CN116019857A - 可抗发炎、促进粒线体再生、促进胶原蛋白生成、保护细胞以及修护细胞的牡丹花蕊萃取物 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种以低温发射超声波连续快速振荡萃取方式获得的牡丹花蕊萃取物的用途，是用于制备抗发炎、促进粒线体再生、促进胶原蛋白生成、保护细胞以及修护细胞的组合物，所制成的组合物可作为医药品、化妆品、保养品、香氛或人体清洁用品等产品的原料。

Description

可抗发炎、促进粒线体再生、促进胶原蛋白生成、保护细胞以及修护细胞的牡丹花蕊萃取物

技术领域

本发明有关一种植物萃取物，特别是指牡丹花蕊萃取物，由该萃取物所制成的组合物可作为医药品、化妆品、保养品、香氛或人体清洁用品等产品的原料。

背景技术

中国发明专利公开号CN105106043A提出一种消炎除臭芳香漱口水及其制备方法，按照质量百分数由以下成分组成：牡丹花萃取物浓缩液

表面活性剂

矫正味剂0.05重量％～2重量％，保湿剂

防腐剂

乙醇

余量为水。该发明的漱口水对人体口腔具有明显消炎、杀菌以及除口臭的作用。

中国发明专利公开号CN110025518A提出一种含牡丹花萃取物的牡丹香型面膜，其按重量份量计，包括以下成分：透明质酸

份，胶原蛋白

份，六胜肽

份，三胜肽

份，牡丹花精油

份，牡丹花浸提液

份，羟乙基纤维素

份，防腐剂

份；具体制作步骤如下，S21：向羟乙基纤维素中加入去离子水，料液比

常温下搅拌均匀；S22：向透明质酸，胶原蛋白，六胜肽，三胜肽，牡丹花精油，牡丹花浸提液加入去离子水，料液比为

于

℃温度下搅拌

分钟；S23：将防腐剂加入步骤S22所得混合液中，于

℃温度下，搅拌

分钟至混合均匀；S24：将步骤S21得到液体移入步骤S23得到混合液中，于

℃温度下，搅拌

min至混合均匀后，自然冷却至室温；该面膜具有抗氧化、保湿、紧致肌肤和抗衰老的功效。

中国发明专利公开号CN110051593A提出一种牡丹精华露及其制备方法，该牡丹精华露中加入牡丹花提取物，牡丹花水和牡丹花提取了活性成分含量达15％，能够有效地清除皮肤细胞自由基，抵抗衰老，有效消除人体内的酪胺酸酶的活性，减少黑色素的生成，减轻色素沉积，增强皮肤的抗衰老功能。该牡丹精华露中的牡丹花水和牡丹花提取物的提纯过程中，首先对牡丹花瓣在低温环境下冷藏，并采用低温冷冻干燥除去牡丹花瓣的水分，得到牡丹花瓣水的同时，得到干燥的牡丹花瓣，通过在

℃条件下对玫瑰花瓣里的活性物质萃取，有效地保证了牡丹花瓣中的提取物的活性，提高牡丹花提取物的使用功效。

发明内容

本发明的一目的在于提供一种牡丹花蕊萃取物的用途，是用于制备抗发炎、促进粒线体再生、促进胶原蛋白生成、保护细胞以及修护细胞的组合物。

更佳者，该牡丹花蕊萃取物的制备方法包含：浸泡步骤，以水或乙醇溶液将牡丹花蕊覆盖浸泡；以及萃取步骤，于低温下以总能量500～800w的超声波能量连续快速振荡萃取该浸泡有牡丹花蕊的水或乙醇溶液。

更佳者，在浸泡步骤中，于以水将牡丹花蕊覆盖浸泡下，牡丹花蕊与水的重量比例为1：7～1：11，其温度条件为4℃～50℃，其浸泡时间为72～120小时；于以乙醇溶液将牡丹花蕊覆盖浸泡下，牡丹花蕊与乙醇溶液的重量比例为1：7～1：11，其温度条件为4℃～50℃，其浸泡时间为72～120小时。

更佳者，该牡丹花蕊萃取物的制备方法包含：冷冻步骤，以急速冷冻、固化牡丹花蕊；研磨步骤，以冷冻研磨器研磨牡丹花蕊，将牡丹花蕊磨成粉末；浸泡步骤，以水或乙醇溶液将牡丹花蕊粉末覆盖浸泡；以及萃取步骤，于低温下以总能量500～800w的超声波能量连续快速振荡萃取该浸泡有牡丹花蕊粉末的水或乙醇溶液。

更佳者，在浸泡步骤中，于以水将牡丹花蕊粉末覆盖浸泡下，牡丹花蕊粉末与水的重量比例为1：7～1：11，其温度条件为4℃～50℃，其浸泡时间为72～120小时；于以乙醇溶液将牡丹花蕊粉末覆盖浸泡下，牡丹花蕊与水的重量比例为1：7～1：11，其温度条件为4℃～50℃，其浸泡时间为72～120小时。

更佳者，该牡丹花蕊萃取物的制备方法更包含：离心步骤，于低温下对该快速振荡萃取后的水或乙醇溶液进行高速离心，以去除底部沉淀物并收集上清液。

更佳者，该牡丹花蕊萃取物的制备方法更包含：过滤步骤，将该上清液以微孔结构滤膜，并利用真空筛检器过滤，以获得澄清过滤液。

更佳者，该牡丹花蕊萃取物的制备方法更包含：干燥步骤，利用减压浓缩机及真空冷冻干燥机将该澄清过滤液冻干。

更佳者，该组合物用以投予至皮肤细胞或皮肤纤维母细胞以抗发炎、促进粒线体再生、促进胶原蛋白生成、保护细胞以及修护细胞。

更佳者，该萃取步骤的温度为-4℃～25℃，快速振荡时间为60～120分钟。

此外，本发明所揭露上述制成萃取物的用途为用于制备抗发炎、促进粒线体再生、促进胶原蛋白生成、保护细胞以及修护细胞的组合物，而此组合物可为医药品、化妆品、保养品、香氛或人体清洁用品。

附图说明

图1为一曲线图，说明：牡丹花蕊生长点组织萃取物的层析指纹图谱；

图2为一照片图，说明：牡丹花蕊生长点组织萃取物的促进伤口愈合试验结果；

图3为一照片图，说明：牡丹花蕊生长点组织萃取物的促进细胞修复功能试验结果。

具体实施方式

为让本发明上述及/或其他目的、功效、特征更明显易懂，下文特举较佳实施方式，作详细说明于下：

本发明提供一种牡丹花蕊萃取物。

本发明另提供一种上述牡丹花蕊萃取物的用途，其可用于制备具抗发炎、促进粒线体再生、促进胶原蛋白生成、保护细胞或修护细胞功能的组合物，但不以此为限。

更佳者，该粒线体包含动物细胞的粒线体、植物细胞的粒线体、真菌细胞的粒线体或原生生物细胞的粒线体，但不以此为限。

更佳者，该胶原蛋白种类包含第一型胶原蛋白(Type I Collagen)、第二型胶原蛋白(Type II Collagen)、第三型胶原蛋白(Type III Collagen)、第四型胶原蛋白(Type IVCollagen)或第五型胶原蛋白(Type V Collagen)。

更佳者，该细胞种类包含皮肤细胞、皮肤纤维母细胞、上皮细胞、神经细胞、红细胞、白细胞、血小板、吞噬细胞(噬中性粒细胞、噬碱性粒细胞、噬酸性粒细胞)、B淋巴细胞、效应B细胞、记忆B细胞、T淋巴细胞、记忆T细胞、效应T细胞、心肌细胞、平滑肌细胞、骨骼肌细胞、心肌细胞、成骨细胞、神经胶质细胞、肝细胞、肾细胞、腺细胞或内分泌细胞(甲状腺细胞、胸腺细胞、胰岛B细胞、胰岛细胞)，但不以此为限。

本发明另提供一种上述牡丹花蕊萃取物的萃取方法。

于一实施方式中，该牡丹花蕊萃取物的制备方法包含：浸泡步骤，以水或乙醇溶液将牡丹花蕊覆盖浸泡；以及萃取步骤，于低温下以总能量500～800w的超声波能量连续快速振荡萃取该浸泡有牡丹花蕊的水或乙醇溶液。

更佳者，该低温的温度条件为-4℃～25℃。

更佳者，该连续快速震荡的时间累积60～120分钟。

更佳者，该连续快速震荡的过程为：每震荡5分钟休息2分钟，直到震荡累积时间为60～120分钟。

更佳者，在浸泡步骤中，于以水将牡丹花蕊覆盖浸泡下，牡丹花蕊与水的重量比例为1：7～1：11，其温度条件为4℃～50℃，其浸泡时间为72～120小时；于以乙醇溶液将牡丹花蕊覆盖浸泡下，牡丹花蕊与乙醇溶液的重量比例为1：7～1：11，其温度条件为4℃～50℃，其浸泡时间为72～120小时。

更佳者，该牡丹花蕊与水的重量比例为1：9。

更佳者，该水可为纯水、结晶水、超纯水、地下水、天然水、生物水、矿泉水或去离子水，但不以此为限。

更佳者，该牡丹花蕊与乙醇溶液的重量比例为1：9。

更佳者，该乙醇溶液含有50重量％～75重量％的乙醇。

于另一实施方式中，该牡丹花蕊萃取物的制备方法包含：冷冻步骤，以急速(-195.79℃)冷冻、固化牡丹花蕊；研磨步骤，以冷冻研磨器研磨牡丹花蕊，将牡丹花蕊磨成粉末；浸泡步骤，以水或乙醇溶液将牡丹花蕊粉末覆盖浸泡；以及萃取步骤，于低温下以总能量500～800w的超声波能量连续快速振荡萃取该浸泡有牡丹花蕊粉末的水或乙醇溶液。

更佳者，该低温的温度条件为-4℃～25℃。

更佳者，该连续快速震荡的时间累积60～120分钟。

更佳者，该连续快速震荡的过程为：每震荡5分钟休息2分钟，直到震荡累积时间为60～120分钟。

更佳者，在浸泡步骤中，于以水将牡丹花蕊粉末覆盖浸泡下，牡丹花蕊粉末与水的重量比例为1：7～1：11，其温度条件为4℃～50℃，其浸泡时间为72～120小时；于以乙醇溶液将牡丹花蕊粉末覆盖浸泡下，牡丹花蕊与乙醇溶液的重量比例为1：7～1：11，其温度条件为4℃～50℃，其浸泡时间为72～120小时。

更佳者，该牡丹花蕊粉末与水的重量比例为1：9。

更佳者，该水可为纯水、结晶水、超纯水、地下水、天然水、生物水、矿泉水或去离子水，但不以此为限。

更佳者，该牡丹花蕊粉末与乙醇溶液的重量比例为1：9。

更佳者，该乙醇溶液含有50重量％～75重量％的乙醇。

更佳者，以上二种实施方式所述的牡丹花蕊萃取物的制备方法更包含：离心步骤，于低温(-20℃)下对该快速振荡萃取后的水或乙醇溶液以15,000g进行高速离心10分钟，以去除底部沉淀物并收集上清液。

更佳者，该牡丹花蕊萃取物的制备方法更包含：过滤步骤，将该上清液以微孔滤膜孔径为0.22～0.45μm的多微孔结构滤膜，并利用真空筛检器过滤，以获得澄清过滤液。

更佳者，该牡丹花蕊萃取物的制备方法更包含：干燥步骤，利用减压浓缩机及真空冷冻干燥机将该澄清过滤液冻干。

为了解本发明的技术特征、运用技术手段及所预期达成的功效，兹将本发明萃取物的相关实施例加以说明，其叙述如下：

实施例1：牡丹花蕊生长点组织萃取物的萃取方法

萃取方法一：以纯水浸泡牡丹花蕊组织

新鲜花蕊采取后，将牡丹花蕊组织以急速-195.79℃(77K)液态氮冷冻固化，并以冷冻研磨器研磨牡丹花蕊组织，将牡丹花蕊组织磨成粉末；提取重量比为9：1的纯水以及牡丹花蕊组织粉末，并将牡丹花蕊组织粉末浸泡于纯水中，于温度条件4℃～50℃的情况下浸泡72～120小时；将浸泡完成的牡丹花蕊组织粉末以及纯水的混合物，于温度条件-4℃～25℃的情况下，以总能量500～800w的超声波能量连续快速振荡萃取，其中，以每震动5分钟休息2分钟的方式连续震荡，直到总震荡时间达60～120分钟；于温度条件-20℃下以15,000g高速离心10分钟以去除底部沉淀物并收集上清液；将该上清液以孔径0.22～0.45μM的多微孔结构滤膜后，利用真空筛检器的程序过滤，以获得一澄清过滤液；利用减压浓缩机及真空冷冻干燥机将该澄清过滤液冻干，获得牡丹花蕊生长点组织萃取物(PSB)。

萃取方法二：以酒精溶液浸泡牡丹花蕊组织

新鲜花蕊采取后，将牡丹花蕊组织以急速-195.79℃(77K)液态氮冷冻固化，并以冷冻研磨器研磨牡丹花蕊组织，将牡丹花蕊组织磨成粉末；提取重量比为9：1的酒精溶液(含50重量％～75重量％乙醇)以及牡丹花蕊组织粉末，并将牡丹花蕊组织粉末浸泡于酒精溶液(含50重量％～75重量％乙醇)中，于温度条件4℃～50℃的情况下浸泡72～120小时；将浸泡完成的牡丹花蕊组织粉末以及酒精溶液(含50重量％～75重量％乙醇)的混合物，于温度条件-4℃～25℃的情况下，以总能量500～800w的超声波能量连续快速振荡萃取，其中，以每震动5分钟休息2分钟的方式连续震荡，直到总震荡时间达60～120分钟；于温度条件-20℃下以15,000g高速离心10分钟以去除底部沉淀物并收集上清液；将该上清液以孔径0.22-0.45μm的多微孔结构滤膜后，利用真空筛检器的程序过滤，以获得一澄清过滤液；利用减压浓缩机及真空冷冻干燥机将该澄清过滤液冻干，获得牡丹花蕊生长点组织萃取物(PSB)。

实施例2：牡丹花蕊生长点组织萃取物的层析指纹图谱

将牡丹花蕊生长点组织萃取物制成50ppm的浓度，接着放入LC-MS中进行数据的分析。结果如图1所示，在牡丹花蕊生长点组织萃取物的活性成分标定中，一共标定出了4个讯号作为分析的化合物，经过与数据库自数据比对后，讯号1～4皆有比对到相应的分子量，其对应的分析化合物如下：1.阿魏酸(Ferulic acid,M.W.＝194.187)具清除自由基，促进清除自由基的酶的产生，增加谷胱甘肽转硫酶和醌还原酶的活性，保护细胞免于UVA的伤害，抑制酪氨酸酶活性的美白功效，抗发炎、降血糖、抗肥胖、抗心血管疾病、神经保护等调节人体生理机能；2.遗传霉素(Geneticin,M.W.＝258.23)是一种氨基糖苷类抗生素；3.二乙烯二胺(Paprazine)(M.W.＝283.327)具抑制酪胺酸酶活性、抑制黑色素生成的美白功效与抗菌、抗寄生虫功效；4.丹皮酚(Paeonolacetic acid)(M.W.＝426.513)。

实施例3：牡丹花蕊生长点组织萃取物(PSB)的总酚含量测定

多酚类化合物(phenolics)是一种存在于植物的抗氧化剂及植物营养素。多酚抗氧化剂可以抵抗导致神经退化性疾病及一些心血管疾病的氧化应激。福林酚试剂(Folin-Ciocalteu’s phenol reagent)中的磷钼酸(phosphomolybdic acid)复合物会被苯酚(phenol)还原成钼(molybdenum)，试剂会由金黄色变成蓝绿色，可用来定量样品中酚的含量。取1μL牡丹花蕊生长点组织萃取物(PSB)各别加入25μL稀释10X的福林酚试剂反应5mins，再加入20μL Na₂CO₃和50μL二次水反应1h，以酵素免疫分析仪检测700nm吸光值。以不同浓度没食子酸(Gallic acid,0～1280μg/mL)作为标准品制成检量线。试验结果如表1所示：1g的牡丹花蕊生长点组织萃取物(PSB)相当于含有51.4mg的没食子酸。

表1

实施例4：牡丹花蕊生长点组织萃取物(PSB)的总黄酮含量测定

黄酮素(flavonoids)存在于蔬果类食物，具抗氧化、控制炎症，防止细胞被破坏，及对抗老化等功效。黄酮类化合物在碱性的环境下可与三氯化铝(aluminiumchloride)产生螯合，会生成红色的螯合物，在波长510nm具有特定吸光值。取1μL牡丹花蕊萃取物(PSB)各别加入3μL 5％NaNO₂反应6mins，再加入3μL 10％AlCl₃反应6mins，最后加入40μL 4％NaOH和4μL二次水反应15mins，以酵素免疫分析仪检测510nm吸光值。以不同浓度芸香苷(rutin,0～1280μg/mL)作为标准品制成检量线。试验结果如表2所示：1g的牡丹花蕊生长点组织萃取物(PSB)相当于含有54.2mg的芸香苷。

表2

实施例5：牡丹花蕊生长点组织萃取物(PSB)的抗氧化试验

进行牡丹花蕊生长点组织萃取物(PSB)的抗氧化，自由基清除能力试验。DPPH·(2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl,1,1-二苯基-2-三硝基苯肼，别名1,1-二苯基-2-苦肼基(自由基)；是一个稳定的自由基，为暗紫色棱柱状结晶，熔点127～129℃(分解)。可用于亮度测定生育酚和脂肪族硫醇类、还原物质的分析试剂，也是常用的阻聚剂。利用暗紫色的DPPH乙醇溶液在波长517nm处具有特定的吸光值，若DPPH·自由基与样品反应，其吸光值会降低。可由吸光值的变化判断样品清除DPPH·自由基能力。吸光值越低表示样品清除DPPH自由基的能力越强。将样品萃取物配置成不同浓度，分别加入90μL新鲜配置的100μM的DPPH·乙醇溶液一起添加在96孔盘中反应，以酵素免疫分析仪检测517nm吸光值。试验结果如表3所示：牡丹花蕊生长点组织萃取物(PSB)(50、100、250、500μg/mL)的自由基清除能力为28.5％、61.7％、81.2％和94.8％。对照组维生素C(20μg/mL)的自由基清除能力94.4％。

表3

实施例6：牡丹花蕊生长点组织萃取物(PSB)的抗发炎试验

进行牡丹花蕊生长点组织萃取物(PSB)的抗发炎，抑制发炎因子一氧化氮活性试验。硝普钠(sodium nitroprusside,SNP)本身是NO donor的一种，与氧反应会形成亚硝酸(nitrite)，亚硝酸再与Griess reagent反应会变成粉红色溶液，在波长546nm具有特定吸光值。若样品能抑制一氧化氮生成的速率而减少亚硝酸产生，其吸光值会降低；吸光值愈低，表示样品清除一氧化氮自由基的能力越强。取2μL牡丹花蕊萃取物(PSB)各别加入98μL25mM SNP反应120mins，的后加入100μL Griess reagent反应10mins，以酵素免疫分析仪检测546nm吸光值。一氧化氮自由基清除率(％)如DPPH自由基清除能力试验；此试验对照组为芸香苷(Rutin)。试验结果如表4所示：牡丹花蕊生长点组织萃取物(PSB)(50、100、250、500μg/mL)的抑制发炎因子一氧化氮活性为2.3％、8.6％、22.1％和32.4％。对照组芸香苷(500μg/mL)的抑制发炎因子一氧化氮活性能力为41.2％。

表4

实施例7：牡丹花蕊生长点组织萃取物(PSB)的安全性评估试验

进行牡丹花蕊萃取物(PSB)的安全性评估，细胞存活度试验。将人类皮肤角质株化细胞株(HaCaT cells)迅速移至37℃水浴箱内使其在40-60秒内急速解冻，随即将细胞冷冻保存液(含10％DMSO的细胞培养液)加入细胞培养液，将细胞打散并移置25cm²细胞培养瓶，于37℃、5％CO₂细胞培养箱中生长，平均每隔2天更换一次培养液。将人类皮肤角质株化细胞和人类皮肤纤维母细胞(HaCaT and Hs68 cells)培养在96-well盘，并在37℃及5％CO₂培养箱中培养至少24小时。评估牡丹花蕊生长点组织萃取物(PSB)对皮肤细胞是否会影响到细胞存活度：加入不同浓度的牡丹花蕊生长点组织萃取物(PSB)以及于指定的时间作用，达反应时间，移除旧的培养液，以PBS清洗一次，并换上新的培养液，加入10μL的MTT(3-(4,5-cimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide)溶液反应，于37℃、5％CO₂反应4小时后移除培养液，加入100μL的DMSO溶解formazan沉淀物，最后于波长570nm下测定吸光值(BioTek,Synergy^TM2,USA)。试验结果如表5所示：将人类皮肤角质株化细胞和人类皮肤纤维母细胞(HaCaT and Hs68 cells)分别作用牡丹花蕊生长点组织萃取物(PSB)(50、100、250、500μg/mL)24小时后，人类皮肤角质株化细胞的细胞存活度分别为102.5％、103.6％、108.2％和112.5％；人类皮肤纤维母细胞的细胞存活度分别为101.1％、101.5％、102.5％和105.5％。

表5

实施例8：牡丹花蕊生长点组织萃取物(PSB)的促进粒线体再生试验

粒线体是动物及人类细胞的发电厂，每个组织细胞有数百至数千个粒线体，是负责执行许多重要生化功能的胞器(organelles)。主要进行能量代谢途径，供应细胞90％以上的ATP能量需求。粒线体也参与嘧啶核苷酸(pyrimidine nucleotides)生合成、细胞内钙离子恒定(homeostasis)调解及透过凋亡分子(apoptotic molecules)的移位(translocation)管控细胞的生与死。粒线体会随着年龄增加逐渐减少，因此粒线体质量与健康和老化有非常大的关连。评估牡丹花蕊生长点组织萃取物(PSB)的促进粒线体再生效能。将人类皮肤角质株化细胞(HaCaT细胞)(1×10⁴/well)培养于24-well盘，在37℃及5％CO₂培养箱中培养至少24小时，加入不同浓度样品处理，置入培养箱作用24小时。达反应时间后，移除培养液及样品，加入PBS清洗，加入paraforaldehyde固定细胞，使用1％TritonX100作用5分钟，接着使用PBS清洗细胞，加入mitoview染剂，以及用Hoechst33342staining solution染细胞核(定量细胞数)，使用荧光免疫分析仪(BioTek,Synergy^TM2,USA)测定粒线体(green)(Excitation:490nm,Emission:523nm)及细胞核荧光(blue)(Excitation:346nm,Emission:460nm)表现。粒线体表现计算公式：Mitoviewintensity/Hoechst 33342intensity×100。试验结果如表6所示：人类皮肤角质株化细胞(HaCaT细胞)经牡丹花蕊生长点组织萃取物(PSB)(50、100、250、500μg/mL)作用24小时后，粒线体质量分别为102.8％、106.8％、113.2％和126.2％。结果显示牡丹花蕊生长点组织萃取物(PSB)可促进人类皮肤细胞的粒线体质量，促进粒线体再生效能。

表6

实施例9：牡丹花蕊生长点组织萃取物(PSB)的活化三磷酸腺苷(denosinetriphosphate,ATP)试验

ATP是一种核苷酸，为细胞中最重要的能量携带者，所含的能量较易释出，可直接供应细胞能量。ATP在核酸合成中也具有重要作用，它也是RNA序列中的鸟嘌呤二核苷酸，在DNA进行转录时可做为替补。ATP是生命活动能量的直接来源。人体所有需要的能量几乎都是ATP提供的：心脏的跳动、肌肉的运动以及各类细胞的各种功能都源于ATP所产生的能量，没有ATP人体各器官组织就会相继罢工，会出现心功能衰竭、肌肉酸疼、容易疲劳等情况。评估牡丹花蕊生长点组织萃取物(PSB)的活化皮肤细胞中ATP的功能。将人类皮肤角质株化细胞(HaCaT细胞)(1.5×10⁵/mL)培养于24-well盘，在37℃及5％CO₂培养箱中培养至少24小时，加入牡丹花蕊生长点组织萃取物(PSB)处理24小时，置入培养箱作用24小时。达反应时间后，移除培养液及样品，加入PBS清洗，以PBS清洗，并换上新的培养液，加入lysis buffer作用30分钟后于1500rpm离心2分钟，的后将50μL上清液转移到白色96well盘，接着使用ATPdetermination kit(Molecular Probes,Eugene,OR,USA)测定吸光值(BioTek,Synergy^TM2,USA)，评估细胞内ATP含量(μmol/g weight)。试验结果如表7所示：人类皮肤角质株化细胞(HaCaT细胞)经牡丹花蕊生长点组织萃取物(PSB)(50、100、250、500μg/mL)作用后，细胞内ATP含量别为103.2％、105.3％、111.2％和116.2％。结果显示牡丹花蕊生长点组织萃取物(PSB)可促进人类皮肤细胞的ATP含量，促进ATP活化效能。

表7

实施例10：牡丹花蕊生长点组织萃取物(PSB)的促进胶原蛋白生成含量试验

胶原蛋白是一种生物性高分子物质，是人体内含量最丰富的蛋白质，占全身总蛋白质的30％以上。在人体皮肤成分中，有70％是由胶原蛋白所组成。当胶原蛋白不足时，不仅皮肤及骨骼会出现问题，对内脏器官也会产生不利影响。也就是说，胶原蛋白是维持身体正常活动所不可缺少的重要成分。同时也是使身体保持年轻、防止老化的物质。另外，胶原蛋白还可以预防疾病，改善体质，对美容和健康都很有帮助。在皮肤上胶原蛋白为保持肌肤弹性及抗皱的重要因子，其合成量受到年龄的影响，因此若能适时促进胶原蛋白的合成量，可避免肌肤生成皱纹、失去弹力光泽的情形。将皮肤纤维母细胞(3T3L-1)以2×10⁵cell/mL细胞量培养在3-cm dish盘中24小时后，移除上清液再加入含有不同浓度样品的无血清培养液培养48小时，PBS清洗后，刮除细胞，离心1200rpm 5分钟，再去除上清液。本试验是利用Sircol soluble collagen assay kit进行胶原蛋白测定。首先将100μL细胞液混合1mLSircol dye reagent，接着在室温下均匀摇晃30分钟，再离心12000rpm 10分钟，直接倒掉上清液，再加入750μL ice-cold acid-salt wash reagent，再离心12000rpm 10分钟，将dye reagent完全去除干净。的后加入250μL alkali reagent混合均匀，取100μL至96-well盘，在555nm以酵素免疫分析仪测吸光值。试验结果如表8所示：经牡丹花蕊生长点组织萃取物(PSB)(50、100、250、500μg/mL)作用皮肤纤维母细胞后，可促进细胞中胶原蛋白的生成量分别为107.8％、116.2％、126.7％及138.5％，显示牡丹花蕊生长点组织萃取物(PSB)具促进皮肤纤维母细胞的胶原蛋白生成。

表8

实施例11：牡丹花蕊生长点组织萃取物(PSB)的促进伤口愈合试验

评估牡丹花蕊生长点组织萃取物(PSB)是否具促进皮肤伤口愈合效能。将Culture-Insert细胞间隔框架，置于24-well plate中，制造出大小一致的细胞间隙(500±50μm)，将3×10⁵cell/mL细胞数的细胞培养在insert中，并在37℃及5％CO₂培养箱中培养至少24小时，拔除insert进行UVB(20mJ/cm²)照射后再加入不同浓度牡丹花蕊生长点组织萃取物(PSB)反应4小时后，以显微镜观察48小时的变化并拍照，最后进行定量分析。评估是否可因加入牡丹花蕊生长点组织萃取物(PSB)促使细胞生长，让细胞间隔(gap)变小。细胞间隔越小，代表具促使细胞生长作用。试验结果如表9所示：细胞培养经过48小时后，经UVB照射的控制组(control)当100.0％比，如图2所示，经UVB照射后加入牡丹花蕊生长点组织萃取物(PSB)(100、250、500μg/mL)后，细胞间隔变小，促进伤口愈合效能为108.2％、116.1％和128.7％。结果推测牡丹花蕊生长点组织萃取物具促使细胞生长，让细胞间隔变小，推测具促进伤口愈合效能。

表9

实施例12：牡丹花蕊生长点组织萃取物(PSB)的促进细胞保护功能试验

紫外线对于身体的影响，主要是影响表皮细胞。照射过量的紫外线时，细胞的修复能力会受到破坏而造成细胞老化。评估牡丹花蕊生长点组织萃取物(PSB)是否具保护皮肤细胞免于环境紫外线伤害。将人类皮肤角质细胞(1×10⁴/well)培养在96-well盘，并在37℃及5％CO₂培养箱中培养至少24小时。Control组：移除细胞上清液，更换无血清的新鲜培养液，培养4小时后，以PBS清洗置入无血清的新鲜培养液，继续培养4小时，进行存活度分析。UV照射组：移除细胞上清液，更换无血清的新鲜培养液，放置细胞培养箱中培养4小时后，移除上清液以PBS清洗并抽干，进行UV照射后，立即加入无血清的新鲜培养液，继续培养4小时，进行存活度分析。UV照射+牡丹花蕊生长点组织萃取物(PSB)组：移除细胞的上清液，将萃取物，各别混合于无血清的新鲜培养液，培养4小时后，移除上清液以PBS清洗并抽干，各别进行UV照射后，立即加入含萃取物的无血清新鲜培养液，继续培养4小时，进行存活度分析。达反应时间，移除旧的培养液，以PBS清洗一次，并换上新的培养液，加入10μL的MTT(3-(4,5-cimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide)溶液反应，于37℃、5％CO₂反应4小时后移除培养液，加入100μL的DMSO溶解formazan沉淀物，最后于波长570nm下测定吸光值(BioTek,Synergy^TM2,USA)。试验结果如表10所示：经UVB(20mJ/cm²)照射后，细胞存活度约78.1％，而经过牡丹花蕊生长点组织萃取物(PSB)(100、250和500μg/mL)作用后，细胞存活度为82.1％，90.7％和99.5％。显示牡丹花蕊生长点组织萃取物(PSB)具有保护细胞免于紫外线伤害的效能。

表10

实施例13：牡丹花蕊生长点组织萃取物(PSB)的促进细胞修复功能试验DNA是负责任何生物体中维护和传递遗传讯息的分子，稳定原有的基因组型态。若DNA受到生物分子的攻击，将导致基因突变，细胞老化甚至死亡。生理正常代谢所产生的活性氧和自由基及外源性，例如紫外线、辐射、化学物质及环境污染等，易造成的DNA损伤及结构导致突变。在人的细胞中，一般的代谢活动和环境因素(如紫外线和放射线)都能造成DNA损伤，导致每个细胞每天多达1,000,000处的分子损害。人类表皮细胞经紫外线照射所造成的DNA损伤主要是以核苷酸切除修复(nucleotide excision repair,NER)系统进行修复机制。PCNA(proliferating cell nuclear antigen)是一种增殖细胞核抗原，可作为DNA钳，帮助DNA聚合酶活性(DNA pol)然后募集FEN1(Flap内切核酸酶1)以去除悬垂的5'端，是DNA修复的最后一步涉及DNA连接酶，该酶将最终的DNA链以磷酸二酯键结合在一起。有许多机制可以修复受损的双链。

评估牡丹花蕊生长点组织萃取物(PSB)是否具促进核苷酸切除修复(NER)系统，促进皮肤细胞的修复作用。细胞RNA的萃取：将人类皮肤角质株化细胞(HaCaT cells)(1×10⁵/mL)培养在6well盘中24小时后，加入牡丹花蕊生长点组织萃取物(PSB)(500μg/mL)预处理24小时，再使用UVB(20mJ/cm²)照射细胞，加入不含血清的培养液培养24小时。达反应时间后，各别收集上清液至15mL离心管，PBS清洗6well盘一次，再以1.5倍trypsin-EDTA溶液将细胞取下至离心管中，离心1200rpm、5分钟。移除上清液后，将剩下细胞液移置1.5mL的微量离心管中，再次离心后，移除上清液，加入1mL Rezol TM C&T溶液，25℃反应5分钟将细胞溶解。加入200μL氯仿(chloroform)，将其混合均匀并置冰上5分钟，萃取RNA。于4℃以12000rpm离心15分钟，取上层液至另一管经DEPC-treated H₂O处理过的微量离心管，并加入等体积冰的异丙醇(isopropanol)混合均匀反应10分钟后，于4℃以12000rpm离心15分钟，RNA在微量离心管底部形成一透明白色沉淀物(pellet)。移除上清液，以200μL冰的75％酒精轻轻润洗此沉淀物，并于4℃下以12000rpm离心5分钟后，移除上清液。静置干燥(air-dry)RNA pellet 15分钟，的后将RNA pellet溶于适量的DEPC-treated H₂O，储存于-80℃，的后以分光亮度计于OD260nm以及OD280nm测量吸光值及RNA纯度。

反转录作用(reverse transcription,RT)制备cDNA：取3μg的RNA，混合适量diethyl pyrocarbonate(DEPC)water后，加入1μL Oligo(dT)18primer置于70℃作用2分钟后迅速移至冰上，再分别加入4μL 10×MMLV RT buffer solution、1μL dNTP mixture(10mM each dNTP)、0.5μL recombinant RNase inhibitor(1unit/mL)、1μL MMLV reversetranscriptase(5unit)，使总体积为20μL。将其混合均匀，于42℃下作用1小时，再于94℃取加热5分钟，去除MMLV-RTase活性用以终止反应，便完成第一股cDNA模板的制备，之后加入80μl DEPC water，保存于-20℃备用。

聚合酶链反应(polymerase chain reaction,PCR)：取1μL cDNA至微量离心管中,分别加入5μL 10×reaction buffer、0.8μL 10mM dNTP(200mM each dGTP、dATP、dTTP和dCTP)及各1μL的50mM upstream primer、downstream primer、Taq DNA polymerase(5unit/μL)，最后加入去离子水(ddH2O)使总体积达50μL。混合均匀后，置于自动温度循环机(Techne Progene)进行PCR反应，反应条件如下：前变性反应(denaturation)

3分钟一个循环；继的变性反应94℃、黏合反应(annealing)60℃、合成反应(extension)72℃各1分钟的聚合酶链反应，总反应过程共进行35个循环。反应完毕后，取适量反应产物以2％琼脂凝胶电泳来分析。PCNA引子：Forward 5′-GAA CTG GTT CAT TCA TCT CTA TGG-3′；Reverse 5′-TGT CAC AGA CAA GTA ATG TCG ATA AA-3′。β-actin引子：Forward 5′-ACCCAC ACT GTG CCC ATC TA-3′；Reverse 5′-CGG AAC CGC TCA TTG CC-3′。利用凝胶电泳对各组别的参照基因(β-actin)和目标基因进行分析，再利用影像软件(image J)进行定量。

结果如图3所示：未经过UVB伤害的控制组，PCNA表现定量(1.0)，而经过UVB照射后，其表现明显降低(0.2)。而经牡丹花蕊生长点组织萃取物(PSB)作用的细胞则可明显提升PCNA的表现(0.8)。显示牡丹花蕊生长点组织萃取物可有效调控修护皮肤细胞免于UV的伤害。

惟以上所述者，仅为本发明的较佳实施例，但不能以此限定本发明的保护范围；故，凡依本发明权利要求及说明书内容所做的简单的等效改变与修饰，皆仍属本发明的保护范围内。

Claims (10)

1.一种牡丹花蕊萃取物的用途，其特征在于，是用于制备抗发炎、促进粒线体再生、促进胶原蛋白生成、保护细胞以及修护细胞的组合物。

2.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，该牡丹花蕊萃取物的制备方法包含：浸泡步骤，以水或乙醇溶液将牡丹花蕊覆盖浸泡；以及萃取步骤，于低温下以总能量500～800w的超声波能量连续快速振荡萃取该浸泡有牡丹花蕊的水或乙醇溶液。

3.根据权利要求2所述的用途，其特征在于，在浸泡步骤中，于以水将牡丹花蕊覆盖浸泡下，牡丹花蕊与水的重量比例为1：7～1：11，其温度条件为4℃～50℃，其浸泡时间为72～120小时；于以乙醇溶液将牡丹花蕊覆盖浸泡下，牡丹花蕊与乙醇溶液的重量比例为1：7～1：11，其温度条件为4℃～50℃，其浸泡时间为72～120小时。

4.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，该牡丹花蕊萃取物的制备方法包含：冷冻步骤，以急速冷冻、固化牡丹花蕊；研磨步骤，以冷冻研磨器研磨牡丹花蕊，将牡丹花蕊磨成粉末；浸泡步骤，以水或乙醇溶液将牡丹花蕊粉末覆盖浸泡；以及萃取步骤，于低温下以总能量500～800w的超声波能量连续快速振荡萃取该浸泡有牡丹花蕊粉末的水或乙醇溶液。

5.根据权利要求4所述的用途，其特征在于，在浸泡步骤中，于以水将牡丹花蕊粉末覆盖浸泡下，牡丹花蕊粉末与水的重量比例为1：7～1：11，其温度条件为4℃～50℃，其浸泡时间为72～120小时；于以乙醇溶液将牡丹花蕊粉末覆盖浸泡下，牡丹花蕊与水的重量比例为1：7～1：11，其温度条件为4℃～50℃，其浸泡时间为72～120小时。

6.根据权利要求3或5所述的用途，其特征在于，该牡丹花蕊萃取物的制备方法更包含：离心步骤，于低温下对该快速振荡萃取后的水或乙醇溶液进行高速离心，以去除底部沉淀物并收集上清液。

7.根据权利要求6所述的用途，其特征在于，该牡丹花蕊萃取物的制备方法更包含：过滤步骤，将该上清液以微孔结构滤膜，并利用真空筛检器过滤，以获得澄清过滤液。

8.根据权利要求7所述的用途，其特征在于，该牡丹花蕊萃取物的制备方法更包含：干燥步骤，利用减压浓缩机及真空冷冻干燥机将该澄清过滤液冻干。

9.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，该组合物用以投予至皮肤细胞或皮肤纤维母细胞以抗发炎、促进粒线体再生、促进胶原蛋白生成、保护细胞以及修护细胞。

10.根据权利要求2或4所述的用途，其特征在于，该萃取步骤的温度为-4℃～25℃，快速振荡时间为60～120分钟。

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