KR101734873B1

KR101734873B1 - 해삼 자숙액 또는 이의 분획물을 유효성분으로 포함하는 화장료 조성물

Info

Publication number: KR101734873B1
Application number: KR1020150083652A
Authority: KR
Inventors: 김소정; 이상철; 권은혜; 홍선미; 조선정
Original assignee: 재단법인 경북해양바이오산업연구원; 이상철
Priority date: 2015-06-12
Filing date: 2015-06-12
Publication date: 2017-05-12
Also published as: KR20160146406A

Abstract

본 발명은 해삼 자숙액 또는 이의 분획물을 유효성분으로 포함하며 미백 및 주름개선에 효능이 있는 화장료 조성물에 관한 것이다.

Description

해삼 자숙액 또는 이의 분획물을 유효성분으로 포함하는 화장료 조성물 {Cosmetic composition comprising sea cucumber steaming juice or a fraction thereof as functional component}

해삼은 극피동물 해삼강에 속하는 해삼류의 총칭으로, 약효가 인삼과 같다고 하여 해삼이라고 명명되었다. 식품학적으로 해삼은 약 90.5%가 수분으로 구성되어 있으며, 그 외 단백질 3.2%, 지방 0.2% 및 무기질 3.5% 로 구성되어 있다. 해삼에 함유된 단백질은 질이 우수하고, 무기질로는 칼슘과 인이 적절한 비율로 포함되어 있으며, 연골부에는 콘드로이친 황산이 많다. 또한 유리 아미노산으로, 단맛을 내는 알라닌 및 감칠맛을 내는 글루탐산이 가장 많이 분포하고 있으며, 인삼의 기능성 성분으로 알려진 사포닌의 함량도 높아 바다의 인삼으로도 불린다. 또한, 건해삼의 주요 성분은 당단백질과 콘드로이친이며, 점액성 다당류 및 황산 콘드로이친 구조를 관한 연구가 진행된 바 있다.

해삼 자숙액은 생 해삼을 가열 및 건조하여 건해삼을 생산하는 과정에서 다량으로 발생하는 부산물로서, 대부분 폐기되고 있어 경제적 손실이 크며, 환경 오염 문제가 제기되고 있다. 또한, 해삼 자숙액에는 폴리페놀, 단백질 및 글리코겐과 같은 유용 영양성분과 같은 기능성 성분이 다량 함유되어 있음에도 불구하고, 종래 해삼에 관한 연구는 해삼 자체를 이용한 식품 개발이 대다수를 이루고 있을 뿐이며, 해삼 자숙액으로부터 기능성 물질을 추출하거나 기능성 제품을 개발하는 연구는 매우 미진한 실정이다.

국내특허등록 1513892호 (2015. 4. 15) 국내특허등록 1493158호 (2015. 2. 6)

본 발명은 해삼 자숙액을 분자량에 따라 분획, 정제하여 당단백질을 분리하고, 상기 당당백질을 포함하는 분획물이 미백 활성 및/또는 주름개선 효능을 나타낸다는 것을 확인하였다. 이에, 본 발명은 해삼 가공 공정에서 생산되는 부산물인 해삼 자숙액을 화장품의 기능성 소재로 제공한다.

따라서, 본 발명의 목적은 해삼 자숙액 또는 이의 분획물을 유효성분으로 포함하는 화장료 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 화장료 조성물을 포함하는 화장품을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 화장료 조성물의 제조방법을 제공하는 것이다.

일 예로, 본 발명은 해삼 자숙액 또는 이의 분획물을 유효성분으로 포함하는 화장료 조성물에 관한 것이다.

일 구현예로, 상기 화장료 조성물은 미백 또는 주름 개선의 용도로 사용될 수 있다.

다른 구현예로, 상기 해삼 자숙액의 분획물은 분자량 50kDa 이상의 당단백질을 포함하는 분획, 상기 분획의 농축물, 또는 상기 분획의 동결건조물일 수 있다.

다른 예로, 본 발명은 상기 화장료 조성물을 포함하는 화장품을 제공한다.

일 구현예로, 상기 화장품은 화장수, 유액, 크림, 에센스, 화장연고, 스프레이, 젤, 팩, 선 스크린, 메이크업 베이스, 파운데이션, 파우더, 메이크업 제거제 및 세정제로 구성되는 군으로부터 선택된 1종 이상의 제형을 가진 것일 수 있다.

다른 예로, 본 발명은 80 ~ 90℃에서 해삼을 자숙하여 해삼 자숙액을 수득하는 단계, 해삼 자숙액을 감압여과하는 단계, 및 분자량 50kDa 이상의 당단백질을 포함하는 분획물을 분리하는 단계를 포함하는, 해삼 자숙액 분획물을 유효성분으로 포함하는 화장료 조성물을 제조하는 방법에 관한 것이다.

이하, 본 발명을 보다 상세하게 설명한다.

본 발명은 해삼 자숙액을 분자 크기별로 분획 및 정제하여 50kDa 이상 또는 50kDa 미만의 분자량을 가진 해삼 자숙액 분획물을 수득하였고, 상기 분획물이 미백 활성 및/또는 주름개선 효능을 나타낸다는 것을 확인하였다. 따라서, 해삼 자숙액 또는 이의 분획물을 포함하는 화장료 조성물 및 화장품을 제공하고자 한다.

본 발명의 화장료 조성물은, 해삼 자숙액 또는 이의 분획물을 조성물 총 중량에 대하여 0.01 ~ 10 % 을 함유할 수 있으며, 조성물의 용도, 적용 형태, 사용 목적 및 소망하는 효과에 따라서 적절히 조절 가능하다. 다만, 상기 범위 미만인 경우에는 실질적인 미백 또는 주름 개선 효과를 얻을 수 없고, 상기 범위 이상이면 제형의 안정성을 떨어트릴 수 있으므로, 상기 범위인 것이 바람직하다.

본 발명에서, 해삼 자숙액은 생 해삼을 가열하여 삶은 후 발생하는 액상 부산물을 말한다. 본 발명의 해삼 자숙액을 수득하는 대표적인 공정을 예로 들면, 우선 채집된 해삼을 절개하고 내장을 제거한 후 세척함으로써 염 및 불순물을 제거할 수 있다. 이 때, 해삼의 채집은 보통 잠수 작업으로 하며 채집시 해삼에 상처가 생기거나 상품성이 떨어지지 않도록 하는 것이 좋다. 또한, 당일 채집된 해삼을 사용하는 것이 해삼이나 해삼 자숙액 신선도를 맞출 수 있으며 수율(중증률)을 높일 수 있어 바람직하다. 해삼의 절개는 2∼3cm가 적당하며, 일직선으로 깨끗하게 절개를 하되 작을수록 해삼 삶기 할 때 깨끗하게 나올 수 있고 자숙액도 부유물이 덜 생긴다. 해삼 내장 제거 작업이 끝난 해삼은 담수를 이용하여 깨끗하게 세척할 수 있으며, 담수 세척을 완료한 후 끓는 물(예, 약 80 내지 90℃)에 내장이 제거된 해삼을 넣어 적당히 저어주면서 삶을 수 있다. 이후 해삼을 모두 건져내고 남은 액상을 해삼 자숙액으로 수득할 수 있다. 상기 공정은 본 발명을 구현하는 일예에 불과하며, 통상의 기술자가 적절히 변경 및 수정하여 해삼 자숙액을 수득할 수 있음이 자명하다.

본 발명에서, 해삼 자숙액의 분획물은 해삼 자숙액을 탈염 및 분자크기에 따라 수득한 분획물을 의미한다. 상기 해삼 자숙액 분획물은, 80 ~ 90℃에서 해삼을 자숙하여 해삼 자숙액을 수득하는 단계, 해삼 자숙액을 감압여과하는 단계, 및 분자량 50kDa 이상의 당단백질을 포함하는 분획물을 분리하는 단계를 포함하는 공정에 의하여 제조될 수 있다.

본 발명에서 해삼 자숙액의 분획물을 수득하는 대표적인 공정을 보다 상세하게 예로 들면, 우선, 해삼 자숙액을 냉장 상태(예, 약 4∼6℃)로 해동 후 감압 여과하여 불순물을 제거할 수 있다. 분자량에 따른 해삼 자숙액 분획물을 수득하기 위하여, 탈염농축장치를 이용하여 해삼 자숙액을 50kDa 이상 및 50kDa 미만의 분자량을 가진 자숙액을 분리할 수 있다. 또는, 특정 포어 사이즈를 가지는 통상의 멤브레인을 사용하여 분획하거나, 액체 크로파토그라피를 통하여 수행할 수도 있다. 얻어진 분획물은 적절한 포어 사이즈를 갖는 필터로 농축하거나, 감압농축 등의 통상의 방법으로 원하는 당단백질 농도가 얻어질 때까지 농축될 수 있다. 그러나, 상기 공정은 본 발명을 구현하는 일예에 불과하며, 통상의 기술자가 적절히 변경 및 수정하여 해삼 자숙액 분획물을 수득할 수 있음이 자명하다.

상기 해삼 자숙액 분획물은 건조 또는 동결건조하여 사용할 수 있으며, 정제수 등 용매에 녹여 사용할 수 있다.

본 발명에서, '유효성분으로 포함하는' 이란 화장료 조성물로서 피부 개선효과, 예컨대 주름 개선 및/또는 미백 효능을 나타내는 성분을 유효량으로 함유하는 것을 의미한다.

본원의 구체적인 실시예에서는, 50kDa 이상 또는 50kDa 미만의 분자량을 가진 해삼 자숙액 분획물에 대하여 알시안 블루(Alcian blue) 염색 및 렉틴 블랏(Lectin blotting)을 통해 당단백질을 확인하였고, 세포 내 티로시나아제(tyrosinase) 활성 및 엘라스타아제(elastase) 활성을 저해하는 효능이 함께 존재함을 확인하였다. 또한, 해삼 자숙액 분획물을 함유하는 에센스 제형의 화장품을 제조하고 이를 임상에 적용하여, 피부를 자극하지 않으면서 주름 개선 효능이 우수하다는 것을 확인하였다. 따라서, 본 발명의 화장료 조성물은 주름 개선 및/또는 미백용으로 적용될 수 있다.

주름 개선이란, 피부의 주름 및 탄력과 관련된 능력을 유지 또는 강화시키는 것을 포함한다. 이와 관련하여, 엘라스타아제(elastase) 활성은 피부 노화를 증가시키고 피부 탄력의 감소를 유발하는 것으로 알려져 있으므로, 엘라스타아제의 활성 저해제는 피부노화 억제 및 주름 개선에 사용될 수 있다.

미백이란, 피부에 과도한 멜라닌 색소의 침착을 방지하거나, 기존에 침착된 멜라닌 색소의 색을 엷게 하여 기미나 주근깨의 생성을 억제함으로써 피부의 미백에 도움을 주는 기능을 포함한다. 사람 피부에 있는 멜라닌 색소는 UV에 의한 손상을 보호해주는 주요한 메커니즘이지만, 기미(melasma), 주근깨(freckles), 광선각화증(senile lentigines) 또는 과도한 색소 같은 비정상 색소 형성과 같은 바람직하지 않은 문제점들을 야기시키는데, 티로시나아제(tyrosinase)는 사람의 피부에 멜라닌 생합성을 초래한다. 따라서, 티로시나아제의 저해제는 미백효과를 위한 화장품에 사용되는 중요한 소재로 알려져 있다.

본원의 화장료 조성물은, 미백 또는 주름 개선용 기능성 화장료 조성물로서, 투여 경로에 따라서, 피부 외용, 경피 또는 피하 투여가 가능하며, 바람직하게는 피부 외용 또는 경피, 보다 바람직하게는 피부 외용 투여가 가능한 조성물 일 수 있다.

상기 화장료 조성물은 피부, 두피 또는 모발에 경피적으로 적용될 수 있고, 기초 화장품, 메이크업 화장품, 바디 제품(바디 클렌져, 바디로션 등), 면도용 제품, 모발 제품(샴푸, 린스, 헤어 에센스 등) 등의 모든 화장품 제품의 제조에 사용 가능한 조성물을 의미하는 것으로, 경고제, 스프레이제, 현탁액, 유액, 크림, 젤, 폼 등의 형태로 제제화된 것일 수 있으나, 그 형태에 특별한 제한이 없다. 예를 들어, 화장수, 유액, 크림, 에센스, 화장연고, 스프레이, 젤, 팩, 선 스크린, 메이크업 베이스, 파운데이션, 파우더, 메이크업 제거제 및 세정제 등의 제형을 가질 수 있다.

상기 화장료 조성물은 유효성분 이외에, 통상의 제품화 또는 제제화에 사용 가능한 모든 종류의 성분, 예컨대 향료, 색소, 살균제, 산화방지제, 방부제, 보습제, 점증제, 부형제, 희석제, 무기염류 및 합성 고분자 물질 등을 추가로 포함할 수 있으며, 그 종류와 함량은 최종 산물의 용도 및 사용 목적에 따라 적절하게 조절할 수 있다.

또한, 상기 화장료 조성물은 적용되는 형태에 통상적으로 포함되는 용매를 포함하는 것일 수 있으며, 예컨대, 에탄올, 글리세린, 부틸렌글리콜, 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌글리콜, 1,2,4-부탄트리올, 솔비톨에스테르, 1,2,6-헥산트리올, 벤질알코올, 이소프로판올, 부탄디올, 디에틸렌글리콜 모노에틸에테르, 디메틸이소소르비드, N-메틸-2-피롤리돈, 프로필렌카보네이트, 글리세레스-26, 메틸글루세스-20, 이소세틸미리스테이트, 이소세틸옥타노에이트, 옥틸도데실미리스테이트, 옥틸도데칸올, 이소스테아릴이소스테아레이트, 세틸옥타노에이트 및 네오펜틸글리콜디카프레이트 등 중에서 선택된 1 종 이상을 포함할 수 있다.　 본 발명이 속하는 기술 분야의 당업자라면 제품의 특성에 따라 용매의 종류 및 사용량을 알맞게 선택하여 적용할 수 있다.

또한, 상기 화장료 조성물은 경피 투여시의 경피 투과를 강화하기 위한 다양한 물질을 포함할 수 있다.　예를 들어, 라우로켑람 유도체 및 올레인산, 모노올레이트 유도체의 에스테르 유도체, 아다팔렌, 트리티노인, 레틴알데하이드, 타자로틴, 살리실산, 아질라익산, 글라이콜산, 에톡시다이글라이콜, 트윈80, 레시틴 올가노겔 등을 포함할 수 있다.　또한, 본 발명의 화장료 조성물은 부가적인 기능을 부여하기 위해, 본 발명의 미백 또는 주름 개선 효과를 해치지 않는 범위 내에서 공계면활성제, 계면활성제, 비듬 방지제, 각질 연화제, 혈행 촉진제, 세포 활성제, 청량제, 보습제, 항산화제, pH 조절제, 정제수 등의 보조 성분들을 첨가할 수 있으며, 적용되는 형태에 따라서 적절한 향료, 색소, 방부제, 부형제 등의 첨가제를 함유할 수 있다.

본 발명은 해삼 자숙액 또는 이의 조성물을 이용하여 피부세포 독성이 없으면서도 주름개선 및 미백 효능이 있는 기능성 화장품을 제공함으로써, 해삼 양식에서 생산되는 부산물 처리 비용 저감, 환경오염 저감 및 새로운 산업수요 창출 측면에서 중요한 기여를 할 수 있다.

도 1은 본 발명에 따른 해삼 자숙액 분획물(각각 분자량 50kDa 이상 및 50kDa 미만) 제조 방법에 따른 제조 공정도를 나타내는 것이다.
도 2는 본 발명에 따른 해삼 자숙액 분획물(50kDa 이상, 50kDa 미만) 내의 당단백질을 확인하기 위하여, 렉틴(RCA-120) 을 처리하여 N-glycan 을 확인한 결과 및 알시안 블루(AB)로 염색하여 0-glycan 을 확인한 결과를 나타낸다. M은 marker, B는 50kDa 미만의 분획물, A는 50kDa 이상의 분획물, C는 대조군 뮤신(Bovine submaxillary glands), AB는 알시안 블루 염색, RCA-120은 Ricinus communis(β-Gal) 유래 렉틴을 나타낸다.
도 3은 본 발명에 따른 해삼 자숙액 분획물(50kDa 이상, 50kDa 미만)의 다양한 농도(0.1, 1, 2, 5mg/ml)에서의 세포독성효과를 나타내는 것이다. P.C.는 양성 대조군(100% Ethanol)을 나타낸다.
도 4는 본 발명에 따른 해삼 자숙액, 해삼 및 해삼 정제(50kDa 이상)의 아미노산 분석값을 그래프로 나타내는 것이다. 해삼 자숙액은 자체 동결 건조한 한 분말이고, 해삼은 건해삼을 분말한 것이고, 해삼 정제물은 50kDa 이상 분획물을 말한다.
도 5는 본 발명에 따른 해삼 자숙액 분획물(50kDa 이상, 50kDa 미만)의 티로시나아제 저해 효능을 그래프로 나타내는 것이다. 양성 대조군으로 비타민 C(Ascorbic acid) 및 알부틴을 이용하였다.
도 6은 본 발명에 따른 해삼 자숙액 분획물(50kDa 이상, 50kDa 미만)의 주름개선효능을 그래프로 나타내는 것이다. 양성 대조군으로 비타민 C(Ascorbic acid)를 이용하였다.
도 7은 본 발명에 따른 해삼 자숙액 분획물(50kDa 이상) 함유 화장품 사용 후 눈가 주름 개선 정도를 그래프로 나타내는 것이다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명이 하기 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.

실시예 1. 해삼 자숙액의 제조

해삼의 크기는 200g 이상으로 당일 채집한 국내산 해삼을 이용하였다. 해삼의 내장 제거 시 항문에서 중앙으로 3cm 위쪽으로 배면 중앙으로 절개하였다. 해삼 내장 제거 작업이 끝난 해삼은 담수를 이용하여 깨끗하게 세척하여, 1차적인 염 제거 및 불순물 제거하였다. 담수 세척을 완료한 해삼은 담수로 삶아주었다. 이를 위하여, 끓는 물에 내장을 제거한 해삼 약 50kg 를 넣어 주걱 등의 넓적한 도구를 이용하여 솥 저면에 퍼지도록 눌러주고 그대로 두었다. 해삼이 끓어오르면 주걱으로 저어 바닥면에 타지 않도록 계속 저어주었다. 해삼이 숨이 죽기 시작하여 처음 넣은 상태보다 완연히 줄어들기 시작하면, 내장을 제거한 해삼을 추가로 넣었다. 해삼을 삶으면서 반복적으로 위의 과정을 수행하였다. 해삼이 공처럼 부풀어 오르면 건져내고 계속 해삼을 투여하였다. 가열 온도는 80 내지 90℃로 유지하였다.

위의 단계를 거쳐, 고형물(해삼)을 모두 건져낸 나머지 액상이 해삼 자숙액이며, 이 해삼 자숙액을 수거 후 -20℃ 로 동결하여, 자숙액 분획물을 제조하기 전까지 보관하였다.

실시예 2. 해삼 자숙액 분획물의 제조 및 당단백질의 확인

2-1. 해삼 자숙액 분획물의 분리 및 정제

실시예 1에서 제조한 해삼 자숙액을 냉장 상태(4∼6℃)로 해동한 후, SUPRAcap depth filter K500P grade를 이용하여 1차 감압 여과하고, SUPRAcap depth filter 10 inch capsule을 이용하여 2차 감압 여과하여 불순물을 제거하였다. 다음으로, 탈염농축장치(UF SYSTEM, 제조사 비티알)를 이용하여 분자량 50kDa 이상 및 50kDa 미만의 자숙액 분획물을 분리하였으며, 이를 동결 건조하여 화장품 조성물로 사용하였다. 도 1은 해삼 자숙액 분획물의 분리 정제 방법을 도식화하여 나타낸 그림이다.

2-2. 해삼 자숙액 분획물의 트립신 처리

분자량 50kDa 이상 및 50kDa 미만의 자숙액 분획물에 트립신(Porcine, Sigma-Aldrich)을 0.2% 의 양으로 넣고 3시간 동안 37℃ 에서 배양하여 당단백질 확인에 사용하였다.

2-3. 당단백질의 확인

(1) 알시안 블루(Alcian blue) 염색

실시예 2-1에서 제조한 50kDa 이상 또는 50kDa 미만의 자숙액 분획물 시료 각 60㎕에 4X 샘플 버퍼 20㎕를 첨가하여 100℃에서 10분 방치한 후, 8% 아크릴아미드 겔(acrylamid gel)에 40㎕ 로딩하여 SDS-PAGE를 수행하였다. SDS-PAGE 겔을 깨끗한 통에 담아 3차 증류수로 5분씩 3회 세척한 다음 O-glycan　당단백질을 염색용 알시안 블루(Alcian blue, AB) 염색 용액(0.1% 알시안 블루, 3% 아세트산)에 20분 염색 시킨 후 3차 증류수에 넣어 탈 염색 시켜 밴드를 확인하였다.

　그 결과, 도 2에 나타난 바와 같이, 알시안 블루 염색을 통하여, 해삼 자숙액 내의 당단백질의 존재를 확인할 수 있었다. 구체적으로, 50 kDa 미만는 밴드 확인이 어려웠으며, 50 kDa 이상의 경우는 두 개의 밴드 형태의 단백질이 알시안 블루 염색으로 모두에서 확인되었다. 이상의 결과로 해삼 자숙액 내 O-glycan 당단백질의 존재를 확인할 수 있었다.

(2) Lectin blotting

다음으로, N-glycan 당단백질의 분석을 위하여, RCA120 을 이용한 렉틴 항원-항체 반응을 통해 N-glycan 의 β-Gal 사카라이드를 확인하였다. 이를 위하여, SDS-PAGE 겔의 단백질을 PVDF 멤브레인으로 이동시켰다. 멤브레인을 TBST(Tris-buffered saline, 0.1% Tween 20) 용액에 5분씩 2회 세척하였다. TBST 용액에 각각 1000:1로 희석된 RCA-120 을 1시간 반응 시킨 후 TBST 용액에 10분씩 3회 세척하였다. Streptavidin-HRP(Thermo)가 1:5000으로 희석된 TBST용액과 1시간 반응시킨 후 TBST 용액에 10분씩 3회 세척하였다. 반응이 끝난 멤브레인을 DAP Substrate kit(Thermo)의 stable peroxide substrate buffer에 1 X 로 희석된 DAP 용액에 밴드가 명확히 보일 때까지 반응시킨 후 증류수로 세척하여 밴드를 확인하였다.

그 결과, 도 2에 나타난 바와 같이, 트립신 처리 후의 자숙액의 약 52 kDa 의 밴드가 RCA120 렉틴으로 확인되었다(도 2).

실시예 3. 해삼 자숙액 분획물의 안정성 평가

B16-F10 멜라닌 세포(제조사 ATCC LOT. 60508145)를 이용하여 해삼 자숙액 분획물의 안정성을 평가하였다. 96 well plate에 cell suspension(5000cells/well) 100㎕씩 분주하여, 24시간 동안 37℃ 및 5% CO₂ 조건으로 pre-incubation 시켜 cell을 well plate에 부착시켰다. blank well은 cell을 포함하지 않은 배지 DMEM(Dulbecco's Modified Eagle Medium, 제조사 ATCC)만 100㎕ 분주하였다.

농도별로 test sample(해삼 자숙액 50kDa 이상 분획물, 50kDa 미만 분획물)을 각 well에 10㎕씩 처리하고, 음성 대조군(negative control)으로는 배지 10㎕만 처리한 후, 24시간 동안 37℃ 및 5% CO₂ 조건으로 incubation 시켰다. 각 well에 CCK-8 solution 10㎕씩　첨가한 후 1시간 동안 incubation하여 450nm에서 흡광도를 측정하였다. blank 는 세포가 없는 상태에서 시료를 넣고 측정한 것이다.

survival rate(%) = (A_sample-A_b)/(A_c-A_b) × 100

A_sample : sample 흡광도

A_b : blank 흡광도

A_c : 음성 대조군 흡광도(cell있는 상태에서 증류수를 넣고 측정한 값)

도 3에 나타난 바와 같이, 해삼 자숙액 유래 분자 크기별 분획물(50kDa 이상, 50kDa 미만) 각각 0.1, 1, 2, 5mg/ml 농도에서의 세포 생존력을 측정한 결과, 농도별로 약 90% 이상의 세포 생존율을 나타내었으므로, 해삼 자숙액 분획물의 안정성이 확인되었다. 이에 반하여, 양성 대조군(100% Ethanol) 은 세포 생존율이 10%이하로 나타났다.

실시예 4. 해삼 자숙액 분획물 및 해삼에 함유된 아미노산 분석

해삼 자숙액 시료, 해삼 시료 및 해삼 정제 시료를 약 2-5g을 달아 시험관에 넣었다. 해삼 자숙액 시료는 자체 동결 건조한 한 분말을 사용하였고, 해삼 시료는 건해삼을 분말한 것이고 해삼 정제 시료는 50kDa 이상 분획물을 사용하여 분석하였다. 6N 염산을 10mL을 가하여 혼합하고 질소 가스를 1분간 충진한 후 뚜껑을 닫아 110℃에 22시간 동안 가수분해시키고, 가수분해 종료 후 방냉하였다. 가수분해된 검체를 50mL 정용 flask에 D.W.로 정용하여 여과한 후 10배 희석시켰다. 이를 0.45㎛ syringe filter로 여과하였다.

AccQ-Tag Kit로 유도체화하였다. 유도체화 단계는 PCR tube에 borate buffer 70㎕, sample 및 standard 10㎕, 제조한 AccQ-Tag Reagent 20㎕ 첨가하여 55℃ heating block에 10분간 반응시켰다. 충분히 식힌 후 LC vial에 옮겨 HPLC분석하였다. 분석조건은 아래의 표 1 및 표 2와 같다

Column	AccQ-Tag column 3.9x150nm
Detector	fluorescence lex=250nm　 len=395nm
Flow rate	1 mL/min

Mobile phase (A: acetate phosphate buffer B: 60% ACN)

Time	A(%)	B(%)
0	100	0
0.5	98	2
15	93	7
19	90	10
32	67	33
33	67	33
34	0	100
37	0	100
38	100	0
45	100	0

도 4에 나타난 바와 같이, 16가지 아미노산 분석 결과, 해삼 자숙액의 경우 총 아미노산 함량이 16.59g/100g 이고, 해삼은 54.21g/100g으로 나타났다. 해삼 자숙액 분획물(50kDa 이상)도 해삼 아미노산을 약 4.21g/100g 함유하고 있음을 알 수 있다.　

실시예 5. 해삼 자숙액 분획물의 미백 효능 검증

5-1. 세포 내 티로시나아제( tyrosinase ) 저해 활성 측정

B16-F10 멜라닌 세포(제조사 ATCC LOT. 60508145)를 이용하여 해삼 자숙액 분획물의 세포 내 티로시나아제 저해 활성을 측정하였다. 24 well plate에 cell suspension(50000cells/well) 500㎕씩 분주하여 (B16-F10, 제조사 ATCC LOT. 60508145), 24시간 동안 37℃ 및 5% CO₂조건으로 pre-incubation 시켜 cell을 well plate에 부착시켰다.

농도별로 해삼 자숙액 50kDa 이상 분획물 및 50kDa 미만 분획물과, 양성대조군으로 비타민 C, 알부틴을 각 well에 50㎕씩 첨가하여 24시간 동안 37℃ 및 5% CO₂조건으로 incubation시켰다. 트립신 처리(trypsinization)로 얻은 pellet을 1% triton X-100 PBS 0.5ml로 용해시키고, 0.2% L-DOPA 0.1M Sodium phosphate buffer 0.5ml을 혼합한 후, 37℃에서 2시간 배양시키고　490nm에서 흡광도를 측정하였다.

저해율(%) = (대조군의 흡광도 - 첨가군의 흡광도) / 대조군의 흡광도 *100

그 결과, 도 5에 나타난 바와 같이, 해삼 자숙액 유래 분자 크기별(50kDa 이상, 50kDa 미만)의 경우 각각 0.1, 1, 2, 5mg/ml 농도에서 세포 내 티로시나아제(tyrosinase) 활성을 측정 결과, 50kDa 이상 분획물이 50kDa 미만 분획물보다 티로시나아제 저해 활성이 높아 미백 효능이 높게 나타났으며 농도-의존적으로 활성을 나타내었다. 양성 대조군으로는 비타민 C(Ascorbic acid) 및 알부틴을 이용하였다.

5-2. 엘라스타아제( Elastase ) 저해 활성 분석

엘라스타아제(Elastase) 저해 활성 측정을 위하여, 농도별로 해삼 자숙액 50kDa 이상 분획물 및 50kDa 미만 분획물과, 양성대조군으로 비타민 C, 알부틴을 조제하여 10㎕씩 시험관에 취하고, 50mM tris-HCl buffer (pH 8.6)에 녹인 porcine pancreas elastase (10㎍/mL)용액 50㎕을 가한 후 기질로 50mM tris-HCl buffer (pH 8.6)에 녹인 N-succinyl-(L-Ala)₃-p-nitroanilide (0.5mg/mL)을 100㎕첨가하여 20분간 반응시켜 측정하였다. 엘라스타아제 저해 활성은 시료용액의 첨가구와 무첨가구의 흡광도 감소율로 나타내었다.

그 결과, 도 6에 나타난 바와 같이, 해삼 자숙액 유래 분자 크기별 분획물(50kDa 이상, 50kDa 미만)의 경우 각각 0.1, 1, 5, 10mg/ml에서 엘라스타아제 저해능을 측정한 결과 50kDa 이상 분획물이 50kDa 미만 분획물보다 엘라스타아제 저해 활성이 높아 주름개선 효능이 높게 나타났으며 50kDa 이상 분획물은 농도 의존적으로 활성을 나타났다.　양성 대조군 비타민 C(Ascorbic acid)를 이용하였다.

실시예 6. 해삼 자숙액 분획물을 유효성분으로 함유하는 화장품의 임상 시험

6-1. 에센스 제형의 화장품 제조

본 발명의 해삼 자숙액 분획물을 유효성분으로 함유하는 에센스 제형의 화장품을 제조하였다. 구체적인 조성은 표 3에 나타내었다.

원료명	함량
정제수	to 100g
해삼 자숙액 50kDa 이상 분획물	0.01
한방 추출물	0.01
헥산디올	2g
글리세린	3g
병풀추출물	0.1g
니아신아마이드	2g
마린콜라겐	0.5g
히아루론산	2g
아데노신	0.5g
알란토인	0.1g
판테놀	0.5g
솔베이트 80	1g
잔탄검	0.05g
Hydroxyethylcellulose	0.05g

6-2. 피부자극테스트

피험자의 기본정보는 아래 표 4와 같다

전체피험자수	30 명
성별	남: 2 명	여: 28 명
평균연령	41 세

상기 실시예 6-1에서 제조한 해삼 자숙액 분획물을 유효성분으로 함유하는 에센스 제형의 화장품을 이용하여, 24시간 첩포 시험을 실시하였다. 피부에 24시간 동안 패치를 적용하고, 패치 제거 후 30분, 24시간(즉, 패치 적용 후 48시간), 48시간(즉, 패치 적용 후 72시간)에 각각 일차 피부 자극 유무를 피부과 전문의가 판정하였다. 피부 반응 판정은 국제접촉피부염학회(ICDRG) 기준 및 미국화장품협회(PCPC) 가이드라인에 의거하였으며, 각 피험자들의 피부 반응 점수를 이용하여 자극 지수를 산출하였다. 24시간 첩포시험 판정기준은 아래 표 5와 같다. 그 결과, 표 6에 나타난 바와 같이, 피부자극지수 0점을 얻어, 상기 화장품 제형을 무자극 물질로 판단하였다.

점수	판정기준
0(-)	염증의 징후 없음, 정상 피부 (No signs of inflammation, normal skin)
0.5(±)	불확실한 또는 희미한 반응 (Doubtful or slight reaction)
1(+)	희미한 홍반(Slight erythema)
2(++)	부분적인 부종 또는 구진을 동반하거나 동반하지 않은 보통의 홍반 (Moderate erythema with or without partial edema or papules)
3(+++)	미만성 부종을 동반한 보통의 홍반 (Moderate erythema with diffuse edema)
4(++++)	수포와 미만성 부종을 동반한 강한 홍반 Intense erythema with diffuse edema with vesicles

피험자 ID	실시예 6-1의 화장품 제형			BLANK
피험자 ID	24h*	Reaction 48h	72h	24h*	Reaction 48h	72h
1720	0	0	0	0	0	0
1721	0	0	0	0	0	0
1293	0	0	0	0	0	0
1722	0	0	0	0	0.5	0
1018	0	0	0	0	0	0
1349	0	0	0	0	0	0
1724	0	0	0	0	0	0
1526	0	0	0	0	0	0
222	0	0	0	0	0	0
904	0	0	0	0	0	0
1713	0	0	0	0	0	0
1725	0	0	0	0	0	0
1430	0	0	0	0	0	0
1712	0	0	0	0	0	0
1719	0	0	0	0	0	0
1726	0	0	0	0	0	0
1385	0	0	0	0	0	0
674	0	0	0	0	0	0
1072	0	0	0	0	0	0
1482	0	0	0	0	0	0
157	0	0	0	0	0	0
1127	0	0	0	0	0	0
1684	0	0	0	0	0	0
856	0	0	0	0	0	0
1686	0	0	0	0	0	0
892	0	0	0	0	0	0
1309	0	0	0	0	0	0
940	0	0	0	0	0	0
1061	0	0	0	0	0	0
624	0	0	0	0	0	0
자극지수	0			0.006
판정	무자극			-

상기 표에서, "24h*" 는 패치 제거 후 30분 후에 판독한 것이고, "48h" 및 "72h"는 패치 적용 후 48시간 및 72시간 후 판독한 결과를 나타낸다. Blank 시료 바르지 않고 진행한 데이터를 나타낸다.

6-3. 주름개선효능 평가 실험

상기 실시예 6-1에서 제조한 해삼 자숙액 분획물을 유효성분으로 함유하는 에센스 제형의 화장품을 이용하여, 총 22명의 피험자를 대상으로 총 4주간 제품의 눈가주름 개선 효능 임상 시험을 실시하였으며, 중도 탈락자 없이 22명의 피험자가 모두 시험을 완료하였다.

(1) 사용 장비

ANTERA 3D^TM (Miravex, Ireland) : Antera 3D^TM 는 다파장 LED 광원을 이용하여 표피와 진피의 상태를 측정 할 수 있는 장비로 내장 프로그램을 이용하여 이미지의 2차원 및3차원 재구성이 가능하며 파장대별 분석을 진행하였다.

(2) 시험 순서

시험 순서는 사용 전, 사용 후 2주 및 4주로 나누어 측정하였는데, 사용 전 첫 테스트는 방문일 12시간 전부터 기초제품의 사용을 금지하였다. 시험자가 제공하는 기준 세안제를 이용하여 세안한 후, 페이퍼 타올로 가볍게 두드려 물기를 제거한 후, 30분간 항온 항습 조건(20~24℃, 40~60% RH)에서 안정을 한 후 양측 눈가 주름 부위에서 Antera 3D를 이용한 화상측정을 실시하였다. Antera 3D 촬영 구역 설정은 안와 전체 및 양측 눈가를 포함하는 6cmX 6cm 크기의 정방형 구역으로 하였다. 사용 후 2주차, 4주차 테스트는 첫 방문일과 동일한 방법으로 동일한 부위에서 기기평가를 시행하였다.

(3) 평가 및 분석방법

Antera 3D를 이용한 눈가주름 개선효과 평가: 제품 사용 전, 사용 2주 후, 사용 4주 후에 측정된 눈가주름 측정치 간의 통계학적 유의성을 Wilcoxon 부호 순위 검정을 이용해 분석 및 검증하였다.

(4) 시험 결과

도 7, 표 8 및 표 9에 나타난 바와 같이, 시험 부위의 눈가 주름 개선율은 사용 2주 후에 좌측과 우측 눈가 모두 약 0.96%로 확인되었고, 사용 4주 후에는 각각 약 2.21%과 약 1.45%로 확인되었으며, 제품 사용 2주 후부터 지속적으로 사용 전과 비교해서 통계적으로 유의한 수준의 눈가주름 개선율을 보이는 것으로 확인되었다. 또한 4주간의 시험 기간 동안 모든 피험자에서 특별한 이상 반응이 관찰되지 않았다. 결론적으로,　사용 2 주차부터 통계적으로 유의한 수준의 눈가주름 개선 효과를 보였다.

피험자 기본정보는 아래와 같다

전체 피험자수	22명
성별	남: 0명	여: 22명
평균 연령	48세
연령 분포
30대	4 명
40대	8 명
50대	10명

Antera 3D 측정결과 : Indentation index (Wrinkles: small)

피험자 ID	좌측 눈가			우측 눈가
피험자 ID	사용 전	사용 2주후	사용 4주후	사용 전	사용 2주후	사용 4주후
349	69.565	68.950	68.602	68.609	67.899	67.459
1645	70.177	68.855	68.044	69.407	67.718	67.459
1430	66.630	66.627	66.152	67.718	67.661	67.512
1628	67.371	67.290	65.901	68.408	68.368	68.327
1472	71.070	70.995	69.179	69.498	68.920	68.894
1630	68.693	67.888	66.978	68.097	68.163	67.117
1670	69.961	68.927	68.871	69.287	68.891	68.782
1042	73.425	72.455	71.598	65.544	65.064	65.035
1074	73.829	72.637	72.317	69.678	68.836	68.740
1671	71.435	71.242	70.930	69.658	69.040	69.062
1297	68.407	68.422	68.325	68.537	68.463	68.447
1298	68.602	65.852	65.580	67.674	67.463	66.664
1304	73.871	73.766	72.832	70.384	69.238	69.415
1667	76.069	75.765	74.085	75.013	74.788	74.778
1541	72.585	72.336	71.017	72.007	71.940	71.378
892	73.947	72.503	70.608	79.211	77.789	77.681
1637	71.726	71.710	71.383	71.555	71.448	71.364
1292	72.449	72.314	71.192	72.115	70.749	69.692
1370	78.270	77.645	74.248	75.911	71.309	70.590
1672	74.143	73.464	73.007	74.550	74.386	73.289
624	81.529	78.848	77.835	76.145	75.857	74.704
1483	80.724	80.652	80.512	76.303	76.276	76.170

평균 눈가 주름 개선 정도

		사용 전	사용 2주 후	사용 4주 후
좌측눈가	측정값 개선율 P- value	72.476 0% -	71.779*** 0.96% <0.001*	70.873*** 2.21% <0.001
우측눈가	측정값 개선율 P- value	71.150 0% -	70.467*** 0.96% <0.001*	70.116*** 1.45% <0.001

*: P<00.05, **: P<00.01, ***: P<00.001

Claims

해삼 자숙액 분획물을 유효성분으로 포함하고, 상기 해삼 자숙액 분액물은 분자량 50kDa 이상의 당단백질을 포함하는 분획, 상기 분획의 농축물, 또는 상기 분획의 동결건조물인 미백 또는 주름 개선용 화장료 조성물.
삭제
제1항에 있어서, 상기 해삼 자숙액 분획물은,
80 내지 90℃에서 해삼을 자숙하여 해삼 자숙액을 수득하는 단계,
해삼 자숙액을 감압 여과하는 단계, 및
분자량 50kDa 이상의 당단백질을 포함하는 분획물을 분리하는 단계
를 포함하는 공정에 의하여 제조된 것인, 화장료 조성물.
제1항 또는 제3항의 조성물을 포함하는 화장품.
제4항에 있어서, 상기 화장품은 화장수, 유액, 크림, 에센스, 화장연고, 스프레이, 젤, 팩, 선 스크린, 메이크업 베이스, 파운데이션, 파우더, 메이크업 제거제 및 세정제로 구성되는 군으로부터 선택된 1종의 제형을 가지는 것인 화장품.
80 내지 90℃에서 해삼을 자숙하여 해삼 자숙액을 수득하는 단계,
해삼 자숙액을 감압 여과하는 단계, 및
분자량 50kDa 이상의 당단백질을 포함하는 분획물을 분리하는 단계를 포함하는,
제1항의 화장료 조성물을 제조하는 방법.