KR101130245B1

KR101130245B1 - 사향쥐에서 얻은 사향추출물과 생약추출물을 함유하는 노화방지 복합 한방조성물

Info

Publication number: KR101130245B1
Application number: KR1020090103146A
Authority: KR
Inventors: 김광중; 신수식; 조항의; 백태웅; 소경석
Original assignee: 정산생명공학 주식회사
Priority date: 2009-10-29
Filing date: 2009-10-29
Publication date: 2012-03-26
Also published as: KR20110046624A

Abstract

본 발명은 사향쥐로부터 얻은 사향추출물과 대황, 백지, 당귀, 천화분, 금은화, 자단향, 창이자, 의이인, 녹각, 녹차를 포함하는 것을 특징으로 하는 항산화, 항염, 보습 및 콜라겐 생합성 효능을 가지는 노화 방지 복합한방 조성물에 관한 것이다. 또한 본 발명은 상기 조성물을 포함하는 화장료 조성물에 관한 것이다.

본 발명에 따르면, 상기 복합 한방추출물은 우수한 자유라디칼 소거 활성, NF-κB 억제효과, 보습 및 콜라겐섬유 생합성 효능을 가져, 노화방지 및 개선효과가 뛰어난 화장품 원료로서 유용하다.

노화방지, 항산화, 복합한방조성물, 사향, 서사향

Description

사향쥐에서 얻은 사향추출물과 생약추출물을 함유하는 노화방지 복합 한방조성물 { Composition formed by using mixture of herbal extracts and Muskrat (Ondatra zibethicus)musk for Anti-aging }

본 발명은 사향쥐에서 얻은 사향추출물과 생약추출물을 함유하는 복합 한방 조성물을 이용하여 이루어진 조성물에 관한 것으로 더욱 상세하게는 사향쥐에서 얻은 사향추출물 0.0001~30 중량% 및 물 100 중량부당 대황 0.001~20 중량%, 백지 0.001~20 중량%, 당귀 0.001~20 중량%, 천화분 0.001~20 중량%, 금은화 0.001~20 중량%, 자단향 0.001~20 중량%, 창이자 0.001~20 중량%, 의이인 0.001~20 중량%, 녹각 0.001~20 중량%, 녹차 0.001~20 중량%를 첨가한 후 60~120 ^oC 온도에서 2~8시간 가열한 후 제조되는 생약추출물 0.001~30 중량%의 복합조성물로 이루어진 화장료용 조성물에 관한 것이다.

노화란 생명체가 피할 수 없이 겪는 시간에 따른 생체 기능의 손실을 의미하 며, 인체의 노화과정이란 수십 년에 걸쳐 오랜 시간 동안에 일어나는 퇴행적인 변화이다. 노화가 왜 일어나는지를 설명하기 위해 여러 학설이 존재하나 가장 보편적인 피부노화 메커니즘은 다음과 같다.

자외선이나 외부환경적 요인에 의해 활성산소나 자유라디칼이 생성되며, 생성된 활성산소나 자유라디칼에 의한 연속적인 유해반응의 결과로 피부에 염증이 발생하고, 염증화된 조직은 단백질이나 유전자물질을 파괴하여 주름 등을 형성하는 피부노화가 일어난다. 생체 내에서 끊임없이 생성되는 자유라디칼은 세포성분(DNA, RNA, 효소, 세포막)을 산화시켜 세포의 기능저하와 손상을 가져오고, 세포 항상성의 파괴로 피부노화를 초래한다.

자유라디칼은 생체 내 여러 세포의 작용을 조절하는 염증반응과 깊이 관련되어 있다. 세포 내에서 세포손상에 관여하는 자유라디칼은 미토콘드리아나 다양한 효소 이외에 염증 반응 시 대식세포, 호중구 및 다른 면역 세포들의 면역반응으로 인해 다량 생성된다. 이는 감염이나 염증반응에서 이물질을 제거하는데 중요한 역할을 하기 때문이다. 또한 면역계를 활성화시키는데 중요한 역할을 하지만 과다한 양이 장기간 지속적으로 생성되어 축적되면 세포구성성분의 손상을 초래하게 된다.

노화과정에는 NF-κB의 염증반응이 중심적 위치를 차지하고 있다. NF-κB 의 활성화와 이에 의한 유전자 발현은 노화, 염증, 면역반응의 상태와 관련이 있는 것으로 보고되고 있다. NF-κB , 염증 및 산화적 스트레스 간의 복잡한 관계는 자유라디칼 상태에 따라 조절된다.

염증반응이 노화과정에 밀접하게 관련됨이 최근 명확히 밝혀지고 있다. 자유 라디칼은 NF-κB의 활성화를 초래하고, 활성화된 NF-κB는 염증반응 및 산화적 스트레스에 주된 역할을 담당하여 노화에 영향을 미치게 된다. 또한 노화 과정에서 자유라디칼에 의한 여러 조직의 손상은 염증세포들의 염증성 cytokine 발현유도 및 활성화를 초래하여 염증반응을 지속적으로 증폭시킨다. 결국 축적된 자유라디칼이 염증 반응의 증폭을 야기하며, 세포의 항상성 상실을 가져와 노화를 초래한다.

여러 연구와 결과들을 통해 자유라디칼과 염증이 노화에 얼마나 중대한 영향을 미치는지 알 수 있다. 특히 NF-κB 에 의한 염증반응은 노화의 핵심 메커니즘이다.

따라서 항노화 물질로써 실질적인 효과를 얻기 위해서는 자유라디칼 소거 능력과 더불어 NF-κB 억제효과를 갖는 물질이어야 한다.

피부에서 콜라겐 섬유는 엘라스틴 섬유와 함께 진피 안쪽에서 가교결합을 형성한다. 나이가 들어감에 따라 콜라겐 섬유가 감소하고 이에 따라 피부의 탄력이 급격히 저하되고 나아가 함몰이 생긴다. 따라서 피부노화를 지연시키기 위해서는 피부탄력을 유지시켜주는 콜라겐 분해를 저해시키는 효능이 요구되며, 복합 생약추출물은 안정성이 뛰어날 뿐만 아니라 여러 가지 유익한 약효성분들을 함유하고 있어 좋은 항노화 대상물질이 되고 있다.

사향은 천연 동물성 향료로서 무스크(Musk)라고도 한다. 사향은 난쟁이사향노루 (Moschus berezovskii Flerove), 산사향노루(Moschus chrysogaster Hodgson) 또는 사향노루(Moschus mosschiferus Linne) 수컷의 사향선 분비물로써 상기 이외에 사향쥐, 사향고양이, 사향소 등이 사향을 포함하고 있다고 알려져 있다.

사향의 효과는 본초강목 및 동의학 등에 효과가 잘 알려져 있다. 사향의 주성분은 무색의 기름 같은 액체 무스콘(Muscone)이며 사향은 죽은 사람도 살린다는 속설이 말해주듯 옛날부터 생약으로 강심, 흥분, 진정제로 사용되었으며 또 기절했을 때 정신을 들게 하는 약으로 내복되었고, 특히 막힌 기운을 통하게 한다 해서 중풍이나 전신마비 등에 상비약으로 쓰였다.

사향의 약리 작용으로는 항염, 항균, 혈액순환계통에 대한작용, 남성 호르몬에 대한 작용 등 다양한 효과가 확인되었다. 그러나 사향은 상기와 같은 장점에도 불구하고 사향의 주 생산 동물인 사향노루가 멸종위기 동물로 지정되고 사향고양이는 사스(Sars)의 주 매개 동물로 밝혀져 중국에서 대량 포획, 살 처분 되어 사실상 사육이 불가능하여, 유일하게 머스크랫(사향쥐)에서 채취되는 서사향(鼠麝香, Muskrat Musk)이 노루사향을 대체할 새로운 천연물질로 떠오르고 있으나 그 입수가 용이하지 않고, 가격이 고가일 뿐만 아니라 서사향만으로는 높은 항산화 효능 및 노화방지 효능이 충분하지 못하여 단독으로 화장료 조성물로 사용되기에는 부족한 점이 있다.

대황(Rheum Palmatum)은 마디풀과의 다년생 초본식물인 개장군풀, 약용대황의 뿌리와 근경으로 시베리아가 원산지로 알려져 있다. 한방에서는 건위, 지사 등에 약재로 쓰이고 동의보감에서는 어혈을 풀고 생리불순, 종양, 염증을 다스리며 변비를 없애준다고 나온다. 그 효능으로는 배변작용 및 수렴작용을 하여 변비를 치료하며, 포도상구균, 진균 등에 대하여 억제작용이 있고 담즙 등 소화액의 분비를 촉진하며 이담, 해석과 소화를 촉진하는 작용이 있으며 혈청 콜레스테롤을 저하시 킨다.

백지(Angelica Dahurica)는 미나리과의 다년생 초본식물로 호흡을 증강시키고 혈압을 올라가게 하는 작용이 있으며 항균작용과 관상동맥 확장작용이 있다. 두통, 치통 등 통증치료로 사용되며 몸의 종기에도 쓰인다.

당귀(Angelica gigas Nakai)는 뿌리를 약물로 사용하는데 유즙을 함유하고 향기가 강하다. 주성분은 정유, 자당, 비타민E 등이다. 대표적인 보혈제로 부인병, 임산부의 산후 회복에 주로 쓰이며, 이 밖에도 심한 기침, 부스럼 등에 사용된다.

천화분(Trichosanthes Kirilowii Maxim)은 박과의 여러해살이 덩굴식물 하늘타리의 뿌리이다. 열을 내리고 진액이 생기게 하는 작용이 있어 열병이나 소갈, 황달, 옹종 따위에 쓴다. 종기와 피부가 헐어 생긴 발진에 염증을 가라앉히고 농의 배출을 용이하게 유도한다.

금은화(Lonicerae Flos)는 인동과의 다년생 덩굴식물인 인동의 꽃봉우리로 그 효능으로는 열을 내리고 해독작용을 하며 염증을 삭히고 종기의 고름을 배출시키는 작용을 한다. 일반적으로 향균, 항바이러스, 항진균작용이 있다고 보고된다.

자단향(Ptero carpus Santalinus L.)은 자단을 잘게 깍아서 만든 향으로 불에 피우기도 하고 약으로 쓰이기도 한다. 종기를 없애며 금창을 다스리는 효능이 있다

창이자(Xanthium strumarium)는 도꼬마리의 열매를 말하며 해열, 발한, 두통에 사용한다. 맛은 맵고 쓰며, 성질은 따뜻하고 축농증으로 코가 막히고 머리가 아플 때, 콧물과 피부 가려움증에 쓰인다.

의이인(Coix lachrymajobi L.)은 율무종자를 말하며, 그 맛은 달고 성질은 온화하며 어의들이 미용처방으로 자주 사용하던 약재 중의 하나다. 폐를 보호하고 열을 내리며 습기를 없애 미용에 도움을 준다.

녹각(Cervus Nippon Nippon Temminck)은 단단하게 각질화 된 사슴의 뿔을 말한다. 녹용은 성장기 과정에 채취하여 각질이 유연하고 각모가 있지만, 녹각은 단단한 각질이 되어 떨어진 것으로 각모가 없다. 간신의 기능을 보온시키고 피부의 창양과 종독을 제거하는데 유효하다.

녹차(Thea chinensis)는 진정작용이 뛰어나 여드름 피부의 세안물에 이용하면 효과적이다. 특히 성분 중 카테킨은 피부노화 예방에 탁월하다. 비타민 C도 다량 함유하고 있어 피부 미백에 도움을 주며 세균번식 억제와 살균작용으로 여드름 치료 및 예방에 도움이 된다.

이에 본 발명자들은 사향쥐로부터 얻어진 사향과 종래의 한방재료들을 특정 비율로 포함하는 추출물이 뛰어난 자유라디칼 소거 능력, NF-κB 억제효과, 보습 및 콜라겐 생합성 효능을 가지고 있음을 확인하고 본 발명을 완성하게 되었다.

내인성 또는 외인성 요인에 의해 활성산소나 자유라디칼이 생성되며, 생성된 활성산소나 자유라디칼에 의한 연속적인 유해반응의 결과로 피부에 염증이 발생하고, 염증화된 조직은 단백질이나 유전자물질을 파괴하여 주름 등을 형성하여 초래되는 피부노화 현상을 개선하고자 한다.

본 발명은 상기와 같은 문제점을 해결하기 위한 것으로서, 사향쥐로부터 얻은 사향추출물과 대황, 백지, 당귀, 천화분, 금은화, 자단향, 창이자, 의이인, 녹각, 녹차를 포함하는 것을 특징으로 하는 항산화, 항염, 보습 및 콜라겐 생합성 효능을 가지는 노화 방지 복합한방 조성물 및 이를 포함하는 화장료 조성물을 제공하고자 한다.

상기 복합 한방추출물은 우수한 자유라디칼 소거 활성, NF-κB 억제효과, 보습 및 콜라겐섬유 생합성 효과가 뛰어나다. 따라서 이를 포함하는 화장료 조성물은 피부노화 방지 및 개선 효능을 나타낸다.

본 발명은 사향쥐에서 얻은 사향추출물 0.0001~30 중량% 및 물 100 중량부당 대황 0.001~20 중량%, 백지 0.001~20 중량%, 당귀 0.001~20 중량%, 천화분 0.001~20 중량%, 금은화 0.001~20 중량%, 자단향 0.001~20 중량%, 창이자 0.001~20 중량%, 의이인 0.001~20 중량%, 녹각 0.001~20 중량%, 녹차 0.001~20 중량%를 첨가한 후 60~120 ^oC 온도에서 2~8시간 가열한 후 제조되는 생약추출물 0.001~30 중량%을 포함하는 복합 한방조성물을 제공한다.

본 발명의 복합 한방조성물에 있어서, 사향은 사향쥐로부터 채취하며, 채취된 사향은 보존성이 떨어지므로 바람직하게는 IPM(Iso Propyl Myristate) 등의 용매에 0.0001% ~ 30%의 농도로 희석하여 제조되는 것을 특징으로 한다.

대황, 백지, 당귀, 천화분, 금은화, 자단향, 창이자, 의이인, 녹각, 녹차 등의 생약재는 여러 가지 형태로 조성물에 함유될 수 있다. 예를 들어, 생약재를 완전히 건조한 후 미세하게 분말화하거나, 용매를 사용하여 추출하여 조성물에 함유시킬 수 있다. 용매로는 물이나 에탄올, 에틸아세테이트, 부탄올, Butylen Glycol, Glycerin, IPM 등을 사용할 수 있다. 본 발명의 생약재를 추출하기 위한 추출방법으로는 상대적으로 낮은 온도에서 일정시간 침출하는 냉침법, 35-45^oC에서 침출하는 온침법, 60-120^oC에서 침출하는 가열추출법, 퍼콜레이터(percolater)를 사용하는 방법, 증류냉각추출법 등이 사용될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

생약의 추출물은 생약들을 통상의 방법에 의해 각각 추출하거나, 또는 생약들을 혼합한 후 한꺼번에 추출할 수 있다. 필요한 경우 이를 농축하여 분말화 할 수 있다.

본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 상기 본 발명의 복합 한방조성물을 함유하는 화장료 조성물을 제공한다.

본 발명의 화장료 조성물에 있어서, 조성물은 생약재 성분 이외에 화장품학적 또는 식품학적으로 허용되는 성분을 추가로 함유할 수 있다. 예를 들어 결합제, 활택제, 붕해제, 부형제, 가용화제, 안정화제, 기제, 윤활제, 보존제, 습윤제, 유화제, 현탁화제, 점도조절제, 방부제, 계면활성제, 산화방지제, 보습제, 향료, 색소 등을 추가로 함유할 수 있다. 또한 사용되어온 세라마이드 등 보습제 또는 지질성분이나 레티닐팔미테이트 등의 비타민 A 유도체, 토코페폴, 기타 식물추출물 등을 추가로 함유할 수 있다. 본 발명의 조성물은 피부 또는 국소에 적용할 수 있으며, 액제, 현탁화제, 연고제, 크림제, 로션타입, 화장수타입, 팩타입 뿐만 아니라, 비누, 세안폼과 같은 세안료 등 여러 가지 형태로 제조할 수 있다. 또한 리포좀 형태로 만드는 것도 가능하다.

본 발명에 따른 조성물을 피부에 바르는 외용제의 형태로 제조하는 경우, 피부 외용제 중의 복합 생약조성물의 배합량은 전체의 0.0001%~30.0 중량%, 바람직하게는 0.01~20.0 중량%로 할 수 있다.

이하, 본 발명을 실시예 등을 통하여 보다 구체적으로 설명하나, 본 발명에 따른 실시 예들은 여러 가지 다른 형태로 변형될 수 있으며 발명의 범위가 이에 의하여 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 복합 한방조성물이 우수한 자유라디칼 소거 효능, 염증반응에 관 여하는 NF-kB를 억제하는 효능, 보습 및 콜라겐 생활성 효능을 가지고 있음이 밝혀 졌다. (실험예 1 내지 4 참조) 따라서 본 발명의 복합 한방조성물은 피부노화방지, 항염, 보습 및 피부탄력 등에 유용한 기능성 화장품을 제조하는데 사용될 수 있다.

< 실시예 1 > 사향 시료 제조 및 생약추출물의 제조법

사향은 생후 2년차 봄부터 사향쥐로부터 채취할 수 있고, 수컷만 사향을 분비하며 암컷은 번식용으로 필요하다. 보통 생육된 사향쥐를 대상으로 하며, 3월부터 사향낭이 단단해지면 1차 채취하고 그 후에 15일 간격으로 9월 말까지 연간 8~10회 채취한다. 보통 1마리의 사향쥐에서 3 ~ 5g / 년 서사향을 채취할 수 있으며, 사향쥐에서 사향을 채취하는 사람은 반드시 일정기간 숙련된 사람이어야 한다.

채취된 사향은 보통 점도가 너무 높고, 보존성도 떨어지기 때문에, Iso Propyl Myristate (CAS NO. 110-27-0, FEMA. 3556)에 서사향의 농도 0.0001% ~ 30%의 농도로 희석하여 냉장보관 한다. 냉장보관시 점도가 떨어져 현탁이 발생할 수 있으나 상온에서 5~6시간 정치시켜 현탁을 제거 후 사용한다.

생약추출물은 대황 20g, 백지 20g, 당귀 20g, 천화분 20g, 금은화 10g, 자단향 10g, 창이자 10g, 의이인 20g, 녹각 10g, 녹차 10g을 분쇄하여 상기 분쇄물에 1000ml의 물을 넣고 가열하여 80 ^oC 에서 약 3시간 정도 추출하였다. 추출액을 Whatman NO. 1 Filter paper로 여과하여 추출물을 얻었다.

상기와 같이 제조된 사향시료 5%와 생약추출물 95%를 Mix하여 복합 한방조성 물울 얻었으며 이 조성물을 [J30]이라 칭하고 다음 실험에 임하였다.

< 실시예 2 > J30을 함유하는 크림 조성물

1) J30 : 5.0 중량%

2) 스테아린산 : 2.0 중량%

3) 스테아릴알코올 : 3.0 중량%

4) 프로판디올 : 5.0 중량%

5) 모노스테아린산글리콜 : 4.0 중량%

6) 수산화칼륨 : 0.1 중량%

7) 레시틴 : 5.0 중량%

8) 콜레스테롤 : 1.0 중량%

9) 파라옥시안식향산메틸 : 0.2 중량%

10) 향료 : 적량

11) 정제수 : 100%가 되도록 적량을 가함

유성성분과 수성성분을 75^oC로 각각 가열한 다음 크림제조용 혼합기에서 균질화용 믹서를 이용하여 유화시킨 후, 탈기, 여과, 냉각하여 제조하였다.

< 실시예 3 > J30을 함유하는 화장수 조성물

1) J30 : 1.0 중량%

2) 프로판디올 : 8.0 중량%

3) 글리세린 : 2.0 중량%

4) 잔탄검 : 0.02 중량%

5) 구연산 : 0.01 중량%

6) 구연산나트륨 : 0.1 중량%

7) 에탄올 : 5.0 중량%

8) 파라옥시안식향산메틸 : 0.1 중량%

9) 폴리옥시에틸렌경화피마자유(40E.O.) : 0.1 중량%

10) 향료 : 적량

11) 정제수 : 100%가 되도록 적량을 가함

성분 1-6 및 11, 성분 7-10를 각각 균일하게 용해하여 양자를 혼합하고 여과하여 제조하였다.

< 실시예 4 > J30을 함유하는 연고 조성물

1) J30 : 5.0 중량%

2) 폴리옥시에틸렌세틸에테르 (30 E.O.) : 2.0 중량%

3) 모노스테아린산글리세린 : 10.0 중량%

4) 유동파라핀 : 5.0 중량%

5) 세탄올 : 6.0 중량%

6) 프로필렌글리콜 : 10.0 중량%

7) 파라옥시안식향산메틸 : 0.1 중량%

8) 정제수 : 100%가 되도록 적량을 가함

성분 2-5를 가열, 용해하여 혼합하고, 70^oC를 유지하여 유상으로 만든다. 성분1 및 6-8을 가열, 용해하여 혼합하고, 75^oC를 유지하여 수상으로 만든다. 유상과 수상을 혼합하여 유화시키고 30^oC까지 냉각하여 제조하였다.

< 실시예 5 > J30을 함유하는 목욕용 조성물

1) J30 : 1.0 중량%

2) 탄산수소나트륨 : 50.0 중량%

3) 향료 : 0.25 중량%

4) 무수황산나트륨 : 44.7 중량%

1-4 성분을 균일하게 혼합하여 제조하였다.

< 실험예 1 > 자유라디칼 소거 활성

항산화력을 측정하기 위해 사용된 방법은 1,1-디페닐-2-피크릴-히드라질(1,1-diphenyl-2-pycryl-hydrazyl)(DPPH) 방법으로 상기 실시예에서 제조한 J30을 에탄올에 농도별(0, 1, 5, 10, 50, 100㎍/mL)로 희석하여 10㎕씩 96웰 플레이트에 넣고, 5mM 에탄올 용액으로 제조된 DPPH를 총 부피가 200㎕가 되도록 넣어 37℃에서 30분간 방치한 후 ELISA Reader로 517nm에서 흡광도를 측정하여 자유 라디칼 소거 활성여부를 아래의 수식에 따라 판정하였다. 이때, 대조군으로 정제수를, 양성대조군으로 항산화력이 우수하다고 널리 알려진 비타민 C를 사용하였으며, 복합 한방조성물(J30)은 농도의존적으로 항산화 활성을 보였으며, 비타민C 보다 항산화 능력이 우수한 것으로 나타났다. (도1)

자유라디칼 소거율(%)

= (대조군의 흡광도 - 실험군의 흡광도) / 대조군의 흡광도] X 100

[표 1] 자유라디칼 소거율

농 도	자유라디칼 소거율(%)
농 도	J30	Vitamin C
0ug/ml	0	0
1ug/ml	10	0
5ug/ml	48	4
10ug/ml	97	9
50ug/ml	98	46
100ug/ml	99	90

< 실험예 2 > NF-kB 어세이

세포염증에 있어 제일 중요한 인자인 NF-kB를 적은 비용으로 많은 시료를 분석하기 위해 Luciferase(루시퍼레이즈)를 사용한 분석법을 확립하였다. 이 방법은 실험스텝이 짧으므로 데이터 재현성이 높고 많은 시료 물질을 동시에 처리할 수 있다. 세포주로는 Panomics사의 NIH3T3-luc 세포주를 사용하였으며, 예비실험을 통한 NF-kB의 발현여부와 각 후보물질에 의한 억제도를 확인하였다. 유도원(TNF-alpha)에 의해 약 12~17배의 루시퍼레이즈(NF-kB)가 유도되었으며, 실험 재현성이 우수함을 확인하였다.

Panomics사의 NIH3T3 (Rev A 060820 Stable Cell Line: NIH3T3/NFkB-luc 1); Stable Cell Line: NIH3T3/NFkB-luc 을 사용하였다. The NIH3T3/NFkB-luc cell line은 세포 기반의 NFkB transcription factor를 확인하기 위해 고안된 시스템으로 pNFkB-luc (Panomics P/N LR0051)와 pHyg 벡터가 동시 Transfection을 통하여 확립된 세포주이다. 위 둘은 리포터 유전자이다. pHyg의 성질을 이용하여 hygromycin 분리법을 이용하여 선택한다. 이러한 방법으로 인하여 세포 크로모좀에 루시퍼레이즈 유전자가 삽입된다. 각각의 배지 제조 방법은 아래와 같다.

[표 2] 배지 조성표

100-mm culture dish나 T-75 flask에 15mL의 미리 데워진 Growth 배지를 넣고, 세포주를 미리 준비된 배양접시에 넣어 세포주를 잘 분산시킨다. 배양접시를 습기가 공급되는 37^oC (5% CO₂) 배양기에 넣고, 2~3일마다 배지를 교환한다. 90% confluency에 도달하면 (usually within 1 week), 동결 보존할 Stock를 만들고 계속 배양한다. 세포는 계대배양법에 따라 배양하여 세포주를 보존한다.

NF-kB 측정은 다음과 같이 한다. 세포를 Initial Growth Media에 5 x 10 ⁵ / well 수준으로 12-well plate에 분주하고, 세포주가 바닥에 부착하도록 습기가 공 급되는 5% CO₂(37^oC)에 넣고 24시간 동안 배양한다. Serum이 함유되지 않은 새로운 배지로 교환한다. 약 8시간 동안 5% CO₂ (37^oC) 인큐베이터에 배양한 후, 배지를 제거하고 100ul lysis buffer를 각각의 well에 넣어 Luciferase activity를 측정한다. 측정법은 Promega 사의 매뉴얼을 참고하여 실험한다. (Promega P/N E1500)

96-Well 을 이용한 NF-kB 정량은 log-growth phase 상태에 있는 세포주를 트립신으로 처리한 후 5 x 10⁴ cells / 100ul 수준으로 맞춘 후 96-well plate에 넣으며, 이때 적절히 희석된 후보물질 15ul도 같이 넣는다. 37^oC로 맞춰진 5% CO² 배양기에 밤새 배양하고, NF-kB를 유도하는 약재(예 TNF-alpha를 15ul volume 수준으로 처리하고, 배지를 제거한 후 50ul lysis buffer (Promega P/N E1500)를 각각의 well에 넣고 처리한다. lysis buffer넣은 상태로 2분 동안 상온에서 처리하고, Lysis Buffer가 충분히 녹여냈는지 확인한다. 0^oC 에 급속히 얼린 후 상온에서 녹여내고 2~3회 용액을 섞어준다. 20ul 의 각각의 용해물(lysate)을 새로운 96-well에 옮기고, 20ul의 luciferase substrate를 각각의 well에 넣고 2~3회 섞어 준 후, Luminometer를 이용하여 측정하였다.

NF-kB의 정량 결과(Luciferase assay)를 각각의 복합 한방조성물(J30)과 상용화된 목단피(목단피), 사이클로스포린(CsA)을 적절하게 희석하여 효과를 비교하 였다. 유도원에 의한 유도율은 19.44 배이었으며, 복합 한방조성물(J30)은 높은 NF-kB 억제율을 나타내었다. 이들은 사이클로스포린보다 억제율이 컸으며, 항염능이 높은 것으로 알려진 목단피와 비교하면, 비슷한 억제율을 나타낸다. (도2)

[표 3] NF-kB 억제율

구 분	J30	CsA	목단피	대조군
0.56	6.66	12.17	7.79	19.45
0.14	7.64	15.07	9.57	19.45

< 실험예 3 > 피부 보습 평가

시료를 정제수를 이용하여 5%농도로 제조 후 평가시료로 사용하였다. 대조군은 정제수를 사용하였으며 사용기기는 Corneometer CM820(제조원: COURAGE+KHAZAKA Germany)이용하였다. 측정 조건은 실내온도 20~25℃, 상대습도 45~55%를 유지 시키는 항온항습실에서 10명의 피검자의 팔 안쪽 부위를 대상으로 좌(정제수), 우(서사향시료)에 평가시료를 0.05ml/circle의 양을 40mm circle에 적하시키고 Corneometer의 탐침을 이용하여 측정한다. Corneometer의 탐침을 측정부위 표면에 밀착 접촉 후 가볍게 누르면 수치가 나타나며 측정 후 티슈로 탐침 표면을 닦아주면서 측정한다. 측정 시 유의할 사항은 항상 동일한 힘을 가하여 측정을 하는 것이다. 측정을 40분간 진행하였으며 측정방법은 매 측정 시 3회 측정하여 평균값을 취하였으며 10명을 동일한 방법으로 진행하여 평균을 구하여 결과를 얻었다.

보습력 변화율의 계산식은 다음과 같다.

계산식: ((B-A)/A)*100(%)

A: 시료 처리전의 보습력 B: 시료의 보습력

대조군인 정제수에 비해 보습효과가 우수함을 확인할 수 있다.(도3).

[표 4] 보습 효능

구 분	J30	정제수
3분 후	87.75	69.16
5분 후	55.88	50.93
10분 후	39.22	26.64
15분 후	37.25	22.43
20분 후	33.33	19.16
30분 후	28.43	14.49
40분 후	19.61	9.35

< 실험예 4 > Human Fibroblast 콜라겐 합성 효능

DMEM에 10% 우태아혈청이 첨가된 96 well plate 배지에 Human fibroblast를 5,000세포/well의 농도로 접종하고 37℃, 5%, CO₂ 조건하에서 배양하였다. 상기 배지에 각각 실시예 1의 복합 한방조성물(J30)을 0.01%, 0.1% 첨가하고 1일 동안 배양하였다. 또한 대조군으로서 J30을 첨가하지 않은 배지를 1일 동안 함께 배양하였다.

배양액을 각각 채취하여 콜라겐 생합성 측정기구(일본 Takara Shuzo Co., Ltd Catalog #MK101)을 이용하여 콜라겐 생성 정도를 측정하였다. 이 콜라겐 생합성 측정기구는 콜라겐 섬유의 항체를 이용하여 콜라겐 섬유와 결합된 후 결합된 부위에 특정한 색을 나타내는 발색단을 결합시키고, 이 발색단이 나타내는 색의 정도를 450nm에서 측정하여 생합성된 콜라겐 섬유를 측정하는 원리를 이용하였다. (도4)

[표 5] J30의 콜라겐 생합성율

구 분	농 도
구 분	0.01% 중량	0.1% 중량	대조군	비교군
콜라겐 생합성율(%)	174	197	100	67

- 대조군 : J30을 함유하지 않고, 자외선을 조사하지 않은 것

- 비교군 : J30을 함유하지 않고, 자외선을 조사한 것

도 1은 복합 한방조성물(J30)의 자유라디칼 소거능을 나타내는 그래프로, 자유라디칼 소거율은 복합 한방조성물의 농도에 비례하여 증가한다.

도 2는 복합 한방조성물(J30)의 NF-kB 억제효과를 나타내는 그래프로, CsA는 사이클로스포린, 대조군은 유도원을 투여한 것을 나타내며, Y축 fold는 유도원을 처리하지 않은 음성대조군의 NF-kB 생성량을 1 fold로 하여 계산한 것이다.

도 3은 정제수 대비 복합 한방조성물 J30(5%)의 보습 증가율을 나타내는 그래프이다.

도 4는 J30을 처리한 실험군과 J30을 처리하지 않고 자외선을 조사하지 않은 대조군과 자외선을 조사한 비교군에 대하여 Human Fibroblast에서 콜라겐 생합성 효능을 실험한 것으로, J30은 콜라겐 생성에 효과가 있으며, 주름 생성의 주된 요인은 콜라겐 섬유의 감소에 기인하기 때문에 콜라겐 섬유가 증가 되었다는 것은 노화 특히, 광노화에 의해 발생하는 주름을 막아줄 수 있다는 것을 의미한다.

Claims

사향쥐로부터 얻은 사향추출물과 대황, 백지, 당귀, 천화분, 금은화, 자단향, 창이자, 의이인, 녹각, 녹차를 포함하는 노화 개선용 복합 한방조성물
제1항에 있어서,

사향쥐로부터 얻은 사향추출물과 대황, 백지, 당귀, 천화분, 금은화, 자단향, 창이자, 의이인, 녹각, 녹차들이 추출물의 형태로 포함되는 조성물
제1항에 있어서,

상기 복합 한방조성물을 총중량에 대하여 0.01 내지 30중량%의 함량을 갖는 화장료용 조성물
제3항에 있어서,

알코올, 오일, 계면활성제, 지방산, 실리콘, 습윤제, 보습제, 점성변형제, 유제, 안정제, 자외선차단제, 발색제 및 향료로 이루어지는 군으로부터 선택된 적어도 하나를 더 포함하는 조성물
제3항에 있어서,

상기 조성물은 화장수, 에센스, 로션, 크림, 팩, 젤, 연고, 패취 및 분무제로 이루어진 제형군으로부터 선택된 하나의 제형으로 이루어지는 조성물