CN115670980B - 一种具有皮肤保护作用的复方精油和含有其的护肤品组合物 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种具有皮肤保护作用的复方精油，由以下成分组成：青蒿精油、乳香精油、白茶精油和玉兰叶精油，体积比为4:3:1:2。本发明还提供了一种护肤品组合物，该护肤品组合物包含上述复方精油。本发明的青蒿精油、乳香精油、和玉兰叶精油是以菊科植物黄花蒿(Artemisia annua L.)、乳香(Boswellia carterii)和玉兰叶(Michelia alba)为原料，通过水蒸气蒸馏取得的挥发油；白茶精油是以山茶科植物毛白茶(Camellia sinensis(L.)O.Ktze)为原料，通过超临界二氧化碳萃取和分子蒸馏提取得到的挥发油。将这四种精油按照一定体积比均匀混合，即获得本发明的复方精油。

Description

一种具有皮肤保护作用的复方精油和含有其的护肤品组合物

技术领域

本发明涉及化妆品领域，具体涉及一种具有皮肤保护作用的复方精油。

背景技术

精油是从植物的叶子、花朵、种子、果实、根部、树皮、树脂、木心等部位以水蒸汽蒸馏法、冷压榨法、脂吸法、二氧化碳超临界萃取等方法提炼出来的，具有高浓度芳香和挥发性的物质。由于是天然产物，且具有不良反应少、健康安全的优势，在医药、食品保健和化妆品行业被广泛应用。精油的种类繁多，功效各样，使用和配伍方法也各不相同。

发明内容

本发明的目的在于提供一种具有皮肤保护作用的复方精油，该复方精油通过修复皮肤屏障、抗炎、抗过敏来保护皮肤。

本发明的复方精油由以下组分组成：青蒿精油、乳香精油、白茶精油和玉兰叶精油。中医方解：

青蒿精油(君)：

主要成分作用：抗菌；抗真菌抗病毒，抑制藓菌，消炎抗敏，促进皮肤细胞新生，帮助伤口修复；

乳香精油(臣)

主要成分作用：抗菌抗炎，促进血液循环，消炎止痛；促进皮肤细胞新生，帮助伤口愈合；美白皮肤，淡化疤痕、使肌肤恢复弹性，能柔润肌肤及改善肤色暗沉；

白茶精油(佐)

主要成分作用：杀菌消炎、收敛毛孔、促进细胞再生；

玉兰叶(使)

主要成分作用：舒缓敏感、抑菌抗真菌、调节皮脂分泌、舒缓镇定。

优选地，本发明复方精油中，青蒿精油、乳香精油、白茶精油和玉兰叶精油的体积比为4：3：1：2。

优选地，青蒿精油、乳香、白茶和玉兰叶精油分别是以菊科植物黄花蒿(Artemisiaannua L.)、中药乳香(Boswellia carterii)、山茶科植物毛白茶(Camellia sinensis(L.)O.Ktze)和木兰科植物白兰(Michelia alba)的枝叶玉兰叶为原料，通过水蒸馏提取或超临界二氧化碳萃取得到的挥发油。

本发明的另一目的是提供一种护肤品组合物，将本发明的复方精油与护肤品可接受的各种辅料、赋形剂制备成适于皮肤施用的护肤品组合物，该组合物包含上述复方精油。

本发明还提供复方精油和含有其的护肤品组合物的用途，可将本发明的复方精油或护肤品组合物用于缓解皮肤过敏、炎症和修复皮肤屏障。

优选地，所述修复皮肤屏障为修复因化学物理因素导致的皮肤屏障损伤。

优选地，在该用途中，复方精油的剂量为体积比0.1％～50％。

本发明的复方精油的优点：该复方精油中，以青蒿为君，其气芳香，清中有透散之力，芳香化浊、疏风清热；以辛温之乳香为臣，加强青蒿辛香透散之效，既能散瘀止痛，“定诸经之痛”，又能活血消痈，祛腐生肌；佐以白茶清香润肺，清热解毒，以助青蒿养阴透热之功；玉兰叶为使药，祛风通窍，辛散温通，可助诸药畅达周身。诸药合用，全方共奏芳香化浊，疏风散寒、清热解毒、活血止痛之功。

本发明复方精油，相比于单个组分精油和其它精油组合物来说，在以下方面都表现出远远更强的功效：抑制炎症状态的巨噬细胞NO释放、抑制LPS诱导下巨噬细胞的TNF-α生成、抑制炎症状态的巨噬细胞IL-6生成、缓解过敏小鼠的耳肿胀、减少二甲苯诱导所致的表皮增厚(P<0.05)、降低小鼠血清IgE、TNF-α水平。因此，本发明复方精油具有优越的缓解皮肤过敏、炎症和修复皮肤屏障的功效。

附图说明

图1：皮肤屏障机械损伤改善实验的各组小鼠皮肤外观变化；(A)未损伤小鼠；(B)模型小鼠组；(C)复方精油高剂量组；(D)复方精油中剂量组；(E)复方精油低剂量组；(F)地松樟薄乳膏组；

图2：小鼠机械损伤皮肤经复方精油处理后的HE染色情况；

图3：单方精油干预12h和24h的角质形成细胞划痕愈合图像；A、B、C和D分别表示青蒿精油、乳香精油、白茶精油、玉兰叶精油；

图4：复方精油和精油组合物干预12h和24h的角质形成细胞划痕愈合图像，A、B、C和D分别表示青蒿精油、乳香精油、白茶精油、玉兰叶精油。

具体实施方式

下面参照具体的实施例对本发明做进一步说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用于解释本发明，并不用于限定本发明的范围。

下述实施例2-6中所使用的精油均从牧九野(上海)科技有限公司采购或者由实施例1的方法提取而得。

青蒿精油：从牧九野(上海)科技有限公司采购，批号为：XYJY0069，企业标准为：相对密度(20℃)0.876～0.906；折光指数(20℃)1.462～1.482。

乳香精油：从牧九野(上海)科技有限公司采购，批号为：JY0020，企业标准为：相对密度(20℃)0.835～0.877；折光指数(20℃)1.455～1.477。

白茶精油：从牧九野(上海)科技有限公司采购，批号为：XYJY0037，企业标准为：相对密度(20℃)0.875～0.950；折光指数(20℃)1.470～1.495。

玉兰叶精油：从牧九野(上海)科技有限公司采购，批号为：JY0035，企业标准为：相对密度(20℃)0.8500～0.8900；折光指数(20℃)1.445～1.480。

【实施例1】提取单方精油

仪器：水封口式蒸馏釜，其设备构成：

蒸馏釜1：整体外观为圆柱形，球冠式釜底，上部开口为加料口；

鹅颈管2：带有蒸馏釜上口的圆锥形盖子，连接冷凝器；

冷凝器3：为铝质列管冷凝器，使蒸汽冷凝和冷却式馏出液；

油水分离器4：用铝材做成，既是接受馏出液的容器，又是精油与水的分离器。

提取精油工艺流程：投料→加水→蒸馏→冷却→油水分离→精油→包装。

1.1提取青蒿精油

青蒿精油是从菊科植物黄花蒿(Artemisia annua L.)中提取得到的挥发油。

材料：以河南地区10月果期黄花蒿植株为材料。

由于叶子受蒸汽加热易发生粘合，有阻碍蒸汽透入现象，因此本次选用水蒸馏法来提取青蒿精油，使材料与水接触，通过水渗出作用，从植物体渗透，提高精油出油率。

步骤：(1)采集新鲜黄花蒿全草，以新鲜嫩苗为最佳，除去残茎及无用部位，将选好的叶子和花蕾洗净，滤干水分，置于电热恒温干燥箱中进行干燥，温度控制在60℃以下，干燥时间为3h；

(2)用切割机将干燥黄花蒿切成4-6mm碎段，便于精油分子的挥发；

(3)将粉粹的黄花蒿叶置于蒸馏内槽中，加入等量的屈臣氏蒸馏水，注于外蒸馏槽中，并将蒸馏槽置放于水槽之上，密封外蒸馏槽，浸泡1.5h后进行蒸馏。萃取温度90℃，冷凝管温度15～25℃，蒸馏时间1.5h，得精油纯露混合液,用分离器分离，得青蒿精油。

1.2提取乳香精油

乳香精油是从橄榄科植物乳香树Boswellia carterii Birdw.及同属植物Boswellia bhaurdajiana Birdw.树皮渗出的树脂。

材料：同仁堂所售的中药乳香块。

步骤：(1)将乳香树脂块，碎过10目筛的粗粉，浸泡于等同于乳香重量的三倍屈臣氏蒸馏水中1h；

(2)过滤，将使用蒸馏水浸泡1小时后的乳香树脂块置入蒸馏内槽中，将等同于乳香容积的屈臣氏蒸馏水注于外蒸馏槽中，并将蒸馏槽置放于水槽之上，并将蒸馏槽置放于水槽之上，密封外蒸馏槽进行蒸馏，萃取温度90～96℃，冷凝管温度15～25℃，蒸馏时间4h，得乳香精油和纯露，分离，得乳香精油。

1.3提取白茶精油

白茶精油是从山茶科植物毛白茶(Camellia sinensis(L.)O.Ktze)提取得到的挥发油。

材料：云南普洱地区大叶种白茶

主要设备：萃取器，由不锈钢管制成，增压缓冲并为双层结构，内简为不锈钢，外简为黄铜，互相紧密配合

步骤：采用超临界CO₂流体萃取白茶精油，在清晨6点到9点，手工采摘大小相当的一心二嫩叶，每株嫩芽整齐摊开，在当地白天如同有日光,在日光下晾晒，夜晚在室内阴凉处晾干，连续3天，之后置入烘干机110℃干燥。后将白茶叶片碎过10～20目筛的粗粉，用砂布袋装好已秤量好的茶叶粗粉，并装入萃取器中，封好顶盖。开启恒温槽电源。打开二氧化碳钢瓶阀门，使气体沿管线经过干燥器，冷却冷凝器(浸在冰水浴中)，柱塞泵，进入增压缓冲瓶。待增压缓冲瓶的压力大大超过实验压力后，打开阀门V1,使萃取器升压到实验压力，关阀门V1,让茶叶预浸润10min,超临界CO₂流体萃取。CO₂流体流速1L/min，萃取温度50℃，萃取压力25MPa，分离温度50℃，分离压力4.5～5.5MPa，萃取时间1.5～2.5h，得白茶精油。

1.4提取玉兰叶精油

玉兰叶精油是从木兰科植物白兰(Michelia alba)的叶片提取得到的挥发油。

材料：广西地区玉兰叶

步骤：选用水蒸馏法提取玉兰叶精油，本次采集新鲜玉兰叶，除去残茎及无用部位，洗净，滤干水分，置于电热恒温干燥箱中进行干燥，温度控制40℃，烘干，置于蒸馏内槽中，加入等量的屈臣氏蒸馏水，注于外蒸馏槽中，并将蒸馏槽置放于水槽之上，密封外蒸馏槽，浸泡1h后开始蒸馏，萃取温度90-96℃，冷凝管温度15～25℃，蒸馏时间60min，得精油纯露混合液,用分离器分离，得玉兰叶精油。

【实施例2】制备复方精油

将实施例1.1～1.4获得的精油或者上述从牧九野(上海)科技有限公司商购的青蒿精油(A)、乳香精油(B)、白茶精油(C)、玉兰叶精油(D)均匀混合在一起，即得复方精油。

复方精油E：青蒿精油+乳香精油+白茶精油+玉兰叶精油，用A+B+C+D表示；

精油组合物1：青蒿精油+乳香精油，用A+B表示；

精油组合物2：青蒿精油+白茶精油，用A+C表示；

精油组合物3：青蒿精油+玉兰叶精油，用A+D表示；

精油组合物4：青蒿精油+乳香精油+白茶精油，用A+B+C表示。

【实施例3】精油对LPS诱导的巨噬细胞炎症模型影响

一、实验材料

3.1.1实验细胞

细胞小鼠单核巨噬细胞RAW 264.7细胞株

3.1.2试药与试剂

配方精油、脂多糖LPS、DMEM高糖培养基、胎牛血清、CCK8检测试剂盒、一氧化氮(NO)检测试剂盒、TNF-α及IL-6酶联免疫吸附测定(ELISA)检定试剂盒。

3.1.3仪器与设备

生物安全柜、细胞恒温培养箱、倒置显微镜、全自动酶标仪、离心机、水浴锅、-80度冰箱、-20度冰箱、4度冰箱、万分之一天平、96孔板、24孔板、一次性刮铲、一次性吸管、1000ul、200ul、10ul等不同规格的枪及枪头、50ml、15ml及2ml离心管。

二、实验方法

3.2.1 RAW 264.7细胞培养

小鼠单核巨噬细胞RAW 264.7细胞株用内含10％ FBS的DMEM高糖培养基于37℃5％ CO₂恒温培养箱中培养，细胞呈对数生长，每24h更换培养基，细胞生长至80％～90％传代。待细胞传至3代，状态稳定后，用于实验。

3.2.1护肤品功效原料组合物配制

利用细胞培养基配置单方精油A、B、C、D的母液，浓度均为250μg/mL。

精油组合物A+B：每1mL培养基含有母液A 400μL，B 300μL，AB的浓度比为4:3。

精油组合物A+C：每1mL含有母液A 400μL，C 100μL，其余用培养基补足，AC的浓度比为4:1。

精油组合物A+D：每1mL含有母液A 400μL，D 200μL，其余用培养基补足，AC的浓度比为4:2。。

精油组合物A+B+C：每1mL含有母液A 400μL，B 300μL，C 100μL，其余用培养基补足，ABC的浓度比为4:3:1。

精油组合物A+B+C+D：每1mL含有母液A 400μL，B 300μL，C 100μL，D 200μL。

3.2.3 CCK8法检测RAW 264.7细胞活性

为考察精油对小鼠单核巨噬细胞RAW 264.7细胞活性的影响，取生长对数期的巨噬细胞用一次性刮铲刮拭，用吸管吹打至呈单个细胞分散。通过细胞计数取相应细胞数，并加入相应培养基，以4×10⁴个/mL的密度接种至96孔板，每孔100μL，孵育24h。实验设空白对照组，配方精油分别稀释浓度为25μg/mL、50μg/mL、125μg/mL、250μg/mL、500μg/mL，每组5个复孔。空白对照组加入相应体积的细胞培养液，继续孵育24h。弃96孔板上层培养基，加入10％的CCK8无血清DMEM液100μL，于37℃、5％ CO₂细胞培养箱孵育30min，利用酶标仪450nm波长的OD值，计算细胞存活率。细胞存活率(％)＝(精油干预孔OD值-空白孔OD值)/(对照组OD值-空白孔OD值)×100％。

3.2.4硝酸还原酶法检测NO含量

取“2.1”项下细胞，以4×10⁴个/mL密度接种于96孔板，孵育24h。加入不同浓度的配方精油及单方精油，共培养1小时。孵育结束后，给药组和模型对照组加入LPS(终浓度为1μg/mL)，空白组加入完全培养基，继续培养24h，收集上清液，具体步骤按照NO试剂盒说明书操作。于540nm处测吸光值，并计算NO的含量及抑制率。公式：NO含量[c/(μmol·L^-1)]＝(测定管平均OD值-空白管平均OD值)/(标准管平均OD值-空白管平均OD值)×标准品浓度×样品稀释倍数。NO抑制率(％)＝(模型对照组NO平均含量-给药组NO平均含量)/模型对照组NO平均含量×100％。

3.2.5 ELISA法检测TNF-α和IL-6含量

取“2.1”项下细胞，以5×10⁵个/mL密度接种于24孔板，孵育24h。加入配方精油及单方精油，共培养1小时。孵育结束后，给药组和模型对照组加LPS(终浓度为1μg/mL)，空白组加入完全培养基，继续培养18h，收集细胞上清液，按照ELISA试剂盒说明书于450nm处测吸光值OD值，绘制标准曲线，计算TNF-α和IL-6的含量及抑制率。TNF-α抑制率(％)＝(模型对照组TNF-α含量-给药组TNF-α含量)/模型对照组TNF-α含量×100％。IL-6抑制率(％)＝(模型对照组IL-6平均含量-给药组IL-6平均含量)/模型对照组IL-6平均含量×100％。

三、实验结果

3.3.1 CCK8法检测RAW 264.7细胞活性测定结果

考察不同浓度的配方精油对巨噬细胞生长影响，结果如表1所示。从表1可以直观看出，500μg/mL浓度的配方精油显著影响巨噬细胞正常生长，该浓度下细胞存活率只有37％(P<0.001，数据见表1)。而其他浓度作用下，并未对巨噬细胞正常生长造成明显影响。因此后续实验选择安全剂量25μg/mL、50μg/mL、125μg/mL、250μg/mL进行。

表1不同浓度配方精油对巨噬细胞生长影响

注:***P<0.001.

3.3.2精油对炎症状态的巨噬细胞NO释放的影响

从结果分析(表2)，复方精油(A+B+C+D)对NO产生明显的抑制作用。从单方精油结果来看，青蒿精油(A)和乳香精油(B)能够抑制NO产生，而白茶精油(C)、玉兰叶精油(D)无抑制NO作用。复方精油的组合显著提升了NO的抑制率，提示有较好的抗炎能力，不同精油组合的抑制率排序为A+B+C+D>A+B+C>A+B>A+C>A+D。

表2不同精油及组方对LPS诱导的巨噬细胞释放NO的影响

3.3.3精油对炎症状态的巨噬细胞TNF-α生成的影响

各组细胞上清液TNF-α含量如表3所示，在250μg/mL的浓度下，青蒿精油(A)能够显著抑制TNF-α的生成，抑制率为24.12％(P<0.001)；乳香精油(B)和白茶精油(C)不能抑制TNF-α的生成；玉兰叶精油(D)的作用微弱。含有青蒿精油(A)的复方精油组合均能够抑制LPS诱导下巨噬细胞的TNF-α生成，尤以复方精油(A+B+C+D)效果最显著，抑制率为44.22％。精油组合的TNF-α生成抑制率排序为：A+B+C+D>A+B+C>A+D＞A+C>A+B。

表3不同精油对LPS诱导的巨噬细胞TNF-α生成的影响

3.3.4精油对炎症状态的巨噬细胞IL-6生成的影响

各组细胞上清液IL-6含量检测结果如表4所示，在250μg/mL的浓度下，青蒿精油(A)、乳香精油(B)、白茶精油(C)和玉兰叶精油(D)均对IL-6的生成有抑制作用，其中青蒿精油(A)、乳香精油(B)作用较为明显，抑制率在40％以上(P<0.001)，白茶精油(B)和玉兰叶精油(D)的作用较弱。复方精油组合均能够提升青蒿精油(A)对IL-6生成的抑制作用。复方精油(A+B+C+D)效果最显著，减少了73.46％的IL-6产生。精油组合的IL-6生成抑制率排序为：A+B+C+D>A+B+C>A+B＞A+C>A+D。

表4不同精油对LSP诱导的巨噬细胞炎症模型IL-6释放水平影响

巨噬细胞NO释放、巨噬细胞TNF-α、巨噬细胞IL-6是炎症反应和变态反应中的常用检测指标，其抑制率能提示抗炎抗过敏的效果。从上述实验结果可以得出，按照君臣佐使理论的精油组合(A+B+C+D)在抗炎舒敏功效方面优于单个精油和其他组合，能够最大程度上发挥精油的抗炎舒敏作用。上述精油应用于化妆品时，应当按照设定的比例(ABCD的质量比为4:3:1:2)复配得到复方精油后再制备成化妆品制剂。

【实施例4】精油对二甲苯诱导的小鼠急性耳肿胀模型影响

一、实验材料

4.1.1实验动物

昆明种小鼠，雄性，体重20-23g，购自上海杰斯捷实验动物有限公司，许可证号码：SCXK(沪)2018-0004

4.1.2试药与试剂

配方精油、地松樟薄乳膏(批号21060501，上海市皮肤病医院)二甲苯(批号20210418，购自上海凌峰化学试剂有限公司)0、TNF-α及IgE酶联免疫吸附测定(ELISA)检定试剂盒。

4.1.3仪器与设备

正置白光拍照显微镜(型号Eclipse Ci-L购自Nikon(Japan))。

二、实验方法

4.2.1耳肿胀率及IgE、TNF-α水平检测

25g左右昆明种雄性小鼠，随机分6组，每组7只。分为空白组、模型组、复方精油高中低组及阳性对照组。连续涂抹给药5天(1次/天)，最后一次给药1h后用二甲苯20μL均匀涂于小鼠右耳廓致炎，左耳对照，致炎30min后颈椎脱臼处死动物，沿耳廓基线剪下两耳并称量，以耳片肿胀度(两耳片质量之差)作为炎症指标，计算各组耳肿胀率。ELISA法检测血清中IgE、TNF-α表达水平。

耳片肿胀率＝(致炎右耳片质量－对照左耳片质量)/对照左耳片质量*100％

4.2.2病理组织检测

组织石蜡包埋切片实验步骤

①取材：将小鼠耳组织在4％多聚甲醛固定24h以上，并修整目标组织，注意需在通风橱进行，修整好后将组织放于脱水盒内，并贴上标签。

②脱水：按照以下脱水顺序及浓度对脱水盒进行脱水处理。

75％酒精4h-85％酒精2h-90％酒精2h-95％酒精1h-无水乙醇I 30min-无水乙醇II 30min-醇苯5-10min-二甲苯I5-10min-二甲苯II 5-10min-蜡I1h-蜡II 1h-蜡III 1h。

③包埋并切片：将蜡融化，放入包埋框内。待蜡凝固将组织放入包埋框进行包埋并标上标签。蜡凝固后将蜡块从包埋框中取出并修整蜡块。修整好后，于石蜡切片机上将蜡块切片，片厚4μm。让切片于摊片机40℃温水上漂浮，使组织展平然后用载玻片捞起，并放进60℃烘箱内使水烤干蜡烤化，之后取出常温保存备用。

4.2.3 HE染色实验步骤

①石蜡切片脱蜡：从上往下依次将切片放入:依次将切片放入二甲苯Ⅰ20min-二甲苯Ⅱ20min-无水乙醇Ⅰ10min-无水乙醇Ⅱ10min-95％酒精5min-90％酒精5min-80％酒精5min-70％酒精5min-蒸馏水洗。

②苏木素染细胞核：用Harris苏木素将切片染3-8min后用自来水洗，接着用1％的盐酸酒精分化数秒，再次用自来水冲洗，最后用0.6％氨水返蓝，流水冲洗。

③伊红染细胞质：切片入伊红染液中染色1-3min。

④脱水封片：将切片依次放入95％酒精I 5min-95％酒精II 5min-无水乙醇Ⅰ5min-无水乙醇Ⅱ5min-二甲苯Ⅰ5min-二甲苯Ⅱ5min中脱水透明，将切片从二甲苯拿出来稍晾干，中性树胶封片。

⑤图像采集：在光学显微镜下观察并描述，对应主要描述部位进行拍照，炎症细胞计数。

三、实验结果

4.3.1耳肿胀率

结果表明(表5)，与空白组相比，模型组小鼠耳肿胀率高达107.37％(P<0.001)。ABCD精油对过敏小鼠的耳肿胀有缓解作用，复方精油组合(A+B，A+C，A+D，A+B+C，A+B+C+D)可以增强精油对过敏小鼠的耳肿胀缓解作用，尤以A+B+C+D组合的效果最好，缓解作用排序为：A+B+C+D＞A+B+C＞A+D＞A+B＞A+C。

表5不同剂量复方精油对二甲苯诱导的耳肿胀模型影响

4.3.2 HE染色分析结果

使用Eclipse Ci-L拍照显微镜选取组织的目的区域进行200倍成像，成像时尽量让组织充满整个视野，保证每张照片的背景光一致。成像完成后分别计数每张切片3个视野中炎症细胞数量，并计算平均值。炎症细胞计算结果表明(表6)，复方精油组合的高中低3个剂量均能减少炎症细胞浸润，中低剂量虽然能够减少炎症细胞浸润，但差异没有统计学意义(P>0.05)。复方精油高剂量组炎症细胞显著减少了炎症细胞浸润(P＜0.001)，效果优于含激素地塞米松的地松樟薄乳膏。

表6精油对二甲苯诱导的小鼠炎症模型HE染色炎症细胞分析结果

注：***P<0.001。

经HE染色后，对每块切片随机选取一个视野，对表皮厚度测量五次，计算平均值。结果显示(表7)，经二甲苯刺激后，模型组的表皮增厚，经给药后表皮厚度均有所降低。其中复方精油高剂量组及阳性对照组与模型组相比，差异具有统计学意义。说明复方精油高剂量组能够有效减少二甲苯诱导所致的表皮增厚(P<0.05)。

表7不同剂量复方精油对二甲苯诱导的小鼠炎症模型表皮厚度影响结果(n＝7)

注：*P<0.05。

4.3.3 TNF-α及IgE含量测定

血清TNF-α、IgE含量过敏状态检测的常用指标，其含量变化提示抗过敏作用。

从TNF-α检测结果可以看出(表8)，精油A、B、C、D均能降低小鼠血清中TNF-α水平，作用效果A＞C≈B≈D。复方精油组合能够增加精油的降TNF-α作用。

IgE含量测定显示(表9)，精油A、B、C、D均能降低小鼠血清IgE水平，精油组合物和复方精油增强了这一作用，尤以A+B+C+D组合的作用最为明显。

表8精油对二甲苯诱导的小鼠耳肿胀模型血清TNF-α影响

表9精油对二甲苯诱导的小鼠耳肿胀模型血清IgE影响

【实施例5】复方精油对小鼠皮肤机械屏障障碍模型影响

一、实验材料

5.1.1实验动物

昆明种小鼠，雄性，体重20-23g，购自上海杰斯捷实验动物有限公司，许可证号码：SCXK(沪)2018-0004

5.1.2试药与试剂

配方精油高中低剂量组、尿素乳膏(批号21061601，上海市皮肤病医院)、神经酰胺试剂盒(Lot May 2021，购自江莱生物)。

5.1.3仪器与设备

皮肤测定仪、酶标分析仪Rayto RT-6100。

二、实验方法

取昆明种小鼠30只，雄性，分为6组，每组5只。除正常组外，其余各组小鼠采用胶带法建立皮肤机械屏障受损模型。具体方法如下：用剃刀将每组小鼠背部毛发剔除，剔除面积为2*3cm²，用脱毛膏进一步脱毛。将医用胶带紧贴于剃去被毛的小鼠背部皮肤，随即快速撕下。每只小鼠每天进行2次造模刺激，每次刺激均重复5次“胶带粘贴－撕下”的流程，2次造模刺激的间隔时间约为8h，造模过程连续3d。造模后，各组小鼠给予相应精油干预，连续5d。具体方法如下将药膏涂抹在小鼠皮肤机械屏障损伤处，并轻3min至吸收。末次给药后，观察受损皮肤组织的状况。

三、实验结果

5.3.1皮肤含水量、油相比例及弹力测定

从表结10的结果可以看出，复方精油(A+B+C+D)低中高3个剂量组的皮肤含水量均有所改善(P<0.05)，特别是高剂量组的改善效果优于地松樟薄乳膏；在皮肤油相比例改善方面，复方精油(A+B+C+D)的高剂量组改善作用较为明显，效果优于地松樟薄乳膏，中剂量组的效果与地松樟薄乳膏相当；在皮肤弹力改善上，复方精油(A+B+C+D)低中高3个剂量组的作用均比较明显，改善作用略差于地松樟薄乳膏。

表10复方精油对小鼠皮肤机械屏障障碍模型含水量、油相比例及弹力影响(n＝5)

皮肤含水量、油相比例及弹力是非侵入性测定皮肤屏障功能的指标，能反应皮肤屏障修复功效和保湿功效。

5.3.2皮肤神经酰胺含量

取各组皮损处皮肤制备匀浆，用ELISA法检测皮肤匀浆中的神经酰胺含量。实验结果显示(表11)，复方精油低中高剂量组均能升高皮肤组织神经酰胺含量(高剂量组P<0.001，中剂量组P<0.05)，中高剂量组的功效优于地松樟薄乳膏。

表11复方精油对小鼠皮肤机械屏障障碍模型神经酰胺含量影响(n＝5)

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神经酰胺作为皮肤角质层细胞间脂质的主要成分，不仅在鞘磷脂途径中作为第二信使分子，还对表皮角质层形成过程发挥重要作用，具有维持皮肤屏障、保湿、抗衰老、美白和疾病治疗等作用。

5.3.3皮损变化和表皮厚度

损伤皮肤部位的每张HE染色切片的不同部位测量五次，计算平均表皮厚度。结果显示(表12，图1，图2)，低中高剂量复方精油均能够显著改善表皮增厚、红斑、血痂等现象，中高剂量复方精油组在改善表皮增厚方面较为明显(P<0.05)，且效果与地松樟薄乳膏相当(P>0.05)。

表12不同剂量复方精油对机械屏障障碍模型小鼠表皮厚度影响(n＝5)

注：^*P<0.05。

上述结果可以得出结论：本发明的复方精油E具有促进小鼠皮肤机械损伤后修复的功效，在低剂量下即可发挥作用，改善作用呈剂量依赖性。中高剂量复方精油的对机械损伤皮肤的修复作用与地塞米松激素制剂相当，甚至优于后者。

【实施例6】复方精油对HaCat细胞划痕修复的影响

一、实验材料

6.1.1实验细胞与动物

Hacat细胞

6.1.2试药与试剂

复方精油、DMEM高糖培养基、胰酶、胎牛血清、PBS缓冲液、CCK8检测试剂盒。

6.1.3仪器与设备

生物安全柜、细胞恒温培养箱、倒置显微镜、全自动酶标仪、离心机、水浴锅、-80度冰箱、-20度冰箱、4度冰箱、96孔板、6孔板、一次性吸管、1000μL、200μL、10μL等不同规格的枪及枪头、50mL、15mL及2mL离心管、细胞插件。

二、实验方法

6.2.1 Hacat细胞培养、传代

新购买的Hacat细胞培养箱适应性培养2小时后及时换上新鲜培养基，继续培养。当细胞生长至对数生长期后，弃去培养基，用PBS洗涤3次，加入1mL胰酶，在孵箱中放置5min之后在倒置显微镜下观察，若细胞间隙变大，细胞变圆，加入2mL培养基终止消化，将细胞混悬液吸入到15mL离心管中。1000rpm，室温离心5min，弃上清，加入3mL完全培养基吹打混匀，均分至10cm细胞培养皿中，每皿加10mL DMEM培养基，在37℃，5％ CO₂饱和湿度的孵箱中继续培养。

6.2.2 CCK8法检测精油对角质形成细胞活力的影响

将Hacat细胞以5×10⁴个/mL的密度，100μl/孔接种于96孔板，于孵箱中培养，待细胞密度约为80％，加入不同浓度的配方精油及单方精油孵育24h。以1:9将CCK8用培养液稀释，吸弃96孔板内的液体，每孔加入100μl稀释后的CCK8溶液。培养箱内孵育30min后取出，用酶标仪在450nm处检测每个孔的吸光度值。

6.2.3检测精油对角质形成细胞迁移的影响

细胞划痕实验是一种常用的研究细胞迁移的体外实验方法，在一定程度上模拟了体内细胞迁移的过程，具体操作步骤如下：(1)24孔板每孔放置细胞插件(2)将Hacat细胞以5×10⁵个/mL接种于细胞插件中，细胞生长到80-90％融合时，弃去培养基，加药孵育(含1％血清的培养基配制)。(3)不同时间点在倒置显微镜下观察并拍照，用软件Image J计算划痕损伤面积愈合率。(4)迁移率＝(原面积－划痕后面积)/原面积×100％；相对迁移率＝(给药组迁移率-空白组迁移率)/空白组迁移率。

三、实验结果

6.3.1 CCK8法检测精油对角质形成细胞活力测试结果

结果显示(表13)，1000μg/mL、500μg/mL、250μg/mL浓度的复方精油(A+B+C+D)对角质形成细胞生长无显著影响。

表13 CCK8法检测复方精油对HaCat细胞活力的影响

皮肤角质形成细胞的细胞活力OD值代表细胞活力和屏障修复能力。精油作用于皮肤角质形成细胞后，使用CCK-8法检测获得OD值高，说明细胞活性高、细胞增殖能力强，提示精油造成的细胞毒性弱、屏障修复能力强。

6.3.2细胞划痕实验结果

从表14、图3和图4可以看出，精油A、B可以通过诱导角质形成细胞的迁移来促进细胞划痕的愈合，相对空白组的迁移率分别为26.8％和17.6％，精油C、D对细胞划痕的愈合基本没有作用。复方精油组合能够增加精油的促细胞划痕愈合作用，作用排序为A+B+C+D＞A+B+C＞A+B＞A+C＞A+D。

表14精油对角质形成细胞划痕愈合的影响

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细胞划痕实验是简便快捷的测定细胞迁移运动和修复能力的方法，类似体外伤口愈合模型。细胞划痕实验的迁移率高，说明角质形成细胞迁移与修复能力强，屏障修复能力强。

上述实验结果可以看出，本发明复方精油可以显著提高对角质形成细胞迁移的作用，这一作用与皮肤修复功效密切相关。

【实施例7】复方精油治疗慢性湿疹的临床试验

一、病例来源与临床分组

样本量计算依据：本课题是两独立样本均数比较，根据前期预实验结果，按照样本量计算公式可得：

在n1＝n2时，

α＝0.05，β＝0.20，

μβ＝μ0.2＝0.84

σ＝1.04，δ＝1.02

n1＝n2≈30

所以本试验样本量为60例。

病例来源

本次临床研究共计观察了60例2022年7月至2022年9月就诊于上海中医药大学附属岳阳中西医结合医院皮肤科门诊并且符合入组标准的18-65岁慢性湿疹患者。

临床分组

依据SPSS 21.0 for Windows软件生成的随机数字表，按就诊顺序将60例符合入组标准的患者随机分为精油治疗组(研究组)30例、尤卓尔组(对照组)30例。

二、诊断标准

慢性湿疹西医诊断标准，参照《中国临床皮肤病学(2017)》慢性湿疹的西医诊断标准，慢性湿疹表现为患处皮损浸润增厚，伴有一定程度的色素沉着，表面粗糙，可覆少量糠秕样鳞屑，有不同程度的苔藓样变。

三、病例标准

纳入标准：

A.符合《中国临床皮肤病学(2017)》慢性湿疹的西医诊断标准；

B.年龄为18～65周岁。④治疗前皮损面积＜10％体表面积。

排除标准：

A.皮损合并严重感染者；

B.心、肝、肾功能严重损害及免疫功能严重低下者；

C.妊娠期或哺乳期女性；

D.对本临床研究的中西医药物成分过敏者；

E.存在内分泌系统疾病患病史及长期系统使用皮质类固醇激素者。

脱落标准：

A.实验过程中，受试者依从性差，影响有效性和安全性判定者；

B.发生了严重的不良事件、并发症和以及特殊生理变化，不适宜继续接受试验，并将此计入不良反应；

C.实验过程中自行退出者；

D.因各种原因疗程未结束退出试验、失访或死亡病例；

E.资料不全，影响有效性和安全性判断者；

F.在非规定范围内联合使用其他药品，尤其是对实验用药影响较大的药物，对有效性和安全性判定有影响。

四、试验终止标准：

A.进入试验后，发现符合排除标准的病例(如实验室检查不支持)应中止试验；

B.因发生不良反应退出试验者(不计入终疗效，但应计入不良反应评价)；

C.违反试验方案者。

五、治疗方案

分组

1、研究组

复方精油(原精油稀释4倍)

使用方法：复方精油外涂患处，每天二次。

2、对照组

尤卓尔霜由天津金耀药业有限公司生产

使用方法：尤卓尔霜外涂患处，每天二次。

观察周期、评价时点及随访

观察周期

疗程：6周

评价时点

分别在就诊当日、治疗后2周、4周、6周根据就诊时的临床表现进行皮损的评分，一般以皮损愈合作为最终的评价点，若皮损未愈者以治疗后第6周作为最终评价点。

评价内容

详细记录患者皮损红斑、丘疱疹、浸润糜烂、苔癣化、渗出/结痂、皮损面积大小计算面积及严重程度评分(EASI评分)、皮肤病生活质量调查表评分(DLQI评分)及不良反应。

观察指标

一般情况

患者及监护人姓名、联系电话、家庭住址、性别、年龄、病程、诱发因素、曾使用药物、既往史等一般性临床资料。

生物学指标

人口学特征：性别，年龄，身高，体重；

生命体征：体温，静息心率，呼吸。

疗效评估指标

EASI评分

EASI评分是根据不同部位皮损症状严重程度所占面积的大小再结合患者各部位面积占全身面积的比例的综合积分。

临床表现评分

主要为四项：红斑(erythema，E)、浸润(水肿)或丘疹(induration(edema)/population，I)、表皮剥脱(excoriation，Ex)、苔藓样变(lichenification，L)。每一临床表现的严重程度以0～3分计分：0＝无，1＝轻，2＝中，3＝重。各种症状分值之间可记半级分，即0.5。(表1)

表15皮损严重程度

皮损面积大小评分

将全身分为四部分，即头颈(H)、上肢(UL)、躯干(T)、下肢(LL)用患者手掌为1％估算，将四部分的皮损面积换算成所占该部位的比例计分，分值为0～6:即0为无皮疹，1为＜10％，2为10％～19％，3为20％～49％，4为50％～69％，5为70％～89％，6为90％～100％。(表2)

表16皮损占各部位表面积分值

EASI评分总分计算

根据患者身体各部分占全身的比例不同，各部分乘以相应的百分比系数，各部位分值相加即为EASI皮损症状严重程度的总分。

表17湿疹面积及严重度指数评分

DLQI评分

即皮肤病生活质量指数调查表，用以明确湿疹患者的生活质量指数。

表18皮肤生活质量问卷(DLQI量表)

备注:计分原则:非常多3分；许多2分；一点1分；完全没有0分；无关0分；未回答0分；问题7回答“是”3分。满分为30分,测量得分越高,生活质量越差。

临床疗效评价

愈显率＝(痊愈例数+显效例数)/总例数

总有效率＝(痊愈例数+显效例数+有效例数)/总例数

疗效判定时间为治疗后4周。

具体计算公式：[(治疗前EASI积分－治疗后EASI积分)/治疗前积分]×100％。(表7)

表19疗效评价标准

安全性评价指标

不良事件是指病例在本临床试验中，自签署患者知情同意书并入选参加试验，从试验开始至最后一次随访之间，发生的任何不利医疗事件，该不利事件无论是否与上述使用的药物有因果关系。

不良事件的记录

临床研究期间对治疗患者所可能出现的不良反应，都应如实详细地进行记录，包括该不良事件的发生时间、严重程度、持续时间、采取的有效措施和转归。若受试者感觉身体不适，可暂停或中止试验。

严重程度判断

轻度：轻度的不适，受试者可耐受，不影响治疗，不需要特殊处理，对患者康复无影响；

中度：中度的不适，受试者表示难以忍受，需要特殊处理，对受试者康复有影响；

重度：重度的不适，可能危及受试者生命，导致死亡或残疾，需立即做紧急处理。

与药物因果关系判断指标

开始用药时间与可疑不良反应出现有无合理的先后关系；

可疑不良反应是否符合该药品已知的不良反应类型；

可疑不良反应能否通过合并药作用、病人的临床状况或者其他疗法的影响来解释；

停药或减量后，可疑不良反应是否消失或减轻；

再次接触可疑药品后，是否重新出现同样的反应。

统计学处理

数理统计方法用SPSS 21.0 for Windows统计软件对临床数据资料进行整理。若数据服从正态分布，则计量资料以±S表示，统计方法采用单因素方差分析，按α＝0.05标准进行检验，并用Levene法进行方差齐性检验，若方差齐，两两比较则采用LSD法；若是方差不齐，两两则比较采用Tamhane法；计数资料用率表示，若是偏态分布资料则用中位数M表示；两组计量资料若是正态分布且方差齐性，则采用两独立样本资料t检验，配对资料t检验，非正态分布资料应采用非参数秩和检验，分类资料应采用χ2检验。

六、研究结果

一般资料分析

选择岳阳医院皮肤科2022年7月至2022年9就诊且符合此次临床研究入组标准的60例慢性湿疹患者。将入选的60例患者随机分为研究u组和对照组，各30例，其中脱落0例。共观察记录完成60例慢性湿疹患者。研究组：男15例，女15例；年龄19-64岁，平均41.93±11.51岁；病程平均39.80月。对照组：男15例，女15例；年龄24-62岁，平均41.90±10.62岁；病程平均39.83月。两组患者的性别、年龄、病程及治疗前EASI评分及DLQI评分差异无统计学意义，具有可比性。患者均签署知情同意书。

研究结果分析

临床疗效见表20。研究组和对照组患者的总有效率均为100％，差异无统计学意义(P>0.05)。愈显率分别为43.33％和30.00％，差异无统计学意义(P>0.05)。

表20两组患者治疗前后临床疗效比较

注：愈显率＝(痊愈例数+显效例数)/总例数

总有效率＝(痊愈例数+显效例数+有效例数)/总例数

经chi-square test检验，研究组、对照组的愈显率比较，卡方值＝0.167，P＝0.683，P＞0.05，两组之间的愈显率比较无显著差异；研究组、对照组的总有效率比较，卡方值＝1.310，P＝0.519，P>0.05，两组的总有效率比较无显著性差异。但是愈显率和总有效率的数值上研究组要略优于对照组。因此，分析可得，在总的趋势上，研究组的疗效要略优于对照组。

EASI评分比较见表21。

表21两组患者治疗前后EASI评分分析(±S)

EASI评分治疗前，两组经配对t检验分析，t＝0.22，P＝0.983，P＞0.05，两者在治疗前的EASI评分无统计学差异，说明两组在治疗前的临床症状相当，可进行后续的比较。

研究组治疗前后EASI评分经配对t检验分析，t＝18.495，P＝0.000，P<0.05,提示研究组患者外用复方精油后EASI评分与治疗前相比有统计学差异，说明复方精油治疗慢性湿疹能改善患者的红斑、水肿/丘疹、表皮剥脱、苔藓化的临床症状。

对照组治疗前后EASI评分经配对t检验分析，t＝-4.194，P＝0.000，P<0.05,提示对照组患者外用丁酸氢化考的松霜后EASI评分与治疗前相比有统计学差异，说明丁酸氢化考的松霜外用治疗慢性湿疹患者能显著改善其红斑、水肿/丘疹、表皮剥脱、苔藓化的临床症状。

两组EASI评分治疗前后差值经配对t检验分析，t＝1.685，P＝0.097，P>0.05,提示两组患者EASI评分治疗前后差值无明显统计学差异，说明复方精油与丁酸氢化考的松治疗慢性湿疹在临床症状的改善程度相当。

DLQI评分比较见表22

表22两组患者治疗前后DLQI评分分析

DLQI评分治疗前，两组经配对t检验分析，t＝0.069，P＝0.945,P＞0.05，两者在治疗前的DLQI评分无统计学差异，说明两组在治疗前的DLQI程度相当。

研究组治疗前后DLQI评分经配对t检验分析，t＝15.214，P＝0.000，P<0.05,提示治疗组患者外用复方精油后DLQI评分与治疗前相比有显著性差异，说明复方精油治疗慢性湿疹炎能显著提高患者的生活质量。

对照组治疗前后DLQI评分经配对t检验分析，t＝13.598，P＝0.000，P<0.05,提示对照组患者外用丁酸氢化考的松后DLQI评分与治疗前相比有显著性差异，说明患者外用丁酸氢化考的松治疗慢性湿疹能显著提高患者的生活质量。

两组DFI评分治疗前后差值经配对t检验分析，t＝0.929，P＝0.357，P＞0.05,提示两组患者DLQI评分差值没有统计学差异，说明复方精油外用治疗慢性湿疹在提高患者生活质量上与丁酸氢化考的松霜无显著差异。

不良反应

两组患者治疗期间均无不良反应发生，不良事件发生率为0％。

综合以上实验说明，本发明复方精油具有抗炎、抗过敏、保湿、屏障修复、改善湿疹的红斑、水肿/丘疹、表皮剥脱、苔藓化的功效，可用于治疗皮肤疾病，尤其用于治疗慢性湿疹、改善皮肤敏感状态和化学物理因素导致的皮肤屏障损伤。

Claims (5)

1.一种具有皮肤保护作用的复方精油，其特征在于，由以下组分组成：青蒿精油、乳香精油、白茶精油和玉兰叶精油；所述青蒿精油、乳香精油、白茶精油、玉兰叶精油的体积比为4：3：1：2；

所述青蒿精油、乳香精油、玉兰叶精油分别是以菊科植物黄花蒿(Artemisia annuaL.)、乳香(Boswellia carterii)和玉兰叶(Michelia alba)为原料，通过水蒸气蒸馏取得的挥发油；白茶精油是以山茶科植物毛白茶(Camellia sinensis(L.)O.Ktze)为原料，通过超临界二氧化碳萃取和分子蒸馏提取得到的挥发油；

所述复方精油是通过以下方法制备而得：

(1)制备所述青蒿精油

(1.1)采集新鲜黄花蒿(Artemisia annua L.)全草，除去残茎及无用部位，将选好的叶子和花蕾洗净，滤干水分，置于电热恒温干燥箱中进行干燥，温度控制在60℃以下，干燥时间为3h；

(1.2)用切割机将干燥黄花蒿切成4-6mm碎段，便于精油分子的挥发；

(1.3)将粉粹的黄花蒿叶置于蒸馏内槽中，加入等量的屈臣氏蒸馏水，注于外蒸馏槽中，并将蒸馏槽置放于水槽之上，密封外蒸馏槽，浸泡1.5h后进行蒸馏；萃取温度90℃，冷凝管温度15～25℃，蒸馏时间1.5h，得精油纯露混合液,用分离器分离，获得所述青蒿精油；

(2)制备所述乳香精油

(2.1)将乳香(Boswellia carterii)树脂块，碎过10目筛的粗粉，浸泡于等同于乳香重量的三倍屈臣氏蒸馏水中1h；

(2.2)过滤，将浸泡后的乳香置入蒸馏内槽中，将等同于乳香容积的屈臣氏蒸馏水注于外蒸馏槽中，并将蒸馏槽置放于水槽之上，密封外蒸馏槽进行蒸馏，萃取温度90～96℃，冷凝管温度15～25℃，蒸馏时间4h，得乳香精油和纯露，分离，获得所述乳香精油；

(3)制备所述白茶精油

(3.1)将新鲜采摘的白茶(Camellia sinensis(L.)O.Ktze)嫩叶整齐摊开，在日光下晾晒，夜晚在室内阴凉处晾干，连续3天，之后置入烘干机110℃干燥；

(3.2)然后将干燥后的白茶叶片碎过10～20目筛的粗粉，用砂布袋装好已秤量好的茶叶粗粉，并装入萃取器中，封好顶盖；

(3.3)开启恒温槽电源；打开二氧化碳钢瓶阀门，使气体沿管线经过干燥器，冷却冷凝器，柱塞泵，进入增压缓冲瓶；待增压缓冲瓶的压力大大超过实验压力后，打开阀门V1，使萃取器升压到实验压力，关阀门V1，让茶叶预浸润10min，超临界CO2流体萃取；CO2流体流速1L/min，萃取温度50℃，萃取压力25MPa，分离温度50℃，分离压力4.5～5.5MPa，萃取时间1.5～2.5h，获得所述白茶精油；

(4)制备所述玉兰叶精油

(4.1)采集新鲜玉兰叶(Michelia alba)，除去残茎及无用部位，洗净，滤干水分，置于电热恒温干燥箱中进行干燥，温度控制40℃，烘干；

(4.2)将烘干后的所述玉兰叶置于蒸馏内槽中，加入等量的屈臣氏蒸馏水，注于外蒸馏槽中，并将蒸馏槽置放于水槽之上，密封外蒸馏槽，浸泡1h后开始蒸馏；萃取温度90-96℃，冷凝管温度15～25℃，蒸馏时间60min，获得精油纯露混合液；

(4.3)用分离器分离所述精油纯露混合液，获得所述玉兰叶精油；

(5)制备所述复方精油

将步骤(1)～(4)获得的精油或者商售的青蒿精油、乳香精油、白茶精油和玉兰叶精油按照体积比4：3：1：2均匀混合，即获得所述复方精油。

2.根据权利要求1所述的复方精油，其特征在于，所述皮肤保护作用为缓解皮肤过敏、炎症和修复皮肤屏障。

3.一种护肤品组合物，含有权利要求1或者2任意一项所述的复方精油。

4.权利要求1所述的复方精油或权利要求3所述的护肤品组合物在制备缓解皮肤过敏、炎症和修复皮肤屏障的产品中的用途。

5.如权利要求4所述的用途，其中，所述复方精油的剂量为体积比0.1％～50％。