JP2020066635A - 皮膚におけるコレステロールの代謝経路に影響を与える新物質であるポリフェノール物質及びその新しい用途 - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、皮膚のコレステロール代謝と微粒子との間に直接な関係があり、空気における微粒子、例えば、PM2.5が角質層におけるコレステロールの含有量に影響を与えることができることを初めて証明した。このような含有量について、遺伝子レベル及び細胞レベルのいずれにおいても直接的な証拠がある。このようなメカニズムにより、皮膚に対する微粒子の悪影響を改善できる活性物質をスクリーニングすることができ、これらの活性物質は、微粒子による悪影響を効果的に防御することができ、遺伝子レベルにより、最終のコレステロール及びスクアレンの含有量が証明され得る。
検出は、ある物質又は材料(例えば、化学物質、有機化合物、無機化合物、新陳代謝生成物、薬物若しくは薬物の代謝物、有機組織若くは有機組織の代謝物、核酸、タンパク質、又はポリマーなど)の存在を確認するために試験又は測定することを言う。また、検出は、物質又は材料の数を測定することを言う。
皮膚角質層は、外界環境において重要なバリア機能を発揮し、環境中の汚染物質の構造と直接接触する最初の構造であり、微粒子に吸着された有毒物質が皮膚バリアの正常機能を破壊することがある。皮膚バリアは、角質細胞及び角質細胞間脂質成分から構成され、コレステロール、セラミド、遊離脂肪酸は、主なバリア脂質であり、その割合及びタイプによってバリアの正常機能が決定される。テープの引き裂き又はアセトンによる急性バリア損傷は、角質層中のコレステロールの含有量に影響を与えることが証明された。
本発明によれば、皮膚に対する微粒子物質の影響、特に、角質層に対する微粒子物質の影響、具体的には、角質層におけるコレステロールの代謝に対する微粒子物質の影響を評価することができるバイオマーカーが提供される。
ここで言う「微粒子」とは、一般に大気粒子状物質(Atmospheric Particulate Matters)をいう。大気粒子状物質は、大気に存在する種々の固体及び液体の粒子状物質の総称である。様々な粒子状物質が空気中に均一に分散して相対的安定した大きな懸濁システム、即ち、アエロゾールシステムを構成するため、大気粒子状物質は、大気アエロゾール(Atmospheric Aerosols)とも呼ばれ(Hinds,w.C. Aerosol Technology:Properties,Behavior,and Measurement of Airborne Particles[M],Wiley,1999,New York)、微細粒子状物質は、細粒、微細粒子、PM2.5とも呼ばれる。微細粒子状物質とは、環境空气における空気動力学径が2.5μm以下の粒子状物質(PM2.5)を言う。比較的太い大気粒子状物質と比較して、PM2.5は、粒径が小さく、表面積が大きく、活性が強く、有毒有害な物質(例えば、重金属、微生物等)が付着しやすく、且つ大気中での滞在時間が長く、輸送距離が長いので、人間の健康と環境の質により大きな影響を与える。
頭皮は、皮膚と類似する構造を有し、表皮、真皮及び皮下組織から構成される。角質細胞が表皮を形成し、真皮は、コラーゲン繊維で構成される密なネットワークであり、弾性血管、リンパ管、免疫細胞、毛嚢、神経線維及び腺体を有する。健康な頭皮には、1平方センチメートルあたり約300個の汗腺と600本の毛髪があり、各毛嚢には、多くとも5個の皮脂腺がある。研究によると、空気汚染は、毛嚢ではなく、主に頭皮を損傷することで、抜け毛を引き起こすか、又は皮膚バリアを破壊して頭皮を敏感にさせる。
本発明によれば、バイオマーカーを用いて皮膚に対する微粒子の影響を評価する方法が提供される。いくつかの実施形態において、これらのバイオマーカーのうちの1種又は複数種を用いて角質層に対する微粒子の影響を評価する方法が提供される。いくつかの実施形態において、これらのバイオマーカーのうちの1種又は複数種を用いて角質層におけるコレステロールの代謝経路に対する微粒子の影響を評価する方法が提供される。
本発明によれば、皮膚に対する微粒子の作用に影響を与える活性物質をスクリーニングする方法が提供される。ここの活性物質は、コレステロール代謝経路における酵素、基質又は前駆体物質と異なり、微粒子物質にも該当せず、皮膚に対する微粒子物質の悪影響を改善、逆転できる物質である。勿論、皮膚に対する微粒子物質の悪影響を促進、悪化する物質であってもよい。いくつかの方法又は使用において、前記バイオマーカーを標識物質としてこのような活性物質をスクリーニングすることにより、皮膚に対する微粒子物質の悪影響を改善、逆転する。いくつかの方法において、微粒子が皮膚に作用する前後、同時、又は皮膚に作用する過程において、測定対象活性物質を投与し、これらのバイオマーカー(コレステロール代謝に関連する物質)の含有量又は活性が変化した場合、それを測定対象活性物質の影響と関連付けることにより、皮膚に対する微粒子物質の悪影響を改善、逆転できる物質、又は皮膚に対する微粒子物質の悪影響を促進、悪化する物質を得ることができる。いくつかの方法において、コレステロールの含有量が増加(正常レベルに対して)した場合、この活性物質が有利な作用を有しないことを示す。一方、コレステロールの含有量が減少するか、又は増加しない場合、この活性物質は、有利な作用、例えば、微粒子による悪影響を改善、逆転する作用を有する。当業者に理解できるように、コレステロール代謝経路におけるバイオマーカーは、いずれもこのような方法により測定することができ、少なくとも活性の変化、含有量の変化、及び活性物質の作用はいずれも容易に得ることができる。ここで言う「関連」とは、活性物質の作用とコレステロール代謝経路関連物質の変化との間に直接的な関係を有することを意味し、このような変化により、有効、無効又は有害な活性物質を得ることができる。例えば、活性物質の投与により、コレステロールの含有量が正常レベルとなった場合、この活性物質は、有効な物質であると考えることができる。このような関係は、正の相関または負の相関であってもよいが、関連性のない場合も含まれる。
PM2.5サンプルの採取及び分析。
本実験で用いられるPM2.5サンプルは、中国科学院地球環境研究所(西安)によって提供され、2009年3月から4月に空気流速が1200L/minの条件下で西安ハイテクゾーンから採取されたものである。PM2.5粒子は、石英繊維フィルターに吸着され、毎日このフィルターを回収した後、40mLのMilli−Qで濾過した超純水を用いて15分間超音波処理し、3回繰り返す。その後、真空凍結乾燥機を用いて懸濁液を乾燥させ、4℃で保存する。使用前に、PM2.5を細胞培地に懸濁させ、30分間超音波処理30し、用ガラス繊維フィルターで懸濁液を濾過して破片を除去し、最終濃度が50μg/mLのPM2.5細胞培養液を調製する。
異なる地域からのPM2.5の組成及び出所はいずれも異なる。本実験では、中国西安から採取したPM2.5サンプルを化学分析した。PM2.5には、複雑な成分、例えば、金属イオン、有毒な有機物及び無機物質が含まれる。元素成分の分析から分かるように、S、Zn及びFeは、実験で用いられるPM2.5に含まれる最も多い3つの元素成分であり、Zn及びFeは、最も豊富な地殻の元素であるので、粉塵排出はこのサンプルの主要な由来源であることを示している。また、高濃度のS、NO3 −及びSO4 2−は、石炭燃焼は、別の主要な由来源であることを示している。硫酸塩及び硝酸塩は、主にSO2及びNOXの酸化に由来し、主に地元での石炭燃焼によって産生されると考えられている。また、研究によると、石炭燃焼により排出されるOC/ECは、2.5−10.5であり、本実験では、OC/ECが5.25であるので、石炭燃焼が主な由来源であることが実証された。したがって、本実験で用いられるPM2.5サンプルは、典型的な石炭燃焼及び粉塵に由来するものである。
体外細胞に対するPM2.5の影響
(2.1 細胞培養)
KcGrowth培地(PY1011,Biocell,Guangdong,China)を用いて初代ヒト表皮角化細胞(PC2011,Biocell,Guangdong,China)を培養し、初代ヒト角質細胞を37℃、CO2 5%の細胞インキュベーター中で培養した。
2.1のEDTA−トリプシン溶液で融合したケラチノサイトを平板から分離した。遠心分離した後、KcGrowth培地を用いて106細胞/mlの濃度で細胞を再懸濁した。1×104個/ウェルの密度で96ウェル培養プレートに接種し、一晩培養した。
倒立光学顕微鏡(Olympus Corporation,Japan)を用いて細胞形態を観察した。24ウェルプレートで培養したケラチノサイトをPM2.5とともにインキュベートしたか、又はGTE溶液とともに24時間処理した(図1)。角質細胞の形態学的変化を観察し、各実験条件について2回繰り返した。
培養した後の細胞の一部をMTT試験により形態又は活力の変化を検出した。実験結果から分かるように(図1A及び図1Bを参照)、異なる濃度のPM2.5培養液で細胞を24時間培養した後、細胞の活力がPM2.5濃度の上昇について顕著に低下し、PM2.5の濃度が50μg/mLを超えた時に、大量の細胞破片が出たことが観察された(図1B)。細胞の形態では、C(PM2.5)>50μg/mLで24時間処理した後、細胞の生存率は、用量依存性的に徐々に減少した(図1B)。PM2.5の用量が50μg/mLに増加された時に、細胞には、顕著な形態学的変化が発生し、いくつかの細胞破片が現れ始め、細胞が縮んだが、付着細胞の数は顕著に変化しなかった。比較的高い濃度のPM2.5の場合、細胞が収縮し、丸くなり、浮き上がり、付着細胞の数が顕著に減少した。このため、次の実験では、本発明者らが選択したPM2.5の最大安全用量は50μg/mLとされた。このような濃度では、細胞が損傷される場合があるが、細胞の活力は顕著に影響を受けないので、後続の実験に有利である。しかし、いずれにしても、図1Aから分かるように、PM2.5の濃度の徐々な増加につれて、細胞の活力には低下する傾向があり、濃度が高ければ高いほど、低下の速度が顕著になる。これは、PM2.5が細胞に対して顕著な影響を有することを示している。また、細胞は、生体の最小単位であり、角質層の重要な組成でもあ流ので、角質層に対する影響が生体の細胞に対する影響に起因し、最終的には、皮膚バリア機能が低下又は消失することになる。
ケラチノサイトにおけるmRNAの発現(転写レベル)に対するPM2.5の影響
実施例2においてPM2.5でケラチノサイト(50μg/mL PM2.5)を24時間処理すると同時に、ブランク対照(PM2.5無し)で24時間処理した後、TRIzol Reagent(Invitrogen,USA)を用いて製造業者の説明書に従って総RNAを抽出した。
Illuminaシーケンシング技術によりケラチノサイトについて全面的な遺伝子発現プロファイル分析を行い、rRNA配列及び低発現配列を取り除いた後、PM2.5がヒトケラチノサイトにおいて引き起こした変化を研究した。対照群(PM2.5及びGTEで処理しない群)と比較して、PM2.5処理群の発現の有意差Padj(補正後のp値)<0.001であった。表3から分かるように、対照群に対して、56個の遺伝子が顕著にアップレギュレーションされ、20個の遺伝子が顕著にダウンレギュレーションされた。
PM2.5で処理したケラチノサイトの機能注釈及び細胞経路分析。
Metascape(http://metascape.org/gp/index.html#/main/step1)は、バイオインフォマティクス分析に用いられ、遺伝子転写レベルの生データを要約して可視化することができる。PM2.5の刺激に応答する独特な経路及びタンパク質ネットワークをより深く理解するために、本発明者らは、オンラインデータベースMetascapeにより遺伝子を顕著にアップレギュレーション及びダウンレギュレーションする遺伝子本体(GO)分子アイテム(生物学的プロセス、分子機能及び細胞内局在)及びKEGG経路を分析した(http://metascape.org/gp/index.html#/main/step1)。
PM2.5の刺激によるケラチノサイトにおけるmRNA発現(転写レベル)に対する緑茶抽出物の影響
GTE(0.6%)+PM2.5(50μg/mL)でケラチノサイトを24時間処理した後、実施例3の方法によりRNAを抽出し、シーケンシングした。
PM2.5で処理した表皮組織モデルからのコレステロール及びスクアレンの抽出
皮膚におけるコレステロールの合成に対する微粒子の影響を検討するために、本発明は、3D表皮組織モデル(Epikutis PM1011,Biocell,Guangdong,China)を用いてEpiGrowth培地(PY1021,Biocell,Guangdong,China)中で37℃、5%CO2の条件下で合成に対する影響を研究した。
Claims (18)
- 皮膚に対する微粒子物質の悪影響を改善可能な試薬の製造におけるポリフェノール物質の使用。
- 前記ポリフェノール物質は、植物、微生物発酵生成物、哺乳動物に由来する、請求項1に記載の使用。
- 前記植物は、茶葉である、請求項2に記載の使用。
- 前記ポリフェノール物質は、茶ポリフェノールである、請求項3に記載の使用。
- 前記微粒子は、PM2.5である、請求項1に記載の使用。
- 前記皮膚に対する微粒子物質の悪影響は、皮膚角質層に対する微粒子の影響を含む、請求項1に記載の使用。
- 前記皮膚角質層に対する微粒子の影響は、角質層におけるコレステロール代謝関連物質に対する微粒子の影響を含む、請求項6に記載の使用。
- 前記コレステロール代謝関連物質は、コレステロール代謝調節に関与する遺伝子を含む、請求項7に記載の使用。
- 前記コレステロール代謝関連物質は、コレステロール代謝経路に関与する酵素を含む、請求項8に記載の使用。
- 前記コレステロール代謝関連物質は、コレステロールの合成初期段階又は合成ステップにおけるいくつかの基質又は前駆体物質を含む、請求項8に記載の使用。
- 前記遺伝子は、ACLY、ACSS2、HMGCR、HMGCS1、MVD、MSMD1、FDFT1、SQLE、LSS、LDLR、SCD、FASN、INSIGLのうちの1つ又は複数の遺伝子を含む、請求項8に記載の使用。
- 前記遺伝子は、HMGCS1、LDLR又はFASNである、請求項11に記載の使用。
- 前記酵素は、ATPクエン酸リアーゼ、3−ヒドロキシ−3−メチルグルタリル−CoAレダクターゼ、3−ヒドロキシ−3−メチルグルタリルCoAシンターゼ1、メバロン酸二硫酸デカルボキシラーゼ、メチルステロールモノオキシゲナーゼ1、ファルネシル−二硫酸ファルネシルトランスフェラーゼ1、スクアレンエポキシダーゼ、ラノステロールシンターゼ、ステアロイルCoAデサチュラーゼ又は脂肪酸合成酵素のうちの1種又は複数種を含む、請求項9に記載の使用。
- 前記基質又は前駆体物質は、酢酸塩、クエン酸塩、アセチルCoA、アセトアセチルCoA、β−ヒドロキシ−β−メチルグルタリルCoA(HMG−CoA)、メバロン酸、メバロン酸5−リン酸、メバロン酸5−ピロリン酸、イソペンテニル二リン酸、イソペンテニルピロリン酸、ファルネシルピロリン酸、2,3−エポキシ化スクアレン、スクアレン、ラノステロール、低密度リポタンパク質、低密度リポタンパク質受容体のうちの1種又は複数種を含む、請求項10に記載の使用。
- 前記コレステロール代謝関連物質は、コレステロールである、請求項8に記載の使用。
- 前記試薬は、パーソナルケア製品試薬である、請求項1に記載の使用。
- 前記微粒子は、大気中の微粒子である、請求項1に記載の使用。
- 前記パーソナルケア製品試薬は、スキンケア製品、化粧品、清潔用品を含む、請求項16に記載の使用。
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