TWI418363B - 血漿中動態經改善之磷脂醯肌醇蛋白聚醣３抗體 - Google Patents

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血漿中動態經改善之磷脂醯肌醇蛋白聚醣3抗體 關連申請

本申請係基於日本專利申請第2007-249891號(2007年9月26日申請而主張優先權。此申請之揭示，係含圖式及表，藉由全部參照收錄於本說明書。

本發明關於改善磷脂醯肌醇蛋白聚醣3抗體之血漿中(血中)動態之方法、含有血漿中動態經改善之磷脂醯肌醇蛋白聚醣3抗體作為有效成分之醫藥組成物，及其製造方法等。

由於抗體在血漿中的安定性高、副作用也少，因此作為其醫藥品的使用正受到注目。複數抗體的異構型之中，尤其IgG異構型的治療用抗體多數已經上市，現在另外還有數量繁多的治療用抗體在開發中(非專利文獻1、非專利文獻2、非專利文獻3)。已知藉由磷脂醯肌醇蛋白聚醣3抗體對肝癌、肺癌細胞等發揮細胞傷害活性，可發揮抗腫瘤效果(專利文獻1)。另外還已知對於肝癌、卵巢癌，黑色素瘤等，結合了磷脂醯肌醇蛋白聚醣3抗體與細胞傷害物質的藥物結合抗體，能發揮抗腫瘤效果(非專利文獻4)。

另外，作為第二代的治療用抗體之製作技術，使效應器機能等增強的技術亦正被開發中。已知有例如藉由將構成IgG異構型之抗體(以下稱為IgG抗體)之Fc區域的胺基酸取代為其他相異的胺基酸之胺基酸取代，使抗體依賴性細胞傷害活性(ADCC)活性或補體依賴性細胞傷害活性(CDC)活性增強的技術(非專利文獻5)。藉由海藻糖轉運蛋白缺失的CHO細胞所產生的磷脂醯肌醇蛋白聚醣3抗體，海藻糖並未結合於結合在磷脂醯肌醇蛋白聚醣3抗體之結合糖鏈中之分枝鏈，而該磷脂醯肌醇蛋白聚醣3抗體相較於在其結合糖鏈中之分枝鏈含海藻糖之磷脂醯肌醇蛋白聚醣3抗體，ADCC活性顯著地增大，而認為作為治療用抗體之抗腫瘤效果高(專利文獻2)。

再者，除了如此之效應器機能等經過增強的技術以外，還有報告出藉由對構成抗體之Fc區域的胺基酸施加胺基酸取代，使抗體之血漿中半衰期增減之技術(非專利文獻6、非專利文獻7)。藉由將延長抗體在血漿中半衰期的技術適用於治療用抗體，可期待所投予之治療用抗體之投予量減低或投予間隔之延長，進一步可提供低成本，便利性高的治療用抗體。

具體而言，藉由將導致提升對於已知為IgG抗體之救助接受器(salvage receptor)之胎兒性Fc受體(neonatal Fc receptor)之IgG抗體之親和性的效果之胺基酸取代，施加於構成IgG抗體之Fc區域之胺基酸，可延長血漿中半衰期。另外，亦已知一種藉由將構成抗體之恆定區域的CH1、CH2、CH3之各區域調換(shuffling)之延長血漿中半衰期的技術(非專利文獻8)。然而，由於IgG抗體之恆定區域的胺基酸序列被保存在人體中，因此對構成恆定區域的胺基酸導入之如上述般之具有人工胺基酸取代之抗體，係有造成所謂的在人身體內表現出免疫原性(抗原性)的副作用的可能性。因此，如此之施加胺基酸取代之胺基酸之數量係以少者為佳。

就對構成IgG抗體之可變區域(亦稱為V區域)的胺基酸施加胺基酸取代之技術而言，以人化技術(非專利文獻9)為始，報告出構成用於使結合活性增強之互補決定區域(CDR)的胺基酸之胺基酸取代造成之親和力成熟(affinity maturation)(非專利文獻10)、構成架構區域(FR)的胺基酸之胺基酸取代造成之物理化學的安定性之提升(非專利文獻11)。亦即，與構成恆定區域(亦被稱為C區域)的胺基酸之胺基酸取代相異地，構成可變區域的胺基酸之胺基酸取代，係為了增強對於抗體之抗原結合活性等機能或提升安定性等特性一般而言被採用的手法。構成人化抗體之CDR的胺基酸序列，被認為由於來自人類的以外之動物種的胺基酸序列，因此藉由在該序列中之胺基酸，施加人工胺基酸取代，產生免疫原性之風險相比於其他區域之序列中之胺基酸取代較低。另外，對構成人化抗體之FR的胺基酸序列施加人工胺基酸取代，只要構成經過取代之結果所得到之FR之胺基酸序列與構成在Kabat Database(http://ftp.ebi.ac.uk/pub/databases/kabat/)及IMGT Database(http://imgt.cines.fr/)等所公開的複數人類抗體之FR之胺基酸序列之任一者相同，則認為由該取代所產生之免疫原性之風險小。進一步，藉著從構成在Kabat Database及IMGT Database等所公開的複數人類抗體之FR之胺基酸序列，再度選擇與構成經過取代的結果所得到之FR之胺基酸序列類似性高的人類抗體之序列，可使免疫原性降低(專利文獻3)。

另一方面，如上述之方式，使IgG抗體之血漿中半衰期提升的方法，僅已知構成恆定區域之一部份之Fc區域的胺基酸之胺基酸取代而得到者，而使構成可變區域(認為此胺基酸取代所造成的免疫原性風險小)之胺基酸之胺基酸取代所造成的IgG抗體之血漿中半衰期提升之方法，至此並未被報告出來。就此理由而言，可列舉認為是IgG抗體之血漿中半衰期，係大幅地依賴於對IgG抗體之救助接受器之胎兒性Fc受體之結合與抗原依賴性的消失(非專利文獻12)，可變區域之機能或特性不會大幅地影響血漿中半衰期。

另外，報告出藉由將IgG抗體琉珀醯化，使IgG抗體陰離子化，使其等電點(pI)降低之技術(非專利文獻13)，或藉由將IgG抗體藉聚胺進行修飾，使IgG抗體陽離子化，使其pI上昇的技術(非專利文獻14)，然而任何修飾之IgG抗體之血漿中半衰期皆沒有增大，不僅如此，相反地其血漿中半衰期縮短。亦即，尚未實現藉由如上述般IgG抗體之化學修飾改變其pI延長IgG抗體之血漿中半衰期。

[非專利文獻1]Janice M Reichert,Clark J Rosensweig,Laura B Faden & MatthewC Dewitz,Monoclonal antibody successes in the clinic,Nature Biotechnology(2005)23,1073-8

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[專利文獻1]WO 2003/000883公報

[專利文獻2]WO2006/067913公報

[專利文獻3]WO 1999/018212公報

[專利文獻4]WO 2004/035752公報

本發明係鑑於如此的狀況而完成，其目的在於提供一種、控制磷脂醯肌醇蛋白聚醣3抗體之血漿中半衰期之方法，使血漿中半衰期經控制之磷脂醯肌醇蛋白聚醣3抗體及含有此作為有效成分之醫藥組成物，以及該等製造方法。

進一步而言，在於提供一種藉由控制具有細胞傷害活性的抗體之血漿中半衰期而控制該抗體之細胞傷害活性的方法，使細胞傷害活性經控制之抗體及含有此作為有效成分之醫藥組成物，以及該等製造方法。

本發明人等，對於控制以磷脂醯肌醇蛋白聚醣3抗體為始的抗體之血漿中半衰期的方法努力進行研究。其結果，本發明人等發現藉由改變構成以磷脂醯肌醇蛋白聚醣3抗體為始的抗體之可變區域及恆定區域之的胺基酸殘基之內暴露在該抗體分子表面之胺基酸殘基，控制抗體分子表面電荷，可控制以磷脂醯肌醇蛋白聚醣3抗體為始的抗體之血漿中半衰期。具體而言，構成以磷脂醯肌醇蛋白聚醣3抗體為始的抗體之可變區域及恆定區域的胺基酸序列中之胺基酸殘基之內，對抗體之抗原的結合活性等抗體所具有的機能，或不會對其構造造成影響，藉由調節抗體分子表面之電荷，可控制以磷脂醯肌醇蛋白聚醣3抗體為始的抗體之血漿中半衰期，識別特定之胺基酸殘基。進一步本發明人等確認了以如此之方式，使血漿中半衰期經控制之以磷脂醯肌醇蛋白聚醣3抗體為始的抗體，可保持即時對抗原的結合活性。再者，本發明人等確認了藉由控制以磷脂醯肌醇蛋白聚醣3抗體為始的抗體之血漿中半衰期，發揮以磷脂醯肌醇蛋白聚醣3抗體為始的細胞傷害活性之抗體所具有對癌細胞的腫瘤增殖抑制效果增大，而使得本發明完成。

本發明係關於一種藉由改變暴露在以磷脂醯肌醇蛋白聚醣3抗體為始的抗體表面之胺基酸殘基，控制該抗體之血漿中半衰期的方法、藉由胺基酸殘基之改變，使以血漿中半衰期經控制之磷脂醯肌醇蛋白聚醣3抗體為始的抗體，含有該抗體作為有效成分之醫藥組成物，以及該等醫藥組成物之製造方法。較具體而言，本發明提供：

[1]一種血漿中動態經控制之磷脂醯肌醇蛋白聚醣3抗體之製造方法，係包含以下各階段

(a)將保持編碼磷脂醯肌醇蛋白聚醣3抗體的核酸之宿主細胞，在該核酸表現之條件下培養，此處，該磷脂醯肌醇蛋白聚醣3抗體，係以具有可暴露在抗體表面的至少一個胺基酸殘基的電荷被改變之方式經過變更之胺基酸序列，以及

(b)由該宿主細胞之培養物回收之磷脂醯肌醇蛋白聚醣3抗體；

[2]如[1]所記載之方法，其中上述血漿中動態之控制，係血漿中半衰期、平均血漿中滯留時間、血漿中清除率之任一參數之擴張或縮減；

[3]如[1]所記載之方法，其中胺基酸殘基之電荷的改變係由胺基酸取代所造成；

[4]如[1]所記載之方法，其中可暴露在上述磷脂醯肌醇蛋白聚醣3抗體表面的胺基酸殘基，係在磷脂醯肌醇蛋白聚醣3抗體中之FcRn結合區域以外的區域；

[5]如[4]所記載之方法，其中上述FcRn結合區域係由Fc區域所構成；

[6]如[4]所記載之方法，其中上述FcRn結合區域包含Kabat記載中之EU號碼250、253、310、311、314、428、435、436之胺基酸殘基；

[7]如[1]所記載之方法，其中磷脂醯肌醇蛋白聚醣3抗體為IgG抗體；

[8]如[1]至[7]中任一者所記載之方法，其電荷被改變之胺基酸殘基係重鏈可變區域或輕鏈可變區域之胺基酸殘基；

[9]如[8]所記載之方法，其特徵為上述磷脂醯肌醇蛋白聚醣3抗體係含有來自人類以外的動物的互補決定區域(CDR)、來自人類的架構區域(FR)及人類恆定區域之磷脂醯肌醇蛋白聚醣3抗體，而胺基酸殘基之電荷的改變，係由可暴露在抗體之CDR或FR中之抗體表面的至少一個胺基酸殘基，至具有與該胺基酸殘基相異電荷之胺基酸殘基之取代；

[10]如[9]所記載之方法，其特徵為上述胺基酸殘基之電荷的改變係

(1)以序列號碼1所表示之重鏈可變區域之內以下任一個或一個以上之取代；

(a)第43號胺基酸殘基Q至K之取代、

(b)第52號胺基酸殘基D至N之取代、

(c)第107號胺基酸殘基Q至R之取代、及/或，

(2)以序列號碼7所表示之輕鏈可變區域之內以下任一個或一個以上之取代；

(d)第17號胺基酸殘基E至Q之取代、

(e)第27號胺基酸殘基Q至R之取代、

(f)第105號胺基酸殘基Q至R之取代；

[11]如[9]所記載之方法，其特徵為上述胺基酸殘基之電荷的改變係

(1)以序列號碼1所表示之重鏈可變區域之內以下任一個或一個以上之取代；

(a)第19號胺基酸殘基K至T之取代、

(b)第43號胺基酸殘基Q至E之取代、

(c)第62號胺基酸殘基Q至E之取代、

(d)第63號胺基酸殘基K至S之取代、

(e)第65號胺基酸殘基K至Q之取代、

(f)第66號胺基酸殘基G至D之取代、及/或、

(2)以序列號碼7所表示之輕鏈可變區域之內以下任一個或一個以上之取代；

(g)第24號胺基酸殘基R至Q之取代、

(h)第27號胺基酸殘基Q至E之取代、

(i)第79號胺基酸殘基K至T之取代、

(j)第82號胺基酸殘基R至S之取代、

(k)第112號胺基酸殘基K至E之取代；

[12]如[11]所記載之方法，其特徵為進一步包含以下之改變；

以序列號碼31所表示之重鏈恆定區域之內以下任一個或一個以上之取代；

(a)第151號胺基酸殘基H至Q之取代、

(b)第157號胺基酸殘基K至Q之取代、

(c)第238號胺基酸殘基R至Q之取代、

(d)第239號胺基酸殘基D至E之取代、

(e)第241號胺基酸殘基L至M之取代、

(f)第302號胺基酸殘基Q至E之取代；

[13]如[9]至[12]中任一者所記載之方法，其中上述磷脂醯肌醇蛋白聚醣3抗體係結合於其Fc區域之海藻糖含量降低之抗體；

[14]一種磷脂醯肌醇蛋白聚醣3抗體，係藉由[1]至[13]中任一者所記載之方法所製造；

[15]一種血漿中動態經控制之抗體之製造方法，係包含以下之各階段：

(a)將保持編碼抗體的核酸之宿主細胞，在該核酸表現之條件下培養，此處，該抗體係具有以使抗體FcRn結合區域以外的恆定區域之胺基酸殘基的電荷被改變之方式經過變更的胺基酸序列，以及

(b)由該宿主細胞之培養物回收抗體；

[16]如[15]所記載之方法，其中上述血漿中動態之控制，係血漿中半衰期、平均血漿中滯留時間、血漿中清除率之任一參數之擴張或縮減；

[17]如[15]所記載之方法，其中胺基酸殘基之電荷的改變，係由胺基酸取代所造成；

[18]如[17]所記載之方法，其中抗體為IgG抗體；

[19]如[18]所記載之方法，其中抗體為IgG1；

[20]如[17]所記載之方法，其特徵為上述胺基酸殘基之電荷的改變，係IgG1抗體之1或其以上之胺基酸殘基至對應IgG4抗體的1或其以上之胺基酸殘基之取代；

[21]如[15]至[20]中任一者所記載之方法，其中上述FcRn結合區域，係包含Kabat表記中之EU號碼250、253、310、311、314、428、435、436之胺基酸殘基；

[22]如[20]所記載之方法，其特徵為上述胺基酸殘基之電荷的改變，係以序列號碼31所表示之重鏈恆定區域之內以下任一個或一個以上之取代；

(a)第151號胺基酸殘基H至Q之取代、

(b)第157號胺基酸殘基K至Q之取代、

(c)第238號胺基酸殘基R至Q之取代、

(d)第239號胺基酸殘基D至E之取代、

(e)第241號胺基酸殘基L至M之取代、

(f)第302號胺基酸殘基Q至E之取代；

[23]如[15]至[22]中任一者所記載之方法，其中抗體為磷脂醯肌醇蛋白聚醣3抗體；

[24]一種含有來自人類以外的動物的互補決定區域(CDR)、來自人類的架構區域(FR)及人類恆定區域之磷脂醯肌醇蛋白聚醣3抗體之安定化方法，係包含以下之各階段

(a)將保持編碼磷脂醯肌醇蛋白聚醣3抗體的核酸之宿主細胞，在該核酸表現之條件下培養，此處，該磷脂醯肌醇蛋白聚醣3抗體，係具有至少一個藉由胺基酸殘基之改變導致Tm值之增大之方式經過變更之胺基酸序列，以及

(b)由該宿主細胞之培養物回收抗體；

[25]如[24]所記載之方法，其特徵為胺基酸殘基存在於其重鏈或輕鏈之FR1區域及/或FR2區域；

[26]如[25]所記載之方法，其特徵為將重鏈之FR2區域之胺基酸殘基取代為VH4亞型之FR2區域之胺基酸殘基；

[27]如[25]所記載之方法，其特徵為將輕鏈之FR2區域之胺基酸殘基取代為VK3亞型之FR2區域之胺基酸殘基；

[28]如[24]至[27]中任一者所記載之方法，其特徵為上述胺基酸殘基之改變係

(1)對於構成以序列號碼1所表示之重鏈可變區域之胺基酸殘基，以下任一個或一個以上之取代；

(a)第37號胺基酸殘基V至I之取代、

(b)第40號胺基酸殘基A至P之取代、

(c)第48號胺基酸殘基M至I之取代、

(d)第51號胺基酸殘基L至I之取代、及/或

(2)對於構成以序列號碼7所表示之輕鏈可變區域之胺基酸殘基，以下任一個或一個以上之取代；

(e)第42號胺基酸殘基L至Q之取代、

(f)第48號胺基酸殘基S至A之取代、

(g)第50號胺基酸殘基Q至R之取代；

[29]一種細胞傷害活性經控制之抗體之製造方法，係包含以下之各階段：

(a)將保持編碼抗體的核酸之宿主細胞，在該核酸表現之條件下培養，此處，該抗體係具有以可暴露在具有細胞傷害活性的抗體表面的至少一個胺基酸殘基的電荷被改變之方式經過變更的胺基酸序列，以及(b)由該宿主細胞之培養物回收抗體；

[30]如[29]所記載之方法，其中胺基酸殘基之電荷的改變係由胺基酸取代所造成；

[31]如[29]所記載之方法，其中可暴露在上述抗體表面的胺基酸殘基係在抗體中之FcRn結合區域以外的區域；

[32]如[31]所記載之方法，其中上述FcRn結合區域係由Fc區域所構成；

[33]如[31]所記載之方法，其中上述FcRn結合區域，係包含Kabat記載中之EU號碼250、253、310、311、314、428、435、436之胺基酸殘基；

[34]如[29]所記載之方法，其中抗體為IgG抗體；

[35]如[29]至[34]中任一者所記載之方法，其中電荷被改變之胺基酸殘基為恆定區域之胺基酸殘基；

[36]如[29]至[34]中任一者所記載之方法，其中電荷被改變之胺基酸殘基為重鏈可變區域或輕鏈可變區域之胺基酸殘基；

[37]如[36]所記載之方法，其特徵為上述抗體係含有來自人類以外的動物的互補決定區域(CDR)、來自人類的架構區域(FR)及人類恆定區域之抗體，胺基酸殘基之電荷的改變係可暴露在抗體之CDR或FR中之抗體表面的至少一個胺基酸殘基之、具有與該胺基酸殘基相異電荷之胺基酸殘基之取代；

[38]如[37]所記載之方法，其特徵為上述胺基酸殘基之電荷的改變係

(1)以序列號碼1所表示之重鏈可變區域之內以下任一個或一個以上之取代；

(a)第19號胺基酸殘基K至T之取代、

(b)第43號胺基酸殘基Q至E之取代、

(c)第62號胺基酸殘基Q至E之取代、

(d)第63號胺基酸殘基K至S之取代、

(e)第65號胺基酸殘基K至Q之取代、

(f)第66號胺基酸殘基G至D之取代、及/或，

(2)以序列號碼7所表示之輕鏈可變區域之內以下任一個或一個以上之取代；

(g)第24號胺基酸殘基R至Q之取代、

(h)第27號胺基酸殘基Q至E之取代、

(i)第79號胺基酸殘基K至T之取代、

(j)第82號胺基酸殘基R至S之取代、

(k)第112號胺基酸殘基K至E之取代；

[39]如[38]所記載之方法，其特徵為進一步包含以下之改變；

以序列號碼31所表示之重鏈恆定區域之內以下任一個或一個以上之取代；

(a)第151號胺基酸殘基H至Q之取代、

(b)第157號胺基酸殘基K至Q之取代、

(c)第238號胺基酸殘基R至Q之取代、

(d)第239號胺基酸殘基D至E之取代、

(e)第241號胺基酸殘基L至M之取代、

(f)第302號胺基酸殘基Q至E之取代；

[40]如[36]所記載之方法，其特徵為上述抗體係含有來自人類以外的動物的互補決定區域(CDR)、來自人類的架構區域(FR)及人類恆定區域之抗體，胺基酸殘基之電荷的改變，係可暴露在抗體恆定區域中的抗體表面的至少一個胺基酸殘基之、具有與該胺基酸殘基相異電荷之胺基酸殘基之取代；

[41]如[40]所記載之方法，其特徵為取代係以序列號碼31所表示之重鏈恆定區域之內以下任一個或一個以上之取代；

(a)第151號胺基酸殘基H至Q之取代、

(b)第157號胺基酸殘基K至Q之取代、

(c)第238號胺基酸殘基R至Q之取代、

(d)第239號胺基酸殘基D至E之取代、

(e)第241號胺基酸殘基L至M之取代、

(f)第302號胺基酸殘基Q至E之取代；

[42]如[37]至[41]中任一者所記載之方法，其中上述結合於抗體Fc區域之海藻糖含量降低之抗體；

[43]一種抗體，係藉由[29]至[42]中任一者所記載之方法製造；

[44]如[43]所記載之抗體，其中抗體為磷脂醯肌醇蛋白聚醣3抗體；

[45]一種抗體，係含有：

(1)在以序列號碼1所表示之重鏈可變區域的胺基酸序列中，施加了以下任一個或一個以上之取代之重鏈可變區域；

(a)第19號胺基酸殘基K至T之取代、

(b)第43號胺基酸殘基Q至E之取代、

(c)第62號胺基酸殘基Q至E之取代、

(d)第63號胺基酸殘基K至S之取代、

(e)第65號胺基酸殘基K至Q之取代、

(f)第66號胺基酸殘基G至D之取代，及/或

(2)在以序列號碼7所表示之輕鏈可變區域的胺基酸序列中，施加了以下任一個或一個以上之取代之輕鏈可變區域；

(g)第24號胺基酸殘基R至Q之取代、

(h)第27號胺基酸殘基Q至E之取代、

(i)第79號胺基酸殘基K至T之取代、

(j)第82號胺基酸殘基R至S之取代、

(k)第112號胺基酸殘基K至E之取代；

[46]如[45]所記載之抗體，其係含有以序列號碼3所表示之重鏈可變區域及以序列號碼9所表示之輕鏈可變區域；

[47]如[45]所記載之抗體，其係含有以序列號碼5所表示之重鏈可變區域及以序列號碼11所表示之輕鏈可變區域；

[48]如[45]所記載之抗體，其係含有以序列號碼27所表示之重鏈可變區域及以序列號碼28所表示之輕鏈可變區域；

[49]如[45]所記載之抗體，其係含有以序列號碼27所表示之重鏈可變區域及以序列號碼29所表示之輕鏈可變區域；

[50]如[45]至[49]中任一者所記載之抗體，其係具有人類抗體之恆定區域；

[51]如[50]所記載之抗體，其中上述恆定區域含有以序列號碼32或序列號碼33所表示之序列；

[52]一種抗體，係含有：

(1)在以序列號碼1所表示之重鏈可變區域的胺基酸序列中，施加了以下任一個或一個以上之取代之重鏈可變區域；

(a)第43號胺基酸殘基Q至K之取代、

(b)第52號胺基酸殘基D至N之取代、

(c)第107號胺基酸殘基Q至R之取代，及/或

(2)在以序列號碼7所表示之輕鏈可變區域的胺基酸序列中，施加了以下任一個或一個以上之取代之輕鏈可變區域；

(d)第17號胺基酸殘基E至Q之取代、

(e)第27號胺基酸殘基Q至R之取代、

(f)第105號胺基酸殘基Q至R之取代；

[53]如[52]所記載之抗體，其係含以序列號碼4所表示之重鏈可變區域及以序列號碼10所表示之輕鏈可變區域；

[54]如[52]所記載之抗體，其係含以序列號碼6所表示之重鏈可變區域及以序列號碼12所表示之輕鏈可變區域；

[55]如[52]至[54]中任一者所記載之抗體，其係具有人類抗體之恆定區域；

[56]一種抗體，係在以序列號碼31所表示之重鏈恆定區域的胺基酸序列中，具有以下任一個或一個以上之取代；

(a)第151號胺基酸殘基H至Q之取代、

(b)第157號胺基酸殘基K至Q之取代、

(c)第238號胺基酸殘基R至Q之取代、

(d)第239號胺基酸殘基D至E之取代、

(e)第241號胺基酸殘基L至M之取代、

(f)第302號胺基酸殘基Q至E之取代；

[57]一種抗體，係含有以序列號碼33所表示之重鏈恆定區域；

[58]如[45]至[57]中任一者所記載之抗體，其係結合於上述抗體Fc區域之海藻糖含量降低之抗體；

[59]一種組成物，係含有[45]至[58]中任一者所記載之抗體，及醫藥上所容許之擔體；

[60]一種癌治療劑，係含有[45]至[58]中任一者所記載之抗體作為有效成分；

[61]如[60]所記載之癌治療劑，其中癌為肝癌；

[62]一種核酸，係編碼構成[45]至[58]中任一者所記載之抗體的多胜肽；

[63]一種宿主細胞，係保持[62]所記載之核酸；

[64]如[63]所記載之宿主細胞，其中宿主細胞係海藻糖轉運蛋白缺損之動物細胞，岩藻糖基轉移酶缺失之動物細胞，或複合分枝糖鏈修飾改變動物細胞；

[65]一種抗體之製造方法，係包含培養[63]或[64]所記載之宿主細胞之步驟，及由細胞培養物回收多胜肽之步驟。

本發明係提供控制以磷脂醯肌醇蛋白聚醣3抗體為始的抗體在血漿中動態之方法。就本發明方法之適合態樣而言，包含改變可暴露在以磷脂醯肌醇蛋白聚醣3抗體為始的抗體表面的至少一個胺基酸殘基的電荷之方法。亦即，藉由改變以磷脂醯肌醇蛋白聚醣3抗體為始的抗體之胺基酸殘基的電荷，使其等電點(pI)發生變化，可控制該抗體之血漿中動態。使血漿中動態經控制之以磷脂醯肌醇蛋白聚醣3抗體為始的抗體與不經控制的抗體相比，可對癌細胞發揮較優異的抗腫瘤活性。

複數之抗體之異構型之內、IgG抗體，由於其分子量夠大，因此其主要的代謝路徑並非由腎排泄進行之路徑。已知具有Fc區域作為其分子之一部份之IgG抗體，係藉由從表現在血管等內皮細胞的胎兒性Fc受體(FcRn)之救助路徑回收，而具有較長的生體內半衰期。IgG抗體係被認為是主要藉由在內皮細胞中之代謝路徑而代謝者(非專利文獻16)。亦即，認為藉由非特異性地被收取至內皮細胞之IgG抗體結合於FcRn，IgG抗體會被回收，另一方面，無法結合之IgG抗體會被代謝。以對FcRn結合性降低之方式使其Fc部分經改變的IgG抗體之血漿中半衰期會變短。相反地，為了提高對FcRn的結合性，藉由改變IgG抗體之構成Fc區域之胺基酸殘基，可使IgG抗體之血漿中半衰期擴張(非專利文獻16及非專利文獻29)。如上述之方式，以往IgG抗體之血漿中動態之控制方法，向來是藉由改變構成Fc區域之胺基酸殘基造成對FcRn的結合性之改變而進行。上述之胺基酸殘基而言，具體可列舉以Kabat編號為基準之胺基酸殘基H250，H253，H310，H311，H314，H428，H435，H436。其他，間接地作用於IgG抗體與FcRn之交互作用之胺基酸殘基H254，H255，H257，H288，H296，H307，H309，H315，H415，H433亦可列舉作為其改變對象。該等胺基酸殘基分別相當於例如序列號碼30中之、130、133、190、191、194、308、315、第316號胺基酸殘基，以及134、135、137、168、176、187、189、195、295、第313號胺基酸殘基，及序列號碼31中之133、136、193、194、197、311'318、第319號胺基酸殘基，以及137、138、140、171、179、190、192、198、298、第316號胺基酸殘基。但是，亦如在下述之實施例所表示般，在本發明中，判明了以磷脂醯肌醇蛋白聚醣3抗體為始的抗體之血漿中半衰期具有高相關性地依賴於pI之現象。亦即揭示出，不改變構成其改變有導致免疫原性獲得之可能之FcRn結合區域之胺基酸殘基，具體而言，以Kabat編號為基準之胺基酸殘基H250，H253，H310，H311，H314，H428，H435，H436或H254，H255，H257，H288，H296，H307，H309，H315，H415，H433等胺基酸殘基，即可控制以磷脂醯肌醇蛋白聚醣3抗體為始的抗體之血漿中半衰期。另外，上述之H250，H253，H310，H311，H314，H428，H435，H436或H254，H255，H257，H288，H296，H307，H309，H315，H415，H433等胺基酸殘基以外之改變，除了導致PI值之降低之效果，同時由對FcRn的結合性之觀點考量亦產生效果之現象，為意外的驚訝之結果。

並非意圖受到特定之理論拘束，而本發明人等在現在的時間點，係如以下之方式作考量。往內皮細胞之非特異性的IgG抗體之收取速度，係被認為依賴於帶負電荷之細胞表面與IgG抗體之物理化學的庫侖交互作用。因此，藉由以IgG抗體之pI降低(上昇)使庫侖交互作用減低(增大)而使得往內皮細胞之非特異性的收取減少(增大)之結果，認為藉著使在內皮細胞之代謝減少(增大)可控制血漿中動態。另外，此處所謂的庫侖交互作用之減低係意指以斥力所表示之庫侖力之增大。

由於抗體與內皮細胞之細胞表面負電荷之庫侖交互作用係物理化學的交互作用，故認為此交互作用並非完全地依賴於構成抗體的胺基酸序列本身。為此，於本發明揭示的血漿中動態之控制方法並非僅適用於特定抗體，或磷脂醯肌醇蛋白聚醣3抗體，可廣泛適用於任意抗體，或磷脂醯肌醇蛋白聚醣3抗體。

使用IgG抗體作為本發明之以磷脂醯肌醇蛋白聚醣3抗體為始的抗體的情況下，只要為IgG型之抗體分子，任何一種亞型或雙重特異性之IgG抗體皆可。

本發明之以磷脂醯肌醇蛋白聚醣3抗體為始的抗體為雙重特異性抗體的情況下，該抗體亦可對該抗體結合之抗原(在磷脂醯肌醇蛋白聚醣3抗體之情況為磷脂醯肌醇蛋白聚醣3分子)與該抗原以外之抗原之表位特異性地結合。例如就該抗原以外之抗原而言，為了補充NK細胞，細胞傷害性T細胞，LAK細胞等，可適合地利用特異性地結合於該等細胞之表面抗原。曾經有揭示出使用由識別腺癌關連抗原之MUC1之抗體MUSE 11與識別LAK細胞表面抗原之抗體OKT3所製作之雙重特異性抗體，對膽管癌，會發揮LAK細胞造成之傷害之活性(非專利文獻17)。本發明提供之血漿中動態經改善之以磷脂醯肌醇蛋白聚醣3抗體為始的抗體，係可適合使用於代替識別上述MUC1之抗體MUSE 11。另外，就本發明所提供的雙重特異性之以磷脂醯肌醇蛋白聚醣3抗體為始的抗體而言，亦可適當地利用識別與該抗體結合之抗原(脂醯肌醇蛋白聚醣3抗體的情況下，為磷脂醯肌醇蛋白聚醣3分子)相異之表位之抗體。另外，即使為抗體分子，在如scFv或Fab般以腎排泄為其主要的代謝路徑之低分子抗體的情況下，係如上述般，其抗體之血漿中動態無法藉由pI受到控制。但是，本發明只要是在腎排泄並非主要的代謝路徑之Fc結合蛋白質之情況下，任何抗體分子型皆可適用。可列舉例如scFv‧Fc、dAb‧Fc、Fc融合蛋白質等。由於該等分子之主要的代謝路徑，並非由腎排泄產生之代謝而進行者，因此藉由在本發明所發現之方法，藉著使pI變化可控制該等分子之血漿中動態。本發明可適用之抗體分子為抗體般之分子亦可。如抗體般之分子，係指藉著結合於目標分子而發揮機能的分子(非專利文獻18)，可列舉例如DARPins、Antibody、Avimer等。

在本發明中「使血漿中動態經控制」係意指在構成以磷脂醯肌醇蛋白聚醣3抗體為始的抗體之胺基酸之改變前與改變後之抗體之血漿中動態相比，血漿中動態往所希望之方向改變。亦即，在希望延長以磷脂醯肌醇蛋白聚醣3抗體為始的抗體之血漿中半衰期的情況下，「血漿中動態之控制」係指其抗體之血漿中半衰期延長。在希望縮短以磷脂醯肌醇蛋白聚醣3抗體為始的抗體之血漿中半衰期之的情況下，「血漿中動態之控制」係指縮短其抗體之血漿中半衰期。

在本發明中以磷脂醯肌醇蛋白聚醣3抗體為始的抗體之血漿中動態是否往所希望之方向改變，亦即血漿中動態是否如所希望般受到控制，係可藉由實施使用例如小鼠、大鼠、兔、狗、猴等的動態測試適宜地進行評估。另外，本發明中之「血漿中半衰期的延長」或「血漿中半衰期的縮短」，較具體而言，除了所謂血漿中半衰期之參數以外，亦可藉由平均血漿中滯留時間、或血漿中清除率等任一參數掌握(「藉由藥物動力學演習的理解」(南山堂))。例如依據附屬於體內動態解析軟體WinNonlin(Pharsight)之順序書，藉由實施Noncompartmental解析，可對本發明所提供的「血漿中動態之控制」，使用該等參數適當地評估。

在本發明中「可暴露在表面的胺基酸殘基」通常係指在構成以磷脂醯肌醇蛋白聚醣3抗體為始的抗體的多胜肽之表面之胺基酸殘基。「在多胜肽之表面的胺基酸殘基」係指其側鏈可相接於溶劑分子(通常大多為水分子的情形)的胺基酸殘基，未必其全部側鏈有相接於溶劑分子的必要，即使其側鏈的一部份相接於溶劑分子的情況下，其胺基酸殘基係規定為在表面的胺基酸殘基。藉由使用市售軟體的同源模擬等，業界人士可製作多胜肽或抗體之同源模型。以該同源模型為基準，在構成以磷脂醯肌醇蛋白聚醣3抗體為始的抗體之多胜肽表面的胺基酸殘基，係可適當地選擇作為「在多胜肽之表面的胺基酸殘基」。

在本發明中「可暴露在表面的胺基酸殘基」並非受到特別限制者，而以在磷脂醯肌醇蛋白聚醣3抗體為始的抗體中之FcRn結合區域之外的胺基酸殘基者為佳。此FcRn結合區域係可適合列舉例如Fc區域，而較具體而言，可列舉由以Kabat編號為基準之胺基酸殘基H250，H253，H310，H311，H314，H428，H435，H436之一個以上的胺基酸殘基所構成之區域。其他，間接地作用於IgG抗體與FcRn之交互作用之胺基酸殘基H254，H255，H257，H288，H296，H307，H309，H315，H415，H433亦可列舉作為其改變對象。該等胺基酸殘基，分別相當於例如序列號碼30中之130，133、190、191，194、308、315、第316號胺基酸殘基，以及134、135、137、168、176、187、189、195、295、第313號胺基酸殘基，及序列號碼31中之133、136、193、194、197、311、318、第319號胺基酸殘基，以及137、138、140、171、179、190、192、198、298、第316號胺基酸殘基。

根據本發明，在以磷脂醯肌醇蛋白聚醣3抗體為始的抗體中，欲改變電荷之胺基酸殘基，係以構成抗體之重鏈(亦稱為H鏈)可變區域或輕鏈(亦稱為L鏈)可變區域的胺基酸殘基者為佳。就該可變區域而言，具體地可適合列舉互補決定區域(CDR)、架構區域(FR)。

只要為業界人士，在抗體可變區域的表面胺基酸殘基，係可由藉由同源模擬等所製作之同源模型適宜地選擇。亦即，可由以Kabat編號為基準之胺基酸殘基H1，H3，H5，H8，H10，H12，H13，H15，H16，H19，H23，H25，H26，H39，H42，H43，H44，H46，H68，H71，H72，H73，H75，H76，H81，H82b，H83，H85，H86，H105，H108，H110，H112之中，適宜選擇抗體可變區域中之表面胺基酸殘基。例如在以序列號碼1所表示之人化之磷脂醯肌醇蛋白聚醣3抗體之重鏈FR中，1、3、5、8、10、12、13、15、16、19、23、25、26、39、42、43、44、46、69、72、73、74、76、77、82、85、87、89、90、107、110、112、第114號胺基酸殘基係可例示為表面胺基酸，而本發明並未受到該等所限定。另外，重鏈CDR中之表面胺基酸殘基，係可藉由相同的同源模型進行選擇。亦即，以Kabat編號為基準之胺基酸殘基H97，係在幾乎全部的抗體都會露出於表面。例如以序列號碼1所表示之人化之磷脂醯肌醇蛋白聚醣3抗體之重鏈CDR中之第101號之絲胺酸，係相當於該胺基酸殘基者。就以序列號碼1所表示之人化之磷脂醯肌醇蛋白聚醣3抗體之重鏈CDR中之其他胺基酸殘基而言，可適合列舉52、54、62、63、65、第66號胺基酸殘基。

在輕鏈FR中，可由以Kabat編號為基準之胺基酸殘基L1，L3，L7，L8，L9，L11，L12，LI6，L17，L18，L20，L22，L38，L39，L41，L42，L43，L45，L46，L49，L57，L60，L63，L65，L66，L68，L69，L70，L74，L76，L77，L79，L80，L81，L85，L100，L103，L105，L106，L107之中，適宜選擇抗體可變區域中之表面胺基酸殘基。可例示例如以序列號碼7所表示之人化之磷脂醯肌醇蛋白聚醣3抗體之1、3、7、8、9、11、12、16、17、18、20，22，43，44，45，46，48，49，50，54，62，65，68，70，71，73，74，75，79，81、82、84、85、86、90、105、108、110、111、112作為表面胺基酸，而本發明並未受到該等所限定。另外，輕鏈CDR中之表面胺基酸殘基，係可藉由與由此決定重鏈CDR中之表面胺基酸殘基之同源模型相同的同源模型進行選擇。就於以序列號碼7所表示之人化之磷脂醯肌醇蛋白聚醣3抗體之輕鏈CDR之胺基酸殘基而言，可適合列舉24、27、33，55、第59號胺基酸殘基。

本發明所提供的方法中胺基酸殘基之「改變」，具體而言係指將原本的胺基酸殘基取代成其他胺基酸殘基、使原本的胺基酸殘基缺失、附加新的胺基酸殘基等，而宜為將原本的胺基酸殘基取代成其他胺基酸殘基。亦即，本發明中所謂的「胺基酸殘基之電荷的改變」，適宜者可列舉胺基酸取代。

為了對本發明所提供的磷脂醯肌醇蛋白聚醣3抗體，進行上述「胺基酸殘基之電荷的改變」，例如選自構成以序列號碼1所表示之人化之磷脂醯肌醇蛋白聚醣3抗體之重鏈可變區域中之19、43、52、54、62、63、65、66、第107號胺基酸殘基至少1個的胺基酸殘基的電荷經過適合地改變。另外，例如選自構成以序列號碼7所表示之人化之磷脂醯肌醇蛋白聚醣3抗體之的輕鏈可變區域中之17、24、27、33、55、59、79、82、105、第112號胺基酸殘基至少1個的胺基酸殘基的電荷經過適合地改變。上述之胺基酸殘基之內、該電荷經過改變之胺基酸殘基以外之胺基酸殘基，只要可得到目的血漿中動態之控制效果，則沒有改變的必要，而適宜地，具有與經過改變的胺基酸殘基同種的電荷，或不具有電荷之方式，可適當地改變。

已知在胺基酸之中，存在有帶電荷的胺基酸。一般就帶正電荷的胺基酸(正電荷胺基酸)而言，已知有離胺酸(K)、精胺酸(R)、組胺酸(H)。就帶負電荷的胺基酸(負電荷胺基酸)而言，已知有天門冬胺酸(D)、麩胺酸(E)等。該等以外的胺基酸係已知為不具有電荷的胺基酸。

就上述「經過改變的胺基酸殘基」而言，宜為由以下之(a)或(b)任一群所包含之胺基酸殘基適宜地選擇，而並未特別受到該等胺基酸限制。

(a)麩胺酸(E)、天門冬胺酸(D)

(b)離胺酸(K)、精胺酸(R)、組胺酸(H)

另外，原本的(改變前的)胺基酸殘基已經具有電荷的情況，以成為不具有電荷的胺基酸殘基之方式改變之情形亦為本發明之適合態樣之一。亦即，就本發明中之改變而言，可列舉(1)由具有電荷的胺基酸取代為不具有電荷的胺基酸、(2)由具有電荷的胺基酸取代為具有與該胺基酸相反電荷的胺基酸、(3)由不具有電荷的胺基酸取代為具有電荷的胺基酸。

在本發明中，以磷脂醯肌醇蛋白聚醣3抗體為始的抗體之等電點(pI)變化之方式，使構成抗體的胺基酸殘基經改變之情形為佳。另外，在經改變之胺基酸殘基為複數存在的情況下，於供改變之胺基酸殘基之中，可含有少數程度不具有電荷之胺基酸殘基。

就本發明所提供的磷脂醯肌醇蛋白聚醣3抗體中之「胺基酸殘基之電荷的改變」之適合例子而言，可列舉以下之物。使pI值增加的改變而言，可進行例如構成以序列號碼1所表示之人化之磷脂醯肌醇蛋白聚醣3抗體之重鏈可變區域中之Q43K、D52N、Q107R之至少1個的取代，特佳為改變成序列號碼4或以序列號碼6所表示的胺基酸序列。另外，可進行例如構成以序列號碼7所表示之人化之磷脂醯肌醇蛋白聚醣3抗體之輕鏈可變區域中之E17Q、Q27R、Q105R之至少1個的取代，特佳為改變成序列號碼10或以序列號碼12所表示的胺基酸序列。另一方面，使pI值減少的改變而言，可進行構成以序列號碼1所表示之人化之磷脂醯肌醇蛋白聚醣3抗體之重鏈可變區域中之K19T、Q43E、G62E、K63S、K65Q、G66D之至少1個的取代，特佳為改變成以序列號碼3、序列號碼5、序列號碼27所表示的胺基酸序列。另外，可進行例如構成以序列號碼7所表示之人化之磷脂醯肌醇蛋白聚醣3抗體之輕鏈可變區域中之R24Q、Q27E、K79T、R82S、K112E之至少1個的取代，特佳為改變成以序列號碼9、序列號碼11、序列號碼28或以序列號碼29所表示的胺基酸序列。再者，使pI值減少的改變而言，可列舉在重鏈恆定區域中，以Kabat編號為基準而特定胺基酸殘基H268、H274、H355、H356、H358、H419之至少一個的取代。該等取代，可列舉例如以序列號碼31所表示之重鏈恆定區域之第151號胺基酸殘基H至Q之取代、第157號胺基酸殘基K至Q之取代、第238號胺基酸殘基R至Q之取代、第239號胺基酸殘基D至E之取代、第241號胺基酸殘基L之M之取代、第302號胺基酸殘基Q至E之取代等一個或其以上之取代為適合之例。

該等取代之結果，構築了人類抗體之IgG1之恆定區域與IgG4之恆定區域之嵌合體。亦即，藉由該取代，不會對經改變的抗體之免疫原性造成影響，而可製作具有所希望之pI的抗體。

在本發明中，供改變之胺基酸殘基之數目，並無特別受到限制，而在例如改變抗體之可變區域的情況，為了不使與抗原的結合活性降低，另外還為了不使免疫原性上升，係以用於達成作為目的之經控制血漿中動態而有必要之最低限度的胺基酸殘基經過改變者為佳。另外，還可適當地組合會導致與抗原結合活性增大的胺基酸殘基之改變，或會導致免疫原性降低的胺基酸殘基之改變而適當地實施。

對於抗體之抗原結合活性之測定而言，可使用周知之手段。例如可使用ELISA(酵素結合免疫吸附檢定法)、EIA(酵素免疫測定法)、RIA(放射免疫測定法)或螢光免疫法等。在一般的教科書「Antibodies A Laboratory Manual. Ed Harlow，David Lane Cold Spring Harbor Laboratory,1988」記載著上述之方法。

就測定對細胞之抗體的結合活性之方法而言，可列舉例如Antibodies A Laboratory Manual.(Ed Harlow,David Lane Cold Spring Harbor Laboratory,1988)中之359-420頁所記載之方法。亦即，可藉由以細胞作為抗原之ELISA或FACS(fluorescence activated cell sorting)之原理進行評估。在ELISA格式中，抗體對細胞之結合活性，係可藉由比較由酵素反應生成的訊號等級而定量地評估。亦即，於固定化各強制表現細胞之ELISA盤加入被驗抗體，利用識別被驗抗體之酵素標識抗體，偵測出結合於細胞之抗體。或藉由在FACS中，製作被驗抗體的稀釋系列，決定對各強制表現細胞之抗體結合力價(titer)可比較對細胞之結合活性。

在並未結合於ELISA盤等擔體，而懸浮於緩衝液等之細胞表面上，所表現之抗原與對該抗原之抗體之結合，係可藉由FACS格式測定。就如此測定所使用的流動式細胞計數器而言，可列舉例如FACs Canto TMII，FACS Aria TM，FACS Array TM，FACs Vantage TM SE，FACSCaliburTM(以上為BD Biosciences)或、EPICsALTRA HyPerSort，Cytomics FC 500，EPICS XL-MCLADC，EPICS XL ADC，Cell Lab Quanta/Cell Lab Quanta SC(以上為Beckman Coulter)等。

被檢測之磷脂醯肌醇蛋白聚醣3抗體對抗原的結合活性所適合的測定方法之一例而言，可列舉使表現磷脂醯肌醇蛋白聚醣3的細胞與被檢抗體進行反應，以識別被檢抗體之FITC標識之二次抗體將細胞染色之後，藉由FACSCalibur(BD)進行測定，使用CELL QUEST Software(BD)解析其螢光強度的方法。根據本方法，對於所表現之磷脂醯肌醇蛋白聚醣3的細胞表面上磷脂醯肌醇蛋白聚醣3，將結合之被檢抗體，以特異性地識別之FITC標識之二次抗體進行染色後，在藉由FACS Calibur進行測定的情況下，可藉著比較藉由使用CELL QUEST software解析其螢光強度的方法所得到的Geometric Mean值(被檢Geo-Mean值)，與使用對照抗體所得到的對照Geo-Mean值而進行判斷。求得Geo-Mean值(Geometric Mean)之計算式係記載於CELL QUEST Software User's Guide(BDbiosciences公司)。

另外，為了不使投予抗體在人體內之免疫原性上升，經改變的胺基酸序列係以人類序列(被發現於來自人類的天然之抗體之序列)為佳，而本發明並沒有受此限定的情形。進一步，在改變後，以使複數FR之各個(FR1、FR2、FR3、FR4)成為人類序列之方式，並且在等電點變化之方式導入之改變以外之處，可適合地導入變異。如此方式進行之將各FR取代為人類序列之方法，係被報告於非專利文獻25。另外，為了使抗體之等電點變化，以使各FR的電荷變化之方式改變為其他人類FR亦可(例如以抗體等電點降低之方式，將FR3與其他人類FR交換亦可)。如此的人化方法係被報告於非專利文獻26。

另外，藉由些許的表面電荷改變，在未到達目的之經控制之血漿中動態的情況下，藉著重覆進行表面電荷之改變與血漿中動態之評估，可適當地取得表現出目的之經控制之血漿中動態之所希望的以磷脂醯肌醇蛋白聚醣3抗體為始的抗體。

在非專利文獻16之中，揭示了抗E，P-selectin抗體之嵌合體抗體(IgG4)之chimeric EP5C7.g4與人化抗體(IgG4)之HuEP5C7.g4之恆河猴中之血漿中動態作比較，則兩者的血漿中動態為同等。另外，在非專利文獻19之中，揭示了抗CD 154抗體之嵌合體型抗體之ch5d8與人化抗體之Hu5c8之食蟹猴中之血漿中動態作比較，則兩者的血漿中動態為同等。在非專利文獻20之中，揭示了嵌合體抗體之cCC49與人化抗體之HuCC49之小鼠中之血漿中動態為同等之現象。另外，在非專利文獻21及非專利文獻22之中，揭示了在小鼠的評估，小鼠抗體與人化抗體之血漿中動態分佈為同等，而小鼠Fc及人類Fc，係同時交差於小鼠FcRn，因此認為相同嵌合體抗體與相同人化抗體之血漿中動態分佈為同等。如該等例所揭示般，在具備相同CDR之嵌合體抗體與人化抗體之間，血漿中動態為同等。亦即，藉由非專利文獻7等所揭示的周知方法進行人化的情況，與嵌合體抗體比較則血漿中動態為同等，以周知之方法無法製作使血漿中動態經控制之人化抗體。

相對於此，若使用本發明所揭示的方法，則在使嵌合體以磷脂醯肌醇蛋白聚醣3抗體為始的嵌合體抗體人化時，藉由對可暴露在該嵌合體抗體表面的胺基酸殘基加上改變使該嵌合體抗體之pI改變，可製作相較於該嵌合體抗體使血漿中動態經控制之(亦即，延長其血漿中半衰期，或縮短其血漿中半衰期)人化的以磷脂醯肌醇蛋白聚醣3抗體為始的人化抗體。可暴露在用於控制血漿中動態之人化的以磷脂醯肌醇蛋白聚醣3抗體為始的人化抗體表面的胺基酸之改變，係與抗體之人化同時實施亦可，或者亦可藉由使用人化的以磷脂醯肌醇蛋白聚醣3抗體為始的人化抗體作為起始材料，改變可暴露在其表面的胺基酸殘基，進一步改變人化抗體之pI。

於非專利文獻23中，記載了使用相同的人類抗體之FR序列，進行人化的3種人化抗體trastuzumab、bevacizumab、pertuzumab的血漿中動態係幾乎同等。亦即，使用相同FR序列進行人化之情況，血漿中動態幾乎同等。根據於本發明揭示的方法，藉由如上述般人化之步驟，加上對可暴露在以磷脂醯肌醇蛋白聚醣3抗體為始的抗體表面的胺基酸殘基施加改變而使抗體之pI改變，成為可控制以磷脂醯肌醇蛋白聚醣3抗體為始的抗體在血漿中的濃度。

另外，本發明之方法亦可適用於人類抗體。藉由對可露出於由人類抗體庫或產生人類抗體之小鼠等所製作之人類的以磷脂醯肌醇蛋白聚醣3抗體為始的人類抗體表面之胺基酸殘基施加改變而使人類抗體之pI改變，可製作與最初製作的人類抗體之血漿中動態相比，使其在血漿中動態經控制之(亦即，延長其血漿中半衰期，或縮短其血漿中動態)人類的以磷脂醯肌醇蛋白聚醣3抗體為始的人類抗體。

藉由抗體所具有的pI值減少，會使抗體之血漿中半衰期延長。與其相反地，已知藉由抗體之pI值增大，血漿中半衰期縮短，抗體之組織轉移性提升(非專利文獻27及28)。然而，由於該抗體免疫原性增加，另外往細胞內之內在化活性亦增大，因此為了適用於透過由ADCC或CDC活性等其活性之發揮使往細胞內之內在化活性成為阻礙要因之細胞傷害活性等機構而發揮對癌治療效果的抗體，逐漸需要更進一步改良。亦即關於透過由ADCC或CDC活性等其活性之發揮使往細胞內之內在化活性成為阻礙要因之細胞傷害活性等機構而發揮對於癌症治療效果的抗體，抗體之pI值增加或減少之任一者是否導致腫瘤抑制效果之增強仍然為未知。在本發明中，製作其pI值減少的人化之磷脂醯肌醇蛋白聚醣3抗體之改變抗體與其pI值增加的人化之磷脂醯肌醇蛋白聚醣3抗體之改變抗體，藉由比較檢討兩者的抗腫瘤效果，檢驗何者改變會導致高腫瘤抑制效果。其結果令人驚訝地，顯示pI值減少的人化之磷脂醯肌醇蛋白聚醣3抗體為對肝癌發揮較優異的效果。

於本發明中之「磷脂醯肌醇蛋白聚醣3抗體」，係包含使用如上述之方式胺基酸殘基的電荷經改變之磷脂醯肌醇蛋白聚醣3抗體為起始材料，藉由構成該磷脂醯肌醇蛋白聚醣3抗體的胺基酸殘基之取代、缺失、附加及/或插入等，進一步改變其胺基酸序列的磷脂醯肌醇蛋白聚醣3抗體。另外，於本發明中之「磷脂醯肌醇蛋白聚醣3抗體」，亦包含藉由胺基酸殘基之取代、缺失、附加及/或插入，或嵌合體化或人化等，使用胺基酸序列被改變的磷脂醯肌醇蛋白聚醣3抗體為起始材料使構成該磷脂醯肌醇蛋白聚醣3抗體的胺基酸殘基的電荷被進一步改變的磷脂醯肌醇蛋白聚醣3抗體。

以提升本發明所提供的以磷脂醯肌醇蛋白聚醣3抗體為始的抗體之特性作為目的之改變的例示而言，可適合列舉提高抗體之安定性作為目的之改變(以下稱為安定性之改變)。水溶液中之抗體，係在天然狀態與不活性的變性狀態之兩狀態間平衡化。天然狀態之安定性，係以熱力學第二定律(ΔG=ΔH-TΔS)所表示般，依賴於系統之吉布士自由能量變化ΔG及其細項之焓變化ΔH(起因於多胜肽鏈中之疏水性交互作用或氫結合等變化)與熵變化ΔS(起因於溶劑合作用與立體構造之自由度之變化)之平衡。正值之ΔG，係意指蛋白質之天然狀態相較於蛋白質之變性狀態為安定，ΔG表示較大之正值的情況下，蛋白質之天然狀態之安定性進一步增大。為了使蛋白質變性，有將此貢獻於安定化的力破壞之必要。例如，藉由將蛋白質溶液暴露於高溫，使立體構造之自由度增大，由於貢獻於蛋白質之安定化之因子被減弱，而引起蛋白質之熱變性，而此情況-TΔS項成為支配變性。蛋白質之熱變性所造成解褶疊之ΔH係如在本說明書所記載之實施例中具體地記載般，可使用DSC(differential scanning calorimetry；示差掃描熱量測定法)直接測定。蛋白質之熱變性程序中之DSC曲線，係於稱為變性中點(Tm)的被驗蛋白質夾著固有之溫度而成為吸熱峰。藉由將該峰積分，可得到變性焓變化。一般而言Tm之值為熱安定性的一個指標。藉由DSC，亦可測定蛋白質發生熱變性時之熱容量變化(ΔCp)。伴隨熱變性產生之熱容量變化，主要地起因於在蛋白質以天然狀態存在時，並未露出於分子表面之胺基酸殘基伴隨蛋白質之變性露出於溶劑分子之結果而發生水合。

如同上述般，在本發明所提供的方法中之胺基酸殘基之「改變」，具體而言係意指將原本的胺基酸殘基取代成其他胺基酸殘基，使原本的胺基酸殘基缺失、附加新的胺基酸殘基等，而宜為將原本的胺基酸殘基取代成其他胺基酸殘基。亦即，為了改變本發明中之抗體之安定性，可適宜使用由胺基酸取代所造成之改變。對構成以磷脂醯肌醇蛋白聚醣3抗體為始的抗體的胺基酸殘基，施加安定性之改變之結果，抗體的上述Tm值增大。亦即，適合使用上述Tm值作為以磷脂醯肌醇蛋白聚醣3抗體為始的抗體之施加安定性之改變的指標。

本發明所提供的磷脂醯肌醇蛋白聚醣3抗體，為了進行上述「安定性之改變」，選自例如構成以序列號碼1所表示之人化之磷脂醯肌醇蛋白聚醣3抗體之重鏈可變區域中之37、40、48、第51號胺基酸殘基至少1個的胺基酸殘基經過適合地改變。

另外，選自例如構成以序列號碼7所表示之人化之磷脂醯肌醇蛋白聚醣3抗體之輕鏈可變區域中之2、25、42、48、50、83、第84號胺基酸殘基至少1個的胺基酸殘基經過適合地改變。上述之胺基酸殘基之內，施加該安定性之改變之胺基酸殘基以外之胺基酸殘基，只要可得到所希望之Tm值則沒有改變的必要，而可適宜為以與供改變的人化之磷脂醯肌醇蛋白聚醣3抗體之Tm值同程度，或具有其以上之Tm值之方式適當地改變。

安定性之改變，係可藉由隨機地改變構成供改變的人化的以磷脂醯肌醇蛋白聚醣3抗體為始的抗體之各胺基酸殘基而實施。另外，亦可藉由將構成供改變的人化的以磷脂醯肌醇蛋白聚醣3抗體為始的人化抗體之胺基酸序列之一部份取代為構成Tm值高之既已存在的抗體之胺基酸序列，且該供改變的人化的以磷脂醯肌醇蛋白聚醣3抗體為始的人化抗體的胺基酸序列之一部份與抗體之立體構造相關之觀點所對應的序列而實施。經取代的胺基酸殘基之位置並非受到限定者，而FR中之胺基酸殘基可適合地改變。另外，即使CDR中之胺基酸殘基，只要不伴隨對抗原之結合活性之縮減，即可適當地改變。

另外，經改變的胺基酸殘基之數目並未受到特別限定，亦可藉由將FR之特定片段取代為所希望之片段而實施。該片段，亦可將FR之內FR1、FR2，FR3、FR4各片段之全部改變，另外，亦可藉由組合一個或其以上之各片段之改變而實施。

改變FR之片段的情況下，可列舉重鏈或輕鏈之FR2作為適合之例。例如將具有以序列號碼1所表示之VH1b之亞型之人化之磷脂醯肌醇蛋白聚醣3抗體之重鏈之FR2改變為VH4之亞型之胺基酸殘基之改變，亦即，將第37號之纈胺酸取代為異白胺酸之V37I、相同地可列舉A40P、M48I、L51I之改變作為適合的具體例。另外，可列舉例如將具有以序列號碼7所表示之VK2之亞型之人化之磷脂醯肌醇蛋白聚醣3抗體之輕鏈FR2區域改變為VK3之亞型，亦即L42 Q、S48A、Q50R之改變，進一步可列舉相當於改變為FR 1生殖細胞系列之序列之V2I之改變作為適合之具體例。

構成以磷脂醯肌醇蛋白聚醣3抗體為始的抗體的胺基酸殘基之取代、缺失、附加及/或插入，以及人化、嵌合體化等胺基酸序列之改變，任一者皆可藉由業界人士所周知之方法適合地進行。相同地，將本發明所提供的以磷脂醯肌醇蛋白聚醣3抗體為始的抗體製作為重組抗體時，可適合地進行構成抗體之可變區域及恆定區域的胺基酸殘基之取代、缺失、附加及/或插入。

本發明中之以磷脂醯肌醇蛋白聚醣3抗體為始的抗體，係由小鼠抗體、人類抗體、大鼠抗體、兔子抗體、山羊抗體、駱駝抗體等任何一種動物而來之抗體皆適合使用。再者，例如嵌合體抗體，其中尤其以如人化抗體等般，其胺基酸序列經取代的改變之以磷脂醯肌醇蛋白聚醣3抗體為始的抗體亦可適合使用。另外，亦可適合使用結合了各種分子的抗體修飾物。

「嵌合體抗體」係指將來自相異動物的序列加以組合而製作的抗體。可適合例示例如由小鼠抗體之重鏈、輕鏈之可變區域與人類抗體之重鏈、輕鏈之恆定區域所構成之抗體。嵌合體抗體之製作方法為周知的。例如將編碼抗體可變區域的DNA與編碼人類抗體恆定區域的DNA以順框融合之重組DNA，係可被編入通常所使用之表現載體。藉由培養導入了該載體的宿主細胞，可適宜地由其培養液取得或分離嵌合體抗體。

人化抗體亦被稱為再構成(reshaped)人類抗體，由人類的以外之哺乳動物(例如小鼠等)所分離之抗體的互補決定區域(CDR；complementary determining region)與人類抗體之架構區域(FR；framework region)連結的抗體。編碼人化抗體的DNA序列，係可藉由使用複數個的寡核苷酸作為鑄型之重疊PCR反應而合成。重疊PCR反應之材料，其實施方法被記載於WO98/13388等。本發明之編碼人化抗體之可變區域之DNA，係由以具有互相重疊之核苷酸序列之方式製作之複數個的寡核苷酸，藉由重疊PCR而得到，此為與編碼人類抗體恆定區域的DNA以順框形成密碼子序列之方式而連結。

上述之方式連結之DNA，接著以表現該DNA之方式插入於表現載體，而導入至宿主。

用於識別CDR之方法為周知的(Kabat et al.,sequence of Proteins of Immuno1ogical Interest(1987)，National Institute of Health, Bethesda, Md.； Chothia et al., Nature(1989)342,877)。另外，其一般的基因重組手法亦為周知的(參照歐洲專利申請公開號碼EP125023號公報、WO96/02576號公報)。藉由使用該等周知方法，例如在取自小鼠抗體等非人類動物之抗體之CDR被決定之後，構築編碼連結該CDR與人類抗體之FR之重組抗體之DNA。透過CDR連結之人類抗體之FR係以CDR形成良好的抗原結合部位之方式選擇。只要有必要，以再構成人類抗體之CDR形成適當的抗原結合部位之方式，在抗體之可變區域之FR之胺基酸殘基可適當地改變(sato et al., Cancer Res.(1993)53,851-6)。就供改變的FR中之胺基酸殘基而言，係包含對於抗原藉由非共價鍵直接鍵結之殘基(Amit et al， Science(1986)233,747-53)，影響或作用於CDR構造之殘基(Chothia et al., J. Mol. Biol.(1987)196,901-17)以及關連於VH-VL(重鏈可變區域-輕鏈可變區域)交互作用之殘基(EP239400號專利公報)。

藉由插入該DNA之通常所使用之表現載體而經過形質轉換或經過形質導入的宿主細胞所生產之人化抗體(由該DNA編碼)，係藉由培養該宿主細胞，由該培養液分離。

本發明所提供的抗體為嵌合體抗體、人化抗體或人類抗體的情況下，適合使用人類抗體由來之恆定區域作為該抗體之恆定區域。例如本發明所提供的磷脂醯肌醇蛋白聚醣3抗體為嵌合體之磷脂醯肌醇蛋白聚醣3抗體、人化之磷脂醯肌醇蛋白聚醣3抗體或人類之磷脂醯肌醇蛋白聚醣3抗體的情況下，適合使用人類抗體由來之恆定區域作為該磷脂醯肌醇蛋白聚醣3抗體之恆定區域。例如分別就重鏈恆定區域而言，可適合地使用Cγ1、Cγ2、Cγ3、Cγ4，輕鏈恆定區域而言，可適合地使用Cκ、Cλ。另外，為了改善以磷脂醯肌醇蛋白聚醣3抗體為始的抗體或其產生之安定性，可適宜地修飾人類抗體恆定區域。本發明所提供的嵌合體以磷脂醯肌醇蛋白聚醣3抗體為始的嵌合體抗體，係由取自人類的以外之哺乳動物所抗體之可變區域與人類抗體之恆定區域適當地構成。另一方面，人化抗體，宜為由取自人類的以外之哺乳動物之抗體之CDR與人類抗體之FR及恆定區域適當地構成。例如人化之磷脂醯肌醇蛋白聚醣3抗體，宜為由取自人類以外之哺乳動物之磷脂醯肌醇蛋白聚醣3抗體之CDR、與人類抗體之FR及恆定區域適合地構成。另外，人類抗體，係由取自人類抗體之CDR、與人類抗體之FR及恆定區域適合地構成。例如人類之磷脂醯肌醇蛋白聚醣3抗體，係由取自人類之磷脂醯肌醇蛋白聚醣3抗體之CDR、與人類抗體之FR及恆定區域適合地構成。人類抗體之恆定區域，係由對應於IgG(IgG1、IgG2、IgG3、IgG4)、IgM、IgA、IgD及IgE等異構型之固有的胺基酸序列所構成。就本發明所提供的人化之磷脂醯肌醇蛋白聚醣3抗體之恆定區域而言，屬於任一異構型之抗體之恆定區域亦適合使用。適宜地可使用人類IgG之恆定區域，而並非受到此限定者。另外，人化之以磷脂醯肌醇蛋白聚醣3抗體為始的人化抗體，或作為人類的以磷脂醯肌醇蛋白聚醣3抗體為始的人類抗體之FR而利用之人類抗體之FR，亦並非受到特別限定者，而屬於任一者之異構型抗體之FR亦適合使用。

以免疫原性之降低作為目的，藉由使用與於非專利文獻25所記載之方法類似之方法，亦可適用將構成FR的胺基酸殘基之全部或一部份取代為生殖細胞系列之序列。生殖細胞系列之序列，係基於免疫原性可能為低的合理予測，藉由將構成人化抗體之FR之胺基酸序列與生殖細胞系列的胺基酸序列加以整列而作比較(Abhinandan K. R. and Martin C. R.,J. Mol.Biol.,(2007)369,852-862)。在不失去對抗原之結合性之範圍，在該比較中，構成相異的人化抗體之FR的胺基酸殘基可被生殖細胞系列的序列中之胺基酸殘基取代。就具體例子而言，可列舉構成序列號碼1所表示之重鏈可變區域之胺基酸殘基之內、第70號之L取代為I、第87號之T取代為R、第97號之T取代為A的改變等。另外，構成序列號碼7所表示之輕鏈可變區域的胺基酸殘基之內，可列舉第25號之S取代為A之改變等。

本發明所提供的經改變的嵌合體抗體、人化抗體及人類抗體之可變區域及定常區域，只要能表現出對抗原的結合特異性，則可適合地施行構成供改變的抗體之可變區域及/或恆定區域的一種或其以上之胺基酸之缺失、取代、插入及/或附加等。特別是，本發明所提供的經改變的嵌合體之磷脂醯肌醇蛋白聚醣3抗體、人化之磷脂醯肌醇蛋白聚醣3抗體及人類之磷脂醯肌醇蛋白聚醣3抗體之可變區域及恆定區域，只要能表現出對抗原之磷脂醯肌醇蛋白聚醣3分子之結合特異性，則可適合地施行構成供改變的磷脂醯肌醇蛋白聚醣3抗體之可變區域及/或恆定區域之一或其以上之胺基酸之缺失、取代、插入及/或附加等。

利用來自人類的序列的嵌合體之磷脂醯肌醇蛋白聚醣3抗體、人化之磷脂醯肌醇蛋白聚醣3抗體及人類之磷脂醯肌醇蛋白聚醣3抗體，係由於在人類體內之免疫原性降低，因此認為在以治療目的等使用作為投予至人體之治療用抗體的情況下是有用的。

對於本發明方法中的編碼變異導入前之抗體之重鏈或輕鏈之基因之序列而言，可使用已知的序列，其他可藉由業界人士所周知的方法，取得抗體基因新的序列。該基因可由例如抗體庫適當地取得。進一步，該基因係亦可藉由使用將生產單株抗體之融合瘤之mRNA使用作為鑄型之RT-PCR法等周知的手法進行選殖而取得。

關於抗體庫，有許多抗體庫已為周知的。另外，由於抗體庫的製作方法亦為周知的，業界人士可適宜地獲得或製作抗體庫。例如適合之抗體庫而言，例示了由Clackson et a1.,Nature(1991)352,624-8,Marks et a,.,J. Mol. Biol.(1991)222,581-97,Waterhouses et al.,Nucleic Acids Res.(1993)21.,2265-6,Griffiths et al.,EMBO J.(1994)13,3245-60,Vaughan et al.,Nature Biotechnology(1996)14,309-14、及特表平20-504970號公報等文獻所揭示之抗體噬菌體庫。其他，在真核細胞中，適合使用製作資料庫的方法(WO95/15393號小冊子)或核糖體提示法等周知之方法。再者，將人類抗體庫使用於起始材料，藉由淘選取得人類抗體之技術，在業界人士中為已知的。亦即，人類抗體之重鏈及輕鏈之可變區域以順框融合之單鏈抗體(scFv)藉由噬菌體展示法，表現於噬菌體之表面。藉由選擇對於抗原結合之噬菌體，可由該噬菌體分離編碼結合於抗原之scFv之基因。藉由識別該基因之序列，可決定編碼結合於成為抗原之磷脂醯肌醇蛋白聚醣3之人類之磷脂醯肌醇蛋白聚醣3抗體之重鏈及輕鏈之可變區域之DNA之序列。具有該序列的抗體基因，係適宜地插入表現載體，如後述般，藉由在適當的宿主細胞中表現，可適當地取得人類之磷脂醯肌醇蛋白聚醣3抗體。而該等方法已經周知，可例示WO92/01047、WO92/20791、WO93/06213、WO93/11236、WO93/19172，WO95/01438、WO95/15388所揭示的方法。

由產生抗體的融合瘤取得編碼該抗體之基因之方法，特別是由產生抗體之磷脂醯肌醇蛋白聚醣3單株抗體的融合瘤取得編碼該磷脂醯肌醇蛋白聚醣3抗體之基因的方法，基本上可採用周知技術。於以下作詳述，而簡單而言，依照通常的免疫方法，藉由所希望之致敏抗原之磷脂醯肌醇蛋白聚醣3使動物經過免疫之後，由該動物所得到之免疫細胞係供應至與得自通常的細胞融合法之周知的親細胞之細胞融合。依照通常的篩選法，篩選單株的抗體產生細胞(融合瘤)，將取自所選擇之融合瘤之mRNA使用作為鑄型，磷脂醯肌醇蛋白聚醣3抗體之可變區域(V區域)之cDNA藉由反轉錄酵素而合成。藉由將該cDNA與編碼所希望之抗體恆定區域(C區域)之DNA以順框(in frame)融合，可適當地取得磷脂醯肌醇蛋白聚醣3抗體基因。

較具體而言，可適合列舉如以下的例示，而本發明並非受到該等例示所限定者。為了得到由本發明提供的抗體，所使用之致敏抗原，係具有免疫原性的完全抗原，或含有未表現出免疫原性之半抗原等的不完全抗原皆可。可適合使用例如磷脂醯肌醇蛋白聚醣3之全長蛋白質，或其部分多胜肽或胜肽等。以序列號碼13所表示之可溶型GPC3核心多胜肽，係可列舉為其適合之具體例。其他已知，由多糖類、核酸、脂質等所構成的物質亦作為抗原發揮作用，本發明的結合有磷脂醯肌醇蛋白聚醣3抗體的抗原，係並非特別受到上述物質之態樣限定者。抗原之調製，係藉由業界人士所周知之方法適合地進行，可適合使用例如使用桿狀病毒之方法(例如WO98/46777等)等。抗原之免疫原性低的情況下，藉由結合於具有蛋白素等免疫原性的巨大分子之該抗原，動物可適當地免疫。另外，致敏抗原係如磷脂醯肌醇蛋白聚醣3般貫通細胞膜之分子的情況下，如果有必要，可適當使用該分子之細胞外區域之多胜肽斷片作為致敏抗原。或可適當地使用在細胞表面上表現該分子之細胞作為致敏抗原。再者，致敏抗原為不溶性之分子的情況下，可藉由使該分子與其他的水溶性分子結合而溶化，該可溶化之結合分子適合使用作為致敏抗原。

以磷脂醯肌醇蛋白聚醣3抗體產生細胞為始的抗體產生細胞，係可適合地藉由使用上述適當的致敏抗原，使動物免疫而得到。或藉由使可產生抗體的淋巴球，在invitro之下藉由免疫，可取得以磷脂醯肌醇蛋白聚醣3抗體產生細胞為始之抗體產生細胞。就經過免疫的動物而言，可使用各種脊椎動物、哺乳動物。特別是囓齒目、兔目、靈長目動物一般而言可使用作為免疫動物。例示有小鼠、大鼠、倉鼠等之囓齒目、兔等之兔目、食蟹猴、恆河猴、阿拉伯狒狒、黑猩猩等猴等之靈長目動物。其他還已知將人類抗體基因之目錄保持於其基因組上之基因轉殖動物，由使用如此之動物，可適合地得到人類抗體(參照WO96/34096；Mendez et al.,Nat. Genet.(1997)15,146-56)。替代如此之基因轉殖動物之使用，可藉由例如人類淋巴球在in vitro之下藉著所希望之抗原或表現所希望之抗原之細胞致敏之後，與人類骨髓瘤細胞，例如U266進行細胞融合，適當地得到具有對該抗原之結合活性的所希望之人類抗體(特公平1-59878號公報參照)。另外，藉由將人類抗體基因之全部之目錄保持於其基因組上之基因轉殖動物，以所希望之抗原免疫(參照WO93/12227、WO92/03918、WO94/02602、WO96/34096、WO96/33735)可適合地取得所希望之人類的以磷脂醯肌醇蛋白聚醣3抗體為始的人類抗體。

動物之免疫，係藉由例如使致敏抗原以Phosphate Buffered saline(PBs)或生理食鹽水等適宜稀釋、懸浮，如果有必要，藉著與佐劑混合而乳化之後，將該致敏抗原注射於動物之腹腔內或皮下而實施。其後，宜為將與弗氏不完全佐劑混合之致敏抗原每4~21天投予數次。對經免疫之動物中之致敏抗原之抗體的產生之確認，係可藉由對致敏抗原之該動物血清中之抗體力價，以慣用之方法，例如酵素結合免疫吸附分析(ELISA)、流動式細胞計數器(FACS)等周知之分析法進行測定而實施。

融合瘤係可藉由將經所希望的致敏抗原免疫之動物或淋巴球所得到之磷脂醯肌醇蛋白聚醣3抗體產生細胞，使用為了進行細胞融合所慣用之融合劑(例如聚乙二醇)與骨髓瘤細胞融合而製作(Goding,Monoclonal Antibodies：Principles and Practice,Academic Press,(1986)59-103)。融合瘤之製作，係可依照例如米爾斯坦等之方法(G. Kohler and C. Milstein,Methods Enzymol.(1981)73,3-46)等適當地進行。藉由培養‧增殖以上述之方法製作之融合瘤細胞，可取得與藉由該融合瘤所產生之磷脂醯肌醇蛋白聚醣3特異性地結合之單株抗體。藉由免疫沉降、放射免疫分析(RIA)、酵素結合免疫吸附分析(ELISA)、流動式細胞計數器(FACS)等周知之分析法，可適宜測定該單株抗體之對磷脂醯肌醇蛋白聚醣3之結合特異性。其後，如果有必要，生產所希望之特異性、親和性或活性經過測定之磷脂醯肌醇蛋白聚醣3抗體之融合瘤係藉由限數稀釋法等手法，經過適當地次選殖(subclone)，可分離出藉由該融合瘤所產生之單株抗體。

接著，編碼所選擇的抗體之基因，係可由上述之融合瘤或抗體產生細胞(致敏淋巴球等)，使用可特異性地結合於該基因之探子(例如與編碼抗體恆定區域之序列互補的寡核苷酸等)進行選殖。另外，可藉由將由融合瘤或抗體產生細胞(致敏淋巴球等)取得的mRNA使用作為鑄型之RT-PCR法進行選殖。免疫球蛋白，係基於其構造及機能之相異而分類為IgA、IgD、IgE、IgG及IgM之5種相異的類別。再者，各類別分類為數種亞型(異構型)(例如IgG1、IgG2、IgG3、及IgG4；IgA1及IgA2等)。藉由本發明所提供之抗體為，來自屬於該等任一者類別及亞型之抗體者皆可，並未特別受到任一類別及亞型所限定，而可列舉屬於IgG類別之抗體為特別適合者。

編碼構成以磷脂醯肌醇蛋白聚醣3抗體為始的抗體之重鏈及輕鏈之胺基酸序列之基因，係可藉由基因工學的手法適宜地改變。例如，藉由將編碼構成小鼠抗體、大鼠抗體、兔抗體、倉鼠抗體、綿羊抗體、駱駝抗體等抗體的胺基酸序列的核酸殘基加以改變，可適宜製作施加人為改變(目的為使對人類的異種免疫原性降低等)之基因重組抗體，例如嵌合體之以磷脂醯肌醇蛋白聚醣3抗體為始的嵌合體抗體、人化之以磷脂醯肌醇蛋白聚醣3抗體為始的人化抗體等。嵌合體抗體係可由人類的以外之哺乳動物，例如來自小鼠的抗體之重鏈、輕鏈之可變區域與人類抗體之重鏈、輕鏈之恆定區域所構成之抗體，例如將編碼來自小鼠的抗體之可變區域的DNA與編碼人類抗體之恆定區域的DNA作連結，將此編入於表現載體之重組載體導入至宿主之後，藉由表現而可得到。人化抗體亦稱為再構成(reshaped)人類抗體，而係由人類的以外之哺乳動物，例如小鼠等分離之以磷脂醯肌醇蛋白聚醣3抗體為始的抗體的互補決定區域(CDR；complementary determining region)與人類抗體之架構區域以順框形成密碼子序列之方式連結之抗體。編碼此人化抗體之DNA序列，係可藉由使用複數個的寡核苷酸作為鑄型之重疊PCR反應而合成。重疊PCR反應之材料、與其實施方法，係記載於WO98/13388等。

編碼本發明之基因重組之以磷脂醯肌醇蛋白聚醣3抗體為始的基因重組抗體之可變區域之DNA，可由以具有互相重疊之核苷酸序列之方式製作之複數個的寡核苷酸藉由重疊PCR而得到，此為與編碼人類抗體恆定區域之DNA以順框形成密碼子序列之方式連結。以上述方式連結之DNA，接下來以表現該DNA之方式插入至表現載體而導入至宿主。以該DNA編碼的以磷脂醯肌醇蛋白聚醣3抗體為始的抗體，係藉由培養該宿主而表現。所表現出的以磷脂醯肌醇蛋白聚醣3抗體為始的抗體，係可藉由從該宿主之培養液等適宜精製(參照EP239400:WO96/02576)而得到。透過CDR連結之人化的以磷脂醯肌醇蛋白聚醣3抗體為始的抗體之FR，係選擇互補決定區域形成對於抗原之良好的抗原結合部位者。因應必要，構成以再構成人類抗體的互補決定區域形成對於抗原之適當的抗原結合部位之方式所選擇的抗體之可變區域之FR之胺基酸殘基，係可藉由適宜取代而改變(K.sato et al.,Cancer Res.(1993)53,851-856)。

上述之人化所關聯的改變以外，可實施用於改善與抗原(例如識別以磷脂醯肌醇蛋白聚醣3抗體為始的抗體之抗原)之結合性等抗體之生物學的特性之改變。本發明中之改變，係可藉由部位特異性的突然變異(參照例如Kunkel,Proc. Natl. Acad. sci. USA(1985)82,488)、PCR變異、盒式變異(cassette mutagenesis)等方法適當地進行。一般而言，構成其生物學的特性經過改善之改變抗體之胺基酸序列，係相對於構成供改變的抗體(亦即作為改變抗體之基礎之抗體)之胺基酸序列，具有70%以上，較佳為80%以上，更佳為90%以上(例如95%以上，97%、98%、99%等)之同一性及/或類似性。在本說明書中，序列之同一性及/或類似性係意指，序列同一性以取最大值之方式，因應必要將序列整列化、及不染色的部份(gap)導入之後，與構成作為改變抗體之基礎之抗體之胺基酸殘基相同(相同之殘基)或類似(以一般的胺基酸之側鏈之特性為基準，分類為相同之群組之胺基酸殘基)之胺基酸殘基之比例。通常天然之胺基酸殘基，以其側鏈之性質為基準，可分類為(1)疏水性：丙胺酸、異白胺酸、纈胺酸、甲硫胺酸及白胺酸；(2)中性親水性：天門冬醯胺、麩醯胺酸、半胱胺酸、羥丁胺酸及絲胺酸；(3)酸性：天門冬胺酸及麩胺酸；(4)鹼性：精胺酸、組胺酸及離胺酸；(5)影響鏈的位向之殘基：甘胺酸及脯胺酸；以及(6)芳香族性：酪胺酸、色胺酸及苯丙胺酸之群組。

另外，就以抗體機能之增強為目的改變而言，亦可適合列舉例如人化的以磷脂醯肌醇蛋白聚醣3抗體為始的抗體發揮之細胞傷害活性之提升作為具體的一個態樣。就細胞傷害活性而言，可例示例如抗體依賴性細胞媒介性細胞傷害(antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity：ADCC)活性、補體依賴性細胞傷害(complement-dependent cytotoxicity：CDC)活性等作為適合之例。在本發明中，CDC活性係指由補體系所產生之細胞傷害活性。另一方面ADCC活性係指於標的細胞之細胞表面抗原附著特異的抗體時，於其Fc部分，Fcγ受體保持細胞(免疫細胞等)透過Fcγ受體而結合，對標的細胞造成傷害之活性。被驗抗體為是否具有ADCC活性、或是否具有CDC活性，係可藉由周知之方法測定(例如Current protocols in Immunology,Chapter7. Immunologic studies in humans,Editor,John E,Coligan etal.,John Wiley & Sons,Inc.,(1993)等)。

具體而言，首先實施效應細胞，補體溶液、標的細胞之調製。

(1)效應細胞之調製

由CBA/N小鼠等將脾臟摘出，於RPMI 1640培養基(Invitrogen)中分離脾臟細胞。以含10%牛胎兒血清(FBS、HyClone)之同培養基洗淨後，藉由將細胞濃度調製成5×10⁶ 細胞/ml，可調製效應細胞。

(2)補體溶液之調製

將Baby Rabbit Complement(CEDARLANE)以含有10% FBS之培養基(Invitrogen)稀釋10倍，可調製補體溶液。

(3)標的細胞之調製

藉由將表現出結合被驗抗體之抗原蛋白質之細胞，與0.2mCi的51Cr鉻酸鈉(GE HEALTHCARE BIOSCIENCES)一起於含有10%FBs之DMEM培養基中以37℃培養1小時，可對該標的細胞進行放射性標識。就表現出結合被驗抗體之抗原蛋白質之細胞而言，可利用以編碼結合被驗抗體之抗原蛋白質之基因進行形質轉換之細胞，卵巢癌、前立腺癌、乳癌、子宮癌、肝癌、肺癌、胰臟癌、胃癌、膀胱癌、及大腸癌細胞等。放射性標識後，藉由將該細胞以含有10%FBS之RPMI 1640培養基洗淨3次，將細胞濃度調製成2×10⁵ 細胞/ml，可調製該標的細胞。

ADCC活性、或CDC活性，係可藉由下述方法進行測定。ADCC活性之測定的情況下，係於96孔U底盤(Becton Dickinson)每次加入50μl標的細胞與被驗抗體，於冰上實施15分鐘之反應。其後，使加入效應細胞100μl之反應混合液在二氧化碳培養箱內培養4小時。被驗抗體的終濃度可在0至10μg/ml之範圍內適宜地使用。在進行該培養之後，回收100μl的上清液，以伽瑪計數器(COBRAII AUTO-GAMMA、MODEL D5005、Packard Instrument Company)測定該上清液具有之放射活性。細胞傷害活性(%)，係可使用所得到之放射活性之值，依據(A-C)/(B-C)×100之計算式進行計算。A係在使用各被檢抗體之試樣的情況下之放射活性(cpm)、B係在使用添加1%NP-40(nacalai tesque)之試樣的情況下之放射活性(cpm)、C係在使用僅含表示標的細胞之試樣的情況下之放射活性(cpm)。

另一方面，CDC活性之測定之情況，係於96孔平底盤(Becton Dickinson)，每次加入50μl標的細胞與被驗抗體，於冰上實施15分鐘之反應。其後，加入補體溶液100μl之反應混合液在二氧化碳培養箱內培養4小時。被驗抗體的終濃度可在0至3μg/ml之範圍內適宜使用。

培養後，回收100μl的上清液，以伽瑪計數器測定該上清液所具有之放射活性。細胞傷害活性可與ADCC活性之測定相同的方式計算。

另一方面，測定由抗體偶聯物所產生之細胞傷害活性之情況，係於96孔平底盤(Becton Dickinson)，每次加入50μl標的細胞與被驗抗體偶聯物，於冰上實施15分鐘之反應。該盤在二氧化碳培養箱內培養1至4小時。抗體之終濃度可在0至3μg/ml之範圍內適宜使用。培養後，回收100μl的上清液，以伽瑪計數器測定該上清液所具有之放射活性。細胞傷害活性係可以與ADCC活性之測定相同的方式計算。

例如以磷脂醯肌醇蛋白聚醣3抗體為始的抗體之重鏈及輕鏈之可變區域，係如上述之方式，通常由3個CDR與4個FR所構成。在本發明之適合態樣中，供「改變」之胺基酸殘基而言，可由例如構成CDR或FR之胺基酸殘基之中適宜選擇。構成CDR之胺基酸殘基之改變，係有引起該改變所關聯的以磷脂醯肌醇蛋白聚醣3抗體為始的抗體之對抗原之結合能降低之情況。因此，在本發明中構成供「改變」之以磷脂醯肌醇蛋白聚醣3抗體為始的抗體之胺基酸殘基，並非受到特別限定者，而由構成FR的胺基酸殘基之中適宜選擇者為佳。即使為位於CDR之胺基酸殘基之改變，在確認該改變不會引起改變所關聯的以磷脂醯肌醇蛋白聚醣3抗體為始的抗體之對抗原之結合能力之降低之情況下，亦可適宜選擇該胺基酸殘基。

另外，只要是業界人士可利用Kabat等公共之資料庫等，適當地取得構成抗體之可變區域之FR的胺基酸序列並且在人類或小鼠等生物中實際存在之序列。

在本發明之適合態樣中，藉由本發明之方法，可提供使血漿中動態經控制之人化的以磷脂醯肌醇蛋白聚醣3抗體為始的人化抗體。該人化的以磷脂醯肌醇蛋白聚醣3抗體為始的人化抗體，係含例如來自人類以外的動物的互補決定區域(CDR)、來自人類的架構區域(FR)及人類恆定區域之人化抗體，並且為在CDR或FR中，可暴露在抗體表面的至少一個胺基酸殘基係具有與原本的抗體之CDR或FR對應之位置之胺基酸殘基相異之電荷的胺基酸殘基，而與具有相同之恆定區域之嵌合體抗體相比血漿中動態受到控制之人化抗體。

進一步在本發明之適合態樣中，藉由本發明之方法，提供血漿中動態經控制之人類的以磷脂醯肌醇蛋白聚醣3抗體為始的人類抗體。該人類抗體，係包含例如來自人類的互補決定區域(CDR)、來自人類的架構區域(FR)及人類恆定區域之人類抗體，並且在CDR或FR中，可暴露在抗體表面的至少一個胺基酸殘基，係具有與原本的抗體之CDR或FR之對應位置之胺基酸殘基相異之電荷的胺基酸殘基，而與具有相同恆定區域的嵌合體抗體相比血漿中動態受到控制之人類抗體。

上述人類恆定區域，宜為包含野生型之人類Fc區域之區域，而經改變的Fc亦可適合地使用。就上述「經改變的Fc」而言，構成該Fc之胺基酸殘基亦可包含經改變者，另外，施加於該Fc部分之修飾亦可包含經改變者。將附加於該Fc部分之糖鏈修飾之樣式加以改變之情況，係可適合列舉作為上述之修飾之改變之具體例。在本說明書中，作為參考實施例具體地揭示之「結合於抗體Fc區域之海藻糖含量為降低的抗體」，可列舉作為如此的適合之具體例。

「結合於抗體Fc區域的海藻糖含量降低的抗體」係指與作為對照之抗體比較的情況下，結合狀態之海藻糖量為顯著地少(宜為無法偵測)的抗體。

通常而言，海藻糖附加在結合於存在於構成抗體1分子的2分子重鏈之Fc區域之2處糖鏈結合部位之N-糖苷鍵結糖鏈。在本發明中「結合於抗體Fc區域之海藻糖含量降低之抗體」係意指將如此之通常抗體作為對照加以比較之情況中，對照抗體所具有的總糖鏈含量之50%以下，宜為25%以下，更佳為10%以下，特佳為具有0%以下之海藻糖含量的抗體。海藻糖含量可使用在下述作為參考實施例而具體地例示之解析方法進行測定。該海藻糖含量降低的抗體之製作方法，除了記載為本發明申請之參考實施例之外，亦可適合地列舉藉由例如缺失岩藻糖基轉移酶之動物細胞而製作之方法(Biotechnol Bioeng.(2004),87(5),614-22)，藉由複合分枝糖鏈修飾經改變的動物細胞而製作之方法(Biotechnol Bioeng.(2006)93(5)l851-61)等作為其例示。另外，就將動物細胞以外之細胞製作為宿主細胞的方法而言，亦可適合地列舉藉由植物細胞製作的方法(Nature Biotechnology(2006)24l1591-7)或藉由酵母細胞製作的方法(Nature Biotechnology(2006)24,210-5)等。

就本發明之製造方法之適合態樣而言，使血漿中動態經控制之以磷脂醯肌醇蛋白聚醣3抗體為始的抗體之製造方法，係包含(a)以可暴露在以磷脂醯肌醇蛋白聚醣3抗體為始的抗體表面的至少一個胺基酸殘基的電荷被改變之方式，將編碼含該胺基酸殘基之多胜肽的核酸加以改變，(b)將宿主細胞，以表現出在(a)中經改變的核酸之方式進行培養、(c)由宿主細胞培養物回收以磷脂醯肌醇蛋白聚醣3抗體為始的抗體之方法。

在本發明之上述方法中，「改變核酸」係意指成為藉由本發明中之「改變」而導入之胺基酸殘基所對應之密碼子般將核酸序列加以改變。較具體而言，係意指將相當於改變前之胺基酸殘基之密碼子，以成為藉由改變而導入之胺基酸殘基之密碼子之方式，將構成供改變的密碼子之核酸加以改變。通常意指以成為編碼目的之胺基酸殘基的密碼子之方式，對構成密碼子之核酸之至少1個鹼進行如取代般之基因操作或變異處理。亦即，編碼供改變的胺基酸殘基之密碼子，係藉由編碼由改變所導入之胺基酸殘基之密碼子而被取代。如此之核酸之改變係在業界人士中可使用周知之技術，例如部位特異的變異誘發法、PCR變異導入法等適宜地實施。

另外，本發明中之核酸係通常保持(插入)於適當之載體，導入至宿主細胞。就該載體而言，只要是安定地保持所插入之核酸者，並未特別受到限制，例如若使用大腸菌當作宿主，則就選殖用載體而言，係以pBluescript載體(stratagene)等為佳，而可利用市售之各種載體。為了生產本發明之多胜肽而使用載體的情況下，尤其以表現載體為有用的。就表現載體而言，只要是在測試管內、大腸菌內、培養細胞內、生物個體內，表現出多胜肽之載體，則並非受到特別限制者，例如在測試管內表現出pBEST載體(PROMEGA)，若大腸菌則以pET載體(Invitrogen)，培養細胞則以pME 18S-FL3載體(GenBank AccessionNo.AB009864)，生物個體則以pME 18S載體(Mol Cell Biol. (1988)8,466-472)等為佳。本發明之DNA往載體之插入，係藉由常法，例如可藉由使用限制酵素部位的接合酶反應適當地進行(Current protocols in Molecular Biologyedit. Ausubel et al. (1987)Publish. John Wiley & Sons. Section 11.4-11.11)。

就上述宿主細胞而言，係並無特別限制，可因應目的使用各種宿主細胞。用於使多胜肽表現之細胞而言，可例示例如細菌細胞(例：鏈球菌、葡萄球菌、大腸菌、鏈絲菌、枯草菌)、真菌細胞(例：酵母、麴菌)、昆蟲細胞(例：果蠅(drosophila)S2、支翅夜蛾(Spodoptera)SF9)、動物細胞(例：CHO、COS、HeLa、C 127、3T3、BHK、HEK293、Bowes黑色素瘤細胞)及植物細胞。往宿主細胞之載體導入係可藉由例如磷酸鈣沉澱法、電氣脈衝穿孔法(Current protocols in Molecular Biology edit. Ausubel et al.(1987)Publish. John Wiley & Sons. Section 9.1-9.9)、脂質體轉染(lipofection)法、顯微注射法等周知之方法進行。

在宿主細胞中，由於使表現之以磷脂醯肌醇蛋白聚醣3抗體為始的抗體分泌於小胞體之內腔、於細胞周邊腔、或於細胞外之環境，可適當地將適宜的分泌訊號編入目的抗體。該等訊號，係可適合利用目的之以磷脂醯肌醇蛋白聚醣3抗體為始的抗體所結合之抗原所特有之內因性訊號，或異種訊號。

在上述製造方法中之以磷脂醯肌醇蛋白聚醣3抗體為始的抗體之回收，在本發明之抗體分泌至培養基的情況下，藉由培養基之回收而實施。本發明之以磷脂醯肌醇蛋白聚醣3抗體為始的抗體為在細胞內產生的情況下，首先使此細胞溶解，於其後回收該抗體。

為了精製由重組細胞培養物回收的本發明之以磷脂醯肌醇蛋白聚醣3抗體為始的抗體，可適合使用包含硫酸銨或乙醇沉澱、酸萃取、陰離子或陽離子交換層析、磷酸纖維素層析、疏水性交互作用層析、親和層析、羥基磷灰石層析及凝集素層析的周知方法。

另外，本發明還關於一種組成物(藥劑)，係含有藉由本發明之方法使血漿中動態經控制之以磷脂醯肌醇蛋白聚醣3抗體為始的抗體(例如IgG抗體)，及醫藥上所容許之擔體。

在本發明中的醫藥組成物，係通常指用於疾病的治療或預防，或檢查．診斷的藥劑。

本發明之醫藥組成物係可藉由業界人士所周知的方法適當地製劑化。可以例如溶於水或其以外之藥學上可容許的液體之無菌性溶液，或懸浮液劑之注射劑之形式，非口服地使用。可藉由與例如藥理學上所容許之擔體或媒體，具體而言，滅菌水或生理食鹽水、植物油、乳化劑、懸浮劑、界面活性劑、安定劑、香味劑、賦形劑、媒介物(vehicle)、防腐劑、結合劑等適當地組合，以一般認可之製藥實施所要求之單位用量形態混和而適當地製劑化。該等製劑中之有效成分量，係以可得到指示之範圍之適當用量的方式作設定。

用於注射的無菌組成物係使用如注射用蒸餾水般之媒介物，可適當地依照通常之製劑實施進行配方。

就注射用之水溶液而言，可列舉含例如生理食鹽水、葡萄糖或其他補助藥(例如D-山梨醇、D-甘露糖、D-甘露醇、氯化鈉)之等張液。適當之溶解補助劑、例如醇(乙醇等)、多元醇(丙二醇、聚乙二醇等)、非離子性界面活性劑(聚山梨酸酯80(TM)、HCO-50等)為可適合地併用。

就油性液而言，可列舉胡麻油、大豆油，可適合地併用安息香酸苄基及/或苄基醇作為溶解補助劑。另外，可適當地配合緩衝劑(例如磷酸鹽緩衝液及醋酸鈉緩衝液)、無痛化劑(例如鹽酸普羅卡因)、安定劑(例如苄基醇及酚)、抗氧化劑。以上述方式調製注射液，通常適當地充填於安瓿。

本發明之醫藥組成物，可適宜藉由非口服投予投予。例如可適當地調製成為注射劑型、經由鼻部投予之劑型、經由肺部投予之劑型、經由皮膚投予型之組成物。可適當藉由例如靜脈內注射、肌肉內注射、腹腔內注射、皮下注射等進行全身或局部性地投予。

投予方法可依照患者年齡、症狀適宜地選擇。含有抗體或編碼抗體之多核苷酸之醫藥組成物之投予量可適宜設定為例如每次每1kg體重0.0001mg至1000mg之範圍。或可設定或調製成為例如每名患者0.001～100000mg的投予量，而本發明未必受到該等數值限制。投予量及投予方法係依照患者的體重、年齡、症狀等而變動，而只要是業界人士，考慮該等條件則可設定適當之投予量及投予方法。

另外，本發明，係藉由本發明之方法，提供編碼使血漿中動態經控制之以磷脂醯肌醇蛋白聚醣3抗體為始的抗體(例如人化之磷脂醯肌醇蛋白聚醣3抗體等)的核酸。進一步擔持該核酸的載體另外亦被包含於本發明。

進一步本發明係提供含上述核酸的宿主細胞。該宿主細胞之種類並未受到特別限制，可列舉例如大腸菌等細菌細胞或各種之動物細胞等。該宿主細胞，係可適合使用作為用於製造或表現本發明之以磷脂醯肌醇蛋白聚醣3抗體為始的抗體之生產系統。亦即本發明提供一種生產系統，係為了製造使用該宿主細胞的以磷脂醯肌醇蛋白聚醣3抗體為始的抗體而使用。就該生產系統而言，可適合使用in vitro及in vivo之生產系統。在in vitro之生產系統中，就所使用之宿主細胞而言，適合使用真核細胞，及原核細胞。

就被使用作為宿主細胞的真核細胞而言，可列舉例如動物細胞，植物細胞，真菌細胞。就動物細胞而言，適合例示哺乳類細胞，例如CHO(J. Exp.Med.(1995)108,945)、COs、HEK293、3T3、骨髓瘤、BHK(baby hamster kidney)、HeLa、Vero等、兩生類細胞，例如非洲爪蟾卵母細胞(Valle et al.,Nature(1981)291,338-340)，及昆蟲細胞，例如Sf9、Sf21、Tn5。在本發明之磷脂醯肌醇蛋白聚醣3抗體之表現中，適合使用CHO-DG44、CHO-DX11B、COS7細胞，HEK293細胞，BHK細胞。在目的為藉由動物細胞而大量表現之情況下，尤其以CHO細胞作為宿主細胞為佳。藉由使用例如使用磷酸鈣法、DEAE聚葡萄醣法、陽離子型核糖體 DOTAP(Boehringer Mannheim)的方法、電穿孔法、脂質體轉染等方法，可適當地實施重組載體等往宿主細胞之導入。

就植物細胞而言，已知例如來自菸草(Nicotiana tabacum)的細胞及浮萍(Lemma minor)為作為蛋白質生產系統，藉由將此細胞進行癒合組織培養之方法，可生產本發明之磷脂醯肌醇蛋白聚醣3抗體。就真菌細胞而言，使用酵母，例如酵母菌(saccharomyces)屬之細胞(啤酒酵母菌(saccharomyces cerevisiae)、裂殖性酵母菌(schizosaccharomyces pombe)等)，及絲狀菌，例如麴菌(Aspergillus)屬之細胞(黑麴菌(Aspergillus niger)等)的蛋白質表現系統為周知的，可利用作為生產本發明之磷脂醯肌醇蛋白聚醣3抗體之宿主細胞。

使用原核細胞的情況，使用細菌細胞的生產系統為適合使用。就細菌細胞而言，已知有使用上述之大腸菌(E.coli)和枯草菌(B.subtilis)的生產系統，該等細菌細胞任一者皆可適合利用於生產本發明之以磷脂醯肌醇蛋白聚醣3抗體為始的抗體。

為了使用本發明之宿主細胞生產以磷脂醯肌醇蛋白聚醣3抗體為始的抗體，藉由含編碼本發明之抗體的多核苷酸之表現載體，進行經過形質轉換之宿主細胞的培養，在該培養中，會表現出編碼以磷脂醯肌醇蛋白聚醣3抗體為始的抗體的多核苷酸。培養可依據周知之方法適當地進行。例如動物細胞被使用作為宿主的情況，就培養液而言，可適當地使用例如DMEM、MEM、RPMI 1640、IMDM。此時，可適當地併用FBS、牛胎兒血清(FCS)等血清補液。另外，可藉由無血清培養進行細胞培養。雖然依照宿主細胞而變，而在培養時，可在pH約6～8之條件下適當地培養。培養通常在約30～40℃進行約15～200小時，因應必要加上培養基之交換、通氣、攪拌。

另一方面，在in vivo之情況，就本發明之以磷脂醯肌醇蛋白聚醣3抗體為始的抗體生產系統而言，可適合使用例如使用動物的生產系統或使用植物的生產系統。亦即，編碼本發明之以磷脂醯肌醇蛋白聚醣3抗體為始的抗體的多核苷酸被導入至該等動物或植物，於動物或植物之體內生產、回收本發明之抗體。該等動物、植物被包含於本發明之「宿主」中。

在使用動物作為宿主的情況下，可利用使用哺乳類動物、昆蟲的生產系統。就哺乳類動物而言，適合使用山羊、豬、綿羊、小鼠、牛等(Vicki Glaser,SPECTRUM Biotechnology Applications(1993))。另外，使用哺乳類動物的情況下，可使用基因轉殖動物。

例如，編碼本發明之以磷脂醯肌醇蛋白聚醣3抗體為始的抗體之多核苷酸，係被調製為與編碼在乳汁中特異性地產生之多胜肽(如山羊β酪蛋白般)之基因的融合基因。接著，將含此融合基因之多核苷酸斷片注入山羊之胚胎，該胚係移植至雌性山羊。由受容了胚的山羊所生出之基因轉殖山羊或其子孫所生產之乳汁，可得到目的之以磷脂醯肌醇蛋白聚醣3抗體為始的抗體。為了使該基因轉殖山羊所生產之含以磷脂醯肌醇蛋白聚醣3抗體為始的抗體之乳汁量增加，可適當地將適宜的荷爾蒙投予至該基因轉殖山羊(Ebert et al.,Bio/Technology(1994)12,699-702)。

另外，就生產本發明之以磷脂醯肌醇蛋白聚醣3抗體為始的抗體的昆蟲而言，可使用例如蠶。在使用蠶的情況下，將編碼目的之以磷脂醯肌醇蛋白聚醣3抗體為始的抗體的多核苷酸插入至其病毒基因組上之桿狀病毒，係可使用在對蠶之感染中。由該經過感染之蠶的體液，可得到目的以磷脂醯肌醇蛋白聚醣3抗體為始的抗體(susumu et al.,Nature(1985)315,592-4)。

再者，在植物被使用於生產本發明之以磷脂醯肌醇蛋白聚醣3抗體為始的抗體的情況下，就植物而言，可使用例如菸草。使用菸草的情況下，將編碼作為目的以磷脂醯肌醇蛋白聚醣3抗體為始的抗體之多核苷酸，插入至植物表現用載體(例如pMON 530)之結果所得到之重組載體，可導入至如根瘤農桿菌(Agrobacterium tumefaciens)般之細菌。該細菌，係可使用於對菸草(Tobacco)例如菸草(Nicotiana tabacum)之感染(Ma et al.,Eur. J. Immunol.(1994)24,131-8)、由受到感染之菸草葉可得到所希望之以磷脂醯肌醇蛋白聚醣3抗體為始的抗體。另外，相同的細菌，係可使用於對浮萍(Lemna minor)之感染，由經過選殖之感染浮萍細胞，可得到所希望之以磷脂醯肌醇蛋白聚醣3抗體為始的抗體(Cox KM et al. Nat. Biotechnol.(2006)24(12),1591-7)。

如此之方式所得到之本發明之以磷脂醯肌醇蛋白聚醣3抗體為始的抗體，係由宿主細胞內或細胞外(培養基、乳汁等)分離，可精製成為實質上純粹且均勻的抗體。抗體之分離、精製可適合使用在通常的多胜肽精製所使用的分離、精製方法，而並非受到該等所限定者。宜選擇例如層析管柱、過濾器、超過濾、鹽析、溶劑沉澱、溶劑萃取、蒸餾、免疫沉降、SDS-聚丙烯酸醯胺膠體電泳、等電點電泳法、透析、再結晶等，使其組合，可適當地分離，及精製抗體。

就層析而言，可列舉例如親和層析、離子交換層析、疏水性層析、凝膠過濾層析、逆相層析、吸附層析等(strategies for Protein Purification and Characterization ：A Laboratory Course Manual. Ed Daniel R. Marshak et al. (1996)Cold spring Harbor Laboratory Press)。該等層析可使用液相層析進行，例如HPLC、FPLC等液相層析。就親和層析所使用的管柱而言，可列舉蛋白質A管柱、蛋白質G管柱。例如使用蛋白質A的管柱而言，可列舉Hyper D，POROs，sepharose F. F.(Pharmacia製)等。

包含以上述之方式培養本發明之宿主細胞，由該細胞之培養物回收以磷脂醯肌醇蛋白聚醣3抗體為始的抗體之步驟，而使血漿中動態經控制之本發明之以磷脂醯肌醇蛋白聚醣3抗體為始的抗體之製造方法，亦為本發明之適合態樣的其中之一。

另外，在本說明書中，所引用之全部先前技術文獻，係作為參照而編入本說明書。

於以下對本發明作具體地說明，而本發明並非受到下述實施例限定者。

[實施例]

[實施例1]

(1)人化H0L0抗體之點變異基因之製作

以WO2006/046751所揭示的編碼含人化GC33抗體之CDR之磷脂醯肌醇蛋白聚醣3抗體之基因作為起始材料，製作各種之點變異基因。以含改變部位之順鏈及逆鏈之序列為基準，合成所設計之寡聚DNA。使用市售之QuikChange site-Directed Mutagenesis Kit(stratagene)，製作複數之點變異基因。

點變異基因之製作，係依照以下之條件，藉由PCB法實施。將由10ng之鑄型質體、與10pmol之順鏈及逆鏈之合成寡聚DNA、附帶於套組之10x Buffer、dNTP mix及Pfuturbo DNA polymerase所構成之反應混合物，於95℃加熱30秒鐘之後，95℃30秒鐘、55℃1分鐘、68℃ 4分鐘所構成之PCR反應循環實施18次。將附帶於套組之DpnI添加於反應混合物之後，於37℃持續進行1小時之藉由限制酵素之限制消化反應。藉由該反應液，DH5α勝任細胞(Competent cells)(TOYOBO)經過形質轉換之結果，可得到形質轉換體。以由該形質轉換體分離的質體DNA之鹼序列之決定為基準，已確認經過導入點變異之點變異基因，係在動物細胞中，選殖至可表現出插入基因之表現載體中。改變基因，係藉由具有以下所表示的構成之改變而取得。

人化H0L0抗體及其點變異改變抗體之暫時性表現，係藉由使用Polyethyleneimine(Polysciences Inc.)的暫時性表現而實施。以Trypsin EDTA(Invitrogen)剝離之HEK293細胞係以成為6×10⁶ cells/10mL之方式接種於10cm² 培養皿。翌日，依據順序書，於H鏈表現質體DNA及L鏈表現質體DNA混合SFMII培養基及Polyetyleneimine之後，將該混合液係於室溫靜置10分鐘。混合液之全量為HEK293細胞，係如上述記載般，滴下至接種之培養皿。由此約72小時後所回收之培養上清液，表現之人化H0L0抗體及其點變異改變抗體之精製，係使用rProteinA sepharose TM Fast Flow(GE Healthcare)，依照其順序書實施。

(1-1)人化HOLD抗體之Tm值之改變

熱變性中間溫度(Tm)，係認定為以一定之經過程序化之加熱速度，將被檢試樣溶液加熱之後，所得到之溫度記錄圖(Cp對T)中之變性峰之頂點。藉由如以下之方式實施DSC測定用試樣溶液之調製，測定人化H0L0抗體之Tm值。首先，將含150mmol/1之氯化鈉之20mol/1之醋酸鈉緩衝溶液(pH6.0)相對於透析外液封入透析膜之50-100μg相當量之抗體溶液，在一晝夜之間供給於透析。其後，使用透析外液將其抗體濃度調製成為50-100μg/ml之試樣溶液，係使用作為DSC測定用試樣溶液。

為了進行此實驗，適合地使用適當的DSC裝置，例如DSC-II(Calorimetry sciences Corporation)。藉由上述方法所調製的試樣溶液及參考溶液(透析外液)在充分地脫氣之後，將各個被驗檢體封入熱量計槽，於40℃進行加熱充分的平衡化。接下來DSC掃描係於40℃~100℃，以約1K/分之掃描速度進行。該測定之結果，表示溫度之函數之變性峰的頂點。參考非專利文獻(Rodolfo等,Immunology Letters(1999)47-52)之Fab領域之峰指定而進行，計算出人化H0L0抗體之熱變性中間溫度。作為具體例，由Hspu2.2Lspu2.2(Hu2.2Lu2.2)抗體之DSC(示差掃描熱量計)測定所得到之線圖，係例示於圖1。

以由上述記載之方法計算出為基準之以序列號碼1所表示之H鏈、及、以序列號碼7所表示之L鏈所構成之人化H0L0抗體之Tm值為76.6℃，而作為既已存在之抗體而例示之synagis 及 Herceptin 之 Tm值，係分別測量為85.4℃及81.8℃。因此表示了人化H0L0抗體之Tm值，係相較於既已存在的抗體之Tm為較低。

於是，以提升其Tm值為目的，製作人化H0L0抗體之改變抗體。製作了對於以序列號碼1所表示之H0L0抗體之H鏈之FR2而言，加上將其VH1b之亞型改變為VH4之亞型的V37I、A40P、M48I、L51I之改變之H15(序列號碼2)。其Tm值係被改善為79.1℃。製作出實施了將以序列號碼7所表示之H0L0抗體之L鏈之FR2由VK2改變為VK3之亞型的L42Q、S48A、Q50R之改變，以及將FR1之V2取代為生殖細胞系列之序列之I的V2I之改變之L4(序列號碼8)。各抗體之Tm值的測定，係藉由上述記載之方法而實施。其結果，H15L0及H0L4之Tm值，係分別測定為79.2℃及77.2℃，相較於H0L0之Tm值之76.6℃已經過改善。組合此2個改變體之H15L4抗體之Tm值係被改善為80.5℃。

(1-2)人化H0L0抗體之pI值之改變

藉由使抗體所具有的pI值減少，抗體之血漿中半衰期延長。與此相反地，藉由使抗體之pI值增大，抗體之組織轉移性會被改善。發揮對於癌治療之效果之抗體之pI值為增加或減少何者，又或者是否導致腫瘤抑制效果之增強，還尚未瞭解。於是，製作pI值減少的人化H0L0抗體之改變抗體與pI值增加的人化H0L0抗體之改變抗體，藉由比較檢討兩者的抗腫瘤效果，檢驗了何者改變會導致高的腫瘤抑制效果。

各抗體之pI值，係基於藉由等電點電泳之分析而計算出。該電泳係如以下之方式進行。使用Phastsystem Cassette(AmerchamBioscience公司製)，藉由具有以下之組成的膨潤液，約60分鐘的程度，使Phast-Gel Dry IEF(AmerchamBioscience)凝膠膨潤。

(a)高pI用之膨潤液之組成：

1.5ml的10%Glycerol

100μl的Pharmalyte 8-10.5 for IEF (AmerchamBioscience)

(b)低pI用之膨潤液之組成：

1.5ml的精製水

20μl的Pharmalyte 8-10.5 for IEF(AmerchamBioscience)

80μl的Pharmalyte 5-8 for IEF(AmerchamBioscience)

將約0.5μg之抗體供給至膨潤之凝膠，藉由使用經由以下之程序控制之Phastsystem(AmerchamBioscience)進行等電點電泳。

試樣係於下述程序中之Step 2階段添加於凝膠。作為pI標識，係使用Calibration Kit for pI(AmerchamBioscience)。

Step 1：2000V，2.5mA，3.5W，15℃，75Vh

Step 2：200V，2.5mA，3.5W，15℃，15Vh

Step 3：2000V，2.5mA，3.5W，15℃，410Vh

泳動後之凝膠，係藉由20%TCA被固定化之後，使用silver staining Kit，protein(AmerchamBioscience)，依據套組所附帶的順序書進行銀染色。染色後，以具有pI標識的已知之等電點為基準，計算出被驗試樣之各抗體的等電點。於圖2及圖3，分別表示高pI等電點電泳之電泳圖及低pI等電點電泳之電泳圖。

(a)pI值增加之改變

製作出進一步於H15施加Q43K、D52N、Q107R之改變之Hspu2.2(Hu2.2)(序列號碼6)。另外還製作出於L4施加將E17Q、Q27R，Q105R、及CDR2之S25以生殖細胞系列多數取代為A之S25A之改變之Lspu2.2(Lu2.2)(序列號碼12)。由Hspu2.2(Hu2.2)及Lspu2.2(Lu2.2)所構成之抗體之Hspu2.2Lspu2.2(Hu2.2Lu2.2)抗體之Tm值係測量為76.8℃，pI值係測量為9.6。由於HOLO抗體之pI值係8.9，Hspu2.2Lspu2.2(Hu2.2Lu2.2)抗體之pI值增大0.7。

(b)pI值減少之改變

製作出進一步於H15施加K19T、Q43E、K63S、K65Q、G66D之改變之Hspd1.8(Hd 1.8)(序列號碼5)。製作出於L4施加Q27E之改變，構成L4之FR3之79-84之序列之KISRVE改變為TISSLQ，對Lspu2.2(Lu2.2)之改變相同地，施加S25A之改變之Lspd1.6(Ld 1.6)(序列號碼11)。Hspd1.8(Hd1.8)及Lspd1.5(Ld 1.6)所構成之抗體之Hspd1.8Lspd1.6(Hd1.8Ld 1.6)之pI值係測量為7.4。由於HOLO抗體之pI值為8.9，Hspd1.8Lspd1.6(Hd1.8Ld 1.6)抗體之pI值減少1.5。

(2)由競爭ELISA進行之HOLO抗體之點變異改變抗體之結合活性之評估

進行在(1)所精製之HOLO抗體及其點變異改變抗體之由競爭ELISA進行之評估。以成為1μg/ml之方式調製的可溶型GPC3核心多胜肽(序列號碼13)，係於96孔盤每1孔加入100μl。該盤係於4℃終夜靜置，可溶型GPC3核心多胜肽固態化於該盤。固態化於該盤之可溶型GPC3核心多胜肽，係使用skan WASHER400(Molecular Devices)，以洗淨緩衝液洗淨3次，加入200μ1的封阻緩衝液，於4℃進行30分鐘以上封阻。該可溶型GPC3核心多胜肽經固態化並經過封阻之盤，係接下來使用skan WASHER400，以洗淨緩衝液洗淨3次。其後，將各種濃度之H0L0抗體或其點變異改變抗體與終濃度0.3μg/ml的經過生物素化之H0L0抗體分別100μ1混合之混合液200μ1加入盤之每1孔。

H0L0抗體之生物素化，係使用Biotin Labeling套組(Roche)，依照套組之順序書實施。該盤，係於室溫靜置1小時之後，使用Skan WASHER400(Molecular Devices)以洗淨緩衝液洗淨5次。添加有藉由此每1孔基質緩衝液稀釋成20,000倍之100μ1的Goat anti streptabidin Alkaline phosphatase(ZYMED)之該盤，係於室溫靜置1小時後，使用SkanWASHER400以洗淨緩衝液洗淨5次。使用基質緩衝液，以成為1mg/ml之方式調製Phosphatase Substrate(Sigma)，每1孔加入100μ1並靜置1小時。使用Benchmark Plus(BIO-RAD)，使用655nm之對照吸光度，測定各孔中之反應液在405nm之吸光度。

如圖4所表示般，顯示出H15L4抗體之對抗原的結合活性，係與供改變的H0L0抗體的為幾乎同等。另外，如圖5所表示般，顯示出Hspu2.2Lspu2.2(Hu2.2Lu2.2)抗體之對抗原之結合活性，係與供改變的H0L0抗體的為幾乎同等。再者，如圖6所表示般，顯示出Hspd1.8Lspd1.6Hd1.8Ld1.6)抗體之對抗原之結合活性，係與供改變的H0L0抗體的為幾乎同等。

[參考實施例2]CHQ細胞中之海藻糖轉運蛋白基因之破壞

(1)目標載體之構築

(1-1)KO1載體之製作

藉著由pcDNA3.1/Hygro(INVITROGEN)，以Hyg5-BH與Hyg3-NT之引子進行PCR，於Hygromycin耐性基因(Hygr)之開始密碼子之5'側附加BamH I部位與TGCGC之序列，成為與海藻糖轉運蛋白基因之開始密碼子之5'側相同序列，於含SV40 polyA附加訊號為止之區域之3'側附加Not I部位，並將Hygr抽出。

前置引子

Hyg5-BH5'-GGATCCTGCGCATGAAAAAGCCTGAACTCACC-3'(序列號碼14)

反置引子

Hyg3-NT5'-GCGGCCGCCTATTCCTTTGCCCTCGGACG-3'(序列號碼15)

海藻糖轉運蛋白之目標載體ver.1(以下稱為KO1載體)，係藉由在pMC 1DT-A載體(Yagi T,Proc. Natl. Acad. Sci. USA(1990)87,9918-22)，分別將海藻糖轉運蛋白之5'側(表示為序列號碼16之鹼序列之No.2,780之smaI至No.4,232之BamHI)、3'側(由No.4,284至No.10,934之sacI為止)、及Hygr斷片插入而構築。就載體之特徵而言，由於啟動子並未附加於Hygr，因此在相同重組發生時，藉由海藻糖轉運蛋白之啟動子，而成為表現出Hygr。然而，即使藉由相同重組僅1份複製之載體導入至細胞，未必會以獲得對潮黴素B之耐性之程度表現出Hygr。另外，KO1載體係以NotI切斷而導入細胞。認為藉由KO1載體，海藻糖轉運蛋白會成為欠缺含開始密碼子之外顯子1之41鹼對而失去機能。

(1-2)pBSK-pgk-1-Hygr之製作

由pKJ2載體(PopoH，Biochemical Genetics(1990)28,299-308)，將小鼠pgk-1基因之啟動子藉由EcoR I-Pst I切出，並選殖至pBluescript(STRATAGENE)之EcoR I‧Pst I部位，製作pBSK-pgk-1。Hygr係藉著由pcDNA3.1/Hygro以Hyg5-AV與Hyg3-BH之引子進行PCR，於Hygr之5'側附加EcoT22I部位與Kozak序列，於含SV40polyA附加訊號為止之區域之3'側附加BamH I部位，並將Hygr抽出。

前置引子

Hyg5-AV5'-ATGCATGCCACCATGAAAAAGCCTGAACTCACC-3'(序列號碼17)

反置引子

Hyg3-BH 5'-GGATCCCAGGCTTTACACTTTATGCTTC-3'(序列號碼18)

將此Hygr(EcoT22I-BamH I)斷片插入pBSK-pgk-1之Pst I-BamH I部位，製作pBSK-pgk-1-Hygr。

(1-3)KO2載體之製作

海藻糖轉運蛋白之目標載體ver.2(以下稱為KO2載體)，係藉由分別將海藻糖轉運蛋白之5'側(表示為序列號碼16之鹼序列之No.2,780之Sma I至No.4,232之BamH I)、3'側(由No.4,284至No.10,934之SacI為止)及pgk-1-Hygr斷片插入至pMC1DT-A載體而構築。與KO1載體相異地，由於KO2載體係pgk-1基因之啟動子附加於Hygr，因此，即使藉由相同重組，僅1份複製載體導入細胞，亦可獲得對潮黴素B之耐性。另外，KO2載體係以NotI切斷而導入至細胞。認為藉由KO2載體，海藻糖轉運蛋白會成為欠缺含開始密碼子之外顯子1之46鹼對而失去機能。

(1-4)pBSK-pgk-1-Puror之製作

將pPUR載體(BD Biosciences)以Pst I與BamH I切斷，將切出之斷片(Puror)插入pBSK-pgk-1之Pst I-BamH 1部位，製作pBSK-pgk-1-Puror。

(1-5)KO3載體之製作

海藻糖轉運蛋白之目標載體ver.3(以下稱為KO3載體)，係藉著將海藻糖轉運蛋白之5'側(表示為序列號碼16之鹼序列之No.2,780之Sma I至No.4,232之BamH I)、3'側(由No.4,284至No.10,934之sac I為止)、及pgk-1-Puror斷片分別插入至pMC1DT-A載體而構築。另外，於pgk-1-Puror之3'末端，預先附加結合有於以下所表示之篩選用引子之序列。另外，KO3載體係以Not I切斷而導入細胞。認為藉由KO3載體，海藻糖轉運蛋白成為欠缺含開始密碼子之外顯子1之46鹼對而失去機能。

反置引子

RSGR-A5'-GCTGTCTGGAGTACTGTGCATCTGC-3'(序列號碼19)

使用以上的3種目標載體，嘗試進行海藻糖轉運蛋白基因之剔除。

(2)往CHO細胞之載體導入

於CHO-S-SFMIIHT-(INVITROGEN)，將HT supplement(100x)(INVITROGEN)與青黴素/鏈黴素(INVITROGEN)，相對於CHO-S-SFMIIHT之容量分別加入1/100之量。將此作為培養用之培養基(以下稱為SFMII(+))，對CHO細胞之DXB 11株進行繼代，進一步，在基因導入後之培養亦以此SFMII(+)進行。使8×10⁶ 個的CHO細胞，懸浮於0.8ml的杜爾貝科(Dulbecco's)磷酸緩衝液(以下略記為PBS。INVITROGEN)。於細胞懸浮液加入30μg的目標載體，將細胞懸浮液移至Gene Pulser Cuvette(4mm)(Bio-Rad)。於冰上放置10分鐘後，以GENE-PULSER II(Bio-Rad)，以1.5kV,25μ FD之條件，藉由電穿孔法將載體導入至細胞。導入載體之後，使細胞懸浮於200ml的SFMII(＋)培養基，以100μl/孔將細胞接種至20枚96孔平底盤(IWAKI)。將盤在CO₂ 培養箱內，於37℃培養24小時之後，添加藥劑。

(3)剔除之第一階段

將KO1載體、或KO2載體分別導入至CHO細胞，自載體導入24小時後，進行藉由潮黴素B(INVITROGEN)之挑選。潮黴素B係以成為0.3mg/ml之方式溶解於SFMII(＋)，以100μl/孔進行添加。

(4)藉由PCR之相同重組體之篩選

(4-1)PCR用之試樣之調整

相同重組體，係藉由PCR法進行篩選。於篩選所使用之CHO細胞，係以96孔平底盤培養，除去培養上清液後，以50ul/孔加入細胞溶解用之緩衝液，於55℃加溫2小時，接著於95℃加熱15分鐘，使蛋白酶K失活，製成PCR之鑄型。細胞溶解用之緩衝液，係由每1孔10 X LA緩衝液11(附帶於TAKARA LA Taq)5μl、10% NP-40(ROCHE)2.5μl、蛋白酶K(20mg/ml，TAKARA)4μl、及蒸餾水(NACALAI TESQUE)38.5μl構成。

(4-2)PCR之條件

PCR反應混合物，係定為上述之PCR試樣1μl、10x LA緩衝液II 5μl、MgCl₂ (25mM)5μl、dNTP(2.5mM)5μl、引子(各10μM)2μl、LA Taq(5IU/μl)0.5μl，及蒸餾水29.5μl(全部50μl)。導入KO1載體的細胞之篩選係使用TP-F4與THygro-R1作為PCR引子，而導入KO2載體的細胞之篩選係使用TP-F4與THygro-F1作為PCR引子。

導入KO1載體的細胞之PCR，係定為於95℃進行1分鐘之前加熱、於95℃進行30秒鐘、60℃進行30秒鐘，及60℃進行2分鐘之增幅循環40循環，以及於72℃進行7分鐘之複加熱。導入KO2載體之細胞之篩選方面，定為於95℃進行1分鐘之前加熱，於95℃進行30秒鐘、及於70℃進行3分鐘之增幅循環40循環，以及於70℃進行7分鐘之複加熱。

引子係如以下所述，在引起相同重組之細胞試樣之中，於KO1載體約1.6kb，於KO2載體約2.0kb之DNA受到增幅。引子係TP-F4設定為在載體之外側且5'側之海藻糖轉運蛋白之基因組區域，THygro-F1、及THygro-R1設定為在載體內之Hygr之中。

前置引子(KO1，KO2)

TP-F45'-GGAATGCAGCTTCCTCAAGGGACTCGC-3'(序列號碼20)

反置引子(KO1)

THygro-R15'-TGCATCAGGTCGGAGACGCTGTCGAAC-3'(序列號碼21)

反置引子(KO2)

THygro-F15'-GCACTCGTCCGAGGGCAAAGGAATAGC-3'(序列號碼22)

(5)PCR篩選結果

導入KO1載體的細胞，係解析出918個，其中認為是相同重組體之細胞為1個(相同重組效率為約0.1%)。另外，導入KO2載體之細胞，係解析出537個，其中認為是相同重組體之細胞為17個(相同重組效率為約3.2%)。

(6)南方墨點解析

另外還進一步藉由南方墨點法進行確認。由培養之細胞藉由既定方法，將基因組DNA調整為10μg，進行南方墨點。由表示為序列號碼16之鹼序列之No.2，113-No.2,500之區域，使用以下二種引子藉由PCR法調整387bp之探子，將此使用於藉由南方墨點法之確認。基因組DNA係以Bgl 11切斷。

前置引子

Bgl-F：5'-TGTGCTGGGAATTGAACCCAGGAC-3'(序列號碼23)

反置引子

Bgl-R：5'-CTACTTGTCTGTGCTTTCTTCC-3'(序列號碼24)

藉由Bgl II造成之切斷，分別由海藻糖轉運蛋白之染色體出現約3.0kb之帶(band)，由以KO1載體引起相同重組之染色體為約4.6kb之帶，由以KO2載體引起相同重組之染色體為約5.0kb之帶。分別將藉由KO1載體及KO2載體引起相同重組之細胞之1和7種使用於實驗。將以KO1載體唯一獲得之細胞命名為5C1，而藉由其後之解析判明了由複數之細胞集團構成，因此藉由限數稀釋而選殖，使用於其後之實驗。另外，將以KO2載體所獲得之細胞其中一命名為6E2。

(7)剔除之第二階段

對於藉由KO1載體、及KO2載體相同重組成功之細胞，使用3種載體，嘗試海藻糖轉運蛋白基因完全欠缺之細胞株之建立。載體與細胞之組合，係如以下所述。方法1：KO2載體與5C1細胞(KO1)、方法2：KO2載體與6E2細胞(KO2)、方法3：KO3載體與6E2細胞(KO2)。將載體導入至各細胞，自載體導入24小時後，開始進行藉由潮黴素B、嘌呤黴素(NACALAI TESQUE)之挑選。潮黴素B在方法1之中最終濃度為1mg/ml、方法2之中最終濃度成為7mg/ml。進一步在方法3之中，潮黴素B之最終濃度為0.15mg/ml、嘌呤黴素之最終濃度成為8μg/ml之方式添加。

(8)藉由PCR之相同重組體之篩選

試樣之調製，係如同上述。關於方法1之篩選，係偵測以上述KO1載體及KO2載體引起相同重組之細胞之PCR兩者一起進行。關於方法2，係設計下述PCR引子。於表示為序列號碼16之鹼序列之No.3,924-3,950之區域設定為TPS-F1，於No.4,248-4,274設定為SHygro-R1。藉由此PCR引子，由KO2載體造成欠缺之海藻糖轉運蛋白之基因區域之350bp受到增幅。因此，將在方法2中之PCR篩選中350bp並未增幅者視為海藻糖轉運蛋白基因完全欠缺之細胞。PCR之條件係定為於95℃進行1分鐘之前加熱、於95℃進行30秒鐘、於70℃進行1分鐘之增幅循環35循環，以及於70℃進行7分之複加熱。

前置引子

TPS-F1：5'-CTCGACTCGTCCCTATTAGGCAACAGC-3'(序列號碼25)

反置引子

SHygro-R1：5'-TCAGAGGCAGTGGAGCCTCCAGTCAGC-3'(序列號碼26)

關於方法3，將TP-F4使用於前置引子，而RSGR-A使用於反置引子。PCR之條件，係定為於95℃進行1分鐘之前加熱，於95℃進行30秒鐘、於60℃進行30秒鐘、於72℃進行2分鐘之增幅循環35循環，以及於72℃進行7分鐘之複加熱。在藉由KO3載體引起相同重組之細胞試樣之中，約1.6kb之DNA受到增幅。於此PCR偵測藉由KO3載體引起相同重組的細胞，同時亦確認殘留著以KO2載體之相同重組。

(9)PCR篩選結果

於方法1解析出616個，其中被認為是相同重組體的細胞為18個(相同重組效率為2.9%)。於方法2解析出524個，其中被認為是相同重組體的細胞為2個(相同重組效率為約0.4%)。再者，於方法3解析出382個，其中被認為是相同重組體的細胞為7個(相同重組效率為約1.8%)。

(10)南方墨點解析

以上述之方法為基準進行解析。其結果，解析完成之細胞內，發現出1個海藻糖轉運蛋白之基因完全欠缺之細胞。在第一階段之剔除，係與PCR和南方墨點之解析結果為一致，而在此第二階段之剔除並未一致。

(11)海藻糖之表現解析

進一步，以PCR解析經判斷為相同重組體之26之細胞中之海藻糖之表現。於含5μg/ml的Lens culinaris Agglutinin，FITC Conjugate(Vector laboratory)，2.5%之FBS、0.02%之疊氮化鈉之PBS(以下稱為FACS溶解液)100μl，對1×10⁶ 個細胞在冰冷中進行1小時染色。其後，以FACS溶解液將細胞洗淨3次，並以FACSCalibur(Becton,Dickinson)進行測定。其結果，判明了僅有以南方墨點解析判斷為海藻糖轉運蛋白的基因完全欠缺之細胞之FTP-KO株海藻糖之表現會降低。

[參考實施例3]來自FTP-KO株的抗體生產細胞之建立與藉由該細胞所生產的抗體之精製

以SFMII(+)培養基之中潮黴素B之最終濃度成為1mg/ml之方式調製，繼代在實施例1所得到之海藻糖轉運蛋白欠缺株(FTP-KO細胞，純株細胞系名稱為3F2)。使8×10⁶ 個的3F2懸浮於0.8ml的杜爾貝科磷酸緩衝液。於細胞懸浮液，加入25μg之人化的磷脂醯肌醇蛋白聚醣3抗體表現載體，將細胞懸浮液移至Gene Pulser Cuvette。於冰上放置10分鐘之後，以GENE-PULsER II，1.5kV，25μFD之條件，藉由電穿孔法將載體導入至細胞。導入載體後，使細胞懸浮於SFMII(+)培養基40ml，以100μl/孔將細胞接種至96孔平底盤(IWAKI公司)。將盤於CO₂ 培養箱內以37℃進行24小時培養之後，以終濃度成為0.5mg/ml之方式添加Geneticin(INVITROGEN)。測定對藥劑成為耐性之細胞之抗體產量，分別建立人化之磷脂醯肌醇蛋白聚醣3抗體生產細胞株。

由抗體表現株回收培養上清液，使用P-1泵(Pharmacia)施加至Hitrap rProteinA(Pharmacia)管柱。管柱係以結合緩衝液(20 mM sodium phosphate(pH 7.0))洗淨後，結合之抗體，係以溶離緩衝液(0-1MGlycin-HCl(pH2.7))溶離。溶離液立刻以中和緩衝液(1M Tris-HCl(pH 9.0))中和。藉由DC protein assay(BIO-RAD)，抗體之溶離部分經過選擇並儲存之後，該溶離部分係以Centriprep-YM10(Millipore)濃縮至2ml程度為止。接著，該濃縮液係以含150mM NaCl之20mM醋酸緩衝液(pH6.0)，供給至使用經過平衡化之Superdex200 26/60(Pharmacia)之凝膠過濾。溶離液之單體部分之峰被回收，該部分係以Centriprep-YM 10濃縮。該濃縮液係使用MILLEX-GW 0.22μm Filter Unit(Millipore)過濾之後，保存於4℃。經過精製的抗體之濃度係以在波長280nm測定之吸光度為基準，由莫耳吸光係數換算而決定。

[參考實施例4]結合於藉由FTP-KO細胞所生產的人化抗磷脂醯肌醇蛋白聚醣3抗體之糖鏈之解析

(1)2-胺基苯甲醯胺標識糖鏈(2-AB化糖鏈)之調製

藉由使N-Glycosidase F(Roche diagnostics)作用於本發明之FTP-KO細胞產生抗體，及作為對照試樣之CHO細胞產生抗體，結合於抗體之糖鏈會由蛋白質游離(Weitzhandler M. et al.,Journal of Pharmaceutical Sciences(1994)83(12),1670-5)。進行使用乙醇的去蛋白質操作後(Schenk B. et al.,The Journal of Clinical Investigation(2001),108(11),1687-95)，游離糖鏈濃縮乾燥凝固，接著藉由2-胺基吡啶，施行螢光標識(Bigge J. C. et al.,Analytical Biochemistry(1995)230(2),229-238)。所得到之2-AB化糖鏈，係藉由使用纖維素支架之固態萃取，脫除試藥之後，藉由離心分離濃縮，製成精製2-AB化糖鏈供之後的解析。接著，藉由使β-Galactosidase(生化學工業)作用於精製2-AB化糖鏈，調製無半乳糖(agalactosyl)2-AB化糖鏈。

(2)藉由無半乳糖2-AB化糖鏈之順相HPLC之分析

以前項的方法，本發明之FTP-KO細胞產生抗體、及作為對照試樣之以由CHO細胞產生抗體游離之糖鏈作為起始材料所調製之無半乳糖2-AB化糖鏈，係藉由以醯胺管柱TSKgel Amide-80(TOSOH)進行之順相HPLC進行分析，並比較其層析。在CHO細胞產生抗體中，G(0)係存在作為其糖鏈之主成分，並未附加海藻糖之G(0)-Fuc，估計為以由峰面積比之計算為基準，在全糖鏈中存在4%之程度。另一方面，在FTP-KO細胞產生抗體中，G(0)-Fuc為主成分，在由任一者之產生株所產生之抗體中，若以由峰面積比之計算為基準，則全糖鏈中之90%以上皆以並未附加海藻糖之糖鏈之形式存在。

[實施例5]人化H0L0抗體及其點變異改變抗體之安定性表現株之建立

以記載於實施例1的方法製作的H0L0抗體之改變抗體之編碼Hspu2.2Lspu2.2(Hu2.2Lu2.2)抗體與Hspd1.8Lspd1.6(Hd1.8Ld 1.6)抗體，或其供改變的H0L0抗體的基因，係選殖於表現載體。選殖時係以表現出編碼構成抗體的H鏈及L鏈的各基因之方式，將編碼H鏈及L鏈的各基因分別插入其他的表現載體。如上述般，以編碼H鏈及L鏈的各基因成為所希望之組合之方式選擇之二種表現載體，係在以PvuI切斷之後，使用電穿孔導入至在參考實施例2所製作之FTP-KO株中。

將由電穿孔而得之H0L0抗體及其改變抗體安定地生產之形質導入株的製作，係使用Gene PulserII(Bio Rad公司製)實施。導致構成所希望之H鏈及L鏈的組合之H鏈、L鏈表現質體DNA各10μg與懸浮於PBs之 CHO細胞(1×10⁷ 細胞/ml)0.75ml混合，混合液係於冰上靜置10分鐘。將混合液移至Gene Pulserll用光析管之後，以1.5kV、25μFD之容量給予電氣脈衝。經過脈衝給予之混合液係於室溫靜置10分鐘之後，使其懸浮於CHO-S-SF MII/1%HT/1%PS培養基。將以相同培養基所調製的5、10、50倍之各稀釋懸浮液100μl分注至96孔培養用盤之各孔。該盤係在維持於5%之CO₂ 濃度之CO₂ 培養箱中進行24小時培養。其後，Geneticin(GIBCO)成為最終濃度500μg/ml、Zeocin(Invitrogen)成為最終濃度600μg/ml之方式添加於各孔之該盤，係進一步培養2週。表現出Geneticin及Zeocin耐性之形質導入細胞之聚落，係藉由以含500μg/ml Geneticin(GIBCO)及600μg/ml Zeocin(Invitrogen)之相同培養基進行繼代，作進一步挑選。藉由使用BiacoreQ(BIACORE)對經過上述之方式挑選之該形質導入細胞之培養上清液中之抗體濃度進行評估，建立了所希望之抗體高表現之形質導入株。培養上清液中之抗體濃度之測定係以附帶於BiacoreQ(BIACORE)順序書為基準而實施。所建立之細胞株，係在含500μg/ml Geneticin(1nvitrogen)及600μg/ml Zeocin(Invitrogen)之CHO-s-SFMII培養基(Invitrogen)中進行培養，藉由適當的期間之培養回收所得到之培養上清液。所回收之培養上清液，係使用rProteinA-Sepharose管柱(GE Healthcare)進行精製。經過精製的抗體，係在使用Amicon Ultra-4(MILLIPORE)濃縮之後，使用PD-10 Desalting管柱(Amersham Biosciences)濃縮液被取代為含有200mM NaCl的20mM醋酸緩衝液(pH6.0)。經過精製的抗體，供至ND-1000spectrophotometer(NanoDrop)或分光光度計DU-600(BECKMAN)，並測定其在280nm的吸光度。藉由以使用該測定值的RACE法為基準之計算法，計算出其抗體之濃度。

[實施例6]使用in vivo模型的人化H0L0抗體及其點變異改變抗體之藥效測試

(1)供移植至in vivo模型之細胞株之維持

使用Hep G2細胞(ATCC)。Hep G2細胞，係於含10%FBs、1mmol/1 MEM sodium Pyruvate(Invitrogen)、1mmol/l MEM Non-Essentia1 Amino Acid(Invitrogen)之Minimun Essential Medium Eagle培養基(SIGMA)(以下，稱為繼代用培養基)中進行繼代而維持。

(2)Hep G2細胞移植小鼠模型之製作

Hep G2細胞之細胞懸浮液，係使用含繼代用培養基與MATRIGEL Matrix(BD Bioscience)1：1的溶液，以成為5×10⁷ 細胞/ml之方式調製。在細胞移植前日，於預先投予抗去唾液酸GM1抗體(和光純藥，1小瓶中之內容物係藉由5ml的該溶液而溶解)100μl至腹腔內之sCID小鼠(雄性，5週齡)(日本CLEA)之腹部皮下，移植該細胞懸浮液100μl(5×10⁶ 細胞/小鼠)。腫瘤體積係使用下式計算出：

腫瘤體積=長徑×短徑×短徑/2，在腫瘤體積之平均成為130-330mm³ 的時間點，判斷為模型成立之情形。

(3)含各被驗抗體的投予試樣之調製

含H0L0抗體、Hu2.2Lu2.2抗體、Hd1.8Ld1.6抗體之各抗體的投予試樣，係在其投予當日，使用生理食鹽水，以成為0.5mg/ml(5mg/kg投予群)或0.1mg/ml(1mg/kg投予群)之方式調製。

(4)含抗體的投予試樣之投予

由對在(2)所製作之小鼠模型進行HepG2細胞之移植後27天開始，每週1次，在3週的期間，將於上述(3)所調製之投予試樣，以10ml/kg的投予量由尾部靜脈進行投予。作為陰性對照，將生理食鹽水相同地每週1次，在3週的期間，以10ml/kg的投予量由尾部靜脈進行投予。任一群皆以5隻為1群，對各群實施含各被驗抗體的投予試樣之投予。與投予幾乎同時地，由各群之中3隻個體，採取其靜脈血作為為了測定各抗體在小鼠血漿中之濃度所使用的被驗物質。具體而言，在初次投予後0.5小時、即將第二次投予前的二個時間點，由背部足靜脈進行採血。20μl容量之採血係藉由肝素處理進行，藉由離心分離，調製血漿。

(5)各被驗抗體的抗腫瘤效果之評估

人類肝癌移植小鼠模型中之各被驗抗體的抗腫瘤效果，係藉由測定投予試樣之投予最終日至一週後之腫瘤體積而進行評估。其結果如圖7所表示般，於Hspd1.8Lspd1.6(Hd 1.8Ld 1.6)抗體藥效有變強的傾向，而於Hspu2.2Lspu2.2(Hu2.2Lu2.2)抗體藥效有變弱的傾向。

(6)各被驗抗體的血漿中濃度

小鼠血漿中之被驗抗體的濃度係藉由實施例1所記載之以ELISA法為基準之方法進行測定。調製了血漿中濃度為12.8、6.4、3.2、1.6、0.8、0.4、0.2μg/ml的檢量線試樣。檢量線試樣及成為所希望之濃度之方式經過適宜稀釋之小鼠血漿被驗試樣，分注至將soluble Glypican-3 core(中外製藥公司製)固態化的免疫盤(Nunc-Immuno Plate,MaxiSoup(Nalge nunc International))，使該盤於室溫靜置1小時。其後，依序分注Goat Anti-Human IgG-BIOT(Southern Biotechnology Associates)及Streptavidin-alkaline phosphatase conjugate(Roche Diagnostics)，進行使用BluePhos Microwell Phosphatase Substrates System(Kirkegaard & Perry Laboratories)作為基質之發色反應。各孔中之反應液之呈色，係藉由使用微量盤測讀儀測定反應液在650nm之吸光度而計算出。依據由各檢量線試樣之吸光度製作的檢量線，使用解析軟體SOFTmax PRO(Molecular Devices)，計算出小鼠血漿中之抗體濃度。

投予30分鐘及7天後之小鼠血漿中濃度係表示於圖8。在被驗抗體的任一個投予量，只要被驗抗體的pI較為降低，皆顯示出投予7天後之小鼠血漿中之抗體濃度變高。

[實施例7]使用人類末梢血單核球作為效應細胞之各被驗抗體的ADCC活性

使用人類末梢血單核球(以下稱為人類PBMC)作為效應細胞，各被驗抗體的ADCC活性係採用以下的方式測定。

(1)人類PBMC溶液之調製

使用預先注入1000單位/ml的肝素溶液(NOVO-HEPARIN注5千單位，NOVONORDISK)200μl之注射器，由中外製藥股份有限公司所屬之正常人志願者(成人男性)採取末梢血50ml。使用PBS(-)稀釋2倍的該末梢血被分成4等分，加入預先注入15ml之Ficoll-Paque PLUS，已進行離心操作之Leucosep淋巴球分離管(Greiner bio-one)。分注該末梢血之分離管，係以2150rpm之速度進行10分鐘於室溫之離心分離之操作後，分取出單核球部分層。藉由含10%FBS的Dulbecco's Modified Eagle'sMedium(SIGMA)(以下稱為10%FBS/D-MEM。)將該各分層所含之細胞洗淨1次後，使該細胞以其細胞密度成為5×10⁶ /ml之方式懸浮於10%FBS/D-MEM中。以該細胞懸浮液作為人類PBMC溶液供以後之實驗。

(2)標的細胞之調製

Hep G2細胞被由培養皿剝離，成為1×10⁴ cells/孔之方式接種至96孔U底盤。該盤係在5%二氧化碳培養箱中，於37℃培養一晚。翌日，於該盤之各孔中加入5.55MBq之Cr-51，該盤係在5%二氧化碳培養箱中，於37℃培養3小時。於該盤之各孔中所存在之Hep G2細胞，係作為標的細胞，在以後之ADCC活性之測定時使用。

(3)鉻游離測試(ADCC活性)

ADCC活性係以由鉻釋放法而得之特異的鉻游離率進行評估。於(2)所調製的標的細胞係以培養基洗淨，分別添加調製成各濃度(0、0.004、0.04、0.4、4、40μg/ml)之H0L0抗體，Hu2.2Lu2.2抗體，Hd1.8Ld 1.6抗體之各抗體100μl。該盤係於室溫進行15分鐘反應之後，除去抗體溶液。接著，於各孔中添加繼代用培養基各100μl之該盤在5%二氧化碳培養箱中，於37℃培養1小時。於各孔中加入在(1)所調製的人類PBMC溶液各100μl(5×10⁵ 細胞/孔)之該盤，係在5%二氧化碳培養箱中，於37℃靜置4小時後，進行離心分離操作。該盤之各孔中之100μl的培養上清液的放射活性，係使用伽瑪計數器進行測定。以下式為基準：

特異的鉻游離率(%)=(A-C)×100/(B-C)，求得特異的鉻游離率。

在上式中，A表示各孔中之100μl的培養上清液之放射活性(cpm)之平均值。

另外，B係表示於標的細胞添加100μl的2%NP-40水溶液(Nonidet P-40，NACALAI TESQUE)及50μl的10%FBS/D-MEM培養基的孔中之100μl的培養上清液的放射活性(cpm)之平均值。再者，C係於表示標的細胞添加10%FBS/D-MEM培養基150μl的孔中之100μl的培養上清液的放射活性(cpm)之平均值。測試係以triplicate實施，計算出在反映各被驗抗體的ADCC活性之上述測試中之特異的鉻游離率(%)之平均值及標準偏差。

(4)各被驗抗體的ADCC活性之評估

透過各被驗抗體，評估人類PBMC發揮之ADCC活性之結果，認為全部的被驗抗體具有ADCC活性。其結果表示於圖9。對在各濃度之各被驗抗體所表現出特異的鉻游離率進行顯著差異檢定之結果，在全部之抗體濃度中，並未認為各被驗抗體所表現出特異的鉻游離率之各被驗抗體間有顯著的差異。在統計解析方面，使用SAS前臨床套件(SAS Institute Inc.)。基於以上之結果顯示，在其pI經改變的各被驗抗體的ADCC活性之間沒有差異。

[實施例8]點變異pI改變抗體之製作與該抗體之特徵

(1)用於pI降低之改變處的選定

為了進一步提升Hd1.8Ld1.6抗體之腫瘤抑制效果，進行了可使可變區域之pI降低的改變處的檢討。其結果，可表現出使可變區域之pI降低的胺基酸殘基，該殘基係彙整於表2(重鏈)及表3(輕鏈)。就該等改變之內pI降低之具體例而言，可列舉pH7pL14抗體及pH7pL16抗體。各個pI改變抗體之製作，係藉以下之方式實施。

藉由進行使用PCR的Assemble PCR，進行改變部位之製作。以含改變部位的順鏈及逆鏈之序列為基準，合成所設計之寡聚DNA。將含改變部位的逆鏈寡聚DNA與插入有進行改變之基因之載體之順鏈寡聚DNA、含改變部位的順鏈寡聚DNA與插入有進行改變之基因之載體之逆鏈寡聚DNA分別加以組合，藉由使用Prime STAR(TAKARA)進行PCR，將含改變部位的斷片製作成5末端側與3末端側的2個。藉由將此2個斷片藉著Assemble PCR接合而製作各變異體。

將所製作之變異體，插入至在動物細胞中可表現出插入基因之表現載體，所得到之表現載體之鹼序列係以業界人士周知之方法決定。以質體DNA之鹼序列之決定為基準，已確認導入點變異之點變異基因，係選殖於在動物細胞中可表現出插入基因之表現載體中。抗體之表現、精製等方法，係使用實施例1記載之方法或以其為基準之方法實施。

使用Hd 1.8為起始物質，製作出存在於Hd 1.8之CDR 1的根據kabat編號之第61號之麩醯胺酸(Q)取代為麩胺酸(E)之pH7(序列號碼27)。使用Ld 1.6為起始物質，製作出分別將存在於Ld 1.6之CDR 1的根據kabat編號之第24號之精胺酸(R)取代為麩醯胺酸(Q)、存在於FR2及FR3的第37號之麩醯胺酸(Q)取代為白胺酸(L)、第43號之丙胺酸(A)取代為絲胺酸(S)、第45號之精胺酸(R)取代為麩醯胺酸(Q)、第74號之羥丁胺酸(T)取代為離胺酸(K)、第77號之絲胺酸(S)取代為精胺酸(R)、第78號之白胺酸(L)取代為纈胺酸(V)、第79號之麩醯胺酸(Q)取代為麩胺酸(E)的pL14(序列號碼28)。

使用pL14為起始物質，製作分別將存在於pL14之FR4的根據kabat編號之第104號之白胺酸(L)取代為纈胺酸(V)、第107號之離胺酸(K)取代為麩胺酸(E)pL16(序列號碼29)。

(2)點變異pI改變抗體之pI值的測定

由實施例1所記載或以實施例1為基準之方法，藉由使用Phast Gel IEF 4-6.5(GE Healthcase)的泳動測定Hd1.8Ld1.6抗體、pH7pL14抗體及pH7pL16抗體之pI值。Hd1.8Ld1.6抗體、pH7pL14抗體及pH7pL16抗體之pI值分別測定為7.47、7.07及6.52，顯示出pH7pL14抗體、pH7pL16抗體之pI值相較於Hd1.8Ld1.6抗體之pI值，分別減少0.4、0.95。

(3)點變異pI改變抗體之Tm值的測定

由Hd 1.8Ld 1.6抗體、pH7pL14抗體及pH7pL16抗體所得到之Fab之Tm值，係依據實施例1所記載之方法，使用VP-DsC(Micro Cal)進行測定。此時，使用PBS作為透析外液。另外，作為DSC測定用試樣溶液，抗體濃度調製成25-100μg/ml。於20℃~115℃，藉由掃描速度設定為約4K/分之DSC掃描，測定參考溶液(透析外液)及DSC測定用試樣溶液。Hd1.8Ld 1.6抗體、pH7pL14抗體及pH7pL16抗體之Fab熱變性中間溫度分別測定為77.5，78.0及74.7℃。

(4)藉由競爭ELISA進行之點變異pI改變抗體對於抗原之結合活性之評估

使用實施例1所記載的方法，測定對於抗原之磷脂醯肌醇蛋白聚醣3之各點變異pI改變抗體之結合活性(圖10)。顯示出對pH7pH14抗體及pH7pL16抗體之磷脂醯肌醇蛋白聚醣3的結合活性，係與H0L0抗體的為幾乎同等。

[實施例9]使用FTP-KO株的各點變異pI改變抗體之調製

藉由將含編碼在實施例8製作的各點變異pI改變抗體之基因之表現載體，於參考實施例2製作的FTP-KO株，使用Polyethylenimine(Polysciences Inc.)將表現載體收取進入細胞內，表現出該改變抗體。由上述細胞之培養上清液，使用rProtein A sepharose TM Fast Flow(Amersham Biosciences)精製該改變抗體。經過精製的抗體溶液係以實施例5所記載之方法進行調製，測定其抗體濃度。

[實施例10]使用in vivo模型的人化GC33抗體及各點變異pI改變抗體之藥效測試

(1)供移植至in vivo模型的細胞株之維持

使用Hep G2細胞(ATCC)。Hep G2細胞係在含10%FBs、1mmol/l MEM Sodium Pyruvate(Invitrogen)、1mmol/l MEM Non-Essential Amino Acid(Invitrogen)的Minimun Essential Medium Eagle培養基(SIGMA)(以下稱為繼代用培養基)中繼代而維持。

(2)Hep G2細胞移植小鼠模型之製作

Hep G2細胞之細胞懸浮液，係使用含有繼代用培養基與MATRIGEL Matrix(BD Bioscience)1：1的溶液，以成為5×10⁷ 細胞/ml之方式調製。細胞之移植前日，於預先將抗去唾液酸GM1抗體(和光純藥，1小瓶中之內容物，係藉由5ml的該溶液溶解)100μl投予至腹腔內之SCID小鼠(雄性，5週齡)(日本CLEA)之腹部皮下，移植該細胞懸浮液100μl(5×10⁶ 細胞/小鼠)。腫瘤體積係使用以下公式計算出：

腫瘤體積=長徑×短徑×短徑/2，在腫瘤體積的平均成為400mm³ 的時間點，判斷模型為成立。

(3)含各被驗抗體的投予試樣之調製

含HOLO抗體、Hd1.8Ld1.6抗體、pH7pL14抗體、pH7pL16抗體之各抗體的投予試樣，係在其投予當日，使用生理食鹽水，以成為0.1mg/ml(1mg/kg投予群)之方式調製。

(4)含抗體的投予試樣之投予

從對在(2)所製作的小鼠模型的Hep G2細胞之移植後34天開始，每週1次，於5週的期間，在上述(3)所調製的投予試樣，係以10ml/kg的投予量由尾部靜脈投予。作為陰性對照，相同地將生理食鹽水每週1次，於5週的期間，以10ml/kg的投予量由尾部靜脈投予。任一群皆以5隻定為1群，對各群實施含各被驗抗體的投予試樣之投予。與投予幾乎同時地，由各群之中3隻個體採取其靜脈血作為用於測定各抗體之小鼠血漿中濃度所使用的被驗物質。具體而言，在初次投予後0.5小時、即將進行第三次投予前的二個時間點，由背部足靜脈進行採血。20μl容量之採血係藉由肝素處理進行，藉由離心分離調製血漿。

(5)各被驗抗體的抗腫瘤效果之評估

人類肝癌移植小鼠模型中之各被驗抗體的抗腫瘤效果，係藉由測定投予試樣之投予最終日至一週後之腫瘤體積進行評估。其結果，如圖11所表示，認為在pH7pL14抗體及pH7pL16抗體相較於H0L0抗體、Hd1.8Ld1.6抗體有藥效變強的傾向。

[實施例11]使用invivo模型的人化GC33抗體及各點變異抗體之PK測試

(1)含各被驗抗體的投予試樣之調製

含H0L0抗體、Hd1.8Ld1.6抗體、pH7pL14抗體、pH7pL16抗體、pH7M85pL16抗體之各抗體的投予試樣，係在其投予當日使用生理食鹽水，以成為0.5mg/ml(5mg/kg投予)之方式調製。

(2)含抗體的投予試樣之投予

將在上述(1)所調製的投予試樣，以10ml/kg的投予量由尾部靜脈投予至C.B-17/lcr-scid小鼠。任一群皆以3隻定為1群，對各群實施含各被驗抗體的投予試樣之投予。採取其靜脈血作為用於測定各抗體之小鼠血漿中濃度所使用的被驗物質。具體而言，在初次投予後0.5小時、2小時、8小時、24小時、72小時、168小時的七個時間點，由背部足靜脈進行採血。20μl容量之採血係藉由肝素處理進行，藉由離心分離調製血漿。

(3)各被驗抗體的血漿中濃度

小鼠血漿中之被驗抗體的濃度係藉由以實施例6所記載之ELISA法為基準之方法進行測定。調製血漿中濃度為12.8、6.4、3.2、1.6、0.8、0.4、0.2μg/ml之檢量線試樣。檢量線試樣及以成為所希望濃度之方式適宜地稀釋之小鼠血漿被驗試樣被分注至將soluble Glypican-3 core(中外製藥公司製)固態化之免疫盤(Nunc-ImmunoPlate，MaxiSoup(Nalge nunc International))，使該盤於室溫靜置1小時。其後，依序分注Goat Anti-Human IgG-BIOT(Southern Biotechnology Associates)及Streptavidin-alkaline phosphatase conjugate(Roche Diagnostics)，進行使用BluePhos Microwell Phosphatase substrates system(Kirkegaard&Perry Laboratories)作為基質的發色反應。各孔之反應液之呈色係藉由使用微量盤測讀儀測定反應液之650nm之吸光度而計算出。根據由各檢量線試樣之吸光度製作的檢量線，使用解析軟體SOFTmax PRO(Molecular Devices)計算出小鼠血漿中之抗體濃度。

投予後之小鼠血漿中濃度表示於圖12。顯示若被驗抗體的pI降低，則小鼠血漿中之抗體濃度變高。

[實施例12]使用人類末梢血單核球作為效應細胞的各被驗抗體的ADCC活性

使用人類末梢血單核球(以下稱為人類PBMC)作為效應細胞，而各被驗抗體的ADCC活性係如以下之方式測定。

(1)人類PBMC溶液之調製

使用預先注入1000單位/ml的肝素溶液(NOVO-HEPARIN注5千單位，NOVONORDISK)之200μl注射器，由中外製藥股份有限公司所屬之正常人志願者(成人男性)採取末梢血50ml。使用PBS(-)，稀釋成2倍之該末梢血被4等分，加入預先注入15ml的Ficoll-Paque PLUS並進行離心操作之Leucosep淋巴球分離管(Greiner bio-one)。分注有該末梢血之分離管，係以2150rpm之速度，於室溫進行10分鐘的離心分離操作之後，分取出單核球部分層。藉由含10%FBS的Dulbecco's Modified Eagle'sMedium(SIGMA)(以下稱為10%FBS/D-MEM)，將該各分層所含之細胞洗淨1次後，使該細胞以其細胞密度成為5×10⁶ 細胞/ml之方式懸浮於10%FBS/D-MEM中。以該細胞懸浮液作為人類PBMC溶液，供以後之實驗。

(2)標的細胞之調製

Hep G2細胞被由培養皿剝離，以成為1×10⁴ cells/孔之方式接種至96孔U底盤。該盤係在5%二氧化碳培養箱中，於37℃培養一晚。翌日，於該盤之各孔中加入5.55MBq之Cr-51，該盤係在5%二氧化碳培養箱中，於37℃培養3小時。存在於該盤之各孔中之Hep G2細胞係作為標的細胞，於以後之ADCC活性之測定時使用。

(3)鉻游離測試(ADCC活性)

ADCC活性係以由鉻釋放法而得之特異的鉻游離率進行評估。於(2)所調製的標的細胞係以培養基洗淨，分別添加調製成各濃度(0、0.004、0.04、0.4、4、40μg/ml)的H0L0抗體、Hd1.8Ld1.6抗體、pH7pL14抗體、pH7pL16抗體之各抗體100μl。該盤係於室溫進行15分鐘反應之後，除去抗體溶液。接著，於各孔中添加繼代用培養基各100μl之該盤，係在5%二氧化碳培養箱中，於37℃培養1小時。於各孔中加入於(1)所調製的人類PBMC溶液各100μl(5×10⁵ 細胞/孔)之該盤，係在5%二氧化碳培養箱中，於37℃靜置4小時後，進行離心分離操作。

該盤之各孔中之100μl的培養上清液的放射活性係使用伽瑪計數器進行測定。以下式為基準：

特異的鉻游離率(%)=(A-C)×100/(B-C)可求得特異的鉻游離率。

在上式中，A表示各孔中之100μl的培養上清液的放射活性(cpm)之平均值。

另外，B表示在標的細胞添加100μl的2%NP-40水溶液(Nonidet P-40、NACALAI TESQUE)及50μl的10%FBS/D-MEM培養基之孔中之100μl的培養上清液的放射活性(cpm)之平均值。進一步，C表示在標的細胞添加150μ110%FBS/D-MEM培養基的孔中之100μl的培養上清液的放射活性(cpm)之平均值。測試係以triplicate實施，並計算出反映各被驗抗體的ADCC活性之上述測試中之特異的鉻游離率(%)之平均值及標準偏差。

(4)各被驗抗體的ADCC活性之評估

透過各被驗抗體，對人類PBMC所發揮之ADCC活性進行評估的結果，認為全部的被驗抗體部具有ADCC活性。其結果示於圖13。對於在各濃度之各被驗抗體所表現出特異的鉻游離率，進行顯著差異檢定的結果，在全部之抗體濃度中，各被驗抗體所表現出特異的鉻游離率與對照群之H0L0抗體比較，認為沒有顯著的差異。在統計解析方面，使用SAS前臨床套件(SAS Institute Inc.)。基於以上之結果，顯示出此pI經過改變的各被驗抗體的ADCC活性沒有差異。

[實施例13]使恆定區域之pI值降低的改變體之製作與評估

(1)用於恆定區域之pI值降低的改變處之選定

在具有序列號碼31所記載的胺基酸序列之IgG1恆定區域中，將欠缺以EU編號為基準之第446號之Gly及第447號之Lys之IgG1恆定區域，提供IgG1⊿GK(序列號碼32)。藉由使其欠缺該等兩者胺基酸，來自抗體之重鏈恆定末端的異質性減低開始成為可能的。

藉由將IgG1⊿GK之一部份之胺基酸殘基取代為以其EU編號對應之人類IgG4恆定區域序列之胺基酸殘基，進行使其恆定區域之pI值下降之改變。

具體而言，以IgG1⊿GK之以EU編號為基準之第268號之組胺酸(H)被取代成IgG4之序列之麩醯胺酸(Q)、第274號之離胺酸(K)被取代成麩醯胺酸(Q)、355號精胺酸(R)被取代成盤醯胺酸(Q)、356號天門冬胺酸(D)被取代成麩胺酸(E)、358號白胺酸(L)被取代成甲硫胺酸(M)、419號麩醯胺酸(Q)被取代成麩胺酸(E)。就該等變異任一者皆可成為T-cell表位之9~12胺基酸而言，由於僅使用來自人類恆定區域的序列，因此認為免疫原性風險低。而製作出導入該等6處之改變至IgG 1⊿GK之M85(序列號碼：33)。

藉由組合此恆定區域M85與可變區域pH7及H0，製作pH7M85(序列號碼：34)及H0M85(序列號碼：35)。並且製作使用H0M85或pH7M85作為H鏈，使用L0或pL16作為L鏈的H0M85L0抗體及pH7M85pL16抗體。另外還製作於實施例1及實施例8製作之恆定區域同時為IgG1的H0L0抗體及pH7pL16抗體。H0M85L0，pH7M85pL16，H0L0，pH7pL16之表現與精製係使用FTP-KO株或HEK293細胞實施，以實施例1或9所記載之方法調製。

(2)恆定區域pI改變抗體之pI值的測定

H0L0抗體、H0M85L0抗體、pH7pL16抗體、pH7M85pL16抗體之pI值，係藉由以實施例1為基準之方法，使用PhastGel IEF 4-6.5(GE Healthcase)，藉由與實施例1同等泳動條件作測定。H0L0抗體、H0M85L0抗體、pH7pL16抗體及pH7M85pL16抗體之pI值分別測定為8.85、8.16、6.52及5.78。恆定區域之改變並不影響抗體之免疫原性，進一步判明了其貢獻於pI值的降低之現象。

(3)藉由競爭ELISA進行之恆定區域pI改變抗體之結合活性之評估

各恆定區域pI改變抗體之對抗原之結合活性係藉由實施例1所記載的方法測定(圖14)。顯示出H0L0抗體、H0M85L0抗體、pH7pL16抗體、pH7M85pL16抗體對之磷脂醯肌醇蛋白聚醣3之結合活性為幾乎同等之情形。

[實施例14]使用恆定區域pI改變抗體之人類末梢單核球作為效應細胞的ADCC活性

藉由以實施例12所記載的方法為基準之方法，測定pH7pL16抗體與pH7M85pL16抗體造成的ADCC活性。其結果示於圖15。對於在各濃度中之各被驗抗體所表現出特異的鉻游離率，進行顯著差異檢定之結果，並不認為在全部抗體濃度中，各被驗抗體所表現出特異的鉻游離率之被驗抗體間有顯著的差異。在統計解析方面，使用sAs前臨床套件(SAS Institute Inc.)。基於以上之結果，顯示出對於pH7pL16抗體與其恆定區域經改變的pH7M85pL16抗體之ADCC活性而言沒有差異。

圖1係由Hspu2.2Lspu2.2(Hu2.2Lu2.2)抗體之DSC(示差掃描熱量計)測定所得到之線圖。

圖2係表示在高pI等電點電泳之H0L0抗體及Hspu2.2Lspu2.2(Hu2.2Lu2.2)抗體之電泳圖。線道1及4表示pI標識之電泳圖、線道2表示H0L0抗體、線道3表示Hspu2.2Lspu2.2(Hu2.2Lu2.2)抗體之電泳圖。數字表示pI標識之分子之pI值，箭號表示該pI值之標識分子之泳動度。

圖3係在低pI等電點電泳之H0L0抗體及Hspd1.8Lspd1.6(Hd 1.8Ld 1.6)抗體之電泳圖。線道1及4表示pI標識之電泳圖，線道2表示H0L0抗體、線道3表示Hspd1.8Lspd1.6(Hd1.8Ld 1.6)抗體之電泳圖。數字表示pI標識之分子的pI值，箭號表示該pI值的標識分子之泳動度。

圖4係表示使用H15L4抗體及H0L0抗體的由競爭ELISA而得之對於抗原之磷脂醯肌醇蛋白聚醣3之結合親和性之圖。黑色菱形表示H0L0抗體之結合親和性，灰色四角形表示H15L4抗體之結合親和性。

圖5係表示使用Hspu2.2Lspu2.2(Hu2.2Lu2.2)抗體及H0L0抗體的由競爭ELISA而得之對於抗原之磷脂醯肌醇蛋白聚醣3之結合親和性之圖。黑色菱形表示H0L0抗體之結合親和性，灰色四角形表示Hspu2.2Lspu2.2(Hu2.2Lu2.2)抗體之結合親和性。

圖6係表示使用Hspd1.8Lspd1.6(Hd1.8Ld 1.6)抗體及H0L0抗體的由競爭ELISA而得之對於抗原之磷脂醯肌醇蛋白聚醣3之結合親和性之圖。黑色菱形表示H0L0抗體之結合親和性，灰色四角形表示Hspd1.8Lspd1.6(Hd1.8Ld1.6)抗體之結合親和性。

圖7係表示H0L0抗體、Hspu2.2Lspu2.2(Hu2.2Lu2.2)抗體及Hspd1.8Lspd1.6(Hd1.8Ld 1.6)抗體在人類肝癌移植小鼠模型中之抗腫瘤效果。

圖7A係表示將各被驗抗體投予至以5mg/kg的投予量該模型時之H0L0抗體、Hspu2.2Lspu2.2(Hu2.2Lu2.2)抗體及Hspd1.8Lspd1.6(Hd1.8Ld1.6)抗體在人類肝癌移植小鼠模型中之抗腫瘤效果。黑色菱形表示媒介物的投予效果，黑色三角形表示Hspd1.8Lspd1.6(Hd1.8Ld1.6)抗體之投予效果、白色中空圓形表示Hspu2.2Lspu2.2(Hu2.2Lu2.2)抗體之投予效果，及黑色四角形表示H0L0抗體之投予效果。

圖7B係表示將各被驗抗體以1mg/kg的投予量投予至該模型時之H0L0抗體、Hspu2.2Lspu2.2(Hu2.2Lu2.2)抗體及Hspd1.8Lspd1.6(Hd 1.8Ld 1.6)抗體在人類肝癌移植小鼠模型中之抗腫瘤效果。黑色菱形表示媒介物(vehicle)的投予效果，黑色三角形表示Hspd 1.8Lspd1.6(Hd1.8 Ld1.6)抗體之投予效果、白色中空圓形表示Hspu2.2 Lspu2.2(Hu2.2Lu2.2)抗體之投予效果，及黑色四角形表示H0L0抗體之投予效果。

圖8係表示H0L0抗體、Hspu2.2Lspu2.2(Hu2.2Lu2.2)抗體及Hspd1.8Lspd1.6(Hd1.8Ld1.6)抗體在人類肝癌移植小鼠模型中之抗體血漿中濃度。

圖8A係表示將各被驗抗體以5mg/kg的投予量投予至該模型時之H0L0抗體、Hspu2.2Lspu2.2(Hu2.2Lu2.2)抗體及Hspd1.8Lspd1.6(Hd1.8Ld 1.6)抗體在人類肝癌移植小鼠模型中之被投予的抗體之血漿中濃度。黑色三角形表示Hspd 1.8Lspd1.6(Hd1.8Ld1.6)抗體之血漿中濃度、白色中空圓形表示Hspu2.2Lspu2.2(Hu2.2Lu2.2)抗體之血漿中濃度，及黑色四角形表示H0L0抗體之血漿中濃度。

圖8B係表示將各被驗抗體以1mg/kg的投予量投予至該模型時之H0L0抗體、Hspu2.2Lspu2.2(Hu2.2Lu2.2)抗體及Hspd1.8Lspd1.6(Hd1.8Ld1.6)抗體在人類肝癌移植小鼠模型中之抗腫瘤效果。黑色三角形表示Hspd1.8Lspd1.6(Hd1.8Ld1.6)抗體之血漿中濃度、白色中空圓形表示Hspu2.2Lspu2.2(Hu2.2Lu2.2)抗體之血漿中濃度，及黑色四角形表示H0L0抗體之血漿中濃度。

圖9係表示對人類肝癌細胞株HepG2細胞之各被驗抗體造成的ADCC活性。黑色三角形表示Hspd1.8Lspd1.6(Hd1.8Ld1.6)抗體造成的ADCC活性、白色中空圓形表示Hspu2.2Lspu2.2(Hu2.2Lu2.2)抗體造成的ADCC活性，及黑色四角形表示H0L0抗體造成的ADCC活性。

圖10係表示使用H0L0抗體、Hd 1.8Ld 1.6抗體、pH7pL14抗體及pH7pL1.6抗體的由競爭ELISA而得之對於抗原之磷脂醯肌醇蛋白聚醣3之結合親和性之圖。黑色圓形表示H0L0抗體造成的結合活性、白色中空圓形表示Hd1.8Ld1.6抗體造成的結合活性、黑色四角形表示pH7pL14抗體造成的結合活性、及白色中空四角形表示pH7pL16抗體造成的結合活性。

圖11係表示H0L0抗體、pH7pL14抗體及pH7pL16抗體在人類肝癌移植小鼠模型的抗腫瘤效果。*表示H0L0抗體、白色中空圓形表示Hd1.8Ld1.6抗體、黑色四角形表示pH7pL14抗體，及白色中空四角形表示pH7pL16抗體造成的各抗腫瘤效果。

圖12表示H0L0抗體、Hd1.8Ld1.6抗體、pH7pL14抗體、pH7pL16抗體及pH7M85pL16在小鼠中之抗體血漿中濃度。*表示H0L0抗體、白色中空圓形表示Hd1.8Ld1.6抗體、黑色四角形表示pH7pL14抗體、白色中空四角形表示pH7pL16抗體、及黑色三角形表示pH7M85pL16在小鼠中之各抗體之血漿中濃度。

圖13係表示H0L0抗體、Hd1.8LdI.6抗體、pH7pL14抗體、pH7pL16抗體對人類肝癌細胞株Hep G2細胞造成的ADCC活性。黑色圓形表示H0L0抗體造成的ADCC活性、白色中空圓形表示Hd1.8Ld1.6抗體造成的ADCC活性、黑色四角形表示pH7pL14抗體造成的ADCC活性，及白色中空四角形表示pH7pL16抗體造成的ADCC活性。

圖14係表示使用H0L0抗體、H0M85L0抗體、pH7pL16抗體及pH7M85pL16抗體的由競爭ELISA而得之對於抗原之磷脂醯肌醇蛋白聚醣3之結合親和性之圖。黑色三角形表示H0L0抗體造成的結合活性、黑色四角形表示H0M85L0抗體造成的結合活性，*表示pH7pL16抗體造成的結合活性，及白色中空菱形表示pH7M85pL16抗體造成的結合活性。

圖15係表示pH7pL16抗體及pH7M85pL16抗體對人類肝癌細胞株Hep G2細胞造成的ADCC活性。白色中空四角形表示pH7pL16抗體造成的ADCC活性、黑色三角形表示pH7M85pL16抗體造成的ADCC活性。

Claims (11)

1. 一種抗體，其係含有以序列號碼27所表示之重鏈可變區域及以序列號碼29所表示之輕鏈可變區域。
2. 如申請專利範圍第1項之抗體，其係具有人類抗體之恆定區域。
3. 如申請專利範圍第2項之抗體，其中該恆定區域含有以序列號碼32或以序列號碼33所表示之序列。
4. 如申請專利範圍第1至3項中任一項之抗體，其係結合於該抗體Fc區域之海藻糖含量降低之抗體。
5. 一種組成物，其特徵為含有申請專利範圍第1至4項中任一項之抗體、及醫藥上所容許之擔體。
6. 一種癌治療劑，其特徵為含有申請專利範圍第1至4項中任一項之抗體作為有效成分。
7. 如申請專利範圍第6項所記載之癌治療劑，其中癌為肝癌。
8. 一種核酸，其特徵為將構成申請專利範圍第1至4項中任一項之抗體之多胜肽加以編碼。
9. 一種宿主細胞，其特徵為保持申請專利範圍第8項之核酸。
10. 如申請專利範圍第9項之宿主細胞，其中宿主細胞係海藻糖轉運蛋白缺損之動物細胞，岩藻糖基轉移酶缺失之動物細胞，或複合分枝糖鏈經修飾改變之動物細胞。
11. 一種抗體之製造方法，其特徵為包含培養申請專利範圍第9或10項之宿主細胞之步驟、及由細胞培養物回收多胜肽之步驟。