局、ＴＬＲ２によって発生する抗炎反応は、ＰＥＰ１が共に処理されたときに低減するということを確認することができた。

実施例２：ＰＥＰＲＩＡシリーズ（配列番号２〜配列番号１７９）ペプチドのＴＮＦ−α阻害活性測定
前記実施例１において、配列番号１のペプチド（ＰＥＰ１）に対するＴＮＦ−α阻害活性を確認し、それに基づいて、配列番号２〜配列番号１７９のペプチドに対するＴＮＦ−α阻害活性を確認する実験を実施した。配列番号２〜配列番号１７９のペプチドを合成する方法は、実施例１に記述された配列番号１のペプチドを合成する方法のような方法を使用するが、付加されるアミノ酸を異にした。

実験例１：細胞培養
健常者から血液を採血（５０ｍｌ）した後、Biocoll Separating Solution（Biochrom ＡＧ，Berlin，Germany）を使用して、ＰＢＭＣ（peripheral blood mononuclear cells）層を回収した。回収されたＰＢＭＣは、ヒト血清（２０％）が添加されたＲＰＭＩ１６４０培地で富化させ、３０分ほどヒト血清をコーティングした１００ｍｍポリスチレン細胞培養プレートに移し、２時間ほど３７℃、５％ＣＯ₂インキュベータで２時間培養した。その後、底に付いたモノサイトを、冷たいＰＢＳで引き離した後、９６ウェルプレートに、ウェル当たり１×１０⁵セルになるように、ＲＰＭＩ１６４０培地（supplemented with penicillin-streptomycin；１００ｍｇ／ｍｌ、human serum；２０％）で富化させ、実験前日に培養させておいた。

実験例２：ＴＮＦ−α阻害活性分析
ＰＥＰＲＩＡシリーズのペプチドが、ＴＮＦ−αに対していかなる影響を及ぼすかということを調べるために、ＥＬＩＳＡ実験を行った。ＰＢＭＣに由来したモノサイトを、９６ウェルプレートに、ウェル当たり１×１０⁵セルになるように、実験前日に培養した後、ＬＰＳ（lipopolysaccharide；１０ｎｇ／ｍｌ，Sigma）で２時間処理し、ＰＢＳで３回洗浄した。ＰＢＳで３回洗浄したモノサイトは、ＯＰＴＩ−ＭＥＭ培地を加え、１時間飢餓状態（starvation）においた後、４μＭペプチド処理を施して２時間培養した。細胞に何も処理していない群、細胞にエストロゲン（estrogenの一種として、estradiolを使用）（２０ｎＭ）で処理した群、及び細胞にＬＰＳ（１０ｎｇ／ｍｌ）と共にエストロゲン（２０ｎＭ）で処理した群を比較群にした。また、実施例１において、ＴＮＦ−α阻害活性を確認したＰＥＰ１も、比較対照群として使用して、ＴＮＦ−α阻害活性を測定した。培養が終了した後、細胞培養液を集め、ＥＬＩＳＡ（Ｒ＆Ｄ，Minneapolis，ＭＮ，ＵＳＡ）キットマニュアルによって、ＴＮＦ−αを定量した。具体的な定量方法は、実施例１の実験例２−２に記載されている通りである。

前述のような実験を介して、ＴＮＦ−αのレベルに影響を及ぼすペプチドをスクリーニングした。ＰＢＭＣ由来モノサイトを、エンドトキシンであるＬＰＳ（１０ｎｇ／ｍｌ）で２時間刺激させ、１時間ＯＰＴＩ−ＭＥＭで、飢餓状態（starvation）においた後、１７９個のペプチドを４μＭの濃度で２時間反応させた。反応後、細胞培養液のＴＮＦ−αレベルをＥＬＩＳＡで測定し、比較群に比べ、またはＰＥＰ１に比べ、ＴＮＦ−αのレベルを低下させるペプチドをスクリーニングした（図２〜図２２）。

ＬＰＳのみを処理した比較群に比べ、ＴＮＦ−α阻害効果を示すペプチドとして、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３８、配列番号４２、配列番号４３、配列番号４４、配列番号４５、配列番号４６、配列番号５４、配列番号５５、配列番号５６、配列番号５７、配列番号５８、配列番号６２、配列番号６３、配列番号６４、配列番号６５、配列番号６６、配列番号７０、配列番号７１、配列番号７２、配列番号７３、配列番号７４、配列番号８０、配列番号８１、配列番号８２、配列番号８３、配列番号８４、配列番号８８、配列番号８９、配列番号９０、配列番号９１、配列番号９２、配列番号９６、配列番号９７、配列番号９８、配列番号９９、配列番号１００、配列番号１０１、配列番号１０２、配列番号１０３、配列番号１０４、配列番号１０５、配列番号１０８、配列番号１０９、配列番号１１０、配列番号１１１、配列番号１１２、配列番号１１３、配列番号１１６、配列番号１１７、配列番号１１８、配列番号１１９、配列番号１２４、配列番号１３１、配列番号１４０、配列番号１４１、配列番号１４２、配列番号１４８、配列番号１４９、配列番号１５０、配列番号１５６、配列番号１５７、配列番号１５８、配列番号１５９、配列番号１６４、配列番号１６５、配列番号１６６、配列番号１６７、配列番号１６８、配列番号１７２、配列番号１７３、配列番号１７４、配列番号１７５、配列番号１７６、配列番号１７７及び配列番号１７８が選別された。

また、ＬＰＳ＋エストロゲンに比べ、ＴＮＦ−α阻害効果を示すペプチドとして、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号３３、配列番号３４、配列番号４２、配列番号４３、配列番号４４、配列番号５４、配列番号５５、配列番号５６、配列番号６２、配列番号６３、配列番号６４、配列番号６５、配列番号７０、配列番号７１、配列番号７２、配列番号７３、配列番号８０、配列番号８１、配列番号８２、配列番号８３、配列番号８８、配列番号８９、配列番号９０、配列番号９１、配列番号９６、配列番号９７、配列番号９８、配列番号９９、配列番号１００、配列番号１０１、配列番号１０２、配列番号１０３、配列番号１０８、配列番号１０９、配列番号１１０、配列番号１１６、配列番号１１７、配列番号１４０、配列番号１４８、配列番号１４９、配列番号１５６、配列番号１５７、配列番号１６４、配列番号１６５、配列番号１６６、配列番号１６７、配列番号１７２、配列番号１７３及び配列番号１７４のペプチドが選別された。

実験例３：ＴＨＰ１細胞株でＴＮＦ−αレベルに影響を及ぼすペプチド分析
ヒト急性単核性白血病（human acute monocytic leukemia）細胞株であるＴＨＰ−１細胞（ＡＴＣＣ（American Type Culture Collection），Manassas，ＶＡ，ＵＳＡ）を使用して実験を進めた。

ＴＨＰ−１を９６ウェルプレートに、ウェル当たり１×１０⁵セルになるように、ＲＰＭＩ１６４０培地で富化させ、２４時間培養した。このとき、ＴＨＰ−１細胞の大食細胞（macrophage）への分化のために、１００ｎＭＰＭＡ（phorbol １２−myristate １３−acetate）処理を行った。ＴＨＰ−１細胞株の、ＰＭＡによる大食細胞への分化後、ＬＰＳの２時間処理と洗浄とを行った。その後、１時間の飢餓状態（starvation）処理後、１時間ＰＥＰ１処理を行った。

ＰＭＡで分化させたＴＨＰ−１細胞株を、エンドトキシンであるＬＰＳ（１０ｎｇ／ｍｌ）で２時間刺激させ、２回ＰＢＳで洗浄した後、１時間ＯＰＴＩ−ＭＥＭを加えて飢餓状態（starvation）処理を行い、１７９個のペプチドを、１μＭの濃度で１時間培養した。培養後、細胞培養液のＴＮＦ−αレベルをＥＬＩＳＡで測定し、比較群に比べ、ＴＮＦ−αのレベルを低下させるペプチドをスクリーニングした（図２４〜図４６）。

ペプチドをスクリーニングした結果、ＬＰＳのみで処理した比較群に比べ、ＴＮＦ−αのレベルを低下させるペプチドとして、配列番号５、配列番号７、配列番号３６、配列番号３８。配列番号７３、配列番号７５、配列番号７８〜配列番号１０７、配列番号１０９及び配列番号１７９が選別された。また、ＬＰＳ＋エストロゲンに比べてＴＮＦ−αの発現量を減少させるペプチドとして、配列番号２、配列番号３、配列番号３０、配列番号４１、配列番号１１２及び配列番号１１３のペプチドが選別された。

実施例３：ベータアミロイドによって誘導された炎症反応分析
外部刺激によって、核内に存在するＨＭＧＢ１タンパク質がアセチル化され、細胞質に移動していて、その後、細胞外部に分泌されることにより、炎症誘発サイトカインの役割を行うと知られている。このように、炎症がある場合、ＨＭＧＢ１タンパク質が細胞外部に分泌されるので、炎症性疾患であるチャーグ・ストラウス症侯群、リューマチ関節炎及びシェーグレン症候群の患者の血清は、正常人よりはるかに多量のＨＭＧＢ１タンパク質を有する。従って、炎症が誘発されるいかなる刺激が与えられても、細胞核内のＨＭＧＢ１タンパク質量が多ければ、それは、ＨＭＧＢ１タンパク質が細胞外部に分泌されていないということを意味するので、炎症が抑制されていると見られる。

実験例１：ＰＥＰ１の抗炎症効果による神経幹細胞の生存効果及び増殖効果の分析
まず、ＰＥＰ１を、実施例１に記載されたペプチドの製造方法によって準備した。

実験例１−１：神経幹細胞の培養及びベータアミロイド毒性評価
妊娠１３日目のネズミ（rat）胚芽の頭から大脳皮質を分離した後、次のような培養条件で１週間、ｂＦＧＦ（Basic Fibroblast Growth Factor）で処理し、神経幹細胞を確保した。ベータアミロイドタンパク質が、前記培養された神経幹細胞に及ぼす影響を分析するために、あらかじめオリゴマー化させたベータアミロイドタンパク質を、０μＭで、４０μＭ濃度で神経幹細胞を４８時間処理した後、ＣＣＫ−８アッセイ、ＢｒｄＵ及びTUNELアッセイ利用して、細胞毒性評価を実施した。２０μＭのベータアミロイドタンパク質の処理後、６０％ほどに細胞生存率が低下するということを確認し、前述のところと同一の濃度（０μＭ〜４０μＭ）を、その後の実験に利用した（図４７及び図４８参照）。

実験例１−２：ＰＥＰ１の処理による細胞毒性評価
ＰＥＰ１が、前記培養された神経幹細胞に及ぼす影響を分析するために、既存に周知の方法によって、あらかじめ０，１，１０，５０，１００，２００μＭまで多様な濃度で処理した後、ＭＴＴアッセイ、ＢｒｄＵ及びＴＵＮＥＬアッセイを利用して、細胞生存率と細胞増殖程度との評価を実施した。ＰＥＰ１の０〜２００μＭの濃度では、細胞の生存及び増殖を阻害しないということが分かり、神経細胞系で安定しているということが確認された（図４９及び図５０参照）。

実験例１−３：ベータアミロイドタンパク質及びテロメラーゼペプチド（ＧＶ１００１）の同時処理後の細胞毒性評価
ＰＥＰ１がベータアミロイドタンパク質の神経毒性を抑制する効果があるか否かということを確認するために、２０μＭベータアミロイドタンパク質と、多様な濃度のＰＥＰ１とで４８時間処理後、細胞生存率及び死滅程度を、ＭＴＴアッセイ、ＣＣＫ−８アッセイ、ＬＤＨアッセイ及びＴＵＮＥＬアッセイを利用して測定し、ＢｒｄＵアッセイを利用して、神経幹細胞の増殖程度を測定した。

ＭＴＴアッセイ、ＣＣＫ−８アッセイの分析結果、１０μＭＰＥＰ１が、ベータアミロイドタンパク質による神経毒性から神経幹細胞を保護し始め、１００μＭで、最良の保護効果が確認された（図５１参照）。他の方法として、細胞の死滅程度を評価するＬＤＨアッセイを実施し、ベータアミロイドタンパク質によって増大した細胞死滅が、ＰＥＰ１によって効果的に低減するということを確認することができ、この場合には、１μＭ濃度から効果を見せ始めた（図５２参照）。

ＢｒｄＵアッセイを介しては、ベータアミロイドタンパク質によって低下した細胞の増殖（proliferation）が、ＰＥＰ１を処理した場合、増殖が回復するということを確認した（図５３参照）。

神経幹細胞の特性上、細胞移動性は、非常に重要な部分である。細胞移動性に係わる実験結果、ベータアミロイドタンパク質によって低下した細胞移動が、ＰＥＰ１処理によって回復し、１０μＭ濃度の場合、対照群対比で、さらに増大しているということを確認し、その後、臨床実験で幹細胞移植前に前処理される場合、さらに効果的な結果が出てくるであろうということを示している（図５４参照）。

神経幹細胞損傷程度を直接的に確認するために、TUNELアッセイを実施した。２０μＭベータアミロイドタンパク質処理群において、神経幹細胞死滅が著しく増加することを観察し、１から１００μＭＰＥＰ１処理によって、神経幹細胞死滅が低減するということを確認した（図５５参照）。

ベータアミロイドタンパク質による細胞死滅において、ＰＥＰ１保護効果の作用メカニズムを調べる。まず、ベータアミロイドタンパク質による酸化性損傷を、ＰＥＰ１が低減させるか否かということを調べる。ＤＣＦ−ＤＡ染色試料を利用して、ベータアミロイドタンパク質及びＰＥＰ１の処理後、活性酸素の発生変化を観察し、２０μＭのベータアミロイドタンパク質によって、活性酸素が増加し、ＰＥＰ１と共に処理した群では、増えた活性酸素が減少するということを確認した（図５６参照）。

実験例１−４：ＰＥＰ１を処理した群と、処理していない比較群とのタンパク質発現量比較分析
ＰＥＰ１処理された群と、処理されていない群とのタンパク質発現量を、２Ｄ−電気泳動技法（２−Ｄ gel electrophoresis）及び抗体マイクロアレイ（antibody microarray）技法で分析して定量した。前記実施例３の実験例１−１で培養された神経幹細胞から、プロテオームを抽出して２００μｇを準備し、ＰＥＰ１が処理されていない群を比較群として使用して、同一条件で比較分析した。

２Ｄ電気泳動技法は、８．５ｘ７サイズの１２％アクリルアミドゲルを使用して、ＰＩ４〜１０Ｎで、一次電気泳動を実施した。電気泳動後、クマシーブルー（Colloidal Coomassie Blue）染色試薬で発色させ、ＰＤQuestソフトウェアを利用して、それぞれのスポットを分析して発現量を比較した。

発現量の差が１．５倍以上であるものは、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＭＳ（Matrix Desoprtion／lionization Time of Flight Mass Spectromestry）を利用して、タンパク質を同定した。そのうち、ｉ−ＮＯＳ及びＨＭＧＢ−１のような炎症関連信号伝逹と相関関係があると知られたタンパク質を同定した（表６参照）。ベータアミロイドタンパク質によって、発現量の変化が１．５倍以上増減したが、ＰＥＰ１を加えたとき、発現量が陰性対照群の発現量に近く調節されているということを確認した（図５７参照）。

抗体マイクロアレイ技法は、細胞信号伝逹キット（ＣＳＡＡ１、Panorama^TM Ａｂ Microarray Cell Signaling kit）を利用して実施し、ＧｅｎｅＰｉｘ Personal ４１００Ａスキャナを使用して、アレイスライドをスキャンし、ＧｅｎｅＰｉｘＰｒｏ５．０（Molecular Devices）を利用してデータを分析した。

下記表６は、２Ｄ電気泳動技法を介して獲得された炎症関連タンパク質の発現分析結果である。対照群は、ベータアミロイドタンパク質またはＰＥＰ１を処理していない正常細胞から抽出したタンパク質の発現量を示し、対照群の発現量を基準に増減した発現量の倍数を整理して示したものである。

下記表６に提示されている分析結果を介して、ＰＥＰ１によって、炎症関連タンパク質の過剰発現（over-expression）及び過小発現（under-expression）が統制され、対照群のタンパク質発現量が陰性対照群に近い発現量を示すということを確認した。

ＰＩ３Ｋ（phosphatidylinositol−３−kinase）／ＡＫＴ信号伝達経路は、神経幹細胞の成長及び生存において決定的な役割を行う。ＰＩ３Ｋ経路は、多様な成長因子及び調節因子によって活性化され、神経幹細胞の成長及び生存の正常調節に関与する。ＡＫＴ信号伝達経路は、多くのプロ細胞死滅因子（pro-apoptotic factor）を非活性化させ、すでに公知の代表的細胞死滅信号であるＧＳＫ３βを抑制させる。

ＰＥＰ１の抗炎症効果について、さらに詳細に確認するために、タンパク質分析で明らかな変化を示したＨＭＧＢ１に対するウェスタンブロットを行った。その結果、ＰＥＰ１の処理は、細胞生存信号であるＫｉ６７，ｐＡＫＴ，ＰＩ３Ｋ，ＨＳＴＦ−１及びＢｃｌ−２タンパク質の発現量を増加させ、細胞死滅信号であるＢａｘ，ＧＳＫ３β，Cytochrom−ｃ、caspase−３タンパク質の発現量を減少させた（図５８参照）。

非ヒストン（non-histone）構造を有し、ＤＮＡに結合するタンパク質であるＨＭＧＢ１は、ヌクレオソーム（nucleosome）構造を安定化させて遺伝子発現調節を行うというような、細胞内で多様な役割を行う。炎症反応の後期段階で排出される炎症誘発物質のうち一つでもって、炎症反応が生ずるたびに刺激が加えられれば、初期に、大食細胞とモノサイドとによって排出されるが、神経細胞が著しく損傷されて懐死が生じれば、細胞外に排出され、非常に強烈な炎症反応を誘発させる。神経細胞の細胞質内で、ベータアミロイドタンパク質の処理後に減少したＨＭＧＢ１が、テロメラーゼペプチド（ＧＶ１００１）が、神経細胞死滅によるＨＭＧＢ１の細胞外排出を阻害し、細胞内での重要な役割を増大させるということを反映することにより、ＧＶ１００１が強力な抗炎症効果があり得ることを示す（図５８参照）。

ベータアミロイド凝集に対するＰＥＰ１が、いかなる効果を示すかということを確認した。ベータアミロイドタンパク質の凝集誘導過程で、ＰＥＰ１で共に処理するとき、タンパク質凝集が阻害され（図５９（Ａ）参照）、すでに凝集が誘導されたベータアミロイドタンパク質にＰＥＰ１処理を行うとき、タンパク質が分解されるということが確認された（図５９（Ｂ）参照）。

テロメラーゼペプチド（ＧＶ１００１）の作用メカニズムにおいて、ＰＩ３Ｋ経路の細胞生存信号増加や細胞死滅信号減少などを確認したが、そのような現象が直接的なものであるか、あるいは間接的なものであるかということを確認するために、ＰＩ３Ｋ抑制剤であるＬＹ２９４００２（Promega）処理を行った結果、テロメラーゼペプチド（ＧＶ１００１）の処理後に上昇した細胞生存率が、ＬＹ２９４００２（Promega）の処理後に低下した。従って、ＧＶ１００１の神経保護効果において、ＰＩ３Ｋ経路に対する直接的な影響に関与するものであると確認された（図６０参照）。

ＰＥＰ１は、ベータアミロイドタンパク質による神経幹細胞の死滅を抑制する効果は、神経幹細胞でさらに明らかに確認された。また、神経幹細胞の移動能向上にも寄与するということを確認し、臨床適用時に多様な可能性を提示した。ＰＥＰ１の作用メカニズムにより、抗炎症効果、神経幹細胞生存因子増加及び死滅因子減少、特に、ＰＩ３Ｋ信号伝達体系の活性化や抗酸化の効果などが確認され、非常に多様な作用メカニズムを介して、ベータアミロイドタンパク質による神経毒性抑制を確認した。

実施例４：ベータアミロイドタンパク質による炎症に対する、配列番号２〜配列番号１７９ＰＥＰＲＩＡシリーズペプチドの効果

実験例１．細胞培養
実験１．細胞培養
未分化のＰＣ１２細胞（ＡＴＣＣ，Rockville，ＭＤ，ＵＳＡ）は、１０％熱非活性化ウマ血清（heat-inactivated horse serum）、５％熱非活性化ウシ胎児血清（heat-inactivated fetal bovine serum）、１００units／ｍｌ penicillin、及び１００ｇ／ｍｌ streptomycinを含むＲＰＭＩ１６４０培養液に、すでにコーティングされた１００ｍｍ dishes（Corning，ＰＡ，ＵＳＡ）であるpoly−ｌ−lysine（Sigma，Saint Louis，ＭＯ，ＵＳＡ）を利用して、ogarithmic-phase growthに維持した。培養液は、３７ｏＣ、５％ＣＯ₂の条件で培養し、５０％ confluence条件で育ち、１ｍＭＥＤＴＡを含むfree Hank’s balanced salt溶液であるＣａ²⁺／Ｍｇ²⁺から抽出し、細胞は、１００ｍｍ dish当たり１ｘ１０⁶になるように分周した後、一日培養した。神経分化のために、ＰＣ１２細胞は、１２時間血清飢餓処理（ウマ血清またはウシ胎児血清を除き、１００units／ｍｌ penicillinと、１００ｇ／ｍｌ streptomycinと含むＲＰＭＩ１６４０培地）を行い、従って、ＰＣ１２細胞を無血清培地条件で維持した。二日後、以前の培地は、新たな培地で交換され、３日目、ＮＧＦ（５０ｎｇ／ｍｌ、Sigma、Saint Louis，ＭＯ，ＵＳＡ）を培地に加えた後、追加して３日間無血清培地条件を維持した。細胞分化後、ｎＰＣ細胞は、多様な濃度のpeptides及び２０μＭベータアミルロイドタンパク質と４８時間培養した。

実験例２．ウェスタンブロット分析
ウェスタンブロットを利用し、てＨＭＧＢ１のレベルが分析した。５ｘ１０⁶細胞は、冷たいＰＢＳで２回洗浄し、溶解緩衝剤［５０ｍＭＴｒｉｓ（ｐＨ８．０）、１５０ｍＭＮａＣｌ、０．０２％アジ化ナトリウム（sodium azide）、０、２％ＳＤＳ、１０μｇ／ｍｌフェニルメチルスルホニルフルオライド（ＰＭＳＦ）、５０ μｍ／ｍｌアプロチニン（aprotinin）、１％Ｉｇｅｐ６３０、１００ｍＭＮａＦ、０．５％デオキシコール酸ナトリウム、０．５ｍＭＥＤＴＡ、０．１ｍＭＥＧＴＡ］氷で１０分間培養した。１０分間２，０００ｘｇで損傷されていない細胞及び核は遠心分離し、１０，０００ｘｇで溶解物（lysates）は除去した。Anti−ＨＭＧＢ１（１：１０００；ＣｅｌｌＳｉｇｎａｌｉｎｇ，Beverly，ＭＡ，ＵＳＡ）抗体と、anti−β−tubulin（１：１０００；Cell Signaling，Beverly，ＭＡ，ＵＳＡ）抗体とを使用した。細胞膜は、０．０５％ Tween−２０（ＴＢＳＴ）を含むＴｒｉｓ−buffered salineで洗浄し、ＥＣＬ（Amersham Pharmacia Biotech）検出後、ＨＲＰ結合されたanti−rabbit抗体（Amersham Pharmacia Biotech，Piscataway，ＮＪ，ＵＳＡ）を利用して処理し、blotsは、イメージアナライザ（ＧＥ Healthcare、Image Quant ＬＡＳ４０００）を利用して定量した。

図６０〜図１５９は、ウェスタンブロット分析の結果を基に、細胞内ＨＭＧＢ１蓄積を示す選択されたペプチドを示す。前記図面に示されたチューブリン（tubulins）を利用して、タンパク質発現量を確認し、選択されたペブチドの配列は、次の通りである：
配列番号３、配列番号４、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、配列番号４０、配列番号４３、配列番号４５、配列番号４６、配列番号４７、配列番号４８、配列番号５７、配列番号５８、配列番号６１、配列番号６４、配列番号６５、配列番号６６、配列番号６８、配列番号７０、配列番号７３、配列番号７４、配列番号７５、配列番号８２、配列番号８３、配列番号８７、配列番号８８、配列番号８９、配列番号９１、配列番号９３、配列番号９５、配列番号９６、配列番号９８、配列番号１０２、配列番号１０９、配列番号１１０、配列番号１１１、配列番号１１２、配列番号１１３、配列番号１１５、配列番号１１６、配列番号１１７、配列番号１１８配列番号１１９、配列番号、配列番号１２０、配列番号１２１、配列番号１２３、配列番号１２７、配列番号１２８、配列番号１３０、配列番号１３２、配列番号１３３、配列番号１３４、配列番号１３５、配列番号１３６、配列番号１４２、配列番号１４３、配列番号１４４、配列番号１４５、配列番号１４７、配列番号１４８、配列番号１４９、配列番号１５３、配列番号１５４、配列番号１５５、配列番号１５７、配列番号１５８、配列番号１６４、配列番号１６５、配列番号１６６、配列番号１６７、配列番号１７０、配列番号１７１、配列番号１７２、配列番号１７３、配列番号１７５、配列番号１７６、配列番号１７７、配列番号１７８及び配列番号１７９である。

Claims

配列番号９、１７、２５、２６、３３、４２、５４、５５、６２、６３及び６４から選択される少なくとも１つのアミノ酸配列から成る、抗炎症活性を有するペプチド。
ヒトテロメラーゼに由来する、請求項１に記載のペプチド。
請求項１又は２に記載のペプチドをコードするポリヌクレオチド。
請求項１又は２に記載のペプチドを活性成分として含む、抗炎症組成物。
皮膚炎症の改善または予防のための化粧料組成物である、請求項４に記載の抗炎症組成物。
炎症性疾患の治療または予防のための医薬組成物である、請求項４に記載の抗炎症組成物。
炎症の治療または予防のための食品組成物である、請求項４に記載の抗炎症組成物。
前記炎症性疾患は、（１）全身または局所の炎症疾患（例えば、アレルギー；免疫複合体疾患；枯草熱；異常高熱；肉芽腫症；または類肉腫症）；（２）胃腸管系疾患（例えば、虫垂炎；胃潰瘍；十二指腸潰瘍；腹膜炎；膵腸炎；潰瘍性、急性または虚血性の大腸炎；胆管炎；胆嚢炎、脂肪便症、肝炎、クローン病；またはウィップル病）；（３）皮膚関連疾患（例えば、乾癬；火傷；日焼け火傷；皮膚炎；蕁麻疹性のいぼまたは膨疹）；（４）心血管系疾患（例えば、血管炎；脈管炎；心内膜炎；動脈炎；粥状動脈硬化症；血栓静脈炎；心膜炎；鬱血性心不全；心筋炎；心筋虚血症；結節性動脈周囲炎；再発性狭窄症；バーガー氏病；またはリューマチ熱）；（５）呼吸器系疾患（例えば、喘息；喉頭蓋炎；気管支炎；肺気腫（emphysema）；鼻炎；嚢胞性纎維症；癲癇性肺炎；慢性閉鎖性疾患（ＣＯＰＤ）；成人呼吸障害症侯群；塵肺症；肺胞炎；細気管支炎；咽頭炎；肋膜炎；または副鼻腔炎）；（６）骨、関節、筋肉及び結合組織関連疾患（例えば、好酸性肉芽種；関節炎；関節痛；骨髄炎；皮膚筋炎；筋膜炎；パジェット病；通風；歯周疾患；リューマチ性関節炎；重症筋無力症；強直性脊椎炎；または潤滑膜炎）；（７）泌尿生殖系疾患（例えば、副睾丸炎；膣炎；前立腺炎；または尿道炎）；（８）中枢または末梢神経系関連疾患（例えば、アルツハイマー病；髄膜炎；脳炎；多発性硬化症；脳梗塞；脳塞栓症；キラン・バレー症侯群（Guillain-Barre syndrome）；神経炎；神経痛；骨髄外傷；麻痺；またはぶどう膜炎）；（９）ウイルス（例えば、インフルエンザ；呼吸器細胞融合ウイルス；ＨＩＶ；Ｂ型肝炎ウイルス；Ｃ型肝炎ウイルスまたはヘルペスウイルス）、感染疾患（例えば、デング熱；または敗血症（septicemia））、真菌感染疾患（例えば、カンジダ症）；またはバクテリア、寄生虫および類似の微生物感染疾患（例えば、散在性菌血症；マラリア；糸状虫症；またはアメーバ症）；（１０）自己免疫性疾患（例えば、甲状腺炎；ループス；グッドパスチャー症侯群；同種移植拒否反応；移植片対宿主病；または糖尿病）；及び（１１）癌または腫瘍性疾患（例えば、ホジキン病）からなる群から選択される、請求項６に記載の抗炎症組成物。
請求項１又は２に記載のペプチド；および前記ペプチドの投与量、投与経路、投与回数及び適応症のうち少なくとも一つを含む指示書を含む、炎症性疾患を予防または治療するためのキット。