CN105267268B

CN105267268B - 人参叶提取物制造方法及包含其为有效成分的化妆品组合物

Info

Publication number: CN105267268B
Application number: CN201510232365.1A
Authority: CN
Inventors: 崔钟玩; 郑珉硕; 朴昌珉; 林美辰; 金成根
Original assignee: Hankook Cosmetics Manufacturing Co Ltd
Current assignee: Hankook Cosmetics Manufacturing Co Ltd
Priority date: 2014-07-03
Filing date: 2015-05-08
Publication date: 2020-06-30
Anticipated expiration: 2035-05-08
Also published as: KR20160004568A; CN105267268A

Abstract

本发明涉及人参叶提取物制造方法及包含其为有效成分的化妆品组合物，公开了皮肤外用剂化妆品组合物及其制造方法，通过含有以砂炒法或醋炙法炮制的人参叶提取物0.001～10.0重量％，与以往的单纯人参叶提取物或作为现有炮制品的人参叶碳提取物相比，进一步增加抗氧化效果、基质金属蛋白酶的活性抑制与表达阻碍效果。本化妆品组合物能够抑制酪氨酸酶的活性，进一步增加改善发暗的肤色或防止皮肤的色素沉着的效果。

Description

人参叶提取物制造方法及包含其为有效成分的化妆品组合物

技术领域

本发明涉及以中药炮制加工改良人参叶(The Leaf of Panax ginseng)的方法及含有改良的人参叶提取物为主要活性成分的化妆品组合物。

背景技术

暴露在紫外线下的皮肤由于生成自由基与活性氧类(ROS)而引发皮肤癌、光毒性、自身免疫障碍、光过敏症、皮肤老化等(Norins,J.Invest.Dermatol.,39:445,1962；Cadenas,Ann.Rev.Biochem.,58:79,1989)。在人体内如胶原蛋白等细胞外基质的合成和分解能适当进行调节，但是随着老化其合成减少且促进作为分解胶原蛋白酶的基质金属蛋白酶(MMP；Matrix Metalloprotease)的表达，使得皮肤弹性下降，形成皱纹。而且这种分解酶也能由紫外线照射而激活。因此需要开发能够调节在细胞内诱导活化的基质金属蛋白酶的表达或抑制其活性的物质。

另一方面，决定肤色的因素除了基本的人种、地域、性别、年龄的差异，有痣、雀斑、因暴露在紫外线而晒黑之类的部分或整体的色素沉着，此外还有粉刺和疤痕、角质的分布状态与血液循环、压力、健康状态等。以上因素中最重要的因素是色素沉着。影响肤色的色素是黑色素，根据紫外线与体内激素分泌程度而不同。黑色素的生物合成由作为氨基酸的一种的酪氨酸在黑色素细胞的黑素体中被酪氨酸酶(tyrosinase)氧化而转化为二羟基苯丙氨酸(dihydroxy phenylalanine)开始，进过继续发生的一系列氧化过程形成褐黑素(pheomelanin)、真黑色素(eumelanin)的聚合物而形成。这种生物合成过程在名为黑素体的特殊的细胞内小器官中进行，包含黑色素颗粒的黑素体从细胞核周边部位向树枝状突起端部移动，由角化细胞的吞噬体作用向细胞质内移动，蓄积在细胞核周边。黑色素的合成与黑素体的数量，向周围角化细胞的移动部分地受激素与紫外线等的影响，主要受遗传的较大影响。此外众所周知，作为与酪氨酸酶的表达及黑色素的合成、输送相关的细胞内调节因子的细胞因子(cytokine)、铜、锌、铁等的金属离子及干扰素、前列腺素、组胺等也进行参与(朴寿南:大韩化妆品学会志，25:77-127,1999(

25:77-127,1999))。从而通过抑制决定肤色的黑色素的合成、抑制参与其中的酶即酪氨酸酶的活性，可以期待提高皮肤的美白效果。

人参(Panax ginseng C.A.Meyer)作为韩半岛的原产的韩国的特产药用植物，是从2000多年前开始在东北亚作为保元气药物使用的重要的中药之一。人参在东洋最早的本草书神农本草经中记录为保五脏、补充元气(Namba,1980)。人参的生理活性在系统的药理学角度被报具有心血管系统(Lee et al.,1981)、免疫系统(Jie et al.,1984)、对神经系统(Kim et al.,1998)的功效与解毒作用(Joo et al.,1977)、抗癌作用(Tahara et al.,1985)以及抗糖尿病作用(Yokozawa et al.,1985)等。人参的主要生理活性物质已知的有人参皂苷(ginsenosides)、聚乙炔(polyacetylenes)、酸性多糖体、人参蛋白质、多酚物质等(Park,1996；Sanata et al.,1974；Kitagawa et al.,1987)。其中皂苷的化学结构已经由萨纳塔(Sanata)等(1974)的研究而明确确认，且被报具有包括抗糖尿病活性(Yokozawaet al.,1985)在内的抗癌作用、抗氧化作用、动脉硬化及预防高血压、促进肝功能及解酒作用、抗疲劳及抗压作用、抗老化作用、促进大脑活动作用、抗炎作用、治疗过敏性疾病、促进蛋白质合成能力等(Park,1996)。已知人参的代表性活性成分人参皂苷(Ginsenoside)均匀的分布在人参的地上及地下部位，特别是根据人参根、人参叶及人参果实等部位的不同，不仅是人参皂苷的含量，其组成也不同(Attele AS et al,Biochem Pharmacol,58；1685-1693,1999)。人参收获大概4～6年根而商品化为干参、红参及利用其的各种产品，在其过程中人参的叶、茎等副产物一直被废弃。根据学界的关于人参叶的相关材料，人参叶具有比人参根多2～3倍的10～13％程度的与人参的皂苷类似结构和药理功效的皂苷，被评价为非常有价值的医药资源(Xiang-guo Li et.al.,Life Science Journal,679-683,9(4),2012)。

发明内容

本发明的目的在于提供砂炒人参叶提取物或醋炙人参叶提取物及其制造方法，利用砂炒法或醋炙法制造人参叶提取物，以100℃～160℃进行加热使人参叶的有效成分不被炭化，与人参叶生品或人参叶碳提取物相比，酚性化合物人参皂苷含量高，且抗氧化效果、抗皱效果、美白效果显著提升。

而且，本发明的另一目的在于提供化妆品组合物，由于人参叶提取物的颜色浅，使原料颜色对化妆品产品的影响最小化。

本发明的目的不限于上面所提及的目的，未提及的其他目的可由下面的记载所明确地被理解。

根据本发明的人参叶提取物制造方法可以包括：将人参叶与海砂或醋酸进行混合的第一步骤；在100℃～160℃搅拌加热所述第一步骤中制造的混合物后，冷却，制造炮制的人参叶的第二步骤；将提取溶剂加入所述第二步骤中炮制的人参叶中，回流提取后进行减压过滤的第三步骤；以及减压浓缩所述第三步骤中形成的滤液，获得浓缩的人参叶提取物的第四步骤。

在这里，所述提取溶剂可以是选自纯净水、甲醇、乙醇、甘油、乙酸乙酯、丁烯二醇、丙二醇、二氯甲烷和己烷中的一种以上。

另外，根据本发明的化妆品组合物，其特征在于，相对于组合物总重量，以0.001重量％～10重量％的量含有由所述制造方法制造的人参叶提取物。

根据本发明，将人参叶加工成以砂炒法炮制的砂炒人参叶或以醋炙法炮制的醋炙人参叶，与现有的单纯的人参叶提取物和以现有的炮制方法加工的人参叶碳提取物相比，作为植物性抗氧化物质的酚性化合物的提取率显著高，能够提供更优异的抗氧化效果。

而且本发明的醋炙人参叶提取物或砂炒人参叶提取物与现有的单纯的人参叶提取物和人参叶碳提取物相比，MMP阻碍效果、紫外线照射引起的MMP表达调节效果、以及细纹改善效果等抗老化效果更优异。

另外，加工为醋炙人参叶提取物或砂炒人参叶提取物时，与现有的单纯的人参叶提取物和人参叶碳提取物相比，具有更高的酪氨酸酶(tyrosinase)阻碍效果、黑色素生物合成阻碍效果、以及肤色的美白效果。

另外，现有的单纯的人参叶提取物的外观颜色是深绿色，但加工为醋炙人参叶提取物或砂炒人参叶提取物时，因其颜色变淡成为黄色，所以加入化妆品后具有对整个化妆品颜色的影响显著减少的效果。

因此，这种含有醋炙人参叶提取物或砂炒人参叶提取物的化妆水、霜、乳液、面膜、粉等化妆品组合物可以用为具有抗氧化效果与改善皮肤细纹的优异抗老化效果的皮肤外用剂。

具体实施方式

用于实现这种目的的本发明涉及人参叶的炮制方法，提供一种制造人参叶提取物的方法，其以砂炒法或醋炙法炮制人参叶来增加人参的主要成分中的人参皂苷的含量，从而增加作为植物性抗氧化物质的酚性化合物，增加抗氧化活性与抗老化活性及美白效果。

根据本发明的化妆品组合物不同于已开发的含有来自红参或人参的人参皂苷Re与Rh2复合体的化妆品组合物及其制造方法(大韩民国专利号第10-1233832号)，以人参的水解物为有效成分的抗氧化、抗老化、皱纹预防及改善用组合物(大韩民国专利；申请日期2010年06月18日)，含有来自无土栽培的人参中的人参皂苷F2的皮肤外用剂组合物(大韩民国专利申请日期2012年07月05日)、人参叶提取物的制造方法及其提取物(大韩民国专利号10-1328194)等为了弥补单纯的人参叶提取物的缺点的对人参主要成分的分离方法及其组合物、进行包括对人参叶的发酵的规定处理后提取的人参叶提取物的制造方法及其提取物，而是单独利用人参叶加工为砂炒品或醋炙品，以其作为包含主要活性成分的提取物为特征。

本发明的发明人在对人参叶进行研究的过程中发现以炮制方法提取人参叶能提高人参的主要活性成分与生理活性的功效，并确认了适用本产品的化妆品的组合物能增加抗氧化、抗老化、对氧化应激的抵抗性，从而完成了本发明。

即，本发明的发明人作为寻找更优异的化妆品原料的研究的一个环节，检测各种天然物的结果，发现人参叶提取物具有抗氧化及抗老化效果。但是人参叶的单纯提取物具有以下缺点，即，虽然在人物体外有效果，但将含有其的化妆品实际涂敷于皮肤时，其效果不能令人满意或为了取得令人满意的效果需要投入高浓度的提取物。而且人参叶提取物还有以下缺点，因其外观带有深绿色，在为了在皮肤上显示出令人满意的改善效果而投入高浓度时，化妆品颜色带有深绿色，所以不适用于作为以美丽外观为重要形象的商品的化妆品。

另一方面，炮制作为中医学中使用的传统药材加工方法，又叫做修治或炮炙。炮制作为根据药物的医疗目的、调制或制剂等的需要进行加工处理的方法的总称，是包含筛选药物形态工整的药材、去除杂质、精制、加热处理、利用辅料的加工等的术语。炮制的起源记载在中国最早的医书内经、神农本草经，具有超过2000年的历史，从初期的药材净制、切制等简单的处理开始，因酒的发明，其技术急速发展，由古方与治疗经验进行了修正和完善。炮制根据情况添加辅料一起进行炮制，这符合医疗的要求，是为了达到根据辨证的用药的目的。药物的炮制中使用的辅料种类多样且具有各不相同的性质与作用，因此炮制的药物起的作用也各不相同。目前常用的辅料的种类比较多，大体可分为液体辅料与固体辅料。液体辅料有酒、醋、蜂蜜、生姜汁、甘草汁、黑豆汁、食盐水、米泔水、麻油、乳、童便、石灰水等。固体辅料有稻米、麦麸、白帆、豆腐、土、蛤粉、砂(河砂、海砂)等。中药学中使用炮制的目的在于减少药物的毒副作用，增强药物疗效或方便调剂与制剂及患者的服用，改善原料的保存性，形成标准化(中药炮制学，金继英等，新日商社；中药炮制与临床应用，崔虎英等，英林社(

))。

人参叶使用为蔬菜，几乎不以治疗为目的使用。人参叶在中医学中也不会直接切制使用或制作使用其生品。人参叶碳是以炮制法中的不使用辅料而在220～300℃大火中炒至表面显深黑色、内部显黑褐色的炒炭法制造而成的。这种方法虽不知在中医学中有没有效果，但有如下缺点：在220～300℃的大火中炒至药材内部的加工引起符合本发明要完成的作为抗老化化妆品的目的的目标成分的流失与药材碳化引起的有害成分的产生。

因此，本发明的发明人为了克服人参叶的溶剂提取物所具有的上述缺点而研究炮制方法的结果，发现以砂炒法和醋炙法加工的人参叶比生品和作为已有的炮制品的人参叶碳具有更高的作为植物性抗氧化剂的酚性化合物的提取率，由此发现能够提高自由基、活性氧类的消除活性及胶原酶的表达和活性的抑制效果，发现将含有少量本发明的人参叶提取物的化妆品涂敷在皮肤上时具有优异的改善皱纹效果，从而完成了本发明。而且，能够抑制酪氨酸酶的活性，增加改善紫外线引起的色素沉着和皮肤发暗的效果，进而发现将含有少量本发明的人参叶提取物的化妆品涂敷在皮肤上时能够带来优异的美白效果，从而完成了本发明。而且，发现以砂炒法和醋炙法加工的人参叶的颜色从黄绿色变为褐色，制造成提取物时由于颜色变淡，更易于高浓度投入于产品中，从而完成了本发明。

因此考虑到已知的人参叶碳的制造是以大火将药材完全碳化，引起有效成分的损失和碳化引起的有害成分的生成，本发明使用了以100～160℃的小火使用辅料进行加工的方法。本发明的发明人确认了以不同于人参叶生品或人参叶碳的方法进行炮制时，植物性抗氧化剂酚性化合物(Polyphenols)、主成分人参皂苷的含量增加，抗氧化活性、抗老化活性及美白效果增加。而且，发现了如果用在低温加热加工而变为褐色的药材来制造提取物，则深绿色提取物变为黄色提取物，改善为更易投入产品的性状，从而完成了本发明。

下面更具体地说明本发明。

首先，去除干燥销售的人参叶的杂质，与干净的海砂(海砂；sea sand)以相同的体积比混合，在100℃～160℃的温度范围内边搅拌边加热，当原来黄绿色的药材表面变为褐色时终止加热，常温冷却。从上述制造的碳炒人参叶中除去海砂，使用选自纯净水、甲醇、乙醇、甘油、乙酸乙酯、丁烯二醇、丙二醇、二氯甲烷和己烷中的一种以上的溶剂为提取溶剂而制造砂炒人参叶提取物。

作为另一种方法，去除干燥销售的人参叶的杂质，充分吸收含4～6％醋酸的水溶液后，在100℃～160℃的温度范围内边搅拌边加热，当原来的黄绿色的药材表面变为褐色时终止加热，常温冷却。由上述制造的醋炙人参叶中使用选自纯净水、甲醇、乙醇、甘油、乙酸乙酯、丁烯二醇、丙二醇、二氯甲烷和己烷中的一种以上的溶剂为提取溶剂，进行提取，制造醋炙人参叶提取物。

而且，本发明还提供含有以上述方法制造的砂炒人参叶提取物或醋炙人参叶提取物的化妆品组合物。

本发明中发现砂炒人参叶提取物或醋炙人参叶提取物与人参叶生品的提取物或人参叶碳提取物相比，植物性酚含量显著高，并将其适用于化妆品。即，发现并确认了随着影响如抗氧化活性或胶原酶表达及活性调节之类的抗老化活性的植物性酚含量的提高，实际上自由基与活性氧类的消除活性提高，直接涂敷在皮肤上时，皱纹改善效果提升，并将其适用于化妆品。

而且，本发明确认了砂炒人参叶提取物或醋炙人参叶提取物与人参叶生品的提取物或人参叶碳提取物相比，阻碍酪氨酸酶的活性而抑制黑色素生物合成的效果高，发现并确认了直接涂敷于皮肤时，能够使皮肤变白，改善发暗的肤色，并将其适用于化妆品。

而且，本发明确认了因砂炒人参叶提取物或醋炙人参叶提取物比人参叶生品的提取物的颜色浅，在投入化妆品制型时，能够显著减少对产品颜色的影响，并将其适用于化妆品。

而且，本发明的主题是作为抗氧化剂、防皱剂、皮肤美白剂使用的化妆品组合物的用途。

而且，本发明为了实现目标效果，其特征在于，相对于组合物总重量，以0.001重量％～10.0重量％的量含有砂炒人参叶提取物或醋炙人参叶提取物。

本发明的化妆品组合物的剂型没有特别限制，可以具有例如，皱纹改善功能型化妆品、柔肤化妆水、营养化妆水、眼霜、营养霜、按摩霜、洁肤霜、洁肤泡沫、洁肤水、精华、粉、面膜等剂型。

而且，作为各剂型的化妆品组合物，由于包含砂炒人参叶提取物或醋炙人参叶提取物作为抗氧化及抗老化原料，本领域技术人员能够轻易根据化妆品的剂型或使用目的等，适当选择其他成分进行配合。

下面，通过实施例更具体地对本发明进行说明。但是，这些实施例只是示例性的记载，本发明的范围并不局限于这些实施例。

实施例1：砂炒人参叶提取物的制造

混合阴干并除去杂质的人参叶600g与能够充分埋掉人参叶的相似体积比的干净海砂(Sea Sand)，在100～160℃边搅拌边加热。这时，当原来黄绿色的药材表面变为褐色时，终止加热，常温冷却，制造砂炒人参叶。抖掉海砂，只选取炮制的人参叶，投入10L酒精乙醇作为溶剂，在70℃回流提取3～6小时，减压过滤后，将其滤液在40℃的水槽中减压浓缩，获得浓缩的乙醇砂炒人参叶提取物。

实施例2：醋炙人参叶提取物的制造

使阴干并除去杂质的人参叶600g充分吸收具有与醋类似的酸的比率的含有4～6％的醋酸(acetic acid)的醋酸水溶液后，在100～160℃边搅拌边加热。这时，当原来黄绿色的药材表面变为褐色时，终止加热，常温冷却，制造醋炙人参叶。制造的炮制品投入10L酒精乙醇作为溶剂，在70℃回流提取3～6小时，减压过滤后，将其滤液在40℃的水槽中减压浓缩，获得浓缩的乙醇醋炙人参叶提取物。

比较例1：制造人参生品提取物

在阴干并除去杂质的人参叶600g中投入10L酒精乙醇作为溶剂，在70℃回流提取3～6小时，减压过滤后，将其滤液在40℃的水槽中减压浓缩，获得浓缩的乙醇人参叶提取物。

比较例2：制造人参叶碳提取物

将阴干并除去杂质的人参叶600g在220～300℃的温度下边搅拌边加热。这时，原来黄绿色的药材表面变成绿黑色，则终止加热，撒少量水，熄掉火花，常温冷却，制造人参叶碳。在制造的人参叶碳中投入10L酒精乙醇作为溶剂，在70℃回流提取3～6小时，减压过滤后，将其滤液在40℃的水槽中减压浓缩，获得浓缩的乙醇人参叶碳提取物。

[实验例1：砂炒人参叶提取物(实施例1)与醋炙人参叶提取物(实施例2)的成分确认及含量实验]

为了确认实施例1的砂炒人参叶提取物、实施例2的醋炙人参叶提取物、用于比较的比较例1和比较例2中获得的人参叶生品提取物和人参叶碳提取物的主要成分中酚性物质的定量分析与总酚含量变化及人参皂苷的含量，进行了如下操作。

(1)酚性物质的定量分析

在将各提取物溶于乙醇而得到的溶液中滴加1～2滴的2.5％FeCl₃乙醇溶液后放置，观察是否显色为暗绿色或形成沉淀。

(2)总酚含量分析

在将各提取物100mg溶于10ml乙醇而得到的溶液1ml中加入10ml蒸馏水，加入2ml福林-乔卡梯奥酚试剂(Folin-Ciocalteu phenol reagent；Sigma)混合后，室温反应5分钟。在反应物中加入20％碳酸钠2ml混合后，常温冷却1小时后，测定在680nm的吸光度。这时指标物质使用没食子酸(gallic acid)。

总酚含量的结果如表1，砂炒人参叶和醋炙人参叶的提取物的总酚含量比人参叶生品和人参叶碳提取物的总酚含量高。

[表1]

(3)人参皂苷的含量比较

提取的人参叶经过过滤和减压浓缩制成提取物粉，以10000ppm溶于80％乙醇并进行了高效液相色谱分析(High-Performance Liquid Chromatography；HLPC)。另外，人参皂苷的标准品使用了从Chromadex(U.S.A)购入的纯度99％以上的人参皂苷(ginsenoside)。

HLPC分析使用了(株)Waters(USA)的2695分离单元(separation module)和2996PDA检测器(detector)，分析柱使用了(株)Kanto Chemical(Japan)的250mm 4.6mmi.d.Mightysil C18反相柱(reverse phase column)。流动相溶液使用水和乙腈(acetonitrile)分析了85分钟。详细来说，设水和乙腈的总量为100％，从0分钟到5分钟水的含量从90％到79％，从5分钟到10分钟水的含量从79％到79％，从10分钟到35分钟水的含量从79％到77.5％，从35分钟到37分钟水的含量从775.％到69％，从37分钟到77分钟水的含量从69％到50％，从77分钟到80分钟水的含量从50％到50％，从80分钟到83分钟水的含量从50％到90％，从83分钟到85分钟水的含量从90％到90％进行了分析。如表2所示，砂炒人参叶提取物(实施例1)和醋炙人参叶提取物(实施例2)与人参叶生品提取物(比较例1)和人参叶碳提取物(比较例2)相比，不但特定的人参的人参皂苷含量增加，总皂苷含量也高。

[表2]

[实验例2：利用NBT法的抗氧化效果测定实验]

为了确认各提取物的抗氧化效果，在实验室条件下，以其他抗氧化剂，即以视黄醇与BHT(二丁基羟基甲苯(butylated hydroxy toluene))作为比较样品，利用NBT法，测定了抗氧化活性。

为了测定抗氧化效果，用NBT法测定由黄嘌呤与黄嘌呤氧化酶生成的活性氧，评价检测物消除活性氧的效果，即活性氧消除效果。由黄嘌呤与黄嘌呤氧化酶生成活性氧。以在波长560nm测定这些活性氧与氯化硝基四氮唑蓝(Nitro Blue Tetrazolium；NBT)反应而生成的蓝色来测定活性氧的消除率。

测定方法中使用了以下成分。

成分1. 0.05M Na₂CO₃-------------------------------2.4ml

成分2. 3mM黄嘌呤溶液----------------------------0.1ml

成分3. 3mM EDTA溶液----------------------------0.1ml

成分4. BSA溶液--------------------------------------0.1ml

成分5. 0.72mM NBT溶液---------------------------0.1ml

成分6. 黄嘌呤氧化酶溶液----------------------------0.1ml

成分7. 6mM CuCl₂溶液-----------------------------0.1ml

①小瓶(

)中加入以上成分1至成分5，向其中加入试样溶液0.1ml，25℃放置10分钟。

②加入成分6快速搅拌，25℃下开始培养20分钟。

③然后加入成分7来终止反应，测定在560nm的吸光度St。

④空白实验用蒸馏水代替试样溶液，进行与上述相同操作后测定吸光度Bt。

⑤同样，试样溶液的空白(Blank)以蒸馏水代替成分6，进行相同操作后测定吸光度Bo。

效果的结果由数学式1算出，其结果如表3.

[数学式1]

抑制率(％)＝[1-(St-So)/(Bt-Bo)]×100

St：试样溶液的酶反应后在560nm的吸光度

Bt：空白实验的酶反应后在560nm的吸光度

So：试样溶液不加入酶时，反应前在560nm的吸光度

Bo：空白实验溶液不加入酶时，反应前在560nm的吸光度

如表3所示，砂炒人参叶提取物(实施例1)和醋炙人参叶提取物(实施例2)与人参叶生品提取物(比较例1)和人参叶碳提取物(比较例2)相比，在更低的浓度具有与视黄醇(retinol)和BHT类似或更优异的抗氧化效果。

[表3]

试样名	处理浓度(％)	抗氧化效果(％)
			比较例1	0.1	92
比较例2	0.1	89
			实施例1	0.05	98
实施例2	0.05	97
			视黄醇(retinol)	0.1	93
BHT	0.1	90

[实验例3：利用DPPH法的抗氧化效果测定实验]

为了测定各提取物的抗氧化效果，在实验室条件下，以绿茶提取物和维他命E之类的抗氧化剂作为比较样品，利用DPPH法测定抗氧化活性。

DPPH法利用被称为DPPH(2,2-二(4-叔辛基苯基)-1-苦肼基自由基[2,2-Di(4-tert-octylphenyl)-1-picrylhydrazyl free radical])的自由基以还原力测定抗氧化活性。将DPPH被检测物还原而减少吸光度的程度与空白实验液的吸光度进行比较，在波长560nm测定自由基的消除率。

使用的试剂是2,2-二(4-叔辛基苯基)-1-苦肼基自由基(2,2-Di(4-tert-octylphenyl)-1-picrylhydrazyl free radical)(Aldrich Chem.Co.,MW＝618.76)0.1mM溶液，将61.88mg试剂溶于甲醇，制成100ml溶液。

测定方法是，

①在96孔酶标板中滴加0.1mM DPPH溶液0.15ml和试样溶液0.15ml，快速搅拌后，25℃培养10分钟。

②然后测定在560nm的吸光度St。

③空白实验以蒸馏水代替试样溶液，进行相同的操作后测定吸光度Bt。

④同样，试样溶液的空白(Blank)以甲醇代替0.1mM DPPH溶液，进行相同操作后测定吸光度Bo。

效果的结果由数学式2算出，其结果如表4。

[数学式2}

抑制率(％)＝[1-(St-So)/(Bt-Bo)]×100

St：消除试样溶液的自由基后，在560nm的吸光度

Bt：消除空白实验溶液的自由基后，在560nm的吸光度

So：没有添加试样溶液的自由基时，反应前在560nm的吸光度

Bo：没有添加空白实验溶液的自由基时，反应前在560nm的吸光度

如表4所示，砂炒人参叶提取物(实施例1)和醋炙人参叶提取物(实施例2)在0.03％浓度上具有比绿茶提取物和维他命E更优异的抗氧化效果。

[表4]

试样名	处理浓度(％)	抗氧化效果(％)
			比较例1	0.1	79
比较例2	0.1	81
			实施例1	0.039	6
实施例2	0.03	98
			绿茶提取物	0.1	66
维他命E	0.1	72

[实验例4：体外(in vitro)MMP-1阻碍活性评价]

基质金属蛋白酶(MMP-1)阻碍活性在生物化学模型中进行了测定，其以与纯化的胶原酶及作为其基质的接合于荧光素的胶原蛋白和明胶的利用为基础[EnzChek(商标名)明胶酶/胶原酶试剂盒，分子探针(

)]。将由溶组织梭菌(

)纯化的胶原酶供给到上述EnzChek明胶酶/胶原酶试剂盒内。由猪皮纯化且与荧光素接合的DQ-胶原蛋白和由0.05M Tris-HCl、0.15M NaCl、5m M CaCl₂和0.2mM叠氮钠(pH 7.6)组成的反应缓冲液利用了EnzChek明胶酶/胶原酶试剂盒(分子探针)。将实施例1和2、比较例1和2的各提取物溶解于上述反应缓冲液中。在4；2；0.4；0.2；0.1％(w/v)进行了测试。测试提取物的稀释液与25μg/ml的DQ-胶原蛋白及0.1U/ml的胶原酶一起在室温下进行了恒温处理15分钟、45分钟、120分钟。

在各实验条件下，与胶原酶和DQ-胶原蛋白混合物相应的对照用混合物(control)也同样进行了恒温处理。另外，在各实验条件下空白(Blank)、下面称为“不含酶的空白”的试样在DQ-胶原蛋白存在及胶原酶不存在的情况下进行了恒温处理。各实验进行了3次。

经过15分钟、45分钟、120分钟后，以荧光测定仪(激发:485nm，释放505nm)测定了与DQ-胶原蛋白的分解相应的信号。以“不含酶的空白”的荧光值为基准测定了各试样的荧光值。将其结果以每个试样的荧光单位及对照组的变异率(％)来显示。

总而言之，在选择的实验条件下，在0.04至4％(v/v)间测试的实施例1和2、比较例1和2中获得的人参叶生品及炮制品提取物以投入量依赖性地拥有抗胶原酶/明胶酶活性。

结果如表5所示，砂炒人参叶提取物(实施例1)和醋炙人参叶提取物(实施例2)以0.04％处理时能够抑制95％的溶组织梭菌胶原酶的胶原蛋白分解活性，这比绿茶提取物的阻碍效果更优异。

[表5]

[实验例5：紫外线照射引起的MMP-1表达抑制评价]

为了在各提取物的紫外线(UV)照射及试样添加后测定MMP-1浓度，实施了ELISA。

利用紫外(UV)室向人体真皮成纤维细胞以5J/cm²的能量照射长波长紫外线(UVA)。通过预备试验确立了紫外线照射量与培养时间使成纤维细胞中MMP表达量最大的条件。阴性对照组以锡纸包起来，在UVA的环境下维持了相同的时间。利用紫外线(UV)辐射计测定了长波长紫外线(UVA)的释放量。长波长紫外线(UVA)照射过程中，细胞还是之前分株的培养基，没有变化，UVA照射后换成包含样品的培养基培养24小时后，将培养基回收，涂敷在96孔板的孔中。处理一级抗体(MMP-1(Ab-5)单克隆抗体与MMP-2(Ab-3)单克隆抗体)后，在37℃反应60分钟。将二级抗体抗鼠IgG(whole mouse,alkaline phosphataseconjugated)再反应60分钟左右后，将碱性磷酸酶基质溶液(1mg/ml磷酸对硝基苯酯的二乙醇胺(ρ-nitrophenyl phosphate in diethanolamine)缓冲溶液)在常温下反应30分钟，在405nm以酶标仪(

)测定吸光度。使用不添加试样的组作为对照组。

对于紫外线照射时表达被诱导的MMP-1，与没有处理试样的对照组相比，砂炒人参叶提取物(实施例1)和醋炙人参叶提取物(实施例2)显示出约80％以上的抑制率，这是比作为对照组使用的视黄醇的抑制率更优异的结果。(表6)

[表6]

试验组	处理浓度(％)	MMP-1表达抑制率(％)
			对照组	-	-
比较例1	0.1	75
			比较例2	0.1	69
实施例1	0.05	84
			实施例2	0.05	87
视黄醇(retinlo)	0.1	31

[实验例6：利用蘑菇酪氨酸酶的酪氨酸酶的抑制效果测定实验]

为了确认各提取物的美白效果，以酪氨酸酶(tyrosinase)的酶的功能抑制程度判断美白效果。

酪氨酸酶是在生物体内促进被称为酪氨酸(tyrosine)的物质的氧化过程而有助于生成黑色素的酶。本实施例应用如下方法来判定美白效果：测定抑制这种酶的功能来抑制酪氨酸氧化而形成称为黑色素的黑色高分子的程度的方法(Pomerantz S.H.:J.Biochem.,24:161-168,1996)。

通过以下操作测定各试样对酪氨酸酶的阻碍活性：15μl的试样放入96孔板，加入50mM的磷酸缓冲液(pH 6.5)150μl、1.5mM L-酪氨酸溶液25μl后，添加10μl蘑菇酪氨酸酶(1500units/ml，Sigma公司)，在37℃反应20分钟后，使用酶标仪(microplate reader,ELx800,美国)，在490nm测定吸光度来测定对酪氨酸酶的阻碍率。对酪氨酸酶的阻碍率(％)以数学式3计算，IC₅₀的值是将酪氨酸酶的酶活性阻碍50％的物质的浓度。

[数学式3]

阻碍率(％)＝[(D-C)-(B-A)]/(D-C)×100

A：加入试样的孔的反应前吸光度

B：加入试样的孔的反应后吸光度

C：没有加入试样的孔的反应前吸光度

D：没有加入试样的孔的反应后吸光度

试验了酪氨酸酶活性抑制的结果，砂炒人参叶提取物(实施例1)和醋炙人参叶提取物(实施例2)的IC₅₀值为0.01％、0.02％，与人参叶提取物(比较例1)和人参叶碳提取物(比较例2)相比，其酪氨酸酶阻碍效果上升，显示出比作为已知的美白剂的曲酸、熊果苷、桑白皮提取物等更优异的效果。(表7)

[表7]

[实验例7：利用B16F1黑色素细胞(melanocyte)的细胞内酪氨酸酶(tyrosinase)的活性抑制效果测定实验]

为了确认各提取物的美白效果，测定B16F1黑色素细胞内的酪氨酸酶的活性抑制程度而进行判断。

本实验例中使用的B16F1黑色素细胞是来自小鼠的细胞株，是合成被称为酪氨酸酶的酶的细胞。在这种细胞的人工培养中处理试样，从细胞分离酪氨酸酶来测定酶的活性，从而比较评价了酪氨酸酶的活性抑制程度。

本实施例中使用的B16F1黑色素细胞是从ATCC(美国典型培养物保藏中心(American Type Culture Collection,保藏编号：6323))获取使用的。B16F1黑色素细胞的酪氨酸酶的活性抑制效果的测定操作如下。

在6孔板上将B16F1黑色素细胞以每孔2×10⁶的浓度进行分株，附着细胞后，以不引发毒性的浓度处理试样，培养72小时。培养72小时后，用胰蛋白酶(Trypsin)-EDTA消化细胞后，测定细胞数，之后进行离心分离来回收细胞。以PBS将细胞沉淀洗涤一次后，添加均质化缓冲液(50mM磷酸钠,pH 6.8,1％Triton X-100,2mM PMSF)1ml，以涡流5分钟来破碎细胞，进行离心分离(3000rpm，10分钟)，回收上清液。向50mM磷酸钠缓冲液(pH 6.5)中分别加入1.5mM L-酪氨酸、0.06mM L-DOPA、细胞上清液，在37℃培养30分钟后，使用酶标仪在490nm测定吸光度来测定酪氨酸酶的酶活性抑制效果。由数学式4计算B16F1黑色素细胞的酪氨酸酶的活性抑制率(％)，IC₅₀值是将酪氨酸酶的酶活性阻碍50％的物质浓度。

[数学式4]

阻碍率(％)＝[(A-B)/A]×100

A:没添加试样的孔中酪氨酸酶的酶活性

B:添加试样的孔中酪氨酸酶的酶活性

测定B16F1黑色素细胞的酪氨酸酶的酶活性的抑制效果的结果显示，砂炒人参叶提取物(实施例1)和醋炙人参叶提取物(实施例2)的IC₅₀值分别是0.08％和0.06％，与现有的美白剂曲酸、熊果苷、油溶性甘草提取物、桑白皮提取物等相比，即使在低的浓度下也显示出更有效地阻碍酪氨酸酶的活性，与现有人参叶提取物和人参叶碳提取物相比，显示出改善了效果(表8)。

[表8]

[实验例8：利用了B16F1黑色素细胞(melanocyte)的黑色素(melanin)生成抑制效果测定实验]

为了确认各提取物的美白效果，以对B16F1黑色素细胞的黑色素生成抑制程度来判断美白效果。

本实验例中使用的B16F1黑色素细胞是来自小鼠的细胞株，是分泌被称为黑色素的黑色色素的细胞。在这种细胞的人工培养中处理试样，比较评价黑色素黑色色素的减少程度。本实施例中使用的B16F1黑色素细胞是从(美国典型培养物保藏中心(American TypeCulture Collection,保藏编号：6323))获取使用的。

B16F1黑色素细胞的黑色素的生物合成抑制效果测定操作如下。在6孔板上将B16F1黑色素细胞以每孔2×10⁶的浓度进行分株，附着细胞后，以不引发毒性的浓度处理试样，培养72小时。培养72小时后，用胰蛋白酶(Trypsin)-EDTA消化细胞后测定细胞数，之后进行离心分离来回收细胞。略微改变Lotan(Lotan:Cancer Res.,40:3345-3350,1980)的方法来进行了对细胞内黑色素的定量。以PBS将细沉淀胞洗涤一次后，添加均质化缓冲液(50mM磷酸钠,pH 6.8,1％Triton X-100,2mM PMSF)1ml，以涡流5分钟来破碎细胞。在离心分离(3000rpm,10分钟)而获得的细胞滤液中添加1N NaOH(10％DMSO)，溶解提取的黑色素后，以酶标仪在405nm测定黑色素的吸光度，之后对黑色素进行定量，测定试样黑色素生成的阻碍率(％)。由数学式5算出B16F1黑色素细胞的黑色素生成阻碍率(％)，IC₅₀值是将黑色素生成阻碍50％的物质浓度。

[数学式5]

阻碍率(％)＝[(A-B)/A]×100

A：没有添加试样的孔中黑色素的量

B：添加试样的孔中黑色素的量

测试B16F1黑色素细胞的黑色素生成抑制效果的结果显示，砂炒人参叶提取物(实施例1)和醋炙人参叶提取物(实施例2)的IC₅₀值分别是0.02％和0.03％，与人参叶生品提取物(比较例1)和人参叶碳提取物(比较例2)相比，改善了美白活性，与现有的美白剂对苯二酚、熊果苷、油溶性甘草提取物、桑白皮提取物等相比，显示出类似或更优异的效果(表9)。

[表9]

试样	黑色素合成阻碍效果(IC<sub>50</sub>)
		比较例1	0.1％
比较例2	0.06％
		实施例1	0.02％
实施例2	0.03％
		对苯二酚(hydroquinone)	0.03％
熊果苷(arbutin)	0.5％
		桑白皮提取物	5％
油溶性甘草提取物	0.04％

[比较例3和4、实施例3和4、以及比较例5]

制造含有从实施例1和2、比较例1和2获得的各提取物的化妆品，以人为对象评价了皮肤弹力改善效果与肤色改善效果。

在这里使用的化妆品是霜形态，其组成如表10所示。首先加热表9中记录的(乙)相，以70℃保存。向其中加入(甲)相进行预乳化后，以均质搅拌器进行均匀乳化，之后慢慢冷却，制造霜。以实验者(20岁-35岁的女性)35名为对象，在右脸部位涂敷比较例3和4、以及实施例3和4中制造的霜，左脸部位涂敷比较例5中制造的霜，分别是1日2次，连续涂敷2个月。

[表10]

注)单位：重量％

实验完成结束后，以硅树脂复制物(复制品)采取产品使用前和使用2个月后的面部眼角周围的皱纹，将其以皮肤细纹装置和皮肤影像分析器比较眼角细纹状态，获得了皮肤细纹缓解效果。表11比较了使用比较例3和4、实施例3和4中制造的霜的实验者和使用比较例5的霜的实验者的眼角平均细纹深度及皱纹减小率。

如表11所示，可知涂敷含有砂炒人参叶提取物或醋炙人参叶提取物的霜(实施例3和4)的实验者的眼睛周围皮肤的皮肤皱纹改善效果更优异。

[表11]

n(受试者数量)＝35，p(显著性概率)＜0.05

以实验者(20岁-35岁的女性)40名为对象，在右脸部位涂敷比较例3和4、以及实施例3和4中制造的霜，左脸部位涂敷比较例5中制造的霜，分别为1日2次，连续涂敷2个月。表12比较了使用了比较例3和4、以及实施例3和4中制造的霜的实验者的脸部肤色和使用了比较例5中制造的霜的实验者的脸部肤色。实验结束后，将脸左右两侧的涂敷部位皮肤用图像分析仪及色差计比较了脸部的脸色，设最暗的颜色为5、中间色为3、最亮的颜色为1，估计其中间程度后，进行评价。

如表12所示，涂敷了含有砂炒人参叶提取物或醋炙人参叶提取物的霜(实施例3和4)的受试者的面部皮肤的美白效果优异。

[表12]

n(受试者数量)＝40，p(显著性概率)＜0.05

[实施例5：制造含有在实施例3和4中获得的砂炒人参叶提取物或醋炙人参叶提取物的化妆水]

在95％乙醇8g中混合溶解聚吡咯烷酮0.05g、油醇0.1g、聚氧乙烯单油酸酯0.2g、香料0.2g、对羟基苯甲酸甲酯0.1g、少量防氧化剂、少量色素。在将实施例3中获得的砂炒人参叶提取物0.05g(或实施例4中获得的醋炙人参叶提取物0.05g)、甘油5g溶解于85.33g纯净水中而得到的液体中添加上述混合液后，搅拌获得具有皮肤改善效果的化妆水。

[实施例6：制造含有在实施例3和4中获得的砂炒人参叶提取物或醋炙人参叶提取物的乳液]

在70℃将十六烷醇1.2g、角鲨烷10g、凡士林2g、对羟基苯甲酸乙酯0.2g、单硬脂酸甘油酯1g、聚氧乙烯(附加20摩尔)单油酸1g及香料0.1g进行加热混合溶解，将实施例3中获得的砂炒人参叶提取物0.5g(或实施例4中获得的醋炙人参叶提取物0.5g)、二丙二醇5g、聚乙二烯-15002g、三乙醇胺0.2g、纯净水76.2g加热至75℃而使其溶解。混合两者进行乳化后，冷却，获得具有皮肤改善效果的水包油(O/W)型乳液。

[实施例7：制造含有在实施例3和4中获得的砂炒人参叶提取物或醋炙人参叶提取物的美容液]

在95％乙醇5g中混合聚氧乙烯山梨醇酐单油酸酯1.2g、克突老奥兹(

)0.3g、透明质酸钠 0.2g、维生素 E-醋酸酯0.2g、甘草酸钠0.2g、聚氧乙烯苯甲酸乙酯0.1g、实施例3中获得的砂炒人参叶提取物1g(或实施例4中获得的醋炙人参叶提取物1g)和适量色素，得到具有皮肤改善效果的美容液。

如上述说明，根据本发明，将人参叶加工成以砂炒法炮制的砂炒人参叶或以醋炙法炮制的醋炙人参叶，与现有的单纯人参叶提取物和用现有的炮制方法加工的人参叶提取物相比，作为植物性抗氧化物质的酚性化合物的提取率显著提高，能够提供更好的抗氧化效果。

另外，本发明的醋炙人参叶提取物或砂炒人参叶提取物比现有的单纯人参叶提取物和人参叶碳提取物具有更优异的MMP阻碍效果、紫外线照射引起的MMP表达调节效果、以及细纹改善效果等抗老化效果。

另外，加工为醋炙人参叶提取物或砂炒人参叶提取物时，与现有的单纯人参叶提取物和人参叶碳提取物相比，酪氨酸酶阻碍效果、黑色素生物合成阻碍效果、以及使肤色变白的美白效果更高。

另外，现有的单纯人参叶提取物的外观颜色为深绿色，但加工为醋炙人参叶提取物与砂炒人参叶提取物时，颜色变浅为黄色，因此投入化妆品时，具有对整个化妆品颜色的影响显著下降的效果。

因此，含有这种醋炙人参叶提取物或砂炒人参叶提取物的化妆水、霜、乳液、面膜、粉等的化妆品组合物能够使用为具有如抗氧化效果与皮肤细纹改善之类的优异的抗老化效果的皮肤外用剂。

虽然到现在为止说明了本发明优选的实施例，但是在本发明所属技术领域的技术人员能够在不超出本发明的本质特性的范围内体现为变形的形态。因此在这里说明的本发明的实施例并不是限定的观点，要从解释性的观点进行考虑，本发明的范围显示在权利要求范围上而不是上述说明，应解释为在其同等范围内的一切差异都包含在本发明内。

Claims

1.一种砂炒人参叶提取物制造方法，其特征在于，包括：

第一步骤，将人参叶与海砂以相同的体积比进行混合；

第二步骤，在100℃～160℃的温度范围搅拌加热所述第一步骤中制造的混合物后，当所述人参叶的表面变为褐色时终止加热，常温冷却，制造炮制的砂炒人参叶；

第三步骤，将提取溶剂加入所述第二步骤中炮制的砂炒人参叶中，回流提取3～6小时后进行减压过滤；以及

第四步骤，减压浓缩所述第三步骤中形成的滤液，获得浓缩的砂炒人参叶提取物。

2.根据权利要求1所述的砂炒人参叶提取物制造方法，其特征在于，所述提取溶剂为选自纯净水、甲醇、乙醇、甘油、乙酸乙酯、丁二醇、丙二醇、二氯甲烷和己烷中的一种以上。

3.一种化妆品组合物，其特征在于，相对于组合物总重量，以0.001重量％～10重量％的量含有由权利要求1或2制造的砂炒人参叶提取物。