KR102230390B1 - 프루누스 페르시카의 수성 추출물 및 그의 제조 방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 피부 화장료 용도를 위한 복숭아 꽃 추출물 (프루누스 페르시카 엘.)로부터 추출물을 얻는 방법, 상기 방법에 의해 수득가능한 복숭아 꽃 추출물 및 상기 추출물을 포함하는 화장료 조성물을 제공한다. 본 발명은 추가로 SIRT2 발현을 조정하는 방법, 피부 및 케라틴성 부속기의 노화 및 광-노화의 징후를 감소시키고/거나 교정하도록, 및 자외선 조사로 인한 공격에 대해 피부를 보호하도록 설계된 치료 방법을 제공한다.

Description

프루누스 페르시카의 수성 추출물 및 그의 제조 방법

본 발명은 화장료의 분야, 및 보다 구체적으로 피부 관리의 분야에 있다. 본 발명은 수성 추출에 의해 복숭아 꽃 (프루누스 페르시카(Prunus Persica)) 추출물을 제조하는 방법, 상기 방법에 의해 수득가능한 복숭아 꽃 추출물 및 복숭아 꽃 추출물을 포함하는 화장료 조성물에 관한 것이다.

본 발명은 또한 SIRT2 발현을 조정하는 방법, 피부 및 케라틴성 부속기의 노화 및 광-노화의 징후를 감소시키고/거나 교정하도록, 및 자외선 조사로 인한 공격에 대해 피부를 보호하도록 설계된 화장적 치료 방법에 관한 것이다.

복숭아 꽃 추출물은 단독으로 또는 다른 활성제와 조합으로 사용될 수 있다.

피부는 신체의 전체 표면을 덮고, 보호, 민감, 면역, 대사 또는 열조절 기능을 보장하는, 몇몇 층 (진피, 증식층 및 각질층)으로 구성된 필수적인 기관이다. 피부는 다른 기관과 마찬가지로 노화에 처해진다.

예를 들어, 피부의 외관은 다양한 유형의 내부 (질환 및 호르몬 변화, 예컨대 임신) 또는 외부 공격 (환경적 인자, 예컨대 오염, 일광, 병원체 등)에 의해 변형된다. 이어서, 주름 및 미세 주름선, 과다색소침착 또는 저색소침착 잡티, 피부의 건조 또는 심지어 탈수, 표피의 얇아짐, 탄력섬유증, 결함, 검버섯 등이 나타날 수 있다. 이들 변화 모두는 피부 뿐만 아니라, 케라틴성 부속기, 예컨대 손톱 및 모발에도 영향을 미친다.

세포내 대사 또는 외부 공격에 의해 생성되는 화학적으로 불안정하고 매우 반응성 종인 자유 라디칼은 노화 프로세스에, 및 보다 특히 산화된, 손상된 단백질의 형성에 핵심적 역할을 하는 것으로 공지되어 있다 (Harman et al. "Aging: a theory based on free radical and radiation chemistry" J. Gerontol., 11, 298-300). 이들 외부 공격은 자외선 조사, 독소, 대기 오염, 영양적 산화제를 포함할 수 있다. 자외선 조사 피부 노출은 반응성 산소 종 (ROS)의 광범위한 생성을 유도한다. 이들은 산화적 손상을 유발하는 DNA, 단백질, 지방산 및 사카라이드와 반응할 수 있다.

피부에서, 특히 엘라스틴, 콜라겐 또는 피브로넥틴에 영향을 미치는, 거대분자로의 변경 (지질성 과산화, 단백질의 카르보닐화)의 현상을 특징으로 하는, 자외선 조사에 노출된 영역에서 발생하는 조기 노화가 관찰된다.

산화적 손상의 축적의 중요한 결과 중 하나는 ATP를 생산하는 세포의 능력의 감소이다 (Porteous et al., Eur J Biochem 1998, 257(1):192-201). 따라서, 세포 노화의 현상은 세포가 경험하는 산화적 손상 뿐만 아니라 세포가 생존하는데 필요한 에너지 생산의 프로세스에도 관련이 있다.

인간 시르투인 족은 진화 전반에 걸쳐 매우 보존된, SIRT1 내지 SIRT7로 명명된 7가지의 단백질을 포함한다. "SIRT2 단백질"은 세포질에 우세하게 위치하며, 산화적 스트레스 반응, 염증, 유사분열 진행, 미소관 동역학, 세포 이동, 장수에 있어서 역할을 한다. 세포질에서, SIRT2는 미소관과 공동-국재화되며, 이를 탈아세틸화한다. 유사분열 동안, 이는 핵으로 전위하며, 여기서 이는 히스톤을 탈아세틸화하고, 염색체 응축을 조절한다 (Serrano L. et al., "The tumor suppressor SirT2 regulates cell cycle progression and genome stability by modulating the mitotic deposition of H4K20 methylation", Genes & Dev. 2013. 27: 639-653). 그에 의해, SIRT2는 유사분열 체크포인트 역할을 한다: 이는 유사분열 진행 및 유사분열 출구를 조절한다 (Bosch-Presegue L. and Vaquero A., "Sirtuins in stress response: guardians of the genome", Oncogene (2014) 33, 3764-3775). 더욱이, 방추 어셈블리 체크포인트 단백질 BubR1의 안정성은 SIRT2의 제어 하에 있으며, 시간 경과에 따른 BubR1의 감소는 포유동물 노화와 연관된 바 있다 (North B.J. et al., "SIRT2 induces the checkpoint kinase BubR1 to increase lifespan", The EMBO Journal, 2014, 33, Issue 13, 1438-1453). 따라서, SIRT2는 BubR1 경로 보존을 통한 증가된 세포 장수와 연관될 수 있다.

SIRT2에 의한 BubR1의 Lys668의 탈아세틸화는 BubR1의 편재화 및 프로테아솜에 대한 그의 지정을 억제한다. BubR1 풍부도를 감소시키는 생식계열 돌연변이는 이수배수체를 유발한다.

종래기술의 진술로부터, 어떤 점에서 식물-기재 원료를 오일 또는 추출물의 형태로 함유하는 다수의 화장료가 공지되어 있다. 대부분의 경우, 개별적 식물의 공지된 유리한 효과는 상응하는 전체적 효과를 달성하는데 사용된다.

본 발명의 목표는 SIRT2 발현의 활성화를 나타내는 신규한 식물 추출물을 개발하는 것이었다. 특허 EP1868632는 시르투인 (SIRT1) 단백질의 내인성 합성을 활성화시킬 수 있으며, 발명자들에 의해 SIRT 2를 활성화시킬 수 있는 것으로 확인된 합성 펩티드를 개시하였다. 이 지식에 기초하여, 본 발명자들은 SIRT2 펩티드를 활성화시키는 것으로 확인된 것들과 서열 상동성을 포함하는 식물에 대해 조사하였다. 상동성 서열을 확인하기 위한 서열 유사성 조사는 BLAST와 같은 포괄적인 단백질 서열 데이터 베이스를 사용하여 표준 절차에 따라 수행되었다 (William Pearson, "An Introduction to Sequence Similarity ("Homology") searching", Curr Protoc Bioinformatics. June 2013). 이 조사는 본 발명자들이 프루누스 페르시카를 우수한 후보로서 선택하는 것을 허용하였다.

본 발명에 따른 복숭아 꽃 추출물은 피부에서 시르투인 SIRT2 단백질의 증가된 발현을 제시한 바 있다.

종명 프루누스 페르시카는 페르시아에서의 그의 널리 퍼진 재배를 지칭하며, 그곳에서 이는 유럽으로 이식되었다. 이는 로사세아에(Rosaceae) 과에서 체리 및 자두를 포함하는 프루누스(Prunus) 속에 속한다. 유전적 연구는 복숭아가 중국에서 기원하였으며, 이들이 기원전 약 2000년에 중국 문화의 초기 이래로 재배되어 왔음을 시사한다.

프루누스 페르시카는 피부 장애를 치료하기 위해 중국 의학에서 오래도록 사용되어 왔다. 한국에서, 꽃은 항상 여성 및 남성에게 편지의 좋아하는 영감의 원천이었다. 뮤즈의 이 특성 외에도, 꽃은 음식 장식 또는 주입을 위한 매일의 삶에 사용되어 왔다.

복숭아 꽃은 한국 여성 미의 상징이다. 복숭아 꽃으로의 주입은 한때 피부 톤에 대한 그의 유익한 특성을 알았던 높은 사회적 등급의 여성 사이에서 매우 인기 있었다. 대중적으로 차로서 소비되는 복숭아 꽃은 건강한 젊어 보이는 피부를 촉진시키는 것으로 믿어진다. 복숭아 꽃에 관한 약리학적 연구를 보고하는 문헌은 매우 제한된다.

복숭아 꽃은 폴리페놀성 화합물, 예컨대 페놀산 및 플라보노이드가 매우 풍부한 것으로 공지되어 있다. 이들 분자는 초과산화물 음이온, 일중항 산소, 히드록실 라디칼, 및 지질 퍼옥실 라디칼의 스캐빈저로서 작용할 수 있다. 많은 플라보노이드, 예컨대 쿠에르세틴, 루테올린 및 카테킨은 영양소 비타민 C 및 베타-카로텐보다 더 우수한 항산화제이다 (Svobodova et al., "Natural phenolics in the prevention of UV-induced skin damage. A Review" Biomed. Papers 147(2), 137-145 (2003)). 제어된 가수분해는 이들 화합물이 방출되는 것을 가능하게 한다. 복숭아 잎은 전통 의학에서 구충제, 및 진정제로서 사용된다 (Nadkarni, 1976). 세발로스-카살스(Cevallos-Casals) 등은 페놀류 및 안토시아닌이 풍부한 복숭아 과일이 우수한 항산화 및 항미생물 활성을 가짐을 보고하였다 (Cevallos-Casals et al., "Selecting new peach and plum genotypes rich in phenolic compounds and enhanced functional properties", Food Chemistry 96 (2006) 273-280). 대중적으로 차로서 소비되는 분홍색-색상의 복숭아 꽃은 하제이며, 건강한 젊어 보이는 피부를 촉진시키는 것으로 믿어진다. 복숭아 꽃은 한국 여성 미의 상징이다. 복숭아 꽃으로의 주입은 한때 피부 톤에 대한 그의 유익한 특성을 알았던 높은 사회적 등급의 여성 사이에서 매우 인기 있었다.

일부 플라보노이드, 예컨대 캠페롤 글리코시드 유도체 멀티플로린 B, 트리폴린, 아프젤린, 및 아스트라갈린은 복숭아 꽃에서 확인된 바 있다. 또한, 피부 보호 효과는 멀티플로린 B에 대해 입증되었다 (Young ha Kim et al., "The extract of the flowers of Prunus persica, a new cosmetic ingredient, protects against solar ultraviolet-induced skin damage in vivo", j. Cosmet. Sci., 53, 27-34 (January/February 2002)).

분홍색 색상인 복숭아 꽃은 추출물을 얻는데 사용되어 왔다. 꽃은 폴리페놀성 화합물 및 또한 플라보노이드가 풍부하며, 특히 분홍색 꽃은 또한 특정 플라보노이드, 즉, 흰색 꽃에 비해 꽃에 분홍색 색상을 제공하는 안토시아닌이 풍부하다.

안토시아닌은 폭넓은 스펙트럼의 생물학적 기능을 갖는 것으로 입증된 바 있으며, 플라보노이드 족의 다른 구성원과 마찬가지로 우수한 항산화제로서 작용할 수 있다.

항산화제는 건강 보호 인자로서 중요한 역할을 한다. 천연 발생 항산화제의 주요 공급원은 통곡물, 과일, 꽃 및 채소이다. 식물 항산화제는 비타민 C, 비타민 E, 카로텐, 페놀산, 플라보노이드이다. 이들은 질환 위험을 감소시키는 잠재성, 즉, 항노화 효과를 갖는 것으로 인식된 바 있다. 분홍색 복숭아 꽃 추출물의 항산화 효과는 2,2-디페닐-1-피크릴히드라질 (DPPH)의 방법에 따라 조사된 바 있다.

화장료 조성물에서의 복숭아 추출물의 용도는 종래 기술에 공지되어 있다. 대부분의 추출물은 총 추출물 또는 물-알콜 추출물이다. 예를 들어, 일본 특허 출원 JP-A-2001302439는 고온 추출 공정에 의해 얻어진 흰색 프루누스 페르시아 바치(Prunus Persia Batsh)로부터의 추출물을 포함시킴으로써 피부 노화의 예방을 위한 엘라스타제 및 콜라게나제에 대한 억제 활성을 갖는 화장료를 개시하였다. 한국 특허 KR-526637은 활성 성분 중에 0.1-20.0 중량%의 복숭아 꽃으로부터의 추출물 및 0.1-20.0 중량%의 페룰산을 포함하여 피부의 안정성이 개선된 페룰산 및 복숭아 꽃 추출물을 포함하는 피부 노화 보호를 위한 항-자외선 및 화장료 조성물을 개시하였다. 일본 특허 출원 JP-A-2016053008은 헥산/물로의 얻어진 추출물의 분할 추출을 수행하는 활성 산소 제거 능력을 갖고, 추가로 스핑고당지질 (세라미드 성분)을 함유하는 복숭아 추출물의 제조 방법을 개시하였다. 한국 특허 KR-1429117은 복숭아 꽃으로부터 꽃 (퓨즈)을 제거하고, 꽃받침만을 사용하고, 샘플을 건조시키고, 샘플을 저온살균하고, 균질화기로 처리하는 단계에 의해 얻어진 복숭아 꽃 추출물을 함유하는 피부 화이트닝용 조성물을 개시하였다. 물, C3-6의 저급 알콜 및 C3-6의 저급 유기산으로 이루어진 군에서 선택된 용매 중에서의 추출의 단계로. 얻어진 추출물을 그것을 필터 페이퍼로 여과한 후 동결-건조시킨다. 종래 기술과는 달리, 본 출원은 높은 폴리페놀 함량을 갖고 세라미드가 없는 복숭아 꽃 추출물의 추출을 위한 효과적인 방법을 제공한다.

피부의 치료를 위한 시장에 나와 있는 다양한 항노화 화장료 제품에도 불구하고, 활성제로서 천연 성분을 사용하여 피부, 모발 및/또는 손톱에 항노화 또는 회춘 유익을 제공하는 효과적인 국소적으로 적용되는 화장료 조성물에 대한 필요가 남아 있다. 비천연, 화학적으로-합성된 제품은 환경적으로 또는 개인적으로 비안전한 것으로 인지될 수 있다. 대조적으로, 천연 제품은 순수하고, 부드럽고, 화학적으로 합성된 제품보다 우수한 것으로 인지된다. 식물 또는 허브로부터 추출된 다수의 천연 기재 제품은 자유-라디칼 손상의 효과를 중화시킬 수 있는 항산화제/자유-라디칼 스캐빈징제를 함유하는 것으로 공지되어 있다. 추가적으로, 이들은 진피에서 손상된 결합 조직 구조의 합성 및 복원 및 표피에서 장벽 기능을 자극하는 작용제를 함유할 수 있다.

노화의 징후, 특히 주름, 주름선, 및 처짐의 출현을 다루는 화장료 조성물에 대한 필요가 남아 있다. 따라서, 본 발명의 목적은 노화된 또는 노화하는 피부의 징후를 치료하고/거나, 개선시키고/거나, 예방하기 위한 새로운 조성물 및 방법을 제공하는 것이다. 본 발명의 추가의 목적은 노화하는 또는 노화된 피부의 전체적인 외관을 개선시키는 것이다.

상기 도입은 단지 관련 기술분야에서 부딪치는 문제의 성질의 보다 우수한 이해를 제공하기 위해 제시되며, 어떠한 식으로도 종래 기술로서의 허용으로 해석되지 않아야 하고, 본원에서 임의의 참고문헌의 인용은 이러한 참고문헌이 본 출원에 대한 "종래 기술"을 구성한다는 허용으로서 해석되지 않아야 한다.

본 발명의 주요 측면은 하기 단계를 포함하는, 속 프루누스 페르시카 엘.(Prunus persica L.)의 식물의 꽃을 함유하는 추출물을 얻는 방법을 제공한다:

(i) 물을 복숭아 꽃에 첨가하여 혼합물을 제조하는 단계,

(ii) 온도를 실온 (RT) 내지 70℃ 초과로 유지하여 상기 혼합물을 교반하는 단계,

(iii) 혼합물을 여과하여 고체 꽃 부분을 제거하여 추출물을 얻는 단계.

또 다른 측면에서, 본 발명은 수성 추출에 의해 얻어진 복숭아 꽃 추출물을 포함하며, 여기서 복숭아 꽃 추출물은 생리학적으로 허용되는 매질 중에 10 kDa 미만의 분자량을 갖는 화합물을 포함하는 것인 화장료 조성물을 제공한다.

추가의 또 다른 측면에서, 본 발명은 수성 추출에 의해 얻어진 복숭아 꽃 추출물을 포함하는 화장료 조성물을 피부, 점막 및/또는 표재 피부 부속기에 국소적으로 적용하는 것을 포함하며, 여기서 복숭아 꽃 추출물은 생리학적으로 허용되는 매질 중에 10 kDa 미만의 분자량을 갖는 화합물을 포함하는 것인, 피부 및 케라틴성 부속기의 노화 및 광-노화의 징후를 감소시키고/거나 교정하는 방법을 제공한다.

추가의 또 다른 측면에서, 본 발명은 수성 추출에 의해 얻어진 복숭아 꽃 추출물을 포함하는 화장료 조성물을 피부, 점막 및/또는 표재 피부 부속기에 국소적으로 적용하는 것을 포함하며, 여기서 복숭아 꽃 추출물은 생리학적으로 허용되는 매질 중에 10 kDa 미만의 분자량을 갖는 화합물을 포함하는 것인, SIRT2 발현을 조정하는 방법을 제공한다.

본 발명의 추가의 실시양태는 첨부된 도면으로 이해될 수 있다.
도 1은 케라틴세포에 대한 SIRT2 mRNA 연구의 정량화의 예시이다.
도 2는 섬유모세포에 대한 SIRT2 mRNA 연구의 정량화의 예시이다.
도 3은 케라틴세포에 대한 BubR1 mRNA 연구의 정량화의 예시이다.
도 4는 섬유모세포에 대한 노쇠 연관된 베타-갈락토시다제 (SA 베타-gal) 활성 연구의 예시이다.
도 5는 섬유모세포에 대한 BubR1 염색의 현미경 관찰의 예시이다.
도 6은 섬유모세포에 대한 베타-갈락토시다제 노쇠 마커의 활성의 예시이다.
도 7은 형광 마커 시스템을 통한 섬유모세포의 정량화의 예시이다.
도 8은 흡광도 @ 570 nm를 통해 측정된 평균 세포 수의 예시이다.

본 발명의 상세한 실시양태가 본원에 개시되지만; 개시된 실시양태는 단지 다양한 형태로 구현될 수 있는 본 발명의 예시임이 이해되어야 한다. 따라서, 본원에 개시된 구체적인 구조적 및 기능적 상세사항은 제한으로서가 아니라, 단지 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 본 발명을 다양하게 이용하는 것을 교시하기 위한 대표적인 기초로서 해석되어야 한다.

용어가 범위에 대한 언급에 의해 확인되는 경우마다, 범위는 그의 모든 요소를 명백하게 개시하는 것으로 이해될 것이다. 비-제한적 예로서, 1-10%의 범위는 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 및 10%, 및 1과 10% 사이의 모든 값을 포함하는 것으로 이해될 것이다.

2개 이상의 치환체가 열거된 대안의 군"으로부터 선택되는" 것으로 언급되는 경우, 각각의 치환체는 다른 치환체의 정체성과 무관하게, 그 군의 임의의 요소일 수 있는 것으로 의미된다.

본원에 사용된 바와 같은 "%"는 달리 제공되지 않는다면 조성물 (즉, 임의의 담체, 비히클, 용매, 충전제, 또는 피부에의 적용 전에 첨가되는 다른 성분을 포함함)의 총 중량에 관한 성분의 중량 퍼센트인 중량%를 지칭한다.

본원에 사용된 모든 용어는 달리 제공되지 않는다면 그들의 통상적인 의미를 갖는 것으로 의도된다. 본 발명을 설명하고 청구하는 목적을 위해, 하기 용어가 정의된다:

"추출물"은 추출 방법 또는 성분과 무관하게, 천연 공급원으로부터 추출된 임의의 물질 또는 단리된 제제인 것으로 이해된다. 상기 용어는 예를 들어, 용매를 사용하여 천연 물질로부터 추출된 물 또는 유기 용매에 가용성인 성분, 또는 천연 물질의 구체적인 성분을 포함하는 넓은 의미로 사용된다.

"수성 추출물"은 물로의 추출에 의해 얻어진 화합물의 혼합물인 것으로 이해된다.

용어 "펩티드"는 펩티드 결합에 의해 또는 변형된 펩티드 결합에 의해 함께 연결된 2개 또는 몇몇 아미노산의 서열을 지시하며; 폴리펩티드는 보다 큰 크기의 펩티드를 지시한다. 용어 "펩티드"는 상기 기재된 바와 같은 본 발명의 천연 또는 합성 펩티드 또는 그의 서열이 이전에 기재된 서열에 의해 전체적으로 또는 부분적으로 구성되는 적어도 임의의 천연 또는 합성 펩티드를 지칭한다.

"생리학적으로 허용되는"은 본 발명에 따른 활성제, 또는 상기 작용제를 함유하는 조성물이 독성 또는 불내성 반응을 유발하지 않고 피부 또는 점막과 접촉하기에 적합한 것으로 이해된다.

"노화 및 광-노화의 피부 징후"는 노화로 인한 피부 및 피부 부속기의 외부 외관의 모든 변화, 예컨대, 예를 들어, 피부의 얇아짐, 처짐, 수화의 소실 및 무긴장, 깊은 주름 및 미세 주름선, 단단함 및 톤의 소실, 자외선 조사에의 노출로부터 초래되는 피부 위축 또는 피부의 임의의 다른 내부 열화, 간반 및 검버섯을 지칭한다. "일광 흑색점", "노인성 흑색점", "노인 검버섯", "노인 주근깨"로도 공지된 간반은 태양으로부터의 자외선 조사에의 노출로 인한 노화 및 광-노화와 연관된 피부 상의 잡티이다. 이들은 색상에 있어서 밝은 갈색으로부터 적색 또는 흑색까지에 이르며, 태양에 가장 자주 노출되는 영역, 특히 손, 얼굴, 어깨, 팔 및 이마, 및 대머리라면 두피에 위치한다.

"항노화 유익" 항노화 유익으로는 (a) 미세 주름선 또는 주름의 치료, 감소, 및/또는 예방, (b) 피부 기공 크기의 감소, (c) 피부 두께, 토실토실함, 및/또는 팽팽함의 개선; (d) 피부 탄력 및/또는 부드러움의 개선; (e) 피부 톤, 광채, 및/또는 투명성의 개선; (f) 프로콜라겐 및/또는 콜라겐 생성의 개선; (g) 피부 텍스처의 개선 및/또는 재택스처화의 촉진; (h) 피부 장벽 복구 및/또는 기능의 개선; (i) 피부 처짐 또는 위축의 치료 및/또는 예방; (j) 피부 윤곽의 외관의 개선; (k) 피부 광택 및/또는 밝음의 복원; (l) 필수 영양소 및/또는 피부의 구성요소의 보충; (m) 폐경기에 의해 감소된 피부 외관의 개선; (n) 피부 보습 및/또는 수화의 개선; 및 (o) 피부 탄력성 및/또는 탄성의 개선 중 하나 이상을 들 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다.

본 발명에서 종명 "프루누스 페르시카"는 페르시아에서의 그의 널리 퍼진 재배를 지칭하며, 그곳에서 이는 유럽으로 이식되었다. 이는 로사세아에 과에서 체리 및 자두를 포함하는 프루누스 속에 속한다. 유전적 연구는 복숭아가 중국에서 기원하였으며, 이들이 기원전 약 2000년에 중국 문화의 초기 이래로 재배되어 왔음을 시사한다. 프루누스 페르시카는 피부 장애를 치료하기 위해 중국 의학에서 오래도록 사용되어 왔다 (Young ha Kim et al., "The extract of the flowers of Prunus persica, a new cosmetic ingredient, protects against solar ultraviolet-induced skin damage in vivo", j. Cosmet. Sci., 53, 27-34, January-February 2002).

본원에 사용된 바와 같은 "피부"는 피부, 점막 및 모발, 속눈썹 및 눈썹을 비롯한 피부 부속기를 구성하는 커버링 조직 모두를 지칭한다.

"국소 적용"은 피부의 표면 또는 점막 상의 상기 복숭아 꽃 추출물을 함유하는 조성물의 적용 또는 도포로 이해된다.

본원에 기재된 것은 건조된 복숭아 꽃으로부터 추출물을 얻는 방법, 추출물을 포함하는 화장료 조성물, 복숭아 꽃 추출물을 포함하는 조성물을 피부에 국소적으로 적용함으로써 피부 및 케라틴성 부속기의 노화 및 광-노화의 징후를 감소시키고/거나 교정하는 방법, 및 SIRT2 발현을 조정하는 방법이다.

항산화제는 건강 보호 인자로서 중요한 역할을 한다. 과학적 증거는 항산화제가 암 및 심장 질환을 비롯한 만성 질환에 대한 위험을 감소시킴을 시사한다. 천연 발생 항산화제의 주요 공급원은 통곡물, 과일, 꽃 및 채소이다. 식물 항산화제는 비타민 C, 비타민 E, 카로텐, 페놀산, 플라보노이드이다.

본 발명에 따른 복숭아 꽃 추출물은 피부에서 시르투인 SIRT2 단백질의 증가된 발현을 제시한 바 있다. "SIRT 단백질"은 NAD+ 의존적 데아세틸라제이며, Sir2 시르투인 족에 속한다. 시르투인의 데아세틸라제 또는 모노-ADP-리보실트랜스퍼라제 활성은 그들이 일부 히스톤의 아세틸화 수준을 조정하는 것을 가능하게 한다. 따라서, 이들은 종종 크로마틴에 영향을 미치고, 유전자 침묵화, DNA 손상 신호화, DNA 복구 및 세포 주기 조절을 유도함으로써 그들의 기능을 발휘한다. 사실, 시르투인은 대사적, 산화적 또는 유전자독성 스트레스에 대해 반응하는 중요한 인자이다.

본 발명에 따른 복숭아 꽃 추출물은 폴리페놀성 화합물, 예컨대 페놀산, 및 플라보노이드가 풍부한 것으로 공지되어 있다. 그들의 항산화 활성에 대해 공지되어 있는 모든 이들 수용성 분자는 본 발명에 따른 복숭아 꽃 추출물의 항산화 효능을 제공하는 것에 기여한다. 추출물 중의 플라보노이드 함량은 염화알루미늄 비색 방법에 의해 추정되었다. 염화알루미늄 (AlCl3) 비색 방법에 관여하는 원리는 AlCl3가 추출물의 플라본 및 플라보놀의 C-4 케토 기, 및 C-3 또는 C-5 히드록실 기 중 어느 하나와 산 안정성 복합체를 형성하는 것이다. 샘플의 흡광도를 410 nm에서 분광광도계 상에서 판독한다. 플라보노이드 함량을 루틴 표준 곡선을 사용하여 루틴 당량으로서 결정한다. 측정된 총 플라보노이드 함량은 추출물의 200 mg/kg이다.

이들 분자는 초과산화물 음이온, 일중항 산소, 히드록실 라디칼, 및 지질 퍼옥실 라디칼의 스캐빈저로서 작용할 수 있다. 많은 플라보노이드, 예컨대 쿠에르세틴, 루테올린 및 카테킨은 영양소 비타민 C, 비타민 E 및 베타-카로텐보다 더 우수한 항산화제이다 (Svobodova et al., "NATURAL PHENOLICS IN THE PREVENTION OF UV-INDUCED SKIN DAMAGE.A REVIEW" Biomed. Papers 147(2), 137-145 (2003)). 특히, 분홍색 꽃은 특정 플라보노이드, 즉, 흰색 꽃에 비해 꽃에 분홍색 색상을 제공하는 안토시아닌이 풍부한 것으로 밝혀져 있다.

바람직한 실시양태에서, 분홍색 꽃은 본 발명에 따른 추출물을 얻는데 사용되고 있다.

폴리페놀성 화합물은 강력한 항산화제 분자인 것으로 인식된다. "폴리페놀성 화합물"은 항산화 특성을 갖는 천연 식물 식품 공급원에 풍부하게 발견되는 화합물이다. 이들은 폴리페놀의 모든 부류를 지칭하며, 이들은 적어도 1개의 디페놀 방향족 고리를 포함하는 화합물을 의미하며, 페놀 기는 임의로 에테르화되거나 에스테르화될 수 있다. 이들은 또한 간단히 "폴리페놀"로 지칭될 수 있다. 폴리페놀은 건강 및 보건을 유지하는데 중요한 역할을 한다. 군으로서의 항산화제는 자유 라디칼 손상으로부터 신체 중의 세포를 보호함으로써, 노화하는 속도를 제어하는 것을 돕는다. 항산화제는 3가지 주요 군으로 나누어질 수 있다: 카로테노이드, 마늘 및 양파에서 발견되는 알릴 술피드, 폴리페놀 (페놀류로도 공지됨).

폴리페놀은 4가지 범주로 추가로 나누어질 수 있다: 페놀산, 플라보노이드, 리그난, 및 스틸벤, 추가의 하위그룹화는 그들이 함유하는 페놀 고리의 수에 기초하며, 이들 고리를 서로 결합시키는 구조적 원소에 기초한다.

페놀산은 다양한 식물-기재 식품에서 발견되는, 폴리페놀로 지칭되는 식물화학물질의 유형이며; 과일의 종자 및 과피 및 채소의 잎은 가장 높은 농도를 함유한다. 페놀산은 장관의 벽을 통해 용이하게 흡수되며, 이들은 자유-라디칼 산화 반응으로 인한 세포 손상을 방지하는 항산화제로서 작용하기 때문에 건강에 유익할 수 있다. 자연에서 발견되는 많은 여러가지 페놀산이 있으며, 이들은 2개의 범주로 나누어질 수 있다: 벤조산 유도체, 예컨대 갈산; 및 카페인산 및 페룰산을 비롯한 신남산 유도체. 신남산은 벤조산보다 더 통상적이다.

플라보노이드는 폴리페놀성 화합물의 가장 큰 족이며; 이들은 산소화된 헤테로사이클 (고리 C)을 형성하는 3개의 탄소 원자에 의해 함께 결합된 2개의 방향족 고리 (A 및 B)로 이루어진 구조를 갖는다. 플라보노이드는 포함되는 헤테로사이클의 유형의 기능으로서 6개의 하위부류로 추가로 나누어진다: 플라보놀, 플라본, 이소플라본, 플라바논, 안토시아니딘, 및 플라바놀 (카테킨 및 프로안토시아니딘). 식물은 기생충, 산화적 손상 및 가혹한 기후적 조건에 대한 보호로서 플라보노이드를 생산한다.

분지형 플라보노이드 생합성 경로를 통해 합성된, 식물 플라보노이드의 3가지 주요 부류가 있다 (안토시아닌, 프로안토시아닌, 및 플라보놀). 가장 중요한 플라보노이드 부류인 안토시아닌은 꽃 및 과일에서의 주요 색소이며; 이들 색소는 곤충 유인에 필수적이고, 수분 및 종자 확산에 필요하다 (Winkel-Shirley, "Flavonoid Biosynthesis. A Colorful Model for Genetics, Biochemistry, Cell Biology, and Biotechnology", Plant Physiol. Vol. 126, 2001). 염기성 안토시아닌은 주로 펠라르고니딘, 시아니딘, 및 델피닌으로 이루어지며; 이들 화합물의 다양한 변형, 예컨대 글리코실화, 아실화, 및 메틸화가 일어나, 꽃 색상의 다양성에 기여할 수 있다 (Morata et al., "Formation of the highly stable pyranoanthocyanins (vitamins A and B) in red wines by the addition of pyruvic acid and acetaldehyde", Food Chemistry 100 (2007) 1144-1152). 안토시아닌은 또한 넓은 스펙트럼의 생물학적 기능을 갖는 것으로 입증된 바 있으며, 플라보노이드 족의 다른 구성원과 마찬가지로 우수한 항산화제로서 작용할 수 있다.

꽃 색소형성은 복잡한 다중-효소적 생합성 경로를 포함하며, 여기서 몇몇 효소적 반응은 플라보노이드 화합물의 생산 및 축적을 초래한다. 플라보노이드는 많은 생물학적 프로세스, 예컨대 UV 보호 (Li et al., "Arabidopsis Flavonoid Mutants Are Hypersensitive to UV-6 lrradiation", The Plant Cell, Vol. 5, 171-179, February 1993), 병원체 방어 (Treutter, "Significance of Flavonoids in Plant Resistance and Enhancement of Their Biosynthesis", Plant Biology 7 (2005) 581-591), 및 화분 생육가능성 (Taylor, LP and Jorgensen R (1992). "Conditional male fertility in chalcone synthase-deficient petunia". J. Hered. 83: 11-17.)에 중요한 역할을 한다. 복숭아 꽃은 특정 플라보노이드, 즉, 4가지 캠페롤 글리코시드 유도체 (멀티플로린 B, 트리폴린, 아프젤린, 및 아스트라갈린)를 함유하며, 피부 보호 효과는 멀티플로린 B에 대해 입증되었다 (Young ha Kim et al., "The extract of the flowers of Prunus persica, a new cosmetic ingredient, protects against solar ultraviolet-induced skin damage in vivo", j. Cosmet. Sci., 53, 27-34 (January/February 2002)).

본 발명에 사용되는 "플라보노이드" 중에서, 특히 탁시폴린, 카테킨, 에피카테킨, 에리오딕티올, 나링게닌, 루틴, 트록세루틴, 크리신, 탕게레틴, 루테올린, 에피갈로카테킨 갈레이트 및 에피갈로카테킨, 쿠에르세틴, 피세틴, 캠페롤, 갈랑긴, 갈로카테킨, 에피카테킨 갈레이트가 언급될 수 있다.

문헌 (Hassani et al., (2015), "Analysis of biochemical compounds and differentially expressed genes of the anthocyanin biosynthetic pathway in variegated peach flower", Genetic Mol Res. 14(4):13425-36)은 뚜렷한 잡색의 복숭아 나무로부터의 상이한 색상 (흰색 및 분홍색)의 꽃 꽃잎에서 생산된 화합물의 LC-MS 분석에 의한 비교 연구를 제공한다. 시아니딘의 몇몇 글리코실화 유도체 (시아니딘-3-글루코시드, 시아니딘-3-(6"-말로닐 글루코시드), 시아니딘-3-(6"-에틸말로닐 글루코시드)) 또한 펠라르고니딘 (펠라르고니딘-3-글루코시드, 펠라르고니딘-3-(6"-에틸말로닐 글루코시드) 및 페오니딘 (페오니딘-3-글루코시드 및 페오니딘-3-(6"-에틸말로닐 글루코시드))은 분홍색 꽃잎에서 검출되었지만; 이들 화합물 중 어느 것도 흰색 추출물에서는 검출되지 않았다. 이들 화합물, 특히 시아니딘은 2014년에 간행된 정(Jung) 등의 연구에 기재된 바와 같이 그들의 항산화 및 항염증 효과에 대해 기재되어 있다. 이들은 질환 위험을 감소시키는 잠재성, 즉, 항노화 효과를 갖는 것으로 인식된 바 있다. 분홍색 복숭아 꽃 추출물의 항산화 효과는 2,2-디페닐-1-피크릴히드라질 (DPPH)의 방법에 따라 조사된 바 있다.

본 발명에 따른 분홍색 복숭아 꽃 추출물의 항산화 효과는 DPPH의 방법에 따라 조사된 바 있다. DPPH 검정은 자유 라디칼 스캐빈저 또는 수소 공여자로서 작용하는 화합물의 능력을 시험하고, 항산화 활성을 평가하는데 폭넓게 사용되는 자유 라디칼, 2,2-디페닐-1-피크릴히드라질 (DPPH)의 사용을 포함하는 항산화 능력을 측정하는 빠르고 간단한 방법이다.

DPPH 검정 방법은 안정한 자유 라디칼인 DPPH의 환원에 기초한다. 홀수의 전자를 갖는 자유 라디칼 DPPH는 515 nm에서 최대 흡수를 제공한다 (자주색 색상). DPPH의 용액이 수소 원자를 공여할 수 있는 물질과 혼합되는 경우, 이는 여전히 존재하는 피크릴 기로부터의 이 자주색 색상의 잔류의 담황색 색상으로의 소실을 갖는 환원된 형태 (디페닐피크릴히드라진; 비 라디칼)를 유발한다 (Prieto P, Pineda M, and Aguilar M (1999), "Spectrophotometric quantitation of antioxidant capacity through the formation of a phosphomolybdenum complex: Specific application to the determination of vitamin E", Anal Biochem 269, 337-341).

본 발명의 이점 중 하나는 분홍색 복숭아 꽃이 잎, 과일, 뿌리 또는 식물의 임의의 다른 부분에 비해 관심의 여러가지 화합물이 매우 풍부하다는 것이다.

본 발명은 프루누스 페르시카 종으로부터 얻어진 복숭아 꽃 추출물을 제공하며, 보다 바람직하게는 복숭아 꽃 추출물은 전체 꽃으로부터 얻어진다.

본 발명에 따르면 "전체 꽃" 또는 "복숭아 꽃"은 꽃잎 및 꽃받침 둘 다를 포함한다. 꽃은 신선하거나 건조될 수 있다. 바람직하게는, 꽃은 자연 그늘 공기 건조에 의해 또는 45℃에서 48시간 동안 또는 15℃에서 72시간 동안 고온 공기 오븐에서 건조된다.

본 발명에 따른 복숭아 꽃 추출물은 수성 추출에 의해 얻어질 수 있다. 복숭아 추출물에서 발견되는 다수의 화합물은 아마도 생물학적으로 활성을 가지며, 수용성이다.

바람직한 실시양태에서, 본 발명은 하기 단계를 포함하는, 복숭아 꽃 (프루누스 페르시카 엘.)으로부터 추출물을 얻는 방법을 제공한다:

(i) 물을 복숭아 꽃에 첨가하여 혼합물을 제조하는 단계,

(ii) 온도를 RT 내지 70℃ 미만으로 유지하여 상기 혼합물을 2시간 동안 교반하는 단계,

(iii) 혼합물을 여과하여 고체 꽃 부분을 제거하여 추출물을 얻는 단계,

(iv) 추출물을 70℃ 미만의 온도에서 밤새 저온살균하는 단계.

꽃은 신선하거나 건조될 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 꽃은 건조되며, 물을 건조된 꽃에 첨가하여 혼합물을 제조한다. 널리 공지된 건조 방법 중 임의의 것, 예컨대 자연 그늘 또는 오븐 건조가 수행될 수 있다. 가장 바람직한 실시양태에서, 꽃은 오븐에서 48시간 내지 72시간 동안 15℃ 내지 45℃의 온도에서 건조된다.

바람직한 실시양태에서, 복숭아 꽃 물질을 물에 온침한다. 용액을 RT 내지 70℃ 미만의 온도에서 2시간 동안 짧은 시간 온화한 온침에 적용한다. 가장 바람직하게는, 온도는 관심의 분자, 예컨대 플라보노이드 및 페놀산의 통합성, 및 따라서 항산화제로서 작용하는 그들의 능력을 보존하기 위해 RT 내지 50℃에서 유지된다.

추출 온도의 선택은 추출되는 화합물의 바람직한 유형, 식물 공급원 (꽃, 과일, 줄기, 종자, 잎, 뿌리)의 구조적 특징, 추출물에 요구되는 품질 및 수율, 및 공정을 확대하기 위한 경제적 실행가능성에 의존한다. 식물 물질로부터의 페놀성 화합물의 추출은 추출 온도 및 시간에 의해 영향을 받으며, 이는 가용화 및 산화에 의한 분석물 분해의 상충하는 작용을 반영한다. 그러나, 많은 페놀성 화합물은 용이하게 가수분해되고 산화된다. 긴 추출 시간 및 높은 온도는 추출물에서 페놀류의 수율을 감소시키는 페놀류의 산화의 기회를 증가시킨다. 분석을 상이한 온도에서 수행하였으며, 높은 온도는 이들 유형의 분자를 분해시켰음을 제시하였다. 추출물은 복잡한 구조를 가지며, 열로 이들은 파괴되고, 그들의 잠재적인 생물학적 활성을 소실한다. 높은 온도는 급속한 안토시아닌 분해를 유발하는 것으로 제시된 바 있다. 사실, 긴 시간 추출 및 높은 온도 (70℃ 이상)는 추출물에서 폴리페놀성 화합물의 수율을 감소시키는 산화의 기회를 증가시키며, 또한 대략 4-5의 pH는 폴리페놀성 화합물의 안정성에 적합하다. 따라서, 페놀성 화합물의 안정성을 얻고 유지하기 위해 효율적인 추출 온도를 선택하는 것은 결정적으로 중요하다.

물 추출은 실온에서 또는 70℃ 이하에서 가열된 물로 교반하면서 수행될 수 있다. 바람직하게는, 추출은 50℃에서 2시간 동안 가열된 물에서의 온침에 의해 수행된다. 그 후, 원액을 그리드 여과로 처리하여 불용성 물질을 제거한다. 그리드 여과 후, 수성 또는 액체 분획을 수집한다. 수성 추출물의 보다 작은 잔류물을 제거하기 위해, 관련 기술분야의 통상의 기술자에 의해 널리 공지된 임의의 공정에 의한 여과가 수행될 수 있다.

바람직한 실시양태에서, 정제 공정은 추출물을 얻기 위해 50-20 μm로부터 0.5-0.2 μm까지의 감소하는 다공도를 갖는 필터를 사용한 연속적 여과에 의해 시작된다. 또 다른 바람직한 실시양태에서, 얻어진 추출물은, 나트륨 도데실 술페이트 폴리아크릴아미드 겔 전기영동 (SDS-PAGE)에 의해 입증된 바와 같이, 10 kDa 미만의 분자량을 갖는 단백질 단편 및 펩티드로 구성된다. 얻어진 추출물은 투명하고 밝은 용액이다.

또 다른 바람직한 실시양태에서, 추출물을 이어서 8 g/Kg 및 13 g/Kg, 바람직하게는 11 g/Kg의 건조 물질의 농도에서 용매, 예컨대 물, 글리세롤, 에탄올, 프로판디올, 부틸렌 글리콜, 디프로필렌 글리콜, 에톡실화 또는 프로폭실화 글리콜, 시클릭 폴리올 또는 이들 용매의 임의의 혼합물, 예를 들어 30% 글리세롤 및 0.85%의 페녹시에탄올로 pH를 4.0 내지 4.5로 유지하여 희석한다.

그 후, 희석된 활성제를 멸균 여과에 의해 멸균한다. 그 후, 용액을 65℃에서 밤새 가열하여 낮은 온도 저온살균을 수행한다.

더욱이, 본 발명에 따른 희석된 활성제는 정성적으로 및 정량적으로 분석될 수 있다. 특징은 하기와 같다:

- 단백질: 3 - 6 g/kg,

- 당: 3 - 6 g/kg,

- 아미노산: 0.5 - 1.5 g/kg,

- 페놀성 화합물: 0.5 - 1.5 g/kg,

- 플라보노이드: 0.1 - 0.4 g/kg.

- 추출물은 임의의 세라미드 또는 스핑고당지질을 함유하지 않는다.

복숭아 꽃 추출물의 단백질 함량은 추출물의 총 단백질 함량을 정량화하는데 사용되어 온 로우리 단백질 검정에 의해 결정된 바 있다 (Lowry OH, Rosebrough NJ, Farr AL, Randall RJ (1951). "Protein measurement with the Folin phenol reagent" J. Biol. Chem. 193 (1): 265-75). 로우리 검정은 용액 중의 단백질의 총 수준을 결정하기 위한 생화학적 검정이다. 로우리 방법은 펩티드 결합의 산화에 의해 생성된 Cu+의 폴린-시오칼토(Folin-Ciocalteu) 시약과의 반응에 기초한다. 샘플의 흡광도를 550 nm에서 분광광도계 상에서 판독한다. 단백질 함량은 BSA 표준 곡선을 사용하여 결정된다.

복숭아 꽃 추출물의 아미노산 함량은 무어(Moore) 등에 의해 간행된 프로토콜로부터 시작하여 결정된 바 있다 (Moore et al, "Photometric ninhydrin method for use in the chromatography of amino acids", Journal of Biological Chemistry 1948 Vol. 176 pp. 367-388). 추출물의 유리 아미노산 함량을 시약 닌히드린에 의한 아민 및 카르복실 기능의 파열 후, 색깔 있는 복합체의 형성에 의해 평가하였다. 복합체의 흡광도를 570 nm에서 분광광도계 상에서 판독한다. 총 아미노산 함량은 아미노산 풀의 표준 곡선을 사용하여 결정된다.

복숭아 꽃 추출물의 총 당 함량은 문헌 (Dubois et al. ("Colorimetric Method for Determination of Sugars and Related Substances", Anal. Chem., 1956, 28 (3), 350-356)에 의해 기재된 검정의 적합화를 통해 비색적으로 결정된 바 있다. 이 분석은 페놀과 반응하여 색깔 있는 복합체를 형성하는 농축된 황산에서 이루어진다. 복합체의 흡광도를 490 nm에서 분광광도계 상에서 판독한다. 당 함량은 글루코스 표준 곡선을 사용하여 결정된다.

복숭아 꽃 추출물의 폴리페놀 함량은 폴린-시오칼토 검정을 사용하여 결정되었다 (Singleton et al. (1999). "Analysis of total phenols and other oxidation substrates and antioxidants by means of Folin-Ciocalteu reagent", 299: 152). 샘플 중의 폴리페놀 화합물은 폴린-시오칼토 시약과 반응하며, 시약의 산화는 청색 색상을 제공한다. 샘플의 흡광도를 760 nm에서 분광광도계 상에서 판독한다. 함량을 갈산 표준 곡선을 사용하여 갈산 당량으로서 표현하였다.

SDS PAGE 전기영동을 수행하여 추출물의 단백질의 분자량을 평가하였다. 복숭아 꽃 추출물을 70℃에서 10분 동안 환원적 변성 조건에서 변성 샘플 완충제에서 가열한다. 항산화제 용액을 환원된 단백질이 전기영동 동안 재-산화하지 않도록 내부 챔버 (캐소드)에 첨가한다. 단백질 이동을 분자량에 대한 마커로서 표준 노벡스(Novex)® 샤프(Sharp)를 갖는 MES 실행 완충제를 사용하여 수행한다. 단백질 염색을 은 염색을 사용하여 수행한다.

본 발명에 따른 추출물의 이점은 작은 화합물이 알러지 효과를 갖지 않고 보다 안정하고 재생가능하다는 것이다.

또 다른 측면에서, 본 출원은 수성 추출에 의해 얻어진 복숭아 꽃 추출물을 포함하며, 여기서 복숭아 꽃 추출물은 10 kDa 미만의 분자량을 갖는 화합물 및 생리학적으로 허용되는 매질을 포함하는 것인 화장료 조성물을 제공한다.

또 다른 바람직한 실시양태에서, 복숭아 꽃 추출물은 조성물의 총 중량의 약 0.0001 중량% 내지 약 20 중량%, 바람직하게는 0.0005 중량% 내지 약 5 중량%의 범위의 농도로 존재한다.

또 다른 실시양태에서, 복숭아 꽃 추출물은 화장료 적용에, 보다 바람직하게는 국소 적용에 사용된다.

또 다른 바람직한 실시양태에서, 본 발명은 관련 기술분야의 통상의 기술자에 의해 특히 화장료 또는 피부과적 조성물에 적합화된 경구, 비경구 또는 국소 제형을 제공한다. 본 발명에 따른 조성물은 유리하게는 국소적으로 투여되도록 설계된다. 따라서, 이들 조성물은 생리학적으로 허용되는, 즉, 피부 및 상피 부속기와 혼화성인 매질을 함유하고, 모든 화장료 또는 피부과적 형태를 커버해야 한다.

또한, 본 조성물은 바람직하게는 피부, 점막, 입술 및/또는 상피 부속기 상의 적용에 적합화된 수성, 히드로알콜성 또는 오일성 용액; 수중유 에멀젼, 유중수 에멀젼 또는 다중 에멀젼; 크림, 현탁액, 분말의 형태이다. 이들 조성물은 또한 보다 더 또는 보다 덜 유동성이고, 크림, 로션, 밀크, 세럼, 포마드, 겔, 페이스트 또는 무스의 외관을 가질 수 있다. 이들은 또한 고체 형태로, 스틱으로서 존재할 수 있거나, 에어로졸로서 피부에 적용될 수 있다. 이들은 또한 피부관리 제품으로서 및/또는 메이크업 제품으로서 사용될 수 있다.

또 다른 실시양태에서, 조성물은 적용의 범위에서 상상되는 통상적으로 사용되는 첨가제 뿐만 아니라 그들의 제형을 위해 필요한 첨가제, 예컨대 공-용매 (에탄올, 글리세롤, 벤질 알콜, 댐퍼...), 증점제, 시너, 유화제, 항산화제, 착색제, 태양 필터, 안료, 충전제, 보존제, 방향제, 냄새 흡수제, 에센셜 오일, 올리고 요소, 필수 지방산, 계면활성제, 필름-형성 중합체, 화학적 필터 또는 미네랄, 보습제 또는 열수 등을 포함한다. 수용성, 바람직하게는 천연 중합체, 예컨대 폴리사카라이드 또는 폴리펩티드, 유형 메틸셀룰로스 또는 히드록시프로필셀룰로스의 셀룰로스 유도체, 또는 심지어 합성 중합체, 폴록사머, 카르보머, 실록산, PVA 또는 PVP, 및 특히 회사 앳슈랜드(Ashland)에 의해 판매되는 중합체가 예를 들어 인용될 수 있다.

본 발명에 따른 활성제는 그 자체로 또는 다른 활성 성분과 함께 사용될 수 있음이 널리 이해된다.

더욱이, 본 발명에 따라 사용될 수 있는 조성물은 유리하게는 적어도 1종의 다른 활성제를 함유한다. 하기 유형의 성분이 비-제한적 방식으로 인용될 수 있다: 다른 펩티드 활성제, 식물성 추출물, 치유제, 항노화제, 주름 방지제, 평활화제, 항-자유 라디칼, 항-자외선 조사제, 피부 거대분자 합성 또는 에너지 대사를 자극하기 위한 작용제, 보습제, 항박테리아제, 항진균제, 항염증제, 마취제, 피부 분화, 피부 색소형성 또는 탈색소형성을 조정하는 작용제, 및 손톱 및 모발 성장을 자극하기 위한 작용제.

항-자유 라디칼 또는 항산화제, 또는 피부 거대분자 합성 또는 에너지 대사를 자극하는 작용제가 사용되는 것이 바람직하다.

보다 구체적인 실시양태에서, 본 발명에 따른 조성물은 하기를 포함할 것이다:

- 선스크린, 자외선 및 적외선 차단제

- 항-자유 라디칼제,

- DHEA (데히드로에피안드로스테론),

- 적어도 1종의 시토크롬 공동-활성화 화합물, 및/또는;

- 1종 (이상)의 아쿠아포린-활성화 화합물 및/또는;

- 1종 (이상)의 시르투인-활성화 화합물 및/또는;

- 세포 부착을 증가시키는 1종 (이상)의 화합물 및/또는;

- 콜라겐 또는 라미닌 유형 등의 매트릭스 단백질의 생성을 증가시키는 1종 (이상)의 화합물;

- 1종 (이상)의 HSP 단백질-조정 화합물;

- 세포 에너지를 증가시키는 1종 (이상)의 화합물;

- 1종 (이상)의 색소형성-조정 화합물, 예컨대 효모, 아마란스, 아마씨, 콩, 카카오, 옥수수, 대두, 해바라기, 평지씨 또는 완두콩 펩티드 추출물;

- 피부 장벽 기능을 개선시키는 1종 (이상)의 화합물;

- 1종 (이상)의 미토콘드리아-보호 화합물,

- 비타민 A 및 특히 레티노산, 레티놀, 레티놀 프로피오네이트, 레티놀 팔미테이트,

- 비타민 B3 및 특히 미아신아미드, 토코페롤의 니코티네이트,

- 비타민 B5, 비타민 B6, 비타민 B12, 펜테놀,

- 비타민 C, 및 특히 아스코르브산, 아스코르빌 글루코시드, 아스코르빌 테트라팔미테이트, 마그네슘 및 나트륨 아스코르빌 포스페이트,

- 비타민 E, F, H, K, PP, 및 조효소 Q10, 메탈로프로테이나제 억제제, 조직 억제제 메탈로프로테이나제 (TIMP)의 활성화제,

- 아미노산 및 특히 아르기닌, 오르니틴, 히드록시프롤린, 히드록시프롤린 디팔미테이트, 팔미토일글리신, 히드록시리신, 메티오닌 및 그의 유도체, N-아실화 아미노산,

- 천연 또는 합성 펩티드, 예컨대 디-, 트리-, 테트라-, 펜타- 및 헥사펩티드 및 그들의 친지질성 유도체, 이성질체 및 다른 분자, 예커대 금속성 이온 (즉, 구리, 아연, 망간, 마그네슘, 및 기타)와의 착체, 상품명 매트릭실(MATRIXYL)®, 아르기렐린(ARGIRELINE)®, 크로노겐(CHRONOGEN)™, 라미닉실 IS(LAMINIXYL IS)™, 펩티드 Q10(PEPTIDE Q10)™, 콜락실(COLLAXYL)™ (특허 FR2827170, 앳슈랜드®), 펩티드 빈치 01(PEPTIDE VINCI 01)™ (특허 FR2837098, 앳슈랜드®), 펩티드 빈치 02™ (특허 FR2841781, 앳슈랜드®), AT펩티드(ATPeptide)™ (특허 FR2846883, 앳슈랜드®) 또는 앳슈랜드®에 의해 AT펩티드™의 상품명 하에 판매되는 서열 Arg-Gly-Ser-NH2의 합성 펩티드;

- GP4G™의 상품명 하에 판매되는 아르테미아 살리나(Artemia salina)의 추출물 (FR2817748, 앳슈랜드®);

- 식물 펩티드 추출물, 예컨대 아마씨 추출물 (리피게닌(Lipigenine)™ 특허 FR2956818, 앳슈랜드®), 대두 추출물, 외알밀, 포도덩굴, 평지씨, 쌀, 옥수수 또는 완두콩;

- 효모 추출물, 예컨대 디나겐(Dynagen)™ (특허 FR2951946, 앳슈랜드®) 또는 악토폰틴(Actopontine)™ (특허 FR2944526, 앳슈랜드®); 데히드로아세트산 (DHA),

- 천연 또는 합성 피스토스테롤,

- 알파- 및 베타-히드록시산, 실라놀,

- 당 아민, 글루코스아민, D-글루코스아민, N-아세틸-글루코스아민, N-아세틸-D-글루코스아민, 만노스아민, N-아세틸 만노스아민, 갈락토스아민, N-아세틸 갈락토스아민,

- 폴리페놀, 이소플라본, 플라보노이드, 예컨대 포도 추출물, 소나무 추출물, 올리브 추출물,

- 지질, 예컨대 세라미드 또는 인지질,

- 동물성 오일, 예컨대 스쿠알렌 또는 스쿠알란,

- 식물성 오일, 예컨대 아몬드 오일, 코코넛 오일, 피마자 오일, 호호바 오일, 올리브 오일, 평지씨 오일, 땅콩 오일, 해바라기 오일, 맥아 오일, 옥수수 배아 오일, 대두 오일, 면실 오일, 알팔파 오일, 양귀비 오일, 호박씨 오일, 달맞이꽃 오일, 기장 오일, 보리 오일, 호밀 오일, 홍화 오일, 패션 오일, 헤이즐넛 오일, 야자 오일, 살구 커넬 오일, 아보카도 오일, 금잔화 오일, 에톡실화 식물성 오일, 또는 시어 버터 (상기 언급된 화합물은 천연, 예컨대 식물의 펩티드 가수분해물, 또는 또한 합성, 예컨대 펩티드 화합물일 수 있음).

추가의 또 다른 실시양태에서, 본 출원은 본 출원에 따른 복숭아 꽃 추출물을 포함하는 조성물을 피부, 점막 및/또는 피부 부속기에 국소적으로 적용하는 것을 포함하는, 피부 및 케라틴성 부속기의 노화 및 광-노화의 징후를 감소시키고/거나 교정하는 화장적 방법을 제공한다.

본 발명은 일반적으로 포유동물, 및 보다 구체적으로 인간을 위해 설계됨이 명백하다. 본 발명자들은 사실 피부 및 케라틴성 부속기의 노화 및 광-노화의 피부 징후를 감소시키고/거나 교정하고, 자외선 조사로 인한 공격에 대해 피부를 보호하는데 유용한 생물학적 활성을 확인하였다.

"노화 및 광-노화의 피부 징후"는 노화로 인한 피부 및 피부 부속기의 외부 외관의 모든 변화, 예컨대, 예를 들어, 피부의 얇아짐, 처짐, 수화의 소실 및 무긴장, 깊은 주름 및 미세 주름선, 단단함 및 톤의 소실, 자외선 조사에의 노출로부터 초래되는 피부 위축 또는 피부의 임의의 다른 내부 열화, 간반 및 검버섯을 지칭한다.

추가의 또 다른 측면에서, 본 출원은 본 발명에 따른 복숭아 꽃 추출물을 포함하는 화장료 조성물이 치료되어야 할 피부에 국소적으로 적용되는, 자외선 조사로 인한 공격에 대해 피부를 보호하는 화장적 방법을 제공한다.

추가의 또 다른 실시양태에서, 본 출원은 본 발명에 따른 복숭아 꽃 추출물을 포함하는 화장료 조성물이 치료되어야 할 피부에 국소적으로 적용되는, 피부 세포에서 SIRT2 발현을 조정하는 화장적 방법을 제공한다.

이 화장적 방법에 구체적인 실시양태는 또한 상기 설명으로부터 초래된다.

본 발명의 추가의 이점 및 특징은 제공되는 예시적인, 비-제한적 실시예를 읽음으로써 보다 상세히 나타날 수 있다.

실시예 1: 복숭아 꽃 추출물 (프루누스 페르시카 엘.)의 제조

분홍색 복숭아 꽃을 대한민국 전라남도 담양으로부터 얻었다. 꽃을 자연 그늘 공기 건조에 의해 또는 45℃에서 48시간 동안 또는 15℃에서 72시간 동안 고온 공기 오븐에서 건조시켰다. 건조 복숭아 꽃 (프루누스 페르시카) 50 g을 증류수 1 리터에 정치하였다. 용액을 50℃의 온도에서 2시간 가열하였다. 그 후, 필터 그리드를 사용하여 고체 꽃 잔류물을 액체 부분으로부터 분리하였다. 정제 공정은 투명한 밝은 용액을 얻기 위해 감소하는 다공도 (0.5 내지 0.2 μm)의 필터를 사용한 연속적 여과에 의해 시작한다. 그 후, 여액을 희석하여 30% 글리세롤 및 0.85% 페녹시에탄올을 갖는 10-12 g/Kg 건조 물질을 갖는 추출물을 얻었다. 용액의 pH를 4 내지 5로 조정하여 추출물의 안정성을 증가시켰다. 정화 및 희석 후, 여액을 이어서 멸균 조건 하에서 0.2 μm 필터 다공도로 필터-멸균하였다. 그 후, 용액을 65℃에서 밤새 가열하여 낮은 온도 저온살균을 수행하였다. 복숭아 꽃 추출물을 표준 절차를 사용하여 분석하였다. 얻어진 복숭아 꽃 추출물의 특징은 하기와 같다: 건조 물질: 11 g/kg - 단백질: 4.5 g/kg - 당: 4.5 g/kg - 아미노산: 0.7 g/kg 및 폴리페놀성 화합물: 1.1 g/Kg. 복숭아 꽃 추출물에서 여러가지 화합물의 양을 결정하기 위한 분광광도법 검정에 사용된 방법: 복숭아 꽃 추출물의 단백질 함량을 로우리 단백질 검정 (Lowry et al., 1951)에 의해 결정하여 추출물의 총 단백질 함량을 정량화하였다. 로우리 검정은 용액 중의 단백질의 총 수준을 결정하기 위한 생화학적 검정이다. 로우리 방법은 펩티드 결합의 산화에 의해 생성된 Cu+의 폴린-시오칼토 시약과의 반응에 기초한다. 샘플의 흡광도를 550 nm에서 분광광도계 상에서 판독한다. 단백질 함량을 BSA 표준 곡선을 사용하여 결정하였다. 추출물의 아미노산 함량을 문헌 [Moore et al. (1948)]에 의해 간행된 프로토콜로부터 시작하여 결정한 바 있으며, 추출물의 유리 아미노산 함량을 시약 닌히드린에 의한 아민 및 카르복실 기능의 파열 후, 색깔 있는 복합체의 형성에 의해 평가하였다. 복합체의 흡광도를 570 nm에서 분광광도계 상에서 판독한다. 총 아미노산 함량을 아미노산 풀의 표준 곡선을 사용하여 결정하였다.

추출물 상의 총 당 함량을 문헌 [Dubois et al. (1956)]에 의해 기재된 검정의 적합화를 통해 비색적으로 결정하였다 (Dubois et al, "Colorimetric Method for Determination of Sugars and Related Substances", Anal. Chem., 1956, 28 (3), 350-356). 이 분석은 농축된 황산에서의 원료의 용해 및 그 후 페놀과 반응하여 색깔 있는 복합체를 형성하는 것으로 이루어진다. 복합체의 흡광도를 490 nm에서 분광광도계 상에서 판독한다. 당 함량을 글루코스 표준 곡선을 사용하여 결정한다.

복숭아 꽃 추출물의 폴리페놀 함량을 폴린-시오칼토 검정을 사용하여 결정하였다 (Singleton et al., "Analysis of total phenols and other oxidation substrates and antioxidants by means of Folin-Ciocalteu reagent", 1999, 299: 152). 샘플 중의 폴리페놀 화합물은 폴린-시오칼토 시약과 반응하고, 시약의 산화는 청색 색상을 제공한다. 샘플의 흡광도를 760 nm에서 분광광도계 상에서 판독한다. 함량을 갈산 표준 곡선을 사용하여 갈산 당량으로서 표현하였다.

SDS PAGE 전기영동을 수행하여 추출물의 단백질의 분자량을 평가하였다. 복숭아 꽃 추출물을 70℃로 10분 동안 환원적 변성 조건에서 변성 샘플 완충제에서 가열한다. 항산화제 용액을 환원된 단백질이 전기영동 동안 재-산화하지 않도록 내부 챔버 (캐소드)에 첨가한다. 단백질 이동을 분자량에 대한 마커로서 표준 노벡스® 샤프를 갖는 MES 실행 완충제를 사용하여 수행한다. 단백질 염색을 은 염색을 사용하여 수행한다.

얻어진 추출물은 10 kDa 미만의 분자량을 갖는 펩티드로 구성된다.

HPLC 프로토콜:

페놀산의 크로마토그래피 분석: 모든 샘플을 애질런트(Agilent) 1260 HPLC 시스템 (애질런트 테크놀로지스(Agilent Technologies), 미국 캘리포니아주)에 의해 컬럼 업티스피어(Column Uptisphere) CS 에볼루션 100 mm x 4.6 mm x 2.6 μm (참조 인터킴(Interchim): UE2.6AQ-100/046) 상에서 분리하였다. 유속은 0.8 ml min-1이었다. 이동상은 수성 용액 중 0.1% TFA (트리플루오로아세트산) (A) 및 메탄올 (B)로 이루어졌다. 용리는 하기와 같은 구배 프로그램에 의해 가능하였다 (표 참조):

표. 1 - 용리의 구배

컬럼 온도를 25℃에서 유지하였다. 주사 부피는 20 μL였고, 검출 파장은 UV 검출기를 사용하여 280 nm에서 설정되었다. 아미노산 표준물은 시그마-알드리치(Sigma-Aldrich)로부터 구입하였다. 아미노산의 확인을 진본 표준과의 샘플의 체류 시간 및 UV 스펙트럼 피크의 비교에 의해 수행하였다. 페놀산의 정량적 추정을 샘플 농도 및 표준물의 피크 면적에 기초하여 수행하였다.

아미노산의 크로마토그래피 분석: 모든 샘플을 애질런트 1260 HPLC 시스템 (애질런트 테크놀로지스, 미국 캘리포니아주)에 의해 컬럼 업티스피어 스트라티지 C18-2 5 μm (250x4.6 mm) US5C182-250/046 (참조 인터킴: UE2.6AQ-100/046) 상에서 분리하였다. 유속은 1 ml/분이었다. 이동상은 인산 (H3PO4) 0.1% 용액 (A) 및 아세토니트릴 (B)로 이루어졌다. 용리는 하기와 같은 구배 프로그램에 의해 가능하였다 (표 참조):

표. 2 - 용리의 구배

컬럼 온도를 25℃에서 유지하였다. 주사 부피는 5 μL였고, 검출 파장은 UV 검출기를 사용하여 254 nm에서 설정되었다. 아미노산 표준물은 시그마-알드리치로부터 구입하였다. 주사 전의 표준물 및 샘플은 페닐이소티오시아네이트 (PITC)로 유도체화된다. 아미노산의 확인을 진본 표준과의 샘플의 체류 시간 및 UV 스펙트럼 피크의 비교에 의해 수행하였다. 아미노산의 정량적 추정을 샘플 농도 및 표준물의 피크 면적에 기초하여 수행하였다.

HPLC 분석

표. 3 - HPLC 분석

표. 4 - HPLC 분석 - 50℃ & 70℃의 온도에서의 결과

카테킨 함량은 50℃에 비해 70℃에서 매우 낮은 것으로 관찰되었으며, 카테킨은 천연 페놀의 유형이며 강력한 항산화제 분자인 플라보노이드의 화학적 족의 부분인 플라보놀의 군에 속한다. 상승하는 온도에 따른 이 분자의 감소하는 함량은 70℃에서 얻어진 추출물이 보다 낮은 온도에서 얻어진 추출물보다 덜 항산화성이라는 사실을 설명할 수 있다.

결론적으로, 50℃에서 수행된 추출은 카테킨 분자를 특이적으로 보존하는 것으로 제시되고 있다.

실시예 2: qPCR에 의한, 실시예 1의 복숭아 꽃 추출물로 처리된 케라틴세포 및 섬유모세포에 대한 SIRT2 mRNA 연구

이 연구의 목적은 qPCR에 의해 인간 세포에서의 시르투인 2 mRNA 수준에 대한 실시예 1의 복숭아 꽃 추출물의 영향을 결정하는 것이다.

프로토콜: 합성 SIRT2 펩티드의 처리 용액을 100 ppm ("ppm"은 백만분율을 지칭함)의 스톡 용액을 세포의 배양 배지에 0.5% 부피/부피에서 희석함으로써 제조하였다.

복숭아 꽃 추출물의 처리 용액을 실시예 1의 복숭아 꽃 추출물을 세포의 배양 배지에 0.1% 부피/부피, 또는 0.5% 부피/부피에서 희석함으로써 제조하였다.

정상 인간 케라틴세포 또는 정상 인간 섬유모세포를 합성 SIRT2 활성화 펩티드의 0.5% 부피/부피의 용액으로 또는 실시예 1의 복숭아 꽃 추출물의 0.1% 부피/부피 또는 0.5% 부피/부피로 24시간 동안 2회 처리하였다. 총 RNA를 먼저 RN이지 미니 키트 (74106, 퀴아젠(Qiagen))를 사용하여 추출한 후; 총 RNA를 고성능 cDNA 역전사 키트 (4374966, 라이프 테크놀로지스(Life technologies))로 역전사하였다. 마지막으로, 실시간 PCR을 서열에 특이적인 2개의 프라이머 및 1개의 프로브로 구성된 택맨 유전자 발현 마스터 믹스 (4369514, 라이프 테크놀로지스) 및 택맨 유전자 발현 검정 (Hs00247263_m1, 라이프 테크놀로지스)으로 써모시클러 (어플라이드 바이오시스템즈(Applied Biosystems)) 상에서 수행하였다. 18S 택맨 유전자 발현 검정 (Hs99999901_s1, 라이프 테크놀로지스)을 내인성 대조군으로서 사용하였으며, 비교 Ct 방법을 표적 발현의 상대적 정량화에 사용하였다.

결과: SIRT2 mRNA 수준은 비처리된 세포 대비 케라틴세포 및 섬유모세포 둘 다에 대해 복숭아 꽃 추출물로의 처리 후에 증가되었다. 수준은 높았으며, 케라틴세포 및 섬유모세포에 대해 각각 0.1% 처리 후에 64% 및 56%, 및 0.5% 처리 후에 88% 및 91% 유의하게 (스튜던트 t 검정) 증가되었다.

결론: SIRT2 mRNA의 수준은 복숭아 꽃 추출물로 24시간 동안 처리된 세포에서 정량적으로 증가되었다. 결과를 도 1 & 도 2에 예시한다.

표. 5 - 복숭아 꽃 추출물로의 처리 후의 케라틴세포 & 섬유모세포에 대한 SIRT2 mRNA 발현

실시예 3: 실시예 1의 복숭아 꽃 추출물로 처리된 케라틴세포에 대한 SIRT2 단백질 발현 연구

이 연구의 목적은 세포 상의 시르투인 2 단백질 발현에 대한 실시예 1의 복숭아 꽃 추출물의 영향을 결정하는 것이다. 이를 수행하기 위해, 면역형광에 의한 특이적 표지화를 정상 인간 케라틴세포 상에서 수행하였다.

프로토콜: 복숭아 꽃 추출물의 처리 용액을 실시예 2에서와 같이 제조하였다.

정상 인간 케라틴세포를 합성 SIRT2 활성화 펩티드의 0.5%의 용액으로 또는 실시예 1의 복숭아 꽃 추출물의 0.1% 부피/부피 또는 0.5% 부피/부피로 24시간 동안 2회 처리하였다. 항-SIRT2 항체에 의한 면역표지화를 위해, 세포를 세척하고, 3.7%의 파라포름알데히드로 10분 동안 고정시켰다. 그 후, 세포를 특이적 항-SIRT2 항체 (압캠(Abcam), 참조 ab19388, 토끼 폴리클로날)의 존재 하에서 인큐베이션한 후, 2차 적합한 항체를 형광 염료와 커플링시켰다. 특정 배지에서의 마운팅 후, 슬라이드를 에피형광 현미경 (니콘 이클립스(Nikon Eclipse) 80i 현미경)에 의해 관찰하였다.

결과: 현미경 관찰은 복숭아 꽃 추출물로의 처리 후, 케라틴세포 상의 증가된 SIRT2 염색을 제시하였다.

결론: SIRT2 단백질의 발현은 복숭아 꽃 추출물로 24시간 동안 처리된 세포에서 가시적으로 증가되었다.

실시예 4: 실시예 1의 복숭아 꽃 추출물로 처리된 생체외 인간 피부 생검에 대한 SIRT2 단백질 발현 연구

이 연구의 목적은 피부 상의 시르투인 2 단백질 발현에 대한 실시예 1의 복숭아 꽃 추출물의 영향을 결정하는 것이다. 이를 수행하기 위해, 면역형광에 의한 특이적 표지화를 정상 인간 피부 생검 상에서 수행하였다.

프로토콜: 복숭아 꽃 추출물의 처리 용액을 실시예 2에서와 같이 제조하였다.

정상 인간 피부 생검을 실시예 1의 복숭아 꽃 추출물의 0.1% 부피/부피 또는 0.5% 부피/부피의 용액으로 24시간 동안 2회 처리하였다. 항-SIRT2 항체에 의한 면역표지화를 위해, 조직을 고정시키고, 파라핀에 포매시켰다. 그 후, 포매된 피부 생검을 커팅하고, 섹션을 탈파라핀화하고, 재수화시켰다. 그 후, 언마스킹 프로토콜을 수행한 후, 특이적 항-SIRT2 항체 (압캠, 참조 ab19388, 토끼 폴리클로날)에 적용한 후, 2차 적합한 항체를 형광 염료와 커플링시켰다. 특정 배지에서의 마운팅 후, 슬라이드를 에피형광 현미경 (니콘 이클립스 80i 현미경)에 의해 관찰하였다.

결과: 피부 섹션에 대한 SIRT2 면역형광 염색의 현미경 관찰은 표 5에 제시된 바와 같이 복숭아 꽃 추출물로의 처리 후 용량 의존적 방식으로 SIRT2 발현의 증가를 제시하였다. 증가는 용량-의존적 방식이며, 합성 펩티드로의 처리에 비해 더 높았다.

결론: SIRT2 단백질의 발현은 복숭아 꽃 추출물로 24시간 동안 처리된 피부 생검에서 가시적으로 증가되었다.

실시예 5: qPCR에 의한 실시예 1의 복숭아 꽃 추출물로 처리된 케라틴세포에 대한 BubR1 mRNA 연구

BubR1 단백질은 SIRT2의 제어 하에 있고, 포유동물 노화와 연관되기 때문에, 이 연구의 목적은 qPCR에 의해 인간 세포에서 BubR1 mRNA 수준에 대한 실시예 1의 복숭아 꽃 추출물의 영향을 결정하는 것이다.

프로토콜: 복숭아 꽃 추출물의 처리 용액을 실시예 2에서와 같이 제조하였다.

정상 인간 케라틴세포를 실시예 1의 복숭아 꽃 추출물의 0.1% 부피/부피 또는 0.5% 부피/부피의 용액으로 24시간 동안 1일당 2회 처리하였다. 총 RNA를 먼저 RN이지 미니 키트 (74106, 퀴아젠)를 사용하여 추출한 후; 총 RNA를 고성능 cDNA 역전사 키트 (4374966, 라이프 테크놀로지스)로 역전사하였다. 마지막으로, 실시간 PCR을 서열에 특이적인 2개의 프라이머 및 1개의 프로브로 구성된 택맨 유전자 발현 마스터 믹스 (4369514, 라이프 테크놀로지스) 및 택맨 유전자 발현 검정 (Hs01084828_m1, 라이프 테크놀로지스)으로 써모시클러 (어플라이드 바이오시스템즈) 상에서 수행하였다. 18S 택맨 유전자 발현 검정 (Hs99999901_s1, 라이프 테크놀로지스)을 내인성 대조군으로서 사용하였으며, 비교 Ct 방법을 표적 발현의 상대적 정량화에 사용하였다.

결과: BubR1 mRNA 수준은 비처리된 세포 대비 케라틴세포에 대해 복숭아 꽃 추출물로의 처리 후에 증가되었다. 수준은 케라틴세포에 대해 0.1% 처리 후 46% 및 0.5% 처리 후 42% 유의하게 (스튜던트 t 검정) 증가되었다. 결과를 도 3에 예시한다.

결론: BubR1 mRNA의 수준은 복숭아 꽃 추출물로 24시간 동안 처리된 케라틴세포에서 증가되었다.

실시예 6: 실시예 1의 복숭아 꽃 추출물로 처리된 케라틴세포 및 섬유모세포에 대한 BubR1 단백질 발현 연구

이 연구의 목적은 세포 상의 BubR1 단백질 발현에 대한 실시예 1의 복숭아 꽃 추출물의 영향을 결정하는 것이다. 이를 수행하기 위해, 면역형광에 의한 특이적 표지화를 정상 인간 케라틴세포 및 섬유모세포 상에서 수행하였다.

프로토콜: 복숭아 꽃 추출물의 처리 용액을 실시예 2에서와 같이 제조하였다.

정상 인간 케라틴세포 및 정상 인간 섬유모세포를 실시예 1의 복숭아 꽃 추출물의 0.1% 부피/부피 또는 0.5% 부피/부피의 용액으로 24시간 동안 2회 처리하였다. 항-BubR1 항체에 의한 면역표지화를 위해, 세포를 세척하고, 3.7%의 파라포름알데히드로 10분 동안 고정시켰다. 그 후, 세포를 특이적 항-BubR1 항체 (압캠(Abcam), 참조 ab4639, 마우스 모노클로날)의 존재 하에서 인큐베이션한 후, 2차 적합한 항체를 형광 염료와 커플링시켰다. 특정 배지에서의 마운팅 후, 슬라이드를 에피형광 현미경 (니콘 이클립스 80i 현미경)에 의해 관찰하였다. 형광 강도를 화상을 볼로시티(Volocity) 6.3. 소프트웨어를 사용하여 분석함으로써 정량화하였다.

결과: 현미경 관찰은 복숭아 꽃 추출물로의 처리 후, 케라틴세포 및 섬유모세포 상의 BubR1 염색의 유의하게 높은 (스튜던트 t 검정) 증가를 제시하였다. 결과를 각각 도 4 및 5에 예시한다.

표. 6 - 케라틴세포 & 섬유모세포 상의 BubR1 발현의 현미경 관찰의 정량화

결론: BubR1 단백질의 발현은 복숭아 꽃 추출물로 24시간 동안 처리된 세포에서 증가되었다.

실시예 7: 실시예 1의 복숭아 꽃 추출물로 처리된 섬유모세포에 대한 노쇠 연관된 베타-갈락토시다제 (SA 베타-gal) 활성 연구

이 연구의 목적은 보다 긴 적용 시간 후, 세포 상의 베타-갈락토시다제 노쇠 마커에 대한 실시예 1의 복숭아 꽃 추출물의 영향을 결정하는 것이다.

프로토콜: 복숭아 꽃 추출물의 처리 용액을 실시예 2에서와 같이 제조하였다.

정상 인간 섬유모세포를 실시예 1의 복숭아 꽃 추출물의 0.1% 부피/부피 또는 0.5% 부피/부피의 용액으로 12 하위-배양 (P3 내지 P15) 동안 1일당 2회 처리하고, P5에서 비처리된 섬유모세포와 비교하였다. SA 베타-gal 활성 염색을 위해, 세포를 먼저 세척하고, 고정시켰다. 그 후, 이를 SA 베타-gal 염색 용액과 함께 밤새 인큐베이션하였다. 특정 배지에서의 마운팅 후, 슬라이드를 광 현미경 (니콘 이클립스 E600 현미경)에 의해 관찰하였다. 청색 강도를 화상을 볼로시티 6.3. 소프트웨어를 사용하여 분석함으로써 정량화하였다. 세포의 수에 의한 정규화를 수행하였다.

결과: 예상된 바와 같이, 청색 염색은 비처리된 "젊은" 섬유모세포 (P5) 및 비처리된 노쇠 섬유모세포 (P15) 사이에서 증가하였다. 이 증가는 통계적이며, 섬유모세포를 각각 0.1% 및 0.5%에서의 복숭아 꽃 추출물로 처리한 경우 17% 및 21% 유의하게 (스튜던트 검정) 감소되었다.

결론: 베타-갈락토시다제 노쇠 마커의 활성은 복숭아 꽃 추출물로 장기간 동안 처리된 섬유모세포에서 감소되었다. 결과를 도 6에 예시한다. 이 발명은 특정 바람직한 실시양태를 참고로 상세하게 설명되었지만, 본 발명은 그러한 정확한 실시양태에 제한되지 않음이 인정되어야 한다. 오히려, 본 발명을 실시하기 위한 현재 가장 우수한 방식을 설명하는 본 개시내용의 관점에서, 많은 변형 및 변경은 이 발명의 범위 및 정신으로부터 벗어나지 않고 그들 자신을 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 제시할 것이다.

실시예 8: 실시예 1의 복숭아 꽃 추출물로 처리된 진피 섬유모세포에 대한 SIRT2 활성화 연구.

이 연구의 목적은 인간 진피 섬유모세포 세포에서의 시르투인 2 세포 이동에 대한 복숭아 꽃 추출물의 영향을 결정하는 것이며, 시험을 실시예 1의 추출물을 사용하여 수행하였다.

프로토콜: 복숭아 꽃 추출물의 처리 용액을 실시예 1의 복숭아 꽃 추출물을 0.2% 부피/부피, 0.5% 부피/부피 또는 1% 부피/부피에서 희석함으로써 제조하였다.

오리스(Oris) 이동 검정:

물질:

● 오리스 96 웰 세포 이동 검정 시스템 콜라겐 I 코팅됨 (1-팩), 카탈로그 번호 CMACC1.101

● 세포 염색:

○ 셀트래커 그린 라이프 테크놀로지스 1 mg, 카탈로그 번호 C2925

● 트립신:

○ 트립신 EDTA 1x 코닝, 카탈로그 번호 25-053-CI

● 세척:

○ 둘베코 포스페이트 완충 염수 용액 (DPBS) 1X, 카탈로그 번호 25-055-CV

● 배지:

○ 라이프 테크놀로지스에 의한 둘베코 변형 이글 배지 (DMEM), 카탈로그 번호 11965092

■ 보충물이 있음 및 없음

■ 보충된 배지에 대해, 배지는

● 하이클론 태아 소 혈청 (FBS) @ 10%, 카탈로그 번호 SH30071.03으로 보충되었다.

시험된 샘플:

1. 대조군:

○ 배지 단독

2. 이동 양성 대조군:

○ PDGF @ 10 ng/ml 시그마 카탈로그 번호 P8147 로트 번호 SLBN0763V

3. 보존제 "복숭아 추출물" (실시예 1로부터 얻어진 복숭아 꽃 추출물을 지칭함)이 없는 CR14031

○ 제조자: 앳슈랜드 빈시엔스(Ashland Vincience)

○ 코드: 865810

○ 이전 코드: CR14031

○ 배치 번호 RM15048

■ 0.2% (v/v)

■ 0.5% (v/v)

■ 1% (v/v)

방법

제1일: 오리스 이동 플레이트의 세포 시딩 및 활성제로의 예비-처리:

오리스 세포 이동 검정을 플레이트를 실온으로 하기 위해 시딩 전에 4℃ 냉장으로부터 제거하였다.

멸균 세포 배양 조건 하에서, 오리스 이동 플레이트를 젠 바이오(Zen Bio) 로트 번호 DFM110210B로부터의 62-년령 계대 11 정상 진피 인간 섬유모세포 (NHDF)로 웰당 50 ul 배지에서 웰당 20,000 세포의 밀도로 시딩하였다.

그 후, 배지 중 동등 부피 (50 ul)의 2x 농축된 처리물을 지정된 웰에 하기 플레이트 레이아웃 (n=10)에 따라, 생성된 1x 처리물을 갖는 100 ul의 웰에서의 최종 부피에 대해 첨가하였다. 플레이트를 95% 습도, 5% CO₂ 및 37℃의 표준 세포 배양 조건 하에서 24시간 동안 인큐베이션하였다.

그늘진 웰은 이용하지 않았으며, 과도하였다.

표. 7 - 실험을 위한 플레이트 설계의 개요

제2일: 세포 염색, 활성제로의 리프레시 처리, 이동 검정 시점의 시작.

다음 날, 배지 및 처리물을 플레이트로부터 제거하고, 부착 세포를 37℃ 가온된 둘베코 PBS에서 2회 세척하여 세포를 세척한 후 염색하였다.

세포를 혈청-무함유 배지 중 셀 트래커 그린의 10 mM 용액을 사용하여 염색하고, 표준 세포 배양 조건 하에서 30분 동안 인큐베이션하였다.

30분 염색의 마지막에, 오리스 이동 검정에서 특수화된 웰 삽입물을 제공된 툴을 사용하여 제거하고, 셀트래커 그린 염색을 제거하였다.

세포를 미리 가온된 37℃ 둘베코 PBS로 2회 세척하여 임의의 방해되는 세포 및 잔류의 염료를 세정하였다.

1X 제조된 처리물을 플레이트에서 제공된 플레이트 레이아웃에 따라 리프레시하고, 플레이트를 형광 플레이트 판독기를 사용하여 하기 설정에서 즉시 판독하였다: t=0으로 지정된 검정의 시작에서 492 nm ex/517 nm em. 1, 2, 3, 4, 6, 8, 및 24시간에서의 추가의 시점을 취하고, 데이터를 기록하였다.

결과: 결과는 복숭아 꽃 추출물로의 처리가 62 년령 인간 진피 섬유모세포 세포에서 세포 이동을 증가시켰고, 농도 의존적이었음을 제시한다. 결과를 표에 보고한다:

표. 8 - 복숭아 꽃 추출물로 처리된 인간 진피 섬유모세포 세포에서의 세포 이동

결론: 복숭아 꽃 추출물을 통한 Sirt2를 지지함으로써, 본 발명자들은 세포가 성숙한 피부 세포에서의 세포 이동 활성을 회복하는 것을 도울 수 있었다.

결과를 도 7에 예시한다.

실시예 9: 실시예 1의 복숭아 꽃 추출물로의 처리 후의 평균 세포 수의 측정.

이 연구의 목적은 평균 세포 수에 대한 복숭아 꽃 추출물의 영향을 결정하는 것이며, 시험을 실시예 1의 추출물을 사용하여 수행하였다.

프로토콜: 복숭아 꽃 추출물의 처리 용액을 실시예 1의 복숭아 꽃 추출물을 0.2% 부피/부피, 0.5% 부피/부피 또는 1% 부피/부피에서 희석함으로써 제조하였다.

알라마르 블루(Alamar Blue) 프로토콜 - 세포 증식 결정을 위한 검정:

물질:

● 96 웰 플레이트

● 알라마르 블루 용액 인비트로젠(Invitrogen), 카탈로그 번호 DAL1100

● 라이프 테크놀로지스에 의한 둘베코 변형 이글 배지 (DMEM), 카탈로그 번호 11965092

○ 하기로 보충됨:

■ 하이클론 태아 소 혈청 (FBS) @ 10%, 카탈로그 번호 SH30071.03

방법:

96 웰 플레이트를 제공된 플레이트 레이아웃에 따른 처리를 갖는 젠 바이오 로트 번호 DFM110210B로부터의 62-년령 계대 11 정상 진피 인간 섬유모세포 (NHDF)의 웰당 20,000 세포로 시딩하고, 정상 세포 배양 조건 하에서 48시간 동안 배양하였다.

48시간의 마지막에, 배지 및 처리물을 제거하고, 배지 중 알라마르 블루의 10% 용액을 생성하고, 이 용액 100 ul를 플레이트의 모든 웰 내로 피펫팅하였다.

그 후, 플레이트를 표준 세포 배양 조건 하에서 1시간 동안 인큐베이터로 복귀시켰다. 1시간 인큐베이션의 마지막에, 570 nm에서의 흡광도를 플레이트 판독기 상에서 측정하였다.

결과를 시험된 샘플 대비 570 nm에서의 O.D.를 그래프화함으로써 분석하였다.

결과: 알라마르 블루 판독은 플레이트에 살아 있는 세포의 수에 비례한다. Sirt2를 지지하는 복숭아 꽃 추출물로 처리함으로써, 본 발명자들은 성숙한 인간 진피 섬유모세포 (62 년령)에서 세포 수의 증가를 측정하였다.

결론: 성숙한 피부 세포에서의 SIRT2의 지지는 그들을 증식하게 도우며, 이는 SIRT2가 세포가 분열하는데 필수적인 미소관 상의 세포골격과 관련되기 때문에 타당하다.

결과를 도 8에 예시한다.

표. 9 - 복숭아 꽃 추출물로의 처리 후의 흡광도 @ 570 nm를 통해 측정된 평균 세포 수

Claims (22)

1. 하기 단계를 포함하는, 복숭아 꽃 (프루누스 페르시카 엘.(Prunus persica L.))으로부터 추출물을 얻는 방법:
   (i) 물을 복숭아 꽃에 첨가하여 혼합물을 제조하는 단계,
   (ii) 온도를 RT 내지 50℃의 범위로 유지하여 상기 혼합물을 2시간 동안 교반하는 단계,
   (iii) 혼합물을 여과하여 고체 꽃 부분을 제거하여 추출물을 얻는 단계,
   (iv) 추출물을 70℃ 미만의 온도에서 밤새 저온살균하는 단계.
2. 제1항에 있어서, 상기 복숭아 꽃이 분홍색 색상인 방법.
3. 삭제
4. 제1항에 있어서, 단계 (ii)가 50℃의 온도에서 실시되는 것인 방법.
5. 제1항에 있어서, 상기 복숭아 추출물이 건조된 복숭아 꽃으로부터 얻어지는 것인 방법.
6. 제1항에 있어서, 단계 (iv)의 상기 추출물이, 추출물을 얻기 위해 약 50 μm 내지 약 20 μm 다공도로부터 약 0.5 μm 내지 약 0.2 μm까지의 순차적 여과에 의해 추가로 정화되는 것인 방법.
7. 제1항에 있어서, 단계 (iv)의 상기 복숭아 꽃 추출물이 이어서 물, 글리세롤, 에탄올, 프로판디올, 부틸렌 글리콜, 디프로필렌 글리콜, 에톡실화 또는 프로폭실화 글리콜, 시클릭 폴리올 또는 이들 용매의 임의의 혼합물로부터 선택된 용매에 희석되는 것인 방법.
8. 제1항의 방법에 의해 얻어진 복숭아 꽃 추출물.
9. 제8항에 있어서, 10 kDa 미만의 분자량을 갖는 화합물을 포함하는 복숭아 꽃 추출물.
10. 제8항에 있어서, DPPH 자유 라디칼-스캐빈징 활성이 80 mg/L 미만인 복숭아 꽃 추출물.
11. 제8항에 있어서, 상기 복숭아 꽃 추출물이 8 내지 15 g/kg의 건조 물질, 2 내지 8 g/L의 단백질, 2 내지 8 g/L의 당, 0.2 내지 2 g/L의 아미노산; 및 0.2 내지 2 g/L의 페놀성 화합물을 포함하는 것인 복숭아 꽃 추출물.
12. 제11항에 있어서, 페놀성 화합물이 카페인산, 카테킨, 로즈마린산, 갈산, 쿠마르산 및 히드록시벤조산을 포함하는 것인 복숭아 꽃 추출물.
13. 제1항의 방법에 따라 얻어진 복숭아 꽃 추출물을 포함하며, 여기서 상기 복숭아 꽃 추출물이 10 kDa 미만의 분자량을 갖는 화합물 및 생리학적으로 허용되는 매질을 포함하는 것인 화장료 조성물.
14. 제13항에 있어서, 상기 복숭아 꽃 추출물이 조성물의 총 중량의 약 0.0001 중량% 내지 약 20 중량%의 농도로 사용되는 것인 화장료 조성물.
15. 제13항에 있어서, 상기 복숭아 꽃 추출물이 조성물의 총 중량의 약 0.0005 중량% 내지 약 5 중량%의 농도로 사용되는 것인 화장료 조성물.
16. 제13항에 있어서, 상기 조성물이 국소 적용에 적합화된 형태인 화장료 조성물.
17. 제13항에 있어서, 상기 조성물이 겔, 크림, 밤, 밀크 또는 포밍 조성물의 형태인 화장료 조성물.
18. 제13항에 있어서, 적어도 1종의 다른 활성제를 추가로 포함하는 화장료 조성물.
19. 제13항에 있어서, 항산화제, 식물의 가수분해물, 합성 펩티드 화합물, 선스크린 및 주름 방지제로부터 선택된 적어도 1종의 다른 활성제를 추가로 포함하는 화장료 조성물.
20. 제1항의 방법에 따라 얻어진 복숭아 꽃 추출물을 포함하는 화장료 조성물을 피부, 점막 및/또는 표재 피부 부속기에 국소적으로 적용하는 것을 포함하며, 여기서 복숭아 꽃 추출물은 생리학적으로 허용되는 매질 중에 10 kDa 미만의 분자량을 갖는 화합물을 포함하는 것인, 피부 및 케라틴성 부속기의 노화 및 광-노화의 징후를 감소시키고/거나 교정하는 방법.
21. 제20항에 있어서, 화장료 조성물을 치료되는 피부 상에 국소적으로 적용하는 것을 포함하고, 자외선 조사로 인한 공격에 대해 피부를 보호하기 위한 것인, 피부 및 케라틴성 부속기의 노화 및 광-노화의 징후를 감소시키고/거나 교정하는 방법.
22. 제1항의 방법에 따라 얻어진 복숭아 꽃 추출물을 포함하는 화장료 조성물을 피부, 점막 및/또는 표재 피부 부속기에 국소적으로 적용하는 것을 포함하며, 여기서 복숭아 꽃 추출물은 생리학적으로 허용되는 매질 중에 10 kDa 미만의 분자량을 갖는 화합물을 포함하는 것인, SIRT2 발현을 조정하는 방법.

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