KR20070067364A

KR20070067364A - 히알루론산의 생성촉진을 위한 조성물

Info

Publication number: KR20070067364A
Application number: KR1020050128590A
Authority: KR
Inventors: 진무현; 이상화; 강상진; 김청택; 조완구
Original assignee: 주식회사 엘지생활건강
Priority date: 2005-12-23
Filing date: 2005-12-23
Publication date: 2007-06-28

Abstract

본 발명은 히알루론산 생성촉진제에 관한 것으로서, 연교 추출물, 오수유 추출물, 천궁 추출물, 곡아 추출물 및 핵도추피 추출물로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나 이상을 함유하는 것을 특징으로 한다. 본 발명의 연교 추출물, 오수유 추출물, 천궁 추출물, 곡아 추출물 또는 핵도추피 추출물은 히알루론산 합성효소(hyaluronic acid synthase, HAS) 유전자의 발현을 증가시켜 히알루론산(hyaluronic acid) 생성을 촉진하는 효능이 있으며, 따라서 이러한 추출물을 함유하는 화장료 조성물은 피부 주름, 피부 탄력 저하, 피부의 수분 함유 저하 또는 피부 노화를 개선 또는 예방하는데 유용하다.

히알루론산, 히알루론산 합성효소, 연교, 오수유, 천궁, 곡아, 핵도추피

Description

히알루론산의 생성촉진을 위한 조성물{Composition for promoting the production of hyaluronic acid}

도 1은 본 발명의 추출물을 투여한 섬유아세포 NIH 3T3의 히알루론산 합성효소 발현증가를 측정한 사진임.

본 발명은 히알루론산(hyaluronic acid)의 생성을 촉진할 수 있는 조성물에 관한 것이다.

히알루론산(hyaluronic acid)은 섬유아세포(fibroblast)와 기타 피부세포의 원형질막(plasma membrane)에서 합성되는 황산기가 부착되지 않은 글루코스아미노글리칸(nonsulfated glycosaminoglycan)의 일종으로 200~10,000개의 반복되는 디사카라이드 단위체(disaccharide unit)인 글루쿠로닉산과 N-아세틸글루코사민 잔기가 반복적으로 사슬 모양으로 연결되어 있는 1×10⁵~5×10⁶Da 크기의 선형 고분자 다당류 물질이다. 특히 피부는 체내 히알루론산의 50% 이상을 함유하는 것으로 알려져 있으며, 히알루론산은 세포외 기질의 주요 구성성분으로, 수분 보유, 세포간 간 격 유지, 세포성장인자 및 영양성분의 저장과 확산에 관여할 뿐만 아니라, 세포의 분열과 분화, 이동 등에도 관여하는 것으로 보고된 바 있다.

피부세포 배양상태에서 히알루론산의 합성은 여러 종류의 성장 인자, 트랜스레티노인산, N-메틸세린 등에 의해 증가된다는 보고(Biochem . J. 258, 919-922; Biochem . J. 283, 165-170; Biochem . J. 307, 817-821; J. Biol . Chem . 272, 4787-4794; J Invest Dermatol 92, 326-332; Biol Pharm Bull 17, 361-364; 및 Skin Pharmacol Appl Skin Physiol 12, 276-283 참조)와, 피부에 도포된 여성호르몬(estradiol) 및 그 유사물질이 히알루론산의 합성을 증가시킨다는 보고(Steroids 16, 1-3; J Invest Dermatol 87, 668-673; 및 Skin Pharmacol Appl Skin Physiol 15, 175-183 참조)가 있었으나, 히알루론산 대사에 대한 자세한 기작은 아직까지 밝혀지지 않았다. 단지, 히알루론산의 합성은 세포막의 안쪽 표면에서 히알루론산 합성효소(hyaluronic acid synthase, HAS)에 의해 진행되며, 합성되는 동안 세포막을 뚫고 나와 세포외 기질에 축적되는 것으로 알려졌다 (J. Biol . Chem . 272, 13997-14000 참조).

포유동물에서 히알루론산 합성효소의 유전자는 서열상의 유사성이 높은 HAS1, HAS2 및 HAS3의 세가지 형태가 보고되었다. 이와 관련하여, 표피성장인자(Epidermal growth factor, EGF)를 표피세포 배양액 속에 첨가하였을 때 HAS2 유전자 발현이 증가되었음이 보고된 바 있다 (J. Biol . Chem . 276, 20428-20435 참조). 그러나, 히알루론산의 세포 및 조직에서의 분포, 히알루론산과 관련된 각종 인자 및 효소, 예를 들면 히알루론산 합성효소 또는 히알루론산 활성을 조절하는 인자에 대한 연구는 매우 미흡한 실정이다.

전술한 바와 같이 포유류의 체내에 존재하는 히알루론산의 50% 이상이 피부, 특히 표피의 세포간 간격과 진피의 결체 조직에 분포한다고 보고되었고, 이러한 히알루론산은 주로 각질형성세포와 섬유아세포에 의해 합성되는 것으로 알려졌다. 인간 피부에서 히알루론산의 양은 노화와 함께 감소되는 것으로 보고되었는데, 피부 내 히알루론산의 감소는 노화에 따른 피부 탄력 저하 및 수분 함유량 감소의 직접적인 원인 중 하나라고 여겨지고 있다 (Biochem Biophys Acta 279, 265-275; Carbohydr Res 159, 127-136; 및 Int J Dermatol 33, 119-122 참조).

따라서 히알루론산의 위와 같은 피부 적용가능성에 주목하여, 히알루론산을 효과적으로 생산 또는 주입하거나, 또는 인체 내의 히알루론산의 생성을 증가시킬 수 있는 방법에 대한 연구가 활발히 진행되고 있으나, 괄목한 만한 연구 결과는 아직 알려진 바가 없는 실정이다.

따라서 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 피부 내에서 히알루론산의 생성을 촉진할 수 있는 히알루론산 생성촉진제를 제공하는 것이며, 본 발명이 이루고자 하는 다른 기술적 과제는 이러한 히알루론산 생성촉진제를 함유하는 피부 주름, 피부 탄력, 피부의 수분 함유 또는 피부 노화의 개선 또는 예방용 화장료 조성물을 제공하는 것이다.

상기 기술적 과제를 달성하기 위하여 본 발명은 연교 추출물, 오수유 추출 물, 천궁 추출물, 곡아 추출물 및 핵도추피 추출물로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나 이상을 함유하는 것을 특징으로 하는 히알루론산 생성촉진제를 제공한다.

본 발명은 또한 연교 추출물, 오수유 추출물, 천궁 추출물, 곡아 추출물 및 핵도추피 추출물로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나 이상을 함유하는 것을 특징으로 하는 피부의 히알루론산과 관련된 피부 주름, 피부 탄력 저하, 피부의 수분 함유 저하 또는 피부 노화의 개선 또는 예방용 화장료 조성물을 제공한다.

본 발명자들은 히알루론산을 보다 효과적으로 공급할 수 있는 방법에 대하여 연구한 결과 연교 추출물, 오수유 추출물, 천궁 추출물, 곡아 추출물 또는 핵도추피 추출물이 히알루론산의 생성을 촉진하는 효능이 있음을 발견하였다. 즉, 이들 추출물을 도포하였을 때 히알루론산의 생성이 촉진되고 세포 내 히알루론산의 양이 증가하므로, 히알루론산의 유용성을 이용하는 각종의 용도, 예를 들면 피부 탄력 증진, 피부 건조 방지 또는 피부 노화 방지와 같은 피부 개선용 물질로 이용할 수 있음을 발견하고 본 발명을 완성하였다.

이하, 본 발명에 대하여 상세히 설명한다.

본 발명에서 히알루론산 생성촉진 효능을 갖는 연교는 물푸레나무과 식물 연교(개나리, Forsythia suspensa , F. koreana , F. viridissima)의 열매이다. 연교 추출물은 항균효과가 있는 것으로 알려져 있으며, 한방에서는 해열, 해독, 부기제거에 사용되는 약재로서 성분으로는 forsythoside, matairesinol, matairesinoside, oleanolic acid, ursolic acid 등이 알려져 있다 (동양의약과학대전, 중약대사전 참조).

본 발명에서 히알루론산 생성촉진 효능을 갖는 오수유는 산초과 식물 오수유(Evodia rutaecarpa , E. officinalis , E. rutaecarpa)의 성숙되지 않은 열매이다. 오수유 추출물은 항균효과 및 구충효과가 있는 것으로 알려져 있으며, 한방에서는 지통, 지사, 거담에 사용되는 약재로서 성분으로는 evodiamide, evodioside, rutaecarpine, rutaevin, atanine 등이 알려져 있다 (동양의약과학대전, 중약대사전 참조).

본 발명에서 히알루론산 생성촉진 효능을 갖는 천궁은 산형과 식물 천궁(Ligusticum chuanxiong , L. wallichii var . officinale , Cnidium officinale)의 뿌리줄기이다. 천궁 추출물은 항균효과 및 중추신경계 진정작용이 있는 것으로 알려져 있으며, 한방에서는 기를 순환시키고 혈액순환을 촉진시키며 통증을 완화시켜주는 약재로서 사용된다. 성분으로는 ferulic acid, trimethlamine, perlolyrine, senkyunolide 등이 알려져 있다 (동양의약과학대전, 중약대사전 참조).

본 발명에서 히알루론산 생성촉진 효능을 갖는 곡아는 벼과 식물 벼(Oryza sativa)의 열매를 발아시킨 것이다. 한방에서는 식욕을 돋우며 소화를 돕는 효능이 있어 소화불량, 설사 또는 식욕부진을 치료하는 약재로 사용하며, 성분으로는 전분, 단백질, 디아스타제, 비타민 B 등이 알려져 있다 (동양의약과학대전, 중약대사전 참조).

본 발명에서 히알루론산 생성촉진 효능을 갖는 핵도추피는 가래나무과 핵도추(호도, Juglans sinensis , J. regia , J. mandshurica)의 가지 껍질 또는 나무껍질이다. 한방에서는 열을 내리고 시력을 좋게 하는데 사용되며, 탄닌을 많이 포함 하고 있다고 알려져 있다 (중약대사전 참조).

본 발명은 연교 추출물, 오수유 추출물, 천궁 추출물, 곡아 추출물 또는 핵도추피 추출물이 생쥐 유래의 섬유아세포인 NIH 3T3세포에서 히알루론산 합성효소 2(HAS2) 유전자의 발현을 증가시킬 수 있다는 사실에 기초한다.

본 발명의 일 실시예에서, 이들 각 추출물을 1 ug/ml 또는 10 ug/ml의 농도로 12시간 처리한 NIH 3T3세포는 본 발명의 추출물 시료를 처리하지 않은 세포군에 비해 히알루론산 합성효소 유전자의 발현이 매우 많이 증가하였다. 또한, 본 발명의 다른 실시예에서, 연교 추출물, 오수유 추출물, 천궁 추출물, 곡아 추출물 또는 핵도추피 추출물을 무모 생쥐의 등피부에 패취를 통해 1일 2회 4주간 1%의 농도로 처리하였을 때 표피와 진피에서 히알루론산 생성이 약 1.8~3.2배 증가하였음을 확인하였다.

본 발명의 연교, 오수유, 천궁, 곡아 또는 핵도추피의 추출물은 본 발명이 속한 분야에서 통상적으로 사용되는 추출방법으로 제조될 수 있다. 예를 들어, 상대적으로 낮은 온도에서 일정시간 침출하는 냉침추출법, 냉침추출법과 유사하나 약 35∼55℃의 온도에서 침출하는 온침추출법, 약 60∼120℃의 온도에서 침출하는 가열추출법, 퍼콜레이터(percolater)를 사용하는 퍼콜레이션법, 환류장치를 이용하는 환류추출법 등이 사용될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 또 본 발명의 추출에 사용될 수 있는 추출 용매로는 정제수, 무수 저급 알코올, 함수 저급 알코올, 에틸아세테이트, 아세톤, 프로필렌글리콜, 부틸렌글리콜, 글리세릴, 핵산, 클로로포름 등이 이용될 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 연교 추출물, 오수유 추출물, 천궁 추출물, 곡아 추출물 또는 핵도추피 추출물은 피부 내에서 히알루론산 합성효소 유전자의 발현을 증가시키고 결과적으로 히알루론산의 생성을 촉진하는 효능이 있으므로 각종 피부 외용제의 유효성분으로 유용하게 사용될 수 있다. 예를 들어, 피부 탄력 증진, 피부 건조의 방지, 피부 노화의 방지, 피부 주름의 개선 등을 위한 피부 외용제에 첨가될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니며 히알루론산이 유용한 여러 가지 다른 질환 또는 증상의 개선에 사용될 수 있다.

본 발명에 따른 연교 추출물, 오수유 추출물, 천궁 추출물, 곡아 추출물 및 핵도추피 추출물로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나 이상을 함유하는 화장료 조성물은 사용 및 취급이 용이하도록 화장학적 또는 약학적으로 허용되는 담체, 희석제, 보조제, 착색제, 안정화제, 착향제, 계면활성제, 유분, 보습제, 알코올, 점증제, 산화방지제, pH 조절제, 자외선 차단제 등을 추가로 함유할 수 있으며, 피부외용 조성물로서 사용될 때에는 액상, 유상, 크림상, 연고, 스틱상, 팩, 파스타제, 산제 등 외피에 적용할 수 있는 어떠한 제형으로도 이용 가능하다.

한편 본 발명의 화장료 조성물에 함유되는 히알루론산 생성촉진 추출물의 총함량은 화장료 조성물 총중량 대비 건조중량으로 0.00001%(w/w) 내지 10%(w/w)인 것이 바람직하다. 건조중량으로 0.0001% 미만이면 본 발명의 히알루론산 생성촉진 효과가 충분히 발휘되기 어렵고, 10%를 초과하는 경우에는 화장료의 제조 및 안정성 측면에서 바람직하지 못하다.

또한 본 발명의 히알루론산 생성촉진 추출물을 함유하는 조성물은 화장료 뿐 만 아니라 동일한 효과를 가지는 의약품 또는 의약부외품으로도 사용될 수 있으며, 이 경우 부형제, 활택제, 붕해제 등의 약학적으로 허용가능한 첨가제를 추가로 함유할 수 있다.

이하, 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위해 실시예 등을 들어 설명하기로 한다. 그러나 본 발명에 따른 실시예들은 여러 가지 다른 형태로 변형될 수 있으며, 본 발명의 범위가 아래에서 상술하는 예들에 한정되는 것으로 해석되어서는 안 된다.

<실시예 1~5의 제조>

시판되는 연교, 오수유, 천궁, 곡아 및 핵도추피를 구입하여 분쇄한 다음, 분쇄물 100 g을 70% 에탄올 2 L에 넣고, 냉각콘덴서가 달린 환류추출기에서 3시간 끓여 추출하였다. 그 후, 100메쉬 여과포로 여과하고 잔사를 동일한 방법으로 1회 더 추출하였다. 각각의 추출액을 합한 후 상온에서 화트만(Whatman) 2번 여과지로 여과하여 불용성물질을 제거하고, 냉각콘덴서가 달린 증류장치에서 60℃로 감압농축한 후 동결건조하여 건조중량으로 각각 연교 추출물 6.7 g, 오수유 추출물 10.2 g, 천궁 추출물 8.3 g, 곡아 추출물 9.6 g 및 핵도추피 추출물 10.7 g을 얻었다 (표 1 참조).

	성분	건조중량(g)
실시예 1	연교	6.7
실시예 2	오수유	10.2
실시예 3	천궁	8.3
실시예 4	곡아	9.6
실시예 5	핵도추피	10.7

<생쥐 유래의 섬유아세포 NIH 3T3에서의 HAS2 발현증가 평가>

생쥐 유래의 섬유아세포 NIH 3T3를 10% 우혈청(fetal bovin serum)을 포함한 DMEM 배지에서 24시간 배양하였다. 배양된 세포를 우혈청이 포함되지 않은 DMEM 배지로 2회 세척하고, 다시 12시간 동안 동일배지를 처리하여 우혈청의 영향을 제거하였다. 이렇게 배양된 세포의 배지를 다시 각각의 연교 추출물, 오수유 추출물, 천궁 추출물, 곡아 추출물 또는 핵도추피 추출물을 1 ug/ml 또는 10 ug/ml의 농도로 우혈청을 포함하지 않은 DMEM 배지에 첨가한 배양액으로 교체하고 12시간 처리하였다.

12시간 경과 후 세포를 회수하여 냉각된 인산완충용액(PBS)으로 세척하고, RNA 분리 키트(Tri-reagent, Gibco BRL) 1 ㎖을 첨가하여 총 RNA를 추출한 후 하기의 방법으로 정량적인 역전사 PCR을 수행하였다. 히알루론산 합성효소2(HAS2) 및 GAPDH의 PCR 수행을 위한 센스 프라이머는 5'-CTGTGAAAAGGCTGACCTAC-3'(서열번호: 1)이었고, 안티-센스 프라이머는 5'-TCAGTAAGGCACTTGGACCG-3'(서열번호: 2)이었다.

1 ug의 총 RNA를 역 전사 시스템(Promega사, 미국)을 이용하여 역전사하여 cDNA를 얻었다. 이후 역전사 반응용액 2 ㎕를 50 mM KCl, 10 mM tris-HCl (pH 8.3), 5 mM MgCl₂ 및 0.16 mM dNTP의 PCR 반응 완충액 50 ㎕에 섞고, 20 pmol의 프라이머와 1.25 U의 Taq DNA 중합효소를 첨가하여 94℃에서 60초, 60℃에서 120초, 72℃에서 120초의 30사이클을 수행하였다. PCR 산물을 아가로스 젤에 전기영동하고 이를 Fluoro-S MultiImager(BioRad)로 분석하였다.

분석 결과를 도 1 및 표 2에 종합하여 나타내었다. 각각의 추출물 시료를 1 ug/ml 또는 10 ug/ml의 농도로 처리하였을 때 농도에 따른 HAS2 유전자의 발현정도(HAS2 mRNA의 양)를 대조군에 대한 상대적인 값(%)으로 하기 표 2에 나타내었다. GAPDH는 유전자 발현변화를 정량적 역전사 PCR 방법으로 확인할 때 내부 지표 유전자(internal control)로 사용하는 유전자로서, GAPDH의 변화에 대한 특정 유전자, 여기에서는 HAS2의 상대적 양을 나타냄으로써 시료간의 표준화를 이룰 수 있다. 하기 표 2에 나타나는 바와 같이, 결과를 살펴보면, 연교 추출물, 오수유 추출물, 천궁 추출물, 곡아 추출물 및 핵도추피 추출물은 1 ug/ml과 10 ug/ml의 농도에서 히알루론산 합성효소2의 발현을 증가시켰으며, 1 ug/ml의 투여량에 있어서는 곡아 추출물, 연교 추출물, 천궁 추출물, 오수유 추출물 및 핵도추피 추출물의 순으로 효과가 좋았고, 10 ug/ml의 투여량에 있어서는 연교 추출물, 핵도추피, 천궁 추출물, 곡아 추출물 및 오수유 추출물의 순으로 효과가 좋았다.

투여량	연교	오수유	천궁	곡아	핵도추피
1 ug/ml	166	135	161	182	64
10 ug/ml	257	139	189	162	192

<무모생쥐 피부에서의 히알루론산 생성 증가 평가>

본 실험을 위한 생쥐로는 체중이 25∼39 g 정도되는 30주령의 암컷 무모 생쥐(hairless mouse; Skh:HR-1)를 Charles River Laboratories(Wilmington, MA, 미국)로부터 구입하여 사용하였다. 실험쥐들을 일주일 동안 동물사육실에서 적응시킨 후 그룹당 5마리씩 정상군, 시료처치군으로 나누어 실험기간 동안 사육하였다.

각각 1% 농도로 용매(1.3 부틸렌 글리콜(Buthylene Glycol):에탄올 = 7:3)에 녹인 연교 추출물, 오수유 추출물, 천궁 추출물, 곡아 추출물 및 핵도추피 추출물을 시료처치군에 1일 2회 4주간 처치하였고, 대조군의 경우 용매만 같은 방법으로 처치하였다. 처치 완료 후, 동물을 희생시키고 등쪽 피부를 떼어내어 필터 페이퍼에 편평하게 부착한 후 10% 중성 포르말린에 고정시켰다. 그 후 파라핀에 임베드하여 얇은 절편으로 잘랐다. 파라핀 제거 후 각 절편은 메탄올에 희석된 0.3% 과산화수소 용액에 담구어 30분간 방치하고, 인산완충용액으로 씻은 후 1% 우혈청알부민으로 처리하였다. 피부조직내 히알루론산의 양을 측정하기 위하여 퍼옥시다제가 결합된 히알루론산 결합단백질(Corgenix, 미국)을 처리하여 상온에서 2시간 방치한 후, 3,3-디아미노벤지딘(diaminnobezidine) 테트라하이드로클로라이드 시약을 5분간 상온에서 처리하여 발색시켰다. 그 후 조직상태 관찰을 위하여 헤마톡실린(Hematoxylin) 염색을 실시하였다. 면역염색된 히알루론산은 Image Pro(Media Cybernetics) 이미지 분석프로그램을 이용하여 정량화하였다. 그 결과를 종합하여 하기 표 3에 나타내었다. 실험결과 용매만을 처리한 대조군에 비하여, 연교 추출물, 오수유 추출물, 천궁 추출물, 곡아 추출물 및 핵도추피 추출물을 처리한 군의 피부조직 내 히알루론산의 양이 약 180~320% 정도 증가한 것을 알 수 있었다.

	연교	오수유	천궁	곡아	핵도추피
증가량(%)	320%	180%	210%	240%	280%

이상과 같이, 본 발명의 연교 추출물, 오수유 추출물, 천궁 추출물, 곡아 추출물 또는 핵도추피 추출물은 히알루론산 합성효소를 코딩하는 유전자의 발현을 증가시키는 효능이 있어 결과적으로 히알루론산의 생성 작용을 활성화시키는 뛰어난 효과가 있다. 따라서, 본 발명의 히알루론산 생성촉진 추출물들은 피부 주름, 피부의 탄력 저하, 피부 수분 함유량 감소 및 노화의 진행을 효과적으로 개선 또는 예방하는데 이용될 수 있다.

<110> LG Household & Health Care Ltd. <120> Composition for promoting the production of hyaluronic acid <130> LH05-029 <160> 2 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> sense primer for PCR <400> 1 ctgtgaaaag gctgacctac 20 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> anti-sense primer for PCR <400> 2 tcagtaaggc acttggaccg 20

Claims

연교 추출물, 오수유 추출물, 천궁 추출물, 곡아 추출물 및 핵도추피 추출물로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나 이상을 함유하는 것을 특징으로 하는 히알루론산(hyaluronic acid) 생성촉진제.
제1항에 있어서, 상기 히알루론산 생성촉진은 히알루론산 합성효소 유전자의 발현을 증가시키는데 기인하는 것을 특징으로 하는 히알루론산 생성촉진제.
연교 추출물, 오수유 추출물, 천궁 추출물, 곡아 추출물 및 핵도추피 추출물로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나 이상을 함유하는 것을 특징으로 하는 피부의 히알루론산과 관련된 피부 주름, 피부 탄력 저하, 피부의 수분 함유 저하 또는 피부 노화의 개선 또는 예방용 화장료 조성물.
제3항에 있어서, 상기 연교 추출물, 오수유 추출물, 천궁 추출물, 곡아 추출물 및 핵도추피 추출물의 총함량은 화장료 조성물 총중량 대비 건조중량으로0.00001 내지 10%(w/w)인 것을 특징으로 하는 화장료 조성물.