KR20230006133A - 꾸지뽕나무 열매 유래의 화합물을 유효성분으로 포함하는 피부미백용 화장료 조성물 - Google Patents
꾸지뽕나무 열매 유래의 화합물을 유효성분으로 포함하는 피부미백용 화장료 조성물 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명에서는 꾸지뽕나무 열매 유래의 화합물 또는 꾸지뽕나무 열매 분획물을 유효성분으로 포함하는 피부미백용 화장료 조성물이 개시된다.
본 발명에 따른 꾸지뽕나무 열매 유래의 화합물 또는 꾸지뽕나무 열매 분획물을 유효성분으로 포함하는 조성물은 현저히 증진된 피부미백 효과가 있어 화장료 조성물의 소재(첨가제)로 유용하다.
본 발명에 따른 화장료 조성물은 티로시나아제 활성을 저해하고, 멜라닌 합성을 저해하고, 멜라닌 합성 유전자의 발현을 저해하는 효과를 가져서 피부미백 용도로 안전하고 유용하게 사용될 수 있다.
본 발명에 따른 꾸지뽕나무 열매 유래의 화합물 또는 꾸지뽕나무 열매 분획물을 유효성분으로 포함하는 조성물은 현저히 증진된 피부미백 효과가 있어 화장료 조성물의 소재(첨가제)로 유용하다.
본 발명에 따른 화장료 조성물은 티로시나아제 활성을 저해하고, 멜라닌 합성을 저해하고, 멜라닌 합성 유전자의 발현을 저해하는 효과를 가져서 피부미백 용도로 안전하고 유용하게 사용될 수 있다.
Description
본 발명은 피부미백용 화장료 조성물에 관한 것으로, 더 상세하게는 꾸지뽕나무 열매 유래의 화합물을 유효성분으로 포함하는 피부미백용 화장료 조성물에 관한 것이다.
희고 고운 피부를 갖고자 하는 것은 모든 사람의 한결같은 소망이다. 사람의 피부색은 여러 원인 중 멜라닌이 결정적인 작용을 하는데, 멜라닌은 생체 고분자물질로 검은 색소와 단백질의 복합체이며 사람의 머리카락과 피부색을 이루는 색소 중의 하나이다.
멜라닌은 피부의 기초층(basal layer)에 존재하는 멜라닌세포(melanocyte)에 의해 합성되어, 세포질 돌기를 통해 각질형성세포(keratinocyte)로 전달된다. 표피에 존재하는 멜라닌은 자외선을 흡수하여 세포의 단백질이나 핵산의 손상을 방지하는 역할을 한다. 그러나, 멜라닌이 국소적으로 과도하게 합성되거나, 노화 등에 의해 피부의 생리기능이 떨어지게 되면, 멜라닌 생성과정에 이상이 생겨 기미, 주근깨, 검버섯 및 일광흑색증 등의 색소침착을 유발하게 된다. 상술한 멜라닌 합성의 주요인으로는, 유전, 호르몬의 불균형, 내분비 질환, 스트레스, 자외선 등이 해당하며, 특히 멜라닌세포 자극 호르몬(α-MSH), 자외선(ultraviolet B) 등은 일상생활에서 가장 노출되기 쉬운 내재적 또는 환경적 요인으로 알려져 있다.
피부의 색을 결정하는 멜라닌 생성에 대한 화학적 작용은 현재까지 여러 논문 등을 통해 많이 보고되고 있는데, 멜라닌 생성세포인 멜라닌세포(melanocyte)가 멜라노좀(melanosome)이라는 세포내 소기관 내에서 자외선으로부터 세포를 보호하는 기능을 가지는 멜라닌을 합성한 후, 상기 멜라닌은 멜라노사이트에서 각질형성세포(keratinocyte)로 이동하는 것으로 알려져 있으며, 이렇게 각질형성세포로 이동된 멜라닌이 피부색을 결정하는 것으로 보고되고 있다.
멜라닌 생합성 과정에서 필요한 전구물질은 티로신(tyrosine)이라는 아미노산으로, 이 티로신은 디히드록시페닐알라닌(dihydroxyphenylalanine, DOPA)으로 전환되고, 그 후 도파퀴논(dopaquinone)이라는 물질 등을 거쳐 최종적으로 멜라닌으로 전환된다고 알려져 있다.
이렇게 합성된 멜라닌은 피부색을 짙게 만드는데, 건강 또는 미용상의 요구로 인해 상기 멜라닌 합성을 저해하여 피부색을 밝게 하려는 피부 미백 방법에 관한 연구가 이루어지고 있다.
일반적인 알려진 미백 성분으로서, 코지산(Kojic acid), 알부틴(Arbutin) 등과 같은 티로시나아제 효소활성을 억제하는 물질이 있다. 이들은 멜라닌 색소의 생성을 저해함으로써, 피부톤을 밝게 하여 피부 미백을 실현할 수 있을 뿐만 아니라, 자외선, 호르몬 또는 유전에 기인한 기미나 주근깨 등의 피부 과색소 침착증의 개선이 가능하다. 그러나 피부 적용 시, 자극과 발적 등의 안전성의 문제로 사용량의 제한이 있다.
따라서 부작용은 적으면서도 안전성이 높은 천연물 유래의 대체 피부미백 활성을 갖는 소재의 개발이 요구되고 있다.
이에 본 발명자들은 종래 기술에서의 요구에 부응하기 위해 지속적으로 연구한 결과, 꾸지뽕나무 열매 유래의 특정 화합물 또는 이를 포함하는 꾸지뽕나무 열매 분획물이 놀랍게도 티로시나아제 활성 저해, 멜라닌 합성 저해 및 멜라닌 합성 유전자의 발현 저해 효과가 현저히 우수하여 피부미백용 화장료 조성물의 소재로서 유용하다는 것을 확인하여 본 발명을 완성하게 되었다.
따라서 본 발명의 목적은 꾸지뽕나무 열매 유래의 화합물을 유효성분으로 포함하는 피부미백용 화장료 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 꾸지뽕나무 열매 유래의 화합물을 유효성분으로 포함하는 피부미백용 의약외품 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 꾸지뽕나무 열매 분획물을 유효성분으로 포함하는 피부미백용 화장료 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 꾸지뽕나무 열매 분획물을 유효성분으로 포함하는 피부미백용 의약외품 조성물을 제공하는 것이다.
상기 본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 꾸지뽕나무 열매 유래의 화합물을 유효성분으로 포함하는 피부미백용 화장료 조성물을 제공한다.
꾸지뽕나무 (Cudrania tricuspidata B.)는 뽕나무과에 속하는 낙엽성 소교목 또는 관목으로서 우리나라, 중국, 일본 등지에 자생하는 식물이다. 꾸지뽕나무 잎은 한방에서 습진, 유행성 이하선염, 당뇨, 만성요퇴통, 타박상 등의 치료에 사용되며, 줄기는 주로 부인들의 붕중과 혈결의 치료에, 열매는 청열과 양혈을 다스리는 데 이용되고 있는 것으로 알려져 있다. 또한 민간에서 열매는 강장, 중풍, 이뇨 및 진해 등의 치료약으로 이용되어 왔다. 그러나, 꾸지뽕나무 열매 유래의 화합물과 분획물의 피부미백 효과는 알려진 바 없다.
본 발명에서 꾸지뽕나무 열매 유래의 화합물은 하기 화학식 1의 구조를 갖는 화합물(화합물 1)일 수 있다:
C15H10O6
본 발명에서 유효성분인 상기 화합물은 꾸지뽕나무의 열매를 유기 용매를 사용하여 추출하여 얻은 추출물을 추가로 비극성 용매로 분획하여 분획물을 얻은 후, 분획물을 액체크로마토그래피를 통하여 분리할 수 있다. 일례로서 꾸지뽕나무 열매를 메탄올을 사용하여 추출하고 감압농축한 조추출물을 메탄올에 현탁한 후 헥산, 클로로포름, 에틸아세테이트 순서로 용매 분획하여 감압농축하여 얻은 분획물 중에서 에틸아세테이트 분획물을 분취용 액체크로마토그래피를 실시하여 14개의 소분획물을 얻고, 4번째 소분획물에서 컬럼크로마토그래피를 통하여 화합물 1(Comp.1)를 분리할 수 있다 (도 1).
본 발명의 또 다른 목적에 따라서, 꾸지뽕나무 열매 분획물을 유효성분으로 포함하는 피부미백용 화장료 조성물을 제공한다.
본 발명에서, 꾸지뽕나무 열매 분획물은 꾸지뽕나무 열매의 용매 추출물을 추가적으로 분획(fractionation)한 분획 추출물을 의미한다.
본 발명에서, 꾸지뽕나무 열매 분획물은 꾸지뽕나무 열매를 용매를 사용하여 추출한 추출물을 추가로 비극성 용매로 분획한 분획물을 사용할 수 있다. 바람직하게는 꾸지뽕나무 열매 분획물은 꾸지뽕나무 열매를 메탄올로 추출한 추출물의 에틸아세테이트 분획물이다.
본 발명에서 꾸지뽕나무 열매 분획물은 동결 건조 또는 분무 건조 등과 같은 추가적인 과정에 의해 분말 상태로 제조될 수도 있다.
본 발명에 따른 조성물은 티로시나아제 저해활성, 멜라닌 합성 저해활성, 멜라닌 합성 유전자 (TYR, TRP2, MITF 및 MLPH) 발현의 저해활성이 우수하다 (도 2 내지 도 5).
본 발명의 화장료 조성물은 유연 화장수 또는 영양 화장수 등과 같은 화장수, 훼이셜 로션, 바디로션 등과 같은 유액, 영양 크림, 수분 크림, 아이 크림 등과 같은 크림, 에센스, 화장연고, 스프레이, 젤, 팩, 선 스크린, 메이크업 베이스, 액체 타입, 고체 타입 또는 스프레이 타입 등의 파운데이션, 파우더, 클렌징 크림, 클렌징 로션, 클렌징 오일과 같은 메이크업 제거제, 클렌징 폼, 비누, 바디 워쉬, 물휴지 등과 같은 세정제 등의 제형을 가질 수 있다.
상기 화장료 조성물은 상기 화학식 1의 화합물 또는 꾸지뽕나무 열매 분획물에 추가로 지방 물질, 유기 용매, 용해제, 농축제 및 겔화제, 연화제, 항산화제, 현탁화제, 안정화제, 발포제(foaming agent), 방향제, 계면활성제, 물, 이온형 또는 비이온형 유화제, 충전제, 금속이온봉쇄제 및 킬레이트화제, 보존제, 비타민, 차단제, 습윤화제, 필수 오일, 염료, 안료, 친수성 또는 친유성 활성제, 지질 소낭 또는 화장품에 통상적으로 사용되는 임의의 다른 성분과 같은 화장품학 분야에서 통상적으로 사용되는 보조제를 함유할 수 있다.
본 발명의 화장료 조성물은 유효성분인 화학식 1의 화합물 또는 꾸지뽕나무 열매 분획물을 전체 조성물 중량에 대하여 0.01 내지 10 중량%로 포함할 수 있다. 본 발명의 화장료 조성물에 상기 유효성분이 0.01 중량% 미만으로 포함할 경우에는 충분한 피부미백 효과를 기대할 수 없고, 10 중량%를 초과하여 포함할 경우에는 제조비용이 높아질 수 있다.
본 발명에 따른 화장료 조성물은 피부미백 효과가 우수하다 (도 2 내지 도 5).
본 발명의 또 다른 목적에 따라서, 화학식 1의 화합물을 유효성분으로 포함하는 피부미백용 의약외품 조성물을 제공한다.
본 발명의 또 다른 목적에 따라서, 꾸지뽕나무 열매 분획물을 유효성분으로 포함하는 피부미백용 의약외품 조성물을 제공한다.
본 발명에서 '의약외품'은 사람이나 동물의 질병을 진단, 치료, 개선, 경감, 처치 또는 예방할 목적으로 사용되는 물품들 중 의약품보다 작용이 경미한 물품들을 의미한다. 예를 들어, 약사법에 따른 의약외품은 의약품의 용도로 사용되는 물품을 제외한 것으로, 사람/동물의 질병 치료나 예방에 쓰이는 제품, 인체에 대한 작용이 경미하거나 직접 작용하지 않는 제품 등이 포함된다.
본 발명에 따른 유효성분인 화학식 1의 화합물 또는 꾸지뽕나무 열매 분획물을 의약외품 첨가물로 사용할 경우, 상기 조성물을 그대로 첨가하거나 다른 의약외품 또는 의약외품 성분과 함께 사용할 수 있고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용할 수 있다. 유효성분의 혼합량은 사용 목적(예방, 건강 또는 치료적 처치)에 따라 적합하게 결정될 수 있다.
본 발명의 의약외품 조성물에는 상기 성분 외에 필요에 따라 약학적으로 허용 가능한 담체, 부형제 또는 희석제를 더 포함할 수 있다
상기 '약학적으로 허용 가능한 담체'는 생물체를 자극하지 않으면서, 주입되는 화합물의 생물학적 활성 및 특성을 저해하지 않는 담체, 부형제 또는 희석제를 의미할 수 있으며, 구체적으로, 비자연적 담체(non-naturally occuring carrier)일 수 있다. 본 발명에 사용 가능한 상기 담체의 종류는 특별히 제한되지 아니하며 당해 기술분야에서 통상적으로 사용되고 약학적으로 허용되는 담체라면 어느 것이든 사용할 수 있다.
약학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 상기 조성물은 특별히 제한 되지 않으나, 구체적으로 연고제, 로션제, 스프레이제, 패취제, 크림제, 산제, 현탁제, 겔제 또는 젤의 형태로 제조되어 사용될 수 있다
본 발명에 따른 꾸지뽕나무 열매 유래의 화합물 또는 꾸지뽕나무 열매 분획물을 유효성분으로 포함하는 조성물은 현저히 증진된 피부미백 효과가 있어 화장료 조성물의 소재(첨가제)로 유용하다.
본 발명에 따른 화장료 조성물은 티로시나아제 활성을 저해하고, 멜라닌 합성을 저해하고, 멜라닌 합성 유전자의 발현을 저해하는 효과를 가져서, 피부미백 용도로 안전하고 유용하게 사용될 수 있다.
도 1은 본 발명에 따른 꾸지뽕나무 열매 유래의 화합물들의 분리 공정도의 일례이다.
도 2는 본 발명에 따른 조성물의 티로시나아제 저해활성을 분석한 결과 그래프이다. 기질로는 L-DOPA(L-3,4-dihydroxy-L-phenylalanine) 사용, 본 발명에 따른 조성물 처리군 (#5) 및 약물을 처리하지 않은 대조군(CTL)
도 3은 인간 흑색종 세포주에서 본 발명에 따른 조성물의 멜라닌 합성 저해활성 분석 결과를 보여주는 펠렛 사진 (위)과 결과 그래프 (아래)이다. 본 발명에 따른 조성물 처리군 (#5) 및 약물을 처리하지 않은 대조군(CTL)
도 4는 리포터 아데노바이러스를 이용하여 본 발명에 따른 조성물의 멜라닌 합성 유전자 (TYR, TRP2, MITF 및 MLPH)의 발현 저해활성을 분석한 결과 그래프이다. 본 발명에 따른 조성물 처리군 (#5), 약물을 처리하지 않은 대조군 (Only virus), 및 참조군 (CTL)
도 5는 α-MSH 이용하여 본 발명에 따른 조성물의 멜라닌 합성유전자 (TYR, TRP2, MITF 및 MLPH) 발현 저해활성을 분석한 결과 그래프이다. 유전자 과발현 및 α-MSH 처리후 본 발명에 따른 조성물 처리군 (#5), 유전자 과발현 및 α-MSH 처리 대조군(α-MSH_virus), 유전자 과발현, α-MSH 미처리 및 약물 비처리 대조군 (virus), 유전자 과발현없는 참조군 (CTL)
도 2는 본 발명에 따른 조성물의 티로시나아제 저해활성을 분석한 결과 그래프이다. 기질로는 L-DOPA(L-3,4-dihydroxy-L-phenylalanine) 사용, 본 발명에 따른 조성물 처리군 (#5) 및 약물을 처리하지 않은 대조군(CTL)
도 3은 인간 흑색종 세포주에서 본 발명에 따른 조성물의 멜라닌 합성 저해활성 분석 결과를 보여주는 펠렛 사진 (위)과 결과 그래프 (아래)이다. 본 발명에 따른 조성물 처리군 (#5) 및 약물을 처리하지 않은 대조군(CTL)
도 4는 리포터 아데노바이러스를 이용하여 본 발명에 따른 조성물의 멜라닌 합성 유전자 (TYR, TRP2, MITF 및 MLPH)의 발현 저해활성을 분석한 결과 그래프이다. 본 발명에 따른 조성물 처리군 (#5), 약물을 처리하지 않은 대조군 (Only virus), 및 참조군 (CTL)
도 5는 α-MSH 이용하여 본 발명에 따른 조성물의 멜라닌 합성유전자 (TYR, TRP2, MITF 및 MLPH) 발현 저해활성을 분석한 결과 그래프이다. 유전자 과발현 및 α-MSH 처리후 본 발명에 따른 조성물 처리군 (#5), 유전자 과발현 및 α-MSH 처리 대조군(α-MSH_virus), 유전자 과발현, α-MSH 미처리 및 약물 비처리 대조군 (virus), 유전자 과발현없는 참조군 (CTL)
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 구체적인 실시예를 통하여 본 발명의 구성 및 효과를 보다 상세히 설명하기로 한다. 그러나 하기 실시예는 본 발명을 보다 명확하게 이해시키기 위하여 예시한 것일 뿐이며, 본 발명의 권리범위가 하기 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.
제조예 1: 꾸지뽕나무 열매로부터 화합물 1의 분리
산청 및 진주에서 재배되고 있는 꾸지뽕나무 열매를 수확하고 건조하여 7 kg의 건조중량을 얻었고 이 꾸지뽕나무 열매를 90% 메탄올 20 L를 이용하여 침지 추출을 3반복 실시한 후, 추출된 용액(추출액)을 No.2 종이필터를 이용하여 여과하였으며 대형회전감압농축를 이용하여 농축하여 약 1.09 kg의 조추출물을 얻었다.
상기 조추출물 300 g을 5% 메탄올 1 L에 현탁시킨 후 헥산, 크로로포름, 에틸아세테이트, 물(H2O) 층으로 용매 분획을 반복 시행하여 분획물들을 모은 후 회전감압농축기를 이용하여 감압여과 및 농축 후 동결건조를 통해 활성물질 다수가 확인된 에틸아세테이트 분획물 35g을 ODS-25 (YMC-DispoPack AT) 40 g 칼럼을 이용한 분취용 액체크로마토그래피를 실시하였으며, 시료는 한번에 1 g 씩 나눠서 주입하였고, 10% 메탄올부터 100% 메탄올로 기울기용리 조건으로 반복 시행하여 14개의 소분획물(분획물 E1 - E14)을 얻었다. 소분획물 E4로부터 sephadex LH-20 칼럼크로마토그래피를 통해 Comp.1 화합물(화합물 1)을 얻었다 (도 1).
분리된 화합물 1을 핵자기공명분광기(300MHz, 500MHz FT-NMR spectrometer,Bruker)와 고분해능질량분석기(High Resolution Mass Spectrometer(EI),JMS-700(Jeol))를 사용하여 화합물을 확인하였고 다음과 같이 구조식, 분자량이 확인되었다:
소분획물 E8로부터 Kinetex 5μ Biphenyl 100 (250 × 21.2 ㎜) 칼럼을 이용한 분취용 액체크로마토그래피를 실시하여 화합물(Comp.) 2, 화합물 3, 화합물 4를 얻었고, 화합물 7은 소분획물 E9의 재결정을 통해 얻었으며, 소분획물 E9로부터 Kinetex 5μ Biphenyl 100 (250 × 21.2 ㎜) 칼럼을 이용한 분취용 액체크로마토그래피와 sephadex LH-20 칼럼크로마토그래피를 통해 화합물 5, 6, 8, 9, 10을 얻었다 (도 1).
화합물 1(#5), 화합물 5(#1), 화합물 7(#2), 화합물8(#3), 화합물10(#4), 화합물2(#6)를 각각 메틸술폭사이드 (DMSO)에 20 ㎍/ml 농도로 희석하여 시료로 사용하여 하기 활성 분석을 수행하였다.
시험예 1: 티로시나아제 저해활성 분석
미백효능 평가 시험의 대표적 방법인 티로시나아제 저해활성을 측정을 하기와 같이 수행하였다.
기질로는 L-DOPA((L-3,4-dihydroxy-L-phenylalanine)을 사용하였는데, L-DOPA은 티로신이 티로신수산화효소에 의해 변환되는 도파민의 전구물질이며, 티로신은 단백질을 구성하는 아미노산의 일종으로 멜라닌 합성에 필요한 전구체로 잘 알려져 있다. 티로시나아제는 복합효소로 티로신을 L-DOPA로 전화시키고 이어서 L-DOPA를 L-DOPA 퀴논(quinone)으로 산화시킨다.
제조예 1에서 분리된 각각의 화합물 1(#5)과 나머지 화합물들을 각각 메틸술폭사이드 (DMSO)에 20 ㎍/ml 농도로 희석하여 시료로 사용하였고, 티로시나아제 저해활성이 잘 알려진 표준물질로는 알부틴 (A) 400 ㎍/ml과 코지산 (K) 5 mM를 사용하였다.
96-웰 플레이트에 50 mM 인산염 완충액 140 ㎕/well 씩 넣고, 시료 또는 표준물질 20 ㎕, L-DOPA 30 ㎕, mushroom tyrosinase 10 ㎕ 를 순서대로 넣고 섞어 37℃에서 15분간 반응시킨 후 분광광도계를 사용하여 490 nm에서 흡광도를 측정하여 얻은 값을 표 1의 식에 대입하여 저해활성을 산출하여 그 결과를 도 2에 나타냈다.
| Tyrosinase 활성 (%) = (B-B＇)/(A-A＇)×100 A: L-DOPA + tyrosinase 만의 흡광도 A＇: buffer + tyrosinase만의 흡광도 B: 시료+ L-DOPA + tyrosinase만의 흡광도 B＇:시료 + buffer + tyrosinase만의 흡광도 |
도 2에 도시된 바와 같이, L-DOPA를 기질로 사용한 티로시나아제 저해활성 시험에서, 본 발명에 따른 유효성분인 화합물 1(#5)은 표준물질인 코지산 (K)과 유사한 현저히 우수한 미백효과를 나타냈다.
시험예 2. 인간 흑색종 세포주에서 멜라닌 합성 저해활성 분석
HM3KO 세포는 사람 피부 흑색종 세포주로서 인비트로(in vitro) 상에서 미백 효능 평가를 위해 많이 사용되어 왔으며, 본 발명에서는 제조예에서 제조된 시료를 처리한 후, 펠렛(pellet) 색깔과 멜라닌 함량을 평가함으로써 본 발명에 따른 조성물의 미백 효과를 확인하였다.
HM3KO 세포는 90% MEM, 10% FBS, 100 unit/ml의 페니실린과 스트렙토마이신(PS)이 첨가된 성장배지를 포함하는 100 mm dish에 1×106 cell/dish로 접종하여 37 ℃, CO2 배양기에서 24시간 동안 배양 후, 미백 효과를 확인하기 위해 시료를 20 ㎍/ml 농도로 HM3KO세포 배지에 함께 처리한 후 48시간 동안 배양하였다.
멜라닌 합성 저해활성을 비교하기 위해, 미백 표준물질로 잘 알려진 알부틴 및 코지산을 각각 500 ㎍/ml 및 600 μM 농도로 상기와 같이 배양된 HM3KO 세포에 처리한 후 48시간 동안 배양하였다.
처리가 완료된 100 mm dish의 배지를 모두 제거한 뒤, 5 ml의 PBS로 2회 수세하고 trypLE 완충액으로 세포를 회수하여 이-튜브(e-tube)로 옮긴 후 10분간 원심분리(12,000 × g, 4℃)를 실시하였다. 펠렛 색상 (HM3KO 세포내 멜라닌 색소)을 확인하기 위해 상층액을 제거하여 PBS 용액으로 한 번 더 수세한 후 10분간 원심분리(12,000 × g, 4℃)하여 상층액을 제거한 후 펠렛 색상을 디지털 카메라로 촬영하여 비교하였고, 그 결과를 도 3에 나타냈다.
또한 상층액을 제거한 펠렛에 0.5 M NaOH를 500 ㎕ 씩 주입한 후 교반기로 섞어 37℃에서 24시간 동안 정치시킨 후, 80℃에서 1시간 동안 가열하여 96웰 플레이트에 펠렛 용액을 200 ㎕씩 2번 주입 후 마이크로리더를 이용하여 400nm에서 흡광도를 측정하여 세포 펠렛 내의 멜라닌 함량을 측정하였고 그 결과를 도 3에 나타냈다.
도 3에 도시된 사진에 의하면, 본 발명에 따른 조성물을 처리한 경우는 펠렛의 색깔이 표준물질인 알부틴 및 코지산을 처리한 경우에 비하여도 더 옅어진 것을 확인할 수 있다.
또한 도 3에 도시된 그래프에 의하면, 본 발명에 따른 조성물을 처리한 경우는 세포내 멜라닌 함량이 알부틴 및 코지산을 처리한 경우에 비하여도 더 감소하였음을 확인할 수 있다.
따라서 본 발명에 따른 조성물은 멜라닌 합성 저해활성이 우수함을 알 수 있다,
시험예 3. 멜라닌 합성 유전자 발현 저해활성 분석
멜라닌 합성에 중요한 역할을 하는 유전자로 알려진 TYR, TRP2, MITF 및 MLPH의 네 가지 유전자의 발현을 조절하는 각 프로모터에 리포터로 루시퍼라제를 발현하는 아데노바이러스 (리포터 아데노바이러스)를 제조하여, 프로모터 분석을 수행하여 본 발명에 따른 조성물이 세포 내에서 상기 유전자들의 mRNA 전사 단계에서 조절 여부 (유전자 발현 저해)를 확인하였다.
구체적으로는 HM3KO 세포주를 24-웰 플레이트에 1×105 cell/well로 접종하여 37℃, CO2 배양기에서 24시간 배양 후, 상기에서 제조한 리포터 아데노바이러스를 접종하여 24시간 배양한 후 상층액을 제거하고, 제조예에서 제조한 시료를 처리한 후 24시간 배양한 후, 각 웰에 CCK-8을 첨가하고 2시간 반응 후 마이크로플레이트 리더를 이용하여 450 nm에서 흡광도를 측정하고 무처리군을 100%로 하여 세포생존율을 계산하였다.
프로모터 활성 억제능을 확인하기 위해 HM3KO 세포주를 웰 플레이트에 1×105 cell/well로 접종하여 37℃, CO2 배양기에서 24시간 배양 후, MLPH와 TRP2 리포터 아데노바이러스는 0.75%, MITF와 TYR리포터 아데노바이러스는 7.5%의 농도로 24시간 처리한 후 상층액을 제거한 후, 제조예에서 제조한 시료를 24시간 처리하거나 (도 4), 또는 50mM a-MSH와 제조예에서 제조한 시료를 24시간 처리하였다 (도 5).
그리고 나서 루시퍼라제 분석시스템 키트를 사용하여 다음과 같이 루시퍼라제의 활성 정도를 측정하였다: 시료를 처리한 세포를 회수하기 위해 상층액을 제거한 후 증류수를 이용하여 희석된 루시퍼라제 세포 배양 용해 시약(CCLR)을 200㎕ 씩 주입한 후 상온에서 5분간 잘 희석하여 세포를 용해시켰다. 세포 용액을 이-튜브로 옮긴 후 더 효과적으로 세포를 용해시키기 위해 딥 프리저(deep freezer)에서 약 30분간 냉동 후 해동시켜 세포 내에서 추출된 루시퍼라제만 기질과 반응시키기 위해 10분간 원심분리(13,000 × g, 4℃)하여 펠렛을 분리시키고 상층액을 새로운 이-튜브로 옮겼다. 그리고 나서 불투명한 하얀색 96-웰 플레이트에 상층액을 150 ㎕씩 주입하고완충액에 용해된 루시퍼라제 분석 기질을 25㎕씩 넣어서 Glomax 다중 검출 장비를 이용하여 발광도를 측정하였고, 그 결과를 도 4 및 도 5에 나타냈다.
도 4에 도시된 바와 같이, 본 발명에 따른 조성물 (#5)을 처리한 경우는, 무처리구(only virus)에 비교하여 보면, 멜라닌 합성에 관여하는 유전자인 TYR, TRP2, MITF 및 MLPH 유전자의 발현을 모두 현저히 억제하였다는 것을 확인할 수 있다. 따라서 본 발명에 따른 조성물은 뛰어난 피부미백 효과가 있을 것으로 예상된다.
도 5에 나타낸 바와 같이, 멜라닌세포 자극 호르몬(α-MSH)과 본 발명에 따른 조성물 (#5)을 처리한 경우도 멜라닌 합성에 관여하는 유전자인 TYR, TRP2 및 MITF 유전자의 발현이 억제되었다는 것을 확인할 수 있다. 따라서 본 발명에 따른 조성물은 뛰어난 피부미백 효과가 있을 것으로 예상된다.
Claims (8)
- 꾸지뽕나무 열매 유래의 화합물을 유효성분으로 포함하는 피부미백용 화장료 조성물로,
상기 화합물은 하기 화학식 1의 구조를 갖는 화합물인 것인 조성물:
[화학식 1].
- 제 1항에 있어서, 상기 조성물은 티로시나아제의 활성 및 멜라닌 합성을 저해하는 것을 특징으로 하는 피부미백용 화장료 조성물.
- 제 1항에 있어서, 상기 조성물은 멜라닌 합성 유전자의 발현을 저해하는 것을 특징으로 하는 피부미백용 화장료 조성물.
- 제 1항에 있어서, 상기 화장료 조성물은 화장수, 훼이셜 로션, 바디로션, 영양 크림, 수분 크림, 아이 크림, 에센스, 화장연고, 스프레이, 젤, 팩, 선 스크린, 메이크업 베이스, 파운데이션, 파우더, 클렌징 크림, 클렌징 로션, 클렌징 오일, 클렌징 폼, 비누, 바디 워쉬, 및 물휴지로 구성되는 군으로부터 선택되는 어느 하나의 제형인 것을 특징으로 하는 피부미백용 화장료 조성물.
- 꾸지뽕나무 열매 유래의 화합물을 유효성분으로 포함하는 피부미백용 의약외품 조성물로,
상기 화합물은 하기 화학식 1의 구조를 갖는 화합물인 것인 조성물:
[화학식 1].
- 꾸지뽕나무 열매 분획물을 유효성분으로 포함하는 피부미백용 화장료 조성물로,
상기 분획물은 꾸지뽕나무 열매의 에틸아세테이트 분획물인 것인 조성물.
- 제 6항에 있어서, 상기 화장료 조성물은 화장수, 훼이셜 로션, 바디로션, 영양 크림, 수분 크림, 아이 크림, 에센스, 화장연고, 스프레이, 젤, 팩, 선 스크린, 메이크업 베이스, 파운데이션, 파우더, 클렌징 크림, 클렌징 로션, 클렌징 오일, 클렌징 폼, 비누, 바디 워쉬, 및 물휴지로 구성되는 군으로부터 선택되는 어느 하나의 제형인 것을 특징으로 하는 피부미백용 화장료 조성물.
- 꾸지뽕나무 열매 분획물을 유효성분으로 포함하는 피부미백용 의약외품 조성물로,
상기 분획물은 꾸지뽕나무 열매의 에틸아세테이트 분획물인 것인 조성물.
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| KR1020210086948A KR20230006133A (ko) | 2021-07-02 | 2021-07-02 | 꾸지뽕나무 열매 유래의 화합물을 유효성분으로 포함하는 피부미백용 화장료 조성물 |
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|---|---|---|---|---|
| KR101045031B1 (ko) | 2008-10-14 | 2011-06-30 | 한국 한의학 연구원 | 꾸지뽕나무 열매 추출물을 함유하는 면역기능 강화용 조성물 |
| KR20150124140A (ko) | 2014-04-28 | 2015-11-05 | 대한민국(산림청 국립산림과학원장) | 뇌질환 예방 또는 치료용 조성물 및 꾸지뽕나무 유래의 신규 화합물 |
-
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- 2021-07-02 KR KR1020210086948A patent/KR20230006133A/ko not_active Application Discontinuation
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