CN109862878B - 桃花的水性提取物和制备其的方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种从桃花提取物(Prunus persica L.)中获得用于皮肤化妆用途的提取物的方法、可通过该方法获得的桃花提取物和包含所述提取物的化妆品组合物。本发明进一步提供了一种调节SIRT2表达的方法，一种用于减少和/或修正皮肤和角质附属物的老化和光老化迹象并保护皮肤免受紫外线辐射引起的侵害的治疗方法。

Description

桃花的水性提取物和制备其的方法

技术领域

本发明属于化妆品领域，且更具体而言，属于皮肤护理领域。本发明涉及通过水性提取制备桃花(Prunus Persica)提取物的方法，可通过该方法获得的桃花提取物和包含该桃花提取物的化妆品组合物。

本发明还涉及调节SIRT2表达的方法，涉及设计用于减少和/或修正皮肤和角质附属物的老化和光老化迹象的美容方法，并涉及保护皮肤免受由于紫外线辐射的侵害。

桃花提取物可单独使用或与其他活性剂组合使用。

背景技术

皮肤是由几层(真皮、增生层和角质层)组成的重要器官，其覆盖整个身体表面并确保保护、敏感、免疫、代谢或体温调节功能。与其他器官一样，皮肤会老化。

例如，皮肤的外观通过各种类型的内部(疾病和激素变化，例如怀孕)或外部侵害(环境因素，例如污染、阳光、病原体等)来改变。然后可能出现皱纹和细纹、色素沉着过度或色素沉着不足的瑕疵、皮肤干燥甚至脱水、表皮变薄、弹性组织变性、不完美、老年斑等。所有这些变化不仅影响皮肤，还影响角质附属物如指甲和毛发。

已知由细胞内代谢或外部侵害产生的化学不稳定和非常活泼的种类(species)的自由基在老化过程中起关键作用，尤其是在氧化的受损蛋白质的形成中(Harman et al.“Aging:a theory based on free radical and radiation chemistry”J.Gerontol.,11,298-300)。这些外部侵害可包括：紫外线辐射、毒素、大气污染物、营养氧化剂。紫外线辐射皮肤暴露诱导大量活性氧(ROS)产生。它们可以与DNA、蛋白质、脂肪酸和糖类发生反应，引起氧化损伤。

在皮肤中，观察到过早老化发生在暴露于紫外线辐射的区域，其特征在于大分子改变的现象(脂质过氧化、蛋白质的羰基化)，特别是影响弹性蛋白、胶原蛋白或纤连蛋白。

氧化损伤积累的重要后果之一是细胞产生ATP的能力降低(Porteous et al.,EurJ Biochem 1998,257(1):192-201)。因此，细胞老化的现象与细胞经历的氧化损伤有关，而且与细胞存活所必需的能量产生过程有关。

人类sirtuin家族包含7种蛋白质，在整个进化过程中非常保守，称为SIRT1至SIRT7。“SIRT2蛋白质”主要位于细胞质中，并在氧化应激反应、炎症、有丝分裂进展、微管动力学、细胞迁移、长寿中发挥作用。在细胞质中，SIRT2与微管共定位并使其去乙酰化。在有丝分裂期间，它被转移到细胞核，在那里它使组蛋白去乙酰化并调节染色体凝缩(SerranoL.et al.,“The tumor suppressor SirT2regulates cell cycle progression andgenome stability by modulating the mitotic deposition of H4K20methylation”,Genes&Dev.2013.27:639-653)。因此，SIRT2起到有丝分裂检查点的作用：它调节有丝分裂进展和有丝分裂退出(Bosch-PreseguéL.and Vaquero A.,“Sirtuins in stressresponse:guardians of the genome”,Oncogene(2014)33,3764–3775)。此外，纺锤体组装检查点蛋白BubR1的稳定性受SIRT2控制，并且BubR1随时间的下降与哺乳动物老化有关(North B.J.et al.,“SIRT2induces the checkpoint kinase BubR1to increaselifespan”,The EMBO Journal,2014,33,Issue 13,1438-1453)。因此，SIRT2可通过保留BubR1途径与增加的细胞寿命相关联。

SIRT2对BubR1的Lys668的去乙酰化抑制了BubR1的遍在蛋白化(ubiquitination)及其对蛋白酶体的指定。减少BubR1丰度的种系突变导致非整倍性。

从现有技术中已知许多化妆品以某种方式以油或提取物形式含有植物基原料。在大多数情况下，使用各个植物的已知有利效果来实现相应的整体效果。

本发明的目的是开发一种新型植物提取物，其表现出活化SIRT2表达。专利EP1868632公开了能够活化sirtuin(SIRT1)蛋白的内源性合成的合成肽，并且已经由发明人鉴定能够活化SIRT 2。基于该知识，发明人寻找包含与那些鉴定为活化SIRT2肽的序列同源的序列的植物。使用全面的蛋白质序列数据库如BLAST遵循标准程序(William Pearson,“An Introduction to Sequence Similarity(“Homology”)searching”,Curr ProtocBioinformatics.June 2013)进行序列相似性检索以鉴定同源序列。该检索允许发明人选择桃(Prunus persica)作为良好的候选者。

根据本发明的桃花提取物显示出sirtuin SIRT2蛋白质在皮肤中的表达增加。

桃(Prunus persica)的物种名称是指它在波斯的广泛种植，从那里被移植到欧洲。它属于李属(Prunus)(包括樱桃和李子)，其为蔷薇科(Rosaceae)。遗传研究表明，桃起源于中国，自公元前2000年左右的早期中国文化就开始种植。

桃在中药中长期以来一直用于治疗皮肤病。在韩国，桃花一直是女性和男性信件的最佳灵感来源。除了这种缪斯的特质之外，桃花还被用于每天的生活中，用于食物装饰或浸剂。

桃花是韩国女性美的象征。桃花的浸剂曾经非常受上流社会女性的欢迎，她们知道它对肤色的有益特性。桃花，通常作为茶食用，被认为可以促进健康、看上去年轻的皮肤。报道与桃花有关的药理学研究的文献非常有限。

已知桃花富含多酚化合物，例如酚酸和黄酮类。这些分子可以作为超氧阴离子、单线态氧、羟自由基和脂质过氧自由基的清除剂。许多黄酮类如槲皮素、木犀草素和儿茶素是比营养素维生素C和β-胡萝卜素更好的抗氧化剂(Svobodova et al.,“Natural phenolicsin the prevention of UV-induced skin damage.A Review”Biomed.Papers 147(2),137–145(2003))。受控水解使这些化合物得以释放。桃叶在传统医学中用作驱虫剂和镇静剂(Nadkarni，1976)。Cevallos-Casals等报道富含酚类和花色素的桃果实具有良好的抗氧化和抗菌活性(Cevallos-Casals et al.,“Selecting new peach and plum genotypesrich in phenolic compounds and enhanced functional properties”,Food Chemistry96(2006)273–280)。粉红色的桃花，通常作为茶饮用，是催泻剂，被认为可以促进健康、看上去年轻的皮肤。桃花是韩国女性美的象征。桃花的浸剂曾经非常受上流女性的欢迎，她们知道它对肤色的有益特性。

已经在桃花中鉴定了一些黄酮类，例如山萘酚糖苷衍生物multiflora B、三叶豆甙、阿福豆甙和黄芪甙。此外，还证实了multiflora B的皮肤保护作用(Young ha Kim etal.,“The extract of the flowers of Prunus persica,a new cosmetic ingredient,protects against solar ultraviolet-induced skin damage invivo”,j.Cosmet.Sci.,53,27-34(January/February 2002))。

已经使用粉色的桃花来获得提取物。花中富含丰富的多酚类化合物以及黄酮类，且特别是在粉色的花中富含特定的黄酮类，即其与白花相比赋予花粉色的花色素(anthocyanins)。

已经证明花色素具有广谱的生物学功能，并且可以像黄酮类家族的其他成员一样起到良好的抗氧化作用。

抗氧化剂作为健康保护因子起着重要作用。天然存在的抗氧化剂的主要来源是全谷类、果实、花和蔬菜。植物抗氧化剂是维生素C、维生素E、胡萝卜素、酚酸、黄酮类。它们被认为具有降低疾病风险、抗老化作用的潜力。根据2,2-二苯基-1-苦基肼(DPPH)的方法研究了粉色桃花提取物的抗氧化作用。

桃提取物在化妆品组合物中的用途在现有技术中是已知的。大多数提取物是完全提取物或水-醇提取物。例如，日本专利申请JP-A-2001302439公开了一种化妆品，其具有对弹性蛋白酶和胶原酶的抑制作用来预防皮肤老化，通过包括通过高温提取方法获得的白色桃Batsh提取物。韩国专利KR-526637公开了一种用于皮肤老化保护的抗紫外线和化妆品组合物，包括阿魏酸和桃花提取物，其中包括活性成分中的0.1-20.0重量％的桃花提取物和0.1-20.0重量％的阿魏酸，皮肤的稳定性得到改善。日本专利申请JP-A-2016053008公开了一种桃提取物的制备方法，其具有活性氧消除能力，进一步用己烷/水对所得提取物进行分段提取，并含有鞘糖脂(神经酰胺组分)。韩国专利KR-1429117公开了一种含有桃花提取物的皮肤美白组合物，该组合物是通过从桃花中除去花(花丝)并仅使用花萼、干燥样品、粉碎样品，经均化器的步骤获得的。采用在由以下溶剂中提取的步骤：水、C3-6的低级醇和C3-6的低级有机酸。用滤纸过滤后，将得到的提取物冷冻干燥。与现有技术不同，本申请提供了一种提取具有高多酚含量且不含神经酰胺的桃花提取物的有效方法。

尽管市场上有各种用于处理皮肤的抗衰老化妆品，但仍需要有效的表面施用的化妆品组合物，其作为活性剂，使用天然成分为皮肤、毛发和/或指甲提供抗老化或恢复活力的有益效果。非自然的、化学合成的产品可能被认为是环境或个人不安全的。相比之下，天然产品被认为是纯净的、温和的、并且优于化学合成的产品。已知从植物或草药中提取的许多天然产品含有抗氧化剂/自由基清除剂，其可以中和自由基的损伤作用。另外，它们可含有刺激真皮中受损结缔组织结构和表皮屏障功能的合成和恢复的试剂。

仍然需要能够解决老化迹象特别是皱纹、细纹和下垂的外观的化妆品组合物。因此，本发明的一个目的是提供用于处理、改善和/或预防老化的或在老化中的皮肤迹象的新组合物和方法。本发明的另一个目的是改善老化的或在老化中的皮肤的整体外观。

上述介绍仅用于提供对本领域所面临问题的本质的更好理解，不应以任何方式解释为对现有技术的承认，也不应将本文中任何参考文献的引用解释为承认此参考文献构成本申请的“现有技术”。

发明内容

本发明的主要方面提供了一种获得含有桃(Prunus persica L.)属植物的花的提取物的方法，包括以下步骤：

(i)将水加入桃花中制成混合物，

(ii)通过将温度保持在室温(RT)至高于70℃来搅拌所述混合物。

(iii)过滤混合物以除去固体花部分以获得提取物。

另一方面，本发明提供一种化妆品组合物，其包含通过水性提取获得的桃花提取物，其中所述桃花提取物包含在生理学上可接受的介质中分子量小于10kDa的化合物。

在另一个方面，本发明提供了一种减少和/或修正皮肤和角质附属物的老化和光老化迹象的方法，包括向皮肤、粘膜和/或表面皮肤附属物表面施用化妆品组合物，所述化妆品组合物包含通过水性提取获得的桃花提取物，其中桃花提取物包含在生理学上可接受的介质中分子量小于10kDa的化合物。

另一方面，本发明提供了调节SIRT2表达的方法，包括向皮肤、粘膜和/或表面皮肤附属物表面施用包含通过水性提取获得的桃花提取物的化妆品组合物，其中所述桃花提取物包含在生理学上可接受的介质中分子量小于10kDa的化合物。

附图说明

通过附图可以理解本发明的其他实施方案。

图1是角质形成细胞上SIRT2mRNA研究的定量的图示

图2是成纤维细胞的SIRT2mRNA研究的定量的图示

图3是角质形成细胞的BubR1mRNA研究的定量的图示

图4是成纤维细胞的衰老相关β-半乳糖苷酶(SAβ-gal)活性研究的图示

图5是显微镜观察成纤维细胞上BubR1染色的图示

图6是成纤维细胞的β-半乳糖苷酶衰老标记物活性的图示

图7是通过荧光标记物系统定量成纤维细胞的图示

图8是通过570nm处吸光度测量的平均细胞数的图示

具体实施方式

本文公开了本发明的具体实施方案；然而，应该理解，所公开的实施方案仅仅是对可以以各种形式实施的本发明的说明。因此，在此公开的具体结构和功能细节不应被解释为限制性的，而仅仅作为用于教导本领域技术人员以各种方式使用本发明的代表性基础。

无论何时通过指代范围来确定术语，该范围将被理解为明确地公开其每个要素。作为非限制性实例，1-10％的范围应理解为包括1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％和10％，和所有在1到10％之间的值。

当两个或更多个取代被称为“选自”一组列举的选择时，意指每个取代可以是该组的任何元素，与其他取代的特性无关。

除非另有规定，如本文所用，“％”是指重量％，即组分相对于组合物总重量的重量百分比(即，包括任何载剂、载体、溶剂、填充剂或在施用于皮肤之前添加的其他组分)。

除非另有说明，否则本文使用的所有术语旨在具有其普通含义。出于描述和要求保护本发明的目的，定义了以下术语：

“提取物”应理解为从天然来源提取的任何物质或分离的制剂，无论提取方法或成分如何。该术语以广义使用，包括例如可溶于水的成分或使用溶剂从天然物质中提取的有机溶剂，或天然物质的特定成分。

“水性提取物”应理解为通过用水提取获得的化合物的混合物。

术语“肽”表示通过肽键或通过经修饰的肽键连接在一起的两个或几个氨基酸的序列；且多肽表示较大尺寸的肽。术语“肽”是指如上所述的本发明的天然或合成肽，或其序列完全或部分地由前述序列构成的至少任何天然或合成肽。

通过“生理学上可接受的”理解，根据本发明的活性剂或含有所述试剂的组合物适于与皮肤或粘膜接触而不会引起毒性或不耐受反应。

“老化和光老化的皮肤迹象”是指由于老化导致的皮肤外观和皮肤附属物的所有变化，例如皮肤变薄、下垂、失水和张力缺失、深皱纹和细纹、硬度和色泽的丧失、皮肤萎缩或由于暴露于紫外线而导致的任何其他内部皮肤退化、雀斑和老年斑。雀斑也被称为“太阳斑”、“老年性雀斑样痣”、“老年斑”、“衰老斑”，是由于暴露于来自太阳的紫外线辐射而导致与老化和光老化相关的皮肤上的瑕疵。它们的颜色范围从浅棕色到红色或黑色，且位于最常暴露在阳光下的区域，特别是手、脸、肩膀、手臂和前额、以及头皮(如果是秃头)。

“抗老化益处”，抗老化益处包括但不限于以下一种或多种：(a)治疗、减少和/或预防细纹或皱纹，(b)减少皮肤毛孔尺寸，(c)改善皮肤厚度、饱满度和/或紧绷度；(d)改善皮肤柔韧性和/或柔软度；(e)改善肤色、光泽和/或透明度；(f)改善前胶原和/或胶原蛋白产生；(g)改善皮肤质地和/或促进再造(retexturization)；(h)改善皮肤屏障修复和/或功能；(i)治疗和/或预防皮肤下垂或萎缩；(j)改善皮肤轮廓的外观；(k)恢复皮肤光泽和/或亮度；(l)补充皮肤中必需的营养素和/或成分；(m)改善更年期变差的皮肤外观；(n)改善皮肤保湿和/或水分；以及(o)改善皮肤弹性和/或回弹。

本发明中的物种名称“Prunus persica”是指它在波斯的广泛种植，从那里被移植到欧洲。它属于李属(Prunus)(包括樱桃和李子)，其为蔷薇科(Rosaceae)。遗传研究表明，桃起源于中国，自公元前2000年左右的早期中国文化就开始种植。桃在中医中长期以来一直用于治疗皮肤病(Young ha Kim et al.,“The extract of the flowers of Prunuspersica,a new cosmetic ingredient,protects against solar ultraviolet-inducedskin damage in vivo”,j.Cosmet.Sci.,53,27-34,January-February 2002)。

如本文所用，“皮肤”是指构成皮肤、粘膜和皮肤附属物的所有覆盖组织，包括毛发、睫毛和眉毛。

“表面施用”应理解为在皮肤表面或粘膜上施用或涂抹含有所述桃花提取物的组合物。

本文描述的是通过从干燥的桃花获得提取物的方法，包含该提取物的化妆品组合物，通过向皮肤表面施用包含桃花提取物的组合物减少和/或修正皮肤和角质附属物的老化和光老化迹象的方法，以及调节SIRT2表达的方法。

抗氧化剂作为健康保护因子起着重要作用。科学证据表明，抗氧化剂降低慢性病如癌症和心脏病的风险。天然存在的抗氧化剂的主要来源是全谷类、果实、花和蔬菜。植物抗氧化剂是维生素C、维生素E、胡萝卜素、酚酸、黄酮类。

根据本发明的桃花提取物显示出sirtuin SIRT2蛋白质在皮肤中的表达增加。“SIRT蛋白”是NAD+依赖性脱乙酰酶，且属于Sir2sirtuin家族。sirtuin的脱乙酰酶或单-ADP-核糖基转移酶活性使它们能够调节一些组蛋白的乙酰化水平。因此，它们通常通过影响染色质、诱导基因沉默、DNA损伤信号传导、DNA修复和细胞周期调节来发挥其功能。实际上，sirtuins是响应代谢、氧化或基因毒性应激的关键因素。

已知根据本发明的桃花提取物富含多酚化合物，例如酚酸和黄酮类。已知其抗氧化活性的所有这些水溶性分子有助于提供根据本发明的桃花提取物的抗氧化剂效力。通过氯化铝比色法估算提取物中的黄酮类含量。氯化铝(AlCl3)比色法的原理是AlCl3与C-4酮基、和提取物的黄酮或黄酮醇的C-3或C-5羟基形成酸稳定的复合物。在分光光度计上在410nm处读取样品的吸光度。使用芦丁标准曲线以芦丁当量测定黄酮类含量。测得的总黄酮含量为200mg/kg提取物。

这些分子可以作为超氧阴离子、单线态氧、羟基自由基和脂质过氧自由基的清除剂。许多黄酮类如槲皮素、木犀草素和儿茶素都是比营养素维生素C、维生素E和β-胡萝卜素更好的抗氧化剂(Svobodova et al.,“NATURAL PHENOLICS IN THE PREVENTION OF UV-INDUCED SKIN DAMAGE.A REVIEW”Biomed.Papers 147(2),137–145(2003))。特别是粉色的花被发现富含特定的黄酮类化合物，即与白花相比赋予花粉色的花色素。

在优选的实施方案中，粉色花已用于获得根据本发明的提取物。

多酚化合物被认为是强大的抗氧化分子。“多酚化合物”是在具有抗氧化特性的天然植物食物来源中大量存在的化合物。它们是指所有类型的多酚，它们是指包含至少一个二酚芳环的化合物，酚基可任选醚化或酯化。它们也可以简称为“多酚”。多酚类在维持健康和保健方面发挥着重要作用。抗氧化剂作为一个组有助于保护体内的细胞免受自由基的伤害，从而控制老化的速度。抗氧化剂可分为三大类：类胡萝卜素、烯丙基硫化物(在大蒜和洋葱中发现)、多酚类(也称为酚类)。

多酚类可以进一步分为四类：酚酸类、黄酮类、木脂素类和芪类，基于它们含有的酚环的数量，并且基于将这些环彼此结合的结构元素，具有额外的亚组。

酚酸是一种叫做多酚的植物化学物质，存在于各种基于植物的食物中；水果的种子和皮以及蔬菜的叶子含有最高浓度。酚酸很容易通过肠道壁吸收，且它们可能有益于健康，因为它们可以作为抗氧化剂，防止由于自由基氧化反应引起的细胞损伤。在自然界中发现了许多不同的酚酸，且它们可以分为两类：苯甲酸衍生物，如没食子酸；和肉桂酸衍生物，包括咖啡酸和阿魏酸。肉桂酸比苯甲酸更常见。

黄酮类化合物是最大的多酚类化合物家族；它们具有由2个芳环(A和B)组成的结构，所述芳环由3个碳原子键合在一起形成氧化的杂环(环C)。根据所涉及的杂环类型，黄酮类进一步分为6个亚类：黄酮醇、黄酮、异黄酮、黄烷酮、花色素和黄烷醇(儿茶素和原花色素)。植物产生黄酮类，以防止寄生虫、氧化损伤和恶劣的气候条件。

植物黄酮类有三大类(花色素、原花色素和黄酮醇)，通过支链黄酮类生物合成途径合成。花色素是最重要的黄酮类类别，其是花和果实中的主要色素；这些色素对于授粉和种子传播所必需的昆虫吸引是至关重要的(Winkel-Shirley,“Flavonoid Biosynthesis.AColorful Model for Genetics,Biochemistry,Cell Biology,and Biotechnology”,Plant Physiol.Vol.126,2001)。碱性花色素主要由天竺葵素、花青苷和飞燕草碱组成；可能会发生这些化合物的各种修饰，例如糖基化、酰化和甲基化，这有助于花色的多样性(Morata et al.,“Formation of the highly stable pyranoanthocyanins(vitamins Aand B)in red wines by the addition of pyruvic acid and acetaldehyde”,FoodChemistry 100(2007)1144–1152)。花色素也被证明具有广谱的生物学功能，并且可以像黄酮类家族的其他成员一样起到良好的抗氧化作用。

花色素沉着涉及复杂的多酶生物合成途径，其中几个酶促反应导致黄酮类化合物的产生和积累。黄酮类在许多生物过程中起重要作用，例如紫外线防护(Li et al.,“Arabidopsis Flavonoid Mutants Are Hypersensitive to UV-6lrradiation”,ThePlant Cell,Vol.5,171-179,February 1993)、病原体防御(Treutter,“Significance ofFlavonoids in Plant Resistance and Enhancement of Their Biosynthesis”,PlantBiology 7(2005)581–591)和花粉活力(Taylor,LP and Jorgensen R(1992).“Conditional male fertility in chalcone synthase-deficient petunia”.J.Hered.83:11-17.)。桃花中含有特定的黄酮类，四种山柰酚糖苷衍生物(multiflorinB、三叶豆甙、阿福豆甙、和黄芪甙)，且证明multiflorin B具有皮肤保护作用(Young haKim et al.,“The extract of the flowers of Prunus persica,a new cosmeticingredient,protects against solar ultraviolet-induced skin damage in vivo”,j.Cosmet.Sci.,53,27-34(January/February 2002))。

在本发明中使用的“黄酮类”中，可特别提及花旗松素、儿茶素、表儿茶素、圣草酚、柚皮素、芦丁、曲克芦丁、白杨素、红橘、木犀草素、表没食子儿茶素没食子酸酯和表没食子儿茶素、槲皮素、非瑟酮、山奈酚、高良姜精、没食子儿茶素、表儿茶酸牻酸盐。

(Hassani et al.,(2015),“Analysis of biochemical compounds anddifferentially expressed genes of the anthocyanin biosynthetic pathway invariegated peach flower”,Genetic Mol Res.14(4):13425-36)提供了通过LC-MS分析对来自标记的杂色桃树的不同颜色(白色和粉色)花瓣中产生的化合物进行的比较研究。花青苷的几种糖基化衍生物(花青苷-3-葡萄糖苷、花青苷-3-(6″-丙二酰基葡糖苷)、花青苷-3-(6″-乙基丙二酰基葡糖苷))，以及天竺葵素(天竺葵素-3-葡萄糖苷、天竺葵素-3-(6″-乙基丙二酰基葡糖苷)和芍药苷(芍药苷-3-葡萄糖苷和芍药苷-3-(6″-乙基丙二酰基葡糖苷))在粉色花瓣中检测到；然而，在白色提取物中未检测到这些化合物。这些化合物特别是花青苷已在Jung等人于2014年发表的论文中描述了它们的抗氧化和抗炎作用。它们被认为具有降低疾病风险、抗老化作用的潜力。粉色桃花提取物的抗氧化作用已根据2,2-二苯基-1-苦基肼(DPPH)的方法研究。

根据DPPH的方法研究了根据本发明的粉色桃花提取物的抗氧化作用。DPPH测定是一种快速、简单的测量抗氧化能力的方法，涉及使用自由基、2,2-二苯基-1-苦基肼(DPPH)，其广泛用于测试化合物作为自由基清除剂或氢的供体的能力，以及用于评估抗氧化活性。

DPPH测定方法基于DPPH的还原，DPPH是稳定的自由基。具有奇数电子的自由基DPPH在515nm处产生最大吸收(紫色)。当DPPH溶液与可以提供氢原子的物质混合时，然后这会产生其还原形式(二苯基三硝苯肼；非自由基)，伴随着紫罗兰色消失为从仍然存在的苦基而来的残留的淡黄色(Prieto P,Pineda M,and Aguilar M(1999),“Spectrophotometric quantitation of antioxidant capacity through theformation of a phosphomolybdenum complex:Specific application to thedetermination of vitamin E″,Anal Biochem 269,337-341)。

本发明的一个优点是与叶子、果实、根或植物的任何其他部分相比，粉色的桃花高度富含不同的感兴趣的化合物。

本发明提供一种从桃(Prunus persica)物种中获得的桃花提取物，且更优选地，从整个花中获得桃花提取物。

根据本发明，“整花”或“桃花”包括花瓣和萼片。花可以是新鲜的或干燥的。优选地，通过自然空气阴干或在热空气烘箱中在45℃干燥48小时或在15℃干燥72小时将花干燥。

根据本发明的桃花提取物可以通过水性提取获得。在桃提取物中发现的大量化合物可能具有水溶性的生物活性。

在一个优选的实施方案中，本发明提供了一种从桃花(Prunus persica L.)中获得提取物的方法，所述方法包括：

(i)将水加入桃花中制成混合物，

(ii)通过将温度保持在从室温(RT)至低于70℃2小时来搅拌所述混合物。

(iii)过滤混合物以除去固体花部分以获得提取物。

(iv)在低于70℃的温度下将混合物巴氏杀菌过夜。

花可以是新鲜的或干燥的。在一个优选的实施方案中，将花干燥并将水加入干燥的花中以制备混合物。可以进行任何公知的干燥方法，例如自然阴干或烘箱干燥。在最优选的实施方案中，将花在烘箱中在15℃至45℃的温度干燥48小时至72小时。

在优选的实施方案中，将桃花材料浸渍在水中。在室温至低于70℃的温度将溶液短时间温和浸渍2小时。最优选地，温度保持在RT至50℃之间，以保持感兴趣的分子(例如黄酮类和酚酸)的完整性，并从而保持它们作为抗氧化剂的能力。

提取温度的选择取决于所需待提取的化合物类型、植物来源(花、果实、茎、种子、叶、根)的结构特征、提取物所需的质量和产量、以及扩大这一进程的经济可行性。从植物材料中提取酚类化合物受提取温度和时间的影响，这反映了溶解和分析物通过氧化降解的相互矛盾的作用。然而，许多酚类化合物易于水解和氧化。长的提取时间和高温会增加酚类物质的氧化机会，从而降低提取物中酚类物质的产量。分析在不同温度进行，并表明高温会降解这些类型的分子。提取物具有复杂的结构，且加热使它们变性并失去其潜在的生物活性。已显示高温导致花色素快速降解。实际上，长时间提取和高温(70℃及以上)会增加氧化的机会，这会降低提取物中多酚化合物的产量，而4-5左右的pH也适合于多酚化合物的稳定性。因此，选择有效的提取温度以获得和保持酚类化合物的稳定性至关重要。

水性提取可以在室温下进行，或者也可以在加热至不超过70℃的水中进行，同时进行搅拌。优选地，通过在加热至50℃的水中浸渍2小时来进行提取。然后对原始溶液进行网格过滤(grid filtering)以除去不溶物质。在网格过滤后，收集水性或液态部分。为了除去较小的水性提取物残留物，可以通过本领域技术人员熟知的任何方法进行过滤。

在一个优选的实施方案中，纯化过程开始于使用孔隙从50-20μm减小至0.5-0.2μm的过滤器连续过滤以得到提取物。在另一个优选的实施方案中，所获得的提取物由分子量小于10kDa的蛋白质片段和肽组成，如通过十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)所证明的。获得的提取物是清澈明亮的溶液。

在另一个优选的实施方案中，然后将提取物用溶剂稀释至8g/Kg至13g/Kg，优选11g/Kg干物质的浓度，所述溶剂例如水、甘油、乙醇、丙二醇、丁二醇、双丙二醇、乙氧基化或丙氧基化二醇、环状多元醇或这些溶剂的任何混合物，例如30％甘油和0.85％苯氧基乙醇，保持pH在4.0-4.5之间。

然后，通过无菌过滤将稀释的活性剂灭菌。然后将溶液在65℃加热过夜以进行低温巴氏灭菌。

此外，可以定性和定量分析根据本发明的稀释的活性剂。特征如下：

-蛋白质：3-6克/千克，

-糖：3-6克/千克，

-氨基酸：0.5-1.5克/千克，

-酚类化合物：0.5-1.5克/千克，

-黄酮类：0.1-0.4克/千克。

-提取物不含任何神经酰胺或鞘脂。

桃花提取物的蛋白质含量已经通过Lowry蛋白质测定法测定(Lowry OH,Rosebrough NJ,Farr AL,Randall RJ(1951).“Protein measurement with the Folinphenol reagent”,J.Biol.Chem.193(1):265–75)，其已用于量化提取物的总蛋白质含量。Lowry测定法是用于确定溶液中蛋白质总水平的生化测定法。Lowry方法基于通过肽键的氧化产生的Cu+与Folin-Ciocalteu试剂的反应。在分光光度计上在550nm处读取样品的吸光度。使用BSA标准曲线测定蛋白质含量。

桃花提取物的氨基酸含量已经从Moore等人发表的方案测定(Moore et al,“Photometric ninhydrin method for use in the chromatography of amino acids”,Journal of Biological Chemistry 1948Vol.176pp.367-388)。在由试剂茚三酮破坏胺基和羧基官能团之后，通过形成有色复合物来评估提取物的游离氨基酸含量。在分光光度计上在570nm处读取复合物的吸光度。使用氨基酸库的标准曲线测定总氨基酸含量。

桃花提取物的总糖含量通过改编自Dubois等人描述的测定法(Dubois et al.(“Colorimetric Method for Determination of Sugars and Related Substances”,Anal.Chem.,1956,28(3),350–356)进行比色测定。该分析包括浓硫酸与苯酚反应形成有色复合物，在分光光度计上在490nm处读取复合物的吸光度，用葡萄糖标准曲线测定糖含量。

使用Folin-Ciocalteu测定法(Singleton et al.(1999).“Analysis of totalphenols and other oxidation substrates and antioxidants by means of Folin–Ciocalteu reagent”,299:152)测定桃花提取物的多酚含量。样品中的多酚化合物与Folin-Ciocalteu试剂反应，试剂的氧化产生蓝色。在分光光度计上在760nm处读取样品的吸光度。使用没食子酸标准曲线将含量表示为没食子酸当量。

进行SDS PAGE电泳以评估提取物的蛋白质的分子量。将桃花提取物在还原性变性条件下在变性样品缓冲剂中加热至70℃持续10分钟。将抗氧化剂溶液添加到内室(阴极)中，使得还原的蛋白质在电泳期间不再氧化。使用MES运行缓冲剂进行蛋白质迁移，使用标准

Sharp作为分子量标记。使用银染色进行蛋白质染色。

根据本发明的提取物的优点是小化合物更稳定和可再现，而没有过敏原作用。

另一方面，本申请提供了一种化妆品组合物，其包含通过水性提取获得的桃花提取物，其中所述桃花提取物包含分子量小于10kDa的化合物和生理学上可接受的介质。

在另一个优选的实施方案中，桃花提取物的存在浓度范围为组合物总重量的约0.0001重量％至约20重量％，优选0.0005重量％至约5重量％。

在另一个实施方案中，桃花提取物用于化妆品施用，更优选用于表面施用。

在另一个优选的实施方案中，本发明提供了本领域技术人员适用的口服、肠胃外或表面制剂，特别是用于化妆品或皮肤病学的组合物。有利地，根据本发明的组合物设计为表面给药。因此，这些组合物必须含有生理学上可接受的介质，即与皮肤和上皮附属物相容，并覆盖所有化妆品或皮肤病学形式。

此外，本发明的组合物优选为水溶液、水醇溶液或油溶液形式；水包油乳液、油包水乳液或多重乳液；适用于皮肤、粘膜、嘴唇和/或上皮附属物的乳膏、悬浮液、粉末。这些组合物也可以或多或少是流动的并且具有乳膏、乳液、乳、精华、润发油、凝胶、糊剂或慕斯的外观。它们也可以以固体形式存在，如棒，或者可以作为气溶胶施用于皮肤。它们还可以用作护肤产品和/或化妆产品。

在另一个实施方案中，该组合物包含在应用范围内设想的常规使用的添加剂以及用于其制剂的必要添加剂，例如共溶剂(乙醇、甘油、苯甲醇、阻尼剂......)、增稠剂、稀释剂、乳化剂、抗氧化剂、着色剂、阳光过滤剂、颜料、填充剂、防腐剂、香料、气味吸收剂、精油、低聚物、必需脂肪酸、表面活性剂、成膜聚合物、化学过滤剂或矿物质、保湿剂或热水等。水溶性，优选天然多聚物，可以引用例如多糖或多肽、纤维素衍生物如甲基纤维素或羟丙基纤维素类型、或甚至合成聚合物、泊洛沙姆、卡波姆、硅氧烷、PVA或PVP、且特别是由Ashland公司销售的聚合物。

已知根据本发明的活性剂可以单独使用或与其他活性成分结合使用。

此外，有利地，可根据本发明使用的组合物含有至少一种其他活性剂。可以以非限制性方式引用以下类型的成分：其他肽活性剂、植物提取物、愈合剂、抗老化剂、抗皱剂、平滑剂、抗自由基、抗紫外线辐射剂、用于刺激皮肤大分子合成或能量代谢的试剂、保湿剂、抗菌剂、抗真菌剂、抗炎剂、麻醉剂、调节皮肤分化、皮肤色素沉着或色素脱失的试剂、以及刺激指甲和毛发生长的试剂。

优选使用抗自由基或抗氧化剂，或刺激皮肤大分子合成或能量代谢的试剂。

在更具体的实施方案中，根据本发明的组合物将包含：

-防晒剂、防紫外线和红外线剂

-抗自由基试剂，

-DHEA(脱氢表雄酮)，

-至少一种细胞色素共活化化合物，和/或；

-一种(或多种)水通道蛋白活化化合物和/或；

-一种(或多种)sirtuin活化化合物和/或；

-一种(或多种)增加细胞粘附的化合物和/或；

-一种(或多种)增加胶原蛋白或层粘连蛋白类型的基质蛋白质产生的化合物；

-一种(或多种)HSP蛋白质调节化合物；

-一种(或多种)增加细胞能量的化合物；

-一种(或多种)色素沉着调节化合物，例如酵母、苋菜、亚麻籽、豆、可可、玉米、大豆、向日葵、油菜籽或豌豆肽提取物；

-一种(或多种)改善皮肤屏障功能的化合物；

-一种(或多种)线粒体保护化合物。

-维生素A，且特别是类维生素A、视黄醇、视黄醇丙酸酯、视黄醇棕榈酸酯，

-维生素B3，且特别是烟酰胺、生育酚的烟酸盐(niconitate)，

-维生素B5、维生素B6、维生素B12、泛醇，

-维生素C，且尤其是抗坏血酸、抗坏血酸葡糖苷、抗坏血酸四棕榈酸酯、抗坏血酸磷酸镁和抗坏血酸磷酸钠，

-维生素E、F、H、K、PP和辅酶Q10、金属蛋白酶抑制剂、金属蛋白酶组织抑制剂(TIMP)的活化剂，

-氨基酸，且特别是精氨酸、鸟氨酸、羟脯氨酸、羟脯氨酸二棕榈酸酯、棕榈酰甘氨酸、羟赖氨酸、蛋氨酸及其衍生物、N-酰化氨基酸，

-天然或合成肽，包括二肽、三肽、四肽、五肽和六肽及其亲脂性衍生物、异构体和与其他分子如金属离子(即铜、锌、锰、镁等)的复合物，以以下商品名销售的肽：

CHRONOGEN ^TM、LAMINIXYL IS ^TM、PEPTIDE Q10^TM、COLLAXYL ^TM(专利FR2827170，

)、PEPTIDE VINCI 01^TM(专利FR2837098，

)、PEPTIDE VINCI 02^TM(专利FR2841781，

)、ATPeptide ^TM(专利FR2846883，

)或序列Arg-Gly-Ser-NH2的合成肽(由

以商品名ATPeptide ^TM销售)；

-卤虫藻(Artémia salina)的提取物，以商品名GP4G ^TM(FR2817748，

)销售；

-植物肽提取物，如亚麻籽提取物(Lipigénine^TM，专利FR2956818，

)，大豆提取物、单粒小麦、葡萄藤、油菜籽、大米、玉米或豌豆；

-酵母提取物，例如Dynagen^TM，(专利FR2951946，

)或Actopontine^TM(专利FR2944526，

)；脱氢乙酸(DHA)，

-天然或合成植物甾醇，

-α-和β-羟基酸、硅醇，

-糖胺、葡萄糖胺、D-葡萄糖胺、N-乙酰基-葡糖胺、N-乙酰基-D-葡糖胺、甘露糖胺、N-乙酰甘露糖胺、半乳糖胺、N-乙酰半乳糖胺、

-多酚、异黄酮、黄酮类、如葡萄提取物、松树提取物、橄榄提取物、

-脂质如神经酰胺或磷脂、

-动物油如角鲨烯或角鲨烷、

-植物油如扁桃仁油(almond oil)、椰子油、蓖麻油、荷荷巴油、橄榄油、菜籽油、花生油、葵花籽油、小麦胚芽油、玉米胚芽油、大豆油、棉花油、苜蓿油、罂粟油、南瓜籽油、月见草油、小米油、大麦油、黑麦油、红花油、西番莲油(passion oil)、榛子油、棕榈油、杏仁油(apricot kernel oil)、鳄梨油、金盏花油、乙氧基化植物油或牛油树脂，上述化合物可以是天然的，例如植物的肽水解产物，或者也可以是合成的，例如肽化合物。

在另一个实施方案中，本申请提供了用于减少和/或修正皮肤和角质附属物的老化和光老化迹象的美容方法，包括向皮肤、粘膜和/或皮肤附属物表面施用包含根据本申请的桃花提取物的组合物。

显然，本发明一般是针对哺乳动物而设计的，且更具体地是针对人类而设计的。发明人确实已经确定了对于减少和/或由于皮肤和角质附属物的老化和光老化的皮肤迹象有用的生物活性，并保护皮肤免受紫外线辐射的侵害。

“老化和光老化的皮肤迹象”是指由于老化导致的皮肤外观和皮肤附属物的所有外观变化，例如皮肤变薄、下垂、失水和张力缺失、深皱纹和细纹、硬度和色泽的丧失、皮肤萎缩或由于暴露于紫外线而导致的任何其他皮肤的内部退化、雀斑和老年斑。

在另一个方面，本申请提供了保护皮肤免受紫外线辐射侵害的美容方法，其中将包含根据本发明的桃花提取物的化妆品组合物表面施用于待治疗的皮肤上。

在另一个实施方案中，本申请提供调节皮肤细胞中SIRT2表达的美容方法，其中将包含根据本发明的桃花提取物的化妆品组合物表面施用于待治疗的皮肤上。

该美容方法特有的实施方案也是由以上描述得出的。

通过阅读所提供的说明性的非限制性的实施例，可以更详细地看出本发明的其他优点和特征。

实施例1：桃花(Prunus persica L.)提取物的制备

粉色的桃花是从韩国全罗南道的潭阳获得的。通过自然空气阴干或在热空气烘箱中在45℃将花干燥48小时或在15℃干燥72小时。将50g干桃花(Prunus persica)置于1升蒸馏水中。将溶液在温度50℃加热2小时。然后使用过滤网格将固体花渣与液体部分分离。使用孔隙降低(0.5至0.2μm)的过滤器通过连续过滤开始纯化过程，以获得澄清、明亮的溶液。然后稀释滤液，得到10-12g/Kg干物质与30％甘油和0.85％苯氧基乙醇的提取物。将溶液的pH调节至4至5，以增加提取物的稳定性。在澄清和稀释后，然后在无菌条件下将滤液用0.2μm过滤器孔隙过滤灭菌。然后将溶液在65℃加热过夜以进行低温巴氏灭菌。使用标准程序分析桃花提取物。获得的桃花提取物的特征如下：干物质：11g/kg-蛋白质：4.5g/kg-糖：4.5g/kg-氨基酸：0.7g/kg和多酚化合物：1.1g/Kg。用于分光光度测定法以测定桃花提取物中不同化合物的量的方法：通过Lowry蛋白质测定法(Lowry等，1951)测定桃花提取物的蛋白质含量以定量提取物的总蛋白质含量。Lowry测定法是用于确定溶液中蛋白质总水平的生化测定法。Lowry方法基于通过肽键氧化产生的Cu+与Folin-Ciocalteu试剂的反应。在分光光度计上在550nm处读取样品的吸光度。使用BSA标准曲线测定蛋白质含量。已经从Moore等人(1948)公布的方案开始确定了提取物的氨基酸含量，在由试剂茚三酮破坏胺基和羧基官能团之后，通过形成有色复合物来评估提取物的游离氨基酸含量。在分光光度计上在570nm处读取复合物的吸光度。使用氨基酸池的标准曲线测定总氨基酸含量。

提取物的总糖含量通过改编自Dubois等人描述的测定法(Dubois et al,“Colorimetric Method for Determination of Sugars and Related Substances”,Anal.Chem.,1956,28(3),350–356)进行比色测定。该分析包括浓硫酸与苯酚反应形成有色复合物，在分光光度计上在490nm处读取复合物的吸光度，用葡萄糖标准曲线测定糖含量。

使用Folin-Ciocalteu测定法(Singleton et al.(1999).“Analysis of totalphenols and other oxidation substrates and antioxidants by means of Folin–Ciocalteu reagent”,299:152)测定桃花提取物的多酚含量。样品中的多酚化合物与Folin-Ciocalteu试剂反应，试剂的氧化产生蓝色。在分光光度计上在760nm处读取样品的吸光度。使用没食子酸标准曲线将含量表示为没食子酸当量。

进行SDS PAGE电泳以评估提取物的蛋白质的分子量。将桃花提取物在还原性变性条件下在变性样品缓冲剂中加热至70℃持续10分钟。将抗氧化剂溶液添加到内室(阴极)中，使得还原的蛋白质在电泳期间不再氧化。使用MES运行缓冲剂进行蛋白质迁移，使用标准

Sharp作为分子量标记物。使用银染色进行蛋白质染色。

获得的提取物由分子量小于10kDa的肽组成。

HPLC方案：

酚酸的色谱分析：通过Agilent 1260HPLC系统(Agilent Technologies，CA，USA)在柱Uptisphere CS evolution 100mm x 4.6mm x 2.6μm(ref Interchim：UE2.6AQ-100/046)上分离所有样品。流速为0.8ml min-1。流动相由在水溶液(A)和甲醇(B)中的0.1％TFA(三氟乙酸)组成。通过梯度程序促进洗脱如下(见表)：

表1–梯度洗洗

柱温保持在25℃。注射体积为20μL，且使用UV检测器将检测波长设定为280nm。氨基酸标准品购自Sigma-Aldrich。通过比较具有可靠标准的样品的保留时间和UV光谱峰来进行氨基酸的鉴定。基于样品浓度和标准的峰面积进行酚酸的定量估计。

氨基酸的色谱分析：通过Agilent 1260HPLC系统(Agilent Technologies，CA,USA)在柱Uptisphere Strategy C18-2 5μm(250x4.6mm)US5C182-250/046(refInterchim:UE2.6AQ-100/046)上分离所有样品。流速为1ml min-1。流动相由磷酸(H3PO4)0.1％溶液(A)和乙腈(B)组成。通过梯度程序促进洗脱如下(见表)：

表2-梯度洗脱

柱温保持在25℃。注射体积为5μL，且使用UV检测器将检测波长设定为254nm。氨基酸标准品购自Sigma-Aldrich。注射前的标准品和样品用异硫氰酸苯酯(PITC)衍生化。通过比较具有可靠标准的样品的保留时间和UV光谱峰来进行氨基酸的鉴定。基于样品浓度和标准的峰面积进行氨基酸的定量估计。

HPLC分析

表3–HPLC分析

过程(T℃)	酚酸总量(mg/Kg)	绿原酸含量(mg/kg)
			RT	534	422
50℃	478	342
			70℃	266	220

表4-HPLC分析–在温度50℃&70℃的结果

观察到与50℃相比，儿茶素含量在70℃非常低，儿茶素属于黄酮醇类，其是黄酮类化学家族的一部分，是一种天然酚和有效的抗氧化剂分子。随着温度升高，该分子的含量降低可以解释以下事实，即在70℃获得的提取物的抗氧化性低于在较低温度获得的提取物。

作为结论，已经表明在50℃进行的提取特异性地保留了儿茶素分子。

实施例2：通过qPCR对用实施例1的桃花提取物处理的角质形成细胞和成纤维细胞 的SIRT2mRNA研究

本研究的目的是通过qPCR测定实施例1的桃花提取物对人细胞中Sirtuin 2mRNA水平的影响。

方案：通过在细胞培养基中以0.5体积％稀释100ppm(“ppm”指百万分之一)的储备溶液来制备合成SIRT2肽的处理溶液。

通过在细胞的培养基中以0.1体积％或0.5体积％稀释实施例1的桃花提取物来制备桃花提取物的处理溶液。

将正常人角质形成细胞或正常人成纤维细胞用0.5体积％的合成SIRT2活化肽溶液或0.1体积％或0.5体积％的实施例1的桃花提取物处理24小时。首先使用RNeasy MiniKit(74106，Qiagen)提取总RNA；然后用HighCapacity cDNA Reverse Transcription Kit(4374966，Life technologies)逆转录总RNA。最后，在具有TaqMan Gene ExpressionMaster Mix(4369514，Lifetechnologies)和TaqMan Gene Expression Assays(Hs00247263_m1，Lifetechnologies)的热循环仪(Applied Biosystems)上进行实时PCR，其由两个引物和一个对序列特异性的探针组成。18S TaqMan Gene Expression Assays(Hs99999901_s1，Life technologies)用作内源对照，且比较Ct方法用于靶表达的相对定量。

结果：与未处理的细胞相比，在角质形成细胞和成纤维细胞上用桃花提取物处理后，SIRT2mRNA水平增加。水平非常显著地(学生t检验)升高，且在用0.1％处理后角质形成细胞和成纤维细胞分别增加64％和56％，在用0.5％处理后角质形成细胞和成纤维细胞分别增加88％和91％。

结论：用桃花提取物处理细胞24小时后，SIRT2mRNA水平在数量上增加。结果如图1和图2所示

表5-桃花提取物处理后角质形成细胞和成纤维细胞上SIRT2mRNA的表达

实施例3：用实施例1的桃花提取物处理的角质形成细胞的SIRT2蛋白质表达研究

本研究的目的是测定实施例1的桃花提取物对细胞中的Sirtuin 2蛋白质表达的影响。为此，通过免疫荧光对正常人角质形成细胞进行特异性标记。

方案：如实施例2中那样制备桃花提取物的处理溶液。

将正常人角质形成细胞用0.5％合成SIRT2活化肽的溶液或0.1体积％或0.5体积％的实施例1的桃花提取物的溶液处理2次，24小时。对于抗-SIRT2抗体的免疫标记，将细胞洗涤并用3.7％多聚甲醛固定10分钟。然后将细胞在特异性抗SIRT2抗体(Abcam,ref.ab19388，兔多克隆)的存在下孵育，且然后用合适的与荧光染料偶联的二抗孵育。在特定介质中封片后，通过落射荧光显微镜(Nikon Eclipse 80i显微镜)观察载玻片。

结果：显微镜观察显示用桃花提取物处理后角质形成细胞上的SIRT2染色增加。

结论：用桃花提取物处理24小时后，SIRT2蛋白质的表达在视觉上增加。

实施例4：用实施例1的桃花提取物处理的离体人皮肤活组织检查的SIRT2蛋白质 表达研究

本研究的目的是测定实施例1的桃花提取物对皮肤的Sirtuin 2蛋白质表达的影响。为此，通过免疫荧光对正常人皮肤活组织检查进行特异性标记。

方案：如实施例2中那样制备桃花提取物的处理溶液。

将正常人皮肤活组织检查用0.1体积％或0.5体积％的实施例1的桃花提取物溶液处理两次，24小时。为对抗-SIRT2抗体进行免疫标记，将组织用石蜡固定并包埋。然后切割包埋的皮肤活组织检查切片并将切片脱石蜡并再水合。然后，在应用特异性抗SIRT2抗体(Abcam，ref.ab19388，兔多克隆)之前进行去掩蔽方案，且然后应用与荧光染料偶联的合适的二抗。在特定介质中封片后，通过落射荧光显微镜(Nikon Eclipse 80i显微镜)观察载玻片。

结果：如表5所示，皮肤切片上SIRT2免疫荧光染色的显微镜观察显示，用桃花提取物处理后，SIRT2表达以剂量依赖性方式增加。增加呈剂量依赖性，并且比用合成肽处理更高。

结论：用桃花提取物处理24小时的皮肤活检组织中SIRT2蛋白质的表达在视觉上增加。

实施例5：通过qPCR对用实施例1的桃花提取物处理的角质形成细胞进行BubR1 mRNA研究

由于BubR1蛋白在SIRT2的控制下并且与哺乳动物老化相关，因此该研究的目的是通过qPCR测定实施例1的桃花提取物对人细胞中BubR1mRNA水平的影响。

方案：如实施例2中那样制备桃花提取物的处理溶液。

正常人角质形成细胞每天用0.1体积％或0.5体积％的实施例1的桃花提取物溶液处理2次，24小时。首先使用RNeasy Mini Kit(74106，Qiagen)提取总RNA；然后，用HighCapacity cDNA Reverse Transcription Kit(4374966，Life technologies)逆转录总RNA。最后，在具有TaqMan Gene Expression Master Mix(4369514，Life technologies)和TaqMan Gene Expression Assays(Hs01084828_m1，Life technologies)的热循环仪(Applied Biosystems)上进行实时PCR，其由两个引物和一个对序列特异性的探针组成。18S TaqMan Gene Expression Assays(Hs99999901_s1，Life technologies)用作内源对照，且比较Ct方法用于靶表达的相对定量。

结果：与未处理的细胞相比，用桃花提取物处理角质形成细胞后，BubR1mRNA水平增加。水平非常显著地(学生t检验)升高，角质形成细胞在0.1％处理后BubR1mRNA水平增加了46％，在0.5％处理后增加了42％。结果如图3所示。

结论：桃花提取物处理角质形成细胞24小时后，BubR1mRNA水平升高。

实施例6：用实施例1的桃花提取物处理的角质形成细胞和成纤维细胞的BubR1蛋 白表达研究

本研究的目的是测定实施例1的桃花提取物对细胞的BubR1蛋白表达的影响。为此，通过免疫荧光对正常人角质形成细胞和成纤维细胞进行特异性标记。

方案：如实施例2中那样制备桃花提取物的处理溶液。

将正常人角质形成细胞和正常人成纤维细胞用0.1体积％或0.5体积％的实施例1的桃花提取物溶液处理2次，24小时。为进行抗BubR1抗体的免疫标记，洗涤细胞并用3.7％多聚甲醛固定10分钟。然后将细胞在特异性抗BubR1抗体(Abcam,ref.ab4639，鼠多克隆)的存在下孵育，然后用合适的与荧光染料偶联的二抗孵育。在特定介质中封片后，通过落射荧光显微镜(Nikon Eclipse 80i显微镜)观察载玻片。通过使用Volocity 6.3软件分析图像来量化荧光强度。

结果：显微镜观察显示在用桃花提取物处理后，角质形成细胞和成纤维细胞上的BubR1染色非常显著地(学生t检验)增加。结果分别如图4和5所示。

表6–量化角质形成细胞和成纤维细胞的BubR1表达的显微镜观察

结论：桃花提取物处理细胞24h后，BubR1蛋白表达增加。

实施例7：用实施例1的桃花提取物处理的成纤维细胞的衰老相关β-半乳糖苷酶 (SAβ-gal)活性研究

本研究的目的是测定实施例1的桃花提取物在较长时间施用后对细胞的β-半乳糖苷酶衰老标记物的影响。

方案：如实施例2中那样制备桃花提取物的处理溶液。

对于12个亚培养物(P3至P15)，用0.1体积％或0.5体积％的实施例1的桃花提取物的溶液每天处理正常人成纤维细胞两次，并与P5中未处理的成纤维细胞进行比较。对于SAβ-gal活性染色，首先洗涤并固定细胞。然后将它们与SAβ-gal染色溶液一起孵育过夜。在特定介质中封片后，通过落射荧光显微镜(Nikon Eclipse 80i显微镜)观察载玻片。通过使用Volocity6.3软件分析图像来量化荧光强度。通过细胞数进行标准化。

结果：正如预期的那样，未处理的“年轻”成纤维细胞(P5)和未处理的衰老成纤维细胞(P15)之间的蓝色染色增加。当用桃花提取物分别以0.1％和0.5％处理成纤维细胞时，这种增加在统计学上分别显著(学生t检验)减少了17％和21％。

结论：桃花提取物长期处理的成纤维细胞中β-半乳糖苷酶衰老标志物的活性降低。结果在图6中示出。虽然已经参考某些优选实施方案详细描述了本发明，但是应该理解，本发明不限于那些精确的实施方案。相反，鉴于本公开描述了用于实践本发明的当前最佳模式，在不脱离本发明的范围和精神的情况下，本领域技术人员可以进行许多修改和变化。

实施例8：用实施例1的桃花提取物处理的真皮成纤维细胞的SIRT2活化研究。

本研究的目的是测定桃花提取物对人真皮成纤维细胞中Sirtuin 2细胞迁移的影响，使用实施例1的提取物进行测试。

方案：通过以0.2体积％、0.5体积％或1体积％稀释实施例1的桃花提取物来制备桃花提取物的处理溶液。

Oris迁移分析：

材料：

●Oris 96孔细胞迁移测定系统，胶原蛋白I包被(1包)，Cat#CMACC1.101

●细胞染色：

CellTracker Green Life Technologies 1mg，Cat#C2925

●胰蛋白酶：

胰蛋白酶EDTA 1x Corning，Cat#25-053-CI

●洗涤：

Dulbecco的磷酸盐缓冲盐水溶液(DPBS)1X，Cat#25-055-CV

●培养基：

Life Technologies的Dulbecco’s Modified Eagle Media(DMEM)，Cat#11965092

■有无补充

■对于补充的培养基，培养基补充有：

●Hyclone Fetal Bovine Serum(FBS)@10％，Cat#SH30071.03

样品测试：

1、对照：

仅限培养基

2、迁移阳性对照：

PDGF@10ng/ml Sigma Cat#P8147Lot#SLBN0763V

3、不含防腐剂的CR14031“桃提取物”(指从实施例1获得的桃花提取物)

Manuf：Ashland Vincience

代码：865810

前代码：CR14031

批次#RM15048

■0.2％(v/v)

■0.5％(v/v)

■1％(v/v)

方法

第1天：Oris迁移板的细胞接种和活性物预处理：

在接种之前从4℃冷藏中移除Oris细胞迁移测定，以使板达到室温。

在无菌细胞培养条件下，用来自Zen Bio Lot#DFM110210B的62岁第11代普通人真皮成纤维细胞(NHDF)以50μl培养基每孔向Oris迁移板以20,000个细胞每孔的密度接种。

然后，根据以下板布局(n＝10)，在指定的孔中加入与培养基等体积(50μl)的2x浓缩处理剂，在最终体积100μl的孔中得到1x处理剂。将板在95％湿度、5％CO₂和37℃的标准细胞培养条件下孵育24小时。

阴影孔未使用且剩余。

表7-实验板设计的图式

第2天：染色细胞，用活性物更新处理，开始迁移测定时间点。

第二天，从培养板中移除培养基和处理剂，将贴壁细胞在37℃温热的Dulbecco'sPBS中洗涤两次，以在染色前洗涤细胞。

使用10mM Cell Tracker Green溶液在无血清培养基中染色细胞，并在标准细胞培养条件下孵育30分钟。

在30分钟染色结束时，使用提供的工具除去Oris迁移测试中的专门的孔插入物，并除去CellTracker Green染色剂。

用预热的37℃ Dulbecco's PBS洗涤细胞两次，以除去任何受干扰的细胞和剩余的染料。

根据提供的平板布局在板中更新1X制备的处理剂，并使用荧光板读数器在以下设置下立即读取平板：在测定开始时指定t＝0，492nm ex/517nmem。在1、2、3、4、6、8和24小时取额外的时间点并记录数据。

结果：结果表明，桃花提取物处理增加了62岁人真皮成纤维细胞的细胞迁移，并且具有浓度依赖性。结果报告在表格中：

表8–用桃花提取物处理的人真皮成纤维细胞的细胞迁移

结论：通过桃花提取物支持Sirt2，我们能够帮助细胞恢复成熟皮肤细胞的细胞迁移活性。

结果如图7所示。

实施例9：用实施例1的桃花提取物处理后的平均细胞数的测量。

本研究的目的是测定桃花提取物对平均细胞数的影响，使用实施例1的提取物进行测试。

方案：通过以0.2体积％、0.5体积％或1体积％稀释实施例1的桃花提取物来制备桃花提取物的处理溶液。

Alamar Blue方案-细胞增殖测定的测定法：

材料：

●96孔板

●Alamar Blue Solution Invitrogen，Cat#DAL1100

●Life Technologies的Dulbecco’s Modified Eagle Media(DMEM)，Cat#11965092

补充有：

■Hyclone Fetal Bovine Serum(FBS)@10％，Cat#SH30071.03

方法：

用来自Zen Bio Lot#DFM110210B的62岁第11代普通人真皮成纤维细胞(NHDF)向96孔板每孔接种20,000个细胞，按照提供的平板布局进行处理，并使其在正常细胞培养条件下培养48小时。

在48小时结束时，除去培养基和处理物，并用培养基制造10％的Alamar Blue溶液，并将100μl该溶液移液到平板的所有孔中。

然后在标准细胞培养条件下将平板返回培养箱1小时。在孵育结束时，在平板读数器上测量570nm处的吸光度。

通过绘制570nm处的O.D.对测试样品的图表来分析结果。

结果：Alamar Blue读数与平板中存活的细胞数成比例。通过用支持Sirt2的桃花提取物处理，我们测量到成熟人真皮成纤维细胞(62岁)中细胞数量的增加。

结论：在成熟皮肤细胞中支持SIRT2有助于它们增殖，这是有道理的，因为SIRT2与微管上的细胞骨架有关，这对细胞分裂至关重要。

结果如图8所示。

表9-用桃花提取物处理后，通过570nm的吸光度测量的平均细胞数

Claims (18)

1.一种从粉色桃花(Prunus persica L.)中获得提取物的方法，包括：

(i)将水加入桃花中制成混合物，

(ii)通过将温度保持在从室温至低于50℃ 2小时来搅拌所述混合物；

(iii)过滤所述混合物以除去固体花部分以获得提取物；

(iv)在低于65℃的温度下将所述混合物巴氏杀菌过夜；

其中所获得的桃花提取物包含8至15g/kg干物质、2至8g/L蛋白质、2至8g/L糖、0.2至2g/L氨基酸；和0.2至2g/L的酚类化合物。

2.权利要求1的方法，其中步骤(ii)在50℃的温度进行。

3.权利要求1的方法，其中所述桃提取物是从干燥的桃花中获得的。

4.权利要求1的方法，其中步骤(iv)的所述提取物通过孔隙从约50μm至约20μm，直至约0.5μm至约0.2μm的连续过滤进一步澄清，以得到提取物。

5.权利要求1的方法，其中步骤(iv)的所述桃花提取物随后在选自以下的溶剂中稀释：水、甘油、乙醇、丙二醇、丁二醇、双丙二醇、乙氧基化或丙氧基化二醇、环状多元醇或这些溶剂的任何混合物。

6.通过权利要求1的方法获得的桃花提取物，包含分子量小于10kDa的化合物。

7.权利要求6的桃花提取物，其中DPPH自由基清除活性小于80mg/L。

8.权利要求6的桃花提取物，其中所述酚类化合物包括咖啡酸、儿茶素、迷迭香酸、没食子酸、香豆酸和羟基苯甲酸。

9.一种化妆品组合物，其包含权利要求1的方法获得的桃花提取物，其中所述桃花提取物包含分子量小于10kDa的化合物和生理学上可接受的介质。

10.权利要求9的化妆品组合物，其中所述桃花提取物的使用浓度为组合物总重量的约0.0001重量％至约20重量％。

11.权利要求9的化妆品组合物，其中所述桃花提取物的使用浓度为组合物总重量的约0.0005重量％至约5重量％。

12.权利要求9的化妆品组合物，其中所述组合物为适于表面施用的形式。

13.权利要求9的化妆品组合物，其中所述组合物是凝胶、乳膏、香脂、乳或泡沫产品的形式。

14.权利要求9的化妆品组合物，还包含至少一种其他活性剂。

15.权利要求9的化妆品组合物，还包含至少一种选自抗氧化剂、植物水解产物、合成肽化合物、防晒剂和抗皱剂的其他活性剂。

16.一种减少和/或修正皮肤和角质附属物的老化和光老化迹象的方法，包括向所述皮肤、粘膜和/或表面皮肤附属物表面施用包含根据权利要求1的方法所获得的桃花提取物的化妆品组合物，其中所述桃花提取物包含在生理学上可接受的介质中分子量小于10kDa的化合物。

17.权利要求16的方法，其用于保护皮肤免受紫外线辐射引起的侵害，包括在待治疗的皮肤上表面施用化妆品组合物。

18.一种调节SIRT2表达的方法，包括向皮肤、粘膜和/或表面皮肤附属物表面施用包含根据权利要求1的方法所获得的桃花提取物的化妆品组合物，其中所述桃花提取物包含在生理学上可接受的介质中分子量小于10kDa的化合物。

Images