KR20230023792A - 유기 화합물의 개선 또는 유기 화합물과 관련된 개선 - Google Patents
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Abstract
히만탈리아 엘롱가타의 추출물, 및 상기 추출물 및 담체를 포함하는 화장품 조성물이 제공된다. 상기 추출물 및 조성물은 미백 및 항노화 활성을 나타낸다.
Description
본 발명은 히만탈리아 엘롱가타(Himanthalia elongata) 추출물 및 피부 치료를 위한 이의 용도에 관한 것이다. 추가로 히만탈리아 엘롱가타 추출물을 포함하는 화장품 조성물에 관한 것이다.
히만탈리아 엘롱가타는 바다의 스파게티라고도 알려진 식용 갈조류이다. 이는 2년생 조류이며, 식물체와 번식체의 2단계 형태를 갖는다. 번식체는 긴 끈을 가져, 머리카락처럼 보인다.
히만탈리아 엘롱가타는 발트해, 북해 및 스칸디나비아 남쪽에서 포르투갈에 이르는 북동 대서양에서 발견된다. 예를 들어, 상기 조류는 프랑스 브르타뉴 북부, 예를 들어 호스꼬프(Roscoff) 근처 또는 랑드헬렉(Landrellec) 근처, 바람직하게는 일르 그헝드(Ile Grande)와 플루비앙(Pleubian) 사이의 지역에서, 5월과 8월 사이(그러나 바람직하게는 7월 또는 8월)에 수확될 수 있다.
히만탈리아 엘롱가타는 더모코스메틱(dermocosmetic)에서 흥미로울 수 있는 많은 원시 분자를 포함한다. 예를 들어, 이러한 갈색 해초에는 두 가지 폴리올이 포함되어 있다. 첫 번째인 D-만니톨은 갈조류에 흔하지만, 두 번째인 D-알트리톨 또는 D-탈리톨은 히만탈리아 엘롱가타에서 자연에서 처음 발견되었으며, 희소당으로 여겨진다. 상기 폴리올은 세포내 삼투압 조절, 에너지 저장 및 생물학적 거대분자의 보호에 관여한다. 히만탈리아 엘롱가타는 또한 펩타이드 및 아미노산이 풍부하고, 다당류(알긴산염, 라미나린, 퓨칸) 및 폴리페놀을 함유하고 있다.
놀랍게도, 히만탈리아 엘롱가타 추출물, 특히 이의 특정 분획물이 인상적인 피부 관리 특성을 가질 수 있다는 것이 발견되었다.
제1 측면에서, 본 발명은 히만탈리아 엘롱가타 추출물을 제공한다. 상기 추출물은 피부 치료용 조성물 및 방법에 유용하다. 특히, 이들은 화장품, 비치료 조성물 및 방법이다.
히만탈리아 엘롱가타 추출물은 산성 조건에서 냉동 조류를 처리하여 수득된 수성 추출물이다. 특히, 추출물은 수성 산으로 처리하여 수득된다.
본 발명의 히만탈리아 엘롱가타 추출물은 폴리페놀, 특히 플로로탄닌(phlorotannin)을 함유하는 농축 추출물이다. 플로로탄닌은 거대조류에 고유한 플로로글루시놀(1,3,5-트라이하이드록시벤젠)의 복합 중합체 그룹이다. 이러한 페놀 화합물은 갈조류의 세포벽에 필수적인 구조적 구성 요소이지만, UV 조사로부터의 보호 및 섭식(grazing)에 대한 방어와 같은 다수의 2차적인 생태학적 역할도 수행한다. 추출물은 지방산, 시트르산, D-만니톨, D-알트리톨, 및 다양한 중합도(DP)를 갖는 올리고머 및 플로로글루시놀 중합체 형태의 상이한 플로로탄닌을 포함한다.
히만탈리아 엘롱가타에 존재하는 플로로탄닌의 몇 가지 예가 도 1에 나와 있다.
히만탈리아 엘롱가타 추출물의 첫 번째 관내(in tubo) 스크리닝에서, 피부 관리 분야에서 관심을 끄는 항티로시나아제(anti-tyrosinase), 항히알루로니다아제(anti-hyaluronidase), 항콜라게나아제(anti-collagenase) 및 항엘라스타아제(anti-elastase) 활성이 관찰되었다(실시예 3 내지 6).
항티로시나아제 활성은 화장품에서 기대하는 피부 미백과 관련이 있다. 히만탈리아 엘롱가타 추출물은 멜라닌 생성을 조절하는 효소인 티로시나아제와 상호 작용할 수 있다.
티로시나아제 효소는 이의 천연 기질과 접촉하여 L-DOPA를 반응성 중간체인 도파퀴논(dopaquinone)으로 산화하는 것을 촉매작용하고, 이는 추가로 반응하여 궁극적으로 멜라닌 올리고머를 생성한다. 상기 효소의 억제제가 존재하면 도파퀴논 형성 속도를 감소시킬 수 있다.
히만탈리아 엘롱가타 추출물의 항히알루로니다아제, 항콜라게나아제 및 항엘라스타아제 활성은, 항노화 특성, 예를 들어 잔주름 및 주름 감소, 피부 탄력성(elasticity) 증가, 탄력(firmness) 및 수분 공급, 및 기타 화장품 및 피부 관리에서 또한 기대하는 특성과 관련이 있다.
히알루론산은 피부 진피에서 자연적으로 생성되는 화합물이며, 히알루로니다아제라는 효소에 의해 지속적으로 분해된다. 따라서, 나이가 들면 세포에서 합성되는 히알루론산 대 히알루로니다아제에 의해 분해되는 히알루론산의 백분율이 감소한다. 이로 인해 피부 보습이 감소하고 점진적인 처짐(sag)이 발생하여 주름이 생긴다. 히알루로니다아제의 억제(항히알루로니다아제 활성)는 진피에서 분해된 히알루론산의 양을 감소시켜 주름의 출현을 제한한다.
콜라게나아제 효소는 엘라스틴, 피브로넥틴 및 콜라겐과 같은 분자를 분해할 수 있다. 진피에 존재하는 이러한 단백질은 세포외 기질(ECM)에서 필수적인 역할을 하며, 이들의 분해는 피부의 조기 노화를 초래한다. 따라서, 콜라게나아제 활성을 억제하는(항콜라게나아제 활성을 나타내는) 작용제는 진피 기질의 분해를 방지하여, 건강한 피부를 유지하는 데 유익한 효과를 가질 수 있다. 콜라게나아제는 아미노 말단이 차단된 합성 펩타이드의 "X-gly" 결합을 절단할 수 있다.
엘라스틴은 세포외 기질(ECM)의 구성요소인 진피 단백질로, 주로 피부 탄력과 탄력성에 기여한다. 시간이 지남에 따라, ECM 단백질의 신진 대사가 느려진다. 이와 동시에 엘라스틴을 분해하는 엘라스타아제를 포함한 효소 활동이 증가한다. 이러한 탄력성 손실을 방지하는 한 가지 방법은 상기 효소를 억제할 수 있는 항콜라게나아제 활성을 가진 활성 성분을 사용하는 것이다.
따라서, 히만탈리아 엘롱가타 추출물에서 관찰된 항티로시나아제, 항히알루로니다아제, 항콜라게나아제 및 항엘라스타아제 활성은 추출물의 미백 및 항노화 특성을 시사한다. 히만탈리아 엘롱가타 추출물을 포함하는 화장품 조성물이 잔주름및 주름을 감소시키고, 피부 탄력성, 탄력 및 수분 공급을 증가시킬 수 있다고 결론지어 진다. 또한, 히만탈리아 엘롱가타 추출물을 포함하는 화장품 조성물이 피부를 희게 및/또는 밝게 할 수 있다고 결론지어 진다.
히만탈리아 엘롱가타 추출물과 페닐에틸 레조르시놀(시중에서 입수가능한 미백 화합물)을 비교한 결과, 미백 효과가 비슷하거나 오히려 더 우수한 것으로 나타났다. 또한, 히만탈리아 엘롱가타 추출물은 항노화 특성을 나타낸다. 게다가, 히만탈리아 엘롱가타 추출물은 재생가능한 공급원으로부터 수득할 수 있는 천연 생성물이다.
히만탈리아 엘롱가타 추출물의 미백 활성을 보다 자세히 조사하였다.
첫 번째로, 정상적인 인간의 멜라닌 세포에서 히만탈리아 엘롱가타 추출물에 의한 멜라닌 합성 억제가 관찰되어, 시험관내 수준의 미백 활성을 확인하였다.
관내 테스트에서, 히만탈리아 엘롱가타 추출물이 강력한 항티로시나아제 활성을 가지고 있는 것으로 입증되었다. 따라서, 색소침착된 노화 반점(pigmented ageing spot)과 같은 과색소침착(hyper pigmented) 질환에 매우 효율적일 수 있다. 실제로, 티로시나아제는 피부색을 담당하는 멜라닌 생합성에 관여하는 핵심 효소이다. 상기 효소가 과활성되면, 피부 질환 중 노인성 흑색점 및 일광 흑색점이라는 두 가지 유형으로 나눌 수 있는 노화 반점을 유발한다.
따라서, 다음 단계에서는, 노인성 흑색점(실시예 7) 및 일광 흑색점(실시예 8)이 관련된 노화 반점에 대한 생체외 시험을 수행하였다. 히만탈리아 엘롱가타 추출물은 멜라닌 함량을 감소시킬 수 있고, 산화된 단백질을 감소시킬 수 있고, 일광 흑색점과 관련된 염증을 조절할 수 있고, 피부 장벽을 개선할 수 있는 것으로 밝혀졌다.
노인성 흑색점은 세포 노화, 특히 진피-표피 접합부를 따라 밀접하게 기반을 둔 진피 섬유아세포의 증가와 관련이 있다. 이들은 SDF-1(기질 세포 유래 인자 1) 방출로 인한 피부 색소침착 조절에 적극적인 역할을 한다. 불행하게도, 노화와 함께 SDF-1 발현의 급격한 감소가 관찰되어, 과색소침착 및 색소침착된 노화 반점의 형성을 초래한다.
일광 흑색점은 UV 노출에 의해 매개되어 세포 노화를 초래하며, 놀랍게도 색소침착 조절의 상실과 관련된 SDF-1 발현의 뒤이은 감소를 초래한다. 게다가, UV 노출은 또한 각질층 두께의 증가와 관련된 프로테아좀 활성의 감소로 인한 산화된 단백질의 증가도 초래한다. 결과적으로, 노화 반점 형성에 관여하는 것으로 잘 알려진, 리포푸신(lipofuscin)의 강력한 증가가 관찰된다. 이와 동시에, 멜라닌생성의 과도한 자극과 관련된 UV-유도 염증의 증가가 관찰된다. 이러한 모든 방해 메커니즘은 과색소침착 및 색소침착된 노화 반점 형성을 초래한다.
SDF-1은 진피의 섬유아세포 노화와 관련이 있는 것으로 문헌에 기재되어 있다. 실제로, 노화 상태에서 이러한 섬유아세포는 SDF-1을 발현하는 능력을 상실한다(문헌[Yoon et al, 2018]). 다른 한편으로, UV 조사는 피부의 섬유아세포 및 각질세포에서 세포 노화를 유도하는 것으로 알려져 있다(문헌[Debacq-Chainiaux et al, 2012; Amaro-Ortiz et al, 2014]). 따라서, 일광 흑색점 형성에 관여하는 UV 조사도 또한 피부 노화를 유발할 수 있다고 가정하였다. 이러한 경우에, 문헌에 기재되어 있지는 않지만 유두진피에서의 SDF-1 발현에 대한 UV 조사의 영향이 예상된다.
놀랍게도, SDF-1은 일광 흑색점을 초래하는 UV 노출과 관련된 과색소침착에 관여하는 것으로 밝혀졌다. 또한, 이러한 효과가 히만탈리아 엘롱가타 추출물을 사용한 치료에 의해 영향을 받을 수 있는 것으로 나타났다.
히만탈리아 엘롱가타 추출물은 노인성 및 일광 흑색점에 영향을 미치는 것으로 밝혀졌다(실시예 7 및 8 참조). 히만탈리아 엘롱가타 추출물을 포함하는 화장품 조성물이 SDF-1 발현을 증가시킬 수 있고, 이에 따라 색소침착 조절을 활성화할 수 있는 것으로 결론지을 수 있다. 또한, 멜라닌 함량 감소에 의해 관찰되는 바와 같이, 히만탈리아 엘롱가타 추출물을 포함하는 화장품 조성물이 멜라닌 생합성을 감소시킬 수 있다고 결론지을 수 있다.
그 후, 백인, 아시아인 및 아프리카인을 포함하는 다양한 인종 그룹의 피부 외식편에 대해 생체외 연구를 수행하였다(실시예 9). 히만탈리아 엘롱가타 추출물은 색소침착되지 않은 세포의 증가와 매우 색소침착된 세포의 감소를 일으키는 미백 활성을 갖고 있는 것으로 나타났다. 히만탈리아 엘롱가타 추출물은 다양한 인종의 피부에서 미백 효능을 갖는다. 이러한 효과는 페닐에틸 레조르시놀의 효과와 비슷하거나 오히려 더 우수하다.
마지막으로, 임상 연구에서 히만탈리아 엘롱가타 추출물의 미백 활성을 테스트하였다. 첫 번째 시험에서, 백인 지원자의 손에서 색소침착된 반점의 감소를 조사하였다(실시예 10). 두 번째 시험에서, 아시아인 지원자의 안면에서 색소침착된 반점의 감소를 연구하였다(실시예 11). 세 번째 시험에서, 아프리카인 지원자의 안면에서 색소침착된 반점의 감소를 조사하였다(실시예 12). 전반적으로, 히만탈리아 엘롱가타 추출물이 피부, 특히 손 및 안면의 색소침착된 반점을 줄일 수 있는 것으로 입증되었다.
히만탈리아 엘롱가타 추출물을 피부에 도포하면, 티로시나아제 억제, 히알루로니다아제 억제, 엘라스타아제 억제, 콜라게나아제 억제, SDF-1 발현 증가, 멜라닌 생합성 감소, 멜라닌 함량 감소, UV 노출 후 산화 단백질 감소, UV 노출 후 리포푸신체(lipofuscin body) 축적 감소, UV 노출 후 염증 감소, UV 노출 후 각질층 두께 감소 중 하나 이상의 효과가 달성될 수 있는 것으로 입증되었다.
히만탈리아 엘롱가타 추출물을 피부에 도포하면, 피부 미백, 색소침착 조절 활성화, 색소침착 또는 과색소침착 감소, 피부 발적 감소, 눈에 보이는(visible) 반점 감소, 노화 반점 감소, 피부 노화 감소 중 하나 이상의 효과가 관찰될 수 있는 것으로 입증되었다.
추가 측면에서, 본 발명은 제1 활성 화장품 성분으로서 히만탈리아 엘롱가타 추출물, 및 담체를 포함하는 화장품 조성물을 제공한다. 히만탈리아 엘롱가타 추출물은 화장품 조성물의 2 내지 5 중량%, 바람직하게는 2.5 내지 3.5 중량%, 더욱 바람직하게는 3 중량%의 양으로 존재해야 한다. 화장품 조성물은 추가의 활성 화장품 성분을 포함할 수 있다. 화장품 조성물 내 담체는 피부학적으로 허용되는 담체이어야 한다.
본 발명의 추가 측면에서, 피부 관리 조성물인 화장품 조성물이 제공된다. 전형적인 피부 관리 조성물은, 예를 들어 크림, 세럼, 에센스, 마스크 또는 로션이다.
본 발명의 추가 측면에서, 히만탈리아 엘롱가타 추출물을 포함하는 화장품 조성물을 피부에 도포하는 단계를 포함하는 피부 치료 방법이 제공된다. 특히, 도포되는 화장품 조성물은 피부 관리 조성물이다.
본 발명의 추가 측면에서, 피부 미백을 위한 피부 치료 방법이 제공된다. 또한, 제공되는 피부 치료 방법은 항노화 치료를 위한 것이다.
본 발명의 추가 측면에서, 피부 관리에서 히만탈리아 엘롱가타 추출물의 용도가 제공된다.
본 발명의 추가 측면에서, 본 발명은 히만탈리아 엘롱가타를 추출하는 단계를 포함하는 활성 화장품 성분의 제조 방법에 관한 것이다.
히만탈리아 엘롱가타를 추출하기 위해, 냉동 조류를 분쇄하여 물에 현탁하고 가열한 다음, 고온에서 산으로 처리한다. 산성 가수분해 후, 반응 혼합물을 냉각하고 pH를 2.2로 설정한다. 용액을 원심분리하고 여과하여 첫 번째 추출물을 얻는다. 이후, 상기 추출물을 수지에 흡착시키고 물로 세척한 후, 에탄올로 탈착시켜 정제한다. 이후, 에탄올을 증발시키고 물을 첨가한다. pH를 3으로 조정한 후, 0.2 μm에서 여과한다. 여과가 끝나면, 글리세린을 첨가한다. 수득된 추출물은 1 내지 30 g/L의 폴리페놀(무수 갈산 등가물로 정량화됨), 바람직하게는 3 내지 25 g/L의 폴리페놀, 더 바람직하게는 5 내지 20 g/L의 폴리페놀, 훨씬 더 바람직하게는 9 내지 18 g/L 폴리페놀을 함유한다.
도 1은 히만탈리아 엘롱가타에 존재하는 플로로탄닌의 몇 가지 예를 도시한다.
도 2는 히만탈리아 엘롱가타 추출물(HEX)의 제조의 공정 흐름도를 도시한다.
도 3a는 히만탈리아 엘롱가타 추출물의 항티로시나아제 활성에 대해 평가한 결과를 티로시나아제 억제율에 대해 도시한 그래프이다. 도 3b는 히만탈리아 엘롱가타 추출물의 항티로시나아제 활성에 대해 평가한 결과를 IC50에 대해 도시한 그래프이다.
도 4는 히만탈리아 엘롱가타 추출물의 항히알루로니다아제 활성에 대해 평가한 결과를 페닐에틸 레조르시놀과 비교하여 도시한 그래프이다.
도 5는 히만탈리아 엘롱가타 추출물의 항엘라스타아제 활성에 대해 평가한 결과를 페닐에틸 레조르시놀과 비교하여 도시한 그래프이다.
도 6은 히만탈리아 엘롱가타 추출물의 항콜라게나아제 활성에 대해 평가한 결과를 페닐에틸 레조르시놀과 비교하여 도시한 그래프이다.
도 7a는 노화 반점(노인성 흑색점)을 H2O2로 처리하여 노화를 유도한 생체외 시험의 SDF-1 면역염색의 결과를 도시한다. 도 7b는 이러한 생체외 시험 후 진피 표피 접합부 근처에서 SDF-1을 발현하는 다수의 섬유아세포의 점수화를 도시하는 그래프이다.
도 8a는 노화 반점(노인성 흑색점)을 H2O2로 처리하여 노화를 유도한 생체외 시험의 멜라닌 함량을 시각화하기 위한 폰타나 마손 염색의 현미경 사진을 도시한다. 도 8b는 이러한 폰타나 마손 염색의 결과를 이미지화 분석한 결과를 도시한다. 도 8c는 5일 동안 3% HEX를 국소 도포한 후 이미지화 분석을 사용하여 색소침착 지수를 계산한 결과를 도시하는 그래프이다.
도 9a는 노화 반점(일광 흑색점)을 UV 조사로 처리하여 노화를 유도한 생체외 시험의 SDF-1 면역염색의 결과를 도시한다. 도 9b는 이러한 생체외 시험 후 진피 표피 접합부 근처에서 SDF-1을 발현하는 다수의 섬유아세포에 대한 점수화를 도시하는 그래프이다.
도 10a는 노화 반점(일광 흑색점)을 UV 조사로 처리하여 노화를 유도한 생체외 시험의 멜라닌 함량을 시각화하기 위한 폰타나 마손 염색의 결과를 도시한다. 도 10b는 이러한 폰타나 마손 염색의 결과를 이미지화 분석한 결과를 도시한다. 도 10c는 5일 동안 3% HEX를 국소 도포한 후 이미지화 분석을 사용하여 색소침착 지수를 계산한 결과를 도시하는 그래프이다.
도 11a는 UV 노출 전후 및 HEX 국소 도포한 피부 외식편 단편의 표면형광 현미경의 이미지이다. 도 11b는 형광 검출의 강도에 의해 관찰된 카보닐 점수 측정에 의한 산화된 단백질의 정량화 결과를 도시하는 그래프이다.
도 12a는 UV 노출 전후 및 HEX 국소 도포한 저온 단편을 수단 블랙 B 염색한 역상 형광 현미경 이미지이다. 도 12b는 UV 노출 후 리포푸신 축적의 결과를 시각화하는 그래프이다.
도 13은 전염증성 사이토카인(IL-8)에 대한 피부 외식편의 비색 분석 결과를 도시하는 그래프이다.
도 14a는 UV 노출 후 각질층의 두께를 시각화하기 위한 필라그린 염색의 결과를 도시한다. 도 14b는 UV 노출 후 각질층의 두께를 도시하는 그래프이다.
도 15a는 백인 피부 외식편에서 히만탈리아 엘롱가타 추출물 및 페닐에틸 레조르시놀 및 하이드로퀴논의 미백 효능의 나타내는 폰타나 마손 염색법에 의한 조직학적 분석을 도시한다. 도 15b는 백인 피부 외식편에서 광학 현미경으로 멜라닌 색소를 포함하는 세포를 정량화하여 미백 효능에 대한 미백 점수화를 나타내는 그래프이다.
도 16a는 아시아인 피부 외식편에서 히만탈리아 엘롱가타 추출물 및 페닐에틸 레조르시놀 및 하이드로퀴논의 미백 효능의 나타내는 폰타나 마손 염색법에 의한 조직학적 분석을 도시한다. 도 16b는 아시아인 피부 외식편에서 광학 현미경으로 멜라닌 색소를 포함하는 세포를 정량화하여 미백 효능에 대한 미백 점수화를 나타내는 그래프이다.
도 17a는 아프리카인 피부 외식편에서 히만탈리아 엘롱가타 추출물 및 페닐에틸 레조르시놀 및 하이드로퀴논의 미백 효능의 나타내는 폰타나 마손 염색법에 의한 조직학적 분석을 도시한다. 도 17b는 아프리카인 피부 외식편에서 광학 현미경으로 멜라닌 색소를 포함하는 세포를 정량화하여 미백 효능에 대한 미백 점수화를 나타내는 그래프이다.
도 18은 백인 지원자의 손의 색소침착된 반점에 대한 위약, HEX, 페닐에틸 레조르시놀 도포 28일 및 56일 후, 피부의 멜라닌 함량을 도시하는 그래프이다.
도 19는 백인 지원자의 손의 색소침착된 반점에 대한 위약, HEX, 페닐에틸 레조르시놀 도포 28일 및 56일 후, 항발적 효과를 도시하는 그래프이다.
도 20은 아시아인 지원자의 색소침착된 안면 반점에 대한 HEX, 페닐에틸 레조르시놀 도포 28일 및 56일 후, 눈에 보이는 반점의 수를 도시하는 그래프이다.
도 21은 아시아인 지원자의 색소침착된 안면 반점에 대한 HEX, 페닐에틸 레조르시놀 도포 28일 및 56일 후, 갈색 반점의 수를 도시하는 그래프이다.
도 22는 아시아인 지원자의 색소침착된 안면 반점에 대한 HEX, 페닐에틸 레조르시놀 도포 28일 및 56일 후, b* 매개변수를 도시하는 그래프이다.
도 23은 아프리카인 지원자의 안면의 과색소침착된 반점에 대한 HEX, 페닐에틸 레조르시놀 도포 28일 및 56일 후, 멜라닌 함량을 도시하는 그래프이다.
도 2는 히만탈리아 엘롱가타 추출물(HEX)의 제조의 공정 흐름도를 도시한다.
도 3a는 히만탈리아 엘롱가타 추출물의 항티로시나아제 활성에 대해 평가한 결과를 티로시나아제 억제율에 대해 도시한 그래프이다. 도 3b는 히만탈리아 엘롱가타 추출물의 항티로시나아제 활성에 대해 평가한 결과를 IC50에 대해 도시한 그래프이다.
도 4는 히만탈리아 엘롱가타 추출물의 항히알루로니다아제 활성에 대해 평가한 결과를 페닐에틸 레조르시놀과 비교하여 도시한 그래프이다.
도 5는 히만탈리아 엘롱가타 추출물의 항엘라스타아제 활성에 대해 평가한 결과를 페닐에틸 레조르시놀과 비교하여 도시한 그래프이다.
도 6은 히만탈리아 엘롱가타 추출물의 항콜라게나아제 활성에 대해 평가한 결과를 페닐에틸 레조르시놀과 비교하여 도시한 그래프이다.
도 7a는 노화 반점(노인성 흑색점)을 H2O2로 처리하여 노화를 유도한 생체외 시험의 SDF-1 면역염색의 결과를 도시한다. 도 7b는 이러한 생체외 시험 후 진피 표피 접합부 근처에서 SDF-1을 발현하는 다수의 섬유아세포의 점수화를 도시하는 그래프이다.
도 8a는 노화 반점(노인성 흑색점)을 H2O2로 처리하여 노화를 유도한 생체외 시험의 멜라닌 함량을 시각화하기 위한 폰타나 마손 염색의 현미경 사진을 도시한다. 도 8b는 이러한 폰타나 마손 염색의 결과를 이미지화 분석한 결과를 도시한다. 도 8c는 5일 동안 3% HEX를 국소 도포한 후 이미지화 분석을 사용하여 색소침착 지수를 계산한 결과를 도시하는 그래프이다.
도 9a는 노화 반점(일광 흑색점)을 UV 조사로 처리하여 노화를 유도한 생체외 시험의 SDF-1 면역염색의 결과를 도시한다. 도 9b는 이러한 생체외 시험 후 진피 표피 접합부 근처에서 SDF-1을 발현하는 다수의 섬유아세포에 대한 점수화를 도시하는 그래프이다.
도 10a는 노화 반점(일광 흑색점)을 UV 조사로 처리하여 노화를 유도한 생체외 시험의 멜라닌 함량을 시각화하기 위한 폰타나 마손 염색의 결과를 도시한다. 도 10b는 이러한 폰타나 마손 염색의 결과를 이미지화 분석한 결과를 도시한다. 도 10c는 5일 동안 3% HEX를 국소 도포한 후 이미지화 분석을 사용하여 색소침착 지수를 계산한 결과를 도시하는 그래프이다.
도 11a는 UV 노출 전후 및 HEX 국소 도포한 피부 외식편 단편의 표면형광 현미경의 이미지이다. 도 11b는 형광 검출의 강도에 의해 관찰된 카보닐 점수 측정에 의한 산화된 단백질의 정량화 결과를 도시하는 그래프이다.
도 12a는 UV 노출 전후 및 HEX 국소 도포한 저온 단편을 수단 블랙 B 염색한 역상 형광 현미경 이미지이다. 도 12b는 UV 노출 후 리포푸신 축적의 결과를 시각화하는 그래프이다.
도 13은 전염증성 사이토카인(IL-8)에 대한 피부 외식편의 비색 분석 결과를 도시하는 그래프이다.
도 14a는 UV 노출 후 각질층의 두께를 시각화하기 위한 필라그린 염색의 결과를 도시한다. 도 14b는 UV 노출 후 각질층의 두께를 도시하는 그래프이다.
도 15a는 백인 피부 외식편에서 히만탈리아 엘롱가타 추출물 및 페닐에틸 레조르시놀 및 하이드로퀴논의 미백 효능의 나타내는 폰타나 마손 염색법에 의한 조직학적 분석을 도시한다. 도 15b는 백인 피부 외식편에서 광학 현미경으로 멜라닌 색소를 포함하는 세포를 정량화하여 미백 효능에 대한 미백 점수화를 나타내는 그래프이다.
도 16a는 아시아인 피부 외식편에서 히만탈리아 엘롱가타 추출물 및 페닐에틸 레조르시놀 및 하이드로퀴논의 미백 효능의 나타내는 폰타나 마손 염색법에 의한 조직학적 분석을 도시한다. 도 16b는 아시아인 피부 외식편에서 광학 현미경으로 멜라닌 색소를 포함하는 세포를 정량화하여 미백 효능에 대한 미백 점수화를 나타내는 그래프이다.
도 17a는 아프리카인 피부 외식편에서 히만탈리아 엘롱가타 추출물 및 페닐에틸 레조르시놀 및 하이드로퀴논의 미백 효능의 나타내는 폰타나 마손 염색법에 의한 조직학적 분석을 도시한다. 도 17b는 아프리카인 피부 외식편에서 광학 현미경으로 멜라닌 색소를 포함하는 세포를 정량화하여 미백 효능에 대한 미백 점수화를 나타내는 그래프이다.
도 18은 백인 지원자의 손의 색소침착된 반점에 대한 위약, HEX, 페닐에틸 레조르시놀 도포 28일 및 56일 후, 피부의 멜라닌 함량을 도시하는 그래프이다.
도 19는 백인 지원자의 손의 색소침착된 반점에 대한 위약, HEX, 페닐에틸 레조르시놀 도포 28일 및 56일 후, 항발적 효과를 도시하는 그래프이다.
도 20은 아시아인 지원자의 색소침착된 안면 반점에 대한 HEX, 페닐에틸 레조르시놀 도포 28일 및 56일 후, 눈에 보이는 반점의 수를 도시하는 그래프이다.
도 21은 아시아인 지원자의 색소침착된 안면 반점에 대한 HEX, 페닐에틸 레조르시놀 도포 28일 및 56일 후, 갈색 반점의 수를 도시하는 그래프이다.
도 22는 아시아인 지원자의 색소침착된 안면 반점에 대한 HEX, 페닐에틸 레조르시놀 도포 28일 및 56일 후, b* 매개변수를 도시하는 그래프이다.
도 23은 아프리카인 지원자의 안면의 과색소침착된 반점에 대한 HEX, 페닐에틸 레조르시놀 도포 28일 및 56일 후, 멜라닌 함량을 도시하는 그래프이다.
이하, 본 발명은 하기 비제한적 실시예에 의해 추가로 설명된다:
일반적인 내용: 데이터가 가우시안(Gaussian) 법칙을 따르는지 여부를 결정하기 위해 샤피로-월크(Shapiro-Wilk) 테스트로 시험관내 실험에서 생체내 실험까지의 모든 원시 데이터를 분석하였다. 가우시안 법칙을 따르는 경우, 데이터는 모수 대응(paired) 또는 비대응(unpaired) 스튜던트 t-테스트(student t-test)를 사용하여 분석하였다. 이를 따르지 않은 경우, 비모수 윌콕슨(Wilcoxon) 테스트 또는 비모수 맨-휘트니(Mann-Whitney) 테스트를 사용하여 데이터를 분석하였다. 결과는 p<0.1#, p<0.05*, p<0.01** 및 p<0.001***인 경우 유의한 것으로 간주한다.
실시예 1: 히만탈리아 엘롱가타 추출물(HEX)의 제조
도 2는 a) 및 b)의 두 단계로 수행되는 추출 공정의 흐름도를 도시한다.
a) 비정제 추출물
히만탈리아 엘롱가타(브르타뉴 북부에서 수확) 건조물의 물 중 4% 현탁액을 제조하였다. 해조류를 먼저 작은 조각으로 자르고 10분 동안 교반하면서 불린 다음, Ultra-turrax로 3분 동안 거칠게 분쇄하였다(12,000 rpm). 이후, 상기 용액을 교반하고 가열하였다. 온도가 65℃에 도달했을 때, 시트르산을 첨가하였다(시트르산 첨가량은 현탁액 건조물의 7.5%에 해당). 1N 황산을 첨가하여 pH=2.2로 설정하였다. 산 가수분해는 70℃에서 2시간 동안 지속하였다. 2시간 후, 용액을 냉각시키고, 170 μm의 체를 통해 여과하였다. 비정제 추출물은 거대다공성 흡착제 수지(예: Diaion HP20)와 접촉하기 전에 원심분리될 수 있다(12,000g, 18℃, 15분).
b) 정제 추출물(HEX)
비정제 추출물(약 4,000 g)을 1시간 동안 교반하면서 수지(약 1,600 g, 습윤 형태)와 일괄적으로 접촉시킨다. 흡착 단계 후, 수지를 물로 5분 동안 3회 세척하여(3 x 4.6 L) 염 및 극성 화합물(예: 당 및 단백질)을 제거한다. 이후, 수지에 흡착된 화학 물질을 에탄올 90%로 탈착시킨다(최대 밀도 0.835, 30분 동안 1 x 4.6 L 및 3 x 3.8 L). 마지막으로, 3 L의 물을 사용하여 5분 동안 새로운 세척을 수행한다.
에탄올 분획 및 최종 물 용출액을 모아, 에탄올 함량이 1% 미만이 되고 농축 용액의 질량이 초기 추출물 질량의 1/85가 될 때까지 진공 회전 증발기에서 증발시킨다. 수산화나트륨을 사용하여 pH를 3.0으로 조정하고 생성물을 0.2 μm로 여과한다. 글리세롤(w/w)에 2회 희석하여 최종 생성물(정제 추출물)을 수득한다. 이는 9 내지 18 g/L의 폴리페놀(무수 갈산 등가물로 정량화됨)을 포함한다.
실시예 2: 히만탈리아 엘롱가타 추출물에 존재하는 플로로탄닌 분석
a) 플로로탄닌의 농축
히만탈리아 엘롱가타의 수성 추출물(실시예 1에서 수득된 정제 추출물)을 증류수로 희석하고 n-헵탄 + 아세토나이트릴 + 메틸-tert-부틸 에터를 분별 깔대기에 넣어 혼합하였다. 혼합 및 경사분리 후, 생성된 3개의 비혼화성 액체상(상부상1 UP1, 중간상 MP1, 하부상 LP1)을 분리하였다.
하부 상 LP1을 증류수로 희석하고 아세토나이트릴 + 메틸-tert-부틸 에터와 혼합하였다. 생성된 2개의 액상(상부상 UP2 및 하부상 LP2)을 분리하였다. 상부상UP2를 최종적으로 MP1과 혼합하였다. 용매를 진공 하에서 증발시켜 플로로탄닌이 풍부한 분획(E-Phlor로 기재)을 생성하였다.
b) 분획화
하기 조건 하에서, Rousselet-Robatel-Kromaton의 FCPE300® 기기에서 원심 분할 크로마토그래피(CPC)로 플로로탄닌이 풍부한 추출물 E-Phlor를 분획화하였다.
ㆍ 주입된 E-phlor 질량: 1.5 g
ㆍ 2상 용매 시스템: 메틸-tert-부틸 에터/아세토나이트릴/물(4/1/5, v/v)
ㆍ 정지상: 2상 용매 시스템의 하부상(상승법)
ㆍ 이동상: 2상 용매 시스템의 상부상
ㆍ 컬럼 회전 속도: 1,200 rpm
ㆍ 유속: 20 mL/분
이동상은 60분 동안 정지상을 통해 펌핑되었다. 상기 용출 단계 동안, 이동상에 대해 친화성을 갖는 유기 화합물이 컬럼의 출구에서 수집되었다. 이후, 정지상을 압출하였다. 상기 압출 단계 동안, 컬럼에 갇힌 나머지 모든 화합물이 회수되었다.
c) 분획물 분석
11개의 연속 CPC 분획물 F01 내지 F11을 얻었다. 모든 분획물은 저온 프로브가 장착된 Bruker Avance AVIII-600 분광계(카를스루에, 독일)에서 13C NMR로 분석하였다. 모든 CPC 분획물은 표 1에 요약된 바와 같이 상당한 양의 플로로탄닌을 함유하고 있으며, 여기서 *는 표시된 중합도를 갖는 더 적은 양의 플로로탄닌의 존재를 의미하고 **는 더 많은 양의 플로로탄닌의 존재를 의미한다. CPC 분획물에 함유된 플로로탄닌의 다양한 화학 구조를 잠정적으로 구별하기 위해 LC/MS 분석도 수행하였다.
중합도가 더 높은 다른 플로로탄닌도 CPC 분획물에 존재했지만, MS에 의해서는 잘 검출되지 않았다.
실시예 3: 히만탈리아 엘롱가타 추출물의 항티로시나아제 활성에 대한 관내
평가
화장품 적용을 위한 흥미로운 미백 활성을 확인하기 위해, 티로시나아제 효소를 억제하는 능력에 대해 실시예 1에서 수득된 히만탈리아 엘롱가타의 비정제 및 정제 추출물을 테스트하였다.
티로시나아제는 이의 천연 기질로 L-DOPA를 용해시킨다. 효소 억제제의 존재는 가수분해 속도를 감소시킨다. 이러한 활성의 발현은 기질의 가수분해 후 배지에서 방출된 도파퀴논의 흡광도 측정치(OD)에 해당한다. 효소가 억제되지 않을 때, 방출되는 도파퀴논의 농도가 증가하고 갈색 색소침착이 관찰된다.
수득된 결과는 IC50(mg/ml)으로 표시된다. 최대 억제 농도의 절반(IC50)은 특정 생물학적 또는 생화학적 기능을 억제하는 물질의 유효성의 측정치이다. IC50이 낮을수록, 낮은 농도의 추출물에서 생물학적 활성이 더 강하다.
상기 분석은 96-웰 마이크로플레이트에 적합하다. 40 μl의 샘플을 60 μl의 인산염 완충액(pH 6.8)과 혼합한다. 이후, 40 μl의 티로시나아제를 첨가한다. 반응 혼합물을 흔들고 15분 동안 37℃에서 사전 인큐베이션한다. 이후, L-DOPA 용액 40 μl를 첨가한다. 마이크로플레이트를 37℃에서 인큐베이션하고 15분 동안 475 nm의 파장에서 5분마다 판독한다. 양성 기준으로 코직산(Kojic acid)을 사용한다.
정제 추출물을 다양한 농도에서 테스트하였다. 결과는 도 3a에 표시된다. 수득된 결과는 티로시나아제 억제율(%)로 표시된다.
히만탈리아 엘롱가타 추출물(실시예 1a에서 수득), 정제 추출물 HEX(실시예 1b에서 수득, 폴리페놀 함량이 더 높음) 대 페닐에틸 레조르시놀에 대해 수득된 결과가 도 3b에 나와 있다. 정제 추출물은 페닐에틸 레조르시놀(기준점)보다 2.6배, 비정제 추출물보다 160배 더 높은 활성을 갖는다. 이는, 히만탈리아 엘롱가타 추출물이 티로시나아제를 억제할 수 있는 것으로 나타났다.
실시예 4: 히만탈리아 엘롱가타 추출물의 항히알루로니다아제 활성에 대한 관내 평가
비탁법에 의한 항히알루로니다아제 활성의 평가는 히알루론산 중합체를 계면활성제인 CTAB(세틸트라이메틸암모늄 브로마이드)와 접촉시켜 수득된 침전물의 형성을 기반으로 한다.
효소 반응 동안, 히알루론산(20 내지 12,500 단위로 형성됨)은 히알루로니다아제에 의해 분해되어 크기가 감소된 중합체를 생성한다. 따라서, 수득된 이당류 및 8 kDA보다 작은 크기의 중합체는 CTAB의 존재 하에 침전되지 않는 반면, 분해되지 않은 히알루론산의 중합체 및 8 kDA보다 큰 크기의 중합체는 CTAB와 접촉하여 침전된다.
분석은 96웰 마이크로플레이트에서 수행하였다. 20 μl의 샘플을 먼저 Mc Ilvaine 완충액(pH 4.6) 10 μl와 혼합한다. 이후, 20 μl의 히알루로니다아제 및 20 μl의 히알루론산을 첨가한다. 혼합물을 진탕하고 37℃에서 40분 동안 인큐베이션한다. 마지막으로, CTAB 180 μl를 모든 웰에 첨가하여 가수분해되지 않은 히알루론산 중합체를 침전시킨다. 혼합물을 실온에서 20분 동안 인큐베이션하고, 600 nm에서의 흡광도를 분광광도계로 측정한다. 양성 대조군으로 DSCG(크로모글리크산 이나트륨)를 사용된다.
플로로탄닌이 비정제 및 정제된 히만탈리아 엘롱가타 추출물(각각 실시예 1a 및 1b에서 수득) 대 페닐에틸 레조르시놀에 대해 수득된 결과를 도 4에 나타내었다. 히만탈리아 엘롱가타의 정제 추출물이 최고의 항히알루로니다아제 활성을 가질 뿐만 아니라, 히만탈리아 엘롱가타의 전체 추출물이 상당한 항히알루로니다아제 활성을 갖는 것으로 나타났다. 이는, 히만탈리아 엘롱가타 추출물이 히알루로니다아제를 억제할 수 있는 것을 나타냈다.
실시예 5: 히만탈리아 엘롱가타 추출물의 항엘라스타아제 활성의 관내
평가
엘라스타아제가 이의 천연 기질과 접촉하면 N-석시닐-(Ala)3-p-나이트로아닐라이드를 용해한다. 이러한 효소의 억제제가 존재하면 가수분해 속도를 감소시킬 수 있다.
상기 활성의 발현은 기질의 가수분해 후 배지에서 방출된 p-나이트로아닐린의 흡광도 측정(OD)에 해당한다. 효소가 억제되지 않을 때, 방출되는 p-나이트로아닐린의 농도가 증가하고 황색이 나타난다.
사용된 항엘라스타아제 분석은 분광광도법에 기초하며, 96-웰 마이크로플레이트에서 수행된다. 돼지 췌장의 엘라스타아제를 효소로 사용하고 N-석시닐-(Ala)3-p-나이트로아닐라이드를 기질로 사용하여, p-나이트로아닐라이드의 방출을 모니터링한다. 반응 혼합물은 샘플 25 μl, 0.2M Tris-HCl 완충액(pH 8) 25 μl, 엘라스타아제 효소 25 μl를 포함한다. 37℃에서 15분 동안 혼합물을 사전 인큐베이션한다. 이어서, 기질로서 N-석시닐-(Ala)3-p-나이트로아닐라이드 100 μl를 첨가한다. 37℃에서 30분 인큐베이션 후, 405 nm에서 흡광도를 모니터링한다. 엘라스타티날이 양성 대조군으로 사용된다.
플로로탄닌이 비정제 및 정제된 히만탈리아 엘롱가타 추출물(각각 실시예 1a 및 1b에서 수득) 대 페닐에틸 레조르시놀에 대해 수득된 결과를 도 5에 나타내었다. 히만탈리아 엘롱가타의 정제 추출물이 최고의 항엘라스타아제 활성을 가지며, 히만탈리아 엘롱가타의 비정제 추출물이 상당한 항엘라스타아제 활성을 갖는 것으로 나타났다. 이는, 히만탈리아 엘롱가타 추출물이 엘라스타아제를 억제할 수 있는 것을 나타냈다.
실시예 6: 히만탈리아 엘롱가타 추출물의 항콜라게나아제 활성에 대한 관내 평가
항노화 활성의 추정은, 분광형광법에 의해 320 nm(여기) 및 405 nm(방출)에서, 클로스트리디움 히스토리티쿰(ChC) 박테리아의 콜라게나아제와 형광 펩티드 기질(MMP-2)의 효소 반응을 지연시키는 추출물의 능력을 결정함으로써 수행된다. 양성 기준으로 PADS(포스포라미돈 황산이나트륨)를 사용한다.
히만탈리아 엘롱가타 추출물(각각 실시예 1a 및 1b에서 수득) 대 페닐에틸 레조르시놀에 대해 수득된 결과를 도 6에 나타내었다. 히만탈리아 엘롱가타의 비정제 추출물뿐만 아니라, 히만탈리아 엘롱가타의 정제 추출물이 상당한 항콜라게나제 활성을 갖는 것으로 나타났다. 이는, 히만탈리아 엘롱가타 추출물이 콜라게나아제를 억제할 수 있는 것을 나타냈다.
실시예 7: 노화 반점에 대한 생체외
시험
-
노인성 흑색점
i) 피부 외식편 처리
피부 섬유아세포 노화는 200 μm에서 2시간 동안 H2O2로 화학적 전신 처리에 의해 신선한 인간 피부 외식편(여성 기증자, 35세)에 유도되었다. 히만탈리아 엘롱가타 추출물을 사용한 국소 도포의 영향을 평가하기 위해 외식편을 하기와 같이 처리하였다:
노화 유도 후, 피부 배지를 신선한 배지로 교체하고, a) 피부 외식편을 3%(v/v) 히만탈리아 엘롱가타 추출물(정제 추출물)로 국소 처리하거나, 또는 b) 피부 외식편을 미처리된 노화 상태로 처리하지 않았다. 미처리된 기본 대조군에 대한 다른 피부 외식편은 처리하지 않았고, 이들의 배지는 매일 교체하였다.
이러한 조건을 5일 동안 매일 반복하였다. 샘플링 후, 피부 외식편을 포르말린으로 고정한 후 탈수하고 파라핀에 포매하였다.
ii) 과색소침착(SDF-1)
방법: SDF-1 면역염색
파라핀에 포매된 외식편을 4 μm 두께로 절단한 후 탈납(dewax)하였다. EDTA(에틸렌다이아민테트라아세트산) pH 8 완충액에서 항원 검색을 수행한 후, 피부 샘플의 비특이적 부위를 소 혈청 알부민으로 포화시켰다. 이후, 샘플을 항SDF-1 항체와 함께 4℃에서 밤새 인큐베이션한 다음, 이를 세정하고, 암실 실온에서 45분 동안 알렉사 플루오르(Alexa Fluor) 488에 결합된 2차 항체와 또 다른 인큐베이션을 수행하였다. 샘플을 세정하고, 커버슬립 및 DAPI(4',6-다이아미디노-2-페닐인돌)를 함유하는 마운팅 배지와 함께 조립하였다. SDF-1 발현에 대한 양성 세포를 점수화하였다.
결과: SDF-1 발현을 통한 과색소침착 조절
미처리된 피부와 비교하여(도 7a, 왼쪽), 노화 유도가 SDF-1을 발현하는 섬유아세포의 수를 현저하게 감소시키는 것을 확인하였으며(도 7a, 중간), 이는 색소침착 조절의 상실을 의미한다. 노화된 외식편을 5일 동안 3% HEX로 처리한 후, SDF-1 발현의 상당한 증가가 관찰되었는데(도 7a, 오른쪽), 이는 색소침착 조절의 잠재적인 활성화를 초래하였다.
또한, 각 조건에 대해 진피 표피 접합부 근처에서 SDF-1을 발현하는 다수의 섬유아세포의 점수화(도 7b)로 상기 결과를 확인하였다.
히만탈리아 엘롱가타 추출물은 SDF-1 발현을 증가시켜, 특히 노인성 흑색점과 관련하여 색소침착 조절을 활성화할 수 있는 것을 나타냈다.
iii) 과색소침착(폰타나 마손(Fontana's Masson) 염색)
방법: 폰타나 마손 염색 및 이미지화 분석을 이용한 멜라닌 정량화
포르말린-고정 및 파라핀-포매된 외식편을 4 μm 두께로 절단하고 탈납한 다음, 폰타나 마손 은(silver) 염색법으로 멜라닌에 대해 염색하였다. 명시야 모드에서 Axio Observer 역상 형광 현미경(Zeiss)으로 이미지를 수집하였다.
멜라닌은 2개의 오픈 소스 광학 이미지화 소프트웨어 프로그램을 사용하여 정량화되었다. GIMP-GNU 이미지 조작 프로그램에서 폰타나-마손 조직 섹션의 현미경 사진(jpeg 형식)을 열었다. 염색된 부분의 멜라닌 입자에 해당하는 갈색-검정색 신호를 선택하고 복사하여 새 이미지에 붙여넣고 jpeg 파일로 저장하였다. 상기 jpeg 파일은 흰색 배경에 검은색/갈색(멜라닌 입자)으로만 구성되어 있다. 이후, 상기 이미지를 ImageJ 프로그램을 사용하여 열었다. 이미지의 히스토그램이 생성되어, 이미지의 총 픽셀 수를 가시 스펙트럼에 걸친 255개의 색상 범주로 구분한다. 갈색-검은색 색상(멜라닌)에 해당하는 피크는 멜라닌 피크의 각 채널에서 적절한 카운트를 자르고 합산하여 결정되었다. 대안적으로, 색소 피크에 해당하는 숫자를 엑셀 스프레드시트에 붙여넣고 합산할 수 있다. 색소침착 지수는 ImageJ에 의해 결정된 대표적인 20X 필드에서 블랙 픽셀의 절대 수를 취하여 10-3을 곱함으로써 수득되었다.
결과: 폰타나 마손 염색 및 이미지화 분석을 이용한 과색소침착의 조절
동일한 피부 외식편에서, 도포 전후의 멜라닌 함량을 시각화하기 위해 폰타나 마손 염색을 수행하였다(도 8a).
H2O2가 SDF-1 발현의 억제를 통해 미처리된 조건과 비교하여 멜라닌 함량의 중요한 증가를 유도했음이 입증되었다. 상기 결과는 이러한 모델이 노인성 흑색점에서 발견되는 과색소침착을 모방한다는 것을 입증하였다.
5일 동안 3% HEX를 국소 도포하면 미처리된 조건에서 관찰된 것과 동일한 수준으로 멜라닌 함량이 급격하게 감소하는데, 이는 노화 섬유아세포에 의한 SDF-1 발현의 재활성화에 기인한 것이다.
이미지화 분석을 사용하여 색소침착 지수를 계산한 결과(도 8b), H2O2 존재 하의 결과에서 관찰된 바와 같이 노화 유도와 함께 현저한 과색소침착(+145%)이 있음을 입증하였다. 5일 동안 3% HEX를 국소 도포하면, 멜라닌 함량 감소에 의해 관찰되는 바와 같이 멜라닌 생성이 상당히 감소한다(도 8c).
실시예 8: 노화 반점에 대한 생체외 시험 -
일광 흑색점
i) 피부 외식편 처리
5일 동안, 신선한 인간 피부 외식편(여성 기증자, 35세)에 UV-A(9 J/cm2) 및 UV-B(0.33 J/cm2, UV-A/UV-B 백분율 = 27)를 총 5회의 단일 조사로 매일 조사하였다. 각각의 단일 조사 후, 3개의 외식편을 3%(v/v) 히만탈리아 엘롱가타 추출물(정제 추출물)로 국소 처리하였고, 다른 외식편은 미처리 UV 노출 조건에서 처리하지 않았다. 대조군의 외식편은 어떠한 조사나 처리도 하지 않았다. 샘플링 후, 외식편을 두 부분으로 절단하여 한 부분은 OCT에 보존하고 카보닐 점수 이미지화를 수행하는 데 사용하고, 다른 부분은 탈수하기 전에 포르말린에 고정하고 폰타나 마손 염색 및 보완 면역화학을 위해 파라핀에 포매하였다. IL-8 생성을 측정하기 위 조사 후 마지막 날 8시간에 상청액을 수집하였다.
ii) 과색소침착(SDF-1)
방법은 실시예 7ii)를 참조한다.
결과: SDF-1 발현을 통한 과색소침착 조절
문헌에는 일일 UV 노출이 피부 세포 노화 유도를 통해 피부 조기 노화를 유발하는 것으로 기재되어 있다. SDF-1 면역염색을 수행함으로써 UV 유도 노화가 SDF-1 발현에 미치는 영향을 입증하였다. 또한, 히만탈리아 엘롱가타 추출물이 이러한 현상을 어떻게 변화시킬 수 있는지도 보여주었다.
미처리된 피부(도 9a, 왼쪽)와 비교하여, UV 노출이 SDF-1을 발현하는 섬유아세포의 수를 현저히 감소시키는 것을 확인했으며(도 9a, 중간), 이는 색소침착 조절의 손실을 의미한다. UV 조사된 외식편을 5일 동안 3% HEX로 처리한 후 SDF-1 발현의 상당한 증가가 관찰되었으며(도 9a, 오른쪽), 이는 색소침착 조절의 잠재적인 활성화를 초래하였다.
또한, 각 조건에 대해 진피 표피 접합부 근처에서 SDF-1을 발현하는 다수의 섬유아세포에 대한 점수화(도 9b)로 상기 결과를 확인하였다. 이는, 히만탈리아 엘롱가타 추출물이 SDF-1 발현을 증가시킬 수 있으며, 따라서 특히 일광 흑색점과 관련하여 색소침착 조절을 활성화할 수 있는 것을 나타냈다.
iii) 과색소침착(폰타나 마손 염색)
방법은 실시예 7iii)을 참조한다.
결과: 폰타나 마손 염색 및 이미지화 분석을 이용한 과색소침착의 조절
미처리 상태와 비교하여 폰타나 마손 염색을 사용하여 관찰된 바와 같이 UV 노출이 피부 외식편에서 멜라닌 함량의 증가를 유도한 것으로 나타났다(도 10a의 상단 및 중간 참조). 5일 동안 3% HEX를 국소적으로 적용하면, UV에 의해 유발된 과색소침착이 감소하였다(도 10a 하단).
이미지화 분석을 사용하여 색소침착 지수를 계산한 결과(도 10b, 10c), UV 노출에 의해 유도된 현저한 과색소침착이 있는 것으로 입증되었으며, 이는 5일 후 3% HEX를 국소 도포함으로써 상당히 감소되었다.
이는, 히만탈리아 엘롱가타 추출물이 UV 노출에 의해 유발된 과색소침착을 감소시킬 수 있는 것을 나타냈다.
iv) 산화된 단백질의 환원
방법: 카보닐 점수 측정에 의한 산화 단백질의 정량화
저온유지장치(Leica)를 사용하여 4 μm 두께의 외식편 단편을 수득하고, 95% 에탄올과 5% 아세트산을 포함하는 용액으로 고정하였다. 카보닐화 단백질은 핵 표지화를 위해 카보닐 모이어티 및 DAPI(4',6-다이아미디노-2-페닐인돌)와 반응하는 특정 형광 프로브(Ex = 480 nm / Em = 530 nm)를 사용하여 표지하였다.
표면형광 현미경(EVOS M5000 Imaging System; Thermo Fisher Scientific)으로 형광 이미지를 수집하고, ImageJ 소프트웨어(Schneider, 2012)로 분석하였다. 배율(10X 또는 60X 대물렌즈)에 대해 동일한 획득 조건을 사용하여, 상이한 조건의 이미지 비교가 이루어졌다.
결과: UV 노출 후 산화된 단백질의 감소
적색 형광 검출의 강도에 의해 관찰되는 바와 같이, UV 노출이 산화된 단백질의 증가를 유도하는 것이 입증되었다. 이러한 효과는 산화된 단백질의 검출 및 제거를 담당하는 프로테아좀 활성의 감소와 관련이 있다.
3% HEX를 5일 동안 국소 도포한 후, 산화된 단백질의 현저한 감소가 관찰되었다. 따라서, HEX가 일광 흑색점에서 크게 영향을 받는 프로테아좀 활성을 재활성화할 수 있는 것을 입증하였다(도 11a).
신호의 정량화는 관찰치를 확인하였으며, UV 노출 후 +24%까지 산화된 단백질의 상당한 증가를 나타냈고, 이는 HEX의 국소 도포에 의해 3%에서 -40%로 현저히 감소되었다(도 11b).
이는, 히만탈리아 엘롱가타 추출물이 UV 노출 후 산화된 단백질의 존재를 감소시킬 수 있는 것을 나타냈다.
v) UV 노출 후 리포푸신체 축적 감소
방법: 수단 블랙 B 염색(Sudan Black B staining)
8 μm 두께의 저온 단편은 저온 유지 장치를 사용하여 수득하고 10분 동안 10% 포르말린으로 고정하였다. 고정 후, 12분 동안 무수 프로필렌 글리콜의 연속적인 수조, 및 60℃에서 15분 동안 무수 프로필렌 글리콜에서 제조된 0.7% 수단 블랙 B 용액을 색소침착 처리한 후, 85℃의 프로필렌 글리콜 및 3개의 증류수 수조에서 세정하였다. 수성 마운팅 배지를 사용하여 커버슬립을 냉동 단편에 추가하고, 명시야 모드에서 Axio Observer 역상 형광 현미경(Zeiss)으로 이미지를 수집하였다.
리포푸신 축적의 정량화:
리포푸신은 2개의 오픈 소스 광학 이미지화 소프트웨어 프로그램을 사용하여 정량화되었다. 수단 블랙 B 조직 섹션의 현미경 사진(Tif 형식)을 ImageJ 소프트웨어에서 열고 색상 채널을 분할하였다. GIMP-GNU 이미지 조작 프로그램에서 열기 전에 수단 블랙 B 염색을 더욱 대표하는 녹색 채널을 선택하여 저장하였다. 염색된 부분의 리포푸신에 해당하는 어두운 색 신호를 선택하고 복사하여 새 이미지에 붙여넣고 jpeg 파일로 저장하였다. 상기 jpeg 파일은 흰색 배경에 어두운 리포푸신으로만 구성되어 있다. 이후, 상기 이미지를 ImageJ 프로그램을 사용하여 열고, 이를 반전시켜 검은색의 배경 및 측정할 신호에 해당하는 흰색의 리포푸신 염색을 얻었다. 염색 강도는 표피 부위에서 측정하여 리포푸신 양에 해당하는 값을 얻었다.
결과: UV 노출 후 리포푸신체 축적 감소
산화된 단백질의 축적이 표피에서 리포푸신체의 형성으로 이어질 수 있는지 여부를 평가하였다. UV 노출 후 리포푸신 축적을 시각화하기 위해 지질을 검출하는 데 특이적인 수단 블랙 B 염색을 사용하였다(문헌[Evangelou et al. 2017]).
수단 블랙 B 염색은 UV 노출 후 리포푸신체 축적이 +69%까지 상당히 증가했음을 입증하였다. 이것은 미처리된 조건과 비교하여 UV 노출 후 청색 염색의 증가로 명확하게 볼 수 있다(도 12a 상단 및 중간, 도 12b).
3% HEX의 국소 도포는 UV-유도된 리포푸신체 축적을 5일 후 -39%만큼 현저하게 감소시켰으며, 이는 사진에서 청색 염색의 감소로도 관찰된다(도 12a 하단, 도 12b).
이러한 결과는 HEX가 지질 산화에 대한 보호 효과가 있어 피부 노화의 지표인 리포푸신체가 표피에 축적되는 것을 감소시킨다는 것을 보여준다. 이는, 히만탈리아 엘롱가타 추출물이 UV 노출 후 리포푸신체의 축적을 감소시킬 수 있는 것을 나타냈다.
vi) 전염증성 사이토카인(IL-8)
방법: 전염증성 사이토카인(IL-8)의 정량화
비조사 외식편의 경우 피부 외식편의 상청액을 1:5로 희석하고, 조사된 외식편의 경우 1:20으로 희석하였다. 외식편으로부터의 IL-8 방출은 인간 IL-8 Quantikine ELISA 키트(Biotechne)를 사용하여 ELISA 투여량에 의해 정량화되었다. ELISA는 공급업체 지침에 따라 수행되었다. 상기 비색 분석에서 수득된 광학 밀도는 Tecan 마이크로플레이트 판독기(Spark)로 판독하였다.
결과: UV 노출 후 염증 감소
염증 반응의 증가는 특히 전염증성 사이토카인 IL-8의 정량화를 통해 관찰되었으며, 이는 UV 노출로 +121%의 강력한 증가를 입증하였다.
3% HEX의 국소 도포는 UV 유도된 IL-8의 과잉 생성을 현저하고 크게 감소시켰으며, 이는 HEX가 일광 흑색점과 관련된 염증을 조절할 수 있음을 입증하였다(도 13).
이는, 히만탈리아 엘롱가타 추출물이 UV 노출 후 염증을 감소시킬 수 있는 것을 나타냈다.
vii) UV 노출 후 각질층 두께 감소
방법: 필라그린(Filaggrin) 면역염색
파라핀에 포매된 외식편을 4 μm 두께로 절단한 후 탈납하였다. EDTA pH 8 완충액에서 항원 검색을 수행한 후, 피부 샘플의 비특이적 부위를 소 혈청 알부민으로 포화시켰다. 이후, 실온에서 샘플을 2시간 동안 항필라그린 항체와 함께 인큐베이션한 다음, 이를 세정하고, 암실 실온에서 1시간 동안 알렉사 플루오르 488에 결합된 2차 항체와 함께 또 다른 인큐베이션을 수행하였다. 샘플을 세정하고, 커버슬립 및 DAPI(4',6-다이아미디노-2-페닐인돌)를 함유하는 마운팅 배지와 함께 조립하였다. 각질층의 두께는 각질층을 시각화할 수 있는 특정 필라그린 염색 후 ImageJ 소프트웨어로 측정하였다.
결과: UV 노출은 각질층 두께의 증가로 인해 각질세포 사이의 응집력 상실로 이어져 피부 장벽 무결성에 영향을 미치는 것으로 나타났다. 필라그린 면역염색을 관찰함으로써 3% HEX의 국소 도포가 필라그린 발현(녹색 형광, 도 14a)에 이어 각질층 두께를 현저하게 감소시키는 것으로 나타났다.
실제로, UV 노출 후 11 μm에서 15 μm로 두꺼워지는 것으로 나타났다(+26%). 3% HEX의 국소 도포하면, 조사되지 않은 상태에 가까운 각질층 두께가 회복되어, 11 μm의 두께를 나타내는 것으로 관찰되었다(-27%)(도 14b). 이는, 히만탈리아 엘롱가타 추출물이 UV 노출 후 각질층 두께를 감소시킬 수 있는 것을 나타냈다.
실시예 9: 미백 효능의 생체외 시험
i) 피부 외식편 처리
3명의 아시아인, 3명의 아프리카인, 3명의 백인의 피부 단편을 1 cm²조각으로 절단하고 항생제를 사용하여 3회 세척하였다. 피하 지방과 하부 진피는 외과용 메스를 사용하여 입체 현미경으로 기계적으로 제거하였다.
피부 생검은 인큐베이션 삽입물(필터 기공 크기 12 μm, Costar, VWR International, 퐁트네-수-부아, 프랑스)의 공기/액체 경계면에서 상피가 최상부에 배치되었다. 상기 삽입물을 5% CO2의 가습 인큐베이터에 37℃에서 14일 동안 12-웰 플레이트에 두었다.
배지 표면이 필터와 수평이 되도록 배지를 웰에 첨가하였다. 장기 인큐베이션은 항생제, L-글루타민, 소 뇌하수체 추출물, 성장 인자 및 소 태아 혈청(DAP, 뇌프-브히사슈, 프랑스)을 함유하는 둘베코 최소 필수 배지(Invitrogen Corporation, 페이즐리, UK)로 보존하였다.
미처리된 피부와 비교하여 양성 대조군으로서 히만탈리아 엘롱가타 추출물 3%(비정제 추출물), 페닐에틸 레조르시놀 0.5% 및 하이드로퀴논 2%(SIGMA H9003)를 피부 단편의 표피에 14일 동안 매일 국소 도포하였다.
하기 4가지 조건(3중 실행)을 비교하였다.
- 미처리된 피부
- 히만탈리아 엘롱가타 추출물 3%(v/v)로 처리된 피부
- 페닐에틸 레조르시놀 0.5%(w/v) 처리된 피부
- 하이드로퀴논 2%(w/v)로 처리된 피부.
ii) 방법: 폰타나 마손 염색법에 의한 조직학적 분석 및 전문가에 의한 미백 점수화
색소탈실(depigmentation) 생성을 테스트하기 위해, 처리된 피부로부터 표피의 기저 세포층의 인접 케라티노사이트 및 멜라닌 세포에 존재하는 멜라닌 색소를 미처리된 피부와 비교하여 평가한다.
샘플을 14일에 포르말린으로 고정하고 파라핀-포매하였다. 이후, 섹션(4 μm)을 멜라닌에 대한 폰타나 마손 은 염색법으로 염색하였다(실시예 4 iii) 참조).
표피의 기저세포 약 300개에 대해 광학 현미경으로 40배율로 멜라닌 색소를 포함하는 세포를 정량화하였다.
두 가지 유형의 세포를 계수하였다.
- 점수 1: 색소침착되지 않은 세포, 또는 세포질에서 분리된 희귀 멜라닌 색소를 나타내는 세포
- 점수 3: 세포질 전체에 중요한 멜라닌 색소를 나타내는 세포
각각의 점수화에서 표피 멜라닌 함량은 표피 세포의 백분율로 계산되었다.
결과:
a) 백인 피부 외식편에서의 미백(도 15a,b)
14일 동안 3%의 비정제 히만탈리아 엘롱가타 추출물을 국소 도포한 결과, 백인 피부 외식편에서 매우 색소침착된 세포의 백분율이 크게 감소하고(-21.6%) 색소침착되지 않은 세포가 크게 증가하여(+36.7%), 백인 피부에서 3% 히만탈리아 엘롱가타 추출물의 미백 효능이 입증되었다.
이에 비해, 페닐에틸 레조르시놀은 색소침착되지 않은 세포의 백분율만 크게 증가시켰지만(+38.8%), 매우 색소침착된 세포에는 영향이 없었다(-4.2%). 3% 히만탈리아 엘롱가타 추출물이 백인 피부 외식편에서 페닐에틸 레조르시놀보다 더욱 효율적이라는 결론을 내릴 수 있다.
3% 히만탈리아 엘롱가타 추출물은 또한 2% 하이드로퀴논보다 훨씬 우수하였는데, 이 성분은 백인 피부의 색소침착되지 않은 또는 매우 색소침착된 세포에 큰 영향을 미치지 않았다.
b) 아시아인 피부 외식편에서의 미백(도 16a,b)
14일에 걸쳐 3% 비정제 히만탈리아 엘롱가타 추출물을 국소 도포한 결과, 아시아인 피부 외식편에서 매우 색소침착된 세포의 백분율이 현저하게 감소하고(-18.9%) 색소침착되지 않은 세포가 현저하게 증가하여(+75.9%), 아시아인 피부에서 3% 히만탈리아 엘롱가타 추출물의 미백 효능이 입증되었다.
페닐에틸 레조르시놀의 국소 도포는 색소침착되지 않은 세포의 백분율을 상당히 증가시켰고(+110.7%), 색소침착된 세포의 백분율을 상당히 감소시켰다(-29.2%). 따라서, 3% 히만탈리아 엘롱가타 추출물은 아시아인 피부 외식편에서 페닐에틸 레조르시놀만큼 효율적이다.
3% 히만탈리아 엘롱가타 추출물은 또한 2%의 하이드로퀴논만큼 미백 활동에 효율적인데, 이는 아시아인 피부에서 색소침착되지 않은 세포의 현저한 증가(+54.1%) 및 매우 색소침착된 세포의 현저한 감소(-25.8%)를 유발하였다.
c) 아프리카 피부 외식편에서의 미백(도 17a,b)
14일 동안 3% 비정제 히만탈리아 엘롱가타 추출물을 국소 도포한 결과, 아프리카 피부 외식편에서 매우 색소침착된 세포의 백분율이 크게 감소하고(-23.6%) 색소침착되지 않은 세포가 크게 증가하여(+88.4%), 아프리카인 피부에서 3% 히만탈리아 엘롱가타 추출물의 미백 효능이 입증되었다.
페닐에틸 레조르시놀로 처리한 결과 또한 색소침착되지 않은 세포의 백분율을 크게 증가시키고(+91.7%) 색소침착된 세포의 백분율을 유의하게 감소시켜(-22.7%), 3% 히만탈리아 엘롱가타 추출물이 아프리카인 피부 외식편에서 페닐에틸 레조르시놀만큼 효율적임을 보여준다.
그러나, 3% 히만탈리아 엘롱가타 추출물은 2% 하이드로퀴논보다 미백 활동에 더욱 효율적이다. 하이드로퀴논은 아프리카인 피부에 국소 도포한 후 색소침착되지 않은 세포와 매우 색소침착된 세포에 유의미한 결과를 나타내지 않았다.
히만탈리아 엘롱가타 추출물은 다양한 유형의 피부에 미백 효과가 있는 것을 나타냈다.
실시예 10: 임상 시험 - 백인 지원자의 손의 색소침착된 반점의 감소
i) 사용된 INCI 제형
ii) 패널 설명
이 연구는 이중 맹검, 무작위 및 위약 통제 연구였다. 평가는 3% HEX 크림 (활성 제품), 0.3% 페닐에틸 레조르시놀 크림 및 위약 크림으로 수득된 결과 간의 대상 내 비교를 기반으로 하였다. 측정은 21±1℃의 온도 및 50±10%의 습도에서 조절된 분위기에서 수행되었다. 이 연구는 손에 색소침착된 노화 반점을 갖는 39명의 지원자(50세에서 75세 사이의 건강한 백인 여성, 평균 연령: 61.7 ± 5.6세)를 대상으로 수행되었다.
iii) 치료
이 연구는 각각 약 20명의 지원자로 구성된 2개 그룹(50세에서 70세까지 총 39명의 지원자)에 대해 수행되었다. 크림 제형을 하루에 두 번 손에 발랐다. 평가는 치료 전과 28일 및 56일 후에 수행되었다. 그룹 1은 한쪽 손에 위약을, 다른 한쪽 손에는 3% HEX를 도포하였고, 그룹 2는 한쪽 손에 3% HEX를, 다른 한쪽 손에는 0.3% 페닐에틸 레조르시놀을 도포하였다.
iv) 방법: Mexameter® 분석
측정은 흡수 원리를 기반으로 한다. MEXAMETER MX 18 프로브는 세 가지 정의된 파장의 방사선을 방출한다. 수신기는 피부에서 반사된 빛의 반사를 측정한다. 송신기와 수신기의 위치는 산란광만 측정되도록 한다. 방출된 빛의 정의된 양으로 피부에 흡수된 빛의 양을 계산할 수 있다. 멜라닌은 두 가지 파장으로 측정된다. 파장은 멜라닌 색소의 다른 흡수 피크에 따라 선택되었다. 홍반(피부의 발적) 측정을 위해, 두 가지 다른 파장을 사용하여 표피의 흡수 능력을 측정한다. 파장 중 하나는 헤모글로빈의 흡수 스펙트럼에 해당한다. 다른 파장은 피부색에 영향을 미치는 다른 색소를 갖도록 선택되었다.
v) 결과:
a) 멜라닌 함량 감소(도 18)
3% HEX는 28일 및 56일 후에 피부의 멜라닌 함량을 D0에 비해 각각 -13.8% 및 -21.3%로 상당히 감소시킬 수 있었다.
위약 크림은 연구 기간 동안 약간의 미백 효과를 나타내었지만, 3% HEX는 위약보다 훨씬 더 멜라닌 함량을 감소시켰고, HEX 도포 28일 후에는 2.2배 더 효율적인 미백 활동을 보여주었다.
3% HEX의 멜라닌 감소 효능은 0.3% 페닐에틸 레조르시놀과 동일하였고, 두 제품 간에 유의한 차이는 관찰되지 않았다.
이는, 히만탈리아 엘롱가타 추출물이 피부의 멜라닌 함량을 감소시켜 피부, 특히 백인 지원자의 손에 있는 색소침착된 반점을 감소시킬 수 있는 것을 나타냈다.
b) 피부 발적 감소(도 19)
3% HEX는 28일 및 56일 후 피부의 피부 발적을 D0에 비해 각각 -8.9% 및 -14.8%로 상당히 감소시킬 수 있었다.
위약은 연구 기간 동안 약간의 발적 감소를 일으켰지만, 위약과 비교하여 HEX 도포 56일 후 1.6배 더 효율적인 발적 감소를 보여, 3% HEX는 피부 발적 감소에 훨씬 더 효율적이었다.
페닐에틸 레조르시놀은 위약으로 수득된 효능과 동일한 효능을 입증하였다. 이 결과는 HEX가 손의 색소침착된 노화 반점에 대한 피부 발적 감소에 페닐에틸 레조르시놀보다 더 효율적임을 입증하였다.
이는, 히만탈리아 엘롱가타 추출물이 특히 백인 지원자의 손에서 색소침착된 노화 반점에 대한 피부 발적을 감소시킬 수 있는 것을 나타냈다.
vi) DermaScop®을 사용한 예시 사진
제품 적용 전과 후에 손에 있는 특정 색소침착된 노화 반점에 대해 DermaScop®으로 예시 사진을 촬영하였다. 효과를 정성적으로 평가하기 위해서만 사진을 사용하였다. 노화 반점의 감소에 대한 3% HEX의 명확한 긍정적 효과가 0.3% 페닐에틸 레조르시놀 효능과 유사하게 가시화되었다. 위약은 이이 대해 긍정적인 영향을 미치지 않았다.
실시예 11: 임상 시험 - 아시아인 지원자의 색소침착된 안면 반점 감소
i) 사용된 INCI 제형
실시예 10 i)에 기재된 제형을 사용하였다.
ii) 패널 설명
이 연구는 이중 맹검, 무작위 및 위약 통제 연구였다. 평가는 3% HEX 크림(활성 제품), 0.3% 페닐에틸 레조르시놀 크림 및 위약 크림으로 수득된 결과 간의 대상 간 비교를 기반으로 한다. 측정은 21±1℃의 온도와 50±10%의 습도에서 조절된 분위기에서 수행되었다. 이 연구는 안면에 색소침착된 노화 반점이 있는 72명의 지원자(45세에서 65세 사이의 건강한 아시아인 여성)를 대상으로 수행되었다.
iii) 치료
이 연구는 각각 36명의 지원자로 구성된 2개 그룹(총 72명의 지원자)에 대해 수행되었다. 크림 제형을 하루에 두 번 안면에 도포하였다. 평가는 치료 전과 28일 및 56일 후에 수행되었다. 그룹 1은 안면 한쪽에 위약을 도포하고, 안면 반대쪽에는 3% HEX를 도포하였다. 그룹 2는 안면 한쪽에 3% HEX를 테스트하고, 안면 반대쪽에는 0.3% 페닐에틸 레조르시놀을 테스트하였다.
iv) 방법: VISIA CR2.0에 의한 노화 반점 분석
CANFIELD® 이미지화 시스템의 장치 VISIAR을 사용하였다. 이는 다양한 유형의 조명으로 사진을 찍고 이미지를 매우 빠르게 캡쳐할 수 있다. 재배치 조절은 획득할 때마다 이미지의 오버레이 시각화를 사용하여 데이터 처리 화면에서 직접 이루어진다.
다중 스펙트럼 이미지화 및 분석(백색광, UV 또는 편광 - 평행 또는 교차)에서 촬영한 일련의 사진을 통해 안색 건강 및 외모에 영향을 미치는 시각적 정보를 캡쳐할 수 있다.
표준 조명 하에서, 특히 주근깨, 여드름 흉터, 과색소침착 및 혈관 병변을 포함하는 갈색 또는 적색 피부 병변의 가시화에 의해 눈에 보이는 반점을 평가할 수 있다. CANFIELD의 RBX® 기술과 결합된 교차 편광으로 특히 표면 아래 멜라닌 상태를 분석하여 갈색 반점을 평가할 수 있다. CANFIELD의 RBX® 기술은 적색 및 갈색 피부 구성 요소의 고유한 색상 시그니처를 분리하여 거미정맥류(spider vein), 과색소침착, 염증 및 기타 질환과 같이 색상 집중을 초래하는 질환의 탁월한 시각화를 제공한다. 결과는 크기 또는 강도에 관계없이 장치에서 감지한 병변의 카운트인 병변 수로 제공된다.
v) 결과:
a) 안면의 눈에 보이는 반점 감소(도 20)
VISIA 사진을 사용하여 눈에 보이는 반점의 수를 분석하였다.
3% HEX는 도포 28일 및 56일 후 눈에 보이는 반점의 수를 D0에 비해 각각 -5.6% 및 -3.8%로 상당히 감소시켰다.
위약 크림은 눈에 보이는 반점의 수를 약간 줄였지만 3% HEX를 함유한 크림보다는 명백하게 덜 효율적이다. 또한, 3% HEX는 HEX 크림 도포 56일 후에 위약과 비교하여 2.9배 더 높은 효능을 가져, 눈에 보이는 반점을 현저하게 감소시킨다.
0.3% 페닐에틸 레조르시놀을 함유한 크림은 3% HEX로 수득된 효능과 매우 유사한 효능을 가져, 두 제품 간에는 큰 차이가 없으며, 안면 부위의 눈에 보이는 반점 감소에 HEX가 페닐에틸 레조르시놀만큼 효율적이라는 것을 나타낸다.
이는, 히만탈리아 엘롱가타 추출물이 특히 아시아인 지원자의 안면에 보이는 반점을 감소시킬 수 있는 것을 나타냈다.
b) 안면의 갈색 반점 감소(도 21)
VISIA 분석을 통해 안면의 색소침착된 노화 반점과 관련된 갈색 반점을 평가하였다.
3% HEX를 함유한 크림은 도포 28일 및 56일 후에 갈색 반점을 D0에 비해 각각 -3.4% 및 -2.7%로 상당히 감소시켰다. 또한, 3% HEX는, HEX 크림 도포 28일 후 갈색 반점이 4.9배만큼 크게 감소하여 위약보다 훨씬 더 효율적이다.
0.3%의 페닐에틸 레조르시놀과 비교하여, 두 제품 간의 상당한 차이 없이 안면의 갈색 반점 감소에 대해 HEX보다 약간 더 나은 활성이 나타났으며, 이는 3% HEX가 안면의 갈색 반점의 감소에 페닐에틸 레조르시놀만큼 효율적임을 나타낸다. 이는, 히만탈리아 엘롱가타 추출물이 특히 아시아인 지원자의 안면에 갈색 반점을 감소시킬 수 있는 것을 나타냈다.
vi) 방법: 분광색도계 측정
피부 비색 측정은 직경 8 mm 헤드가 장착된 MINOLTA CM700-d 분광광도계®로 수행되었다. 분광광도계®는 사람이 인지하는 색상을 하기의 세 가지 매개변수로 구성된 디지털 코드로 변환한다.
L*: 선명도(어두운 것에서 밝은 것까지),
a*: 녹색-적색 스펙트럼,
b*: 청색-황색 스펙트럼.
여기서 a* 및 b*는 색차 매개변수이고 L*는 휘도 매개변수이다.
동일한 색으로 보이는 두 피부 영역 사이의 미세한 차이를 설명할 수 있다. 보정 단계 후, 펄스 제논 광원과 전송된 빛을 측정하고 약간의 편차를 수정하도록 설계된 이중 빔 시스템을 사용하여 피부에서 직접 측정이 수행된다.
색소 반점(pigmentary blotch)에 대한 연구 중에 매개변수 b*(피부 멜라닌 황색)가 연구된다. b* 매개변수는 개별 유형학적 각도(ITA°)의 계산을 통해 활용되며, 이는 피부 선명도(L*)와 멜라닌 매개변수(b*)를 고려하여 대상의 피부 색소침착 정도를 하기의 식에 따라 정의한다:
ITA°=[Arc tan((L*-50)/b*)] x 180 / π
vii) 결과: 안면의 색소침착된 반점 부위에 대한 b* 파라미터의 감소(도 22)
분광색도계를 이용하여 특히 b* 매개변수에 초점을 맞추어 색소침착된 노화 반점 부위의 색에 대한 보완적 분석을 수행하였다.
3% HEX를 함유한 크림은 페오멜라닌 함량(황색 천연 색소)과 상관관계가 있을 수 있는 황색 색소인 b* 매개변수를 상당히 감소시켰다. 3% HEX가 또한 위약보다 훨씬 우수하고, 도포 28일 및 56일 후에 두 제품 사이에 상당한 차이를 보여준다.
페닐에틸 레조르시놀의 효능과 관련하여, 3% HEX와 동일한 미백 효능이 도포 28일 및 56일 후 피부의 황색 감소를 의미하는 b* 매개변수의 상당한 감소로 관찰되었다. 따라서, 아시아인 지원자의 안면의 색소침착된 노화 반점에 대한 b* 매개변수 감소에 3% HEX는 0.3% 페닐에틸 레조르시놀만큼 효율적이다. 이는, 히만탈리아 엘롱가타 추출물이 특히 아시아인 지원자의 안면의 색소침착된 노화 반점에 대한 b* 매개변수를 감소시킬 수 있는 것을 나타냈다.
실시예 12: 임상 시험 - 아프리카인 지원자의 안면의 과색소침착된 반점의 감소
i) 사용된 INCI 제형
실시예 10 i)에 기재된 제형을 사용하였다.
ii) 패널 설명
이 연구는 이중 맹검, 무작위 및 위약 통제 연구였다. 평가는 3% HEX 크림(활성 제품), 0.3% 페닐에틸 레조르시놀 크림 및 위약 크림으로 수득된 결과 간의 대상 간 비교를 기반으로 한다. 측정은 20℃ 온도 및 40% 습도의 조절된 분위기에서 수행되었다. 이러한 연구는 70명의 지원자(19 내지 57세, 안면에 과색소침착된 반점이 있음)를 대상으로 수행되었다.
iii) 치료
연구는 3개 그룹에서 수행되었다. 크림 제형을 하루에 두 번 안면 전체에 도포하였다. 평가는 치료 전, 및 28일 및 56일 후에 수행되었다. 각각 25명의 지원자가 있는 그룹 1과 2는 각각 위약 및 3% HEX를 도포하였고, 20명의 지원자가 있는 그룹 3은 0.3% 페닐에틸 레조르시놀을 도포하였다.
iv) 방법: Mexameter® 분석
실시예 10 iv)를 참조한다.
v) 결과:
멜라닌 함량 감소(도 23)
3% HEX는 56일 후 멜라닌 함량을 D0에 비해 상당히 감소시킬 수 있었다(-3.4%). 이러한 효과는 또한 도포 56일 후 위약과는 상당히 상이하다(-4.9%)(도 23 왼쪽).
시험에서 기준점으로 사용된 페닐에틸 레조르시놀은 과색소침착된 부위의 멜라닌 함량을 약간 감소시켰는데, 28일 후 유의한 효과를 나타냈으나(-2.1%), 56일 후에는 유지되지 않았다. 이러한 효과는 도포 28일 후 위약과는 상당히 상이하다(-4.3%)(도 23 오른쪽). 이러한 결과는 페닐에틸 레조르시놀이 히만탈리아 엘롱가타 추출물보다 아프리카인 피부의 과색소침착된 반점의 감소에 덜 효율적인 것으로 보인다는 것을 입증하였다.
두 제품의 효능을 비교한 결과 상당한 차이가 없는 것으로 관찰되어, 히만탈리아 엘롱가타 추출물이 D0 및 위약과 비교하여 아프리카인 피부의 과색소침착된 반점의 감소에 대해 기준점만큼 효율적임을 입증하였다. 이는, 히만탈리아 엘롱가타 추출물이 특히 아프리카인 지원자에게서 피부의 과색소침착된 반점을 감소시킬 수 있는 것을 나타냈다.
Claims (14)
- 히만탈리아 엘롱가타(Himanthalia elongata)의 추출물.
- 제1항에 있어서,
수성 추출물인 추출물. - 제1항 또는 제2항에 있어서,
플로로탄닌의 혼합물을 포함하는 추출물. - 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
플로로탄닌 및 폴리페놀의 혼합물을 포함하고, 이때 폴리페놀 농도가 1 내지 30 g/L인, 추출물. - 제1 활성 화장품 성분으로서 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 따른 히만탈리아 엘롱가타의 추출물, 및 담체를 포함하는 화장품 조성물.
- 제4항에 있어서,
히만탈리아 엘롱가타의 추출물이 화장품 조성물의 2 내지 5 중량%의 양으로 존재하는, 화장품 조성물. - 제4항 또는 제5항에 있어서,
피부 관리 조성물인 화장품 조성물. - 제6항에 있어서,
피부 미백을 위한 화장품 조성물. - 제6항에 있어서,
항노화 치료를 위한 화장품 조성물. - 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 따른 히만탈리아 엘롱가타의 추출물을 포함하는 화장품 조성물을 피부에 도포하는 단계를 포함하는, 피부 치료 방법.
- 제9항에 있어서,
피부 미백을 위한 방법. - 제9항에 있어서,
항노화 치료를 위한 방법. - 피부 관리에서 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 따른 히만탈리아 엘롱가타의 추출물의 용도.
- 히만탈리아 엘롱가타를 추출하는 단계를 포함하는, 활성 화장품 성분의 제조방법.
Applications Claiming Priority (3)
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Publications (1)
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