CN104717965A - 包括槲皮素-3-O-β-D-葡糖苷酸的用于抑制细胞衰老的组合物 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种用于抑制细胞衰老的组合物,包括槲皮素-3-O-β-D-葡糖苷酸(Q3GA)作为有效成分,并且提供一种用于抑制成纤维细胞或脐静脉内皮细胞的细胞衰老或复制性衰老的组合物,成纤维细胞或脐静脉内皮细胞的细胞衰老可通过阿霉素诱导,槲皮素-3-O-β-D-葡糖苷酸(Q3GA)表征为从萹蓄提取物中分离。该组合物通过抑制成纤维细胞或脐静脉内皮细胞的细胞衰老过程,可用于治疗老化相关的疾病,例如皮肤老化、类风湿关节炎、骨关节炎、肝炎、慢性受损的皮肤组织、动脉硬化、前列腺增生、肝癌。
Description
技术领域
本发明涉及一种用于抑制细胞衰老的组合物,包括槲皮素-3-O-β-D-葡糖苷酸(Q3GA)作为活性成分。
背景技术
正常体细胞揭示了由于细胞衰老而造成的有限数量的增殖。细胞衰老是由多种因素所诱导的,如由于DNA末端复制问题造成的端粒缩短(Colladoet al.,Cell.(2007)130:223-233)、肿瘤抑制基因和癌基因的活性改变、炎症、氧化应激化疗剂以及暴露于紫外线照射和电离辐射(Kuilman et al.,Genes&Development.(2010)24:2463-2479)。衰老细胞显示出放大和扁平的细胞形态、生长停滞、在细胞核中的DNA损伤病灶、衰老相关的分泌表型(SASP)和衰老相关的β-半乳糖苷酶(SA-β-gal)活性(Dimri et al.,Proc Natl Acad Sci U S A.(1995)92:9363-9367;Rodier and Campisi,J CellBiol.(2011)192:547-556)。虽然已知不同的因素诱导细胞衰老,但2种肿瘤抑制途径p53/p21和Rb/p16在细胞衰老的调控中发挥关键作用(Campisi,Curr Opin Genet Dev.(2011)21:107-112)。
越来越多的证据表明,细胞衰老有助于组织和有机体老化、组织修复和再生、以及癌症进展和保护。此外,细胞衰老是有时还是多种年龄有关的疾病,包括癌症、动脉粥样硬化、皮肤老化、神经变性疾病、肌肉萎缩、骨质疏松症和良性前列腺增生的发病机制的起因。最近的证据表明在体内抑制细胞衰老或去除衰老细胞可以防止或延缓与年龄有关的组织功能障碍并延长寿命。端粒酶敲除小鼠披露了过早老化的表型,端粒酶缺失小鼠的端粒酶恢复减少了DNA损伤信号,并挽救了多个器官的退行性表型(Jaskelioff et al.,Nature.(2011)469:102-106)。BUBR1早衰样小鼠的中的p16INK4a阳性衰老细胞的消除使年龄相关的组织表型和已建立的与年龄有关的疾病的减毒进展延迟发作(Baker et al.,Nature.(2011)479:232-236)。在小鼠中,肝星状细胞在肝纤维化的过程老化,并且已经知道,肝星状细胞的老化抑制过度肝纤维化。人们已经知道了不被适当控制的过高的p53活性加速衰老,但与此相反,适当的p53活性抑制衰老。
而且,也报道了一些具有细胞衰老抑制作用的材料的研究结果。药物或单一成分,如维生素C、N-乙酰半胱氨酸、NS398和表无羁萜醇抑制细胞衰老(Won-Sang et al.,Nutrition Research and Practice.(2007)1:105-112;Kim etal.,Mech Ageing Dev.(2008)129:706-713;Yang et al.,Planta Med.(2011)77:441-449)。而且,据报道,雷帕霉素在小鼠模型和4,4'-二氨苯砜在线虫中抑制老化相关疾病的产生,以及增大健康调整型预期寿命(Harrison et al.,Nature.(2009)460:392-395;Cho et al.,Proc Natl Acad Sci U S A.(2010)107:19326-19331)。
萹蓄(Polygoni avicularis Herba)也被称为萹蓄草并具有抗氧化作用。也已知它具有各种作用,如:在小鼠模型中提高因电磁波照射所降低的精子流动性;恢复人体牙龈发炎;抑制胆管结扎引起的肝纤维化;恢复对乙酰氨基酚引起的肾毒性;和释放血管平滑肌细胞从而扩张血管(Milan et al.,PakJ Biol Sci.(2011)14:720-724;Sohn et al.,Environ Toxicol Pharmacol.(2009)27:225-230;Yin et al.,J Ethnopharmacol.(2005)99:113-117)。
另一方面,本发明人在韩国专利公开号10-2011-0041710中公开了一种用于抑制老化的药物组合物,包括大黄(Rhei rhizoma)、大蓟(CirsiiRadix)、车前子(Plantaginis semen)、肉桂(Cinnamoni cortex)、Cinnamoni cortex spissus、Euonimi lignum suberalatu、Salicis radicis cortex、萹蓄(Polygoni avicularis herba)和海棠根(Chaenomelis langenariae radix)中的至少一种的药草提取物作为活性成分,但没有提到本公开内容的槲皮素-3-O-β-D-葡糖苷酸(Q3GA)化合物。
发明内容
【技术问题】
本公开内容涉及提供一种用于抑制细胞衰老的组合物,包括槲皮素-3-O-β-D-葡糖苷酸(Q3GA)作为有效成分。
本公开内容还涉及提供一种用于抑制细胞衰老的药物组合物,包括槲皮素-3-O-β-D-葡糖苷酸(Q3GA)作为活性成分,其可对于皮肤老化、类风湿关节炎、骨关节炎、肝炎、慢性受损的皮肤组织、动脉硬化、前列腺增生、肝癌等赋予治疗效果。
本公开内容还涉及槲皮素-3-O-β-D-葡糖苷酸(Q3GA)在制备用于抑制细胞衰老的组合物或用于抑制细胞衰老的方法中的应用,其包括向受试者给予治疗有效量的槲皮素-3-O-β-D-葡糖苷酸(Q3GA)的步骤。
【技术方案】
作为一个总的方面,在本公开内容中,检查了在人成纤维细胞和脐静脉内皮细胞中,12种从萹蓄(Polygoni avicularis herba)提取物分离并纯化的单组分的细胞衰老抑制作用。结果是,发现其中槲皮素-3-O-β-D-葡糖苷酸(Q3GA)抑制在人成纤维细胞和人静脉内皮细胞中的阿霉素诱导的细胞衰老,并且也抑制在复制性衰老诱导的细胞中的细胞衰老,从而完成本公开内容。
本公开内容提供了一种抑制细胞衰老的组合物,包括由以下化学式1表示的槲皮素-3-O-β-D-葡糖苷酸(Q3GA)作为活性成分。具体地,槲皮素-3-O-β-D-葡糖苷酸(Q3GA)可以从萹蓄(Polygoni avicularis Herba)提取物分离,并且更具体地,萹蓄提取物可以通过向萹蓄甲醇提取物中加入蒸馏水和己烷(n-己烷)后分馏,向蒸馏水层中加入乙酸乙酯(EtOAc)后分流,向蒸馏水层中加入丁醇(n-BuOH)后分馏来制备。
<化学式1>
化学式1的槲皮素-3-O-β-D-葡糖苷酸(Q3GA)可以分离自天然材料,具体地,植物。它可以从天然的杂交植物(cross and variety)的各种器官、根、茎、叶、花和植物组织培养提取物中分离。最具体地,它可从萹蓄(Polygoni avicularis Herba)中分离。
具体地,细胞衰老可以是成纤维细胞或脐静脉内皮细胞的衰老或复制性衰老,并且成纤维细胞或脐静脉内皮细胞的衰老可通过阿霉素诱导。
此外,细胞衰老抑制作用可通过测量衰老相关的β-半乳糖苷酶(SA-β-gal)活性的抑制或p53表达的抑制来确定。
此外,本公开内容的组合物可以以选自药物组合物或功能性食品组合物的各种形式来提供。
当本公开内容的组合物是药物组合物时,该药物组合物除了槲皮素-3-O-β-D-葡糖苷酸(Q3GA)外还可含有药学上可接受的载体,并且药学上可接受的载体可以是通常用于配制药物的载体,例如,乳糖、葡萄糖、蔗糖、山梨醇、甘露糖醇、淀粉、阿拉伯树胶、磷酸钙、藻酸盐、明胶、硅酸钙、微晶纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、纤维素、水、糖浆、甲基纤维素、羟苯甲酯、羟苯丙酯、滑石、硬脂酸镁、矿物油等,但不限于此。此外,药物组合物可进一步含有添加剂,如润滑剂、湿润剂、甜味剂、调味剂、乳化剂、悬浮剂和防腐剂。
给予所述药物组合物的方法可以根据细胞衰老的程度来确定,并且一般可以是局部给药方法。此外,在药物组合物中的活性成分的治疗有效量可以因给药途径、疾病的严重程度、患者年龄、性别和体重等等而不同,并且例如,每日剂量可以是0.01至1,000mg/kg,特别是0.1至1,000mg/kg,更具体为0.1至100mg/kg。给药可以是一天一次或一天几次。
药物组合物可以通过各种途径给予哺乳动物受试者,包括大鼠、小鼠、牛和人。可以采用所有的给药途径,例如,口服、直肠、静脉内、肌内、皮下、子宫内、硬膜外或脑室内途径。
药物组合物可以制造成单剂量制剂,或使用药学上可接受的载体和/或赋形剂配制封闭在多剂量小瓶中。此时,该制剂可以是溶液、悬液或乳剂、或酏剂、提取物、粉剂、颗粒、片剂、硬膏剂、洗剂或软膏的形式。
另一方面,该药物组合物可以治疗选自皮肤老化、类风湿关节炎、骨关节炎、肝炎、慢性损伤的皮肤组织、动脉硬化、前列腺增生和肝癌组成组中的任意一种疾病,但不限于此。
此外,当本公开内容是一种食品组合物时,可以并不特别限定食品的种类。可向其中加入槲皮素-3-O-β-D-葡糖苷酸(Q3GA)的食品的例子可以包括肉类、香肠、面包、巧克力、糖果、小吃、糖果、比萨饼、方便面、其他面条、口香糖、乳制品包括冰淇淋、各种汤、饮料、茶、饮料、酒精饮料和综合维生素制剂。
【有益效果】
本发明人证实,从萹蓄(Polygoni avicularis Herba)中分离的槲皮素-3-O-β-D-葡糖苷酸(Q3GA)化合物抑制阿霉素诱导的细胞衰老,并且还抑制在复制性衰老诱导的细胞中的细胞衰老。它可以通过抑制人成纤维细胞和脐静脉内皮细胞的细胞衰老过程,有效地用于治疗衰老相关的疾病,例如,皮肤老化、类风湿关节炎、骨关节炎、肝炎、慢性损伤的皮肤组织、动脉硬化、前列腺增生和肝癌。
附图说明
图1表示在人真皮成纤维细胞(HDF)中槲皮素-3-O-β-D-葡糖苷酸(Q3GA)对阿霉素诱导的细胞衰老的影响。将用500nM阿霉素处理4h的细胞以500个细胞/孔接种在96孔板中。在用增加浓度的Q3GA处理后,将细胞孵育3天,并通过SA-β-gal活性染色来评估细胞衰老。在HDF中的SA-β-gal活性染色(左)和SA-β-gal阳性细胞百分比(右)。示出了3个独立实验的代表性的SA-β-gal染色图片。数值是以一式三份测量的来自3个独立实验的平均值±SD。C,对照;D,二甲亚砜;N,5mM的N-乙酰半胱氨酸;R,500nM雷帕霉素。*p<0.05或**p<0.01vs DMSO。
图2表示在人脐静脉内皮细胞(HUVEC)中槲皮素-3-O-β-D-葡糖苷酸(Q3GA)对阿霉素诱导的细胞衰老的影响。将用500nM阿霉素处理4h的细胞以1,000个细胞/孔接种在96孔板中。在用增加浓度的Q3GA处理后,将细胞孵育3天,并通过SA-β-gal活性染色来评估细胞衰老。在HUVEC中的SA-β-gal活性染色(左)和SA-β-gal阳性细胞百分比(右)。示出了3个独立实验的代表性的SA-β-gal染色图片。数值是以一式三份测量的来自3个独立实验的平均值±SD。C,对照;D,二甲亚砜;N,5mM的N-乙酰半胱氨酸;R,500nM雷帕霉素。*p<0.05或**p<0.01vs DMSO。
图3表示在用阿霉素处理过的HDF和HUVEC中,Q3GA对p53、pS6K和p21蛋白的表达水平的影响。细胞用所示浓度的Q3GA处理1h然后用阿霉素处理并孵育4h。从细胞提取并分离蛋白质。通过Western印迹分析各蛋白质的表达水平。示出3个独立实验的代表性数据。NT,没用阿霉素处理;ADR,阿霉素;C,对照;D,二甲亚砜;N,5mM的N-乙酰半胱氨酸;R,500nM雷帕霉素。
图4代表Q3GA对在HDF中通过阿霉素处理增加的细胞内ROS水平的影响。将用阿霉素处理和未用阿霉素处理的年轻细胞(1.5×105)接种在60mm培养皿中并孵育24h。用10μg/mL的Q3GA、0.5%DMSO、5mM的NAC,或500nM的雷帕霉素处理细胞3天后,将细胞装载到250M的H2DCFDA中20min。通过流式细胞仪测量每个群体10,000个细胞的DCF荧光强度。示出来自三个独立实验的代表性数据。获得中位数荧光强度并比较。数值是来自3个独立实验的平均值±SD。没用阿霉素处理;ADR,阿霉素;C,对照;D,二甲亚砜;N,5mM的N-乙酰半胱氨酸;R,500nM雷帕霉素。*p<0.05vs DMSO。
图5代表Q3GA对在HUVEC中通过阿霉素处理增加的细胞内ROS水平的影响。将用阿霉素处理和未用阿霉素处理的年轻细胞(1.5×105)接种在60mm培养皿中并孵育24h。用10μg/mL的Q3GA、0.5%DMSO、5mM的NAC,或500nM的雷帕霉素处理细胞3天后,将细胞装载到250M的H2DCFDA中20min。通过流式细胞仪测量每个群体10,000个细胞的DCF荧光强度。示出来自三个独立实验的代表性数据。获得中位数荧光强度并比较。数值是来自3个独立实验的平均值±SD。没用阿霉素处理;ADR,阿霉素;C,对照;D,二甲亚砜;N,5mM的N-乙酰半胱氨酸;R,500nM雷帕霉素。*p<0.05vs DMSO。
图6代表Q3GA对HDF的复制性衰老的影响。将老的细胞(3×104/孔)接种在6孔板中,并用或不用10μg/mL的Q3GA孵育3天。通过SA-β-gal的活性染色评估细胞衰老。示出来自三个独立实验的代表性图像。测量SA-β-gal阳性细胞的百分比。数值是来自3个独立实验的平均值±SD。O,老的细胞;D,二甲亚砜;N,5mM的N-乙酰半胱氨酸;R,500nM雷帕霉素。*p<0.05或**p<0.05vs DMSO。
图7代表Q3GA对HUVEC的复制性衰老的影响。将老的细胞(3×104/孔)接种在6孔板中,并用或不用10μg/mL的Q3GA孵育3天。通过SA-β-gal的活性染色评估细胞衰老。示出来自三个独立实验的代表性图像。测量SA-β-gal阳性细胞的百分比。数值是来自3个独立实验的平均值±SD。O,老的细胞;D,二甲亚砜;N,5mM的N-乙酰半胱氨酸;R,500nM雷帕霉素。*p<0.05或**p<0.05vs DMSO。
具体实施方式
现在将描述实施例和实验。以下实施例和实验仅用于说明目的,并且不意欲限制本公开内容的范围。
<实施例1>槲皮素-3-O-β-D-葡糖苷酸(Q3GA)的分离及结构鉴定
1、槲皮素-3-O-β-D-葡糖苷酸(Q3GA)的分离
依次用70%、90%和100%的MeOH回流24小时提取萹蓄(P.aviculare L.)的干燥的地上部分(9kg),并且将合并的MeOH溶液蒸发至干燥(1.4kg)。将干燥的MeOH提取物(1.4kg)再悬浮于1.5L蒸馏水中,溶液依次用正己烷(1.5L×3)、乙酸乙酯(EtOAc,1.5升×3)和正丁醇(正丁醇,1.5升×3)进行分层。干燥后,得到正己烷(120g)、乙酸乙酯(65g)、n-BuOH(140g)和H2O(21g)4种溶剂提取物。
将n-BuOH提取物(10g)装入Sephadex LH-20柱(4×90cm),并且用MeOH洗脱柱。基于TLC将洗脱液组合,得到17种馏分(PAB 1-17)。这些馏分中,通过用MeOH-H2O(梯度由15%至35%)的逆相柱色谱(4×50cm),PAB 12给出槲皮素-3-O-β-D-葡糖苷酸(Q3GA,PAC11,15mg)。Q3GA溶解于二甲亚砜,然后处理细胞。
2、槲皮素-3-O-β-D-葡糖苷酸的结构鉴定
通过将下述光谱分析数据与基准进行比较,鉴定从萹蓄提取物分离的槲皮素-3-O-β-D-葡糖苷酸的化学结构(J.agric.Food Chem.1998,46,4898-4903)(化学式1)。光谱分析数据如下。
棕色粉末,C22H20O12m.p.190-192℃1H-NMR(250MHz,甲醇-d4)7.92~7.76(2H,m,H-2',6'),6.84(1H,d,J=9.0Hz,H-5'),6.38(1H,d,J=2.0Hz,H-8),6.19(1H,d,J=2.0Hz,H-6),5.33(1H,d,J=7.4Hz,H-1"),3.77(1H,d,J=9.5Hz,H-5"),3.42-3.62(3H,m,H-2",3",4")13C-NMR(62.9MHz,甲醇-d4)179.2(C=O),172.3(C-6"),166.0(C-7),163.0(C-5),159.0(C-2),158.4(C-9),150.0(C-4'),146.0(C-3'),135.4(C-3),123.5(C-6'),122.8(C-1'),117.2(C-5'),116.0(C-2'),105.6(C-10),104.3(C-1"),99.9(C-6),94.8(C-8),77.6(C-3"),77.1(C-5"),75.4(C-2"),72.9(C-4")阳性FABMS m/z 460.1[M-OH+H]+-24.5°(c0.66MeOH)。
<化学式1>
<实施例2>槲皮素-3-O-β-D-葡糖苷酸(Q3GA)在人类成纤维细胞和脐静脉内皮细胞中的细胞衰老抑制作用的检查
1、材料
从Lonza(Walkersvill,MD,USA)获得人真皮成纤维细胞(HDF)和人脐静脉内皮细胞(HUVEC)。Dulbecco改良的Eagle培养基(DMEM),胎牛血清(FBS)和青霉素-链霉素溶液分别来自WelGene(大邱,韩国)。表皮细胞生长培养基-2(EGM-2)来自Lonza(Walkersvill,MD,USA)。针对p53和p21的抗体来自Santa CruzBiotech.Inc.(Santa Cruz,CA,USA),并且针对磷酸化S6激酶的抗体来自Cell Signaling Technology Inc.(Beverly,MA,USA)。针对甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)的兔多克隆抗体由K.S.Kwon博士惠赠(KRIBB,大田,韩国)。阿霉素购自IIdong制药有限公司(首尔,韩国)。
2、细胞培养
将在含10%FBS和1%抗生素(青霉素10,000单位/mL和链霉素10,000mg/mL)的DMEM中的HDF以每100mm培养皿中1×105个细胞接种,并于37℃在5%CO2加湿空气中孵育。当传代培养达到80-90%汇合时,通过胰蛋白酶消化进行连续传代。在相同的条件下培养在EGM-2培养基中的HUVEC。监测群体倍增(PDS)数量用于进一步的实验。PD是使用几何公式计算:PD=log2F/log2I(F,最终细胞数;I,初始细胞数)。PD<35的HDF和PD<30的HUVEC用于阿霉素诱导的细胞衰老。PD>75的HDF和在PD>50的HUVEC用作复制性衰老下的老的细胞。
3、诱导细胞衰老的阿霉素处理
将在DMEM培养基中的HDF或在EGM-2培养基中的HUVEC以每100mm培养皿1.5×105个细胞铺板。于37℃在CO2培养箱中孵育3天后,除去细胞培养基。用含有1%抗生素的DMEM漂洗3次后,将在含10%FBS和1%抗生素的DMEM中的HDF和在EGM-2中的HUVEC在5%CO2培养箱中孵育4天。通过衰老相关的β-半乳糖苷酶(SA-β-gal)活性染色来确认阿霉素诱导的细胞衰老。
4、单一化合物对阿霉素诱导的细胞衰老的影响的检查
检查单一化合物是否对阿霉素诱导的细胞衰老有效。将用阿霉素处理4小时的细胞用胰蛋白酶-EDTA从培养皿分离。成纤维细胞制成在含10%胎牛血清和1%抗生素的DMEM培养基中5,000个细胞/ml的细胞浓度,而脐静脉内皮细胞制成在EGM-2培养基中10,000个细胞/ml的细胞浓度,然后将它们100ml分到96孔细胞培养板的各孔中。最后,将500细胞的成纤维细胞和1,000细胞的脐静脉内皮细胞分别分到各孔中,然后培养在37℃,在5%CO2培养箱中培养1天。向每个孔中分别进一步加入100ml的含有10%胎牛血清和1%抗生素的DMEM培养基以及EGM-2培养基,并随之将萹蓄(Polygoni avicularis Herba)单一化合物处理为10mg/ml的浓度。分别将作为阴性对照组的二甲基亚砜,以及作为阳性对照组的5mM的N-乙酰半胱氨酸的和500nM雷帕霉素加入到细胞中。然后,在37℃将细胞在5%CO2培养箱中培养3天。通过MTT测定法来检查细胞生长程度,并通过衰老相关的β-半乳糖苷酶(SA-β-gal)活性染色测定法检查细胞衰老程度。
5、MTT法
由3-(4,5-二甲基-2-基)-2,5-二苯基溴化物(MTT)测定法测量细胞生长程度。向96孔培养板的各孔中加入50μl的0.1%MTT溶液,并于37℃在5%CO2培养箱中反应3小时。除去培养基和MTT溶液,然后向其中加入100μl二甲基亚砜以溶解形成的晶体。使用酶标仪测量在550nm处的吸光度。
6、衰老相关的β-半乳糖苷酶(SA-β-GAL)活性染色
通过SA-β-GAL活性染色检查单一成分对细胞衰老的影响。各单一成分在24孔培养板或12孔培养板中处理3天,然后用磷酸盐缓冲液洗涤细胞。用3.7%多聚甲醛固定细胞后,向24孔的各孔中分别加入250μl的SA-β-gal染色溶液[40mM柠檬酸/磷酸盐,pH 5.8,5mM亚铁氰化钾,5mM铁氰化钾,150mM NaCl,2mM MgCl2,1mg/ml的X-gal]并向12孔的各孔中分别加入500μl的SA-β-gal染色溶液。将平板用铝箔包裹,然后在37℃反应16小时至18小时。将细胞用磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤2次,然后用1%伊红溶液染色1分钟。将细胞用磷酸盐缓冲液洗涤2次,然后用光学显微镜观察染成蓝色的细胞。通过细胞计数来测量SA-β-gal活性的程度,其生物溶质染成蓝色,在总共约50至100细胞中并显示为百分比(%)。
7、细胞蛋白提取
每种细胞都分到60mm培养皿中至1×105细胞数,然后于37℃在5%CO2培养箱中培养。将细胞用含有抗生素的DMEM培养基洗涤两次,并于此对萹蓄(Polygoni avicularis Herba)提取物的馏分和所述化合物通过浓缩预处理1小时,接着通过500nM阿霉素处理4小时。除去培养基,然后用磷酸盐缓冲液洗涤细胞一次。向其中加入50μl细胞裂解溶液[25mM的Tris-HCl(pH 7.6),150mM NaCl,1%Tryton X-100,0.5%脱氧胆酸钠,0.1%SDS,1mM钒酸钠,5mM NaF,蛋白酶抑制剂或1mM的PMSF]。使用细胞刮刀来收集整个溶液和细胞,然后转移到离心管中。将管在冰上反应30min同时每10min振荡溶液。将管以12,000×g离心10min,然后将上清转移到新管中。通过二辛可宁酸(BCA)法,使用牛血清白蛋白作为标准蛋白质,量化在溶液中的蛋白质的量(Pierce Biotechnology Inc.,RockfordIL,USA)。
8、Western印迹分析
通过10%SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白(30μg)。将蛋白转移到硝酸纤维素膜,然后反应,在含有5%的干全脂奶的Tween-20-Tris缓冲盐水(TTBS)中反应1小时。将硝酸纤维素膜与含有抗p53或p21的初级抗体的5%干全乳-TTBS溶液过夜反应。将膜用TTBS溶液洗涤三次,然后与辣根过氧化物酶缀合的第二抗体反应3小时。每5分钟用TTBS洗涤膜,然后使用增强的化学发光溶液测定p53、p21和PS6的量。通过使用LAS-3000成像系统(Fujifilm Corp.,Stanford,CT,USA)测定与每种抗体反应的特异性蛋白质的量。通过使用甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)抗体来证实在每个实验中是否使用相同量蛋白质。
9、细胞内活性氧物种(ROS)浓度的测量
每种细胞都分到100mm培养皿中至1.5×105细胞数,然后于37℃在5%CO2培养箱中培养3天。将细胞用含有抗生素的DMEM培养基洗涤两次,然后向其中通过500nM阿霉素处理4小时。通过胰蛋白酶-EDTA溶液(2.5%)处理将细胞分离出来,然后再分到60mm培养皿中至1×105的细胞数,接着于37℃在5%CO2培养箱中培养。更换培养基,然后用10μg/ml槲皮素-3-O-β-D-葡糖苷酸处理细胞。将作为阴性对照组的二甲基亚砜以及作为阳性对照组的5mM的N-乙酰半胱氨酸和500nM雷帕霉素分别加入到细胞中。将细胞于37℃在5%CO2培养箱中培养3天,用含有抗生素的DMEM培养基洗涤两次,然后用250μM的H2DCFDA处理20min。将细胞用磷酸盐缓冲液洗涤2次,通过胰蛋白酶-EDTA溶液(2.5%)处理来分离接着转移到微离心管中。将管以12,000×g离心10min,然后弃去上清液。用1ml的含有2%胎牛血清的磷酸盐缓冲液洗涤细胞,然后再次以12,000×g离心10min。如上所述洗涤细胞两次,然后向其中加入1ml的1%多聚甲醛。使用BD FACS Canto II流式细胞仪(BD Biosciences,圣何塞,加利福尼亚州)测量ROS。
10、统计分析
每个实验3套重复3次或更多次,然后计算平均和标准偏差。采用Student t检验分析统计学显著性,且p值小于0.05(p<0.05)被认为是显著的。
11、结果
起初,测量从萹蓄分离的Q3GA是否在HDF和HUVEC中表现出毒性。结果是,在10μg/mL化合物时没有观察到细胞毒性。然后通过观察SA-β-gal活性染色,调查了Q3GA是否会对用公知的细胞衰老标记阿霉素处理的HDF和HUVEC的细胞衰老有抑制作用。并且,将其与N-乙酰半胱氨酸(NAC)和雷帕霉素比较,报告有细胞衰老的抑制作用。首先,用10μg/mL的Q3GA处理经阿霉素处理过的细胞,3天后,由SA-β-gal的活性染色比较衰老程度。结果是,在HDF和HUVEC两者中,由阿霉素处理所诱导的增加的SA-β-gal活性染色被Q3GA处理减少(图1和图2)。此外,检查了Q3GA的细胞衰老的抑制作用是否是浓度依赖性的。结果是,确认了当Q3GA浓度增加时,阿霉素诱导增加的SA-β-gal活性减少(图1和图2)。
此外,蛋白质p53和p21是公知的细胞衰老中由阿霉素处理所增加的标记物。因此,通过免疫印迹测量了Q3GA是否降低在阿霉素处理的细胞中的p53和p21的表达水平。结果是,Q3GA以浓度依赖的方式降低了在HDF和HUVEC两者中由阿霉素处理的p53和p21蛋白的水平。
由于已知在阿霉素诱导的细胞衰老过程中,细胞内的ROS水平在细胞中增加,通过测量细胞内DCF荧光强度,评估了Q3GA是否会降低在HDF和HUVEC中通过阿霉素处理增加的ROS。结果是,Q3GA降低了通过阿霉素处理增加的细胞内ROS水平(图4和图5)。总之,证实了在HDF和HUVEC中,从萹蓄纯化的Q3GA对阿霉素诱导的细胞衰老的抑制作用。
同时,由于Q3GA抑制在HDF和HUVEC中阿霉素诱导的细胞衰老,阐明了在这两种类型的细胞中Q3GA是否也逆转复制性衰老。在HDF和HUVEC中,通过继代培养诱导复制性衰老。而且,检查了增加Q3GA的浓度同时,在老的细胞中的SA-β-gal活性。结果是,Q3GA以浓度依赖的方式降低在HDF和HUVEC中复制性衰老(图6和图7)下的SA-β-gal活性,这表明除了阿霉素诱导的细胞衰老外,Q3GA还可能能够挽救HDF和HUVEC中的复制性衰老。
数据表明,通过SA-β-gal活性和p53和p21蛋白的水平所证实,Q3GA抑制了由阿霉素处理诱导的过早衰老以及复制性衰老。
总之,发现从萹蓄纯化的Q3GA对在HDF和HUVEC中的细胞衰老有抑制作用。这种化合物可以是用于开发膳食补充剂或化妆品来调节组织老化或老化相关疾病的有希望的候选者。
本领域技术人员将理解,在前面的描述中公开的概念和具体实施例可以容易地用作修改或设计用于执行本公开内容的相同目的的其他实施例的基础。本领域技术人员还将理解,这种等同实施例不脱离本公开内容的精神和如所附权利要求中阐述的范围。
Claims (11)
1.一种用于抑制细胞衰老的组合物,包括由以下化学式1表示的槲皮素-3-O-β-D-葡糖苷酸(Q3GA)作为活性成分
2.根据权利要求1的用于抑制细胞衰老的组合物,其中所述槲皮素-3-O-β-D-葡糖苷酸(Q3GA)是从萹蓄(Polygoni avicularis Herba)提取物分离的。
3.根据权利要求2的用于抑制细胞衰老的组合物,其中所述萹蓄提取物是通过向萹蓄甲醇提取物中加入蒸馏水和己烷(n-己烷)后分馏,向蒸馏水层中加入乙酸乙酯(EtOAc)后分流,向蒸馏水层中加入丁醇(n-BuOH)后分馏来制备的。
4.根据权利要求1的用于抑制细胞衰老的组合物,其中所述细胞衰老是成纤维细胞或脐静脉内皮细胞的衰老或复制性衰老。
5.根据权利要求4的用于抑制细胞衰老的组合物,其中成纤维细胞或脐静脉内皮细胞的衰老是阿霉素诱导的。
6.根据权利要求1的用于抑制细胞衰老的组合物,其中抑制细胞衰老的效果是通过测量抑制衰老相关的β-半乳糖苷酶(SA-β-gal)活性或抑制p53表达来确定的。
7.根据权利要求1的用于抑制细胞衰老的组合物,其是药物组合物。
8.根据权利要求7的用于抑制细胞衰老的组合物,其中所述药物组合物用于治疗选自皮肤老化、类风湿关节炎、骨关节炎、肝炎、慢性损伤的皮肤组织、动脉硬化、前列腺增生和肝癌的组中的任意一种疾病。
9.根据权利要求1的用于抑制细胞衰老的组合物,其是食品组合物。
10.由以下化学式1表示的槲皮素-3-O-β-D-葡糖苷酸(Q3GA)在制备用于抑制细胞衰老的组合物中的应用
11.一种抑制细胞衰老的方法,包括向有需要的受试者给予治疗有效量的由以下化学式1表示的槲皮素-3-O-β-D-葡糖苷酸(Q3GA)的步骤
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