KR100663282B1 - 국내산 팔손이 근피의 면역 기능 증진을 위한 팔손이근피의 추출물 제조방법 - Google Patents
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Abstract
두릅나무과 수종들은 기능성 소재로 널리 알려져 다양한 약리 작용을 위해 활용하고 있는 인삼, 가시오갈피, 음나무, 땃두릅 등은 일반적인 약리 성분 추출 방법인 열수 추출을 통해 주로 식이 및 연구, 생산 되고 있으며 이들의 유용생리 활성은 이미 많은 연구를 통해 알려져 있다.
두릅나무과 수종들 중에서 인삼은 과거부터 약용 및 기능성 소재로서 가장 많이 쓰이고 있다. 특히 항암과 관련하여 다양한 연구가 지속되어오고 있다. 특히 위암과 장암 및 간암세포의 저해효과에 있어서는 최고 90%까지 효과를 보이고 있음을 연구를 통해 발표되었고 위암 환자의 수술 후 인삼을 장기복용 시킨 후에 면역 T세포의 양이 수술 전보다 5~10% 정도 높게 유지되었고 말초 혈액 단백구의 IL-1 및 TNF-α 유전자의 발현을 증가시켰으며 생쥐의 면역계에 인삼 사포닌이 면역억제에 대한 높은 회복 능력을 보여주었다. 그리고 과거 구소련의 우주비행사의 강장제로서 잘 알려졌으며 높은 피로 회복 효과로 최근 들어 기능성 식품의 천연물 소재로서 가장 많이 사용되고 있는 가시오갈피의 근피는 면역 T 세포 면역 활성을 최고 275%까지 활성화 시키는 것이 보고되어 있고 유방암 세포에 대한 생육 억제는 85%의 활성을 나타내는 것으로 보고되어있다. 또 다른 두릅나무과 수종 중 음나무는 예로부터 한방에서 수피와 내피를 다양한 질병에 대한 약재로서 사용되어져 왔다. 최근 연구를 통해서는 유방암과 폐암 및 간암 세포주에 대해 최고 60% 이상의 억제활성과 89%의 항 돌연변이 억제 효과를 보인다. 역시 두릅나무과 수종으로 우리나 라 특산수종인 황칠나무는 잎의 추출물을 통해 80%의 항암 활성과 면역세포인 T 세포와 B 세포의 면역 활성을 130%로 높이고 cytokine인 IL-6와 TNF-α의 분비에 있어서는 대조구에 비해 최고 3배로의 분비량 증가에 대한 연구가 발표되었다.
그러나 앞선 다양한 생리 활성 기능을 지닌 두릅나무 수종들의 연구들은 물을 이용한 열수 추출이나 식이가 불가능한 추출 용매들에 의한 연구가 대부분을 차지하고 있다. 이에 비해 관련 연구가 미비한 수종인 팔손이를 이용한 기능성 소재로서의 면역 기능 증진을 위한 최적의 방법을 마련하고자 에탄올의 추출물과 물 추출물의 생리 활성 비교 실험을 실시하였다.
에탄올 용매를 이용한 추출 방법에 있어서는 실온에서의 침지 후 35~45℃에서 1차 추출을 하였고 실온에서 냉각 시킨 후 다시 실온에서 침지 후 55~65℃에서 2차 추출을 실시하였다. 이의 추출물을 이용하여 면역 활성을 측정하기 위하여 T 세포와 B 세포의 생육활성 및 생육증가 그리고 cytokine의 측정을 통하여 면역 기능 증진에 대해 검증하였다.
팔손이 근피의 열수 추출물은 B cell의 생육 활성에 있어서 최고 농도인 1 mg/ml에서 143%정도를 나타내고 T cell에서는 140%를 나타내고 있는 반면에 에탄올 추출물에서는 각각 152%와 178%의 생육 활성을 나타내어 열수 추출물 보다 40%이상의 높은 활성을 보이고 면역 세포의 생육도 측정에 있어서는 열수 추출물은 각 면역세포의 가장 높은 세포 생육도를 보이는 6일째에서 B cell은 7 × 104 cells/ml을 T cell은 8 × 104 cells/ml의 생육도를 보이는 반면에 근피 추출물은 B cell과 T cell 모두 11 × 104 cells/ml의 생육도를 보여 열수 추출물보다 0.4배 이상의 생육도가 증가한 것을 확인하였다. 특히 면역 세포의 생육 활성과 깊은 관계가 있는 cytokine인 IL-6와 TNF-α는 면역세포의 5일째 배양일에서 T cell의 열수 추출물이 IL-6는 82 pg/ml와 TNF-α는 84 pg/ml와 에탄올 추출물은 IL-6는 110 pg/ml와 TNF-α는 125 pg/ml의 분비량을 나타내었고 각각의 배양일에 따라서도 근피 추출물이 10~40 pg/ml 이상의 높은 분비량을 나타내었다. 이로서 면역 활성과 깊은 관계가 있는 T cell과 B cell의 생육 활성 및 생육도 그리고 cytokine 분비량의 측정을 통하여 열수 추출물과 에탄올 추출물과의 면역 활성의 차이를 확인하였고 팔손이의 각 부위 중에서 가장 높은 면역 활성을 보이는 근피의 면역 활성의 최적화를 위하여 에탄올 추출방법을 이용한 활용이 기대되는 바이다.
Description
도1a는 B 세포의 팔손이 각 부위의 용매별 추출물의 농도별 생육도이다.
도1b는 T 세포의 팔손이 각 부위의 용매별 추출물의 농도별 생육도이다.
도2a는 B 세포의 배양시간에 따른 팔손이 각 부위의 용매별 추출물에 대한 생육도이다.
도2b는 T 세포의 배양시간에 따른 팔손이 각 부위의 용매별 추출물에 대한 생육도이다.
본 발명은 면역기능증진을 위한 팔손이 근피의 추출물 제조방법에 관한 것이다.
두릅나무 수종의 유용 생리 활성이 널리 알려짐으로 인하여 무분별한 채취와 제한된 수종에 대한 연구 개발로 인하여 이들 수종들의 멸종을 초래 할 것으로 보인다. 따라서 타 수종에 대한 연구 개발을 통하여 멸종 위기에 있는 수종의 보존과 새로운 수종에 대한 유용생리활성 연구 활동을 활성화 시키기 위하여 팔손이의 부위 중 가장 높은 활성을 보이는 근피의 면역 기능 증진을 위한 최적 공정을 개발하였다.
국내에 자생하는 두릅나무과 식물들 중 다수의 수종들은 그 약리 활성이 널리 알려져 있고 다양한 방법으로 재배되어 지고 있으며 그의 대표적인 수종으로서 인삼이 있다. 이는 과거에서부터 세계적으로 알려져 있었으며 이의 생리활성의 주성분인 인삼사포닌은 전 세계적으로 널리 알려진 생리활성 물질로 인정되어 고가의 약재로서 이용되어왔다. 이로서 과거부터 인삼의 재배와 판매를 국가에서 전매를 통해 관리하여 인삼은 농가의 고부가가치의 작물로서 지역별 넓은 재배 단지를 조성하고 있다. 또한 가시오갈피는 과거 구소련의 우주비행사의 강장제로서 그 효능이 입증되어 일명 시베리아의 인삼이라고 불리고 있으며 주로 강장, 가정, 신경통, 중풍, 고혈압, 피로회복제로 널리 이용되어 왔다. 이의 추출물은 흥분완화작용 및 수면시간증가, 항산화와 지질개선 효과 등이 동물실험을 통해 보고 되어있고 최근 기능성 소재로서 많은 관심의 대상이 되어왔다. 또한 음나무는 과거로부터 한방에서 수피와 근피를 이용하여 가래, 기침, 신경통, 류마티스, 피부병, 궤양, 전염성 상처 등의 치료에 쓰였으며 면역 활성과 항산화활성, 강장 및 혈당강하, 항염증 작용 등에 대한 연구가 보고 되어있다. 땃두릅나무는 어린잎과 줄기는 특유의 향에 의해 고급나물로서 식이 되어지고 있으며 독활(獨活)이라 불리는 이의 뿌리는 진 통, 부종, 해열, 치통, 관절염 등에 유용한 한방 생약재로 이용되어 왔다. 이외에도 다양한 수종들의 유용생리활성을 밝히기 위해 연구 활동이 진행되고 있다.
앞선 각 두릅나무 수종들의 섭취 및 생리활성 연구를 위하여 열수를 이용한 추출이 대부분임이 확인되었다. 그러나 식이의 재료로서 섭취가 가능한 에탄올 용매를 이용한 추출 방법의 연구가 부족한 것으로 보인다.
본 발명은 최근 기능성 식품 소재에 대한 관심에 의해 다양한 식품소재에 대한 연구 범위가 넓어지고 있으며 과거 높은 생리활성으로 알려진 인삼과 가시오갈피, 두릅나무 등이 속한 두릅나무과 식물들에 대한 관심이 집중되고 있다. 두릅나무과인 팔손이는 조경용수로 이용하거나, 교목하부에 식재, 실내전원 또는 화분에 심어 분물로 감상할 수 있고, 잎에서는 염료액을 얻을 수 있다는 것이 알려져 있을뿐, 유용 생리활성 연구를 통해 밝혀진 생리기능, 효과는 아직까지 밝혀진 바 없다.
이에 새로운 수종에 대한 생리활성 및 기능성 제품화를 위한 연구 개발을 위하여 팔손이(Fatsia japonica) 나무를 이용하였으며 이를 위해 식이가 가능한 용매를 통한 추출방법을 이용하여 면역 기능을 살펴보았다.
이를 위해 열수를 이용한 근피 추출물의 면역 기능과 비교 실험을 통하여 에탄올 추출물의 면역 기능을 검토하기로 하였고 이를 통해 최적 추출 공정을 확립하였다.
본 발명의 면역기능증진을 위한 팔손이 근피의 추출물 제조방법은 시료인 팔손이 근피의 중량에 10배수의 에탄올 추출 용매로 추출 플라스크를 이용하여 20~25℃에서 12시간 침지를 한 후에 수직 환류 냉각기가 부착된 추출 플라스크를 이용하여 에탄올의 비등점보다 낮은 온도인 35~45℃에서 12시간 동안 추출을 통해 1차 추출을 한 후 20~25℃의 수온에 추출 플라스크를 담가 추출 플라스크내 시료와 용매의 온도를 20~25℃으로 냉각 시킨 후 다시 12시간 동안 침지를 실시하고 1차 추출온도보다 높은 55~65℃에서 12시간 동안 2차 추출을 하는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 구체적인 실시예는 다음과 같다.
실시 예 1. 국내산 팔손이 근피를 이용한 에탄올 추출
1) 원료 : 팔손이(Fatsia Japonica DECNE. et Planchon)의 근피를 세척한 뒤 25~30℃ 정도에서 음건한 후 100~150 mesh정도로 분쇄하였다
2) 에탄올 추출 : 시료인 팔손이 근피의 중량에 10배수의 에탄올 추출 용매로 추출 flask를 이용하여 실온(20~25℃)에서 12시간 침지를 한 후에 수직 환류 냉각기가 부착된 추출 flask를 이용하여 에탄올의 비등점보다 낮은 온도인 35~45℃에서 12시간 동안 추출을 통해 1차 추출을 한 후 20~25℃의 수온에 추출 flask를 담가 냉각시킨다. 추출 flask내 시료와 용매의 온도가 실온(25~25℃)이 되면 다시 12 시간 동안 침지를 실시하고 1차 추출온도보다 높은 55~65℃에서 12시간 동안 2차 추출을 한다.
3) 농축 : 얻어진 추출물은 감압 여과장치로 여과하여 40~50℃에서 감압 농축 하였다.
4) 동결건조 : 상기의 방법으로 얻어진 농축 물들은 동결 건조하여 추출물로 하였다.
실시 예 2. 국내산 팔손이 근피를 이용한 열수 추출
1) 원료 : 실시 예 1의 시료를 세척한 뒤 25~30℃ 정도에서 음건한 후 100~150 mesh정도로 분쇄하였다
2) 열수 추출 : 시료인 팔손이 근피의 중량에 10배수의 물을 추출 용매로 추출 flask를 이용하여 실온(20~25℃)에서 12시간 침지를 한 후에 수직 환류 냉각기가 부착된 추출 flask를 이용하여 물의 비등점보다 낮은 온도인 65~75℃에서 12시간 동안 추출을 통해 1차 추출을 한 후 20~25℃의 수온에 추출 flask를 담가 냉각시킨다. 추출 flask내 시료와 용매의 온도가 실온(25~25℃)이 되면 다시 12시간 동안 침지를 실시하고 1차 추출온도보다 높은 85~95℃에서 12시간 동안 2차 추출을 한다.
3) 농축 : 얻어진 추출물은 감압 여과장치로 여과하여 60~70℃에서 감압 농축 하였다.
4) 동결건조 : 상기의 방법으로 얻어진 농축 물들은 동결 건조하여 추출물로 하였다.
실시 예 3. 에탄올과 열수 추출물들의 생리활성 비교
실시 예 1과 2에서 얻어진 근피의 에탄올 추출물과 열수 추출물에 대하여 다음과 같은 면역 기능 비교 실험을 수행하였다.
1) 용매별 추출물의 수율
팔손이 근피의 용매별 추출 수율은 표-1과 같다. 에탄올 추출물과 물 추출물중 물의 추출 수율이 약 2.7배 정도 높게 나타났다.
표-1. 팔손이의 부위별 에탄올과 열수 추출물의 수율 비교
2) 용매별 면역 활성 검색
(1) 면역 세포의 생육 활성 검색
인간 면역 세포인 T cell(Jurkat)과 B cell(Raji)을 이용하여 생육 활성을 검색하기 위하여 MTT(3-(4,5-dimethylthiazol-2yl)-2,5-diphenyltetrazoilum bromide) assay는 생세포내 미토콘드리아의 dehydrogenase에 의해 생성되는 파란색 formazan 측정을 통해 세포의 증식이나 독성을 조사하는 방법으로 면역 세포의 농도를 4~5×104cells/㎖의 농도로 조절한 후 24 well plate에 900 ㎕씩 첨가하여 24시간 동안 배양(37℃, 5% CO2)시킨 후 시료를 최종농도 0.2, 0.4, 0.6, 0.8, 1.0 g/ℓ로 100 ㎕씩 첨가하여 48시간 동안 다시 배양하였다. 배양한 후, 100 ㎕의 MTT(50 ㎎/㎖) 용액을 첨가하여 4시간 동안 배양하여 formazan을 형성시킨 후, DMSO 900㎕를 첨가하여 formazan을 녹인 후, 각 well에서 100 ㎕씩 취하여 96 well plate에 옮긴 다음 540 nm에서 microplate reader를 이용하여 흡광도를 측정하였다.
도1a와 도1b에서 나타난 바와 같이 에탄올 추출물을 투여한 면역세포들이 물 추출물에 비해 높은 생육 활성을 나타내고 있다. 특히 농도의 증가에 따라서 B 세포는 0.2 mg/ml의 농도에서 110%의 활성도를 나타내었지만 1.0 mg/ml에서 150%로 높아지는 것을 확인하였고 물 추출물에 비해 10%이상의 높은 활성을 보이고 있다. 또한 T 세포에서는 에탄올 근피의 추출물이 1.0 mg/ml의 농도에서 최고 180%의 면역 활성도를 나타내고 있어 물 추출물의 130%보다 높은 활성을 보이고 있다.
에탄올로 추출시 더 높은 면역활성을 보이는 것은 팔손이 근피의 유용생리물질들이 에탄올 용매에서 더 잘 추출되며, 열수추출보다 낮은 실온에서 침지시킴으로써 유용생리물질의 활성이 높게 유지되기 때문이다.
(2) 면역 세포의 생육 증진 검색
면역세포의 생육도 실험은 면역 세포인 T cell(Jurkat)과 B cell(Raji)을 이용하여 검증하였으며 세포의 생육은 10% FBS를 함유하는 RPMI 1640 배지에서 5% CO2, 37℃에서 배양하였으며 각 추출물의 농도를 1.0 g/l로 조절하여 24 well plate에 세포를 2.0×104 cells/㎖의 농도로 분주한 후 시료를 투여하여 8일 동안 배양시켜 매일매일 각 well의 cell을 cell counter (CHEMOMETEC : GERMAN)를 사용하여 세포 수를 측정하는 방법을 사용하였다.
도 2a와 도 2b는 8일간의 배양시간동안 세포의 생육도를 살펴본 것이다. 에탄올 추출물들이 물 추출물에 비해 최고 4~6×104 cells/ml 높은 생육도를 보이고 있다. 팔손이 근피의 에탄올 추출물은 모든 면역세포에서 가장 높은 생육도를 보이고 있다.
(3) 면역 세포의 cytokine 분비량 검색
Cytokine은 Chemicon(USA)사의 IL-6와 TNF-α 정량 kit를 사용하여 측정하였다. 세포의 농도를 4~5 × 104 cells/㎖의 농도로 조절한 후 24 well plate에 900 ㎕씩 첨가하여 24시간 동안 배양(37℃, 5% CO2)시킨 후 시료의 최종농도를 1.0 g/ℓ로 100 ㎕씩 첨가하여 다시 배양(37℃, 5% CO2)하였다. 배양배지를 원심분리기를 이용하여 상층액을 취한 다음 450 nm에서 흡광도를 측정하여 얻어진 O.D값을 표준물 질을 이용해 작성한 표준곡선과 비교하여 cytokine의 양을 측정하였다.
표-2는 면역세포의 배양시간에 따른 IL-6와 TNF-α의 분비량을 나타낸 것이다. 배양시간에 따라서 분비량은 증가하고 있으며 에탄올과 물의 근피 추출물을 투여한 면역세포들이 cytokine의 분비량에서 10~40 pg/ml 의 분비량의 차이를 보이고 있음 알 수 있다.
표-2. 팔손이 각 부위의 에탄올 추출물에 의한 B cell과 T cell의 배양시간에 따른 IL-6와 TNF-α의 분비량 측정
에탄올 용매와 물을 이용하여 팔손이의 근피를 추출 한 결과 물 추출물이 15.6%, 에탄올 추출물이 6.3%로 나타났다.
또한 근피의 에탄올 추출물은 물 추출물과 비교하여 최고 농도인 1 g/L에서 T 세포는 약 40%이상 생육을 촉진하였으며 B 세포에서는 10%이상을 촉진하였다. 면역 활성도 검색에서 면역 세포는 근피의 에탄올 추출물과 물 추출물에 의하여 생육도가 증가하여 6일째에서 가장 높은 생육도를 보이고 있으며 에탄올 추출물이 물 추출물보다 최고 4×104 cells/ml 높은 생육도를 보이고 있다. 또한 면역 세포의 배양시간에 따른 생육도의 증가에 따라 cytokine의 분비량도 증가하였고 근피의 에탄올 추출물에 의한 분비량은 근피의 물 추출물에 비해 최고 40 pg/ml이상 차이가 나는 것을 확인하였다.
이에 따라 본 발명의 재료로 쓰인 팔손이는 인삼, 가시오갈피, 음나무, 황칠나무들과 같이 두릅나무 과에 속하는 관목으로서 인삼 등의 두릅나무 수종에서는 다양한 유용 생리 활성 성분이 포함되어 다양한 연구 및 활용 방안이 계획되어졌다. 이에 의해 두릅나무 수종들의 고갈이 우려되어 새로운 작물의 선별 및 연구에 대한 필요성이 요구 되어지고 있어 두릅나무 과의 수종 중 연구 활동이 가장 미비하고 민간에서의 활용이 극히 적은 팔손이의 근피의 면역 기능 증진을 위한 최적 추출 방법에 대한 연구에서 에탄올을 이용한 추출물의 면역 증진 활성을 확인하게 되었고 이의 면역 기능 활성이 우수한바 추후 팔손이 근피의 새로운 추출 공정이 다양한 활용이 가능할 것으로 사료되는 바이다.
Claims (2)
- 팔손이 근피의 면역 기능 증진을 위해 시료인 팔손이 근피의 중량에 10배수의 에탄올 추출 용매로 추출 플라스크를 이용하여 20~25℃에서 12시간 침지를 한 후에 수직 환류 냉각기가 부착된 추출 플라스크를 이용하여 에탄올의 비등점보다 낮은 온도인 35~45℃에서 12시간 동안 추출을 통해 1차 추출을 한 후 20~25℃의 수온에 추출 플라스크를 담가 추출 플라스크내 시료와 용매의 온도를 20~25℃으로 냉각 시킨 후 다시 12시간 동안 침지를 실시하고 1차 추출온도보다 높은 55~65℃에서 12시간 동안 2차 추출을 하는 것을 특징으로 하는 팔손이 근피 추출물을 유효성분으로 포함하는 면역 증강용 조성물.
- 삭제
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