CN113773910B - 一种促进皮肤细胞新生的青蒿精油、白茶精油及它们的组合物 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种促进皮肤细胞新生的青蒿精油、白茶精油及它们的组合物。所述青蒿精油采用以下方法制备：采集新鲜青蒿嫩苗，取叶子，干燥，切成碎段，先后使用碱性蛋白酶和纤维素酶酶解，再离心、萃取。所述白茶精油采用以下方法制备：采集新鲜白茶嫩芽，于背光的室内在温度30‑35℃，湿度50％‑60％的条件下萎凋至减重率为40％‑60％，干燥，粉碎，先后使用果胶酶和纤维素酶酶解，再离心、萃取。本发明证实所述青蒿精油、白茶精油和其组合物对于对HaCat细胞迁移、人皮肤成纤维细胞和表皮干细胞的增殖以及人皮肤成纤维细胞合成I型胶原蛋白的能力有显著的促进作用，在抗皮肤衰老方面具有应用潜力。

Description

一种促进皮肤细胞新生的青蒿精油、白茶精油及它们的组 合物
技术领域
本发明涉及植物的精油提取，具体地说，涉及一种促进皮肤细胞新生的青蒿精油、白茶精油及它们的组合物，制备方法，及其用途。
背景技术
随着生活物质水平的提高，人们对皮肤抗衰老的需求日益增加。皮肤衰老是各种因素共同作用的结果，根据引起皮肤衰老的因素可将皮肤衰老归纳为两种：一种是内源性老化，又称为自然老化，主要受遗传因素影响，是自然渐进衰老的过程；另一种是受紫外线辐射、吸烟、引力、化学物等外在环境因素影响而引起的外源性老化，其中超过80％的面部皮肤老化是由于紫外线辐射，因此又称光老化，该类皮肤老化的特征表现为皮肤质地粗糙、肤色暗沉、色素沉着、皮肤弹性丧失。
人的皮肤分为三层：表皮、真皮、皮下组织。表皮是皮肤的最外层，起到防止有害物质和细菌入侵的作用。真皮层位于表皮的下方，由细胞和细胞外基质共同构成，成纤维细胞是真皮的主要细胞，其正常的增殖、分化维系着皮肤正常的结构和生理功能。真皮层是与肌肤老化有直接关系的重要部位。皮下组织则位于真皮下方，主要作用则是缓冲外力冲击。
精油是从植物的叶子、花朵、种子、果实、根部、树皮、树脂、木心等部位以水蒸汽蒸馏法、有机溶剂萃取法、CO2超临界萃取法、冷压榨法、超声波法、酶提取法、微波萃取法、结晶法等方法提炼出来的，具有高浓度芳香和挥发性的物质。在医药、食品保健和化妆品行业被广泛应用。由于是天然产物，作为医药或化妆品具有不良反应少，健康安全的优势。
青蒿精油是从黄花蒿(Artemisia annua L.)中提取得到的挥发油。现代研究已证明青蒿挥发油具有抗菌，抗癌，抗病毒，抗炎，驱蚊，杀虫，抗氧化等活性。主要用途有治疗痤疮，抑制流感病毒，消炎、抗溃疡，局部刺激和强心，解热、止咳、祛痰、平喘和镇痛，并能作为保健食品，还可用于驱蚊虫。
白茶是中国茶类中的特殊珍品，属微发酵茶，其通过特殊工艺，将茶(Camelliasinensis(L.)O.Ktze.)中白茶树的叶和芽萎凋、烘焙(或阴干)、拣剔、复火，制作而成。白茶精油是从白茶茶叶和芽中提取得到的挥发油。目前关于白茶精油的功效的研究较少。
期刊文献(殷芳,许瑾,张蓓蓓,等.青蒿素对人皮肤瘢痕疙瘩成纤维细胞的抑制作用及相关机制初探[J].南京医科大学学报(自然科学版),2020(8).)公开了青蒿素对人皮肤瘢痕疙瘩成纤维细胞具有抑制作用。期刊文献(农晓琳,邓凌,李昊,等.青蒿素,青蒿琥酯抗皮肤瘢痕的研究[J].中华皮肤科杂志,2009,42(006):421-424.)公开了用青蒿素和青蒿琥酯配制外用膏剂治疗兔耳腹侧增生性瘢痕模型，结果发现青蒿素、青蒿琥酯膏可有效地抑制动物实验性皮肤瘢痕。专利文献CN103550407A公开了一种天然皮肤修复膏，含有重量份数的以下物质：西兰花汁8～17份，西瓜汁3～13份，燕窝粉2～11份，绿茶粉6～17份，红豆粉6～15份，黄豆粉4～12份，冰片1～6份，食盐3～9份，菜籽油2～9份，蒸馏水23～39份。该天然皮肤修复膏，能有效改善皮肤细胞活性，使细胞变得丰满，延缓皮肤衰老、增强皮肤张力、消除小皱纹等功效，能防止皱纹产生，避免皮肤变得粗糙，能显著增强皮肤的抗损伤能力，还有助于修复损伤的肌肤，调节皮肤新陈代谢、维持皮肤细胞组织正常机能。
然而，目前未见青蒿精油、绿茶精油在促进皮肤新生中的研究。
发明内容
本发明的目的是针对现有技术中的不足，提供一种促进皮肤细胞新生的青蒿精油、白茶精油及它们的组合物，制备方法，以及用途。
第一方面，本发明提供了一种白茶精油在抗皮肤老化或促进皮肤细胞新生的化妆品或药物中的应用，所述白茶精油是采用以下方法制备的：采集新鲜白茶的嫩芽，在背光的室内整齐摊开至厚度为3-5cm，温度控制在30-35℃，湿度为50％-60％，萎凋至减重率为50％-60％，之后置入烘干机100-120℃烘干20-40min；将白茶干燥叶片粉碎，加入14-18倍量的蒸馏水，调节pH为3.8-4.2，加入果胶酶，用量为40-60U/g，水浴锅中45-55℃下反应3.5-4.5h，再调节pH为4.5-5.0，加入纤维素酶，用量为40-60U/g，水浴锅中45-55℃下反应1.5-2.5h；酶解结束后，离心，收集液相，用乙醚萃取，收集上层，无水硫酸钠脱水，去除乙醚。
优选地，所述白茶为云南大叶种白茶。
优选地，所述白茶干燥叶片被粉碎成10～20目粗粉。
优选地，所述离心的参数为转速2000-5000r/min，离心时间10-30min；所述去除乙醚的方法是45-55℃恒温水浴挥去乙醚。
优选地，所述皮肤细胞为表皮干细胞、皮肤成纤维或表皮细胞。
第二方面，本发明提供了一种青蒿精油在制备抗皮肤老化或促进皮肤细胞新生的化妆品或药物中的应用，所述青蒿精油是采用以下方法制备的：取青蒿叶子洗净，干燥，切成碎段，加入4-6倍量的蒸馏水，调节pH为9.5-10.5，加入碱性蛋白酶，用量为80-120U/g，水浴锅中45-55℃下反应2.5-3.5h，再调节pH为4.5-5.0，加入纤维素酶，用量为10-30U/g，水浴锅中45-55℃下反应2.5-3.5h；酶解结束后，离心，收集液相，用乙醚萃取，收集上层，无水硫酸钠脱水，去除乙醚。
优选地，所述青蒿叶子为青蒿嫩苗的叶子，所述青蒿其产地为河南。
优选地，所述干燥的方式为60℃以下干燥2-5小时，所述碎段的大小为4-6mm。
优选地，所述离心的参数为转速2000-5000r/min，离心时间10-30min；所述去除乙醚的方法是45-55℃恒温水浴挥去乙醚。
优选地，所述皮肤细胞为表皮干细胞、皮肤成纤维或表皮细胞。
第三方面，本发明提供了一种植物精油组合物在制备抗皮肤老化或促进皮肤细胞新生的化妆品或药物中的应用，所述植物精油组合物含有如上任一所述的青蒿精油和如上任一所述的白茶精油。
优选地，所述青蒿精油和白茶精油的比例为1:(0.01-20)。
本文中所述的青蒿精油是从菊科植物黄花蒿Artemisia annua L.中提取得到。所述的白茶精油是从山茶科植物毛白茶Camellia sinensis(L.)O.Ktze.提取得到。
本发明优点在于：
1、本发明制备得到青蒿精油和白茶精油。考察了两种精油和精油组合物对HaCat细胞、人皮肤成纤维细胞和表皮干细胞增殖、迁移或胶原蛋白合成的影响，发现对于HaCat细胞迁移、人皮肤成纤维细胞和表皮干细胞的增殖以及人皮肤成纤维细胞合成I型胶原蛋白的能力有显著的促进作用。
2、本发明对精油的制备方法进行了优化，提高了精油的活性。
抗皮肤老化是医学美容的重要课题，研究表明，干细胞在维持机体稳态、保证组织器官的修复和再生中发挥着举足轻重的作用，干细胞对皮肤防老化过程有重要作用，而表皮细胞的迁移和新陈代谢的快慢决定了皮肤的状态，皮肤中胶原蛋白的含量是决定皮肤弹性和维持年轻状态的重要影响因素，因此本发明提示青蒿精油、白茶精油和它们的组合物在抗皮肤衰老方面具有良好的应用前景。
附图说明
图1：CCK8检测不同浓度精油对HaCat细胞生成影响。A空白组；B 250μg/mL青蒿精油；C 250μg/mL白茶精油；D 250μg/mL组方精油。
具体实施方式
下面结合附图对本发明提供的具体实施方式作详细说明。
实施例1本发明青蒿精油及其制备(一)
采集河南地区5月份的新鲜青蒿嫩苗，除去茎及无用部位，将叶子洗净，滤干水分，置于电热恒温干燥箱中进行干燥，温度控制在60℃以下，干燥时间为3h；用切割机将干燥青蒿切成4-6mm碎段，加入5倍量的蒸馏水，调节pH为10，加入碱性蛋白酶，用量为100U/g，水浴锅中50℃下反应3h，再调节pH为4.8，加入纤维素酶，用量为20U/g，水浴锅中50℃下反应3h；酶解结束后，3000r/min下离心20min，收集液相，用乙醚萃取，收集上层，无水硫酸钠脱水，50℃恒温水浴挥去乙醚。
实施例2本发明青蒿精油及其制备(二)
采集河南地区5月份的新鲜青蒿嫩苗，除去茎及无用部位，将叶子洗净，滤干水分，置于电热恒温干燥箱中进行干燥，温度控制在60℃以下，干燥时间为3h；用切割机将干燥青蒿切成4-6mm碎段，加入5倍量的蒸馏水，调节pH为10，加入碱性蛋白酶，用量为80U/g，水浴锅中50℃下反应3h，再调节pH为4.8，加入纤维素酶，用量为20U/g，水浴锅中50℃下反应3h；酶解结束后，3000r/min下离心20min，收集液相，用乙醚萃取，收集上层，无水硫酸钠脱水，50℃恒温水浴挥去乙醚。
实施例3本发明青蒿精油及其制备(三)
采集河南地区5月份的新鲜青蒿嫩苗，除去茎及无用部位，将叶子洗净，滤干水分，置于电热恒温干燥箱中进行干燥，温度控制在60℃以下，干燥时间为3h；用切割机将干燥青蒿切成4-6mm碎段，加入5倍量的蒸馏水，调节pH为10，加入碱性蛋白酶，用量为120U/g，水浴锅中50℃下反应3h，再调节pH为4.8，加入纤维素酶，用量为20U/g，水浴锅中50℃下反应3h；酶解结束后，3000r/min下离心20min，收集液相，用乙醚萃取，收集上层，无水硫酸钠脱水，50℃恒温水浴挥去乙醚。
实施例4本发明青蒿精油及其制备(四)
采集河南地区5月份的新鲜青蒿嫩苗，除去茎及无用部位，将叶子洗净，滤干水分，置于电热恒温干燥箱中进行干燥，温度控制在60℃以下，干燥时间为2h；用切割机将干燥青蒿切成4-6mm碎段，加入4倍量的蒸馏水，调节pH为10，加入碱性蛋白酶，用量为80U/g，水浴锅中45℃下反应2.5h，再调节pH为4.8，加入纤维素酶，用量为10U/g，水浴锅中45℃下反应3.5h；酶解结束后，5000r/min下离心10min，收集液相，用乙醚萃取，收集上层，无水硫酸钠脱水，45℃恒温水浴挥去乙醚。
实施例5本发明青蒿精油及其制备(五)
采集河南地区5月份的新鲜青蒿嫩苗，除去茎及无用部位，将叶子洗净，滤干水分，置于电热恒温干燥箱中进行干燥，温度控制在60℃以下，干燥时间为2h；用切割机将干燥青蒿切成4-6mm碎段，加入6倍量的蒸馏水，调节pH为10，加入碱性蛋白酶，用量为120U/g，水浴锅中35℃下反应1.5h，再调节pH为4.8，加入纤维素酶，用量为30U/g，水浴锅中55℃下反应2.5h；酶解结束后，2000r/min下离心30min，收集液相，用乙醚萃取，收集上层，无水硫酸钠脱水，55℃恒温水浴挥去乙醚。
实施例6本发明青蒿精油及其制备(六)
采集河南地区5月份的新鲜青蒿嫩苗，除去茎及无用部位，将叶子洗净，滤干水分，置于电热恒温干燥箱中进行干燥，温度控制在60℃以下，干燥时间为2h；用切割机将干燥青蒿切成4-6mm碎段，加入6倍量的蒸馏水，调节pH为10，加入碱性蛋白酶，用量为80U/g，水浴锅中45℃下反应2.5h，再调节pH为4.8，加入纤维素酶，用量为10U/g，水浴锅中45℃下反应3.5h；酶解结束后，2000r/min下离心30min，收集液相，用乙醚萃取，收集上层，无水硫酸钠脱水，55℃恒温水浴挥去乙醚。
实施例7本发明青蒿精油及其制备(七)
采集河南地区5月份的新鲜青蒿嫩苗，除去茎及无用部位，将叶子洗净，滤干水分，置于电热恒温干燥箱中进行干燥，温度控制在60℃以下，干燥时间为3h；用切割机将干燥青蒿切成4-6mm碎段，加入5倍量的蒸馏水，调节pH为10，加入碱性蛋白酶，用量为100U/g，水浴锅中40℃下反应2h，再调节pH为4.8，加入纤维素酶，用量为30U/g，水浴锅中55℃下反应2.5h；酶解结束后，2000r/min下离心30min，收集液相，用乙醚萃取，收集上层，无水硫酸钠脱水，55℃恒温水浴挥去乙醚。
实施例8本发明白茶精油及其制备(一)
以云南普洱地区大叶种白茶为材料，在清晨6点到9点，手工采摘大小相当的一心二嫩叶，在背光的室内整齐摊开至厚度为3-5cm，温度控制在35℃，湿度为55％-60％，萎凋至减重率为50％-55％，之后置入烘干机110℃干燥30min，后将白茶叶片粉碎过10目筛得粗粉。加入16倍量的蒸馏水，调节pH为4.0，加入果胶酶，用量为50U/g，水浴锅中50℃下反应4h，再调节pH为4.8，加入纤维素酶，用量为50U/g，水浴锅中50℃下反应2h。酶解结束后，3000r/min下离心20min，收集液相，用乙醚萃取，收集上层，无水硫酸钠脱水，50℃恒温水浴挥去乙醚。
实施例9本发明白茶精油及其制备(二)
以云南普洱地区大叶种白茶为材料，在清晨6点到9点，手工采摘大小相当的一心二嫩叶，在背光的室内整齐摊开至厚度为3-5cm，温度控制在35℃，湿度为55％-60％，萎凋至减重率为50％-55％，之后置入烘干机110℃干燥30min，后将白茶叶片粉碎过10目筛得粗粉。加入16倍量的蒸馏水，调节pH为4.0，加入果胶酶，用量为60U/g，水浴锅中50℃下反应4h，再调节pH为4.8，加入纤维素酶，用量为50U/g，水浴锅中50℃下反应2h。酶解结束后，3000r/min下离心20min，收集液相，用乙醚萃取，收集上层，无水硫酸钠脱水，50℃恒温水浴挥去乙醚。
实施例10本发明白茶精油及其制备(三)
以云南普洱地区大叶种白茶为材料，在清晨6点到9点，手工采摘大小相当的一心二嫩叶，在背光的室内整齐摊开至厚度为3-5cm，温度控制在30℃，湿度为50％-55％，萎凋至减重率为50％-55％，之后置入烘干机120℃干燥20min，后将白茶叶片粉碎过10目筛得粗粉。加入14倍量的蒸馏水，调节pH为4.0，加入果胶酶，用量为60U/g，水浴锅中55℃下反应3.5h，再调节pH为4.8，加入纤维素酶，用量为40U/g，水浴锅中55℃下反应2.5h。酶解结束后，2000r/min下离心30min，收集液相，用乙醚萃取，收集上层，无水硫酸钠脱水，45℃恒温水浴挥去乙醚。
实施例11本发明白茶精油及其制备(四)
以云南普洱地区大叶种白茶为材料，在清晨6点到9点，手工采摘大小相当的一心二嫩叶，在背光的室内整齐摊开至厚度为3-5cm，温度控制在32℃，湿度为50％-55％，萎凋至减重率为50％-55％，之后置入烘干机110℃干燥40min，后将白茶叶片粉碎过10目筛得粗粉。加入18倍量的蒸馏水，调节pH为4.0，加入果胶酶，用量为40U/g，水浴锅中45℃下反应4.5h，再调节pH为4.8，加入纤维素酶，用量为60U/g，水浴锅中45℃下反应1.5h。酶解结束后，5000r/min下离心10min，收集液相，用乙醚萃取，收集上层，无水硫酸钠脱水，55℃恒温水浴挥去乙醚。
对比例1青蒿精油对照一及其制备
采集河南地区5月份的新鲜青蒿嫩苗，除去茎及无用部位，将叶子洗净，滤干水分，置于电热恒温干燥箱中进行干燥，温度控制在60℃以下，干燥时间为3h；用切割机将干燥青蒿切成4-6mm碎段，加入5倍量的蒸馏水，调节pH为10，加入碱性蛋白酶，用量为140U/g，水浴锅中50℃下反应3h，再调节pH为4.8，加入纤维素酶，用量为20U/g，水浴锅中50℃下反应3h；酶解结束后，3000r/min下离心20min，收集液相，用乙醚萃取，收集上层，无水硫酸钠脱水，50℃恒温水浴挥去乙醚。
对比例2青蒿精油对照二及其制备
采集河南地区5月份的新鲜青蒿嫩苗，除去茎及无用部位，将叶子洗净，滤干水分，置于电热恒温干燥箱中进行干燥，温度控制在60℃以下，干燥时间为3h；用切割机将干燥青蒿切成4-6mm碎段，加入5倍量的蒸馏水，调节pH为10，加入碱性蛋白酶，用量为160U/g，水浴锅中50℃下反应3h，再调节pH为4.8，加入纤维素酶，用量为20U/g，水浴锅中50℃下反应3h；酶解结束后，3000r/min下离心20min，收集液相，用乙醚萃取，收集上层，无水硫酸钠脱水，50℃恒温水浴挥去乙醚。
对比例3白茶精油对照一及其制备
以云南普洱地区大叶种白茶为材料，在清晨6点到9点，手工采摘大小相当的一心二嫩叶，在背光的室内整齐摊开至厚度为3-5cm，温度控制在35℃，湿度为55％-60％，萎凋至减重率为50％-55％，之后置入烘干机110℃干燥30min，后将白茶叶片粉碎过10目筛得粗粉。加入16倍量的蒸馏水，调节pH为4.0，加入果胶酶，用量为70U/g，水浴锅中50℃下反应4h，再调节pH为4.8，加入纤维素酶，用量为50U/g，水浴锅中50℃下反应2h。酶解结束后，3000r/min下离心20min，收集液相，用乙醚萃取，收集上层，无水硫酸钠脱水，50℃恒温水浴挥去乙醚。
对比例4白茶精油对照二及其制备
以云南普洱地区大叶种白茶为材料，在清晨6点到9点，手工采摘大小相当的一心二嫩叶，在背光的室内整齐摊开至厚度为3-5cm，温度控制在35℃，湿度为55％-60％，萎凋至减重率为50％-55％，之后置入烘干机110℃干燥30min，后将白茶叶片粉碎过10目筛得粗粉。加入16倍量的蒸馏水，调节pH为4.0，加入果胶酶，用量为80U/g，水浴锅中50℃下反应4h，再调节pH为4.8，加入纤维素酶，用量为50U/g，水浴锅中50℃下反应2h。酶解结束后，3000r/min下离心20min，收集液相，用乙醚萃取，收集上层，无水硫酸钠脱水，50℃恒温水浴挥去乙醚。
实施例12青蒿精油、白茶精油及组方精油对HaCat细胞划痕影响
1实验材料
1.1实验细胞与动物
Hacat细胞。
1.2试药与试剂
实施例1-3、对比例1-2的青蒿精油、实施例8-9、对比例3-4的白茶精油、实施例1青蒿精油与实施例8的白茶精油的组合物(青蒿精油与白茶精油质量比为4:1)、DMEM高糖培养基、胰酶、胎牛血清、PBS缓冲液、CCK8检测试剂盒。
1.3仪器与设备
生物安全柜、细胞恒温培养箱、倒置显微镜、全自动酶标仪、离心机、水浴锅、-80度冰箱、-20度冰箱、4度冰箱、96孔板、6孔板、一次性吸管、1000ul、200ul、10ul等不同规格的枪及枪头、50ml、15ml及2ml离心管、细胞插件。
2实验方法
2.1 Hacat细胞培养、传代
Hacat细胞培养2小时后及时换上新鲜培养基，继续培养。当细胞生长至对数生长期后，弃去培养基，用PBS洗涤3次，加入1ml胰酶，在孵箱中放置5min之后在倒置显微镜下观察，若细胞间隙变大，细胞变圆，加入2ml培养基终止消化，将细胞混悬液吸入到15ml离心管中。1000rpm，室温离心5min，弃上清，加入3ml完全培养基吹打混匀，均分至10cm细胞培养皿中，每皿加10ml DMEM培养基，在37℃，5％CO2饱和湿度的孵箱中继续培养。
2.2 CCK8法检测单方精油及组方精油对角质形成细胞生存活力的影响
将Hacat细胞以5×104个/ml的密度，100μl/孔接种于96孔板，于孵箱中培养，待细胞密度约为80％，加入不同浓度的组方精油及单方精油孵育24h。以1:9将CCK8用培养液稀释，吸弃96孔板内的液体，每孔加入100μl稀释后的CCK8溶液。培养箱内孵育30min后取出，用酶标仪在450nm处检测每个孔的吸光度值。
2.3检测单方精油及组方精油对角质形成细胞迁移的影响
细胞划痕实验是一种常用的研究细胞迁移的体外实验方法，在一定程度上模拟了体内细胞迁移的过程，具体操作步骤如下：(1)24孔板每孔放置细胞插件；(2)将Hacat细胞以5×105个/ml接种于细胞插件中，细胞生长到80-90％融合时，弃去培养基，加药孵育(含1％血清的培养基配制)；(3)不同时间点在倒置显微镜下观察并拍照，用软件Image J计算划痕损伤面积愈合率；(4)迁移率＝(原划痕面积－残留面积)/原划痕面积×100％；相对迁移率＝(给药组迁移率－空白组迁移率)/空白组迁移率。
3实验结果
3.1 CCK8结果
结果显示，1000μg/mL、500μg/mL、250μg/mL浓度的单方精油及组方精油对HaCat细胞生长无显著影响。
表1 CCK8检测不同浓度精油对HaCat细胞生长影响
Figure BDA0003290585520000081
Figure BDA0003290585520000091
3.2细胞划痕实验结果
结果显示，组方精油浓度为125μg/mL时，相对迁移率为85.63％。单方精油结果显示：125μg/mL实施例1-3青蒿精油组迁移率在45％以上，125μg/mL实施例8-9白茶精油组迁移率在43％以上。经比较，组方精油组迁移率与实施例1-3青蒿精油组以及实施例8-9白茶精油组迁移率具有显著性差异(P＜0.01)。
对比例1和对比例2青蒿精油组迁移率均小于实施例1-3青蒿精油组迁移率，差异有统计学意义(P＜0.01)。对比例3和对比例4白茶精油组迁移率小于实施例8-9白茶精油组迁移率，差异有统计学意义(P＜0.01)。
表2不同精油对HaCat细胞迁移影响(
Figure BDA0003290585520000092
n＝6)
Figure BDA0003290585520000093
注：实施例1-3青蒿精油组vs.对比例1青蒿精油组，**P＜0.01；实施例1-3青蒿精油组vs.对比例2青蒿精油组，##P＜0.01；实施例8-9白茶精油组vs.对比例3白茶精油组，△△P＜0.01；实施例8-9白茶精油组vs.对比例4白茶精油组，▲▲P＜0.01；vs.组方精油组，&&P＜0.01。
实施例13青蒿精油、白茶精油及组方精油对人皮肤成纤维细胞增殖和I型胶原蛋白合成影响
1实验方法
1.1药物配制
单方精油：青蒿精油、白茶精油均分别用DMSO溶解，并用完全培养基稀释至使用浓度250μg/mL。
组方精油：青蒿精油+白茶精油，每1mL含有250μg/mL青蒿精油400μL，250μg/mL白茶精油100μL，其余用完全培养基补足至使用浓度125μg/mL。
1.2 CCK8法检测精油对人皮肤成纤维细胞增殖影响
为考察精油对小鼠单核巨噬细胞RAW 264.7细胞增殖的影响，取对数生长期的人皮肤成纤维细胞(ESF-1，上海市皮肤病医院馈赠)用DMEM完全培养液制备成细胞悬液，再以4×104个/ml的密度接种至96孔板，每孔200μl，孵育24h。精油稀释浓度为250μg/ml，每组6个复孔。实验设空白对照组和阳性对照组，空白对照组加入相应体积的细胞培养液，阳性对照组加入0.001μmol·L-1雌二醇(Sigma)。弃96孔板上层培养基，加入10％的CCK8无血清DMEM液100μl，于37℃、5％CO2细胞培养箱孵育30min，于酶标仪测OD490值，计算细胞存活率。细胞增殖率(％)＝(精油组OD值－空白对照组OD值)/空白对照组OD值×100％。
1.3检测精油对人皮肤成纤维细胞I型胶原蛋白合成影响
选择250μg/mL精油浓度用于精油对ESF-1细胞I型胶原蛋白合成的测定。取对数生长期的ESF-1细胞，采用DMEM完全培养液制备成细胞悬液，再以4×104个/ml的密度接种至96孔板，每孔200μl，孵育36h。精油稀释浓度为250μg/ml，每组6个复孔。实验设空白对照组和阳性对照组，空白对照组加入相应体积的细胞培养液，阳性对照组加入0.001μmol·L-1雌二醇。培养结束后，收集细胞培养上清液，按照I型胶原蛋白酶联免疫吸附测定(ELISA)检定试剂盒说明书测定I型胶原蛋白含量。
1.4统计学处理
采用SPSS 20.0软件对数据进行统计学分析，数据以平均数±标准差表示，多组均数比较采用One-way ANOVA方法，组间两两比较方差齐时选择LSD法，方差不齐时选择Dunnett’s T3法。以P＜0.05为差异具有统计学意义。
3实验结果
3.1对人皮肤成纤维细胞增殖影响
计算各组细胞增殖率，与空白组比较可见，阳性对照组、实施例1-3青蒿精油组、实施例8-9白茶精油组和组方精油组均能显著促进ESF-1细胞增殖，细胞增殖率与空白组的差异有统计学意义(P＜0.05或P＜0.01)，而对比例4白茶精油组的细胞增殖率小于空白组且差异有统计学意义(P＜0.05)，表明对ESF-1细胞增殖有一定的抑制作用。比较实施例1-3青蒿精油组与对比例1青蒿精油组的细胞增殖率，结果表明实施例1-3青蒿精油组的细胞增殖率显著高于对比例1青蒿精油组(P＜0.05或P＜0.01)。比较实施例1-3青蒿精油组与对比例2青蒿精油组的细胞增殖率，结果表明实施例1-3青蒿精油组细胞增殖率显著高于对比例2青蒿精油组(P＜0.05或P＜0.01)。比较实施例8-9白茶精油组与对比例3白茶精油组的细胞增殖率，结果表明实施例8-9白茶精油组的细胞增殖率显著高于对比例3白茶精油组(P＜0.05或P＜0.01)。比较实施例8-9白茶精油组与对比例4白茶精油组的细胞增殖率，结果表明实施例8-9白茶精油组的细胞增殖率显著高于对比例4白茶精油组(P＜0.01)。与阳性对照组比较，组方精油组的细胞增殖率显著高于阳性对照组(P＜0.05)。
表3不同精油对ESF-1细胞增殖影响(
Figure BDA0003290585520000111
n＝6)
Figure BDA0003290585520000112
注：与空白组相比，*P＜0.05，**P＜0.01；实施例1-3青蒿精油组vs.对比例1青蒿精油组，#P＜0.05，##P＜0.01；实施例1-3青蒿精油组vs.对比例2青蒿精油组，△P＜0.05，△△P＜0.01；实施例8-9白茶精油组vs.对比例3白茶精油组，▲P＜0.05，▲▲P＜0.01；实施例8-9白茶精油组vs.对比例4白茶精油组，&&P＜0.01；单方精油组vs.组方精油组，&&P＜0.01；与阳性对照组比较，$P＜0.05，$$P＜0.01。
3.2对人皮肤成纤维细胞I型胶原蛋白合成影响
检测人皮肤成纤维细胞上清液中I型胶原蛋白含量，结果可见，与空白组相比较，各药物处理组除了对比例2青蒿精油组和对比例3白茶精油组I型胶原蛋白含量低于空白组，其余各组的I型胶原蛋白含量均有所提高，表明具有促进人皮肤成纤维细胞合成I型胶原蛋白的作用，其中阳性对照组、实施例1-3青蒿精油组、实施例8-9白茶精油组以及组方精油组显著高于空白组，差异有统计学差异(P＜0.05或P＜0.01)。将各精油处理组与阳性对照组比较，考察精油促进人皮肤成纤维细胞合成I型胶原蛋白的能力与雌激素的高低，结果表明，实施例1青蒿精油组、实施例8白茶精油组和组方精油组的I型胶原蛋白含量显著高于阳性对照组(P＜0.05或P＜0.01)，表明促进I型胶原蛋白合成的能力优于雌激素。将实施例1-3青蒿精油组与对比例1青蒿精油组的I型胶原蛋白含量相比较，发现实施例1-3青蒿精油组I型胶原蛋白含量均显著高于对比例1青蒿精油组(P＜0.05或P＜0.01)，将实施例1-3青蒿精油组与对比例2青蒿精油组的I型胶原蛋白含量相比较，发现实施例1-3青蒿精油组I型胶原蛋白含量均显著高于对比例2青蒿精油组(P＜0.01)，比较实施例8-9白茶精油组与对比例3白茶精油组I型胶原蛋白合成，结果表明实施例8-9白茶精油组I型胶原蛋白含量显著高于对比例3白茶精油组(P＜0.01)。比较实施例8-9白茶精油组与对比例4白茶精油组I型胶原蛋白合成，结果表明实施例8-9白茶精油组I型胶原蛋白含量显著高于对比例4白茶精油组(P＜0.05或P＜0.01)。组方精油组与其余各单方精油组的I型胶原蛋白含量相比较可见，组方精油组I型胶原蛋白含量显著高于各单方精油给药组，差异有统计学意义(P＜0.05或P＜0.01)。
表4不同精油对人皮肤成纤维细胞I型胶原蛋白合成影响(
Figure BDA0003290585520000121
n＝6)
Figure BDA0003290585520000122
注：与空白组相比，*P＜0.05，**P＜0.01；与阳性对照组比较，#P＜0.05，##P＜0.01；实施例1-3青蒿精油组vs.对比例1青蒿精油组，△P＜0.05，△△P＜0.01；实施例1-3青蒿精油组vs.对比例2青蒿精油组，▲P＜0.05，▲▲P＜0.01；实施例8-9白茶精油组vs.对比例3白茶精油组，&&P＜0.01；实施例8-9白茶精油组vs.对比例4白茶精油组，$P＜0.05，$$P＜0.01。单方精油组vs.组方精油组，@P＜0.05，@@P＜0.01。
实施例14青蒿精油、白茶精油及组方精油对表皮干细胞增殖的影响
1实验方法
1.1药物配制
单方精油：青蒿精油、白茶精油均分别用DMSO溶解，并用完全培养基稀释至250μg/mL。
组方精油：青蒿精油+白茶精油，每1mL含有250μg/mL青蒿精油400μL，250μg/mL白茶精油100μL，其余用完全培养基补足。
1.2表皮干细胞的分离培养
取C57BL/6乳鼠，颈椎脱臼处死，剥离得到皮片，用胰蛋白酶和EDTA联合消化法分离表皮，使用表皮干细胞完全培养基制成单细胞悬液，接种于已包被基质胶的细胞培养瓶中，37℃、体积分数为5％的CO2条件下培养。每2-3天换液1次。细胞长至70％-80％融合时进行传代。通过免疫荧光法检测整合素α6和CD71的表达鉴定为表皮干细胞。
1.3 CCK8法检测精油对表皮干细胞增殖影响
向传至第3代的小鼠表皮干细胞制成细胞悬液，加入表皮干细胞完全培养基，以4×104个/ml的密度接种至预铺基质胶的96孔板，每孔200μl，孵育24h。单方精油稀释浓度为250μg/ml，组方精油浓度为125μg/ml，每组6个复孔。实验设空白对照组，空白对照组加入相应体积的表皮干细胞完全培养液。以1:9将CCK8用培养液稀释，吸弃96孔板内的液体，每孔加入100μl稀释后的CCK8溶液。培养箱内孵育30min后取出，用酶标仪在570nm处检测每个孔的吸光度值。计算细胞增殖率。细胞增殖率(％)＝(精油组OD值－空白对照组OD值)/空白对照组OD值×100％。
3实验结果
检测单方精油和组方精油对表皮干细胞增殖的影响，结果发现，相比于空白组，各单方精油组以及组方精油组的细胞增殖率显著增加，差异有统计学有意义(P＜0.05或P＜0.01)。比较单方精油和组方精油促进小鼠表皮干细胞增殖的能力，发现组方精油组细胞增殖率显著大于各单方精油组，差异有统计学意义(P＜0.05)。以上结果表明，青蒿精油、白茶精油和组方精油组的处理有助于激活和维持表皮干细胞的增殖活性。
表5不同精油对ESF-1细胞增殖影响(
Figure BDA0003290585520000131
n＝6)
Figure BDA0003290585520000132
Figure BDA0003290585520000141
注：与空白组相比，*P＜0.05，**P＜0.01；单方精油组vs.组方精油组，#P＜0.05。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明方法的前提下，还可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。

Claims (2)

1.一种植物精油组合物在制备抗皮肤老化或促进皮肤细胞新生的化妆品或药物中的应用，其特征在于，所述植物精油组合物含有白茶精油和青蒿精油，其质量比为1：4，所述白茶精油是采用以下方法制备的：采集新鲜白茶的嫩芽，在背光的室内整齐摊开至厚度为 3-5cm，温度控制在 30-35℃，湿度为 50%-60%，萎凋至减重率为 50%-60%，之后置入烘干机100- 120℃烘干 20-40min；将白茶干燥叶片粉碎成10~20目粗粉，加入 14- 18 倍量的蒸馏水，调节 pH 为 3.8-4.2，加入果胶酶，用量为 40-60U/g，水浴锅中 45-55℃下反应3.5-4.5h，再调节 pH 为 4.5-5.0，加入纤维素酶，用量为 40-60U/g，水浴锅中 45-55℃下反应 1.5-2.5h；酶解结束后，2000-5000r/min离心10-30min，收集液相，用乙醚萃取，收集上层，无水硫酸钠脱水，45-55℃恒温水浴挥去乙醚; 所述青蒿精油是采用以下方法制备的：取青蒿叶子洗净，60℃以下干燥2-5h，切成4-6mm碎段，加入 4-6 倍量的蒸馏水，调节pH 为 9.5- 10.5，加入碱性蛋白酶，用量为 80- 120U/g，水浴锅中 45-55℃下反应 2.5-3.5h，再调节 pH 为 4.5-5.0，加入纤维素酶，用量为 10-30U/g，水浴锅中 45-55℃下反应2.5-3.5h；酶解结束后， 2000-5000r/min离心10-30min，收集液相，用乙醚萃取，收集上层，无水硫酸钠脱水，45-55℃恒温水浴挥去乙醚。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述皮肤细胞为表皮干细胞、皮肤成纤维细胞或表皮细胞。
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Application publication date: 20211210

Assignee: Mujiuye (Shanghai) Technology Co.,Ltd.

Assignor: Fanshenlan Technology (Shanghai) Co.,Ltd.

Contract record no.: X2023310000098

Denomination of invention: Artemisia annua essential oil, white tea essential oil, and their compositions that promote skin cell regeneration

Granted publication date: 20221108

License type: Common License

Record date: 20230615