TWI616530B - 穿膜胜肽以及包含該胜肽之共軛物及組成物（一） - Google Patents

Abstract

本發明係關於穿膜胜肽與有效成分之共軛物及該共軛物之使用。具體而言，揭示包括穿膜胜肽之共軛物及包含該共軛物之組成物，該穿膜胜肽為包含SEQ ID NO：1之胺基酸序列之胜肽、SEQ ID NO：1之任一序列之片段或具有與上述序列超過80%同源性之胜肽。

Description

穿膜胜肽以及包含該胜肽之共軛物及組成物(一)

本發明係關於源自人端粒酶反轉錄酶(human telomerase reverse transcriptase；hTERT)之穿膜胜肽、穿膜胜肽及有效成分之共軛物及包含該共軛物之組成物。

儘管低分子量物質、核酸、蛋白質、奈米粒子等在分子水準上具有作為治療物質的極大可能性，但低分子量物質、核酸、蛋白質、奈米粒子等之使用由於無能力穿透組織及細胞膜而受限。輸送此類物質至細胞內之系統的發展已成為過去二十年來活躍的研究領域。在細胞內部運輸物質已成為分子處理方法中之話題。低分子量物質、核酸或奈米粒子係藉由若干試劑、電穿孔或熱休克在細胞內部運輸。然而，難以找到一種適當方法在不破壞蛋白質之活性及完整性的情況下在細胞內部輸送蛋白質。在20世紀80年代，在對人類免疫缺乏病毒(human immunodeficiency virus；HIV)之穿膜能力進行的研究中，已發現，由特定的11種胺基酸組成之HIV-TAT蛋白質在於細胞內部之運輸過程中起重要作用。因 此，在20世紀90年代，探索在細胞內部運輸蛋白質之恰當方法的研究成為重點研究領域。

已知端粒是染色體末端發現之遺傳物質重複序列，端粒防止染色體損傷或合併至其他染色體上。端粒之長度係在每次細胞分裂時縮短，且在一定次數的細胞分裂之後，端粒長度極端縮短至細胞停止分裂且死亡的程度。在另一方面，已知端粒延伸延長細胞之壽命。作為實例，癌細胞分泌稱為端粒酶之酶，該酶防止端粒縮短，因此導致癌細胞增生。

本發明之目標在於提供一種穿膜胜肽。

本發明之另一目標在於提供作為細胞內之有效成分載體的有用胜肽。

本發明之另一目標在於提供作為細胞內之有效成分載體的有用胜肽，尤其是將有效成分局部地輸送至粒線體的有用胜肽。

本發明之另一目標在於提供用於輸送有效成分至粒線體以改善、預防或治療粒線體相關之疾病或病症的有用胜肽。

本發明之另一目標在於提供有效成分及穿膜胜肽共軛成之共軛物。

本發明之另一目標在於提供包含有效成分及穿膜胜肽構成之共軛物的組成物。

本發明之另一目標在於提供包含有效成分及穿膜胜肽構成之共軛物的醫藥組成物。

本發明之另一目標在於提供包含有效成分及穿膜胜肽構成之共軛物的功能性化妝組成物。

本發明之另一目標在於提供包含有效成分及穿膜胜肽構成之共軛物的健康食品組成物。

本發明之另一目標在於提供包含有效成分及穿膜胜肽構成之共軛物的對比造影劑。

根據本發明之一實施例的共軛物可為穿膜乘載胜肽及有效成分構成之共軛物，其中乘載胜肽為包含SEQ ID NO：1之胺基酸序列的胜肽、具有與上述序列超過80%同源性之胺基酸序列的胜肽或上述胜肽之片段，且其中具有與上述序列超過80%同源性之胺基酸序列的胜肽及上述胜肽之片段為保持SEQ ID NO：1之穿膜能力的胜肽。

根據本發明中之共軛物之另一實施例，片段可由三個或更多胺基酸組成。

根據本發明中之共軛物之另一實施例，乘載胜肽可由三十個或更少胺基酸組成。

根據本發明中之共軛物之另一實施例，上述乘載胜肽可為具有SEQ ID NO：1之胺基酸序列的胜肽或具有與上述序列超過80%同源性之胺基酸序列的胜肽。

根據本發明之一實施例的對比造影劑可包含上述的任一種共軛物。

根據本發明之一實施例的對比造影劑可用於進行細胞對比造影。

根據本發明之對比造影劑之另一實施例，細胞可為 幹細胞。

根據本發明之一實施例的組成物可包含上述的任一種共軛物。

根據本發明中之組成物之另一實施例，有效成分可用於治療或預防疾病，且組成物可為醫藥組成物。

根據本發明之組成物之另一實施例，有效成分可為用於功能性化妝品之有效成分，且組成物可為化妝品組成物。

根據本發明之組成物之另一實施例，有效成分可為用於功能健康食品之有效成分，且組成物可為健康食品組成物。

根據本發明之一實施例的有效成分之細胞質靶向輸送系統(targeting delivery system)可包含上述的任一種共軛物，其中乘載胜肽局部地移動至細胞質內且起到局部地輸送所述有效成分至細胞質內之作用，其中具有與上述序列超過80%同源性之胺基酸序列的胜肽及該胜肽之片段為保持SEQ ID NO：1之穿膜能力的胜肽。

根據本發明之一實施例的有效成分之粒線體靶向輸送系統可包含上述的任一種共軛物，其中乘載胜肽局部地移動至粒線體內且起到局部地輸送所述有效成分至粒線體內之作用，其中具有與上述序列超過80%同源性之胺基酸序列的胜肽及該胜肽之片段為保持SEQ ID NO：1之穿膜能力的胜肽。

根據本發明之一實施例用於調節粒線體活性之組成物可包含上述的任一種共軛物，其中乘載胜肽局部地移動至粒線體內且起到局部地輸送所述有效成分至粒線體內之作 用，其中具有與上述序列超過80%同源性之胺基酸序列的胜肽及該胜肽之片段為保持SEQ ID NO：1之穿膜能力的胜肽。

根據本發明之用於調節粒線體活性之組成物的另一實施例，組成物可為用於與粒線體有關之疾病或病症之治療、預防、病情抑制或症狀緩和的醫藥組成物，且有效成分為用於與粒線體有關之疾病或病症之治療、預防、病情抑制或症狀緩和的成分。

根據本發明之一實施例之方法可為一種輸送有效成分至細胞內的方法，其中該方法包含給需要的對象施用任一種上述共軛物之步驟，且其中乘載胜肽為執行有效成分至細胞內之輸送的穿膜胜肽，且其中具有與序列超過80%同源性之胺基酸序列的胜肽及序列之片段可為保持SEQ ID NO：1之胜肽之穿膜能力的胜肽。

根據本發明之方法之另一實施例，方法可用於在細胞內部局部地輸送有效成分至粒線體內。

根據本發明之胜肽可包含SEQ ID NO：1之胺基酸序列或上述胜肽之片段。SEQ ID NO：1之片段可由3至7個胺基酸組成。

根據本發明之胜肽可為具有包含SEQ ID NO：1之超過17個胺基酸的穿膜胜肽。

根據本發明之多核苷酸可編碼上述穿膜胜肽。

根據本發明之載體可包含上述多核苷酸。

根據本發明之轉形細胞可包含上述載體。

產業利用性

難以在細胞內部運輸之有效成分可藉由使用本發明所揭示之胜肽或胜肽及有效成分之共軛物而易於在細胞內部運輸。此意味著可增加有效成分之功效且因此可減少有效成分之劑量。因此，可最小化由於投藥造成的副作用且可增加治療之有效性。特別地，當將藥物局部地輸送至粒線體內時，可改善粒線體相關之疾病或病症，且可增加預防及治療疾病的有效性。在化妝品之情況中，利用少量有效成分可產生顯著效應。藉由使胜肽與對比造影物質共軛，可將該胜肽用作對比造影物質以監測細胞移植之過程或在細胞處理中的移植細胞。特別地，該胜肽可實際上用作用於注入軀體內之幹細胞的對比造影物質。

第1圖描繪在具有限制性酶切位點(EcoRI及HindIII)之pET28a載體中產生的綠螢光蛋白(green fluorescence protein；GFP)融合構建物的圖解。16-mer表示SEQ ID NO：1(pep1)。

第2圖描繪用來產生具有SEQ ID NO：1(pep1)及綠螢光蛋白之融合構建物的pET-28a(+)載體之圖解。

第3圖描繪FITC(CHO-F，對照組，藍線)、CHO-TAT-F(標記有FITC之TAT胜肽，綠線)、CHO-F-pep-1(在N端標記有FITC之pep1，藍線)及CHO-pep1-F(在C端標誌有FITC之pep1，粉紅線)在CHO細胞中之細胞攝入的結果。將CHO細胞以如上所述胜肽處理達1小時、收集且藉由FACS分析。紅線描繪未以任何胜肽處理之CHO細胞的 背景值。

第4圖描繪以FITC處理過之HepG2細胞系(HepG2-F，對照組，藍線)、HepG2-TAT-F(標記有FITC之TAT胜肽，綠線)、HepG2-F-pep1(在N端標記有FITC之pep1，橙線)及HepG2-pep1-F(在C端標記有FITC之pep1，藍線)在HepG2細胞中之細胞攝入的結果。將細胞以如上所述胜肽處理達1小時、收集且藉由FACS分析。紅線描繪未以任何胜肽處理之HepG細胞的背景值。

第5圖描繪TAT-F(標記有FITC之TAT)、F-pep1(在N端標記有FITC之pep1)及pep1-F(在C端標記有FITC之pep1)在CHO細胞中藉由FACS分析之細胞攝入。在FACS分析之前，細胞係以胜肽處理達1小時(對照組對應於CHO細胞系背景值)。

第6圖描繪TAT-F(標記有FITC之TAT),F-pep1(在N端標記有FITC之pep1)及pep1-F(在C端標記有FITC之pep1)在HepG2細胞中藉由FACS分析之細胞攝入。在FACS分析之前，細胞係以胜肽處理達1小時(對照組對應於HepG2細胞系背景值)。

第7圖描繪標記有FITC之具有SEQ ID NO：1之胜肽在HeLa細胞中的細胞攝入。將細胞以胜肽處理達1小時且藉由FACS分析(對照組為僅以FITC處理過的彼等細胞)。

第8圖描繪與FITC組合之具有SEQ ID NO：1之胜肽的毒性及細胞活性檢測的結果且其中每一者係用來處理HeLa細胞。

第9圖及第10圖描繪對於pep1在Huh7細胞系中之穿膜性質的流式細胞儀分析(flow cytometry)結果。

第11圖及第12圖描繪對於pep1在人類T淋巴球細胞系中之穿膜性質的流式細胞儀分析結果。

第13圖及第14圖描繪基於FITC共軛之位置對於pep1之穿膜性質的流式細胞儀分析及共軛焦顯微鏡分析的結果。

第15圖及第16圖描繪TAT胜肽及PEP 1在MCF7、Huh7及HepG2細胞系中之共軛焦顯微鏡分析的結果，以顯示TAT胜肽與pep1之間的細胞內螢光訊號水準差異。

第17圖為描繪TAT胜肽及PEP1在MCF7、Huh7及HepG2細胞系中之細胞內螢光訊號之皮爾森係數(Pearson’s coefficient)之平均色散的圖解。

第18圖至第23圖描繪以在Huh7、bmDC(小鼠骨髓來源樹突狀細胞)、CHO、COS7細胞系中之PEP1濃度為基礎的分析結果，第24圖至第26圖描繪pep1取決於時間的結果。

第27圖至第31圖描繪藉由流式細胞儀分析及共軛焦顯微鏡分析之PEP 1之穿膜性質的結果；其中使用不同的pep1濃度、溫度及培養時間來處理Jurkat(人類T細胞系)、THP1(人類單核細胞系)、Rail(B細胞系)、K562(人類白血病細胞系)。

第32圖至第34圖描繪在人類PBMC中具有不同濃度、溫度及處理時間之pep1之流式細胞儀分析的結果。

第35圖至第36圖描繪在人類PBMC及Jurkat中具有化學處理之pep1之流式細胞儀分析的結果。

第37圖描繪藉由添加各種抗體執行比較pep1之穿膜性質的流式細胞儀分析之結果；其中pep1係以HSP70、烯醇酶、GAPDH(santacruz)及HSP90之抗體來處理。

第38圖為描繪二茂鐵羧基(Ferrocenecarboxylic)-pep1在大鼠神經幹細胞(neural stem cell；NSC)中之細胞攝入隨著時間推移的圖解。

第39圖為描繪藉由共軛焦雷射掃描系統量測之二茂鐵羧基-pep1在大鼠NSC中之細胞攝入的圖解，DAPI係用來給細胞核著色。二茂鐵羧基-pep1及以DAPI染色之細胞核。

第40圖描繪藉由細胞計數試劑盒-8(cell counting kit-8；CCK-8)檢測及乳酸去氫酶(lactate dehydrogenase；LDH)活化檢測分析之二茂鐵羧基-pep1對細胞活性及細胞毒性的效應。

第41圖為具有以二茂鐵羧基-pep1處理過之二茂鐵羧基-pep1之腦部幹細胞組之腦部核磁共振成像影像(magnetic resonance image；MRI)圖解，第42圖為具有未以二茂鐵羧基-pep1處理過之二茂鐵羧基-pep1之腦部幹細胞組之MRI圖解，第43圖為二茂鐵羧基-pep1腦部組之MRI圖解，且第44圖為腦部鹽水處理組之MRI圖解。

第45圖描繪產生具有SEQ ID NO：1之胜肽與綠螢光蛋白(GFP)之共軛物的pET28a(+)載體(Promega)。

第46圖描繪pET-28a載體且第47圖為選殖之圖解。

第48圖圖示用來在pET載體中產生GFP表現質體之選殖策略。

第49圖圖示細菌轉化中之IPTG誘導的原理。

第50圖描繪藉由螢光顯微鏡分析之在各種細胞系中與pep-1組合之GFP的穿膜性質的結果。

第51圖描繪圖示GFP、TAT及pep1在各種細胞系中之細胞攝入的流式細胞儀分析之結果。

第52圖描繪用來產生去氧核糖核酸(deoxyribonucleic acid；DNA)(聚離胺酸)-cpp共軛物之胜肽的主要結構，第53圖為第52圖中之聚離胺酸共軛物之示意圖。

第54圖描繪與胜肽組合之DNA的電泳遷移率。

第55圖描繪藉由共軛至聚離胺酸之pep1輸送的DNA之穿膜性質之結果，如在各種細胞系中藉由hTERT相關的螢光素酶檢測所量測。

第56圖描繪siRNA藉由聚離胺酸-pep1-FITC之細胞攝入之程度的結果，siRNA與聚離胺酸-pep1-FITC組合以輸送至細胞內。

第57圖描繪圖示藉由共軛至pep1之螢光素酶siRNA適當進入Huh7細胞系內減少螢光素酶活性的螢光素酶檢測之結果。

第58圖描繪圖示藉由共軛至pep1之螢光素酶siRNA適當進入CHO細胞系內減少螢光素酶活性的螢光素酶檢測之結果。

第59圖為描繪具有粒線體定位標記物(mitotrackers®，具有深紅FM 644/665nm(Invitrogen公司))之pep1-FITC共軛物之細胞定位之結果的圖解，(A)在MCF-7細胞中僅處理pep1-GFP共軛物，(B)僅處理粒線體定位標記物(mitotrackers®深紅FM 644/665nm(Invitrogen公司))，(C)細胞之相位對比造影，(D)A及B之組合圖解。

第60圖描繪具有粒線體hsp70抗體之pep1-GFP共軛物之西方墨蹟分析之結果；其中共軛物係以MCF7(人類乳腺癌)細胞系處理。

第61圖為描繪pep1-GFP在HepG2細胞系中之細胞攝入的圖解。

本發明之較佳實例如下。

1.一種穿膜乘載胜肽及有效成分之共軛物，其中該乘載胜肽為包含SEQ ID NO：1之胺基酸序列的胜肽、具有與上述胜肽序列超過80%同源性的胜肽，或上述胜肽之片段，其中具有與序列超過80%同源性之胜肽及片段為保持SEQ ID NO：1之穿膜能力的胜肽。

2.如請求項1所述之共軛物，其中該片段係由至少3個胺基酸組成。

3.如請求項1所述之共軛物，其中該乘載胜肽係由30個或更少胺基酸組成。

4.如請求項1所述之共軛物，其中該乘載胜肽為具有SEQ ID NO：1之胺基酸序列的胜肽或具有與上述序列超過 80%同源性之胺基酸序列的胜肽。

5.如請求項1所述之共軛物，其中該有效成分為選自以下各者中之至少一者：蛋白質、核酸、胜肽、脂質、乙二醇脂質(glycol-lipid)、礦物、糖、奈米粒子、生物產品、對比造影劑、藥物及化合物。

6.如請求項5所述之共軛物，其中該有效成分為DNA或RNA，及其中在該有效成分為DNA時，該乘載胜肽係經由聚離胺酸與DNA共軛。

7.如請求項1所述之共軛物，其中該乘載胜肽及該有效成分係經由共價鍵組合，藉由連接子選擇性介導。

8.如請求項1所述之共軛物，其中該乘載胜肽及該有效成分係經由非共價鍵組合。

9.如請求項5所述之共軛物，其中該有效成分為蛋白質或胜肽。

10.如請求項9所述之共軛物，其中該有效成分為細胞介素、抗體、抗體之片段、治療酶、可溶受體或配位子。

11.如請求項1所述之共軛物，其中該乘載胜肽係與螢光素異硫氰酸鹽組合。

12.如請求項1所述之共軛物，其中該乘載胜肽係與綠螢光蛋白(GFP)組合。

13.如請求項1所述之共軛物，其中該有效成分係與上述乘載胜肽之C端組合。

14.如請求項1所述之共軛物，其中該有效成分之功 效標靶為癌細胞、免疫細胞或成纖維細胞。

15.如請求項14所述之共軛物，其中該癌細胞為選自由以下各者組成之群組的至少一個癌細胞：肝癌細胞、乳癌細胞及白血病細胞，其中該免疫細胞為選自由以下各者組成之群組的至少一個免疫細胞：T淋巴球細胞、B細胞及單核細胞。

16.如請求項1所述之共軛物，其中該有效成分為定位至細胞質內所必要的物質，且該乘載胜肽執行該有效成分至細胞質內之局部輸送。

17.如請求項16所述之共軛物，其中該有效成分為定位至粒線體內所必要的物質，且該乘載胜肽執行該有效成分至粒線體內之局部輸送。

18.如請求項5所述之共軛物，其中該對比造影劑係選自由以下各者組成的群組：不透射線對比造影劑、順磁對比造影劑、超順磁對比造影劑及電腦斷層攝影(computed tomography；CT)對比造影劑。

19.如請求項5所述之共軛物，其中該對比造影劑係基於鐵。

20.如請求項19所述之共軛物，其中該對比造影劑為二茂鐵羧酸鹽。

21.一種對比造影劑，該對比造影劑包含如請求項1至20中任一項所述之共軛物。

22.如請求項21所述之對比造影劑，其中該對比造影劑係用於對比造影細胞。

23.如請求項22所述之對比造影劑，其中該細胞為幹細胞。

24.一種組成物，該組成物包含如請求項1至20中任一項所述之共軛物作為有效成分。

25.如請求項24所述之組成物，其中該有效成分係用於治療或預防疾病，且該組成物為醫藥組成物。

26.如請求項24所述之組成物，其中該有效成分為功能性化妝品之有效成分，且該組成物為化妝品組成物。

27.如請求項24所述之組成物，其中該有效成分為健康功能性食品之有效成分，且該組成物為健康食品組成物。

28.一種有效成分之細胞質靶向輸送系統，其中該有效成分之輸送系統包含如請求項1至20所述之任一種共軛物，其中該乘載胜肽為局部地移動至細胞質內且執行局部地輸送有效成分至細胞質之作用的胜肽，其中具有與序列超過80%同源性之胺基酸序列的胜肽及片段為保持SEQ ID NO：1之胜肽之穿膜能力的胜肽。

29.一種有效成分之粒線體靶向輸送系統，其中該有效成分之輸送系統包含如請求項1至20所述之任一種共軛物，其中該乘載胜肽為局部地移動至粒線體內且執行局部地輸送有效成分至粒線體內之作用的胜肽，其中具有與序列超過80%同源性之胺基酸序列的胜肽及片段為保持SEQ ID NO：1之胜肽之穿膜能力的胜肽。

30.一種用於調節粒線體活性之組成物，其中該組成 物包含如請求項1至20所述之任一種共軛物，其中該乘載胜肽為局部地移動至粒線體內且執行局部地輸送有效成分至粒線體內之作用的胜肽，其中具有與序列超過80%同源性之胺基酸序列的胜肽及片段為保持SEQ ID NO：1之胜肽之穿膜能力的胜肽。

31.如請求項30所述之組成物，其中該組成物為用於與粒線體有關之疾病或病症的治療、預防、病情抑制或症狀緩和的醫藥組成物，且其中該等有效成分為用於與粒線體有關之疾病或病症的治療、預防、病情抑制或症狀緩和的成分。

32.一種輸送有效成分至細胞內的方法，其中該方法包含給需要的對象施用任一種上述共軛物之步驟，其中該乘載胜肽為執行有效成分至細胞內之輸送的穿膜胜肽，且其中具有與序列超過80%同源性之胺基酸序列的胜肽及序列之片段為保持SEQ ID NO：1之胜肽之穿膜能力的胜肽。

33.如請求項32所述之方法，其中該方法係用於在細胞內部局部地輸送有效成分至粒線體內。

34.一種穿膜胜肽，其中該胜肽係由包含SEQ ID NO：1之至少17個胺基酸組成。

35.一種穿膜胜肽，其中該胜肽為SEQ ID之片段且由3至7個胺基酸組成。

36.一種多核苷酸，該多核苷酸編碼如請求項34或35所述之胜肽。

37.一種載體，該載體包含如請求項36所述之多核 苷酸。

38.一種轉形細胞，該轉形細胞包含如請求項37所述之載體。

蛋白質、核酸、胜肽或病毒等具有用作治療物質之重大可能性。然而，蛋白質、核酸、胜肽或病毒等之使用是受限的，因為蛋白質、核酸、胜肽或病毒等由於分子水準大小之原因而無法穿透組織及細胞膜。儘管分子大小很小，但該等分子由於分子之結構或特性之原因而無法穿透脂質雙層。因此，試圖經由使用電穿孔、熱休克等在細胞內部運輸蛋白質、核酸、胜肽或病毒；難以在既不破壞細胞膜又保持上述分子之活性狀態的情況下轉移彼等蛋白質、核酸、胜肽或病毒。已進行的許多研究顯示源自人類免疫缺乏病毒(Human Immuno-deficiency Virus；HIV)之反式轉錄活化因子(Trans-Activating Transcriptional activator；TAT activator)蛋白質可用作穿膜胜肽，該穿膜胜肽可在細胞內部運輸極大的活性物質。具體地，已進行了關於下列物質的研究，與在細胞內部產生毒性的TAT蛋白質不同，該等物質可在不產生任何毒性的情況下在細胞內部運輸諸如蛋白質、核酸、胜肽或病毒之極大分子。因此，本發明是因應本發明人發現源自端粒酶之胜肽具有作為穿膜胜肽之顯著功效而無顯著毒性而完成的。

以SEQ ID NO：1描述之胜肽係與下表1相同。SEQ ID NO：2列舉人類端粒酶蛋白質之全長的順序。SEQ ID NO：1列舉由16個胺基酸組成、源自端粒酶的胜肽。下文表1中之「名 稱」係用於區別胜肽。在本發明之不同特定實施例中，SEQ ID NO：1中所述胜肽中之一個以上胜肽包括「合成胜肽」，端粒酶之選定區域之合成胜肽。在本說明書中，術語「pep」在本文係指具有SEQ ID NO：1之胜肽或包含與上述序列具有超過80%同源性之胺基酸序列的胜肽或上述胜肽之片段。

胜肽之生物學性質之實質轉形係藉由以下列功效選定顯著不同的置換而執行：(a)保持置換區域中的多肽主鏈結 構的功效，諸如片狀或三維螺旋結構，(b)保持靶區域中分子之電荷或疏水性的功效，或(c)保持側鏈之整體的功效。自然殘基係藉由一般側鏈性質劃分成如下群組：(1)疏水性：正白胺酸、甲硫胺酸、丙胺酸、纈胺酸、亮胺酸、異亮胺酸；(2)中性親水性：半胱胺酸、絲胺酸、蘇胺酸；(3)酸性：天門冬胺酸、麩胺酸；(4)鹼性：天門冬醯胺、麩醯胺酸、組胺酸、離胺酸、精胺酸；(5)影響鏈取向(chain orientation)之殘基：甘胺酸、脯胺酸；及(6)芳香性：色胺酸、酪胺酸、苯丙胺酸。

非保守置換可藉由交換上述種類之成員與不同種類之成員而執行。與保持胜肽之適當三維結構無關之任何半胱胺酸殘基可通常經置換為絲胺酸，因此增加分子之氧化穩定性且防止不適當交聯。反之，穩定性之改善可藉由給胜肽添加一或更多個半胱胺酸鍵而實現。

胜肽之胺基酸變體之經改變類型為已改變抗體醣基化方式的彼等胺基酸。術語「改變」在本文係指刪除在胜肽中發現的至少一個糖殘基及/或添加在胜肽內不存在的至少一個醣基化殘基。

胜肽中之醣基化作用通常經N連接或O連接。術語「N-連接」在本文係指將糖殘基附著至天門冬醯胺殘基之側鏈。作為三肽序列，天門冬醯胺-X-絲胺酸及天門冬醯胺-X- 蘇胺酸(其中X為除脯胺酸之外的任何胺基酸)為用於將糖殘基酶法附著至天門冬醯胺之側鏈之辨識序列。因此，在多肽中存在該等三肽序列中之一者的情況下，創建可能的醣基化作用位點。α「O-連接醣基化作用」意味著將糖N-乙醯半乳胺糖、半乳糖或木糖中之一者附著至羥基胺基酸。羥基胺基酸大部分通常為絲胺酸或蘇胺酸，但也可使用5-羥基脯胺酸或5-羥基離胺酸。

對胜肽添加醣基化作用位點係藉由改變胺基酸序列為含有上述三肽序列(用於N連結之醣基化作用位點)而便利地執行。該等改變可藉由給第一抗體序列添加至少一個絲胺酸或蘇胺酸殘基或藉由以彼等殘基(用於O連結之醣基化作用位點)置換而進行。

在本發明之一實施例中，提供包含胜肽之穿膜胜肽，其中該胜肽包含SEQ ID NO：1之胺基酸序列，該胜肽具有與上述序列超過80%同源性之胺基酸序列，或胜肽為上述胜肽之片段。在本發明之一實施例中，提供醫藥組成物，該醫藥組成物包含胜肽作為運輸一個以上有效成分之藥物輸送系統，其中該胜肽包含SEQ ID NO：1之胺基酸序列，該胜肽具有與上述序列超過80%的同源性，或該胜肽為上述胜肽之片段。包含SEQ ID NO：1之胺基酸序列之胜肽、上述胜肽之片段或與上述序列具有超過80%同源性之胜肽是安全的且具有作為穿膜胜肽之顯著功效。因此，胜肽可與藥物共軛以在細胞內部運輸藥物。

在本發明之一實施例中，提供胜肽與待運輸之有效 成分的共軛物，其中該胜肽包含SEQ ID NO：1之胺基酸序列，該胜肽為上述胜肽之片段或該胜肽與上述胜肽具有超過80%的同源性。在本發明之一實施例中，有效成分可為選自以下各者中之至少一者：蛋白質、核酸、胜肽、脂質、醣脂質、礦物、糖、對比造影物質、藥物及化合物。在本發明之一實施例中，有效成分可為胜肽。在本發明之一實施例中，有效成分可為細胞介素、抗體、抗體片段、治療酶、可溶受體或配位子。

本文揭示之穿膜胜肽意指可自體外及/或體內運輸貨物(cargo)至細胞內部的胜肽。本文揭示之「貨物」包含可經由與穿膜胜肽之共軛作用在細胞內部運輸之所有物質，例如，想要增加穿膜功效之所有物質，具體而言，藥物、化妝品或健康食品之有效成分，更具體而言，無法經由一般途徑在細胞內部運輸的物質，更具體而言，糖、奈米粒子、生物學配方、病毒、對比造影物質或其他化合物，該等其他化合物可例如具有蛋白質、核酸、胜肽、礦物、葡萄糖，但不限於彼等物質。本文揭示之「藥物」為寬泛概念，包括待運輸用於緩和、預防、治療或診斷疾病、創傷或特定症狀的物質。

本文揭示之「乘載胜肽」為可經由與有效成分之共軛作用運輸有效成分至靶位點的胜肽。

在本發明之一實施例中，作為貨物之蛋白質或胜肽包含以下之一或更多者：激素、激素類似物、酶、酶抑製劑、訊號轉移蛋白質(或胜肽)、抗體及疫苗，但不限於彼等物質。在本發明之一實施例中，核酸為以下分子：可為自發或 人工的、單股或雙股的DNA分子或RNA分子。核酸分子可為相同類型(例如，具有相同的核苷酸序列)之一或更多個核酸或不同類型之核酸。核酸分子包含以下之一或更多者：DNA、互補DNA(cDNA)、誘餌DNA(decoy DNA)、RNA、小干擾RNA(siRNA)、微小RNA(miRNA)、小髮夾式RNA(shRNA)、小時序RNA(stRNA)、小核仁RNA(snoRNA)、小胞核RNA(snRNA)、戊糖核酸(pentose nucleic acid；PNA)、反義寡聚物、質體及其他修飾核酸，但不限於彼等物質。在本發明之一實施例中，病毒包含全病毒或包括病毒之核酸的病毒核心。在本發明之一實施例中，化學物質為包含天然或合成物質之寬泛指示，該天然或合成物質可充當藥物。

其中特定DNA表現在DNA表現之過程中藉由雙股RNA(double stranded RNA；dsRNA)控制的現象被稱為RNA干擾；RNAi。因為該現象於1998年在C線蟲中首先發現，據發現，該現象在植物、果蠅及哺乳動物中是常見的(Fire等人，《自然》，391：806-811，1998年；Novina & Sharp，《自然》，430：161-164，2004年)。

RNA干擾係藉由具有19-25bps之dsRNA調控，該dsRNA進入細胞、接著與RNA誘導沉默複合體(RNA-induced silencing complex；RISC)組合。dsRNA至互補信使RNA(messenger RNA；mRNA)序列之反義鏈之結合藉由在RISC複合體內發現之核酸內切酶觸發目標信使RNA之降解(Rana,T.M.，Nat.Rev.Mol.Cell Biol.，8：23-36，2007年；Tomari,Y.及Zamore,P.D.，Genes Dev.，19：517-529，2005年)。換言 之，小干擾RNA係藉由抑制特定蛋白質之產生且因此干擾DNA表現而包括在RNA干擾中。由19至23個核苷酸組成之小干擾RNA根據信使RNA對於形成雙股RNA之特定mRNA之互補順序形成鹼基對。隨後，在信使RNA自細胞移除的同時特別分解雙股RNA。小干擾RNA已作為用於基因治療之物質而受到關注，因為小干擾RNA在近代動物研究中顯示了對抑制特定DNA之表現的顯著的效應。在過去20年裡已研究了具有DNA之較高活化及精確選擇之小干擾RNA，且期望替換目前正用作治療物之反義寡核苷酸。因此，許多藥物公司現在正開發基於小干擾RNA之治療物。與現有反義寡核苷酸相比，小干擾RNA係熟知為以少10倍的數量抑制基因表現且僅以基因之顯著選擇性抑制目標基因。小干擾RNA技術，特別對於治療目的，具有顯著益處，因為小干擾RNA技術與其他藥物相比可容易設計且具有諸如高目標選擇性及抑制特定基因表現之特性。同樣，因為藉由RNA干擾抑制基因表現利用體內天然存在之機制，故毒性很低。然而，小干擾RNA具有無法將該小干擾RNA輕易運輸至細胞內之缺點，因為小干擾RNA由於小干擾RNA是陰離子而無法穿透細胞膜且由於體內低穩定性之原因容易在短時間週期內被分解。小干擾RNA之此缺點可藉由與本文揭示之乘載胜肽共軛來解決。

在本發明之一實施例中，有效成分(貨物)之功效為癌細胞、免疫細胞或成纖維細胞。具體而言，上述癌細胞包含選自由以下各者組成之群組的任一種癌細胞：肝癌細胞、乳癌細胞及白血病細胞；上述免疫細胞包含選自由以下 各者組成之群組的任一種免疫細胞：T淋巴細胞、B細胞及單核細胞。

在本發明之一實施例中，上述有效成分將在細胞質中定位，且乘載胜肽將上述有效成分局部地運輸至細胞質。

在本發明之一實施例中，上述有效成分將在粒線體中定位，且乘載胜肽將上述有效成分局部地運輸至粒線體。

在本發明之一實施例中，藉由穿膜胜肽在細胞內部運輸之藥物可包含一或更多個藥物運輸載體，諸如脂質體、微胞、奈米粒子、磁性粒子或量子點。

本文揭示之術語「對比造影物質」為寬泛指示，該寬泛指示包含用來在醫學影像中對比軀體內之結構或流體的所有物質。適當對比造影物質包含不透射線對比造影劑、順磁對比造影劑、超順磁對比造影劑、電腦斷層掃描(computed tomography；CT)及其他對比造影物質，但不限於彼等物質。舉例而言，不透射線對比造影劑(用於X射線影像)將包含無機碘化合物及有機碘化合物(例如，泛影酸鹽(diatrizoate))、不透射線金屬及該等不透射線金屬之鹽(例如，銀、金、鉑等)及其他不透射線化合物(例如，鈣鹽、諸如硫酸鋇之鋇鹽、鉭及氧化鉭)。適當的順磁對比造影物質(用於MR影像)包含釓二乙三胺五乙酸(gadolinium diethylene triaminepentaacetic acid；Gd-DTPA)及Gd-DTPA之衍生物、其他釓、錳、鐵、鏑、銅、銪、鉺、鉻、鎳及鈷複合體，例如，1,4,7,10-四氮雜環十二烷-N,N’,N”,N'''-四乙酸(1,4,7,10-tetraazacyclododecan-N,N’,N”,N'''-tetraacetic acid； DOTA)、乙二胺四乙酸(ethylenediaminetetraacetic acid；EDTA)、1,4,7,10-四氮雜環十二烷-N,-N’,N”-三乙酸(1,4,7,10-tetraazacyclododecan-N,-N’,N”-triacetic acid；DO3A)、1,4,7-三氮雜環壬烷-N,N’,N”-三乙酸(1,4,7-triazacyclononane-N,N’,N”-TRIACETIC ACID；NOTA)、1,4,8,10-四氮雜環十四烷-N,N’,N”,N'''-四乙酸(1,4,8,10-tetraazacyclotetradecane-N,N’,N”,N'''-tetraacetic acid；TETA)、羥基苄基乙二胺二乙酸(hydroxybenzylethylene-diamine diacetic acid；HBED)。適當的超順磁對比造影物質(用於MR影像)包含磁鐵礦、超順磁氧化鐵(super-paramagnetic iron oxide；SPIO)、超小超順磁氧化鐵(ultrasmall superparamagnetic iron oxide；USPIO)及單晶氧化鐵。其他適當的對比造影物質為碘化、非碘化、離子及非離子的CT對比造影劑、類似旋轉標記或診斷上有效製劑之對比造影物質。

對比造影物質之其他實例包含β-半乳糖苷酶、綠螢光蛋白、青螢光蛋白、螢光素酶(但不限於彼等物質)及編碼在表示於細胞內時可輕易偵測到之蛋白質之標識基因。可使用各種標記，諸如放射性核種、粉(flour)、酶、酶基質、酶輔因子、酶抑製劑、配位子(尤其是半抗原(heptan))。

在本發明之一實例中，對比造影物質為下文化學式2之二茂鐵羧酸。二茂鐵之結構係表示在化學式1中。

[化學式1]

在本發明之一實例中，穿膜胜肽與對比造影物質之共軛物為下文化學式3中表示之二茂鐵羧基-pep1。

在本發明之一實施例中，胜肽或組成物可與一或更多個可偵測標記融合。標記可為可在化學反應、物理反應或酶反應中偵測到之化合物或在反應中直接或間接地產生訊號之化合物。標記及偵測隨後可根據此技術領域所熟知的方法來執行(例如，Sambrook,J.及Russel,D.W.(2001)；及Lottspeich,F.及Zorbas H.(1998)Bioanalytik，Spektrum Akademischer Verlag，海德堡/柏林，德國)。標記包含螢光標記、酶標記、色原體標記、發光標記、輻射標記、半抗原、 生物素、金屬複合體、金屬及膠態金，但不限於彼等標記。該等標記之所有形式在此工作領域是眾所周知的，該等標記之所有形式可自各供應商購得。

在本發明之一實施例中，貨物可與胜肽直接組合。在本發明之另一實施例中，貨物可經由諸如共價鍵或非共價鍵之各種類型之鍵與胜肽組合。例如，在本發明之一實施例中，貨物可與胜肽之N端或C端組合。舉例而言，貨物可藉由二硫鍵或共價鍵鍵結至胜肽。共價鍵為可將貨物鍵結至N端麩胺酸之α-胺或C端離胺酸殘基之胺的鍵。同樣，胜肽及貨物可經由非共價鍵組合，此可使胜肽或貨物可將彼此封裝為膠囊形式。

在本發明之另一實施例中，胜肽可經由連接子與貨物組合。舉例而言，胜肽可藉由在將諸如聯肼尼克醯胺(6-肼基吡啶-3-羧酸)連接子(Hynic(6-hydrazinopyridine-3-carboxylic acid)linker)之連接子引入N端麩胺酸之α-胺或C端離胺酸殘基之胺之後將貨物結合至連接子而與貨物組合。

在本發明之另一實施例中，當貨物為DNA或RNA時，將SH基團(硫醇基)引入胜肽，且將馬來醯亞胺基引入DNA或RNA，隨後，組合胜肽之SH基團及DNA或RNA之馬來醯亞胺基，因此產生在貨物與胜肽之間的結合。

在本發明之另一實施例中，當貨物為胜肽或蛋白質時，表現貨物之DNA與表現乘載胜肽之DNA組合，且藉由表現該DNA組合，可將貨物與胜肽組合為融合蛋白質之形 式。藉由融合蛋白質組合之特定實例如下：當製造引子用於產生融合蛋白質時，編碼乘載胜肽之核苷酸經附著在表現貨物之核苷酸前面，且使用限制酶將所獲得核苷酸嵌入諸如聚乙烯對苯二甲酸酯(Polyethylene Terephthalate；pET)載體之載體，且核苷酸係以轉化到諸如BL-21(DE3)之細胞中來表現。此時，融合蛋白質將藉由以類似異丙基-1-硫代-β-D-半乳糖苷(isopropyl-1-thio-β-D-galactopyranoside；IPTG)之表現誘導製劑處理該融合蛋白質而有效表現。隨後，所表現的融合蛋白質係藉由His標籤淨化來淨化，且以PBS透析，且經添加至試劑盒以在2000rpm至4000rpm、5至20分鐘之此類條件下藉由離心分離作用而濃縮。

在本發明之一實施例中，乘載胜肽係與染色物質、螢光物質、特別是螢光異硫氰酸鹽(fluorescein isothiocyanate；FITC)或綠螢光蛋白(Green Fluorescent Protein；GFP)組合。在本發明之一實施例中，FITC係與在乘載胜肽之N端或C端之離胺酸之胺基(NH³⁺)組合。在其中離胺酸不存在於胜肽之端的胜肽情況中，胜肽可經由包括離胺酸之連接子與FITC組合。

本文揭示之乘載胜肽可以1：1之莫耳分數與貨物組合，但該乘載胜肽也可以不同於1：1之莫耳分數與貨物組合，該乘載胜肽為包含SEQ ID NO：1之胺基酸序列之胜肽，或具有與上述胜肽超過80%同源性之胺基酸序列之胜肽，或上述胜肽之片段。舉例而言，CPP與貨物之莫耳分數可大於2：1，具體而言，大於2：1、大於3：1、大於4：1、大於5：1、大於6：1、大於7：1、大於8：1、大於9：1或大於10：1。此意味著大量乘 載胜肽分子可與貨物分子組合。大量乘載胜肽分子可經串行或並行組合。「串行組合」意味著乘載胜肽與貨物分子將在端胺基酸處組合。「並行組合」意味著乘載胜肽與貨物分子將在不同於端胺基酸之位點組合。在另一方面，乘載胜肽與貨物之莫耳分數可大於1：2。此意味著乘載胜肽分子可與大量貨物分子組合。舉例而言，乘載胜肽與貨物之莫耳分數可為1：2，具體而言，大於1：2、大於1：3、大於1：4、大於1：5、大於1：6、大於1：7、大於1：8、大於1：9或大於1：10。

可輕易發現與螢光異硫氰酸鹽組合之胜肽的移動途徑。因此，在本發明之一實施例中之乘載胜肽將用於細胞成像或偵測在細胞內部之藥物輸送途徑。

在本發明之一實施例中，提供用作運輸一個以上有效成分之藥物輸送載體的胜肽，其中該胜肽包含SEQ ID NO：1之胺基酸序列，或該胜肽為上述胜肽之片段，或該胜肽具有與上述胜肽超過80%同源性之胺基酸序列。使用可指治療用途或非治療用途。

在本發明之一實施例中，提供在對象之細胞內部輸送藥物之方法，該方法包含施用包含藥物及胜肽之組成物之步驟；其中該胜肽包含SEQ ID NO：1之胺基酸序列，或該胜肽為上述胜肽之片段，或該胜肽具有與上述胜肽超過80%同源性之胺基酸序列。

在本發明之一實施例中，提供偵測藥物輸送途徑之方法，該方法包含給對象應用胜肽及對比造影物質之步驟；其中該胜肽包含SEQ ID NO：1之胺基酸序列，或該胜肽為上 述胜肽之片段，或該胜肽具有與上述胜肽超過80%同源性之胺基酸序列。

在本發明之一實施例中，提供偵測藥物輸送途徑之方法，該方法包含給對象應用胜肽與對比造影物質之共軛物的步驟；其中該胜肽包含SEQ ID NO：1之胺基酸序列，或該胜肽為上述胜肽之片段，或該胜肽具有與上述胜肽超過80%同源性之胺基酸序列。

在本發明之一實施例中，提供用於藥物輸送至對象之細胞內的試劑盒，該試劑盒含有組成物及說明書，其中該組成物包含本發明之胜肽與用於輸送之藥物的共軛物，其中該胜肽包含SEQ ID NO：1之胺基酸序列或該胜肽為上述胜肽之片段，或該胜肽具有與上述胜肽超過80%同源性之胺基酸序列，其中該說明書包括以下之至少一者：給藥劑量、給藥途徑、給藥頻率及組成物之指示。

在本發明之一實施例中，提供包含有效成分及胜肽之化妝品或食品組成物；其中該胜肽包含SEQ ID NO：1之胺基酸序列，該胜肽具有與上述序列超過80%同源性之胺基酸序列，或該胜肽為上述胜肽之片段。在本發明之另一實施例中，提供包含胜肽與有效成分之共軛物的化妝品或食品組成物；其中該胜肽包含SEQ ID NO：1之胺基酸序列，該胜肽具有與上述序列超過80%同源性之胺基酸序列，或該胜肽為上述胜肽之片段。

在本發明之一實施例中，提供具有在細胞內部運輸有效成分之顯著能力的醫藥、化妝品或食品組成物，該醫藥、 化妝品或食品組成物包含胜肽與有效成分之共軛物；其中該胜肽包含SEQ ID NO：1之胺基酸序列，該胜肽具有與上述序列超過80%同源性之胺基酸序列，或該胜肽為上述胜肽之片段。

粒線體，作為真核細胞之能量代謝中之中心胞器，為與人類疾病有關之首先熟知的細胞內胞器(Luft R、Ikkos D、Palmieri G、Ernster L、Afzelius B：A case of severe hypermetabolism of non thyroid origin with a defect in the maintenance of mitochondrial respiratory control：a correlated clinical,biochemical,and morphological study(在保持粒線體呼吸控制中具有缺陷的非甲狀腺成因之嚴重代謝亢進之情況：相關的臨床研究、生物化學研究及形態學研究)，J Clin Invest 41：1776-804，1962年)。

因為粒線體在控制細胞之能量代謝及細胞凋亡中起重要作用，故該等粒線體充當各種治療藥物之主要靶。同樣，此胞器涉及控制細胞內部之鈣濃度，粒線體呼吸鏈充當在能量產生中重要的電子運輸系統，且該粒線體呼吸鏈導致產生活性氧物種。因此，異常粒線體作用與成人疾病具有密切關係，該等成人疾病諸如尿崩症、心肌症、不孕症、失明、腎/肝疾病及中風(Modica-Napolitano KS，Singh KK：四月mitochondri as targets for detection and treatment of cancer.(作為偵測及治療癌症的靶之粒線體。)Expert Rev Mol Med 11：1-19，2002年)。同樣，正建議將粒線體遺傳突變包括在老化、變性神經元疾病及癌症等之爆發中。

本文揭示之「粒線體相關疾病」包含亨汀頓氏疾病、肌萎縮性脊髓側索硬化、粒線體腦肌肉病變合併乳酸血症及類中風症候群(Mitochondrial Encephalomyopathy with Lactic Acidemia and Stroke-like episodes；MELAS)；肌陣攣癲癇合併紅色襤褸肌纖維症(Myoclonus,epilepsy,and myopathy with ragged red fibers；MERRF)；神經性肌肉鬆弛、失調症、色素性視網膜炎/母體遺傳萊氏症狀(Neurogenic muscular weakness,ataxia,retinitis pigmentosa/Maternally inherited leigh syndrome；NARP/MILS)；Leber氏視神經病變(Lebers hereditary optic neuropathy；LHON)；Kearns-Sayre症候群(Kearns-Sayre Syndrome；KSS)；皮爾森骨髓胰腺症(Pearson Marrow-Pancreas Syndrome；PMPS)；慢性漸進性眼外肌麻痹(Chronic progressive external opthalnoplegia；CPEO)；瑞氏症候群；阿爾珀斯氏症候群；多個粒線體DNA缺失症候群；粒線體DNA耗乏症候群；複合體I缺陷；複合體Ⅱ(琥珀酸脫氫酶(succinatedehydrogenase；SDH))缺陷；複合體Ⅲ缺陷；細胞色素c氧化酶(COX，複合體Ⅳ)缺陷；複合體V缺陷；腺嘌呤核苷酸轉運體(Adenine nucleotide translocator；ANT)缺陷；丙酮酸脫氫酶(Pyruvate dehydrogenase；PDH)缺陷；具有乳酸血症之乙基丙二酸酸性尿；具有乳酸血症之3-甲基戊烯二酸酸性尿；體現為在傳染期間之衰減的不應性癲癇；體現為在傳染期間之衰減的阿斯伯格症候群；體現為在傳染期間之衰減的自閉症；注意力不足過動症(Attention deficit hyperactivity disorder；ADHD)；體現為在傳染期間之衰減的 腦性麻痹；體現為在傳染期間之衰減的失讀症；母系遺傳血小板減少症；白血病；MNGIE(粒線體肌病變、周圍及自主神經病變、胃腸功能異常及癲癇)；MARIAHS症候群(粒線體失調症、復發傳染、失語症、低尿酸血症/髓磷脂減少症(hypomyelination)、癲癇發作及二羧酸酸性尿)；ND6肌張力不全症；體現為在傳染期間之衰減的週期性嘔吐症狀；具有乳酸血症之3-羥基異丁酸酸性尿；具有乳酸血症之尿崩症；尿苷反應性神經症狀(Uridine reactive neural syndrome；URNS)；家族雙側紋狀體壞死(Familial bilateral striatum necrosis；FBSN)；與胺基糖苷有關之聽力損失；鬆馳心肌病；脾淋巴瘤；鎢症狀；多個粒線體DNA缺失症狀；及腎小管酸血症/尿崩症/失調症症狀，但不限於彼等疾病。

在本發明之另一實施例中，提供編碼上述多肽之核酸分子。例如，核酸分子具有鹼基序列GAA GCG CGC CCG GCG CTG CTG ACC AGC CGC CTG CGC TTT ATT CCG AAA。核酸可根據熟習此項技術者所熟知的方法引入寄主細胞內。舉例而言，熟知方法可為藉由以下各者之轉化方法：磷酸鈣方法、脂質體、電穿孔、接觸病毒及細胞，或直接微注射至細胞內等。寄主細胞為較高等的真核細胞(例如，哺乳動物細胞)，或較低等的真核細胞(諸如酵母細胞)，或原核細胞(諸如細菌細胞)。適於轉化之原核寄主細胞可為屬於以下的物種：例如，大腸桿菌、枯草桿菌、沙門氏菌、假單胞菌、鏈黴菌及微細菌物種。

包括上述核酸分子之載體通常為重組型表現載體， 且該載體包含賦能寄主細胞轉化之複製起點及可選擇標記物(例如，用於真核細胞培養之二氫葉酸還原酶，或新黴素之容許度、四環素或安比西林在大腸桿菌中之容許度，酵母菌TRP1基因)，及用於控制蛋白質塗佈序列之轉錄的促進子。例如，可用表現載體為：熟知細菌質體，諸如SV40、pcDNA之衍生物；及熟知細菌質體，諸如colE1、pCR1、pBR322、pMal-C2、pET、pGEX(Smith等人，Gene 67：31-40(1988))；質體，諸如pMB9及pMB9之衍生物RP4；與噬菌體I之大量衍生物相同的噬菌體DNA，諸如NM989；諸如M13及絲狀單股噬菌體DNA之噬菌體DNA；酵母質體，例如，噬菌體DNA或自使用表現抑制序列之修飾質體與噬菌體DNA之組合誘導的載體。哺乳動物表現載體包含複製起點、適當促進子及增進子。同樣，該等載體可包含強制核糖體結合位點、聚腺苷酸化位點、剪接供體及受體部分、轉錄終止序列及5’平板式(planking)非轉錄序列。哺乳動物表現載體可包含可誘導促進子，例如，含有二氫葉酸還原酶促進子之載體，含有DHFR表現現匣或DHFR/胺甲葉酸共擴增載體之任何表現載體，諸如pED(Randal J，kaufman，1991，Randal J.Kaufman，Current Protocols in Molycular Biology，16，12(1991))。或者，可使用以下載體：麩醯胺合成酶/甲硫胺酸磺醯亞胺共擴增載體，例如，pEE14(Celltech公司)、人類皰疹病毒第四型(Epstein-Barr-Virus；EBV)；或受核抗原(EBNA)控制引導附加型表現之載體，例如，pREP4(Invitrogen公司)、pCEP4(Invitrogen公司)、pMEP4(Invitrogen公司)、pREP8(Invitrogen 公司)、pREP9(Invitrogen公司)及pEBVHis(Invitrogen公司)。可選擇哺乳動物表現載體為Rc/CMV(Invitrogen公司)及pRc/RSV(Invitrogen公司)等。可用於本發明之牛痘病毒哺乳動物表現載體為pSC11、pMJ601、pTKgptF1S等。

將用於本發明之酵母表現載體系統為非融合pYES2載體(Invitrogen公司)、融合pYESHisA、B、C(Invitrogen公司)、pRS載體等。

上述載體可經引入各種細胞，諸如哺乳動物細胞(特別是源自人類之細胞)或細菌、酵母、真菌、昆蟲、線蟲及植物細胞。適當細胞之實例為：VERO細胞；HELA細胞，例如ATCC No.CCL2；CHO細胞系，例如ATCC No.CCL61；COS細胞，例如COS-7細胞及ATCC No.CRL 1650細胞；W138、BHK、HepG2、3T3，例如，ATCC No.CRL6361；A549、PC12、K562細胞；293細胞；Sf9細胞，例如ATCC No.CRL1711；及Cv1細胞，諸如ATCC No.CCL70等。

將用於本發明之其他適當細胞為原核寄主細胞菌株，例如，屬於大腸桿菌(例如，DH5-α菌株)、枯草桿菌、沙門氏菌、假單胞菌、鏈黴菌及葡萄球菌之菌株。

在本發明之一實施例中，組成物可含有0.1μg/mg至1mg/mg、具體而言1μg/mg至0.5mg/mg、更具體而言10μg/mg至0.1mg/mg的以下胜肽：包含至少一個SEQ ID NO：1之胺基酸序列的胜肽、包含與上述序列超過80%同源性之胺基酸序列的胜肽或上述胜肽之片段。當胜肽係含在上述範圍內時，組成物之所有安全性及穩定性可經滿足且在成本有效 性方面為適當的。

在本發明之一實施例中，組成物可應用於所有動物，包括人類、狗、雞、豬、母牛、羊、天竺鼠及猴。

在本發明之一實施例中，醫藥組成物可在骨髓、硬膜外或皮下手段中經由以下方式給藥：口服、直腸給藥、經皮給藥、靜脈給藥、肌肉給藥、腹膜內給藥。

口服給藥之形式可為但不限於片劑、藥丸、軟膠囊或硬膠囊、顆粒、粉末、溶液或水乳液。非口服給藥之形式可為但不限於注射、滴劑、洗劑、軟膏、凝膠、乳霜、懸浮液、水乳液、栓劑、貼劑或噴劑。

在本發明之一實施例中，若有必要，醫藥組成物可含有添加劑，諸如稀釋劑、賦形劑、潤滑劑、黏合劑、崩解佐劑、緩衝劑、分散劑、表面活化劑、著色劑、芳香劑或甜味劑。在本發明之一實施例中，醫藥組成物可藉由此技術領域中之習知工業方法製造。

在本發明之一實施例中，醫學組成物之有效成分可根據以下各者變化：病人的年齡、性別、體重、病理及狀態、給藥途徑或開藥者的判斷。基於該等因數之劑量係在熟習此項技術者之水準內決定，且每日劑量例如可為但不限於，0.1μg/kg/天至1g/kg/天，具體而言1μg/kg/天至10mg/kg/天，更具體而言10μg/kg/天至1mg/kg/天，更具體而言50μg/kg/天至100μg/kg/天。在本發明之一實施例中，醫藥組成物可每天一至三次給藥，但不限於此。

在本發明之一實施例中，化妝品組成物可以適於局 部應用之所有形式來提供。舉例而言，該等形式可經提供為溶液、藉由油相在水中之分散獲得之水乳液、藉由水在油相中之分散獲得之水乳液、懸浮液、固體、凝膠、粉末、糊劑、泡沫、或氣溶膠。該等形式可藉由此技術領域中之習知工業方法製造。

在本發明之一實施例中，化妝品組成物可在不會損害主效應之水準內包括可合意地增加主效應之其他成分。在本發明之一實施例中，化妝品組成物可另外包括潤膚膏、軟化劑、表面活化劑、UV吸收劑、防腐劑、殺真菌劑、抗氧化劑、pH值調節劑、有機顏料或無機顏料、芳香劑、冷卻劑或止汗劑。上述成分之配方比可在不會損害本發明之目的及效應的水準內藉由熟習此項技術者決定，且基於化妝品組成物之總重量的配方比可為以重量計0.01%至5%，具體而言以重量計0.01%至3%。

在本發明之一實施例中，食品組成物不局限於形式，但例如可為顆粒、粉末、液體及固體形式。每一形式可以由熟習此項技術者適當選取之常用於工業中的成分(除有效成分外)組成，且可增加具有其他成分之效應。

對於上述有效成分之劑量的判定係在熟習此項技術者之水準內，且每日劑量例如可為1μg/kg/天至10mg/kg/天，更具體而言10μg/kg/天至1mg/kg/天，更具體而言50μg/kg/天至100μg/kg/天，但不限於該等數量且可根據年齡、健康狀態、並發病及其他各種因數而變化。

本文使用之術語意欲用來描述實施例，而非用來限 制本發明。前文數不勝數之術語不欲限制量而是表示可存在一個以上的所使用術語之事物。術語「包括」、「具有」、「組成」及「包含」應為開放解釋(亦即，「包括但不限於」)。

使用數量之範圍之提及代替說明範圍內之分開數量，因此除非明確說明，否則每一數量可讀作本文整合之分開數量。所有範圍之端值係包括在範圍內且可經獨立組合。

除非另作說明或明顯同上下文相矛盾，否則本文提及之所有方法可按適當順序執行。除非包括在申請專利範圍內，否則任一實施例及所有實施例或示例性語言(例如，使用「類似......」之語言)之使用係用來更清楚描述本發明，而不是限制本發明之範疇。在申請專利範圍外之本文任何語言將不會解釋為本發明之必需品。除非另外界定，否則本文使用之技術術語及科學術語具有本發明所歸屬之熟習此項技術者通常理解的意義。

本發明之較佳實施例係為執行本發明之發明者所熟知的最佳模式。對熟習此項技術者而言，先於較佳實施例中之變化而讀取聲明之後，可為清楚的。本發明者希望熟習此項技術者可充分使用該等變化且以不同於本文所列舉之其他方式進行本發明。因此，如由專利法所允許，本發明包括在隨附申請專利範圍中所說明之關鍵點的等效物及等效物之變化。另外，在上述組分之任何組合內的所有可能變化係包括在本發明中，除非另外明確說明或同上下文相矛盾。儘管本發明係藉由示例性實施例描述及表示，但熟習此項技術者將很好理解，在不脫離本發明之精神及範圍的情況下可存在藉 由下文申請專利範圍所界定之形式及細節上的各種變化。

實例1：胜肽之合成

具有SEQ ID NO：1之胜肽係根據固相胜肽合成之現有方法來合成。詳細地，胜肽係藉由使用ASP48S(Peptron公司，大田市，大韓民國)經由Fmoc固相胜肽合成(solid phase peptide synthesis；SPPS)自C端偶合每一胺基酸而合成。彼等胜肽經使用如下，彼等胜肽在C端之第一胺基酸附著至樹脂：NH₂-離胺酸(Boc)-2-氯-三苯甲基樹脂

NH₂-丙胺酸-2-氯-三苯甲基樹脂

NH₂-精胺酸(Pbf)-2-氯-三苯甲基樹脂

合成胜肽之所有胺基酸材料在N端係藉由Fmoc保護，且胺基酸殘基係藉由可溶於酸之Trt、Boc、t-Bu(t-丁酯)、Pbf(2,2,4,6,7-五甲基二氫苯並呋喃-5-磺醯基)保護。諸如：Fmoc-丙胺酸-OH、Fmoc-精胺酸(Pbf)-OH、Fmoc-麩胺酸(OtBu)-OH、Fmoc-脯胺酸-OH、Fmoc-亮胺酸-OH、Fmoc-異亮胺酸-OH、Fmoc-苯丙胺酸-OH、Fmoc-絲胺酸(tBu)-OH、Fmoc-蘇胺酸(tBu)-OH、Fmoc-離胺酸(Boc)-OH、Fmoc-麩醯胺(Trt)-OH、Fmoc-色胺酸(Boc)-OH、Fmoc-蛋胺酸-OH、Fmoc-天門冬醯胺(Trt)-OH、Fmoc-酪胺酸(tBu)-OH、Fmoc-胺基己酸-OH、Trt-巰乙酸。

HBTU[2-(1H-苯並三唑-1-基)-1,1,3,3-六氟磷酸四甲銨]/HOBt[N-羥基苯並三唑]/NMM[4-甲基嗎啡啉]係用作偶合試劑。使用含20%哌啶之二甲基甲醯胺(dimethyl formamide；DMF)移除Fmoc。為自殘基移除保護或使所合成胜肽與樹脂 分離，使用分裂混合物[三氟乙酸(trifluoroacetic acid；TFA)/三異丙基矽烷(triisopropylsilane；TIS)/乙二硫醇(ethanedithiol；EDT)/H₂O=92.5/2.5/2.5/2.5]。

胜肽係藉由使用固相分子框架藉由以如下順序過程添加每一胺基酸而合成：胺基酸保護、偶合反應、洗滌及去保護。在自樹脂切斷所合成胜肽之後，所合成胜肽係藉由高效液相層析法(High Performance Liquid Chromatography；HPLC)淨化且藉由質譜測定法(mass spectrometry；MS)驗證合成且隨後冷凍乾燥。

特定胜肽合成過程係以SEQ ID NO：1之pep1之實例描述如下。

1)偶合

將以NH₂-離胺酸(Boc)-2-氯-三苯甲基樹脂保護之胺基酸(8當量)熔融在偶合劑HBTU(8當量)/HOBt(8當量)/NMM(16當量)中，且在添加DMF之後，將反應混合物在室溫下培育達2小時，隨後以DMF、MeOH及DMF順序洗滌。

2)Fmoc去保護

在DMF中添加20%哌啶之後，將反應混合物在室溫下培育達5分鐘2次，隨後以DMF、MeOH及DMF順序洗滌。

3)藉由反復重複反應1及反應2構成胜肽之鹼性框架。

4)分裂：添加分裂混合物至完全合成之胜肽且使胜肽與樹脂分離。

5)將預冷卻乙醚添加至混合物內，且隨後使反應混 合物離心分離以沉澱出胜肽。

6)在藉由Prep-HPLC淨化之後，藉由LC/MS檢查分子重量且冷凍乾燥以獲得粉末形式的胜肽。

實例2：CPP-FITC共軛物之穿膜性質

1. 共軛物之合成

(1)FITC-CPP共軛物之合成

與FITC組合之具有SEQ ID NO：1之胜肽的共軛物經製造如下，例如，具有SEQ ID NO：1之pep1與FITC之共軛物，換言之，FITC-連接子-pep1經製造如下。

根據實例1中描述之製造方法獲得之胜肽之鹼性框架NH₂-連接子-E(OtBu)-A-R(Pbf)-P-A-L-L-T(tBu)-S(tBu)-R(Pbf)L-R(Pbf)-F-I-P-K(Boc)-2-氯-三苯甲基樹脂與FITC反應。具體而言，將螢光素-5-異硫氰酸酯(FITC)(8當量)與N,N-二異丙基乙胺(N,N-Diisopropylethylamine；DIPEA)(16當量)熔融在DMF中。添加DMF溶液且在室溫下反應達2小時，隨後以DMF、MeOH及DMF順序洗滌。因此，獲得FITC-連接子-E(OtBu)-A-R(Pbf)-P-A-L-L-T(tBu)-S(tBu)-R(Pbf)L-R(Pbf)-F-I-P-K(Boc)-2-氯-三苯甲基樹脂。本文之連接子為6-胺基己酸(Ahx)。TFA/TIS/H₂O=95/2.5/2.5經添加至在樹脂上組成之胜肽，且共軛物係與樹脂分離。預冷卻乙醚經添加至所獲得混合物，且使用離心分離作用來沉澱胜肽共軛物。在藉由Prep-HPLC淨化之後，純度係以分析HPLC確定且分子重量係藉由LC/MS決定。如上所述合成之胜肽係藉由由LC/MS 確定分子重量而驗證為FITC-pep1。隨後將共軛物冷凍乾燥。

(2)CPP-FITC共軛物之合成

根據實例2 1.(1)中描述之製造方法產生胜肽之鹼性框架(NH₂-E(OtBu)-A-R(Pbf)-P-A-L-L-T(tBu)-S(tBu)-R(Pbf)L-R(Pbf)-F-I-P-K(Dde)-2-氯-三苯甲基樹脂)。為選擇性引入FITC至胜肽之C端，胜肽之N端經保護不受Boc影響。隨後，將二碳酸二叔丁酯(30當量)與DIPEA(30當量)熔融在DMF中。添加DMF溶液至胜肽且在室溫下培育達2小時，且胜肽係以DMF、MeOH及DMF順序洗滌。因此，獲得Boc-E(OtBu)-A-R(Pbf)-P-A-L-L-T(tBu)-S(tBu)-R(Pbf)L-R(Pbf)-F-I-P-K(Dde)-2-氯-三苯甲基樹脂。使用含2%肼之DMF來移除Dde以添加FITC至離胺酸之C端，該Dde為C端殘基離胺酸之保護基。隨後，將FITC(8當量)及DIPEA(16當量)熔融在DMF中，該DMF經添加至胜肽反應混合物，且混合物在室溫下經培育達2小時，隨後以DMF、MeOH、DMF順序洗滌。因此，獲得Boc-E(OtBu)-A-R(Pbf)-P-A-L-L-T(tBu)-S(tBu)-R(Pbf)L-R(Pbf)-F-I-P-K(FITC)-2-氯-三苯甲基樹脂。TFA/TIS/H₂O=95/2.5/2.5經添加以使胜肽與樹脂分離。預冷卻乙醚經添加至混合物，且使用離心分離作用來沉澱胜肽。在藉由Prep-HPLC淨化之後，純度係以分析HPLC確定且分子重量係以LC/MS確定。所獲得物質係藉由由LC/MS證實分子重量而驗證為pep1-FITC。隨後共軛物經冷凍乾燥。

2. 主要實驗

(1)細胞培養

使用下列細胞及細胞系：CHO(中國倉鼠卵巢細胞系)、Huh7(人類肝細胞癌細胞系)、HepG2(人類肝細胞癌細胞系)、MCF7(人類乳腺癌細胞系)、COS7(猴腎成纖維細胞系)、Jurkat(人類T淋巴球細胞系)、Raji(人類B細胞系)、THP1(人類單核細胞系)及K562(人類白血病細胞系)、bmDCs(骨髓樹突狀細胞)及源自人類滑液及滑液組織之初生細胞。

Huh7、MCF7、Jukat、Raji、THP1、K562係在RPMI 1640培養基中培養，CHO細胞係在培養基中培養，且HepG2細胞係在MEM培養基中培養。所有細胞之生長培養基係以10%胎牛血清(Invitrogen公司，美國)、100ug/ml青黴素、100單元/ml鏈黴素增補，且細胞係在37℃、5% CO₂下培養。

bmDC在RPMI 1640培養基中經分化成為樹突狀細胞，該RPMI 1640培養基含有自小鼠骨髓獲得之細胞、GM-CS(20ng/ml)及IL4(20ng/ml)。1×10⁶個細胞經播種在24孔培養板上，培養基係每2天替換一次，且在第7天獲得之成熟樹突狀細胞係用於實驗。

周邊血液單核細胞(peripheral blood mononuclear cell；PBMC)及淋巴球細胞係使用Biocoll分離溶液(Biochrom AG，柏林，德國)由自健康對象收集之人類血液樣本(50ml)製備。

HeLa細胞係培養在最低必需培養基(Minimum Essential medium；MEM)中且在37℃下在5% CO₂培育箱中培養，該MEM含有10%胎牛血清(Invitrogen公司，美國)、厄爾氏鹽、非必需胺基酸、丙酮酸鈉及100μg/ml青黴素及10單元/ml鏈黴素。

所有上述細胞系係購自美國細胞培養收藏中心(American Type Cell Culture；ATCC)。

(2)pep1-FITC在體外之攝入分析

執行流式細胞儀分析及共軛焦顯微鏡分析以比較在以pep1(SEQ ID NO：1)處理與以HIV之先前已知的PTD、TAT(YGRKKRRQRRR)(SEQ ID NO：10)處理之不同細胞系中的細胞攝入程度。

流式細胞儀分析

細胞係在37℃下在5% CO₂培育箱中培養且生長至90~100%融合。培養基經移除且以PBS洗滌，1mL OPTI-MEM經添加至每一孔且在37℃下在5% CO₂培育箱中培養達一小時用於細胞饑餓。在以OPTI-MEM洗滌一次之後，細胞係在OPTI-MEM(100μl之濃度)及FITC(10μM之濃度)中以胜肽處理、在37℃下在5%CO₂培育箱中培養。在移除培養基之後，細胞係以1倍PBS洗滌三次且使用胰蛋白/EDTA收集。比較FITC及FITC共軛之胜肽之剩餘部分的細胞攝入且以未處理過的細胞系作為對照物來分析。

因此，經確定pep1具有比TAT更好的穿膜能力，該pep1被稱為穿膜胜肽。特別地，當FITC係與C端之離胺酸殘基共軛時，穿膜能力最佳。

共軛焦顯微鏡分析

細胞經播種在2腔室孔式培養玻片(NUNC，Lab-Tek)上，在含有10%胎牛血清(Invitrogen公司，美國)、100ug/ml青黴素、100單元/ml鏈黴素之培養基中生長至達到50%融合，且在37℃下在5% CO₂培育箱中培養達12小時。

在移除培養基之後，細胞係以PBS洗滌且在1ml OPTI-MEM中饑餓達一小時。與FITC(5μM)組合之50μl胜肽經添加在每一腔室內，且在37℃下在5% CO₂培育箱中培養達2小時。在移除培養基之後，細胞係以PBS洗滌三次且在室溫下在0.5mL 4%多聚甲醛中經固定達20分鐘。4% PFA係以PBS快速洗滌兩次。細胞之細胞核係在室溫(room temperature；RT)下以500nM TO-PRO®-3碘化物642/661nm(Invitrogen公司)著色達10分鐘。隨後，細胞係以1倍PBS洗滌三次，移除塑膠腔室，在沒有任何氣泡的情況下將編號1.5厚度的蓋玻片在滴入VECTASHIELDFX封固劑(載體實驗室)之後置放在玻片上。樣本係藉由塗覆透明指甲油至蓋玻片之邊緣而構成。樣本在以螢光顯微鏡觀察之前係在黑暗中在4℃下儲存，且藉由共軛焦雷射掃描系統分析樣本。在分析中使用FV1000大型掃描共軛焦顯微鏡(Olympus)。

(i)酵素免疫吸附測定(Enzyme-linked immunosorbent assay；ELISA)

細胞係以pep1處理、以1倍PBS洗滌兩次且以裂解緩衝劑再懸浮，該裂解緩衝劑含有50mm Tris pH7.5、10mM EDTA pH8.0、1mM PMSF、2mM NaF、2mM Na₃VO₄、0.1% NP 40、100g/μl抑肽酶。懸浮細胞隨後使用音波器(超音波處理器，Misonix，紐約，美國)進行聲處理兩次達15秒，且上清液(細胞溶解產物)係藉由在4℃下以13000rmp離心分離達10分鐘而獲得。蛋白質濃度係使用Bradford蛋白質測定(Bio-Rad，美國)決定且執行螢光ELISA。

3. 次要實驗

(1)在HeLa細胞系中之穿膜性質

執行流式細胞儀分析及共軛焦顯微鏡分析以比較HIV之先前已知的蛋白質轉導域、TAT(YGRKKRQRRR)的細胞攝入的程度；其中細胞係以由實例2.1製備之pep1與FITC之共軛物處理。

細胞系係在6孔培養板中分裂且在含有10%胎牛血清(Invitrogen公司，美國)、100μg/ml青黴素、100單元/ml鏈黴素之培養基中在37℃下在5% CO₂培育箱中培養達12小時。在以PBS洗滌細胞系之後，在最低必需培養基中誘導饑餓達一小時。20uM之每一乘載胜肽經處理且在37℃下培養達一小時。在重複三次以PBS洗滌細胞之步驟之後，將胰蛋白-EDTA在37℃下處理達10分鐘以分離在細胞外部的乘載胜肽。細胞係以致冷之PBS收集且執行離心分離作用以重複洗滌細胞之步驟達三次。隨後，細胞經懸浮在含有4%多聚甲醛之0.5ml PBS中且細胞之螢光係使用FACS Calibur(美國BD公司)分析。比較對照物及與FITC組合之各種胜肽的細胞攝入態樣且藉由平均螢光強度(Mean Fluorescence Intensity；MFI)分析。

培養之細胞系在腔室孔中分裂且在含有10%胎牛血清(Invitrogen公司，美國)、100μg/ml青黴素及100單元/ml鏈黴素之培養基中在37℃下在5% CO₂培育箱中培養達12小時。在以PBS洗滌細胞之後，在最低必需培養基中誘導饑餓達一小時。10μM之每一胜肽經處理且在37℃下培養達一小時。在重複三次以PBS洗滌細胞之步驟之後，細胞係藉由2%(v/v)多聚甲醛在室溫下固定達15分鐘。細胞核係在室溫下以DAPI(4’,6-二脒基-2-苯基吲哚)染色，且比較細胞且藉由共軛焦顯微鏡分析來分析細胞。結果係與第7圖所圖示的一樣。

在另一方面，為分析細胞活性及毒性，上述培養之細胞系係在96孔培養板中分裂且在含有10%胎牛血清(Invitrogen公司，美國)、100μg/ml青黴素及100單元/ml鏈黴素之培養基中在37℃下在5% CO₂培育箱中培養達12小時。在以PBS洗滌細胞之後，在最低必需培養基中誘導饑餓達一小時。20μM之每一乘載胜肽經處理且在37℃下培養達24小時。細胞活性及毒性係藉由MTT測定方法分析。結果係與第8圖所圖示的一樣。

(2)在Huh7細胞系中之穿膜性質之流式細胞儀分析

為研究PEP1之穿膜性質，在以PEP1處理過之Huh7細胞系中執行流式細胞儀分析。所使用之分析方法係與上述(1)HeLa細胞系分析中所描述的一樣。結果顯示，PEP1之穿膜性質低於TAT之穿膜性質但高於對照物之穿膜性質。(第9圖及第10圖)

(3)pep1在人類T淋巴球中之穿膜性質

為研究PEP1之穿膜性質，將胜肽在人類T淋巴球中處理，且螢光活化細胞分類(Fluorescence-activated cell sorting；FACS)經執行作為流式細胞儀分析。所使用之分析方法係與上述(1)HeLa細胞系分析中所描述的一樣。結果顯示，pep1具有高於對照FITC之穿膜性質25倍且高於源自HIV的TAT之穿膜性質6倍的穿膜性質。(第11圖及第12圖)

(4)PEP1之穿膜性質取決於FITC合成位置之流式細胞儀分析及共軛焦顯微鏡分析

為研究PEP1在各種細胞系中之穿膜性質，使用在胜肽之N端與C端與FITC組合之PEP1之共軛物執行流式細胞儀分析及共軛焦顯微鏡分析。所使用之分析方法係與上述(1)HeLa細胞系分析中所描述的一樣。所使用之細胞系為Huh7、HepG2、CHO、bmDC。結果顯示：在C端與FITC組合之PEP1具有高於另一者大約3至10倍的穿膜性質。同樣，當以螢光顯微鏡觀察時，在C端與FITC組合之PEP1具有比在N端與FITC組合之PEP1更高的穿透至細胞質內的穿膜性質。(第14圖)

(5)在各種細胞系中PEP1及TAT之穿膜性質之共軛焦顯微鏡分析

執行共軛焦顯微鏡分析以依據在每一細胞系(MCF7、Huh7、HepG2)中之細胞內部之吸收顯示在TAT胜肽與PEP1之間的差異。第15圖及第16圖為表示分析結果的圖解。綠色(488nm)表示FITC；以TOPRO-3染色之紅色部分表示細胞之細胞核。細胞核經指定為紅色以顯示細胞核及 胜肽之共定位。在圖解中，當顯示定位時，定位經表示為與綠色及紅色組合之橙色。結果表示，以TAT處理且表示為橙色之細胞核之部分為其中發生胜肽與細胞之細胞核的共定位的位置。與此形成對比，在以PEP1處理之細胞核中不存在表示為橙色之細胞之任何部分。

該等結果意味著PEP 1及TAT係在不同位置處被吸收至細胞內。第17圖為PEP1及TAT吸收之數位化圖解。

所有的共軛焦顯微鏡分析圖解係藉由FV1000大型掃描共軛焦顯微鏡(Olympus)產生。圖解中提供意指共定位之皮爾森係數。在每一細胞系MCF7、Huh7 HepG2中，指定感興趣區(region of interest；ROI)以表示皮爾森係數之平均分散。在所有的細胞系中，P值係低於0.0001。經由此驗證，TAT係定位在細胞核中，而停留在細胞質中之PEP1未定位至細胞核內。類似這樣，PEP1在細胞質內定位之特性是區分PEP 1與包括TAT之現有穿膜胜肽的最重要事物。

實例3：PEP1取決於不同環境條件之穿膜性質

(1)PEP 1在各種細胞系中取決於濃度及時間之穿膜性質之流式細胞儀分析

PEP1之穿膜性質係藉由取決於濃度及時間以各種細胞系處理PEP1來研究。特定分析方法遵循實例2中描述之方法。結果顯示，PEP 1之穿膜性質取決於濃度在諸如Huh7、bmDC(小鼠高爾基氏體來源樹突狀細胞系)、CHO、COS7之所有細胞系中具有增強的傾向，類似TAT。在HepG2細胞系之情況下，在50μM之濃度下，TAT之穿膜性質增加，而 PEP1之穿膜性質降低。與其他細胞系不同，在MCF細胞系中，PEP 1之穿膜性質相比TAT之穿膜性質增加了4倍且該等穿膜性質亦取決於濃度而增加(第18圖至第23圖)。當取決於時間觀察胜肽之穿膜性質時，穿膜性質在Huh7細胞系、MCF7細胞系及HeLa細胞系中增加。特別地，在MCH7細胞系中，當處理5μM之胜肽時，穿膜性質在所有時間內增加了10倍。(第24圖至第26圖)

(2)PEP1在富集細胞系中取決於濃度、溫度及時間之穿膜性質之流式細胞儀分析及共軛焦顯微鏡分析

Jurkat(人類T細胞系)、THP1(人類單核細胞系)、Raji(人類B細胞系)、K562細胞系(人類白血病細胞系)係用作富集細胞系以取決於濃度、溫度及時間處理胜肽及分析胜肽之穿膜性質。結果顯示，在Jurkat及THP 1細胞系中，PEP 1之穿膜性質比TAT高1.5至2倍，而在Raji細胞系及K562細胞系中，TAT顯示比PEP1更高的穿膜性質。取決於胜肽之濃度，穿膜性質在所有細胞系內顯示增加的傾向。取決於時間，穿膜性質不斷增加超出3倍，但在THP1細胞系中，胜肽之穿膜性質隨著時間推移而降低。取決於溫度，PEP1之穿膜性質在所有細胞系內不存在差異。該等結果驗證，PEP1在Jurkat細胞系及THP1細胞系中具有較高的穿膜性質。

(3)PEP1在人類PBMC中取決於濃度、溫度及時間之穿膜性質之流式細胞儀分析

與人類血液分離之PBMC係用來取決於濃度、溫度及時間處理胜肽且分析胜肽之穿膜性質。結果顯示，在整體 PBMC中，PEP1顯示比TAT高1.4倍的穿膜性質且TAT及PEP1兩者之穿膜性質係取決於濃度及時間而增加。在淋巴球中，PEP1之穿膜性質經顯示增加了1.8倍，在單核球中，PEP1之穿膜性質類似於TAT。取決於濃度，PEP1之穿膜性質在淋巴球及單核球兩者中皆增加。取決於時間，PEP 1之穿膜性質在淋巴球及單核球兩者中皆顯示增加的傾向，但單核球之穿膜性質尤其在3小時內增加到類似TAT，但到5小時的時候，該穿膜性質與TAT相比增加超過20%。(第32圖至第34圖)

(4)在人類PBMC及Jurkat中藉由化學處理之胜肽之流式細胞儀分析

利用與人類血液分離之PBMC，執行化學處理利用率分析以驗證細胞穿透機制。化學處理之濃度係基於2013年JBC 278(36),34141-34149中報告之資料來決定。在處理PEP1胜肽且執行流式細胞儀分析之前，OPTI-MEM係以化學處理處理且以PBS洗滌一小時。

結果顯示，在整體PBMC中，當MatCD(漿膜膽固醇萃取)以PEP1處理時，穿膜性質傾向於被抑制且其他化學處理顯示類似趨勢。與此形成對比，TAT之穿膜性質係在所有細胞系內增加。在Jurkat細胞系中，MatCD顯示抑制穿膜性質的傾向。所有的化學處理顯示抑制PEP1的傾向，但對TAT沒有影響。此驗證，PEP1在PBMC及Jurkat中係經由漿膜改變位置。(第35圖至第36圖)

(5)使用各種抗體之PEP1之穿膜性質之分析

HSP70/90在Pep1之穿膜性質中起重要作用之事實 係使用HSP70/90抗體分析。GAPDH、HSP70、HSP90及烯醇酶之抗體係在與人類血液分離之PBMC、淋巴球及Jurkat中處理以執行流式細胞儀分析。GAPDH及烯醇酶之抗體係用作對照物。當在pep1與HSP70/90之間的組合及相互作用係受抗體抑制時，pep1之穿膜性質係顯著減少且此支持HSP70/90在PEP1之穿膜性質中起重要作用的事實。

為使用各種抗體比較且分析胜肽之穿膜性質，使用HSP70抗體、烯醇酶抗體、GAPDH抗體(santacruz)、HSP90抗體。在細胞藉由胜肽培養之前一小時，細胞係以肝素(10μg/ml)、甲基β環糊精(5mM)、諾考達唑(20μM)、佈雷菲德菌素A(10μM)、細胞遲緩素F(5μM)或氯奎寧(100μM)處理。隨後，細胞係以PBS洗滌，胜肽處理係如在實例2中描述之相同方法藉由流式細胞儀分析執行。抗-HSP70抗體、抗烯醇酶抗體及抗-GAPDH抗體係購買自Santacruz公司且抗-HSP90抗體係購買自Abcam公司。為分析穿透至細胞內之每一蛋白質之作用，細胞係以對應於利用相同方法之蛋白質的抗體處理。

如第37圖所示，當細胞係以HSP79及HSP90特定之抗體處理時，GV1001-F至hPBMC內之吸收顯著減少。在另一方面，據發現，當細胞係以GAPDA或烯醇酶特定之抗體處理時，對於pep1-F之吸收沒有影響。

同樣，看起來當細胞係以HSP70及HSP90特定之抗體處理時，TAT胜肽之穿膜性質不受影響，且此驗證HSP70及HSP90在GV1001至細胞之細胞質內的穿透中起到特殊作 用。當以THP-1、人類淋巴球及Jurkat細胞進行實驗時，顯示類似結果。

HSP90及HSP70之過度表現(DNA及蛋白質表現)已在各種癌症中報告。因此，pep1在癌細胞中可比在正常細胞中更有效地拖曳貨物至細胞內，且因此可表明，pep1具有以其中HSP70或HSP9過度表現之特定癌細胞為目標的能力。

實例4：二茂鐵羧基-CPP共軛物之穿膜性質

1. 二茂鐵羧基-CPP共軛物之製造

將以NH₂-離胺酸(Boc)-2-氯-三苯甲基樹脂保護之胺基酸(8當量)及偶合劑HBTU(8當量)/HoBt(8當量)/NMM(16當量)熔融在DMF中用於偶合。添加DMF溶液且室溫下反應達2小時，隨後以彼順序之DMF、MeOH、DMF洗滌。隨後，含20%哌啶之DMF經添加用於Fmoc去保護且在室溫下反應達5分鐘2次，隨後以彼順序之DMF、MeOH、DMF洗滌。藉由重複上述反應，構成胜肽之鹼性框架(NH₂-E(OtBu)-A-R(Pbf)-P-A-L-L-T(tBu)-S(tBu)-R(Pbf)L-R(Pbf)-F-I-P-K(Dde)-2-氯-三苯甲基樹脂)。添加含2%肼之DMF以移除Dde，該Dde為C端離胺酸殘基之保護基。隨後，將二茂鐵羧酸(Sigma Aldrich cat.#_46264，16當量)及偶合劑HBTU(16當量)/HoBt(16當量)/NMM(32當量)熔融在DMF中。添加DMF溶液且室溫下反應達2小時，隨後以彼順序之DMF、MeOH及DMF洗滌。TFA/TIS/H₂O=95/2.5/2.5經添加至上述所合成胜肽樹脂以使胜肽與樹脂分離。冷卻乙醚經添加至所獲得混合物，且使用離心分離作用來沉澱所聚集 之胜肽。沉澱物係藉由HPLC淨化且以MS確定。隨後，將胜肽冷凍乾燥。

2. 神經幹細胞之穿透

皮層係自已懷孕13天之胚胎大鼠之頭部移除(Sprague-Dawley，SD)(Orient bio，京畿道，韓國)且細胞係在不含Ca²⁺/Mg²⁺之PBS中在塗佈有多-L-鳥胺酸/纖連蛋白之板中以2×10⁴細胞/cm²分裂(GIBCo，格蘭德艾蘭，紐約，美國)。在藉由每日以10ng/ml之鹼性成纖維細胞生長因子(basic fibroblast growth factor；BFGF)處理N2培養基(DMEM/F12，4.4 IM胰島素，100mg/l轉移，30nM亞硒酸鹽、0.6 IM丁二胺、20nM孕酮、0.2mM抗壞血酸、2nM L-麩醯胺、8.6mM D(+)葡萄糖、20nM NaHCO₃(Sigma，聖路易斯，密蘇裡州))4至6天之後，在37℃下在5% CO₂環境中獲得超過95%之神經幹細胞。

上述獲得之神經幹細胞係以1×10⁵在腔室孔式培養板中分裂。板中之細胞係以10μM之二茂鐵羧基-pep1處理且在37℃下在5% CO₂培育箱中培養。細胞係以PBS洗滌兩次且在室溫下以4%多聚甲醛固定達20分鐘。細胞之細胞核係以DAPI(4’,6-二脒基-2-苯基吲哚)封固培養基(具有DAPI之封固培養基)(載體實驗室，加利福利亞州，美國)染色。隨後，細胞經比較且在430-500nm之藍光波長、620-700nm之紅光波長及紅光波長與藍光波長之組合下藉由共軛焦雷射掃描系統分析細胞。

結果顯示在第38圖及第39圖中。

第38圖為表示在以二茂鐵羧基-pep1處理之後神經幹細胞隨著時間推移之狀態的圖解。

如第38圖所示，分析結果顯示，10μM之二茂鐵羧基-pep1穿透至細胞內達2小時且大量細胞隨著時間推移穿透至細胞內。

第39圖為表示藉由共軛焦雷射掃描系統截取之神經幹細胞之穿透狀態的圖解；其中神經幹細胞係以二茂鐵羧基-pep1處理且細胞之細胞核係以DAPI染色。在第39圖中，在430-550nm之波長下表示為藍色之部分為以DAPI染色之細胞核且在700nm之波長下表示為紅色之部分為二茂鐵羧基-pep1。如在紅光與藍光之組合波長之圖解中所示，二茂鐵羧基-pep1係簇生在細胞核周圍，且此顯示，二茂鐵羧基-pep1穿透至細胞內且改變位置至細胞質內。

3. 毒性評估

對於與二茂鐵羧酸共軛之pep1本身之毒性評估，神經幹細胞係分別在96孔培養板及24孔培養板中以4×10⁴及2.5×10⁵分裂，且在37℃下在5% CO₂培育箱中培養達至少12小時。不同濃度(0μM、0.01μM、0.1μM、1μM、10μM、100μM)之二茂鐵羧基-pep1經處理且培養達24小時，隨後使用細胞計數試劑盒-8(CCK-8)測定及乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase；LDH)活化測定進行細胞活性及毒性評估。結果係顯示在第40圖中。

如第40圖所示，經驗證，在每一濃度(0μM、0.01μM、0.1μM、1μM、10μM、100μM)下對神經幹細胞之細胞 活性及毒性沒有影響。

4. 體內實驗

A. 神經幹細胞之製備

自上述實驗(2)獲得之5×10⁶之神經幹細胞係在100mm皿中分裂。10μM之二茂鐵羧基-pep1經處理且在37℃下在5% CO₂培育箱中培養達24小時且細胞係與TrypLE(GIBCO)板分離且以遊離培養基洗滌。製備每一頭10μl之3×10⁵二茂鐵羧基-pep1標記之神經幹細胞。

B. 以二茂鐵羧基-cpp處理之神經幹細胞之移植

本文揭示之所有動物實驗係在接收韓國漢陽大學之IACUC認可之後進行。購買8周之SD大鼠且在一周之適應週期之後，在實驗中使用290g±15g體重之大鼠。實驗係以4個不同組之動物進行，例如，具有二茂鐵羧基-pep1之NSC組、不具有二茂鐵羧基-pep1之NSC組、二茂鐵羧基-pep1處理組及鹽水處理組。當移植細胞、二茂鐵羧基-pep1或鹽水至每一組時，前述各者係使用立體定向手術在SD大鼠之腦部內移植。在移植之前，以氯胺酮及隆朋(rompun)使大鼠麻醉，且頭骨部分係藉由在刮毛之後碾磨頭皮來移除。二茂鐵羧基-pep1或鹽水係立體定向移植在AP=+0.7、R=+2、V+-5.5之坐標上。

C. MRI影像

MRI影像係用來在體內觀察移植之NSC及二茂鐵羧基-pep1。MRI影像在移植之後的3天執行且使用菲利普之最佳3T MRI。氯胺酮及隆朋係用來麻醉大鼠且MRI影像係使用 多面梯度回波脈衝序列(TR=596ms，TE=16ms，截面厚度=0.7mm，平面內分解：292×290μM(分解大小0.0593mm³)截取，且擷取數量=1。

結果係顯示在第41圖至第44圖中。第41圖為表示移植具有二茂鐵羧基-pep1之幹細胞組之腦部的MRI影像，且第42圖為表示移植不具有二茂鐵羧基-pep1之幹細胞之腦部的MRI影像，第43圖為表示移植二茂鐵羧基-pep1組之腦部的MRI影像且第44圖為表示移植鹽水處理組之腦部的MRI影像。如第41圖至第44圖所示，與未以二茂鐵羧基-pep1處理過之神經幹細胞相比，以二茂鐵羧基-pep1處理過之神經幹細胞之偵測為顯著的。在另一方面，與其中移植鹽水處理組之腦部之偵測(第44圖)相比，移植二茂鐵羧基-pep1組之腦部的偵測(第43圖)係顯著的。

實例5：運輸大分子(蛋白質、DNA及小干擾RNA)之PEP1之穿膜性質

1. CPP-GFP共軛物之穿膜性質

(1)CPP-GFP共軛物之製造

SEQ ID NO：1之胜肽與綠螢光蛋白之共軛物係製造如下。

首先，如藉由第45圖所示，引子經產生以在pET28a(+)載體(Promega)中選殖綠螢光蛋白(SEQ ID NO：6，SEQ ID NO：7)。引子經產生以具有在5’處之EcoRI限制位點，在3’處之HindIII限制位點，添加緊接於部分EcoRI限制位點之21bp之GFP前半部序列，添加緊接於部分Hindlll限制位點 之終止密碼子。對於GFP-CPP蛋白質之DNA之產生，5’經產生與GFP相同且GFP之前部經產生以具有編碼CPP之序列。舉例而言，在SEQ ID NO：1之胜肽的情況下，產生具有下列序列：GAA GCG CGC CCG GCG CTG ACC AGC CGC CTG CGC TTT ATT CCG AAA(SEQ ID NO：3)。用於比較之實例，為產生TAT-GFP，下列序列：TAT GGT CGT AAA AAA CGT CAA CGT CGT CGT(SEQ ID NO：11)，經添加至GFP之前面。

EGFP係使用如第45圖中圖解所表示之載體作為樣板藉由PCR獲得。當產生引子時，在EGFP-16p(GAA GCG CGC CCG GCG CTG CTG ACC AGC CGC CTG CGC TTT ATT CCG AAA)之情況中將16p附著至EGFP之前面。在EGFP-TAT之情況中，當產生引子TAT時，TAT經產生至EGFP之前面。

當在大腸桿菌中表現引子時，16P及TAT經修飾用於大腸桿菌密碼子使用。

第46圖為表示pET-28a載體之模擬圖解。第47圖為選殖之模擬圖解。

正向引子係藉由在CPP編碼序列之後添加21 GFP序列而產生且反向引子係藉由添加GFP之C端序列之部分而產生，使用上述引子及pET-28a-GFP載體作為樣板，且執行PCR。PCR係在95℃下執行30週期，每週期5分鐘(變性)、在63℃下執行30秒(黏著)、在72℃下執行7分鐘且使用10pmol之每一引子。GFP之片段、GFP-CPP DNA係在上述PCR條件下擴展，且片段係在pET28a(+)載體及表現GFP之載體的EcoRI及HindIII部分上選殖且獲得GFP-CPP。(第 47圖)

蛋白質係藉由在細菌中轉化上述載體來分離。具體而言，大腸桿菌BL21(DE3)(Invitrogen公司，卡爾斯巴德，加利福利亞州，美國)以每一上述載體轉化且在5ml LB/康黴素中生長且移動至100ml培養基且在該培養基中培養。康黴素係以1/1000之體積比添加。載體係在37℃下旋轉培養達2至3小時且生長直至量測吸收度在0.6-0.8範圍內且處理10mM之IPTG(異丙基-β-D-1-硫代半乳糖苷)。載體經培養達額外的3至4小時且在5000rpm下離心作用達5分鐘。(第48圖)

在本文1mM IPTG之處理原理如下。處理之條件為：在處理IPTG之前，BL-21轉形體(100ml)係在37℃下以約0.6-0.8之O.D生長達2至3小時，且萃取蛋白質。在EGFP-TAT之情況下，在以IPTG處理之後，EGFP-TT在16℃下為o/n。淨化蛋白質可使用His標籤淨化方法自樣本獲得。(第49圖)

可視覺上確定所表現蛋白質之離心分離之結果，該結果顯示表示為綠色之蛋白質之過度表現。過度表現之蛋白質係根據製造者之說明使用蛋白質分離試劑盒(Prod，#_21277，Thermo Scientific，伊利諾伊州，美國)、His標籤淨化試劑盒分離。

在分離之後，蛋白質經透析淨化及濃縮。具體而言，蛋白質係使用無菌4℃ PBS淨化。首先，透析袋以PBS平衡，上述分離之蛋白質溶液以5ml注射器添加至袋，且在4℃下 藉由攪拌透析。為增加蛋白質之濃度且移除不必要物質，透析之蛋白質係藉由在BIBASPIN 20(Prod，#_VS2092，Sartorius Stedin biotech，德國)中在4℃下以3000rpm之離心分離作用濃縮。

(2)細胞系培養

5×10⁵之細胞系係使用自ATCC獲得之HepG2細胞(人類肝細胞癌細胞)在6孔培養板中分裂，且在37℃下在5% CO₂培育箱中在含有10%胎牛血清(Invitrogen公司，美國)、100μg/ml青黴素、100單元/ml鏈黴素之MEM培養基中培養達12小時。每一CHO(中國倉鼠卵巢細胞)、HeLA(人類宮頸癌細胞)、Huh7(人類肝細胞癌細胞)、MCF7(人類乳癌細胞)細胞系係在含有10%胎牛血清(Invitrogen公司，USA)、2mmol/ml L-麩醯胺、100μg/ml青黴素及100單元/ml鏈黴素之每一MEM RPMI 1640培養基中在37℃下在5% CO₂培育箱中培養。

(3)螢光顯微鏡

在以PBS洗滌細胞系之後，在OPTI-MEM中誘導饑餓達一小時。1uM之GFP(SEQ ID NO：6，SEQ ID NO：7)、TAT(YGRKKRRQRRR)-GFP(在實例5.1(1)中製造)、pep1-GFP(在實例5.1(1)中製造)經處理且在37℃下在5% CO₂培育箱中培養達18小時。在以PBS洗滌細胞系之後，在488nm下觀察細胞，其中該等細胞係在1ml之PBS中分裂。螢光顯微鏡分析顯示TAT至細胞內之穿透及在細胞核中之定位及pep1在細胞質中之定位。結果確定，pep1在MCF細胞系 中具有比TAT更高的穿膜性質且在細胞之穿透之後，pep1在細胞質中定位。(第50圖)

(4)流式細胞儀分析

在以PBS洗滌細胞系之後，在OPTI-MEM中誘導饑餓達一小時。1uM之GFP、TAT-GFP及16mer GFp經處理且在37℃下在5% CO₂培育箱中培養達2小時。在重複三次以PBS洗滌之步驟之後，細胞系係懸浮在0.5ml 1X FACS緩衝劑中且該等細胞系之螢光係以FACS Calibur(美國BD公司)分析。以未處理之細胞系作為對照物比較及分析GFP、TAT-GFP及pep1-GFP之細胞攝入態樣。與pep1組合之GFP係以各種細胞系處理且執行流式細胞儀分析。結果顯示，在MCF7細胞系中，pep1之細胞攝入比TAT增加了超過2倍，但在其他細胞系中，pep1之細胞攝入不高於TAT。(第51圖)

2. DNA共軛物之穿膜性質

(1)DNA(聚離胺酸-CPP)之製造

具有先前已知穿膜性質之胜肽(GGG，TAT)及源自端粒酶之胜肽hTERT係與15mer離胺酸組合。聚離胺酸中有豐富的陽離子且因此該等陽離子與陰離子DNA良好組合。胜肽合成係由Peptron公司執行，所合成胜肽係以具有1mg/ml之濃度的蒸餾水稀釋。第52圖表示用於實驗之胜肽之主要結構。

第53圖為用於實驗之胜肽之模擬圖解。

(2)細胞系培養

每一CHO(中國倉鼠卵巢細胞)、HeLA(人類宮頸 癌細胞)、Huh7(人類肝細胞癌細胞)、MCF7(人類乳癌細胞)細胞系係分別在含有10%胎牛血清(Invitrogen公司，美國)、2mmol/ml L-麩醯胺、100μg/ml青黴素及100單元/ml鏈黴素之DMEM、MEM及RPMI 1640培養基中在37℃下在5% CO₂培育箱中培養。

(3)凝膠電泳

為研究DNA-胜肽複合體之組合程度，0.05-5ug之胜肽與0.5ug之Generuler 1kb DNA ladder(Fermentas)經混合且在室溫下備用達10分鐘。DNA-胜肽複合體經注入含有0.5mg/ml溴化乙錠(EtBr)之1%瓊脂糖凝膠內且在1倍TAE緩衝劑中在100v下反應達30分鐘。

胜肽-DNA複合體之電泳之結果顯示，所有胜肽係與DNA組合良好(第54圖)。當胜肽與DNA經良好組合時，在中和DNA時發生DNA之固定。根據此實驗之結果，當(w/w)超過1時觀察到固定。

(4)使用pep1胜肽之螢光素酶之運輸能力之分析。

5×10⁴至1×10⁵之上述指定細胞系係在12孔培養板之每一孔中培養且以PBS洗滌且以OPTI-MEM置放培養基。piRES2-EGFP載體係藉由將螢光素酶DNA嵌入OPTI-MEM及pIRES2-EGFP載體而產生。2ug之pIRES2-EGFP螢光素酶載體係與每一胜肽之1、2、4、8倍(w/w)混合且產生100ul/孔總體積之複合體。所產生之DNA-胜肽複合體經嵌入每一孔內且在37℃下在5% CO₂中培養達4小時。在洗滌細胞之後，培養基係以完全培養基替換且在37℃下在5% CO₂中培養達 額外的20小時。培養基係在DNA-胜肽複合體注射之後24小時移除，且在以PBS洗滌細胞兩次之後，50ul之裂解緩衝劑經注入每一孔內。對細胞溶解產物執行螢光素酶測定，細胞溶解產物係由在室溫下細胞搖動達15分鐘而獲得。發光係藉由添加100ul之螢光素酶基質至20ul之細胞溶解產物而量測。結果記錄藉由BSA測定標準化之平均值。

螢光素酶分析之結果驗證，hTERT-pk在所有濃度下顯示比對照組(TAT-pK，GGG-pK)更高的螢光素酶表現。特別地，在與DNA相比8倍的濃度下，與TAT-pK及GGG-pK相比，hTERT-pK顯示顯著水準之螢光素酶表現。(第55圖)

3. 小干擾RNA-CPP之穿膜性質

(1)小干擾RNA-CPP共軛物之製造

胜肽之鹼性框架，三苯基-巰基乙醯基-Ahx-E(OtBu)-A-R(Pbf)-P-A-L-L-T(tBu)-R(Pbf)L-R(Pbf)-F-I-P-K(Boc)-2-氯-三苯甲基樹脂係根據實例1中描述之製造方法而製造。Ahs在本文意指6-胺基己酸。所製造之三苯基-巰基乙醯基-Ahx-E(OtBu)-A-R(Pbf)-P-A-L-L-T(tBu)-R(Pbf)L-R(Pbf)-F-I-P-K(Boc)-2-氯-三苯甲基樹脂之合成係藉由HPLC及質量分析驗證。

SiLuc-pep1共軛物係藉由小干擾RNA序列與上述所合成pep1之共軛作用而製造。具體而言，用於與pep1共軛之小干擾RNA序列係如下。

SiLuc正義(5’->3’)：CUUACGCUGAGUACUUCGA (dTdT)(SEQ ID NO：4)

SiLuc反義(5’->3’)：UCGAAGUACUCAGCGUAA(dTdT)(SEQ ID NO：5)

製造方法為，將藉由韓國Bionia公司供應之馬來醯亞胺修飾之SiLuc(75umol)熔融在PBS緩衝劑(1x1ml)中且藉由在室溫下反應達2小時來共軛。共軛係藉由使胜肽之硫醇基與小干擾RNA之馬來醯亞胺反應而執行。共軛反應係使用Ellman’s試劑及5,5'-二硫雙-(2-硝苯甲酸或DTNB)來驗證。Ellman’s試劑為用來量化樣本中之硫醇基之濃度或數量的化學製品。

用於實驗中之小干擾RNA序列係用於螢光素醇DNA目的及在我們請求胜肽合成之情況下由Peptron公司提供之以下小干擾RNA：siLuc-擾亂之pep1[siLuc與巰基乙醯基-Ahx-LRALPKRPFISRLTEA共軛]、siLuc-Tat(47-57)[siLuc與巰基乙醯基-Ahx-YGRKKRRQRRR共軛]、siLuc-穿膜肽[siLuc與巰基乙醯基-Ahx-RQIKIWFQNRRMKWKK共軛]、siLuc-pep1[siLuc與巰基乙醯基-Ahx-EARPALLTSRLRFIPK共軛]。Si0Cont-擾亂之pep1、siCont-Tat(47-57)、siCont-穿膜肽、siCont-pep1係用作對照物。商業上由BIonia公司出售之螢光素酶小干擾RNA及陰性小干擾RNA(Cat#_：SN-1012，AccuTarget陰性對照小干擾RNA)係分別用作陽性對照物及陰性對照物。

小干擾RNA之序列係如下。

SiLuc正義(5’->3’)： CUUACGCUGAGUACUUCGAdTdT(SEQ ID NO：4)

SiLuc反義(5’->3’)：UCGAAGUACUCAGCGUAAGdTdT(SEQ ID NO：5)

SiCont之序列係如下。

SiCont正義(5’->3’)：GCACCUAUAACAACGGUAGdTdT(SEQ ID NO：8)

SiCont反義(5’->3’)：CUACCGUUGUUAUAGGUGCdTdT(SEQ ID NO：9)

(2)細胞系培養

自ATCC獲得之Huh7(人類肝細胞癌)細胞係在含有10%胎牛血清(Invitrogen公司，卡爾斯巴德，加尼福利亞州，美國)、2mmol/ml L-麩醯胺、100μg/ml青黴素及100單元/ml鏈黴素之RPMI 1640培養基(Hyclon)中在37℃下在5% CO₂培育箱中培養。

(3)螢光素酶測定

將2×10⁵之Huh7細胞嵌入24孔培養板之每一孔內且生長。細胞上之短暫轉染係使用2ug之螢光素酶目標DNA及lipofectamin 2000(Invitrogen公司，卡爾斯巴德，加尼福利亞州，美國)來執行。在4小時之後，lipofectamin 2000係以PBS完全洗滌若干次；400nm之最終濃度之小干擾RNA係在500ul之Opti-MEM(Invitrogen公司，卡爾斯巴德，加尼福利亞州，美國)中處理且在37℃培育箱中反應達16小時。為終止反應，細胞係以PBS洗滌且使用Reporter Lysis Buffer(Progema公司，麥迪遜市，威斯康星州，美國)溶液 溶解蛋白質，且發光係使用螢光素酶試劑(Promega公司，麥迪遜市，威斯康星州，美國)藉由光度計(Turner BioSystem，桑尼維爾市，加尼福利亞州，美國)量測。小干擾RNA之功效係藉由Bradford蛋白質測定來更正。

為驗證pep1之穿膜性質，產生用於螢光素酶目的之小干擾RNA且使用Huh7(人類肝細胞癌)細胞及CHO細胞系量測螢光素酶活化。結果驗證：與穿膜肽及pep1在與Huh細胞系中之對照物組合之小干擾RNA中的情況比較，穿膜肽及pep1在與螢光素酶組合之小干擾RNA中之活化減少了近似28%、20%。與此形成對比，當經擾亂且TAT處於與螢光素酶及對照物組合之小干擾RNA中時，沒有觀察到活化之顯著差異。同樣，當比較穿膜肽及pep1之Tat及與螢光素酶組合之擾亂形式及小干擾RNA之間的螢光素酶活化時，分別觀察到27%、55%、40%之活化抑制。(第57圖)

與其他小干擾RNA不同，與pep1共軛之小干擾RNA在CHO細胞中顯示約30%之螢光素酶活性抑制。因此，pep 1之穿膜能力可藉由使用小干擾RNA觀察抑制螢光素酶活性而確定(第58圖)。

(4)小干擾RNA之運輸能力之流式細胞儀分析

用於實驗中之小干擾RNA序列以HBx DNA及與螢光素組合之siHBV、正義-5’GAG GAC UCU UGG ACU CUC A dTdT-3’(SEQ ID NO：3)、反義5’UGA GAG UCC AAG AGUC CCU C dTdT-3’)3’(SEQ ID NO：13)為目標。小干擾RNA合成係由韓國BIONEER公司執行且所合成之小干擾RNA係藉由 HPLC淨化。

1×10⁵之HepG2係在一天前培養在24孔培養板之每一孔中且培養基係以Opti-MEM替換。在細胞培養之後4小時，每一莫耳比之FITC標記之小干擾RNA(siHBV)與胜肽經添加且與300ul之Opti-MEM混合以產生複合體。小干擾RNA經嵌入以具有10uM之最終濃度且在37℃下在5% CO₂中培養達一小時。胰蛋白經處理且在室溫下備用達5分鐘，且以PBS洗滌三次。500ul之FACS緩衝劑經注入每一孔內，且不同於細胞之螢光物質係藉由在300rpm及4℃下重複離心分離作用三次來移除。FITC螢光之10000細胞之總體係藉由流式細胞儀分析(BD FACSCalibur System；BD公司，法國)量測。藉由流式細胞儀分析之細胞攝入分析之結果驗證，在上述20莫耳比之濃度下，hTERT-pk顯示比對照組(RGD-pK，GGG-pK)高了2.5倍之FITC標記之小干擾RNA細胞攝入(第56圖)。

實例6：粒線體內CPP-FITC共軛物之局部運輸能力

1. 顯微鏡分析

(1)細胞系培養

使用自ATCC獲得之MCH7(人類乳腺癌)附著型細胞系。細胞系係在含有10%胎牛血清(Invitrogen公司，美國)、100μg/ml青黴素、100單元/ml鏈黴素之RPMI 1640培養基(Sigma)中在37℃下在5% CO₂培育箱中培養。

FITC組合至胜肽(SEQ ID NO：1)之C端之共軛物係 如上述實例2中所描述而製造。

(2)共軛焦顯微鏡分析

上述細胞系經分裂以佔據2腔室孔式玻片(NUNC，Lab Tek)表面之50%，且上述細胞系係在37℃下在5% CO₂培育箱中培養達12小時。隨後，培養基經移除且以PBS洗滌一次且在1ml之OPTI-MEM(Sigma)中培養達一小時且誘導饑餓。FITC經組合至胜肽(SEQ ID NO：1)之C端的100uM共軛物經添加至每一腔室以變為50μl(10μM)且在37℃下在5% CO₂培育箱中培養達2小時。

隨後，培養基經移除且以PBS(磷酸鹽緩衝鹽水，pH 7.4)洗滌三次。在每一腔室，0.5mL之4%多聚甲醛(PFA)經添加且在室溫下固定達20分鐘。細胞係以1xPBS洗滌且以4% PFA迅速洗滌兩次。

上述細胞係以500nM之TO-PRO-3碘化物642/661nm(Invitrogen公司)處理且在室溫下染色細胞之細胞核達10分鐘。在於室溫下處理粒線體達15分鐘之後，粒線體係以250nM之mototracker深紅FM 644/655nm(Invitrogen公司)染色。移除溶液，且細胞係以1xPBS洗滌三次，且移除塑膠腔室。在移除腔室之後，將VECTASHIELD封固劑(載體實驗室)滴在玻片上，覆蓋載玻片且在無光情況下執行共軛焦雷射掃描系統。FITC係以TO-PROR-3碘化物(Invitrogen公司)在488nm波長下量測且mitotrackerR深紅(Invitrogen公司)係在633nm波長下量測。

結果係顯示在第59圖中。以組合在胜肽(SEQ ID NO：1)之C端之FITC與粒線體定位標記物(mototracker®深紅FM 644/655nm(invitrogen公司))染色之共軛物的結果是，(A)單獨處理在MCF細胞中在胜肽(SEQ ID NO：1)之C端組合FITC之共軛物，(B)單獨處理粒線體定位標記物(mototracker深紅FM 644/665nm(Invitrogen公司))，(C)細胞相位對比造影，(D)A與B之影像之組合。利用該等結果可驗證，源自端粒酶之胜肽係在粒線體內定位。

2. 抗體組合

根據實例5.1(1)中所描述之方法製造之pep-GFP共軛物係在自ATCC獲得之2×10⁷之MCF7(人類乳腺癌)附著型細胞系中處理且以粒線體hsp70抗體執行西方墨蹟法。作為比較實例，在僅GFP之處理、11mer-GFP之處理、ccg-GFP之處理之後，以hsp70抗體執行西方墨蹟分析。具體而言，如下文所述方法執行西方墨蹟分析。

製備2×10⁷之MCF細胞系，且根據相應協定使用粒線體分離試劑盒(Themo science，#89874)分離粒線體。具體而言，將800μl之試劑A添加至細胞聚合體(cell pellet)且在中等速率下渦旋振盪達5秒。隨後，將細胞置放在冰中達2分鐘且將細胞懸浮液移動至Dounce組織磨床且在冰上研磨懸浮液。隨後，將裂解之細胞移動至原始試管。將800μl之試劑C添加至原始試管且以200μl之試劑A沖洗磨床。在緩慢混合之後，將700g之細胞離心作用達10分鐘。將上清液移動至新試管，且在3000g下再次離心作用達15分鐘。將上清液廢棄且將500μl之試劑C添加至含有粒線體的聚合體且在 12000g下離心作用達5分鐘。將上清液廢棄且將聚合體置放在冰中。藉由添加2% CHAPS至TBS(25mM Tris，0.15M NaCl，pH 7.2)產生之100ul緩衝液經渦旋振盪達一分鐘。將緩衝液在12000g下離心作用達2分鐘，可溶粒線體蛋白質係與如下文之測試蛋白質免疫沉澱反應。

測試蛋白質為如實例5.1(1)中所述而製造之pep1-GFP共軛物，GFP、11mer-GFP、ccg-GFP係用作對照物。11mer-GFP為11mer蛋白質與GFP組合之共軛物，其中11mer蛋白質由源自HBV之11種胺基酸組成。ccg為乙型肝炎病毒之複製起點。

為附著每一上述測試蛋白質及對照蛋白質至樹脂，製備6xHis標記之鈷樹脂(Prod.#89964，Thermo Scientific，UL，美國)。將50-100μl之樹脂添加至管柱且以500μl之洗滌緩衝液洗滌五次。將每一表現蛋白質添加至管柱，藉由在4℃下混合達30分鐘至1小時而留置。隨後，將500μl之表現蛋白質樹脂聚合物以洗滌緩衝液洗滌五次。將上文製備之粒線體上清液添加在此且在4℃下攪拌放置過夜。在第二天，將樹脂以相同方法洗滌，樹脂係藉由添加200μl之溶析緩衝液來溶析。結果係顯示在第60圖中。結果驗證，粒線體之hsp70抗體僅組合至pep1-GFP。

<110> 凱爾傑姆維克斯有限公司 金商在

<120> 穿膜胜肽以及包含該胜肽之共軛物及組成物(一)

<130> OF13P163/TW

<150> KR10-2012-0104173

<151> 2012-09-19

<150> KR10-2012-0109207

<151> 2012-09-28

<150> KR10-2013-0017046

<151> 2013-02-18

<150> KR10-2013-0043635

<151> 2013-04-19

<160> 13

<170> PatentIn version 3.2

<210> 1

<211> 16

<212> PRT

<213> 人

<400> 1

<210> 2

<211> 1132

<212> PRT

<213> 人

<400> 2

<210> 3

<211> 48

<212> DNA

<213> 人

<400> 3

<210> 4

<211> 21

<212> RNA

<213> 人工序列

<220>

<223> siRNA正義(sense)

<220>

<221> 變化(variation)

<222> (20)..(21)

<223> n為去氧胸腺嘧啶苷(dT)

<400> 4

<210> 5

<211> 21

<212> RNA

<213> 人工序列

<220>

<223> siRNA反義(antisense)

<220>

<221> 變化

<222> (20)..(21)

<223> n為去氧胸腺嘧啶苷(dT)

<400> 5

<210> 6

<211> 239

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 綠螢光蛋白

<400> 6

<210> 7

<211> 720

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 綠螢光蛋白

<400> 7

<210> 8

<211> 21

<212> RNA

<213> 人工序列

<220>

<223> siCont正義

<220>

<221> 變化

<222> (20)..(21)

<223> n為去氧胸腺嘧啶苷(dT)

<400> 8

<210> 9

<211> 21

<212> RNA

<213> 人工序列

<220>

<223> siCont反義

<220>

<221> 變化

<222> (20)..(21)

<223> n為去氧胸腺嘧啶苷(dT)

<400> 9

<210> 10

<211> 11

<212> PRT

<213> 人類免疫缺乏病毒

<400> 10

<210> 11

<211> 33

<212> DNA

<213> 人類免疫缺乏病毒

<400> 11

<210> 12

<211> 21

<212> RNA

<213> 人工序列

<220>

<223> siRNA正義

<220>

<221> 變化

<222> (20)..(21)

<223> n為去氧胸腺嘧啶苷(dT)

<400> 12

<210> 13

<211> 21

<212> RNA

<213> 人工序列

<220>

<223> siRNA反義

<400> 13

Claims (24)

1. 一種一胜肽於輸送一貨物(cargo)至一細胞內部之用途，其中該胜肽為一細胞穿膜乘載胜肽並且由SEQ ID NO：1之胺基酸序列所組成。
2. 如請求項1所述之用途，其中該貨物包含一有效成分，該有效成分為選自以下各者中之至少一者：蛋白質、核酸、胜肽、脂質、礦物、糖、奈米粒子、生物製品、對比造影劑、藥物及化合物。
3. 如請求項2所述之用途，其中該有效成分為DNA或RNA，及其中當該有效成分為DNA時，該乘載胜肽係經由聚離胺酸與DNA共軛。
4. 如請求項1所述之用途，其中該乘載胜肽及該有效成分係經由一共價鍵組合，藉由一連接子選擇性介導。
5. 如請求項1所述之用途，其中該乘載胜肽及該有效成分係經由非共價鍵組合。
6. 如請求項2所述之用途，其中該有效成分為一蛋白質或一胜肽。
7. 如請求項6所述之用途，其中該有效成分為一細胞介素、抗體、抗體之片段、治療酶、可溶受體或配位子。
8. 如請求項1所述之用途，其中該乘載胜肽係與螢光異硫氰酸鹽組合。
9. 如請求項1所述之用途，其中該乘載胜肽係與綠螢光蛋白(Green Fluorescent Protein；GFP)組合。
10. 如請求項1所述之用途，其中該有效成分係與該上述乘載胜肽之一C端組合。
11. 如請求項1所述之用途，其中該有效成分之該功效靶為癌細胞、免疫細胞或成纖維細胞。
12. 如請求項11所述之用途，其中該癌細胞為選自由以下各者組成之群組的至少一種癌細胞：肝癌細胞、乳癌細胞及白血病細胞，其中該免疫細胞為選自由以下各者組成之群組的至少一種免疫細胞：T淋巴球細胞、B細胞及單核細胞。
13. 如請求項1所述之用途，其中該有效成分為定位至細胞質內所必要的一物質，且該乘載胜肽執行該有效成分至細胞質內之局部輸送。
14. 如請求項13所述之用途，其中該有效成分為定位至粒線體內所必要的一物質，且該乘載胜肽執行該有效成分至粒線體內之局部輸送。
15. 如請求項2所述之用途，其中該對比造影劑係選自由以下各者組成之群組：不透射線對比造影劑、順磁對比造影劑、超順磁對比造影劑及CT對比造影劑。
16. 如請求項5所述之用途，其中該對比造影劑係基於鐵。
17. 如請求項16所述之用途，其中該對比造影劑為一二茂鐵羧酸鹽。
18. 如請求項2所述之用途，其中該對比造影劑係用於對比造影一細胞。
19. 如請求項18所述之用途，其中該細胞為一幹細胞。
20. 如請求項2所述之用途，其中該有效成分係用於治療或預防疾病。
21. 如請求項2所述之用途，其中該有效成分為功能性化妝品之一有效成分。
22. 如請求項2所述之用途，其中該有效成分為健康功能性食品之一有效成分。
23. 如請求項1至22中任一項所述之用途，其中該乘載胜肽為局部地移動至一細胞質內且執行局部地輸送該有效成分至細胞質內之一作用的一胜肽。
24. 如請求項1至22中任一項所述之用途，其中該乘載胜肽為局部地移動至一粒線體內且執行局部地輸送該有效成分至粒線體內之一作用的一胜肽。