CN114349821B - 蛙皮抗氧化肽及其基因在制药和抗皱化妆品的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于生物医学领域，公开了蛙皮抗氧化肽及其基因在制药和抗皱化妆品的应用。所述抗氧化肽的氨基酸序列为FWERCSRWLLN。该抗氧化肽稳定性好，且具有显著的自由基清除、抗氧化应激、治疗神经退行性疾病、抗炎、调节免疫、中和LPS、促细胞增殖和淡化皱纹抗衰老活性等作用，可应用于制备具有抗氧化、消炎、增强免疫力或祛皱等功能的药品和化妆品。
Description
技术领域
本发明涉及生物医学领域，特别涉及蛙皮抗氧化肽及其基因在制药和抗皱化妆品的应用。
背景技术
自由基和其他活性氧在广泛的正常生理条件下产生，当抗氧化防御系统和自由基产生系统之间的平衡被扰乱时，氧化应激被诱导致使多种疾病发生，包括心血管疾病、恶性肿瘤和自身免疫性疾病和神经退行性疾病。脂质过氧化是导致氧自由基相关损伤发展的过程，是细胞膜损伤的主要原因之一。另外，氧化应激被认为与多种神经退行性疾病如老年痴呆症、帕金森氏症有关(Food Chemistry,2008,107,1485–1493)。
脂多糖(LPS)是革兰氏阴性菌的细胞壁成分，可引起严重炎症、感染性休克和全身炎症反应综合征(Lebensmittel-Wissen-schaft und-Technologie,2008,41(7):1344–1349.)。LPS诱导的氧化应激涉及自由基，如活性氧(Reactive oxygen species，ROS)和活性氮。
皮肤状态的平衡受到ROS的影响，一旦平衡被打破，健康组织将遭受持续破坏，其引起的炎症过程会导致色斑、皱纹等皮肤问题。日常补充抗氧化剂有利于预防疾病和提高生活质量，这些抗氧化剂通过减少自由基起作用。抗氧化酶或天然产物可以通过抗氧化作用减轻氧化应激。由于丁基羟基甲苯(BHT)、水杨酸(BHA)和没食子酸丙酯等化学合成抗氧化剂比天然抗氧化剂具有更好的效果和更便宜的价格，因此被广泛应用于食品行业中，但是，目前有研究发现合成抗氧化剂对人体肝、脾、肺等器官有积蓄性致癌作用，从而引起了人们对其安全性的担忧，并且开始慢慢限制其在食品中的使用(Food Processing,1993,12,54–56)。α-生育酚是一种普遍适用的天然抗氧化剂，它能有效保持食品中油脂的稳定性，但却不利于食品保存。
中国博大的多物种天然生物资源是结构多样性小分子有机化合物的重要来源。泽陆蛙(Fejervarya limnocharis)作为我国南方常见蛙类，现已成为人工饲养的经济蛙之一，然而目前对其皮肤药理活性物质的研究较少。
发明内容
本发明旨在至少解决现有技术中存在的技术问题之一。为此，本发明提出一种抗氧化肽，其稳定性好，且具有显著的自由基清除、抗氧化应激、治疗神经退行性疾病、抗炎、调节免疫、中和LPS和淡化皱纹抗衰老活性。
本发明的第一个方面，提供一种抗氧化肽，所述抗氧化肽的氨基酸序列为FWERCSRWLLN(SEQ ID NO.1)。
在本发明的一些实施方式中，所述抗氧化肽由11个氨基酸组成，SEQ ID NO.1所示序列的三字母缩写为Phe Trp Glu Arg Cys Ser Arg Trp Leu Leu Asn。
在本发明的一些实施方式中，所述抗氧化肽的分子量为1509.82Da，等电点为8.25。
在本发明的一些实施方式中，所述抗氧化肽来源于泽陆蛙。
在本发明的一些实施方式中，所述抗氧化肽可直接从泽陆蛙中分离纯化制备，也可以根据其多肽序列由生物公司通过化学合成制备。
在本发明一些优选的实施方式中，所述从泽陆蛙中分离纯化制备的所述抗氧化肽的方法包括但不限于高效液相色谱(HPLC)。
在本发明的一些实施方式中，所述抗氧化肽至少具有抗氧化、消炎、增强免疫力、祛皱中的任一种功能。
在本发明的一些实施方式中，所述抗氧化肽能够中和LPS。
在本发明的一些优选的实施方式中，所述抗氧化肽与LPS的结合常数KD为433e-9±208e-9M。
在本发明的一些优选的实施方式中，所述抗氧化肽与LPS的结合位点数N为0.471±1.6e-2。
本发明的第二个方面，提供编码本发明第一方面的抗氧化肽的核酸分子，所述核酸分子的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
在本发明的一些实施方式中，编码本发明第一方面的抗氧化肽的所述核酸分子序列由222个核苷酸组成，其核苷酸序列如下：
5’-ATGTTCACCTTGAAGAAATCCCTGTTACTCCTTTTCTTCCTTGGGACCATCAACT TATCTTTCTGTGAGGAAGAGAGAAATGCTGATGAGGAAGAAAGAAGAGATGATCCCG ATAAAATGGATGCTGAAGTGCAAAAACGTTTTTGGGAGCGTTGTTCAAGGTGGCTTCT AAATTAGTACCAGCAGCTATTTGTTCAATTTCTAAAAAAAAAAAAAAAAAAA-3’(SEQ ID NO.2)。
在本发明的一些实施方式中，编码本发明第一方面的抗氧化肽的所述核酸分子的核苷酸序列优选为SEQ ID NO.2所示序列的第142-174位核苷酸。
在本发明的一些优选的实施方式中，编码本发明第一方面的抗氧化肽的所述核酸分子的核苷酸序列优选为5’-TTTTGGGAGCGTTGTTCAAGGTGGCTTCTAAAT-3’(SEQ ID NO.7)，共包括33个核苷酸。
在本发明的一些优选的实施方式中，根据SEQ ID NO.7所示的核苷酸序列编码得到的多肽为具有功能的成熟抗氧化肽。
本发明的第三个方面，提供一种试剂，所述试剂中含有(1)～(8)中的任意一种：
(1)本发明第一方面的核酸分子；
(2)含有本发明第一方面的核酸分子的表达盒；
(3)含有本发明第一方面的核酸分子的重组载体；
(4)含有(2)中所述表达盒的重组载体；
(5)含有本发明第一方面的核酸分子的重组微生物；
(6)含有(2)中所述表达盒的重组微生物；
(7)含有(3)中所述重组载体的重组微生物；
(8)含有(4)中所述重组载体的重组微生物。
在本发明的一些实施方式中，所述试剂中含有(9)～(12)中的任意一种：
(9)含有本发明第一方面的核酸分子的转基因动物细胞；
(10)含有(2)中所述表达盒的转基因动物细胞；
(11)含有(3)中所述重组载体的转基因动物细胞；
(12)含有(4)中所述重组载体的转基因动物细胞；
所述细胞不包括动物的胚胎干细胞、生殖细胞和受精卵。
在本发明的一些实施方式中，所述试剂包括但不限于用于本发明第一方面的抗氧化肽的制备。
本发明的第四个方面，提供一种本发明第一方面的抗氧化肽在制备神经退行性疾病治疗或预防药物中的应用；所述神经退行性疾病包括帕金森病和阿尔兹海默症中的至少一种。
在本发明的一些实施方式中，所述抗氧化肽的存在形式包括但不限于丸剂、片剂、胶囊剂、注射剂和药学上可接受的载体。
本发明的第五个方面，提供本发明第一方面的抗氧化肽在制备食品或化妆品中的应用。
在本发明的一些实施方式中，所述化妆品具有(1)～(4)中的至少一种作用：
(1)抗氧化；
(2)消炎；
(3)增强免疫力；
(4)祛皱。
在本发明的一些实施方式中，所述化妆品包括护肤面霜、乳液、精华、护肤水、面膜中的任一种。
本发明的第六个方面，提供本发明第三方面的试剂在制备食品、药品或化妆品中的应用。
在本发明的一些实施方式中，所述药品或化妆品具有(1)～(4)中的至少一种作用：
(1)抗氧化；
(2)消炎；
(3)增强免疫力；
(4)祛皱。
在本发明的一些实施方式中，所述化妆品包括护肤面霜、乳液、精华、护肤水、面膜中的任一种。
在本发明的一些实施方式中，所述药品的剂型包括丸剂、片剂、膏剂、粉剂、胶囊剂、注射剂和药学上可接受的载体中的任一种。
本发明的有益效果是：
本发明提供了一种抗氧化肽。该抗氧化肽稳定性好，且具有显著的自由基清除、抗氧化应激、治疗神经退行性疾病、抗炎、调节免疫、中和LPS、促细胞增殖和淡化皱纹抗衰老活性等作用，可应用于制备具有抗氧化、消炎、增强免疫力或祛皱等功能的药品和化妆品。
本发明提供了一种编码上述抗氧化肽的核酸分子。由该核酸分子推导编码具有成熟功能抗氧化肽的氨基酸序列，利用该核酸分子合成的该抗氧化肽具有结构简单、人工合成方便、活性强的特点，合成的抗氧化肽稳定性好，具有很强的自由基清除、抗氧化应激、治疗神经退行性疾病、抗炎、调节免疫、中和LPS、促细胞增殖和淡化皱纹抗衰老活性。
本发明提供了一种试剂。含上述核酸分子、表达盒或重组载体的试剂便于后续对其进行基因编辑。其中的重组微生物、转基因细胞等能够稳定、持久表达该抗氧化肽，使用方便，操作简单，利用其表达得到的抗氧化肽经纯化或不纯化便可用于制备具有抗氧化、消炎、增强免疫力或祛皱作用的药品或化妆品。同时，该试剂还能够应用于制备具有抗氧化、消炎、增强免疫力或祛皱等功能的药品和化妆品。
附图说明
下面结合附图和实施例对本发明做进一步的说明，其中：
图1为本发明泽陆蛙抗氧化肽HPLC纯化鉴定结果；
图2为本发明泽陆蛙抗氧化肽质谱鉴定结果；
图3为本发明泽陆蛙抗氧化肽自由基清除率的检测结果(DPPH法)；
图4为本发明泽陆蛙抗氧化肽自由基清除率的检测结果(ABTS法)；
图5为本发明泽陆蛙抗氧化肽对双氧水(H2O2)诱导的PC12细胞内的超氧化物歧化酶(SOD)活性的影响图(#表示对照组2与对照组1相比，有显著性差异(p<0.5)；**表示实验组与对照组2相比，有极显著性差异(p<0.1))；
图6为本发明泽陆蛙抗氧化肽对双氧水诱导的PC12细胞内的过氧化氢酶(CAT)活性的影响图(###表示对照组2与对照组1相比，有极显著性差异(p<0.01)；**表示实验组与对照组2相比，有极显著性差异(p<0.1))；
图7为本发明泽陆蛙抗氧化肽对双氧水诱导的PC12细胞内的ROS水平的影响图(###表示对照组2与对照组1相比，有极显著性差异(p<0.01)；**表示实验组与对照组2相比，有极显著性差异(p<0.1)，ns表示实验组与对照组2相比，无显著性差异(p>0.05))；
图8为本发明泽陆蛙抗氧化肽对双氧水诱导的PC12细胞的凋亡率的影响图(###表示对照组2与对照组1相比，有极显著性差异(p<0.01)；*表示实验组与对照组2相比，有显著性差异(p<0.5)，***表示实验组与对照组2相比，有显著性差异(p<0.01))；
图9为本发明泽陆蛙抗氧化肽对双氧水诱导的大鼠肝损伤的丙二醛(MDA)水平的影响图(###表示对照组2与对照组1相比，有极显著性差异(p<0.01)；**表示实验组与对照组2相比，有极显著性差异(p<0.1))；
图10为本发明泽陆蛙抗氧化肽对小鼠急性炎症模型的足掌厚度的影响图；
图11为本发明泽陆蛙抗氧化肽对小鼠急性炎症模型体内促炎细胞因子IL-6(a)、IL-1β(b)和TNF-α(c)水平的影响图(##表示角叉菜胶组与对照组相比，有极显著性差异(p<0.1)，###表示角叉菜胶组与对照组相比，有极显著性差异(p<0.01)；**表示阳性药组或泽陆蛙抗氧化肽组与角叉菜胶组相比，有极显著性差异(p<0.1)，***表示阳性药组或泽陆蛙抗氧化肽组与角叉菜胶组相比，有极显著性差异(p<0.01))；
图12为本发明泽陆蛙抗氧化肽与LPS的结合作用的检测结果；
图13为本发明泽陆蛙抗氧化肽对人成纤维细胞增殖的影响图(**表示实验组与对照组相比，有极显著性差异(p<0.1)，***表示实验组与对照组相比，有极显著性差异(p<0.01))。
具体实施方式
为了让本领域技术人员更加清楚明白本发明所述技术方案，现列举以下实施例进行说明。需要指出的是，以下实施例对本发明要求的保护范围不构成限制作用。
下列实施例中采用的试剂、方法和设备均为本技术领域常规试剂、方法和设备。下列实施例中未注明具体实验条件的试验方法，通常按照常规实验条件或按照制造厂所建议的实验条件。
以下实施例中所用泽陆蛙不属于保护物种，无需特定许可，采集自广东省广州市白云区乡野(23.12°N,113.28°E)；所用PC12细胞购自南方医科大学药学院细胞保藏中心，该细胞是一种神经细胞，被广泛应用于神经生理和神经药理学研究；所用HSF细胞为人成纤维细胞，购自南方医科大学药学院细胞保藏中心。
泽陆蛙抗氧化肽基因的克隆
I、泽陆蛙皮肤总RNA提取：
活体泽陆蛙用水清洗干净，处死后放入液氮中速冻4h，取约300mg泽陆蛙皮肤组织，加入10mL总RNA提取缓冲液(Trizol溶液，购自GIBCOBRL)，于20mL玻璃匀浆器中匀浆30min。加入等体积酚/氯仿溶液，剧烈混匀，室温放置10min，在4℃、12000rpm条件下离心10min，弃沉淀。向上清中加入等体积的异丙醇，室温放置10min，在4℃、12000rpm条件下离心10min，弃上清。沉淀用75％乙醇洗涤一次，干燥后的沉淀物即为泽陆蛙皮肤总RNA。
II、泽陆蛙皮肤mRNA的纯化：
使用mRNA Isolation Systems试剂盒(购自PROMEGA)对步骤I中得到的泽陆蛙皮肤总RNA进行分离纯化。具体步骤如下：
取步骤I中得到的泽陆蛙皮肤总RNA500μg溶于500μL DEPC水中，65℃水浴10min，然后加入3μL生物素化Oligo(dT)探针和13μL 20×SSC溶液(来自mRNAIsolation Systems试剂盒)，混匀，放置室温冷却，称为A液。
将磁珠(来自mRNA Isolation Systems试剂盒)轻弹混匀，至磁力架吸附30s，弃上清。随后向磁珠中加入0.3mL 0.5×SSC溶液，至磁力架吸附30s，弃上清。最后用0.1mL 0.5×SSC溶液重悬磁珠，称为B液。
将A液加入B液中，室温放置10min，至磁力架吸附30s，弃上清，用0.2mL 0.1×SSC溶液洗涤4次，弃上清，随后加入0.15mL DEPC水重悬沉淀，至磁力架吸附30s，将上清移至新的试管中，称为C液。再向沉淀中加入0.15mL DEPC水重新悬浮，至磁力架吸附30s，移上清至C液中，该混合液称为D液(D液中含纯化后的泽陆蛙皮肤mRNA)。
向D液中加入1/10体积3M乙酸钠(pH5.2)和等体积异丙醇，于-70℃放置30min后，于4℃、12000rpm条件下离心10min，弃上清，将沉淀溶解于10μL DEPC水中得到泽陆蛙皮肤mRNA。
III、泽陆蛙皮肤cDNA文库构建：
使用CreatorTM SMARTTM cDNA Library Construction Kit质粒cDNA文库构建试剂盒(购自CLONTECH)合成cDNA双链(包括以下步骤a和b)，使用SV Gel and PCRClean-Up System试剂盒(购自PROMEGA)抽提回收PCR产物(包括以下步骤c)，使用pMDTM818-VcoT Vector Cloning Kit试剂盒(购自Takara)将纯化后的cDNA产物连接到pMD18-T载体上。具体步骤如下：
a.cDNA第一链合成(mRNA反转录)：
在0.5mL无菌的离心管加入1μL SMART IV寡聚核苷酸、1μL CDS III/3’PCR引物(来自CreatorTM SMARTTM cDNA Library Construction Kit质粒cDNA文库构建试剂盒)、1μL步骤II得到的泽陆蛙皮肤mRNA和2μL去离子水，混匀后，12000rpm离心15s，72℃保温2min。将离心管在冰上孵育2min。随后向离心管中加入2.0μL 5×第一链缓冲液、1.0μL 20mM二硫苏糖醇、1.0μL 10mM dNTP混合物、1.0μL PowerScript反转录酶(来自CreatorTM SMARTTMcDNA Library Construction Kit质粒cDNA文库构建试剂盒)，混匀后，12000rpm离心15s，42℃保温1h。将离心管置于冰上以中止cDNA第一链的合成。上述离心管中的液体含有合成的cDNA第一链。
b.采用长末端聚合酶链式反应(LD-PCR)方法扩增第二链：
95℃预热PCR仪。将2μL步骤a中得到的cDNA第一链与80μL去离子水、10μL10×Advantage 2PCR缓冲液、2μL 50×dNTP混合物、2μL 5’PCR引物、2μL CDS III/3’PCR引物以及2μL大肠杆菌聚合酶(来自CreatorTM SMARTTM cDNA Library Construction Kit质粒cDNA文库构建试剂盒)混匀。在PCR仪中按以下程序扩增：95℃20s，95℃5s，68℃6min，22个循环。循环结束后，将离心管中合成的cDNA双链进行抽提。
c.抽提回收PCR产物：
向步骤b中得到的cDNA双链中加入等体积的膜结合缓冲液(来自SV Geland PCR Clean-Up System试剂盒)，颠倒混匀，然后将混和液转入离心纯化柱(来自/>SV Gel and PCR Clean-Up System试剂盒)，室温静置5min，使DNA充分与硅胶膜结合。12000rpm离心30s，弃去收集管中的废液。向离心纯化柱中加入700μL膜洗脱液(含五倍体积95％乙醇，来自/>SV Gel and PCR Clean-Up System试剂盒)，12000rpm离心30s，弃去收集管中的废液。重复步骤上述步骤1次。随后再次12000rpm离心5min后，将离心纯化柱置于新的离心管中。向柱中心加入30μL超纯水，室温静置5min后，12000rpm离心30s，离心管底溶液即为纯化后的cDNA双链。
d.酶切、连接以及连接产物的转化：
在微量离心管中加入4μL步骤c中得到的cDNA双链、1μL pMD18-T载体和5μLSolution I(来自pMDTM 18-T Vector Cloning Kit试剂盒)(全量10μL)，于16℃反应2h。将上述10μL反应液加入至100μL DH5α感受态细胞中，冰中放置30min后，于42℃加热90s，再于冰中放置1min。随后向上述感受态细胞中加入890μL 37℃预热后的LB培养基，37℃缓慢振荡培养60min。取200μL菌液涂布于含有X-Gal(5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷)、IPTG(异丙基-β-D-硫代半乳糖苷)、氨苄青霉素(Amp)的LB固体培养基的培养皿上，于37℃培养16h，形成单菌落。每个培养皿用5mL LB液体培养基洗涤菌落，加30％甘油冻存备用。
对构建的cDNA进行检测，发现其大约含1×106个单独克隆。
Ⅳ、泽陆蛙抗氧化肽基因克隆筛选：
对步骤III构建的细菌cDNA文库进行滴定，然后用含100μg/mL Amp的LB培养基稀释细菌cDNA文库至适当的浓度(约5000个细菌/mL和30个细菌/mL，其中，5000个细菌/mL浓度用于首轮筛选，30个细菌/mL浓度用于第二轮筛选)。在96孔培养板上按8×8矩阵铺板(共64孔，每孔100μL)，37℃过夜培养。
按行、列分别合并细菌培养液，使用下述引物组进行PCR扩增。
其中，扩增引物的核苷酸序列为：
PF1：5’-AGATGTTSACCWTGAAGAAATC-3’(SEQ ID NO.3)；
PR1：5’-ATTCTAGAGGCCGAGGCGGCCGACATG-3’(SEQ ID NO.4)；
其中，S＝G/C；W＝A/T。
其中，如SEQ ID NO.3所示的引物序列含22个核苷酸，如SEQ ID NO.4所示的引物序列含27个核苷酸(为CLONTECH公司SMARTTM cDNA Library Construction Kit中的3’PCRPrimer引物)。按以下程序扩增：94℃30s，50℃45s，72℃2.5min，35个循环。
交叉阳性孔细菌样品进入第二轮筛选(方法同首轮筛选)。
Ⅴ、抗氧化肽基因序列测定和结果：
取步骤IV中第二轮筛选结果为阳性的孔中的细菌样品，提取质粒DNA，用双脱氧法测定核苷酸序列(使用Applied Biosystems 373A全自动核苷酸序列测定仪)。
测序引物为BcaBESTTM Sequencing Primer RV-M和BcaBESTTM SequencingPrimer M1 3-47。
其中，BcaBESTTM Sequencing Primer RV-M的核苷酸序列为：5’-GAGCGGATAACAATTTCACACAGG-3’(SEQ ID NO.5)；
BcaBESTTM Sequencing Primer M13-47的核苷酸序列为：5’-CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC-3’(SEQ ID NO.6)。基因测序结果自5’端至3’端序列如SEQ ID NO.2所示，测序结果具体如下：
5’-ATGTTCACCTTGAAGAAATCCCTGTTACTCCTTTTCTTCCTTGGGACCATCAACT TATCTTTCTGTGAGGAAGAGAGAAATGCTGATGAGGAAGAAAGAAGAGATGATCCCG ATAAAATGGATGCTGAAGTGCAAAAACGTTTTTGGGAGCGTTGTTCAAGGTGGCTTCT AAATTAGTACCAGCAGCTATTTGTTCAATTTCTAAAAAAAAAAAAAAAAAAA-3’(SEQ ID NO.2)。
该泽陆蛙抗氧化肽基因核苷酸序列的长度为222个碱基。
发明人根据泽陆蛙抗氧化肽的基因推断，编码具有实质功能的泽陆蛙抗氧化肽的编码基因为该段序列(SEQ ID NO.7)的第142-174位碱基，其核苷酸序列如下：
5’-TTTTGGGAGCGTTGTTCAAGGTGGCTTCTAAAT-3’(SEQ ID NO.7)；
根据SEQ ID NO.7所示的核苷酸序列翻译得到的氨基酸序列为：Phe Trp Glu ArgCys Ser Arg Trp Leu Leu Asn(FWERCSRWLLN)(SEQ ID NO.1)。
泽陆蛙抗氧化肽的制备
本实施例中的泽陆蛙抗氧化肽的制备方法为：
根据上述实施例中得到的泽陆蛙抗氧化肽的编码基因，使用自动多肽合成仪合成多肽(泽陆蛙抗氧化肽)。通过HPLC反相C18柱层析脱盐、纯化。其中，二硫键的形成采用空气氧化法，具体步骤包括：在烧瓶中将多肽溶解于0.1％醋酸溶液中，用氢氧化铵滴定至pH7.8，室温搅拌过夜。通过HPLC反相C18柱层析脱盐、纯化。纯化时水相为0.1％ TFA+100％CH3CN，有机相为0.1％ TFA，水相浓度梯度为25min内27-52％，检测波长为220nm。
检测结果如图1所示。
由图1可知，纯化的泽陆蛙抗氧化肽出现在8.645min。
进一步对纯化后的泽陆蛙抗氧化肽用快原子轰击质谱法(Fast atombombardment mass spectrometry,FAB-MS)测定其分子量，以甘油:间硝基苄醇:二甲亚砜(1:1:l，V:V:V，体积比)为底物，Cs+作为轰击粒子，电流为1μA，发射电压为25Kv。
测定结果如图2所示。
由图2可见，根据质谱图计算得到本发明实施例中的泽陆蛙抗氧化肽的分子量为1509.82Da。
进一步利用ExPASy生物信息学资源门户网站(http：//www.expasy.org/tools/)对泽陆蛙抗氧化肽等电点进行预测。
预测得到本发明实施例中的泽陆蛙抗氧化肽的等电点为8.25。
综上所述，本发明实施例中获得的泽陆蛙抗氧化肽是中国两栖类动物泽陆蛙抗氧化肽基因编码的一种多肽，分子量为1509.82Da，等电点为8.25。编码该泽陆蛙抗氧化肽的基因序列如SEQ ID NO.2所示，其中编码有功能的成熟泽陆蛙抗氧化肽的核苷酸为第142-174位核苷酸。该泽陆蛙抗氧化肽的氨基酸序列为：Phe Trp Glu Arg Cys Ser Arg TrpLeu Leu Asn(FWERCSRWLLN)(SEQ ID NO.1)。
泽陆蛙抗氧化肽的效果检测
1.泽陆蛙抗氧化肽的自由基清除活性测定：
在本实施例中，发明人分别采用DPPH法和ABTS法对上述实施例中获得的泽陆蛙抗氧化肽进行检测，以测试其自由基清除活性。
(1)DPPH法
采用DPPH法检测泽陆蛙抗氧化肽的自由基清除活性。具体检测步骤包括：将DPPH粉末溶解于95％乙醇中，定容至100mL，用95％乙醇将DPPH溶液稀释至0.04g/L，得DPPH试剂。在96孔板中先后加入20μL上述实施例中获得的泽陆蛙抗氧化肽溶液(浓度分别为25μM、50μM、100μM和200μM，溶剂为超纯水)和180μL DPPH试剂，混匀，室温下避光反应30min，每3min检测一次，用酶联免疫吸附测定读板仪在517nm处测定反应液的吸光值，实验重复三次，取平均值，自由基清除率计算公式如下。
式中：A0为180μL DPPH试剂+20μL超纯水的混合液的吸光值；Ai为180μL DPPH试剂+20μL样品溶液的混合液的吸光值。
检测结果如图3所示。
由图3可知，随着泽陆蛙抗氧化肽浓度的增加，自由基清除率逐渐提高，这表明泽陆蛙抗氧化肽具有抗氧化能力，能有效地清除自由基。
(2)ABTS法
采用总抗氧化能力检测试剂盒(ABTS法)(购自上海碧云天生物技术有限公司)检测泽陆蛙抗氧化肽的自由基清除活性。具体检测步骤包括：将2.8mM过硫酸钾与7mM ABTS在黑暗中反应至少5h，生成ABTS自由基(ABTS+)原液。用磷酸盐缓冲液将ABTS+原液稀释50倍，得到ABTS工作液(OD734≈0.7)。将180μL上述ABTS工作液与20μL上述实施例中获得的泽陆蛙抗氧化肽溶液(浓度分别为25μM、50μM、100μM和200μM，溶剂为超纯水)混匀，室温孵育数分钟后，于734nm波长测定吸光值。实验重复三次，取平均值，自由基清除率计算公式如下。
式中：A0为180μL ABTS工作液+20μL超纯水的混合液的吸光值，Ai为180μL ABTS工作液+20μL样品溶液的混合液的吸光值。
检测结果如图4所示。
由图4可知，随泽陆蛙抗氧化肽浓度的增加，自由基清除率逐渐提高，这表明泽陆蛙抗氧化肽具有抗氧化能力，能很有效地清除自由基。
2.泽陆蛙抗氧化肽的体外抗氧化损伤实验
为了进一步验证上述实施例中制得的泽陆蛙抗氧化肽的抗氧化效果，发明人采用体外抗氧化损伤实验对泽陆蛙抗氧化肽进行测试。
(1)泽陆蛙抗氧化肽对双氧水诱导的PC12细胞SOD和CAT活性的影响
总SOD活性检测试剂盒(WST-8法)和过氧化氢酶检测试剂盒(购自上海碧云天生物技术有限公司)分别用于检测泽陆蛙抗氧化肽处理前后的神经细胞(PC12细胞)中的SOD和CAT活性。具体检测步骤包括：将PC12细胞(5×105个/孔)接种于6孔板中，用上述实施例中制得的泽陆蛙抗氧化肽(8μM)处理30min，然后暴露于0.25mM双氧水中6h，孵育结束后收集细胞，用磷酸盐缓冲液洗2次。每106个细胞加入100μL样品制备液，适当吹打以充分裂解细胞；4℃，12000g离心5min，取上清作为待测样品。按照试剂盒说明书，分别测定细胞上清中SOD活性和CAT活性。
设置对照组1(不做泽陆蛙抗氧化肽和双氧水处理)、对照组2(不做泽陆蛙抗氧化肽处理)和实验组(同时加泽陆蛙抗氧化肽和双氧水处理)。
SOD活性检测结果如图5所示，CAT活性检测结果如图6所示。
由图5和图6可知，0.25mM双氧水显著抑制PC12细胞的SOD活性和CAT活性(分别为50.69％和58.83％)，而8μM泽陆蛙抗氧化肽能够解除0.25mM双氧水对PC12细胞的SOD活性和CAT活性的抑制(在该处理下，SOD活性为102.496％，CAT活性为85.96％)，这表明泽陆蛙抗氧化肽能够增加PC12细胞的SOD活性和CAT活性。
(2)泽陆蛙抗氧化肽对双氧水诱导的PC12细胞ROS水平的影响
ROS包括超氧自由基、过氧化氢、及其下游产物过氧化物和羟化物等，参与细胞生长增殖、发育分化、衰老和凋亡以及许多生理和病理过程。本实验利用荧光探针2’,7’-二氯二氢荧光素二乙酸酯(DCFH-DA，通用的氧化应激指示剂，购自Sigma公司)进行活性氧检测。DCFH-DA本身没有荧光，可以自由穿过细胞膜，进入细胞内后，可以被细胞内的酯酶水解生成2’,7’-二氯二氢荧光素(DCFH)。而DCFH不能通透细胞膜，从而使探针很容易被标记到细胞内。在ROS存在的条件下，DCFH被氧化生成荧光物质2’,7’-二氯荧光素(DCF)，绿色荧光强度与细胞内ROS水平成正比。
具体检测步骤包括：将PC12细胞(5×105个/孔)接种于6孔板中，用上述实施例中制得的泽陆蛙抗氧化肽(2μM，4μM和8μM)处理30min，然后暴露于0.25mM双氧水中6h，孵育结束后收集细胞，用磷酸盐缓冲液洗2次。ROSDCFH-DA(20mM)染料使用前用染色缓冲液稀释2000倍配制为20μM的DCFH-DA。将处理后的细胞和对照细胞加入20μMDCFH-DA，37℃条件下，避光孵育30min。用FACScan流式细胞仪收集细胞，所有实验均重复3次，并使用FlowJ分析各组的荧光强度，计算细胞内相对ROS水平(计算公式如下)。
设置对照组1(不做泽陆蛙抗氧化肽和双氧水处理)、对照组2(不做泽陆蛙抗氧化肽处理)和实验组(同时加泽陆蛙抗氧化肽和双氧水处理)。
相对ROS水平(％)＝实验组平均荧光强度/对照组1平均荧光强度×100％
ROS检测如图7所示。
由图7可知，经0.25mM双氧水处理的PC12细胞内的ROS水平显著增加，而泽陆蛙抗氧化肽能够以浓度依赖的方式减少ROS积累，尤其8μM泽陆蛙抗氧化肽能够显著降低0.25mM双氧水诱导下的PC12细胞内的ROS水平。
(3)泽陆蛙抗氧化肽对双氧水诱导的PC12细胞凋亡的保护
Annexin是一类广泛分布于真核细胞细胞浆内钙离子依赖的磷脂结合蛋白，参与细胞内的信号转导。Annexin V选择性结合磷脂酰丝氨酸。磷脂酰丝氨酸主要分布在细胞膜内侧，即与细胞浆相邻的一侧。在细胞发生凋亡的早期，不同类型的细胞都会把磷脂酰丝氨酸外翻到细胞表面，即细胞膜外侧。而Annexin V和外翻到细胞表面的磷脂酰丝氨酸结合，用带有绿色荧光的荧光探针FITC标记的Annexin V，即Annexin V-FITC，就可以用流式细胞仪或荧光显微镜非常简单而直接地检测到磷脂酰丝氨酸的外翻这一细胞凋亡的重要特征。碘化丙啶(Propidium Iodide,PI)可以染色坏死细胞或凋亡晚期丧失细胞膜完整性的细胞，呈现红色荧光。对于坏死细胞或凋亡晚期丧失细胞膜完整性的细胞，由于细胞膜的完整性已经丧失，Annexin V-FITC可以进入到细胞浆内，与位于细胞膜内侧的磷脂酰丝氨酸结合，从而呈现绿色荧光。
Annexin V-FITC细胞凋亡检测试剂盒(购自上海碧云天生物技术有限公司)。具体检测步骤包括：将PC12细胞(5×105个/孔)接种于6孔板中，用上述实施例中制得的泽陆蛙抗氧化肽(2μM，4μM和8μM)处理30min，然后暴露于0.25mM双氧水中6h，孵育结束后收集细胞，用磷酸盐缓冲液洗2次。向样品中加入10μL PI和5μL Annexin V-FITC，在室温下避光染色30min。用FACScan流式细胞仪收集细胞，所有实验均重复3次，并使用FlowJ分析各组的平均荧光强度，计算细胞凋亡率(计算公式如下)。
设置对照组1(不做泽陆蛙抗氧化肽和双氧水处理)、对照组2(不做泽陆蛙抗氧化肽处理)和实验组(用双氧水处理的同时，分别加入不同浓度的泽陆蛙抗氧化肽进行处理)。
凋亡率(％)＝早期凋亡率(Annexin V-FITC+,PI-)+晚期凋亡率(Annexin V-FITC+,PI+)。
其中，“Annexin V-FITC+,PI-”是指仅检测到绿色荧光，“Annexin V-FITC+,PI+”是指同时检测到红色荧光和绿色荧光。
检测结果如图8所示。
由图8可知，经0.25mM双氧水处理后，PC12细胞凋亡比例显著增加，而泽陆蛙抗氧化肽以浓度依赖的方式减少了双氧水诱导的PC12细胞凋亡。
3.泽陆蛙抗氧化肽的体内抗氧化损伤效果
为了验证泽陆蛙抗氧化肽在体内的实际应用效果，发明人利用双氧水诱导的大鼠肝损伤模型和角叉菜胶诱导的小鼠急性炎症模型作为试验对象进行测试。
本实施例中所用的大鼠为SD大鼠，雄性，体重150-200g，购于南方医科大学动物中心；小鼠为昆明小鼠，雌雄不限，体重20-25g，购于南方医科大学动物中心；IL-1beta MouseELISA检测试剂盒、IL-6Mouse ELISA检测试剂盒和TNF-αMouse ELISA检测试剂盒均购自Thermo Fisher Scientific，分别用于检测组织匀浆上清中的促炎细胞因子IL-1β、IL-6和TNF-α的水平。
(1)泽陆蛙抗氧化肽对双氧水诱导的大鼠肝损伤模型的治疗效果：
具体步骤包括：
S1.双氧水诱导的大鼠肝损伤模型的制备：
将大鼠麻醉后处死，迅速于冰上摘取肝脏，尽量去除肝脏表面附着的脂肪组织，并用0.85％的生理盐水进行清洗。清洗完毕后用吸水纸吸干，剪取小部分肝脏组织，称取0.04g肝脏组织，研碎。加入2mL 0.85％的生理盐水，研磨均匀，即得2％大鼠肝细胞匀浆。
S2.硫代巴比妥酸法(TBA)测定效果：
取100μL步骤S1中制备的2％大鼠肝组织匀浆，加入20μL上述实施例中制得的泽陆蛙抗氧化肽溶液(浓度分别为100μM、50μM和25μM，溶剂为超纯水)，然后加入5μL FeCl2(0.5mM)和5μL双氧水溶液(0.5mM)，于37℃孵育1h后，加入100μL含0.67％硫代巴比妥酸的20％三氯醋酸(TCA)水溶液中，沸水浴35min，测定532nm处的吸光值，平行测定3次，MDA水平计算公式如下。
设置对照组1(不做泽陆蛙抗氧化肽和双氧水处理)、对照组2(不做泽陆蛙抗氧化肽处理)和实验组(用双氧水处理的同时，分别加入不同浓度的泽陆蛙抗氧化肽进行处理)。
式中：Ai为泽陆蛙抗氧化肽的吸光值；A0为以超纯水替代泽陆蛙抗氧化肽的吸光值。
结果如图9所示。
由图9可知，泽陆蛙抗氧化肽抑制双氧水诱导的大鼠肝组织的MDA水平且呈浓度依赖性。
(2)泽陆蛙抗氧化肽对角叉菜胶诱导的小鼠急性炎症模型的治疗效果：
具体步骤包括：将24只小鼠随机分为4组，将它们保持在温度(22±1℃)和湿度(55±10％)的房间内，进行12h的明/暗循环。通过在小鼠右后爪单次注射50μL角叉菜胶(1％，w/v，溶于生理盐水)以诱导急性炎症发生。注射角叉菜胶1h前，对泽陆蛙抗氧化肽组和阳性药组小鼠分别腹腔注射5mg/kg的上述实施例中制得的泽陆蛙抗氧化肽和阳性药吲哚美辛溶液，角叉菜胶组不做处理。同时设置对照组(不做任何处理)。角叉菜胶注射后在设定时间点(1、2、3、4和5h)用足趾溶剂测量仪测定每只小鼠的右后爪的体积，每只小鼠应测三次并取平均值。在角叉菜胶注射后5小时对小鼠实施安乐死，切取小鼠足部并剪成小块，并将获取得到的组织按1g:10mL加入生理盐水，进行组织匀浆后，将组织匀浆在4℃，3000rpm条件下离心10min，取上清。对得到的组织匀浆上清使用IL-1beta Mouse ELISA检测试剂盒、IL-6Mouse ELISA检测试剂盒和TNF-αMouse ELISA检测试剂盒测定其中促炎细胞因子IL-1β、IL-6和TNF-α的水平，具体检测参照说明书进行。
小鼠右后爪的体积检测结果如图10所示。
由图10可知，泽陆蛙抗氧化肽抑制了角叉菜胶诱导的小鼠足肿胀，控制了急性炎症的进展。
组织匀浆上清的促炎细胞因子水平检测结果如图11所示。
由图11可知，泽陆蛙抗氧化肽显著抑制角叉菜胶诱导的促炎细胞因子IL-1β，IL-6和TNF-α的水平。
4.泽陆蛙抗氧化肽和LPS的结合效果
泽陆蛙抗氧化肽和LPS的结合能力通过等热滴定仪进行测定，具体步骤如下：
(1)提前准备已超声脱气的PBS缓冲液(pH 6.0)，LPS(50μM)和上述实施例中制得的泽陆蛙抗氧化肽(0.5mM)。在上样前进行二次脱气处理。
(2)根据仪器说明在样品池和注射器中分别装载样品。40μL上述实施例中制得的泽陆蛙抗氧化肽(0.5mM)置于滴定针内，280μL LPS(50μM)置于样品池内。
(3)设置仪器参数：设定初始时间间隔为60s，温度25℃，上样针的转速为1000rpm，参考功率5μCal/s，高反馈模式。上样针内每次滴定1.0μL至反应池中，间隔120s，总计滴定30次。ITC配套仪器将检测整个滴定过程中热量变化。
检测结果如图12所示。
由图12可知，泽陆蛙抗氧化肽与LPS的结合导致焓降低以及ITC曲线的降低趋势，表明反应中放热；结合饱和发生在约15min，结合常数KD为433e-9±208e-9M，结合位点数N为0.471±1.6e-2。这表明泽陆蛙抗氧化肽能够中和LPS。
5.泽陆蛙抗氧化肽对人成纤维细胞的增殖效果
使用MTT法检测泽陆蛙抗氧化肽对人成纤维细胞(HSF)的增殖活性，以评估泽陆蛙抗氧化肽对细胞活力的影响。
具体步骤包括：将1×104个细胞/孔接种到96孔板中，加入不同浓度的上述实施例中制得的泽陆蛙抗氧化肽(0、2.5、5、10、20和40μM)孵育24h，然后每孔加入10μL MTT(四甲基偶氮唑蓝)(5mg/mL)。4h后，去除上清液，形成的甲瓒结晶在200μL二甲基亚砜中溶解10min。用微量平板阅读器测量490nm处的吸光值，细胞存活率计算公式如下。
设置空白组(不含细胞)、对照组(不做泽陆蛙抗氧化肽处理)和实验组(分别加入不同浓度的泽陆蛙抗氧化肽处理)。
式中：Ai为实验组的吸光值；Aj为对照组的吸光值；A0为空白组的吸光值。
检测结果如图13所示。
由图13可知，随泽陆蛙抗氧化肽浓度增加，细胞存活率逐渐增加，这表明抗氧化肽浓度依赖性地促进人成纤维细胞的增殖。
上面结合附图对本发明实施例作了详细说明，但是本发明不限于上述实施例，在所属技术领域普通技术人员所具备的知识范围内，还可以在不脱离本发明宗旨的前提下作出各种变化。此外，在不冲突的情况下，本发明的实施例及实施例中的特征可以相互组合。
序列表
<110> 南方医科大学珠江医院
<120> 蛙皮抗氧化肽及其基因在制药和抗皱化妆品的应用
<160> 7
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
Phe Trp Glu Arg Cys Ser Arg Trp Leu Leu Asn
1 5 10
<210> 2
<211> 222
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
atgttcacct tgaagaaatc cctgttactc cttttcttcc ttgggaccat caacttatct 60
ttctgtgagg aagagagaaa tgctgatgag gaagaaagaa gagatgatcc cgataaaatg 120
gatgctgaag tgcaaaaacg tttttgggag cgttgttcaa ggtggcttct aaattagtac 180
cagcagctat ttgttcaatt tctaaaaaaa aaaaaaaaaa aa 222
<210> 3
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
agatgttsac cwtgaagaaa tc 22
<210> 4
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
attctagagg ccgaggcggc cgacatg 27
<210> 5
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
gagcggataa caatttcaca cagg 24
<210> 6
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
cgccagggtt ttcccagtca cgac 24
<210> 7
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
ttttgggagc gttgttcaag gtggcttcta aat 33
Claims (5)
1.一种抗氧化肽，其特征在于，所述抗氧化肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
2.编码权利要求1所述的抗氧化肽的核酸分子，其特征在于，所述核酸分子的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示。
3.一种试剂，其特征在于，所述试剂中含有(1)～(8)中的任一种：
(1)权利要求2所述的核酸分子；
(2)含有权利要求2所述核酸分子的表达盒；
(3)含有权利要求2所述核酸分子的重组载体；
(4)含有(2)中所述表达盒的重组载体；
(5)含有权利要求2所述核酸分子的重组微生物；
(6)含有(2)中所述表达盒的重组微生物；
(7)含有(3)中所述重组载体的重组微生物；
(8)含有(4)中所述重组载体的重组微生物。
4.权利要求1所述抗氧化肽在制备食品或化妆品中的应用；
所述化妆品具有如下(1)～(2)中的至少一种作用：
(1)抗氧化；
(2)祛皱。
5.权利要求3所述的试剂在制备食品、药品或化妆品中的应用；
所述药品具有如下(1)～(2)中的至少一种作用：
(1)抗氧化；
(2)消炎；
所述化妆品具有如下(1)～(2)中的至少一种作用：
(1)抗氧化；
(2)祛皱。
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2021
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