CN109045001A - p300活化剂CTPB及其衍生物在提高胶原蛋白Col17A1表达的用途 - Google Patents

Abstract

本发明涉及制药及洗护用品领域，更具体地，本发明公开了一种CTPB活化剂的用途。可用于制备生发剂和/或治疗脱发剂及制备治疗脱发/促进头发增生的药物。

Description

p300活化剂CTPB及其衍生物在提高胶原蛋白Col17A1表达的 用途

技术领域

本发明涉及制药及洗护用品领域，更具体地，本发明公开了一种CTPB活化剂的用途。

背景技术

毛囊干细胞促进毛囊再生和头发生长，还修复受损的表皮。毛囊干细胞的分化受到各种拟遗传的调控，包括增强子(enhancer)和标记组蛋白H3(H3K27Ac)。增强子是一些短的DNA序列，它们可以调控目标基因表达。当增强子的功能受影响时会导致各种疾病，如自生免疫疾病和癌症。现时有不同的方法去鉴定增强子，如ATAC-seq和免疫沉淀配合高通量测序chromatin immunoprecipitation with high-throughput sequencing(ChIP-seq)，这可以找出某个固定目标物在基因组内连接的情况如组蛋白标记，转录因子或共同作用因子。我们可以透过进行活跃组蛋白标记H3K27ac或acetyltransferase p300的ChIP-seq，以及综合多个转录因子的ChIP-seq去找出某种组织内的增强子。但是普遍来说，透过全基因组鉴别出来的增强子往往有成千上万个，这令鉴别真正功能性的增强子异常困难。

因此，我们需要一个更准确的方法去找出有功能性的增强子。近年来，超级增强子(Super-enhancer，SE)开始备受注目。超级增强子是一组独特的活跃增强子，它是一些密集的增强子，并且具有特别强的活跃组蛋白标记H3K27ac，研究证明SE对干细胞激活和分化有重要的功能。通常来说，细胞内只有数百个SE，这大大增加了鉴别功能性增强子的准确度。目前为止，SE已经在多种干细胞内被鉴别出来，包括头发干细胞内的超级增强子。在生物科技发展层面来说，SE是表观遗传学上调控细胞功能的绝佳靶点。现时已经有各种不同的药物在临床测试中，它们的目的都是针对在癌细胞中受到激活的SE，从而治疗癌症。

在衰老过程中，大部分器官的体积都会变小，与此同时，它们的DNA会受到损伤，导致功能和再生能力都会下降。研究发现在小鼠和人类毛囊干细胞衰老过程中会有发炎现象，中性粒细胞的DNA亦会受到损伤，并释放蛋白酶neutrophil elastase，从而消化毛囊干细胞外的胶原蛋白Col17A1。Col17A1的消化会导致毛囊干细胞的再生功能下降，并导致脱发。研究亦证实降低Col17A1的表达会诱发脱发现象，并且在衰老的小鼠过表达Col17A1能够防止脱发。因此能够找到Col17A1基因的调控机制对治疗在人类衰老时的脱发现象十分重要。

发明内容

本发明的第一目的在于提供一种p300活化剂CTPB在提高胶原蛋白Col17A1表达的用途，该用途是基于发明人的下列研究而完成的：通过分析多种细胞内的超级增强子，包括免疫细胞、小脑、大脑皮层、心脏、肝脏、脾脏、甲状腺、肠脏和毛囊干细胞，发明人找出调控Col17A1基因的超级增强子是一个毛囊干细胞特异性的超级增强子，因此可以成为一个靶点去观察各种化合物和拟遗传机制如何调控Col17A1基因的表达。发明人发现，CTPB在纤维母细胞内呈浓度梯度提高Col17A1表达，表明表观调控蛋白p300与纤维母细胞分化成毛囊细胞是密切相关的。在20个月衰老的C57小鼠身上开始出现毛发掉落，而利用p300活化剂CTPB涂抹在皮肤上(每天涂抹，浓度为200nM溶于PEG-400/乙醇/水，比例为40％/20％/40％)，小鼠体重为35g/只，治疗十四天)，与对照组相比(只PEG-400/乙醇/水，比例为40％/20％/40％)，CTPB能提高Col17A1表达和改善脱发现象。以上发现促成了本发明。

其中，本发明术语为以下含义：

增强子/超级增强子(enhancer/super-enhancer)，数百的超级增强子控制了赋予每个细胞特性和功能的大多数关键基因。细胞身份的改变可能以这些超级增强子作为开始和结束，这些超级增强子非常的强有力，但也对环境的改变极其的敏感。

p300是p300-CBP转录辅激活子(coactivator)家族的一个成员，它在不同生理过程中都参与多种转录因子的转录调控，因而备受关注。P300和CBP虽然是由不同的基因所编码，但是它们的结构和功能都非常相似，因此p300和CBP被归类为同一个蛋白质家族。p300的分子量为300kDa，它与CBP的同源性相当高，并且在哺乳类动物中有高度的保守性。p300的功能有很多，包括细胞周期调控和细胞分化等多种生理过程发挥着重要作用。p300作为组蛋白乙酰转移酶(histone acetyltransferase，HAT)，能乙酰化4种核心组蛋白。p300催化乙酰辅酶A中的乙酰基并转移到组蛋白N-端赖氨酸残基的ε-氨基上，中和了上面的正电荷并削弱了DNA与组蛋白之间的相互作用，从而打开高度有序的染色质结构，使转录因子和RNA聚合酶Ⅱ易于与DNA结合，从而促进转录。

CTPB作为一种小分子化合物，是p300-CBP蛋白家族的活化剂，作用于p300。ECM，细胞外基质；Fibroblast，纤维母细胞是一种合成胞外基质和胶原蛋白的细胞，并在动物伤口愈合上扮演重要角色。

本发明的第一目的在于p300活化剂CTPB在提高胶原蛋白Col17A1表达的用途；

优选的是，p300活化剂CTPB在制备治疗脱发药物的用途；

优选的是，p300活化剂CTPB在制备促进头发增生的药物的用途；

优选的是，p300活化剂CTPB分子式为

本发明的另一目的在于公开了一种制剂，为含有CTPB、PEG-400、乙醇、水的溶液，其中CTPB及其衍生物的浓度为50nM-4μM。

优选的是，上述制剂中CTPB及其衍生物的浓度为50nM-4μM。

本发明的最后一个目的在于p300活化剂CTPB在制备生发剂和/或治疗脱发剂中的用途。

本发明至少有以下优点，即：

现有技术中CTPB是一种p300蛋白活化剂，可促进神经细胞增生，以改善帕金森病(Parkinson's disease，PD)。本发明的发明人发现p300活化剂CTPB可以提高胶原蛋白Col17A1表达。当毛囊干细胞衰老时，胶原蛋白Col17A1被蛋白酶消化，促使毛囊干细胞凋亡，并同时增强炎症反应，最终导致脱发。组蛋白乙酰化是表观遗传研究的重要组成部分，p300通过与乙酰化赖氨酸结合调节基因的转录表达，是毛囊干细胞分化的驱动因子，而小分子化合物CTPB则是其活化剂，本发明以p300为靶点，提供一种治疗脱发或促进头发增生的药物小分子化合物CTPB及其衍生物，可用于该病的早期预防和治疗。同时也可用于洗发用品中用来做生发剂或治疗脱发剂。

附图说明

图1 Col17A1基因相关的超级增强子对毛囊干细胞作用结果，表明COL17A1的超级增强子只在毛囊干细胞内找到；

图2实施例1 Col17A1基因在年轻和衰老小鼠皮肤的表达水平的qRT-PCR检测结果；

图3实施例2皮肤涂抹CTPB治疗脱发或促进头发增生对照图；

图4实施例1 CTPB对纤维母细胞(fibroblast)10T 1/2内Col17A1表达水平的qRT-PCR检测结果；

图5实施例2 CTPB对20个月C57小鼠皮肤Col17A1表达水平的qRT-PCR检测结果。

具体实施方式

以下通过具体实施例进一步对本发明的技术方案进行说明，应理解以下仅为本发明的示例性说明，并不用于限制本发明权利要求的保护范围。

本发明试验例中的小鼠为C57BL/6J小鼠，来自美国的The Jackson Laboratory。其他原材料如果没有特别说明，均为市售。

实施例1：研究添加CTPB(Santa Cruz，美国)对在纤维母细胞(fibroblast)10T 1/2内Col17A基因表达的影响。

清华大学生物讯息学组发布了一个超级增强子资料库内(http://asntech.org/dbsuper/index.php)，利用Detailed Search功能，参数如下：mouse(mm9)，select allcell/tissue type，gene name Col17A1。我们找出调控Col17A1基因的超级增强子是毛囊干细胞特异的，这个超级增强子在其他二十二种细胞内都没有活性，结果见图1。由于毛囊细胞也能够从纤维母细胞分化出来的，所以我们利用纤维母细胞研究CTPB对Col17A1基因表达的影响。此外，Col17A1基因的表达水平在小鼠皮肤衰老过程中亦会下降，结果见图2。

此外，采用C57BL/6J小鼠实验模型，在六个月和二十个月大的小鼠身上分别取出1cm²的皮肤组织，然后用Trizol(Life Technolodies，美国)提取RNA，并用Superscript IVReverse Transcriptase(Life Technologies)进行反转录，最后用SYBR Green进行qRT-PCR检测Col17A1基因表达水平，并利用GAPDH表达量作为内参。Col17A1基因的表达水平在小鼠皮肤衰老过程中亦会下降，结果见图2。

采用10T 1/2细胞(CCL-226，ATCC，美国)，接种于6孔板且分别加入CTPB(0nM-500nM)处理的一批细胞用qRT-PCR定量检测Col17A1(GAPDH是通用内参，不是检测对象，只是参照物)；200nM CTPB提高Col17A1的表达，并且CTPB的作用与其提高Col17A1是正相关，表明CTPB在10T1/2细胞中起重要作用，选择CTPB治疗脱发其根源是以p300和Col17A1的超级增强子为治疗靶点。GAPDH广泛用作qRT-PCR cDNA标准化的内参，即将每个样品测得的目的cDNA含量与本样品的GAPDH含量相除，得到每个样品目的cDNA的相对含量，然后才进行样品与样品之间的比较。得到同样的结果见图4，其中qRT-PCR结果表明，200nM及更高浓度的CTPB处理16小时后显着提高了Col17A1表达水平，而CTPB呈梯度依赖作用提高Col17A1的表达，其中200nM JQ1抑制作用已足够显着，其活化p300的作用与Col17A1表达正相关，证实了表观遗传调控蛋白p300在10T1/2细胞中的作用。

实施例2：研究外源性添加CTPB对治疗脱发或促进头发增生的影响。

1.小鼠脱发模型的建立及CTPB对毛发再生的影响。

利用6只衰老(20月)C57BL/6小鼠，将小鼠随机分为对照组和实验组，每天在皮肤上涂抹100μl CTPB(浓度200nM，溶于PEG-400/乙醇/水比例为40％/20％/40％)，小鼠体重为35g/只)作为治疗组(PEG-400/乙醇/水，比例为40％/20％/40％为对照组)，治疗后照相观察治疗脱发情况结果见图3，如图3所示20月与6月大的小鼠比较，20月大的小鼠明显出现脱毛情况，CTPB涂抹14天治疗组与对照组相比脱毛情况显着改善。

2.CTPB对小鼠脱毛模型Col17A1表达的影响

取治疗后的C57BL/6小鼠皮肤，并用Trizol(Life Technologies，美国)提取RNA，然后用Superscript IV Reverse Transcriptase(Life Technologies)进行反转录，最后用SYBR Green进行qRT-PCR检测Col17A1表达水平，利用GAPDH表达量作为内参，结果见图5显示涂抹CTPB后Col17A1表达量提高。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (10)

1.p300活化剂CTPB在提高胶原蛋白Col17A1表达的用途。

2.权利要求1所述的用途，其特征在于p300活化剂CTPB在制备治疗脱发药物中的用途。

3.权利要求1所述的用途，其特征在于p300活化剂CTPB在制备促进头发增生的药物中的用途。

4.权利要求1～3中的任意一项所述的用途，其特征在于p300活化剂CTPB分子式为：

5.一种制剂，为含有p300活化剂CTPB、PEG-400、乙醇、水的溶液。

6.权利要求5所述的制剂，其中p300活化剂CTPB浓度为50nM-4μM。

7.权利要求5或6所述的制剂在提高胶原蛋白Col17A1表达的用途。

8.权利要求5或6所述的制剂在制备治疗脱发药物中的用途。

9.权利要求5或6所述的制剂在制备促进头发增生的药物中的用途。

10.权利要求1所述的用途，其特征在于p300活化剂CTPB在制备生发剂和/或治疗脱发剂中的用途。