SK40599A3 - Antibody against human parathormone related peptides - Google Patents

Description

Predkladaný vynález sa týka ľudskéj/myšej chimérickej protilátky obsahujúcej variabilný región (V región) myšej monoklonálnej protilátky proti proteinu príbuznému s paratyroidálnym hormónom a konštantný región (C región) ľudskej protilátky, humanizované protilátky, v ktorej sú komplementaritu určujúce regióny ľahkého reťazca (L rečazca) a ťažkého reťazca (H reťazca) V regiónov myšej monoklonálnej protilátky proti proteinu príbuznému s paratyroidálnym hormónom (PTHrP) prenesené na ľudskú protilátku, L a H reťazcov uvedenej protilátky, rovnako ako polypeptidu obsahujúceho V región tvoriaci L alebo H reťazec uvedenej protilátky.

Predkladaný vynález sa tiež týka DNA obsahujúcej sekvencie báz kódujúcej uvedenú protilátku, najmä jej V región a DNA kódujúcej L alebo H reťazec obsahujúci V región. Ďalej sa predkladaný vynález týka rekombinantného vektora obsahujúceho uvedenú DNA a hostiteľa transformovaného uvedeným vektorom.

Ďalej sa predkladaný vynález týka spôsobov na prípravu chimérických a humanizovaných protilátok proti PTHrP. Ešte ďalej sa predkladaný vynález týka farmaceutického prostriedku a činidiel potlačujúcich hyperkalcémiu alebo zlepšujúcich hypofosfatémiu, ktoré obsahujú protilátku proti PTHrP ako účinnú zložku.

DoterajSí stav techniky

Hyperkalcémia spojená s malígnymi nádormi je vážnou komplikáciou, ktorá sa vyskytuje u 5 až 20% vSetkých pacientov s malígnymi nádormi a je považovaná za terminálny príznak malígneho nádoru, pretože vedie s istotou k smrti, ak nie je liečená. Kontrola hyperkalcémie môže priaznivo ovplyvniť prognózu a QOL (kvalitu života) pacienta; preto bude mať klinický význam.

VSeobecne, hyperkalcémia u pacientov s malígnymi nádormi je delená na HHM (humorálna hyperkalcémia u malignít), ktorá vzniká v dôsledku tumorom produkovaných humorálnych faktorov na resorpciu kostí a LOH (lokálna osteolytická hyperkalcémia), ktorá vzniká v dôsledku lokálneho účinku nádoru disseminovaného do kosti alebo infiltrujúceho kosť. U HHM sa usudzuje, že kostná resorpcia alebo osteolýza spôsobuje zvýšený výdaj vápnika a spôsobuje hyperkalcémiu spolu so zníženou schopnosťou ľadvín vylučovať vápnik (s: Hada and N. Nagata, Internal Medicine, 69: 644-648).

Hyperkalcémia sa prejavuje, pokiaľ koncentrácia vápnika v sére prekročí 12 mg/dl; ako jej príznaky sú v ranom Štádiu u pacientov s malígnym nádorom nešpecifický pozorované anorexie (nechutenstvá), nauzie a emesie (zvracanie). Pri zhoršení anorexie vedie redukcia koncentračnej schopnosti ľadvín, ktorá je spôsobená léziou distálnych tubulov, k hyperuréze (polyurii) a anorexia a nauzea sú sprevádzané dehydratáciou spôsobenou nedostatočným spätným vychytávaním vody.

Ako humorálne faktory spôsobujúce HHM u pacientov s hyperkalcémiou spojenou s malígnymi nádormi identifikoval Moseley, J.M. et al. proteín príbuzný s paratyroidálnym hormónom (tu ďalej označovaný ako PTHrP), čo je substancia podobná paratyroidálnemu hormónu (PTH): Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1987) 84: 5048-5052.

Potom bol izolovaný gén kódujúci PTHrP (Suva, L.J. et al., Science (1987) 237: 893) a pri jeho analýze bolo zistené, že existujú tri druhy ľudského PTHrP majúce 139, 141 a 173 aminokyselín, čo je spôsobené alternatívnym zostrihom génu, a že v krvi sú prítomné rôzne fragmenty, čo je spôsobené obmedzenou degradáciou PTHrP (1-139) majúceho úplnú štruktúru: Baba, H. Clinical Calcium (1995) 5: 229-223. V PTHrP je 8 aminokyselín z Nkoncových 13 aminokyselín identických s aminokyselinami PTH a je odvodené, že aminokyselinové miesto na pozícii 14 až 34 má sterickú štruktúru tiež rovnakú ako PTH; preto sa PTHrP a PTH viažu na spoločný PTH/PTHrP receptor aspoň v Nkoncovom regióne: Jueppner, H. et al., Science (1991) 254: 1024-1026; AbouSamra, A-B. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1992) 89: 2732-2736.

Je opísaná produkcia PTHrP v mnohých nádorových tkanivách a bol zistený aj mimo nádory, napríklad v rôznych normálnych tkanivách plodov až dospelých jedincov, vrátane kože, centrálneho nervového systému, maternice, placenty, prsnej žľazy v laktácii, Štítnej žľazy, pri&títnych teliesok, nadobličiek, pečene, obličiek a močového mechúra: Burtis, W.J. Clin. Chem. (1992) 38: 2171-2183; Stewart, A.F. and Broadus, A.E. J. Clin. Endocrinol. (1991) 71: 1410-1414. Ďalej, usudzuje sa, že PTHrP má významnú úlohu pri regulácii metabolizmu vápnika, ktorý je udržiavaný na vySšej koncentrácii vo fatálnom až novorodeneckom období, než je u matky.

V súčasnosti je známe, že PTH/PTHrP receptory sú prítomné najmä v kostiach a obličkách (C. Shigeno, Clinical Calcium (1995) 5: 355-359) a že aktivujú po väzbe PTHrP na receptory mnoho intracelulárnych systémov prenosu signálu. Jedným z nich je adenylatcykláza a iným je fosfolipáza C. Aktivácia adenylatcyklázy zvyšuje koncentráciu intracelulárneho cAMP na aktiváciu proteínkinázy A. Fosfolipáza C spôsobuje rozklad fosfatidylinozitol-4,5bifosfonátu za vzniku inozitol-1,4,5-trifosfonátu a diacylglycerolu. V týchto systémoch prenosu signálu je obsiahnutý G-proteín: Coleman, D.T et al., Biochemical Mechanisms of parathyroid hormone action, v The parathyroids (Bilezikian J.P. et al., Raven Press, New York (1994), strana 239).

Prostredníctvom týchto systémov prenosu signálu spôsobuje PTHrP hyperkalcémiu, hypofosfatémiu, znižuje renálnu schopnosť resorpcie fosfátov, zvyšuje renálnu exkréciu cAMP a podobné javy, ktoré sú pozorované pri HHM.

Tak bolo zistené, že PTHrP úzko súvisí s hyperkalcémiou spojenou s malígnymi nádormi. Pri liečbe hyperkalcémie spojenej s malígnymi nádormi sa používa kalcitonín, steroidné prípravky, indometacín, anorganické fosfátové soli, bisfosfonáty a podobne, rovnako ako dodávanie tekutín. Tieto činidlá však môžu mať redukovaný účinok po opakovanom podaní, môžu mať niektoré závažné nežiaduce účinky alebo môžu mať pomalý nástup farmakologického účinku; v súlade s tým je žiaduce použitie činidiel alebo liečiv, ktoré majú vyšší terapeutický účinok a menej nežiaducich účinkov.

Na druhej strane, ako nový pokus o liečbu hyperkalcémie spojenej s malígnymi nádormi opisuje Kukreja, S.S. et. al., že pri podaní neutralizačného antiséra proti PTHrP atypickým myšiam, ktorým boli na vyvolanie hyperkalcémie transplantované ľudské bunky nádoru pľúc alebo laryngu, boli koncentrácie vápniku v krvi a koncentrácie cAMP v moči redukované: J. Clin. Invest. (1998), 82: 1798-1802. Knji sato et al. opisujú, že pri podaní protilátky proti PTHrP (1-34) holým myšiam, ktorým bol transplantovaný ľudský nádor produkujúci PTHrP, bola hyperkalcémie redukovaná a čas života myší bol značne predĺžený: J. Bone and Mine. Res. (1993) 8: 849860. Ďalej, japonská otvorená patentová prihláška č. 4-228089 opisuje myšie/ľudské chimérické protilátky proti ľudskému PTHrP (1-34).

Myšie monoklonálne protilátky sú vysoko imunogénne (niekedy sa tiež používa výraz antigénne) u ľudí, Co obmedzuje terapeutickú hodnotu myších monoklonálnych protilátok u ľudí. Napríklad, myšia protilátka môže byt metabolizovaná ako cudzorodá látka pri podaní ľuďom; preto je polčas myšej protilátky relatívne krátky u ľudí a nevykazuje predpokladané účinky. Ďalej, ľudské anti-myšie protilátky (ΗΆΜΆ) namierené proti podanej myšej protilátke môžu vyvolávač imunitné odpovede, ktoré sú nepríjemné a nebezpečné pre pacientov, ako je sérová choroba alebo iné alergické reakcie. V súlade s tým nemôžu byt myšie monoklonálne protilátky podávané ľuďom často.

Na riešenie týchto problémov boli vyvinuté metódy na redukciu imunogenicity non-ľudských protilátok, napríklad myších monoklonálnych protilátok. Jednou z týchto metód je výroba chimérickej protilátky, v ktorej je variabilný región (V región) odvodený z myšej monoklonálnej protilátky a konštantný región (C región) je odvodený z vhodnej ľudskej protilátky.

Keďže má výsledná chimérická protilátka intaktný variabilný región pôvodnej myšej protilátky, je možné očakávat, že sa chimérická protilátka bude viazat na antigén s rovnakou äpecificitou ako pôvodná myšia protilátka. Ďalej, taká chimérická protilátka má významne redukovanú čast aminokyselinovej sekvencie odvodenej od iného živočícha, než človeka; preto sa predpokladá, že bude mat nižšiu imunogenicitu v porovnaní s pôvodnou myšou protilátkou. Aj keď sa chimérická protilátka viaže na antigén ekvivalentne k pôvodnej myšej protilátke a zároveň vykazuje nižšiu imunogenicitu, môžu byt ešte stále vyvolané nejaké imunitné odpovede proti myšiemu variabilnému regiónu: LoBuglio, A.F. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 4220-4224, 1989.

Druhý spôsob na redukciu imunogenicity myších protilátok je ešte zložitejší, ale očakáva sa u neho vyššia redukcia potenciálnej imunogenicity myších protilátok. V tomto spôsobe sú na ľudský variabilný región prenesené iba komplementaritu určujúce regióny (CDR) variabilného regiónu myšej protilátky a je vytvorený pretvorený ľudský variabilný región. Ak je to žiaduce, môže byt čiastočná aminokyselinová sekvencia regiónu pracovného rámca (FR) nesúca CDR vo variabilnom regióne myšej protilátky prenesená na ľudský variabilný región, aby bola štruktúra CDR v pretvorenom ľudskom variabilnom regióne bližšia k štruktúre pôvodnej myšej protilátky.

Potom sú tieto humanizované, pretvorené variabilné regióny kombinované s ľudskými konštantnými regiónmi. V konečne pretvorenej, humanizovanéj protilátke sú častami odvodenými z non-ľudských aminokyselinových sekvencií iba CDR a veľmi malé časti FR. CDR sú zložené z hypervariabilnej aminokyselinovej sekvencie a nevykazujú žiadne druhovo špecifické sekvencie. Preto nebude mat humanizované protilátka obsahujúca myšiu CDR žiadnu silnejSiu imunogenicitu, než prirodzená ľudská protilátka obsahujúca ľudské CDR.

Ďalšie odkazy na humanizované protilátky sú v Riechmann, L. et al., Náture, 332: 323-327, 1988; Verhoeye, N. et al., Science, 239: 1534-1536, 1988; Kettleborough, C.A. et al., Protein Engng., 4: 773-783, 1991; Maeda, H. et al., Human Antibodies and Hybridoma, 2: 124-134, 1991; Gorman, S.D. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 4181-4185, 1991; Tempest P.R. et al., Bio/Technology 9: 266-271, 1991; Co, M.S. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 2869-2873, 1991; Carter, P. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 42854289, 1992; Co, M.S. et al., J. Immunol. 148: 1149-1154, 1992; a Sato, K. et al., Cancer Res. 53: 851-856, 1993.

Aj keď sa očakáva, že humanizované protilátky sú použiteľné na uvedené účely, nie je v uvedených odkazoch uvedená ani naznačená žiadna humanizované protilátka proti PTHrP. Ďalej, neexistujú žiadne Štandardizované prostriedky vSeobecne použiteľné na akékoľvek protilátky v procese na prípravu humanizovaných protilátok; rôzne prostriedky a spôsoby sú nutné na výrobu humanizovanéj protilátky vykazujúcej dostatočnú väzbu, neutralizačnú aktivitu pre Špecifický antigén: pozri napríklad Sato, K. et al., Cancer Res., 53:

851-856,

1993.

Podstata vynálezu

Predmetom predkladaného vynálezu je ľudská/myšia chimérická protilátka obsahujúca variabilný región (V región) myšej monoklonálnej protilátky proti PTHrP a konštantný región (C región) ľudskej protilátky, humanizovanej protilátky, v ktorej sú komplementaritu určujúce regióny ľahkého reťazca (L reťazca) a ťažkého reťazca (H reťazca) V regiónov myšej monoklonálnej protilátky prenesené na ľudskú protilátku, L a H reťazcov uvedenej protilátky, rovnako ako polypeptidu obsahujúceho V región tvoriaci L alebo H reťazec uvedenej protilátky.

Iným predmetom predkladaného vynálezu je DNA obsahujúca sekvenciu báz kódujúca uvedenú protilátku, najmä jej V región a DNA kódujúca L a H reťazec obsahujúca polypeptid obsahujúci V región. Ešte iným predmetom predkladaného vynálezu je rekombinantný vektor obsahujúci uvedenú DNA a hostiteľ transformovaný uvedeným vektorom. Ďalej, predmetom predkladaného vynálezu je spôsob na prípravu chimérických a humanizovaných protilátok proti PTHrP. Ešte ďalším predmetom predkladaného vynálezu je protilátka proti PTHrP majúca vysokú neutralizačnú aktivitu. Ešte ďalším predmetom predkladaného vynálezu je farmaceutický prostriedok a hyperkalcémiu potláčajúce, hypofosfatémiu zmierňujúce alebo alkalózu zmierňujúce činidlo obsahujúce protilátku alebo humanizovanú protilátku proti PTHrP ako účinnú zložku.

V dôsledku dôkladného štúdia uvedených predmetov vynálezcovia úspešne získali protilátku, v ktorej je imunogenicita myšej monoklonálnej protilátky proti PTHrP redukovaná u ľudí; tak bol uskutočnený predkladaný vynález.

Predkladaný vynález je zameraný na chimérický L reťazec obsahujúci C región L reťazca ľudskej protilátky a V región L reťazca myšej monoklonálnej protilátky proti PTHrP. V región L reťazca zahŕňa jeden z regiónov obsahujúcich aminokyselinovú sekvenciu podľa SEQ ID NO: 45 a C región L reťazca zahŕňa Ολ región.

Predkladaný vynález je tiež zameraný na chimérický H reťazec obsahujúci C región H reťazca ľudskej protilátky a V región H reťazca myšej monoklonálnej protilátky proti PTHrP. V región H reťazca zahŕňa jeden z regiónov obsahujúcich aminokyselinovú sekvenciu podľa SEQ ID NO: 46 a C región L reťazca zahŕňa Cyl región.

Ďalej sa predkladaný vynález týka chimérickej monoklonálnej protilátky proti PTHrP obsahujúcej uvedený chimérický L reťazec a uvedený chimérický H reťazec.

Ešte ďalej predkladaný vynález zahŕňa polypeptid obsahujúci V región L reťazca humanizovanej protilátky obsahujúcej regióny pracovných rámcov 1 až 4

V regiónu L reťazca ľudskej protilátky a komplementaritu určujúce regióny 1 až 3 V regiónu L reťazca mySej monoklonálnej protilátky proti PTHrP. Komplementaritu určujúce regióny 1 až 3 zahŕňajú tie, ktoré obsahujú aminokyselinovú sekvenciu podľa SEQ ID NO: 59-61, v príslušnom poradí; regióny pracovných rámcov 1 až 3 zahŕňajú tie regióny, ktoré sú odvodené od regiónov pracovných rámcov 1 až 3 ľudskej protilátky HSU03868, v príslušnom poradí a región pracovného rámca 4 zahŕňa tie regióny, ktoré sú odvodené od regiónu pracovného rámca 4 ľudskej protilátky S25755; alebo regióny pracovných rámcov 1 až 3 zahŕňajú tie regióny, ktoré sú v podstate identické s regiónmi pracovných rámcov 1 až 3 ľudskej protilátky HSU03868, v príslušnom poradí a región pracovného rámca 4 zahŕňa taký región, ktorý je v podstate identický s regiónom pracovného rámca 4 ľudskej protilátky S25755.

Termín v podstate identický, ako je tu použitý, znamená, že regióny pracovných rámcov ľudskej protilátky použité v humanizovanej protilátke môžu mať delécie, náhrady a/alebo adície aminokyselín nutných na tvorbu konqalementaritu určujúcich regiónov myšej monoklonálnej protilátky tak, že humanizovaná protilátka bude mať aktivitu ekvivalentnú aktivite myšej monoklonálnej protilátky.

Tak je predkladaný vynález zameraný na polypeptid obsahujúci V región L reťazca humanizovanej protilátky, kde v regiónoch pracovných rámcov sú na 36. a 49. aminokyselinovej pozícii podľa Kabata (Kabat, E.A., US Dept. Health and Human Services, US Government Printing Offices, 1991) tyrozín a kyselina asparágová, v príslušnom poradí.

Predkladaný vynález je tiež zameraný na polypeptid obsahujúci V región L reťazca humanizovanej protilátky obsahujúci aminokyselinovú sekvenciu v akejkoľvek zo SEQ ID NO: 48-51.

Ďalej je predkladaný vynález zameraný na polypeptid obsahujúci V región L reťazca humanizovanej protilátky, kde v regiónoch pracovných rámcov sú na

45. a 87. aminokyselinovej pozícii podľa Kabata lyzín a izoleucín, v príslušnom poradí.

Ešte ďalej je predkladaný vynález zameraný na polypeptid obsahujúci V región L reťazca humanizovanej protilátky obsahujúci aminokyselinovú sekvenciu uvedenú v akejkoľvek zo SEQ ID NO: 52-55.

Predkladaný vynález tiež zahŕňa polypeptid obsahujúci V región H reťazca humanizovanej protilátky obsahujúcej regióny pracovných rámcov 1 až 4 V regiónu H reťazca ľudskej protilátky a komplementaritu určujúce regióny 1 až 3 V regiónu H reťazca myšej monoklonálnej protilátky proti PTHrP. Komplementaritu určujúce regióny nezahŕňajú tie, ktoré obsahujú aminokyselinovú sekvenciu podľa SEQ ID NO: 62-64, v príslušnom poradí; regióny pracovných rámcov 1 až 4 zahŕňajú tie regióny, ktoré sú odvodené od regiónov pracovných rámcov 1 až 4 ľudskej protilátky patriacej do ľudskej podskupiny III (Human Subgroup III (HSG III), Kabat, E.A. et al., US Dept. Health and Human Services, US Government Printing Offices, 1991), presnejšie tie regióny, ktoré sú odvodené od regiónov pracovných rámcov 1 až 4 ľudskej protilátky S31679, v príslušnom poradí alebo regióny, ktoré sú v podstate identické s regiónmi pracovného rámca 1-4 ľudskej protilátky S31679, v príslušnom poradí.

Ďalej je predkladaný vynález zameraný na polypeptid obsahujúci V región H reťazca humanizovanej protilátky obsahujúci aminokyselinovú sekvenciu uvedenú v SEQ ID NO: 56.

Predkladaný vynález tiež zahŕňa L reťazec humanizovanej protilátky proti ľudskému PTHrP obsahujúci polypeptid obsahujúci V región L reťazca uvedenej humanizovanej protilátky a polypeptid obsahujúci C región L reťazca ľudskej protilátky. C región obsahuje Čk región, regióny pracovných rámcov 1 až 3 zahŕňajú tie regióny, ktoré sú v podstate identické s regiónmi pracovných rámcov 1 až 3 ľudskej protilátky HSU03868, v príslušnom poradí, región pracovného rámca 4 zahŕňa ten región, ktorý je v podstate identický s regiónom pracovného rámca 4 ľudskej protilátky S25755 a aminokyselinové sekvencie komplementaritu určujúcich regiónov 1 až 3 zahŕňajú tie, ktoré sú uvedené v SEQ ID NO: 59-61, v príslušnom poradí.

Ďalej, predkladaný vynález tiež zahŕňa H reťazec humanizovanej protilátky proti ľudskému PTHrP obsahujúci polypeptid obsahujúci C región H reťazca a V región H reťazca uvedenej humanizovanej protilátky. C región obsahuje Cyl región, regióny pracovných rámcov 1 až 4 zahŕňajú tie regióny, ktoré sú v podstate odvodené od regiónov pracovných rámcov 1 až 4 ľudskej protilátky patriacej k HSGIII; komplementaritu určujúce regióny 1 až 3 zahŕňajú tie, ktoré obsahujú aminokyselinovú sekvenciu uvedenú v SEQ ID NO: 62-64, v príslušnom poradí.

Ešte ďalej sa predkladaný vynález tiež týka anti PTHrP protilátky so slabou antigenicitou a vysokou neutralizačnou aktivitou. Protilátky proti PTHrP zahŕňajú ľudské protilátky, humanizované protilátky, chimérické protilátky a primatizované protilátky, ktoré môžu byť použité na liečbu ľudských ochorení. Ďalej, protilátka podľa vynálezu má vysokú neutralizačnú aktivitu v dôsledku nízkej disociačnej konštanty a preto môže byť použitá na liečbu ľudských ochorení.

Protilátka podľa predkladaného vynálezu má disociačnú konštantu l,86xl0'⁷ (M) alebo nižšiu, disociačnú rýchlostnú konštantu 1,22x1ο¹ (1/s) alebo nižšiu a asociačnú rýchlostnú konštantu 6,55x10* (1/M.s) alebo vyššiu.

Tieto konStanty môžu byt merané Scatchardovou analýzou pomocou RI značených ligandov alebo pri použití senzoru povrchovej plazmónovej rezonancie.

Predkladaný vynález je tiež zameraný na DNA obsahujúcu sekvenciu báz kódujúcu V región L retazca alebo V región H reťazca mySej monoklonálnej protilátky proti ľudskému PTHrP. V región L reťazca a V región H reťazca zahŕňajú tie, ktoré obsahujú aminokyselinovú sekvenciu podľa SEQ ID NO: 4546, v príslušnom poradí, DNA obsahujúcu sekvenciu báz kódujúcu V región L reťazca zahŕňa, napríklad, DNA podľa SEQ ID NO: 65 a DNA obsahujúcu sekvenciu báz kódujúcu V región H reťazca zahŕňa, napríklad, DNA podľa SEQ ID NO: 57.

Ďalej sa predkladaný vynález tiež týka DNA kódujúcej uvedené chimérické L a H reťazce. DNA kódujúca uvedený L reťazec zahŕňa, napríklad, DNA obsahujúcu sekvenciu báz podľa SEQ ID NO: 65 a DNA kódujúca uvedený H reťazec zahŕňa, napríklad, DNA obsahujúcu sekvenciu báz podľa SEQ ID NO: 57.

ESte ďalej je predkladaný vynález tiež zameraný na DNA obsahujúcu sekvenciu báz kódujúcu V región L reťazca alebo V región H reťazca uvedenej humanizovanej protilátky. DNA obsahujúca sekvencia báz, kódujúca V región L reťazca, zahŕňa, napríklad DNA obsahujúcu sekvenciu báz podľa ktorejkoľvek zo SEQ ID NO: 66-74 a DNA obsahujúca sekvenciu báz kódujúca V región H reťazca zahŕňa, napríklad, DNA podľa SEQ ID NO: 58.

Predkladaný vynález sa tiež týka DNA pre V región L reťazca humanizovanej protilátky obsahujúcej sekvenciu báz kódujúcu aminokyselinovú sekvenciu podľa akejkoľvek zo SEQ ID NO: 47-55. Uvedená DNA zahŕňa DNA obsahujúcu sekvenciu báz podľa akejkoľvek zo SEQ ID NO: 66-74.

ESte ďalej sa predkladaný tiež týka DNA pre V región H reťazca humanizovanej protilátky obsahujúci sekvenciu báz kódujúcu aminokyselinovú sekvenciu podľa SEQ ID NO: 56. Uvedená DNA zahŕňa DNA obsahujúcu sekvenciu báz podľa SEQ ID NO: 58.

Predkladaný vynález sa tiež týka rekombinantného vektora obsahujúceho akúkoľvek z uvedených DNA.

Predkladaný vynález sa tiež týka transformantov transformovaných uvedeným rekombinantným vektorom.

Predkladaný vynález sa tiež týka spôsobu prípravy chimérickej alebo humanizovanej protilátky proti ľudskému proteínu príbuznému s paratyroidálnym hormónom, ktorý obsahuje kultiváciu uvedeného transformantu a odber chimérickej alebo humanizovanej protilátky proti ľudskému proteínu príbuznému s paratyroidálnym hormónom z výslednej kultúry.

Ešte ďalej sa predkladaný vynález tiež týka farmaceutického prostriedku a hyperkalcémiu potláčajúceho, hypofosfatémiu zmierňujúceho činidla obsahujúceho uvedenú protilátku ako účinnú zložku. Hyperkalcémia je spôsobená malígnym nádorom a hypofosfatémia je často pozorovaná pri pacientoch trpiacich hyperkalcémiou spojenou s malígnymi nádormi. Tak môže byt protilátka podľa predkladaného vynálezu použitá pri liečbe malígnych nádorov alebo na zlepšenie príznakov hyperkalcémie alebo hypofosfatémie. Malígne nádory zahŕňajú, ale nie sú obmedzené na nádory vybrané zo skupiny skladajúcej sa z nádorov podžalúdkovej žľazy, pľúc, hltanu, hrtanu, jazyka, ďasien, pažeráku, žalúdka, žlčových ciest, pŕs, obličiek, močového mechúra, maternice a prostaty a malígnych lymfómov. Činidlo potláčajúce hyperkalcémiu podľa predkladaného vynálezu je použiteľné pre akýkoľvek nádor, ktorý spôsobuje hyperkalcémiu.

Predkladaný vynález bude opísaný ďalej.

1. Produkcia myších monoklonálnych protilátok proti ľudskému PTHrP.

Myšie monoklonálne protilátky proti PTHrP môžu byt pripravené pomocou hybridômov vzniknutých fúziou buniek medzi myelômovými bunkami a bunkami produkujúcimi protilátky, ktoré sú získané od zvierat imunizovaných antigénom a selekciou klonov produkujúcich protilátky špecificky inhibujúce aktivitu PTHrP zo vzniknutých hybridômov.

(1) Príprava antigénov

PTHrP použitý na imunizáciu zvierat zahŕňa peptidy majúce celú alebo časť aminokyselinovej sekvencie PTHrP pripraveného rekombinantnou DNA technológiou alebo chemickou syntézou, a PTHrP získaný zo supernatantov nádorových buniek spôsobujúcich hyperkalcémiu. Napríklad, peptid PTHrP(1-34) obsahujúci 1. až 34. aminokyselinu známeho PTHrP (Kemp, B.E. et al., Science (1987) 238: 1568-1570) môže byt použitý ako antigén. Ľudský PTHrP(1-34) má aminokyselinovú sekvenciu uvedenú v SEQ ID NO: 75.

Vzniknutý PTHrP je naviazaný na proteínový nosič, ako tyreoglobulín a potom nasleduje pridanie pomocného činidla. Môže byt pridané akékoľvek pomocné činidlo, vrátane Freundovho kompletného a inkompletného adjuvans.

(2) Imunizácia a získanie buniek produkujúcich protilátku

Získaný antigén sa podá cicavcovi, ako napríklad myš, krysa, kôň, opica, králik, koza alebo ovca. Imunizácia môže byt uskutočnená akoukoľvek známou technikou, vrátane intravenóznej, subkutánnej a intreperitoneálnej injekcie. Intervaly medzi injekciami na imunizáciu nie sú presne určené a môžu byt od niekoľkých dní do niekoľkých týždňov, výhodne 4 až 21 dní.

Dva až tri dni po konečnej imunizácii sa získajú bunky produkujúce protilátky. Bunky produkujúce protilátky zahŕňajú bunky sleziny, lymfatických uzlín a krvi; obyčajne sa použijú bunky sleziny. Jednotlivá dávka antigénu, ktorá je použitá na imunizáciu, je lOOpg na myš.

(3) Určenie titrov protilátok

Na určenie hladín imunitnej odpovede u imunizovaných zvierat a hybridómov u vybraných buniek, ktoré boli podrobené fúzii, sa meria titer protilátky v krvi imunizovaných zvierat alebo titer protilátky v supernatante buniek produkujúcich protilátku.

Spôsoby detekcie protilátok sú známe a zahŕňajú EIA (Enzýmový imunotest), RIA (rádioaktívne značený imunotest) a ELISA (enzýmový imunosorbentný test).

(4) Fúzie buniek

Myelčmové bunky použité na fúziu s bunkami produkujúcimi protilátky zahŕňajú bunkové línie, ktoré sú získané od rôznych živočíchov, ako myši, krysy alebo ľudia a sú zvyčajne odborníkom v odbore známe. Vhodnými bunkovými líniami sú tie línie, ktoré majú liekovú rezistenciu, ktoré nie sú životaschopné v selektívnom médiu, ako je HAT médium v nefúzovanom stave a ktoré sú životaschopné iba vo fúzovanom stave. Obyčajne sú použité bunkové línie rezistentné na 8-azaguanín, ktorým chýba hypoxantín-guanínfosforibozyltransferáza a nie sú schopné rastu v hypoxantínaminopteríntymidínovom (HAT) médiu.

Vhodné myelómové bunky zahŕňajú rôzne bunkové línie, ako je P3 (P3x63Ag8.653) (J. Immunol. (1979) 123: 1548-1550); P3x63Ag8U.l (Current Topics in Microbiology and Immunology (1978) 81: 1-7); NS-1 (Kohler, G. a Milstein, C., Eur., J. Immunol. (1976) 6: 511-519); MPC-11 (Nargulies, D.H. et al., Celí (197) 8: 405-415); SP2/0 (Shulman, M. et al., Náture (1978) 276: 269-270); FO (de St. Groth, S: F. et al., J. Immunol. Methods (1980) 35: 1-21); S194 (Trowbridge, I.S., J. Exp. Med. (1978) 148: 313-323); a R210 (Galfre, G. et al., Náture (1979) 277: 131-133).

Bunky produkujúce protilátky môžu byt získané z buniek sleziny, buniek lymfatických uzlín a podobne. To znamená, že slezina lebo lymfatická uzlina a pod. je odstránená alebo odobratá z ktoréhokoľvek z uvedených zvierat a tkanivo je rozrušené. Vzniknutý rozrušený materiál sa suspenduje v médiu alebo pufri, ako je PBS, DMEM alebo RPMI1640, filtruje sa cez oceľové sito alebo podobný prostriedok a centrifúguje sa na prípravu požadovaných buniek produkujúcich protilátky.

Potom sa uvedené myelómové bunky a bunky produkujúce protilátky podrobia bunkovej fúzii.

Fúzia buniek môže byt uskutočnená kontaktovaním myelómových a protilátku produkujúcich buniek v pomere 1:1 až 1:10 v médiu na kultiváciu zvieracích buniek, ako je MEM, DMEM alebo RPME-1640, za prítomnosti fúzneho akcelerátora pri 30-37°C počas 1 až 15 minút. Na akceleráciu fúzie môže byt použitý fúzny akcelerátor alebo vírus, ako je polyetylénglykol s primérovou molekulovou hmotnosťou 1000 až 6000, polyvinylalkohol alebo Sendai vírus. Fúzia buniek môže byt tiež uskutočnená v komerčne dostupnom prístroji na fúziu , ktorý využíva elektrickú stimuláciu, ako je elektroporácia.

(5) Selekcia a klonovanie hybridómov

Požadované hybridômy sa selektujú z buniek po bunkovej fúzii, napríklad technikou využívajúcou selektívny rast buniek v selektívnom médiu.

To znamená, že suspenzie buniek sa riedia vhodným médiom a inokuluje sa na mikrotitračnú platňu. Selektívne médium, ako HAT médium, sa pridá do každej jamky a vykoná sa inkubácia pri správnej výmene čerstvého selektívneho média.

Rastúce bunky sú odobraté ako hybridômy.

Tieto hybridômy sa potom vyšetrujú limitným riedením, fluorescenciou aktivovaným triedením alebo iným spôsobom. Nakoniec sa získajú hybridômy produkujúce monoklonálnu protilátku.

(6) Odber monoklonálnych protilátok

Spôsoby na odber monoklonálnych protilátok zo získaných hybridómov zahŕňajú bežné techniky kultivácie buniek a tvorby ascitu.

V technike kultivácie buniek sa hybridômy kultivujú v médiu na kultiváciu zvieracích buniek, ako je RPMI-1640 médium obsahujúce 10 až 20% fetálne hovädzie sérum, MEM médium alebo bezsérové médium, pri bežných podmienkach (napr. 37°C, 5% CO,) počas 2 až 14 dní a protilátky sa získajú zo supernatantu.

Pri tvorbe ascitu sa hybridômy inokulujú intraperitoneálne rovnakému druhu cicavca, ktorý je zdrojom myelómových buniek, takže hybridômy rastú v nadmernom množstve. Po 1 až 4 týždňoch sa odoberie ascites alebo sérum.

Ak je v týchto technikách nevyhnutné prečistenie protilátok, vyberú sa známe techniky, ako je vyzrážanie síranom amónnym, iónomeničová chromatografia a afinitná chromatografia, alebo sa kombinujú.

2. Konštrukcia chimérických protilátok (1) Klonovanie DNA obsahujúcej sekvenciu báz kódujúcu V región myšej monoklonálnej protilátky proti ľudskému PTHrP (i) Príprava mRNA

Na klonovanie DNA obsahujúcej sekvenciu báz kódujúcu V región myšej monoklonálnej protilátky proti ľudskému PTHrP sa získané hybridómy spracujú bežným spôsobom, napríklad guanidínovou ultracentrifugáciou (Chirgwin, J.M. et al., Biochemistry (1979) 18: 5294-5299), alebo AGCP technikou (Chomzynski, P. et al., Analytical Biochemistry (1987) 162: 156-159), na prípravu celkovej RNA, z ktorej sa pripraví mRNA napríklad pomocou Oligo(dT)-celulózovej preklenovacej kolóny pripojenej na mRNA Purification Kit (Pharmacia). Quick Prep mRNA Purification Kit (Pharmacia AB) môže byt tiež použitý na prípravu mRNA bez nutnosti extrakcie celkovej RNA.

(ii) Príprava a amplifikácia cDNA

Z mRNA získanej v kroku (i) sa syntetizuje každá cDNA vo V regiónoch L a H reťazcov pomocou reverznej transkriptázy. V syntéze cDNA môže byt použitý Oligo-dT primér alebo iný vhodný primér, ktorý hybridizuje na C región L alebo H reťazce, napr. MHC2 primér majúci sekvenciu báz podľa SEQ ID NO: 1.

Pri syntéze cDNA sa uvedená mRNA a primér zmieša a reakcia sa vykoná za prítomnosti reverznej transkriptázy, napríklad pri 52°C počas 30 minút.

Amplifikácia cDNA pre L a H reťazce môže byť uskutočnená PCR (polymerázovou reťazovou reakciou) podľa 5'-RAČE metódy (Frohman, M.A. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 8998-9002, 1988; Belyavsky, A. et al., Nucleic Acids Res., 17: 2919-2932, 1989) pomocou 5*-Ampli FINDER RAČE Kit-u (Clontech Inc.). Tak je Ampli FINDER Anchor (SEQ ID NO: 42) naviazaná na 5'koniec cDNA syntetizovanej vyššie a PCR sa prevedie pre DNA obsahujúce sekvencie báz kódujúce C regióny L a H reťazcov. (Tu je DNA obsahujúca sekvenciu báz kódujúcu V región L· reťazca niekedy označená jednoducho ako DNA pre V región L reťazca alebo DNA kódujúca V región L reťazca. Toto platí tiež pre V región H reťazca, C región, atď.).

Primér, ktorý môže byť použitý na amplifikáciu DNA pre V región L reťazca môže byť napríklad Anchor primér (SEQ ID NO: 2) a priméry navrhnuté pre konzervované sekvencie v konštantnom regióne LX reťazca (C λ región) myších protilátok, ako MLC primér, majúci sekvenciu báz SEQ ID NO: 4. Primér pre amplifikáciu DNA pre V región H reťazca môže byť napríklad Anchor primér (SEQ ID NO: 2) a MHC-G1 primér (SEQ ID NO: 3) (S.T. Jones et al., Biotechnology, 9, 88, 1991).

(iii) Prečistenie DNA a určenie sekvencie báz

Produkty PCR sa podrobia elektroforéze na agarózovom géli podľa bežných techník na excisiu požadovaných DNA fragmentov, ktoré sa potom odoberú, prečistia a ligujú sa na vektorovú DNA.

Prečistenie DNA môže byť vykonané pomocou komerčne dostupných kitov, ako je GENECLEAN II; BI0101. Vhodná vektorová DNA pre tieto DNA fragmenty je napríklad pUC19 alebo Bluescript.

Uvedená DNA a vektorová DNA sa ligujú pomocou známych ligačných kitov (Takara Shuzo) za vzniku rekombinantného vektora. Vzniknutý rekombinantný vektor sa vloží do napríklad Escherichia coli JM109 a selektujú sa kolónie rezistentné na ampicilín; tak je vektorová DNA pripravená známou technikou: J. Sambrook et al., Molecular Cloning), Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989. Po trávení vektorovej DNA reštrikčnými enzýmami je sekvencia báz požadovanej DNA určená známou technikou, ako dideoxy technika: J. Sambrook et al., Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989. V predkladanom vynáleze môže byť použitý automatický prístroj na určenie sekvencie báz (DNA Sequencer 373A; ABI Inc.).

(iv) Komplementaritu určujúci región

V regióny H a L reťazca tvoria väzbové miesto pre antigén a ich úplné Štruktúry majú určitú vzájomnú podobnosť. To znamená, že štyri regióny pracovných rámcov (FR) sú viazané pomocou troch hypervariabilných regiónov, alebo komplementaritu určujúcich regiónov (CDR). Aminokyselinová sekvencia v FR je relatívne dobre konzervovaná, pričom variabilita aminokyselinovej sekvencie v CDR regióne je veľmi vysoká; Kabat, E.A. et al., Seguence of Proteins of Immunological Interest, U.S. Dept. Health and Human Services, 1983.

Mnoho častí štyroch FR má štruktúru β-listu a v dôsledku toho tvoria tri CDR slučku. CDR môže niekedy tvoriť časť štruktúry β-listu. Preto sú tri CDR stericky držané vo veľmi blízkych vzájomných pozíciách FR, čo vytvára väzbové miesto pre antigén spolu s tromi CDR v párových regiónoch.

Vo svetle týchto skutočností môžu byť CDR regióny zistené porovnaním aminokyselinovej sekvencie vo variabilnom regióne myšej monoklonálnej protilátky proti ľudskému PTHrP a databáz aminokyselinových sekvencií pre protilátky, ktoré pripravil Kabat, E.A. et al., (Sequence of Proteins of Immunological Interest, U.S. Dept. Health and Human Services, 1983) pre výskum homológie medzi týmito sekvenciami.

(2) KonStrukcia expresného vektora chimérickej protilátky.

Po klonovani DNA fragmentov kódujúcich V regióny L a H reťazcov mySej monoklonálnej protilátky (tu môže byť ďalej L a H reťazec protilátky oznaCovaný ako myší L reťazec atď. pre mySie protilátky a ľudský H reťazec atď. pre ľudské protilátky) sú DNA kódujúce myšie V regióny a DNA kódujúce konštantné regióny ľudskej protilátky ligované a exprivované pri získaní chimérických protilátok proti ľudskému PTHrP.

Štandardná technika na prípravu chimérických protilátok obsahuje ligáciu myšej vedúcej sekvencie a sekvencie V regiónu prítomnej v klenovej cDNA do sekvencie kódujúcej C región ľudskej protilátky, ktorá je už prítomná v expresnom vektore cicavčej bunky. Alternatívne sú myšie vedúce sekvencie a sekvencie V regiónu prítomné v klonovanej DNA ligované do sekvencie kódujúcej C región ľudskej protilátky a potom nasleduje ligácia na expresný vektor cicavčej bunky.

Polypeptid obsahujúci C región ľudskej protilátky môže byť akýkoľvek z C región H alebo L reťazca ľudskej protilátky, vrátane, napríklad, Cyl, Cy2, Cy3 alebo Cy4 pre ľudské H reťazce a Cy alebo Ck pre L reťazce.

Na prípravu chimérickej protilátky sú najprv vyrobené dva expresné vektory; to znamená, že je konštruovaný expresný vektor obsahujúci DNA kódujúcu V región myšieho L reťazca a C región ľudského L reťazca pod kontrolou regiónu na kontrolu expresie, ako systém zosilňovač/promotor, a expresný vektor; to znamená, je konštruovaný expresný vektor obsahujúci DNA kódujúcu V región myšieho H reťazca a C región ľudského H reťazca pod kontrolou regiónu na kontrolu expresie, ako je systém zosilňovač/promotor. Potom sú hostiteľské bunky, ako cicavčie bunky, súčasne transformované týmito expresnými vektormi a transformované bunky sú kultivované in vitro alebo in vivo za produkcie chimérickej protilátky; pozri napríklad HO91/16928.

Alternatívne sú myšie vedúce sekvencie prítomné v klonovanej DNA a DNA kódujúcej V región myšieho L reťazca a C región ľudského L reťazca, rovnako ako myšie vedúce sekvencie a DNA kódujúca V región myšieho H reťazca a C región ľudského H reťazca vložené do jediného expresného vektora (pozri napríklad HO94/11523) a uvedený vektor sa použije na transformáciu hostiteľských buniek; potom sa transformovaná hostiteľská bunka kultivuje in vitro alebo in vivo za získania požadovanej chimérickej protilátky.

(i) Produkcia H reťazca chimérickej protilátky

Vektor na expresiu H reťazca chimérickej protilátky môže byť získaný vložením cDNA obsahujúcej sekvenciu báz kódujúcu V región myšieho H reťazca (tu tiež označovanej ako cDNA pre V región H reťazca) do vhodného expresného vektora obsahujúceho genómovú DNA obsahujúcu sekvenciu báz kódujúcu C región H reťazca ľudskej protilátky (tu tiež označovanou ako genómová DNA pre C región H reťazca) alebo cDNA kódujúca uvedený región (tu tiež označovanú ako cDNA pre C región H reťazca). C región H reťazca zahŕňa, napríklad, Cfl, Cy2, Cy3 alebo Cy4 regióny.

(i-a) Konštrukcia expresného vektora pre chimérický H reťazec, ktorý obsahuje genómovú DNA kódujúcu C región H reťazca

Expresné vektory obsahujúce genómovú DNA kódujúcu C región H reťazca, najmä tie vektory, ktoré kódujú Cyl región, zahŕňajú napríklad, HEF-PMh-gyl (HO 92/19759) a DHFR-Δ E-RVh-PMl-f (HO 92/19759).

Po inzercii cDNA kódujúcej V región myšieho H reťazca do týchto expresných vektorov, môže byť vhodná sekvencia báz vložená do uvedenej cDNA pomocou PCR techniky. Napríklad, PCR môže byť uskutočnená pomocou PCR priméru, ktorý je navrhnutý tak, že uvedená cDNA má rozpoznávaciu sekvenciu pre vhodný reštrikčný enzým a jej 5' koniec a Kozákovu konsenzuálnu sekvenciu bezprostredne pred jej iniciačným kodónom takú, že je zlepšená účinnosť transkripcie, rovnako ako pomocou PCR priméru, ktorý je navrhnutý tak, že uvedená cDNA má rozpoznávaciu sekvenciu pre vhodný reštrikčný enzým a jej 3'koniec a donorové miesto na riadny zostrih primárnych produktov transkripcie genómovej DNA za vzniku mRNA, pre vloženie týchto vhodných sekvencií báz do expresného vektora.

Potom je takto vyrobená cDNA kódujúca V región myšieho H reťazca spracovaná vhodným reštrikčným enzýmom a je inzertovaná do uvedeného expresného vektora na výrobu expresného vektora pre chimérický H reťazec, ktorý obsahuje genómovú DNA kódujúcu C región H reťazca (Ογΐ región).

(i-b) Konštrukcia expresného vektora pre chimérický H reťazec, ktorý obsahuje cDNA obsahujúcu sekvenciu báz kódujúcu C región H reťazca.

Expresné vektory obsahujúce cDNA kódujúcu C región H reťazca, ako je Cyl región, môžu byť vyrobené nasledujúcim spôsobom: mRNA sa pripraví z CHO buniek, do ktorých boli vložené expresný vektor DHFR-ÁE-RVh-PMl-f (pozri WO 92/19759) obsahujúci DNA kódujúcu V región H reťazca humanizovanej PM1 protilátky a genómová DNA pre C región CylH reťazca ľudskej protilátky (N. Takahashi et al., Celí, 29: 671-679 (1982)) a expresný vektor RVl-PMla (pozri HO 92/19759) obsahujúci genómovú DNA kódujúcu V región L reťazca humanizovanej PM1 protilátky a genómovú DNA C regiónu Lk reťazca ľudskej protilátky, a cDNA kódujúcu V región H reťazca humanizovanej PM1 protilátky a cDNA kódujúcu C región (Cyl) H reťazca ľudskej protilátky sa klonujú RT-PCR technikou a ligujú sa na expresný vektor pre expresiu v živočíšnych bunkách, ktorý sa spracuje vhodným reštrikčným enzýmom, za vzniku požadovaného expresnOho vektora.

Ak je cDNA kódujúca V región myšieho H reťazca priamo ligovaná na cDNA kódujúcu C región Cyl H reťazca ľudskej protilátky, potom môže byť vhodná sekvencia báz vložená do fragmentu obsahujúceho cDNA kódujúcu V región H reťazca pomocou PCR. Napríklad, PCR môže byť vykonaná pomocou PCR priméru, ktorý je navrhnutý tak, že uvedená cDNA má rozpoznávaciu sekvenciu pre vhodný reštrikčný enzým a jej 5'-koniec a Kozákovu konsenzuálnu sekvenciu bezprostredne pred jej iniciačným kodónom takú, že je zlepšená účinnosť transkripcie, rovnako ako pomocou PCR priméru, ktorý je navrhnutý tak, že uvedená cDNA má rozpoznávaciu sekvenciu pre vhodný reštrikčný enzým a jej 3'koniec pre priame ligovanie C regiónu Cyl H reťazca, na vloženie týchto vhodných sekvencií báz do uvedenej cDNA.

Potom je takto vyrobená cDNA kódujúca V región myšieho H reťazca spracovaná vhodným reštrikčným enzýmom, je ligovaná na cDNA kódujúcu uvedený C región Cyl H reťazca a je inzertovaná do expresného vektora, ako pCOSl alebo pCHOl na výrobu expresného vektora, ktorý obsahuje cDNA kódujúcu chimérický H reťazec.

(ii) Produkcia L reťazca chimérickej protilátky

Vektor na expresiu L reťazca chimérickej protilátky môže byť získaný ligovaním cDNA kódujúcej V región myšieho L· reťazca a genómovej DNA alebo cDNA kódujúcej C región L reťazca ľudskej protilátky a ich vložením do vhodného expresného vektora. C región L reťazca zahŕňa, napríklad κ alebo λ reťazec.

(ii-a) Konštrukcia expresného vektora, ktorý obsahuje cDNA kódujúcu chimérický LX reťazec

Po konštrukcii expresného vektora obsahujúceho cDNA kódujúcu V región myšieho L reťazca môže byť vhodná sekvencia báz vložená do uvedeného expresného vektora pomocou PCR techniky. Napríklad, PCR môže byť vykonaná pomocou PCR priméru, ktorý je navrhnutý tak, že uvedená cDNA má rozpoznávaciu sekvenciu pre vhodný reštrikčný enzým a jej 5'- koniec a Kozákovu konsenzuálnu sekvenciu, takže je zlepšená účinnosť transkripcie, rovnako ako pomocou PCR priméru, ktorý je navrhnutý tak, že uvedená cDNA má rozpoznávaciu sekvenciu pre vhodný reštrikčný enzým a jej 3'- koniec, na vloženie týchto vhodných sekvencií báz do uvedenej cDNA.

Úplná sekvencia báz cDNA kódujúca C región ľudského LX reťazca môže byť syntetizovaná na DNA syntezátore a vyrobená pomocou PCR. Je známe, že C región ľudského LX reťazca má aspoň 4 rôzne izotypy a že každý izotyp môže byť použitý na konštrukciu expresného vektora. Napríklad, na základe vyhľadávania homológie s C regiónmi LX reťazca klonovaných myších monoklonálnych protilátok môže byť vybraný izotyp Mcg+Ke+Oz- fragmentu C regiónu ľudského LX reťazca (prírastkové č. X57819) (P. Dariavach et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84: 9074-9078) a môže byť použitý na konštrukciu expresného vektora. Na konštrukciu cDNA pre známe C regióny ľudských LX reťazcov, ako je Mcg+Ke+Oz-, napríklad môžu byť použité nasledujúce štyri priméry, ako sú uvedené v SEQ ID NO: 11-14: Priméry MBC1HPG1 (SEQ ID NO: 11) a MBC1HGP3 (SEQ ID NO: 14) majú sense DNA sekvencie a priméry MBC1HPG2 (SEQ ID NO: 12) a MBC1HGP4 (SEQ ID NO: 14) majú antisense DNA sekvencie, kde každý primér má 20-23 bp komplementárne sekvencie s ďalšími primérmi.

MBC1HGPS (SEQ ID NO: 15) a MBC1HGPR (SEQ ID NO: 16) sa nazývajú externé priméry a majú sekvencie homologické s MBC1HGP1 a MBC1HGP4, v príslušnom poradí, a každý má rozpoznávaciu sekvenciu pre vhodný reštrikčný enzým. V PCR technike sú štyri priméry zostavené tak, aby bola syntetizovaná úplná cDNA a externé priméry sa pridajú na amplifikáciu cDNA.

Zostavenie pomocou PCR znamená, že MBC1HGP1 a MBC1HGP2 alebo MBC1HGP3 a MBC1HGP4 sú tepelne spracované cez ich komplementárne sekvencie, čo vedie k syntéze MBC1HGP1-MBC1HGP2 fragmentu a MBC1HGP3-MBC1HGP4 fragmentu a každý fragment je znova tepelne spracovaný cez ich komplementárne sekvencie, čo vedie k syntéze cDNA kódujúcej úplný C región ľudského LX reťazca.

Takto konštruovaná cDNA kódujúca C región ľudbkého Lk reťazca a predtým konštruovaná cDNA kódujúca V región myšieho L reťazca môžu byt ligované medzi vhodné miesta pre reštrikčný enzým a môžu byt inzertované do expresného vektora, ako je pCOSl alebo pCHOl za vzniku expresného vektora, ktorý obsahuje cDNA kódujúcu Ιιλ reťazec chimérickej protilátky.

(ii-b) Konštrukcia expresného vektora, ktorý obsahuje cDNA kódujúcu chimérický Lk reťazec

Po konštrukcii expresného vektora obsahujúceho cDNA kódujúcu V región myšieho L reťazca môže byt vhodná sekvencia báz vložená do uvedeného expresného vektora pomocou PCR techniky. Napríklad, PCR môže byt vykonaná pomocou PCR priméru, ktorý je navrhnutý tak, že uvedená cDNA má rozpoznávaciu sekvenciu pre vhodný reštrikčný enzým a jej 5'-koniec a Kozákovu konsenzuálnu sekvenciu, takže je zlepšená účinnosť transkripcie, a pomocou PCR priméru, ktorý je navrhnutý tak, že uvedená cDNA má rozpoznávaciu sekvenciu pre vhodný reštrikčný enzým a jej 3'-koniec, na vloženie týchto vhodných sekvencií báz do uvedenej cDNA.

DNA kódujúca C región ľudského Lk reťazca, ktorá má byt ligovaná do DNA kódujúcej V región myšieho L reťazca, môže byt konštruovaná napríklad z HEFPMlk-gk obsahujúceho genómovú DNA (pozri HO 92/19759).

Rozpoznávacie sekvencie pre vhodné reštrikčné enzýmy môžu byt vložené, pomocou PCR techniky, do 5'- a 3'- koncov DNA kódujúca C región Lk reťazca a DNA kódujúca V región myšieho L reťazca, ako boli konštruované vyššie a DNA kódujúca C región Lk reťazca môže byt ligovaná na ktorúkoľvek z nich a môže byt inzertovaná do expresného vektora, ako je pCOSl alebo pCHOl pre konštrukciu expresného vektora, ktorý obsahuje cDNA kódujúcu Lk reťazec chimérickej protilátky.

3. Produkcia humanizovaných protilátok (1) Vyhľadávanie homológie s ľudskými protilátkami

Pri výrobe humanizovanej protilátky, v ktorej je CDR myšej monoklonálnej protilátky prenesený na ľudskú protilátku, je žiaduce, aby tu existovala vysoká homológia medzi FR myšej monoklonálnej protilátky a FR ľudskej protilátky. V súlade s tým je vykonané porovnanie medzi V regiónmi H a L reťazcov myšej monoklonálnej protilátky proti ľudskému PTHrP a V regiónmi všetkých známych protilátok, ktorých štruktúra bola vyhodnotená pomocou Protein Data Bank. Ďalej sú simultánne porovnávané s podskupinami ľudských protilátok (HSG: Human subgroup) klasifikovanými podľa Kabat et al., podľa dĺžky FR protilátky, podľa homológie aminokyselín a podobne. Kabat, E.A., US Dept. Health and Human Services, US Government Printing Offices, 1991.

V regióny ľudského H reťazca môžu byť zaradené do HSG I až III podľa HSG klasifikácie podľa Kabat et al., a V regióny H reťazca myšej monoklonálnej protilátky proti ľudskému PTHrP majú homológiu 82,7% s konvenčnou sekvenciou HSG III. Na druhej strane, V regióny ľudského IA môžu byť zaradené do HSG I až IV podľa HSG klasifikácie podľa Kabat et al., a V regióny iA reťazca myšej monoklonálnej protilátky proti ľudskému PTHrP nemajú vysokú homológiu s konvenčnými sekvenciami V regiónov ľudského IA reťazca, ktoré patria do akejkoľvek podskupiny.

Ak má byť monoklonálna protilátka proti ľudskému PTHrP humanizovaná, je žiaduce, aby bol použitý V región ľudského H reťazca, ktorý patrí do HSG III a má najvyššiu homológiu, alebo V región ľudského H reťazca, ktorý má FR štruktúru so zodpovedajúcou konvenčnou štruktúrou (Chothia C. et al., J. Mol. Biol. 196: 907-917, 1987) ako má V región ľudského H reťazca, pre konštrukciu humanizovanej protilátky. Ďalej, pretože neexistuje konvenčná sekvencia s vysokou homológiou v podskupinách V regiónov ľudského IA reťazca, je žiaduce, aby bol pri konštrukcii humanizovanej protilátky použitý V región IA reťazca ľudskej protilátky s najvyššou homológiou, ktorý je zaregistrovaný v Protein Data Bank.

(2) Vývoj DNA kódujúcej V región humanizovanej protilátky

Prvým krokom pre vývoj DNA kódujúcej V región humanizovanej protilátky je výber V regiónu ľudskej protilátky, ktorý je základom pre tento vývoj.

V predkladanom vynáleze môže byť v humanizovanej protilátke použitý FR v regiónu ľudskej protilátky majúci homológiu vyššiu než 80% z FR V regiónu myšej FR protilátky. FR V regiónu H reťazca ako fragment v podstate identického FR môže zahŕňať FR odvodený z regiónov patriacich do podskupiny III, ako je S31679: NBRF-PDB, Cuisinier A.M. et al., Eur. J. Immunol., 23: 110-118, 1993. Ďalej, FR V regiónu L reťazca ako fragment v podstate identického FR môže zahŕňať napríklad FR1, FR2 a FR3 odvodené z ľudskej protilátky HSU03868 (GEN-BANK, Deftos M. et al., Scand. J. Immunol., 39: 95103, 1994) a FR4 odvodený z ľudskej protilátky S25755 (NBRF-PDB).

Ľudská protilátka S31679 bola klonovaná z cDNA knižnice ľudskej fetálnej pečene, pričom ľudská protilátka HSU03868 bola klonovaná ako nový gén pre V región Ιιλ reťazca.

(3) Príprava polypeptidov obsahujúcich V región humanizovanej protilátky

V humanizovanej protilátke podľa predkladaného vynálezu pochádzajú C región a región pracovného rámca (PR) V regiónu uvedenej protilátky od ľudí a komplementaritu určujúce regióny (CDR) V regiónu sú mySieho pôvodu, (obr. 1). polypeptid obsahujúci V región humanizovanej protilátky podľa predkladaného vynálezu môže byť vyrobený technikou nazývanou CDR-prenos pomocou PCR, ak bude dostupný DNA fragment ľudskej protilátky ako šablóna. CDR-prenos označuje techniku, v ktorej je vyrobený DNA fragment kódujúci myšiu CDR a je nahradený za CDR ľudskej protilátky, ktorá je šablónou.

Ak nie je DNA fragment ľudskej protilátky, ktorý má byť použitý ako šablóna, dostupný, potom môže byť na DNA syntezátore syntetizovaná sekvencia báz registrovaná v databáze a DNA pre V región humanizovanej protilátky môže byt vyrobená pomocou PCR. Ďalej, ak je v databáze registrovaná iba môže byť celá sekvencia báz odvodená z na základe znalostí využitia kodónov v protilátkach, ako ich opisuje Kabat, E.A., US Dept. Health and human

Services, US Government Printing Offices, 1991. Táto sekvencia báz sa syntetizuje na DNA syntezátore a DNA pre V región humanizovanej protilátky môže byť pripravená PCR technikou a môže byť vložená do vhodného hostiteľa a potom nasleduje jej expresia pri produkcii požadovaného polypeptidu.

Ďalej sú opísané všeobecné postupy pre CDR-prenos pomocou PCR techniky, za situácie, že je dostupný DNA fragment ľudskej protilátky ako šablóna.

aminokyselinová sekvencia, aminokyselinovej sekvencie (i) CDR-prenos

Predpokladá sa, že DNA kódujúca V región zahŕňa DNA kódujúcu FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 a FR4, ktoré sú na seba naviazané v tomto poradí, ako znázorňuj e obr.2.

Najprv sa syntetizujú myšie DNA fragmenty zodpovedajúce príslušným CDR. CDRl až 3 sa syntetizujú na základe sekvencie báz predtým klonovaných V regiónov H a L reťazcov. Priméry na prenos B a E sa syntetizujú tak, že primér B by mal obsahovať sekvenciu hybridizujúcu s myším CDRl a FR2 ľudskej protilátky v sense smere a primér E by mal obsahovať sekvenciu hybridizujúcu s myším CDR1 a FR2 ľudskej protilátky v antisense smere (obr. 2 (D). Podobne sú syntetizované priméry na prenos C a F a priméry D a G. Ďalej sú tiež syntetizované vhodné priméry, nazývané externé priméry, zodpovedajúce A a H na obr. 2. (1), ktoré môžu hybridizovať na regióny upstream od FR1 a downstream od FR4, v príslušnom poradí. Izolácia a extrakcia primérov pre prenos môže byť uskutočnená pri použití známych techník: Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989.

Potom sa vykoná prvá PCR pri použití priméru na prenos E a externého priméru A, primérov na prenos B a F, primérov na prenos C a G, rovnako ako priméru na prenos D a externého priméru H, čo vedie k vzniku fragmentov A-E, B-F, C-G a D-H, v príslušnom poradí (Obr.2 (2)).

Pretože upstream región priméru na prenos B a časť downstream priméru na prenos E sú navrhnuté tak, aby sa prekrývali (čo platí tiež pre priméry na prenos C a F, rovnako ako D a G), môžu byť tieto fragmenty tepelne spracované s príslušnými komplementárnymi sekvenciami v reakcii pri vhodnej teplote a tak môže byť pomocou PCR zostavená DNA majúca dĺžku od A do H. Po získaní DNA fragmentu kódujúceho V región môžu byť pridané externé priméry A a H a môže byť vykonaná druhá PCR, pri získaní DNA kódujúcej V región humanizovanej protilátky, v ktorej sú FR 1 až 4 ľudského pôvodu a CDR 1 až 3 myšieho pôvodu. Potom môže byť vložená do vhodného hostiteľa pre expresiu pri získaní požadovaného polypeptidu (obr. 2 (3)).

(ii) Konštrukcia DNA a expresného vektora kódujúceho V región humanizovaného H reťazca

V predkladanom vynáleze môže byť celá sekvencia báz DNA kódujúca V región H reťazca ľudskej protilátky, ktorá má byť použitá ako šablóna pre humanizovanú protilátku, syntetizovaná pomocou DNA syntezátora a konštruovaná PCR technikou, ak nie je uvedená DNA dostupná z prirodzených zdrojov.

V región H reťazca myšej monoklonálnej protilátky proti ľudskému PTHrP má vysokú homológiu s S31679, ktorá patrí do ľudskej podskupiny III. Pri použití tejto ľudskej protilátky ako šablóny pre konštrukciu DNA kódujúcej V región humanizovaného H reťazca sú použité napríklad 4 priméry, ktoré sú uvedené v SEQ ID NO: 23-26. Priméry MBC1HGP1 (SEQ ID NO: 23) a MBC1HGP3 (SEQ ID NO: 24) majú sense DNA sekvencie a priméry MBC1HGP2 (SEQ ID NO: 25) a MBC1HGP4 (SEQ ID NO: 26) majú antisense DNA sekvencie. Sú navrhnuté tak, aby mal každý na svojom konci 15 až 21 bp komplementárnych sekvencií.

Externé priméry MBC1HVS1 (SEQ ID NO: 27) a MBC1HVR (SEQ ID NO: 28) majú homologické sekvencie s MBC1HGP1 a MBC1HGP4, v príslušnom poradí, a každý obsahuje rozpoznávaciu sekvenciu pre príslušný vhodný reštrikčný enzým. Štyri priméry sú zostavené pomocou PCR, čo vedie k syntéze kompletnej cDNA a externé priméry sa pridajú na amplifikáciu DNA. Zostavenie pomocou PCR znamená, že MBC1HPG1 a MBC1HGP2 alebo MBC1HGP3 a MBC1HGP54 sú tepelne spracované cez ich komplementárne sekvencie, čo vedie k syntéze MBC1HGP1MBC1HGP2 fragmentu a MBC1HGP3-MBC1HGP4 fragmentu a fragmenty sú znova tepelne spracované cez ich komplementárne sekvencie, čo vedie k syntéze konpletnej DNA pre V región humanizovaného H reťazca.

C región H reťazca ľudskej protilátky môže byť akýkoľvek C región ľudského H reťazca, ako je napríklad Cyl, Cy2, Cy3 alebo Cy4 ľudského H reťazca.

DNA pre V región H reťazca humanizovanej protilátky konštruovaná vyššie môže byť ligovaná na DNA pre akýkoľvek C región H reťazca ľudskej protilátky, napríklad na DNA pre Cyl región ľudského H reťazca. Ako je uvedené v oddieli Produkcia H reťazca chimérickej protilátky, môže byť DNA pre V región H reťazca spracovaná vhodným reštrikčným enzýmom a môže byť ligovaná na DNA kódujúcu C región ľudského H reťazca pod kontrolou regiónu na kontrolu expresie, ako je systém zosilňovač/promotor, za vzniku expresného vektora, ktorý obsahuje DNA pre V región humanizovaného H reťazca a C región ľudského H reťazca.

(iii) Konštrukcia DNA a expresného vektora kódujúceho V región humanizovaného L reťazca

V predkladanom vynáleze môže byť celá sekvencia báz DNA kódujúca V región L reťazca ľudskej protilátky, ktorá má byť použitá ako šablóna pre humanizovanú protilátku, syntetizovaná pomocou DNA syntezátora a konštruovaná PCR technikou, ak nie je DNA pre V región L reťazca dostupná, ako je to v prípade DNA kódujúcej V región H reťazca.

Pre konštrukciu DNA pre V región humanizovaného L reťazca pomocou ľudskej protilátky SU03868 majúcej najvyššiu homológiu s V regiónom L reťazca myšej monoklonálnej protilátky proti ľudskému PTHrP sú použité napríklad štyri priméry, ktoré sú uvedené v SEQ ID NO: 29-32. Priméry MBC1LGP1 (SEQ ID NO: 29) a MBC1LGP3 (SEQ ID NO: 30) majú sense DNA sekvencie a priméry MBC1LGP2 (SEQ ID NO: 31) a MBC1LGP4 (SEQ ID NO: 32) majú antisense DNA sekvencie. Sú navrhnuté tak, aby mal každý na svojom konci 15 až 21 bp komplementárnych sekvencií.

Externé priméry MBC1LVS1 (SEQ ID NO: 33) a MBC1LVR1 (SEQ ID NO: 34) majú homologické sekvencie s MBC1LGP1 a MBC1LGP4, v príslušnom poradí a každý obsahuje rozpoznávaciu sekvenciu pre príslušný vhodný reštrikčný enzým. Štyri priméry sú zostavené pomocou PCR, čo vedie k syntéze kompletnej cDNA a externé priméry sa pridajú pre amplifikáciu DNA. Zostavenie pomocou PCR znamená, že MBC1LGP1 a MBC1LGP3 alebo MBC1LGP2 a MBC1LGP4 sú tepelne spracované cez ich komplementárne sekvencie, čo vedie k syntéze MBC1LGP1MBC1LGP3 fragmentu a MBC1LGP2-MBC1LGP4 fragmentu a fragmenty sú znova tepelne spracované cez ich komplementárne sekvencie, čo vedie k syntéze kompletnej DNA pre V región humanizovaného L reťazca.

C región L reťazca ľudskej protilátky môže byť akýkoľvek C región ľudského L reťazca, ako je napríklad CX alebo Ck ľudského L reťazca.

DNA pre V región L reťazca humanizovanej protilátky konStruovaná vyššie môže byť ligovaná na DNA pre akýkoľvek C región L reťazca ľudskej protilátky, napríklad na DNA pre CX región ľudského L reťazca. DNA pre V región L reťazca môže byť spracovaná vhodným reštrikčným enzýmom a môže byť ligovaná na DNA kódujúcu C región ľudského I>X reťazca pod kontrolou regiónu pre kontrolu expresie, ako je systém zosilňovač/promotor, za vzniku expresného vektora, ktorý obsahuje DNA pre V región humanizovaného L reťazca a C región ľudského LX reťazca.

Aj keď môže byť polypeptid obsahujúci V región humanizovanej protilátky produkovaný spôsobom opísaným vyššie, nie je jasné, či bude mať polypeptid rovnaké aktivity ako protilátka, ako napríklad väzba a neutralizačná aktivita proti jej antigénu. Toto platí najmä v prípade L reťazca, pretože V región L reťazca myšej monoklonálnej protilátky proti ľudskému PTHrP je odvodený z veľmi vzácneho νλχ génu a preto je nutné testovať prítomnosť alebo neprítomnosť aktivity pomocou jej kombinovania s humanizovaným H reťazcom expresie vo zvieracích bunkách, ako COS-7.

Ako metóda na hodnotenie toho, ktorý FR vo V regióne humanizovanej protilátky môže spôsobovať väzbu a neutralizačnú aktivitu humanizovanej protilátky, môže byť použitá konštrukcia hybridného V regiónu (Ohtomo, T. et al., Molecular Immunology 32: 407-416, 1995). Na vyhodnotenie toho, ktorá aminokyselina vo V regióne L reťazca humanizovanej protilátky podľa predkladaného vynálezu mala byť mutovaná na získanie aktívnej protilátky je použitá DNA, v ktorej je fragment FR regiónu humanizovanej protilátky rekombinovaný s fragmentom FR regiónu myšieho pôvodu a každý región je testovaný na humanizáciu.

Ako ukazuje obr. 3, je vyrobená protilátka obsahujúca polypeptid obsahujúci rekombinantný V región, v ktorom sú FR1 a FR2 odvodené od ľudskej protilátky a FR3 a FR4 sú odvodené od myšej protilátky (taká protilátka obsahujúca rekombinantný fragment je označovaná ako hybridná protilátka), hybridná protilátka, v ktorej je iba FR1 ľudského pôvodu a hybridná protilátka, v ktorej je iba FR2 ľudského pôvodu. Každá DNA kódujúca tieto hybridné protilátky je vložená do expresného vektora a humanizované protilátky sú prechodne exprivované a je testovaná prítomnosť aktivity u protilátok.

Pomocou tejto techniky testovali vynálezci polypeptidy obsahujúce V regióny L reťazca na väzbu antigénu a na neutralizačné aktivity a zistili, že niektoré aminokyseliny v FR2 a FR3 by mali byť nahradené.

Po zistení, že aminokyseliny spôsobujúce aktivitu existujú v FR2 a FR3 regiónoch vynálezci zistili, že 36., 45. a 49. aminokyselina v FR2 regióne a 87. aminokyselina v FR3 regióne (číslovanie aminokyselín a protilátok bolo určené v Kabat, E. A. et al., US Dept. Health and Human Services, US Government Printing Offices, 1991) spôsobujú aktivitu protilátky.

Tak je v predkladanom vynáleze vyrobený polypeptid obsahujúci V región, v ktorom sú uvedené aminokyseliny mutované (napríklad nahradené).

Najprv je pripravený uvedenou technikou CDR-prenosu polypeptid obsahujúci V región majúci aminokyselinovú sekvenciu, ktorý je základom pre vkladanie mutácií aminokyselín. Tento základný polypeptid obsahuje aminokyselinovú sekvenciu podľa SEQ ID NO: 47 a je označovaný ako verzia a (a v tabuľke 1).

Potom sú z verzie a ako základu pripravené rôzne variantné fragmenty, v ktorých je jedna alebo viac aminokyselín z FR mutovaných.

Vloženie mutácie môže byť uskutočnené pomocou vývoja oligonukleotidového priméru (mutagénnneho priméru) kódujúceho aminokyselinu, ktorá má byť vložená ako požadovaná mutácia a vykonaním PCR pri použití uvedeného priméru.

Tak sú vyrobené polypeptidy obsahujúce V regióny (verzia b až t)^v, v ktorých sú určité aminokyseliny v FR2 a FR3 mutované (b až t v tabuľke 1).

Tabuľka 1

CSZ

U.

n	-C *	Vi
CM	Vi	Vi
—M	>	>
O	E—	e—
os	>·	>
00	_3	_3
e-	f-	E—
<o IÍ3	3	3
M·	O	o
CO

CDR1

m	v:	*T*	VI
	S	s	s
CO	lO	<	u
CM	>-	>-	>-
	Vi	1/3	C/3

o o s- 2— 05 b— O n o c/3 05 ti. 00 tt— e_ lO o m c/3 v < to c CM U — VI

CM O —J 05 —2 r- V) lO o m u c/3 cc

u.

cm > — _i o o os o oc o t- C/3 tC tii m >

to

CM σ

>

<

<

u

C/3

-J * 3

Vi * cc u e_ * Or >

* 5>

* U O O C/3 UJ > _3 O U* θ'

	LO	O	o	O
		TT	3<c		Sŕí
		CO	>	>	5>
		CM	Vi	C/3	C/3
			a	O	O
	<O	O	O-	<	0L
		05	>-	>-	s-
		00	>-	>-	>
		ρ-	t—	sc	E—
		ιΟ	>>	z	>-
		U3	C/3	C/3	C/3
		v	o	O	O
		n	%	O	o
CM		<	>-	CZ3
CC		CM	Vi	1/3	1/3
o			»—·		►—M
CJ	IO	O	t—		E—

05	<	< 1
00	>	> 1
Γ-		» 1
ΙΟ	U3	UJ 1
U3	_J	_J 1
θ'	CC *	o 1
co		1
CM	Q *	O 1
——	o_	C- 1
m· o	t- *	«C 1
OS	ar	O 1
CM 00	CC	CC 1
cc r-	— #	> 1
u. «o		* 1

U

CO os t— «© n

C/3 a

u

c.

C_>

CO

3E a

Q)

o. a

UJ c_ = os i

0= I*^- — (O o o — cc co to s s 1/3 -C

CM >— < < (X.

	— os	E—	o
CO	00	s	o
CC	Γ-	E—	CC
Q	ΙΟ	E—	Vi
C_>	U3	ar	Czl

	CC	Q£
		n CM	δ		δ
			>·		>-
		o	ο-	*	>-
		05	χ	*	>
		00	<		<
	05	Γ-	ί-		t“
	ΙΟ	α		a
		m	U1		U3
		tp	C/3	*	Š
		co		*
		U	-J		-J
		03	C/3		C/3
		<	C/3	#	Z
		CM	3		3
		O	_3		-J
		05	>-		>-
		00	_3
	00	Γ-	E—		E—
		ιΟ	Z		Z
		lO	s«c		30
		W	<	*	C/3
		CO	z		Z
		CM	o		O
			CC		CC
		O	C/3		C/3
		05
n		00	E—		b“
cc		Γ-	Li-		U.
u.	Γ-	ΙΟ	eč		C£

QUJ

c.

o

CO os

ΓΙΟ n

Vi hMBCl-H. pep -------------------------------- QTTMTYFAY

		co	O		o	o
		m	U		O	u
		o	t—		sň	t—
		u	co		CZJ	CZJ
		o				X
		<	vi		vi	Vi
CM		ó	g		o Q	g
QC		CM	Cf		Vi	o
O			Sť		z	sc
U	in	C			—3	_i
		O)	o	*	Sň	1
		co r-	>	*	5	1 1
		to	>-		>-	1
		LO	mí	*	os	1
		•’T	Ol		o.	1
		n	O.	#	u	1
		CM	Sň		Sň	1
			_J	*	cu	1
		o	Ol.		O.	1
		OJ	QT		Or	1
		00	Or		QT	1
CM					or	1
Oň		co	>-	*	x	1
U-		CO			*	1
		M-	to		<	UJ
		«*»	*—1		>—<	l-M
		CM	t-		<	f-

ΟΟ>I

CS

Q

U — >n o ίσι CZJ co x c σ t'- CZJ tO Vi m _] >- SCZJ tCZJ Vi X X o o CZJ Vi Vi Vi

CM

T—	*“		t—
	O		u
CM	f—		í—
—	_J		_j
o
O!	<	*	>
oc	CZJ		Vi
l~-	c		c
CO	o		o
UJ	1
L—	CZJ		Vi
ΓΟ	e.	*	<
CM	Vi		CZJ
—	<		<c
O	1		1
Ο»	CZJ		CZJ
00	Vi	*	C-
r-	CZJ		CZJ
CO	a		Or
in	f—		f—
Μ-
η	>		>
CM			_□
—	σ		σ

CCJ

Q.

o so

CO to n

o o

VI

o.

v

o.

Λ J3 O Ό Φ <*- 00

Ι

I

I

I >I

I

I

I

I

I

I

I

I >I

I

I

I

I

I

I

I

I

I

I

Q I

I I I ·> I I SC äí >I

I

I

I

I

I >I

J*

Sň

I

I

I >I

O.OIOO

I I I I I I i > s> i l I

V-D

I

I

I

I >I (Z1 >I

Ο

0£

U.

C σι QOC Or £ 3 <c > m E— >

CO

C9 t— — O O U 05 p 00 (L

CDR3

t— <0 O u CO < m «· CO	> >- > o_ o 10 ää »—« ί-	S	TIKEOFVYV	1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 ! 1 1 1 1 1
09	α	o	a	1	1	1 1
•-M	o		ĽJ	1	1	1 1
O	>	ί-	>		1	1 1
05	a	ο	CJ	1	1	1 1

í

I

I

I

I

I

00	O	o
Γ-		*	>-
ιο	>-		>-
m	SE	*	a
	<		<
CO	(0		(0
09	a		a
	[0		10
o	Q.	*	to
05 00	C? ►—1	*	3
Γ-	z	*	Vi
(O	to		Vi
IO			K-4
TT	VI	*	f-
CO	J
09	S-		>-
	cc		CC
O	a	*	(0
05	<c		<
00 r-	%		U Vi
<0	Vi		Vi
ΙΛ	Vi		Vi
CO	%		£
CM	u.		Ci-
	CC		ce
O	a		a
05	Q_		Ο-
00	^-4		Ι—·
	O		o

Q.

CzJ

C.

O

CO

CO o

=3 to

C.

ω

Ql o

co

SE

« jo u -o o <— oo jc — -o jc —< E e o o. a· u m<j

DNA kódujúca každú verziu V regiónu L reťazca humanizovanej protilátky konštruovanej vyšSie môže byť ligovaná na DNA pre akýkoľvek C región L reťazca ľudskej protilátky, napríklad na DNA pre CX región ľudského L reťazca. DNA môže byť spracovaná vhodným reštrikčným enzýmom a môže byť ligovaná na DNA kódujúcu C región ľudského LX reťazca pod kontrolou regiónu na kontrolu expresie, ako je systém zosilňovač/promotor, za vzniku expresného vektora, ktorý obsahuje DNA kódujúcu každú verziu V regiónu humanizovaného L reťazca a DNA kódujúcu C región humanizovaného LX reťazca.

DNA kódujúca V región H reťazca humanizovanej protilátky a C región ľudského H reťazca, ako bola konštruovaná vyššie a DNA kódujúca V región humanizovaného L reťazca a C región ľudského L reťazca môžu byť tiež vložené do jediného expresného vektora, ako je vektor opísaný v HO 94/611523, uvedený vektor môže byť použitý na transformáciu hostiteľskej bunky a transformovaný hostiteľ môže byť kultivovaný in vitro alebo in vivo pri produkcii požadovanej humanizovanej protilátky.

4. Produkcia chimérickej protilátky a humanizovanej protilátky.

Na produkciu chimérickej a humanizovanej protilátky by mali byť pripravené dva uvedené expresné vektory. Tak sú pre chimérickú protilátku pripravené expresný vektor, obsahujúci DNA kódujúcu V región myšieho H reťazca a C región ľudského H reťazca pod kontrolou regiónu na kontrolu expresie, ako je systém zosilňovafi/promotor a expresný vektor obsahujúci DNA kódujúcu V región myšieho L reťazca a C región ľudského L reťazca pod kontrolou regiónu na kontrolu expresie, ako je systém zosilňovač/promotor. Pre humanizovanú protilátku sú pripravené expresný vektor obsahujúci DNA kódujúcu V región humanizovaného H reťazca a C región ľudského H reťazca pod kontrolou regiónu na kontrolu expresie, ako je systém zosilňovač/promotor a expresný vektor obsahujúci DNA jódujúcu V región humanizovaného L reťazca a C región ľudského L reťazca pod kontrolou regiónu na kontrolu expresie, ako je systém zosilňovač/promotor.

Potom je hostiteľská bunka, ako napríklad cicavčia bunka, súčasne transformovaná týmito expresnými vektormi a vzniknutá transformovaná bunka je kultivovaná in vitro alebo in vivo pri produkcii chimérickej alebo humanizovanej protilátky (pozri napríklad WO 91/16928).

Alternatívne môžu byť DNA kódujúca V a C regióny H reťazca a DNA kódujúca V a C regióny L reťazca ligované do jediného vektora a môžu byt transformované do vhodnej hostiteľskej bunky za produkcie protilátky.

Tak sú pri expresii chimérickej protilátky DNA kódujúce myšiu vedúcu sekvenciu prítomné v klonovanej cDNA, V región myšieho H reťazca a C región ľudského H reťazca, rovnako ako DNA kódujúca myšiu vedúcu sekvenciu, V región myšieho L reťazca a C región ľudského L reťazca vložené do jediného expresného vektora, ako je napríklad vektor, ktorý je opísaný vo NO 94/11523. Pri expresii humanizovanej protilátky sú DNA kódujúce V región humanizovaného H reťazca a C región ľudského H reťazca a DNA kódujúca V región humanizovaného L reťazca a C región ľudského L reťazca vložené do jediného expresného vektora, ako je napríklad vektor, ktorý je opísaný v HO 94/11523. Taký vektor je použitý pri transformácii hostiteľskej bunky a vzniknutá transformovaná hostiteľská bunka je kultivovaná in vitro alebo in vivo pri produkcii požadovanej chimérickej alebo humanizovanej protilátky.

Požadovaná chimérická alebo humanizovaná protilátka, ktorá je takto produkovaná kultiváciou transformantov transformovaných DNA kódujúca uvedenú chimérickú alebo humanizovanú protilátku môže byť izolovaná z vonkajšieho alebo vnútorného prostredia buniek a môže byť prečistená do homogenity.

Izolácia a prečistenie požadovaných chimérických alebo humanizovaných protilátok podľa predkladaného vynálezu môže byť napríklad vykonané pri použití kolóny obsahujúcej protein A agarózu, ale môže byť tiež vykonané pomocou akýchkoľvek techník používaných pri izolácii a prečistení bežných proteínov. Napríklad môžu byť na Izoláciu a prečistenie chimérickej alebo humanizovanej protilátky použité techniky voliteľne vybrané z chromatografických, ultrafiltračných, vysoľovacích a dialyzačných techník.

Akýkoľvek expresný systém môže byť použitý na produkciu chimérickej alebo humanizovanej protilátky proti ľudskému PTHrP podľa predkladaného vynálezu. Napríklad, eukaryotické bunky zahŕňajú živočíšne bunky, ako sú cicavčie bunkové línie, bunky plesní alebo húb a kvasnice; prokaryotické bunky zahŕňajú bakteriálne bunky ako Escherichia coli. Výhodne je chimérická alebo humanizovaná protilátka podľa predkladaného vynálezu exprivovaná v cicavčích bunkách, ako napríklad COS alebo CHO bunky.

Môžu byť použité akékoľvek bežné promotory použiteľné na expresiu v cicavčích bunkách. Napríklad, je výhodné použiť bezprostredný časový promotor ľudského cytomegalovírusu (HCMV). Príklady expresných vektorov obsahujúcich HCMV zahŕňajú HCMV-VH-HCy a HCMV-VL-HCK, ktoré sú odvodené od pSV2neo (HO 92/19759) .

Ďalej, promotory pre génovú expresiu v cicavčích bunkách, ktoré môžu byť použité v predkladanom vynáleze, zahŕňajú vírusové promotory, ako sú promotory retrovírusové, polyomavírusové, adenovírusové a simian vírus (SV, 40, a promotory z cicavčích buniek, ako je elongačný faktor - la ľudských polypeptidových reťazcov (HEF-la). Napríklad, SV40 promotor môže byť jednoducho použitý technikou podľa Mulligan et al., (Náture 27: 108, 1979); technika podľa Mizushima, S. et al., (Nucleic Acids Research 18: 5322, 1990) môže byť jednoducho použitá s HEF-la promotorom.

Medzi elementy rozpoznávajúce začiatok replikácie, ktoré môžu byť použité v predkladanom vynáleze, patria elementy odvodené od SV40, polyomavírusu, adenovírusu alebo hovädzieho papilomavirusu (BPV). Ďalej, expresný vektor môže obsahovať gén pre fosfotransferázu APH (3¹) II alebo I (neo), tymidín kinázu (TK), E.coli xantín-guanín-fosforibozyltransferázu (Ecogpt) alebo dihydrofolátreduktázu (DHFR) ako selektívny marker na zvýšenie počtu kópií génu v hostiteľskom systéme.

5. Hodnotenie väzby na antigén a neutralizačné aktivity chimérických a humanizovaných protilátok (1) Určenie koncentrácie protilátky

Koncentrácia vzniknutej prečistenej protilátky môže určiť ELISA.

ELI5A platne na určenie koncentrácie protilátky sú pripravené nasledujúcim spôsobom: lOOpg kozej protilátky proti ľudskému IgG pripravenej s koncentráciou napríklad lpg/ml sa imobilizuje v každej jamke 96-jamkovej platne pre ELISA (napríklad Maxisorp, NUNC). Po blokovaní 200 μΐ pufra na riedenie (napríklad 50 mM Tris-HCl, 1 mM MgCl,, 0,1 M NaCl, 0,05% Tween 20, 0,02% NaN,, 1% hovädzí sérový albumín (BSA), pH 7,2), do každej jamky sa pridá postupne riedený supernatant COS-7 alebo CHO buniek, v ktorých bola exprivovaná chimérická, hybridná alebo humanizovaná protilátka, alebo prečistená chimérická, hybridná alebo humanizovaná protilátka, pridá sa 100 μΐ kozej protilátky proti ľudskému IgG konjugovanej s alkalickou fosfatázou a potom sa pridá 1 mg/ml substrátového roztoku (Sigma 104, kyselina p-nitrofenylfosforečná, SIGMA) a potom sa meria absorbancia pri 405 nm pomocou čítačky mikroplatní (BioRad). Hu IgGlX Purified (the Binding Site) môže byť použitá ako štandard na určenie koncentrácií.

(2) Určenie schopností väzby na antigén

ELISA platne na určenie schopnosti väzby na antigén sú pripravené nasledujúcim spôsobom: 100 pg ľudského PTHrP (1-34) pripraveného s koncentráciou 1 pg/ml sa imobilizuje v každej jamke 96-jamkovej platne pre

ELISA. Po blokovaní 200 μΐ pufra na riedenie sa do každej jamky pridá postupne riedený supernatant COS-7 alebo pCHO buniek, v ktorých bola exprivovaná chimérická, hybridná alebo humanizovaná protilátka, pridá sa 100 μΐ kozej protilátky proti ľudskému IgG konjugovanej s alkalickou fosfatázou a potom sa pridá 1 mg/ml substrátového roztoku (Sigma 104, kyselina pnitrofenylfosforečná, SIGMA) a potom sa meria absorbancia pri 405 nm pomocou čítačky mikroplatní (BioRad).

(3) Určenie neutralizačnej aktivity

Určenie neutralizačnej aktivity mySích, chimérických a humanizovaných protilátok sa vykoná, napríklad, pomocou bunkovej línie krysieho osteosarkómu ROS17/2.8-5 (Sato, K. et al.. Acta Endocrinology 116: 113-120, 1987). ROS17/2.8-5 bunky sa stimulujú 4 mM hydrokortizónu na indukciu receptora pre PTH/PTHrP. Degradačný enzým pre cAMP je inhibovaný 1 mM izobutyl-1metylxantínu (IBMX, SIGMA). Myšia, chimérická alebo humanizovaná protilátka, u ktorej má byť určená neutralizačná aktivita, je zmiešaná s rovnakým množstvom PTHrP(1-34) a pridá sa do každej jamky. Neutralizačná schopnosť myšej, chimérickej alebo humanizovanej protilátky môže byť testovaná meraním množstva cAMP produkovaného bunkami bunkovej línie krysieho osteosarkómu ROS17/2.8-5 v priebehu stimulácie PTHrP.

(4) Kinetické analýzy interakcií medzi PTHrP a protilátkou proti PTHrP

V predkladanom vynáleze môžu byť kinetiky interakcií medzi PTHrP a antiPTHrP analyzované rôznymi prostriedkami a technikami. Konkrétne, disociačné konštanty, konštanty disociačnéj rýchlosti a konštanty asociačnej rýchlosti môžu byť merané Scatchardovou analýzou a senzorom povrchovej plazmónovej rezonancie nazývaným BIACORE (ktorý vyvinul a predáva Pharmacia Biotech). Analýza pri použití senzora povrchovej plazmónovej rezonancie nazývaného BIACORE bude opísaná ďalej ako jeden z príkladov.

Základná štruktúra BIACORE obsahuje optický zdroj, hranol, detektor a mikrokanál. V praxi je ligand imobilizovaný na konci senzora v tvare kazety a analyt sa injikuje do tejto kazety. Ak medzi nimi existuje akákoľvek afinita, potom je opticky detekovaná úroveň väzby.

Princípom detekcie je fenomén nazývaný povrchová plazmónová rezonancia. Pri dopade svetla na priestor medzi skleneným a kovovým filmom, pri ktorom môže dôjsť k úplnému odrazu, sa svetlo dopadajúce pod určitým uhlom použije na excitáciM“ povrchového plazmónu a svetlo je utlmené. Uhol sa líši podľa zmeny koncentrácie rozpúšťadla, ktoré je v kontakte s kovovým filmom (senzorom). BIACORE detekuje túto zmenu.

Pri použití BIACORE sa táto zmena nazýva rezonančný signál (SPR signál) a zmenou 0,1 stupňa je 1000 RU (rezonančných jednotiek). 1000 RU zodpovedá zmene väzby približne o 1 ng proteínu na tenký zlatý senzor s povrchom 1 mm². Pre proteín môže byt úplne detekovaná zmena približne 50 RU (50 pg).

Detekčné signály sa prevedú na krivku väzby, ktorá sa nazýva senzorogram pomocou počítača, ktorý je pripojený na BIACORE a táto krivka sa prenáša na obrazovku v reálnom čase: Natsume, T. et al., (1995) Experimental Medicíne 13: 563-569; Karlsson, R. et al., (1991) J. Immunol. Methods 145: 229-240. Kinetické parametre, t.j. disociačná konštanta (KD), disociačná rýchlostná konštanta (Kdiss) a asociačná rýchlostná konštanta (Kass) protilátok proti PTHrP podľa predkladaného vynálezu môžu byt merané pomocou uvedenej BIACORE.

Protilátky proti PTHrP podľa predkladaného vynálezu majú výhodne takú malú disociačnú konštantu (hodnotu KD) , ako je to možné vzhľadom na neutralizačnú aktivitu. Výhodne majú protilátky proti PTHrP podľa predkladaného vynálezu KD hodnotu l,86xlO^T alebo menšiu, výhodnejšie 1,86x10^b alebo menšiu a najvýhodnejšie 3,58xl0'^l° alebo menšiu.

KD hodnota je určená z dvoch parametrov, disociačných rýchlostných konštánt (Kdiss) a asociačných rýchlostných konštánt (Kass) (KD=Kdiss/Kass). Je preto jasné, že hodnoty KD sú nižšie, ak sú hodnoty Kdiss nižšie a Kass vyššie.

Presnejšie, hodnoty Kdiss pre protilátky proti PTHrP podľa predkladaného podľa predkladaného vynálezu môžu byt 1,22x1ο¹ (1/s) alebo nižšie. Výhodne sú hodnoty Kdiss l,22xl0² alebo nižšie, lepšie 3,16x10'* alebo nižšie a najlepšie 2,32x10* (1/s) alebo nižšie.

Na druhej strane môžu byt hodnoty Kass 6,55x10* (1/M.s) alebo vyššie. Výhodne sú Kass hodnoty 6,55x10* alebo vyššie, výhodnejšie 0,833x10* alebo vyššie, najvýhodnejšie sú 1,03x10* (1/M.s) alebo vyššie.

Ďalej, tiež sú výhodné protilátky proti PTHrP podľa predkladaného vynálezu majúce hodnotu Kdiss 1,22x1ο¹ (1/s) a Kass 6,55x10* (1/M.s) alebo vyššie.

Ešte presnejšie, protilátky proti PTHrP podľa predkladaného vynálezu majú hodnotu KD v rozmedzí 1,02x10 “ až l,86xl0'⁷ (M, , výhodnejšie l,O2xlO'¹⁰ až 1,86x10'* (M), ešte výhodnejšie 1,34x10 ¹⁰ až 3,58xlO'¹⁰ (M), najlepšie 2,25xlO'¹⁰ až 3,58xlO'¹⁰ (M).

Hodnoty Kdiss sú v rozmedzí 7,38x10* až 1,22x10'* (1/s), výhodnejšie 7,38x10⁵ až 1,22x10² (1/s), ešte výhodnejšie 1,66x10* až 3,16x10* (1/s), najvýhodnejšie 1,66x10'* až 2,32x10'* (1/s).

Hodnoty Kass sú v rozmedzí 6,55x10* až l,24xlO^T (1/M.s), výhodnejšie 6,55x10* až 1,24x10* (1/M.s), ešte výhodnejšie 7,23x10* až 1,03x10* (1/M.s), najvýhodnejšie 0,883x10* až 1,03x10* (1/M.s).

Tieto hodnoty KD, Kdiss a Kass môžu byť získané Scatchardovou analýzou alebo senzorom povrchovej plazmónovej rezonancie, ako BIACORE, výhodne pomocou BIACORE.

6. Farmaceutické prostriedky a činidlá potláčajúce hyperkalcémiu obsahujúce humanizovanú protilátku proti PTHrP ako účinnú zložku

Terapeutický účinok humanizovanéj protilátky na PTHrP môže byť potvrdený pridaním protilátky proti PTHrP alebo humanizovanej protilátky zvieraťu s hyperkalcémiou a meraním indexu pre hyperkalcémiu. Pri zvieratách s hyperkalcémiou a pri pacientoch s hyperkalcémiou je často pozorovaná hypofosfatémia; protilátky podľa predkladaného vynálezu môžu byť tiež použité na liečbu hypofosfatémie.

Protilátkou použitou v predkladanom vynáleze je protilátka proti PTHrP zahŕňajúca ľudskú, chimérickú a primatizovanú protilátku proti PTHrP majúcu disociačnú konštantu, disociačnú rýchlostnú konštantu a asociačnú rýchlostnú konštantu. Protilátka bude neutralizovať aktivitu PTHrP väzbou na PTHrP a výhodne zahŕňa humanizovanú #23-57-137-1 protilátku. Spôsob produkcie humanizovanej protilátky #23-57-137-1 bude opísaný v príkladoch 1 až 3.

Protilátka použitá v predkladanom vynáleze môže byť prečistená na vysokú čistotu akoukoľvek kombináciou bežných techník prečistenia, vrátane vysoľovania, gélovej filtrácie pri použití HPLC atď., a afinitnej chromatografie pri použití proteín A kolóny atď. Rozpoznávanie PTHrP takou prečistenou protilátkou môže byť potvrdené akýmikoľvek bežnými imunologickými technikami, ako je rádioimunotest (RIA), enzýmový imunotest (EIA, ELISA) alebo imunofluorescenčná analýza.

Zvieratá s hyperkalcémiou, ktoré môžu byt použité, zahŕňajú zvierací model pripravený transplantovaním nádorových buniek produkujúcich PTHrP pokusnému zvieraťu s redukovanou alebo zrušenou funkciou imunitného systému. Transplantovanými nádorovými bunkami sú výhodne ľudské nádorové bunky, napríklad bunky karcinómu podžalúdkovej žľazy PAN-7. K zvieratám s redukovanou alebo zrušenou funkciou imunitného systému, ktorým sú nádorové bunky transplantované, patria holé myši a SC1D myši.

Supresia hyperkalcémie môže byť hodnotená pozorovaním koncentrácie vápnika v krvi, zaznamenávaním redukcie telesnej hmotnosti alebo redukcie rozsahu pohybov po určitom intervale a určitom stupni zlepšenia.

Farmaceutické prostriedky a činidlá potláčajúce hyperkalcémiu obsahujúce protilátku alebo humanizovanú protilátku proti PTHrP ako účinnú zložku podľa predkladaného vynálezu môžu byť parenterálne podané systémovo alebo lokálne.

Napríklad môže byť použitá parenterálna injekcia intramuskulárna injekcia, intraperitoneálna injekcia injekcia. Spôsob podania bude vybraný podľa veku pacienta a ochorenia. Jednotlivá účinná dávka môže byť v rozmedzí 0,01 až 1000 mg na kg telesnej hmotnosti. Alternatívne môže byť dávka 5 až 10000 mg/pacienta, výhodnejšie 50 až 1000 mg/pacienta.

Farmaceutické prostriedky a činidlá potláčajúce hyperkalcémiu obsahujúce protilátku alebo humanizovanú protilátku proti PTHrP ako účinnú zložku podľa predkladaného vynálezu môžu ďalej obsahovať farmaceutický prijateľný nosič a/alebo pomocné činidlo, v závislosti na spôsobe podania. Príklady takých nosičov a pomocných činidiel zahŕňajú vodu, farmaceutický prijateľné organické rozpúšťadlá, kolagén, polyvinylalkohol, polyvinylpyrrolidón, karboxyvinylpolymér, karboxymetylcelulózu sodnú, poly(akrylát) sodný, arginát sodný, dextrán rozpustný vo vode, karboxymetyl škrob sodný, pektín, metylcelulózu, etylcelulózu, xantánovú gumu, arabskú klovatinu, kaseín, želatínu, agar, diglycerín, glycerín, propylénglykol, polyetylénglykol, vazelínu, parafín, stearylalkohol, kyselinu steárovú, ľudský sérový albumín (HSA), manitol, sorbitol, laktózu a povrchovo aktívne činidlá ako farmaceutické pomocné činidlá. Použité pomocné činidlá môžu byť vhodne vybrané z horeuvedených činidiel buď samostatne, alebo v kombinácii, nie sú však obmedzené na uvedené činidlá.

Protilátka podľa predkladaného vynálezu môže byť použitá všeobecne na liečbu hyperkalcémie spojenej s rôznymi malígnymi nádormi. Tieto malígne nádory nie sú nijak presne obmedzené a zahŕňajú nielen jediný nádor, ale aj multiplicitné nádory. Medzi tieto nádory patria napríklad nádory podžalúdkovej žľazy, pľúc, hrtanu, hltanu, mandle, ďasna, pažeráku, žalúdka, žlčových ciest, prsníka, obličky, močového mechúra, maternice a prostaty, a malígne lymfómy.

vrátane infúzie, alebo subkutánna

Opis obrázkov na výkresoch

Obr. 1 je schematické znázornenie protilátky podľa predkladaného vynálezu;

Obr. 2 je schematické znázornenie CDR-prenosu; Obr. 3 znázorňuje určenie FR a CDR V regiónu;

Obr.	4	je graf	znázorňujúci	výsledky	merania	väzbovej
protilátok	na	antigén;
Obr.	5	je graf	znázorňujúci	výsledky	merania	väzbovej
protilátok	na	antigén;
Obr.	6	j e graf	znázorňujúci	výsledky	merania	väzbovej
protilátok	na	antigén;
Obr.	7	je graf	znázorňujúci	výsledky	merania	väzbovej
protilátok	na	antigén;
Obr.	8	j e graf	znázorňujúci	výsledky	merania	väzbovej
protilátok	na	antigén;
Obr.	9	je graf	znázorňujúci	výsledky	merania	väzbovej
protilátok	na	antigén;
Obr.	10 je graf	znázorňujúci	výsledky	merania	väzbovej
protilátok	na	antigén;
Obr.	11 je graf	znázorňujúci	výsledky	merania	väzbovej

aktivity aktivity aktivity aktivity aktivity aktivity aktivity aktivity protilátok na antigén;

Obr. protilátok;	12	je	graf	znázorňujúci	neutralizačnú	aktivitu	humanizovaných
Obr. protilátok;	13	je	graf	znázorňujúci	neutralizačnú	aktivitu	humanizovaných
Obr. protilátok;	14	je	graf	znázorňujúci	neutralizačnú	aktivitu	humanizovaných
Obr.	15	sú	grafy	znázorňujúce	účinnosť protilátok podľa	predkladaného

vynálezu proti hyperkalcémii v zvieracom modeli;

Obr. 16 sú grafy znázorňujúce účinnosť protilátok podľa predkladaného vynálezu proti hyperkalcémii v zvieracom modeli;

Obr. 17 sú grafy znázorňujúce účinnosť protilátok podľa predkladaného vynálezu proti hyperkalcémii v zvieracom modeli;

Obr. 18 sú grafy znázorňujúce účinnosť protilátok podľa predkladaného vynálezu proti hyperkalcémii v zvieracom modeli;

Obr.	19 je	senzorogram ilustrujúci imobilizáciu	PTHrP	na vrchole
senzora;
Obr.	20 je	graf znázorňujúci výsledky kinetickej	analýzy	protilátky

podľa predkladaného vynálezu;

Obr. 21 je graf znázorňujúci výsledky kinetickej analýzy protilátky podľa predkladaného vynálezu,Obr. 22 je graf znázorňujúci výsledky kinetickej analýzy protilátky podľa predkladaného vynálezu;

Obr. 23 je graf znázorňujúci výsledky kinetickej analýzy protilátky podľa predkladaného vynálezu;

Obr. 24 je graf znázorňujúci výsledky kinetickej analýzy protilátky podľa predkladaného vynálezu,Obr. 25 je graf znázorňujúci výsledky testu vplyvu humanizovanej podľa predkladaného vynálezu na frakcionované vylučovanie protilátky fosfátov;

Obr.

je graf znázorňujúci výsledky testu vplyvu humanizovanej protilátky podľa predkladaného vynálezu na koncentráciu fosforu v plazme,·

Obr. 27 je fotografia znázorňujúca viditeľné klinické príznaky hyperkalcémie na myšom modeli, ktoré sa vyvinuli po podaní protilátky proti PTHrP podľa predkladaného vynálezu (morfológia živého zvieratá);

Obr. 28 je fotografia znázorňujúca viditeľné klinické príznaky hyperkalcémie na myšom modeli, ktoré sa vyvinuli po podaní protilátky proti PTHrP podľa predkladaného vynálezu (morfológia živého zvieraťa);

Obr. 29 je graf ukazujúci zmenu spontánnej aktivity vo zvieracom modeli hyperkalcémie v čase po podaní protilátky proti PTHrP podľa predkladaného vynálezu v porovnaní so zmenou v kontrolnom zvieracom modeli po podaní fyziologického roztoku;

Obr. 30 je graf ukazujúci zmenu telesnej teploty aktivity vo zvieracom modeli hyperkalcémie v čase po podaní protilátky proti PTHrP podľa predkladaného vynálezu v porovnaní so zmenou v kontrolnom zvieracom modeli po podaní fyziologického roztoku;

Príklady uskutočnenia vynálezu

Predkladaný vynález bude ďalej opísaný podrobnejšie v nasledujúcich príkladoch, ktoré neobmedzujú rozsah predkladaného vynálezu.

Odkazy k príkladu 1

Príprava hybridómu produkujúceho mySiu monoklonálnu protilátku proti PTHrP(1-34)

Hybridómy schopné produkovať monoklonálne protilátky proti ľudskému PTHrP(l-34), #23-57-154 a #23-57-137-1, sa pripraví technikou, ktorú opísal Kanji Sato et al. (Sato, K. et al., J. Bone Miner. Res. 8: 849-860, 1993).

Použitým imunogénom bol PTHrP(1-34) (Penisula), na ktorý bol konjugovaný proteínový nosič, thyreoglobulín, pomocou karbodiimidu (Dojinn). PTHrP(1-34) konjugovaný na thyreoglobulín bol dialyzovaný pri získaní roztoku s koncentráciou proteínu 2pg/ml. Výsledný roztok sa zmieSal s Freundovým adjuvans (Difco) v pomere 1:1 pri získaní emulzie. Táto emulzia bola injikovaná 16 samiciam BALB/C mySí subkutánne v oblasti chrbta alebo intraperitoneálne v dávke 100gg/myš na imunizáciu myší. Injekcia bola podaná 11 krát. S ohľadom na adjuvans bolo Freundove kompletné adjuvans použité pri prvej imunizácii a Freundove nekompletné adjuvans bolo použité na injekcie pri nasledujúcich imunizáciách.

Pri každej imunizovanej mySi boli určené titre protilátky v sére nasledujúcim spôsobom:

Každej mySi bola odobratá krv z chvostovej žily a krv bola centrifugovaná pri získaní séra. Sérum bolo riedené RIA pufrom, bolo zmiešané s ¹²⁵I značeným PTHrP(l-34) a určila sa jeho väzbová aktivita. Myšiam, u ktorých boli zistené dostatočne vysoké titre protilátky, bola podaná intraperitoneálna injekcia PTHrP(1-34) bez proteínového nosiča v dávke 50 pg/myš na konečnú imunizáciu.

Tri dni po poslednej imunizácii boli myši utratené a boli im odobraté sleziny. Potom boli bunky sleziny podrobené fúzii s myšou myelómovou bunkovou líniou P3x63Ag8U.l, podľa bežnej techniky pri použití 50% polyetylénglykolu 4000. Takto pripravené fúzne bunky boli inokulované do 85 jamiek 96-jamkovej platne v množstve 2x10* na jamku. Vyšetrovanie požadovaných hybridómov bolo vykonané pri použití HAT média nasledujúcim spôsobom.

Vyšetrovanie hybridómov bolo uskutočnené určením prítomnosti protilátok rozpoznávajúcich PTHrP v supernatante kultúr v jamkách, v ktorých bol pozorovaný rast buniek v HAT médiu pomocou techniky RIA na solídnej fáze. Hybridómy boli získané z jamiek, v ktorých bola potvrdená väzbová schopnosť protilátky rozpoznávajúcej PTHrP. Takto získané hybridómy boli suspendované do RPMI-1640 média obsahujúceho 15% FCS a doplneného OPI-doplnkom (Sigma) a potom nasledovala unifikácia hybridómov pri použití techniky postupného riedenia a týmto spôsobom sa získali dva typy hybridómnych klonov, #23-57154 a #23-57-137-1, ktoré oba vykazovali silnú väzbovú schopnosť pre PTHrP(l-34).

Hybridómny kloň #23-57-137-1, ktorý bol označený myší-myší hybridóm #23-57-137-1, bol uložený podľa Budapeštianskej zmluvy 15.8.1996 v National Inštitúte of Bioscience and Human Technology, Agency of Industrial Science and Technology, Japan (1-3, Higashi 1-chome, Tsukuba-shi, Ibaragi-ken, Japan) s prírastkovým číslom FERM BP-5631.

Príklad 1: Klonovanie DNA kódujúcej V región myšej monoklonálnej protilátky proti ľudskému PTHrP (1-34).

Klonovanie DNA kódujúcej V región myšej monoklonálnej protilátky proti ľudskému PTHrP(1-34) získanej vyššie, #23-57-137-1, sa vykonalo nasledujúcim spôsobom.

(1) Príprava mRNA mRNA sa pripravila z hybridómu #23-57-137-1 pomocou Quick Prep mRNA Purification Kit (Pharmacia Biotech) nasledujúcim spôsobom.

Bunky hybridómu #23-57-137-1 získaného vyššie sa plne homogenizovali s extrakčným pufrom a mRNA z neho bola extrahovaná pri použití oligo(dT)Cellulose Spun Column podľa návodu výrobcu kitu. Extrakčný roztok sa zráža s etanolom pri získaní mRNA ako zrazeniny. Zrazenina mRNA sa rozpustila v elučnom pufri.

(2) Príprava a amplifikácia cDNA génu kódujúceho V región myšieho H reťazca.

(i) klonovanie cDNA pre V región H reťazca protilátky #23-57-137-1

DNA kódujúca V región H reťazca myšej monoklonálnej protilátky proti ľudskému PTHrP bola klonovaná 5'-RAČE technikou (Frohman, M.A. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 8998-9002, 1988; Belyavsky, A: et al., Nucleic Acids Res. 17: 2919-2932, 1989). Táto technika bola uskutočnená pri použití 5'Ampli FINDER RAČE Kit (CLONTECH) podľa návodu výrobcu. V tejto technike bol primér použitý na syntézu cDNA MHC2 primér (SEQ ID NO:1), ktorý hybridizuje s C regiónom myšieho H reťazca. Približne 2 pg mRNA získanej vyššie, ktorá bola šablónou syntézy cDNA, sa zmiešalo s 10 pmol priméru MHC2. Vzniknutá zmes reagovala s reverznou transkriptázou pri 52°C počas 30 minút pri získaní cDNA, ktorá bola komplementárna k mRNA.

Vzniknutá zmes sa zmiešala s 6N NaOH na hydrolýzu prítomnej mRNA (pri 65°C počas 30 minút) a potom sa uskutočnilo zrážanie etanolom na izoláciu cDNA ako zrazeniny. Takto izolovaná cDNA bola ligovaná na Ampli FINDER Anchor (SEQ ID NO: 42) na jej 5'-koniec reakciou s T4 RNA ligázou pri 37°C počas 6 hodín a ďalej pri izbovej teplote počas 16 hodín. Ako priméry na amplifikáciu cDNA technikou PCR boli použité Anchor primér (SEQ ID NO: 2) a MHC-G1 primér (SEQ ID NO: 3) (S.T. Jones et al., Biotechnology, 9: 88, 1991).

PCR roztok (50μ1) použitý pri tejto technike obsahoval 10 mM Tris-HCl (pH 8,3), 50 mM KC1, 0,25 mM dNTP (dATP, dGTP, dCTP, dTTP) , 1,5 mM MgCl₂, 2,5 jednotky TaKaRa Taq (Takara Shuzo) , 10 pmol Anchor priméru a Ιμΐ reakčnej zmesi cDNA, na ktorú boli ligované MHC-G1 primér a Ampli FINDER Anchor primér, ktorá bola prevrstvená 50μ1 minerálneho oleja. Tridsať cyklov PCR reakcie bolo uskutočnených pri použití Thermal Cycler Model 480J (Perkin Elmer) a teplotných cyklov 94°C, 45 sekúnd; 60°C, 45 sekúnd; a 72°C, 2 minúty.

(ii) Klonovanie cDNA pre V región L reťazca protilátky #23-57-137-1

DNA kódujúca V región L reťazca myšej monoklonálnej protilátky proti ľudskému PTHrP bola klonovaná 5'-RAČE technikou (Frohman, M.A. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 8998-9002, 1988; Belyavsky, A: et al., Nucleic Acids Res. 17: 2919-2932, 1989). Táto technika bola vykonaná pri použití 5'-Ampli FINDER RAČE Kit (CLONTECH) podľa návodu výrobcu. Pri tejto technike bol oligo-dT primér použitý ako primér pre syntézu cDNA. Približne 2 pg mRNA získanej vyššie, ktorá bola šablónou syntézy cDNA, sa zmiešalo s oligo-dT primérom. Vzniknutá zmes reagovala s reverznou transkriptázou pri 52 °C počas 30 minút pri získaní cDNA. Vzniknutá zmes sa zmiešala s 6N NaOH pre hydrolýzu tu prítomnej RNA (pri 65°C počas 30 minút). Potom sa vykonalo zrážanie etanolom na izoláciu cDNA ako zrazeniny. Takto izolovaná cDNA bola ligovaná na Ampli FINDER Anchor na jej 5'-koniec reakciou s T4 RNA ligázou pri 37°C počas 6 hodín a ďalej pri izbovej teplote počas 16 hodín.

PCR primér MLC (SEQ ID NO: 4) bol navrhnutý na základe konzervovanej sekvencie pre C región myšieho LX reťazca a bol syntetizovaný pri použití 394 DNA/RNA Synthesizer (ABI). PCR roztok (100 μΐ) použitý na syntézu priméru obsahoval 10 mM Tris-HCl (pH 8,3), 50 mM KCl, 0,25 mM dNTP (dATP, dGTP, dCTP, dTTP), 1,5 mM MgCl₂, 2,5 jednotiek AmpliTaq (Perkin Elmer), 50 pmol Anchor priméru (SEQ ID NO: 2) a ΐμΐ reakčnej zmesi cDNA, na ktorú boli ligované MLC (SEQ ID NO: 4) a Ampli FINDER Anchor, ktorá bola prevrstvená 50 μΐ minerálneho oleja. Tridsať cyklov PCR reakcie bolo vykonaných pri použití Thermal Cycler Model 480J (Perkin Elmer) a teplotných cyklov 94°C, 45 sekúnd; 60°C, 45 sekúnd; a 72°C, 2 minúty.

(3) Prečistenie a fragmentácia produktu PCR

Každý z DNA fragmentov amplifikovaných opísanou PCR technikou bol separovaný agarózovou gélovou elektroforézou pri použití 3% NuSieve GTG agarózy (FMC Bio. Products). Pre V región H reťazca a V región L- reťazca bola v príslušnom poradí z gélu excidovaná frakcia obsahujúca DNA fragment s dĺžkou približne 550 bp. Každá získaná frakcia gélu bola prečistená pri získaní DNA pomocou GENECLEAN II Kitu (BI0101) podľa návodu výrobcu. Prečistená DNA bola vyzrážaná z roztoku etanolom a bola rozpustená v 20μ1 roztoku obsahujúceho 10 mM Tris-HCl (pH 7,4) a 1 mM EDTA. 1 μΐ takto pripraveného roztoku DNA bol trávený reštrikčným enzýmom Xmal (New England Biolabs) pri 37°C počas 1 hodiny a ďalej reštrikčným enzýmom EcoRI (Takara Shuzo) pri 37°C počas 1 hodiny. Trávená zmes bola podrobená extrakcii fenolom a chloroformom a potom zrážaniu etanolom pre odber DNA.

Týmto spôsobom boli získané DNA kódujúce V región Myšieho H reťazca a DNA kódujúce V región myšieho L reťazca, ktoré mali obe na 5'-konci sekvenciu rozpoznávajúcu EcoRI a na 3'-konci sekvenciu rozpoznávajúcu Xmal.

Každý z EcoRI-Xmal DNA fragmentov obsahujúcich DNA kódujúcu V región myšieho H reťazca a DNA kódujúcu V región myšieho L reťazca, v príslušnom poradí, reagoval s pUC19 vektorom, ktorý bol trávený EcoRI a Xmal, pri 16°C počas 1 hodiny pri použití DNA Ligation Kit verzia 2 (Takara Shuzo) podľa návodu výrobcu na vzájomnú ligáciu. Takto získaná ligačná zmes (10 μΐ) sa pridala k 100 μΐ roztoku obsahujúceho kompetentné bunky E.coli, JM 109 (Nippon Gene) . Zmes buniek sa nechala stáť počas 15 minút na ľade, ďalej pri 42°C počas 1 minúty a ďalej počas 1 minúty na ľade. Výsledná zmes sa zmiešala s 300 μΐ SOC kultivačného média (Sambrook et al., Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989) a potom sa vykonala inkubácia pri 37°C počas 30 minút. Vzniknutý roztok buniek sa kultivoval na LB alebo 2xYT agarovom médiu (Sambrook et al., Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989) doplnenom 100 alebo 50pg/ml ampicilínu, 0,1 mM IPTQ a 20pg/ml X-gal a potom sa vykonala inkubácia pri 37°C cez noc. Týmto spôsobom sa pripravili transformanty E.coli.

Transformanty sa kultivovali cez noc v 2 ml LB alebo 2xYT média obsahujúceho 100 alebo 50 pg/ml ampicilínu pri 37°C a potom sa z bunkovej frakcie pripravila plazmidová DNA pomocou Plasmid Extracter ΡΙ-100Σ (Kurabou) alebo QUIAPrep Spin Plasmid Kitu (QIAGEN). Pri takto získaných plazmidových DNA boli určené jej DNA sekvencie.

(4) Sekvencovanie cDNA kódujúcej V región myšej protilátky.

Sekvencia cDNA kódujúca región nesený na plazmide bola určená pri použití DNA Sequencer 373A (ABI; Perkin-Elmer) pei použití Dye terminátor Cycle Sequencing Kitu (Perkin Elmer). Táto DNA sekvencia bola určená potvrdením sekvencie báz v oboch orientáciách pri použití primérov M13 Primér M4 (Takara Shuzo) (SEQ ID NO: 5) a M13 Primér RV (Takara Shuzo) (SEQ ID NO: 6) .

Takto získané plazmidy, ktoré obsahovali cDNA kódujúcu V región myšieho H reťazca a cDNA kódujúcu V región myšieho L reťazca odvodené od hybridómu #23-57-137-1 boli označené MBC1H04 a MBC1L24, v príslušnom poradí. Sekvencie (vrátane zodpovedajúcich aminokyselinových sekvencií) DNA kódujúce V región H reťazca a DNA kódujúce V región L reťazca myšej protilátky #23-57131-1 (v príslušnom poradí nesené na plazmidoch MBC1H04 a MBC1H24) sú uvedené v SEQ ID NO: 57 a SEQ ID NO: 65, v príslušnom poradí. Obidva polypeptidy pre fragment V regiónu H reťazca a pre fragment V regiónu L reťazca boli translatované od 58.bázy (ktorá kóduje glutamín) v DNA sekvencií uvedenej v SEQ ID NO: 57 a SEQ ID NO: 65. Aminokyselinové sekvencie pre V región H reťazca a V región L reťazca sú uvedené v SEQ ID NO: 46 a SEQ ID NO: 45, v príslušnom poradí.

E. coli nesúca plazmid MBC1H04 a E.coli nesúca plazmid MBC1L24 boli označené Escherichia coli JM109 (MBC1H04) a Escherichia coli JM109 (MBC1L24), v príslušnom poradí. Tieto kmene E. coli boli uložené podľa Budapeštianskej zmluvy z 15.8.1996 v National Inštitúte of Bioscience and Human Technology, Agency of Industrial Science and Technology, Japan (1-3, Higashi 1-chome, Tsukuba-shi, Ibaragi-ken, Japan) s prírastkovým číslom FERM BP-5628 pre Escherichia coli JM109 (MBC1H04) a FERM BP-5627 pre Escherichia coli JM109 (MBC1L24), v príslušnom poradí.

(5) Určenie CDR myšej monoklonálnej protilátky #23-57-137-1 proti ľudskému PTHrP

Všeobecné štruktúry V regiónu H reťazca a V regiónu L reťazca sú navzájom podobné. To znamená, že obidve štruktúry majú štyri regióny pracovných rámcov spojené troma hypervariabilnými regiónmi (t. j. komplementaritu určujúcimi regiónmi (CDR)). Aminokyselinové sekvencie regiónov pracovných rámcov sú relatívne dobre konzervované, pričom aminokyselinové sekvencie CDR regiónov vykazujú extrémne vysokú mutagenicitu (Kabat, E.A. et al., Seguence of Proteins of Immunological Interest, U.S. Dept. Health and Human Services, 1983).

Na základe uvedených skutočností boli CDR určené vyhľadávaním homológie aminokyselinových sekvencií V regiónu myšej monoklonálnej protilátky v Data Base aminokyselinových sekvencií pre protilátky, ktorú určil Kabat et al.

Aminokyselinové sekvencie CDR 1-3 vo V regióne L reťazca sú uvedené v SEQ ID NO: 59-61, v príslušnom poradí a aminokyselinové sekvencie CDR 1-3 vo V regióne H reťazca sú uvedené v SEQ ID NO: 62-64, v príslušnom poradí.

Tabuľka 2

V región	SEQ ID NO:	CDR1	CDR2	CDR3
V región H reťazca	57	31-35	50-66	99-107
V región L reťazca	65	23-34	50-60	93-105

Príklad 2: Konštrukcia chimérickej protilátky (1) Konštrukcia H reťazca chimérickej protilátky (i) Konštrukcia V regiónu H reťazca

Klonovaná cDNA kódujúca V región myšieho H reťazca bola modifikovaná PCR metódou pre jej ligáciu do expresného vektora nesúceho genómovú DNA pre C región Cyl ľudského H retazca. Použitý downstream primér MBC1-S1 (SEQ ID NO: 7) bol navrhnutý tak, aby mohol hybridizovať na DNA kódujúcu 5'-koncový región vedúcej sekvencie V región a aby mal obe Kozákove konvenčné sekvencie (Kozák, M. et al., J. Mol. Biol. 196: 947-950, 1987) a sekvenciu rozpoznávajúcu HindlII. Použitý upstream primér MBCl-a (SEQ ID NO: 8) bol navrhnutý tak, aby mohol hybridizovať na DNA kódujúcu 3'-koncový región J regiónu a aby mal obidve zostrihové donorové sekvencie a sekvenciu rozpoznávajúcu BamHI. PCR reakcia bola vykonaná pri použití TaKaRa Ex Taq (Takara Shuzo) a príslušného pufra. PCR roztok (50μ1) použitý v tejto technike obsahoval 0,07 pg plazmidu MBC1H04 ako šablónovej DNA, 50 pmol MBCl-a a 50 pmol MBC1-S1 ako primérov, 2,5 jednotiek TaKaRa Ex Taq a 0,25 mM dNTP v pufri, ktorý bol prevrstvený 50μ1 minerálneho oleja. Tridsať cyklov PCR reakcie bolo vykonaných pri použití teplotných cyklov 94°C, 1 minúta; 55 °C, 1 minúta; a 72°C, 2 minúty. Takto amplifikované DNA fragmenty boli separované agarózovou gélovou elektroforézou pri použití 3% Nu Sieve GTG Agarózy (FMC Bio. Products).

Potom boli fragmenty agarózového gélu obsahujúce DNA fragment s dĺžkou 437 bp excidované a DNA fragment bol prečistený pomocou GENECLEAN II Kitu (BI0101) podľa návodu výrobcu. Prečistená DNA bola vyzrážaná z roztoku etanolom a bola rozpustená v 20 μΐ roztoku obsahujúceho 10 mM Tria-Hcl (pH 7,4) a 1 mM EDTA. Ιμΐ takto pripraveného roztoku DNA bol trávený reštrikčnými enzýmami BamHI a HindlII (Takara Shuzo) pri 37°C počas 1 hodiny. Trávená zmes bola podrobená extrakcii fenolom a chloroformom a potom zrážaniu etanolom pre odber DNA.

Získaný HindlII-BamHI fragment obsahujúci DNA kódujúcu V región myšieho H reťazca bol subklonovaný so pUC19 vektora, ktorý bol trávený HindlII a BamHI. Výsledný plazmid bol sekvencovaný pomocou DNA Sequencer 373A (Perkin Elmer) pri použití M13 Primer M4 a M13 Primer RV ako primérov a Dye Terminátor Cycle Sequencing Kit-u (Perkin Elmer). Plazmid obsahoval DNA so správnou sekvenciou báz kódujúcu V región myšieho H reťazca odvodený od hybridómu #23-57-137-1 a mal rozpoznávaciu sekvenciu pre HindlII a Kozákovu sekvenciu na svojom 5'-koncovom regióne a rozpoznávaciu sekvenciu pre BamHI na svojom 3¹-koncovom regióne a bol označený MBClH/pUC19.

(ii) Konštrukcia V regiónu H reťazca, ktorý je použitý na prípravu cDNA pre myší-ľudský chimérický H reťazec

DNA kódujúca V región myšieho H reťazca konštruovaná vyššie bola modifikovaná PCR metódou na jej ligáciu na cDNA pre C región cyl ľudského H reťazca. Spätný primér, MBC1HVS2 (SEQ ID NO: 9) použitý na modifikáciu V regiónu H reťazca, bol navrhnutý tak, aby nahradil druhú aminokyselinu (t.j. asparagín) sekvencie kódujúcej prvú časť vedúcej sekvencie V regiónu glycínom a aby mal Kozákovu konvenčnú sekvenciu (Kozák, M. et al., J. Mol. Biol. 196: 947-950, 1987) a rozpoznávacie miesto pre HindlII a EcoRI. Sense primér

MBC1HVR2 (SEQ ID NO: 10) použitý na modifikáciu V regiónu H reťazca bol navrhnutý tak, aby mohol hybridizovať na DNA kódujúcu 3' koncový región J regiónu, na 5'-koncový región C regiónu a aby mal sekvenciu rozpoznávajúcu Apal a Smal.

PCR reakcia bola vykonaná pri použití TaKaRa Ex Taq (Takara Shuzo) a príslušného pufra. PCR roztok (50 μΐ) použitý pri tejto technike obsahoval 0,6 pg plazmidu MBClH/pUC19 ako šablónovej DNA, 50 pmol MBC1HVS2 a 50 pmol MBC1HVR2 ako primérov, 2,5 jednotiek TaKaRa Ex Taq a 0,25 mM dNTP v pufri, ktorý bol prevrstvený 50 μΐ minerálneho oleja. Tridsať cyklov PCR reakcie bolo vykonaných pri použití teplotných cyklov 94’C, 1 minúta; 55°C, 1 minúta; a 72°C, 1 minúta. DNA fragmenty amplifikované v PCR reakcii boli separované agarózovou gélovou elektroforézou pri použití 1% Sea Kem GTG agarózy (FMC Bio. Products). Potom boli fragmenty agarózového gélu obsahujúce DNA fragment s dĺžkou 456 bp excidované a DNA fragment bol prečistený pomocou GENECLEAN II Kitu (BI0101) podľa návodu výrobcu. Prečistené DNA fragmenty boli vyzrážané etanolom a potom boli rozpustené v 20 μΐ roztoku obsahujúceho 10 mM Tris-HCl (pH 7,4) a 1 mM EDTA.

μΐ takto pripraveného roztoku DNA bol trávený reštrikčnými enzýmami ExoRI a Smal (Takara Shuzo) pri 37°C počas 1 hodiny. Trávená zmes bola podrobená extrakcii fenolom a chloroformom a potom zrážaniu etanolom na odber DNA. Získané EcoRI-Smal DNA fragmenty obsahujúce DNA kódujúcu V región myšieho H reťazca boli subklonované do pUC19 vektora, ktorý bol pripravený trávením plazmidu EcoRI a Smal. Výsledný plazmid bol sekvencovaný pomocou DNA Sequencer 373A (Perkin Elmer) pri použití M13 Primer M4 a M13 Primer RV ako primérov a Dye Terminátor Cycle Sequencing Kit-u (Perkin Elmer). Plazmid obsahoval DNA so správnou sekvenciou báz kódujúcu V región V región myšieho H reťazca odvodený od hybridómu #23-57-137-1 a mal rozpoznávaciu sekvenciu pre Hind III a Kozákovu sekvenciu na svojom 5'-koncovom regióne a rozpoznávaciu sekvenciu pre Apal a Smal na svojom 3'-koncovom regióne a bol označený MBClHv/pUC19.

(iii) Konštrukcia expresného vektora pre H reťazec chimérickej protilátky cDNA obsahujúca C región Cyl H reťazca ľudskej protilátky bola pripravená nasledujúcim spôsobom.

mRNA bola pripravená z CHO buniek, do ktorých bol vložený expresný vektor DHFR-ÁE-RVh-PM-l-f (pozri WO 92/19759) kódujúcej genómovej DNA V regiónu H reťazca humanizovanej protilátky PM1 a C región H reťazca ľudskej protilátky IgGl a expresný vektor RVl-PMla (pozri WO 92/19759) kódujúcej genómovej DNA V regiónu L reťazca humanizovanej protilátky PM1 a C región κ reťazca L reťazca ľudskej protilátky. Pri použití získanej mRNA bola klonovaná cDNA obsahujúca V región H reťazca humanizovanej protilátky PM1 a C región Cyl ľudskej protilátky technikou RT-PCR a potom bola subklonovaná do plazmidu pUC 19 v HindlII-BamHI mieste. Pri subklonovanom plazmide bola určená jeho DNA sekvencia a plazmid so správnou sekvenciou báz bol označený pRVh-PMlf-CDNA.

Expresný vektor DHFR-AE-RVh-PM-l-f, ktorý mal delécie HindlII miesta medzi SV40 promotorom a DHFR génom a EcoRI miesta medzi Ef-ΐα promotorom a V regiónom H reťazca humanizovanej protilátky PM1 bol pripravený na konštrukciu expresného vektora pre cDNA obsahujúcu V región H reťazca humanizovanej protilátky PM1 a C región Cyl ľudskej protilátky.

Získaný plazmid pRVh-PMlf-cDNA bol trávený BamHľ, tupo zakončený Klenow fragmentom a bol ďalej trávený HindlII pri získaní tupo zakončeného HinlllBamHI fragmentu. Tento tupo zakončený HinlII-BamHI fragment bol ligovaný do uvedeného expresného vektora s deletovaným HindlII miestom a EcoRI miestom DHFR-AE-RVh-PM-l-f, ktorý bol trávený HindlII a BamHI pri konštrukcii expresného vektora RVh-PMlf-cDNA obsahujúceho cDNA kódujúcu V región H reťazca humanizovanej protilátky PM1 a C región Cyl ľudskej protilátky, -v príslušnom poradí.

Expresný vektor RVh-PMlf-cDNA obsahujúci cDNA kódujúcu V región H reťazca humanizovanej protilátky PM1 a c región Cyl ľudskej protilátky bol trávený Apal a BamHI a bol z nej získaný DNA fragment obsahujúci C región H reťazca. Výsledný DNA fragment bol vložený do uvedeného plazmidu MBClHv/pUC19, ktorý bol trávený Apal a BamHI. Takto pripravený plazmid bol označený MBClHcDNA/pUC19. Tento plazmid je plazmid obsahujúci cDNA kódujúcu V región H reťazca myšej protilátky a C región Cyl ľudskej protilátky, v príslušnom poradí, ktorý má rozpoznávacie sekvencie pre EcoRI a HindlII na svojom 5'-konci a rozpoznávaciu sekvenciu pre BamHI na svojom 3'-konci.

Plazmid MBClHcDNA/pUC19 bol trávený EcoRI a BamHI pri získaní DNA kódujúcej H reťazec chimérickej protilátky. Vzniknutý DNA fragment bol vložený do expresného vektora pCOSl, ktorý bol trávený EcoRI a BamHI. Takto získaný expresný vektor pre chimérickú protilátku bol označený MBCIHcDNA/pCOSI. Tu bol expresný vektor pCOSl konštruovaný pri použití HEFPMh-gyl (pozri HO 92/19759) pomocou jeho delécie z génu pre protilátku pomocou trávenia EcoRI a Smal a potom jeho ligáciou na EcoRI-Notl-BamHI Adaptor (Takara Shuzo).

Na prípravu plazmidu na expresiu v CHO bunkách pol plazmid MBClHcDNA/pUC19 trávený ExoRI a BamHI pri získaní DNA kódujúcej H reťazec chimérickej protilátky, ktorá bola potom vložená do expresného plazmidu pCHOl, ktorý bol trávený EcoRI a BamHI. Takto získaný expresný plazmid pre chimérickú protilátku bol označený MBCIHcDNA/pCHOl. Tu bol expresný vektor pCHOl konštruovaný pri použití DHFR-AE-rvH-PMl-f (pozri WO 92/19759) pomocou jeho delécie z génu pre protilátku pomocou trávenia EcoRI a Smal a potom jeho ligáciou na EcoRI-Nôti-BamHI Adaptor (Takara Shuzo).

(2) Konštrukcia C regiónu ľudského H reťazca (i) Príprava klonovacieho vektora

Na konštrukciu pUC19 vektora obsahujúceho C región ľudského L reťazca bol pripravený vektor pUC19 s deletovaným HindlII miestom. 2 pg pUC19 vektora boli trávené v 20 μΐ reakčného roztoku, ktorý obsahoval 20 mM Tris-HCl (pH 8,5), 10 mM MgCl,, 1 mM DTT, 100 mM KCl, 8 U HindlII (Takara Shuzo) pri 37°C počas 1 hodiny. Výsledný trávený roztok bol podrobený extrakcii fenolom a chloroformom a potom zrážaniu etanolom na získanie požadovanej DNA.

Takto získaná DNA reagovala v 50 μΐ reakčného roztoku obsahujúceho 50 mM Tris-HCl (pH 7,5), 10 mM MgCl,, 1 mM DTT, 100 mM NaCl, 0,5 mM dNTP a 6 U Klenow fragmentu (GIBCO BRL) pri izbovej teplote počas 20 minút, čo spôsobilo tupé zakončenie koncov DNA. Táto reakčná zmes bola podrobená extrakcii fenolom a chloroformom a potom zrážanie etanolom na získanie vektorovej DNA.

Takto získaná vektorová DNA reagovala v 10 μΐ reakčného roztoku obsahujúceho 50 mM Tris-HCl (pH 7,6), 10 mM MgCl₂, 1 mM ATP, 1 mM DTT, 5% (obj./obj.) polyetylénglykol-8000 a 0,5 U T4 DNA ligázy (GIBCO-BRL) pri 16°C počas 2 hodín, čím bola dosiahnutá samoligácia vektorovej DNA. 5 μΐ reakčného roztoku sa pridalo k 100 μΐ roztoku obsahujúceho kompetentné bunky E.coli, JM 109 (Nippon Gene) a výsledný roztok sa nechal stáť počas 30 minút na ľade, ďalej pri 42°C počas 1 minúty a ďalej počas 1 minúty na ľade. Do reakčného roztoku sa pridalo 300 μΐ SOC kultivačného média a potom sa vykonala inkubácia pri 37°C počas 1 hodiny. Vzniknutý roztok buniek sa kultivoval na 2xYT agarovom médiu (obsahujúcom 50 μς/ιηΐ ampicilínu), ktoré malo na svojom povrchu IPTG a X-gal (Sambrook et al., Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989) a potom sa vykonala inkubácia pri 37°C cez noc pri zisku transformantov.

Transformanty sa kultivovali cez noc na 2xYT médiu obsahujúcom 50 pg/ml ampicilínu pri 37°C. Z bunkovej frakcie kultivačného média sa prečistila plazmidová DNA pomocou Plasmid Mini Kit-u (QIAGEN) podľa návodu výrobcu.

Prečistený plazmid bol trávený HindlII. Plazmid, u ktorého bola potvrdená delécia HindlII miesta bol označený pUC19 AHindlII.

(ii) Konštrukcia DNA kódujúcej C región λ reťazca L reťazca

Je známe, že C región ľudského λ reťazca L reťazca má aspoň 4 rôzne izotypy zahŕňajúce Mcg*Ke*Oz', McgKeOz, McgKeOz* a McgKeOz (p. Dariavach et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84: 9074-9078, 1987). Bolo vykonané vyhľadávanie C regiónov λ reťazca L reťazca ľudskej protilátky homológnych k C regiónu λ reťazca L reťazca #23-57-137-1 c EMBL databáze. Pri tomto vyhľadávaní bolo zistené, že izotyp Mcg*Ke*0z' (prírastkové č. X57819) (P. Dariavach et al., Proc. Natl. Acad. Sci, USA 84: 9074-9078, 1987) λ reťazca L reťazca ľudskej protilátky vykazuje najvyššiu homológiu s C regiónom λ reťazca myšieho L reťazca a má 64,4% homológiu aminokyselinovej sekvencie a 73,4% homológiu DNA sekvencie.

Potom bola vykonaná konštrukcia DNA kódujúca C región λ reťazca L reťazca ľudskej protilátky pomocou PCR. Pri použití 394 DNA/RNA Synthetizer (ABI) bol syntetizovaný každý z nasledujúcich primérov. Syntetizovanými primérmi boli HLAMB1 (SEQ ID NO: 11) a HLAMB3 (SEQ ID NO: 13), ktoré mali obidva sense DNA sekvencie a HLAMB2 (SEQ ID NO: 12) a HLAMB4 (SEQ ID NO: 14), ktoré mali obidva antisense DNA sekvencie, pričom každý primér obsahoval na oboch koncoch komplementárnej sekvencie s dĺžkou 20-23 bp.

Externé priméry HLAMBS (SEQ ID NO: 15) a HLAMBR (SEQ ID NO: 16) majú sekvenciu komplementárnu k primérom HLAMB1 a HLAMB4, v príslušnom poradí, a obsahujú rozpoznávacie sekvencie pre EcoRI, v príslušnom poradí. V prvej PCR reakcii bola vykonaná reakcia HLAMB1-HLAMB2 a HLAMB3-HLAMB4. Po dokončení reakcií boli obe výsledné zmesi zmiešané v rovnakých množstvách a boli zostavené v druhej PCR reakcii. K vzniknutej reakčnej zmesi boli pridané externé priméry HLAMBS a HLAMBR. Na tejto reakčnej zmesi bola vykonaná tretia PCR reakcia na amplifikáciu kompletnej DNA.

PCR reakcie boli vykonané pri použití TaKaRa Ex Taq (Takara Shuzo) podľa návodu výrobcu. V prvej PCR reakcii bolo použitých 100 μΐ buď reakčného roztoku obsahujúceho 5 pmol HLAMB1, 0,5 pmol HLAMB2 a 5U TaKaRa Ex Taq (Takara Shuzo), alebo obsahoval reakčný roztok 0,5 pmol HLAMB3, 5 pmol HLAMB4 a 5U TaKaRa Ex Taq (Takara Shuzo), ktorý bol prevrstvený 50 μΐ minerálneho oleja a päť cyklov PCR reakcie bolo vykonaných pri použití teplotných cyklov 94°C, 1 minúta,· 60°C, 1 minúta,· a 72°C, 1 minúta. V druhej PCR reakcii bola použitá zmes 50 μΐ každého z reakčných roztokov, ktoré boli prevrstvené 50 μΐ minerálneho oleja a tri cykly PCR reakcie boli vykonané pri použití teplotných cyklov 94°C, 1 minúta; 60°C, 1 minúta; a 72°C, 1 minúta. V tretej PCR reakcii bol použitý reakčný roztok, do ktorého bolo pridaných 50 pmol každého z externých primérov HLAMBS a HLAMBR a tridsať cyklov PCR reakcie bolo vykonaných pri použití teplotných cyklov 94°C, 1 minúta; 60°C, 1 minúta; a 72 °C, 1 minúta.

DNA fragment získaný v tretej PCR reakcii bol separovaný agarózovou gélovou elektroforézou pri použití 3% agarózového gélu s nízkou teplotou topenia (Nu Sieve GTG Agarosa, FMC) a potom bol odobratý a prečistený pomocou GENECLEAN II Kit-u (BIO101) podľa návodu výrobcu.

Takto získaný DNA fragment bol trávený v 20 μΐ reakčného roztoku obsahujúceho 10 mM Tris-HCl (pH 7,5) , 10 mM MgCl₂, 1 mM DTT, 100 mM NaCl a 8 U EcoRI (Takara Shuzo) pri teplote 37°C počas 1 hodiny. Trávený roztok bol extrahovaný fenolom a potom zrážaný etanolom pri získaní DNA. DNA bola odobratá a rozpustená v 8 μΐ roztoku obsahujúceho 10 mM Tris-HCl (pH 7,4) a 1 mM EDTA.

0,8 μ9 plazmidu pUC19 ÁHindlII bolo trávených EcoRI opísaným spôsobom. Trávený roztok bol extrahovaný fenolom a chloroformom a potom bol vyzrážaný etanolom, pri získaní tráveného plazmidu pUC19 ÁHindlII. Takto získaný trávený plazmid reagoval v 50 μΐ reakčného roztoku obsahujúceho 50 mM Tris-HCl (pH 9,0), 1 mM MgCl₂ a alkalickú fosfatázu (E. coli c75; Takara Shuzo) pri 37°C počas 30 minút na defosforyláciu plazmidu (t.j. BAP-spracovanie). Reakčný roztok bol extrahovaný fenolom a chloroformom a potom zrážaný etanolom pri zisku DNA. Takto získaná DNA bola rozpustená v 10 μΐ roztoku obsahujúceho 10 mM Tris-HCl (pH 7,4) a 1 mM EDTA.

μΐ takto získaného plazmidu pUC19 ÁHindlII spracovaného BAP bol zmiešaný s 4μ1 DNA získanej v uvedenej PCR reakcii na vzájomnú ligáciu pri použití DNA Ligation Kit ver. 2 (Takara Shuzo). Vzniknutý plazmid bol vložený do kompetentných buniek E. coli JM109 pri vzniku transformantov. Transformanty boli kultivované cez noc v 2 ml 2xYT média obsahujúceho 50 μg/ml ampicilínu. Z buniek bol plazmid prečistený pri použití QIAprep Spin Plasmid Kit-u (QUIAGEN).

U opísaného plazmidu bola určená sekvencia klonovanej DNA. Na určenie sekvencie DNA bol použitý 373A DNA Sequencer (ABI) a priméry M13 Primér M4 a M13 Primér RV (Takara Shuzo). Bolo zistené, že klonovaná DNA má deletovanú časť 12 bp. Plazmid obsahujúci DNA bol označený cXÁ/pUC19. Potom boli na výrobu deletovanej časti nanovo syntetizované priméry HCLMS (SEQ ID NO: 17) a HCLMR (SEQ ID NO: 18) a správna DNA bola rekonštruovaná PCR metódou.

Bola vykonaná prvá PCR reakcia, pri použití plazmidu CXÁ/pUC19 obsahujúceho deletovanú DNA ako Šablónu a primárov HLAMBS a HCLMS alebo primárov HCLMS a HLAMB4. Každý produkt PCR reakcie bol prísluSným spôsobom prečistený. V druhej PCR reakcii boli produkty PCR spojené. K vzniknutému produktu boli pridané externé priméry HLAMBS a HLAMB4 a potom nasledovala tretia PCR reakcia na amplifikáciu kompletnej DNA.

V prvej PCR reakcii bolo použitých 100 μΐ reakčných roztokov obsahujúcich 0,1 pg CXA/pUC19 ako šablóny, buď 50 pmol každého z primérov HLAMBS alebo HCLMR alebo 50 pmol každého z primérov HCLMS a HLAMB4 a 5U TaKaRa Ex Taq (Takara Shuzo), ktoré boli prevrstvené 50 μΐ minerálneho oleja a tridsať cyklov PCR reakcie bolo vykonaných pri použití teplotných cyklov 94°C, 1 minúta; 60°C, 1 minúta; a 72°C, 1 minúta.

Produkty PCR, HLAMBS-HCLMR (236 bp) a HCLMS-HLAMB4 (147 bp) boli podrobené elektroforéze pri použití 3% agarózového gélu s nízkou teplotou topenia na izoláciu DNA fragmentu. DNA fragment bol potom odobratý a prečistený pomocou GENECLEAN II Kit-u (BIO101). V druhej PCR reakcii bolo použitých 20 μΐ reakčného roztoku obsahujúceho 40 ng prečistených DNA fragmentov s 1 U TaKaRa Ex Taq (Takara Shuzo), ktorý bol prevrstvený 25 μΐ minerálneho oleja a bolo vykonaných päť cyklov PCR reakcie pri použití teplotných cyklov 94°C, 1 minúta; 60°C, 1 minúta; a 72°C, 1 minúta.

V tretej PCR reakcii bolo použitých 100 μΐ reakčného roztoku obsahujúceho 2 μΐ reakčného roztoku získaného v druhej PCR reakcii, 50 pmol každého z externých primérov HLAMVS a HLAMB4 a 5 U TaKaRa Ex Taq (Takara Shuzo), ktorý bol prevrstvený 50 μΐ minerálneho oleja a tridsať cyklov PCR reakcie bolo vykonaných pri použití teplotných cyklov 94°C, 1 minúta; 60°C, 1 minúta; a 72°C, 1 minúta, pri získaní DNA fragmentu s dĺžkou 357 bp (produkt tretej PCR). DNA fragment bol podrobený elektroforéze pri použití 3% agarózového gélu s nízkou teplotou topenia na izoláciu DNA fragmentu. DNA fragment bol potom odobratý a prečistený pomocou GENECLEAN II Kitu (BI0101).

0,1 pg takto získaného DNA fragmentu bolo potom trávených EcoRI a výsledný produkt bol potom subklonovaný do plazmidu pUC19ÁHindIII, ktorý bol spracovaný BAP. Vzniknutý plazmid bol vložený do kompetentných buniek E.coli JM109 za vzniku transformantov. Takto pripravené transformanty boli kultivované cez noc v 2 ml 2xYT média obsahujúceho 50 pg/ml ampicilínu. Z buniek bol plazmid prečistený pri použití QIAprep Spin Plasmid Kitu (QIAGEN).

DNA sekvencia takto získaného plazmidu bola potvrdená pomocou M13 Primer M4 a M13 Primer RV (Takara Shuzo) a pri použití 373A DNA Sequencer (ABI) . Plazmid s potvrdenou správnou sekvenciou DNA bez akejkoľvek delécie bol označený VX/pUC19.

(iii) Konštrukcia DNA kódujúcej C región κ reťazca ľudského L reťazca

DNA fragment kódujúci C región κ reťazca L reťazca bol klonovaný z plazmidu HEF-PMl-gk: (HO 92/19759) technikou PCR. Sense primér HKAPS (SEQ ID NO: 19) bol navrhnutý tak, aby obsahoval EcoRI, HindlII a Blnl rozpoznávacie sekvencie a antisense primér HKAPA (SEQ ID NO: 20) bol navrhnutý tak, aby obsahoval EcoRI-rozpoznávaciu sekvenciu, a obidva boli syntetizované pri použití 394 DNA/RNA Synthetizer (ABI).

PCR reakcia bola vykonaná pri použití 100 μΐ reakčného roztoku obsahujúceho 0,1 pg plazmidu HEF-PMlk-gk ako šablónu, 50 pmol každého z primérov HKAPS a HKAPA a 5U TaKaRa Ex Taq (Takara Shuzo), ktorý bol prevrstvený 50 μΐ minerálneho oleja. Tridsať cyklov PCR reakcie bolo vykonaných pri použití teplotných cyklov 94°C, 1 minúta; 60°C, 1 minúta; a 72°C, 1 minúta, pri získaní DNA fragmentu s dĺžkou 360 bp. DNA fragment bol izolovaný elektroforézou pri použití 3% agarózy s nízkou teplotou topenia a potom bol odobratý a prečistený pomocou GENECLEAN III Kit-u (BI0101).

Takto získaný DNA fragment bol potom trávený EcoRI a výsledný produkt bol klonovaný do plazmidu pUC19AHindIII, ktorý bol spracovaný BAP. Výsledný plazmid bol vložený do kompetentných buniek E. coli JM109 za vzniku transformantov. Takto pripravené transformanty boli kultivované cez noc v 2 ml 2xYT média obsahujúceho 50 pg/ml ampicilínu. Z bunkovej frakcie bol plazmid prečistený pri použití QIAprep Spin Plasmid Kit-u (QIAGEN).

DNA sekvencia takto získaného plazmidu bola potvrdená pomocou M13 Primér M4 a M13 Primér RV (Takara Shuzo) a pri použití 373A DNA Sequencer (ABI) . Plazmid s potvrdenou správnou sekvenciou DNA bez akejkoľvek delécie bol označený CK/pUC19.

(3) Konštrukcia expresného vektora pre L reťazec chimérickej protilátky

Bol konštruovaný expresný vektor pre L reťazec chimérickej protilátky #23-57-137-1. DNA kódujúca V región L reťazca #23-57-137-1 bola ligovaná do HindlII a Blnl miest, prítomných tesne pred C regiónom ľudskej protilátky každého z plazmidov CX/pUC19 a Cic/pUC19, pri získaní pUC19 vektorov, ktoré obsahovali DNA kódujúcu V región L reťazca chimérickej protilátky #23-57-137-1 a C región λ alebo κ reťazca L reťazca. Každý zo vzniknutých vektorov bol potom trávený EcoRI na excisiu DNA kódujúcej L reťazec chimérickej protilátky a DNA bola subklonovaná do HEF expresného vektora.

DNA kódujúca V región L· reťazca protilátky #23-57-137-1 bola klonovaná z plazmidu MBC1L24 pomocou PCR techniky. Priméry boli individuálne syntetizované pomocou 394 DNA/RNA Synthetizer (ABI). Použitý antisense primér MBCCHL1 (SEQ ID NO: 21) bol navrhnutý tak, aby obsahoval rozpoznávaciu sekvenciu pre HindlII a Kozákovu sekvenciu (Kozák, M. et. al., J. Mol. Biol. 196: 947-950, 1987) a sense primér MBCCHL3 (SEQ ID NO: 22) bol navrhnutý tak, aby obsahoval rozpoznávacie sekvencie pre BglII a EcoRI.

PCR reakcia bola vykonaná pri použití 100 μΐ reakčného roztoku obsahujúceho 10 mM Tris-HCl (pH 8,3), 50 mM KC1, 1,5 mM MgCl,, 0,2 mM dNTP, 0,1 pg MBC1L24, 50 pmol každého z primérov MBCCHL1 a MBCCHL3 a 1 pg AmpliTaq (PERKIN ELMER), ktorý bol prevrstvený 50 μΐ minerálneho oleja. Tridsať cyklov PCR reakcie bolo vykonaných pri použití teplotných cyklov 94°C, 45 sekúnd; 60°C, 45 sekúnd; a 72°C, 2 minúty.

DNA fragment bol izolovaný elektroforézou pri použití 3% agarózového gélu s nízkou teplotou topenia a potom bol odobratý a prečistený pomocou GENECLEAN II Kitu (BI0101).

Prečistený DNA fragment s dĺžkou 444 bp bol rozpustený v 20 μΐ reakčného roztoku obsahujúceho 10 mM Tris-HCl (pH 7,4) a l mM EDTA. 1 μΐ produktu PCR bol trávený v 20 μΐ reakčného roztoku obsahujúceho 10 mM Tris-HCl (pH 7,5), 10 mM MgCl,, 1 mM DTT, 50 mM NaCl a 8 U HindlII (Takara Shuzo) a 8 U ExoRI (Takara Shuzo) pri teplote 37°C počas 1 hodiny. Trávený roztok bol extrahovaný fenolom a chloroformom a potom zrážaný etanolom pri získaní DNA ako zrazeniny. Takto získaná DNA bola rozpustená v 8 μΐ roztoku obsahujúceho 10 mM Tris-HCl (pH 7,4) a 1 m EDTA.

pg plazmidu pUC19 bol trávený HindlII a EcoRI opísaným spôsobom a potom bol extrahovaný fenolom a chloroformom a potom bol vyzrážaný etanolom, pri získaní tráveného plazmidu. Takto získaný trávený plazmid bol spracovaný BAP (t.j. alkalickou fosfatázou (E. coli C75; Takara Shuzo)) a bol extrahovaný fenolom a chloroformom a potom zrážaný etanolom pri získaní DNA. Takto získaná DNA bola rozpustená v 10 μΐ roztoku obsahujúceho 10 mM Tris-HCl (pH 7,4) a 1 mM EDTA.

μΐ takto získaného plazmidu pUC19 spracovaného BAP bol zmiešaný so 4 μΐ uvedeného produktu PCR reakcie na vzájomnú ligáciu pri použití DNA Ligation Kit ver. 2 (Takara Shuzo). Vzniknutý plazmid bol vložený do kompetentných buniek E. coli JM109 (Nippon Gene), rovnakým spôsobom, ako je uvedené vyššie, pri vzniku transformantov. Transformanty boli kultivované cez noc v 2 ml 2xYT agarového média obsahujúceho 50 pg/ml ampicilínu pri 37°C. Vzniknuté transformanty boli kultivované cez noc v 2 ml 2xYT média obsahujúceho 50 pg/ml ampicilínu pri 37°C. Z buniek bol plazmid prečistený pri použití QIAprep Spin Plasmid Kit-u (QIAGEN). Po určení DNA sekvencie bol plazmid s potvrdenou správnou sekvenciou označený CHL/pUC19.

pg každého z plazmidov CX/pUC19 a C</pUC19 bol trávený v 20 μΐ reakčného roztoku obsahujúceho 20 mM Tris-HCl (pH 8,5), 10 mM MgCl₂, 1 mM DTT, 100 mM KC1, 8 U HindlII (Takara Shuzo) a 2 U Blnl (Takara Shuzo) pri teplote 37°C počas 1 hodiny. Trávený roztok bol extrahovaný fenolom a chloroformom a potom zrážaný etanolom pri získaní DNA ako zrazeniny. DNA bola spracovaná BAP pri 37°C počas 30 minút a potom bola extrahovaná fenolom a chloroformom a zrážaná etanolom. Takto získaná DNA bola rozpustená v 10 μΐ roztoku obsahujúceho 10 mM Tris-HCl (pH 7,4) a 1 mM EDTA.

pg plazmidu CHL/pUC19, ktorý obsahoval DNA kódujúcu V región L reťazca #23-57-137-1, bol trávený HindlII a Blnl spôsobom, opísaným vyššie. Takto získaný DNA fragment s dĺžkou 409 bp bol izolovaný elektroforézou pri použití 3% agarózového gélu s nízkou teplotou topenia a potom bol z gélu odobratý a prečistený pomocou GENECLEAN II Kit-u (BIO101). DNA fragment bol rozpustený v 10 μΐ reakčného roztoku obsahujúceho 10 mM Tris-HCl (pH 7,4) a 1 mM EDTA.

μΐ DNA pre V región L reťazca boli subklonované do 1 μΐ každého z plazmidov CK/pUC19 a CK/pUC19 a potom boli vložené do kompetentných buniek E. coli JM109 pri vzniku transformantov. Transformanty boli kultivované cez noc v 3 ml 2xYT média obsahujúceho 50pg/ml ampicilínu. Z buniek bol plazmid prečistený pri použití QIAprep Spin Plasmid Kitu (QUIAGEN). Takto pripravené plazmidy boli označené MBC1L(λ)/pUC19 a MBC1L(k)/pUC19, v príslušnom poradí.

Každý z plazmidov MBC1L(λ)/pUC19 a MBC1L(k)/pUC19 bol trávený EcoRI a potom bol podrobený elektroforéze pri použití 3% agarózového gélu s nízkou teplotou topenia. DNA fragment dĺžky 743 bp bol izolovaný a prečistený pomocou GENECLEAN II Kit-u (BI0101) a bol rozpustený v 10 μΐ roztoku obsahujúceho 10 mM Tris-HCl (pH 7,4) a 1 mM EDTA.

2,7 pg expresného vektora, plazmidu HEF-PMIK-gk, bolo trávených EcoRI a potom sa vykonala extrakcia fenolom a chloroformom, po ktorej nasledovalo zrážanie etanolom, pri získaní DNA fragmentu. DNA fragment bol spracovaný BAP a potom bol podrobený elektroforéze pri použití 1% agarózového gélu s nízkou teplotou topenia. DNA fragment s dĺžkou 6561 bp bol z gélu izolovaný a prečistený pomocou GENECLEAN II Kit-u (BI0101). DNA fragment bol rozpustený v 10 μΐ roztoku obsahujúceho 10 mM Tris-HCl (pH 7,4) a 1 mM EDTA.

Takto pripravený HEF vektor bol spracovaný BAP a 2 μΐ HEF vektora spracovaného BAP boli zmiešané s 3 μΐ EcoRI fragmentov plazmidov MBCIL(X)/pUC19 alebo MBC1L(k)/pUC19, na vzájomnú ligáciu. Produkt ligácie bol vložený do kompetentných buniek E. coli JM109 pri vzniku transformantov.

Trans formanty boli kultivované cez noc v 2 ml 2xYT agarového média obsahujúceho 50 pg/ml ampicilinu. Z bunkovej frakcie bol plazmid prečistený pri použití QIAprep Spin Plasmid Kit-u (QUIAGEN).

Takto prečistená plazmidová DNA bola trávená v 20 μΐ reakčného roztoku obsahujúceho 20 mM Tris-HCl (pH 8,5), 10 mM MgCl₂, 1 mM DTT, 100 mM KC1, 8 U HindlII (Takara Shuzo) a 2 U Pvul (Takara Shuzo) pri teplote 37°C počas 1 hodiny. Pri tomto trávení sa predpokladalo, že ak bol uvedený DNA fragment inzertovaný do vektora so správnou orientácii, bude získaný trávený fragment 5104/2195 bp, pričom ak bol uvedený DNA fragment inzertovaný do vektora s opačnou orientáciou, bol získaný trávený fragment 4387/2926 bp. Na základe tohto predpokladu boli plazmidy, v ktorých bol fragment inzertovaný so správnou orientáciou, označené MBCIL(X)/neo a MBC1L(k)/neo, v príslušnom poradí.

(4) Transfekcia COS-7 buniek

Expresné plazmidy pripravené vyššie boli dočasne exprivované pri použití COS-7 buniek na hodnotenie väzby chimérickej protilátky na antigén a neutralizačnej aktivity chimérickej protilátky proti antigénu.

Prechodná expresia chimérickej protilátky bola vykonaná pri použití kombinácie buď plazmidov MBCIHcDNA/pCOS a MBC1L(λ)/neo, alebo MBCIHcDNA/pCOS a MBCIL(k)/neo, pomocou elektroporéze pri použití Gene Pulser (BioRad) na súčasnú transfekciu každej z týchto kombinácií plazmidových DNA do COS-7 buniek. To znamená, že do 0,8 ml bunkovej suspenzie, v ktorej boli suspendované COS-7 bunky v PBS(-) s koncentráciou lxlO⁷ buniek/ml, sa pridalo 10 pg každej plazmidovej DNA. Do vzniknutého roztoku sa aplikovali pulzy s elektrostatickou kapacitou 1500 V a 2 pF, na vykonanie elektroporézy. Po 10 minútach zotavovacej periódy pri izbovej teplote boli bunky suspendované v DMEM médiu obsahujúcom 2% Ultra Low IgG fetálne teľacie sérum (GIBCO) a vykonala sa inkubácia pri použití 10 cm kultivačných platní v CO₂ inkubátore. Po kultivácii počas 72 hodín bol supernatant kultúry odobratý a centrifugovaný na odstránenie bunkovej drviny a bol použitý ako vzorka na ELISA test.

V tomto postupe bolo prečistenie chemických protilátok zo supernatantu kultúry COS-7 buniek vykonané pomocou AffiGel Protein A MAPSII Kitu (BioRad) podľa návodu výrobcu kitu.

(5) ELISA test (i) Určenie koncentrácie protilátky

ELISA platňa na určenie koncentrácie protilátky bola pripravená nasledujúcim spôsobom. Každá jamka 96-jamkovej platne pre ELISA (Maxisorp, NUNC) bola potiahnutá 100 μΐ roztoku, ktorý obsahoval koziu protilátku proti ľudskému IgG (TÁGO) a ktorý bol pripravený v potahovacom pufri (0,1 M NaHCO,, 0,02% NaN₃) s koncentráciou 1 pg/ml a potom bolo vykonané blokovanie 200 μΐ pufra na riedenie (50 mM Tris-HCl, 1 mM MgCl₂, 0,1 M NaCl, 0,05% Tween20, 0,02% NaN₃, 1% hovädzí sérovy albumín (BSA); pH 7,2). Do každej jamky sa pridal supernatant kultúry COS-7 buniek, v ktorých boli exprivované chimérické protilátky alebo prečistené chimérické protilátky, pomocou postupného riedenia. Po inkubácii pri izbovej teplote počas 1 hodiny a po premytí PBS-Tween20 sa do každej jamky pridalo 100 pg roztoku kozej protilátky proti ľudskému IgG s konjugovanou alkalickou fosfatázou (TÁGO). Po inkubácii pri izbovej teplote počas 1 hodiny a po premytí PBS-Tween20 sa do každej jamky pridal roztok substrátu s koncentráciou 1 mg/ml (Sigma 104, kyselina p-nitrofenylfosforečná, SIGMA). Absorbancia roztoku sa merala pri 405 nM pri použití Microplate Reader (Bio Rad). Ako štandard na toto meranie sa použil Hu IgGlX Purified (The Binding Site).

(ii) Určenie väzbovej schopnosti na antigén

ELISA platňa na určenie väzbovej schopnosti na antigén bola pripravená nasledujúcim spôsobom. Každá jamka 96-jamkovej platne pre ELISA (Maxisorp, NUNC) bola potiahnutá 100 μΐ roztoku, ktorý obsahoval ľudský PTHrP(1-34) (Peptide Research Inštitúte) a ktorý bol pripravený v poťahovacom pufri s koncentráciou 1 pg/ml a potom bolo vykonané blokovanie 200 μΐ pufra na riedenie. Do každej jamky sa pridal supernatant kultúry COS-7 buniek, v ktorých boli exprivované chimérické protilátky alebo prečistené chimérické protilátky, pri postupnom riedení. Po inkubácii pri izbovej teplote počas 1 hodiny a po premytí PBS-Tween20 sa do každej jamky pridalo 100 pg roztoku kozej protilátky proti ľudskému IgG s konjugovanou alkalickou fosfatázou (TÁGO). Po inkubácii pri izbovej teplote počas 1 hodiny a po premytí PBSTween20 sa do každej jamky pridal roztok substrátu s koncentráciou 1 mg/ml („Sigma 104, kyselina p-nitrofenylfosforečná, SIGMA). Absorbancia roztoku sa merala pri 405 nm pri použití Microplate Reader (Bio Rad).

Bolo zistené, že chimérická protilátka má väzobnú schopnosť na ľudský PTHrP(1-34) a že má tiež správnu štruktúru klonovaného v-regiónu myšej protilátky (obr.4). Tiež bolo zistené, že neexistuje rozdiel v schopnosti väzby na PTHrP(l-34) medzi chimérickou protilátkou v ktorej má C región L reťazca λ reťazec a tou protilátkou, v ktorej má C región L reťazca κ reťazec. Preto bol C región L reťazca humanizovanej protilátky konštruovaný pri použití λ reťazca L reťazca humanizovanej protilátky.

(6) Vytvorenie stabilne transformovanej CHO bunkovej línie

Na vytvorenie stabilných transformantov pre chimérickú protilátku bol uvedený expresný plazmid vložený do CHO buniek (DXB11).

Vytvorenie stabilných transformantov pre chimérickú protilátku bolo vykonané pri použití kombinácie expresných plazmidov pre CHO bunky, MBCIHcDNA/pCHOl a MBCl(X)/neo, alebo expresných plazmidov pre CHO bunky MBCIHcDNA/pCHOl a MBC1L(k)/neo. Tieto kombinácie plazmidov boli jednotlivo súčasne transfektované do CHO buniek pomocou elektroporácie pri použití Gene Pulser (BioRad). Každý expresný vektor bol štiepený reštrikčným enzýmom Pvul pri získaní lineárnej DNA. Vzniknutá DNA bola získaná extrakciou fenolom a chloroformom a následným zrážaním etanolom. Takto pripravené plazmidové DNA boli elektroporované. 10 pg každý každej plazmidovéj DNA bolo pridaných do 0,8 ml bunkovej suspenzie obsahujúcej CHO bunky v PBS(-) s koncentráciou 1x10’ buniek/ml. Do vzniknutej zmesi sa aplikovali pulzy s elektrostatickou kapacitou 1500 V a 2 pF. Po 10 minútach zotavovacej periódy pri izbovej teplote boli bunky suspendované v MEM-a médiu (GIBCO) a 500 mg/ml GENETICIN-u (G418 Sufate; Gibco) bez ribonukleozidu alebo deoxyribonukleozidu). Z kultivačného média boli selektované bunky, do ktorých bol vložený gén pre protilátku. Po nahradení selektívneho média za čerstvé, pred a po dvoch dňoch kultivácie, boli bunky skúmané pod mikroskopom. Ak bol pozorovaný bunkový rast, bolo uvedeným ELISA testom určené množstvo protilátok produkovaných bunkami. Boli vybrané tie bunky, ktoré produkovali najviac protilátok.

Rozšírenie kultúry stabilných transformantov na určenie protilátok bolo vykonané vo valcovej nádobe pri použití MEM média doplneného 2% Ultra Low IgG fetálnym teľacím sérom bez ribonukleozidu alebo deoxyribonukleozidu. V 3. Deň a 4. Deň kultivácie bol odobratý supernatant kultúry a bol filtrovaný pri použití filtra majúceho veľkosť pórov 0,2 pm (Millipore), aby sa vykonalo odstránenie bunkovej drviny zo supernatantu.

Potom bolo prečistenie chimérických protilátok zo supernatantov kultúr CHO buniek vykonané pri použití POROS Protein A kolóny (PerSeptive

Biosysteme) na ConSep LC100 (Millipore) podľa návodu výrobcu. Prečistené chimérické protilátky boli použité ako vzorky na určenie neutralizačnej aktivity a na vyšetrenie účinnosti vo zvieracích modeloch hyperkalcémie. Koncentrácia a väzbová aktivita prečistených chimérických protilátok proti antigénu boli určené rovnakým ELISA testom.

Príklad 3: Konštrukcia humanizovanej protilátky (1) Konštrukcia H reťazca humanizovanej protilátky (i) Konštrukcia V regiónu humanizovaného H reťazca

Humanizovaný H reťazec protilátky #23-57-137-1 bol pripravený technikou prenosu PCR pri použití PCR metódy. Na prípravu H reťazca humanizovanej protilátky #23-57-137-1 (verzia „a) majúca FR odvodené od ľudskej protilátky S31679 (NMRF-PDB, Cuisinier A.M. et al., Eur. J. Immunol., 23: 110-118, 1993) bolo použitých nasledujúcich šesť typov PCR primérov: priméry na prenos CDR: MBC1HGP1 (SEQ ID NO: 23) a MBC1HGP2 (SEQ ID NO: 24) (obidva obsahujúce „sense” DNA sekvenciu) a MBC1HGP3 (SEQ ID NO: 25) a MBC1HGP4 (SEQ ID NO: 26) (obidva obsahujúce „antisense DNA sekvenciu, kde všetky priméry mali na svojich koncoch 15-21 bp komplementárne sekvencie; a externé priméry: MBC1HVS1 (SEQ ID NO: 27) a MBC1HVR1 (SEQ ID NO: 28), ktoré mali obidva homológiu s primérmi na prenos CDR MBC1HGP1 a MBC1HGP4, v príslušnom poradí.

Priméry na prenos CDR MBC1HGP1, MBC1HGP2, MBC1HGP3, MBC1HGP4 boli izolované pri použití polyakrylamidového gélu denaturovaného močovinou („Molecular Cloning, Sambrook et al., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989) a z frakcie gélu boli extrahované technikou rozdrvenia a namáčania („Molecular Cloning”, Sambrook et al., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989) nasledujúcim spôsobom.

nmol každého priméru na prenos PCR bol izolovaný pomocou 6% denaturovaného polyakrylamidového gélu pri získaní DNA fragmentov. Z výsledných DNA fragmentov boli fragmenty požadovanej dĺžky identifikované na tenkej silikagélovej platni pomocou UV žiarenia a z nich boli priméry získané technikou rozdrvenia a namáčania. Výsledné fragmenty boli rozpustené v 20 μΐ roztoku obsahujúceho 10 mM Tris-HCl (pH 7,4) a 1 mM EDTA. PCR reakcia bola uskutočnená pri použití TaKaRa Ex Taq (Shuzo). Reakčný roztok (100 μΐ) použitý v PCR reakcii obsahoval 1 μΐ každého z uvedených primérov na prenos CDR MBC1HGP1, MBC1HGP2, MBC1HGP3, MBC1HGP4, 0,25 mM dNTP a 2,5 jednotky TaKaRa Ex Taq v pufri. Päť cyklov PCR reakcie bolo vykonaných pri použití teplotného cyklu 94°C, 1 minúta; 55°C, 1 minúta; 55°C, 1 minúta; a 72°C, 1 minúta. Do vzniknutej reakčnej zmesi boli pridané obidva externé priméry MBC1HVS1 a MBC1HVR1, obidva v množstve 50 pmol. Takto amplifikované DNA fragmenty boli separované elektroforézou na agarózovom géli pri použití 4% Nu Sieve GTG Agarózy (FMC Bio. Products).

Fragment agarózového gélu obsahujúci DNA fragment s dĺžkou 421 bp bol excidovaný a DNA fragment bol prečistený pomocou GENECLEAN II Kitu (BIO101) podľa návodu výrobcu. Takto prečistený DNA fragment bol vyzrážaný z roztoku etanolom a potom bol rozpustený v 20 μΐ roztoku obsahujúceho 10 mM Tris-HCl (pH 7,4) a 1 mM EDTA. Získaná PCR reakčná zmes bola použitá na subklonovanie DNA fragmentu do plazmidu pUC19, ktorý bol pripravený trávením plazmidu BamHI a HindlII; potom bola určená sekvencia báz výsledného plazmidu. Plazmid obsahujúci správnu sekvenciu bol označený „hMBCHv/pUC19.

(ii) KonStrukcia V regiónu H reťazca pre cDNA humanizovaného H reťazca

Pre ligáciu cDNA C regiónu Cyl humanizovaného H reťazca bola DNA

V regiónu humanizovaného H reťazca konštruovaná v uvedenom kroku modifikovaná PCR. V tejto metóde bol použitý „antisense primér, MBC1HVS2 navrhnutý tak,' aby hybridizoval na sekvencii kódujúcej 5'-koncový región vedúcej sekvencie

V regiónu a aby mal Kozákovu konvenčnú sekvenciu (Kozák, M. et al., J. Mol. Biol. 196: 947-950, 1987) a rozpoznávacie miesto pre HindlII a EcoRI. „Sense primér MBC1HVR2 použitý na modifikáciu DNA pre V región H reťazca bol navrhnutý tak, aby mohol hybridizovať na DNA kódujúcej 3'-koncový región J regiónu a aby mal sekvenciu rozpoznávajúcu Apal a Sami.

PCR reakcia bola vykonaná pri použití TaKaRa Ex Taq (Takara Shuzo) a prísluSného pufra. PCR roztok použitý v tejto PCR reakcii obsahoval 0,4 pg hMBCHv/pUC19 ako šablónovej DNA, 50 pmol MBC1HVS2 a 50 pmol MBC1HVR2 ako primérov, 2,5 jednotky TaKaRa Ex Taq a 0,25 mM dNTP v pufri. Tridsať cyklov PCR reakcie bolo vykonaných pri použití teplotných cyklov 94°C, 1 minúta; 55°C, 1 minúta; a 72°C, 1 minúta. DNA fragmenty amplifikované v PCR reakcii boli separované elektroforézou na agarózovom géli pri použití 3% Nu Sieve agarózy (FMC Bio. Products).

DNA fragment s dĺžkou 456 bp bol excidovaný a DNA fragment bol prečistený pomocou GENECLEAN II Kitu (BI0101) podľa návodu výrobcu. Takto prečistený DNA fragment bol vyzrážaný z roztoku etanolom a potom bol rozpustený v 20 μΐ roztoku obsahujúceho 10 mM Tris-HCl (pH 7,4) a 1 mM EDTA. Takto získaná PCR reakčná zmes bola použitá na subklonovanie DNA fragmentu do plazmidu pUC19, ktorý bol pripravený trávením plazmidu EcoRI a Smal; potom bola určená sekvencia báz výsledného plazmidu. Takto pripravený plazmid obsahujúci DNA kódujúcu V región myšieho H reťazca odvodený od hybridómu #2357-137-1 a rozpoznávacie sekvencie pre EcoRI a HindlII a Kozákovu sekvenciu na 5'-konci a rozpoznávacie sekvencie pre Apal a Smal na 3'-konci bol označený _whMBClHv/pUC19.

(2) Konštrukcia expresného vektora pre H reťazec humanizovanej protilátky

Expresný vektor RVh-PMlf-cDNA obsahujúci cDNA kódujúcu H reťazec humanizovanej protilátky PM1 bol trávený Apal a BamHI a bol z nej získaný DNA fragment obsahujúci sekvenciu báz pre C región H reťazca. Výsledný DNA fragment bol vložený do plazmidu hMBClHv/pUC19, ktorý bol pripravený trávením Apal a BamHI. Takto pripravený plazmid bol označený _HhMBClHcDNA/pUC19. Tento plazmid je plazmid obsahujúci DNA kódujúcu V región H reťazca humanizovanej protilátky #23-57-137-1 a DNA kódujúcu C región Cyl ľudskej protilátky a má rozpoznávacie sekvencie pre EcoRI a HindlII na svojom 5'-konci a rozpoznávacie sekvencie pre BamHI na svojom 3'-konci. Sekvencie báz a zodpovedajúca aminokyselinová sekvencia verzie „a humanizovaného H reťazca nachádzajúce sa v plazmide hMBClHcDNA/pUC19 sú uvedené v SEQ ID NO: 58 a SEQ ID NO: 56, v príslušnom poradí.

Plazmid hMBClHcDNA/pUC19 bol trávený EcoRI a BamHI pri získaní DNA fragmentu obsahujúceho sekvenciu báz kódujúcu H reťazec. Vzniknutý DNA fragment bol vložený do expresného plazmidu pCOSl, ktorý bol pripravený trávením plazmidu EcoRI a BamHI. Takto získaný expresný plazmid pre humanizovanú protilátku bol označený „hMBCIHcDNA/pCOSl.

Na prípravu plazmidu na expresiu v CHO bunkách bol plazmid hMBClHcDNA/pUC19 trávený EcoRI a BamHI pri získaní DNA fragmentu obsahujúceho DNA kódujúcu H reťazec. DNA fragment bol potom vložený do expresného vektora pCHOl, ktorý bol pripravený trávením plazmidu EcoRI a BamHI. Takto získaný expresný plazmid pre humanizovanú protilátku bol označený „hMBCIHcDNA/pCHOl.

(3) Konštrukcia hybridného variabilného regiónu L reťazca (i) Príprava FR1,2/FR3,4 hybridnej protilátky

Bola konštruovaná DNA kódujúca L reťazec, v ktorom sa kombinujú FR regióny z humanizovanej protilátky a myšej (chimérickej) protilátky a boli hodnotené jej regióny na vhodnosť pre humanizáciu. V tomto kroku bola pripravená hybridná protilátka obsahujúca FR1 a FR2 z ľudskej protilátky a FR3 a FR4 z myšej protilátky, pri použití AflII reštrikčného miesta prítomného v CDR2.

pg každého z plazmidov MBC1L(λ)/neo a hMBCIL(λ)/neo bolo trávených v 100 μΐ reakčného roztoku obsahujúceho 10 mM Tris-HCl (pH 7,5), 10 mM MgCl₂, 1 mM DTT, 50 mM NaCl, 0,01% (hmot./obj.) BSA a 10 U AflII (Takara Shuzo) pri teplote 37°C počas 1 hodiny. Reakčný roztok bol podrobený elektroforéze pri použití 2% agarózového gélu s nízkou teplotou topenia a DNA fragmentmi s dĺžkou 6282 bp (označený ako „cl) a 1022 bp (označený ako „hl) boli z gélu odstránené a prečistené pomocou GENECLEAN II Kitu (BIO101).

pg každého zo získaných cl a hl fragmentov bol spracovaný BAP. DNA fragment bol extrahovaný fenolom a chloroformom, zrážaný etanolom, rozpustený v 10 μΐ roztoku obsahujúceho 10 mM Tris-HCl (pH 7,4) a 1 mM EDTA.

μΐ každého z cl a hl DNA fragmentov spracovaných BAP bol zmiešaný so 4 μΐ h2 a c2 DNA fragmentov, v príslušnom poradí, na vzájomnú ligáciu (pri 4°C cez noc). Produkt ligácie bol vložený do kompetentných buniek E. coli JM109 pri vzniku transformantov. Transformanty boli kultivované cez noc v 2 ml 2xYT média obsahujúceho 50 pg/ml ampicilínu. Z bunkovej frakcie bol plazmid prečistený pri použití QIAPrep Spin Plasmid Kitu (QUIAGEN).

Prečistená plazmidová DNA bola trávená v 20 μΐ reakčného roztoku obsahujúceho 10 mM Tris-HCl (pH 7,5), 10 mM MgCl₂, 1 mM DTT, 2 U ApaLI (Takara Shuzo) a 8U BamHI (Takara Shuzo) pri teplote 37°C počas 1 hodiny. V tomto kroku bol plazmid identifikovaný na základe predpokladu, že ak je cl-h2 fragment správne ligovaný v plazmide, povedie táto ligácia pri trávení Apaľ k vzniku fragmentu 5560/1246/498 bp, alebo pri trávení BaniHI/HindlII k vzniku fragmentu 7134/269 bp.

Expresný vektor kódujúci L reťazec hybridnej protilátky, ľudský FRl,2/myší FR3,4 bol označený _nh/mMBClL(X)/neo. Na druhej strane, kloň pre hl-cl nemohol byť získaný. Preto bola vykonaná rekombinácia na pUC vektore, po ktorej nasledovalo klonovanie HEF vektora. Tu boli ako šablóny použité plazmid hMBClLaX/pUC19, ktorý obsahoval DNA kódujúcu V región L reťazca humanizovanej protilátky bez aminokyselinovej substitúcie a plazmid hMBClLdX/pUC19, ktorý obsahoval DNA kódujúcu V región L reťazca humanizovanej protilátky s aminokyselinovou substitúciou v 91. aminokyselinovej pozícii (t.j. v aminokyseline 87 podľa Kabátovej definície), t.j. substitúciu izoleucínu za tyrozín.

pg každého z plazmidov MBCIL(X)/pUC19, hMBClLaX/pUC19 a hMBClLdÁ/pUC19 bolo trávených v 30 μΐ reakčného roztoku obsahujúceho 10 mM Tris-HCl (pH 7,5), 10 mM MgCl₂, 1 mM DTT, 50 mM NaCl, 0,01% (hmot./obj.) BSA,

U HindlII a 4 U AflII pri teplote 37°C počas 1 hodiny. Reakčný roztok bol podrobený elektroforéze pri použití 2% agarózového gélu s nízkou teplotou topenia a potom boli z gélu odobraté a prečistené pomocou GENECLEAN II Kit-u (BI0101) nasledujúce DNA fragmenty: DNA fragment s dĺžkou 215 bp z plazmidu MBC1L(λ)/pUC19 (označený ako „c2'ⁿ) alebo DNA fragment s dĺžkou 3218 bp z každého z plazmidov hMBClLaX/pUC19 a hMBClLdX/pUC19 (označené ako „haľ a „hdľ, v príslušnom poradí).

Každý z halq a hdlq a hdľ fragmentov bol samostatne ligovaný na c2' fragment a potom bol vložený do kompetentných buniek E. coli JM109 pri vzniku transformantov. Transformanty boli kultivované cez noc v 2 ml 2xYT média obsahujúceho 50 gg/ml ampicilinu. Z bunkovej frakcie bol plazmid prečistený pri použití QIAprep Spin Plasmid Kit-u (QUIAGEN). Vzniknuté plazmidové DNA obsahujúce haľ fragment a hdľ fragment boli označené „m/hMBClLal/pUC19 a _Mm/hMBClLdX/pUC19, v príslušnom poradí.

Každý z plazmidov m/hMBClLal/pUC19 a m/hMBClLdk/pUC19 bol trávený EcoRI. DNA fragment s dĺžkou 743 bp bol podrobený elektroforéze pri použití 2% agarózového gélu s nízkou teplotou topenia a bol z gélu odobratý a prečistený pomocou GENECLEAN II Kit-u (BIO101). Vzniknutý fragment bol rozpustený v 20 μΐ roztoku obsahujúceho 10 mM Tris-HCl (pH 7,4) a 1 mM EDTA.

I μΐ získaného DNA fragmentu boli zmiešané s 1 μΐ uvedeného HEF vektora spracovaného BAP na vzájomnú ligáciu. Produkt ligácie bol vložený do kompetentných buniek E. coli JM109 pri vzniku transformantov. Transformanty boli kultivované cez noc v 2 ml 2xYT média obsahujúceho 50 μς/ιηΐ ampicilinu. Z bunkovej frakcie bol plazmid prečistený pri použití QIAprep Spin Plasmid Kit-u (QIAGEN).

Prečistená plazmidová DNA bola trávená v 20 μΐ reakčného roztoku obsahujúceho 20 mM Tris-HCl (pH 8,5), 10 mM MgCl₂, 1 mM DTT, 100 mM KC1, 8 U HindlII (Takara Shuzo) a 2U Pvul (Takara Shuzo) pri teplote 37°C počas 1 hodiny. V tomto kroku bol plazmid identifikovaný na základe predpokladu, že ak je DNA fragment ligovaný v plazmide so správnou orientáciou, povedie toto trávenie k vzniku fragmentu 4378/2926 bp. Takto získané plazmidy boli expresné vektory kódujúce L reťazec hybridnej protilátky, myší FRl,2/ľudský FR3,4 a boli označené ako expresné vektory „m/hMBCILal/neo a „m/hMBCILdX/neo, v príslušnom poradí.

(ii) Príprava FR1/FR2 hybridnej protilátky

FR1/FR2 hybridná protilátka bola pripravená rovnakým spôsobom, ako bolo uvedené vyššie, pri použití SnaBI reštrikčného miesta prítomného v CDR.

gg každého z plazmidov MBClL(X)/neo a hMBCIL(λ)/neo bolo trávených v 20 μΐ reakčného roztoku obsahujúceho 10 mM Tris-HCL (pH 7,9), 10 mM MgCl,, 1 mM DTT, 50 mM NaCl, 0,01% (hmot./obj.) BSA a 6 U SnaBI (Takara Shuzo) pri teplote 37°C počas 1 hodiny. Vzniknutý reakčný roztok bol ďalej trávený v 50 μΐ reakčného roztoku obsahujúceho 20 mM Tris-HCl (pH 8,5), 10 mM MgCl,, 1 mM DTT, 100 mM KC1, 0,01% (hmot./obj.) BSA a 6 U Pvul pri teplote 37°C počas 1 hodiny.

Vzniknutý reakčný roztok bol podrobený elektroforéze pri použití 1,5% agarózového gélu s nízkou teplotou topenia a potom boli DNA fragmenty s dĺžkou 4955 bp a 2349 bp z gélu odobraté a prečistené pomocou GENECLEAN II Kit-u (BI0101). DNA fragmenty získané z plazmidu MBClL(X)/neo boli označené „ml (4955 bp) a „m2 (2349 bp) a DNA fragmenty získané z plazmidu h/mBClL(X)/neo boli označené „hml (4955 bp) a „hm2 (2349 bp) . Každý zo získaných DNA fragmentov bol rozpustený v 40 μΐ roztoku obsahujúceho 10 mM Ťris-HCl (pH 7,4) a 1 mM EDTA.

μΐ každého z ml a hml fragmentov bol ligovaný so 4 μΐ každého z hm2 a m2 fragmentov, v prislúžnom poradí, a potom bol vložený do kompetentných buniek E. coli JM109 pri vzniku transformantov. Transformanty boli kultivované cez noc v 2 ml 2xYT média obsahujúceho 50 μΐ/ml ampicilínu. Z bunkovej frakcie bol plazmid prečistený pri použití QIAprep Spin Plasmid Kit-u (QIAGEN).

Prečistená plazmidová DNA bola trávená v 20 μΐ reakčného roztoku obsahujúceho 10 mM Tris-HCl (pH 7,5), 10 mM MgClj, 1 mM DTT, a buď 8 U Apal (Takara Shuzo), alebo 2 U Apall (Takara Shuzo) pri teplote 37°C počas 1 hodiny.

Takto pripravené plazmidy (ml-hm2 a hml-hm2) boli identifikované na základe predpokladu, že ak je DNA fragment ligovaný v plazmide so správnou orientáciou, povedie trávenie plazmidu (ml-hm2) Apal a ApaLI k vzniku fragmentu 7304 bp a fragmentov 5560/1246/498, v príslušnom poradí, a trávenie plazmidu (hml-m2) Apal a APALI povedie k vzniku fragmentov 6538/766 bp a fragmentov 3535/2025/498, v príslušnom poradí.

Expresný vektor kódujúci L reťazec hybridnej protilátky, ľudský FR/myší FR2,3,4, bol označený ako expresný vektor „hmmMBClL(X)/neo a expresný vektor kódujúci L reťazec hybridnej protilátky, myší FRl/ľudský FR2/myší FR3,4, bol označený ako expresný vektor „mhmMBClL(X)/neo.

(4) Konštrukcia L reťazca humanizovanej protilátky

Humanizovaný L reťazec protilátky #23-57-137-1 bol pripravený technikou prenosu CDR pri použití PCR metódy. To znamená, že bol pripravený L reťazec humanizovanej protilátky #23-57-137-1 (verzia „a) majúci FR1, FR2 a FR3 odvodené od ľudskej protilátky HSU03868 (GEN-BANK, Deftos M. et al., Scand. J, Immunol. 39: 95-103, 1994) a FR4 odvodený od ľudskej protilátky S25755 (NMRF-PDB) pri použití nasledujúcich šiestich typov PCR primérov:

Priméry na prenos CDR, MBC1LGP1 (SEQ ID NO: 29) a MBC1LGP3 (SEQ ID NO: 30) (obidva obsahujúce „sense* DNA sekvenciu) a MBC1LGP2 (SEQ ID NO: 31) a MBC1LGP4 (SEQ ID NO: 32) (obidva obsahujúce „antisense DNA sekvenciu, kde všetky priméry mali na svojich koncoch 15-21 bp komplementárne sekvencie; a externé priméry: MBC1LVS1 (SEQ ID NO: 33) a MBC1LVR1 (SEQ ID NO: 34), ktoré mali oba homológiu s primérmi na prenos CDR MBC1LGP1 a MBC1LGP4, v príslušnom poradí.

Priméry na prenos CDR MBC1LGP1, MBC1LGP2, MBC1LGP3, MBC1LGP4 boli izolované pri použití polyakrylamidového gélu denaturovaného močovinou („Molecular Cloning, Sambrook et al., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989) a z frakcie gélu boli extrahované technikou rozdrvenia a namáčania („Molecular Cloning, Sambrook et al., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989) .

nmol každého priméru na prenos CDR bol izolovaný pomocou 6% denaturovaného polyakrylamidového gélu. Z výsledných DNA fragmentov boli fragmenty požadovanej dĺžky identifikované na tenkej silikagélovej platni pomocou UV žiarenia a z nich boli fragmenty získané technikou rozdrvenia a namáčania. Výsledné fragmenty boli rozpustené v 20 μΐ roztoku obsahujúceho 10 mM Tris-HCl (pH 7,4) a 1 mM EDTA.

PCR reakcia bola vykonaná pri použití TaKaRa Ex Taq (Takara Shuzo) s pufrom. Reakčný roztok (100 μΐ) použitý v PCR reakcii obsahoval 1 μΐ každého z uvedených primérov na prenos CDR, MBC1LGP1, MBC1LGP2, MBC1LGP3 a MBC1LGP4, 0,25 mM dNTP a 2,5 jednotiek TaKaRa Ex Taq v pufri. Päť cyklov PCR reakcie bolo vykonaných pri použití teplotného cyklu 94°C, 1 minúta; 55°C, 1 minúta; a 72°C, 1 minúta. Do vzniknutej reakčnej zmesi boli pridané obidva externé priméry MBC1LVS1 a MBC1LVR1, obidva v množstve 50 pmol. Pri použití rovnakej reakčnej zmesi bolo vykonaných ďalších tridsať cyklov PCR reakcie pri použití rovnakého teplotného cyklu. Takto amplifikovaný DNA fragment bol izolovaný elektroforézou na agarózovom géli pri použití 3% Nu Sieve GTG Agarózy (FMC Bio. Products).

Fragment agarózového gélu obsahujúci DNA fragment s dĺžkou 421 bp bol excidovaný a DNA fragment bol prečistený pomocou GENECLEAN II Kitu (BI0101) podľa návodu výrobcu. Takto získaná PCR reakčná zmes bola použitá na subklonovanie DNA fragmentu do plazmidu pUC19, ktorý bol pripravený trávením plazmidu BamHI a HindlII. Potom bola určená sekvencia DNA výsledného plazmidu. Takto pripravený plazmid bol označený „hMBCL/pUC19. Pri tomto plazmide bolo však zistené, že aminokyselina na pozícii 104 (aminokyselina číslo 96 podľa Kabatovho označenia) CDR4 bola nahradená arginínom. Na opravu tejto aminokyseliny na tyrozín bol navrhnutý a syntetizovaný primér MBC1LGP10R (SEQ ID NO: 35) . Potom bola PCR reakcia vykonaná pri použití TaKaRa Ex Taq (Takara Shuzo) s pufrom. Reakčný roztok (100 μΐ) použitý v PCR reakcii obsahoval 0,6 μΐ plazmidu hMBCL/pUC19 ako šablónovej DNA, 50 pmol každého z primárov MBC1LVS1 a MBC1LGP10R, 0,25 mM dNTP a 2,5 jednotiek TaKaRa Ex Taq v pufri, cez ktorý bol prevrstvený minerálny olej. Tridsať cyklov PCR reakcie bolo vykonaných pri použití teplotného cyklu 94°C, 1 minúta; 55°C, 1 minúta; a 72°C, 1 minúta. Takto amplifikovaný DNA fragment bol izolovaný elektroforézou na agarózovom géli pri použití 3* Nu Sieve GTG Agarózy (FMC Bio. Products).

Fragment agarózového gélu obsahujúci DNA fragment s dĺžkou 421 bp bol excidovaný a DNA fragment bol prečistený pomocou GENECLEAN II Kit-u (BIO101) podľa návodu výrobcu. Takto získaná PCR reakčná zmes bola použitá na subklonovanie DNA fragmentu do plazmidu pUC19, ktorý bol pripravený trávením plazmidu BamHI a HindlII.

Potom bola určená sekvencia DNA výsledného plazmidu pri použití M13 Primér M4 a M13 Primér RV. Bolo potvrdené, že plazmid má správnu sekvenciu. Plazmid bol potom trávený HindlII a Blnl a DNA fragment s dĺžkou 416 bp bol izolovaný elektroforézou pri použití 1% agarózového gélu. DNA fragment bol prečistený pomocou GENECLEAN II Kit-u (BIO101) podľa návodu výrobcu a potom bol vložený do plazmidu ολ/pUC, ktorý bol pripravený trávením plazmidu HindlII a Blnl. Výsledný plazmid bol označený „hMBClLaX/pUC19. Tento plazmid bol trávený EcoRI pri získaní DNA fragmentu kódujúceho humanizovaný L reťazec. DNA fragment bol potom vložený do plazmidu pCOSl tak, že iniciačný kodón pre humanizovaný L reťazec bol umiestnený „downstream od EFla promotora. Takto získaný plazmid bol označený „hMBCILaÄ/pCOSI. DNA sekvencia (vrátane zodpovedajúcej aminokyselinovej sekvencie) verzie „a humanizovaného L reťazca je uvedená v SEQ ID NO: 66. Sekvencie aminokyselín verzie „a je uvedená v SEQ ID NO: 47.

Verzia „b bola pripravená pri použití techniky mutagenézy pomocou PCR metódy. Verzia ,b bola navrhnutá tak, aby bola aminokyselina na pozícii 4366 glycín (aminokyselina 43 podľa Kabatovho číslovania) nahradená prolínom a aminokyselina na pozícii 49-lyzín (aminokyselina 49 podľa Kabatovho číslovania) nahradená kyselinou asparágovou. PCR reakcia bola vykonaná pri použití plazmidu hMBClLAX/pUC19 ako šablóny s mutagénnym primárom MBC1LGP5R (SEQ ID NO: 36) a primárom MBC1LVS1. Získaný DNA fragment bol trávený BamHI a HindlII a trávený fragment bol subklonovaný do BamHI-HindlII miesta pUC19. Po sekvencovaní bola získaná plazmidová DNA trávená HindlII a AflII a výsledný fragment bol ligovaný do plazmidu hMBClLaX/pUC19, ktorý bol pripravený trávením plazmidu HindlII a AflII.

Výsledný plazmid bol označený „hMBClLb\/pUC19. Táto plazmidová DNA bola trávená EcoRI pri získaní DNA fragmentu obsahujúceho DNA kódujúcu humanizovaný L reťazec. DNA fragment bol vložený do plazmidu pCOSl tak, Se iniciačný kodón pre humanizovaný L reťazec bol umiestnený „downstream^H od EFla promotora. Takto získaný plazmid bol označený „hMBCILbX/pCOSI.

Verzia „c bola pripravená pri použití techniky mutagenézy pomocou PCR metódy. Verzia ,c* bola navrhnutá tak, aby bola aminokyselina na pozícii 84serín (aminokyselina číslo 80 podľa Kabatovho číslovania) nahradená prolínom. PCR reakcia bola vykonaná pri použití plazmidu hMBClLaX/pUC19 ako šablóny s mutagénnym primérom MBC1LGP6S (SEQ ID NO: 37) a primérom M13 Primer RV. Získaný DNA fragment bol trávený BamHI a HindlII a trávený fragment bol subklonovaný do pUCl9, ktorý bol pripravený trávením plazmidu BamHI a HindlII. Po sekvencovaní bola získaná plazmidová DNA trávená BstPI a Aor51HI a výsledný fragment bol ligovaný do plazmidu hMBClLa\/pUC19, ktorý bol pripravený trávením plazmidu BstPI a AorSlHI. Výsledný plazmid bol označený „hMBClLcX/pUC19. Táto plazmidová DNA bola trávená EcoRI pri získaní sekvencie obsahujúcej sekvenciu kódujúcu humanizovaný L reťazec. Sekvencia bola vložená do EcoRI miesta plazmidu pCOSl tak, že iniciačný kodón pre humanizovaný L reťazec bol umiestnený „downstream od EFla promotora. Takto získaný plazmid bol označený „hMBClLcX/pCOSl.

Verzie „d·, „e a „f boli tiež pripravené pri použití techniky mutagenézy pomocou PCR metódy. Každá z verzií „d, „e a „f· bola navrhnutá tak, aby bola aminokyselina na pozícii 91-tyrozín (aminokyselina číslo 87 podľa Kabatovho číslovania) nahradená izoleucínom vo verziách „a, „b a „c v príslušnom poradí. Pre každú z verzií „d, „e a „f bola PCR reakcia vykonaná pri použití každého z plazmidov hMBClLcl/pCOSl (pre verziu „d) , hMBCILbX/pCOSI (pre verziu „e) a hMBCILcX/pCOSI (pre verziu „f“) ako šablóny s mutagénnym primérom MBC1LGP11R (SEQ ID NO: 38) a primérom M-Sl (SEQ ID NO: 44). Takto získaný DNA fragment bol subklonovaný do pUC19, ktorý bol pripravený trávením plazmidu BamHI a HindlII. Po sekvencovaní bol plazmid

- 67 trávený HindlII a Blnl a výsledný fragment bol ligovaný do plazmidu CÁ/pUC19, ktorý bol pripravený trávením plazmidu HindlII a Blnl.

Výsledné plazmidy boli v príslušnom poradí označené „hMBClLdX/pUC19, _whMBClLeX/pUC19 a „hMBClLfX/pUC19. Každý z týchto plazmidov bol trávený EcoRI pri získaní DNA fragmentu obsahujúceho DNA kódujúcu humanizovaný L reťazec. DNA fragment bol vložený do EcoRI miesta plazmidu pCOSl tak, že iniciačný kodón pre humanizovaný L reťazec bol umiestnený „downstream od EFla promotora. Takto získané plazmidy boli v príslušnom poradí označené „hMBCÍLd λ/pCOSl, „hMBCILeX/pCOSI a „hMBCILfλ/pCOSl.

Verzie „g a „h boli tiež pripravené pri použití techniky mutagenézy pomocou PCR metódy. Každá z verzií „g a „h bola navrhnutá tak, aby bola aminokyselina na pozícii 36-hystidín (aminokyselina číslo 36 podľa Kabatovho číslovania) nahradená tyrozínom vo verziách „a a „d v príslušnom poradí. PCR reakcia bola vykonaná pri použití plazmidu hMBClLaX/pUC19 ako templátu s mutagénnym primérom MBC1LGP9R (SEQ ID NO: 39) a M13 Primér RV. Produkt PCR bol podrobený ďalšej PCR reakcii pri použití M13 Primér 144 ako priméru a plazmidu hMBClLaÁ/pUC19 ako šablóny. Takto získaný DNA fragment bol trávený HindlII a Blnl. Pri použití tohto plazmidu ako šablóny bola vykonaná PCR reakcia s primérmi MBC1LGP13R (SEQ ID NO: 40) a MBC1LVS1. Získaný PCR fragment bol trávený Apal a HindlII a trávený fragment bol potom vložený do každého z plazmidov hMBClLaÁ/pUC19 a hMBClLdX/pUC19, ktoré boli pripravené trávením obidvoch plazmidov Apal a HindlII. Potom boli určené DNA sekvencie plazmidov. Plazmidy, pri ktorých bola potvrdená správna sekvencia, boli označené _MhMBClLgÁ/pUCl9 a „hMBClLHÁ/pUC19, v príslušnom poradí. Každý z týchto plazmidov bol trávený EcoRI pri získaní DNA fragmentu obsahujúceho DNA kódujúcu humanizovaný L reťazec. DNA fragment bol vložený do EcoRI miesta plazmidu pCOSl tak, že iniciačný kodón pre humanizovaný L reťazec bol umiestnený „downstream od EFla promotora. Takto získané plazmidy boli v príslušnom poradí označené „hMBCILgÁ/pCOSI a „hMBCILhÁ/pCOSI.

Verzie „i, „j, „k, „1, „m, „n a „o boli tiež pripravené pri použití techniky mutagenézy pomocou PCR metódy. PCR reakcia bola vykonaná pri použití plazmidu hMBClLaÁ/pUC19 ako šablóny s mutagénnym primérom MBC1LGP14S (SEQ ID NO: 41) a primérom V1RV(Á) (SEQ ID NO: 43) . Takto získaný DNA fragment bol trávený Apal a Blnl a potom bol subklonovaný do plazmidu hMBClLgÁ/pUC19, ktorý bol pripravený trávením plazmidu Apal a Blnl. Pri takto získanom plazmide bola určená sekvencia báz a bol selektovaný kloň, do ktorého bola vložená mutácia zodpovedajúca každej z verzií Výsledný plazmid bol označený „hMBClLxÁ/pUC19 (x=i, j, k, 1, m, n alebo o). Tento plazmid bol trávený EcoRI pri získaní DNA fragmentu obsahujúceho DNA kódujúcu humanizovaný L reťazec.

DNA fragment bol potom vložený do EcoRI miesta plazmidu pCOSl tak, že iniciačný kodón pre humanizovaný L reťazec bol umiestnený „downstream^a od EFla promotora. Takto získaný plazmid bol označený „hMBClLxX/pCOSl (x=i, j, k, 1, m, n alebo o) . DNA sekvencie (vrátane zodpovedajúcich aminokyselinových sekvencií) verzií „j, „l^a, „m· a „o sú uvedené v SEQ ID NO: 67, SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO: 69 a SEQ ID NO: 70, v príslušnom poradí. Sekvencie aminokyselín týchto verzií sú uvedené v SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 50 a SEQ ID NO: 51, v príslušnom poradí.

Verzie „p, „q, „r, ,s“ a „t sú modifikované formy verzií „i, „j, „m, „1 a „o, v príslušnom poradí, v ktorých je aminokyselina na pozícii 87 - tyrozín - nahradená izoleucínom. Tieto verzie boli pripravené pri použití AorSIMI reštrikčného miesta FR3 na nahradenie verzie „h* verziou ,i\ „j, „m, „1 a ,o nasledujúcim spôsobom. Z expresného plazmidu hMBCILxX/pCOSl (x=i, j, m, 1 alebo o), bol deletovaný AorSlHI reštrikčný fragment (514 bp) obsahujúci CDR3, časť FR3 a celý FR4. K deletovanej časti expresného plazmidu bol ligovaný AorSlHI reštrikčný fragment (514 bp) obsahujúci CDR3, časť FR3 a celý FR4. K deletovanej časti expresného plazmidu bol ligovaný Aor51HI reštrikčný fragment (514 bp) obsahujúci CDR3 a časť FR3 a celý FR4 tak, že aminokyselina na pozícii 91-tyrozín (aminokyselina číslo 87 podľa Kabatovho číslovania) bola nahradená izoleucínom. Pri výsledných plazmidoch bola určená ich DNA sekvencia a bol selektovaný kloň každej z verzií „i*, »j”» «m, ,1“ a ,o*, v ktorom bola aminokyselina na pozícii 91-tyrozín (aminokyselina číslo 87 podľa Kabatovho číslovania) nahradená izoleucínom. Verzie zodpovedajúca verziám „i, „j, „m, „1 a ,o· boli označené ako verzie „p, „q, „s, ,r* a ,t, v príslušnom poradí a plazmidy pre tieto verzie boli označené „hMBClLxX/pCOSl (x=p, q, s, r alebo t)*. DNA sekvencie (vrátane zodpovedajúcich aminokyselinových sekvencií) verzií „q, „r, „s” a ,t sú uvedené V SEQ ID NO: 71, SEQ ID NO: 72, SEQ ID NO: 73 a SEQ ID NO: 74, V príslušnom poradí. Sekvencie aminokyselín týchto verzií sú uvedené v SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 53, SEQ ID NO: 54 a SEQ ID NO: 55, v príslušnom poradí.

Plazmid hMBCILqX/pCOSI bol trávený HindlIIa EcoRI a potom bol subklonovaný do plazmidu pUC19, ktorý bol trávený HindlII a EcoRI. Takto získaný plazmid bol označený _MhMBClLqX/pUC19.

Pozície nahradených aminokyselín v každej verzii humanizovaného L reťazca je uvedená v nasledujúcej tabuľke 3.

Tabuľka 3: Pozície nahradených aminokyselín v zozname sekvencií (Číslovanie aminokyselín podľa Kabatovho Číslovania)

Verzia	36	43	45	47	49	80	87
a
b		P			D
c						P
d							I
e		P			D		I
f						P	I
3	Y
h	Y					I
i	Y		K
J	Y		K		D
k	Y		K	V
1	Y		K	V	D
m	Y				D
n	Y		v
o	Y		v		D
P	Y		K				I
q	Y		K		D		I
r	Y				D		I
s	Y		K	V	D		I
t	Y			V	D		I

V uvedenej tabuľke 3 znamenajú veľké písmená nasledujúce aminokyseliny: Y: tyrozín; P: prolín; K: lyzín; V: valín; D: kyselina asparágová;

a I: izoleucín.

Kmeň E. coli obsahujúci plazmid hMBClHcDNA/pUC19 a kmeň E.coli obsahujúci plazmid hMBClLqX/pUC19 boli oznaCené „Escherichia coli JM109 (hMBClHcDNA/pUC19) a !Escherichia coli JM109 (hMBClLqX/pUC19), v príslušnom poradí, a boli uložené podľa Budapeštianskej zmluvy 15.8.1996 v National Inštitúte of Bioscience and Human Technology, Agency of Industrial Science and Technology, Japan (1-3, Higashi 1-chome, Tsukuba-shi, Ibaragi-ken, Japan) s prírastkovým Číslom FERM BP-5629 pre Escherichia coli JM109 (hMBCIHcDNA/pUCI 9j a FERM BP-5630 pre Escherichia coli JM109 (hMBClLq\/pUC19) .

(5) Transfekcia do COS-7 buniek

Na určenie väzbovej aktivity na antigén a neutralizačnej aktivity hybridnej protilátky a humanizovanej protilátky #23-57-137-1 boli uvedené expresné plazmidy prechodne exprivované v COS-7 bunkách. Na prechodnú expresiu L reťazca hybridnej protilátky bola každá z nasledujúcich kombinácií plazmidov súčasne transfektovaná do COS-7 buniek pomocou elektroporácie pri použití Gene Pulser (BioRad):

hMBCIHcDNA/pCOSI a h/mMBCIL(λ)/neo; hMBCIHcDNA/pCOSI a m/hMBCILal/neo; hMBCIHcDNA/pCOSl a h/mBClLdl/neo; hMBCIHcDNA/pCOSI a hmmMBCIL(λ)/neo; a hMBCIHcDNA/pCOSl a mhmMBClL(λ)/neo. To znamená, že do 0,8 ml bunkovej suspenzie, v ktorej boli suspendované COS-7 bunky s PBS(-) koncentráciou lxio⁷ buniek/ml, sa pridalo 10 pg každej plazmidovej DNA. Do vzniknutého roztoku sa aplikovali pulzy s elektrostatickou kapacitou 1500 V a 2 pF. Po 10 minútach zotavovacej periódy pri izbovej teplote boli bunky suspendované v DMEM médiu doplnenom 2% Ultra Low IgG fetálnym teľacím sérom (GXBCO) a vykonala sa kultivácia pri použití 10 cm kultivačných platní v CO₃ inkubátore. Po kultivácii počas 72 hodín bol supernatant kultúry odobratý a centrifugovaný na odstránenie bunkovej drviny. Roztok bol použitý ako vzorka pre ELISA test.

Na dočasnú expresiu humanizovanej protilátky #23-57-137-1 bola kombinácia plazmidov buď hMbCIHcDNA/pCOSI alebo hMBCILxX/pCOSl (x = a - t) transfektovaná do COS-7 buniek pri použití Gene Pulser (Bio Rad) rovnakým spôsobom, ako bol uvedený vySfiie. Získaný supernatant kultúry bol použitý ako vzorka pre ELISA test.

Pri tomto postupe bolo prečistenie hybridnej protilátky alebo humanizovanej protilátky zo supernatantu kultúry COS-7 buniek vykonané pomocou AffiGel Protein A MAPSII Kit-u (BioRad) podľa návodu výrobcu kitu.

(6) ELISA test (i) Určenie koncentrácie protilátky

ELISA platňa na určenie koncentrácie protilátky bola pripravená nasledujúcim spôsobom. Každá jamka 96-jamkovej plate pre ELISA (Maxisorp, NUNC) bola potiahnutá 100 μΐ roztoku, ktorý obsahoval koziu protilátku proti ľudskému IgG (TÁGO) a ktorý bol pripravený v poťahovacom pufri (0,1 M NaHCO,, 0,02% NaNj) s koncentráciou 1 pg/ml a potom bolo vykonané blokovanie 200 μΐ pufra na riedenie (50 mM Tris-HCl, 1 mM MgCl_a, 0,1 M NaCl, 0,05% Tween20, 0,02% NaNj, 1% hovädzí sérový albumín (BSA); pH 7,2). Do každej jamky sa pridal supernatant kultúry COS-7 buniek, v ktorých bola exprivovaná hybridná protilátka alebo humanizovaná protilátka, alebo roztok prečistenej hybridnej protilátky alebo humanizovanej protilátky pri postupnom riedenf. Po inkubácii pri izbovej teplote počas 1 hodiny a po premytí PBS-Tween20 sa do každej jamky pridalo 100 pg roztoku kozej protilátky proti ľudskému IgG s konjugovanou alkalickou fosfatázou (TÁGO). Po inkubácii pri izbovej teplote počas 1 hodiny a po premytí PBS-Tween20 sa do každej jamky pridal roztok substrátu s koncentráciou 1 mg/ml („Sigma 104, kyselina pnitrofenylfosforečná, SIGMA). Absorbancia roztoku sa merala pri 405 nm pri použití Microplate Reader (BioRad). Ako štandard na toto meranie sa použil Hu IgGlK Purified (The Binding State).

(ii) Určenie väzbovej schopnosti na antigén

ELISA platňa na určenie väzbovej schopnosti na antigén bola pripravená nasledujúcim spôsobom. Každá jamka 96-jamkovej platne pre ELISA (Maxisorp, NUNC) bola potiahnutá 100 pl roztoku, ktorý obsahoval ľudský PTHrP (1-34) a ktorý bol pripravený v poťahovacom pufri s koncentráciou 1 pg/ml a potom bolo vykonané blokovanie 200 pl pufra na riedenie. Potom sa do každej jamky pridal supernatant kultúry 'COS-7 buniek, v ktorých bola exprivovaná hybridná protilátka alebo humanizovaná protilátka, alebo roztok prečistenej hybridnej protilátky alebo humanizovanej protilátky, pri postupnom riedení. Po inkubácii pri izbovej teplote počas 1 hodiny a po premytí PBS-Tween20 sa do každej jamky pridalo 100 pg roztoku kozej protilátky proti ľudskému IgG s konjugovanou alkalickou fosfatázou (TÁGO). Po inkubácii pri izbovej teplote počas 1 hodiny a po premytí PBS-Tween20 sa do každej jamky pridal roztok substrátu s koncentráciou 1 mg/ml („Sigma 104, kyselina pnitrofenylfosforečná, SIGMA). Absorbancia roztoku sa merala pri 405 nm pri použití Microplate Reader (BioRad).

(7) Potvrdenie aktivít (i) Hodnotenie humanizovaného H reťazca

Bolo zistené, že protilátka obsahujúca verziu „a humanizovaného H reťazca a chimérického L reťazca vykazuje rovnakú hladinu väzbovej aktivity pre PTHrP ako chimérická protilátka (pozri obr.5). Tieto výsledky ukazujú, že humanizácia V regiónu H reťazca je uspokojivá vo verzii „a. Preto bola verzia „a humanizovaného H reťazca použitá ako H reťazec humanizovanej protilátky pri nasledujúcich pokusoch.

(ii) Aktivita hybridnej protilátky (ii-a) FR1,2/FR3,4 hybridná protilátka

Ak bol L reťazec h/mMBClLd(X), nevykazovala protilátka žiadnu väzbovú aktivitu na antigén. Ak bol vSak L reťazec hybridnej protilátky buď m/hNBCILaX alebo m/hMBClLdX, tak vykazovala protilátka rovnakú úroveň väzbovej aktivity na antigén ako chimérická protilátka #23-57-137-1 (obr.6). Tieto výsledky ukazujú, že FR3 a FR4 sú vhodné pre humanizovanú protilátku, ale že existuje aminokyselinový zvyšok (zvyšky), ktoré musia byť nahradené v FR1 a FR2.

(ii-b) FR1/FR2 hybridná protilátka

Ak bol L reťazec mhtnMBClL (λ), nevykazovala protilátka žiadnu väzbovú aktivitu na antigén. Ak bol vSak L reťazec hybridnej protilátky hnunMBClL (λ), vykazovala protilátka rovnakú úroveň väzbovej aktivity na antigén ako chimérická protilátka #23-57-137-1 (obr.7). Tieto výsledky ukazujú, že FR1 je vhodný pre humanizovanú protilátku, ale že existuje aminokyselinový zvySok (zvyšky), ktoré musia byť nahradené v FR2.

(iii) Aktivita humanizovanej protilátky

Bola určená väzbová aktivita na antigén pre humanizované protilátky, v ktorých bola každá z verzii „a až ,t použitá ako L reťazec. Bolo zistené, že humanizované protilátky majúce verzie „j, „1, „m, „o, „q, „r, „s a „t L reťazca, vykazovali rovnakú hladinu väzbovej aktivity pre PTHrP, ako chimérická protilátka (obr. 8 až 11).

(8) Vytvorenie stabilne transformovanej CHO bunkovej línie

Na vytvorenie stabilných transformantov pre humanizovanú protilátku bol uvedený expresný plazmid vložený do CHO buniek (DXB11).

Na vytvorenie stabilných transformantov pre humanizovanú protilátku bol uvedená expresný plazmid vložený do CHO buniek (DXB11).

Vytvorenie stabilných transformantov pre humanizovanú protilátku bolo vykonané pri použití každej z nasledujúcich kombinácií plazmidov ako expresných vektorov pre CHO bunky: hMBCIHcDNA/pCHOl a MBClLml/pCOSl; hMBCIHcDNA/pCHOl a MBClLql/pCOSl; a hMBCIHcDNA/pCHOl a MBCILrX/pCOSI. Plazmidy boli súčasne transfektované do CHO buniek pomocou elektroporácie pri použití Gene Pulser (BioRad). Potom bol každý expresný vektor Štiepený reštrikčným enzýmom Pvul pri získaní lineárnej DNA. Vzniknutá DNA bola extrahovaná fenolom a chloroformom a následne vyzrážaná etanolom. Takto pripravené plazmidové DNA boli elektroporované nasledujúcim spôsobom. 10 pg každej plazmidovéj DNA bolo pridaných do 0,8 ml bunkovej suspenzie obsahujúcej CHO bunky s PBS(-) koncentráciou lxio⁷ buniek/ml. Do vzniknutej zmesi sa aplikovali pulzy s elektrostatickou kapacitou 1500 V a 2 pF. Po 10 minútach zotavovacej periódy pri izbovej teplote boli bunky suspendované v MEM-a médiu (GIBCO) doplnenom 10% fetálnym teľacím sérom (GIBCO) a potom bola vykonaná kultivácia pri použití 96-jamkových platní (Falcon) v CO, inkubátore. Po jednom dni kultivácie bolo médium nahradené selektívnym médiom (MEM-α médium doplnené 10% fetálnym teľacím sérom (GIBCO) a 500 mg/ml GENETICIN-u (G418 Sufate; Gibco) bez ribonukleozidu či deoxyribonukleozidu). Z kultivačného média boli selektované bunky, do ktorých bol vložený gén pre protilátku. Po nahradení selektívneho média za čerstvé, pred a po dvoch týždňoch kultivácie, boli bunky skúmané pod mikroskopom. Ak bol pozorovaný uspokojivý bunkový rast, bolo uvedeným ELISA testom bežne používaným na určenie koncentrácie protilátok určené množstvo protilátok produkovaných bunkami. Boli vybrané tie bunky, ktoré produkovali najviac protilátok.

RozSírenie kultúry stabilných transformantov na určenie protilátok bolo vykonané vo valcovej nádobe pri použití MEM-α média doplneného 2% Ultra Low IgG fetálnym teľacím sérom bez ribonukleozidu alebo deoxyribonukleozidu. V 3. deň a v 4. deň kultivácie bol odobratý supernatant kultúry a bol filtrovaný pri použití filtra majúceho veľkosť pórov 0,2 pm (Millipore), aby sa vykonalo odstránenie bunkovej drviny zo supernatantu. Prečistenie humanizovaných protilátok zo supernatantu kultúr CHO buniek bolo vykonané pri použití POROS Protein A kolóny (PerSeptive Biosystems) na ConSep LC100 (Millipore) podľa návodu výrobcu). Humanizované protilátky boli použité ako vzorky na určenie neutralizačnej aktivity a na vyšetrenie účinnosti v zvieracích modeloch hyperkalcémie. Koncentrácia a väzbová aktivita prečistených humanizovaných protilátok proti antigénu boli určené ELISA testom, ako je opísaný vyššie.

Príklad 4: Určenie neutralizačnej aktivity

Určenie neutralizačnej aktivity myšej protilátky, chimérickej protilátky a humanizovanej protilátky bolo vykonané pri použití buniek krysej myelómovej bunkovej línie ROS17/2.8-5. ROS17/2.8-5 bunky boli kultivované v Ham*S F12 médiu (GIBCO) doplnenom 10% fetálnym teľacím sérom (GIBCO) v CO, inkubátore. ROS17/2.8-5 bunky boli inokulované do každej jamky 96-jamkovej platne v koncentrácii 10⁴ buniek/100 μΐ/jamku a bola vykonaná kultivácia počas 1 dňa. Kultivačné médium bolo nahradené Ham'S F-12 médiom (GIBCO) doplneným 4 mM hydrokortizónu a 10% fetálnym teľacím sérom. Po kultivácii počas 3 až 4 dní boli kultivované bunky premyté 260 μΐ Ham'S F-12 média (GIBCO) a potom 80 μΐ Ham'S F-12 média doplneného 1 mM izobutyl-l-metylxantínom (IBMX, SIGMA), s pridaným 10% fetálnym teľacím sérom a 10 mM HEPES. Vzniknutá zmes bola inkubovaná pri 37°C počas 30 minút.

MySia protilátka, chimérická protilátka a humanizovaná protilátka, pri ktorých bola testovaná neutralizačná aktivita, boli postupne riedené nasledujúcim spôsobom: (10 pg/ml, 2 pg/ml, 0,5 pg/ml a 0,01 pg/ml) a (10 pg/ml, 5 pg/ml, 1,25 pg/ml, 0,63 pg/ml a 0,31 pg/ml). Každý roztok riedenej protilátky bol zmiešaný s ekvivalentným množstvom 4 ng/ml PTHrP(1-34). 8 μΐ výsledného roztoku sa pridalo do každej jamky. Konečná koncentrácia každej protilátky bola štvrtinou koncentrácie uvedenej protilátky a preto bola koncentrácia PTHrP(1-34) 1 ng/ml. 10 minút po inkubácii pri izbovej teplote bol supernatant odstránený a zvyšok bol trikrát premytý PBS. Z vzniknutej vzorky bol cAMP v bunkách extrahovaný 10 μΐ 0,3% HCl-95% etanolu a potom bolo vykonané odparenie pomocou vodného dýzového aspirátora na odstránenie HC1etanolu. Zvyšok bol rozpustený v 120 μΐ EIA pufra pripojeného k cAMP EZA Kit-u (CAYMAN CHEMICALS) na extrakciu cAMP zo zvyšku. Koncentrácia cAMP bola určená pri použití cAMP EIA Kit-u (CAYMAN CHEMICALS) podľa návodu výrobcu. Bolo zistené, že z humanizovaných protilátok majúcich verzie L reťazca vykazujúce rovnaké úrovne väzbovej schopnosti na antigén ako chimérická protilátka majú tie protilátky, ktoré majú verzie „q, „r, „s a „t L reťazca, pri ktorých bol tyrozín na pozícii 91 nahradený izoleucínom, neutralizačnú aktivitu najviac sa podobajúcu na neutralizačnú aktivitu chimérickej protilátky, a najsilnejšiu neutralizačnú aktivitu vykazujú protilátky majúce verziu „q L reťazca (obr. 12 až 14).

Príklad 5: Hodnotenie farmakologickej účinnosti na zvieracom modeli hyperkalcémie (1)

Pri použití zvieracieho modelu hyperkalcémie (ľudský nádor transplantovaný holým myšiam) bola vyšetrovaná terapeutická účinnosť chimérickej protilátky a humanizovanej protilátky proti PTHrP majúcej verzie „m, „r a ,q L reťazca na hyperkalcémiu.

Ako zvierací model 'hyperkalcémie boli použité holé myši, ktorým bol transplantovaný ľudský karcinóm pankreasu PAN-7 (získaný od Central Inštitúte for Experimental Animals). Je známe, že pri holých myšiach, ktorým bol transplantovaný ľudský karcinóm pankreasu PAN-7, dochádza k zvyšovaniu koncentrácie vápnika v krvi so zväčšovaním objemu nádoru a dochádza k vývoju hyperkalcémie, ktorá je napríklad spojená so znížením telesnej hmotnosti a spontánnej aktivity. V tomto príklade bol vyšetrovaný terapeutický účinok chimérickej protilátky a humanizovanej protilátky podľa predkladaného vynálezu na hyperkalcémiu indukovanú ľudským karcinómom pankreasu PAN-7 pomocou merania telesnej hmotnosti a koncentrácie vápnika v krvi testovaných zvierat.

Pasáž buniek ľudského karcinómu podžalúdkovej žľazy PAN-7 bola vykonaná pri použití BALB/c-nu/nu holých myší (Nippon Charles River) in vivo. Po hodnotení farmakologickej účinnosti boli zakúpení 5 týždňov starí samci BALB/c-nu/nu holých myší (Nippon Charles River) a nechali sa aklimatizovať počas 1 týždňa a takto pripravené myši staré 6 týždňov boli použité na test. Myšie modely hyperkalcémie boli pripravené a boli rozdelené do skupín nasledujúcim spôsobom. Pasážované bunky ľudského karcinómu pankreasu PAN-7 boli excidované a narezané na 3 mm bločky. Vzniknuté bločky nádory boli transplantované subkutánne do kožného záhybu myší v počte 1 bloček na myš. Dva až tri týždne po transplantácii, keď bolo potvrdené, že objem tumoru pri každej myši je dostatočne veľký, boli myši rozdelené do skupín a bol vypočítaný priemer objemu nádoru, koncentrácia vápnika v krvi a telesné hmotnosti pre myši jednotlivých skupín a myši boli použité ako zvierací model hyperkalcémie.

Určenie terapeutickej účinnosti na hyperkalcémiu bolo vykonané nasledujúcim spôsobom. Jedna dávka chimérickej protilátky alebo humanizovanej protilátky proti PTHrP majúca verziu „m alebo „r* L reťazca bola podaná každému z uvedených myších modelov hyperkalcémie chvostovou cievou v dávke 10 alebo 30 pg na myš. Jedna dávka humanizovanej protilátky proti PTHrP majúca verziu „q L reťazca bola podaná každému z uvedených myších modelov hyperkalcémie chvostovou cievou v dávke 20 alebo 60 pg na myš. V 1. deň, 4. deň, 7. deň a 11. deň po podaní bola pri každej myši meraná koncentrácia vápnika v krvi a telesná hmotnosť, na hodnotenie farmakologickej účinnosti protilátky. Objem nádora bol určený meraním väčšieho priemeru (a mm) a menšieho priemeru (b mm) nádora výpočtom pri použití Galantovho vzorca (ab²/2). Koncentrácia vápnika v krvi bola určená ako koncentrácia ionizovaného vápnika v krvi odobratej od každej myši z orbitu pri použití hematokritovej kapiláry, ktorá bola vložená do 643 Automatic Ca/pH Analýzer (CIBA-CORNING).

Bolo zistené, Se podanie chimérickej protilátky a humanizovaných protilátok majúcich verzie „m, „r a „q* L reťazca vedie k rýchlemu zlepSeniu telesnej hmotnosti a koncentrácie vápnika v krvi a k zachovaniu tohto zlepšenia na dlhší Sas. Tento výsledok ukazuje, Se chimérická protilátka a humanizované protilátky podľa predkladaného vynálezu sú použiteľné na liečbu hyperkalcémie spojenej s malígnymi nádormi (pozri obr. 15 a 16) .

Príklad 6: Hodnotenie farmakologickej účinnosti na zvieracom modeli hyperkalcémie (2)

Pri použití zvieracieho modelu hyperkalcémie (ľudský nádor transplantovaný holým myšiam) bola vyšetrovaná terapeutická účinnosť chimérickej protilátky a humanizovanej protilátky proti PTHrP majúcej verziu „q L reťazca na hyperkalcémiu.

Určenie terapeutickej účinnosti na hyperkalcémiu bolo vykonané nasledujúcim spôsobom. Jedna dávka chimérickej protilátky alebo humanizovanej protilátky proti PTHrP majúca verziu „q L reťazca bola podaná každému z uvedených myších modelov hyperkalcémie chvostovou cievou v dávke 10 alebo 30 pg na myš. V 1. deň, 4. deň, 7. deň a 11. deň po podaní bola pri každej myši meraná koncentrácia vápnika v krvi a telesná hmotnosť, na hodnotenie farmakologickej účinnosti protilátky. Koncentrácia vápnika v krvi bola určená ako koncentrácia ionizovaného vápnika v krvi odobratej od každej myši z orbitu pri použití hematokritovej kapiláry, ktorá bola vložená do 643 Automatic Ca**/pH Analyzer (CIBA-CORNING).

Bolo zistené, že v zvieracom modeli hyperkalcémie nesúcom ľudský karcinóm podžalúdkovej žľazy PAN-7 vedie podanie chimérickej protilátky a humanizovaných protilátok majúcich verziu ,q* L reťazca k rýchlemu zlepšeniu telesnej hmotnosti a koncentrácie vápnika v krvi a k zachovaniu tohto zlepšenia na dlhší čas. Tento výsledok ukazuje, že chimérická protilátka a humanizovaná protilátka podľa predkladaného vynálezu sú použiteľné na liečbu hyperkalcémie spojenej s malígnymi nádormi (pozri obr. 17).

Príklad 7: Hodnotenie farmakologickej účinnosti na zvieracom modeli hyperkalcémie (3)

Pri použití zvieracieho modelu hyperkalcémie (ľudský pľúcny nádor LC-6 transplantovaný holým myšiam) bola vyšetrovaná terapeutická účinnosť protilátky a hyperkalcémiu chimérickej protilátky a humanizovanej protilátky proti PTHrP majúca verziu „q* L reťazca na hyperkalcémiu.

Ako zvierací model hyperkalcémie boli použité holé myši, ktorým bol transplantovaný ľudský karcinóm pľúc LC-6 (získaný od Central Inštitúte for Experimental Animals). Je známe, že pri holých myšiach, ktorým bol transplantovaný ľudský karcinóm pľúc LC-6, dochádza k zvyšovaniu koncentrácie vápnika v krvi so zväčšovaním objemu nádoru a dochádza k vývoju hyperkalcémie, ktorá je napríklad spojená so znížením telesnej hmotnosti a spontánnej aktivity.

V tomto príklade bol vyšetrovaný terapeutický účinok chimérickej humanizovanej protilátky podľa predkladaného vynálezu na indukovanú ľudským karcinómom pľúc LC-6 pomocou merania telesnej hmotnosti a koncentrácie vápnika v krvi testovaných zvierat.

Pasáž buniek ľudského karcinómu pľúc LC-6 bola vykonaná pri použití BALB/c-nu/nu holých myší (Nippon Charles River) in vivo. Na hodnotenie farmakologickej účinnosti boli zakúpení 5 týždňov starí samci BALB/c-nu/nu holých myší (Nippon Charles River) a nechali sa aklimatizovať počas 1 týždňa a takto pripravené myši staré 6 týždňov boli použité na test.

Myšie modely hyperkalcémie boli pripravené a boli rozdelené do skupín nasledujúcim spôsobom. Pasážované bunky ľudského karcinómu pľúc LC-6 boli excidované a narezané na 3 mm bločky. Vzniknuté bločky nádoru boli transplantované subkutánne do kožného záhybu myší v počte jeden bloček na myš. Dva až tri týždne po transplantácii, keď bolo potvrdené, že objem tumoru pri každej myši je dostatočne veľký, boli myši rozdelené do skupín a bol vypočítaný priemer objemu nádoru, koncentrácia vápnika v krvi a telesnej hmotnosti pre myši jednotlivých skupín a myši boli použité ako zvierací model hyperkalcémie.

Určenie terapeutickej účinnosti na hyperkalcémiu bolo vykonané nasledujúcim spôsobom. Jedna dávka chimérickej protilátky alebo humanizovanej protilátky proti PTHrP majúca verziu „q L reťazca bola podaná každému z uvedených myších modelov hyperkalcémie chvostovou cievou v dávke 10 alebo 30 pg na myš. V 1. deň, 3. deň, 6. deň a 10. deň po podaní bola pri každej myši meraná koncentrácia vápnika v krvi a telesná hmotnosť, na hodnotenie farmakologickej účinnosti protilátky. Koncentrácia vápnika v krvi bola určená ako koncentrácia ionizovaného vápnika v krvi odobratej od každej myši z orbitu pri použití hematokritovej kapiláry, ktorá bola vložená do 643 Automatic Ca/pH Analyzer (CIBA-CORNING).

Bolo zistené, že v zvieracom modeli hyperkalcémie nesúcom ľudský karcinóm pľúc LC-6 vedie podanie chimérickej protilátky a humanizovanej protilátky majúcej verziu „q L reťazca k rýchlemu zlepšeniu telesnej hmotnosti a koncentrácie vápnika v krvi a k zachovaniu tohto zlepšenia na dlhší čas. Tento výsledok ukazuje, že chimérická protilátka a humanizovaná protilátka podľa predkladaného vynálezu sú použiteľné na liečbu hyperkalcémie spojenej s malígnymi nádormi (pozri obr. 18).

Príklad 8: Kinetická analýza interakcií medzi PTHrP a protilátkou proti PTHrP pri použití BIACORE

V tomto príklade bola vykonaná kinetická analýza interakcií antigénprotilátka pri použití BIACORE. PTHrP(1-34+Cys) bol použitý ako antigén a bol adsorbovaný na vrchol senzora špecificky pre C-konce. Prečistené protilátky rôznych koncentrácií boli použité na analýzu. Zo získaného senzorogramu boli vypočítané kinetické parametre (väzbová rýchlostná konštanta „kass a disociačná rýchlostná konštanta „kdiss). Odkazy ku kinetickej analýze je možné nájsť v „Kinetic analysis of monoclonal antibody-antigen interaction with new biosensor based analytical systém, Karlsson, R. et al., (1991), J. Immunol. Methods 145, str. 229-240).

(1) Imobilizácia PTHrP(1-34+C) na vrchol senzora

PTHrP(l-34+C, bol adsorbovaný na vrchol senzora CM5 (Pharmacia).

Ako výplachový pufor bol použitý HBS (10 mM HEPES, pH 7,4; 0,15 M NaCl; 3,4 mM EDTA; 0,005% Surfactant P20) s prietokom 5 μΐ/min. Karboxymetylové skupiny karboxymetyldextránu na vrchole senzora CM5 boli aktivované injekciou 100 μΐ 0,05 M N-hydroxysukcimidu (NHS)/0,2 M N-etyl-N’-(3-dimetylaminopropyl) karbodiimidchloridu (EDC) a injekciou 100 μΐ 80 mM 2-(2-pyridinyltio)etánamín (PDEA)/0,l M boritanového pufra (pH 8,5) a ďalšou injekciou 10 μΐ 5 pg/ml PTHrP(1-34+C)/10 mM pufra octanu sodného (pH 5,0) na adsorpciu na C-konce PTHrP(1-34+C) špecifickú pre Cys zvyšky. Potom bola vykonaná injekcia 100 μΐ pufra obsahujúceho 50 mM (L)-cysteín/ΙΜ NaCl/0,1 M mravenčan sodný (pH 4,3) na blokovanie nadmerne aktivovaných skupín. Potom bola vykonaná injekcia 10 μΐ pufra obsahujúceho 0,1 M glycín-HCl (pH 2,5) a 10 μΐ 10 mM HC1 na vymytie substancií s nekovalentnou väzbou. Množstvo takto imobilizovaného PTHrP(1-34+C) bolo 226,4 RU (rezonančných jednotiek) (obr.19).

(2) Interakcia medzi imobilizovaným PTHrP(1-34+C) a prečistenú myšiu protilátku proti PTHrP

Ako výplachový pufor bol použitý HBS s prietokom 20 μΐ/min. Hybridómy produkujúce protilátku boli injikované do dutiny brušnej Balb/c myší a po dvoch týždňoch bol odobratý ascites a bol aplikovaný do proteín A kolóny na prečistenie protilátok. Prečistená protilátka #23-57-137-1 bola označená „MBC a prečistená protilátka 3F5 bola označená „3F5. Tieto protilátky boli riedené v HBS v sérii koncentrácií 1,25; 2,5; 5; 10 a 20 gg/ml.

V analýze bolo 40 μΐ roztoku protilátky injikovaných na 2 minúty pre väzbovú fázu a potom bol injikovaný HBS na 2 minúty na určenie disociačnej fázy. Po dokončení disociácie bolo injikovaných 10 μΐ 10 mM HCl na obnovenie vrcholu senzora. Analýza bola vykonaná pri použití tohto cyklu väzbadisociácia-obnovenie a injikovanie rôznych roztokov protilátky na získanie senzorogramu.

(3) Interakcia medzi imobilizovaným PTHrP(1-34+C) a prečistenou humanizovanou protilátkou proti PTHrP

Ako výplachový pufor bol použitý HBS s prietokom 20 μΐ/min. Protilátka bola produkovaná v CHO bunkách a bola prečistená pomocou proteín A kolóny. Prečistená chimérická protilátka bola označená „chMBC a verzie m a q prečistených humanizovaných protilátok boli označené „hMBCm a „hMBCq, v príslušnom poradí. Tieto protilátky boli riedené v HBS v sérii koncentrácií 1,25; 2,5; 5; 10 a 20 pg/ml.

Pri analýze bolo 40 μΐ roztoku protilátky injikovaných počas 2 minút pre väzbovú fázu a potom bol injikovaný HBS počas 2 minút na určenie disociačnej fázy. Po dokončení disociácie bolo injikovaných 10 μΐ 10 mM HCl na obnovenie vrcholu senzora. Analýza bola vykonaná pri použití tohto cyklu väzbadisociácia-obnovenie a injikovanie rôznych roztokov protilátky na získanie senzorogramu.

(4) Kinetická analýza interakcie

Boli získané požadované séra a bolo vykonané porovnanie charakteru reakcií pomocou prekrývania požadovaných reakčných regiónov (obr. 20-24). Na každom z obrázkov 20-24 krivky postupne zhora ukazujú dáta pre koncentráciu protilátky 1,25; 2,5; 5; 10 a 20 μς/πιΐ. Ďalej bola kinetická analýza interakcií vykonaná pri použití softwaru na analýzu „BIAevaluation 2.1 špecificky navrhnutého pre BIACORE, ktorý je schopný vypočítač kinetické parametre (väzbovú rýchlostnú konštantu „kass a disociačnú rýchlostnú konštantu „kdiss) z kriviek (tabuľka 4 a 5).

Tabuľka 4: Kinetické parametre MBC a 3F3

	MBC	3F5
Kdiss (1/s)	7,38x10*	1,22x10'
Kase (1/Ms)	7,23x10*	6,55x10*
KD(M)	l,O2xlO10	1,86x10*

Tabuľka 5: Kinetické parametre chimérických a humanizovaných protilátok

	chH-chl	hMBCm	hMBCq
Kdiss (1/s) (xlO’)	1,66	3,16	2,32
Kass (1/Ms) (xlO*)	1,24	0,833	1,03
KD (M) (xl0'1#)	1,34	3,58	2,25

V tomto pokuse bol na určenie väzbovej rýchlostnej konštanty použitý model 4 na analýzu (BIAevaluation 2,1 Software Handbook, A1-A5) .

Príklad 9: Potlačenie vylučovania fosforu v modeli hyperkalcémie spojenej s malígnymi nádormi

Hyperkalcémia spojená s malígnymi nádormi (HHM) je ochorenie spôsobené prítomnosťou PTHrP a je známe, že PTHrP akceleruje resorpciu kostí a resorpciu vápnika v obličkách a renálnych tubuloch, čo vedie k vývoju hyperkalcémie. Na druhej strane, z hľadiska fosforu, PTHrP potláča resorpciu fosforu v obličkách a v renálnych tubuloch, čo vedie k zvýšenému vylučovaniu a preto sa u pacientov s klinickou HHM často vyvíja hypofosfatémia. V tomto príklade bol vyšetrovaný účinok humanizovanej protilátky proti PTHrP na vylučovanie fosforu v obličkách pri použití krysieho modelu hyperkalcémie spojenej s malígnymi nádormi.

Ako zvierací model boli použité holé krysy, ktorým bol transplantovaný ľudský karcinóm pľúc LC-6 (získaný od Central Inštitúte for Experimental Animals). Je známe, že pri holých krysách, ktorým bol transplantovaný ľudský karcinóm pľúc LC-6, dochádza k zvyšovaniu koncentrácie vápnika v krvi so zväčšovaním objemu nádoru a dochádza k vývoju hyperkalcémie, ktorá je napríklad spojená so znížením telesnej hmotnosti a spontánnej aktivity. Pri použití tohto modelu bol vyšetrovaný účinok humanizovanej protilátky proti

PTHrP podľa predkladaného vynálezu na vylufiovanie fosfátov v obličkách pomocou metódy obličkový klirens založenej na ďalej uvedenej frakčnej exkrécii fosfátov.

Pasáž buniek ľudského karcinómu pľúc LC-6 bola vykonaná pri použití BALB/c-nu/nu holých myší (Nippon Kurea) in vivo. Na hodnotenie farmakologickej účinnosti boli zakúpení 5 týždňov starí samci F344N/Jcl-rnu holých krýs (Nippon Kurea) a nechali sa aklimatizovať počas 1 týždňa a takto pripravené myši staré 6 týždňov boli použité na test.

Zvieracie modely hyperkalcémie spojenej s malígnymi nádormi boli pripravené nasledujúcim spôsobom. Pasážované bunky ľudského karcinómu pľúc LC-6 boli excidované a narezané na 3 mm bločky. Vzniknuté bločky nádoru boli subkutánne transplantované do kožného záhybu krýs v počte jeden bloček na krysu. Približne tri dni po transplantácii, keď bolo potvrdené, že objem tumoru pri každej kryse je dostatočne veľký (3000 mm¹), boli krysy použité ako zvierací model hyperkalcémie spojenej s malígnymi nádormi, na základe koncentrácie vápnika v krvi a telesnej hmotnosti.

Určenie vylučovania fosfátov technikou renálny klirens bolo vykonané nasledujúcim spôsobom.

(1) Technika renálny klirens

Modelové zvieratá pre hyperkalcémiu spojenú s malígnymi nádormi bolí anestezované pantobarbitalom (Nembutal, Dainippon Pharmaceutical CO. Ltd.), boli fixované v polohe na chrbte v inkubačnom boxe s teplotou 37°C a bola im zavedená kanyla (polyetylénová kanyla, PE50, Nippon Becton Dickinson) do močového mechúra na odber moču. Potom bola zvieraciemu modelu zavedená kanyla na infúziu (polyetylénová kanyla, PE10, Nippon Becton Dickinson) do femorálnej vény, ktorou bola potom modelovým zvieratám podaná infúzia (0,7% inulín, 5% manitol, 0,2 % pentobarbital a 0,9% chlorid sodný) rýchlosťou 2 ml/hod. pri použití infúznej pumpy (Terufusion syringe púmp; STC-525; TERUMO). Po dosiahnutí rovnováhy počas 50 minút bol z kanyly päťkrát odobratý moč v 20-minútových intervaloch (t.j. od periódy 1 do periódy 5) pri získaní vzoriek moču. Uprostred každého odberu moču bolo z pravej krčnej vény každého zvieraťa odobratých 0,25 ml krvi pri použití injekčnej striekačky ošetrenej heparínom.

(2) Podanie protilátky

V priebehu uvedeného testu klírens bola v čase začiatku 2. obdobia odberu moču podaná intravenózne zvieraťu humanizovaná protilátka proti PTHrP v dávke 1 mg/ml/kg.

(3) Určenie koncentrácie inulínu a fosforu v moči a v krvi

Bol meraný objem vzoriek moču získaných z obdobia 1 až 5 a bola v nich určená koncentrácia inulínu a fosforu. Vzorky krvi získané vySäie boli tiež spracované centrifugáciou pri ochladzovaní na získanie vzorky plazmy, ktorá bola použitá na určenie koncentrácie inulínu a fosforu. Určenie inulínu bolo vykonané Antrone-sulfátovou technikou (Roe, L. et al., J. Biol. Chem. 178: 839-845, 1949) a určenie koncentrácie fosforu bolo vykonané pri použití Hitachi Automatic Analyzer 7170 a činidiel na určenie anorganického fosforu, Autosera IP (Daiichi Pure Chemicals) podľa návodu výrobcu (Physke-Sabarohova metóda).

(4) Výpočet klírens inulínu, klírens fosforu a frakčného vylučovania fosforu

Klírens inulínu (Cin), klírens fosforu (Cp) a frakčné vylučovanie fosforu (Fep) boli vypočítané podľa nasledujúcich rovníc.

Výpočet klírens inulínu (Cin):

Cin = Uin V/Pin kde Cin je klírens inulínu (ml/kg/min); Uin je koncentrácia inulínu v moči (mg/ml); V je objem moču za jednotku času (ml/kg/min); a Pin je koncentrácia inulínu v krvi (mg/ml).

Výpočet klírens fosforu (Cp):

Cp = Up V/Pp kde Cp je klírens fosforu (ml/kg/min); Up je koncentrácia fosforu v moči (mg/ml) ; V je objem moču za jednotku času (ml/kg/min) ; a Pp je koncentrácia fosforu v krvi (mg/ml).

Výpočet trakčného vylučovania fosforu (Fep):

Fep = Cp/Cin kde Fep je frakčné vylučovanie fosforu; Cin je klfrens inulínu; a Cp je klírens fosforu. Určenie bolo vykonané pri použití štyroch zvierat. Výsledky sú určené ako priemerná hodnota ± štandardná odchýlka.

Výsledky trakčného vylučovania fosforu a koncentrácie fosforu v krvi sú uvedené na obr. 25 a 26.

Obr. 25 je graf ilustrujúci vzťah medzi frakčným vylučovaním fosforu (= klírens fosforu/klírens inulínu) a periódou klírens (1 perióda = 20 minút). Humanizovaná protilátka proti PTHrP (1 mg/ml) bola podaná (i.v.) v čase začiatku periódy 2.

Obr. 26 je graf ilustrujúci vzťah medzi koncentráciou fosforu v plazme a periódou klírens (1 perióda = 20 minút). Humanizovaná protilátka proti PTHrP (1 mg/ml) bola podaná (i.v.) v čase začiatku periódy 2.

Z týchto výsledkov bolo zistené, že frakčné vylučovanie fosforu bolo po podaní protilátky (t.j. od periódy 2 do periódy 5) potlačené v porovnaní s vylučovaním pred podaním protilátky (t.j. perióda 1). Inými slovami, bolo zistené, že podanie neutralizačnej protilátky subjektu, u ktorého sa vyvíja hypofosfatémia, ktorá je spôsobená akceleráciou vylučovania fosforu (Fep > 0,2), vedie k obnoveniu resorpcie fosforu u subjektu na približne normálnu úroveň (frakčná resorpcia fosfátov s l-Fep > 0,8%) a v dôsledku toho bol pozorovaný trend normalizácie koncentrácie fosforu v krvi subjektu. Tieto výsledky tiež ukazujú použiteľnosť protilátok podľa predkladaného vynálezu ako činidiel na liečbu akcelerovaného vylučovania fosforu a hypofosfatémie spôsobenej PTHrP.

PTHrP je substrátom spôsobujúcim hyperkalcémiu spojenú s malígnymi nádormi a preto sa predpokladá možnosť zvýšenia vylučovania fosforu a zníženia množstva vysoko energetického organického fosforu v tkanivách pôsobením PTHrP. V súlade s tým, rôzne ochorenia spojené s hypofosfatémiou, ako je hypofosfatemická rachitis a hypofosfatemická vitamín D-rezistentná rachitis sú spôsobené hlavne zvýšeným vylučovaním fosforu močom a preto sú protilátky podľa predloženého vynálezu tiež užitočné na liečbu takýchto ochorení.

Príklad 10: Zlepšenie rôznych klinických príznakov hyperkalcémie spojenej s malígnymi nádormi.

Je známe, že hyperkalcémia spojená s malígnymi nádormi je spôsobená prítomnosťou PTHrP a že PTHrP akceleruje resorpciu kostí a resorpciu vápnika v obličkách a obličkových tubuloch, čo vedie k rozvoju hyperkalcémie. Ďalej je u pacientov trpiacich hyperkalcémiou pozorované zhoršenie klinických príznakov, ako je zlý performance status, bludy, nekľud, hydrodipsia, nevoľnosť a zvracanie (anorexia). Účinok protilátky proti PTHrP na také klinické príznaky bol vyšetrovaný pri použití zvieracích modelov hyperkalcémie, t.j. holých myší s transplantovanými ľudskými nádormi a holých krýs s transplantovanými ľudskými nádormi.

Ako zvierací model hyperkalcémie boli použité holé myši a holé krysy, ktorým bol transplantovaný ľudský karcinóm pľúc LC-6 (získaný od Central Inštitúte for Experimental Animals). Pri holých myšiach a pri holých krysách, ktorým bol transplantovaný ľudský karcinóm pľúc LC-6, dochádza k zvyšovaniu koncentrácie vápnika v krvi so zväčšovaním objemu nádoru a dochádza k vývoju hyperkalcémie, ktorá je napríklad spojená so znížením telesnej teploty a telesnej hmotnosti.

Terapeutický účinok myšej protilátky proti PTHrP na klinické príznaky hyperkalcémie spojenej s malígnymi nádormi bol vyšetrovaný pri použití holých myší s transplantovaným karcinómom pľúc LC-6 a výsledky sú znázornené na fotografiách. Účinok protilátky na zlepšenie spontánnej aktivity, telesnej teploty a anorexie bol vyšetrovaný pri použití holých myší s transplantovaným karcinómom pľúc LC-6.

1. Zlepšenie viditeľných klinických príznakov spojených s hyperkalcémiou

Pasáž buniek ľudského karcinómu pľúc LC-6 bola vykonaná pri použití BALB/c-nu/nu holých myší (Nippon Charles River) in vivo. Na hodnotenie farmakologickej účinnosti boli zakúpení 5 týždňov starí samci BALB/c-nu/nu holých myší (Nippon Charles River) a nechali sa aklimatizovať počas 1 týždňa a takto pripravené myši staré 6 týždňov boli použité na test.

Myšie modely hyperkalcémie boli pripravené a boli rozdelené do skupín nasledujúcim spôsobom. Pasážované bunky ľudského karcinómu pľúc LC-6 boli excidované a narezané na 3 mm bločky. Vzniknuté bločky nádoru boli transplantované subkutánne do kožného záhybu myší v počte jeden bloček na myš. Dvadsaťsedem dní po transplantácii, keď bolo potvrdené, Se objem tumoru pri každej myši je dostatočne veľký, boli myši rozdelené do skupín a bol vypočítaný priemer objemu nádoru, koncentrácia vápnika v krvi a telesné hmotnosti pre myši jednotlivých skupín a myši boli použité ako zvierací model hyperkalcémie.

Objem nádoru bol určený meraním väčšieho priemeru (a mm) a menšieho priemeru (b mm) nádoru a výpočtom pri použití Galantovho vzorca (ab³/2).

Koncentrácia vápnika v krvi bola určená ako koncentrácia ionizovaného vápnika v krvi odobratej od každej myši z orbitu pri použití hematokritovej kapiláry, ktorá bola vložená do 643 Automatic Ca/pH Analyzer (CZBA-CORNING) .

Určenie terapeutickej účinnosti na hyperkalcémiu bolo vykonané nasledujúcim spôsobom. Myšia protilátka proti PTHrP bola podaná každému z uvedených myších modelov hyperkalcémie chvostovou cievou v 27., 30., 34. a 37. deň po transplantácii v dávke 100 pg/myš. Na kontrolu bol namiesto protilátky pridaný fosfátom pufrovaný fyziologický roztok rovnakým spôsobom. V 41. deň po transplantácii nádoru bola z každej skupiny (kontrolnej a s podaním protilátky) vybraná typická myš a bola urobená jej fotografia spolu s normálnou myšou.

Výsledkom bolo, že u zvieracích modelov hyperkalcémie s transplantovaným ľudským karcinómom pľúc LC-6 (znázorneným v strede každého z obrázkov 27 a 28), došlo k vývoju rovnakých nádorových hmôt ako u kontrolných myší (napravo od obr. 27 a 28), ale mali rovnaké správanie ako normálne myši (naľavo od obr. 27 a 28) . Tento výsledok naznačuje, že podanie protilátky proti PTHrP zlepšuje viditeľné klinické príznaky (obr. 27 a 28).

2. Zlepšenie zníženej spontánnej aktivity spojenej s hyperkalcémiou

Pasáž buniek ľudského karcinómu pľúc LC-6 bola vykonaná pri použití BALB/c-nu/nu holých myší (Nippon Kurea) in vivo. Na hodnotenie farmakologickej účinnosti boli zakúpení 5 týždňov starí samci F344/Jcl-rnu holých krýs (Nippon Kurea) a nechali sa aklimatizovať počas 1 týždňa a takto pripravené myši staré 6 týždňov boli pripravené na test.

Myšie modely hyperkalcémie boli pripravené nasledujúcim spôsobom. Pasážované bunky ľudského karcinómu pľúc LC-6 boli excidované a narezané na 3 mm bločky. Vzniknuté bločky nádoru boli transplantované subkutánne do kožného záhybu myší v počte jeden bloček na myš. Asi tridsať dní po transplantácii, keď bolo potvrdené, že objem tumoru pri každej myši je dostatočne veľký, boli myši rozdelené do skupín a bol vypočítaný priemer objemu nádoru, koncentrácia vápnika v krvi a telesné hmotnosti pre myši jednotlivých skupín a myši boli použité ako zvierací model hyperkalcémie.

Koncentrácia vápnika v krvi bola určená ako koncentrácia ionizovaného vápnika v krvi odobratej od každej myši z orbitu pri použití hematokritovej kapiláry, ktorá bola vložená do 643 Automatic Ca**/pH Analyzer (CIBA-CORNING).

(1) Spôsob určenia spontánnej aktivity

Určenie spontánnej aktivity bolo vykonané pri použití ANIMEX merača aktivity typu SE (FARAD, Electronics, Sweden), ktorý bol umiestnený vo vopred určenej polohe v polyetylénovom boxe, v ktorom boli samostatne umiestnené modelové zvieratá (pri kŕmení a napájaní). Tento prístroj bol navrhnutý na meranie pohyblivosti každej krysy. Pri použití tohto prístroja bola pohyblivosť zaznamenávaná ako počet pohybov za jednotku času. Meranie bolo vykonávané počas 13 hodín (od 19:00 do 8:00 ďalšieho dňa) a výsledky sú uvedené ako počet pohybov za hodinu.

(2) Podanie protilátky

Humanizovaná protilátka proti PTHrP bola podaná každej z uvedených krýs, u ktorých bola rozvinutá hyperkalcémia, chvostovou cievou v dávke 5 mg/0,5 ml/kg. Každej kryse ďalšej skupiny bol podaný fyziologický roztok. Meranie bolo vykonané so zámenou kontrolnej krysy a krysy, ktorej bola podaná protilátka.

Meranie bolo vykonané v 0. deň (t.j. deň pred podaním), 2., 4., 7. a 14. deň pre krysy, ktorým bola podaná protilátka a v 1., 3., 5., 8. a 15. deň pre kontrolné krysy.

Výsledkom bolo, že kontrolné krysy nevykazovali žiadnu zmenu alebo zníženie spontánnej aktivity v priebehu testu, pričom krysy s podanou protilátkou vykazovali zvýšenie spontánnej aktivity po 4. dni podania (obr. 29) .

3. Zlepšenie zníženej telesnej teploty spojenej s hyperkalcémiou

Pasáž buniek ľudského karcinómu pľúc LC-6 a príprava modelových zvierat hyperkalcémie spojenej s malígnymi nádormi bola vykonaná rovnako ako v horeuvedenom kroku 2.

(1) Meranie telesnej teploty

Meranie telesnej teploty bolo vykonané pri použití digitálneho teplomera pri anestézii zvierat pentobarbitalom (Nembutal, Dainippon Pharmaceutical Co., Ltd.) a vložení teplotného senzora do ich rekta.

(2) Podanie protilátky

Humanizovaná protilátka proti PTHrP bola podaná každej z uvedených modelových krýs s hyperkalcémiou chvostovou cievou v dávke 1 mg/ml/kg. Iným modelovým krysám bol podaný na kontrolu fyziologický roztok. Šalej bola meraná telesná teplota normálnych krýs, ktorým nebola podaná žiadna protilátka. Meranie bolo vykonané pri krysách v 0. deň (t.j. deň pred podaním). 1., 2. a 3. deň pre krysy s podanou protilátkou, pre kontrolné krysy a pre normálne krysy.

Výsledkom bolo, že normálne krysy nevykazovali žiadnu zmenu telesnej teploty (34,2-34,4°C) v priebehu testu, pričom modelové krysy s hyperkalcémiou spojenou s mallgnymi nádormi vykazovali zníženie telesnej teploty o približne 2 C. Keď bola humanizovaná protilátka proti PTHrP podaná modelovým krysám, bolo potvrdené, že po troch dňoch po podaní dochádza pri týchto krysách k nárastu ich zníženej telesnej teploty na rovnakú úroveň, ako majú normálne krysy.

Tieto výsledky ukazujú, že humanizovaná protilátka proti PTHrP podľa predkladaného vynálezu je účinná pre zvýSenie zníženej telesnej teploty modelových zvierat s hyperkalcémiou spojenom s malígnymi nádormi (obr. 30).

4. Zlepšenie indukovaného zníženia príjmu potravy

Pasáž buniek ľudského karcinómu pľúc LC-6 a príprava modelových zvierat hyperkalcémie spojenej s malígnymi nádormi bola vykonaná rovnako ako v uvedenom kroku 2. Pripravené zvieracie modely boli rozdelené do skupín a bola vypočítaná priemerná koncentrácia vápnika v krvi a telesná hmotnosť pre myši jednotlivých skupín a myši boli použité na pokus uvedený ďalej.

(1) Meranie príjmu potravy

V priebehu testu boli krysy samostatne umiestnené do metabolického boxu a boli napájené vodou a kŕmené. Pre každú krysu bol príjem potravy určený ako množstvo (g) za 24 hodín (od 9:00 do 9:00 ďalšieho dňa) . Meranie bolo vykonané meraním celkovej hmotnosti zásobníka s potravou o 9:00 v prvý deň (t.j. tara) a v 9:00 ďalSieho dňa a výpočtom rozdielu hmotností.

(2) Podanie protilátky

Humanizovaná protilátka proti PTHrP bola podaná každej z uvedených modelových krýs s hyperkalcémiou (HHM krýs) opísaných vyšäie, chvostovou cievou v dávke 5 mg/0,5 ml/kg. Každej kryse kontrolnej skupiny bol chvostovou cievou podaný pre kontrolu fyziologický roztok. Normálnym krysám bol tiež podaný rovnakým spôsobom chvostovou cievou fyziologický roztok. Pre krysy s podanou protilátkou, pre kontrolné krysy a pre normálne krysy bolo určenie príjmu potravy vykonané v 0. deň (t.j. odo dňa pred podaním do dňa podania), v 1. deň (t.j. odo dňa podania do ďalSieho dňa), 3. deň (t.j. od tretieho dňa po podaní do ďalSieho dňa) a 5. deň (t.j. od piateho dňa po podaní do ďalSieho dňa).

Pred podaním protilátky bol príjem potravy pre modelovú hyperkalcemickú krysu (5-9 krýs) priemerne 8,11 g, pričom pre normálnu krysu bol priemerne 12,06 g, čo ukazuje výrazné zníženie príjmu potravy pre modelové hyperkalcemické krysy. Pri podaní humanizovanej protilátky proti PTHrP modelovým krysám, v defi a po dni podania protilátky, stúpol príjem potravy u krýs s podanou protilátkou na rovnakú úroveň, ako bol príjem normálnych krýs, aj keď u kontrolných krýs nebola pozorovaná zmena v príjme potravy. Tieto výsledky ukazujú, že humanizovaná protilátka proti PTHrP podľa predkladaného vynálezu je účinná na zvýSenie zníženého príjmu potravy u modelových zvierat s hyperkalcémiou spojenou s malígnymi nádormi (tabuľka 6).

Tabuľka 6: Vplyv na príjem potravy

Zviera	Jedinec C.	Podanie*	Príjem potravy jedinca (g)
O.deň	l.deň	2 .deň	3. deň
Normálna	1	Fyz. roztok	13,7	16,7	18,63	18,71
krysa	2	Fyz. roztok	14,27	15,3	19,55	19,39
	3	Fyz. roztok	9,83	15,5	20,72	19,88
	4	Fyz. roztok	10,42	15,04	20,28	22,03
BHH	5	Fyz. roztok	10,77	14,24	12,66	11,82
krysa	6	Fyz. roztok	6,99	8,92	2,59	14,8
HHM	7	Anti-PTHrP protilátka	7,46	17,65	22,52	17,99
krysa	B	Anti-PTHrP protilátka	12	12,38	20,94	23,1
	9	Anti-PTHrP protilátka	3,35	16,65	20,36	21,89

'Podanie fyziologického roztoku: 0,5 ml/kg cestou chvostovej .žily; a podanie protilátky: 5 mg/0,5 ml/kg cestou chvostovej žily.

Uvedené výsledky ukazujú, že chimérické protilátky a humanizované protilátky podľa predkladaného vynálezu sú použiteľné ako činidlá na zlepšenie rôznych klinických príznakov hyperkalcémie spojenej s malígnymi nádormi.

5. Zlepšenie zníženého pH krvi indukovaného hyperkalcémiou.

Pasáž buniek ľudského karcinômu pľúc LC-6 a príprava modelových zvierat hyperkalcémie spojenej s malígnymi nádormi bola vykonaná rovnako ako v kroku

2. Pripravené zvieracie modely boli rozdelené do skupín a bola vypočítaná priemerná koncentrácia vápnika v krvi a telesná hmotnosť pre myši jednotlivých skupín.

(1) Určenie pH krvi

Krv bola odobratá od každého z testovaných zvierat pri použití heparínom ošetrenej injekčnej striekačky technikou odberu kardiálnej krvi a potom bola výsledná vzorka krvi aplikovaná do 643 Automatic Ca**/pH Analyzer (CIBACORNING) na určenie pH vzorky krvi.

(2) Podanie protilátky

Humanizovaná protilátka proti PTHrP bola podaná každej z uvedených modelových krýs s hyperkalcémiou (HHM krýs) opísaných vySSie chvostovou cievou v dávke 5 mg/0,5 ml/kq (n=3). Každej kryse kontrolnej skupiny bol chvostovou cievou podaný rovnakým spôsobom fyziologický roztok. Pre krysy s podanou protilátkou a pre kontrolné krysy bolo určenie pH krvi vykonané v 0. deň (t.j. deň pred podaním), 1. deň a 7. deň. Výsledky sú uvedené ako priemer získaných hodnôt pH.

Pred podaním protilátky bolo pH krvi modelovej hyperkalcemickej krysy približne 7,49 (pričom pre normálnu krysu bolo približne 7,40 ± 0,02), čo znamená, že pri modelovej kryse dochádza k rozvoju metabolickej alkalózy. Pri podaní humanizovanej protilátky proti PTHrP modelovým krysám sa u nich sedem dní po podaní protilátky zvýžilo pH krvi na hodnoty blízke hodnotám pH normálnych krýs, aj keď u kontrolných krýs nebola pozorovaná zmena pH krvi. Ako jeden z klinických príznakov hyperkalcémie spojenej s malígnymi nádormi (HHM) bola opísaná metabolická alkalóza, o ktorej je známe, že je indukovaná inhibíciou vylučovania bikarbonátu (HCO/) v obličkách. Podanie humanizovanej protilátky proti PTHrP podľa predkladaného vynálezu normalizuje pH krvi u modelových hyperkalcemických zvierat a preto sa predpokladá, že protilátka môže zlepäiť metabolickú alkalózu, ktorá sa vyskytuje u HHM (obr. 31) .

Uvedené výsledky ukazujú, že chimérické protilátky a humanizované protilátky podľa prekladaného vynálezu sú použiteľné ako činidlá na zlepženie rôznych klinických príznakov hyperkalcémie spojenej s malígnymi nádormi.

Priemyselná využiteľnosť

Predkladaný vynález obsahuje chimérickú protilátku a humanizovanú protilátku proti PTHrP. Tieto protilátky majú nízku antigenicitu pre človeka a preto sú použiteľné ako činidlá na liečbu hyperkalcémie, hypofosfatémie a podobne.

Zoznam sekvencií (2) Informácie pre SEQ ID NO: 1:

(i) Charakteristika sekvencie:

(A) Dĺžka: 20 párov báz (B) Typ: nukleová kyselina (C) Reťazec: jednoduchý (D) Topológia: lineárna (ii) Typ molekuly: iná nukleová kyselina (A) Opis: /opis = „syntetická DNA (ix) Opis sekvencie: SEQ ID NO: 1:

(2) Informácie pre SEQ ID NO: 2:

(i) Charakteristika sekvencie:

(A) DÍžka: 38 párov báz (B) Typ: nukleová kyselina (C) Reťazec: jednoduchý (D) Topológia: lineárna (ii) Typ molekuly: iná nukleová kyselina (A) Opis: /opis b „syntetická DNA (ix) Opis sekvencie: SEQ ID NO: 2:

CIUGTTGGGG OCAUCIUTCA MKITCCACA ATCGATAG 38 (2) Informácie pre SEQ ID NO: 3:

(i) Charakteristika sekvencie:

(A) Dĺžka: 28 párov báz (B) Typ: nukleová kyselina (C) Reťazec: jednoduchý (D) Topológia: lineárna (ii) Typ molekuly: iná nukleová kyselina (A) Opis: /opis b „syntetická DNA (ix) Opis sekvencie: SEQ ID NO: 3:

GGATCCOGGG CCAGTGGATA GACAGATG (2) Informácie pre SEQ ID NO: 4:

(i) Charakteristika sekvencie:

(A) Dĺžka: 29 párov báz (B) Typ: nukleová kyselina (C) Reťazec: jednoduchý (D) Topológia: lineárna (ii) Typ molekuly: iná nukleová kyselina (A) Opis: /opis = „syntetická DNA (ix) Opis sekvencie: SEQ ID NO: 4:

GCATCYrGGG TCACRGGAAG CTGCRAACA _2g (2) Informácie pre SEQ ID NO: 5:

(i) Charakteristika sekvencie:

(A) Dĺžka: 17 párov báz (B) Typ: nukleová kyselina (C) Reťazec: jednoduchý (D) Topológia: lineárna (ii) Typ molekuly: iná nukleová kyselina (A) Opis: /opis b „syntetická DNA (ix) Opis sekvencie: SEQ ID NO: 5:

GITITOXAG TCAOGAC ₁₇ (2) Informácie pre SEQ ID NO: 6:

(i) Charakteristika sekvencie:

(A) DÍŽka: 17 párov báz (B) Typ: nukleová kyselina (C) Reťazec: jednoduchý (D) Topológia: lineárna (ii) Typ molekuly: iná nukleová kyselina (A) Opis: /opis b „syntetická DNA (ix) Opis sekvencie: SEQ ID NO: 6:

CAGGAAACAG ťTATGAC (2) Informácie pre SEQ ID NO: 7:

(i) Charakteristika sekvencie:

(A) Dĺžka: 31 párov báz (B) Typ: nukleová kyselina (C) Reťazec: jednoduchý (D) Topológia: lineárna (ii) Typ molekuly: iná nukleová kyselina (A) Opis: /opis = „syntetická DNA (ix) opis sekvencie: SEQ ID NO: 7:

CTCTAAGC1T CCACCATCAP ACTTOGGGCT C _{3 χ} (2) Informácie pre SEQ ID NO: 8:

(i) Charakteristika sekvencie:

(A) Dĺžka: 30 párov báz (B) Typ: nukleová kyselina (C) Reťazec: j ednoduchý (D) Topológia: lineárna (ii) Typ molekuly: iná nukleová kyselina (A) Opis: /opis » „syntetická DNA (ix) Opis sekvencie: SEQ ID NO: 8:

TGTTGGATGC CTGCAGAGAC AGTGACCAGA (2) Informácie pre SEQ ID NO: 9:

(i) Charakteristika sekvencie:

(A) Dĺžka: 36 párov báz (B) Typ: nukleová kyselina (C) Reťazec: jednoduchý (D) Topológia: lineárna (ii) Typ molekuly: iná nukleová kyselina (A) Opis: /opis = „syntetická DNA (ix) Opis sekvencie: SEQ ID NO: 9:

GTCTGAATTC AAGCTTCCAC CATGGGdTT GGGCTG (2) Informácie pre SEQ ID NO: 10:

(i) Charakteristika sekvencie:

(A) Dĺžka: 41 párov báz (B) Typ: nukleová kyselina (C) Reťazec: jednoduchý (D) Topológia: lineárna (ii) Typ molekuly: iná nukleová kyselina (A) Opis: /opis = „syntetická DNA (ix) Opis sekvencie: SEQ ID NO: 10:

TTTCCCGGGC CCTTCGTGGA GGCTCAGGAG ACGGTGACCA G (2) Informácie pre SEQ ID NO: 11:

(i) Charakteristika sekvencie:

(A) Dĺžka: 109 párov báz (B) Typ: nukleová kyselina (C) Reťazec: jednoduchý (D) Topológia: lineárna (ii) Typ molekuly: iná nukleová kyselina (A) Opis: /opis = „syntetická DNA (ix) Opis sekvencie: SEQ ID NO: 11:

GTCTCAATTC AAGCTTAGTA CTTGGCCAGC CCAAGGCCAA CCCCAGGGTC ACCCTCTTCC

CGCCCTCCTC TGAGGAGCTC CAAGCCAACA AGGCCACACT AGTGTGTCT (2) Informácie pre SEQ ID NO: 12:

(i) Charakteristika sekvencie:

(A) Dĺžka: 110 párov báz (B) Typ: nukleová kyselina (C) Reťazec: jednoduchý (D) Topológia: lineárna (ii) Typ molekuly: iná nukleová kyselina (A) Opis: /opis = „syntetická DNA (ix) Opis sekvencie: SEQ ID NO: 12:

GGTTTGGTGG TCTCCACTCC CGGCTTCACG GGGCTGCCAT CTGCCTTCCA GGCCACTGTC

ACAGCTCCCG GGTAGAAGTC ACTGATCAGA CACACTAGTC TCGCCTTCTT

110 (2) Informácie pre SEQ ID NO: 13:

(i) Charakteristika sekvencie:

(A) Dĺžka: 98 párov báz (B) Typ: nukleová kyselina (C) Reťazec: jednoduchý (D) Topológia: lineárna (ii) Typ molekuly: iná nukleová kyselina (A) Opis: /opis = „syntetická DNA (ix) Opis sekvencie: SEQ ID NO: 13:

GGAGTGGAGA CCACCAAACC CTCCAAACAG AGCAACAACA AGTACGCGGC CAGCAGCTAC

CTCAKX-TCA CGCCCGAGCA GTGGAAGTCC CACAGAAG (2) Informácie pre SEQ ID NO: 14:

(i) Charakteristika sekvencie:

(A) Dĺžka: 106 párov báz (B) Typ: nukleová kyselina (C) Reťazec: jednoduchý (D) Topológia: lineárna (ii) Typ molekuly: iná nukleová kyselina (A) Opis: /opis = „syntetická DNA (ix) Opis sekvencie: SEQ ID NO: 14:

TGTTGAATTC TTACTATGAA CATTCTCTAG GGGCCACTGT CTTCTCCACG GTCCTCCCTT

CATGCGTCAC CTGGCAGCTG TAGCTTCTGT GGGACTTCCA CTGCTC (2) Informácie pre SEQ ID NO: 15:

(i) Charakteristika sekvencie:

(A) Dĺžka: 43 párov báz (B) Typ: nukleová kyselina (C) Reťazec: jednoduchý (D) Topológia: lineárna (ii) Typ molekuly: iná nukleová kyselina (A) Opis: /opis = „syntetická DNA (ix) Opis sekvencie: SEQ ID NO: 15:

GTCTGAATIĽ AAGCTTAGTA CTTGGCCAGC CCAAGGCCAA CCC

106

- 97 (2) Informácie pre SEQ ID NO: 16:

(i) Charakteristika sekvencie:

(A) DÍžka: 20 párov báz (B) Typ: nukleová kyselina (C) Reťazec: jednoduchý (D) Topológia: lineárna (ii) Typ molekuly: iná nukleová kyselina (A) Opis: /opis o „syntetická DNA (ix) Opis sekvencie: SEQ ID NO: 16:

TCTTGAATTC TTACTATCAA (2) Informácie pre SEQ ID NO: 17:

(i) Charakteristika sekvencie:

(A) Dĺžka: 39 párov báz (B) Typ: nukleová kyselina (C) Reťazec: jednoduchý (D) Topológia: lineárna (ii) Typ molekuly: iná nukleová kyselina (A) Opis: /opis = „syntetická DNA (ix) Opis sekvencie: SEQ ID NO: 17:

CAACAAf TAC GOGGCCACCA GCTACCTCAG CCľCACGCC (2) Informácie pre SEQ ID NO: 18:

(i) Charakteristika sekvencie:

(A) DÍžka: 39 párov báz (B) Typ: nukleová kyselina (C) Reťazec: jednoduchý (D) Topológia: lineárna (ii) Typ molekuly: iná nukleová kyselina (A) Opis: /opis = „syntetická DNA (ix) Opis sekvencie: SEQ ID NO: 18:

GTAGCTCCTC GCGGCGTACT TCTTGTTCCT CTCTTTCGA (2) Informácie pre SEQ ID NO: 19:

(i) Charakteristika sekvencie:

(A) Dĺžka: 46 párov báz (B) Typ: nukleová kyselina (C) Reťazec: jednoduchý (D) Topológia: lineárna (ii) Typ molekuly: iná nukleová kyselina (A) Opis: /opis = „syntetická DNA (ix) Opis sekvencie: SEQ ID NO: 19:

GTCIGMTTC AAGCTTAGTC CTAGGTDGAA CTCTGGCTGC ACCATC (2) Informácie pre SEQ ID NO: 20:

(i) Charakteristika sekvencie:

(A) DÍžka: 34 párov báz (B) Typ: nukleová kyselina (C) Reťazec: jednoduchý (D) Topológia: lineárna (ii) Typ molekuly: iná nukleová kyselina (A) Opis: /opis = „syntetická DNA (ix) Opis sekvencie: SEQ ID NO: 20:

TCTTGAATTC TTACTAACAC TCTCCCCTCT TCAA (2) Informácie pre SEQ ID NO: 21:

(i) Charakteristika sekvencie:

(A) DÍžka: 35 párov báz (B) Typ: nukleová kyselina (C) Reťazec: jednoduchý (D) Topológia: lineárna (ii) Typ molekuly: iná nukleová kyselina (A) Opis: /opis = „syntetická DNA (ix) Opis sekvencie: SEQ ID NO: 21:

GTCTAAGCTT CCACCATGGC CTCGACTCCT CTCTT (2) Informácie pre SEQ ID NO: 22:

(i) Charakteristika sekvencie:

(A) Dĺžka: 48 párov báz (B) Typ: nukleová kyselina (C) Reťazec: jednoduchý (D) Topológia: lineárna (ii) Typ molekuly: iná nukleová kyselina (A) Opis: /opis = „syntetická DNA (ix) Opis sekvencie: SEQ ID NO: 22:

TGTTGAATTC AGATCTAACT ACTTACCTAG GACAGTGACC TTGGTOOC ⁴⁸ (2) Informácie pre SEQ ID NO: 23:

(i) Charakteristika sekvencie:

(A) DÍäka: 128 párov báz (B) Typ: nukleová kyselina (C) Reťazec: jednoduchý (D) Topológia: lineárna (ii) Typ molekuly: iná nukleová kyselina (A) Opis: /opis = „syntetická DNA (ix) Opis sekvencie: SEQ ID NO: 23:

CTCTAAGCTT CCACCATGGG GTTTGGGCTC AGCTGGGTTT TOCTOGTTCC TCTTTTAAGA ₃₈

GGTĽTCCAGT GTCAGGTGCA GCTGGTGGAG TCTGGGGGAG GCGTGGTCCA GCCTGGGAGG ¹²⁰

128

TCCCIGAG (2) Informácie pre SEQ ID NO: 24:

(i) Charakteristika sekvencie:

(A) Dĺžka: 125 párov báz (B) Typ: nukleová kyselina (C) Reťazec: jednoduchý (D) Topológia: lineárna (ii) Typ molekuly: iná nukleová kyselina (A) Opis: /opis = „syntetická DNA (ix) Opis sekvencie: SEQ ID NO: 24:

ACCAITAGTA GTGGTGGTAG TTACACCTAC TATCCAGACA GTGTGAAGGG GCGATTCACC 60

ATCTCjCAGAG acaattccaa gaacacgctc tatctgcaaa tgaacagcct gagagctcag ¹²⁰

125

GACAC

100 (2) Informácie pre SEQ ID NO: 25:

(i) Charakteristika sekvencie:

(A) Dĺžka: 132 párov báz (B) Typ: nukleová kyselina (C) Reťazec: jednoduchý (D) Topológia: lineárna (ii) Typ molekuly: iná nukleová kyselina (A) Opis: /opis = „syntetická DNA (ix) Opis sekvencie: SEQ ID NO: 25:

CTACCACCAC TACTAATCGT TCCCACCCAC TCCAGCCCCT TCCCTGGAGC CTGGCGGACC

CAAGACATGC CATAGCTACT GAAGGTGAAT CCAGAGGCTG CACAGGAGAG TCTCAGGGAC

CTCOCAGGCT GG (2) Informácie pre SEQ ID NO: 26:

(i) Charakteristika sekvencie:

(A) Dĺžka: 110 párov báz (B) Typ: nukleová kyselina (C) Reťazec: jednoduchý (D) Topológia: lineárna (ii) Typ molekuly: iná nukleová kyselina (A) Opis: /opis = „syntetická DNA (ix) Opis sekvencie: SEQ ID NO: 26:

TGTTGGATCC CTGAGGAGAC GGTGACCAGG GTTCCCTGGC CCCAGTAAGC AAAGTAAGTC ATAGTAGTCT GTCTOGCACA GTAATACACA GCCGTGTCCT CAGCTCTCAG (2) Informácie pre SEQ ID NO: 27:

(i) Charakteristika sekvencie:

(A) Dĺžka: 30 párov báz (B) Typ: nukleová kyselina (C) Reťazec: jednoduchý (D) Topológia: lineárna (ii) Typ molekuly: iná nukleová kyselina (A) Opis: /opis = „syntetická DNA” (ix) Opis sekvencie: SEQ ID NO: 27:

GTCTAAGCTT CCAGCATGGG GTTTGGGCTG

120

132

110

101 (2) Informácie pre SEQ ID NO: 28:

(i) Charakteristika sekvencie:

(A) Dĺžka: 30 párov báz (B) Typ: nukleová kyselina (C) Reťazec: jednoduchý (D) Topológia: lineárna (ii) Typ molekuly: iná nukleová kyselina (A) Opis: /opis = „syntetická DNA (ix) Opis sekvencie: SEQ ID NO: 28:

TGTTGGATCC CTGAGGAGAC GGTGACCAGG _3Q (2) Informácie pre SEQ ID NO: 29:

(i) Charakteristika sekvencie:

(A) Dĺžka: 133 párov báz (B) Typ: nukleová kyselina (C) Reťazec: jednoduchý (D) Topológia: lineárna (ii) Typ molekuly: iná nukleová kyselina (A) Opis: /opis = „syntetická DNA (ix) Opis sekvencie: SEQ ID NO: 29:

ACAAAGCITC CACCATGGCC TGGACTCCTC TCITCTTCTT CTrTGTTCTT CATTGCTCAG ₆0

GlTCITICľC CCA(X.TIGTC CTGACTCAAT CGCCCTCIGC CICICCCTCC CIGGGAGCCT ¹²⁰

133 (GGTCAAGCľ CAC (2) Informácie pre SEQ ID NO: 30:

(i) Charakteristika sekvencie:

(A) Dĺžka: 118 párov báz (B) Typ: nukleová kyselina (C) Reťazec: jednoduchý (D) Topológia: lineárna (ii) Typ molekuly: iná nukleová kyselina (A, Opis: /opis = „syntetická DNA (ix) Opis sekvencie: SEQ ID NO: 30:

AGCAAGATGG AAGCCACAGC ACAGGTGATG GGATTCCTGA TCGCTTCTCA GGCTCCAGCT 60

CTGGCGCIGA GCGCTACCTC ACCATCTCCA GCCTCCAGTC TCAGGATGAG GCTGACTA

118

102 (2) Informácie pre SEQ ID NO: 31:

(i) Charakteristika sekvencie:

(A) Dĺžka: 128 párov báz (B) Typ: nukleová kyselina (C) Reťazec: jednoduchý (D) Topológia: lineárna (ii) Typ molekuly: iná nukleová kyselina (A) Opis: /opis = „syntetická DNA (ix) Opis sekvencie: SEQ ID NO: 31:

cnm^.Tii CA!iTir.crr μπτπχιγ mgtaocgaí; cccľľttctc igcogcigc

TCAIGGCATT CAAI'GGľGTA CGTACTGTGC TCACIALTCA AGGTGCAGGT GAGCITCACL

GAGGCTCC

120

128 (2) Informácie pre SEQ ID NO: 32:

(i) Charakteristika sekvencie:

(A) Dĺžka: 114 párov báz (B) Typ: nukleová kyselina (C) Reťazec: jednoduchý (D) Topológia: lineárna (ii) Typ molekuly: iná nukleová kyselina (A) Opis: /opis = „syntetická DNA (ix) Opis sekvencie: SEQ ID NO: 32:

CTTGGATCCG GGCTCACCTA GGAOGGTCAG TTTGGTCCCT CCGCCGAACA CCCTCACAAA

TTGTTCtTTA ATTOTATCAC CCACACCACA GTAATAGTCA GCCTCATCCT CAGA

114 (2) Informácie pre SEQ ID NO: 33:

(i) Charakteristika sekvencie:

(A) Dĺžka: 17 párov báz (B) Typ: nukleová kyselina (C) Reťazec: jednoduchý (D) Topológia: lineárna (ii) Typ molekuly: iná nukleová kyselina (A) Opis: /opis = „syntetická DNA (ix) Opis sekvencie: SEQ ID NO: 33:

ACAAAW.TľC CACCATG

103 (2) Informácie pre SEQ ID NO: 34:

(i) Charakteristika sekvencie:

(A) Dĺžka: 19 párov báz (B) Typ: nukleová kyselina (C) Reťazec: jednoduchý (D) Topológia: lineárna (ii) Typ molekuly: iná nukleová kyselina (A) Opis: /opis = „syntetická DNA (ix) Opis sekvencie: SEQ ID NO: 34:

CTTGGATCCG GGCTGACC1 (2) Informácie pre SEQ ID NO: 35:

(i) Charakteristika sekvencie:

(A) Dĺžka: 75 párov báz (B) Typ: nukleová kyselina (C) Reťazec: jednoduchý (D) Topológia: lineárna (ii) Typ molekuly: iná nukleová kyselina (A) Opis: /opis = „syntetická DNA (ix) Opis sekvencie: SEQ ID NO: 35:

CTTGGATCCG GGCTCACCTA GGACGGTCAG TTTGGTCCCT CCCCCGAACA CGTACACAAA

TTGTTCCTTA ATTGT (2) Informácie pre SEQ ID NO: 36:

(i) Charakteristika sekvencie:

(A) Dĺžka: 43 párov báz (B) Typ: nukleová kyselina (C) Reťazec: jednoduchý (D) Topológia: lineárna (ii) Typ molekuly: iná nukleová kyselina (A) Opis: /opis = „syntetická DNA (ix) Opis sekvencie: SEQ ID NO: 36:

GTCTAAGCIT CCACCATGAP ACTTCGGGČT C

104 (2) Informácie pre SEQ ID NO: 37:

(i) Charakteristika sekvencie:

(A) Dĺžka: 46 párov báz (B) Typ: nukleová kyselina (C) Reťazec: jednoduchý (D) Topológia: lineárna (ii) Typ molekuly: iná nukleová kyselina (A) Opis: /opis = „syntetická DNA (ix) Opis sekvencie: SEQ ID NO: 37:

ACAAAGCTrA GCGCTACCTC ACCATCTCCA GCCTCCAGCC TGAGGA _4g (2) Informácie pre SEQ ID NO: 38:

(i) Charakteristika sekvencie:

(A) Dĺžka: 111 párov báz (B) Typ: nukleová kyselina (C) Reťazec: jednoduchý (D) Topológia: lineárna (ii) Typ molekuly: iná nukleová kyselina (A) Opis: /opis = „syntetická DNA (ix) Opis sekvencie: SEQ ID NO: 38:

CTTGGATCCG GCCTCACCTA CGACGGTCAG T1TGGTCCCT CCGCCCAACA OGTACACAAA ₆₀

TTCTTOCTTA AITGTATCAC CCACACCACA GATATAGTCA GCCTCATOCT C lll (2) Informácie pre SEQ ID NO: 39:

(i) Charakteristika sekvencie:

(A) Dĺžka: 42 párov báz (B) Typ: nukleová kyselina (C) Reťazec: jednoduchý (D) Topológia: lineárna (ii) Typ molekuly: iná nukleová kyselina (A) Opis: /opis = „syntetická DNA (ix) Opis sekvencie: SEQ ID NO: 39:

CTTCTCTGGC TGCTCCTGAT ACCATTCAAT GGTGTAOGTA CT

105 (2) Informácie pre SEQ ID NO: 40:

(i) Charakteristika sekvencie:

(A) Dĺžka: 26 párov báz (B) Typ: nukleová kyselina (C) Reťazec: jednoduchý (D) Topológia: lineárna (ii) Typ molekuly: iná nukleová kyselina (A) Opis: /opis = „syntetická DNA (ix) Opis sekvencie: SEQ ID NO: 40:

<r.A(iľ.Gccrr ii’mwjciV. cnrn;

(2) Informácie pre SEQ ID NO: 41:

(i) Charakteristika sekvencie:

(A) DÍžka: 35 párov báz (B) Typ: nukleová kyselina (C) Reťazec: jednoduchý (D) Topológia: lineárna (ii) Typ molekuly: iná nukleová kyselina (A) Opis: /opis = „syntetická DNA (ix) Opis sekvencie: SEQ ID NO: 41:

GAGAAGGGCC CTARGTACST GATGRAWCTT AAGCA (2) Informácie pre SEQ ID NO: 42:

(i) Charakteristika sekvencie:

(A) DÍžka: 35 párov báz (B) Typ: nukleová kyselina (C) Reťazec: jednoduchý (D) Topológia: lineárna (ii) Typ molekuly: iná nukleová kyselina (A) Opis: /opis = „syntetická DNA (ix) Opis sekvencie: SEQ ID NO: 42:

CACGAATTCA CTATCGATTC TGCAACCTľC AGAGG

106 (2) Informácie pre SEQ ID NO: 43:

(i) Charakteristika sekvencie:

(A) Dĺžka: 18 párov báz (B) Typ: nukleová kyselina (C) Reťazec: jednoduchý (D) Topológia: lineárna (ii) Typ molekuly: iná nukleová kyselina (A) Opis: /opis = „syntetická DNA (ix) Opis sekvencie: SEQ ID NO: 43:

GGCTTCGAGC TCCTCAGA

Informácie pre SEQ ID NO: 44:

(i) Charakteristika sekvencie:

(A) DÍžka: 20 párov báz (B) Typ: nukleová kyselina (C) Reťazec: jednoduchý (D) Topológia: lineárna (ii) Typ molekuly: iná nukleová kyselina (A) Opis: /opis = „syntetická DNA (ix) Opis sekvencie: SEQ ID NO: 44:

GACAGTCGTT (ΑΑΛΰΤΤΊΤΤ

107 (2) Informácie pre SEQ ID NO: 45:

(i) Charakteristika sekvencie:

(A) Dĺžka: 118 aminokyselín (B) Typ: aminokyselinová (D) Topológia: lineárna (ii) Typ molekuly: proteín (ix) Opis sekvencie: SEQ ID NO: 45:

Gin Leu Val Leu Thr Gin Ser Ser Ser Ala Ser Phe Ser Leu Gly

10 15

Ala Ser Ala l.ys Leu Thr Cys Thr Leu Ser Ser Gin llis Ser Thr

25 30

Tyr Thr íle Glu Trp Tyr Gin Gin Gin Pro Leu Lys Pro Pro Lys 35 40 45

Tyr Val Het Asp Leu Lys Gin Asp Gly Ser llis Ser Thr Gly Asp 50 55 60

Gly íle Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Ser Ser Gly Ala Asp Arg

70 75 lyľ Leu Ser lle Ser Asii Ile Gin Pro Glu Asp Glu Ala Mri Tvr

85 90

11c Cys Gly Val Gly Asp Thr 11c Lys Glu Gin Phe Val ľyr Val

100 105

Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Thr Val Leu Gly Gin Pro

110 115 (2) Informácie pre SEQ ID NO: 46:

(i) Charakteristika sekvencie:

(A) Dĺžka: 118 aminokyselín (B) Typ: aminokyselinová (D) Topológia: lineárna (ii) Typ molekuly: proteín (ix) Opis sekvencie: SEQ ID NO: 46:

10Β

Glu Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Asp Leu Val Lys Pro Gly 15 10 15

Gly Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser 20 25 30

Ser Tyr Gly Met Ser Trp íle Arg Gin Thr Pro Asp Lys Arg Leu 35 40 45

Glu Trp Val Ala Thr 11c Ser Ser Gly Gly Ser Tyr Thr Tyr Tyr 50 55 60

Pro Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr íle Ser Arg Asp Asn Ala 65 70 75

Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gin Met Ser Ser Leu Lys Ser Glu Asp 80 85 90

Thľ Ala Met Phe Tyr Cys Ala Arg Gin Thr Thr Met Thr Tyr Phe 95 100 105

Aln ľyr Trp Gly Gin Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala

110 115 (2) Informácie pre SEQ ID NO: 47:

(i) Charakteristika sekvencie:

(A) DÍžka: 116 aminokyselín (B) Typ: aminokyselinová (D) Topológia: lineárna (ii) Typ molekuly: proteín (ix) Opis sekvencie: SEQ ID NO: 47:

Gin Leu Val Leu Thr Gin Ser Pro Ser Ala Ser Ala Ser Leu Gly

10 15

Ala Ser Val Lys Leu Thr Cys Thr Leu Ser Ser Gin His Ser Thr

109

Tyr Thr íle Glu Trp His Gin Gin Gin Pro Glu Lys Gly Pro Arg

40 45

Tyr Leu Met Lys Leu Lys Gin Asp Gly Ser ilis Ser Thr Gly Asp

55 60

Gly íle Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Ser Ser Gly Ala Glu Arg

70 75

Tyr Leu Thr II»· Ser Ser Leu Gin Ser Glu Asp Glu Aln Asp Tyr

A) 85 90 ľyr C»s Gly Val Gly Asp Thr 11c Lys Glu Gin Phe Val Tyr Val

100 105

Phe Gly GJy Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly

110 115 (2) Informácie pre SEQ ID NO: 48:

(i) Charakteristika sekvencie:

(A) DÍžka: 118 aminokyselín (B) Typ: aminokyselinová (D) Topológia: lineárna (ii) Typ molekuly: proteín (ix) Opis sekvencie: SEQ ID NO: 48:

Gin Leu Val Leu Thr Gin Ser Pro Ser Ala Ser Ala Ser Leu Gly 15 10 15

Ala Ser Val L/a leu Thr Cys Thr Leu Ser Ser Gin His Ser Thr

110

Tyr Thr T Je Clu Trp Tyr Cln Gin Gin Pro Glu Lys Gly Pro Lys

40 45

Tyr Leu Het Asp Leu Lys Gin Asp Gly Ser His Ser Thr Gly Asp

55 60

Gly 11c Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Ser Ser Gly Ala Glu Arg

70 75

Tyr Leu Tlir 11c ber Ser Leu Gin Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr

85 90

Tyr Cys Gly Val Gly Asp Thr íle Lys Glu Gin Phe Val Tyr Val

100 105

Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Gin Pro

110 115 (2) Informácie pre SEQ ID NO: 49:

(i) Charakteristika sekvencie:

(A) DÍžka: 118 aminokyselín (B) Typ_: aminokyselinová (D) Topológia: lineárna (ii) Typ molekuly: protein (ix) Opis sekvencie: SEQ ID NO: 49:

Gin Leu Val Leu Thr Gin Ser Pro Ser Ala Ser Ala Ser Leu Gly

10 15

Ala Ser Val Lys Leu Thr Cys Thr Leu Ser Ser Gin His Ser Thr

25 30

Tyr Thr íle Glu Trp Tyr Gin Gin Gin Pro Glu Lys Gly Pro Lys

40 45

Tyr Val Met Asp Leu Lys Gin Asp Gly Ser His Ser Thr Gly Asp

55 60

Gly íle Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Ser Ser Gly Ala Glu Arg

111

70 75

Tyr Leu Thr Íle Ser Ser Leu Gin Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr

85 90

Tyr Cys Gly Val Gly Asp Thr íle Lys Glu Gin Phe Val Tyr Val

100 105

Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Gin Pro

110 115 (2) Informácie pre SEQ ID NO: 50:

(i) Charakteristika sekvencie:

(A) DÍžka: 118 aminokyselín (B) Typ: aminokyselinová (D) Topológia: lineárna (ii) Typ molekuly: proteín (ix) Opis sekvencie: SEQ ID NO: 50:

Gin Leu Val Leu Thr Gin Ser Pro Ser Ala Ser Ala Ser Leu Gly 15 10 15

Ala Ser Val Lys Leu Thr Cys Thr Leu Ser Ser Gin His Ser Thr 20 25 30

Tyr Thr íle Glu Trp Tyr Gin Gin Gin Pro Glu Lys Gly Pro Arg 35 40 45

Tyr Leu Mei Asp Leu Lys Gin Asp Gly Ser His Ser Thr Gly Asp 50 55 60

Gly íle Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Ser Ser Gly Ala Glu Arg 65 70 75 lyr Leu Thr íle Ser Ser Leu Gin Scr Glu Asp Glu Ala Asp Tyr

85 90

Tvr Cys Gly Val Gly Asp Thr Ilc Lys Glu Gin Phe Val Tyr Val

100 105 l’he Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Gin Pro

110

115

112 (2) Informácie pre SEQ ID NO: 51:

(i) Charakteristika sekvencie:

(A) Dĺžka: 118 aminokyselín (B) Typ: aminokyselinová (D) Topológia: lineárna (ii) Typ molekuly: proteín (ix) Opis sekvencie: SEQ ID NO: 51:

Gin Leu Val Leu Thr Gin Ser Pro Ser Ala Ser Ala Ser Leu Gly

10 15

Ala Ser Val Lys Leu Thr Cys Thr Leu Ser Ser Gin His Ser Thr

25 30

Tyr Thr íle Glu Trp Tyr Gin Gin Gin Pro Glu Lys Gly Pro Arg

40 45

Tyr Val Met Asp Leu Lys Gin Asp Gly Ser His Ser Thr Gly Asp

55 60

Gly íle Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Ser Ser Gly Ala Glu Arg 65 70 75

Tys Leu Thr íle Ser Ser Leu Gin Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr

85 90 ľys Cvs í'.ly Val Gly Asp Thr Íle l.ys Glu Gin Phe Val Tyr Val

100 105

Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Gin Pro

110 115 (2) Informácie pre SEQ ID NO: 52:

(i) Charakteristika sekvencie:

(A) Dĺžka: 118 aminokyselín (B) Typ: aminokyselinová (D) Topológia: lineárna (ii) Typ molekuly: proteín (ix) Opis sekvencie: SEQ ID NO: 52:

113

Gin Leu Val l.eu Thr Gin Ser Pro Ser Ala Ser Ala Ser Leu Gly

10 15

Ala Ser »<»1 l.ys Leu Thr Cys Thr Leu Ser Ser Gin His Ser Thr

25 30

Tyr Thr llc Glu Trp Tyr Gin Gin Gin Pro Glu Lys Gly Pro Lys

40 45

Tyr Leu Met Asp Leu Lys Gin Asp Gly Ser His Ser Thr Gly Asp

55 60

Gly íle Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Ser Ser Gly Ala Glu Arg

70 75

Tyr l.eu Thr íle Ser Ser Leu Gin Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr

85 90 llc Cys Gly Val Gly Asp Thr lle Lys Glu Gin Phe Val Tyr Val

100 105

Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Gin Pro

110 115 (2) Informácie pre SEQ ID NO: 53:

(i) Charakteristika sekvencie:

(A) Dĺžka: 118 aminokyselín (B) Typ: aminokyselinová (D) Topológia: lineárna (ii) Typ molekuly: protein (ix) Opis sekvencie: SEQ ID NO: 53:

Gin Leu Val Leu Thr Gin Ser Pro Ser Ala Ser Ala Ser Leu Gly

10 15

Ala Ser Vai Lys Leu Thr Cys Thr Leu Ser Ser Gin His Ser Thr

25 30

Tyr Thr íle Glu Trp Tyr Gin Gin Gin Pro Glu Lys Gly Pro Arg

40 45

Tyr Leu Mei Asp Leu Lys Gin Asp Gly Ser His Ser Thr Gly Asp

55 60

Gly llc Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Ser Ser Gly Ala Glu Arg

114

70 75

Tyr Leu Thr lle Ser Scr l.eu Gin Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr

85 90

IIc Cys Glv Val Gly Asp Thr lle l.ys Glu Gin Phe Val Tyr Val

100 105

Phc Glv Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Gin Pro

110 115 (2) Informácie pre SEQ ID NO: 54:

(i) Charakteristika sekvencie:

(A) Dĺžka: 118 aminokyselín (B) Typ: aminokyselinová (D) Topológia: lineárna (ii) Typ molekuly: proteín (ix) Opis sekvencie: SEQ ID NO: 54:

Gin Leu Val Leu Thr Gin Ser Pro Ser Ala Ser Ala Ser Leu Gly i s IO 16

Ala Ser Val Lys Lud Thr Cys Thr Leu Ser Ser Gin His Ser Thr

25 30

Tyr Thr lle Glu Trp Tyr Gin Gin Gin Pro Glu Lys Gly Pro Lys

40 45

Tyr Val Mei Asp Leu Lys Gin Asp Gly Ser His Ser Thr Gly Asp

55 60

Gly íle Pro Asp Arg Phe Scr Gly Ser Ser Ser Gly Ala Glu Arg

70 75

Tyr l.eu Thi lle Ser Ser Leu Gin Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr

85 90

11«· Cys Gly Val Gly Asp Thr íle Lys Glu Gin Phe Val Tyr Val

100 105

Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Gin Pro

110

115

115 (2) Informácie pre SEQ ID NO; 55:

(i) Charakteristika sekvencie:

(A) DÍžka: 118 aminokyselín (B) Typ: aminokyselinová (D) Topológia: lineárna (ii) Typ molekuly: proteín (ix) Opis sekvencie: SEQ ID NO: 55:

Gin Leu Val Leu Thr Gin Ser Pro Ser Ala Ser Ala Ser Leu Gly

10 15

Ala Ser Val l.ys Leu Thr Cys 1hr Leu Ser Ser Gin His Ser Thr

25 30

Tyr Thr íle Glu Trp Tyr Gin Gin Gin Pro Glu Lys Gly Pro Arg

40 45

Tyr Val Met Asp Leu Lys Gin Asp Gly Ser His Ser Thr Gly Asp

55 60

Gly íle Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Ser Ser Gly Ala Glu Arg 65 70 75

Tyr Leu Thr íle Ser Ser Leu Gin Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr

85 90

Ile Cys Gly Val Gly Asp Thr IIe l.ys Glu Gin Phe Val Tyr Val

100 105

Phe Gly Gly Gly Thr l.ys Leu Thr Val Leu Gly Gin Pro

110 115 (2) Informácie pre SEQ ID NO: 56:

(i) Charakteristika sekvencie:

(A) DÍžka: 118 aminokyselín (B) Typ: aminokyselinová (D) Topológia: lineárna (ii) Typ molekuly: proteín (ix) Opis sekvencie: SEQ ID NO: 56:

116

Gin Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gin Pro Gly

5 10 15

Arg Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser

25 30

Ser Tyr Gly Met Ser Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu

40 45

Glu Trp Val Ala Thr íle Ser Ser Gly Gly Ser Tyr Thr Tyr Tyr

55 60

Pro Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr íle Ser Arg Asp Asn Ser

70 75

l.ys Asn Thr l.eu Tyr Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp

85 90 |hr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Gin Thr Thr Met Thr Tyr Phe

100 105

Ala Tyr Trp Gly Gin Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

110 115 (2) Informácie pre SEQ ID NO: 57:

(i) Charakteristika sekvencie:

(A) Dĺžka: 411 párov báz (B) Typ: nukleová kyselina (C) Reťazec: dvojitý (D) Topológia: lineárna (ii) Typ molekuly: cDNA k mRNA (ix) Opis sekvencie: SEQ ID NO: 57:

A1G AAC TTC GGG CTC AGC TTC ATT TTC CH GCC CTC ATT TTA AAA Met Asn Phe Gly Leu Ser Leu íle Phe Leu Ala Leu íle Leu Lys

-15 -10 -5

GGT GTC CAG TCT GAG GTC CAA CTC GTC GAG TCT GGG GCA CAC TTA Gly Val Gin Cys Glu Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Asp Leu

I 5 10

CTG AAG CCT GGA GGG TCC CTC AAA CTC TCC TGT GCA GCC TCT GGA Val Lys Pro Gly Gly Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly

135

117

20 25

TTC ACT ľl'C AGT AGC TAT GGC ATC TCT IGG AK OGC CAG ACT CCA IHO ľlie Thr Phe Ser Ser lyr Gly Met Ser Trp íle Arg Gin Thr Pro

35 40

GAC AAG AGG CIG GAG IGG GTC GCA ACC ΑΤΓ AGT AGT GGT GGT AGT 225

Asp l.ys Arg Leu Glu Trp Val Ala Thr Ue Ser Ser Gly Gly Ser

50 55

TAC ACC TAC TAT CGA GAC AGT GTC AAG GGG OGA TTC ACC ATC TCC 270

Tyr Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr I ie Ser

65 70

AGA GAC AAT GCC AAG AAC ACC CTA TAC CTG CAA ATC AGC AGT CIC 315

Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gin Met Ser Ser Leu

80 85

AAG TCT GAG GAC ACA GCC ATC TTT TAC TCT GCA AGA CAG ACT ACT 360

Lys Ser Glu Asp Thr Ala Met Phe Tyr Cys Ala Arg Gin Thr Thr

95 100

ATC ACT TAC ITT GCT TAC TCG GGC CAA GGG ACT CIG GTC ACT GTC 405

Met ľhr Tyr Phe Ala Tyr Trp Gly Gin Gly Thr Leu Val Thr Val

105 110 115

TCT GCA 411

Ser Ala (2) Informácie pre SEQ ID NO: 58:

(i) Charakteristika sekvencie:

(A) DÍžka: 411 párov báz (B) Typ: nukleová kyselina (C) Reťazec: dvojitý (D) Topológia: lineárna (ii) Typ molekuly: cDNA k mRNA (ix) Opis sekvencie: SEQ ID NO: 58:

118

ATC Gtr, ΓΓΓ GGG CTC AGC TGG GTT TTC CTC GTT GCT CTT TO AGA 45

Gly P^Ke Gly Leu Ser Trp Val Phe Leu Val Ala Leu Leu Arg

-15 -10 -5

GGT G1C CAG TCT CAG GTC CAG CTC GTG GAG TCT GGG GGA GGC GTC 90

Gly Val Gin Cys Gin Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val l 5 10

GTC CAG CCT GGG AGG TCC CTC AGA CTC TCC TGT GCA GCC TCT GGA 135

Val Gin Pro Gly Arg Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly

20 25

TTC ACC TTC AGT AGC TAT GGC ATC TCT TGG GTC CGC CAG GCT CCA 180

Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Gly Met Ser Trp Val Arg Gin Ala Pro

35 40

GGC AAG GGG CTC GAG TGG GTG GCA AOC ATT AGT AGT GGT GGT AGT 225

Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala Thr íle Ser Ser Gly Gly Ser

50 55

TAC ACC TAC ΤΛΤ CCA GAC AGT GTG AAG GGG OGA TTC ACC ATC TCC 270

Tvr Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr íle Ser

65 70

AGA GAC ΛΛΤ TCC AAG AAC ACG CTG TAT CTG CAA ATC AAC AGC CTG 315

Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gin Met Asn Ser Leu

80 85

AGA GCT GAG GAC ACG GCT GTG TAT TAC TGT GGG AGA CAG ACT ACT 360

Arg Aln Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Gin Thr Thr 90 95 100

Alf. ACľ TAC ΤΤΓ GCT TAC TGG (X^-,C CAG GGA ACC CIG GTC ACC GTC 405

Met Thr Tu ľhe Ala Tyr Trp Glv Gin Gly Thr Leu Val Thr Val

105 HO 115 τπ; ιγλ -m

Ser Ser

119 (2) Informácie pre SEQ ID NO: 59:

(i) Charakteristika sekvencie:

(A) Dĺžka: 11 aminokyselín (B) Typ: aminokyselinová (D) Topológia: lineárna (ii) Typ molekuly: peptid (ix) Opis sekvencie: SEQ ID NO: 59:

Lys Ala Ser Gin Asp Val Asn Thr Ala Val Ala

5 10 (2) Informácie pre SEQ ID NO: 60:

(i) Charakteristika sekvencie:

(A) Dĺžka: 7 aminokyselín (B) Typ: aminokyselinová (D) Topológia: lineárna (ii) Typ molekuly: peptid (ix) Opis sekvencie: SEQ ID NO: 60:

Lys Ala Ser Gin Asp Val Asn Thr Ala Val Ala

5 10 (2) Informácie pre SEQ ID NO: 61:

(i) Charakteristika sekvencie:

(A) DÍžka: 9 aminokyselín (B) Typ: aminokyselinová (D) Topológia: lineárna (ii) Typ molekuly: peptid (ix) Opis sekvencie: SEQ ID NO: 61:

Gin Gin His Tyr Ser Thr Pro Phe Thr

5 (2) Informácie pre SEQ ID NO: 62:

(i) Charakteristika sekvencie:

(A) DÍžka: 5 aminokyselín (B) Typ: aminokyselinová (D) Topológia: lineárna (ii) Typ molekuly: peptid (ix) Opis sekvencie: SEQ ID NO: 62:

Pro Tyr Trp Mei Gin

120 (2) Informácie pre SEQ ID NO: 63:

(i) Charakteristika sekvencie:

(A) DÍžka: 11 aminokyselín (B) Typ: aminokyselinová (D) Topológia: lineárna (ii) Typ molekuly: peptid (ix) Opis sekvencie: SEQ ID NO: 63:

Ser íle Phe Gly. Asp Gly Asp Thr Arg Tyr Ser Gin Lys Phe Lys Gly

10 15 (2) Informácie pre SEQ ID NO: 64:

(i) Charakteristika sekvencie:

(A) DÍžka: 11 aminokyselín (B) Typ: aminokyselinová (D) Topológia: lineárna (ii) Typ molekuly: peptid (ix) Opis sekvencie: SEQ ID NO: 64:

Gly Leu Arg Arg Gly Gly Tyr Tyr Phe Asp Tyr

5 10 (2) Informácie pre SEQ ID NO: 65:

(i) Charakteristika sekvencie:

(A) DÍžka: 411 párov báz (B) Typ: nukleová kyselina (C) Reťazec: dvojitý (D) Topológia: lineárna (ii) Typ molekuly: cDNA k mRNA (ix) Opis sekvencie: SEQ ID NO: 65:

ATG GCC TGG ACT CCT CTC TTC TTC TľC ITT GTT CTT CAT TGC TCA 45

Het Ala Trp Thr Pro Leu Phe Phe Phe Phe Val Leu His Cys Ser

-15 -10 -5

GGT TCT TTC TCC CAA CTT GTG CTC ACT CAG TCA TCT TCA GCC TCT 90 Gly Ser Phe Ser Gin Leu Val Leu Thr Gin Ser Ser Ser Ala Ser

5 10

TTC TCC CTC GCA GCC TCA GCA AAA CTC ACG TGC ACC TTG AGT AGT 135 Phe Ser Leu Gly Ala Ser Ala Lys Leu Thr Cys Thr Leu Ser Ser

121

CAG CAC AGT ACG TAC ACC ATT GAA TGG ΤΛΤ CAG CAA CAG CCA CIC 180

Gin His Ser Thr Tyr Thr íle Glu Trp Tyr Gin Gin Gin Pro Leu

35 40

AAG CCT CCT AAG TAT GTG ATG GAT CTT AAG CAA GAT GGA AGC CAC 225

Lys Pro Pro Lys Tyr Val Met Asp Leu Lys Gin Asp Gly Ser His *15 50 55

AGC ACA GGT GAT GGG ATT CCT GAT CGC TTC TCT GGA TCC AGC TCT 270

Ser Thr Gly Asp Gly íle Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Ser Ser

65 70

GGT GCT GAT CGC TAC CTT AGC ATT ICC AAC ATC CAG CCA GAA GAT 315

Gly Ala Asp Arg Tyr Leu Ser íle Ser Asn íle Gin Pro Glu Asp

80 85

GAA GCA ATG TAC ATC TGT GGT GTG GGT GAT ACA ATT AAG GAA CAA 360

Glu Ala Met Tyr íle Cys Gly Val Gly Asp Thr íle Lys Glu Gin

95 100

TTT GTG TAT GTľTTC GGC GGT GGG ACC AAG GTC ACT GTC CTA GGT 405

Phe Val Tyr Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Thr Val Leu Gly

105 110 115

CAG CCC 411

Gin Pro (2) Informácie pre SEQ ID NO: 66:

(i) Charakteristika sekvencie:

(A) Dĺžka: 405 párov báz (B) Typ: nukleová kyselina (C) Reťazec: dvojitý (D) Topológia: lineárna (ii) Typ molekuly: cDNA k mRNA (ix) Opis sekvencie: SEQ ID NO: 66:

122

ATC GCC TO ACT CCT CTC TTC TTC TTC HT GH CH CAT TO TCA 45

Met Akí Trp Thr Pro Leu Phe Phe Phe Phe Val Leu His Cys Ser

-15 -10 -5

GGT TCT TTC TCC CAG CTT GTG CTG ACT CAA TCG CCC TCT GCC TCT 90

Gly Ser Phe Ser Gin Leu Val Leu Thr Gin Ser Pro Ser Ala Ser

5 10

GCC TCC CTG GGA GCC TCG GTC AAG CTC ACC TGC ACC TTG AGT AGT 135

Ala Ser Leu Gly Ala Ser Val Lys Leu Thr Cys Thr Leu Ser Ser

20 25

CAG CAC AGT ACG TAC ACC AH GAA TO CAT CAG CAG CAG CCA GAG 180

Gin His Ser Thr Tyr Thr íle Glu Trp His Gin Gin Gin Pro Glu

35 40

AAG GGC CCT CGG TAC TTG ATG AAA CH AAG CAA GAT GGA AGC CAC 225

Lys Gly Pro Arg Tyr Leu Met Lys Leu Lys Gin Asp Gly Ser His

50 55

AGC ACA GGT GAT GGG AH CCT GAT CGC TTC TCA GGC TCC AGC TCT 270

Ser Thr Gly Asp Gly íle Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Ser Ser

65 70

GGG GCT GAG CGC TAC CTC ACC ATC TCC AGC CTC CAG TCT GAG GAT 315

Gly Ala Glu Arg Tyr Leu Thr íle Ser Ser Leu Gin Ser Glu Asp

80 85

GAG GCT GAC TAT TAC TCT GGT GTC GGT GAT ACA AH AAG GAA CAA 360

Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gly Val Gly Asp Thr íle Lys Glu Gin

95 100

HT G IG ΓΛί GTG Π C GGC GGA (XX! ACC ΛΛΛ CIG ACC GTC CTA GGT 405

Phe V;iI Tvi V.-i| ľhc Gly Gly Glv Thr l.ys Leu Thr Val Leu Gly

10:'» 110 115

123 (2) Informácie pre SEQ ID NO: 67:

(i) Charakteristika sekvencie:

(A, Dĺžka: 411 párov báz (B) Typ: nukleová kyselina (C) Reťazec: dvojitý (D) Topológia: lineárna (ii) Typ molekuly: cDNA k mRNA (ix) Opis sekvencie: SEQ ID NO: 67:

ATC GCC TCG ACT CCT CTC TTC TTC TTC ITT GTT CTT CAT TGC TCA Met Ala Trp Thr Pro Leu Phe Phe Phe Phe Val Leu His Cys Ser

-15 -10 -5

GGT TCT TTC TCC CAG CTT GTC CTG ACT CAA TCC CCC TCT GCC TCT

Gly Ser Phe Ser Gin Leu Val Leu Thr Gin Ser Pro Ser Ala Ser

5 10

GCC TCC CTC GGA GCC TCG GTC AAG CTC AGC TCC AGC TTC AGT AGT

Ala Ser Leu Gly Ala Ser Val Lys Leu Thr Cys Thr Leu Ser Ser

20 25

CAG CAC AGT AOG TAC ACC ATT GAA TCG TAT CAG CAG CAG CCA GAG

Gin His Ser Thr Tyr Thr íle Glu Trp Tyr Gin Gin Gin Pro Glu

124

35 40

ΛΑΟ GGC CCT AAG TAC CTC ATT. GAT CIT AAG CAA GAT GGA AGC CAC 225

Lys Glv Pro l.»s Tyr Leu Met Asp Leu Lys Gin Asp Gly Ser His

50 55

AGC ACA GGT GAT GGG ATT CCT GAT CGC TTC TCA GGC TCC AGC TCT 270

Ser Thr Gly Asp Gly íle Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Ser Ser

65 70

GGG GCT GAG CGC TAC CTC ACC ATC TCC AGC CTC CAG TCT GAG GAT 315

Gly Ala Glu Arg Tyr Leu Thr íle Ser Ser Leu Gin Ser Glu Asp

80 85

GAG GCT GAC TAT TAC TGT GGT GTG GGT GAT ACA AK AAG GAA CAA 360

Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gly Val Gly Asp Thr íle Lys Glu Gin

95 100

ITT GTG TAC GTG TTC GGC GGA GGG ACC AAA CTG ACC GTC CTA GGC 405

Phe Val Tyr Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly

105 110 115

CAG CCC 411

Gin Pro (2) Informácie pre SEQ ID NO: 68:

(i) Charakteristika sekvencie:

(A) DÍžka: 411 párov báz (B) Typ: nukleová kyselina (C) Reťazec: dvojitý (D) Topológia: lineárna (ii) Typ molekuly: cDNA k mRNA (ix) Opis sekvencie: SEQ ID NO: 68:

125

ATG GCC TGG ACT CCT CTC TTC TTC TTC TTT GTT CTT CAT TGC TCA 45

Met Ala Trp Thr Pro Leu Phe Phe Phe Phe Val Leu His Cys Ser

-15 -10 -5

GGT TCT TTC TCC C?G CTT GTC CTG ACT CAA TCG CCC TCT GCC TCT 90

Gly Ser Phe Ser Gin Leu Val Leu Thr Gin Ser Pro Ser Ala Ser

5 10

GCC TCC CTG GGA GCC TCG GTC AAG CTC ACC TGC ACC TTG AGT AGT 135

Ala Ser Leu Gly Ala Ser Val Lys Leu Thr Cys Thr Leu Ser Ser

20 25

CAG CAC AGT ACG TAC ACC ATT GAA TGG ΤΛΤ CAG CAG CAG CCA GAG 180

Gin His Ser Thr Tyr Thr íle Glu Trp Tyr Gin Gin Gin Pro Glu

35 40

AAG GGC CCT AAG TAC GTG ATG GAT CTI AAG CAA GAT GGA AGC CAC 225

Lys Gly Pro Lys Tyr Val Met Asp Leu Lys Gin Asp Gly Ser His

50 55

AGC ACA GGT GAT GGG ATT CCT GAT CGC TTC TCA GGC TCC AGC TCT 270

Ser Thr Gly Asp Gly íle Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Ser Ser

65 70

GGG GCT GAG CGC TAC CTC ACC ATC TCC AGC CTC CAG TCT GAG GAT 315

Gly Ala Glu Arg Tyr Leu Thr íle Ser Ser Leu Gin Ser Glu Asp

80 85

GAG GCT GAC TAT TAC TGT GGT GTC GGT GAT ACA ATT AAG GAA CAA 360

Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gly Val Gly Asp Thr íle Lys Glu Gin

95 100

ΓΓΓ GTG TAC GTC TTC GGC GGA GGG ACC ΑΛΛ CTG ACC GTC CTA CGC 405

Ρ1ι«· Val |y,- Val ľhe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val I.c Gly ^|(15 110 lift í'At: í cc m

Gin l'ľn

126 (2) Informácie pre SEQ ID NO: 69:

(i) Charakteristika sekvencie:

(A, DÍžka: 411 párov báz (B) Typ: nukleová kyselina (C) Reťazec: dvojitý (D) Topológia: lineárna (ii) Typ molekuly: cDNA k mRNA (ix) Opis sekvencie: SEQ ID NO: 69:

ATG GCC TGG ACT CCT CTC TTC TTC TTC TTT GTT CTT CAT TGC TCA 45

Met Ala Trp Thr Pro Leu Phe Phe Phe Phe Val Leu His Cys Ser

-15 -10 -5

GGT TCT TTC TCC CAG CTT GTG CTG ACT CAA TCG CCC TCT GCC TCT 90

Gly Ser Phe Ser Gin Leu Val Leu Thr Gin Ser Pro Ser Ala Ser

5 10

GGC TCC CTG GGA GCC TOG GTC AAG CTC ACC TGC ACC TTC AGT AGT 135

Ala Ser Leu Gly Ala Ser Val Lys Leu Thr Cys Thr Leu Ser Ser

20 25

CAG CAC AGT AOG TAC ACC ATT GAA TGG TAT CAG CAG CAG CCA GAG 180

Gin His Ser Thr Tyr Thr íle Glu Trp Tyr Gin Gin Gin Pro Glu

35 40

AAG GGC (C1 A(k; lAC CIG ATG GAT CIT AAG CAA GAT GGA AGC CAC 225

I.y.» Gly Pro Λικ Τνι Leu Met Asp Leu Lys Gin Asp Gly Ser His

50 55

AGC ACA GGT Ιί-VI G ÍG ATT CCT GAT CCC TTC TCA GGC TCC AGC TCT 270

127

315

Ser Thr Gly Asp Gly lle Pro Asp Arg Phc Ser Gly Ser Ser Ser

65 70

GGG GCT GAG CGC TAC CTC ACC ATC TCC AGC CTC CAG TCT GAG GAT

Gly Ala Glu Arg Tyr Leu Thr íle Ser Ser Leu Gin Ser Glu Asp

80 85

GAG GCT GAC TAT TAC TCT GGT GTG GGT GAT ACA AK AAG GAA CAA

Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gly Val Gly Asp Thr íle Lys Glu Gin

95 100

KT GTC TAC GTC KC GGC GGA GGG ACC AAA CTC ACC GTC CTA GGC

Phe Val Tyr Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly

105 110 115

CAG CCC 411

Gin Pro (2) Informácie pre SEQ ID NO: 70:

(i) Charakteristika sekvencie:

(A) Dĺžka: 411 párov báz (B) Typ: nukleová kyselina (C) Reťazec: dvojitý (D) Topológia: lineárna (ii) Typ molekuly: cDNA k mRNA (ix) opis sekvencie: SEQ ID NO: 70:

360

405

128 αίγ, co: τπ; act cct ctc rrc ttc

Met A!:·, ľi-p Thr Pro Leu Phe Phe ggt icr rrc tcc cag ctt gtc ctg

Gly Ser Phe Ser Gin Leu Val Leu

GCC TCC CTG GGA GCC TCG GTC AAG

Ala Sei Leu Gly Ala Ser Val Lys

CAG CAC AGT ACG TAC ACC ATT GAA

Gin His Ser Thr Tyr Thr íle Glu

AAG GGC CCľ AGG TAC GTC ATC GAT

Lys Gly Pro Arg Tyr Val Met Asp

AGC ACA GGT GAT GGG ATT CCT GAT

Ser Thr Gly Asp Gly íle Pro Asp

GGG (XT GAG CGC TAC CTC ACC ATC

Gly Ala Glu Arg Tyr Leu Thr íle

GAG iXT GAC ΤΛΤ TAC TCT GGT GTC

Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gly Val

TTT GTG TAC GTC TTC GGC GGA GGG

Phe Val Tyi Val Phe Gly Gly Gly

105

CAG CCC 111

TTC ΤΓΤ GTT CTT CAT TCC TCA 45

Phe Phe Val Leu His Cys Ser

-10 -5

ACT ΓΛΑ TCG CCC TCT GCC TCT 90

Thr Gin Ser Pro Ser Ala Ser

10

CTC ACC TCC ACC TTC AGT AGT 135

Leu Thr Cys Thr Leu Ser Ser

25

TCG TAT CAG CAG CAG CCA GAG 180

Trp Tyr Gin Gin Gin Pro Glu

40

CTT AAG CAA GAT GGA AGC CAC 225

Leu Lys Gin Asp Gly Ser His

55

CGC TTC TCA GGC TCC AGC TCT 270

Arg	Phe	Ser	Gly	Ser	Ser	Ser
65					70
TCC	AGC	CTC	CAG	TCT	GAG	GAT
Ser	Ser	Leu	Gin	Ser	Glu	Asp
80					85
GGT	GAT	ALA	ATT	AAG	GAA	CAA
Gly	Asp	Thr	íle	Lys	Glu	Gin
95					100
ACC	ΛΛΛ	CTG	ACC	GTC	CTA	GGC
Thr	Lys	Leu	Thr	Val	Leu	Gly

110 115

Gin Pro

129 (2) Informácie pre SEQ ID NO: 71:

(i) Charakteristika sekvencie:

(A) Dĺžka: 411 párov báz (B) Typ: nukleová kyselina (C) Reťazec: dvojitý (D) Topológia: lineárna (ii) Typ molekuly: cDNA k mRNA (ix) Opis sekvencie: SEQ ID NO: 71:

ATG GCC TGG ACT CCT CTC TTC TTC TTC TTT GTT CTT CAT TGC TCA 45

Met Ala Trp Thr Pro Leu Phe Phe Phe Phe Val Leu His Cys Ser

-15 -10 -5

GGT TCT TTC TCC CAG CTT GTG CTC ACT CAA TCG OOC TCT GCC TCT 90

Gly Ser Phe Ser Gin Leu Val Leu Thr Gin Ser Pro ser Ala Ser

5 10

GCC TCC CTG GGA GCC TCG GTC AAG CTC ACC TGC ACC TTG AGT AGT 135

Ala Ser Leu Gly Ala Ser Val Lys Leu Thr Cys Thr Leu Ser Ser

20 25

CAG CAC AGT ACG TAC ACC AK GAA TCG TAT CAG CAG CAG CCA GAG 180

Gin His Ser Thr Tyr Thr íle Glu Trp Tyr Gin Gin Gin Pro Glu

3U^- 35 10

AAG GGC CCT AAG TAC CTC ATC GAT CTT AAG CAA GAT (ΧίΛ AGC CAC 225

Lys Gly Pro l.ys Tyr Leu Mel Asp Leu Lys Gin Asp Gly Ser Ihs

I5 50 55

ACC ACA GGT GAT GGG ΑΤΓ CCT GAT CGC TTC TCA GGC TCC AGC TCT 270

130

315

Ser Thr Gly Asp Gly Íle Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Ser Ser

65 70

GGG GCT GAG CGC TAC CTC ACC ATC TCC AGC CTC CAG TCT GAG GAT

Gly Ala Glu Arg Tyr Leu Thr íle Ser Ser Leu Gin Ser Glu Asp

80 85

GAG GCT GAC TAT ATC TGT GGT GTC GGT GAT ACA AH AAG GAA CAA

Glu Ala Asp Tyr íle Cys Gly Val Gly Asp Thr íle Lys Glu Gin

95 100

TTT GTG TAC GTG TTC GGC GGA GGG ACC AAA CTG ACC GTC CTA GGC

Phe Val Tyr VaJ Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly

105 110 115

CAG CCC 111

Gin Pro

360

405 (2) Informácie pre SEQ ID NO: 72:

(i) Charakteristika sekvencie:

(A) Dĺžka: 411 párov báz (B) Typ: nukleová kyselina (C) Reťazec: dvojitý (D) Topológia: lineárna (ii) Typ molekuly: cDNA k mRNA (ix) Opis sekvencie: SEQ ID NO: 72:

131

ATG GCC 1GG ALT CCT CTC TTC TTC TTC TTT GTT CTT CAT TGC TCA 45

Met Ala Trp Thr Pro Leu Phe Phe Phe Phe Val Leu IIis Cys Scr

-15 -10 -5

GGT TCT TfC TCC CAG CTT GTG CTG ACT CAA TGG COC TCT GCC TĽT 90

Gly Ser Phe Ser Gin Leu Val Leu Thr Gin Ser Pro Ser Ala Ser

5 10

GCC TCC CTG GGA GCC TCG GTC AAG CTC ACC TGC ACC TTG AGT AGT 135

Ala Ser Leu Gly Ala Ser Val Lys Leu Thr Cys Thr Leu Ser Ser

20 25

CAG CAC AGT ACG TAC ACC ATT GAA TGG TAT CAG CAG CAG OCA GAG 180

Gin llis Ser Thr Tyr Thr íle Glu Trp Tyr Gin Gin Gin Pro Glu

35 40

AAG GCC CCT AGG TAC CTG ATG GAT CTT AAG CAA GAT GGA AGC CAC 225

Lys Gly Pro Arg Tyr Leu Met Asp Leu Lys Gin Asp Gly Ser llis

50 55

AGC ACA GGT GAT GGG ATT CCT GAT CGC TTC TCA GGC TCC AGC TCT 270

Ser

Thr

Gly

Asp Gly

Íle

Pro

Asp

Arg

Phe

Ser

Gly

Ser

Ser

Ser

60

65

70

GGG

GCT

GAG

CGC TAC

CTC

ACC

ATC

TCC

AGC

CTC

CAG

TCT

GAG

GAT

315

Gly

Ala

Glu

Arg Tyr

Leu

Thr

íle

Ser

Ser

Leu

Gin

Ser

Glu

Asp

75

80

85

GAG

GCT

GAC

TAT ATC

TGT

GGT

GTG

GGT

GAT

ACA

ATT

AAG

GAA

CAA

360

Glu

Ala

Asp

Tyr Ilc

Cys

Gly

Val

Gly

Asp

Thr

íle

Lys

Glu

Gin

90

95

100

TTT

GTG

TAC

GTG TTC

GGC

GGA

GGG

ACC

AAA

CTG

ACC

GTC

CTA

GGC

405

l’he

Val

Tyr

Viil l’he

Gly

Gly

Gly

Thr

Lys

Leu

Tlir

Val

Leu

Gl>

Hfi

110

115

CAC. CCC Ί11

Gin Pro

132 (2) Informácie pre SEQ ID NO: 73:

(i) Charakteristika sekvencie:

(A) Dĺžka: 411 párov báz (B) Typ: nukleová kyselina (C) Reťazec: dvojitý (D) Topológia: lineárna (ii) Typ molekuly: cDNA k mRNA (ix) Opis sekvencie: SEQ ID NO: 73:

ATG GCC TO ACT CCľ CTC TTC TTC TTC TTT GTT CTT CAT TGC TCA

Met Ala Trp Thr Pro Leu Phe Phe Phe Phe Val Leu His Cys Ser

-15 -10 -5

GGT TCT TTC TCC CAG CTT GTG CTG ACT CAA TCG CCC TCT GCC TCT

Gly S;r Phe Ser Gin Leu Val Leu Thr Gin Ser Pro Ser Ala Ser

5 10

GCC ICC CTG GGA GCC TCG GTC AAG CTC ACC TGC ACC TTG AGT AGT

Ala Ser Leu Gly Ala Ser Val Lys Leu Thr Cys Thr Leu Ser Ser

20 25

CAG CAC AGT ACG TAC ACC ATT GAA TO TAT CAG CAG CAG CCA GAG

Gin llis Ser Thr Tyr Thr Íle Glu Trp Tyr Gin Gin Gin Pro Glu :w 35 40

AAG GGC CCľ AAG TAC GTG ATC GAT CTT AAG CAA C.AT GGA AGC CAC

l.ys Gly Pro Lys Tyr Val Met Asp Leu Lys Gin Asp Gly Ser His •15 50 55

AGC ACA GGT GAT GGG ATT CCT GAT CGC TTC TCA GGC TCC AGC TCT

Ser Thr Gly Asp Gly Ilc Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Ser Ser

133

360

Gly Ala Glu Arg Tyr Leu Thr íle Ser Ser Leu Gin Ser Glu Asp

80 85

GAG GCT GAC TAT ATC TCT GGT GTC GGT GAT ACA Al ľ AAG GAA CAA

Glu Ala Asp Tyr íle Cys Gly Val Gly Asp Thr Íle Lys Glu Gin

95 100

TTT GTC TAC GTG TTC GGC GGA GGG ACC AAA CTC ACC GTC CTA GGC

Phe Val Tyr Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly

105 110 115

CAG CCC 411

Gin Pro (2) Informácie pre SEQ ID NO: 74:

(i) Charakteristika sekvencie:

(A) DÍžka: 411 párov báz (B) Typ: nukleová kyselina (C) Reťazec: dvojitý (D) Topológia: lineárna (ii) Typ molekuly: cDNA k mRNA (ix) Opis sekvencie: SEQ ID NO: 74:

ATC GCC TCG ACľ CCT CTC TTC TTC TTC TTT GIT CTT CAT TCC TCA 45

Met Ala Trp Ihr Pro Leu Phe Phe Phe Phe Val Leu llis Cys Ser

-15 -10 -5

GGT TCT 1TC TCC CAG CTT GTC CTC ACT CAA TCG CCC TCT GCC TCT 90

Gly Ser Phe Ser Gin Leu Val Leu Thr Gin Ser Pro Ser Ala Ser

5 10

GCC TCC CTG GGA GCC TCC GTC AAG CTC ACC TCC ACC TTG AGT AGT 135

Ala Ser Leu Gly Ala Ser Val Lys Leu Thr Cys Thr Leu Ser Ser

405

134

Gin His Ser Thr Tyr Thr íle Glu Trp Tyr Gin Gin Gin Pro Glu

35 40

AAG GGC GCT AGG TAC GTG ATG GAT CTT AAG CAA GAT GGA AGC CAC 225

l.ys Gly Pro Arg Tyr Val Met Asp Leu Lys Gin Asp Gly Ser His

50 55

AGC ACA GGT GAT GGG ATT CCT GAT CGC TTC TCA GGC TCC AGC TCT 270

Ser Thr Gly Asp Gly Íle Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Ser Ser

65 70

GGG GCT GAG CGC TAC CTC ACC ATC TCC AGC CTC CAG TCT GAG GAT 315

Gly Ala Glu Arg Tyr Leu Thr Íle Ser Ser Leu Gin Ser Glu Asp

80 85

GAG GCT GAC TAT ATC TCT GGT GTC GGT GAT ACA ATT AAG GAA CAA 360

Clu Ala Asp Tyr íle Cys Gly Val Gly Asp Thr íle Lys Glu Gin

95 100

ITT GTG TAC GTG TTC GGC GGA GGG ACC AAA CTG ACC GTC CTA GGC 405

Phe Val Tyi Val Phe G,y Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly

105 110 115

CAG CCC Ί ίI

Gin Pro (2) Informácie pre SEQ ID NO: 75:

(i) Charakteristika sekvencie:

(A) Dĺžka: 34 aminokyselín (B) Typ: aminokyselinová (D) Topológia: lineárna (ii) Typ molekuly: peptid (ix) Opis sekvencie: SEQ ID NO: 75:

Ala Val Ser Glu His Gin Leu Leu His Asp Lys Gly Lys Ser íle

10 15

Gin Asp Leu Arg Arg Arg Phe Phe Leu His His Leu Íle Ala Glu

25 30 íle His Thr Ala

Claims (33)

1. PATENTOVÉ NÁROKY

   1. Chimérický L reťazec obsahujúci C región L reťazca ľudskej protilátky a

   V región L reťazca myšej monoklonálnej protilátky proti ľudskému proteínu príbuznému s paratyroidálnym hormónom.
2. 2. Chimérický L reťazec podľa nároku 1, kde V región L reťazca obsahuje aminokyselinovú sekvenciu uvedenú v SEQ ID NO: 45.
3. 3. Chimérický L reťazec podľa nároku 1, kde C región je CX reťazec.
4. 4. Chimérický H reťazec obsahujúci C región H reťazca ľudskej protilátky a

   V región H reťazca myšej monoklonálnej protilátky proti ľudskému proteínu príbuznému s paratyroidálnym hormónom.
5. 5. Chimérický H reťazec podľa nároku 4, kde V región H reťazca obsahuje aminokyselinovú sekvenciu uvedenú v SEQ ID NO: 46.
6. 6. Chimérický H reťazec podľa nároku 4, kde C región je Cyl reťazec.
7. 7. Chimérická monoklonálna protilátka proti ľudskému proteínu príbuznému s paratyroidálnym hormónom obsahujúca chimérický L reťazec podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 3 a chimérický H reťazec podľa ktoréhokoľvek z nárokov 4 až 6.
8. 8. Polypeptid obsahujúci V región L reťazca humanizovanej protilátky obsahujúci regióny pracovných rámcov 1 až 4 V regiónu L reťazca ľudskej protilátky a komplementaritu určujúce regióny 1 až 3 V regiónu L reťazca myšej monoklonálnej protilátky proti ľudskému proteínu príbuznému s paratyroidálnym hormónom.
9. 9. Polypeptid podľa nároku 8, kde komplementaritu určujúce regióny 1 až 3 obsahujú aminokyselinové sekvencie uvedené v SEQ ID NO: 59-61, v príslušnom poradí.
10. 10. Polypeptid podľa nároku 8, kde uvedené regióny pracovných rámcov 1 až 3 sú odvodené z regiónov pracovných rámcov 1 až 3 ľudskej protilátky HSU03868, v príslušnom poradí, a uvedený región pracovného rámca 4 je región pracovného rámca 4 ľudskej protilátky S25755.

    136
11. 11. Polypeptid podľa nároku 8, kde uvedené regióny pracovných rámcov 1 až 3 sú v podstate identické s regiónmi 1 až 3 pracovných rámcov ľudskej protilátky HSU03868, v príslušnom poradí, a uvedený región pracovného rámca 4 je v podstate identický s regiónom pracovného rámca 4 ľudskej protilátky S25755.
12. 12. Polypeptid podľa nároku 8, v ktorom sú aminokyseliny 36 a 49 regiónov pracovných rámcov podľa Kabátovej definície tyrozin a kyselina asparágová, v príslušnom poradí.
13. 13. Polypeptid podľa nároku 12, obsahujúci aminokyselinovú sekvenciu uvedenú v ktorejkoľvek zo sekvencií SEQ ID NO: 48-51.
14. 14. Polypeptid podľa nároku 8, v ktorom sú aminokyseliny 45 a 87 regiónov pracovných rámcov podľa Kabátovej definície lyzín a izoleucín, v príslušnom poradí.
15. 15. Polypeptid podľa nároku 14, obsahujúci aminokyselinovú sekvenciu uvedenú v ktorejkoľvek zo sekvencií SEQ ID NO: 52-55.
16. 16. Polypeptid obsahujúci V región H reťazca humanizovanej protilátky obsahujúcej regióny pracovných rámcov 1 až 4 V regiónu H reťazca ľudskej protilátky a komplementaritu určujúce regióny 1 až 3 V regiónu H reťazca myšej monoklonálnej protilátky proti ľudskému proteínu príbuznému s paratyroidálnym hormónom.
17. 17. Polypeptid podľa nároku 16, kde komplementaritu určujúce regióny 1 až 3 obsahujú aminokyselinové sekvencie uvedené v SEQ ID NO: 62-64, v príslušnom poradí.
18. 18. Polypeptid podľa nároku 16, kde uvedené regióny pracovných rámcov 1 až 4 sú odvodené od regiónov pracovných rámcov 1 až 4 ľudskej protilátky patriacej do ľudskej podskupiny III.
19. 19. Polypeptid podľa nároku 16, kde uvedené regióny pracovných rámcov 1 až 4 sú odvodené od regiónov pracovných rámcov 1 až 4 ľudskej protilátky S31679, v príslušnom poradí.

    137
20. 20. Polypeptid podľa nároku 16, kde uvedené regióny pracovných rámcov 1 až 4 sú v podstate identické s regiónmi pracovných rámcov 1 až 4 ľudskej protilátky S31679, v príslušnom poradí.
21. 21. Polypeptid obsahujúci V región H reťazca humanizovanej protilátky obsahujúcej aminokyselinovú sekvenciu uvedenú v SEQ ID NO: 56.
22. 22. L reťazec humanizovanej protilátky proti ľudskému proteínu príbuznému s paratyroidálnym hormónom obsahujúcim polypeptid obsahujúci C región L reťazca ľudskej protilátky a polypeptid podľa ktoréhokoľvek z nárokov 8 až 15.
23. 23. L reťazec humanizovanej protilátky podľa nároku 22, kde C región je Ολ reťazec, uvedené regióny pracovných rámcov 1 až 3 sú v podstate identické s regiónmi pracovných rámcov 1 až 3 ľudskej protilátky HSU03868, v príslušnom poradí, a uvedený región pracovného rámca 4 je v podstate identický s regiónom pracovného rámca 4 ľudskej protilátky S25755 a komplementaritu určujúce regióny 1 až 3 obsahujú aminokyselinové sekvencie uvedené v SEQ ID NO: 59-61, v príslušnom poradí.
24. 24. H reťazec humanizovanej protilátky proti ľudskému proteínu príbuznému s paratyroidálnym hormónom obsahujúci polypeptid obsahujúci C región H reťazca ľudskej protilátky a polypeptid podľa ktoréhokoľvek z nárokov 16 až 21.
25. 25. H reťazec humanizovanej protilátky podľa nároku 24m kde C región je Ckl reťazec, uvedené regióny pracovných rámcov 1 až 4 sú odvodené od regiónov pracovných rámcov 1 až 4 ľudskej protilátky HSGľlľ a komplementaritu určujúce regióny 1 až 3 obsahujú aminokyselinové sekvencie uvedené v SEQ ID NO: 62-64, v príslušnom poradí.
26. 26. Humanizovaná protilátka proti ľudskému proteínu príbuznému s paratyroidálnym hormónom obsahujúca L reťazec humanizovanej protilátky podľa nárokov 22 alebo 23 a H reťazec humanizovanej protilátky podľa nárokov 24 alebo 25.
27. 27. Protilátka proti ľudskému proteínu príbuznému s paratyroidálnym hormónom majúca disociačnú konštantu Ι,ββχΙΟ¹ (M) alebo nižšiu.

    138
28. 28. Protilátka proti ľudskému proteínu príbuznému s paratyroidálnym hormónom majúca disociačnú rýchlostnú konštantu 1,22x1ο¹ (1/s) alebo nižšiu.
29. 29. Protilátka proti ľudskému proteínu príbuznému s paratyroidálnym hormónom majúca asociačnú rýchlostnú konštantu 1,86x10* (l/M.s) alebo vyššiu.
30. 30. Protilátka proti ľudskému proteínu príbuznému s paratyroidálnym hormónom majúca disociačnú rýchlostnú konštantu 1,22x1ο*¹ (l/s) alebo nižšiu a asociačnú rýchlostnú konštantu 6,55x10* (l/M.s) alebo vyššiu.
31. 31. Protilátka podľa nároku 27, kde disociačná konštanta je meraná senzorom povrchovej plazmónovej rezonancie.
32. 32. Protilátka podľa nároku 28 alebo 30, kde disociačná rýchlostná konštanta je meraná senzorom povrchovej plazmónovej rezonancie.
33. 33. Protilátka podľa nároku 29 alebo 30, kde asociačná rýchlostná konštanta je meraná senzorom povrchovej plazmónovej rezonancie.

    34. Protilátka podľa nároku 27, kde disociačná konštanta je 1,02x10“ až l,86xl0’⁷ (M). 35. Protilátka podľa nároku 27, kde disociačná konštanta je l,O2xlO'¹⁰ až 1,86x10’’ (M). 36.Protilátka podľa nároku 27, kde disociačná konštanta je 1,34x10 ¹⁰ až

    3,58xlO’¹⁰ (M).

    37. Protilátka podľa nároku 28, kde disociačná rýchlostná konštanta je 7,38x10* až 1,22x10 ' ¹ (l/s) 38. Protilátka podľa nároku 28, kde disociačná rýchlostná konštanta je 7,38x10 ⁵ až 1,22x10 ’² (l/s) 39. Protilátka podľa nároku 28. kde disociačná rýchlostná konštanta je 1,66x10 * až 3,16x10 '* (l/s) 40. Protilátka podľa nároku 28, kde disociačná rýchlostná konštanta je

    2,32x10 ’ (l/s).

    139

    41. Protilátka podľa nároku 29, kde asociačná rýchlostná konStanta je 6,55x10* až 1,24x10’ (l/M.s).

    42. Protilátka podľa nároku 29, kde asociačná rýchlostná konStanta je 6,55xlO^s až 1,24x10® (l/M.s).

    43. Protilátka podľa nároku 29, kde asociačná rýchlostná konStanta je 7,23x10* až 1,03x10* (l/M.s).

    44. Protilátka podľa nároku 29, kde asociačná rýchlostná konStanta je 1,03x10* (l/M.s).

    45. Protilátka proti ľudskému proteinu príbuznému s paratyroidálnym hormónom majúca disociačnú rýchlostnú konštantu 2,32x10* až 3,16x10* (1/s) a asociačnú rýchlostnú konštantu 0,833x10* až 1,03x10* (l/M.s).

    46.Protilátka podľa ktoréhokoľvek z nárokov 27 až 45, kde protilátka je ľudská, humanizovaná, chimérická alebo primatizovaná protilátka.

    47. DNA obsahujúca sekvenciu báz kódujúcu V región L reťazca myšej monoklonálnej protilátky proti ľudskému proteinu príbuznému s paratyroidálnym hormónom.

    48. DNA podľa nároku 47, kde V región L reťazca obsahuje aminokyselinovú sekvenciu uvedenú v SEQ ID NO: 45.

    49. DNA podľa nároku 47, kde sekvencia báz kódujúca V región L reťazca je uvedená v SEQ ID NO: 65.

    50. DNA obsahujúca sekvenciu báz kódujúcu V región H reťazca myšej monoklonálnej protilátky proti ľudskému proteinu príbuznému s paratyroidálnym hormónom.

    51. DNA podľa nároku 50, kde V región H reťazca obsahuje aminokyselinovú sekvenciu uvedenú v SEQ ID NO: 46.

    52. DNA podľa nároku 50, kde sekvencia báz kódujúca V región H reťazca je uvedená v SEQ ID NO: 57.

    53. DNA kódujúca chimérický L reťazec podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 3.

    140

    54. DNA podl'a nároku 53, kde DNA kódujúca chimérický L reťazec obsahuje sekvenciu báz uvedenú v SEQ ID NO: 65.

    55. DNA kódujúca chimérický H reťazec podľa ktoréhokoľvek z nárokov 4 až 6.

    56. DNA podľa nároku 55, kde DNA kódujúca chimérický H reťazec obsahuje sekvenciu báz uvedenú v SEQ ID NO: 57.

    57. DNA obsahujúca sekvenciu báz kódujúcu polypeptid podľa ktoréhokoľvek z nárokov 8 až 15.

    58. DNA podľa nároku 57 obsahujúca sekvenciu báz uvedenú v ktorejkoľvek zo SEQ ID NO: 66-74.

    59. DNA obsahujúca sekvenciu báz kódujúcu polypeptid podľa ktoréhokoľvek z nárokov 16 až 21.

    60. DNA podľa nároku 59 obsahujúca sekvenciu báz uvedenú v SEQ ID NO: 58.

    61. DNA kódujúca L reťazec humanizovanej protilátky podľa nárokov 22 alebo 23.

    62. DNA pre L reťazec humanizovanej protilátky obsahujúca sekvenciu báz kódujúcu aminokyselinovú sekvenciu uvedenú v ktorejkoľvek zo SEQ ID NO: 47-55.

    63. DNA podľa nároku 62, kde DNA pre L reťazec humanizovanej protilátky obsahuje sekvenciu báz, ako je uvedená v ktorejkoľvek zo SEQ ID NO: 66-74.

    64. DNA kódujúca H reťazec humanizovanej protilátky podľa nárokov 24 alebo 25.

    65. DNA pre H reťazec humanizovanej protilátky obsahujúca sekvenciu báz kódujúcu aminokyselinovú sekvenciu uvedenú v SEQ ID NO: 56.

    66. DNA podľa nároku 65, kde DNA pre H reťazec humanizovanej protilátky obsahuje sekvenciu báz ako je uvedená v SEQ ID NO: 58.

    67. Rekombinantný vektor obsahujúci DNA podľa ktoréhokoľvek z nárokov 47-66.

    68. Transformant transformovaný rekombinantným vektorom podľa nároku 67.

    141

    69. Spôsob na prípravu chimérickej protilátky proti ľudskému proteínu príbuznému s paratyroidálnym hormónom, vyznačujúci sa tým, že obsahuje kultiváciu transformantu transformovaného expresným vektorom obsahujúcim DNA podľa ktoréhokoľvek z nárokov 47 až 49, 53 a 54 a expresným vektorom obsahujúcim DNA podľa ktoréhokoľvek z nárokov 50 až 52, 55 a 56 a získanie chimérickej protilátky proti ľudskému proteínu príbuznému s paratyroidálnym hormónom z výslednej kultúry.

    70. Spôsob na prípravu humanizovanej protilátky proti ľudskému proteínu príbuznému s paratyroidálnym hormónom, vyznačujúci sa tým, že obsahuje kultiváciu transformantu transformovaného expresným vektorom obsahujúcim DNA podľa ktoréhokoľvek z nárokov 57, 58 a 61 až 63 a expresným vektorom obsahujúcim DNA podľa ktoréhokoľvek z nárokov 59, 60 a 64 až 65 a získanie humanizovanej protilátky proti ľudskému proteínu príbuznému s paratyroidálnym hormónom z výslednej kultúry.

    71. Farmaceutický prostriedok, vyznačujúci sa tým, že obsahuje humanizovanú protilátku proti ľudskému proteínu príbuznému s paratyroidálnym hormónom ako účinnú zložku.

    72. Činidlo na potlačenie hyperkalcémie, vyznačujúce sa tým, že obsahuje humanizovanú protilátku proti ľudskému proteínu príbuznému s paratyroidálnym hormónom ako účinnú zložku.

    73. Činidlo na potlačenie hyperkalcémie spojenej s malígnym nádorom, vyznačujúce sa tým, že obsahuje humanizovanú protilátku proti ľudskému proteínu príbuznému s paratyroidálnym hormónom ako účinnú zložku.

    74. Činidlo na potlačenie hyperkalcémie podľa nároku 73, vyznačujúce sa tým, že malígny nádor je vybraný zo skupiny skladajúcej sa z nádorov podžalúdkovej žľazy, pľúc, hltanu, hrtanu, jazyka, ďasien, pažeráku, žalúdka, žlčových ciest, prsníka, obličiek, močového mechúra, maternice a prostaty a malígnych lymfómov.

    75. Farmaceutický prostriedok, vyznačujúci sa tým, že obsahuje protilátku podľa ktoréhokoľvek z nárokov 27 až 46 ako účinnú zložku.

    142

    76. Činidlo na potláčanie hyperkalcémie, vyznačujúce sa tým, že obsahuje protilátku podľa ktoréhokoľvek z nárokov 27 až 46 ako účinnú zložku.

    77. Činidlo na potláčanie hyperkalcémie spojenej s malígnym nádorom, vyznačujúce sa tým, že obsahuje protilátku podľa ktoréhokoľvek z nárokov 27 až 46 ako účinnú zložku.

    78. Činidlo na potláčanie hyperkalcémie podľa nároku 77, vyznačujúce sa tým, že malígny nádor je vybraný zo skupiny skladajúcej s z nádorov podžalúdkovej žľazy, pľúc, hltanu, hrtanu, jazyka, ďasien, pažeráka, žalúdka, žlčových ciest, prsníka, obličiek, močového mechúra, maternice a prostaty a malígnych lymfómov.

    79. Činidlo na zlepšenie hypofosfatémie, vyznačujúce sa tým, že obsahuje humanizovanú protilátku proti ľudskému proteínu príbuznému s paratyroidálnym hormónom ako účinnú zložku.

    80. Činidlo na zlepšenie vyznačujúce sa rachitis.

    hypofosfatémie podľa tým, že hypofosfatémia je nároku 79, hypofosfatemická

    Činidlo v y z n vitamín na zlepšenie ačujúce sa t D-rezistentná rachitis.

    hypofosfatémie podľa ý m, že hypofosfatémia je nároku 79, hypofosfatemická

    82. Činidlo na zlepšenie hypofosfatémie, vyznačujúce sa tým, že obsahuje protilátku podľa ktoréhokoľvek z nárokov 27 až 46 ako účinnú zložku.

    Činidlo na vyznačuj rachitis.

    zlepšenie ú c e sa hypofosfatémie podľa tým, že hypofosfatémia je nároku 82, hypofosfatemická

    84. Činidlo na zlepšenie vyznačujúce sa hypofosfatémie podľa nároku 82, tým, že hypofosfatémia je hypofosfatemická vitamín D-rezistentná rachitis.