CN115589946A - 一种沙漠蔷薇叶愈伤组织提取物的制备方法及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种沙漠蔷薇叶愈伤组织提取物的制备方法及其应用，属于植物组织提取技术领域。所述的制备方法通过纤维素酶与果胶酶进行酶解预处理，以1,3‑丁二醇为提取溶剂，通过热回流方法提取。本发明提高了沙漠蔷薇叶愈伤组织提取的得率，沙漠蔷薇叶愈伤组织提取物对COX‑2和炎症细胞模型中炎症因子的分泌具有明显的抑制作用，对于PM2.5损伤THP‑1细胞模型具有抑制乳酸脱氢酶分泌的能力。
Description
技术领域
本发明属于植物组织提取技术领域，涉及一种沙漠蔷薇叶愈伤组织提取物的制备方法及其应用。
背景技术
沙漠蔷薇，拉丁学名Adenium obesum，又名沙漠玫瑰、天宝花、小夹竹桃、矮性鸡蛋花等，属夹竹桃科沙漠玫瑰属植物，是一种多年生肉质植物，在其自然栖息地分布广泛且差异较大，原产于非洲东南部至阿拉伯半岛地区，目前主要分布在撒哈拉以南的非洲地区，如非洲的科尼亚、坦桑尼亚、索马里及津巴布韦等，因其原产地从塞内加尔和毛里塔尼亚向东到苏丹和肯尼亚一带，原产地接近沙漠，而且花红如玫瑰，因而得名沙漠蔷薇。沙漠蔷薇，性喜高温、干旱、阳光充足的气候环境，喜富含钙质的、疏松透气的、排水良好的砂质壤土，不耐荫蔽，忌涝，忌浓肥和生肥，畏寒冷，生长适温。它是“东非十字架”最顽强的生命，在极度干燥缺水的沙漠地带，也可保水修护、盛开依然。
有研究表明沙漠蔷薇叶提取物有很好的药用价值和美容功效。沙漠蔷薇中可提取出30种强心苷和两种孕烷，可用于治疗心脏病和妇科病；沙漠蔷薇内含高浓度的海藻糖成分，能在肌肤细胞表面形成透气水脂膜，有效保护细胞膜及肌肤的储水功能，使肌肤免受自由基侵袭，减少晒黑和皮肤老化现象的发生，有效保护细胞膜和肌肤的储水功能。有文章指出，从沙漠蔷薇的叶子中提取出来的复合精萃能帮助肌肤深入持久保湿，激发肌肤天然的保湿潜能，抵御环境压力以及衰老的影响。
目前对于沙漠蔷薇细胞叶提取物的提取和应用不多，因此，建立有效的提取方法，可以促进其生物活性成分在药用价值和美容功效等方面的研究。
现有技术提取沙漠蔷薇细胞提取物的方法主要有两种，一种是水蒸气蒸馏法，一种是超临界CO2萃取。中国发明专利CN104622759A公开了一种沙漠蔷薇叶细胞提取物的提取方法及其应用，具体是：取新鲜的沙漠蔷薇的叶子，粉碎；把原料粉末送入超临界萃取釜中进行超临界CO2萃取；取萃取混合物送入超临界分离釜中进行分离；分离产物加入蒸馏水中进行蒸馏，蒸气冷凝回收得到沙漠蔷薇叶细胞提取物。方法在不破坏沙漠蔷薇的天然活性成分的前提下，能够快速地提取到大量的沙漠蔷薇叶细胞提取物。
由于目前对于沙漠蔷薇叶愈伤组织的提取和应用不多，因此本研究旨在提供一种对沙漠蔷薇叶愈伤组织进行提取制备的方法，在建立有效的提取方法的同时，提高得率，并研究其抗炎及抗PM2.5损伤功效，开拓其在化妆品领域的应用。
发明内容
针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种沙漠蔷薇叶愈伤组织提取物的制备方法。该制备方法以丁二醇为提取溶剂，通过先酶解后溶剂提取的方式进行提取，该方法操作简单，产物质量稳定，得率高，得到的提取物具有良好的抗炎及抗PM2.5损伤的功能。
为实现上述发明目的，本发明采用的技术方案如下：
一方面，一种沙漠蔷薇叶愈伤组织提取物的制备方法，所述制备方法通过纤维素酶与果胶酶进行酶解，以1,3-丁二醇为提取溶剂，采用热回流提取制备。
优选地，所述1,3-丁二醇的浓度为10-70％，优选为30％。
所述的制备方法包括以下步骤：
(1)准确称取沙漠蔷薇叶愈伤组织细胞粉，添加纤维素酶与果胶酶进行酶解预处理；
(2)加入提取溶剂，调整细胞粉与提取溶剂的料液比；
(3)酶解后，热回流提取，冷却后精滤，收集滤液。
优选地，步骤(1)所述的纤维素酶的添加量为所述沙漠蔷薇叶愈伤组织细胞粉质量的0.5％-2.5％；所述的果胶酶的添加量为所述沙漠蔷薇叶愈伤组织细胞粉质量的0.5％-2.5％，纤维素酶与果胶酶的质量比为1-3：1。
进一步优选地，步骤(1)所述的纤维素酶的添加量为所述沙漠蔷薇叶愈伤组织细胞粉质量的1％；所述的果胶酶的添加量为所述沙漠蔷薇叶愈伤组织细胞粉质量的1％，纤维素酶与果胶酶的质量比为1：1。
优选地，步骤(1)所述的酶解的条件是温度为40-60℃，pH为4-6，酶解时间为1.5-2.5h。
进一步优选地，步骤(1)所述的酶解的条件是温度为50℃，pH为5.0，酶解时间为2h。
优选地，步骤(1)所述的细胞粉与提取溶剂的料液比为1:40-60，单位为g/mL。
进一步优选地，步骤(1)所述的细胞粉与提取溶剂的料液比为1:50，单位为g/mL。
优选地，步骤(3)所述的热回流提取的温度为80-120℃，时间为2-3h。
进一步优选地，步骤(3)所述的热回流提取的温度为100℃，时间为2.5h。
优选地，步骤(3)所述的精滤使用0.45μm滤板。
再一方面，一种通过上述的制备方法制备的沙漠蔷薇叶愈伤组织提取物。
再一方面，一种所述的沙漠蔷薇叶愈伤组织提取物在制备抗炎和/或抗PM2.5损伤药物中的应用。
再一方面，一种所述的沙漠蔷薇叶愈伤组织提取物在制备抗炎和/或抗PM2.5损伤护肤品中的应用。
相对于现有技术，本发明具有以下有益效果：
1、本发明采用两步法制备沙漠蔷薇叶愈伤组织提取物，通过纤维素酶与果胶酶协同作用提高细胞通透性，通过丁二醇进行热回流提取，提高了沙漠蔷薇叶愈伤组织提取物活性成分含量；
2、本发明提取的沙漠蔷薇叶愈伤组织提取物通过细胞实验和试剂盒实验被证明具有良好的抗炎作用，能抑制COX-2与炎症因子TNF-a的表达；
3、本发明提取的沙漠蔷薇叶愈伤组织提取物通过细胞实验和试剂盒实验被证明具有良好的抗PM2.5损伤作用，能抑制PM2.5诱导的细胞焦亡。
附图说明
图1为实施例1-3、对比例1-3提取得到的沙漠蔷薇叶愈伤组织提取物中黄酮、多酚的含量。
具体实施方式
以下非限制性实施例可以使本领域的普通技术人员更全面的理解本发明，但不以任何方式限制本发明。下述内容仅仅是对本申请要求保护的范围的示例性说明，本领域技术人员可以根据所公开的内容对本申请的发明作出多种改变和修饰，而其也应当属于本申请要求保护的范围之中。
下面以具体实施例的方式对本发明作进一步的说明。本发明实施例中所使用的各种化学试剂如无特殊说明均通过常规商业途径获得。
下述实施例中，沙漠蔷薇叶愈伤组织细胞粉购自安赛搏生物科技有限公司，1,3-丁二醇购自美国OXEA；纤维素酶购自Biotopped，货号为C6270；果胶酶购自Biotopped，货号为P6280；COX-2抑制剂筛选试剂盒购自上海碧云天生物技术有限公司，货号为S0168；TNF-a试剂盒购自上海威奥生物科技有限公司，货号为EH0313；乳酸脱氢酶试剂盒购自南京建成生物工程研究所，货号为A020-2-2。
实施例1
沙漠蔷薇叶愈伤组织提取物的制备
准确称取5g沙漠蔷薇叶愈伤组织细胞粉，添加纤维素酶1.0％，果胶酶1.0％，在温度50℃，使用柠檬酸和NaOH调整pH为4.5，酶解预处理120分钟；酶解后，加入250mL的30％1,3-丁二醇；100℃热回流提取2.5h，冷却后用0.45μm滤板精滤，收集滤液，得提取物。
实施例2
准确称取5g沙漠蔷薇叶愈伤组织细胞粉，添加纤维素酶1.5％，果胶酶0.5％，在温度50℃，使用柠檬酸和NaOH调整pH为4.5，酶解预处理120分钟；酶解后，加入250mL的70％1,3-丁二醇；100℃热回流提取2.5h，冷却后用0.45μm滤板精滤，收集滤液，得提取物。
实施例3
准确称取5g沙漠蔷薇叶愈伤组织细胞粉，添加纤维素酶0.7％，果胶酶1.3％，在温度50℃，使用柠檬酸和NaOH调整pH为4.5，酶解预处理120分钟；酶解后，加入250mL的10％1,3-丁二醇；100℃热回流提取2.5h，冷却后用0.45μm滤板精滤，收集滤液，得提取物。
对比例1
准确称取5g沙漠蔷薇叶愈伤组织细胞粉，加入250mL的30％1,3-丁二醇；100℃热回流提取2.5h，冷却后用0.45μm滤板精滤，收集滤液，得提取物。
对比例2
准确称取5g沙漠蔷薇叶愈伤组织细胞粉，添加纤维素酶1.0％，果胶酶1.0％，在温度50℃，使用柠檬酸和NaOH调整pH为4.5，酶解预处理120分钟；酶解后，用0.45μm滤板精滤，收集滤液，得提取物。
对比例3
准确称取5g沙漠蔷薇叶愈伤组织细胞粉，添加纤维素酶0.5％，果胶酶0.5％，在温度50℃，使用柠檬酸和NaOH调整pH为4.5，酶解预处理120分钟；酶解后，加入250mL的90％1,3-丁二醇；100℃热回流提取2.5h，冷却后用0.45μm滤板精滤，收集滤液，得提取物。
在实施例与对比例中，实施例1-3的黄酮、多酚含量明显高于对比例1-3，具体结果如图1所示。
效果实验
1、对COX-2抑制活性
采用COX-2抑制剂筛选试剂盒检测，具体步骤严格按照说明书进行。具体步骤简要说明如下：
(1)配制提取物：实施例与对比例所得提取物用DMSO适当稀释，使加入反应孔中的终浓度保持一致，质量浓度为5％。
(2)在黑色96孔板上加入各反应液，提前设置各类对照和样品孔，并按照表2所示的加样顺序依次加入待测样品和各种溶剂。
(3)加样完成后，注意不要让液体溅出板外，37℃孵育10min。孵育完成后，各孔加入COX-2Probe 5μL。
(4)随后向各孔快速加入5μL的Substrate工作液，混匀，加入COX-2Substrate工作液后反应即会开始。
(5)37℃避光孵育5min后进行荧光测定。激发波长为560nm，发射波长为590nm。
计算每组的COX-2抑制百分率。计算公式：抑制率(％)＝(RFU 100％酶活性对照-RFU样品)/(RFU 100％酶活性对照-RFU空白对照)×100％。
表2
注：样品溶剂是指配制和稀释待测抑制剂所用的溶剂。
(6)计算每组的COX-2抑制百分率。计算公式：抑制率(％)＝(RFU 100％酶活性对照-RFU样品)/(RFU 100％酶活性对照-RFU空白对照)×100％。
实验结果见表3。
2、对痤疮丙酸杆菌相关炎症细胞模型中炎症因子TNF-a分泌的抑制活性
将HaCaT细胞以2×105cells/mL的密度接种于96孔板中，每孔200μL。在37℃、5％CO2条件下培养12h贴壁后，吸出培养基，进行痤疮丙酸杆菌诱导加样，具体如下：
设置空白组、模型组及样品组；空白组接入200μL无血清培养基；模型组接入200μL无血清培养基培养4h，加入浓度为(2×108CFU/mL)痤疮丙酸杆菌刺激物20μL；样品组接入200μL样品培养基(1％质量浓度)培养4h，加入浓度为(2×108CFU/mL)痤疮丙酸杆菌刺激物20μL。
将96孔板置于培养箱37℃，5％CO2环境中培养24h，收集细胞上清液，进行TNF-a含量检测。实验结果见表4。
3、对PM2.5损伤THP-1细胞模型乳酸脱氢酶的抑制活性
(1)转移：取出处于对数生长期的THP-1细胞，将细胞液全部吸入离心管中，1000rcf离心4min，弃上清，加入新的1640培养基吹匀细胞。
(2)铺板：配制细胞浓度3×106cells/mL，96孔板每孔接入100μL细胞液。
(3)加样：将沙漠蔷薇叶愈伤组织提取物用无血清培养基稀释至1％质量浓度。每孔加入100μL待测样品，以RPMI1640无血清培养基为空白对照，各做3个复孔。置于培养箱37℃，5％CO2环境中培养4h后进行PM2.5诱导。
(4)细胞培养4h后加入100μg/mL的PM2.5，置于培养箱37℃，5％CO2环境中培养24h。
(5)24h后将液体转移至1.5mL离心管，25℃，1000rcf离心5min，收集上清液，根据乳酸脱氢酶试剂盒说明书进行测试样品孔中乳酸脱氢酶的含量。
实验结果见表5。
实验结果及分析
表3沙漠蔷薇叶愈伤组织提取物对COX-2的抑制作用
表4沙漠蔷薇叶愈伤组织提取物对TNF-a分泌的影响
表5沙漠蔷薇叶愈伤组织提取物对乳酸脱氢酶分泌的影响
从表3可以看出，COX-2体外抑制实验结果表明沙漠蔷薇叶愈伤组织提取物具有抑制炎症因子COX-2表达的作用，与对比例1-3相比，实施例1-3得到的提取物的抑制效果明显更高。采用痤疮丙酸杆菌诱导HACAT细胞炎症因子高表达模型，通过检测TNF-a含量，从表4可以看出，实施例1-3得到的提取物能够显著抑制炎症因子TNF-a的分泌。
因此，沙漠蔷薇叶愈伤组织提取物具有抗炎的功效。
采用PM2.5损伤THP-1细胞模型，通过检测乳酸脱氢酶含量(见表5)，结果表明实施例1-3得到的沙漠蔷薇叶愈伤组织提取物能够显著抑制乳酸脱氢酶的分泌，具有抑制PM2.5诱导细胞焦亡的效果。
最后应当说明的是，以上内容仅用以说明本发明的技术方案，而非对本发明保护范围的限制，本领域的普通技术人员对本发明的技术方案进行的简单修改或者等同替换，均不脱离本发明技术方案的实质和范围。
Claims (12)
1.一种沙漠蔷薇叶愈伤组织提取物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：通过使用纤维素酶与果胶酶对沙漠蔷薇叶愈伤组织细胞粉进行酶解，以1,3-丁二醇为提取溶剂，采用热回流提取制备。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述1,3-丁二醇的质量浓度为10-70％，优选为30％。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)准确称取沙漠蔷薇叶愈伤组织细胞粉，添加纤维素酶与果胶酶，进行酶解预处理；
(2)加入提取溶剂，调整沙漠蔷薇叶愈伤组织细胞粉与提取溶剂的料液比；
(3)热回流提取，冷却后精滤，收集滤液。
4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)所述的纤维素酶的添加量为所述沙漠蔷薇叶愈伤组织细胞粉质量的0.5％-2.5％；所述的果胶酶的添加量为所述沙漠蔷薇叶愈伤组织细胞粉质量的0.5％-2.5％，纤维素酶与果胶酶的质量比为1-3：1。
5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)所述的纤维素酶的添加量为所述沙漠蔷薇叶愈伤组织细胞粉质量的1％；所述的果胶酶的添加量为所述沙漠蔷薇叶愈伤组织细胞粉质量的1％，纤维素酶与果胶酶的质量比为1：1。
6.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)所述的酶解的条件是温度为40-60℃，pH为4-6，酶解时间为1.5-2.5h。
7.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)所述的细胞粉与提取溶剂的料液比为1:40-60，单位为g/mL。
8.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)所述的细胞粉与提取溶剂的料液比为1:50，单位为g/mL。
9.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，步骤(3)所述的热回流提取的温度为80-120℃，时间为2-3h。
10.一种沙漠蔷薇叶愈伤组织提取物，其特征在于，所述的沙漠蔷薇叶愈伤组织提取物通过权利要求1-9任一项所述的制备方法制备。
11.一种权利要求10所述的沙漠蔷薇叶愈伤组织提取物在制备抗炎和/或抗PM2.5损伤药物中的应用。
12.一种权利要求10所述的沙漠蔷薇叶愈伤组织提取物在制备抗炎和/或抗PM2.5损伤护肤品中的应用。
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