KR20110138075A - 인삼 가수분해물을 유효성분으로 포함하는 항산화, 항노화, 주름 예방 및 개선용 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 인삼 가수분해물을 유효성분으로 함유하는 항산화, 항노화, 주름 예방 및 개선용 조성물 및 그 제조방법에 대한 것이다. 본 발명의 조성물은 항산화, 항노화, 주름 예방 및 개선 효과가 탁월한바, 건강, 외모의 개선 및 유지에 유용하다.

Description

인삼 가수분해물을 유효성분으로 포함하는 항산화, 항노화, 주름 예방 및 개선용 조성물{COMPOSITION FOR ANTIOXIDATION, ANTIAGING, PREVENTION AND IMPROVEMENT OF WRINKLE WHICH COMPRISES JINSENG HYDROSATE AS ACTIVE INGREDIENT}

본 발명은 인삼 가수분해물을 유효성분으로 포함하는 항산화, 항노화, 주름 예방 및 개선용 조성물에 대한 것이다.

인삼(Panax ginseng C.A. Meyer)은 한반도가 원산인 한국의 특산 약용식물로 2000여년 전부터 동북아시아에서 보원기제로 사용되어 온 중요한 한약 중의 하나이다. 동양에서 가장 오래된 본초서인 신농본초경에 인삼은 오장을 보하고, 원기를 보충한다고 기록되어 있다(Namba, 1980).

인삼의 생리활성은 체계적인 약리학적 접근으로 심혈관계(Lee et al., 1981), 면역계(Jie et al., 1984), 신경계(Kim et al., 1998)에 대한 효능과 해독작용(Joo et al., 1977), 항암작용(Tahara et al., 1985) 그리고 항당뇨작용(Yokozawa et al., 1985) 등이 보고되었다. 인삼의 주요한 생리활성물질은 인삼사포닌(ginsenosides), polyacetylenes, 산성다당체, 인삼단백질, 폴리페놀물질 등이 알려져 있다(Park, 1996; Sanata et al., 1974; Kitagawa et al., 1987). 그 중에서 사포닌은 Sanata 등(1974)의 연구에 의해서 그 화학구조가 명확히 확인되었고, 항당뇨 활성(Yokozawa et al., 1985)을 비롯하여 항암작용, 항산화작용, 동맥경화 및 고혈압의 예방, 간 기능 촉진 및 숙취제거효과, 항 피로 및 항 스트레스 작용, 노화방지 작용, 두뇌활동 촉진작용, 항염활성, 알레르기성 질환치료, 단백질합성능력의 촉진 등이 보고되었다(Park, 1996).

그러나 인삼의 뿌리가 그 효능을 인정받아 민간 및 한방계에서 널리 이용된 반면, 인삼 잎은 특별한 효능이 알려져 있지 않으며, 뿌리를 분리하여 이용 후 인삼 잎은 폐기하는 것이 일반적이다.

이에 본 발명자들은 인삼 잎에 대하여 연구를 하던 중, 인삼 잎을 특정 가수분해효소를 이용하여 추출, 가수분해한 조성물이, 항산화, 항노화, 산화적 스트레스에 대한 저항성을 증가시킨다는 것을 확인하고 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 항산화, 항노화, 주름 예방 및 개선용 조성물 및 그 제조 방법을 제공하는 것이다..

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 인삼 가수분해물을 유효성분으로 포함하는 항산화, 항노화, 주름 예방 및 개선용 조성물을 제공한다.

아울러 본 발명은 인삼에 가수분해효소를 가하는 단계를 포함하는 항산화, 항노화, 주름 예방 및 개선용 화장료 조성물의 제조 방법을 제공한다.

본 발명의 조성물은 산화적 손상을 예방, 개선시키며, 노화를 지연시키는데 효과가 있다. 또한 피부의 주름을 예방, 개선하는 효과가 있다.

도 1은 HPLC 분석을 이용하여 16 종 진세노사이드를 확인한 것을 보여준다.
도 2는 인삼 추출물의 피부 흡수율 측정 방법을 나타낸다.
도 3은 인삼 추출물의 장 흡수율 측정 방법을 나타낸다.
도 4는 Caco-2 세포를 이용하여 인삼 추출물의 uptake을 측정하는 것을 나타낸다.
도 5는 인삼 추출물의 가수분해효소에 따른 고형분 함량 및 수율을 나타낸다.
도 6은 인삼 추출물의 가수분해효소에 따른 총 당 및 산성당 함량 변화를 나타낸다.
도 7은 인삼 추출물의 가수분해효소에 따른 폴리페놀 및 플라보노이드 함량 변화를 나타낸다.
도 8은 인삼 추출물의 가수분해효소에 따른 진세노사이드 함량 변화를 나타낸다.
도 9는 인삼 베타-글루카네이즈 가수분해물의 피부 투과율을 나타낸다.
도 10은 인삼 베타-글루카네이즈 가수분해물의 장 흡수율을 나타낸다.
도 11은 인삼 베타-글루카네이즈 가수분해물의 Caco-2 cell monolayer에서의 진세노사이드 F2 uptake 및 uptake rate를 나타낸다.
도 12는 인삼 베타-글루카네이즈 가수분해물의 농도에 따른 Caco-2 cell monolayer에서의 uptake 변화를 나타낸다.
도 13은 인삼 베타-글루카네이즈 가수분해물의 pH에 따른 Caco-2 cell monolayer에서의 uptake 변화를 나타낸다.
도 14는 인삼 추출물의 가수분해효소에 따른 DPPH 라디칼 소거능 및 ABTS 라디칼 소거능을 나타낸다.
도 15는 인삼 추출물의 가수분해효소에 따른 tyrosinase 저해능 및 elastase 저해능을 나타낸다.
도 16은 주름 개선을 통하여 확인한 화장료 조성물의 광노화 및 산화적 스트레스 저해능을 나타낸다.
도 17은 글루타치온, 과산화수소와 과산화지질 수치를 통하여 확인한 화장료 조성물의 광노화 및 산화적 스트레스 저해능을 나타낸다.

본 발명은 인삼 가수분해물을 유효성분으로 포함하는 항산화, 항노화, 주름 예방 및 개선용 조성물을 제공한다.

또한 본 발명은 인삼에 가수분해효소를 가하는 단계를 포함하는 항산화, 항노화, 주름 예방 및 개선용 화장료 조성물의 제조 방법을 제공한다.

이하, 본 발명을 자세히 설명한다.

본 발명의 인삼은 Panax ginseng C.A. Meyer이다. 본 발명의 인삼은 수삼, 홍삼, 장뇌삼, 산삼 등이 될 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.

상기 인삼은 인삼의 잎, 뿌리, 줄기 등이 될 수 있다. 바람직하게는 상기 인삼은 인삼의 잎이다.

상기 인삼은 채취 후 생삼의 형태로 이용할 수 있으며, 동결건조, 자연건조 등을 통하여 건조된 삼의 형태로 이용할 수도 있다. 또한 상기 인삼은 세절하여 이용하거나 분쇄하여 분말의 형태로 이용할 수도 있다. 당업자가 추출 및 가수분해 환경에 따라 본 발명의 인삼을 적절한 형태로 선택하여 실시할 수 있다는 것은 자명하다.

본 발명의 인삼 가수분해물은 인삼에 가수분해효소를 처리하여 수득한다. 이때 인삼을 추출한 후 가수분해효소를 처리할 수 있으며, 인삼에 가수분해효소를 처리한 후, 추출을 수행할 수도 있다. 이때 추출은 열수, 탄소수 4 이하의 저급 알코올로 할 수 있으며, 바람직하게는 에탄올로 할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

상기 가수분해효소는 에코네이즈(Econase CE), 사이토레이즈 (Cytolase PCL 5), 펙티넥스(Pectinex 5×L), 셀루크라스트(Celluclast KN), 래피데이즈 (Rapidase Liq plus), 비스코자임 (Viscozyme L), 울트라플로(Ultraflo L), 옵티덱스 L-400(Optidex L-400) 등이 될 수 있으며며, 바람직하게는 울트라플로를 사용하나, 이에 제한되는 것은 아니며, 인삼을 가수분해할 수 있는 효소이면 본 발명의 가수분해효소라 할 것이다.

상기 가수분해효소로는 또한 셀룰레이즈, 펙티네이즈, 엔도-자일라네이즈, 베타-글루카네이즈, 글루코아밀레이즈, 폴리갈락트로네이즈, 헤미셀룰레이즈, 아라비네이즈 또는 자일라네이즈 등을 사용할 수 있으나, 이들 효소로 제한되는 것은 아니며, 인삼을 가수분해할 수 있는 효소이면 본 발명을 실시하는데 문제가 없다.

본 발명의 조성물은 식품 조성물 또는 화장료 조성물인 것이 바람직하나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 화장료 조성물에 있어서, 화장품 제조에 허용되는 담체는 본 발명의 화장료 조성물의 제형에 따라 다를 수 있다. 본 발명의 제형은 용액, 현탁액, 유탁액, 페이스트, 젤, 크림, 로션, 비누, 샴푸, 계면활성제-함유 클렌징, 오일, 분말 파운데이션, 리퀴드 파운데이션, 크림 파운데이션 및 스프레이 등으로 제형화 될 수 있으며, 본 발명의 항산화용 화장료 조성물은 보다 상세하게는 유연 화장수(스킨, 토너), 수렴 화장수, 영양 화장수(로션), 영양 크림, 마사지 크림, 에센스, 젤, 피부 접착용 패치, 파우더, 피부외용연고, 첩포제, 현탁액, 에멀젼 스프레이, 아이 크림, 클렌징 크림, 클렌징 폼, 클렌징 위터, 팩, 헤어 에센스 또는 미용액 등의 통상의 화장료 형태로 제조될 수 있다.

상기 본 발명의 화장료 조성물의 제형이 페이스트, 크림 또는 젤의 경우 담체 성분으로는 동물성 유, 식물성 유, 왁스, 파라핀, 전분, 트라킨트, 셀룰로오스 유도체, 폴리에틸렌 글리콜, 실리콘, 벤토나이트, 실리카, 탈크 또는 산화아연 등이 바람직하다.

상기 본 발명의 화장료 조성물의 제형이 용액 또는 유탁액인 경우 담체 성분으로는 용매, 용매화제 또는 유탁화제가 이용될 수 있으며, 그 예로서는 물, 에탄올, 이소프로판올, 에틸 카보네이트, 에틸 아세테이트, 벤젠 알코올, 벤젠 벤조에이트, 프로필렌 글리콜, 1,3-부틸글리콜 오일, 글리세롤 지방족 에스테르, 폴리에틸렌 글리콜 또는 소르비탄의 지방산 에스테르 등이 바람직하다.

상기 본 발명의 화장료 조성물의 제형이 현탄액의 경우 담체 성분으로는 물, 에탄올 또는 프로필렌 글리콜과 같은 액상의 희석제, 에톡실화 이소스테아릴 알코올, 알루미늄 메타히드록시드, 벤토나이트, 아가 또는 트라칸트 등이 바람직하다.

상기 본 발명의 화장료 조성물의 제형이 계면 활성제 함유 클린징인 경우에는 담체 성분으로는 지방족 알코올 설페이트, 지방족 알코올 에테르설페이트, 설포숙신산 모노에스테르, 이세티오네이트, 이미다졸리늄 유도체, 메틸타우레이트, 사르코시네이트, 지방산 아미드 에테르 설페이트, 알킬아미도베타인, 지방족 알코올, 지방산 글리세리드, 지방산 디에탄올아미드, 식물성 유, 라놀린 유도체 또는 에톡실화 글리세롤. 지방산 에스테르 등이 바람직하다.

본 발명의 식품 조성물은 건강보조식품, 건강기능식품, 기능성 식품 등이 될 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니며, 천연식품, 가공식품, 일반적인 식자재 등에 본 발명의 식품 조성물을 첨가한 것도 포함된다.

본 발명의 식품 조성물은, 상기 조성물을 그대로 첨가하거나 다른 식품 또는 식품 조성물과 함께 사용될 수 있으며, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용될 수 있다. 유효 성분의 혼합양은 그의 사용 목적에 따라 적합하게 결정될 수 있다. 일반적으로, 본 발명의 식품 조성물은, 식품 또는 음료의 제조시에 원료에 대하여 0.01 내지 70.00 중량%, 바람직하게는 0.01 내지 30.00 중량%의 양으로 첨가될 수 있으며, 더욱 바람직하게는 0.01 내지 10.00 중량%의 양으로 첨가될 수 있다.

상기 식품의 종류에는 특별한 제한은 없다. 본 발명의 식품 조성물은 정제, 경질 또는 연질 캅셀제, 액제, 현탁제 등과 같은 경구투여용 제제의 형태로 이용될 수 있으며, 이들 제제는 허용 가능한 통상의 담체, 예를 들어 경구투여용 제제의 경우에는 부형제, 결합제, 붕해제, 활택제, 가용화제, 현탁화제, 보존제 또는 증량제 등을 사용하여 조제할 수 있다.

본 발명의 식품 조성물을 첨가할 수 있는 식품의 예로는 육류, 소세지, 빵, 쵸코렛, 캔디류, 스넥류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종 스프, 음료수, 차, 드링크제, 알콜 음료 및 비타민 복합제 등을 들 수 있으나 이들 종류의 식품으로 제한되는 것은 아니다.

이하, 본 발명을 다음의 실시예 및 실험예에 의하여 보다 상세하게 설명한다. 단, 하기 실시예 및 실험예는 본 발명의 내용을 예시하는 것일 뿐 발명의 범위가 실시예 및 실험예에 의해 한정되는 것은 아니다.

재료 및 방법

<인삼 잎>

인삼 잎은 동결건조하여 분쇄한 후 고운 분말상으로 만들어 사용하였다.

<가수분해효소>

에코네이즈(Econase CE)는 AB Enzymes (Darmstadt, Germany)으로부터 사이토레이즈 (Cytolase PCL 5), 펙티넥스(Pectinex 5×L), 셀루크라스트(Celluclast KN), 래피데이즈 (Rapidase Liq plus)는 비전바이오캠(Seoul, Korea)으로부터 구입한 것을 사용하였다. 비스코자임 (Viscozyme L)과 울트라플로(Ultraflo L)은 Novozyme (Bagsvaerd, Denmark)것을 사용하였다. 상기 효소들의 특징은 표 1과 같다.

가수분해효소	주된 활성	Source	최적 활성 조건
			온도 (℃)	pH
Celluclast 1.5 L	Cellulase	Trichoderma reesei	50-60	4.5-6.0
Cytolase PCL 5	Pectinase	Aspergillus niger	10-55	2.5-5.0
Econase CE	Cellulase	Trichoderma sp .	55	4.0-5.5
Optidex L-400	Glucoamylase	Geobacillus stearothermohilus	58-65	4.0-4.5
Pectinex 5XL	Polygalacturonase	Asp . Niger & T. aculeatus	40-55	3.5-5.0
Rapidase TF	Pectinase, Hemicellulase, Cellulase	Asp . Niger & T. longibrachiatum	10-55	4.5-5.0
Ultraflo L	β-glucanase	Humicola insolens	40	6
Viscozyme L	Arabinase, Cellulase, β-glucanase, Xylanase Hemicellulase	Asp . sp .	40-50	3.3-5.5

<진세노사이드의 HPLC 분석>

인삼 잎 추출액 전처리

Varian (Palo Alto, CA, USA)사의 Mega BondElut C18 ODS cartridge (1 g, 6 ㎕, particle size 40 μm)를 이용하여 전처리를 실시하였다. C18 cartrige를 2 ㎕의 Methanol과 5 ㎕의 증류수로 활성화 시킨 후, 액상상의 인삼 잎 추출액을 2 ㎕을 용출시킨 다음 5 ㎕의 증류수와 5 ㎕의 30% Methanol을 용출시켜주었다. Methanol 5 ㎕로 용출시킨 후 이 용출액을 40 ℃에서 질소 하에 날려보낸 후 잔류물을 Methaol에 녹여준 후 0.2 μm polytetrafluoroethylene (PTFE) syringe filter를 이용하여 여과하여 시험용액으로 하였다. 시험용액 5 ㎕을 주입하여 HPLC 분석을 하였다.

HPLC 분석

16종의 진세노사이드 함량은 Kim의 방법에 따라 확인하였다(Kim SJ, Murthy HN, Hahn EJ, Lee HL, Paek KY. Parameters affecting the extraction of ginsenosides from the adventitious roots of ginseng (Panax ginseng CA Meyer). Separation and Purification Technology. 2007 Sep 15;56(3):401-6). Varian Prostar 200 HPLC system (Varian Inc., Palo Alto, CA)을 이용하여 실험하였고, column은 IMtakt Cadenza CD-C18 (4.6 × 75 mm, Imtakt Corporation, Kyoto, Japan)을 이용하였고, column의 온도는 40 ℃에서 실시하였다. UV 흡광도 검출기를 이용하여 203 nm에서 측정하였으며, 이동상 용매로는 10% Acetonitrile (A)과 90% Acetonitrile (B)을 이용하였고, 이동상의 gradient 조건은 다음과 같다:

0 → 11 min, 11% B (isocratic); 11 →15 min, 11 → 16%B; 15 → 16 min, 16% → 20% B; 16 → 18 min, 20% → 21%; 18 → 24 min, 21% B (isocratic); 24 → 25 min, 21 → 22% B; 25 → 35 min, 22% B (isocratic); 35 → 36 min, 22 → 23% B; 36 → 40 min, 23% B(isocratic); 40 → 41 min, 23% → 24%; 41 → 45 min, 24% B (isocratic); 45 → 53 min, 24 → 37% B; 53 → 61 min, 37% → 45% B; 61 → 66 min, 45% → 46%; 66 → 73 min, 46 → 48% B; 73 → 75 min, 48% B (isocratic); 75 → 77 min, 48% → 11%; 77 → 85 min, 11% B (isocratic).

이동상의 유속은 1.3 ㎕/min이였으며, sample 주입량은 5 ㎕이었다. 도 1은 16종의 ginsenoside standard를 나타낸다.

<인삼 잎 추출물의 피부 투과율 측정>

인삼 잎 추출물의 피부 투과율은 Sonavan의 방법을 이용하였다(도 2)(Sonavane G, Tomoda K, Sano A, Ohshima H, Terada H, Makino K. In vitro permeation of gold nanoparticles through rat skin and rat intestine: Effect of particle size. Colloids and Surfaces B-Biointerfaces. 2008 Aug 1;65(1):1-10). 5주령의 수컷 SD 쥐(200±20 g), 5마리를 나라바이오텍(Daejuon, Korea)에서 제공받아 실험 전날 털을 제거한 후 diethyl ether로 마취하여 희생하고 피부를 벗겨내었다. 벗겨낸 피부를 1.5 cm²로 잘라내어 Franz-type diffusion cell에 membrane으로 장착하고 0.1 M sodium phosphate buffer (pH 7.4) 4.9 ㎕을 receptor medium으로 넣고 donor side에 인삼 잎 추출액을 100 ㎕ 주입하였다. 실험하는 동안 buffer를 400 ×g으로 교반하면서 water jacket을 이용해 37 ℃을 유지하도록 하였다. 0.5시간, 1-6시간 그리고 24시간에 receptor medium에서 각각 0.5 ㎕를 취하고 시료 채취 후 0.1 M sodium phosphate buffer 0.5 ㎕을 즉시 receptor medium에 넣었다. 채취된 시료는 Taga 의 방법으로 측정된 총 폴리페놀 양에 의해 농도를 계산하였다(Taga MS, Miller EE, Pratt DE. Chia Seeds as a Source of Natural Lipid Antioxidants. Journal of the American Oil Chemists Society. 1984;61(5):928-31).

<인삼 잎 추출물의 장 흡수율 측정>

인삼 잎 추출액의 장 흡수율은 Mahomoodally의 방법을 이용하였다 (도 3)(Mahomoodally MF, Gurib-Fakim A, Subratty AH. Experimental evidence for in vitro fluid transport in the presence of a traditional medicinal fruit extract across rat everted intestinal sacs. Fundamental & Clinical Pharmacology. 2005 Feb;19(1):87-92). 5주령의 수컷 SD 쥐 (200±20 g)를 12시간 공복시킨 후 diethyl ether로 마취하여 희생하고 소장을 재빨리 취해서 세척한 후 공장 시작 부분의 10 cm를 취하였다. 유리 막대를 이용하여 장을 뒤집은 후 한쪽 끝을 수술용 실을 이용해 묶고 0.1% glucose을 함유한 Krebs-Henseleit bicarbonate (KHB) buffer (pH 7.4) 1 ㎕을 serosal fluid(inner compartment)로 넣은 후 다른 한 쪽을 묶어 장 주머니를 만들었다. 장 주머니를 인삼 잎 추출액 0.5 ㎕와 KHB buffer 29.5 ㎕가 함유된 mucosal fluid(outer compartment)에 넣었다. 실험하는 동안 buffer를 400 × g으로 교반하면서 water jacket을 이용해 37 ℃를 유지하도록 하고 5% CO₂와 95% O₂을 계속적으로 공급하였다. 주머니 안의 시료는 10, 20, 30분 그리고 1시간에 각각 채취하여 Taga의 방법으로 측정된 총 폴리페놀양에 의해 농도를 계산하였으며, 이용한 주머니의 건조 중량으로 장 흡수율을 나타내었다(Taga MS, Miller EE, Pratt DE. Chia Seeds as a Source of Natural Lipid Antioxidants. Journal of the American Oil Chemists Society. 1984;61(5):928-31).

<인삼 잎 추출물의 uptake 측정>

Caco -2 cell culture

Caco-2 cell (도 4)은 American Type Culture Collection (Rockville, MD, USA)로부터 구입하여 사용하였다. 배양액은 10% fecal bovine serume (FBS), 1% non-essential amino acid, 100 units/㎕ penicillin과 0.1㎎/㎕ streptomycin를 함유한 Minimum Essential Medium (MEM)을 사용하였다. 37 ℃에서 5% CO₂와 95% humidity 조건을 항상 유지하도록 하여 100mm dish에서 배양했으며 80-90%의 confluency에 도달하면 trypsin-ethylenediamine tetraacetic acid (EDTA)을 사용하여 1:5의 비율로 subculture를 하였다. Passage number가 25-30인 Caco-2 cell을 6-well에 2.5x10⁵ cells/㎕의 density로 seeding하여 uptake실험에 사용할 때까지 CO₂ incubator에서 배양하면서 2일에 한 번씩 배양액을 갈아주었다.

Uptake studies

본 실험에서는 6-well에서 11-14일 배양한 Caco-2 세포 단층막을 사용하였다. 실험 전에 10% FBS 배지를 가하여 2시간 동안 renew하였다. 37 ℃ Hanks' balanced salt solution(HBSS; without phenol red; 10mM N-2-hydroxyethylpiperazine-N'-2- ethanesulfonic acid (HEPES); pH 7.2)을 이용하여 세척한 후 30분 동안 CO₂ incubator에서 incubation시키면서 starvated condition을 만들어 주고 흡입 제거하였다.

Time-dependent 에서는 HBSS에 녹인 동일한 농도와 pH의 인삼 잎 추출액을 1 ㎕씩 가하여 준 후, CO₂ incubator에서 incubation시키면서 시간별로 꺼냈다. pH-dependent 실험에서는 각기 다른 pH와 동일한 농도와 시간 (2시간)으로 incubation 시켰다.

Dose-dependent 실험에서는 각기 다른 농도와 동일한 pH (pH 6.5)와 시간 (2시간)동안 incubation시켰다.

Transport inhibitor uptake 실험에서는 transport inhibitor (P-glycoprotein (P-gp) (cyclosporine A, 10 μmol/㎕; verapamil, 100 μmol/㎕) or metabolic inhibitors (2,4-dinitrophenol, 0.5 mM/㎕; sodium azide, 10 mM/㎕))가 들어 있는 HBSS에 동일한 농도와 pH(pH 6.5), 그리고 동일한 시간(2시간)동안 incubation시켰다. Incubation이 끝난 cell의 sample은 흡입 제거하고 4 ℃의 phosphate buffered saline (PBS)로 세척한 후, 1% Triton X-100을 1 ㎕씩 분주하여 37℃에서 30분간 incubation시키면서 cell을 lysis시킨다. Lysis된 cell은 phosphoric acid(85%) 20 ㎕을 가하여 5분간 방치한 후 원심분리 (1,200 × g, 30 min)한다. 그 상징액을 분획하여 ginsenoside의 함량을 HPLC분석을 이용하여 측정하였고, 그 결과는 단백질 ㎎당 ginsenoside F2 ㎍으로 표현하였다. 침전물은 5% SDS (in 0.1N NaOH) 1 ㎕에 녹인 후 BCA method를 이용하여 단백질량을 측정하였다.

<통계 분석>

실험 결과는 SPSS 12.0(SPSS Inc., IL, USA)을 이용하여 통계 처리하였으며 모든 측정 항목에 대한 평균(mean)과 표준편차(standard deviation, SD)를 산출하였다. 실험군간의 유의성은 ANOVA test 후 구체적인 사후 검증은 p<0.05 수준에서 Duncan's multiple range test로 실시하였다.

<실험예 1> 인삼 잎 가수분해물의 활성성분

<인삼 잎 가수분해물의 제조>

추출 전 효소처리군의 제조

인삼 잎 분말 (3 g)을 증류수 (500 ㎕)에 팽윤시킨 후, 0.5%의 가수분해효소 (표 1)를 첨가하여 40 ℃에서 12시간 동안 효소 반응을 시킨 후, 열을 가하여 효소를 불활성화시켰다. 여기에 에탄올 150 ㎕을 가하여 90 ℃에서 2시간 환류추출한 후, 10,000 × g에서 30분 동안 원심분리 하였다. 원심분리한 상징액을 분리하고, 이 과정을 2번 반복하였다. 상징액을 모아 50 ㎕이 되도록 감압농축하고, 3,000 × g에서 20분 동안 원심분리하여 사용하였다. 그 외 효소 처리를 제외하고는 동일한 방법으로 control을 제조하였다.

추출 후 효소처리군의 제조

인삼 잎 분말 (100 g)에 70% 에탄올 1.5 L를 가하여 90 ℃에서 2시간 동안 환류추출 한 후, 10,000 × g에서 30분 동안 원심분리 하였다. 원심분리 한 상징액을 분리하고, 이 과정을 2번 반복하였다. 상징액을 모아 1 L이 되도록 감압농축하고, 3,000 × g에서 20분 동안 원심분리하였다. 이 추출액 20 ㎕에 표 1의 가수분해효소를 0.5% 씩 첨가하여 40 ℃에서 12시간 동안 효소 반응을 시킨 후 열을 가하여 효소를 불활성화시켰다. 그 후 3,000 × g에서 20분 동안 원심분리하여 사용하였다. 그 외 효소 처리를 제외하고는 동일한 방법으로 control을 제조하였다.

<1-1> 인삼 잎 가수분해물의 고형분 함량 및 수율 변화

인삼 잎 추출액의 (A) 고형분 함량과 (B) 수율은 도 5에 나타내었다. 고형분 함량과 수율은 유사한 경향을 보였으며, 추출 전 효소처리군에서는 고형분 함량과 수율이 Celluclast 1.5L, Optidex L-400 그리고 Rapidase TF (11.00 - 11.67 ㎎/㎕; 0.037 - 0.039%) 효소를 처리한 군들이 높은 경향을 나타내었다. 또한 Cytolase PCL5와 Ultraflo L (5.33 - 6.00 ㎎/㎕; 0.024 - 0.026%, respectively) 효소를 처리한 군들이 control(7.66 ㎎/㎕; 0.026%) 군에 비해 낮은 경향을 나타내었다. 추출 후 효소처리군에서는 고형분 함량과 수율이 Pectinex 5XL (41.00 ㎎/㎕; 0.210%) 효소를 처리한 군이 가장 높은 경향을 나타냈으며, Optidex L-400 (33.33 ㎎/㎕; 0.170%) 효소를 처리한 군이 가장 낮게 나타났다. 고형분 함량과 수율에서 각각의 효소는 추출 전 효소처리군와 추출 후 효소처리군 사이에서 유의적인 차이가 있는 것으로 나타났다 (p < 0.05).

<1-2> 인삼 잎 가수분해물의 총당 함량 및 산성당 함량 변화

총당 함량은 glucose을 표준물질로 사용하여 phenol-sulfuric acid 방법으로 정량하였다(Dubois M, Gilles KA, Hamilton JK, Rebers PA, Smith F. Colorimetric Method for Determination of Sugars and Related Substances. Analytical Chemistry. 1956;28(3):350-6). 인삼 잎 추출액 200 ㎕에 5% Phenol을 가한 후, 1 ㎕의 conc. sulfuric acid를 첨가한다. 2-3초간 반응시킨 후, 냉각시키고 490 nm에서 흡광도를 측정하였다.

산성당 함량은 galactronic acid을 표준물질로 사용하여 3-phenylphenol 방법으로 정량하였다(Blumenkr.N, Asboehan.G. New Method for Quantitative-Determination of Uronic Acids. Analytical Biochemistry. 1973;54(2):484-9). 냉각시킨 1.2 ㎕의 sulfuric acid/tetraborate에 인삼 잎 추출액 200 ㎕를 첨가시킨 후, 100 ℃에서 5분간 반응시킨다. 얼음에 냉각시킨 후, 20 ㎕의 3-phenylphenol을 첨가하여 발색시키고 520 nm에서 흡광도를 측정하였다.

인삼 잎 추출액의 (A) 총당 함량과 (B) 산성당 함량은 도 6에 나타내었다. 한국인삼 잎은 starch, polysaccharides, cellulose, glycosides와 같은 탄수화물(60 - 70 g carbohydrate/100 g solid)로 이루어져 있는데 그 중 starch가 주를 이루고 있는 것으로 보고되어있다(고성룡 최김한. 인삼(Panax)속 식물의 일반성분 , 무기성분 , 아미노산 및 유리당 함량조성 (Comparison of Proximate Composition , Mineral Nutrient , Amino Acid and Free Sugar Contents of Several Panax Species ). Journal of Ginseng Research(구 고려인삼학회지). 1996;20(1):36-41). 산성당은 당의 알데하이드기 또는 카보닐기를 가진 당 유도체로 한쪽 끝의 CH₂OH를 COOH로 바꾼 형식의 화합물로서 식물 근원의 산성당은 면역활성, 항산화, antitumor, 항바이러스 효과 등의 다양한 생물학적 활성을 가지고 있는 것으로 알려져 있다(Nangia-Makker P, Conklin J, Hogan V, Raz A. Carbohydrate-binding proteins in cancer, and their ligands as therapeutic agents. Trends in Molecular Medicine. [doi: DOI: 10.1016/S1471-4914(02)02295-5]. 2002;8(4):187-92). 특히 인삼 잎 유래의 산성당의 면역활성은 β-(1,3)-linked galactan backbone에 arabinose, galactose, rhamnose and galacturonic acid가 연결된 branched glycan structure가 높은 것에 따른 것으로 보여진다(Tomoda M, Hirabayashi K, Shimizu N, Gonda R, Ohara N. The core structure of ginsenan PA, a phagocytosis-activating polysaccharide from the root of Panax ginseng. Biol Pharm Bull. 1994 Sep;17(9):1287-91.).

총당의 경우 추출 전 효소처리군에서 Optidex L-400 (0.29 ㎎/㎎) 효소를 처리한 군을 제외한 다른 효소 처리군들은 control (0.47 ㎎/㎎)에 비해 높은 함량을 가지고 있는 것으로 나타났다. 특히 Econase CE와 Viscozyme L (0.96 ㎎/㎎, 0.93 ㎎/㎎; respectively)을 처리한 군의 경우 가장 높은 경향을 나타났다. 추출 후 효소처리군에서는 효소 처리에 따른 총당의 변화가 크게 나타나지는 않았다. 각 효소의 총당 함량은 추출 전 효소처리군와 추출 후 효소처리군 사이에서는 유의적인 차이가 있는 것으로 나타났다 (p < 0.05).

산성당의 경우 추출 전 효소처리군에서 Optidex L-400 (25.60 ㎍/㎎) 효소를 처리한 군을 제외한 다른 효소 처리군들은 control (36.21 ㎍/㎎) 에 비해 높은 함량을 가지고 있는 것으로 나타났다. 특히 Pectinex 5XL와 Viscozyme L (146.86 ㎍/㎎, 159.38 ㎍/㎎; respectively)을 처리한 군의 경우 가장 높은 경향을 나타났다. 추출 후 효소처리군에서는 효소 처리에 따른 산성당의 변화보다, 추출 전 효소처리군와 추출 후 효소처리군 사이에서 더 큰 차이가 있는 것으로 나타났다 (p < 0.05).

<1-3> 인삼 잎 가수분해물의 폴리페놀 및 플라보노이드 함량 변화

폴리페놀 함량은 gallic acid을 표준물질로 사용하여 Folin-ciocalteu 방법으로 정량하였다(Taga MS, Miller EE, Pratt DE. Chia Seeds as a Source of Natural Lipid Antioxidants. Journal of the American Oil Chemists Society. 1984;61(5):928-31). 1.5 ㎕ Eppendorf tube에 0.79 ㎕의 증류수와 인삼 잎 추출액 0.01 ㎕을 혼합하고, 0.9 N Folin-ciocalteu 용액을 가하고 1분간 교반하며 반응시킨다. 여기에 20% sodium carbonate 0.15 ㎕ 가하고 빛을 차단시키면서 상온에서 2시간 동안 반응시킨 후, 750nm에서 흡광도를 측정하였다.

플라보노이드 함량은 catechin을 표준물질로 사용하여 p-dimethylaminocinnamaldehyde 방법으로 정량하였다(Arnous A, Makris DP, Kefalas P. Anthocyanin Composition and Colour Characteristics of Selected Aged Wines Produced in Greece. Journal of Wine Research. 2002;13(1):23 - 34). 1.5 ㎕ Eppendorf tube에 인삼 잎 추출액 40 ㎕과 200 ㎕의 p-dimethylaminocinnamaldehyde 용액을 넣어 교반하고 상온에서 10분간 반응시킨 후, 640nm에서 흡광도를 측정하였다.

인삼 잎 추출액의 (A) 폴리페놀 함량과 (B) 플라보노이드 함량은 Fig. 9에 나타내었다. 폴리페놀의 경우, 추출 전 효소처리군에서는 Cytolase PCL5 (25.25 ㎍/㎎), Pectinex 5XL (24.06 ㎍/㎎) 그리고 Ultraflo L (33.68 ㎍/㎎) 효소를 처리한 군들이 높은 함량을 보였으나 Celluclast 1.5L (15.49 ㎍/㎎), Optidex L-400 (14.88 ㎍/㎎) 및 Rapicase TF (13.74 ㎍/㎎) 효소를 처리한 군들의 경우 control (23.22 ㎍/㎎)에 비해 낮은 함량을 보였다. 각 효소에 따른 폴리페놀의 함량은 추출 전 효소처리군와 추출 후 효소처리군 사이에서 유의적인 차이가 있는 것으로 나타났다 (p < 0.05).

플라보노이드의 경우, 추출 전 효소처리군에서는 Pectinex 5XL (0.15 ㎍/㎎)와 Ultraflo L(0.16 ㎍/㎎) 효소를 처리한 군들의 플라보노이드 함량이 높게 나타난 반면, Celluclast 1.5L(0.07 ㎍/㎎)과 Optidex L-400 (0.08 ㎍/㎎) 효소를 처리한 군들의 경우 control(0.10 ㎍/㎎)에 비해 낮은 함량을 보였다. 추출 후 효소처리군에서는 효소를 처리한 인삼 잎 추출액에서 control에 비해 낮아지는 경향을 나타내었으며 각 효소에 따른 추출 전 효소처리군와 추출 후 효소처리군 사이에서는 유의적인 차이가 있는 것으로 나타났다 (p < 0.05).

<1-4> 인삼 잎 가수분해물의 진세노사이드 함량 변화

효소에 따른 ginsenoside함량의 변화는 도 8, 표 2 및 표 3에 나타내었으며, 총 ginsenoside의 함량, Rg1과 Rb1을 합한 함량, metabolic ginsenoside (Metabolite ginsenoside is added that Rg2, Rg3, Rg5, Rk1, compound K (CK), Rh1, Rh2 and F2)의 함량이 모두 비슷한 경향으로 나타났다.

추출 전 효소처리군에서 총 ginsenoside 함량은 Celluclast 1.5L (181.01 ug/㎎), Optidex L-400 (186.44 ug/㎎) 그리고 Pectinex 5XL (186.44 ug/㎎) 효소를 처리한 군에서 가장 낮은 함량을 보였으며, Ultraflo L (406.13 ug/㎎) 효소를 처리한 군에서 가장 높은 함량으로 나타났다. Rg1과 Rb1을 합한 함량에서는 Celluclast 1.5L (47.02 ug/㎎), Optidex L-400 (47.26 ug/㎎) 그리고 Pectinex 5XL (47.26 ug/㎎) 효소를 처리한 군에서 가장 낮은 함량을 보였으며, Ultraflo L (106.30 ug/㎎) 효소를 처리한 군에서 가장 높은 함량으로 나타났다. Metabolic ginsenoside의 함량은 Celluclast 1.5L (43.02 ug/㎎), Optidex L-400 (45.04 ug/㎎) 그리고 Pectinex 5XL (45.04 ug/㎎) 효소를 처리한 군에서 가장 낮은 함량을 보였으며, Ultraflo L (93.13 ug/㎎) 효소를 처리한 군에서 가장 높은 함량으로 나타났다(표 2).

추출 후 효소처리군에서는 효소처리를 한 군이 control에 비해 크게 변화되는 것이 관찰되지 않았다. 각 효소에 따른 Ginsenoside의 함량은 추출 전 효소처리군와 추출 후 효소처리군 사이에서 유의적인 차이가 있는 것으로 나타났다 (p < 0.05)(표 3).

<실험예 2> 인삼 잎 가수분해물의 생리활성

<2-1> 인삼 잎 가수분해물의 항산화능

DPPH 라디칼 소거능

인삼 잎 추출액의 DPPH(1,1-Diphenyl-2-picryl hydrazyl) 라디칼 소거능 측정은 Quang의 방법을 이용하였다(Quang DN, Hashimoto T, Nukada M, Yamamoto I, Tanaka M, Asakawa Y. Antioxidant activity of curtisians I-L from the inedible mushroom Paxillus curtisii. Planta Med. 2003 Nov;69(11):1063-6). Ethanol에 용해시킨 0.2 mM DPPH 용액 0.4 ㎕와 시료 0.1 ㎕을 암소에서 10분간 반응시킨 후 520 nm에서 흡광도를 측정하였다. 인삼 잎 추출액의 항산화력은 라디칼 소거능의 중간 활성을 나타내는 농도를 표시하는 IC₅₀(half maximal inhibitory concentration)으로 표시하였다. 즉, DPPH 라디칼의 흡광도를 50% 줄여주는 값의 농도를 말한다.

ABTS 라디칼 소거능

인삼 잎 추출액의 ABTS(2,2-Azinobis(3-ethylbenzthiazoline-6-sulfonate)) 라디칼 소거능 측정은 Wang(Wang LL, Xiong YL. Inhibition of Lipid Oxidation in Cooked Beef Patties by Hydrolyzed Potato Protein Is Related to Its Reducing and Radical Scavenging Ability, Journal of Agricultural and Food Chemistry. [doi: 10.1021/jf051213g]. 2005;53(23):9186-92)와 Almajano(Almajano MP, Carbo R, Delgado ME, Gordon MH. Effect of pH on the antimicrobial activity and oxidative stability of oil-in-water emulsions containing caffeic acid. J Food Sci. 2007 Jun;72(5):C258-63)의 방법을 이용하였다. 7 mM ABTS에 2.45 mM potassium persulfate을 첨가하여 암소에서 실온으로 12-16시간 방치한 후 414 nm에서 흡광도가 1.4-1.5가 되도록 증류수로 희석시켰다. 인삼 잎 추출액 12.5 ㎕에 희석된 ABTS 라디칼 용액 250 ㎕를 넣어 암소에서 60분간 반응시키고 414 nm에서 흡광도를 측정하였다. 인삼 잎 추출액의 항산화력은 라디칼 소거능의 중간 활성을 나타내는 농도를 표시하는 IC₅₀ (half maximal inhibitory concentration)으로 표시하였다. 즉, ABTS 라디칼의 흡광도를 50% 줄여주는 값의 농도를 말한다.

결과

추출 전 효소처리군의 경우 DPPH와 ABTS가 비슷한 경향으로 나타났으며, 도 7의 폴리페놀과 플라보노이드 함량의 결과와 연관지어 볼 때 유사하게 나타났다.

라디칼 소거능 활성은 도 14에 나타내었는데, 이 결과에 의하면 Ultraflo L (2.77㎎, 1.57㎎; respectively) 효소를 처리한 군이 DPPH와 ABTS 라디칼 소거능이 가장 높게 나타났다. Fig. 18 (A)은 DPPH 라디칼 소거능 실험의 결과로서, 추출 전 효소처리군에서는 cytolase PCL5 (3.78㎎)와 Pectinex 5XL (4.19 ㎎) 효소를 처리한 군의 라디칼 소거능이 높게 나타났으며, Celluclast 1.5L(6.36 ㎎), Optidex L-400 (6.32 ㎎) 그리고 Rapidase TF (6.78 ㎎) 효소를 처리한 군은 라디칼 소거능이 낮게 나타나는 것으로 관찰되었다. 추출 후 효소처리군의 경우 Cytolase PCL5 (6.11㎎), Optidex L-400 (5.28 ㎎) 그리고 Rpidase TF (6.11 ㎎) 효소를 처리한 군에서 높은 라디칼 소거능이 관찰되었다. 각 효소에 따른 추출 전 효소처리군와 추출 후 효소처리군 사이에는 각각 유의적인 차이가 나타났다 (p < 0.05). Fig. 18 (B)은 ATBS 라디칼 소거능 실험 결과로, 추출 전 효소처리군에서는 Ultraflo L 효소를 처리한 군 외에는 효소 처리한 군이 control (2.19 ㎎)에 비해 낮은 라디칼 소거능을 보였으며, 추출 후 효소처리군에서는 군간의 별다른 차이를 보이지 않았다.

<2-2> 인삼 잎 가수분해물이 주름에 미치는 영향

Tyrosinase 억제능

인삼 잎 추출액의 tytosinase 억제 실험은 Mason & Peterson의 방법을 이용하여 96-well plate에 시행하였다(Mason HS, Peterson EW. Melanoproteins I. reactions between enzyme-generated quinones and amino acids. Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-General Subjects. [doi: DOI: 10.1016/0304-4165(65)90479-4]. 1965;111(1):134-46). 버섯 유래의 tyrosinase은 167 units/㎕이 되도록 phosphate buffer를 이용하여 희석하였으며 인삼 잎 추출액은 dimethyl sulfoxide (DMSO)에 다양한 농도가 되도록 희석한 후 37 ℃에서 5분간 pre-incubation시켰다. 100 ㎕의 tyrosinase 와 인삼 잎 추출액 20 ㎕, 그리고 3,4-dihydroxy-L-phenyl-alanine (L-DOPA) 100 ㎕을 37 ℃에서 30분간 반응시키고 490nm에서 흡광도를 측정하였다.

<식 1>

% inhibition = [(A-B)-(C-D)]/(A -B)x100

A: OD at 492 nm with tyrosinase but without test substanc

B: OD at 492 nm without test substance and tyrosinase

C: OD at 492 nm with test substance and tyrosinase

D: OD at 492 nm with/ test substance but without tyrosinase.

Elastase 억제능

인삼 잎 추출액의 elastase 억제 실험은 James의 방법을 이용하여 측정하였다(Kraunsoe JA, Claridge TD, Lowe G. Inhibition of human leukocyte and porcine pancreatic elastase by homologues of bovine pancreatic trypsin inhibitor. Biochemistry. 1996 Jul 16;35(28):9090-6). 25 ℃에서 20분간 기질인 N-succinyl-(Ala)₃-p-nitoroanilide이 p-nitroaniline로 되는 것을 억제하는 정도를 알아보는 실험이다. 1 ㎍의 porcine pancreatic elastase type IV (PPE) 을 1 ㎕의 0.2 M Tris-HCl buffer (pH 8.0)에 녹인다. 0.2 M Tris-HCl buffer (pH 8.0), 1 ppm PPE, 0.8 mM N-succinyl-(Ala)₃-p-nitoroanilide 및 인삼 잎 추출액을 섞어주고 기질을 가하여 반응시켜준 후, 410 nm에서 흡광도를 측정하여 나타낸다.

<식 2>

% inhibition = (A-B)/A × 100

A: with elastase but without sample

B: with sample and elastase

결과

도 15는 인삼 잎 추출액의 tyrosinase와 elastase 저해능력 실험 결과이다. 추출 전 효소처리군의 tyrosinase 저해 활성은 Cytolase PCL5 (7.36 %/㎎), Econase CE (8.11 %/㎎) 및 Ultraflo L(8.90 %/㎎) 효소를 처리한 군이 control(5.84 %/㎎)에 비해 높게 나타났으며, Celluclast 1.5L(4.00 %/㎎), Optidex 5XL(4.35 %/㎎) 효소를 처리한 군이 control (5.84 %/㎎)에 비해 낮게 나타나는 것으로 관찰되었다. 추출 후 효소처리군에서는 Optidex L-400 (4.67 %/㎎)효소를 처리한 군이 가장 높게 나타난 반면, Celluclase 1.5L (1.91 %/㎎) 효소를 처리한 군이 가장 낮게 나타났다.

<실험예 3> 인삼 잎 베타-글루카네이즈 가수분해물의 체내 흡수율

<인삼 잎 추출물 및 가수분해물의 제조>

인삼 잎 추출액에 효소처리를 하지 않은 실시예 1과 인삼 잎 추출액의 일반성분 실험에서 가장 유효성분의 함량이 높게 나타난 Ultraflo L 효소를 처리한 실시예 2를 실험예 1의 추출 전 효소처리군과 동일한 방법으로 제조하였다.

<3-1> 인삼 잎 베타-글루카네이즈 가수분해물의 진세노사이드 함량

실시예 1 및 실시예 2의 ginsenoside 함량은 HPLC로 분석하였으며 그 결과는 표 4와 같다. 실시예 1과 실시예 2의 ginsenoside 함량은 유의적인 차이를 나타내으며, 실시예 2의 각 항목별 gisenoside의 함량이 일괄적으로 상승하는 경향을 보였다.

<3-2> 인삼 잎 베타-글루카네이즈 가수분해물의 피부 투과율

실시예 1과 실시예 2의 피부흡수율은 Franz diffusion cell에 쥐의 피부를 membrane으로 장착하여 실험하였으며, receptor cell에서 시간별로 채취한 시료를 가지고 polyphenol 함량을 측정하여 도 9에 그 결과를 나타내었다. 그 결과 polyphenol의 함량은 시간이 지남에 따라 증가하는 경향을 보였으며, 실시예 2 (9.83 ug/㎕)의 경우 투과된 polyphenol의 함량이 실시예 1(9.14 ug/㎕)보다 높은 것으로 나타났다.

<3-3> 인삼 잎 베타-글루카네이즈 가수분해물의 장 흡수율

실시예 2과 실시예 1의 장 투과율 실험은 Intestine across everted intestinal sac을 이용하였으며, 채취한 시료의 polyphenol 함량을 측정하여 도 10에 그 결과를 나타내었다. 10-30분 사이의 장 투과율의 결과를 보면 실시예 2의 투과력이 실시예 1에 비해 1.5배 높게 나타났으며, 이는 통계적으로 유의한 차이를 보였다 (p < 0.05). 1시간일 때의 결과를 보면 실시예 2의 투과력 (531.07 of ㎍ of total phenolic compounds/g sac)이 실시예 1의 투과력 (527.96 of ㎍ of total phenolic compounds/g sac)보다 더 높게 나타났다.

<3-4> 인삼 잎 베타-글루카네이즈 가수분해물의 uptake

배양시간에 따른 ginsenoside F2 uptake 실험 결과

Caco-2 cell을 통한 약물의 세포막 투과도는 사람의 소장점막 투과도와 좋은 상관관계를 보여주고 있어 약물의 장관막 투과성을 예측하는 in-vitro 실험계로 많이 사용되고 있다. 특히 caco-2 cell은 수동적으로 흡수되는 약물 투과도 간에 좋은 상관관계가 있는 것으로 알려져 있다. Ginsenoside F2는 주요 ginsenoside 대사체 중의 하나로, protopanaxadiol계의 ginsenoside로부터 만들어지며, 더 분해되면 Compound K나 ginsenoside Rh2을 형성할 수 있는 전구체이다.

도 11은 각 시간대별 ginsenoside F2의 cellular uptake와 uptake rate를 나타내었다. Ginsenoside F2의 cellular uptake를 보면, 실시예 1의 경우 1시간까지 그 함량이 비례적으로 증가되다가 3시간에서 그 함량이 최고에 이른 후 낮아졌다. 실시예 2의 경우 2시간까지 비례적으로 증가되다가 5시간에 최고를 이르렀다. 배양시간에 따른 uptake rate를 보면 처음 0.5-1시간 동안 속도가 증가하다가 그 이후 시간에는 속도가 점점 낮아지는 것으로 관찰되었다. Ginsenoside F2의 cellular uptake 함량과 uptake 속도는 실시예 1과 실시예 2 사이에서 유의한 차이를 보였으며, 실시예 2의 ginsenoside F2의 함량은 실시예 1보다 120-220% 더 높게 나타났다.

농도에 따른 uptake 실험 결과

농도에 따른 uptake 결과는 도 12로 나타내었다. 0-5㎎/㎕의 범위에서 실험을 실시한 결과, 실시예 1과 실시예 2 모두에서 농도 의존적인 것으로 나타났다 (r² = 0.909, r² = 0.962; respectively). 이 결과를 통하여 ginsenoside F2는 세포막의 passive membrane diffusion에 의하여 흡수되는 것으로 사료된다. 특히, 실시예 2의 경우 실시예 1에 비해 120-220% 높은 수치로 유의하게 나타났다 (*mean p < 0.05, **mean p < 0.01).

pH 에 따른 uptake 실험 결과

장에서 영양성분이 흡수되는 곳은 주로 공장으로서 이곳의 pH는 7.4-7.5인 것으로 알려져 있으며, 소장 내의 epithelial cell layer는 약산성의 상태인 것으로 알려져 있다. pH (extracellular pH from 5.5 to 7.4)에 따른 uptake 실험 결과는 도 13에 나타내었다. 실시예 1은 pH 6.5 (18.66 mM/㎎ protein)에서, 실시예 2은 pH 6.0 (21.10 mM/㎎ protein)에서 가장 높은 수치를 나타내었다. 각각의 uptake는 pH 7.4를 기준으로 비교하였을 때 유의적인 차이를 보였는데, 실시예 1의 경우에는 pH 5.5와 유의적인 차이를 나타내었으며, 실시예 2의 경우는 다른 모든 pH와 통계적으로 유의한 차이를 보였다 (*mean p < 0.05, **mean p < 0.01).

<실험예 4> 인삼 잎 베타-글루카네이즈 가수분해물의 광노화 및 산화스트레스 저해능

<화장료 조성물의 제조>

본 실험에서 실시한 화장료 조성물의 기본이 되는 베이스 에센스는 에센스 제형으로, 1%의 carbomer 용액 (30. 0%), hyaluronic acid (5.0%), beta glucan (3.0%), triethanol amine (0.3%), methyl paraben (0.1%), disodium-2,2'-dihydroxy-4, 4'-dimethoxybenzophenonesulphonic acid (0.1%)로 이루어져 있다.

상기 베이스 에센스 자체를 비교예 1로 사용하였으며, 여기에 실시예 1 및 실시예 2의 인삼 잎 추출물 및 가수분해물을 10 %씩 가하여 화장료 조성물을 제조하였다(각각 실시예 3 및 실시예 4). 또한 상기 베이스 에센스에 알부틴 2.0 %를 첨가하여 비교예 2로 하였고, 아데노신 0.04 %를 첨가하여 비교예 3으로 하였다.

Cosmetic formulations	Component ratio (%)
	Deioized water	Carbomer (1% solution)	Hyaluronic acid	Beta glucan	Triethanol amine	Methyl paraban	DS-49	Active ingrdient	Total
실시예 3	51.5	30	5	3	0.3	0.1	0.1	10	100
실시예 4	51.5	30	5	3	0.3	0.1	0.1	10	100
비교예 1	61.5	30	5	3	0.3	0.1	0.1	-	100
비교예 2	59.5	30	5	3	0.3	0.1	0.1	2	100
비교예 3	62.5	30	5	3	0.3	0.1	0.1	0.04	100

실시예 3: 베이스 에센스+인삼 잎 추출물

실시예 4: 베이스 에센스+인삼 잎 베타-글루카네이즈 가수분해물

비교예 1: 베이스 에센스

비교예 2: 베이스 에센스+알부틴

비교예 3: 베이스 에센스+아데노신

DS-49; disodium-2,2'-dihydroxy-4,4'-dimethoxybenzophenonesulphonic acid

<실험설계>

UVB 조사

실험동물은 25-30g 되는 웅성 HRS/J hairless mouse를 사용하였으며, Marquele-Oliveira의 방법을 변형하여 실시하였다(Marquele-Oliveira F, Fonseca YM, de Freitas O, Fonseca MJ. Development of topical functionalized formulations added with propolis extract: stability, cutaneous absorption and in vivo studies. Int J Pharm. 2007 Sep 5;342(1-2):40-8). 실험 동물은 사육 케이지 (42 cm × 8 cm)를 이용하여 실험실의 온도는 22-24 ℃, 습도는 60%가 유지되며 밤낮 주기 (12시간 light/ 12시간 dark)가 환경 조절 장치에 의해 조절되는 고려대학교 동물실에서 사육하였다. 전 실험 기간 동안 물과 사료는 제한 없이 섭취하도록 하였다. 피부의 UVB 조사는 실험 동물을 자체 제작한 자외선 조사용 케이지에 가둔 후 TL/12RS 40W Philips 자외선 조사장치를 사용하였으며, 이것은 270-400nm 범위의 광원을 가지고 있었고 결과적으로 313nm의 파장의 UVB를 방출하며 20㎝떨어진 곳에서 IL 1700 radiometer (International Light Inc., USA) 로 측정하였을 때 2.6075 × 10^-4 W/cm²의 광량으로 UVB를 조사하였다. 500 ㎕의 화장품을 피부에 하루에 3번씩 7일간 도포하였다. 실험동물의 처치는 각 군별로 7일째의 UVB 조사가 끝나고 6시간 후에 경추 탈구사 시킨 후 표피와 진피를 모두 포함한 피부조직을 적출하여 0.15 M NaCl로 세척한 다음 filter paper로 여분의 물기를 제거하였다. 각각의 피부조직의 무게를 잰 후 4.5 ㎕ potassium phosphate buffer (pH 7.0)에 넣어 분쇄 및 균질화 시킨 후 13,000 × g, 4 ℃에서 4분간 원심분리하여 그 상징액을 분취하여 영하 70 ℃에서 보관하며 항산화 실험을 실시하였다.

Visual skin grading

피부의 주름은 grading scale(표 6)을 이용하여 평가하였으며 이것은 Bisset 의 방법을 참고하였다(Bissett D, Hannonand D, Orr T. AN ANIMAL MODEL OF SOLAR-AGED SKIN: HISTOLOGICAL, PHYSICAL, and VISIBLE CHANGES IN UV-IRRADIATED HAIRLESS MOUSE SKIN. Photochemistry and Photobiology. 1987;46(3):367-78).

Grade	Description of skin
0	Numerous fine striations covering back and flanks of body. Fine striations run length of body (head-to-tail direction) and appear and disappear with motion
1	All fine striations on back along spine gone. A few shallow coarse wrinkles across back (run perpendicular to head-to-tail direction) which appear and disappear with motion
2	All fine striations gone. Some coarse wrinkles across back (run perpendicular to head-to-tail direction) which are permanent
3	All fine striations gone. Several deep coarse wrinkles across back (run perpendicular to head-to-tail direction) which are permanent
4	Deep-wrinkled, leathery skin with some flesh-coloured lesions

과산화 지질 측정

피부조직 내 과산화 지질 수준은 thiobarbituric acid reactive substances (TBARS)양을 가지고 평가하였는데 Quintanilh의 방법에 따라 실시하였으며 표준물질로는 malondialdehyde (MDA)을 사용하였다(Quintanilha AT, Packer L, Davies JM, Racanelli TL, Davies KJ. Membrane effects of vitamin E deficiency: bioenergetic and surface charge density studies of skeletal muscle and liver mitochondria. Ann N Y Acad Sci. 1982;393:32-47). 1 ㎕의 sample에 2 ㎕의 0.017 mM thiobarbituric acid와3.36 μM butylated hydroxy toluene의 혼합액을 가해주고 100 ℃ 에서 15분간 반응시켰다. 그 다음 냉각시키고 535nm에서 흡광도를 측정하였으며 그 결과는 피부조직 g 당 μM TBARS함량으로 표현하였다.

환원형 글루타티온 측정

피부조직 내 환원형 글루타티온 (Reduced glutathione (GSH)) 함량 측정은 Tietz의 방법에 따라 실시하였으며 환원형 글루타티온을 표준물질로 정량하였다(Tietze F. Enzymic method for quantitative determination of nanogram amounts of total and oxidized glutathione: Applications to mammalian blood and other tissues. Analytical Biochemistry. [doi: DOI: 10.1016/0003-2697(69)90064-5]. 1969;27(3):502-22). 100 ㎕의 sample, 800 ㎕ 0.3 mM Na₂HPO₄, 100 ㎕ 0.04% 5,5'-dithiobis 2-nitrobenzoic acid (DTNB)을 섞어주고 상온에서 5분간 반응시킨 다음 412 nm에서 흡광도를 측정하여 피부조직 g 당 μM GSH함량으로 표현하였다.

과산화수소 측정

피부조직 내 과산화수소 함량은 Marnett의 방법 변형하여 실시하였으며 H₂O₂을 표준물질로 정량하였다(Marnett LJ, Ji C. Modulation of oxidant formation in mouse skin in vivo by tumor-promoting phorbol esters. Cancer Res. 1994 Apr 1;54(7 Suppl):1886s-9s). 100 ㎕ sample에 900 ㎕ 반응용액 (250 μM ammonium ferrous sulphate, 100 μM xylenol orange and 100 μM sorbitol in 25 mM H₂SO₄)을 섞어주고 상온에서 30분간 반응시켰다. 560 nm에서 흡광도를 측정하여 피부조직 g 당 μM H₂O₂함량으로 표현하였다.

<결과>

인삼 잎 추출물이 첨가된 제품을 피부에 적용시켰을 때 anti-aging 효과가 있는지 보기 위하여, hairless mouse에 UVB를 조사하여 산화적 스트레스를 유발하였다. 인삼 잎 추출물이 함유된 화장품의 mouse 피부의 주름개선효과를 graging scale (표 6)을 이용하여 본 결과는 도 16에 나타내었으며, TBARS, GSH 그리고 hydrogen peroxide level을 본 결과는 표 7과 도 17에 나타내었다.

Fig. 20의 결과를 보면, 아무것도 바르지 않고 UVB를 조사한 군(대조군 2)이 가장 높은 grade을 나타냈으며, 실시예 4이 함유된 화장품을 도포한 군이 UVB를 조사한 군 중에서 가장 낮은 grade를 보였으나 통계적으로 의미있는 수준은 아니었다.

표 7과 도 17를 보면 TBARS에서는 UVB를 조사하지 않은 대조군 1(10.17 μM/g)에 비하여 실시예 3(11.09 μM/g), 실시예 4 (10.78 μM/g)군이 증가하는 것으로 보이나 통계적으로 유의적인 차이를 보이지 않았다.

GSH에서는 UVB를 조사하지 않은 대조군 1(339.13 μM/g)에 비하여 실시예 3(313.10 μM/g), 실시예 4(383.02 μM/g)군이 통계적으로 유의적인 차이를 보였다.

hydrogen peroxide에서는 UVB를 조사하지 않은 대조군 1(261.35 μM/g)에 비하여 실시예 3(200.06 μM/g), 실시예4(147.86 μM/g)군이 통계적으로 유의적인 차이를 보였다. 이에 따라 인삼 잎에 광산화 보호작용이 있음으로 사료된다.

본 발명의 인삼 가수분해물을 유효성분으로 포함하는 조성물은 항산화, 항노화, 주름 예방 및 개선에 탁월한 효과가 있는바, 건강 및 외모를 유지, 증진시키는데 유용할 것으로 예상된다.

Claims (8)

1. 인삼 가수분해물을 유효성분으로 포함하는 항산화, 항노화, 주름 예방 및 개선용 조성물.
   
2. 제 1항에 있어서,
   상기 조성물은 식품 조성물 또는 화장료 조성물인 것을 특징으로 하는 항산화, 항노화, 주름 예방 및 개선용 조성물.
   
3. 제 1항에 있어서,
   상기 인삼은 인삼 잎인 것을 특징으로 하는 항산화, 항노화, 주름 예방 및 개선용 화장료 조성물.
   
4. 제 1항에 있어서,
   상기 인삼 가수분해물은 셀룰레이즈, 펙티네이즈,엔도-자일라네이즈, 베타-글루카네이즈, 글루코아밀레이즈, 폴리갈락트로네이즈, 헤미셀룰레이즈, 아라비네이즈 및 자일라네이즈로 구성되는 군으로부터 선택되는 하나 또는 그 이상의 가수분해효소로 가수분해된 것을 특징으로 하는, 항산화, 항노화, 주름 예방 및 개선용 화장료 조성물.
   
5. 제 1항에 있어서,
   상기 인삼 가수분해물은 인삼 추출 전 또는 인삼 추출 후에 가수분해효소를 가하여 제조되는 것을 특징으로 하는 항산화, 항노화, 주름 예방 및 개선용 화장료 조성물.
   
6. 인삼에 가수분해효소를 가하는 단계를 포함하는 항산화, 항노화, 주름 예방 및 개선용 화장료 조성물의 제조 방법.
   
7. 제 6항에 있어서,
   상기 인삼은 인삼 잎인 것을 특징으로 하는 항산화, 항노화, 주름 예방 및 개선용 화장료 조성물의 제조 방법.
   
8. 제 6항에 있어서,
   인삼에 가수분해효소를 가하는 단계 이전 또는 이후에, 인삼을 추출하는 단계를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 항산화, 항노화, 주름 예방 및 개선용 화장료 조성물의 제조 방법.
   
   

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