KR20230006131A - 피부미백용 화장료 조성물 - Google Patents

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KR20230006131A
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윤태진
하영술
신승미
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정원민
길영숙
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재단법인 경남한방항노화연구원
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Abstract

본 발명에서는 접골목 줄기 추출물을 유효성분으로 포함하는 피부미백용 화장료 조성물이 개시된다. 접골목 줄기를 특정 용매로 추출하여 제조된 본 발명에 따른 추출물은 현저히 증진된 피부미백 효과가 있어 화장료 조성물의 소재(첨가제)로 유용하다.
본 발명에 따른 화장료 조성물은 티로시나아제 활성을 저해하고, 멜라닌 합성을 저해하고, 멜라닌 합성 유전자의 발현을 저해하는 효과를 가지면서도, 세포독성과 같은 부작용 없으므로, 피부미백 용도로 안전하고 유용하게 사용될 수 있다.

Description

피부미백용 화장료 조성물 {Cosmetic composition having skin whitening effect}
본 발명은 피부미백용 화장료 조성물에 관한 것으로, 더 상세하게는 접골목 줄기 추출물을 유효성분으로 포함하는 피부미백용 화장료 조성물에 관한 것이다.
희고 고운 피부를 갖고자 하는 것은 모든 사람의 한결같은 소망이다. 사람의 피부색은 여러 원인 중 멜라닌이 결정적인 작용을 하는데, 멜라닌은 생체 고분자물질로 검은 색소와 단백질의 복합체이며 사람의 머리카락과 피부색을 이루는 색소 중의 하나이다.
멜라닌은 피부의 기초층(basal layer)에 존재하는 멜라닌세포(melanocyte)에 의해 합성되어, 세포질 돌기를 통해 각질형성세포(keratinocyte)로 전달된다. 표피에 존재하는 멜라닌은 자외선을 흡수하여 세포의 단백질이나 핵산의 손상을 방지하는 역할을 한다. 그러나 멜라닌이 국소적으로 과도하게 합성되거나, 노화 등에 의해 피부의 생리기능이 떨어지게 되면, 멜라닌 생성과정에 이상이 생겨 기미, 주근깨, 검버섯 및 일광흑색증 등의 색소침착을 유발하게 된다. 상술한 멜라닌 합성의 주요인으로는, 유전, 호르몬의 불균형, 내분비 질환, 스트레스, 자외선 등이 해당하며, 특히 멜라닌세포 자극 호르몬(α-MSH), 자외선(ultraviolet B) 등은 일상생활에서 가장 노출되기 쉬운 내재적 또는 환경적 요인으로 알려져 있다.
피부의 색을 결정하는 멜라닌 생성에 대한 화학적 작용은 현재까지 여러 논문 등을 통해 많이 보고되고 있는데, 멜라닌 생성세포인 멜라닌세포(melanocyte)가 멜라노좀(melanosome)이라는 세포내 소기관 내에서 자외선으로부터 세포를 보호하는 기능을 가지는 멜라닌을 합성한 후, 상기 멜라닌은 멜라노사이트에서 각질형성세포(keratinocyte)로 이동하는 것으로 알려져 있으며, 이렇게 각질형성세포로 이동된 멜라닌이 피부색을 결정하는 것으로 보고되고 있다.
멜라닌 생합성 과정에서 필요한 전구물질은 티로신(tyrosine)이라는 아미노산으로, 이 티로신은 디히드록시페닐알라닌(dihydroxyphenylalanine, DOPA)으로 전환되고, 그 후 도파퀴논(dopaquinone)이라는 물질 등을 거쳐 최종적으로 멜라닌으로 전환된다고 알려져 있다.
이렇게 합성된 멜라닌은 피부색을 짙게 만드는데, 건강 또는 미용상의 요구로 인해 상기 멜라닌 합성을 저해하여 피부색을 밝게 하려는 피부 미백 방법에 관한 연구가 이루어지고 있다.
일반적인 알려진 미백 성분으로서, 코지산(Kojic acid), 알부틴(Arbutin) 등과 같은 티로시나아제 효소활성을 억제하는 물질이 있다. 이들은 멜라닌 색소의 생성을 저해함으로써, 피부톤을 밝게 하여 피부 미백을 실현할 수 있을 뿐만 아니라, 자외선, 호르몬 또는 유전에 기인한 기미나 주근깨 등의 피부 과색소 침착증의 개선이 가능하다. 그러나 피부 적용 시, 자극과 발적 등의 안전성의 문제로 사용량의 제한이 있다.
따라서 천연물 유래로 생체에 안전하고 피부미백 활성을 갖는 조성물의 개발이 절실히 요구되고 있다.
공개특허 10-2016-0135039호 등록특허 10-2022983호
이에 본 발명자들은 종래 기술의 요구에 부응하기 위한 연구를 지속한 결과, 접골목 줄기 추출물이 놀랍게도 티로시나아제 활성 저해, 멜라닌 합성 저해 및 멜라닌 합성 유전자 발현 저해 효과가 현저히 우수하면서도 세포독성의 부작용도 없어서 피부미백용 조성물로서 유용하다는 것을 확인하여 본 발명을 완성하게 되었다.
따라서 본 발명의 목적은 접골목 줄기 추출물을 유효성분으로 포함하는 피부미백용 화장료 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 접골목 줄기 추출물을 유효성분으로 포함하는 피부미백용 의약외품 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 접골목 줄기 추출물을 유효성분으로 포함하는 멜라닌 합성 저해용 조성물을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 접골목 줄기 추출물을 유효성분으로 포함하는 피부미백용 화장료 조성물을 제공한다.
접골목 (Sambucus williamsii var.)은 인동과 식물로 딱총나무속에 속하며 산지와 골짜기, 볕이 잘드는 산비탈에 서식한다. 유럽, 미국, 중국, 한국 등 전세계에 약 20여종이 있으며 우리나라는 제주도를 제외한 전국 각지에서 자생하고 있다. 키는 2∼3미터쯤 자라고 줄기는 뿌리 부분에서 사방으로 뻗는다. 성장이 빠르고 새로 돋는 줄기는 녹색이다가 자라면서 다갈색으로 바뀐다. 줄기 가운데 굵고 부드러운 연한 갈색의 심이 있다. 잎은 마주나고 홀수깃겹잎으로 쪽잎은 넓은 화원 꼴 또는 달걀 모양이며 6∼10개가 달린다. 4월 하순 무렵에 가지 끝에 연한 녹색을 띤 흰 꽃들이 모여서 핀다. 열매는 8~9월에 빨갛게 익는다. 아무 때나 줄기를 잘라 그늘에서 말려 잘게 썰어서 약으로 쓴다.
접골목은 부러진 뼈를 붙이는 효능이 뛰어나다. 뼈가 부러지거나 베었을 때, 타박상이나 골절, 소변을 잘 나오게 하고, 혈액순환을 좋게 하며 통증을 멎게 하는 효능이 있다. 손발 삔 데, 타박상, 골절, 관절염, 신경통, 부종, 소변을 잘 못 보는 데, 통풍, 신장염, 신경쇠약, 구내염, 인후염, 산후빈혈, 황달 등의 질병에 효과가 알려져 있으나, 접골목 줄기의 피부미백 효과는 알려진 바 없다.
본 발명에서, '피부미백'이라 함은 멜라닌 색소의 생성을 저해함으로써 피부 톤을 밝게 할 뿐만 아니라, 자외선, 호르몬 또는 유전에 기인한 기미나 주근깨 등의 피부 과색소 침착을 개선하는 것을 말한다.
본 발명에서, '추출물'은 접골목 줄기를 용매에 침지한 다음, 상온, 저온 또는 가온 상태에서 일정시간 동안 추출하여 수득한 액상성분, 상기 액상성분으로부터 용매를 제거하여 수득한 고형분 등의 결과물을 의미한다. 뿐만 아니라, 상기 결과물에 더하여, 상기 결과물의 희석액, 이들의 농축액, 이들의 조정제물, 정제물 등을 모두 포함하는 것으로 포괄적으로 해석될 수 있다. 또한 추출물은 조추출물(crude extract)과, 조추출물을 추가적으로 분획(fractionation)한 분획추출물도 포함한다.
본 발명에서, 접골목 줄기 추출물은 용매 추출법 또는 분획 추출법을 이용하여 얻을 수 있다. 바람직하게는 접골목 줄기 추출물로는 접골목 줄기를 메탄올 또는 에탄올을 사용하여 추출한 메탄올 또는 에탄올 추출물을 사용하거나, 이 메탄올 또는 에탄올 추출물을 추가로 헥산, 클로로포름 등의 용매로 분획한 분획추출물을 사용할 수 있다.
본 발명에서 추출물은 정제과정을 추가 적용하여 얻은 것도 포함한다. 또한 본 발명에서 추출물은 감압 증류 및 동결 건조 또는 분무 건조 등과 같은 추가적인 과정에 의해 분말 상태로 제조될 수도 있다.
본 발명에서 접골목 줄기는 100 메쉬 이상의 분말로 제조하여 사용하는 것이 바람직하다.
본 발명에서 추출은 바람직하게는 접골목 줄기의 분말 전체 용량 대비 5 ~ 10배의 용량으로 추출용매를 첨가하여 실온에서 24 ~ 72 시간의 추출한 후 여과하여 수행한다.
본 발명에서 추출용매로는 50~70% 메탄올 또는 50~70% 에탄올을 사용하는 것이 바람직하며, 가장 바람직하게는 50% 메탄올을 사용한다. 추출용매로서 메탄올 또는 에탄올의 농도가 상기 범위를 벗어나면 티로시나아제 저해활성 및 멜라닌 합성 저해활성이 떨어질 수 있다.
상기와 같은 조건의 본 발명에 따른 추출시 티로시나아제 저해활성, 멜라닌 합성 저해활성 및 멜라닌 합성 유전자의 발현 저해활성 (미백 활성)이 현저히 증진된다.
본 발명의 접골목 줄기 추출물의 티로시나아제 저해활성이 100% 이상이며 (도 1), 멜라닌 합성 저해활성(490nm에서 흡광도)이 0.15 이하이다 (도 3).
본 발명의 접골목 줄기 추출물은 멜라닌 합성 유전자 (TYR, TRP2, MITF 및 MLPH) 발현의 저해활성이 우수하다 (도 4 및 도 5).
본 발명의 접골목 줄기 추출물은 고농도(1,000ppm)에서도 세포독성이 없어 안전하다 (도 6).
본 발명의 화장료 조성물은 유연 화장수 또는 영양 화장수 등과 같은 화장수, 훼이셜 로션, 바디로션 등과 같은 유액, 영양 크림, 수분 크림, 아이 크림 등과 같은 크림, 에센스, 화장연고, 스프레이, 젤, 팩, 선 스크린, 메이크업 베이스, 액체 타입, 고체 타입 또는 스프레이 타입 등의 파운데이션, 파우더, 클렌징 크림, 클렌징 로션, 클렌징 오일과 같은 메이크업 제거제, 클렌징 폼, 비누, 바디 워쉬, 물휴지 등과 같은 세정제 등의 제형을 가질 수 있다.
상기 화장료 조성물은 상기 접골목 줄기 추출물에 추가로 지방 물질, 유기 용매, 용해제, 농축제 및 겔화제, 연화제, 항산화제, 현탁화제, 안정화제, 발포제(foaming agent), 방향제, 계면활성제, 물, 이온형 또는 비이온형 유화제, 충전제, 금속이온봉쇄제 및 킬레이트화제, 보존제, 비타민, 차단제, 습윤화제, 필수 오일, 염료, 안료, 친수성 또는 친유성 활성제, 지질 소낭 또는 화장품에 통상적으로 사용되는 임의의 다른 성분과 같은 화장품학 분야에서 통상적으로 사용되는 보조제를 함유할 수 있다.
본 발명의 화장료 조성물은 상기 접골목 줄기 추출물을 전체 조성물 중량에 대하여 0.1 내지 10 중량%로 포함할 수 있다. 본 발명의 복합추출물이 0.1 중량% 미만으로 포함할 경우에는 충분한 피부미백 효과를 기대할 수 없고, 10 중량%를 초과하여 포함할 경우에는 제조비용이 높아질 수 있다.
본 발명에 따른 화장료 조성물은 피부미백 효과가 우수하다 (도 1 내지 도 5).
본 발명의 또 다른 목적에 따라서, 접골목 줄기 추출물을 유효성분으로 포함하는 피부미백용 의약외품 조성물을 제공한다.
본 발명에서 '의약외품'은 사람이나 동물의 질병을 진단, 치료, 개선, 경감, 처치 또는 예방할 목적으로 사용되는 물품들 중 의약품보다 작용이 경미한 물품들을 의미한다. 예를 들어, 약사법에 따른 의약외품은 의약품의 용도로 사용되는 물품을 제외한 것으로, 사람/동물의 질병 치료나 예방에 쓰이는 제품, 인체에 대한 작용이 경미하거나 직접 작용하지 않는 제품 등이 포함된다.
본 발명에 따른 접골목 줄기 추출물을을 의약외품 첨가물로 사용할 경우, 상기 조성물을 그대로 첨가하거나 다른 의약외품 또는 의약외품 성분과 함께 사용할 수 있고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용할 수 있다. 유효성분의 혼합량은 사용 목적(예방, 건강 또는 치료적 처치)에 따라 적합하게 결정될 수 있 다.
본 발명의 의약외품 조성물에는 상기 유효성분 외에 필요에 따라 약학적으로 허용 가능한 담체, 부형제 또는 희석제를 더 포함할 수 있다
상기 '약학적으로 허용 가능한 담체'는 생물체를 자극하지 않으면서, 주입되는 화합물의 생물학적 활성 및 특성을 저해하지 않는 담체, 부형제 또는 희석제를 의미할 수 있으며, 구체적으로, 비자연적 담체(non-naturally occuring carrier)일 수 있다. 본 발명에 사용 가능한 상기 담체의 종류는 특별히 제한되지 아니하며 당해 기술분야에서 통상적으로 사용되고 약학적으로 허용되는 담체라면 어느 것이든 사용할 수 있다.
약학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 상기 조성물은 특별히 제한 되지 않으나, 구체적으로 연고제, 로션제, 스프레이제, 패취제, 크림제, 산제, 현탁제, 겔제 또는 젤의 형태로 제조되어 사용될 수 있다
접골목 줄기를 특정 용매로 추출하여 제조된 본 발명에 따른 추출물은 현저히 증진된 피부미백 효과가 있어 화장료 조성물의 소재(첨가제)로 유용하다.
본 발명에 따른 화장료 조성물은 티로시나아제 활성을 저해하고, 멜라닌 합성을 저해하고, 멜라닌 합성 유전자의 발현을 저해하는 효과를 가지면서도, 세포독성과 같은 부작용 없으므로, 피부미백 용도로 안전하고 유용하게 사용될 수 있다.
도 1은 본 발명에 따른 접골목 줄기 추출물의 티로시나아제 저해활성을 분석한 결과 그래프이다. 기질로는 L-DOPA(L-3,4-dihydroxy-L-phenylalanine) 사용, 접골목 줄기의 물 추출물 처리군 (37), 접골목 줄기의 메탄올 추출물 처리군 (38), 코지산 처리군 (K), 알부틴 처리군 (A), 및 약물을 처리하지 않은 대조군(CTL)
도 2는 마우스 유래 악성흑색종 세포주인 B16F10 세포를 이용한 본 발명에 따른 접골목 줄기 추출물의 멜라닌 합성 저해활성 분석 결과를 보여주는 펠렛 사진이다. 접골목 줄기의 메탄올 추출물 처리군 (38), 알부틴 처리군 (A), 및 약물을 처리하지 않은 대조군(CTL)
도 3은 인간 흑색종 세포주에서 본 발명에 따른 접골목 줄기 추출물의 멜라닌 합성 저해활성 분석 결과를 보여주는 펠렛 사진 (위)과 결과 그래프 (아래)이다. 접골목 줄기의 물 추출물 처리군 (37), 접골목 줄기의 메탄올 추출물 처리군 (38), 알부틴 처리군 (A), 및 약물을 처리하지 않은 대조군(CTL)
도 4는 리포터 아데노바이러스를 이용하여 본 발명에 따른 접골목 줄기 추출물의 멜라닌 합성 유전자 (TYR, TRP2, MITF 및 MLPH) 발현의 저해활성을 분석한 결과 그래프이다. 유전자 과발현시킨 상태에서, 접골목 줄기의 메탄올 추출물 처리군 (38), 약물을 처리하지 않은 대조군 (Only virus), 및 과발현 유전자 넣지 않은 참조군 (CTL)
도 5는 α-MSH 이용하여 본 발명에 따른 접골목 줄기 추출물의 멜라닌 합성유전자 (TYR, TRP2, MITF 및 MLPH) 발현의 저해활성을 분석한 결과 그래프이다. 유전자 과발현 및 α-MSH 처리후 접골목 줄기의 메탄올 추출물 처리군 (38), 유전자 과발현 및 α-MSH 처리 대조군 (α-MSH_virus), 유전자 과발현, α-MSH 미처리 및 약물 비처리 대조군 (virus), 유전자 과발현없는 참조군 (CTL)
도 6은 본 발명에 따른 접골목 줄기 메탄올 추출물의 세포독성 분석 결과를 나타낸 그래프이다.
다음의 실시예들에 의해 본 발명이 더 상세히 설명된다. 이들 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것이며, 본 발명의 범위가 이들에 의해 제한되어서는 안된다.
제조예 : 추출물의 제조
접골목 줄기는 건조된 것을 구입 (경남생약협동조합)하여 100 메쉬로 분말화하여 준비하였다.
추출용매로는 50% 메탄올 (실시예 1) 및 물 (증류수; 비교예 1)을 각각 준비하였다.
접골목 줄기 분말의 용량 대비 10배(v/w)의 물 또는 50% 메탄올을 추출용매로 첨가하고, 24시간 동안 교반하면서 추출한 후, 필터페이퍼로 여과하고 분말화하여 접골목 줄기 추출물의 제조하였다.
시험예 1. 티로시나아제 저해활성 분석
미백효능 평가 시험의 대표적 방법인 티로시나아제 저해활성을 측정을 하기와 같이 수행하였다.
기질로는 L-DOPA((L-3,4-dihydroxy-L-phenylalanine)을 사용하였는데, L-DOPA은 티로신이 티로신수산화효소에 의해 변환되는 도파민의 전구물질이며, 티로신은 단백질을 구성하는 아미노산의 일종으로 멜라닌 합성에 필요한 전구체로 잘 알려져 있다. 티로시나아제는 복합효소로 티로신을 L-DOPA로 전화시키고 이어서 L-DOPA를 L-DOPA 퀴논(quinone)으로 산화시킨다.
제조예에서 제조된 접골목 줄기 추출물을 500 ppm으로 희석하여 시료로 사용하였고, 티로시나아제 저해활성이 잘 알려진 표준물질로는 알부틴 (Arbutin) 400 ㎍/ml과 코지산 (kojic acid) 5 mM를 사용하였다.
96-웰 플레이트에 50 mM 인산염 완충액 140 ㎕/well 씩 넣고, 시료 또는 표준물질 20 ㎕, L-DOPA 30 ㎕, mushroom tyrosinase 10 ㎕ 를 순서대로 넣고 섞어 37℃에서 15분간 반응시킨 후 분광광도계를 사용하여 490 nm에서 흡광도를 측정하여 얻은 값을 표 1의 식에 대입하여 저해활성을 산출하여 그 결과를 도 1에 나타냈다.
Tyrosinase 활성 (%) = (B-B＇)/(A-A＇)×100
A: L-DOPA + tyrosinase 만의 흡광도
A＇: buffer + tyrosinase만의 흡광도
B: 시료+ L-DOPA + tyrosinase만의 흡광도
B＇:시료 + buffer + tyrosinase만의 흡광도
도 1에 도시된 바와 같이, L-DOPA를 기질로 사용한 티로시나아제 저해활성 시험에서, 접골목 줄기의 물 추출물 (37)은 티로시나아제 저해활성을 나타내지 않았으나, 접골목 줄기의 메탄올 추출물 (38)은 무처리군에 비하여 100% 이상의 티로시나아제 저해활성을 보였다. 접골목 줄기의 메탄올 추출물 (38)의 티로시나아제 저해활성은 표준물질인 코지산 (K)이나 알부틴 (A)에 비하여도 현저히 우수하였다.
시험예 2. B16F10 세포에서 멜라닌 합성 저해활성 분석
마우스 유래 악성흑색종 세포주인 B16F10 세포를 90% RPMI-1640, 10% FBS, 100 unit/ml의 페니실린과 스트렙토마이신(PS)이 첨가된 성장배지를 포함하는 96 웰 플레이트에 1×105 cell/well로 접종하여 37℃, CO2 배양기에서 24시간 동안 배양 후, a-MSH를 100mM로 처리하고 동일조건에서 24시간 배양을 한 후, 제조예에서 제조된 접골목 줄기 추출물을 500ppm, 또는 표준물질인 알부틴을 500 ㎍/ml 농도로 B16F10 세포 배지에 처리한 후 48시간 동안 배양하였다.
펠렛 색상을 확인하기 위해 상층액을 제거하고 PBS 용액으로 한 번 더 수세한 후, 10분간 원심분리(12,000 × g, 4℃)하여 상층액을 제거한 후 펠렛 색상을 디지털 카메라로 촬영하여 비교하였고, 그 결과를 도 2에 나타냈다.
도 2에 도시된 바와 같이, 접골목 줄기의 메탄올 추출물 (38)을 처리한 경우는 펠렛의 색깔이 표준물질인 알부틴(A)을 처리한 경우와 거의 유사하게 옅어진 것을 확인할 수 있다.
따라서 본 발명에 따른 접골목 줄기의 메탄올 추출물은 멜라닌 합성을 저해하는 활성이 우수함을 알 수 있다.
시험예 3. 인간 흑색종 세포주에서 멜라닌 합성 저해활성 분석
HM3KO 세포는 사람 피부 흑색종 세포주로서 인비트로(in vitro) 상에서 미백 효능 평가를 위해 많이 사용되어 왔으며, 본 발명에서는 제조예에서 제조된 접골목 줄기 추출물을 처리한 후, 펠렛(pellet) 색깔과 멜라닌 함량을 평가함으로써 접골목 줄기의 추출물의 미백 효과를 확인하였다.
HM3KO 세포는 90% MEM, 10% FBS, 100 unit/ml의 페니실린과 스트렙토마이신(PS)이 첨가된 성장배지를 포함하는 100 mm dish에 1×106 cell/dish로 접종하여 37 ℃, CO2 배양기에서 24시간 동안 배양 후, 미백 효과를 확인하기 위해 제조예에서 제조된 접골목 줄기 추출물을 500ppm 농도로 HM3KO세포 배지에 함께 처리한 후 48시간 동안 배양하였다.
멜라닌 합성 저해활성을 비교하기 위해, 미백 표준물질로 잘 알려진 알부틴(A)을 각각 500 ㎍/ml 농도로 상기와 같이 배양된 HM3KO 세포에 처리한 후 48시간 동안 배양하였다.
처리가 완료된 100 mm dish의 배지를 모두 제거한 뒤, 5 ml의 PBS로 2회 수세하고 trypLE 완충액으로 세포를 회수하여 이-튜브(e-tube)로 옮긴 후 10분간 원심분리(12,000 × g, 4℃)를 실시하였다. 펠렛 색상 (HM3KO 세포내 멜라닌 색소)을 확인하기 위해 상층액을 제거하여 PBS 용액으로 한 번 더 수세한 후 10분간 원심분리(12,000 × g, 4℃)하여 상층액을 제거한 후 펠렛 색상을 디지털 카메라로 촬영하여 비교하였고, 그 결과를 도 3에 나타냈다.
또한 상층액을 제거한 펠렛에 0.5 M NaOH를 500 ㎕ 씩 주입한 후 교반기로 섞어 37℃에서 24시간 동안 정치시킨 후, 80℃에서 1시간 동안 가열하여 96웰 플레이트에 펠렛 용액을 200 ㎕씩 2번 주입 후 마이크로리더를 이용하여 400nm에서 흡광도를 측정하여 세포 펠렛 내의 멜라닌 함량을 측정하였고 그 결과를 도 3에 나타냈다.
도 3에 도시된 사진에 의하면, 접골목 줄기의 메탄올 추출물 (38)을 처리한 경우는 펠렛의 색깔이 표준물질인 알부틴(A)을 처리한 경우에 비하여도 더 옅어진 것을 확인할 수 있다.
또한 도 3에 도시된 그래프에 의하면, 접골목 줄기의 메탄올 추출물 (38)을 처리한 경우는 세포내 멜라닌 함량이 알부틴(A)을 처리한 경우에 비하여도 더 감소하였음을 확인할 수 있다. 이에 비하여 접골목 줄기의 물 추출물 (37)을 처리한 경우는 세포내 멜라닌 함량이 대조군 (Control, 무처리)과 거의 대응함을 확인할 수 있다.
따라서 본 발명에 따른 접골목 줄기의 메탄올 추출물은 멜라닌 합성 저해활성이 우수함을 알 수 있다,
시험예 4. 멜라닌 합성 유전자 발현 저해활성 분석
멜라닌 합성에 중요한 역할을 하는 유전자로 알려진 TYR, TRP2, MITF 및 MLPH의 네 가지 유전자의 발현을 조절하는 각 프로모터에 리포터로 루시퍼라제를 발현하는 아데노바이러스 (리포터 아데노바이러스)를 제조하여, 프로모터 분석을 수행하여 접골목 줄기 메탄올 추출물이 세포 내에서 상기 유전자들의 mRNA 전사 단계에서 조절 여부 (유전자 발현 저해)를 확인하였다.
구체적으로는 HM3KO 세포주를 24-웰 플레이트에 1×105 cell/well로 접종하여 37℃, CO2 배양기에서 24시간 배양 후, 상기에서 제조한 리포터 아데노바이러스를 접종하여 24시간 배양한 후 상층액을 제거하고, 제조예에서 제조된 접골목 줄기 추출물(500ppm)를 처리한 후 24시간 배양한 후, 각 웰에 CCK-8을 첨가하고 2시간 반응 후 마이크로플레이트 리더를 이용하여 450 nm에서 흡광도를 측정하고 무처리군을 100%로 하여 세포생존율을 계산하였다.
프로모터 활성 억제능을 확인하기 위해 HM3KO 세포주를 웰 플레이트에 1×105 cell/well로 접종하여 37℃, CO2 배양기에서 24시간 배양 후, MLPH와 TRP2 리포터 아데노바이러스는 0.75%, MITF와 TYR리포터 아데노바이러스는 7.5%의 농도로 24시간 처리한 후 상층액을 제거한 후, 제조예에서 제조된 접골목 줄기 추출물 시료 (500ppm)를 24시간 처리하거나 (도 4), 또는 50mM a-MSH와 제조예에서 제조된 접골목 줄기 추출물 (500ppm)를 24시간 처리하였다 (도 5).
그리고 나서 루시퍼라제 분석시스템 키트를 사용하여 다음과 같이 루시퍼라제의 활성 정도를 측정하였다: 시료를 처리한 세포를 회수하기 위해 상층액을 제거한 후 증류수를 이용하여 희석된 루시퍼라제 세포 배양 용해 시약(CCLR)을 200㎕ 씩 주입한 후 상온에서 5분간 잘 희석하여 세포를 용해시켰다. 세포 용액을 이-튜브로 옮긴 후 더 효과적으로 세포를 용해시키기 위해 딥 프리저(deep freezer)에서 약 30분간 냉동 후 해동시켜 세포 내에서 추출된 루시퍼라제만 기질과 반응시키기 위해 10분간 원심분리(13,000 × g, 4℃)하여 펠렛을 분리시키고 상층액을 새로운 이-튜브로 옮겼다. 그리고 나서 불투명한 하얀색 96-웰 플레이트에 상층액을 150 ㎕씩 주입하고 완충액에 용해된 루시퍼라제 분석 기질을 25㎕씩 넣어서 Glomax 다중 검출 장비를 이용하여 발광도를 측정하였고, 그 결과를 도 4 및 도 5에 나타냈다.
도 4에 도시된 바와 같이, 접골목 줄기의 메탄올 추출물 (38)을 처리한 경우는, 무처리구(only virus)을 처리한 경우에 비교하여 보면, 멜라닌 합성에 관여하는 유전자인 TYR, TRP2, MITF 및 MLPH 유전자의 발현이 모두 현저히 억제되었다는 것을 확인할 수 있다. 따라서 본 발명에 따른 조성물은 뛰어난 피부미백 효과가 있을 것으로 예상된다.
도 5에 나타낸 바와 같이, 멜라닌세포 자극 호르몬(α-MSH)과 본 발명에 따른 접골목 줄기의 메탄올 추출물 (38)을 처리한 경우도 멜라닌 합성에 관여하는 유전자인 TYR, TRP2, MITF 및 MLPH 유전자의 발현이 모두 억제되었다는 것을 확인할 수 있다. 따라서 본 발명에 따른 조성물은 뛰어난 피부미백 효과가 있을 것으로 예상된다.
시험예 5. 세포독성 분석
B16F10 세포는 90% RPMI-1640, 10% FBS, 100 unit/ml의 페니실린과 스트렙토마이신(PS)이 첨가된 성장배지를 포함하는 96웰 플레이트에 1×105 cell/well로 접종하여 37℃, CO2 배양기에서 24시간 동안 배양 후, 세포생존율 측정을 위해 B16F10 세포를 1×105 cells/ml로 96-웰 플레이트에 분주하고 제조예에서 제조된 접골목 줄기 추출물 시료를 500ppm 또는 1,000ppm으로 처리 후, 37℃, 5% CO2 인큐베이터에서 24시간 배양하였다. MTT 시약을 첨가한 후, 37℃, 5% CO2 인큐베이터에서 4시간 반응시켜 분광광도계를 이용하여 490 nm에서 흡광도를 측정하여 세포생존율을 측정하였고, 그 결과를 도 6에 나타냈다.
도 6에 도시된 바와 같이, 본 발에 따른 조성물은 500ppm 및 1,000ppm에서 세포 생존율 시험 결과 독성이 없는 것으로 확인되었다.

Claims (7)

  1. 접골목 줄기 추출물을 유효성분으로 포함하는 피부미백용 화장료 조성물.
  2. 제 1항에 있어서, 상기 추출물은 접골목 줄기의 메탄올 또는 에탄올 추출물인 것인 피부미백용 화장료 조성물.
  3. 제 1항에 있어서, 상기 조성물은 티로시나아제의 활성 및 멜라닌 합성을 저해하는 것을 특징으로 하는 피부미백용 화장료 조성물.
  4. 제 1항에 있어서, 상기 조성물은 멜라닌 합성 유전자의 발현을 저해하는 것을 특징으로 하는 피부미백용 화장료 조성물.
  5. 제 1항에 있어서, 상기 추출물은 티로시나아제 저해활성이 100% 이상이고 멜라닌 합성 저해활성(490nm에서 흡광도)이 0.15 이하인 것을 특징으로 하는 피부미백용 화장료 조성물.
  6. 제 1항에 있어서, 상기 화장료 조성물은 화장수, 훼이셜 로션, 바디로션, 영양 크림, 수분 크림, 아이 크림, 에센스, 화장연고, 스프레이, 젤, 팩, 선 스크린, 메이크업 베이스, 파운데이션, 파우더, 클렌징 크림, 클렌징 로션, 클렌징 오일, 클렌징 폼, 비누, 바디 워쉬, 및 물휴지로 구성되는 군으로부터 선택되는 어느 하나의 제형인 것을 특징으로 하는 피부미백용 화장료 조성물.
  7. 접골목 줄기 추출물을 유효성분으로 포함하는 피부미백용 의약외품 조성물.
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