CN107809998A

CN107809998A - 柔毛肖乳香的水醇提取物、包含其的化妆品组合物及其美容用途

Info

Publication number: CN107809998A
Application number: CN201680020103.1A
Authority: CN
Inventors: I·安贝尔; N·东洛热; J·M·博托; R·拉维尔; S·加尼耶
Original assignee: ISP Investments LLC
Current assignee: ISP Investments LLC
Priority date: 2015-04-09
Filing date: 2016-04-05
Publication date: 2018-03-16
Anticipated expiration: 2036-04-05
Also published as: CN107809998B; EP3280497B1; FR3034664B1; FR3034664A1; HK1245631A1; EP3280497A1; US20180078491A1; US11045669B2; WO2016162343A1

Abstract

本发明涉及柔毛肖乳香的地上部分的水醇提取物。本发明的特征在于：所述提取物在所提取的多酚中主要包含栎素和槲皮素3‑O‑葡糖苷酸，分别地，栎素的浓度为所述提取物的总重量的至少0.04重量％，槲皮素3‑O‑葡糖苷酸的浓度为所述提取物的总重量的至少0.02重量％，其它所提取的多酚彼此独立地以微量形式存在。本发明还涉及制备本发明的柔毛肖乳香的提取物的方法和包含作为保护性活性剂的有效量的本发明的提取物的化妆品组合物，以及这样的组合物用于改善皮肤的屏障功能和保护皮肤免受大气污染物的美容用途。

Description

柔毛肖乳香的水醇提取物、包含其的化妆品组合物及其美容用途

本发明涉及柔毛肖乳香(Schinus molle)的水醇(hydroalcoholic)提取物、其制备方法、包含其的化妆品组合物及其美容用途。

柔毛肖乳香通常也称为“假胡椒(false pepper)”或“野胡椒(wild pepper)”或“加利福尼亚胡椒树”或“秘鲁胡椒”，其是漆树科(Anacardiacaea)的树，原产于南美洲北部的干旱区和秘鲁的安第斯沙漠，并可在远至阿根廷和智利被发现。其也被引进到世界的大部分热带和亚热带地区。

柔毛肖乳香是快速生长的常青树，其生长15米高和5-10米宽。树的上部的枝特别倾向于下垂。树叶交替地排列在茎上。它们一般有8-25cm长和4-9cm宽，为细裂奇数羽状复叶，由许多具有连续轮廓和羽状脉分布规律的小叶组成，当揉挤时发出强烈的胡椒味。该树在春天在枝的末端开悬挂的成簇小白花，并产生具有5-7mm直径的具有胡椒味的粉红色浆果。它的扭曲且多瘤的树干具有粗糙的灰色树皮，该树皮也发出胡椒味。

在传统药物中，柔毛肖乳香特别因为其抗菌和防腐(antiseptic)性质已用于创伤和感染的治疗(Ferreroa等,“Acute and subacute toxicity evaluation of ethanolicextract from fruits of Schinus molle in rats”,2007)。它似乎也已经用作抗抑郁药(Machado等,“Antidepressant-like effect of rutin isolated from the ethanolicextract from Schinus molle L.in mice:Evidence for the involvement of theserotonergic and noradrenergic systems”,2008)、利尿药，用于缓解牙痛、风湿病和月经问题。柔毛肖乳香的果实、叶和树液也已经因为其抗高血压、利尿、解痉和镇痛性质而被使用(Ambasata等,“The useful plants of India”,1986；Bello et al.,“In vitropharmacological evaluation of the dichloromethanol extract from Schinus molleL.”,1998)。

柔毛肖乳香的杀虫性质使其适合考虑作为对抗寄生虫的合成化学产品的选择(Ferreroa等,“Acute and subacute toxicity evaluation of ethanolic extract fromfruits of Schinus molle in rats”,2007)。为此，已对榆树叶甲虫测试了柔毛肖乳香的叶的水提取物和乙醇提取物的杀虫活性(Huerta等,“Toxicity and repellence ofaqueous and ethanolic extracts from Schinus molle on elm leaf beetleXanthogaleruca luteola”,2010)。应该注意，水提取物和乙醇提取物具有完全不同的效果，水提取物具有驱虫效果，而乙醇提取物则具有杀虫效果。

其他公开详细说明了柔毛肖乳香的抗氧化、抗微生物和毒理学性质(例如MartinsMdo等,“antimicrobial and toxicological properties of Schinus molleL.essential oils”,2013)。

为评估其皮肤毒性，已经更具体地测试了柔毛肖乳香的叶的乙醇和己烷提取物对大鼠的毒性(Bras等,“Evaluation of the acute dermal exposure of the ethanolicand hexanic extracts from leaves of Schinus molle var.areira in rats”,2011)。这里观察到轻度、可逆的皮肤刺激。

专利文件US2013302419公开了来自漆树科的植物(包括柔毛肖乳香)的纯的甲醇或乙醇提取物，其可制备用于治疗影响消化道的疾病的药物组合物。可以使用的植物的部分是叶、花、果实，并优选地是树皮。最初获得的提取物含有没食子酸。

专利文件AR 079996记载由多种植物(包括柔毛肖乳香)的果实制备植物染料。可借助于与水混溶的溶剂(如甲醇、乙醇或异丙醇)进行提取。

化妆品成分的词典(International Cosmetic Ingredient Dictionary andHandbook 2014)提到柔毛肖乳香的总提取物(total extract)、叶提取物、果实提取物和种子提取物，然而该参考文献没有具体说明所提及的成分的提取条件或具体美容效果。

从柔毛肖乳香分离的主要的化合物是三萜酮酸(triterpenoid keto acids)(Pozzo-Balbi等,“The triterpenoid acids of Schinus molle”,1978)。在柔毛肖乳香中已经报导了相当数量的单萜、二萜、倍半萜和三萜、黄酮、没食子鞣质和脂肪酸(等,“Hagers Handbuch der pharmazeutischen praxis”,1994；Terhune等,“β-spathulene:anew sesquiterpene in Schinus molle oil”,1974；Dominguez等,“Lignoceric acid andother compounds of Schinus molle”,1971)。另一项研究分离了3种抗炎剂、2种三萜酸和双黄酮(Yueqin等,“Isolation of two triterpenoids and a biflavanone with ananti-inflammatory activity from Schinus molle fruits”,2003)。

通过在柔毛肖乳香叶的水和80％甲醇的混合物中提取获得的提取物的2D-PC筛选显示糖基黄烷醇和栎素的复合混合物(Hiermann等,“Die Untersuchung potentiellerWirkstoffe in epilobium Arten.”,1983)。出版物Marzouk等(“Antioxidant flavonolglycosides from Schinus molle”,2006)更具体地显示由柔毛肖乳香叶的甲醇水提取物通过色谱分离获得的2种新的酰化栎素糖苷：异栎素6”-O-对羟基苯甲酸酯和2”-O-α-L-吡喃鼠李糖基-金丝桃苷6”-O-没食子酸酯，以及在该物种中已知的12种多酚代谢物，即没食子酸、没食子酸甲酯、氯原酸、2”-α-L-吡喃鼠李糖基-金丝桃苷、栎素3-O-β-D-新橘皮糖苷、槲皮素3-O-葡糖苷酸(miquelianin)、栎素3-O-β-D-吡喃半乳糖醛酸苷(galacturonopyranoside)、异栎素、金丝桃苷、异栎素6”-没食子酸酯、金丝桃苷6”-O-没食子酸酯和(+)-儿茶素。

许多出版物由此涉及不同的柔毛肖乳香提取物，然而似乎均未公开或甚至表明美容用途特别是用于改善皮肤的屏障功能和用于对抗大气污染物(例如用于对抗皮肤老化的迹象出现)的用途。

另外，专利文件JP04176912已知并记载了包含一种或多种植物的提取物的组合物，所述植物选自毛瑞榈(Aguaje,Mauritia flexuosa L.f.,Achira)、姜芋(Canna edulisKer Gawl.)、Alg arrobo(Prosopis pallida DC.)、Huito(Genipa americana L.)、晚香玉酢浆草(Oca,Oxalis tuberosa Mo l.)、乌卢库薯(Olluco,Ullucus tuberousus Caldas)、Cupuazu(Theobroma grandiflorum K.Schu m.)、羽扇豆(Tarwi,Lupinus mutabilisSweet)、玛卡(Maca,Lepidium meyenii Walpers)、块茎金莲花(Mashua,Trop aeolumtuberosum Ruizet Pav.)、柔毛肖乳香(molle,Schinus molle L.)和雪莲果(Yacon,polymnia sonchi folia Poepp.et Endl.)。此类组合物影响水保留，例如以防止皮肤干燥、减少瘙痒和提供有光泽的皮肤和光亮的毛发。

然而，用于在环境温度下浸泡3-7天的溶剂是本领域技术人员常用的溶剂，更具体地选自水、乙醇、1,3-丁二醇、丙二醇、甘油和聚乙二醇。

专利文件JP2000247862也已知并记载了通过在50/50水-乙醇混合物中浸泡5天，来自Pirul(柔毛肖乳香)的全植物提取物的制备。获得的提取物具有抗氧化性质，并可用作药品或化妆品，例如用于美白皮肤。

鉴于以上内容，本发明旨在解决的一个问题是开发可用作化妆品的基于柔毛肖乳香的提取物的产品，其容易生产，并通过优化物理-化学性质而对皮肤具有有益性质同时限制现有技术中观察到的不期望的效果(毒性)。

具体而言，申请人开发了用于柔毛肖乳香提取的方法，其被优化以选择和确保在获得的提取物中所关注的目标分子的高含量，特别是所关注的2种多酚，这两者之前在柔毛肖乳香中都没有记载。相对于现有技术已知的提取物，该开发已经按照生态提取标准(生物源溶剂，优化加热温度和搅拌时间、植物量/溶剂量的比率和类型)得以实现，以获得最佳多酚含量/能量成本妥协(溶剂被有利地保留在液体提取物中)并增加所关注的化合物相对于其他多酚提取物的浓度水平。

在现有技术提及的提取类型(即柔毛肖乳香的水、甲醇、乙醇和己烷提取，或通过蒸汽蒸馏提取(精油)，或超临界CO₂提取)中，没有一种能选择性提取根据本发明的所关注的酚化合物。

实际上，超临界CO₂提取能提取油相，但不是所关注的多酚。同样，水提取的提取物大部分是极性化合物诸如低分子量的极性糖、蛋白质和代谢物，而所关注的多酚则由于其极性仅以微量形式存在。最后，醇溶剂(诸如甲醇和乙醇)非选择性提取柔毛肖乳香中存在的极性和非极性分子，如糖苷黄烷醇(异栎素-6”-O-p-羟基苯甲酸酯、2”-O-α-L-吡喃鼠李糖基-金丝桃苷-6”-O-没食子酸酯、没食子酸、没食子酸甲酯、氯原酸、2”-α-L-吡喃鼠李糖基-金丝桃苷、栎素-3-O-β-D-新橘皮糖苷、槲皮素3-O-葡糖苷酸、栎素-3-O-β-D-吡喃半乳糖醛酸苷、异栎素、金丝桃苷、异栎素6”-没食子酸酯、金丝桃苷6”-O-没食子酸酯、(+)-儿茶素)，精油，甾族三萜，原异菖蒲二醇(preisocalamenediol)，脂肪酸(亚油酸、亚麻酸、山萮酸、木蜡酸)，不皂化物(α-香树素、β-谷甾醇)和糖(漆酶：阿拉伯糖、木糖、甘露糖、半乳糖、葡萄糖、葡糖胺)。

因此，第一，本发明涉及柔毛肖乳香的地上部分的水醇提取物，其特征在于所述提取物在所提取的多酚中主要包含栎素和槲皮素3-O-葡糖苷酸，分别地，栎素浓度为所述提取物的总重量的至少0.04重量％，槲皮素3-O-葡糖苷酸的浓度为所述提取物的总重量的至少0.02重量％，其它所提取的多酚彼此独立地以微量形式存在，即各提取的多酚各自的浓度为低于所述提取物的总重量的0.01重量％(100ppm)。

另外，第二，本发明涉及获得本发明的柔毛肖乳香的提取物的方法，其包括以下步骤，其中：

a)收集柔毛肖乳香的带叶小茎的未剥离叶；

b)将收集的新鲜的或干燥的柔毛肖乳香的带叶小茎的未剥离叶以固体物质相对于所使用的总重量的0.1重量％-20重量％的比例分散在水醇溶剂中，所述醇选自乙醇、甘油或丙二醇，所述醇相对于所述溶剂的总重量的比例为10重量％-90重量％；

c)在4-100℃的温度下，在搅拌下进行固-液提取，持续10分钟至4小时的时间；

d)将液相和固相分离以除去所述固相并回收柔毛肖乳香的液体水醇提取物，所述提取物在所提取的多酚中主要包含栎素和槲皮素3-O-葡糖苷酸，分别地，栎素的浓度为所述提取物的总重量的至少0.04重量％，槲皮素3-O-葡糖苷酸的浓度为所述提取物的总重量的至少0.02重量％，其它所提取的多酚彼此独立地以微量形式存在，即各提取的多酚各自的浓度为低于所述提取物的总重量的0.01重量％(100ppm)；和

e)任选地，当所述醇是乙醇时，将获得的柔毛肖乳香的液体提取物干燥，以获得柔毛肖乳香的固体提取物。

第三，本发明涉及化妆品组合物，其特征在于所述组合物包含作为保护性活性剂的有效量的本发明的柔毛肖乳香的提取物和生理学上可接受的赋形剂。

最后，第四，本发明涉及本发明的组合物用于改善皮肤的屏障功能和用于保护皮肤免受大气污染物的美容用途。

通过阅读以下说明书和非限制性实施方案并参考附图，会更好理解本发明及其带来的优点，其中：

-图1显示本发明的柔毛肖乳香的提取物对暴露在由PM10样污染颗粒引起的环境应力中的角质形成细胞的保护效果的评估；

-图2显示本发明的柔毛肖乳香的提取物对暴露在由PM2.5样污染颗粒引起的环境应力中的角质形成细胞的保护效果的评估；

-图3显示通过测量斑点的表面而得到的本发明的柔毛肖乳香的提取物对皮脂分泌的调节的效果；

-图4显示通过在施用本发明的柔毛肖乳香的提取物后测量斑点的数量而得到的皮脂分泌的发展；

-图5显示本发明的柔毛肖乳香的提取物对皱纹数量的发展的效果；

-图6显示本发明的柔毛肖乳香的提取物对皱纹的平均深度的发展的效果；

-图7显示本发明的柔毛肖乳香的提取物对皮肤的水合的发展的效果；和

-图8显示本发明的柔毛肖乳香的提取物的水合效果。

在本说明书中，除非另外说明，应理解当给定范围时，其包括所述范围的上限和下限。

本发明涉及柔毛肖乳香的地上部分的水醇提取物，所述提取物在所提取的多酚中主要包含栎素和槲皮素3-O-葡糖苷酸，分别地，栎素的浓度为所述提取物的总重量的至少0.04重量％，槲皮素3-O-葡糖苷酸的浓度为所述提取物的总重量的至少0.02重量％，其它所提取的多酚彼此独立地以微量形式存在。

在本发明主要提取的2种多酚中，栎素(一种已知的黄烷醇糖苷)之前从未在柔毛肖乳香(更具体地是其地上部分)的组合物中记载。

其它提取的多酚包括那些通常存在于柔毛肖乳香中的多酚，如异栎素。

术语“微量形式”意指各提取的多酚各自的浓度为低于所述提取物的总重量的0.01重量％(100ppm)。

柔毛肖乳香的地上部分表示叶本身和带叶小茎的未剥离叶。在说明书中，术语“地上部分”和“带叶小茎的未剥离叶”会同义使用。

然而，本发明的柔毛肖乳香的提取物本身很难表征，因为对相同的物种而言，它们的组成根据不同因素而变化，如使用的柔毛肖乳香的部分、收获的地点、收获的方法、气候条件和收获的年份。

有利地，根据本发明优选使用的柔毛肖乳香在远离城市污染的地区种植，例如在南美洲的海拔高度，根据本发明获得的提取物不包含微量污染元素(micro-pollutingelements)，如邻苯二甲酸酯、农药、多环芳烃或重金属。更特别地，在6月到9月收获。

本发明的提取物是通过以下从新鲜的或干燥的柔毛肖乳香的带叶小茎的未剥离叶获得的：

在4-100℃的温度下，在真空下、在大气压力下或在压力下(有利地在大气压力下)，在水醇溶剂中，在搅拌下固-液提取相对于所使用的总重量的0.1重量％-20重量％的固体物质，持续10分钟至4小时的时间，其中所述醇选自乙醇、甘油或丙二醇，所述醇相对于所述溶剂的总重量的比例为10重量％-90重量％，并且

将液相和固相分离以除去所述固相并回收柔毛肖乳香的液体提取物。

术语“新鲜的”意指收集后植物的湿度与采摘前植物的湿度相似的时期。

术语“干燥的”意指收集后将植物脱水至被称为安全湿度(safeguard humidity)的湿度的时期。该干燥处理的目的是为了充分地减少特别是带叶小茎的未剥离叶的含水量，以确保植物的储存或随后的运输的有利条件。

例如，可将带叶小茎的未剥离叶通过暴露在空气中(在阳光下或阴凉处)通过控制相对湿度持续至多10-20天的时间自然干燥，或有利地在20℃至40℃的温度下使用干燥机、热风产生机或风扇吹扫的空气进行人工精细干燥。

优选地，在有利地清洗后，将带叶小茎的未剥离叶干燥，并完整使用或磨碎使用，优选磨碎或低温磨碎。

在收集步骤后，将柔毛肖乳香的带叶小茎的未剥离叶任选地清洗，并有利地干燥，然后磨碎，进行在水醇溶剂中分散和提取的步骤。

有利地，提取总是在搅拌下进行，由此使固体和液体能分散和均化，有效地改善溶质在溶剂中的扩散。

用于提取的水是蒸馏水、去矿质水或富含矿物盐和/或微量元素(oligo element)的水，优选蒸馏水。

为了在柔毛肖乳香的所提取的多酚中主要提取所关注的栎素和槲皮素3-O-葡糖苷酸，使用醇助溶剂，所述醇助溶剂选自乙醇、甘油或丙二醇，例如1,2-丙二醇或1,3-丙二醇，优选1,3-丙二醇，所述醇相对于所述溶剂的总重量的比例为10重量％-90重量％。

水醇溶剂优选是水-醇混合物，其中醇相对于所述溶剂的总重量的比例为50重量％-80重量％，当所述醇是乙醇或丙二醇时，醇的比例甚至更优选60％-80％。

固-液提取优选在10-80℃，更优选20-70℃的温度进行，持续30分钟至3小时，更优选1小时至2小时的时间。

本发明的提取物优选从相对于所使用的总重量的1重量％-15重量％，更优选5重量％-10重量％的固体物质中获得。

在提取结束时，有利地，将耗尽所关注的化合物的剩余的植物物质从液相中分离，例如通过倾倒、通过离心或通过澄清过滤而分离。

所获得的液相可借助于具有适当孔隙率的过滤介质进行微滤，以获得不含固体植物颗粒的澄清溶液。

该液-固分离步骤后，可有利地进行一个或多个纯化步骤(例如通过微滤、超滤和/或纳米过滤纯化)，使得可以消耗其它提取的化合物(如蛋白质和多糖，以及溶剂)来浓缩所关注的化合物。

因此，提取的持续时间和方法对所提取的物质起关键作用，即在提取的多酚中主要是栎素和槲皮素3-O-葡糖苷酸，而其它所提取的多酚则以微量形式存在。

水醇提取持续必要的和充分的时间，使得可以有利地使栎素和槲皮素3-O-葡糖苷酸以其抗衰老性质的有效量溶解在提取物中。

虽然根据本发明使用的醇助溶剂具有相同的溶剂能力，但优选使用的醇助溶剂是甘油或丙二醇，更优选丙二醇，甚至更优选1,3-丙二醇。

根据本发明第一有利的实施方案，这样的醇助溶剂(甘油或丙二醇)使得可以获得保留有该助溶剂的液体提取物。因此，所获得的提取物是生理学上可接受的，且可直接用于美容应用。

根据本发明的第二实施方案，当醇是乙醇时，优选将所获得的柔毛肖乳香的液体提取物干燥(例如通过雾化、冻干或沸石处理(zeodration,使用沸石脱水)干燥)，以获得柔毛肖乳香的固体提取物，乙醇被蒸发。

所述干燥可在诸如麦芽糖糊精的载体(support)的存在下进行。

为此，根据另一方面，本发明涉及获得本发明的柔毛肖乳香的提取物的方法，所述方法包括如上文进一步所述的步骤，有利地根据第一或第二实施方案进行。

获得本发明的柔毛肖乳香的提取物的方法优选包括以下步骤，其中：

a)收集柔毛肖乳香的带叶小茎的未剥离叶；

c)在4-100℃的温度下，在真空下、在大气压力下或在压力下(优选地在大气压力下)，在搅拌下进行固-液提取，持续10分钟至4小时的时间；

d)将液相和固相分离(例如通过倾倒、离心或澄清过滤而分离)以除去所述固相并回收柔毛肖乳香的液体水醇提取物，所述提取物在所提取的多酚中主要包含栎素和槲皮素3-O-葡糖苷酸，分别地，栎素的浓度为所述提取物的总重量的至少0.04重量％，槲皮素3-O-葡糖苷酸的浓度为所述提取物的总重量的至少0.02重量％，其它所提取的多酚彼此独立地以微量形式存在，即各提取的多酚各自的浓度为低于所述提取物的总重量的0.01重量％(100ppm)；和

e)任选地，当所述醇是乙醇时，将所获得的柔毛肖乳香的液体提取物干燥，以获得柔毛肖乳香的固体提取物。

由此获得的柔毛肖乳香的液体提取物可通过微滤、超滤和/或纳米过滤纯化，以相对于也提取的蛋白质和多糖浓缩栎素和槲皮素3-O-葡糖苷酸的提取物。

作为示例，优选的本发明的实际实施例如下所述。

实施例1：柔毛肖乳香的地上部分的水二醇(hydroglycolic)提取物的制备

将预先干燥的柔毛肖乳香的带叶小茎的未剥离叶在包含1mm格栅的刀式粉碎机中低温磨碎，使得可以获得颗粒尺寸主要为500μm的粉末。

然后将由此获得的粉末(150g)放置在装有搅拌器和借助于传热流体的双夹套加热的玻璃反应器中。

用于浸泡的溶剂(1350g)是70％的1,3-丙二醇(DuPont Tate&Lyle Bio ProductsCompany)和30％的蒸馏水的混合物。

将带叶小茎的未剥离叶的粉末于50℃在溶剂中分散2小时，然后将混合物过滤。

然后通过Folin-Ciocalteu法测试由此获得的溶剂介质中的提取物(945g)，使得可以测试所有的多酚。该方法使用没食子酸作为标准品，结果以没食子酸等效质量％表示。由此该提取物含有0.43％m/m(没食子酸等同物)的总多酚，更具体地对于2.4％m/m的干提取物含有0.1％m/m的栎素和0.06％m/m的槲皮素3-O-葡糖苷酸，即18％的总多酚在干提取物中包括4.2％的栎素和2.5％的槲皮素3-O-葡糖苷酸。

实施例2：柔毛肖乳香的地上部分的水乙醇提取物的制备

将由此获得的粉末(150g)放置在装有搅拌器和借助于传热流体的双夹套加热的玻璃反应器中。

用于浸泡的溶剂(1350g)是70％的乙醇和30％的蒸馏水的混合物。

将乙醇提取物在旋转蒸发仪上蒸发以除去大部分溶剂，然后冻干以获得固体，然后将其磨碎。

由此获得13g的柔毛肖乳香的带叶小茎的未剥离叶的干提取物，通过Folin-Ciocalteu法测试，含有14％(没食子酸等同物)的总多酚，更具体地在干提取物中含有4％的栎素和2％的槲皮素3-O-葡糖苷酸。

相比之下，申请人进行其它提取方法使得可以获得柔毛肖乳香的提取物。

例如，通过在与上述实施例2相当的条件下，在纯乙醇中提取柔毛肖乳香的带叶小茎的未剥离叶获得的乙醇提取物使得可以获得仅含有8％的总多酚的干提取物，更具体地在干提取物中含有3％的栎素和1.2％的槲皮素3-O-葡糖苷酸。

本发明的方法特别是水醇溶剂的选择使得可以相当大地限制或甚至避免用单独醇溶剂(100％)从柔毛肖乳香的叶提取脂肪部分，并由此浓缩提取的多酚。

根据这些结果，可注意到该容易实施的提取方法对获得这样的柔毛肖乳香的提取物是必要的，所述提取物在所提取的多酚中主要包含栎素和槲皮素3-O-葡糖苷酸，分别地，栎素的浓度为所述提取物的总重量的至少0.04重量％，槲皮素3-O-葡糖苷酸的浓度为所述提取物的总重量的至少0.02重量％，其它所提取的多酚彼此独立地以微量形式存在，所述提取物由此可用作化妆品。

在本发明的柔毛肖乳香的提取物中含有的主要提取的多酚更具体地是抗衰老活性剂，其特别起到改善皮肤的屏障功能和保护皮肤免受大气污染物的作用。

实际上，与外部介质接触的组织(如皮肤、毛发、指甲和肺)直接且经常暴露于环境中存在的污染物，这些是潜在有害的。

在本发明的范围中，术语“大气污染物”表示环境中存在的对健康有害的污染物，特别是以气体和可吸入颗粒形式存在的污染物。它们可以存在于室外(例如柴油机颗粒、臭氧或重金属)和/或在家里，其中污染可具体由香烟烟雾或由油漆、胶或墙纸释放的溶剂(如甲苯、苯乙烯、二甲苯和苯甲醛)引起。

在环境中存在的污染物中，分为由污染源(道路交通、工业、供暖、农业等)直接产生的原生污染物和源自气体之间的化学反应的二次污染物。在原生污染物中，可提及例如碳氧化物、硫氧化物、氮氧化物、轻质烃类、挥发性有机化合物(VOCs)、金属(铅、汞、镉等)，和细颗粒或超细颗粒如PM10颗粒(直径小于10μm)和PM2.5颗粒(直径小于2.5μm)，其由于深入穿透入呼吸系统、心血管系统和皮肤系统的能力可特别地有毒，它们的尺寸比人类皮肤毛孔的尺寸小。二次污染物包括二次颗粒、臭氧和氮氧化物。

本发明的提取使得可以获得富含活性抗衰老化合物、不含固体植物颗粒的澄清提取物，其在外观、颜色和气味方面有利地稳定，其可用于化妆品组合物的制剂中。

根据本发明的第三方面，所述柔毛肖乳香的提取物用于化妆品组合物中，所述化妆品组合物包含作为保护性活性剂的有效量的本发明的柔毛肖乳香的提取物和生理学上可接受的赋形剂。

术语“有效量”表示在无毒的情况下获得活性(特别是屏障功能和保护皮肤免受大气污染物)所必需的本发明的提取物的最低量。

所述柔毛肖乳香的提取物有利地以相对于组合物的总重量的0.001-1重量％，优选0.01-1％的浓度存在于所述组合物中。

甚至更优选地，本发明的组合物在所提取的多酚中主要包含栎素和槲皮素3-O-葡糖苷酸，并基本不包含任何其它多酚或仅包含微量形式的这些多酚。

生理学上可接受的赋形剂表示适合与皮肤或粘膜外层接触的载体，即其不存在任何毒性且不引起任何刺激、不当的变态反应或不耐受反应。

生理学上可接受的赋形剂可包括一种或多种化合物。

根据本发明可使用的组合物可以以任何适当的方式施用，特别是口服或外部局部施用，并且所述组合物的配制会由本领域技术人员相应地调整。

本发明的组合物优选以适合局部施用的形式存在。因此，这些组合物必须含有生理学上可接受的介质(即与皮肤和附件(appendage)相容的介质)，在其施用期间不会有不适的风险，且覆盖所有合适的化妆品形式。

术语“局部施用”意指在皮肤或粘膜表面施用或涂敷(spread)本发明的柔毛肖乳香的提取物，更具体地含有所述提取物的组合物。

术语“皮肤”更具体地表示脸部皮肤，特别是眼睛和嘴的轮廓、鼻子、前额、颈部、手，以及身体其余部分的皮肤。

用于实施本发明的组合物可特别以水溶液剂、水醇溶液剂、或油溶液剂、水包油乳剂(emulsion)、油包水乳剂、或复合型乳剂(multiple emulsion)的形式存在；所述组合物还可以以适合施用于皮肤、粘膜、唇和/或毛发的混悬剂或粉末的形式存在。

这些组合物可以或多或少地是流体的，还可以具有乳膏剂、洗剂、乳液(milk)、精华液(serum)、软膏剂、凝胶剂、糊剂或摩丝的外观。它们还可以以固体形式存在，如棒状，或以气雾剂的形式施用于皮肤。

例如，可以通过示例方式提及制剂所必需的添加剂，如溶剂、增稠剂、稀释剂、抗氧化剂、着色剂、防晒剂、自晒黑剂(self-tanning agent)、色素、填充剂、防腐剂、香料、气味吸收剂、精油、维生素、必需脂肪酸、表面活性剂、成膜聚合物等，作为在可包括的施用领域中常用的潜在的生理学上可接受的赋形剂。

在任何情况下，本领域技术人员会确保选择这些添加剂及其比例，以免对本发明的组合物所寻求的有利性质不利。例如，这些添加剂可对应组合物的总重量的0.01-20％。当本发明的组合物是乳剂时，脂肪相可占相对于所述组合物的总重量的5-80重量％，优选5-50重量％。在组合物中使用的乳化剂和助乳化剂选自相关领域中常用的那些。例如，它们可以以相对于组合物的总重量的0.3-30重量％的比例使用。

根据本发明的另一有利的实施方案，可将本发明的柔毛肖乳香的提取物包封或封闭在化妆品载体(如脂质体或在化妆品领域使用的任何其它纳米胶囊或微囊)中，或吸附在粉末状有机聚合物或矿物载体(诸如滑石和膨润土)上。

除了本发明的活性剂外，本发明的组合物可有利地包含至少一种具有与本发明的那些相似和/或互补的美容效果的其它活性剂。根据本发明，该活性剂被定义为“额外的活性剂”。

例如，所述一种或多种额外的活性剂可选自：抗衰老剂、固化剂、增白剂、保湿剂(hydrating agent)、排水剂(draining agent)、微循环促进剂、药剂、角质剥脱剂(exfoliant)、剥离剂(peeling agent)、细胞外基质刺激剂、能量代谢激活剂、抗菌剂、抗真菌剂、安抚剂、抗自由基剂、抗紫外线剂、抗痤疮剂、抗炎剂、麻醉剂、提供热感的物质、提供新鲜感觉的物质、和减肥剂。

此类额外的药剂可以选自：

-维生素A，特别是视黄酸、视黄醇、视黄醇丙酸酯、视黄醇棕榈酸酯；

-维生素B3，更特别地是烟酰胺、生育酚烟酸酯；

-维生素B5、维生素B6、维生素B12、泛醇；

-维生素C，特别是抗坏血酸、抗坏血酸葡糖苷、抗坏血酸四棕榈酸酯、抗坏血酸磷酸酯镁和抗坏血酸磷酸酯钠；

-维生素E、维生素F、维生素H、维生素K、维生素PP、辅酶Q10；

-金属蛋白酶抑制剂或TIMPs活化剂；

-DHEA、其前体和衍生物；

-氨基酸，例如精氨酸、鸟氨酸、羟脯氨酸、羟脯氨酸二棕榈酸酯、棕榈酰甘氨酸、羟赖氨酸、甲硫氨酸及其衍生物、N-酰基氨基酸化合物；

-天然肽或合成肽，其包括二肽、三肽、四肽、五肽和六肽及其亲脂性和异构体衍生物、和与诸如金属离子(例如铜、锌、锰、镁等)的其它物质络合的其衍生物。例如，可提及以CHRONOGEN^TM、LAMINIXYL IS^TM、PEPTIDE Q10^TM、COLLAXYL^TM(专利FR2827170,)、PEPTIDE VINCI 01^TM(专利FR2837098,)、PEPTIDE VINCI 02^TM(专利FR2841781,)、ATPeptide^TM(专利FR2846883,)的名称市售已知的肽，或以的ATPeptide^TM的名称销售的序列为Arg-Gly-Ser-NH₂的合成肽；

-以GP4G^TM(FR2817748,)的名称销售的卤虫(Artémia salina)的提取物；

-植物肽提取物，例如亚麻的提取物(Lipigenine^TM,专利FR2956818,)、大豆、斯佩耳特小麦(spelt)、藤本植物、油菜、亚麻、水稻、玉米、豌豆的提取物；

-酵母提取物，例如Dynagen^TM(专利FR2951946,)或Actopontine^TM(专利FR2944526,)；

-脱氢乙酸(DHA)；

-合成或天然来源的植物甾醇；

-水杨酸及其衍生物、α-和β-羟酸、硅烷醇；

-氨基糖、葡糖胺、D-葡糖胺、N-乙酰基葡糖胺、N-乙酰基-D-葡糖胺、甘露糖胺、N-乙酰基甘露糖胺、半乳糖胺、N-乙酰基半乳糖胺；

-多酚、异黄酮和黄酮类化合物的提取物，如葡萄提取物、松树提取物、橄榄提取物；

-脂质，例如神经酰胺或磷脂；动物来源的油，例如角鲨烯或角鲨烷；植物油，例如甜杏仁油、椰子油、蓖麻油、希蒙得木油、橄榄油、油菜油、花生油、向日葵油、小麦胚芽油、玉米胚芽油、大豆油、棉花油、紫花苜蓿油、罂粟油、南瓜油、月见草油、粟油、大麦油、黑麦油、红花油、西番莲油、榛子油、棕榈油、杏仁油、鳄梨油、金盏花油；乙氧基化植物油、雪亚脂；

-所有紫外线屏蔽物质和防晒剂(solar filter)；

-环AMP及其衍生物、腺苷酸环化酶激活剂和磷酸二酯酶抑制剂、积雪草(centellaasiatica)提取物、积雪草皂苷亚细亚酸、甲基黄嘌呤、咖啡碱、咖啡因及其衍生物、茶碱、可可碱、福司柯林、七叶苷和七叶苷糖、ACE抑制剂、肽Val-Trp、神经肽Y抑制剂、脑啡肽、银杏叶(gingko biloba)提取物、薯蓣提取物、芦丁、马黛茶提取物、瓜拉那提取物、寡糖、多糖、肉碱、常春藤提取物、墨角藻提取物、夏枯草(Prunella vulgaris)水解提取物、鸡冠花(Celosia cristata)水解提取物、榆绿木(Anogeissus leiocarpus)提取物、木薯(Manihotutilissima)叶提取物、棕榈酰卡尼丁、肌肽、牛磺酸、接骨木提取物、海藻提取物如掌叶树(Palmaria Palmat)提取物。

作为示例，根据本发明获得的含有柔毛肖乳香的提取物的化妆品组合物的示例性制剂在下文中提及：

实施例3：美容霜(配方号#TCAAE08)

制备实施例3的组合物的方法：

1.将A相添加至主容器并开始均化。加热至70-75℃。

2.在UltraThix^TM P-100中喷洒并充分混合约30分钟。

3.将D相的成分添加至单独的烧杯并加热至70-75℃。

4.将预混合的C相添加至A相并混合直至均匀。

5.保持在70-75℃，将D相添加至主容器并充分混合。该乳液必须是均匀的。

6.开始冷却。

7.于约50℃下添加预混合的E相并充分混合。

8.于环境温度下添加F相并混合直至均匀。于25℃下停止。

根据实施例3的组合物以稳定白色乳膏形式存在，具有5.20-5.80的pH和25000–45000的粘度(D0)(Brookfield RVT/Spindle B/5 RPM/1分钟/25℃)。

除了用纯化水替代“根据实施例1的柔毛肖乳香的提取物”成分外，以完全相同的方式制备被称为“安慰剂”组合物的组合物。该“安慰剂”组合物更具体地在以下的一些活性测试中用作对照。

根据另一方面，本发明涉及特别包含有效量的根据本发明获得的柔毛肖乳香的提取物的组合物用于改善皮肤的屏障功能和保护皮肤免受大气污染物的美容用途。

皮肤是一种器官，其上部角质层和覆盖其的水脂膜(hydrolipid film)对外部环境具有保护性的物理屏障的作用。该屏障作用更通常被称为“皮肤的屏障功能”，在组织稳态和更具体地在对抗致病性或非致病性的外部物质(如环境大气污染物)中至关重要。

已知屏障功能的变化是由外部应力如紫外线引起的。在细胞内聚力(cohesion)和机械完整性的损失方面的影响是显著的。角质形成细胞分化末期阶段涉及的一些酶在对抗紫外线中起关键作用。这些酶的表达和/或活性的改变对皮肤的屏障功能和稳态的完整性具有显著的影响。

在病理皮肤的情况下和健康的衰老皮肤的情况下也观察到屏障功能的变化，这是由脂质合成异常引起的，其通常引起表皮表层细胞缺少内聚力，这可能导致皮肤渗透性增加。因此，例如，在皮肤老化过程中表现的表皮细胞内聚力缺乏可导致角度微裂缝(angularmicrofracture)和皮肤毛孔的扩大。

化学应力可引起屏障功能的变化。在此类中，需要考虑由柴油机、煤的燃烧和吸烟产生的环境大气污染物和更具体地PM2.5微粒。这些小尺寸微粒由于其深度穿透能力实际上是造成大多数由污染引起的负面影响的原因(Pan T-L等The impact of urbanparticulate pollution on skin barrier function and the subsequent drugabsorption.J Dermatol Sci,2015).

另外，一些这些环境大气污染物具有刺激皮肤或可能引起炎症反应的性质。炎症可能是皮脂分泌增加的原因(Lefebvre M.A.等“Evaluation of the impact of urbanpollution on the quality of skin:a multicentre study in Mexico,Int J CosmetSci.2015Feb 6).

因此，皮肤每天经常暴露在环境应力(紫外线、污染等)中，这些环境应力可改变该屏障器官的生理功能(Pan T-L等The impact of urban particulate pollution on skinbarrier function and the subsequent drug absorption.J Dermatol Sci,2015).

对于整个生物体而言，包含有效量的柔毛肖乳香提取物的本发明的组合物使得可以通过促进皮肤层的分化和最佳内聚力来对抗这些外部应力，从而使得可以在组织水平及以上维持功能组织学结构和生理渗透性，所述功能组织学结构和生理渗透性是维持由皮肤功能提供的该必要屏障所必需的。

因此，本发明的组合物涉及皮肤的水合和对抗皮肤老化的迹象出现。

“皮肤老化的迹象”的表述意指任何由老化引起的皮肤外观的改变，例如皱纹和细纹、裂缝、眼袋、黑眼圈(dark ring)、萎缩、皮肤弹性和/或色调损失、颜色损失或光泽损失、色素相关缺陷，也指没有系统转变成外观改变的任何皮肤内部的改变，例如皮肤变薄或暴露在紫外线后对皮肤的任何内部损伤。

因此，本发明的组合物还用于限制皮脂分泌和减小皮肤毛孔的大小。

为此，本发明由下文进行的测试的不同的结果进行说明。

实施例4：根据实施例2获得的柔毛肖乳香的水乙醇提取物对角质形成细胞中分化、水合和脂质合成的标志物的表达的影响(体外模型)

通过RT-qPCR(逆转录定量聚合酶链式反应)方法，通过分析特异于角质形成细胞分化和脂质合成的基因的表达谱，在正常人的表皮角质形成细胞(NHEK)模型中研究了根据实施例2获得的柔毛肖乳香的水乙醇提取物对皮肤水合和屏障功能的潜在影响。

生物学模型：

正常人的表皮角质形成细胞(NHEK)

测试化合物

于环境温度储存的粉末形式的根据实施例2获得的柔毛肖乳香的水乙醇提取物；

在DMSO(二甲基亚砜)中的10％储备溶液(100mg/ml)；

测试浓度：对NHEK 0.0001％；0.0003％和0.001％。

培养和处理

在培养基中接种正常人表皮角质形成细胞(NHEK)并培养24小时。然后将培养基替换为含有或没有(对照)根据测试实施例2获得的柔毛肖乳香的水乙醇提取物的测试培养基或分化的阳性参比品(1.5mM氯化钙)，并将细胞培养24小时。以n＝3进行所有条件。

在培养结束时，将培养上清液去除，并将细胞层用PBS(磷酸盐缓冲盐水)溶液洗涤。立即将板于-80℃冷冻干燥。

通过PCR阵列对标志物的差异表达的分析：

通过对从各处理的细胞层提取的mRNA(信使RNA)进行RT-qPCR来评估标志物的表达(在RNA提取前将重复处理的批次混合)。

借助于2个含有16个基因的“标志物定量PCR阵列”(包括2个持家(HK)基因，专门用于研究并适应筛选形式(mQPA-NHEK-BARRIER-16，的产品))以n＝2进行基因表达分析。

逆转录

根据生产商具体说明的方案借助于TriPure Isolation提取各样品的总RNA。通过毛细管电泳法(Bioanalyzer 2100,Agilent)评价RNA的量和质量。

通过用无DNA系统(Ambion)处理除去潜在污染的DNA痕迹。在寡脱氧胸苷酸(oligo(dT))和“Transcriptor Reverse Transcriptase”酶的存在下，通过总RNA(核糖核酸)的逆转录合成cDNA(互补脱氧核糖核酸)。通过分光光度法(Nanovue；GE)定量获得cDNA，然后调整cDNA量。

定量PCR

通过定量PCR(Light Cycler；Roche Molecular Systems Inc.)并根据生产商推荐的规程进行PCR反应(聚合酶链式反应)。

各样品的反应混合物(最终10μl)含有：

2.5μl的cDNA，

所使用的不同标志物的引物，

含有taq DNA聚合酶的反应混合物，和

标志物SYBR Green I，和MgCl₂。

将原始定量PCR数据转移，并用软件Microsoft处理。

在PCR循环过程中连续测量扩增DNA中荧光的掺入。这些测量使得可以获得根据PCR循环的荧光的强度曲线，并因此可以评估各标志物的相对表达(RE)的值。

基于荧光曲线的“退出(exit)”点确定循环数。对于相同的分析标志物，样品退出越晚(出现晚，在若干增加的循环后)，mRNA的初始拷贝数越低。

RE(相对表达)值根据以下公式以任意单位(AU)表示：

(1/2^循环数)x 10⁶

“mQPA-NHEK-BARRIER-16”PCR阵列含有用于数据归一化的2个参照基因(“持家”基因)。这2个持家基因(即RPS28(核糖体蛋白S28)和GAPDH(甘油醛-3-磷酸脱氢酶)基因)组成型表达且其表达水平不受处理影响或仅轻微受处理影响。因此，将各标志物的表达水平与这2个参照基因的平均表达相比。

数据处理

将原始数据转移，并用软件Microsoft处理。

在此上下文中使用的公式：

标准平均误差：sme＝标准偏差(Sd)/√n

标准平均误差(sme)代表样品相对于真实总体的平均值的平均偏差。通过用标准偏差(Sd)除以样品大小的平方根计算sme。

结果

结果呈现在以下表1和表2中。

-“CaCl₂”：完整结果(循环数和对照的百分比)和参比品(CaCl₂)对所研究的不同标志物表达的影响，通过“聚类(cluster)”方法分类；

-“根据实施例2获得的柔毛肖乳香的水乙醇提取物”：完整结果(循环数和对照的百分比)和该化合物对基因表达的影响，通过“聚类(cluster)”方法分类；

表1和表2：通过RT-qPCR方法评估的根据实施例2的柔毛肖乳香的水乙醇提取物对角质形成细胞中分化标志物、水合和脂质合成的表达的影响

在表1和表2中，当％大于或等于150时，认为存在刺激。与之相比，当％小于或等于65时，认为存在抑制。

用分化的阳性参比品CaCl₂(1.5mM)培养NHEK增加了编码脂质合成(SULT2B1和ALOX12)和角质形成细胞分化(FLG、IVL和TGM1)的标志物的mRNA的表达。这些结果是预期的，并使得可以确证测试。

根据实施例2获得的柔毛肖乳香的水乙醇提取物在较强的测试浓度下(0.001％)刺激角质形成细胞分化的标志物CLDN1、FLG和TGM1的表达。另外，还观察到水合的标志物AQP3以及脂质合成的标志物LASS6和SULT2B1的表达增加。这与参与脂质合成的某些基因(SMPD1和ALOX12)的表达降低有关。在两个最低测试浓度(0.0001％和0.0003％)下，仅观察到SMPD1和ALOX12的表达的抑制。

结论

在本研究的实验条件下，所获得的结果表明，根据实施例2获得的柔毛肖乳香的水乙醇提取物在较强测试浓度(0.001％)下表现出对表皮的水合和屏障功能具有积极影响。

实施例5：评估根据实施例1的柔毛肖乳香的提取物对暴露于由PM10-样污染颗粒引起的环境应力中的角质形成细胞的保护效果

本研究的目的是确定根据实施例1的柔毛肖乳香的提取物在0.1％下对暴露在环境应力中的角质形成细胞的保护效果。空气的污染与尺寸小于10μM(PM10-样颗粒)的细颗粒的存在有关。

通过测量由细胞释放到细胞外基质中的乳酸脱氢酶(LDH)的酶活性来测量细胞应力。LDH是催化丙酮酸转化为乳酸的氧化还原酶。当细胞完整性受损时，细胞将该酶释放到细胞外基质中。

这种酶测试被广泛用于评估组织和细胞的病变和毒性的存在。

方案：

将正常人角质形成细胞在无血清培养基中培养，然后用以0.1％稀释在培养基中的根据实施例1的柔毛肖乳香的提取物以每天施用2次的速率处理48h。在相同条件下制备未处理的对照。在48h结束时，将PM10-样污染颗粒以250μg/ml或500μg/ml的两种浓度单次施用于细胞24小时。

第二天，取样细胞外基质以便使用乳酸脱氢酶活性测定试剂盒(LactateDehydrogenase Activity Assay Kit,Sigma-aldrich,MAK066)的严格和详细的方案来测量乳酸脱氢酶的酶活性。一式三份制备各条件。

结果：

体外获得的图1所示的结果显示，根据实施例1的柔毛肖乳香的提取物在0.1％下以高度显著的方式保护暴露于由250μg/ml(-29.6％的释放的LDH，相当于PM10-样处理250μg/ml)和500μg/ml(-38.5％的释放的LDH，相当于PM10-样处理500μg/ml)剂量的PM10-样颗粒引起的应力中的角质形成细胞。

实施例6：评估根据实施例1的柔毛肖乳香的提取物对暴露于由PM2.5-样污染颗粒引起的环境应力中的角质形成细胞的保护效果

本研究的目的是确定根据实施例1的柔毛肖乳香的提取物在0.1％下对暴露在环境应力中的角质形成细胞的保护效果。

通过测量由细胞释放到细胞外基质中的乳酸脱氢酶(LDH)的酶活性来测量细胞应力。LDH是催化丙酮酸转化为乳酸的氧化还原酶。当细胞完整性受损时，细胞将该酶释放到细胞外基质中。空气的污染与尺寸小于10μM(PM10-样颗粒)的细颗粒的存在有关，也与小于或等于2.5μM(PM2.5-样)的小尺寸颗粒的存在有关。它们的尺寸小于皮肤毛孔的尺寸，PM2.5-样颗粒可直接引起损伤。

方案：

将正常人角质形成细胞在无血清培养基中培养，然后用以0.1％稀释在培养基中的根据实施例1的柔毛肖乳香的提取物以每天施用2次的速率处理48h。在相同条件下制备未处理的对照。在48h结束时，将PM2.5-样污染颗粒以100μg/ml的浓度单次施用于细胞24小时。

第二天，取样细胞外基质以便使用乳酸脱氢酶活性测定试剂盒(Sigma-aldrich,MAK066)的严格和详细的方案来测量乳酸脱氢酶的酶活性。一式三份制备各条件。

结果：

体外获得的图2所示的结果显示，根据实施例1的柔毛肖乳香的提取物在0.1％下以高度显著的方式保护暴露于由100μg/ml(-11％的释放的LDH，相当于PM2.5-样处理100μg/ml)剂量的PM2.5-样颗粒引起的应力中的角质形成细胞。

实施例7：评估根据实施例1的柔毛肖乳香的提取物对参与皮肤的屏障功能的外遗传标志物和mRNA的表达水平的影响

本研究的目的是确定根据实施例1的柔毛肖乳香的提取物在0.1％下对正常人角质形成细胞中的两个长非编码RNA(皮肤的屏障功能的外遗传调节物)的表达水平的影响：TINCR(组织分化诱导非蛋白编码RNA)和DANCR(分化拮抗非蛋白编码RNA)，以及对编码参与皮肤的屏障功能的蛋白质的mRNA的表达水平的影响，如：上皮细胞钙粘蛋白(CDH1)、内披蛋白(IVL)、转谷氨酰胺酶-1(TGM1)和胱天蛋白酶14(CASP14)。

方案：

将正常人角质形成细胞在无血清培养基中培养，然后用以0.1％稀释在培养基中的根据实施例1的柔毛肖乳香的提取物以每天施用2次的速率处理48h。在相同条件下制备未处理的对照。

借助于miRVana提取试剂盒(Ambion,AM1561)提取总mRNA，然后借助于高容量cDNA逆转录试剂盒(Applied Biosystem,4374966)对各条件进行逆转录。使用对DANCR(AppliedBiosystem:4426961；Hs03653830_g1)、TINCR、TGM1、IVL和CASP14(Applied Biosystem:4331182；Hs00542141_m1,Hs01070310_m1,Hs00846307_s1,Hs00201637_m1)有特异性的Gene Expression Assay和Gene Expression Master Mix反应缓冲液(Applied Biosystem:4369514)，在StepOne Plus热循环仪(Applied Biosystem)中进行实时的定量PCR。对18S有特异性的Gene Expression Assay用作内源对照(Applied Biosystem:4331182；Hs99999901_s1)。通过比较Ct法进行不同mRNA表达的相对定量。结果以相对于对照条件的表达水平的增加百分比给出。

结果(表)和结论：

上表所示的结果显示，根据实施例1的柔毛肖乳香的提取物在0.1％下在体外正向调节表皮表达。根据实施例1的柔毛肖乳香的提取物在0.1％下在体外增加编码上皮细胞钙粘蛋白、内披蛋白、转谷氨酰胺酶-1和胱天蛋白酶14的mRNA的表达，这些蛋白质参与皮肤的屏障功能。

实施例8：通过密蛋白1的研究评估根据实施例1的柔毛肖乳香的提取物对皮肤屏障的细胞内聚力的影响

本研究的目的是评估1％的根据实施例1的柔毛肖乳香的提取物对参与表皮细胞紧密连接(epidermal tight junctions)的蛋白质密蛋白1的表达的影响。密蛋白1在表皮中形成表达梯度。紧密连接是确保皮肤的细胞内聚力和屏障功能的动态结构。

方案：

在6孔板中放置的插件(insert)上，将6mm直径的人皮肤活检组织在特定培养基(DMEM 1g/L,HAMF12,SVF和抗生素)存在下离体保持培养。将活检组织培养48h，并每天接受2次施用以1％稀释在PBS 1X中的根据实施例1的柔毛肖乳香的提取物，或对于对照条件仅是PBS 1X。然后将活检组织在甲醛中固定，然后在石蜡中封闭。然后取4μm厚的皮肤切片。然后先后借助于特异于密蛋白1(Abcam,ab15098)的兔多克隆抗体和偶联至荧光染料的第二抗兔抗体(Invitrogen,A21206)进行免疫标记。然后在落射荧光显微镜(Zeiss Axiovert200M显微镜)下检查活检组织。借助于图像分析软件(PerkinElmer,Inc.)，基于所获得的照片进行荧光定量。

结果和结论：

对于离体研究，与仅用PBS 1X处理的对照条件相比，用1％的根据实施例1的柔毛肖乳香的提取物的处理使得可以观察到密蛋白1的表达高度显著地增加128.2％(学生t检验，n＝3+/-sme(sme：标准平均误差))。

用1％的根据实施例1的柔毛肖乳香的提取物的处理引起表皮的最分化层的内聚力提高，并由此加强了皮肤屏障功能。

实施例9：通过离体研究活检组织上的透明质酸来评估根据实施例1的柔毛肖乳香的提取物对作为皮肤屏障功能的基础的细胞内聚力的影响

本研究的目的是评估1％的根据实施例1的柔毛肖乳香的提取物对参与皮肤屏障的建立的透明质酸的表达的影响。透明质酸在细胞外基质中是丰富的，并通过调节表皮分化而促进表皮的水动力作用(hydrodynamism)，并促进皮肤修复的改善。

方案：

在6孔板中放置的插件上，将6mm直径的人皮肤活检组织在特定培养基(DMEM 1g/L,HAMF12,SVF和抗生素)存在下离体保持培养。将活检组织培养48h，并每天接受2次施用以1％稀释在PBS 1X中的根据实施例1的柔毛肖乳香的提取物，或对于对照条件仅是PBS 1X。然后将活检组织在甲醛中固定，然后在石蜡中封闭。然后取4μm厚的皮肤切片。然后先后借助于生物素化透明质酸结合蛋白(Coger-Seikagaki America,400-763-1A)和偶联至荧光染料的链霉抗生物素蛋白(Invitrogen,S32354)检测透明质酸。然后在落射荧光显微镜(Zeiss Axiovert 200M显微镜)下检查活检组织。借助于图像分析软件(PerkinElmer,Inc.)基于所获得的照片进行荧光定量。

结果和结论：

对于离体研究，与仅用PBS 1X处理的对照条件相比，用1％的根据实施例1的柔毛肖乳香的提取物的处理使得可以观察到真皮和表皮中透明质酸高度显著地增加58.9％(学生t检验，n＝3+/-sme)。

用1％的根据实施例1的柔毛肖乳香的提取物的处理引起皮肤屏障功能的改善。

实施例10：评估根据实施例1的柔毛肖乳香的提取物对培养的角质形成细胞的脂质含量的保护效果。

本研究的目的是确定根据实施例1的柔毛肖乳香的提取物在0.1％下对构成皮肤屏障功能的基础的角质形成细胞的脂质含量的影响。

方案：

将正常人的角质形成细胞在无血清培养基中培养，然后用以0.1％稀释在培养基中的根据实施例1的柔毛肖乳香的提取物以每天施用2次的速率处理48h。在相同条件下制备未处理的对照。在48h结束时，将细胞用甲醛在3.7％下固定10分钟(Sigma-aldrich,F1635)。在用PBS清洗后，将细胞与尼罗红在100nM下接触10分钟(Sigma-aldrich,N3013)，然后用PBS 1X清洗。然后在落射荧光显微镜(Zeiss Axiovert 200M显微镜)下检查细胞。

借助于图像分析软件(PerkinElmer,Inc.)基于所获得的照片进行荧光定量。

结果：

对于角质形成细胞的脂质合成，使用在0.1％下的根据实施例1的柔毛肖乳香的提取物，显微镜观察显示高度显著的荧光(与未处理样品相比+102％(根据学生t检验，n＝3+/-sme))。

用根据实施例1的柔毛肖乳香的提取物在0.1％下处理似乎能够加强皮肤屏障功能。

实施例11：通过离体研究活检组织上的表皮的脂质来评估根据实施例1的柔毛肖乳香的提取物对皮肤屏障的细胞内聚力的影响

本研究的目的是评估1％的根据实施例1的柔毛肖乳香的提取物对表皮的脂质含量的影响。形成表皮的脂质在维持屏障功能和保护其免受外部攻击中具有重要作用。

方案：

在6孔板中放置的插件(insert)上，将6mm直径的人皮肤活检组织特定培养基(DMEM 1g/L,HAMF12,SVF和抗生素)存在下离体保持培养。将活检组织培养48h，并每天接受2次施用以1％稀释在PBS 1X中的根据实施例1的柔毛肖乳香的提取物，或对于对照条件仅是PBS 1X。然后将活检组织在甲醛中固定，然后在石蜡中封闭。然后取4μm厚的皮肤切片。然后借助于100nM的尼罗红溶液，然后在碱性缓冲液中培养检测表皮的脂质含量。然后在落射荧光显微镜(Zeiss Axiovert 200M显微镜)下检查活检组织。

结果和结论：

对于离体研究，与仅用PBS 1X处理的对照条件相比，用根据实施例1的柔毛肖乳香的提取物的处理使得可以观察到表皮中脂质非常显著地增加41％(学生t检验，n＝3+/-sme)。

用1％的根据实施例1的柔毛肖乳香的提取物处理似乎能够加强皮肤屏障功能。

实施例12：评估根据实施例1的柔毛肖乳香的提取物对SDS应力后的皮肤的屏障功能的影响。

本研究的目的是使用荧光染料对重建(reconstructed)组织体外评估1％的根据实施例1的柔毛肖乳香的提取物对SDS应力后皮肤的渗透性的影响。

方案：

从重建后第10天开始，用以1％稀释于PBS 1X中的根据实施例1的柔毛肖乳香的提取物以每天施用2次的速率通过局部施用处理重建的人表皮(RHE)48h。在相同条件下用PBS1X处理对照。

在重建后第12天，用0.15％的SDS处理RHE 3h，然后用PBS 1X清洗5次。然后用1mM的荧光黄(Fluka,62644)荧光染料处理RHE 2h。将RHE用PBS 1X清洗，然后在甲醛中固定并在石蜡中封闭。然后取4μm厚的皮肤切片，并放置在载玻片上。然后将载玻片除去石蜡，并经过若干连续的醇浴。

在落射荧光显微镜(Zeiss Axiovert 200M显微镜)下观察到染料穿过屏障进入组织。借助于图像分析软件(PerkinElmer,Inc.)基于所获得的照片评估通过表皮的荧光的扩散。

结果和结论：

用1％的根据实施例1的柔毛肖乳香的提取物预处理并用0.15％SDS施加应力的RHE使得染料能够渗透较小的程度。与用PBS 1X处理并用0.15％SDS施加应力的条件相比，观察到染料扩散进入表皮显著减少16％(学生t检验，“SDS 0.15％”n＝4，“1％+SDS”n＝7，平均±sme)。

实施例13：根据实施例3配制的柔毛肖乳香的提取物对皮脂分泌的调节的影响-体内研究

目的：在健康志愿者中体内研究根据实施例3配制的柔毛肖乳香的提取物相对于安慰剂组合物对皮脂分泌的调节的影响。

健康志愿者的数量：10人(年龄24-46岁)。

研究：相对于安慰剂的双盲研究。

产品测试：根据实施例3以1％在组合物中配制的柔毛肖乳香的提取物(配方号#TCAAE08)相对于安慰剂组合物。

施用数量：以2mg/cm²的剂量早晨和晚上每天2次施用。

测试时间：3周。

监测观察：d0，d0-t1h，d7和d21。

测量：

通过对志愿者的皮肤施用(一种可渗入皮脂的不透明的白色粘合剂)评估皮脂的生理分泌(即非病理状况)。与皮脂接触的区域形成透明的“斑点”。借助于软件进行Sebutape上存在的斑点的表面和数量的定量分析。借助于基于照片独立地评估孔的尺寸。

统计学分析：学生“t”检验。

结果：

施用根据实施例3以1％配制的包含柔毛肖乳香的提取物的组合物后，分析显示在第7天和第21天，斑点的表面(图3和表3)和斑点的数量/cm²(图4和表4)统计学上显著地减少。

表3：施用根据实施例3的含有1％的柔毛肖乳香的提取物的组合物后皮脂分泌的发展(测量斑点的表面)

**：非常显著；***：高度显著，用学生t检验；平均n＝10+/-sme(标准平均误差)。

表4：施用根据实施例3的含有1％的柔毛肖乳香的提取物的组合物后皮脂分泌的发展(测量斑点的数量)

另外，DermaTop的照片(未显示)显示，与安慰剂相比，施用根据实施例3的包含柔毛肖乳香的提取物的组合物(配方号#TCAAE08)后1小时(d0-t1h)对孔尺寸及其数量减少的明显效果。

实施例14：根据实施例3配制的柔毛肖乳香的提取物对皱纹的外观的影响-体内研究

目的：研究根据实施例3配制的柔毛肖乳香的提取物相对于安慰剂组合物对皱纹的外观的影响。

志愿者的数量：14人，其中4人离开研究。对10个年龄52-64岁的志愿者进行测试分析。

研究：相对于安慰剂的双盲研究。

施用数量：以2mg/cm²的剂量早晨和晚上每天2次施用。

测试时间：8周。

监测观察：d0和d56。

测量：

借助于软件对取自鱼尾纹的硅酮复制品分析皱纹的数量和深度。借助于照片工作台通过鱼尾纹的彩色照片评估视觉外观。

统计学分析：根据数据分布的正态性，使用学生“t”检验或Wilcoxon检验。

结果：

与安慰剂相比，施用根据实施例3以1％配制的包含柔毛肖乳香的提取物的组合物后，在第56天观察到皱纹的数量(图5和表5)和皱纹的平均深度(图6和表5)统计学上显著地减少。

表5：对根据实施例3配制的柔毛肖乳香的提取物对皱纹的数量及其平均深度的影响的研究

*：显著；**：非常显著；用学生检验或Wilcoxon检验(根据数据分布的正态性选择检验)；平均n＝10+/-sme(标准平均误差)。

另外，彩色照片(未显示)显示，与安慰剂相比，施用以1％配制的根据实施例3的包含柔毛肖乳香的提取物的组合物(配方号#TCAAE08)后，在第56天皱纹明显减少。

实施例15：以1％配制的根据实施例3的柔毛肖乳香的提取物的测试方案：水合效果-体内研究

目的：研究以1％配制的根据实施例3的柔毛肖乳香的提取物相对于安慰剂组合物的水合效果。

志愿者的数量：10人(年龄24-40岁)。

研究：相对于安慰剂的双盲研究。

产品测试：根据实施例3以在组合物中1％配制的柔毛肖乳香的提取物(配方号#TCAAE08)相对于安慰剂组合物。

施用数量：以2mg/cm²的剂量施用1次。

测试时间：3h。

监测观察：T0,T30min,T1h,T1h30,T2h,T2h30,T3h。

测量：借助于CM825进行水合的定量测量，并由专家和志愿者进行视觉评估。

统计学分析：根据数据的正态性，使用学生“t”检验或Wilcoxon检验。

结果：

与安慰剂相比，施用以1％配制的根据实施例3的包含柔毛肖乳香的提取物的组合物(配方号#TCAAE08)30分钟后，观察到水合显著增加(图7和表6)。

表6：对施用根据实施例3配制的柔毛肖乳香的提取物后皮肤的水合的发展的研究

ns：不显著；*：显著；用学生检验或Wilcoxon检验(根据数据分布的正态性选择检验)；平均n＝10+/-sme(标准平均误差)。

另外，曲线下面积(AUC)的计算显示在本研究期间显著的水合效果(图8和表7)。

表7：对根据实施例3配制的柔毛肖乳香的提取物的水合效果的研究

*：显著，用学生t检验；AUC n＝10+/-sme(标准平均误差)。

当然，本发明不限于上述的实施方案和实施例，本领域技术人员基于常规活动，能够在不脱离本发明的范围的情况下提供其它没有明确描述的实施方案。

Claims

1.柔毛肖乳香(Schinus molle)的地上部分的水醇提取物，其特征在于所述提取物是通过以下从新鲜的或干燥的柔毛肖乳香的带叶小茎的未剥离叶获得的：

在4-100℃的温度下，在水醇溶剂中，在搅拌下固-液提取相对于所使用的总重量的0.1重量％-20重量％的固体物质，持续10分钟至4小时的时间，其中所述醇选自乙醇、甘油或丙二醇，所述醇相对于所述溶剂的总重量的比例为10重量％-90重量％，并且

将液相和固相分离以除去所述固相并回收柔毛肖乳香的液体提取物，所述提取物在所提取的多酚中主要包含栎素和槲皮素3-O-葡糖苷酸，分别地，栎素的浓度为所述提取物的总重量的至少0.04重量％，槲皮素3-O-葡糖苷酸的浓度为所述提取物的总重量的至少0.02重量％，其它所提取的多酚彼此独立地以微量形式存在，即浓度为低于所述提取物的总重量的0.01重量％(100ppm)。

2.根据权利要求1所述的提取物，其特征在于当所述醇是乙醇时，将所获得的柔毛肖乳香的液体提取物干燥，以获得柔毛肖乳香的固体提取物。

3.根据前述权利要求中任一项所述的提取物，其特征在于所述带叶小茎的未剥离叶是干燥并磨碎的。

4.根据前述权利要求中任一项所述的提取物，其特征在于所述水醇溶剂是水-醇混合物，所述醇相对于所述溶剂的总重量的比例为50重量％-80重量％。

5.获得根据权利要求1-4中任一项所述的柔毛肖乳香的提取物的方法，特征在于所述方法包括以下步骤，其中：

a)收集柔毛肖乳香的带叶小茎的未剥离叶；

d)将液相和固相分离以除去所述固相并回收柔毛肖乳香的液体水醇提取物，所述提取物在所提取的多酚中主要包含栎素和槲皮素3-O-葡糖苷酸，分别地，栎素的浓度为所述提取物的总重量的至少0.04重量％，槲皮素3-O-葡糖苷酸的浓度为所述提取物的总重量的至少0.02重量％，其它所提取的多酚彼此独立地以低于所述提取物的总重量的0.01重量％(100ppm)的浓度存在；和

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于将所获得的柔毛肖乳香的液体提取物通过微滤、超滤和/或纳米过滤纯化，以相对于也被提取的蛋白质和多糖浓缩栎素和槲皮素3-O-葡糖苷酸的提取物。

7.化妆品组合物，其特征在于所述组合物包含作为保护性活性剂的有效量的根据权利要求1-4中任一项所述的柔毛肖乳香的提取物，和生理学上可接受的赋形剂。

8.根据权利要求7所述的组合物，其特征在于所述柔毛肖乳香的提取物以相对于所述组合物的总重量的0.001-1重量％，优选0.01-1％的浓度存在于所述组合物中。

9.根据权利要求7或8中任一项所述的组合物，其特征在于所述组合物被配制成局部施用于皮肤的形式。

10.根据权利要求7-9中任一项所述的组合物，其旨在用于改善皮肤的屏障功能和保护皮肤免受大气污染物。

11.根据权利要求7-9中任一项所述的组合物用于水合皮肤和对抗皮肤老化的迹象出现的用途。

12.根据权利要求7-9中任一项所述的组合物用于减小皮肤毛孔的大小的用途。

13.根据权利要求7-9中任一项所述的组合物用于限制皮脂分泌的用途。