CN111100932A - 一种与胆固醇代谢相关的物质在评估微粒对皮肤影响中的用途及方法 - Google Patents

一种与胆固醇代谢相关的物质在评估微粒对皮肤影响中的用途及方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供与胆固醇代谢相关的物质在评估微粒对皮肤影响中的用途以及一种评价或者筛选活性物质对大气中的微粒物质诱导的皮肤影响的方法，该方法包括：用待测活性物质和微粒来处理皮肤，如果皮肤中的胆固醇代谢线路中的相关物质发生变化，依据变化来判断待测活性物质对皮肤的影响。利用这样的用途和方法可以筛选出对于微粒造成的皮肤不利影响具有明显改善作用的物质，这些物质可以应用于例如具有抗污染、抗雾霾作用的个人护理品产品当中。

Description

一种与胆固醇代谢相关的物质在评估微粒对皮肤影响中的用 途及方法
技术领域
本发明涉及一种用于评价微粒对皮肤或者毛发影响的生物标记物质，另一方面，特别是，属于用于评价PM2.5对皮肤或者毛发影响的生物标记物质以及评估方法，也属于影响皮肤中角质层中胆固醇代谢的物质或者该物质的新用途。
背景技术
下面的背景技术用于帮助读者理解本发明，而不能被认为是现有技术。
伴随着工业全球化，大气污染物已经造成严重的人类健康问题。世界卫生组织在空气质量指南中确定了四种主要的空气污染物，即颗粒物，地面臭氧，二氧化氮和二氧化硫。在所有这些物质中，PM2.5是一种微小颗粒物质，其空气动力学直径小于或等于2.5μm。PM2.5作为空气污染物的主要成分，对心血管系统，呼吸系统和皮肤构成威胁。此外，PM2.5具有较大的比表面积，可吸附化学污染物和金属离子。研究表明，长时间暴露在空气中的颗粒物质会激活皮肤细胞表面的芳香烃受体(AhR)，导致外在皮肤老化，皱纹和色素沉着。此外，大气污染物还会诱发和加剧特应性皮炎等皮肤病。
角质层(SC)具有类似“砖和砂浆”的结构。“砖”指的富含角蛋白的角质细胞，而“砂浆”是指角质细胞间填充的脂质成分，包括游离脂肪酸，神经酰胺和胆固醇。这三种脂质成分以高度有序的三维结构堆叠，将角质细胞“粘合”在一起，形成强大的皮肤屏障。皮肤屏障的功能依赖于角质层的完整性，尤其是角质层中脂质的组成。Di Nardo A等科学家发现特应性皮炎患者的皮肤屏障受损，角质层中的神经酰胺减少，胆固醇增加，神经酰胺/胆固醇比例降低。
但是，对于大气中的微粒，特别是直径小于或等于2.5μm的PM2.5对于皮肤角质层的影响如何，以及如何改善和提高皮肤角质层的屏障是有必要解决的问题。
发明内容
本发明第一方面，提供胆固醇代谢路线中的相关物质在用于评价微粒对皮肤影响的新用途。在一些方式中，这些物质是直接影响胆固醇代谢的物质或者将间接影响胆固醇含量的物质，这些物质参于胆固醇合成和代谢。
所谓“参与”是这些物质可以影响胆固醇的合成或者代谢，这些物质可以是涉及具体基因。基因的转录、翻译水平，或者因为基因的表达从而引起酶、底物、前体物质的量或者活性的变化，这些变化是由微粒与皮肤作用而引起的。在一些方式中，胆固醇的代谢是全部或者部分发生在皮肤的角质层中。
在一些方式中，这些物质包括胆固醇代谢路线中的各个酶，或者也包括在这些酶的作用下各个阶段或者步骤中合成的直接物质，或者两者中的一种或者几种。这些直接物质包括，但是不限于胆固醇、角鲨烯等物质。所谓的代谢路线的直接物质实质从胆固醇代谢起始开始，在这些酶的作用，一些中间物质的合成的量的变化，例如乙酸盐、柠檬酸盐、乙酰辅酶A、乙酰乙酰辅酶A、β-羟基-β-甲基戊二酸单酰CoA、甲羟戊酸、5-磷酸甲羟戊酸、5-焦磷酸甲羟戊酸、异戊二烯焦磷酸、二甲基丙烯焦磷酸、法尼基焦磷酸、2,3-环氧化鲨烯、角鲨烯、羊毛甾醇低密度脂蛋白、低密度脂蛋白受体等这些直接物质的变化都可以用来表示角质层与微粒对皮肤的危害之间的关系。
当然，在另外的一些方式中，也可是一些参与胆固醇代谢路线中的间接物质，例如所上列举的各种酶，这些酶的合成直接影响上游物质的合成或者含量，这些酶可以是ATP柠檬酸裂解酶、3-羟基-3-甲基戊二酰-COA还原酶、3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶合酶1、甲羟戊酸二硫酸脱羧酶、甲基甾醇单甲加氧酶1，合金欢基- 二硫酸合金欢基转移酶1、角鲨烯环氧酶、羊毛甾醇合成酶、硬脂酰辅酶A去饱和酶、脂肪酸合成酶中的一种或者几种。
当然，在一些方式中，也可以是直接物质中的一种或者几种，或者间接物质中的一种或者几种，或者直接物质和间接物质联合，来评估微粒对皮肤角质层的影响。胆固醇的代谢路线是公知常识，但是，现有技术没有把微粒和胆固醇代谢路线之间相直接关联，而本发明发现胆固醇的代谢路线直接被微粒影响而生产关联。在一些方式中，胆固醇的代谢路线中的胆固醇或者角鲨烯作为评估微粒物质对皮肤角质层影响的用途。
本发明的第二方面，本发明提供一种评价活性物质对大气中的微粒物质，例如PM2.5，诱导的皮肤影响的方法；或者，提供一种筛活性物质对大气中的微粒物质，例如PM2.5，对皮肤影响的方法。在一些方式中，评价或者筛选大气中的微粒物质，例如PM2.5，对角质层中胆固醇代谢影响的方法。这里所谓的影响一般是指大气环境中有害微粒对皮肤的损伤的不利作用。这种不利的损伤是因为微粒对皮肤角质层中胆固醇代谢路线干扰而引起的。
在一些方式中，而评价或者筛选活性物质，是看这些所谓的活性物质对微粒物质作用于皮肤的不利影响的结果是什么，例如加剧、恶化这种不利作用，或者没有任何作用，或者具有改善、修复有害微粒对皮肤的损伤不利作用，从而向正常皮肤发展。
在一些方式中，活性物质对于微粒造成不利影响具有干预作用，这种干预作用是指对皮肤损伤的加剧以及对皮肤损伤的改善，修复或者治疗等作用。
在一些方式中，这里的方法包括让待测活性物质来处理皮肤，如果皮肤中的胆固醇代谢线路中的相关物质发生变化，依据变化来判断待测活性物质对皮肤的影响。在一些方式中，影响包括让皮肤因为微粒物质，例如PM2.5的作用下损伤加剧或者损伤得以改善，例如损伤减少，或者损伤修复。另一方面，相关物质的变化包括一些物质的增加或者一些物质的减少与损伤的影响相关联或者直接关联。在一些方式中，例如，胆固醇的增加表示活性物质对于皮肤因为微粒物质，例如PM2.5的作用没有改善，相反则具有好的影响，再例如，角鲨烯的增加表示活性物质对于皮肤因为微粒物质，例如PM2.5的作用具有改善作用，相反则没有改善作用，即可能是没有任何作用或者作用相反。通过这样的方法，可以有效筛选出一些活性物质，其可以逆转微粒物质对胆固醇的代谢路线的相反影响。当没有额外活性物质的时候，微粒可以改变胆固醇代谢路线，最终让胆固醇增加而高于正常水平，当施加额外活性物质的时候，可以变胆固醇代谢路线，最终让胆固醇恢复到正常水平，这类物质为有效活性物质。当然，那些不影响因为微粒作用皮肤而改变胆固醇的合成路线方向的物质可以认为是无效的活性物质。可选择的，也可以鉴别或者筛选出一类物质，该类物质作用与皮肤，可以改变或者影响胆固醇的合成路线，最终让胆固醇增加，这类物质为有害活性物质。
在一些方式中，让微粒作用皮肤包括皮肤组织、皮肤细胞、角质层细胞、角质层组织、或者三维模型皮肤中的一种或者几种的同时、之前、之后、或者作用过程中，让活性物质作用皮肤、皮肤组织、皮肤细胞、角质层细胞、角质层组织、或者三维模型，检测与胆固醇代谢相关物质的变化，依据变化来筛选有效、无效或者有害活性物质。在一些方式中，最终得到有效的活性物质，这些物质可以用来改善微粒对皮肤的不利影响。在一些方式中，所谓的皮肤组织，皮肤细胞，角质层细胞，角质层组织为体外的组织或者细胞，当然可选的，也可以非体外的皮肤组织，皮肤细胞，角质层细胞，角质层组织。
本发明的第三方面，本发明提供活性物质在用于制备改善因为大气中的微粒物质对皮肤损伤的试剂中的用途。在一些方式中，应用于具有抗污染、抗雾霾作用的个人护理试剂中，例如护肤产品、清洁沐浴产品或者一些护理产品当中。
这些活性物质可以是利用上述方法筛选得到的。这些活性物质包括，但不限于多酚物质。在一些方式中，这些多酚物质可以是任何多酚物质，例如植物提取、动物提取、微生物提取的多酚物质。在一些方式中，多酚物质是通过下调胆固醇合成路线中的HMGCS1、LDLR和FASN而引起了最终的胆固醇含量趋于稳定。
本发明惊讶的发现多酚物质具有新的用途，虽然现有技术人已经有人发现多酚物质具有消炎、抗氧化的作用，但是没有人发现可以改善微粒对皮肤，特别是可以不改变胆固醇代谢途径的影响。
所以，本发明的第四方面，本发明提供多酚物质在用于制备能够改善微粒物质对皮肤造成的不利影响的试剂中的用途。在一些方式中，所述的多酚物质来自植物、微生物发酵产物、哺乳动物。在一些优选的方式中，所述的绿色植物为茶叶。在一些优选的方式中，所述的多酚物质为茶多酚。在一些方式中，所述的微粒大气中的微粒可以，例如PM2.5。在一些方式中，微粒物质对皮肤不利影响包括微粒对皮肤角质层的影响。在一些方式中，所述的微粒对皮肤角质层的影响包括微粒对角质层中胆固醇代谢相关物质的影响。
在一些方式中，所述的与胆固醇代谢相关的物质包括参与胆固醇代谢调控的基因。在一些方式中，所述的基因包括ACLY，ACSS2，HMGCR，HMGCS1， MVD，MSMD1，FDFT1，SQLE，LSS，LDLR或者SCD，FASN，INSIGL中一个或者多个基因。优选的，所述的基因为HMGCS1、LDLR、FASN。
在一些方式中，所述的与胆固醇代谢相关的物质包括参与胆固醇代谢路线中的酶。在一些方式中，所述的酶包括ATP柠檬酸裂解酶、3-羟基-3-甲基戊二酰 -COA还原酶、3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶合酶1、甲羟戊酸二硫酸脱羧酶，甲基甾醇单甲加氧酶1，合金欢基-二硫酸合金欢基转移酶1、角鲨烯环氧酶，羊毛甾醇合成酶、硬脂酰辅酶A去饱和酶或者脂肪酸合成酶中的一种或者几种
在一些方式中，所述的与胆固醇代谢相关的物质包括一些合成胆固醇的起始阶段或者合成步骤中的中的一些底物或者前体物质。在一些方式中，所述的底物或者前体物质包括：乙酸盐、柠檬酸盐、乙酰辅酶A、乙酰乙酰辅酶A、β-羟基-β-甲基戊二酸单酰CoA(HMG-CoA)、甲羟戊酸、5-磷酸甲羟戊酸、5-焦磷酸甲羟戊酸、异戊二烯焦磷酸、二甲基丙烯焦磷酸、法尼基焦磷酸、2,3-环氧化鲨烯、角鲨烯、羊毛甾醇、低密度脂蛋白、低密度脂蛋白受体的一种或者几种。在一些方式中，所述的与胆固醇代谢相关的物质为胆固醇。
通过以上方法筛选的有效物质可以有多种用途，例如可以直接用来涂覆在皮肤表面，起到改善皮肤因为微粒的不利影响。当然，这些和活性物质可以被作为一些具体的形式来制备化妆品试剂，从而改善、防御、逆转皮肤因为微粒的不利影响，从而修复屏障，让皮肤得以受到保护，避免或减轻微粒的危害。在一些优选的方式中，其中，所述的试剂为皮肤护理制剂，这些护肤试剂包括通过前述方法筛选的物质，例如多酚物质。皮肤护理制剂可以以任何一种形态存在，可以为溶液、水剂、悬浮液、面膜、乳液、霜剂、膏状、凝胶、干粉、湿粉、喷剂中的一种。当然，这些试剂可以是哺乳动物或者人的护理产品试剂，例如护肤、清洁、美容、沐浴、洗漱用品中。
除直接与胆固醇代谢相关基因外，我们首次发现之前未见报道的与PM2.5存在直接或者间接关联或者联系的基因还有：S100A8，S100A9，Krt6b，TXNRD1， FGFBP1，MT2A，CD9，AREG，ITGB1，LAMB3，LAMA3。
所以，本发明的第五个方面，S100A8，S100A9，Krt6b，TXNRD1，FGFBP1， MT2A，CD9，AREG，ITGB1，LAMB3或LAMA3基因在PM2.5刺激下的角质细胞中上调。即在PM2.5的作用下，这些基因表达量上调，则导致一些不利的影响，例如如下一些和这些基因上调的不利影响。相反，正如前面所描述的，如果施加一些活性物质可以逆转、改善或者修复这些基因上调带来的不利影响，则该物质具有对应的功能，这种不利影响是大气中微粒颗粒，例如PM2.5直接引起的。例如，当给皮肤，例如角质层细胞施加某些物质的时候，发现S100A8， S100A9基因表达不上调，例如下调后者不变化，则表示该物质可以改善或者修复或者治疗特异性皮炎，而这种皮炎是因为PM2.5直接导致的。
S100A8，S100A9属于S100蛋白家族，在颗粒层、棘层、基底层中均有分布，其主要作用是参与NADPH氧化酶活化相关的宿主防御过程。研究表明，上述两种S100蛋白在表皮伤口修复，分化和应激反应中具有重要作用，它们在正常表皮中以极低水平表达，但在牛皮癣病患皮肤中大量表达，且证明在特异性皮炎皮肤中上调。Krt6b属于角蛋白家族，可以表征角质细胞分裂速率，是伤口愈合的典型标志物，特异性皮炎和鱼鳞病等皮肤疾病中该基因上调。TXNRD1编码硫氧还蛋白还原酶，为典型抗氧化基因，受到Nrf2转录因子的调节。FGFBP1编码成纤维细胞生长因子结合蛋白，参与调节皮肤细胞的分裂，与伤口愈合和血管形成相关。MT2A是一种金属结合蛋白，可促进细胞增殖，已经被发现其表达量变化与皮肤瘢痕形成相关。CD9是一种细胞表面蛋白，通过偶联细胞内信号的传导参与许多生物学过程，比如伤口愈合。AREG双调蛋白在炎性表皮增生和皮脂腺增大过程中发挥作用，并且已有文章报道在PM2.5影响下，其在人类呼吸道上皮细胞中表达量会上调。LAM层黏连蛋白参与伤口愈合和宿主防御。ITG 整合素介导皮肤细胞的黏连，与伤口愈合和炎症反应均密切相关，在皮肤收到机械压力和外界损伤的条件下被激发以维持皮肤的稳态。
有益效果
本发明首次证明皮肤中胆固醇的代谢与微粒具有直接的关系，受到空气中微粒，例如PM2.5的直接影响，可以影响角质层中胆固醇的含量，这种含量无论从基因水平、细胞水平都有直接的证据。利用这样的机理可以筛选出改善微粒对于皮肤的不利影响的活性物质，这些活性物质可以很好的防御微粒的不利影响，也通过基因水平、最终的胆固醇和角鲨烯的含量得以证明。
附图说明
图1为角质细胞MTT测试结果图。可见PM2.5浓度依赖性细胞活力降低以及细胞形态学异常，表现为细胞皱缩，变圆，贴壁细胞减少，图1A是对细胞活性的影响，图1B是对细胞形态学的影响结果图，说明PM2.5对于皮肤细胞有显著性损伤。
图2为PM2.5刺激引发上调的基因归类后按照富集程度排序图，其中前20 个GO条目和途径图，其中，胆固醇代谢是表现最为突出的。
图3为PM2.5刺激引起的关于胆固醇代谢路线中的上调基因的上调程度图，其中是PM2.5处理相对于对照处理而言的上调基因转录水平的比较图。
图4为对比PM2.5刺激组上调的胆固醇代谢相关基因，GTE+PM2.5共同作用组起到了逆转表达趋势从而下调的胆固醇代谢作用相关基因，以及其下调程度图。
图5为在3D皮肤模型下，P2.5和PM2.5+GTE分别处理不同时间对胆固醇和角鲨烯含量的影响图。图5A为PM2.5处理下不同时间胆固醇和角鲨烯含量变化图；图5B为PM2.5+GTE，PM2.5，不同处理下的胆固醇含量变化图。
图6为胆固醇代谢路线中的物质和多个酶基因以及各自对应的合成步骤中的对应图。
详细说明
下面对本发明涉及的结构或这些所使用的技术术语做进一步的说明。这些说明仅仅是采用举例的方式进行说明本发明的方式是如何实现的，并不能对本发明构成任何的限制。
检测
检测表示化验或测试一种物质或材料是否存在，比如，但并不限于此，化学物质、有机化合物、无机化合物、新陈代谢产物、药物或者药物代谢物、有机组织或有机组织的代谢物、核酸、蛋白质或聚合物。另外，检测表示测试物质或材料的数量。
胆固醇代谢路线和微粒的关系
皮肤角质层在外界环境中发挥重要的屏障功能，是最先直接接触环境中污染物质的结构，微粒所吸附的有毒物质会损害皮肤正常的屏障功能。皮肤屏障由角质细胞和角质细胞间脂质成分组成，而胆固醇、神经酰胺、游离脂肪酸是主要的屏障脂质，其比例和类型决定屏障的正常功能，已证明胶带撕拉或者丙酮造成的急性屏障损伤会影响角质层中胆固醇的含量。
本发明小组成员惊讶的发现，大气中的微粒，例如PM2.5，直接对胆固醇的代谢路线具有重要的影响，涉及到胆固醇代谢路线的一些基因，相对正常状态的表达量显著升高，有些基因却显著降低。这些基因可能直接对应引起胆固醇代谢路线中的酶、底物或者中间体的含量或者活性的影响。当然，基因和这些酶、底物或者中间体可以不是直接的对应关系，而是间接的关系。例如，基因直接影响酶的合成数量或者活性，而酶间接影响胆固醇代谢的中间物质或者前体物质的合成。
另一个惊讶的发现，大气中的微粒，例如PM2.5，可以直接影响胆固醇代谢路线中的一些相关物质，从而让胆固醇代谢路线中的直接物质或者影响这些物质的酶对应的基因表达升高或者降低，从而最终让胆固醇的量相对正常升高。再一个惊讶的发现，大气中的微粒，例如PM2.5让表皮中的胆固醇的含量升高，而合成胆固醇的前体物质角鲨烯含量反而减少。
这与现有技术中的一些传统认识相反。尽管已有研究证明了脂质组分可以用来衡量屏障完整性，但是却没有关于空气污染物，特别是微粒物质对角质层中胆固醇和其相关代谢产物产生影响的确切结论。虽然，在全球范围内1999-2014 年所进行的一系列临床试验表明，生活在严重空气污染地区的居民皮脂氧化程度高，角质层完整度更低。但是，墨西哥和上海的结果表明，生活在污染严重地区的人们皮脂水平较高，角鲨烯/胆固醇比例较低，但胆固醇本身的含量水平却无明显变化。这就表明，在传统认识水平上，似乎大气中的微粒物质或者因为大气污染而形成的微粒物质对于角质层中脂质组成，特别是最终产物胆固醇并没有直接影响。相反，本发明发现，实际上，大气中的微粒物质或者因为大气污染而形成的微粒物质会直接影响胆固醇的合成路线中的各个阶段，从而最终干扰了胆固醇的合成，提高其在角质层中的相对含量(相对于正常含量水平)。
本发明利用大气中的微粒中的代表物质，PM2.5处理的原代人表皮角质形成细胞(pHEK)，根据所得到的转录组结果来分析PM2.5对皮肤屏障的影响。发现众多上调的基因与胆固醇代谢相关，这是因为转录组分析结果使我们聚焦到胆固醇代谢相关的基因表达的变化。根据这些基因转录水平的变化，然后利用体外重建三维表皮组织(3D-ETM)中构建PM2.5处理模型进行进一步的实验，验证了PM2.5对胆固醇和胆固醇前体角鲨烯含量的影响。从基因表达变化和胆固醇代谢线路进行了相关性分析，发现这些变化的基因的转录和胆固醇代谢线路密切相关。从而认为大气中的微粒影响了表皮组织中的胆固醇代谢线路，或者角质层中胆固醇代谢线路，从而最终导致胆固醇升高和胆固醇前体角鲨烯含量的降低。
另外，也发现一些基因的上调，虽然和胆固醇代谢没有直接关系，但是却是因为大气微粒物质，例如PM2.5直接引起的，这些基因仍然是我们新的发现。
生物标记物质
本发明提供一些生物标记物质，利用这些标记物质可以评价或者评估微粒物质对皮肤的影响。特别的，评价或者评估微粒物质对角质层的影响。更具体的，评价或者评估微粒物质对角质层中胆固醇的代谢的影响。
在一些方式中，微粒物质可以是大气中任何地方、任何时间的微粒物质，也可以是某一具体环境下的微粒物质对角质层的影响。在一些方式中，这些生物标记物质包括与胆固醇代谢相关的物质。在一些方式中，这些生物标记物质包括直接或者间接与胆固醇代谢相关的物质。在一些方式中，这些生物标记物质包括为胆固醇代谢路线上的直接相关物质或/和间接相关物质。
本发明提供与胆固醇代谢相关的生物标记物质在评估微粒对皮肤影响中的用途。特别的，在评价或者评估微粒物质对角质层的影响中的用途。更具体的，评价或者评估微粒物质对角质层中胆固醇的合成的影响中的用途。
在这用途中，这些生物标记物质可以用来评价不同地区或者不同时间段的微粒，甚至微粒的具体含量的变化对皮肤的影响程度。
这里的微粒可以是PM2.5，或者不同化学元素或者不同化学物质的混合物形成的微粒对皮肤的影响。另外，建立了这种直接关联，可以用来评估或者筛选一些活性物质来逆转、改善或者预防因为微粒对皮肤的一些不利影响。当然可以理解的是，也可以用这些标识物质来评价或者衡量活性物质对因为微粒对皮肤的一些不利影响的逆转、改善或则预防发生的程度。可以理解，也可以用这些标记物来评估一些活性物质对微粒引起皮肤的不利过程的负面影响，从而不使用这些物质来作用于皮肤。这些还在下面进行详细的阐述。
在一些方式中，这些生物标记物质包括分子水平的基因或者与胆固醇代谢路线中的中酶、底物、受体的核酸或者基因，也可以包括一些参与胆固醇代谢路线中的酶的量或者活性，也可以包括一些合成胆固醇的起始阶段或者合成步骤中的中的一些底物或者前体物质。或者，以上在基因水平、酶水平或者底物前体物质中的一种或者几种的结合。在另外的一些方式中，这些生物标记物质并不是直接和胆固醇代谢相关的物质，而是其它的物质，例如S100A8，S100A9，Krt6b， TXNRD1，FGFBP1，MT2A，CD9，AREG，ITGB1，LAMB3，LAMA3等基因物质。
这里的“胆固醇代谢路线”也可包括胆固醇的合成或者分解、运输等生理过程，而与该代谢过程相关的物质是直接或者间接参与该过程的。
通过这些基因的表达或者转录水平的变化，例如升高，或者升高的幅度，降低或者降低的幅度来表示微粒对皮肤的影响。例如，可以用某些基因的转录水平降低或者降低的程度，表示微粒对皮肤的不利影响的加重程度。相反，则表示微粒对皮肤的影响得到改善、逆转的程度。在一些方式中，分子水平的基因标记物质包括ACLY，ACSS2，HMGCR，HMGCS1，MVD，MSMD1，FDFT1，SQLE， LSS，LDLR或者SCD，FASN，INSIGL中一个或者多个基因。这些基因转录水平的升高，这表示微粒对皮肤的不利影响的加重；相反，这些基因的转录水平的降低，则表示微粒对皮肤的不利影响得以改善或者逆转。例如，一些活性物质作用于皮肤，发现一些基因在转录水平受到下调(相对于单独受到微粒作用)，从而说明这些活性物质具有改善或者逆转不利影响的作用，下调的程度则表示活性物质具有相应的改善或者逆转不利影响的作用的程度如何。
在一些方式中，生物标记物质包括一些酶，这些酶是直接影响胆固醇代谢路线中的各个步骤，从而引起系列的生物反应，从而最终会影响胆固醇的含量(相对于正常健康状态)。在一些方式中，这些酶包括ATP柠檬酸裂解酶、3-羟基-3- 甲基戊二酰-COA还原酶、3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶合酶1、甲羟戊酸二硫酸脱羧酶，甲基甾醇单甲加氧酶1，合金欢基-二硫酸合金欢基转移酶1、角鲨烯环氧酶，羊毛甾醇合成酶、硬脂酰辅酶A去饱和酶或者脂肪酸合成酶中的一种或者几种。利用这些酶的数量或者活性、或者，数量和活性来评估微粒对皮肤的影响，或者活性物质对皮肤的干扰或者改善作用。
在一些方式中，这些生物标记物质可以是胆固醇代谢路线中的各个底物、前体物质。这些物质包括例如ATP柠檬酸裂解酶、3-羟基-3-甲基戊二酰-COA还原酶、3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶合酶1、甲羟戊酸二硫酸脱羧酶，甲基甾醇单甲加氧酶1，合金欢基-二硫酸合金欢基转移酶1、角鲨烯环氧酶、羊毛甾醇合成酶、硬脂酰辅酶A去饱和酶、脂肪酸合成酶或者胆固醇中的一种或者几种。
这里的“影响”指的是当微粒作用于皮肤的时候，所产生的坏的或者不好的影响，一般这种影响会改变合成路线中各种酶的活性或者含量，或者与酶相关的基因的转录水平，从而最终让胆固醇含量高于正常水平，从而引起皮肤角质层脂质成分比例变化，屏障功能异常，这种影响实际上指对皮肤损伤的影响。当对于活性物质来讲，这种活性物质对皮肤的影响可以是逆转微粒对皮肤的不利影响，也可以是恶化或者加剧微粒对皮肤的不利影响；当然可选的，这些活性物质也可能不起任何作用。这些活性物质从分子水平上讲，一般会引起某些基因的下调或者上调，或者某多个基因的下调或者上调，从而最终表现为不同的作用，例如，有效的活性物质可以改善逆转不利影响，有害的活性物质会加快、恶化这样不利影响；无作用的活性物质对微粒造成皮肤的不利影响没有效果。
利用这样的方法，也可以更加详细的评估不同地方的污染大气中的微粒对皮肤的损伤，或者损伤程度。这里的不利、不正常的方向是相对健康正常的标准相对而言。另外，当采用额外的活性物质作用皮肤后，也可以评价这种额外物质是否会改善或者逆转微粒对皮肤的不利影响，这些额外的物质可以是一些活性物质，例如茶叶的提取物，或者另外的多酚物质，当然另外的活性物质也可是为了改善因为微粒物质对皮肤的不利影响的一类物质，这些物质作用于皮肤上，可以改善这种作用或者消除微粒物质对皮肤的不利影响，或者防治微粒对皮肤的危害，或者减轻、减缓大气中的微粒对皮肤的危害，特别是对角质层中胆固醇的含量的影响。
微粒
这里的“微粒”一般是指大气颗粒物(Atmospheric Particulate Matters)，大气颗粒物是大气中存在的各种固态和液态颗粒状物质的总称。各种颗粒状物质均匀地分散在空气中构成一个相对稳定的庞大的悬浮体系，即气溶胶体系，因此大气颗粒物也称为大气气溶胶(Atmospheric Aerosols)(Hinds,w.C.Aerosol Technology:Properties,Behavior,and Measurement of Airborne Particles[M],Wiley,1999,New York)细颗粒物又称细粒、细颗粒、PM2.5。细颗粒物指环境空气中空气动力学当量直径小于等于2.5微米的颗粒物(PM2.5)。与较粗的大气颗粒物相比，PM2.5粒径小，面积大，活性强，易附带有毒、有害物质(例如，重金属、微生物等)，且在大气中的停留时间长、输送距离远，因而对人体健康和大气环境质量的影响更大。
当然，除了大气中的微粒之外，也包括一些特殊环境下的微粒，例如一些局部范围内的微粒物质，例如一些特定工厂环境微粒物质也会对皮肤造成影响。
皮肤或者毛发
头皮具有和皮肤相似的结构，由表皮，真皮和皮下组织组成。角质细胞形成表皮，真皮是胶原纤维组成的密集网络，同时具有弹性血管和淋巴管，免疫细胞，毛囊，神经纤维和腺体。健康头皮中大约每平方厘米有300个汗腺和600根毛发, 其中在每个毛囊最多5个皮脂腺。研究表明，空气污染主要损伤头皮而不是发丝，会引起脱发，或者破坏皮肤屏障造成头皮敏感。
评价的方法
本发明提供利用生物标记物质来评价微粒对皮肤影响的方法。在一些方式中，利用这些生物标记物质中的一种或者几种来评价微粒对角质层影响的方法。在一些方式中，利用这些生物标记物质中的一种或者几种来评价微粒对角质层中胆固醇代谢路线影响的方法。
在一些方式中，该方法包括让微粒作用于皮肤，测定这些生物标记物质的量的变化，从而让微粒与胆固醇代谢路线进行直接关联，从而评价微粒对皮肤的影响。更为具体的，某些生物标记物质的含量升高或则活性增强，指示微粒对皮肤的不利影响增加。某些生物标记物质的含量降低或则活性增减弱，指示微粒对皮肤的不利影响减少。这里的皮肤可以皮肤组织、皮肤细胞、角质层细胞、角质层组织、或者三维模型皮肤中的一种或者几种。在一些方式中，可以是微粒物质作用皮肤的同时、之前、之后、或者作用过程中，让活性物质作用皮肤、皮肤组织、皮肤细胞、角质层细胞、角质层组织、或者三维模型，检测与胆固醇代谢相关物质的变化，依据变化来筛选有效、无效或者有害活性物质。
在一些方式中，最终得到有效的活性物质，这些物质可以用来改善微粒对皮肤的不利影响。在一些方式中，所谓的皮肤组织，皮肤细胞，角质层细胞，角质层组织为体外的组织或者细胞，当然可选的，也可以非体外的皮肤组织，皮肤细胞，角质层细胞，角质层组织。
在一些方式中，这些生物标记物质包括分子水平的基因或者与胆固醇代谢路线中的中酶、底物、受体的核酸或者基因变化，也可以包括一些参与胆固醇代谢路线中的酶的量或者活性，也可以包括一些合成胆固醇的起始阶段或者合成步骤中的中的一些底物或者前体物质。或者，以上在基因水平、酶水平或者底物前体物质中的一种或者几种的结合水平的变化。
在一些方式中，角质层中的胆固醇含量增加或者角鲨烯含量的降低，指示微粒对皮肤的不利影响增加。相反，某些生物标记物质的含量或活性不变化或者没有实质的变化，则表示微粒对皮肤没有不利的影响。
这里的微粒是指任何地方、任何时间、任何种类的微粒，可以是通常认为有害的微粒，也可以是认为无害的微粒，也可以是不知道是否对皮肤有害或者无害的微粒，或者需要待检测的微粒，通过本发明的方法，可检测或者评估微粒是否对皮肤的屏障有不利的影响，通过对胆固醇代谢路线相关物质的检测来评估未知微粒的作用。
筛选方法和活性物质
本发明提供一种筛选活性物质对因为微粒干扰皮肤的而产生影响的方法。这里的活性物质不同于胆固醇代谢路线中的酶、底物或则前体物质，也不属于微粒物质，而是一些可能用来改善、逆转因为微粒物质对皮肤的不利影响的一类物质；当然，也可以是恶化、加速因为微粒物质对皮肤的不利影响的一类物质。在一些方法中或者用途中，利用前述的生物标记物质作为指示物资来筛选这样的活性物质，从而可以改善、逆转微粒物质对皮肤的不利影响的一类物质。在一些方法中，让微粒作用于皮肤之前、作用皮肤的同时，之后或者作用皮肤的过程中，然后施加待测试的活性物质，如果这些生物标记物质(与胆固醇代谢相关的物质)的含量或者活性有变化，让其与待测试的活性物质的影响进行关联，从而获得可以改善、逆转因为微粒物质对皮肤的不利影响的一类物质或者恶化、加速因为微粒物质对皮肤的不利影响的一类物质。在一些方法中，当胆固醇含量增加(相对正常水平)，说明该活性物质没有有利的作用。相反，如果胆固醇含量减少或者不增加，说明该活性物质具有有利的作用，例如改善、逆转因为微粒的不利影响。本领域的一般技术人员应该了解，胆固醇代谢路线中的生物标记物质都可以通过这样的方法来测试，至于活性的变化还是含量的变化与活性物质的作用都可以容易获得。这里的“关联”的意思是指，活性物质的作用与胆固醇代谢路线相关物质的变化具有直接联系，通过这种变化可以获得有效的、无效果的、或者有害的活性物质。例如，当活性物质添加，让胆固醇含量处于正常水平，则认为该活性物质可以为有效的物质。这种关系可以是正相关、也可以是负相关，当然也可以是没有关联性。
这里的皮肤可以皮肤组织、皮肤细胞、角质层细胞、角质层组织、或者三维模型皮肤中的一种或者几种。在一些方式中，可以是微粒物质作用皮肤的同时、之前、之后、或者作用过程中，让活性物质作用皮肤、皮肤组织、皮肤细胞、角质层细胞、角质层组织、或者三维模型，检测与胆固醇代谢相关物质的变化，依据变化来筛选有效、无效或者有害活性物质。在一些方式中，所谓的皮肤组织，皮肤细胞，角质层细胞，角质层组织为体外的组织或者细胞，当然可选的，也可以非体外的皮肤组织，皮肤细胞，角质层细胞，角质层组织。
利用以上的方法，我们探索了一些活性成分(例如植物来源的)对PM2.5诱导的皮肤损伤的干预作用。在一些方式中，茶(Camellia Sinensis)是一种传统的经济植物，可以通过不同程度的发酵进行加工。而绿茶是由新鲜的茶树叶制成的，经过精细的干燥步骤，避免酚类的氧化和聚合。Epigallocatechingallate(EGCG)，一种单体黄烷醇，被发现是绿茶中主要的多酚。
已知，茶多酚其在体外和体内具有强烈的抗炎和抗氧化作用。研究表明，绿茶提取物可以减少紫外线引起的皮肤水肿，红斑和保护DNA免受紫外线伤害。在本研究中，我们发现富含多酚的绿茶提取物在转录组水平上的作用是逆转 PM2.5对皮肤基因表达的影响趋势，并且通过液相色谱质谱联用(LC-MS)验证了3D-ETM中关键脂质生物标志物的变化。
所以，本发明的另一重要发现，发现多酚物质可以逆转PM2.5对皮肤基因表达的影响趋势，从而最终让角质层中在微粒物质的影响下，让胆固醇的合成处于正常水平或者让其前体物质，角鲨烯也处于正常水平。也就是说，这些多酚物质可以修复因为微粒物质对角质层的负面影响(例如减少角质层中胆固醇的含量)，从而让角质层中胆固醇维持正常水平。另一方面，这些多酚物质可以预防或者防治微粒物质对角质层的负面影响(例如维持角质层中胆固醇的正常含量)，从而让角质层中胆固醇维持正常水平，而不受外界大气污染中的微粒的影响。从而，多酚物质可以逆转、修复、预防角质层中胆固醇的不利影响，从而让其处于正常水平，例如胆固醇升高的情况下，可以让其降低，或者防治胆固醇升高的可能性或者潜能。而且，本发明也从机理上证明，茶多酚是让胆固醇代谢路线中的 HMGCS1、LDLR和FASN基因转录水平下调(这些基因在PM2.5的作用下是上调)，从而最终让胆固醇在角质层中维持相对正常的水平。多酚物质实际上是一类混合物的总称，不同来源的多酚可能具体含量有些差异，但是整体的物质作用机理都没有实质差异。所以，本领域的一般技术人员在读到本专利的说明书的时候，自然可以容易理解，任何多酚都具有本发明茶叶多酚的相似功能。
这里的多酚可以是来源于植物的多酚，也可以是来自动物的多酚，还可以是来自微生物发酵产物中的多酚。
在一些优选的方式中，这里的多酚除了茶叶中的多酚外，来自其它植物的多酚也可以的。在另一方式中，多酚物质来自绿色植物的提取物，例如植物多酚 (plantpolyphenol)。植物多酚是一类广泛存在于植物体内的具有多元酚结构的次生代谢物，主要存在于植物的皮、根、叶、果中。狭义认为植物多酚是单宁(tannins) 或鞣质，其相对分子质量在500～3000之间；广义上，还包括小分子酚类化合物，如花青素、儿茶素、栎精、没食子酸、鞣花酸、熊果苷等天然酚类。茶多酚((Tea Ployphenols，TP)，又名茶单宁、茶鞣质，是茶叶中含有的一类多羟基类化合物的总称，占茶叶干重的20％左右，其主要组分为儿茶素类(Catechines)，占其总量的8 0％左右。除此之外，还含有黄烷醇类(Flavanols)、黄烷酮类(Flavanones)、酚酸类(Phenolicacids)和花色苷及其苷元。在各种茶叶中，以绿茶的茶多酚含量最高，约占茶叶干重的15％～25％，其次为乌龙茶、红茶。除了茶多酚之外，还可以是任何其他的物质多酚，苹果多酚；葡萄及葡萄酒中的多酚类物质；啤酒中的多酚类物质；植物多酚蔬菜中的多酚类物质。
苹果多酚是苹果中多元酚类物质的总称，包括花青素类、黄烷醇类、酚酸类及儿茶素等。在一些用于酿酒的苹果品种中其含量可达7g/kg(鲜重计)，普通的鲜食品种含量范围在0.5～2g/kg[3]。根据荷兰、美国等营养学家调查，苹果是位于茶和洋葱之后的第三大酚类物质膳食来源。
葡萄中含有丰富的多酚类化合物。主要分布于果梗、果皮和果核中，尤以果核中含量最高，为3％～7％[4]。在葡萄酒中检测出的1000多种物质中，含有多种多酚类物质，包括花色素类、黄酮类、酚酸类和白藜芦醇等。采用高锰酸钾法测定葡萄酒中的多酚含量，平均可达1～3g/L。另外，红葡萄酒的涩味与苦味多源于酚类物质，其所呈现的红宝石色泽，也与多酚含量密切相关。
啤酒中多酚种类繁多，包括黄烷醇类、黄酮醇类、花色苷类及酚酸等[5]，其中仅原花色素一类就检测出50多种。啤酒中的多酚80％左右来自大麦，20％左右来源于啤酒花。麦芽中含量约0.1％～0.3％，主要存在于谷皮和糊粉层，少量在胚乳。酒花中多酚物质主要存在于酒花的前叶片及蛇麻腺中，占干重的2％～ 4％。多酚类物质与啤酒质量密切相关，其含量对于啤酒的非生物稳定性、口味、泡沫、色泽等都有重要的影响。
植物多酚在蔬菜中分布也较为广泛，如人们经常食用的黄花菜、菠菜、莲藕、色彩鲜艳的紫甘蓝、红苋菜、紫色萝卜等。南欧的传统蔬菜朝鲜蓟中也含有丰富的菜蓟素、黄酮等多酚类化合物。
本领域的一般技术人员可以理解，任何多酚物质都具有本发明的作用，可以改善微粒对皮肤的不利影响，也是本发明发现的多酚物质的新的用途。
具体实施方式
本发明以举例的方式来说明本发明是如何实现的，这些仅仅是在本发明精髓下的有限列举，并不对本发明构成任何限制。
实施例子1：PM2.5样品的收集与分析。
本实验采用PM2.5样本由中国科学院地球环境研究所(西安)提供，于2009 年3月至4月采集自西安高新区，空气流速为1200L/min。PM2.5颗粒吸附于石英纤维过滤器，该滤器每天回收后，用40mL经过Milli-Q过滤后的超纯水进行超声处理15分钟，并重复3次。之后，使用真空冷冻机干燥悬浮液并在4℃下储存。使用前，将PM2.5悬浮于细胞培养基中并超声处理30分钟，用玻璃纤维过滤器过滤悬浮液以除去碎片，制备得到终浓度为50μg/mL的PM2.5细胞培养液。
利用能量色散X射线荧光(ED-XRF)测定12种元素(即，S，Ti，Cr，Mn， Fe，Ni，Cu，Zn，As，Br，Mo，Pb)的组成。使用有机碳分析仪(DRI Model 2001 Carbon Analyzer)分析样品中的有机碳(OC)和元素碳(EC)的量。具体分析结果如表1所示。
表1：采集自中国西安的PM2.5样本的化学组成
Figure BDA0001843809400000171
结果分析：
不同地区PM2.5的组成和来源均有差异，本次试验对采集自中国西安的 PM2.5样品进行了化学分析。PM2.5含有复杂的成分，如金属离子，有毒有机物和无机物质。元素成分分析表明，S，Zn和Fe是实验中使用的PM2.5所含位列前三的元素成分，Zn和Fe是最丰富的地壳元素之一，表明粉尘排放是该样本的重要来源。同时，高浓度的S，NO3 -和SO42-表明煤燃烧排放是另一个重要来源。硫酸盐和硝酸盐主要来自SO2和NOX的氧化，被认为主要是由当地的煤炭燃烧产生的。此外，研究表明煤炭燃烧排放的OC/EC为2.5-10.5，而在本实验中，OC/EC为5.25，这再次显示了煤燃烧排放的主要贡献。因此我们认为本次采用的PM2.5样品为典型的燃煤和扬尘来源。
从以上分析可以看出，微粒的成分复杂，是受当地的自然环境影响的，但是无论如何，微粒虽然在不同的具体地方具有成分和有害物质含量的差异，但是含有的有害物质的种类确是相似，例如扬尘几乎是所有微粒的重要来源，扬尘主要由地壳元素组成，而这些元素虽然似乎对人体并无害处，但是如何形成微粒，则对人体具有极大的危害。危害之一的体现就是微粒对皮肤屏障的损害作用。
对于人的危害在本发明中，指这些微粒对皮肤的影响，在一方面，体现为对皮肤角质层的不利影响。在一些具体方式中，体现为微粒对皮肤角质层中胆固醇代谢路线的直接影响，例如微粒角质层胆固醇含量升高的影响。
实施例子2：PM2.5对体外细胞的影响
2.1细胞培养
用KcGrowth培养基(PY1011，Biocell，Guangdong，China)培养原代人表皮角质形成细胞(PC2011，Biocell，Guangdong，China)，并将原代人角质细胞在37℃，CO25％条件的细胞培养箱中培养。
用EDTA-胰蛋白酶溶液将融合的角质形成细胞从平板上分离。离心后，用KcGrowth培养基以106细胞/ml的浓度重悬细胞，然后以2×105/孔的密度接种在6孔板中。
培养24小时后，去除培养基，然后向培养板中加入含有或不含绿茶提取物 (GTE)的PM2.5悬浮液(实施例子1中的PM2.5微粒，50μg/mL的PM2.5细胞培养液)，每个条件设置三次重复(每孔加入悬浮液2mL，使用PM2.5处理细胞24h)。绿茶提取物(GTE)用含有20％1,3-丁二醇水溶液，干重为0.2％，通过Folin&Ciocalteu方法测量的多酚含量为750μg/ml。(所使用的GTE原液多酚含量为750μg/ml，培养液中添加0.6％的GTE原液(质量百分比)+PM2.5悬浮液(实施例子1中的)。这里，用KcGrowth培养基作为空白对照。
2.2细胞活力测定
将2,1中的用EDTA-胰蛋白酶溶液将融合的角质形成细胞从平板上分离。离心后，用KcGrowth培养基以106个/ml的浓度重悬细胞。以1×10 4个/孔的密度接种在96孔培养板中并培养过夜。
然后用不同浓度的PM2.5处理细胞24小时(图1所示的浓度和时间)。用PBS洗掉培养基，再向每个孔中加入20μLMTT(甲瓒)试剂，将培养板置于黑暗中37℃温育4小时。最后，除去培养基并加入150μLDMSO以溶解甲瓒晶体。使用ELISA Microplate Reader(BioTeK，USA)测量490nm处的吸光度以定量不同培养条件下的细胞活力。
2.3细胞形态
使用倒置光学显微镜(Olympus Corporation，Japan)观察细胞形态。将24 孔板中培养的角质形成细胞与PM2.5一起孵育或与GTE溶液共同处理24小时 (图1)。观察角质细胞的形态学变化，每个实验条件设定两个重复。
实验结果：
培养后的细胞一部分用于MTT测试来检测形态学或者活力的变化影响。实验结果表明，具体参见图1A和图1B,使用不同浓度梯度的PM2.5培养液培养细胞24小时后，观察到细胞的活力随着PM2.5的浓度升高而显著下降，当PM2.5 的浓度超过50μg/mL的时候，细胞碎片大量出现(图1B)。细胞从形态学上，用C(PM2.5)>50μg/mL处理24小时后，细胞存活率呈剂量依赖性逐渐降低(图1B)。当PM2.5剂量增加至50μg/mL时，细胞发生明显的形态学变化，一些细胞碎片开始出现，细胞缩小，但贴壁细胞的数量没有显着变化。在较高浓度的PM2.5下，细胞收缩，变圆和浮起，贴壁细胞的数量明显减少。因此，在随后的实验中我们选择的PM2.5的最大安全剂量为50μg/mL。在这样的浓度下，虽然对细胞具有损伤，但是细胞的活力不会受到显着影响，利于后期的实验。但是无论如何，从图1A可以明显看出，随着PM2.5的浓度逐渐增加，细胞的活力呈下降趋势，浓度越高，下降的速度越明显。这就说明，PM2.5对于细胞具有显著的影响，而对于细胞是生物体的最小单元体，也是角质层的重要组成，对角质层的影响是因为对生物体细胞的影响而最终表现皮肤屏障功能的下降或者消失。
实施例子3：PM2.5对于角质形成细胞中mRNA表达(转录水平)的影响.
将部分实施例子2中部分PM2.5处理角质形成细胞(50μg/mLPM2.5)24小时之后，同时空白对照(无PM2.5)处理24小时，使用TRIzol Reagent(Invitrogen，USA)并根据制造商的说明书提取总RNA。
利用1％琼脂糖凝胶检验RNA降解和污染情况，并使用分光光度计(NanoPhotometer，IMPLEN，CA，USA)检测RNA纯度。使用Qubit 2.0Flurometer (LifeTechnologies，CA，USA)中的Qubit RNA Assay Kit测量RNA的浓度，并使用Bioanalyzer2100系统的RNA Nano 6000Assay Kit(Agilent Technologies， CA，USA)评估RNA的完整性。利用专门用于Illumina检测的NEBNext Ultra RNA文库制备试剂盒(NEB，USA)制备cDNA文库。之后，使用AMPure XP 系统(Beckman Coulter，Beverly，USA)测量cDNA浓度，符合预定的要求，使用Paired-End方法在IlluminaHiSeq 4000(Illumina，USA)上进行RNA测序。
表2：RNA浓度与完整性检测结果
Figure BDA0001843809400000201
从表2可以看出，OD260/280和OD260/230是核酸纯度的指示值，纯 RNAOD260/280值为2.0且OD260/230>2，结果可见OD260/280与OD260/230 数值均接近2.0，表明无蛋白质和DNA污染，无有机溶剂污染，RNA纯度良好。这样实验结果可以更加准确。OD260/230，28S/18S即为衡量提取的RNA完整性的指标，如果28s/18s为2.0左右表明所提取RNA完整性良好，结果可见28s/18s 比值大于2.0，且不可见5sRNA条带，表明RNA无降解。RIN值在0-10之间，数值越大表明完整性越好，结果可见RIN均为10，表明RNA质量完好。一是 RNA是DNA的转录水平的表现，RNA的纯度和完整性为后续的实验结果有更可靠的保障，包括反转录的执行(cDNA)。
选择HiSeq PE150作为测序策略，得到的序列总量为6G。从原始片段中去除核糖体RNA序列及非编码序列，获得可以编码的序列。使用HISAT 2.0.4确定基因，HTSeq v0.6.1用于mRNA表达的定量，DEGSeq 1.12.0和DESeq 1.10.1 用于基因差异表达分析。
结果与分析：
借助Illumina测序技术，我们对角质形成细胞进行了全面的基因表达谱分析，去除rRNA序列和低表达序列后，我们研究了PM2.5在人角质形成细胞中引发的变化。与对照组相比(无PM2.5和GTE处理)，PM2.5处理组的表达的显着差异定义为Padj(矫正后p值)<0.001。从表3可见，相对于对照而言，其中，56 个基因显着上调，20个基因显着下调。
虽然表3中列举了一些现有文献报道的与PM2.5作用下显著上调的基因，如：CXCL1、CYP1A1、IL1RN等，但是，在同时，本发明也发现了一些没有公开的基因的转录水平的提高，例如ACLY，ACSS2，HMGCR，HMGCS1，MVD， MSMD1，FDFT1，SQLE，LSS，LDLR，SCD，FASN，INSIGL等基因水平的上调(表3)。这些基因和胆固醇代谢路线直接相关，这似乎说明微粒(如PM2.5) 还和胆固醇的合成路线相关，在实施例4中将进一步进行分析。
除直接与胆固醇代谢相关基因外，我们首次发现之前未见报道的与PM2.5存在联系的基因还有：S100A8，S100A9，Krt6b，TXNRD1，FGFBP1，MT2A， CD9，AREG，ITGB1，LAMB3，LAMA3(详见表3)。其中S100A8，S100A9 属于S100蛋白家族，在颗粒层、棘层、基底层中均有分布，其主要作用是参与 NADPH氧化酶活化相关的宿主防御过程。研究表明，上述两种S100蛋白在表皮伤口修复，分化和应激反应中具有重要作用，它们在正常表皮中以极低水平表达，但在牛皮癣病患皮肤中大量表达，且证明在特异性皮炎皮肤中上调。Krt6b 属于角蛋白家族，可以表征角质细胞分裂速率，是伤口愈合的典型标志物，特异性皮炎和鱼鳞病等皮肤疾病中该基因上调。TXNRD1编码硫氧还蛋白还原酶，为典型抗氧化基因，受到Nrf2转录因子的调节。FGFBP1编码成纤维细胞生长因子结合蛋白，参与调节皮肤细胞的分裂，与伤口愈合和血管形成相关。MT2A 是一种金属结合蛋白，可促进细胞增殖，已经被发现其表达量变化与皮肤瘢痕形成相关。CD9是一种细胞表面蛋白，通过偶联细胞内信号的传导参与许多生物学过程，比如伤口愈合。AREG双调蛋白在炎性表皮增生和皮脂腺增大过程中发挥作用，并且已有文章报道在PM2.5影响下，其在人类呼吸道上皮细胞中表达量会上调。LAM层黏连蛋白参与伤口愈合和宿主防御。ITG整合素介导皮肤细胞的黏连，与伤口愈合和炎症反应均密切相关，在皮肤收到机械压力和外界损伤的条件下被激发以维持皮肤的稳态。我们首次发现S100A8，S100A9，Krt6b，TXNRD1，FGFBP1，MT2A，CD9，AREG，ITGB1，LAMB3，LAMA3在PM2.5 刺激下的角质细胞中上调。
表3：角质细胞中被PM2.5显著上调或下调的基因。
Figure BDA0001843809400000221
Figure BDA0001843809400000231
Figure BDA0001843809400000241
实施例子4：PM2.5处理角质形成细胞的功能注释和细胞通路分析。
Metascape(http://metascape.org/gp/index.html#/main/step1)被用于生物信息学分析，可以将基因转录水平的原始数据进行归纳并可视化。为了更深入地了解对PM2.5刺激作出反应的独特途径和蛋白质网络，我们利用在线数据库 Metascape分析显著上调和下调基因的基因本体(GO)分子条目(生物过程，分子功能和细胞定位)和KEGG途径(http://metascape.org/gp/index.html#/main/step1)。
通过生物信息学分析，可以获得诸如变化基因所涉及的生物化学途径，基因表达终产物的亚细胞定位以及与某些疾病的相关性等信息。用于该分析的数据是在PM2.5处理后与对照相比显着上调的基因(padj<0.001)。结果如图2所示，前20个GO条目和路径中；最显著富集的GO条目是胆固醇生物合成过程(GO： GO：0006695)，表明PM2.5极有可能影响皮肤中的胆固醇生物合成或者PM2.5 与胆固醇的代谢直接相关。此外，对脂蛋白颗粒(GO：0055094)的反应也是最丰富的条目之一，更指出PM2.5与细胞中胆固醇代谢之间的密切关系。此外，炎症相关途径如IL-17信号传导途径(hsa04657)，白细胞介素-10信号传导 (R-HSA-6783783)也高度富集。同时，伤口愈合的反应(GO：0009611)，伤口愈合的调节(GO：0061041)，也位列前20名，表明皮肤炎症反应的激发。鉴定凋亡过程的正调节(GO：0043065)和细胞氧化剂解毒(GO：0098869)途径揭示PM2.5可诱导细胞凋亡和细胞内氧化清除作为防御反应。
总之，通过功能注释分析，胆固醇生物合成途径，炎症和氧化应激途径以及密切相关的凋亡途径是PM2.5处理的角质形成细胞中被最显著激发的途径，也是直接和PM2.5关联的(图2)。GO分析显示出PM2.5处理后的角质细胞胆固醇代谢异常。因为，脂质是细胞膜的主要成分，也是角质层的重要组成部分，它对皮肤屏障维持正常功能至关重要。这说明PM2.5改变了胆固醇代谢途径，丛然引起胆固醇的正常代谢，从而引起了角质层的变化，从而可能损害了皮肤的屏障功能。
根据转录组学结果“胆固醇生物合成过程”和“响应脂蛋白颗粒”在GO分析中位列最显著富集的条目，我们进一步详细分析了该条目下涉及的变化基因。与胆固醇代谢相关的部分基因列于表4中，在PM2.5刺激下与对照相比的表达水平变化绘制在图3中。胆固醇生物合成途径如图6。结合图3，表4和图6来看， PM2.5可以显著改变胆固醇代谢线路中的直接物质的含量，也会间接影响胆固醇代谢线路中主要酶的变化，从而引起整个路线的变化，最终让胆固醇含量的上调(相对没有处理的对照正常角质层细胞来讲)。更加证明了PM2.5对角质层中胆固醇代谢具有直接的关联，这是本发明的一个新的发现。
一般，例如图6所示，胆固醇代谢过程分为三个阶段。首先，乙酰辅酶A形成甲羟戊酸；其次，将两种甲羟戊酸缩合成一种异戊二烯，然后形成角鲨烯；第三，角鲨烯转化为胆固醇。胆固醇和脂肪酸合成都以共同的前体乙酰辅酶A开始，乙酰辅酶A来源于糖，蛋白质和脂质的分解代谢。
在PM2.5诱导的基因中，有13个基因显著上调，见表4以及图3以及图6， ACLY，ACSS2参与乙酰辅酶A的生成。HMGCS1，HMGCR参与胆固醇代谢的第一阶段。MVD，FDFT1参与胆固醇代谢的第二阶段。LSS和SQLE在胆固醇代谢的第三阶段参与角鲨烯合成羊毛甾醇。LDLR编码与胆固醇-低密度脂蛋白 (LDL)的携带者结合的蛋白质受体，对于胆固醇摄入细胞至关重要。因此，在 PM2.5刺激下这些基因的上调可能导致胆固醇代谢增加。通过图3可以看出，有 13个基因被显著上调，从而影响了胆固醇的合成路线，最终让胆固醇比正常升高。此外，INSIG1在皮肤中发挥着调节是胆固醇代谢的重要作用，通过调节转录因子SREBP/SCAP(胆固醇和脂肪酸合成的调控因子)和HMG-CoA还原酶 (胆固醇代谢限速酶)的转录来维持皮肤中胆固醇的稳态，FASN作为另一大屏障脂质脂肪酸的合成限速酶，也被证明与胆固醇合成具有密切联系，FASN活性的上调可以通过调控乙酰辅酶A来促进胆固醇的产生。这就充分证明了，无论基因水平还是酶水平，以及底物水平上，PM2.5可以直接或者间接改变基因水平的表达或者酶的活性或者数量，或者底物的数量，从而最终让胆固醇含量相对对照上升，从而证明皮肤屏障的损害与PM2.5直接相关。从另外一个角度讲，如果一些外在的活性物质可以逆转，例如下调以13个上调基因中的几个或者几个，或者让酶的活性降低，或者让前体物质或者底物减少或者增加，这些改变都会最终导致胆固醇水平处于正常状态，这些活性物质为有效的物质。
表4：胆固醇代谢相关基因和所对应的GO条目
Figure BDA0001843809400000271
实施例子5：绿茶提取物对于PM2.5刺激下角质形成细胞中mRNA表达(转录水平)的 影响.
用GTE(0.6％)+PM2.5(50μg/mL)条件下共处理角质形成细胞24小时，然后如实施例3的方法提取RNA，并进行测序。
当采用PM2.5和GTE绿茶提取物(茶多酚)同时处理细胞的时候，发现可以有效逆转PM2.5对角质形成细胞转录水平的影响。具体结果见表5中，与PM2.5 处理细胞的条件下相比，GTE的加入使22个基因被显著上调，52个基因被显著下调，这些基因的变化涉及到多个代谢过程的变化。
表5：GTE+PM2.5对比仅PM2.5处理角质细胞后显著上下调的基因。
Figure BDA0001843809400000281
Figure BDA0001843809400000291
Figure BDA0001843809400000301
Figure BDA0001843809400000311
绿茶提取物(茶多酚)影响了多个与炎症反应密切相关的通路，涉及到的显著下调基因中，IL-1a作为公认的炎症标志物，且与痤疮的发生密切相关；matrixmetalloproteinases-1(MMP-1)作为胶原蛋白降解生物标记物，会在热条件或紫外线压力条件下诱导；众多热休克蛋白家族(HSP)包括heat shock protein 90alpha family classA member 1(HSP90AA1),heat shock protein family A(HSP70) member 8(HSPA8)其表达会在不同压力或者外界刺激影响下激发，对皮肤起到保护作用；S100A9(calgranulin B orMRP-14)是与损伤密切相关的模式分子，在许多炎症性皮肤疾病中受到上调。因此，绿茶提取物(茶多酚)主要缓解了PM2.5 引发的炎症反应。
绿茶提取物对以上基因的调节作用都有现有公开资料报道。但是我们首次发现在PM2.5处理细胞的条件下添加绿茶提取物(茶多酚)会显著下调胆固醇代谢通路中HMGCS1，LDLR和FASN的表达，如图4。而这些基因在仅用PM2.5 处理的条件下显著上调(见表3)。这表明绿茶提取物(茶多酚)对于细胞的保护作用也体现在逆转PM2.5对于角质形成细胞胆固醇代谢的不利影响，从而维持胆固醇代谢在一个稳定的状态。进一步表明，茶多酚可以逆转微粒对皮肤角质层中胆固醇的合成影响。这一点在后面也会详细进一步的证明。同时，我们用其它来源的多酚物质(植物提取物，微生物发酵，动物来源，其中植物来源有茶叶、苹果等)做了类似的实验，也发现可以逆转表3中在PM2.5刺激条件下的一些基因的表达水平，其中主要对HMGCS1，LDLR和FASN的表达具有下调作用 (具体实验数据略)。这也进一步证实了，但凡可以让图3中的基因表达水平下调的任何物质都可以逆转PM2.5对皮肤的不利影响，有利于胆固醇维持在正常水平。也从另一个侧面证明了，如果胆固醇合成代谢途径相关的物质发生改变，至少可以说明这种改变是由微粒造成对皮肤的不利影响，增加微粒对皮肤的不利影响作为一个新的证据。这是因为影响胆固醇代谢路线参与的物质众多，影响因素也是极其复杂，当在分析角质层胆固醇代谢中，至少可以把PM2.5的影响作为一种可能性。从而，可以专门用来开发或者筛选对于因为PM2.5对皮肤的不利影响的一些活性物质，用这些活性物质来改善，修复皮肤因为微粒物质，例如 PM2.5对皮肤损伤的一种新的途径。
实施例子6：PM2.5处理的表皮组织模型中胆固醇和角鲨烯的提取
为了证实微粒对皮肤胆固醇中的合成影响，本发明利用3D表皮组织模型(Epikutis PM1011，Biocell，Guangdong，China)在EpiGrowth培养基(PY1021， Biocell，Guangdong，China)中培养来研究进一步的合成影响，条件为37℃，5％ CO2。
3D表皮组织发育4天后，将其在含有PM2.5(50μg/mL)或GTE(0.6％)+ PM2.5(50μg/mL)的培养基中分别培养2,4,6天，不做任何处理的为对照。培养基的总体积为0.9mL/孔，并且每天更换培养基。
在不同时间点(2,4,6天)收集3D-ETM样品，倒去培养基并小心地从表皮组织表面将多余培养基擦去，储存于-20℃，每种条件重复3次。使用刮刀小心地从培养孔侧面分离3D-ETS，然后将样品用100μL蛋白酶K(Ambion)在55℃消化30分钟。将相同条件下培养的样品合并，并在冰水浴中浸泡于有机溶剂(氯仿：甲醇＝2：1)超声处理以提取脂质组分。然后，将样品在氮气下干燥并储存于-80℃条件，利用LC-MS分析脂质含量。
针对LC-MS，液相色谱配备有C18,1.8μM，100x2.1mm色谱柱，将脂质样品重新溶解在流动相中，进样量为1μL。在该系统中，将1100二元泵连接到两个流动相：A.乙腈：异丙醇＝1：9，v/v，0.1％甲酸；B.水：乙腈＝4：6，v/v， 0.1％甲酸，流速为0.5ml/min。流动相连续程序如下：B以线性梯度从99％到50％持续7分钟，B以线性梯度从50％到1％持续3分钟，B以等度洗脱在1％持续 3分钟，最后，B以99％的等度洗脱3分钟，以平衡柱子。Orbitrap MS的参数如下：阳性模式，喷雾电压＝4000V，气体压力1＝30psi，气体压力2＝10psi；扫描范围＝150-1000m/z。使用Progenesis QI进行分析。
结果如图：图5A和图5B。利用3D皮肤模型对转录组学结果进行验证，模拟PM2.5刺激下人体皮肤的变化，在不同的处理时间下检测皮肤中的胆固醇和中间产物角鲨烯的含量。如图5A表示PM2.5刺激2天后，皮肤中胆固醇含量达到最高值，较对照组上升约2.3倍，之后胆固醇含量回落，至第6天基本与对照组近似。而对于胆固醇的前体物质随着时间的延长而呈下降趋势。这充分进一步的说明了，由于胆固醇代谢路线中有部分基因显著上调表达，从而影响胆固醇代谢路线，最终引起胆固醇的含量上升。
同时，在PM2.5处理3D皮肤模型同时加入GTE可以显著抑制胆固醇含量的升高。例如，图5B所示，空白对照中，胆固醇的含量基本保持不变，但是在 PM2.5的作用下，都显著高于对照处理，第二天含量上升幅度最大，随后有所下降，但是当采用PM2.5和GTE同时处理的时候，可以显著抑制胆固醇的含量并处以正常水平，至少是可以接近对照处理的正常水平，这就充分说明了，以胆固醇含量为指标，可以反映出多酚物质能有效改善和逆转PM2.5对皮肤的不利影响。
上述实验结果表明，PM2.5在接触皮肤后诱导胆固醇代谢过程相关酶大量表达，在第2天即引起皮肤中胆固醇含量显著增加，而GTE可以有效抑制这种趋势，无论是处理后第2天还是第6天，GTE处理组的皮肤组织中胆固醇含量均未发生明显波动。进一步说明了多酚物质对胆固醇的合成路线在PM2.5的不利影响下任然可以让其维持正常水平，足以说明多酚物质对于皮肤角质层在微粒物质的不利影响下的显著改善或者逆转作用。本领域的人可以容易想到，多酚物质可以保护皮肤角质层不受PM2.5的不利危害，从而让皮肤处于保护的作用下。
另外，角鲨烯作为胆固醇代谢过程中重要的中间产物，也被证明为皮肤中指示环境污染水平的重要标志物。因此，我们在3D皮肤模型中也对PM2.5处理下角鲨烯的含量进行了检测，图5A结果显示，对于PM2.5的刺激，角鲨烯变化趋势与胆固醇相反，相较对照组含量降低。这可能是胆固醇是以角鲨烯为直接前体物质，胆固醇含量增加，相对角鲨烯含量减少。
在缺少本文中所具体公开的任何元件、限制的情况下，可以实现本文所示和所述的发明。所采用的术语和表达法被用作说明的术语而非限制，并且不希望在这些术语和表达方法的使用中排除所示和所述的特征或其部分的任何等同物，而且应该认识到各种改型在本发明的范围内都是可行的。因此应该理解，尽管通过各种实施例和可选的特征具体公开了本发明，但是本文所述的概念的修改和变型可以被本领域普通技术人员所采用，并且认为这些修改和变型落入所附权利要求书限定的本发明的范围之内。
本文中所述或记载的文章、专利、专利申请以及所有其他文献和以电子方式可得的信息的内容在某种程度上全文包括在此以作参考，就如同每个单独的出版物被具体和单独指出以作参考一样。申请人保留把来自任何这种文章、专利、专利申请或其他文献的任何及所有材料和信息结合入本申请中的权利。
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Claims (37)

1.与胆固醇代谢相关的物质在评估微粒对皮肤影响中的用途。
2.根据权利要求1所述的用途，其中，所述的微粒对皮肤的影响包括对皮肤角质层的影响。
3.根据权利要求2所述的用途，其中，所述的微粒对角质层的影响包括角质层中胆固醇的代谢的影响。
4.根据权利要求1所述的用途，其中，所述的与胆固醇代谢相关的物质包括调控这些相关物质的基因。
5.根据权利要求1所述的用途，其中，所述的与胆固醇代谢相关的物质包括参与胆固醇代谢路线中的酶。
6.根据权利要求1所述的用途，其中，所述的与胆固醇代谢相关的物质包括合成胆固醇的起始阶段或者合成步骤中的底物或者前体物质。
7.根据权利要求4所述的用途，其中，所述的基因包括ACLY、ACSS2、HMGCR、HMGCS1、MVD、MSMD1、FDFT1、SQLE、LSS、LDLR 、SCD、FASN或者INSIGL中一个或者多个基因。
8.根据权利要求5所述的用途，其中，所述的酶包括ATP柠檬酸裂解酶、3-羟基-3-甲基戊二酰-COA还原酶、3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶合酶1、甲羟戊酸二硫酸脱羧酶，甲基甾醇单甲加氧酶1，合金欢基-二硫酸合金欢基转移酶1、角鲨烯环氧酶、羊毛甾醇合成酶、硬脂酰辅酶A去饱和酶或者脂肪酸合成酶中的一种或者几种。
9.根据权利要求6所述的用途，其中，所述的底物或者前体物质包括：乙酸盐、柠檬酸盐、乙酰辅酶A、乙酰乙酰辅酶A、β-羟基-β-甲基戊二酸单酰CoA、甲羟戊酸、5-磷酸甲羟戊酸、5-焦磷酸甲羟戊酸、异戊二烯焦磷酸、二甲基丙烯焦磷酸、法尼基焦磷酸、2,3-环氧化鲨烯、角鲨烯、羊毛甾醇低、密度脂蛋白、低密度脂蛋白受体的一种或者几种。
10.根据权利要求1所述的用途，其中，所述的与胆固醇代谢相关的物质为胆固醇。
11.根据权利要求1所述的用途，其中，所述的微粒为大气中的微粒颗粒。
12.根据权利要求11所述的用途，其中，所述的颗粒微粒为PM2.5。
13.一种评价或者筛选由于微粒物对皮肤影响的活性物质的方法，该方法包括：让待测活性物质来处理皮肤，如果皮肤中的胆固醇代谢途径中的相关物质发生变化，依据该变化来判断待测活性物质对皮肤的影响。
14.根据权利要求13所述的方法，其中，让待测活性物质来处理皮肤的同时，之前或者之后，让微粒作用于皮肤。
15.根据权利要求13所述的方法，其中，所述的相关物质包括影响角质层中胆固醇合成的物质。
16.根据权利要求15所述的方法，其中，所述的影响角质层中胆固醇合成的物质包括核酸水平上的基因物质。
17.根据权利要求15所述的方法，其中，所述影响角质层中胆固醇合成的物质包括参与胆固醇代谢路线中的酶。
18.根据权利要求15所述的方法，其中，所述的胆固醇及其代谢相关物质包括一些合成胆固醇的起始阶段或者合成步骤中的底物或者前体物质。
19.根据权利要求16所述的方法，其中，所述的基因物质包括ACLY，ACSS2，HMGCR，HMGCS1，MVD，MSMD1，FDFT1，SQLE，LSS，LDLR 或者SCD，FASN，INSIGL中一个或者多个基因。
20.根据权利要求17所述的方法，其中，所述的酶包括ATP柠檬酸裂解酶、3-羟基-3-甲基戊二酰-COA还原酶、3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶合酶1、甲羟戊酸二硫酸脱羧酶、甲基甾醇单甲加氧酶1、合金欢基-二硫酸合金欢基转移酶1、角鲨烯环氧酶、羊毛甾醇合成酶、硬脂酰辅酶A去饱和酶或者脂肪酸合成酶中的一种或者几种。
21.根据权利要求18所述的方法，其中，所述的底物或者前体物质包括：乙酸盐、柠檬酸盐、乙酰辅酶A、乙酰乙酰辅酶A、β-羟基-β-甲基戊二酸单酰CoA、甲羟戊酸、5-磷酸甲羟戊酸、5-焦磷酸甲羟戊酸、异戊二烯焦磷酸、二甲基丙烯焦磷酸、法尼基焦磷酸、2,3-环氧化鲨烯、角鲨烯、羊毛甾醇低密度脂蛋白、低密度脂蛋白受体的一种或者几种。
22.根据权利要求21所述的方法，其中，所述的前体物质为角鲨烯。
23.根据权利要求13所述的方法，其中，所述的与胆固醇代谢相关的物质为胆固醇。
24.根据权利要求13所述的方法，其中，如果在微粒处理条件下，待测活性物存在与否对所述的相关物质中的一个或多个含量或表达量造成了影响，并且，如果此种影响与微粒处理对比正常皮肤的改变趋势相反，那么表示该活性物质可以改善微粒对皮肤的不利作用，或者，如果此种影响与微粒处理对比正常皮肤的改变趋势相同，那么表示该活性物质不能够改善微粒对皮肤的不利作用。
25.根据权利要求24所述的方法，其中，如果角鲨烯的含量对比仅用微粒处理的对照组上升或者维持稳定，表示该活性物质能够改善了微粒对皮肤的不利影响。
26.根据权利要求24所述的方法，其中，如果胆固醇的含量对比仅用微粒处理的对照组下降或者维持稳定，表示该活性物质能够改善了微粒对皮肤的不利影响。
27.根据权利要求13所述的方法，其中，所述的变化包括与胆固醇代谢路线相关物质的数量增加或数量的减少；活性增加或者活性减少。
28.根据权利要求13所述的方法，其中，所述的微粒为大气中的微粒颗粒。
29.根据权利要求28所述的方法，其中，所述的微粒颗粒为PM2.5。
30.根据权利要求13所述的方法，其中，所述的皮肤包括皮肤组织、皮肤细胞、角质层细胞、角质层组织、或者三维模型。
31.权利要求30所述的方法，其中，所述的角质层细胞为体外角质层细胞、体外角质层组织、体外皮肤细胞。
32.利用权利要求13-31之一所筛选的活性物质在用于制备能够改善微粒物质对皮肤造成的不利影响的试剂中的用途。
33.根据权利要求32所述的用途，其中，所述的试剂为个人护理试剂。
34.根据权利要求33所述的用途，其中，个人护理试剂包括护肤品、化妆品、或者清洁用品中的一种或者几种。
35.根据权利要求33所述的用途，所述的个人护理品试剂包括溶液、水剂、悬浮液、面膜、乳液、霜剂、膏状、凝胶、干粉、湿粉、喷剂中的一种。
36.根据权利要求32所述的用途，所述的微粒对皮肤的不利影响是微粒通过影响皮肤角质层中胆固醇代谢途径而导致的。
37.根据权利要求36所述的用途，所述的微粒对皮肤的不利影响是微粒通过影响皮肤角质层中胆固醇或者角鲨烯代谢而导致的。
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García et al. Potentialities of vermicompost humic acids to alleviate water stress in rice plants (Oryza sativa L.)
Pedraza-Chaverrí et al. ROS scavenging capacity and neuroprotective effect of α-mangostin against 3-nitropropionic acid in cerebellar granule neurons
Letsiou et al. Skin protective effects of Nannochloropsis gaditana extract on H2O2-stressed human dermal fibroblasts
Orciani et al. Oxidative stress defense in human-skin-derived mesenchymal stem cells versus human keratinocytes: different mechanisms of protection and cell selection
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Nizioł-Łukaszewska et al. Antioxidant activity and cytotoxicity of Jerusalem artichoke tubers and leaves extract on HaCaT and BJ fibroblast cells
Kong et al. Protective effect of isorhamnetin 3-О-β-d-glucopyranoside from Salicornia herbacea against oxidation-induced cell damage
Ramchandani et al. Evaluation of antioxidant and anti-initiating activities of crude polyphenolic extracts from seedless and seeded Indian grapes
Prastya et al. Antioxidant, antiglycation and in vivo antiaging effects of metabolite extracts from marine sponge-associated bacteria
Liao et al. The impact of particulate matter (PM2. 5) on skin barrier revealed by transcriptome analysis: Focusing on cholesterol metabolism
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Reed et al. Benzo [a] pyrene diones are produced by photochemical and enzymatic oxidation and induce concentration-dependent decreases in the proliferative state of human pulmonary epithelial cells
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Mishra et al. Fast-changing life-styles and ecotoxicity of hair dyes drive the emergence of hidden toxicants threatening environmental sustainability in Asia
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Chen et al. Inhibitory effect of aqueous extracts from Miracle Fruit leaves on mutation and oxidative damage
Yasmeen et al. In vitro antioxidant effect of Camellia sinensis on human cell cultures
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