JP6101611B2 - 血漿中動態が改善されたグリピカン3抗体 - Google Patents
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Description
本出願は、日本特許出願第2007−256063号(2007年9月28日出願に基づく優先権を主張する。この出願の開示は、図面および表を含め、すべて参照により本明細書に取り込まれる。
本発明は、グリピカン3抗体の血漿中(血中)動態を改善する方法、血漿中動態が改善されたグリピカン3抗体を有効成分として含有する医薬組成物、および、その製造方法等に関する。
[1] 血漿中動態が制御されたグリピカン3抗体の製造方法であって、
(a)グリピカン3抗体をコードする核酸を保持する宿主細胞を、当該核酸が発現する条件下で培養し、ここで、当該グリピカン3抗体は、抗体の表面に露出され得る少なくとも一つのアミノ酸残基の電荷が改変されるように変更されたアミノ酸配列を有しており、そして
(b)当該宿主細胞の培養物からグリピカン3抗体を回収する、
の各段階を含む方法;
[2] 前記血漿中動態の制御が、血漿中半減期、平均血漿中滞留時間、血漿中クリアランスのいずれかのパラメーターの伸張または減縮である[1]に記載の方法;
[3] アミノ酸残基の電荷の改変が、アミノ酸置換による[1]に記載の方法;
[4] 前記グリピカン3抗体の表面に露出され得るアミノ酸残基が、グリピカン3抗体中のFcRn結合領域以外の領域にある[1]に記載の方法;
[5] 前記FcRn結合領域が、Fc領域からなる[4]に記載の方法;
[6] 前記FcRn結合領域が、Kabat表記におけるEU番号250、253、310、311、314、428、435、436のアミノ酸残基を含む[4]に記載の方法;
[7] グリピカン3抗体がIgG抗体である[1]に記載の方法;
[8] その電荷が改変されるアミノ酸残基が、重鎖可変領域または軽鎖可変領域のアミノ酸残基である[1]から[7]に記載の方法;
[9] 前記グリピカン3抗体がヒト以外の動物由来の相補性決定領域(CDR)、ヒト由来のフレームワーク領域(FR)およびヒト定常領域を含むグリピカン3抗体であって、アミノ酸残基の電荷の改変が、抗体のCDRまたはFR中の抗体表面に露出され得る少なくとも一つのアミノ酸残基から、当該アミノ酸残基と異なる電荷を有するアミノ酸残基への置換であることを特徴とする[8]に記載の方法;
[10] 前記アミノ酸残基の電荷の改変が、
(1)配列番号1で表される重鎖可変領域のうち以下のいずれか一つ又はそれ以上の置換;
(a)43番目のアミノ酸残基であるQのKへの置換
(b)52番目のアミノ酸残基であるDのNへの置換、
(c)107番目のアミノ酸残基であるQのRへの置換、
および/又は、
(2)配列番号7で表される軽鎖可変領域のうち以下のいずれか一つ又はそれ以上の置換;
(d)17番目のアミノ酸残基であるEのQへの置換、
(e)27番目のアミノ酸残基であるQのRへの置換、
(f)105番目のアミノ酸残基であるQのRへの置換、
であることを特徴とする[9]に記載の方法;
[11] 前記アミノ酸残基の電荷の改変が、
(1)配列番号1で表される重鎖可変領域のうち以下のいずれか一つ又はそれ以上の置換;
(a)19番目のアミノ酸残基であるKのTへの置換、
(b)43番目のアミノ酸残基であるQのEへの置換、
(c)62番目のアミノ酸残基であるQのEへの置換、
(d)63番目のアミノ酸残基であるKのSへの置換、
(e)65番目のアミノ酸残基であるKのQへの置換、
(f)66番目のアミノ酸残基であるGのDへの置換、
および/又は、
(2)配列番号7で表される軽鎖可変領域のうち以下のいずれか一つ又はそれ以上の置換;
(g)24番目のアミノ酸残基であるRのQへの置換、
(h)27番目のアミノ酸残基であるQのEへの置換、
(i)79番目のアミノ酸残基であるKのTへの置換、
(j)82番目のアミノ酸残基であるRのSへの置換、
(k)112番目のアミノ酸残基であるKのEへの置換、
であることを特徴とする[9]に記載の方法;
[12] さらに、以下の改変;
配列番号31で表わされる重鎖定常領域のうち以下のいずれか一つ又はそれ以上の置換;
(a)151番目のアミノ酸残基であるHのQへの置換、
(b)157番目のアミノ酸残基であるKのQへの置換、
(c)238番目のアミノ酸残基であるRのQへの置換、
(d)239番目のアミノ酸残基であるDのEへの置換、
(e)241番目のアミノ酸残基であるLのMへの置換、
(f)302番目のアミノ酸残基であるQのEへの置換、
を含むことを特徴とする[11]に記載の方法;
[13] 前記グリピカン3抗体が、そのFc領域に結合したフコース含量が低下した抗体である[9]から[12]に記載の方法;
[14] [1]から[13]に記載の方法により製造されるグリピカン3抗体;
[15] 血漿中動態が制御された抗体の製造方法であって、
(a)抗体をコードする核酸を保持する宿主細胞を、当該核酸が発現する条件下で培養し、ここで、当該抗体は、抗体のFcRn結合領域以外の定常領域にあるアミノ酸残基の電荷が改変されるように変更されたアミノ酸配列を有しており、そして
(b)当該宿主細胞の培養物から抗体を回収する、
の各段階を含む方法;
[16] 前記血漿中動態の制御が、血漿中半減期、平均血漿中滞留時間、血漿中クリアランスのいずれかのパラメーターの伸張または減縮である[15]に記載の方法;
[17] アミノ酸残基の電荷の改変が、アミノ酸置換による[15]に記載の方法;
[18] 抗体がIgG抗体である[17]に記載の方法;
[19] 抗体がIgG1である[18]に記載の方法;
[20] 前記アミノ酸残基の電荷の改変が、IgG1抗体の1又はそれ以上のアミノ酸残基の、IgG4抗体の対応する1又はそれ以上のアミノ酸残基への置換であることを特徴とする[17]に記載の方法;
[21] 前記FcRn結合領域が、Kabat表記におけるEU番号250、253、310、311、314、428、435、436のアミノ酸残基を含む[15]から[20]に記載の方法;
[22] 前記アミノ酸残基の電荷の改変が、配列番号31で表わされる重鎖定常領域のうち以下のいずれか一つ又はそれ以上の置換;
(a)151番目のアミノ酸残基であるHのQへの置換、
(b)157番目のアミノ酸残基であるKのQへの置換、
(c)238番目のアミノ酸残基であるRのQへの置換、
(d)239番目のアミノ酸残基であるDのEへの置換、
(e)241番目のアミノ酸残基であるLのMへの置換、
(f)302番目のアミノ酸残基であるQのEへの置換、
であることを特徴とする[20]に記載の方法;
[23] 抗体がグリピカン3抗体である[15]から[22]に記載の方法;
[24] ヒト以外の動物由来の相補性決定領域(CDR)、ヒト由来のフレームワーク領域(FR)及びヒト定常領域を含むグリピカン3抗体の安定化方法であって、
(a)グリピカン3抗体をコードする核酸を保持する宿主細胞を、当該核酸が発現する条件下で培養し、ここで、当該グリピカン3抗体は、少なくとも一つのアミノ酸残基の改変によりTm値の増大をもたらすように変更されたアミノ酸配列を有しており、そして
(b)当該宿主細胞の培養物から抗体を回収する、
の各段階を含む方法;
[25] アミノ酸残基が、その重鎖または軽鎖のFR1領域および/またはFR2領域に存在することを特徴とする[24]に記載の方法;
[26] 重鎖のFR2領域のアミノ酸残基をVH4サブクラスのFR2領域のアミノ酸残基に置換することを特徴とする[25]に記載の方法;
[27] 軽鎖のFR2領域のアミノ酸残基をVK3サブクラスのFR2領域のアミノ酸残基に置換することを特徴とする[25]に記載の方法;
[28] 前記アミノ酸残基の改変が、
(1)配列番号1で表される重鎖可変領域を構成するアミノ酸残基に対して以下のいずれか一つまたはそれ以上の置換;
(a)37番目のアミノ酸残基であるVのIへの置換、
(b)40番目のアミノ酸残基であるAのPへの置換、
(c)48番目のアミノ酸残基であるMのIへの置換、
(d)51番目のアミノ酸残基であるLのIへの置換、
および/又は
(2)配列番号7で表される軽鎖可変領域を構成するアミノ酸残基に対して以下のいずれか一つ又はそれ以上の置換;
(e)42番目のアミノ酸残基であるLのQへの置換、
(f)48番目のアミノ酸残基であるSのAへの置換、
(g)50番目のアミノ酸残基であるQのRへの置換、
であることを特徴とする[24]から[27]に記載の方法;
[29] 細胞傷害活性が制御された抗体の製造方法であって;
(a)抗体をコードする核酸を保持する宿主細胞を、当該核酸が発現する条件下で培養し、ここで、当該抗体は、細胞傷害活性を有する抗体の表面に露出され得る少なくとも一つのアミノ酸残基の電荷が改変されるように変更されたアミノ酸配列を有しており、そして
(b)当該宿主細胞の培養物から抗体を回収する、
の各段階を含む方法;
[30] アミノ酸残基の電荷の改変が、アミノ酸置換による[29]に記載の方法;
[31] 前記抗体の表面に露出され得るアミノ酸残基が、抗体中のFcRn結合領域以外の領域にある[29]に記載の方法;
[32] 前記FcRn結合領域が、Fc領域からなる[31]に記載の方法;
[33] 前記FcRn結合領域が、Kabat表記におけるEU番号250、253、310、311、314、428、435、436のアミノ酸残基を含む[31]に記載の方法;
[34] 抗体がIgG抗体である[29]に記載の方法;
[35] その電荷が改変されるアミノ酸残基が、定常領域のアミノ酸残基である[29]から[34]に記載の方法;
[36] その電荷が改変されるアミノ酸残基が、重鎖可変領域または軽鎖可変領域のアミノ酸残基である[29]から[34]に記載の方法;
[37] 前記抗体がヒト以外の動物由来の相補性決定領域(CDR)、ヒト由来のフレームワーク領域(FR)およびヒト定常領域を含む抗体であり、アミノ酸残基の電荷の改変が、抗体のCDRまたはFR中の抗体表面に露出され得る少なくとも一つのアミノ酸残基の、当該アミノ酸残基と異なる電荷を有するアミノ酸残基への置換であることを特徴とする[36]に記載の方法;
[38] 前記アミノ酸残基の電荷の改変が、
(1)配列番号1で表される重鎖可変領域のうち以下のいずれか一つ又はそれ以上の置換;
(a)19番目のアミノ酸残基であるKのTへの置換、
(b)43番目のアミノ酸残基であるQのEへの置換、
(c)62番目のアミノ酸残基であるQのEへの置換、
(d)63番目のアミノ酸残基であるKのSへの置換、
(e)65番目のアミノ酸残基であるKのQへの置換、
(f)66番目のアミノ酸残基であるGのDへの置換、
および/又は、
(2)配列番号7で表される軽鎖可変領域のうち以下のいずれか一つ又はそれ以上の置換;
(g)24番目のアミノ酸残基であるRのQへの置換、
(h)27番目のアミノ酸残基であるQのEへの置換、
(i)79番目のアミノ酸残基であるKのTへの置換、
(j)82番目のアミノ酸残基であるRのSへの置換、
(k)112番目のアミノ酸残基であるKのEへの置換、
であることを特徴とする[37]に記載の方法;
[39] さらに、以下の改変;
配列番号31で表わされる重鎖定常領域のうち以下のいずれか一つ又はそれ以上の置換;
(a)151番目のアミノ酸残基であるHのQへの置換、
(b)157番目のアミノ酸残基であるKのQへの置換、
(c)238番目のアミノ酸残基であるRのQへの置換、
(d)239番目のアミノ酸残基であるDのEへの置換、
(e)241番目のアミノ酸残基であるLのMへの置換、
(f)302番目のアミノ酸残基であるQのEへの置換、
を含むことを特徴とする[38]に記載の方法;
[40] 前記抗体がヒト以外の動物由来の相補性決定領域(CDR)、ヒト由来のフレームワーク領域(FR)およびヒト定常領域を含む抗体であり、アミノ酸残基の電荷の改変が、抗体の定常領域中の抗体表面に露出され得る少なくとも一つのアミノ酸残基の、当該アミノ酸残基と異なる電荷を有するアミノ酸残基への置換であることを特徴とする[36]に記載の方法;
[41] 置換が、配列番号31で表わされる重鎖定常領域のうち以下のいずれか一つ又はそれ以上の置換;
(a)151番目のアミノ酸残基であるHのQへの置換、
(b)157番目のアミノ酸残基であるKのQへの置換、
(c)238番目のアミノ酸残基であるRのQへの置換、
(d)239番目のアミノ酸残基であるDのEへの置換、
(e)241番目のアミノ酸残基であるLのMへの置換、
(f)302番目のアミノ酸残基であるQのEへの置換、
であることを特徴とする[40]に記載の方法;
[42] 前記抗体のFc領域に結合したフコース含量が低下した抗体である[37]から[41]に記載の方法;
[43] [29]から[42]に記載の方法により製造される抗体;
[44] 抗体がグリピカン3抗体である[43]に記載の抗体;
[45] (1)配列番号1で表される重鎖可変領域のアミノ酸配列において以下のいずれか一つ又はそれ以上の置換;
(a)19番目のアミノ酸残基であるKのTへの置換、
(b)43番目のアミノ酸残基であるQのEへの置換、
(c)62番目のアミノ酸残基であるQのEへの置換、
(d)63番目のアミノ酸残基であるKのSへの置換、
(e)65番目のアミノ酸残基であるKのQへの置換、
(f)66番目のアミノ酸残基であるGのDへの置換、
が施された重鎖可変領域、および/又は、
(2)配列番号7で表される軽鎖可変領域のアミノ酸配列において以下のいずれか一つ又はそれ以上の置換;
(g)24番目のアミノ酸残基であるRのQへの置換、
(h)27番目のアミノ酸残基であるQのEへの置換、
(i)79番目のアミノ酸残基であるKのTへの置換、
(j)82番目のアミノ酸残基であるRのSへの置換、
(k)112番目のアミノ酸残基であるKのEへの置換、
が施された軽鎖可変領域、
を含む抗体;
[46] 配列番号3で表される重鎖可変領域および配列番号9で表される軽鎖可変領域を含む[45]に記載の抗体;
[47] 配列番号5で表される重鎖可変領域および配列番号11で表される軽鎖可変領域を含む[45]に記載の抗体;
[48] 配列番号27で表される重鎖可変領域および配列番号28で表される軽鎖可変領域を含む[45]に記載の抗体;
[49] 配列番号27で表される重鎖可変領域および配列番号29で表される軽鎖可変領域を含む[45]に記載の抗体;
[50] ヒト抗体の定常領域を有する[45]から[49]に記載の抗体;
[51] 前記定常領域が配列番号32又は配列番号33で表わされる配列を含む[50]に記載の抗体;
[52] (1)配列番号1で表される重鎖可変領域のアミノ酸配列において以下のいずれか一つ又はそれ以上の置換;
(a)43番目のアミノ酸残基であるQのKへの置換、
(b)52番目のアミノ酸残基であるDのNへの置換、
(c)107番目のアミノ酸残基であるQのRへの置換、
が施された重鎖可変領域、および/又は、
(2)配列番号7で表される軽鎖可変領域のアミノ酸配列において以下のいずれか一つ又はそれ以上の置換;
(d)17番目のアミノ酸残基であるEのQへの置換、
(e)27番目のアミノ酸残基であるQのRへの置換、
(f)105番目のアミノ酸残基であるQのRへの置換、
が施された軽鎖可変領域、
を含む抗体;
[53] 配列番号4で表される重鎖可変領域および配列番号10で表される軽鎖可変領域を含む[52]に記載の抗体;
[54] 配列番号6で表される重鎖可変領域および配列番号12で表される軽鎖可変領域を含む[52]に記載の抗体;
[55] ヒト抗体の定常領域を有する[52]から[54]に記載の抗体;
[56] 配列番号31で表わされる重鎖定常領域のアミノ酸配列において以下のいずれか一つ又はそれ以上の置換;
(a)151番目のアミノ酸残基であるHのQへの置換、
(b)157番目のアミノ酸残基であるKのQへの置換、
(c)238番目のアミノ酸残基であるRのQへの置換、
(d)239番目のアミノ酸残基であるDのEへの置換、
(e)241番目のアミノ酸残基であるLのMへの置換、
(f)302番目のアミノ酸残基であるQのEへの置換、
を有する抗体;
[57] 配列番号33で表わされる重鎖定常領域を含む抗体;
[58] 前記抗体のFc領域に結合したフコース含量が低下した抗体である[45]から[57]に記載の抗体;
[59] [45]から[58]に記載の抗体、および、医薬的に許容される担体を含む組成物;
[60] [45]から[58]に記載の抗体を有効成分として含む癌治療剤;
[61] 癌が肝癌である[60]に記載の癌治療剤;
[62] [45]から[58]に記載の抗体を構成するポリペプチドをコードする核酸;
[63] [62に記載の核酸を保持する宿主細胞;
[64] 宿主細胞が、フコーストランスポーター欠損動物細胞、フコシルトランスフェラーゼ欠失動物細胞、又は、複合分岐糖鎖修飾改変動物細胞である[63]に記載の宿主細胞;
[65] [63]又は[64]に記載の宿主細胞を培養する工程、および細胞培養物からポリペプチドを回収する工程を含む抗体の製造方法;
を、提供するものである。
(a)グルタミン酸(E)、アスパラギン酸(D)
(b)リジン(K)、アルギニン(R)、ヒスチジン(H)
(1)エフェクター細胞の調製
CBA/Nマウスなどから脾臓を摘出し、RPMI1640培地(Invitrogen)中で脾臓細胞が分離される。10%ウシ胎児血清(FBS、HyClone)を含む同培地で洗浄後、細胞濃度を5x106細胞/mlに調製することによって、エフェクター細胞が調製され得る。
(2)補体溶液の調製
Baby Rabbit Complement(CEDARLANE)を10% FBS含有培地(Invitrogen)にて10倍希釈し、補体溶液が調製され得る。
(3)標的細胞の調製
被験抗体が結合する抗原タンパク質を発現する細胞を0.2 mCiの51Cr-クロム酸ナトリウム(GEヘルスケアバイオサイエンス)とともに、10% FBS含有DMEM培地中で37℃にて1時間培養することにより当該標的細胞が放射性標識され得る。被験抗体が結合する抗原タンパク質を発現する細胞としては、被験抗体が結合する抗原タンパク質をコードする遺伝子で形質転換された細胞、卵巣癌、前立腺癌、乳癌、子宮癌、肝癌、肺癌、膵臓癌、胃癌、膀胱癌、及び大腸癌細胞等が利用され得る。放射性標識後、当該細胞を10% FBS含有RPMI1640培地にて3回洗浄し、細胞濃度を2x105細胞/mlに調製することによって、当該標的細胞が調製され得る。
(1)ヒト化H0L0抗体の点変異遺伝子の作製
WO2006/046751に開示されるヒト化GC33抗体のCDRを含むグリピカン3抗体をコードする遺伝子を出発材料として、各種の点変異遺伝子を作製した。改変部位を含む順鎖および逆鎖の配列に基づいて設計されたオリゴDNAが合成された。市販のQuikChange Site-Directed Mutagenesis Kit(Stratagene)を用いて複数の点変異遺伝子が作製された。点変異遺伝子の作製は以下の条件に従ってPCR法によって実施された。10 ngの鋳型プラスミドと、10 pmolの順鎖および逆鎖の合成オリゴDNA、キットに添付された10x Buffer、dNTP mixおよびPfu turbo DNA polymeraseからなる反応混合物を、95℃にて30秒間加熱した後、95 ℃にて30秒、55 ℃にて1分、68 ℃にて4分から構成されるPCR反応サイクルが18回実施された。キットに添付されたDpnIが反応混合物に添加された後に37℃にて1時間の制限酵素による制限消化反応が継続された。当該反応液によってDH5αコンピテント細胞(TOYOBO)が形質転換された結果、形質転換体が得られた。当該形質転換体から単離されたプラスミドDNAの塩基配列の決定に基づいて、点変異が導入されたことが確認された点変異遺伝子は、動物細胞において挿入遺伝子を発現可能ならしめる発現ベクター中にクローン化された。改変遺伝子は以下に示す構成を有する改変により取得された。
熱変性中間温度(Tm)は、一定のプログラムされた加熱速度で被検試料溶液を加熱した後に得られるサーモグラム(Cp対T)における変性ピークの頂点として把握される。DSC測定用試料溶液の調製を以下の様に実施することによって、ヒト化H0L0抗体のTm値が測定された。まず、150 mmol/lの塩化ナトリウムを含む20 mol/lの酢酸ナトリウム緩衝溶液(pH6.0)を透析外液に対して、透析膜に封入された50-100μg相当量の抗体溶液が一昼夜の間、透析に供された。その後、透析外液を用いてその抗体濃度が50-100μg/mlに調製された試料溶液がDSC測定用試料溶液として使用された。
抗体が有するpI値が減少することにより、抗体の血漿中半減期が伸長する。それとは逆に抗体のpI値が増大することにより、抗体の組織移行性が改善される。癌治療に対する効果を奏する抗体のpI値の増加または減少のいずれかが、腫瘍抑制効果の増強をもたらすかは分かっていない。そこで、pI値が減少したヒト化H0L0抗体の改変抗体とpI値が増加したヒト化H0L0抗体の改変抗体を作製し、両者の抗腫瘍効果を比較検討することによって、いずれの改変が高い腫瘍抑制効果をもたらすかが検証された。
(a)高pI用の膨潤液の組成:
1.5 mlの10% Glycerol
100μlのPharmalyte 8-10.5 for IEF(AmerchamBioscience)
(b)低pI用の膨潤液の組成:
1.5 mlの精製水
20μlのPharmalyte 8-10.5 for IEF(AmerchamBioscience)
80μlのPharmalyte 5-8 for IEF(AmerchamBioscience)
Step 1:2000 V、2.5 mA、3.5 W、15℃、75 Vh
Step 2:200 V、2.5 mA、3.5 W、15℃、15 Vh
Step 3:2000 V、2.5 mA、3.5 W、15℃、410 Vh
H15にQ43K、D52N、Q107Rの改変が更に施されたHspu2.2(Hu2.2)(配列番号6)が作製された。また、L4にE17Q、Q27R、Q105R、およびCDR2のS25を生殖細胞系列で多いAに置換したS25Aの改変が施されたLspu2.2(Lu2.2)(配列番号12)が作製された。Hspu2.2(Hu2.2)およびLspu2.2(Lu2.2)とからなる抗体であるHspu2.2Lspu2.2(Hu2.2Lu2.2)抗体のTm値は76.8℃と計測され、pI値は9.6と計測された。H0L0抗体のpI値は8.9であることから、Hspu2.2Lspu2.2(Hu2.2Lu2.2)抗体のpI値は0.7増大した。
H15にK19T、Q43E、K63S、K65Q、G66Dの改変が更に施されたHspd1.8(Hd1.8)(配列番号5)が作製された。L4にQ27Eの改変が施され、L4を構成するFR3の79-84の配列であるKISRVEがTISSLQに改変され、Lspu2.2(Lu2.2)に対する改変同様にS25Aの改変が施されたLspd1.6(Ld1.6)(配列番号11)が作製された。Hspd1.8(Hd1.8)およびLspd1.6(Ld1.6)からなる抗体であるHspd1.8Lspd1.6(Hd1.8Ld1.6)のpI値は7.4と計測された。H0L0抗体のpI値は8.9であることからHspd1.8Lspd1.6(Hd1.8Ld1.6)抗体のpI値は1.5減少した。
(1)で精製されたH0L0抗体およびその点変異改変抗体の競合ELISAによる評価が行われた。1μg/mlとなるように調製された可溶型GPC3コアポリペプチド(配列番号13)が96穴プレートに1ウエル当たり100μl加えられた。当該プレートは4℃にて終夜静置され、可溶型GPC3コアポリペプチドが当該プレートに固相化された。当該プレートに固相化された可溶型GPC3コアポリペプチドはSkan WASHER400(Molecular Devices)を用いて洗浄緩衝液にて3回洗浄され200μlのブロッキング緩衝液が加えられ4℃にて30分以上ブロックされた。当可溶型GPC3コアポリペプチドが固相化されブロックされたプレートは次にSkan WASHER400を用いて洗浄緩衝液にて3回洗浄された。その後、種々の濃度のH0L0抗体またはその点変異改変抗体と終濃度0.3μg/mlのビオチン化されたH0L0抗体がそれぞれ100μl混合された混合液200μlがプレート1ウエル当たり加えられた。H0L0抗体のビオチン化はBiotin Labelingキット(Roche)を用いてキットの手順書に従い実施された。当該プレートは室温にて1時間静置された後、Skan WASHER400(Molecular Devices)を用いて洗浄緩衝液にて5回洗浄された。その1ウエル当たり基質緩衝液によって20,000倍に希釈された100μlの Goat anti streptabidin Alkaline phosphatase(ZYMED)が加えられた当該プレートは、室温にて1時間静置された後Skan WASHER400を用いて洗浄緩衝液にて5回洗浄された。基質緩衝液を用いて1 mg/mlとなるようにPhosphatase Substrate(Sigma)が調製され、1ウエル当たり100μl加えられ1時間静置された。Benchmark Plus(BIO-RAD)を用いて655 nmの対照吸光度を用いて、各ウエル中の反応液の405 nmにおける吸光度が測定された。
(1)ターゲッティングベクターの構築
(1−1) KO1ベクターの作製
pcDNA3.1/Hygro(インビトロジェン)よりHyg5-BHとHyg3-NTのプライマーでPCRすることによって、Hygromycin耐性遺伝子(Hygr)の開始コドンの5’側にBamH IサイトとTGCGCの配列を付加することで、フコーストランスポーター遺伝子の開始コドンの5’側と同じ配列にし、SV40 polyA付加シグナルまでの領域を含む3’側にはNot Iサイトを付加してHygrを抜き出した。
フォワードプライマー
Hyg5-BH 5’- GGATCCTGCGCATGAAAAAGCCTGAACTCACC -3’(配列番号14)
リバースプライマー
Hyg3-NT 5’- GCGGCCGCCTATTCCTTTGCCCTCGGACG -3’(配列番号15)
pKJ2ベクター(Popo H, Biochemical Genetics (1990) 28, 299-308,)よりマウスpgk-1遺伝子のプロモーターをEcoR I-Pst Iによって切り出し、pBluescript(ストラタジーン)のEcoR I-Pst IサイトにクローニングしてpBSK-pgk-1を作製した。HygrはpcDNA3.1/HygroよりHyg5-AVとHyg3-BHのプライマーでPCRすることによって、Hygrの5’側にEcoT22 IサイトとKozak配列を付加し、SV40 polyA付加シグナルまでの領域を含む3’側にはBamH Iサイトを付加してHygrを抜き出した。
フォワードプライマー
Hyg5-AV 5’- ATGCATGCCACCATGAAAAAGCCTGAACTCACC -3’(配列番号17)
リバースプライマー
Hyg3-BH 5’- GGATCCCAGGCTTTACACTTTATGCTTC -3’(配列番号18)
フコーストランスポーターのターゲッティングベクターver.2(以下、KO2ベクターと称する)はpMC1DT-Aベクターにフコーストランスポーターの5’側(配列番号16に示す塩基配列のNo.2,780のSma IからNo.4,232のBamH I)、3’側(No.4,284からNo.10,934のSacIまで)、及びpgk-1- Hygrフラグメントを各々挿入することで構築した。KO1ベクターと異なり、KO2ベクターはHygrにpgk-1遺伝子のプロモーターが付加されていることから、相同組み換えによって1コピーのみベクターが細胞に導入されても、ハイグロマイシンBに対する耐性を獲得する。なお、KO2ベクターはNot Iで切断して細胞に導入した。KO2ベクターによって、フコーストランスポーターは開始コドンを含むエクソン1の46塩基対を欠損することになり、機能を失うものと考えられる。
pPURベクター(BD Biosciences)をPst IとBamH Iで切断し、切り出されたフラグメント(Puror)をpBSK-pgk-1のPst I-BamH Iサイトに挿入し、pBSK-pgk-1-Purorを作製した。
フコーストランスポーターのターゲッティングベクターver.3(以下、KO3ベクターと称する)はpMC1DT-Aベクターにフコーストランスポーターの5’側(配列番号16に示す塩基配列のNo.2,780のSma IからNo.4,232のBamH I)、3’側(No.4,284からNo.10,934のSac Iまで)、及びpgk-1- Purorフラグメントを各々挿入することで構築した。なお、pgk-1-Purorの3’末端には、以下に示すスクリーニング用のプライマーが結合する配列を予め付加しておいた。なお、KO3ベクターはNot Iで切断して細胞に導入した。KO3ベクターによって、フコーストランスポーターは開始コドンを含むエクソン1の46塩基対を欠損することになり、機能を失うものと考えられる。
リバースプライマー
RSGR-A 5’- GCTGTCTGGAGTACTGTGCATCTGC -3’(配列番号19)
以上の3種類のターゲッティングベクターを用いて、フコーストランスポーター遺伝子のノックアウトを試みた。
CHO-S-SFMII HT- (インビトロジェン)にHT Supplement(100x)(インビトロジェン)とペニシリンストレプトマイシン(インビトロジェン)をCHO-S-SFMII HT-の容量に対して、それぞれ1/100 量を加えた。これを培養用の培地(以下、SFMII (+)と称する)としてCHO細胞のDXB11株を継代し、さらに遺伝子導入後の培養もこのSFMII(+)で行った。8 x 106個のCHO細胞を0.8 mlのダルベッコリン酸緩衝液(以下、PBSと略す。インビトロジェン)に懸濁した。細胞懸濁液に30μgのターゲッティングベクターを加え、Gene Pulser Cuvette(4 mm)(バイオラッド)に細胞懸濁液を移した。氷上で10分間放置した後に、GENE-PULSER II(バイオラッド)で1.5kV, 25μFDの条件で、エレクトロポレーション法によりベクターを細胞に導入した。ベクターを導入後、細胞を200 mlのSFMII(+)培地に懸濁して20枚の96穴平底プレート(イワキ)に100μl/ウェルで細胞を播きこんだ。プレートをCO2インキュベータ内で、24時間、37℃で培養した後、薬剤を添加した。
KO1ベクター、もしくはKO2ベクターをそれぞれCHO細胞に導入し、ベクター導入から24時間後にハイグロマイシンB (インビトロジェン)による選抜を行った。ハイグロマイシンBは0.3 mg/mlになるようにSFMII(+)に溶解し、100μl/ウェル添加した。
(4−1)PCR用のサンプルの調整
相同組み換え体はPCR法によってスクリーニングした。スクリーニングで用いるCHO細胞は96穴平底プレートで培養し、培養上清除去後に細胞溶解用の緩衝液を50μl/ウェル加えて55℃、2時間加温し、続いて95℃、15分加熱することで、プロティナーゼ Kを失活させてPCRの鋳型とした。細胞溶解用の緩衝液は、1ウェルあたり10 X LA 緩衝液II(タカラLA Taqに添付)5μl、10% NP-40 (ロッシュ)2.5μl、プロティナーゼ K (20mg/ml、タカラ)4μl、及び蒸留水(ナカライテスク)38.5μlで構成されている。
PCR反応混合物は上記のPCRサンプル1μl、10 x LA緩衝液II 5μl、MgCl2 (25 mM) 5μl、dNTP(2.5 mM)5μl、プライマー(各10μM)2μl、LA Taq(5 IU/μl)0.5μl、及び蒸留水 29.5μl(全50μl)とした。KO1ベクターを導入した細胞のスクリーニングには、TP-F4とTHygro-R1、KO2ベクターを導入した細胞のスクリーニングには、TP-F4とTHygro-F1をPCRプライマーに用いた。
フォワードプライマー(KO1, KO2)
TP-F4 5’- GGAATGCAGCTTCCTCAAGGGACTCGC -3’(配列番号20)
リバースプライマー(KO1)
THygro-R1 5’- TGCATCAGGTCGGAGACGCTGTCGAAC -3’(配列番号21)
リバースプライマー(KO2)
THygro-F1 5’- GCACTCGTCCGAGGGCAAAGGAATAGC -3’(配列番号22)
KO1ベクターを導入した細胞は918個を解析し、そのうち相同組み換え体と考えられる細胞は1個であった(相同組み換え効率は約0.1%)。また、KO2ベクターを導入した細胞は537個を解析し、そのうち相同組み換え体と考えられる細胞は17個であった(相同組み換え効率は約3.2%)。
さらに、サザンブロット法によっても確認を行った。培養した細胞から定法に従ってゲノムDNAを10μg調整し、サザンブロットを行った。配列番号16に示す塩基配列のNo.2,113-No.2,500 の領域から、以下の二種類のプライマーを用いてPCR法により387 bpのプローブを調整し、これをサザンブロット法による確認に用いた。ゲノムDNAはBgl IIで切断した。
フォワードプライマー
Bgl-F:5’- TGTGCTGGGAATTGAACCCAGGAC -3’(配列番号23)
リバースプライマー
Bgl-R:5’- CTACTTGTCTGTGCTTTCTTCC -3’(配列番号24)
KO1ベクター、及びKO2ベクターによって相同組み換えが成功した細胞に対し、3種類のベクターを用いて、フコーストランスポーター遺伝子が完全に欠損した細胞株の樹立を試みた。ベクターと細胞の組み合わせは、以下の通りである。方法1:KO2ベクターと5C1細胞(KO1)、方法2:KO2ベクターと6E2細胞(KO2)、方法3:KO3ベクターと6E2細胞(KO2)。ベクターをそれぞれの細胞に導入し、ベクター導入から24時間後にハイグロマイシンB、ピューロマイシン(ナカライテスク)による選抜を開始した。ハイグロマイシンBは方法1では最終濃度が1 mg/ml、方法2では最終濃度が7 mg/mlになるようにした。さらに方法3では、ハイグロマイシンBの最終濃度が0.15 mg/ml、ピューロマイシンの最終濃度が8μg/mlになるように添加した。
サンプルの調製は前述の通り。方法1に関するスクリーニングは、前述のKO1ベクター、及びKO2ベクターで相同組み換えを起こした細胞を検出するPCRを両方行った。方法2に関しては、下記のPCRプライマーを設計した。配列番号16に示す塩基配列のNo.3,924-3,950の領域にTPS-F1を、No.4,248-4,274にSHygro-R1を設定した。このPCRプライマーによって、KO2ベクターにより欠損するフコーストランスポーターの遺伝子領域の350 bpが増幅される。従って、方法2におけるPCRスクリーニングにおいては、350 bpが増幅されないものを、フコーストランスポーター遺伝子が完全に欠損した細胞とみなすことにした。PCRの条件は、95℃にて1分間の前加熱、95℃にて30秒間、70℃にて1分間の増幅サイクル35サイクル、並びに70℃にて7分の複加熱とした。
フォワードプライマー
TPS-F1:5’- CTCGACTCGTCCCTATTAGGCAACAGC -3’(配列番号25)
リバースプライマー
SHygro-R1:5’- TCAGAGGCAGTGGAGCCTCCAGTCAGC -3’(配列番号26)
方法1では616個を解析し、そのうち相同組換体と考えられる細胞は18個であった(相同組換効率は2.9%)。方法2では524個を解析し、そのうち相同組換体と考えられる細胞は2個であった(相同組換効率は約0.4%)。さらに、方法3では382個を解析し、そのうち相同組換体と考えられる細胞は7個であった(相同組換効率は約1.8%)。
前述の方法に準じて解析を行った。その結果、解析できた細胞のうち、フコーストランスポーターの遺伝子が完全に欠損している細胞を1つ見出した。第一段階のノックアウトでは、PCRとサザンブロットの解析結果が一致したが、この第二段階のノックアウトでは、一致しなかった。
さらに、PCRで相同組み換え体と判断された26の細胞におけるフコースの発現を解析した。5μg/mlのLens culinaris Agglutinin, FITC Conjugate(ベクターラボラトリー)、2.5% のFBS、0.02%のアジ化ナトリウムを含むPBS(以下、FACS溶解液と称する)100μlで1×106個の細胞を氷冷中で1時間染色した。その後、FACS溶解液で細胞を3回洗浄してFACSCalibur(ベクトンディッキンソン)で測定を行った。その結果、サザンブロット解析でフコーストランスポーターの遺伝子が完全に欠損していると判断された細胞であるFTP-KO株のみ、フコースの発現が低下していることが明らかになった。
SFMII (+)培地にハイグロマイシンBの最終濃度が1 mg/mlになるように調製し、実施例1で得られたフコーストランスポーター欠損株(FTP-KO細胞、クローン名 3F2)を継代した。8 x 106個の3F2を0.8 mlのダルベッコリン酸緩衝液に懸濁した。細胞懸濁液に25μgのヒト化グリピカン3抗体発現ベクターを加え、Gene Pulser Cuvetteに細胞懸濁液を移した。氷上で10分間放置した後に、GENE-PULSER IIで1.5 kV, 25μFDの条件で、エレクトロポレーション法によりベクターを細胞に導入した。ベクターを導入後、細胞をSFMII(+)培地40 mlに懸濁して96穴平底プレート(イワキ社)に100μl/ウェルで細胞を播きこんだ。プレートをCO2インキュベータ内で、24時間、37℃で培養した後、Geneticin(インビトロジェン)を終濃度0.5 mg/mlになるように添加した。薬剤に耐性になった細胞の抗体産生量を測定し、ヒト化グリピカン3抗体産生細胞株をそれぞれ樹立した。
(1)2-アミノベンズアミド標識糖鎖(2-AB化糖鎖)の調製
本発明のFTP-KO細胞産生抗体、及び対照試料としてCHO細胞産生抗体に、N-Glycosidase F(Roche diagnostics)を作用させることによって、抗体に結合する糖鎖がタンパク質から遊離された(Weitzhandler M. et al., Journal of Pharmaceutical Sciences (1994) 83(12),,1670-5)。エタノールを用いた除タンパク質操作の後(Schenk B. et al., The Journal of Clinical Investigation (2001), 108(11), 1687-95)、遊離糖鎖が濃縮乾固され、次いで2-アミノピリジンによって蛍光標識が施された(Bigge J. C. et al., Analytical Biochemistry (1995) 230(2), 229-238)。得られた2-AB化糖鎖が、セルロースカートリッジを用いた固相抽出により脱試薬された後遠心分離により濃縮され、精製2-AB化糖鎖として以後の解析に供された。次に、β-Galactosidase(生化学工業)を精製2-AB化糖鎖に作用させることによって、アガラクトシル2-AB化糖鎖が調製された。
前項の方法で、本発明のFTP-KO細胞産生抗体、及び対照試料としてCHO細胞産生抗体から遊離された糖鎖を出発材料として調製されたアガラクトシル2-AB化糖鎖は、アミドカラムTSKgel Amide-80(東ソー)による順相HPLCによって分析され、そのクロマトグラムが比較された。CHO細胞産生抗体においてはG(0)がその糖鎖の主成分として存在しており、フコースの付加されていないG(0)-Fucはピーク面積比からの算出に基づき全糖鎖中4%程度存在すると見積もられた。一方,FTP-KO細胞産生抗体においては、G(0)-Fucが主成分であり、いずれの産生株から産生された抗体においてもピーク面積比からの算出に基づけば全糖鎖中の90%以上がフコースの付加されていない糖鎖として存在していた。
実施例1で記載された方法で作製されたH0L0抗体の改変抗体であるHspu2.2Lspu2.2(Hu2.2Lu2.2)抗体とHspd1.8Lspd1.6(Hd1.8Ld1.6)抗体、またはその改変に供したH0L0抗体をコードする遺伝子が発現ベクターにクローン化された。クローン化に際しては、抗体を構成するH鎖およびL鎖をコードする各遺伝子が発現されるように、H鎖およびL鎖をコードする各遺伝子がそれぞれ別の発現ベクターに挿入された。前記のようにH鎖およびL鎖をコードする各遺伝子が所望の組合せとなるように選択された二種類の発現ベクターがPvuIにて切断された後に、参考実施例2で作製されたFTP-KO株中へエレクトロポレーションを用いて導入された。
(1)in vivoモデルへの移植に供する細胞株の維持
Hep G2細胞(ATCC)が用いられた。Hep G2細胞は10%FBS、1 mmol/l MEM Sodium Pyruvate(Invitrogen)、1 mmol/l MEM Non-Essential Amino Acid(Invitrogen)を含むMinimun Essential Medium Eagle培地(SIGMA)(以下、継代用培地という。)中で継代されて維持された。
Hep G2細胞の細胞懸濁液が継代用培地とMATRIGEL Matrix(BD Bioscience)を1:1で含む溶液を用いて5x107細胞/mlになるように調製された。細胞の移植前日に、あらかじめ抗アシアロGM1抗体(和光純薬、1バイアル中の内容物が5 mlの当該溶液によって溶解された。)100μlが腹腔内へ投与されたSCIDマウス(オス、5週齢)(日本クレア)の腹部皮下へ当該細胞懸濁液100μl(5x106細胞/マウス)が移植された。腫瘍体積は、
式:腫瘍体積=長径×短径×短径/2
を用いて算出され、腫瘍体積の平均が130-330 mm3になった時点でモデルが成立したものと判断された。
H0L0抗体、Hu2.2Lu2.2抗体、Hd1.8Ld1.6抗体の各抗体を含む投与試料が、その投与当日に生理食塩水を用いて、0.5 mg/ml(5 mg/kg投与群)または0.1 mg/ml(1 mg/kg投与群)となるように調製された。
(2)で作製されたマウスモデルに対するHep G2細胞の移植後27日から週に1回ずつ、3週間の期間で、上記(3)で調製された投与試料が10 ml/kgの投与量で尾静脈より投与された。陰性対照として、生理食塩水を同様に週に1回ずつ、3週間の期間で、10 ml/kgの投与量で尾静脈より投与された。いずれの群も、5匹を1群として、各群に対して各被験抗体を含む投与試料の投与が実施された。投与とほぼ同時に、各群のうち3匹の個体から、各抗体のマウス血漿中濃度を測定するために使用する被験物質として、その静脈血が採取された。具体的には、初回投与後0.5時間、二回目投与直前の二つのタイムポイントにおいて背中足静脈より採血が行われた。20μl容量の採血がヘパリン処理によって行われ、遠心分離によって血漿が調製された。
ヒト肝癌移植マウスモデルにおける各被験抗体の抗腫瘍効果が、投与試料の投与の最終日から一週間後の腫瘍体積を測定することによって評価された。その結果、図7に示すとおり、Hspd1.8Lspd1.6(Hd1.8Ld1.6)抗体で薬効が強くなる傾向があり、Hspu2.2Lspu2.2(Hu2.2Lu2.2)抗体で薬効が弱くなる傾向があった。
マウス血漿中の被験抗体の濃度が実施例1に記載されたELISA法に準じた方法によって測定された。血漿中濃度として12.8、6.4、3.2、1.6、0.8、0.4、0.2μg/mlの検量線試料が調製された。検量線試料および所望の濃度になる様に適宜希釈されたマウス血漿被験試料がsoluble Glypican-3 core(中外製薬社製)を固相化したイムノプレート(Nunc−Immuno Plate, MaxiSoup(Nalge nunc International))に分注され、当該プレートが室温で1時間静置された。その後、Goat Anti-Human IgG-BIOT(Southern Biotechnology Associates)およびStreptavidin-alkaline phosphatase conjugate(Roche Diagnostics)が順次分注され、BluePhos Microwell Phosphatase Substrates System(Kirkegaard & Perry Laboratories)を基質として用いた発色反応が行われた。各ウエル中の反応液の呈色がマイクロプレートリーダーを用いて反応液の650nmの吸光度を測定することによって算出された。各検量線試料の吸光度から作成された検量線に基づいて、解析ソフトウェアSOFTmax PRO(Molecular Devices)を用いてマウス血漿中の抗体濃度が算出された。
ヒト末梢血単核球(以下、ヒトPBMCと指称する。)をエフェクター細胞として用いて各被験抗体のADCC活性が以下のように測定された。
1000単位/mlのヘパリン溶液(ノボ・ヘパリン注5千単位,ノボ・ノルディスク)が予め200μl注入された注射器を用い、中外製薬株式会社所属の健常人ボランティア(成人男性)より末梢血50 mlが採取された。PBS(-)を用いて2倍に希釈された当該末梢血が4等分され、15 mlのFicoll-Paque PLUSが予め注入されて遠心操作が行なわれたLeucosepリンパ球分離管(Greiner bio-one)に加えられた。当該末梢血が分注された分離管が2150 rpmの速度によって10分間室温にて遠心分離の操作がされた後、単核球画分層が分取された。10%FBSを含むDulbecco’s Modified Eagle’s Medium(SIGMA)(以下10%FBS/D-MEMと称する。)によって1回当該各分層に含まれる細胞が洗浄された後、当該細胞が10%FBS/D-MEM中にその細胞密度が5x106/mlとなるように懸濁された。当該細胞懸濁液がヒトPBMC溶液として以後の実験に供された。
Hep G2細胞がディッシュから剥離されて、1x104cells/ウエルとなるように96ウェルU底プレートに播種された。当該プレートは5%炭酸ガスインキュベータ中において37℃で一晩インキュベートされた。翌日、当該プレートの各ウェル中に5.55MBqのCr-51が加えられ、当該プレートは5%炭酸ガスインキュベータ中において37℃で3時間インキュベートされた。当該プレートの各ウエル中に存在するHep G2細胞が標的細胞として、以後のADCC活性の測定に際して用いられた。
ADCC活性はクロムリリース法による特異的クロム遊離率にて評価される。(2)で調製された標的細胞が培地で洗浄され、各濃度(0、0.004、0.04、0.4、4、40 μg/ml)に調製されたH0L0抗体, Hu2.2Lu2.2抗体, Hd1.8Ld1.6抗体の各抗体100μlがそれぞれ添加された。当該プレートは、室温にて15分間反応された後に抗体溶液が除去された。次に、各ウエル中に継代用培地が各100μl添加された当該プレートは、5%炭酸ガスインキュベータ中において37℃で1時間インキュベートされた。各ウエル中に(1)で調製されたヒトPBMC溶液各100μl(5x105 細胞/ウェル)が加えられた当該プレートは、5%炭酸ガスインキュベータ中において37℃で4時間静置された後に、遠心分離操作された。当該プレートの各ウエル中の100μlの培養上清の放射活性がガンマカウンターを用いて測定された。下式:
特異的クロム遊離率(%)=(A-C)×100/(B-C)
に基づいて特異的クロム遊離率が求められた。
各被験抗体を介してヒトPBMCが発揮するADCC活性が評価された結果、全ての被験抗体がADCC活性を有することが認められた。その結果が図9に示されている。各濃度での各被験抗体が示す特異的クロム遊離率に対して有意差検定が行われた結果、全ての抗体濃度において各被験抗体が示す特異的クロム遊離率の各被験抗体間での有意な差が認められなかった。統計解析にはSAS前臨床パッケージ(SAS Institute Inc.)を用いられた。以上の結果に基づき、そのpIが改変された各被験抗体のADCC活性の間には差がないことが示された。
(1)pI低下のための改変箇所の選定
Hd1.8Ld1.6抗体の腫瘍抑制効果をさらに向上するために、可変領域のpIの低下を可能とする改変箇所の検討が行われた。その結果、可変領域のpIの低下を可能とするアミノ酸残基が見出され、当該残基が表2(重鎖)及び表3(軽鎖)にまとめられている。それらの改変のうちpI低下の具体例として、pH7pL14抗体及びpH7pL16抗体が挙げられる。それぞれのpI改変抗体の作製は以下のように実施された。
実施例1に記載あるいは実施例1に準じた方法によりPhastGel IEF 4-6.5(GE Healthcase)を用いた泳動によりHd1.8Ld1.6抗体、pH7pL14抗体及びpH7pL16抗体のpI値が測定された。Hd1.8Ld1.6抗体、pH7pL14抗体及びpH7pL16抗体のpI値は、それぞれ、7.47、7.07及び6.52と測定され、pH7pL14抗体、pH7pL16抗体のpI値はHd1.8Ld1.6抗体のpI値よりそれぞれ0.4、0.95減少したことが示された。
Hd1.8Ld1.6抗体、pH7pL14抗体及びpH7pL16抗体から得られたFabのTm値が実施例1に記載の方法に準じて、VP-DSC(Micro Cal)を用いて測定された。この際、透析外液としてPBSが用いられた。また、DSC測定用試料溶液として抗体濃度が25-100μg/mlに調製された。20℃〜115℃にて約4K/分の走査速度となるよう設定されたDSC走査によって、リファレンス溶液(透析外液)およびDSC測定用試料溶液が測定された。Hd1.8Ld1.6抗体、pH7pL14抗体及びpH7pL16抗体のFab熱変性中間温度は、それぞれ77.5、78.0及び74.7℃と測定された。
実施例1に記載された方法を用いて、抗原であるグリピカン3に対する各点変異pI改変抗体の結合活性が測定された(図10)。pH7pH14抗体及びpH7pL16抗体のグリピカン3に対する結合活性はH0L0抗体のそれとほぼ同等であることが示された。
実施例8で作製された各点変異pI改変抗体をコードする遺伝子を含む発現ベクターを、参考実施例2で作製されたFTP-KO株にPolyethylenimine(Polysciences Inc.)を用いて発現ベクターを細胞内に取り込ませることによって、当該改変抗体が発現された。前記細胞の培養上清からrProtein A SepharoseTM Fast Flow(Amersham Biosciences)を用いて当該改変抗体が精製された。精製された抗体溶液は実施例5に記載の方法で、調製され、その抗体濃度が測定された。
(1)in vivoモデルへの移植に供する細胞株の維持
Hep G2細胞(ATCC)が用いられた。Hep G2細胞は10%FBS、1 mmol/l MEM Sodium Pyruvate(Invitrogen)、1 mmol/l MEM Non-Essential Amino Acid(Invitrogen)を含むMinimun Essential Medium Eagle培地(SIGMA)(以下、継代用培地という。)中で継代されて維持された。
Hep G2細胞の細胞懸濁液が継代用培地とMATRIGEL Matrix(BD Bioscience)を1:1で含む溶液を用いて5x107細胞/mlになるように調製された。細胞の移植前日に、あらかじめ抗アシアロGM1抗体(和光純薬、1バイアル中の内容物が5 mlの当該溶液によって溶解された。)100μlが腹腔内へ投与されたSCIDマウス(オス、5週齢)(日本クレア)の腹部皮下へ当該細胞懸濁液100μl(5x106細胞/マウス)が移植された。腫瘍体積は、
式:腫瘍体積=長径×短径×短径/2
を用いて算出され、腫瘍体積の平均が400 mm3になった時点でモデルが成立したものと判断された。
H0L0抗体、Hd1.8Ld1.6抗体、pH7pL14抗体、pH7pL16抗体の各抗体を含む投与試料が、その投与当日に生理食塩水を用いて、0.1 mg/ml(1 mg/kg投与群)となるように調製された。
(2)で作製されたマウスモデルに対するHep G2細胞の移植後34日から週に1回ずつ、5週間の期間で、上記(3)で調製された投与試料が10 ml/kgの投与量で尾静脈より投与された。陰性対照として、生理食塩水が同様に週に1回ずつ、5週間の期間で、10 ml/kgの投与量で尾静脈より投与された。いずれの群も、5匹を1群として、各群に対して各被験抗体を含む投与試料の投与が実施された。投与とほぼ同時に、各群のうち3匹の個体から、各抗体のマウス血漿中濃度を測定するために使用する被験物質として、その静脈血が採取された。具体的には、初回投与後0.5時間、三回目投与直前の二つのタイムポイントにおいて背中足静脈より採血が行われた。20μl容量の採血がヘパリン処理によって行われ、遠心分離によって血漿が調製された。
ヒト肝癌移植マウスモデルにおける各被験抗体の抗腫瘍効果が、投与試料の投与の最終日から一週間後の腫瘍体積を測定することによって評価された。その結果、図11に示すとおり、pH7pL14抗体及びpH7pL16抗体では、H0L0抗体、Hd1.8Ld1.6抗体よりも薬効が強くなる傾向が認められた。
(1)各被験抗体を含む投与試料の調製
H0L0抗体、Hd1.8Ld1.6抗体、pH7pL14抗体、pH7pL16抗体、pH7M85pL16抗体の各抗体を含む投与試料が、その投与当日に生理食塩水を用いて、0.5 mg/ml(5 mg/kg投与)となるように調製された。
C.B-17/Icr-scidマウスに、上記(1)で調製された投与試料が10 ml/kgの投与量で尾静脈より投与された。いずれの群も、3匹を1群として、各群に対して各被験抗体を含む投与試料の投与が実施された。各抗体のマウス血漿中濃度を測定するために使用する被験物質として、その静脈血が採取された。具体的には、初回投与後0.5時間、2時間、8時間、24時間、72時間、168時間の七つのタイムポイントにおいて背中足静脈より採血が行われた。20μl容量の採血がヘパリン処理によって行われ、遠心分離によって血漿が調製された。
マウス血漿中の被験抗体の濃度が実施例6に記載されたELISA法に準じた方法によって測定された。血漿中濃度として12.8、6.4、3.2、1.6、0.8、0.4、0.2μg/mlの検量線試料が調製された。検量線試料および所望の濃度になる様に適宜希釈されたマウス血漿被験試料がsoluble Glypican-3 core(中外製薬社製)を固相化したイムノプレート(Nunc−Immuno Plate, MaxiSoup(Nalge nunc International))に分注され、当該プレートが室温で1時間静置された。その後、Goat Anti-Human IgG-BIOT(Southern Biotechnology Associates)およびStreptavidin-alkaline phosphatase conjugate(Roche Diagnostics)が順次分注され、BluePhos Microwell Phosphatase Substrates System(Kirkegaard & Perry Laboratories)を基質として用いた発色反応が行われた。各ウエル中の反応液の呈色がマイクロプレートリーダーを用いて反応液の650nmの吸光度を測定することによって算出された。各検量線試料の吸光度から作成された検量線に基づいて、解析ソフトウェアSOFTmax PRO(Molecular Devices)を用いてマウス血漿中の抗体濃度が算出された。
ヒト末梢血単核球(以下、ヒトPBMCと指称する。)をエフェクター細胞として用いて各被験抗体のADCC活性が以下のように測定された。
(1)ヒトPBMC溶液の調製
1000単位/mlのヘパリン溶液(ノボ・ヘパリン注5千単位,ノボ・ノルディスク)が予め200μl注入された注射器を用い、中外製薬株式会社所属の健常人ボランティア(成人男性)より末梢血50 mlが採取された。PBS(-)を用いて2倍に希釈された当該末梢血が4等分され、15 mlのFicoll-Paque PLUSが予め注入されて遠心操作が行なわれたLeucosepリンパ球分離管(Greiner bio-one)に加えられた。当該末梢血が分注された分離管が2150 rpmの速度によって10分間室温にて遠心分離の操作がされた後、単核球画分層が分取された。10%FBSを含むDulbecco’s Modified Eagle’s Medium(SIGMA)(以下10%FBS/D-MEMと称する。)によって1回当該各分層に含まれる細胞が洗浄された後、当該細胞が10%FBS/D-MEM中にその細胞密度が5x106 細胞/ mlとなるように懸濁された。当該細胞懸濁液がヒトPBMC溶液として以後の実験に供された。
Hep G2細胞がディッシュから剥離されて、1x104cells/ウエルとなるように96ウェルU底プレートに播種された。当該プレートは5%炭酸ガスインキュベータ中において37℃で一晩インキュベートされた。翌日、当該プレートの各ウェル中に5.55MBqのCr-51が加えられ、当該プレートは5%炭酸ガスインキュベータ中において37℃で3時間インキュベートされた。当該プレートの各ウエル中に存在するHep G2細胞が標的細胞として、以後のADCC活性の測定に際して用いられた。
ADCC活性はクロムリリース法による特異的クロム遊離率にて評価される。(2)で調製された標的細胞が培地で洗浄され、各濃度(0、0.004、0.04、0.4、4、40 μg/ml)に調製されたH0L0抗体、Hd1.8Ld1.6抗体、pH7pL14抗体、pH7pL16抗体の各抗体100μlがそれぞれ添加された。当該プレートは、室温にて15分間反応された後に抗体溶液が除去された。次に、各ウエル中に継代用培地が各100μl添加された当該プレートは、5%炭酸ガスインキュベータ中において37℃で1時間インキュベートされた。各ウエル中に(1)で調製されたヒトPBMC溶液各100μl(5x105 細胞/ウェル)が加えられた当該プレートは、5%炭酸ガスインキュベータ中において37℃で4時間静置された後に、遠心分離操作された。当該プレートの各ウエル中の100μlの培養上清の放射活性がガンマカウンターを用いて測定された。下式:
特異的クロム遊離率(%)=(A-C)×100/(B-C)
に基づいて特異的クロム遊離率が求められた。
上式において、Aは各ウェル中の100μlの培養上清の放射活性(cpm)の平均値を表す。また、Bは標的細胞に100μlの2% NP-40水溶液(Nonidet P-40、ナカライテスク)および50μlの10% FBS/D-MEM培地を添加したウェル中の100μlの培養上清の放射活性(cpm)の平均値を表す。さらに、Cは標的細胞に10% FBS/D-MEM培地を150 μl添加したウェル中の100μlの培養上清の放射活性(cpm)の平均値を表す。試験はtriplicateにて実施され、各被験抗体のADCC活性が反映される前記試験における特異的クロム遊離率(%)の平均値および標準偏差が算出された。
各被験抗体を介してヒトPBMCが発揮するADCC活性が評価された結果、全ての被験抗体がADCC活性を有することが認められた。その結果が図13に示されている。各濃度での各被験抗体が示す特異的クロム遊離率に対して有意差検定が行われた結果、全ての抗体濃度において各被験抗体が示す特異的クロム遊離率は対照群のH0L0抗体と比較して有意な差が認められなかった。統計解析にはSAS前臨床パッケージ(SAS Institute Inc.)を用いられた。以上の結果に基づき、そのpIが改変された各被験抗体のADCC活性には差がないことが示された。
(1)定常領域のpI値低下のための改変箇所の選定
配列番号31に記載のアミノ酸配列を有するIgG1定常領域において、EUナンバリングに基づく446番目のGlyおよび447番目のLysが欠損したIgG1定常領域をIgG1ΔGK(配列番号32)が提供される。これらのアミノ酸を両方欠損させることにより、初めて抗体の重鎖定常末端に由来するヘテロジェニティーを低減することが可能である。
H0L0抗体、H0M85L0抗体、pH7pL16抗体、pH7M85pL16抗体のpI値が実施例1に準じた方法により、PhastGel IEF 4-6.5(GE Healthcase)を用いて実施例1と同等の泳動条件により測定された。H0L0抗体、H0M85L0抗体、pH7pL16抗体及びpH7M85pL16抗体のpI値はそれぞれ、8.85、8.16、6.52及び5.78と測定された。定常領域の改変が、抗体の免疫原性に影響することなく、更なるそのpI値の低下に寄与することが明らかとなった。
各定常領域pI改変抗体の抗原に対する結合活性が実施例1に記載された方法により測定された(図14)。H0L0抗体、H0M85L0抗体、pH7pL16抗体、pH7M85pL16抗体のグリピカン3に対する結合活性はほぼ同等であることが示された。
実施例12に記載された方法に準じた方法によって、pH7pL16抗体とpH7M85pL16抗体によるADCC活性が測定された。その結果が図15に示されている。各濃度における各被験抗体が示す特異的クロム遊離率に対して有意差検定が行われた結果、全ての抗体濃度において各被験抗体が示す特異的クロム遊離率の被験抗体間での有意な差は認められなかった。統計解析にはSAS前臨床パッケージ(SAS Institute Inc.)を用いられた。以上の結果に基づき、pH7pL16抗体とその定常領域が改変されたpH7M85pL16抗体のADCC活性には差がないことが示された。
Claims (8)
- 変更前のアミノ酸配列を有するIgG抗体と比較して生体内における抗腫瘍効果が増強されたIgG抗体の製造方法であって;
(a)IgG抗体をコードする核酸を保持する宿主細胞を、当該核酸が発現する条件下で培養し、ここで、当該IgG抗体は、細胞傷害活性を有するIgG抗体のFR中のIgG抗体表面に露出され得る少なくとも一つのアミノ酸残基の電荷が改変されることにより当該IgG抗体の等電点が低下するように変更されたアミノ酸配列を有しており、そして
(b)当該宿主細胞の培養物からIgG抗体を回収する、
の各段階を含む方法。 - アミノ酸残基の電荷の改変が、当該アミノ酸残基と異なる電荷を有するアミノ酸残基への置換であることを特徴とする請求項1に記載の方法。
- 前記IgG抗体がヒト以外の動物由来の相補性決定領域(CDR)、ヒト由来のフレームワーク領域(FR)およびヒト定常領域を含むIgG抗体である、請求項1または2に記載の方法。
- 変更前のアミノ酸配列を有するIgG抗体と比較して生体内における抗腫瘍効果が増強されたIgG抗体の製造方法であって;
(a)IgG抗体をコードする核酸を保持する宿主細胞を、当該核酸が発現する条件下で培養し、ここで、当該IgG抗体は、細胞傷害活性を有するIgG抗体のCDR中のIgG抗体表面に露出され得る少なくとも一つのアミノ酸残基の電荷が改変されることにより当該IgG抗体の等電点が低下するように変更されたアミノ酸配列を有しており、そして
(b)当該宿主細胞の培養物からIgG抗体を回収する、
の各段階を含む方法であり;
当該CDR中のIgG抗体表面に露出され得る少なくとも一つのアミノ酸残基が、重鎖可変領域におけるKabatナンバリングによる62位、64位および65位のアミノ酸残基若しくは軽鎖可変領域におけるKabatナンバリングによる24位および27位のアミノ酸残基から選ばれる、方法。 - アミノ酸残基の電荷の改変が、当該アミノ酸残基と異なる電荷を有するアミノ酸残基への置換であることを特徴とする請求項4に記載の方法。
- 前記IgG抗体がヒト以外の動物由来の相補性決定領域(CDR)、ヒト由来のフレームワーク領域(FR)およびヒト定常領域を含むIgG抗体である、請求項4または5に記載の方法。
- 前記アミノ酸残基の電荷の改変が、
(1)配列番号1で表される重鎖可変領域のうち以下のいずれか一つ又はそれ以上の置換;
(a)63番目のアミノ酸残基であるKのSへの置換、
(b)65番目のアミノ酸残基であるKのQへの置換、
(c)66番目のアミノ酸残基であるGのDへの置換、
および/又は、
(2)配列番号7で表される軽鎖可変領域のうち以下のいずれか一つ又はそれ以上の置換;
(d)24番目のアミノ酸残基であるRのQへの置換、
(e)27番目のアミノ酸残基であるQのEへの置換、
であることを特徴とする請求項4から6のいずれかに記載の方法。 - 前記IgG抗体が、前記IgG抗体のFc領域に結合したフコース含量が低下したIgG抗体である請求項1から7のいずれかに記載の方法。
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