CN107771182A - 人源化抗埃博拉病毒糖蛋白抗体和使用方法 - Google Patents

人源化抗埃博拉病毒糖蛋白抗体和使用方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及抗埃博拉病毒包膜糖蛋白抗体。本发明还涉及利用抗埃博拉病毒糖蛋白抗体的诊断方法以及在治疗和预防上使用这些抗体的药物组合物。

Description

人源化抗埃博拉病毒糖蛋白抗体和使用方法
相关申请的交互引用
本申请要求2015年5月29日提交的临时美国申请号62/168,096的权益，其全部内容通过引用并入本文作为参考。
序列表
本申请包含已经以ASCII格式电子提交的序列表，并通过引用整体并入本文。所述ASCII副本于2016年5月19日创建，名称为P32854-WO_SL.txt，且大小为198,746字节。
发明领域
本发明涉及抗病毒包膜糖蛋白抗体，特别地涉及抗埃博拉病毒包膜糖蛋白(GP)抗体及使用所述抗体的方法。
发明背景
埃博拉病毒(EBOV)是引起埃博拉病毒病(EVD)的传染物。埃博拉病毒属于丝状病毒科(Filoviridae)埃博拉病毒属。埃博拉病毒在人类和非人灵长类动物中引起严重的出血热。存在于病毒表面的唯一蛋白质是埃博拉病毒包膜糖蛋白(GP)。
目前，没有针对埃博拉病毒的被许可疫苗或治疗。在过去十年中，几种实验策略在感染后治疗EBOV攻击的非人灵长类动物已经显示出有前景(参见例如Qui等人(2014)Nature 514：47-53)。到目前为止，只有基于抗体的治疗方法已经在非人灵长类动物中显示出EBOV暴露后超过24小时时施用的实质性益处。示例性抗体包括：MB-003(由人或人-小鼠嵌合单克隆抗体c13C6、h13F6和c6D8组成；参见例如Zeitlin等人(2011)PNAS 108：20690-20694)；ZMab(由鼠单克隆抗体m1H3、m2G4和m4G7组成；参见例如Murin等人(2014)PNAS111:17182-17187；Audet等人(2014)Science Reports 4：6881，第1-7页)；和ZMapp(由嵌合的单克隆抗体c13C6、c2G4和c4G7组成；参见例如美国专利号7,335,356；美国专利号8,513,381；Geisbert(2014)Nature 514：41-43；Zhang等(2014)Science China 57:987-988)。
当EBOV攻击后达5天启动治疗时，ZMapp拯救了100％的恒河猴。如肝脏酶升高、粘膜出血和全身性瘀斑所指示的疾病晚期被逆转，导致受感染动物全面恢复。
尽管这些令人鼓舞的结果显示了在非人灵长类动物上的功效，ZMapp的人类临床开发受到限制，因为目前ZMapp的各种不利因素限制了获得足够的、可靠的和可制造量的ZMapp中所含的三种单克隆抗体中每一种抗体的能力用于该治疗的临床开发。特别地，产生足够量的ZMapp混合物中所含的三种单克隆抗体中的每一种抗体受到了限制，部分原因是由于其目前在烟草中制备。另外，ZMapp中包含的三种单克隆抗体是嵌合的。因此，需要以足够和可靠的量提供抗EBOV单克隆抗体。本发明部分地通过提供多种人源化抗埃博拉病毒包膜糖蛋白单克隆抗体解决了这一需求。
概述
本发明提供了抗埃博拉病毒包膜糖蛋白抗体及使用所述抗体的方法。
在一些实施方案中，本发明提供了结合埃博拉病毒糖蛋白的分离的人源化抗体。在一些实施方案中，本发明的抗埃博拉病毒包膜糖蛋白抗体结合至包含SEQ ID NO:91的氨基酸序列的表位。在一些实施方案中，本发明的抗埃博拉病毒包膜糖蛋白抗体结合至包含SEQ ID NO:92的氨基酸序列的表位。
在一些实施方案中，本发明提供了抗埃博拉病毒包膜糖蛋白抗体，其中所述抗体含有(a)包含SEQ ID NO:22的氨基酸序列的HVR-H1；(b)包含SEQ ID NO:23的氨基酸序列的HVR-H2；和(c)包含SEQ ID NO:24的氨基酸序列的HVR-H3。
在一些实施方案中，本发明提供了抗埃博拉病毒包膜糖蛋白抗体，其中所述抗体含有(a)包含SEQ ID NO:9的氨基酸序列的HVR-L1；(b)包含SEQ ID NO:10的氨基酸序列的HVR-L2；和(c)包含SEQ ID NO:11的氨基酸序列的HVR-L3。
在一些实施方案中，本发明提供了抗埃博拉病毒包膜糖蛋白抗体，其中所述抗体含有(a)包含SEQ ID NO:22的氨基酸序列的HVR-H1；(b)包含SEQ ID NO:23的氨基酸序列的HVR-H2；(c)包含SEQ ID NO:24的氨基酸序列的HVR-H3；(d)包含SEQ ID NO:9的氨基酸序列的HVR-L1；(e)包含SEQ ID NO:10的氨基酸序列的HVR-L2；和(f)包含SEQ ID NO:11的氨基酸序列的HVR-L3。
在一些实施方案中，本发明提供了抗埃博拉病毒包膜糖蛋白抗体，其中所述抗体包含重链可变区，其中所述重链可变区包含选自SEQ ID NO:14、16、18和20的氨基酸序列。
在一些实施方案中，本发明提供了抗埃博拉病毒包膜糖蛋白抗体，其中所述抗体包含轻链可变区，其中所述轻链可变区包含选自SEQ ID NO:3、5和7的氨基酸序列。
在一些实施方案中，本发明提供了抗埃博拉病毒包膜糖蛋白抗体，其中所述抗体包含重链可变区和轻链可变区，其中所述重链可变区包含选自SEQ ID NO:14、16、18和20的氨基酸序列，以及其中所述轻链可变区包含选自SEQ ID NO:3、5和7的氨基酸序列。
在一些实施方案中，本发明提供了抗埃博拉病毒包膜糖蛋白抗体，其中所述抗体包含重链，其中所述重链包含选自SEQ ID NO:15、17、19和21的氨基酸序列。
在一些实施方案中，本发明提供了抗埃博拉病毒包膜糖蛋白抗体，其中所述抗体包含轻链，其中所述轻链包含选自SEQ ID NO:4、6和8的氨基酸序列。
在一些实施方案中，本发明提供了抗埃博拉病毒包膜糖蛋白抗体，其中所述抗体包含重链和轻链，其中所述重链包含选自SEQ ID NO:15、17、19和21的氨基酸序列，并且其中所述轻链包含选自SEQ ID NO:4、6和8的氨基酸序列。
在一些实施方案中，本发明提供了抗埃博拉病毒包膜糖蛋白抗体，其中所述抗体含有包含SEQ ID NO:14的氨基酸序列的重链可变区和包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列的轻链可变区；其中所述抗体含有包含SEQ ID NO:16的氨基酸序列的重链可变区和包含SEQ IDNO:3的氨基酸序列的轻链可变区；其中所述抗体含有包含SEQ ID NO:18的氨基酸序列的重链可变区和包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列的轻链可变区；其中所述抗体含有包含SEQ IDNO:20的氨基酸序列的重链可变区和包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列的轻链可变区；其中所述抗体含有包含SEQ ID NO:14的氨基酸序列的重链可变区和包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列的轻链可变区；其中所述抗体含有包含SEQ ID NO:16的氨基酸序列的重链可变区和包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列的轻链可变区；其中所述抗体含有包含SEQ ID NO:18的氨基酸序列的重链可变区和包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列的轻链可变区；其中所述抗体含有包含SEQ ID NO:20的氨基酸序列的重链可变区和包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列的轻链可变区；其中所述抗体含有包含SEQ ID NO:14的氨基酸序列的重链可变区和包含SEQ ID NO:7的氨基酸序列的轻链可变区；其中所述抗体含有包含SEQ ID NO:16的氨基酸序列的重链可变区和包含SEQ ID NO:7的氨基酸序列的轻链可变区；其中所述抗体含有包含SEQ ID NO:18的氨基酸序列的重链可变区和包含SEQ ID NO:7的氨基酸序列的轻链可变区；其中所述抗体含有包含SEQ ID NO:20的氨基酸序列的重链可变区和包含SEQ ID NO:7的氨基酸序列的轻链可变区。
在一些实施方案中，本发明提供了抗埃博拉病毒包膜糖蛋白抗体，其中所述抗体含有包含SEQ ID NO:15的氨基酸序列的重链和包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列的轻链；其中所述抗体含有包含SEQ ID NO:17的氨基酸序列的重链和包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列的轻链；其中所述抗体含有包含SEQ ID NO:19的氨基酸序列的重链和包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列的轻链；其中所述抗体含有包含SEQ ID NO:21的氨基酸序列的重链和包含SEQID NO:4的氨基酸序列的轻链；其中所述抗体含有包含SEQ ID NO:15的氨基酸序列的重链和包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列的轻链；其中所述抗体含有包含SEQ ID NO:17的氨基酸序列的重链和包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列的轻链；其中所述抗体含有包含SEQ ID NO:19的氨基酸序列的重链和包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列的轻链；其中所述抗体含有包含SEQ ID NO:21的氨基酸序列的重链和包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列的轻链；其中所述抗体含有包含SEQ ID NO:15的氨基酸序列的重链和包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列的轻链；其中所述抗体含有包含SEQ ID NO:17的氨基酸序列的重链和包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列的轻链；其中所述抗体含有包含SEQ ID NO:19的氨基酸序列的重链和包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列的轻链；其中所述抗体含有包含SEQ ID NO:21的氨基酸序列的重链和包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列的轻链。
在一些实施方案中，本发明提供了抗埃博拉病毒包膜糖蛋白抗体，其中所述抗体含有(a)包含SEQ ID NO:50的氨基酸序列的HVR-H1；(b)包含SEQ ID NO:51的氨基酸序列的HVR-H2；和(c)包含SEQ ID NO:52的氨基酸序列的HVR-H3。
在一些实施方案中，本发明提供了抗埃博拉病毒包膜糖蛋白抗体，其中所述抗体含有(a)包含SEQ ID NO:37的氨基酸序列的HVR-L1；(b)包含SEQ ID NO:38的氨基酸序列的HVR-L2；和(c)包含SEQ ID NO:39的氨基酸序列的HVR-L3。
在一些实施方案中，本发明提供了抗埃博拉病毒包膜糖蛋白抗体，其中所述抗体含有(a)包含SEQ ID NO:50的氨基酸序列的HVR-H1；(b)包含SEQ ID NO:51的氨基酸序列的HVR-H2；(c)包含SEQ ID NO:52的氨基酸序列的HVR-H3；(d)包含SEQ ID NO:37的氨基酸序列的HVR-L1；(e)包含SEQ ID NO:38的氨基酸序列的HVR-L2；和(f)包含SEQ ID NO:39的氨基酸序列的HVR-L3。
在一些实施方案中，本发明提供了抗埃博拉病毒包膜糖蛋白抗体，其中所述抗体包含重链可变区，其中所述重链可变区包含选自SEQ ID NO:42、44、46和48的氨基酸序列。
在一些实施方案中，本发明提供了抗埃博拉病毒包膜糖蛋白抗体，其中所述抗体包含轻链可变区，其中所述轻链可变区包含选自SEQ ID NO:27、29、31、33和35的氨基酸序列。
在一些实施方案中，本发明提供了抗埃博拉病毒包膜糖蛋白抗体，其中所述抗体包含重链可变区和轻链可变区，其中所述重链可变区包含选自SEQ ID NO:42、44、46和48的氨基酸序列，以及其中轻链可变区包含选自SEQ ID NO:27、29、31、33和35的氨基酸序列。
在一些实施方案中，本发明提供了抗埃博拉病毒包膜糖蛋白抗体，其中所述抗体包含重链，其中所述重链包含选自SEQ ID NO:43、45、47和49的氨基酸序列。
在一些实施方案中，本发明提供了抗埃博拉病毒包膜糖蛋白抗体，其中所述抗体包含轻链，其中所述轻链包含选自SEQ ID NO:28、30、32、34和36的氨基酸序列。
在一些实施方案中，本发明提供了抗埃博拉病毒包膜糖蛋白抗体，其中所述抗体包含重链和轻链，其中所述重链包含选自SEQ ID NO:43、45、47和49的氨基酸序列，并且其中所述轻链包含选自SEQ ID NO:28、30、32、34和36的氨基酸序列。
在一些实施方案中，本发明提供了抗埃博拉病毒包膜糖蛋白抗体，其中所述抗体含有包含SEQ ID NO:42的氨基酸序列的重链可变区和包含SEQ ID NO:27的氨基酸序列的轻链可变区；其中所述抗体含有包含SEQ ID NO:44的氨基酸序列的重链可变区和包含SEQID NO:27的氨基酸序列的轻链可变区；其中所述抗体含有包含SEQ ID NO:46的氨基酸序列的重链可变区和包含SEQ ID NO:27的氨基酸序列的轻链可变区；其中所述抗体含有包含SEQ ID NO:48的氨基酸序列的重链可变区和包含SEQ ID NO:27的氨基酸序列的轻链可变区；其中所述抗体含有包含SEQ ID NO:42的氨基酸序列的重链可变区和包含SEQ ID NO:29的氨基酸序列的轻链可变区；其中所述抗体含有包含SEQ ID NO:44的氨基酸序列的重链可变区和包含SEQ ID NO:29的氨基酸序列的轻链可变区；其中所述抗体含有包含SEQ ID NO:46的氨基酸序列的重链可变区和包含SEQ ID NO:29的氨基酸序列的轻链可变区；其中所述抗体含有包含SEQ ID NO:48的氨基酸序列的重链可变区和包含SEQ ID NO:29的氨基酸序列的轻链可变区；其中所述抗体含有包含SEQ ID NO:42的氨基酸序列的重链可变区和包含SEQ ID NO:31的氨基酸序列的轻链可变区；其中所述抗体含有包含SEQ ID NO:44的氨基酸序列的重链可变区和包含SEQ ID NO:31的氨基酸序列的轻链可变区；其中所述抗体含有包含SEQ ID NO:46的氨基酸序列的重链可变区和包含SEQ ID NO:31的氨基酸序列的轻链可变区；其中所述抗体含有包含SEQ ID NO:48的氨基酸序列的重链可变区和包含SEQ ID NO:31的氨基酸序列的轻链可变区；其中所述抗体含有包含SEQ ID NO:42的氨基酸序列的重链可变区和包含SEQ ID NO:33的氨基酸序列的轻链可变区；其中所述抗体含有包含SEQ IDNO:44的氨基酸序列的重链可变区和包含SEQ ID NO:33的氨基酸序列的轻链可变区；其中所述抗体含有包含SEQ ID NO:46的氨基酸序列的重链可变区和包含SEQ ID NO:33的氨基酸序列的轻链可变区；其中所述抗体含有包含SEQ ID NO:48的氨基酸序列的重链可变区和包含SEQ ID NO:33的氨基酸序列的轻链可变区；其中所述抗体含有包含SEQ ID NO:42的氨基酸序列的重链可变区和包含SEQ ID NO:35的氨基酸序列的轻链可变区；其中所述抗体含有包含SEQ ID NO:44的氨基酸序列的重链可变区和包含SEQ ID NO:35的氨基酸序列的轻链可变区；其中所述抗体含有包含SEQ ID NO:46的氨基酸序列的重链可变区和包含SEQ IDNO:35的氨基酸序列的轻链可变区；其中所述抗体含有包含SEQ ID NO:48的氨基酸序列的重链可变区和包含SEQ ID NO:35的氨基酸序列的轻链可变区。
在一些实施方案中，本发明提供了抗埃博拉病毒包膜糖蛋白抗体，其中所述抗体含有包含SEQ ID NO:43的氨基酸序列的重链和包含SEQ ID NO:28的氨基酸序列的轻链；其中所述抗体含有包含SEQ ID NO:45的氨基酸序列的重链和包含SEQ ID NO:28的氨基酸序列的轻链；其中所述抗体含有包含SEQ ID NO:47的氨基酸序列的重链和包含SEQ ID NO:28的氨基酸序列的轻链；其中所述抗体含有包含SEQ ID NO:49的氨基酸序列的重链和包含SEQ ID NO:28的氨基酸序列的轻链；其中所述抗体含有包含SEQ ID NO:43的氨基酸序列的重链和包含SEQ ID NO:30的氨基酸序列的轻链；其中所述抗体含有包含SEQ ID NO:45的氨基酸序列的重链和包含SEQ ID NO:30的氨基酸序列的轻链；其中所述抗体含有包含SEQ IDNO:47的氨基酸序列的重链和包含SEQ ID NO:30的氨基酸序列的轻链；其中所述抗体含有包含SEQ ID NO:49的氨基酸序列的重链和包含SEQ ID NO:30的氨基酸序列的轻链；其中所述抗体含有包含SEQ ID NO:43的氨基酸序列的重链和包含SEQ ID NO:32的氨基酸序列的轻链；其中所述抗体含有包含SEQ ID NO:45的氨基酸序列的重链和包含SEQ ID NO:32的氨基酸序列的轻链；其中所述抗体含有包含SEQ ID NO:47的氨基酸序列的重链和包含SEQ IDNO:32的氨基酸序列的轻链；其中所述抗体含有包含SEQ ID NO:49的氨基酸序列的重链和包含SEQ ID NO:32的氨基酸序列的轻链；其中所述抗体含有包含SEQ ID NO:43的氨基酸序列的重链和包含SEQ ID NO:34的氨基酸序列的轻链；其中所述抗体含有包含SEQ ID NO:45的氨基酸序列的重链和包含SEQ ID NO:34的氨基酸序列的轻链；其中所述抗体含有包含SEQ ID NO:47的氨基酸序列的重链和包含SEQ ID NO:34的氨基酸序列的轻链；其中所述抗体含有包含SEQ ID NO:49的氨基酸序列的重链和包含SEQ ID NO:34的氨基酸序列的轻链；其中所述抗体含有包含SEQ ID NO:43的氨基酸序列的重链和包含SEQ ID NO:36的氨基酸序列的轻链；其中所述抗体含有包含SEQ ID NO:45的氨基酸序列的重链和包含SEQ ID NO:36的氨基酸序列的轻链；其中所述抗体含有包含SEQ ID NO:47的氨基酸序列的重链和包含SEQ ID NO:36的氨基酸序列的轻链；其中所述抗体含有包含SEQ ID NO:49的氨基酸序列的重链和包含SEQ ID NO:36的氨基酸序列的轻链；
在一些实施方案中，本发明提供了抗埃博拉病毒包膜糖蛋白抗体，其中所述抗体含有(a)包含SEQ ID NO:76的氨基酸序列的HVR-H1；(b)包含SEQ ID NO:77的氨基酸序列的HVR-H2；和(c)包含SEQ ID NO:78的氨基酸序列的HVR-H3。
在一些实施方案中，本发明提供了抗埃博拉病毒包膜糖蛋白抗体，其中所述抗体含有(a)包含SEQ ID NO:65的氨基酸序列的HVR-L1；(b)包含SEQ ID NO:66的氨基酸序列的HVR-L2；和(c)包含SEQ ID NO:67的氨基酸序列的HVR-L3。
在一些实施方案中，本发明提供了抗埃博拉病毒包膜糖蛋白抗体，其中所述抗体含有(a)包含SEQ ID NO:76的氨基酸序列的HVR-H1；(b)包含SEQ ID NO:77的氨基酸序列的HVR-H2；(c)包含SEQ ID NO:78的氨基酸序列的HVR-H3；(d)包含SEQ ID NO:65的氨基酸序列的HVR-L1；(e)包含SEQ ID NO:66的氨基酸序列的HVR-L2；和(f)包含SEQ ID NO:67的氨基酸序列的HVR-L3。
在一些实施方案中，本发明提供了抗埃博拉病毒包膜糖蛋白抗体，其中所述抗体包含重链可变区，其中所述重链可变区包含选自SEQ ID NO:70、72和74的氨基酸序列。
在一些实施方案中，本发明提供了抗埃博拉病毒包膜糖蛋白抗体，其中所述抗体包含轻链可变区，其中所述轻链可变区包含选自SEQ ID NO:55、57、59、61和63的氨基酸序列。
在一些实施方案中，本发明提供了抗埃博拉病毒包膜糖蛋白抗体，其中所述抗体包含重链可变区和轻链可变区，其中所述重链可变区包含选自SEQ ID NO:70、72和74的氨基酸序列，并且其中轻链可变区包含选自SEQ ID NO:55、57、59、61和63的氨基酸序列。
在一些实施方案中，本发明提供了抗埃博拉病毒包膜糖蛋白抗体，其中所述抗体包含重链，其中所述重链包含选自SEQ ID NO:71、73和75的氨基酸序列。
在一些实施方案中，本发明提供了抗埃博拉病毒包膜糖蛋白抗体，其中所述抗体包含轻链，其中所述轻链包含选自SEQ ID NO:56、58、60、62和64的氨基酸序列。
在一些实施方案中，本发明提供了抗埃博拉病毒包膜糖蛋白抗体，其中所述抗体包含重链和轻链，其中所述重链包含选自SEQ ID NO:71、73和75的氨基酸序列，并且其中所述轻链包含选自SEQ ID NO:56、58、60、62和64的氨基酸序列。
在一些实施方案中，本发明提供了抗埃博拉病毒包膜糖蛋白抗体，其中所述抗体含有包含SEQ ID NO:70的氨基酸序列的重链可变区和包含SEQ ID NO:55的氨基酸序列的轻链可变区；其中所述抗体含有包含SEQ ID NO:72的氨基酸序列的重链可变区和包含SEQID NO:55的氨基酸序列的轻链可变区；其中所述抗体含有包含SEQ ID NO:74的氨基酸序列的重链可变区和包含SEQ ID NO:55的氨基酸序列的轻链可变区；其中所述抗体含有包含SEQ ID NO:70的氨基酸序列的重链可变区和包含SEQ ID NO:57的氨基酸序列的轻链可变区；其中所述抗体含有包含SEQ ID NO:72的氨基酸序列的重链可变区和包含SEQ ID NO:57的氨基酸序列的轻链可变区；其中所述抗体含有包含SEQ ID NO:74的氨基酸序列的重链可变区和包含SEQ ID NO:57的氨基酸序列的轻链可变区；其中所述抗体含有包含SEQ ID NO:70的氨基酸序列的重链可变区和包含SEQ ID NO:59的氨基酸序列的轻链可变区；其中所述抗体含有包含SEQ ID NO:72的氨基酸序列的重链可变区和包含SEQ ID NO:59的氨基酸序列的轻链可变区；其中所述抗体含有包含SEQ ID NO:74的氨基酸序列的重链可变区和包含SEQ ID NO:59的氨基酸序列的轻链可变区；其中所述抗体含有包含SEQ ID NO:70的氨基酸序列的重链可变区和包含SEQ ID NO:61的氨基酸序列的轻链可变区；其中所述抗体含有包含SEQ ID NO:72的氨基酸序列的重链可变区和包含SEQ ID NO:61的氨基酸序列的轻链可变区；其中所述抗体含有包含SEQ ID NO:74的氨基酸序列的重链可变区和包含SEQ ID NO:61的氨基酸序列的轻链可变区；其中所述抗体含有包含SEQ ID NO:70的氨基酸序列的重链可变区和包含SEQ ID NO:63的氨基酸序列的轻链可变区；其中所述抗体含有包含SEQ IDNO:72的氨基酸序列的重链可变区和包含SEQ ID NO:63的氨基酸序列的轻链可变区；其中所述抗体含有包含SEQ ID NO:74的氨基酸序列的重链可变区和包含SEQ ID NO:63的氨基酸序列的轻链可变区。
在一些实施方案中，本发明提供了抗埃博拉病毒包膜糖蛋白抗体，其中所述抗体含有包含SEQ ID NO:71的氨基酸序列的重链和包含SEQ ID NO:56的氨基酸序列的轻链；其中所述抗体含有包含SEQ ID NO:73的氨基酸序列的重链和包含SEQ ID NO:56的氨基酸序列的轻链；其中所述抗体含有包含SEQ ID NO:75的氨基酸序列的重链和包含SEQ ID NO:56的氨基酸序列的轻链；其中所述抗体含有包含SEQ ID NO:71的氨基酸序列的重链和包含SEQ ID NO:58的氨基酸序列的轻链；其中所述抗体含有包含SEQ ID NO:73的氨基酸序列的重链和包含SEQ ID NO:58的氨基酸序列的轻链；其中所述抗体含有包含SEQ ID NO:75的氨基酸序列的重链和包含SEQ ID NO:58的氨基酸序列的轻链；其中所述抗体含有包含SEQ IDNO:71的氨基酸序列的重链和包含SEQ ID NO:60的氨基酸序列的轻链；其中所述抗体含有包含SEQ ID NO:73的氨基酸序列的重链和包含SEQ ID NO:60的氨基酸序列的轻链；其中所述抗体含有包含SEQ ID NO:75的氨基酸序列的重链和包含SEQ ID NO:60的氨基酸序列的轻链；其中所述抗体含有包含SEQ ID NO:71的氨基酸序列的重链和包含SEQ ID NO:62的氨基酸序列的轻链；其中所述抗体含有包含SEQ ID NO:73的氨基酸序列的重链和包含SEQ IDNO:62的氨基酸序列的轻链；其中所述抗体含有包含SEQ ID NO:75的氨基酸序列的重链和包含SEQ ID NO:62的氨基酸序列的轻链；其中所述抗体含有包含SEQ ID NO:71的氨基酸序列的重链和包含SEQ ID NO:64的氨基酸序列的轻链；其中所述抗体含有包含SEQ ID NO:73的氨基酸序列的重链和包含SEQ ID NO:64的氨基酸序列的轻链；其中所述抗体含有包含SEQ ID NO:75的氨基酸序列的重链和包含SEQ ID NO:64的氨基酸序列的轻链。
在一些实施方案中，本发明提供了抗埃博拉病毒包膜糖蛋白抗体，其中所述抗体包含(a)与SEQ ID NO:14的氨基酸序列具有至少90％氨基酸序列同一性的重链可变区氨基酸序列，(b)与SEQ ID NO:7的氨基酸序列具有至少90％氨基酸序列同一性的轻链可变区氨基酸序列，或(c)如(a)中的重链可变区氨基酸序列区和如(b)中的轻链可变区氨基酸序列。
在一些实施方案中，本发明提供了抗埃博拉病毒包膜糖蛋白抗体，其中所述抗体包含(a)与SEQ ID NO:42的氨基酸序列具有至少90％氨基酸序列同一性的重链可变区氨基酸序列，(b)与SEQ ID NO:35的氨基酸序列具有至少90％氨基酸序列同一性的轻链可变区氨基酸序列，或(c)如(a)中的重链可变区氨基酸序列区和如(b)中的轻链可变区氨基酸序列。
在一些实施方案中，本发明提供了抗埃博拉病毒包膜糖蛋白抗体，其中所述抗体包含(a)与SEQ ID NO:70的氨基酸序列具有至少90％氨基酸序列同一性的重链可变区氨基酸序列，(b)与SEQ ID NO:55的氨基酸序列具有至少90％氨基酸序列同一性的轻链可变区氨基酸序列，或(c)如(a)中的重链可变区氨基酸序列区和如(b)中的轻链可变区氨基酸序列。
在一些实施方案中，本发明提供了抗埃博拉病毒包膜糖蛋白抗体，其中所述抗体结合至包含选自SEQ ID NO:79-90的序列的埃博拉病毒糖蛋白。
在某些实施方案中，本发明的抗埃博拉病毒包膜糖蛋白抗体是抗体片段。在其它实施方案中，本发明的抗埃博拉病毒包膜糖蛋白抗体是全长IgG1抗体。在其它实施方案中，本发明的抗埃博拉病毒包膜糖蛋白抗体是非岩藻糖基化的(afucosylated)。
本发明还提供了编码本发明的抗埃博拉病毒包膜糖蛋白抗体的分离的核酸分子。本发明还提供了包含编码本发明的抗埃博拉病毒包膜糖蛋白的核酸分子的载体。所述载体可以是任何类型，例如是重组载体，例如表达载体。
在一些方面，本发明提供了包含编码本发明的抗埃博拉病毒包膜糖蛋白抗体的核酸分子的宿主细胞。可以使用多种宿主细胞中的任一种宿主细胞。在一个实施方案中，宿主细胞是原核细胞，例如大肠杆菌。在另一个实施方案中，宿主细胞是真核细胞，例如哺乳动物细胞，例如中国仓鼠卵巢(CHO)细胞；或植物细胞，例如烟草细胞。在一些实施方案中，宿主细胞是能够产生非岩藻糖基化抗体的宿主细胞。在其他实施方案中，宿主细胞是能够产生非岩藻糖基化抗体的哺乳动物宿主细胞。在其他实施方案中，宿主细胞是在FUT8(α-(1,6)-岩藻糖基转移酶)基因中具有缺失的哺乳动物宿主细胞，其导致无岩藻糖加成至表达的蛋白质。
本发明还提供了产生本发明的抗埃博拉病毒包膜糖蛋白抗体的方法。例如，本发明提供了制备本发明的抗埃博拉病毒包膜糖蛋白抗体(如本文中定义的，其包括全长抗体和其片段)的方法，该方法包括在合适的宿主细胞中表达编码本发明的抗埃博拉病毒包膜糖蛋白抗体或其片段的本发明重组载体，从而产生抗体或其片段。在一些实施方案中，该方法包括培养包含编码本发明的抗埃博拉病毒包膜糖蛋白抗体(或其片段)的核酸的宿主细胞，从而表达该核酸。该方法可以进一步包括从宿主细胞、从宿主细胞培养物或从宿主细胞培养基中回收抗埃博拉病毒包膜糖蛋白抗体或其片段。在一些实施方案中，相对于在不产生非岩藻糖基化抗体的宿主细胞中产生抗体而言，本文所述的方法导致降低的抗体聚集。
在一些实施方案中，本发明提供了免疫缀合物，其包含本发明的抗埃博拉病毒包膜糖蛋白抗体和细胞毒性剂。
在一些实施方案中，本发明提供了包含本发明的抗埃博拉病毒包膜糖蛋白抗体的药物制剂。在一些实施方案中，本发明提供了包含本发明的抗埃博拉病毒包膜糖蛋白抗体和/或免疫缀合物和药学上可接受的载体或稀释剂的药物制剂。在一些实施方案中，药物制剂还包含额外的治疗剂，例如另一种抗埃博拉病毒抗体、抗病毒剂或抗埃博拉疫苗。在一些实施方案中，本发明提供了包含本发明的抗埃博拉病毒包膜糖蛋白抗体的药物组合物，用于治疗、预防或抑制埃博拉病毒感染。
在一些实施方案中，本发明提供了本发明的抗埃博拉病毒包膜糖蛋白抗体，其用作药物。在某些实施方案中，本发明提供了本发明的抗埃博拉病毒包膜糖蛋白抗体，用于治疗埃博拉病毒感染。在一些实施方案中，本发明提供了本发明的抗埃博拉病毒包膜糖蛋白抗体在制备用于治疗埃博拉病毒感染的药物中的用途。另一方面，本发明提供了本发明的抗埃博拉病毒包膜糖蛋白抗体在制备药物中的用途。药物可用于抑制、治疗或预防埃博拉病毒感染。另一方面，本发明提供了本发明制备物用于制造药物的用途。药物可用于抑制、治疗或预防埃博拉病毒感染。
在一些实施方案中，本发明提供了治疗患有埃博拉病毒感染的个体的方法，包括向个体施用有效量的本发明的抗埃博拉病毒包膜糖蛋白抗体或其免疫缀合物。在一些实施方案中，所述方法还包括向所述个体施用额外的治疗剂。在一些实施方案中，额外的治疗剂是另一种抗埃博拉病毒抗体、抗病毒剂或抗埃博拉疫苗。
本发明还提供了一种抑制埃博拉病毒感染的方法，所述方法包括向有需要的个体施用有效量的包含本发明的一种或多种抗埃博拉病毒包膜糖蛋白抗体的组合物，由此抑制埃博拉病毒感染。本发明还提供了一种治疗埃博拉病毒感染的方法，所述方法包括向有需要的个体施用有效量的包含本发明的一种或多种抗埃博拉皮病毒包膜糖蛋白抗体的组合物，由此治疗埃博拉病毒感染。本发明还提供了一种用于预防埃博拉病毒感染的方法，所述方法包括向有需要的个体施用有效量的包含本发明的一种或多种抗埃博拉病毒包膜糖蛋白抗体的组合物，由此预防埃博拉病毒感染。
在一些实施方案中，本发明的抗埃博拉病毒包膜糖蛋白抗体体外、体内或者体外和体内中和埃博拉病毒。在一些实施方案中，本发明的抗埃博拉病毒包膜糖蛋白抗体是单克隆抗体。在一些实施方案中，本发明的抗埃博拉病毒包膜糖蛋白抗体是分离的单克隆抗体。
附图简述
图1A显示了嵌合的抗埃博拉病毒单克隆抗体13C6的轻链可变区(SEQ ID NO:1)和轻链(SEQ ID NO:2)的氨基酸序列。高变区加下划线。
图1B显示了嫁接至κ1的人源化抗埃博拉病毒单克隆抗体13C6的轻链可变区(SEQID NO:3)和轻链(SEQ ID NO:4)的氨基酸序列。带下划线的氨基酸残基表示嵌合的和人源化的抗埃博拉病毒单克隆抗体13C6之间在可变区中不同的氨基酸位置。
图1C显示了嫁接至κ1的具有游标位置43处(Kabat编号)鼠替换的人源化抗埃博拉病毒单克隆抗体13C6的轻链可变区(SEQ ID NO:5)和轻链(SEQ ID NO:6)的氨基酸序列。带下划线的氨基酸残基表示嵌合的和人源化的抗埃博拉病毒单克隆抗体13C6之间在可变区中不同的氨基酸位置。
图1D显示了嫁接至κ1的具有游标位置43和87处(Kabat编号)鼠替换的人源化抗埃博拉病毒单克隆抗体13C6的轻链可变区(SEQ ID NO:7)和轻链(SEQ ID NO:8)的氨基酸序列。带下划线的氨基酸残基表示嵌合的和人源化的抗埃博拉病毒单克隆抗体13C6之间在可变区中不同的氨基酸位置。
图1E显示了嵌合的和人源化的抗埃博拉病毒单克隆抗体13C6的轻链高变区(HVR-L1；SEQ ID NO:9)的氨基酸序列。
图1F显示了嵌合的和人源化的抗埃博拉病毒单克隆抗体13C6的轻链高变区(HVR-L2；SEQ ID NO:10)的氨基酸序列。
图1G显示了嵌合的和人源化的抗埃博拉病毒单克隆抗体13C6的轻链高变区(HVR-L3；SEQ ID NO:11)的氨基酸序列。
图1H显示了嵌合的抗埃博拉病毒单克隆抗体13C6的重链可变区(SEQ ID NO:12)和重链(SEQ ID NO:13)的氨基酸序列。高变区加下划线。
图1I显示了嫁接至H2种系的人源化抗埃博拉病毒单克隆抗体13C6的重链可变区(SEQ ID NO:14)和重链(SEQ ID NO:15)的氨基酸序列。带下划线的氨基酸残基表示嵌合的和人源化的抗埃博拉病毒单克隆抗体13C6之间在可变区中不同的氨基酸位置。
图1J显示了嫁接至H2种系的具有游标位置2、24和37处(Kabat编号)鼠替换的人源化抗埃博拉病毒单克隆抗体13C6的重链可变区(SEQ ID NO:16)和重链(SEQ ID NO:17)的氨基酸序列。带下划线的氨基酸残基表示嵌合的和人源化的抗埃博拉病毒单克隆抗体13C6之间在可变区中不同的氨基酸位置。
图1K显示了嫁接至H2种系的具有游标位置2、24、37、73和75处(Kabat编号)鼠替换的人源化抗埃博拉病毒单克隆抗体13C6的重链可变区(SEQ ID NO:18)和重链(SEQ ID NO:19)的氨基酸序列。带下划线的氨基酸残基表示嵌合的和人源化的抗埃博拉病毒单克隆抗体13C6之间在可变区中不同的氨基酸位置。
图1L显示了嫁接至H2种系的具有游标位置2、24、37、66、68、73和75处(Kabat编号)鼠替换的人源化抗埃博拉病毒单克隆抗体13C6的重链可变区的氨基酸序列(SEQ ID NO:20)和重链(SEQ ID NO:21)的氨基酸序列。带下划线的氨基酸残基表示嵌合的和人源化的抗埃博拉病毒单克隆抗体13C6之间在可变区中不同的氨基酸位置。
图1M显示了嵌合的和人源化的抗埃博拉病毒单克隆抗体13C6的重链高变区(HVR-H1；SEQ ID NO:22)的氨基酸序列。
图1N显示了嵌合的和人源化的抗埃博拉病毒单克隆抗体13C6的重链高变区(HVR-H2；SEQ ID NO:23)的氨基酸序列。
图1O显示了嵌合的和人源化的抗埃博拉病毒单克隆抗体13C6的重链高变区(HVR-H3；SEQ ID NO:24)的氨基酸序列。
图2A显示了嵌合的抗埃博拉病毒单克隆抗体2G4的轻链可变区(SEQ ID NO:25)和轻链(SEQ ID NO:26)的氨基酸序列。高变区加下划线。
图2B显示了嫁接至κ1的人源化抗埃博拉病毒单克隆抗体2G4的轻链可变区(SEQID NO:27)和轻链(SEQ ID NO:28)的氨基酸序列。带下划线的氨基酸残基表示嵌合的和人源化的抗埃博拉病毒单克隆抗体2G4之间在可变区中不同的氨基酸位置。
图2C显示了嫁接至κ1的具有游标位置43处(Kabat编号)鼠替换的人源化抗埃博拉病毒单克隆抗体2G4的轻链可变区(SEQ ID NO:29)和轻链(SEQ ID NO:30)的氨基酸序列。带下划线的氨基酸残基表示嵌合的和人源化的抗埃博拉病毒单克隆抗体2G4之间在可变区中不同的氨基酸位置。
图2D显示了嫁接至κ1的具有游标位置48处(Kabat编号)鼠替换的人源化抗埃博拉病毒单克隆抗体2G4的轻链可变区(SEQ ID NO:31)和轻链(SEQ ID NO:32)的氨基酸序列。带下划线的氨基酸残基表示嵌合的和人源化的抗埃博拉病毒单克隆抗体2G4之间在可变区中不同的氨基酸位置。
图2E显示了嫁接至κ1的具有游标位置43和48处(Kabat编号)鼠替换的人源化抗埃博拉病毒单克隆抗体2G4的轻链可变区(SEQ ID NO:33)和轻链(SEQ ID NO:34)的氨基酸序列。带下划线的氨基酸残基表示嵌合的和人源化的抗埃博拉病毒单克隆抗体2G4之间在可变区中不同的氨基酸位置。
图2F显示了嫁接至κ1的具有游标位置43、48和71处(Kabat编号)鼠替换的人源化抗埃博拉病毒单克隆抗体2G4的轻链可变区(SEQ ID NO:35)和轻链(SEQ ID NO:36)的氨基酸序列。带下划线的氨基酸残基表示嵌合的和人源化的抗埃博拉病毒单克隆抗体2G4之间在可变区中不同的氨基酸位置。
图2G显示了嵌合的和人源化的抗埃博拉病毒单克隆抗体2G4的轻链高变区(HVR-L1；SEQ ID NO:37)的氨基酸序列。
图2H显示了嵌合的和人源化的抗埃博拉病毒单克隆抗体2G4的轻链高变区(HVR-L2；SEQ ID NO:38)的氨基酸序列。
图2I显示了嵌合的和人源化的抗埃博拉病毒单克隆抗体2G4的轻链高变区(HVR-L3；SEQ ID NO:39)的嵌合的和人源化的抗埃博拉病毒单克隆抗体2G4。
图2J显示了嵌合的抗埃博拉病毒单克隆抗体2G4的重链可变区(SEQ ID NO:40)和重链(SEQ ID NO:41)的氨基酸序列。高变区加下划线。
图2K显示了嫁接至H3种系的人源化抗埃博拉病毒单克隆抗体2G4的重链可变区(SEQ ID NO:42)和重链(SEQ ID NO:43)的氨基酸序列。带下划线的氨基酸残基表示嵌合的和人源化的抗埃博拉病毒单克隆抗体2G4之间在可变区中不同的氨基酸位置。
图2L显示了嫁接至H3种系的具有游标位置49处(Kabat编号)鼠替换的人源化抗埃博拉病毒单克隆抗体2G4的重链可变区(SEQ ID NO:44)和重链(SEQ ID NO:45)的氨基酸序列。带下划线的氨基酸残基表示嵌合的和人源化的抗埃博拉病毒单克隆抗体2G4之间在可变区中不同的氨基酸位置。
图2M显示了嫁接至H3种系的具有游标位置78处(Kabat编号)鼠替换的人源化抗埃博拉病毒单克隆抗体2G4的重链可变区(SEQ ID NO:46)和重链(SEQ ID NO:47)的氨基酸序列。带下划线的氨基酸残基表示嵌合的和人源化的抗埃博拉病毒单克隆抗体2G4之间在可变区中不同的氨基酸位置。
图2N显示了嫁接至H3种系的具有游标位置49和78处(Kabat编号)鼠替换的人源化抗埃博拉病毒单克隆抗体2G4的重链可变区(SEQ ID NO:48)和重链(SEQ ID NO:49)的氨基酸序列。带下划线的氨基酸残基表示嵌合的和人源化的抗埃博拉病毒单克隆抗体2G4之间在可变区中不同的氨基酸位置。
图2O显示了嵌合的和人源化的抗埃博拉病毒单克隆抗体2G4的重链高变区(HVR-H1；SEQ ID NO:50)的氨基酸序列。
图2P显示了嵌合的和人源化的抗埃博拉病毒单克隆抗体2G4的重链高变区(HVR-H1；SEQ ID NO:51)的氨基酸序列。
图2Q显示了嵌合的和人源化的抗埃博拉病毒单克隆抗体2G4的重链高变区(HVR-H1；SEQ ID NO:52)的氨基酸序列。
图3A显示了嵌合的抗埃博拉病毒单克隆抗体4G7的轻链可变区(SEQ ID NO:53)和轻链(SEQ ID NO:54)的氨基酸序列。高变区加下划线。
图3B显示了嫁接至κ1的人源化抗埃博拉病毒单克隆抗体4G7的轻链可变区(SEQID NO:55)和轻链(SEQ ID NO:56)的氨基酸序列。带下划线的氨基酸残基表示嵌合的和人源化的抗埃博拉病毒单克隆抗体4G7之间在可变区中不同的氨基酸位置。
图3C显示了嫁接至κ1的具有游标位置43处(Kabat编号)鼠替换的人源化抗埃博拉病毒单克隆抗体4G7的轻链可变区(SEQ ID NO:57)和轻链(SEQ ID NO:58)的氨基酸序列。带下划线的氨基酸残基表示嵌合的和人源化的抗埃博拉病毒单克隆抗体4G7之间在可变区中不同的氨基酸位置。
图3D显示了嫁接至κ1的具有游标位置48处(Kabat编号)鼠替换的人源化抗埃博拉病毒单克隆抗体4G7的轻链可变区(SEQ ID NO:59)和轻链(SEQ ID NO:60)的氨基酸序列。带下划线的氨基酸残基表示嵌合的和人源化的抗埃博拉病毒单克隆抗体4G7之间在可变区中不同的氨基酸位置。
图3E显示了嫁接至κ1的具有游标位置43和48处(Kabat编号)鼠替换的人源化抗埃博拉病毒单克隆抗体4G7的轻链可变区(SEQ ID NO:61)和轻链(SEQ ID NO:62)的氨基酸序列。带下划线的氨基酸残基表示嵌合的和人源化的抗埃博拉病毒单克隆抗体4G7之间在可变区中不同的氨基酸位置。
图3F显示了嫁接至κ1的具有游标位置43、48和87处(Kabat编号)鼠替换的人源化抗埃博拉病毒单克隆抗体4G7的轻链可变区(SEQ ID NO:63)和轻链(SEQ ID NO:64)的氨基酸序列。带下划线的氨基酸残基表示嵌合的和人源化的抗埃博拉病毒单克隆抗体4G7之间在可变区中不同的氨基酸位置。
图3G显示了嵌合的和人源化的抗埃博拉病毒单克隆抗体4G7的轻链高变区(HVR-L1；SEQ ID NO:65)的氨基酸序列。
图3H显示了嵌合的和人源化的抗埃博拉病毒单克隆抗体4G7的轻链高变区(HVR-L2；SEQ ID NO:66)的氨基酸序列。
图3I显示了嵌合的和人源化的抗埃博拉病毒单克隆抗体4G7的轻链高变区(HVR-L3；SEQ ID NO:67)的嵌合的和人源化的抗埃博拉病毒单克隆抗体4G7。
图3J显示了嵌合的抗埃博拉病毒单克隆抗体4G7的重链可变区(SEQ ID NO:68)和重链(SEQ ID NO:69)的氨基酸序列。高变区加下划线。
图3K显示了嫁接至H1种系的人源化抗埃博拉病毒单克隆抗体4G7的重链可变区(SEQ ID NO:70)和重链(SEQ ID NO:71)的氨基酸序列。带下划线的氨基酸残基表示嵌合的和人源化的抗埃博拉病毒单克隆抗体4G7之间在可变区中不同的氨基酸位置。
图3L显示了嫁接至H1种系的具有游标位置71处(Kabat编号)鼠替换的人源化抗埃博拉病毒单克隆抗体4G7的重链可变区(SEQ ID NO:72)和重链(SEQ ID NO:73)的氨基酸序列。带下划线的氨基酸残基表示嵌合的和人源化的抗埃博拉病毒单克隆抗体4G7之间在可变区中不同的氨基酸位置。
图3M显示了嫁接至H1种系的具有游标位置67、69和71处(Kabat编号)鼠替换的人源化抗埃博拉病毒单克隆抗体4G7的重链可变区(SEQ ID NO:74)和重链(SEQ ID NO:75)的氨基酸序列。带下划线的氨基酸残基表示嵌合的和人源化的抗埃博拉病毒单克隆抗体4G7之间在可变区中不同的氨基酸位置。
图3N显示了嵌合的和人源化的抗埃博拉病毒单克隆抗体4G7的重链高变区(HVR-H1；SEQ ID NO:76)的氨基酸序列。
图3O显示了嵌合的和人源化的抗埃博拉病毒单克隆抗体4G7的重链高变区(HVR-H2；SEQ ID NO:77)的氨基酸序列。
图3P显示了嵌合的和人源化的抗埃博拉病毒单克隆抗体4G7的重链高变区(HVR-H3；SEQ ID NO:78)的氨基酸序列。
图4A至图4L显示了来自埃博拉病毒物种不同毒株的病毒包膜糖蛋白的氨基酸序列(SEQ ID NO:79-90)。
图5A至图5B显示了抗埃博拉病毒单克隆抗体13C6的表位序列(SEQ ID NO:91)、2G4的表位序列(SEQ ID NO:92)和4G7的表位序列(SEQ ID NO:92)。
本发明实施方案的详细描述
I.定义
用于本文目的的“接纳体人类构架”是这样的构架，它包含源自人免疫球蛋白构架的轻链可变结构域(VL)构架或重链可变结构域(VH)构架或如下文定义的人共有序列构架的氨基酸序列。“衍生自”人免疫球蛋白构架或人共有构架的接纳体人类构架可以包含其相同的氨基酸序列，或它可以含有氨基酸序列变化。在一些实施方案中，氨基酸变化的数目是10或更小、9或更小、8或更小、7或更小、6或更小、5或更小、4或更小、3或更小或2或更小。在一些实施方案中，VL或VH接纳体人类构架在序列上与VL或VH人免疫球蛋白构架序列或人类共有构架序列相同。
“亲和力”指分子(例如，抗体)的单一结合位点和其结合配偶体(例如，抗原)之间总计非共价相互作用的强度。除非另外指出，否则如本文所用，“结合亲和力”指反映结合对子的成员(例如，抗体和抗原)之间1:1相互作用的固有结合亲和力。分子X对其配偶体Y的亲和力可以通常由解离常数(Kd)代表。亲和力可以由本领域已知的常见方法测量，包括本文所述的那些方法。在下文中描述用于测量结合亲和力的具体示意性和示例性实施方案。
“亲和力成熟的”抗体指在一个或多个高变区(HVR)中存在一个或多个改变的抗体，其中与不拥有这些改变的亲本抗体相比，这类改变导致抗体对抗原的亲和力改善。
术语“抗埃博拉病毒糖蛋白抗体”、“抗埃博拉病毒包膜糖蛋白抗体”、“结合埃博拉病毒糖蛋白的抗体”、“抗埃博拉病毒GP抗体”和“与埃博拉病毒GP结合的抗体”是指能够以足够的亲和力结合埃博拉病毒包膜糖蛋白的抗体，使得该抗体可用作靶向埃博拉病毒糖蛋白的诊断剂和/或治疗剂。在一个实施方案中，抗埃博拉病毒糖蛋白抗体与不相关的非埃博拉病毒糖蛋白的结合程度小于该抗体与埃博拉病毒糖蛋白的结合的约10％，例如通过放射免疫测定法(RIA)测定。在某些实施方案中，结合埃博拉病毒糖蛋白的抗体具有≤1μM,≤100nM,≤10nM,≤1nM,≤0.1nM,≤0.01nM,或≤0.001nM(例如10-8M或更小，例如从10-8M至10-13M,例如从10-9M至10-13M)的解离常数(Kd)。在某些实施方案中，抗埃博拉病毒糖蛋白抗体结合埃博拉病毒糖蛋白的表位，所述埃博拉病毒糖蛋白的表位在来自埃博拉病毒属中的不同埃博拉病毒物种的埃博拉病毒糖蛋白(例如扎伊尔埃博拉病毒包膜糖蛋白、苏丹埃博拉病毒包膜糖蛋白、雷斯顿埃博拉病毒包膜糖蛋白、泰森林埃博拉病毒包膜糖蛋白、本迪布焦埃博拉病毒包膜糖蛋白；参见例如图4A-图4L，SEQ ID NO:79-90)之间是保守的。
术语“抗体”在本文中以最广意义使用并且涵盖多种抗体结构物，包括但不限于单克隆抗体、多克隆抗体、多特异性抗体(例如，双特异性抗体)和抗体片段，只要它们显示出所需的抗原结合活性即可。
“抗体片段”指不为完整抗体的、包含完整抗体的一部分的分子，其结合至与完整抗体结合的抗原。抗体片段的例子包括但不限于Fv、Fab、Fab'、Fab'-SH、F(ab')2；双体抗体(diabodies)；线性抗体；单链抗体分子(例如scFv)；和从抗体片段形成的多特异性抗体。
与参考抗体“结合相同表位的抗体”指在竞争测定法中阻断参考抗体与其抗原结合达50％或更多的抗体，并且反过来，参考抗体在竞争测定法中阻断该抗体与其抗原结合达50％或更多。本文提供了示例性竞争测定法。
术语“嵌合抗体”指一种抗体，其中重链和/或轻链的一部分源自特定来源或物种，而重链和/或轻链的剩余部分源自不同的来源或物种。
抗体的“类”是指其重链所具有的恒定结构域或恒定区的类型。有五种主要类型的抗体：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，且其中几种可进一步分为亚类(同种型)，例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2。对应于不同类别的免疫球蛋白的重链恒定结构域分别称为α、δ、ε、γ和μ。
本文所用的术语“细胞毒性剂”指抑制或阻止细胞功能和/或造成细胞死亡或破坏的物质。细胞毒性剂包括但不限于放射性同位素(例如，At211、I131、I125、Y90、Re186、Re188、Sm153、Bi212、P32、Pb212和Lu的放射性同位素)；化疗剂或药物(例如，甲氨蝶呤、阿霉素、长春碱类生物碱(长春新碱、长春碱、依托泊苷)、多柔比星、美法仑、丝裂霉素C、苯丁酸氮芥、佐柔比星或其他嵌入剂)；生长抑制剂；酶及其片段如溶核酶；抗生素；毒素如细菌源、真菌源、植物源或动物源的小分子毒素或酶活性毒素，包括其片段和/或变体；和下文公开的多种抗肿瘤剂或抗癌剂。
“效应子功能”是指归属于抗体Fc区的那些生物学活性，其随抗体同种型而变化。抗体效应子功能的实例包括：C1q结合和补体依赖性细胞毒性(CDC)；Fc受体结合；抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)；吞噬；细胞表面受体(例如，B细胞受体)的下调；和B细胞活化。
药剂(例如，药物制剂)的“有效量”指以需要的剂量并持续需要的时间段，有效实现所需治疗性或预防性结果的量。
本文中使用的术语“Fc区”用于定义含有至少一部分恒定区的免疫球蛋白重链的C末端区域。该术语包括天然序列Fc区和变体Fc区。在一个实施方案中，人IgG重链Fc区从Cys226或从Pro230延伸至重链的羧基末端。然而，Fc区的C末端赖氨酸(Lys447)可以存在或不存在。除非另有说明，Fc区或恒定区中氨基酸残基的编号是根据EU编号系统，也称为EU索引，如Kabat等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest,第5版，PublicHealth Service,National Institutes of Health,Bethesda,MD,1991。
“构架”或“FR”指除高变区(HVR)残基之外的可变结构域残基。可变结构域的FR通常由以下4个FR结构域组成：FR1、FR2、FR3和FR4。因此，HVR序列和FR序列通常按以下序列出现在VH(或VL)中：FR1-H1(L1)-FR2-H2(L2)-FR3-H3(L3)-FR4。
术语“全长抗体”、“完整抗体”和“全抗体”在本文中可互换地用于指具有与天然抗体结构基本相似或具有包含如本文所定义的Fc区的重链的结构的抗体。
术语“宿主细胞”、“宿主细胞系”和“宿主细胞培养物”可互换使用并且指已经向其中引入外源核酸的细胞，包括这类细胞的后代。宿主细胞包括“转化体”和“经转化的细胞”，其包括原代转化细胞和从其衍生的后代，而无论传代次数是多少。后代可以在核酸含量方面不与亲本细胞完全相同，反而可以含有突变。本文包括具有与最初转化细胞中所筛选或选择的相同功能或生物学活性的突变后代。
“人抗体”是这样一种抗体，其拥有对应于人或人细胞产生的抗体的氨基酸序列或从利用人抗体库或其他编码人抗体的序列的非人来源衍生。人抗体的这种定义特别排除包含非人抗原结合残基的人源化抗体。
“人类共有构架”是这样的构架，它代表在人免疫球蛋白VL或VH构架序列的选项中最常出现的氨基酸残基。通常，人免疫球蛋白VL或VH构架序列的选项来自可变结构域序列的亚组。通常，序列亚组是如Kabat等人,Sequences of Proteins of ImmunologicalInterest(目的免疫蛋白质的序列)，第5版，NIH Publication 91-3242,Bethesda MD(1991)，第1-3卷中描述的亚组。在一个实施方案中，对于VL，该亚组是如上文Kabat等人中描述的亚组κI。在一个实施方案中，对于VH，该亚组是如上文Kabat等人中描述的亚组III。
“人源化”抗体指包含来自非人类HVR的氨基酸残基和来自人FR的氨基酸残基的嵌合抗体。在某些实施方案中，人源化抗体将包含至少1个、并且一般2个可变结构域的基本上全部，其中全部或基本上全部的HVR(例如，CDR)与非人抗体的那些HVR对应并且全部或基本上全部的FR区与人抗体的那些FR对应。人源化抗体任选地可以包含从人抗体衍生的抗体恒定区的至少一部分。抗体的“人源化形式”(例如非人抗体)指已经历过人源化的抗体。
如本文所用，术语“高变区”或“HVR”指抗体可变结构域中在序列方面高度变化(“互补可变区”或“CDR”)和/或形成结构上定义的环(“高变环”)或含有抗原接触残基(“抗原接触部”)的每个区域。通常，抗体包含六个HVR：VH中三个(H1、H2、H3)和VL中三个(L1、L2、L3)。本文的示例性HVR包括：
(a)在氨基酸残基26-32(L1)、50-52(L2)、91-96(L3)、26-32(H1)、53-55(H2)、和96-101(H3)处(Chothia和Lesk,J.Mol.Biol.196:901-917(1987))存在的高变环；
(b)在氨基酸残基24-34(L1)、50-56(L2)、89-97(L3)、31-35b(H1)、50-65(H2)、和95-102(H3)处(Kabat等人,Sequences of Proteins of Immunological Interest,第5版，Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,MD(1991))存在的CDRs；
(c)在氨基酸残基27c-36(L1)、46-55(L2)、89-96(L3)、30-35b(H1)、47-58(H2)、和93-101(H3)处存在的抗原接触(MacCallum等人，J.Mol.Biol.262:732-745(1996))；和
(d)(a)、(b)和/或(c)的组合，包括HVR氨基酸残基46-56(L2)、47-56(L2)、48-56(L2)、49-56(L2)、26-35(H1)、26-35b(H1)、49-65(H2)、93-102(H3)、和94-102(H3)。
在某些实施方案中，HVR残基包含图1E、图1F和图1G(SEQ ID NO:9、10、11)；图1M、图1N和图1O(SEQ ID NO:22、23、24)；图2G、图2H和图2I(SEQ ID NO:37、38、39)；图2O、图2P和图2Q(SEQ ID NO:50、51、52)；图3G、图3H和图3I(SEQ ID NO:65、66、67)；和图3N、图3O和图3P(SEQ ID NO:76、77、78)中鉴定的那些HVR残基。
除非另外说明，否则可变结构域中的HVR残基和其他残基(例如，FR残基)在本文中根据上文Kabat等人所述编号。
“免疫缀合物”是与一个或多个异源分子(包括但不限于细胞毒性剂)缀合的抗体。
“个体”或“受试者”是哺乳动物。哺乳动物包括但不限于驯化动物(例如，奶牛、绵羊、猫、犬和马)、灵长类(例如，人和非人灵长类如猴)、兔和啮齿类(例如，小鼠和大鼠)。在某些实施方案中，个体或受试者是人。
“分离的”抗体是已经与其自然环境的组分分离的一种抗体。在一些实施方案中，将抗体纯化至大于95％或99％纯度，如通过例如电泳(例如，SDS-PAGE、等电聚焦(IEF)、毛细管电泳法)或色谱(例如，离子交换或反相HPLC)所确定。关于评估抗体纯度的方法的综述，参见例如Flatman等人,J.Chromatogr.B848:79-87(2007)。
“分离的”核酸指已经与其自然环境的组分分离的核酸分子。分离的核酸包括含于细胞内的核酸分子，所述细胞通常含有该核酸分子，但是该核酸分子存在于染色体外或与其天然染色体位置不同的染色体位置处。
“编码抗埃博拉病毒糖蛋白抗体的分离的核酸”是指编码抗体重链和轻链(或其片段)的一个或多个核酸分子，包括在单一载体或独立载体中的这类核酸分子和在宿主细胞中一个或多个位置处存在的这类核酸分子。
如本文中所用的术语“单克隆抗体”指从基本上均一的抗体群体获得的抗体，即，包含于该群体的各个抗体是相同的和/或结合相同的表位，除了可能的变体抗体之外(例如，含有天然存在突变或在产生单克隆抗体制备物期间出现)，这类变体通常以微小的量存在。与一般包括针对不同决定簇(表位)的不同抗体的多克隆抗体制备物相反，单克隆抗体制备物的每种单克隆抗体针对抗原上的单一决定簇。因此，修饰语“单克隆的”指示该抗体的特征为从基本上均一的抗体群体获得，并且不得解释为要求通过任何特定方法产生该抗体。例如，可以通过多种技术产生待根据本发明使用的单克隆抗体，所述技术包括但不限于杂交瘤方法、重组DNA方法、噬菌体展示方法和利用含有全部或部分的人免疫球蛋白基因座的转基因动物的方法，本文中描述了用于产生单克隆抗体的这类方法和其他示例性方法。
“裸抗体”指不与异源部分(例如，细胞毒部分)或放射标记物缀合的抗体。裸抗体可以存在于药物制剂中。
“天然抗体”是指具有不同结构的天然存在的免疫球蛋白分子。例如，天然IgG抗体是约150,000道尔顿的异四聚糖蛋白，包含二硫键键合的两个相同的轻链和两个相同的重链。每一重链从N-至C-末端具有可变区(VH)，也称为可变重结构域或重链可变结构域，随后是三个恒定结构域(CHI、CH2和CH3)。类似地，从N至C末端，每一轻链具有可变区(VL)，也称为可变轻结构域或轻链可变结构域，其后是恒定轻结构域(CL)。基于抗体轻链恒定结构域的氨基酸序列，抗体的轻链可以分配为称为κ(κ)和λ(λ)的两种之一。
术语“包装插页”用来指治疗产品的商业包装中习惯性包括的说明书，所述说明书含有关于适应症、用法、剂量、施用、联合疗法、禁忌症和/或涉及此类治疗产品用途之警告的信息。
相对于参考多肽序列，将“氨基酸序列同一性百分数(％)”定义为比对序列并根据需要引入空位以实现最大序列同源性百分数并且不考虑任何保守性置换作为序列同一性的部分之后，候选序列中与参考多肽序列中的氨基酸残基相同的氨基酸残基的百分数。为了确定氨基酸序列同一性百分数的比对可以按本领域能力范围内的多种方式实现，例如，使用可公开获得的计算机软件如BLAST、BLAST-2、ALIGN或Megalign(DNASTAR)软件。本领域技术人员可以确定用于比对序列的适宜参数，包括为实现正在比较的全长序列范围内最大比对所需要的任何算法。然而，出于本文目的，使用序列比较计算机程序ALIGN-2产生氨基酸序列同一性％值。ALIGN-2序列比较计算机程序由Genentech,Inc.授权，并且源代码已经随用户文档提交至华盛顿特区20559的美国版权局，在那里它以美国版权登记号TXU510087登记。ALIGN-2程序从Genentech,Inc.,South San Francisco,加利福尼亚州可公开获得或可以从源代码汇编。应当将ALIGN-2程序汇编在UNIX操作系统(包括数字式UNIX V4.0D)上使用。全部序列比较参数由ALIGN-2程序设定并且不变动。
在使用ALIGN-2比较氨基酸序列的情况下，如下计算给定氨基酸序列A与给定氨基酸序列B、同给定氨基酸序列B或针对给定氨基酸序列B(这可以备选地描述为与给定氨基酸序列B、同给定氨基酸序列B或针对给定氨基酸序列B具有或包含某个氨基酸序列同一性％的给定氨基酸序列A)的氨基酸序列同一性％：
100乘以分数X/Y
其中X是由序列比对程序ALIGN-2在该程序的A和B比对结果中评定为相同匹配的氨基酸残基的数目，并且其中Y是B中氨基酸残基的总数。将可以理解在氨基酸序列A的长度不等于氨基酸序列B的长度时，A相对于B的氨基酸序列同一性％将不等于B相对于A的氨基酸序列同一性％。除非另外特别声明，否则本文所用的全部氨基酸序列同一性值％如紧接前段中所述那样使用ALIGN-2计算机程序获得。
术语“药物制剂”指一种制备物，所述制备物处于这类形式从而允许其中所含的有效成分的生物学活性有效，并且不含有对于将会施用该制剂的受试者不可接受地有毒的额外组分。
“可药用载体”指药物制剂中除有效成分之外的对受试者无毒的成分。可药用载体包括但不限于缓冲剂、赋形剂、稳定剂或防腐剂。
本文所用的术语“埃博拉病毒糖蛋白”或“埃博拉病毒包膜糖蛋白”是指来自任何埃博拉病毒株或分离物的任何天然埃博拉病毒糖蛋白。该术语包含“全长的”未加工的埃博拉病毒糖蛋白以及埃博拉病毒中或埃博拉病毒感染的细胞中加工所得的任何形式的埃博拉病毒糖蛋白。该术语还包含埃博拉病毒糖蛋白的天然存在变体，例如剪接变体或等位基因变体。示例性埃博拉病毒糖蛋白的氨基酸序列示于图4A-图4L(SEQ ID NO:79-90)。埃博拉病毒糖蛋白进一步描述于例如Lee等人,(2009)Future Virol.4(6):621-635,Lee等人,(2008)Nature454:177-182,WO 2005/063798,WO 2011/071574)。
如本文所用，名词“治疗”(和其语法变型如动词“治疗”或分词“治疗”)指意欲改变正在治疗的个体的天然过程的临床介入，并且可以为了预防或在临床病理学过程期间实施。想要的治疗效果包括，但不限于防止疾病出现或复发、减轻症状、减小疾病的任何直接或间接病理学后果、防止转移、降低病情进展速率、改善或缓和疾病状态，以及缓解或预后改善。在一些实施方案中，本发明的抗体用来延缓疾病发展或用来减慢疾病的进展。
术语“可变区”或“可变结构域”指抗体重链或轻链的参与抗体结合至抗原的结构域。天然抗体重链和轻链的可变结构域(分别是VH和VL)通常具有相似的结构，每种结构域包含四个保守的构架区(FR)和三个高变区(HVR)。(参见例如Kindt等人，Kuby Immunology，第6版，W.H.Freeman and Co.，第91页(2007))。单个VH结构域或VL结构域可能足以赋予抗原结合特异性。另外，结合特定抗原的抗体可以利用来自结合该抗原的抗体的VH或VL结构域进行分离以分别筛选互补性VL结构域或VH结构域的文库。参见例如Portolano等人,J.Immunol.150:880-887(1993)；Clarkson等人,Nature 352:624-628(1991)。
如本文所用，术语“载体”指能够增殖与其连接的另一种核酸的核酸分子。该术语包括作为自我复制型核酸结构的载体以及并入宿主细胞基因组的载体，其中已经在宿主细胞中导入了该载体。某些载体能够指导与它们有效连接的核酸表达。此类载体在本文中称作“表达载体”。
II.组合物和方法
在一个方面，本发明部分基于抗埃博拉病毒GP抗体。在某些实施方案中，提供了结合埃博拉病毒糖蛋白的人源化抗体。本发明的抗体可用于例如埃博拉病毒病的诊断或治疗。
A.示例性抗埃博拉病毒糖蛋白抗体
在一个方面，本发明提供了结合埃博拉病毒糖蛋白的分离的抗体。在某些实施方案中，提供了人源化抗埃博拉病毒糖蛋白抗体，例如与包含氨基酸序列SEQ ID NO:91或SEQID NO:92的表位结合的人源化抗体。
在一个方面，本发明提供了包含至少一个、两个、三个、四个、五个或六个HVR的人源化抗埃博拉病毒糖蛋白抗体，所述HVR选自(a)包含SEQ ID NO:22、50或76的氨基酸序列的HVR-H1；(b)包含SEQ ID NO:23、51或77的氨基酸序列的HVR-H2；(c)包含SEQ ID NO:24、52或78的氨基酸序列的HVR-H3；(d)包含SEQ ID NO:9、37或65的氨基酸序列的HVR-L1；(e)包含SEQ ID NO:10、38或66的氨基酸序列的HVR-L2；和(f)包含SEQ ID NO:11、39或67的氨基酸序列的HVR-L3。
在另一方面，本发明的抗体含有(a)包含至少一个，至少两个或全部三个VH HVR序列的VH结构域，所述VH HVR序列选自(i)包含SEQ ID NO:22的氨基酸序列的HVR-H1，(ii)包含SEQ ID NO:23的氨基酸序列的HVR-H2，和(iii)包含选自SEQ ID NO:24的氨基酸序列的HVR-H3；和(b)包含至少一个，至少两个或全部三个VL HVR序列的VL结构域，所述VL HVR序列选自(i)包含SEQ ID NO:9的氨基酸序列的HVR-L1，(ii)包含SEQ ID NO:10的氨基酸序列的HVR-L2，和(c)包含SEQ ID NO:11的氨基酸序列的HVR-L3。在另一方面，本发明提供了一种抗体，其含有(a)包含SEQ ID NO:22的氨基酸序列的HVR-H1；(b)包含SEQ ID NO:23的氨基酸序列的HVR-H2；(c)包含SEQ ID NO:24的氨基酸序列的HVR-H3；(d)包含SEQ ID NO:9的氨基酸序列的HVR-L1；(e)包含SEQ ID NO:10的氨基酸序列的HVR-L2；和(f)包含选自SEQID NO:11的氨基酸序列的HVR-L3。
在另一方面，本发明的抗体含有(a)包含至少一个，至少两个或全部三个VH HVR序列的VH结构域，所述VH HVR序列选自(i)包含SEQ ID NO:50的氨基酸序列的HVR-H1，(ii)包含SEQ ID NO:51的氨基酸序列的HVR-H2，和(iii)包含选自SEQ ID NO:52的氨基酸序列的HVR-H3；和(b)包含至少一个，至少两个或全部三个VL HVR序列的VL结构域，所述VL HVR序列选自(i)包含SEQ ID NO:37的氨基酸序列的HVR-L1，(ii)包含SEQ ID NO:38的氨基酸序列的HVR-L2，和(c)包含SEQ ID NO:39的氨基酸序列的HVR-L3。在另一方面，本发明提供了一种抗体，其含有(a)包含SEQ ID NO:50的氨基酸序列的HVR-H1；(b)包含SEQ ID NO:51的氨基酸序列的HVR-H2；(c)包含SEQ ID NO:52的氨基酸序列的HVR-H3；(d)包含SEQ ID NO:37的氨基酸序列的HVR-L1；(e)包含SEQ ID NO:38的氨基酸序列的HVR-L2；和(f)包含选自SEQ ID NO:39的氨基酸序列的HVR-L3。
在另一方面，本发明的抗体含有(a)包含至少一个，至少两个或全部三个VH HVR序列的VH结构域，所述VH HVR序列选自(i)包含SEQ ID NO:76的氨基酸序列的HVR-H1，(ii)包含SEQ ID NO:77的氨基酸序列的HVR-H2，和(iii)包含选自SEQ ID NO:78的氨基酸序列的HVR-H3；和(b)包含至少一个，至少两个或全部三个VL HVR序列的VL结构域，所述VL HVR序列选自(i)包含SEQ ID NO:65的氨基酸序列的HVR-L1，(ii)包含SEQ ID NO:66的氨基酸序列的HVR-L2，和(c)包含SEQ ID NO:67的氨基酸序列的HVR-L3。在另一方面，本发明提供了一种抗体，其含有(a)包含SEQ ID NO:76的氨基酸序列的HVR-H1；(b)包含SEQ ID NO:77的氨基酸序列的HVR-H2；(c)包含SEQ ID NO:78的氨基酸序列的HVR-H3；(d)包含SEQ ID NO:65的氨基酸序列的HVR-L1；(e)包含SEQ ID NO:66的氨基酸序列的HVR-L2；和(f)包含选自SEQ ID NO:67的氨基酸序列的HVR-L3。
在某些实施方案中，如上提供的抗埃博拉病毒糖蛋白抗体中的任何一个或多个氨基酸在以下HVR位置(Kabat编号)被置换：
在13C6.HVR-H1(SEQ ID NO:22):位置35b
在13C6.HVR-H2(SEQ ID NO:23):位置52、54、58、60或61
在13C6.HVR-H3(SEQ ID NO:24):位置100d或101
在13C6.HVR-L1(SEQ ID NO:9):位置24、28、29、30、31、32或33
在13C6.HVE-L2(SEQ ID NO:10):位置50、53、54、55或56
在13C6.HVR-L3(SEQ ID NO:11):位置92或96
在2G4.HVR-H1(SEQ ID NO:50):位置31、33或35
在2G4.HVR-H2(SEQ ID NO:51):位置50、52、52a、52b、52c、53、54、55、56、58或61
在2G4.HVR-H3(SEQ ID NO:52):位置93或100b
在2G4.HVR-L1(SEQ ID NO:37):位置27、28、30或32
在2G4.HVR-L2(SEQ ID NO:38):位置50、52、53、55或56
在2G4.HVR-L3(SEQ ID NO:39):位置90、91、92、93、94或96
在4G7.HVR-H1(SEQ ID NO:76):位置27、28、31、32、33、34或35
在4G7.HVR-H2(SEQ ID NO:77):位置50、52、52a、53、54、56、58、60或64
在4G7.HVR-H3(SEQ ID NO:78):位置93、94或101
在4G7.HVR-L1(SEQ ID NO:65):位置27、28或30
在4G7.HVR-L2(SEQ ID NO:66):位置50、52、53、55或56
在4G7.HVR-L3(SEQ ID NO:67):位置90、91、92、93或94
在某些实施方案中，置换是本文提供的保守置换。
在某些实施方案中，本发明的抗埃博拉病毒糖蛋白抗体如表1-3所述。
在任一上述实施方案中，抗埃博拉病毒糖蛋白抗体是人源化的。在一个实施方案中，抗埃博拉病毒糖蛋白抗体包含如上述任一实施方案中的HVR，并且还包含接纳体人类构架，例如人免疫球蛋白构架或人共有构架。
另一方面，抗埃博拉病毒糖蛋白抗体包含与氨基酸序列SEQ ID NO:14、42或70具有至少90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％或100％序列同一性的重链可变结构域(VH)序列。在某些实施方案中，所述具有至少90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％或99％同一性的VH序列相对于所述参考序列含有置换(例如保守置换)、插入或缺失，但是包含该序列的抗埃博拉病毒糖蛋白抗体保留结合埃博拉病毒糖蛋白的能力。在某些实施方案中，已经在SEQ ID NO:14、42或70中置换、插入和/或缺失了总共1至10个氨基酸。在某些实施方案中，置换、插入或缺失发生在HVR外部的区域(即，在FR中，例如，在重链游标位置2、24、37、49、66、67、68、69、71、73和/或75(Kabat编号))。在一些实施方案中，抗埃博拉病毒糖蛋白抗体包含SEQ ID NO:14、16、18、20、42、44、46、48、70、72或74中的VH(可变重链区)序列，包括该序列的翻译后修饰。在一个具体实施方案中，VH包含选自以下的一个、两个或三个HVR：(a)包含SEQ ID NO:22、50或76的氨基酸序列的HVR-H1，(b)包含SEQ ID NO:23、51或77的氨基酸序列的HVR-H2，和(c)包含SEQ ID NO:24、52或78的氨基酸序列的HVR-H3。
在另一方面，提供了抗埃博拉病毒糖蛋白抗体，其中抗体包含与氨基酸序列SEQID NO:3、27或55具有至少90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％或100％序列同一性的轻链可变结构域(VL)。在某些实施方案中，所述具有至少90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％或99％同一性的VL序列相对于所述参考序列含有置换(例如保守置换)、插入或缺失，但是包含该序列的人源化抗埃博拉病毒糖蛋白抗体保留结合埃博拉病毒糖蛋白的能力。在某些实施方案中，已经在SEQ ID NO:3、27或55中置换、插入和/或缺失了总共1至10个氨基酸。在某些实施方案中，置换、插入或缺失发生在HVR外部的区域(即，在FR中，例如，在轻链游标位置4、43、48、71和/或87(Kabat编号))。在一些实施方案中，抗埃博拉病毒糖蛋白抗体包含SEQ ID NO:3、5、7、27、29、31、33、35、55、57、59、61或63中的VL序列，包括该序列的翻译后修饰。在一个具体实施方案中，VL包含选自以下的一个、两个或三个HVR：(a)包含SEQ ID NO:9、37或65的氨基酸序列HVR-L1；(b)包含SEQ IDNO:10、38或66的氨基酸序列的HVR-L2；和(c)包含SEQ ID NO:11、39或67的氨基酸序列的HVR-L3。
在另一方面，提供了抗埃博拉病毒糖蛋白抗体，其中所述抗体包含如上述提供的任一实施方案中的VH和如上文提供的任一实施方案中的VL。包含特定VH(可变重链)和VL(可变轻链)序列或包含特定重链和轻链序列的示例性抗体在下表1-3中详细描述。
表1.人源化13C6抗体变体
变体 命名 VL序列 轻链序列 VH序列 重链序列
1 h13C6a SEQ ID NO:3 SEQ ID NO:4 SEQ ID NO:14 SEQ ID NO:15
2 h13C6b SEQ ID NO:3 SEQ ID NO:4 SEQ ID NO:20 SEQ ID NO:21
3 h13C6c SEQ ID NO:3 SEQ ID NO:4 SEQ ID NO:18 SEQ ID NO:19
4 h13C6d SEQ ID NO:3 SEQ ID NO:4 SEQ ID NO:16 SEQ ID NO:17
5 h13C6e SEQ ID NO:5 SEQ ID NO:6 SEQ ID NO:14 SEQ ID NO:15
6 h13C6f SEQ ID NO:5 SEQ ID NO:6 SEQ ID NO:20 SEQ ID NO:21
7 h13C6g SEQ ID NO:5 SEQ ID NO:6 SEQ ID NO:18 SEQ ID NO:19
8 h13C6h SEQ ID NO:5 SEQ ID NO:6 SEQ ID NO:16 SEQ ID NO:17
9 h13C6i SEQ ID NO:7 SEQ ID NO:8 SEQ ID NO:14 SEQ ID NO:15
10 h13C6j SEQ ID NO:7 SEQ ID NO:8 SEQ ID NO:20 SEQ ID NO:21
11 h13C6k SEQ ID NO:7 SEQ ID NO:8 SEQ ID NO:18 SEQ ID NO:19
12 h13C6l SEQ ID NO:7 SEQ ID NO:8 SEQ ID NO:16 SEQ ID NO:17
表2.人源化2G4抗体变体
变体 命名 VL序列 轻链序列 VH序列 重链序列
13 h2G4a SEQ ID NO:27 SEQ ID NO:28 SEQ ID NO:42 SEQ ID NO:43
14 h2G4b SEQ ID NO:27 SEQ ID NO:28 SEQ ID NO:44 SEQ ID NO:45
15 h2G4c SEQ ID NO:27 SEQ ID NO:28 SEQ ID NO:46 SEQ ID NO:47
16 h2G4d SEQ ID NO:27 SEQ ID NO:28 SEQ ID NO:48 SEQ ID NO:49
17 h2G4e SEQ ID NO:29 SEQ ID NO:30 SEQ ID NO:42 SEQ ID NO:43
18 h2G4f SEQ ID NO:29 SEQ ID NO:30 SEQ ID NO:44 SEQ ID NO:45
19 h2G4g SEQ ID NO:29 SEQ ID NO:30 SEQ ID NO:46 SEQ ID NO:47
20 h2G4h SEQ ID NO:29 SEQ ID NO:30 SEQ ID NO:48 SEQ ID NO:49
21 h2G4i SEQ ID NO:31 SEQ ID NO:32 SEQ ID NO:42 SEQ ID NO:43
22 h2G4j SEQ ID NO:31 SEQ ID NO:32 SEQ ID NO:44 SEQ ID NO:45
23 h2G4k SEQ ID NO:31 SEQ ID NO:32 SEQ ID NO:46 SEQ ID NO:47
24 h2G4l SEQ ID NO:31 SEQ ID NO:32 SEQ ID NO:48 SEQ ID NO:49
25 h2G4m SEQ ID NO:33 SEQ ID NO:34 SEQ ID NO:48 SEQ ID NO:49
26 h2G4n SEQ ID NO:35 SEQ ID NO:36 SEQ ID NO:42 SEQ ID NO:43
27 h2G4o SEQ ID NO:35 SEQ ID NO:36 SEQ ID NO:44 SEQ ID NO:45
28 h2G4p SEQ ID NO:35 SEQ ID NO:36 SEQ ID NO:48 SEQ ID NO:47
29 h2G4q SEQ ID NO:33 SEQ ID NO:34 SEQ ID NO:42 SEQ ID NO:43
30 h2G4r SEQ ID NO:33 SEQ ID NO:34 SEQ ID NO:44 SEQ ID NO:45
31 h2G4s SEQ ID NO:33 SEQ ID NO:34 SEQ ID NO:46 SEQ ID NO:47
32 h2G4t SEQ ID NO:35 SEQ ID NO:36 SEQ ID NO:46 SEQ ID NO:47
表3.人源化4G7抗体变体
在一个具体实施方案中，抗体分别包含SEQ ID NO:14和SEQ ID NO:7中的VH和VL序列，包括那些序列的翻译后修饰。在另一个具体实施方案中，抗体分别包含SEQ ID NO:42和SEQ ID NO:35中的VH和VL序列，包括那些序列的翻译后修饰。又在另一个具体实施方案中，抗体分别包含SEQ ID NO:70和SEQ ID NO:55中的VH和VL序列，包括那些序列的翻译后修饰。
在又一方面，本发明提供了结合与本文提供的抗埃博拉病毒糖蛋白抗体相同的表位的抗体。例如，在某些实施方案中，提供了与包含SEQ ID NO:12的VH序列和SEQ ID NO:1的VL序列的抗埃博拉病毒糖蛋白抗体结合相同表位的抗体。在其它实施方案中，提供了与包含SEQ ID NO:40的VH序列和SEQ ID NO:25的VL序列的抗埃博拉病毒糖蛋白抗体结合相同表位的抗体。又在其它实施方案中，提供了与包含SEQ ID NO:68的VH序列和SEQ ID NO:53的VL序列的抗埃博拉病毒糖蛋白抗体结合相同表位的抗体。在某些实施方案中，提供了与由氨基酸389-493(SEQ ID NO:91)组成的扎伊尔埃博拉病毒糖蛋白基因(例如，GenBank登录号L11365)的片段中的表位(也参见例如美国专利号7,335,356，其描述了被抗埃博拉病毒糖蛋白抗体13C6识别的表位)结合的抗体。在其它实施方案中，提供了与由氨基酸502-516(SEQ ID NO:92)组成的扎伊尔埃博拉病毒包膜糖蛋白(例如，UniProt ID：P87666)的片段中的表位(也参见例如美国专利号8,513,391，其描述了多种单克隆抗体的表位作图研究)结合的抗体。
在本发明的又一方面，根据任一上述实施方案的抗埃博拉病毒糖蛋白抗体是单克隆抗体，包括嵌合抗体、人源化抗体或人抗体。在一个实施方案中，抗埃博拉病毒糖蛋白抗体是抗体片段，例如Fv、Fab、Fab'、scFv、双体抗体(diabody)或F(ab’)2片段。在另一个实施方案中，抗体是如本文所定义的全长抗体，例如完整抗体或其它抗体类别或同种型(例如IgA1,IgA2,IgD,IgE,IgG1,IgG2,IgG3,IgG4或IgM)。
在又一个方面，根据任一上述实施方案的抗埃博拉皮病毒糖蛋白抗体可并入如以下1-7节所述的单独或组合的任何特征：
1.抗体亲和力
在某些实施方案中，本文提供的抗体具有≤1μM,≤100nM,≤10nM,≤1nM,≤0.1nM,≤0.01nM,或≤0.001nM(例如10-8M或更小，例如从10-8M至10-13M,例如从10-9M至10- 13M)的解离常数(Kd)。
在一个实施方案中，通过放射性标记的抗原结合测定法(RIA)测量Kd。在一个实施方案中，使用目的抗体的Fab形式和其抗原进行RIA。例如，通过以下方法测量Fab对抗原的溶液结合亲和力：在未标记抗原的滴定系列存在下用最小浓度的(125I)标记抗原平衡Fab，然后用抗Fab抗体包被的板捕获结合的抗原(参见例如Chen等人，J.Mol.Biol.293:865-881(1999))。为了建立测定条件，将多孔板(Thermo Scientific)用在50mM碳酸钠(pH9.6)中的5μg/ml捕获抗Fab抗体(Cappel Labs)包被过夜，并随后用PBS中的2％(w/v)牛血清白蛋白室温(约23℃)封闭2至5小时。在非吸附板(Nunc#269620)中，将100pM或26pM[125I]-抗原与目的Fab的系列稀释液混合(例如，与Presta等人,Cancer Res.57:4593-4599(1997)中评估抗VEGF抗体，Fab-12一致)。然后过夜温育目的Fab；但是，温育可以持续较长期间(例如约65小时)以确保达到平衡。此后，将混合物转移到捕获板中，在室温孵育(例如1小时)。然后除去溶液，并将板用PBS中的0.1％聚山梨酯20洗8次。当板已干燥时，加入150μl/孔的闪烁体(MICROSCINT-20TM；Packard)，并将板在TOPCOUNT TMγ计数器(Packard)上计数10分钟。选择给出小于或等于最大结合的20％的每个Fab的浓度用于竞争性结合测定法。
根据另一个实施方案，使用表面等离子体共振测定法来测量Kd。例如，使用或(BIAcore,Inc.,Piscataway,NJ)的测定法在25℃用约10个响应单位(RU)的固定化抗原CM5芯片进行。在一个实施方案中，根据供应商说明书，以盐酸N-乙基-N'-(3-二甲氨基丙基)-碳二亚胺(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)活化羧甲基化葡聚糖生物传感器芯片(CM5,BIACORE,Inc.)。抗原用10mM乙酸钠，pH4.8稀释至5μg/ml(约0.2μM)，随后以5μl/分钟的流速上样以实现偶联蛋白的大约10个响应单位(RU)。注射抗原后，注入1M乙醇胺以封闭未反应的基团。对于动力学测量，将Fab的两倍连续稀释物(0.78nM至500nM)在25℃以大约25μl/分钟的流速注射于具有0.05％聚山梨醇酯20(Tween-20TM)表面活性剂的PBS中(PBST)。使用简单的一对一朗格缪尔结合模型(评价软件3.2版)通过同时拟合缔合和解离传感图(sensorgram)，计算缔合速率(ka或kon)和解离速率(kd或koff)。将平衡解离常数(KD)计算为比率koff/kon。参见例如Chen等人,J.Mol.Biol.293:865-881(1999)。如果通过以上表面等离子体共振测定法显示缔合速率超过106M-1s-1，则缔合速率可以使用荧光猝灭技术测定，其中所述的荧光猝灭技术在如光谱仪(如配备止流法(stop-flow)的分光光度计(Aviv Instruments)或具有搅拌型比色皿的8000-系列SLM-AMINCOTM分光光度计(ThermoSpectronic))中所测量的增加浓度的抗原存在下，在25℃测量在PBS,pH 7.2中的20nM抗抗原抗体(Fab形式)的荧光发射强度(激发＝295nm；发射＝340nm，16nm带通)增加或减少。
2.抗体片段
在某些实施方案中，本文提供的抗体是抗体片段。抗体片段包括但不限于Fab、Fab’、Fab’-SH、F(ab’)2、Fv和scFv片段，以及下述其它片段。有关某些抗体片段的综述，参阅Hudson等人，Nat.Med.9:129-134(2003)。关于scFv片段的综述，参见例如Pluckthün，在The Pharmacology of Monoclonal Antibodies中,113卷,Rosenburg和Moore编著(Springer-Verlag,New York),pp.269-315(1994)；也见WO 93/16185；和美国专利号5,571,894和5,587,458。关于包含补救受体结合表位残基和具有增加的体内半寿期的Fab和F(ab')2片段的讨论，参见美国专利号5,869,046。
双体抗体(diabodies)是可能为二价或双特异性的具有两个抗原结合位点的抗体片段。参见例如EP 404,097；WO 1993/01161；Hudson等人,Nat.Med.9:129-134(2003)；和Hollinger等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:6444-6448(1993)。Hudson等人,Nat.Med.9:129-134(2003)中也描述了三体抗体(triabodies)和四体抗体(tetrabodies)。
单结构域抗体是包含抗体的全部或部分重链可变结构域或者全部或部分轻链可变结构域的抗体片段。在某些实施方案中，单结构域抗体是人单结构域抗体(Domantis,Inc.,Waltham,MA；参见例如美国专利号6,248,516B1)。
可以通过多种技术制备抗体片段，包括但不限于完整抗体的蛋白水解消化以及通过重组宿主细胞(例如，大肠杆菌或噬菌体)产生，如本文所述。
3.嵌合和人源化抗体
在某些实施方案中，本文提供的抗体是嵌合抗体。某些嵌合抗体例如在美国专利号4,816,567；和Morrison等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,81:6851-6855(1984))中描述。在一个例子中，嵌合抗体包含非人类可变区(例如，源自小鼠、大鼠、仓鼠、兔或非人灵长类如猴的可变区)和人类恒定区。在又一个例子中，嵌合抗体是“类转换”抗体，其中类或亚类已经相对亲本抗体发生改变。嵌合抗体包括其抗原结合其片段。
在某些实施方案中，嵌合抗体是人源化抗体。一般地，将非人抗体人源化以降低对人的免疫原性，同时保留亲本非人抗体的特异性和亲和力。通常，人源化抗体包含其中HVR例如CDR(或其部分)源自非人抗体并且FR(或其部分)源自人抗体序列的一个或多个可变结构域。人源化抗体任选地也将包含人恒定区的至少一部分。在一些实施方案中，将人源化抗体中的一些FR残基置换为来自非人类抗体(例如，从中衍生HVR残基的抗体)的相应残基，例如，以恢复或改善抗体特异性或亲和力。
用于鉴定FR中顺从于置换的残基的策略如下：(a)供体序列和接纳体序列的分析：可以从供体序列和接纳体序列对规范残基、链间包装残基、不寻常残基和糖基化位点的分析中鉴定从人体构架残基回到原始源残基的推定的点回复突变。在具体的实施方案中，已经显示保留源的规范残基和链间包装残基(例如参见抗体60.3和BR96)是重要的；(b)游标区和CDR-H3的分析：可以置换游标区中形成CDRs“平台”的、其上置有CDRs并因此潜在地影响它们的构象的残基。由于它们的极端可变性，没有对CDR-H3定义规范残基，因此应该注意该环以分析可能潜在地影响其构象的残基的结构模型；(c)对结合位点附近的分析：如果结构模型是可获得的，则应检查任何CDR残基5埃内残基的分析，因为这些残基可能与抗原结合，特别是如果这些残基通过对源序列的分析被分类为重要时应进行所述分析；(d)糖基化位点的分析：考虑是否去除潜在的糖基化位点，特别是如果存在于抗体的可获得结构模型的表面上时进行所述考虑，因为去除糖基化通常增强人源化抗体的亲合力。
人源化抗体和制造它们的方法综述于例如Almagro和Fransson，Front.Biosci.13:1619-1633(2008)中，并且例如还在Riechmann等人,Nature332:323-329(1988)；Queen等人,Proc.Nat’l Acad.Sci.USA 86:10029-10033(1989)；美国专利号5,821,337,7,527,791,6,982,321,和7,087,409；Kashmiri等人,Methods 36:25-34(2005)(描述特异性决定区(SDR)移植)；Padlan,Mol.Immunol.28:489-498(1991)(描述“表面重塑(resurfacing)”)；Dall'Acqua等人,Methods 36:43-60(2005)(描述“FR改组”)；和Osbourn等人,Methods 36:61-68(2005)和Klimka等人,Br.J.Cancer,83:252-260(2000)(描述针对FR改组的“导向选择”方案)中描述。
可以用于人源化的人构架区包括但不限于：使用“最佳配合”法选择的构架区(参见例如Sims等人,J.Immunol.151:2296(1993))；从具有特定亚组的轻链可变区或重链可变区的人抗体的共有序列衍生的构架区(参见例如Carter等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA，89:4285(1992)；和Presta等人,J.Immunol.,151:2623(1993))；人成熟(体细胞突变)构架区或人种系构架区(参见例如Almagro和Fransson,Front.Biosci.13:1619-1633(2008))；和从筛选FR文库衍生的构架区(参见例如Baca等人,J.Biol.Chem.272:10678-10684(1997)和Rosok等人,J.Biol.Chem.271:22611-22618(1996))。
4.人抗体
在某些实施方案中，本文提供的抗体是人抗体。可以使用本领域已知的多种技术产生人抗体。人抗体总体上在van Dijk和van de Winkel,Curr.Opin.Pharmacol.5:368-74(2001)和Lonberg,Curr.Opin.Immunol.20:450-459(2008)中描述。
可以通过施用免疫原至转基因动物制备人抗体，其中所述转基因动物已经被修饰成响应于抗原攻击而产生完整人抗体或具有人可变区的完整抗体。这类动物一般含有替换内源免疫球蛋白基因座或在染色体外存在或随机整合入动物染色体的全部或部分人免疫球蛋白基因座。在这类转基因小鼠中，内源免疫球蛋白基因座通常已经失活。关于从转基因动物获得人抗体的方法的综述，见Lonberg,Nat.Biotech.23:1117-1125(2005)。还参见例如描述XENOMOUSETM技术的美国专利号6,075,181和6,150,584；描述技术的美国专利号5,770,429；描述K-M技术的美国专利号7,041,870，和描述VELOCI技术的美国专利申请公开号US 2007/0061900)。可以进一步修饰来自这类动物产生的完整抗体的人可变区，例如，通过与不同的人类恒定区组合。
也可以通过基于杂交瘤的方法产生人抗体。已经描述了用于产生人单克隆抗体的人骨髓瘤细胞系和小鼠-人杂合骨髓瘤细胞系。(参见例如Kozbor J.Immunol.,133:3001(1984)；Brodeur等人,Monoclonal Antibody Production Techniques andApplications,第51-63页(Marcel Dekker,Inc.,New York,1987)；和Boerner等人,J.Immunol.,147:86(1991))。借助人B-细胞杂交瘤技术产生的人抗体也在Li等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA，103:3557-3562(2006)中描述。额外的方法包括例如在美国专利号7,189,826(描述从杂交瘤细胞系产生单克隆人IgM抗体)和Ni,Xiandai Mianyixue,26(4):265-268(2006)(描述人-人杂交瘤)中描述的那些。人杂交瘤技术(三体瘤技术)还在Vollmers和Brandlein,Histology and Histopathology,20(3):927-937(2005)以及Vollmers和Brandlein,Methods and Findings in Experimental and ClinicalPharmacology,27(3):185-91(2005)中描述。
也可以通过分离从人衍生的噬菌体展示文库中选择的Fv克隆可变结构域序列产生人抗体。这类可变结构域序列随后可以与所需的人恒定结构域组合。下文描述用于从抗体文库选出人抗体的技术。
5.文库衍生的抗体
可以通过对组合文库筛选具有所需活性或多种活性的抗体，分离本发明的抗体。例如，本领域已知用于产生噬菌体展示文库并对这类文库筛选拥有所需结合特征的抗体的多种方法。这类方法例如综述于Hoogenboom等人，引自Methods in Molecular Biology178:1-37(O'Brien等人编著,Human Press,Totowa,NJ,2001)中并且例如还在McCafferty等人,Nature 348:552-554；Clackson等人,Nature 352:624-628(1991)；Marks等人,J.Mol.Biol.222:581-597(1992)；Marks和Bradbury,引自Methods in MolecularBiology248:161-175(Lo编著,Human Press,Totowa,NJ,2003)；Sidhu等人,J.Mol.Biol.338(2):299-310(2004)；Lee等人,J.Mol.Biol.340(5):1073-1093(2004)；Fellouse,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 101(34):12467-12472(2004)；和Lee等人,J.Immunol.Methods 284(1-2):119-132(2004)中描述。
在某些噬菌体展示法中，VH基因和VL基因的库分别由聚合酶链反应(PCR)克隆并且在噬菌体文库中随机重组，其中随后可以对所述噬菌体文库筛选结合抗原的噬菌体，如Winter等人,Ann.Rev.Immunol.,12:433-455(1994)中所述。噬菌体一般将抗体片段展示为单链Fv(scFv)片段或展示为Fab片段。来自已免疫来源的文库提供针对免疫原的高亲和力抗体，无需构建杂交瘤。备选地，可以(例如，从人)克隆天然库以在不进行任何免疫的情况下，提供针对广泛类型非自身抗原的抗体和还针对自身抗原的抗体的单一来源，如Griffiths等人,EMBO J,12:725-734(1993)所述。最后，也可以通过从干细胞克隆未重排的V-基因区段并使用含有随机序列以编码高度可变的CDR3区并实现体外重排的PCR引物，合成地产生天然文库，如Hoogenboom和Winter,J.Mol.Biol.,227:381-388(1992)所述。描述人抗体噬菌体文库的专利公布例如包括：美国专利号5,750,373和美国专利公开号2005/0079574、2005/0119455、2005/0266000、2007/0117126、2007/0160598、2007/0237764、2007/0292936和2009/0002360。
认为从人抗体文库分离的抗体或抗体片段是本文中的人抗体或人抗体片段。
6.多特异性抗体
在某些实施方案中，本文提供的抗体是多特异性抗体，例如双特异性抗体。多特异性抗体是对至少两个不同位点具有结合特异性的单克隆抗体。在某些实施方案中，结合特异性之一是用于埃博拉病毒糖蛋白，其他结合特异性是任何其他抗原。在某些实施方案中，双特异性抗体可以结合至埃博拉病毒糖蛋白的两个不同表位。双特异性抗体也可用于将细胞毒性剂定位至埃博拉病毒或感染埃博拉病毒的表达埃博拉病毒糖蛋白的细胞。可以制备双特异性抗体为全长抗体或抗体片段。
用于制备多特异性抗体的技术包括但不限于具有不同特异性的两种免疫球蛋白重链-轻链对的重组共表达(参见Milstein和Cuello,Nature 305:537(1983)),WO 93/08829,和Traunecker等人,EMBO J.10:3655(1991))和“结入扣(knob-in-hole)”工程技术(参见例如美国专利号5,731,168)。也可以通过用于制备抗体Fc异二聚体分子的工程静电转向效应制备多特异性抗体(WO 2009/089004A1)；交联两个或多个抗体或片段(参见例如美国专利号4,676,980和Brennan等人，Science，229：81(1985))；使用亮氨酸拉链产生双特异性抗体(参见例如Kostelny等人,J.Immunol.,148(5):1547-1553(1992))；使用“双体抗体”技术制备双特异性抗体片段(参见例如Hollinger等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,90:6444-6448(1993))；和使用单链Fv(sFv)二聚体(参见例如Gruber等人,J.Immunol.,152:5368(1994))；和制备如Tutt等人J.Immunol.147:60(1991)所述的三特异性抗体。
具有三个或更多个功能性抗原结合位点(包括“章鱼抗体(Octopusantibodies)”)的工程抗体也包括在本文中(参见例如US 2006/0025576A1)。
本文的抗体或片段还包括包含与埃博拉病毒糖蛋白和另一不同抗原结合的抗原结合位点的“双作用FAb”或“DAF”(参见例如US 2008/0069820)。
7.抗体变体
在某些实施方案中，构思了本文提供的抗体的氨基酸序列变体。例如，可能想要改善抗体的结合亲和力和/或其他生物学特性。可以通过向编码抗体的核苷酸序列引入适宜修饰或通过肽合成制备抗体的氨基酸序列变体。此类修饰包括例如，从抗体的氨基酸序列内部缺失残基和/或将残基插入所述氨基酸序列中和/或置换所述氨基酸序列中的残基。可以产生缺失、插入和置换的任意组合以获得最终构建体，只要所述最终构建体拥有想要的特征，例如抗原结合作用。
a)置换变体、插入变体和缺失变体
在某些实施方案中，提供具有一个或多个氨基酸置换的抗体变体。用于置换诱变的目的位点包括HVR和FR。表4中在“优选的置换”标题下显示保守性置换。表4中在“示例性置换”标题下显示并且参考氨基酸侧链类别如下文进一步描述更明显的变化。可以将氨基酸置换引入目的抗体中并且对产物筛选所需的活性，例如，保留的/改善的抗原结合作用、降低的免疫原性或者改善的ADCC或CDC。
表4
氨基酸可以根据常见的侧链特性分组：
(1)疏水性：正亮氨酸、Met、Ala、Val、Leu；Ile；
(2)中性亲水：Cys、Ser、Thr、Asn；Gln；
(3)酸性：Asp、Glu；
(4)碱性：His、Lys、Arg；
(5)影响链方向的残基：Gly、Pro；
(6)芳族：Trp、Tyr、Phe。
非保守性置换将使这些分类之一的成员交换为另一个分类的成员。
一个置换变体类型涉及置换亲本抗体(例如，人源化或人抗体)的一个或多个高变区残基。通常，经选择用于进一步研究的所得变体相对于亲本抗体在某些生物学特性方面(例如，增加的亲和力、降低的免疫原性)具有修饰(例如，改善)和/或将具有亲本抗体的基本上保留的某些生物学特性。示例性置换变体是亲和力成熟抗体，所述抗体可以例如，使用基于噬菌体展示的亲和力成熟技术如本文所述的那些技术便利地产生。简而言之，将一个或多个HVR残基突变并且将变体抗体在噬菌体上展示并筛选特定生物学活性(例如结合亲和力)。
可以在HVR中做出改变(例如，置换)，例如以改善抗体亲和力。这类改变可以在HVR“热点”(即，在体细胞成熟过程期间以高频率经历突变的密码子所编码的残基(参见例如Chowdhury,Methods Mol.Biol.207:179-196(2008))和/或接触抗原的残基中做出，同时对所产生的变体VH或VL测试结合亲和力。已经例如在Hoogenboom等人，引自Methods inMolecular Biology 178:1-37(O'Brien等人编著，Human Press,Totowa,NJ,(2001))中描述了通过构建次级文库并从中重新选择实现亲和力成熟。在亲和力成熟的一些实施方案中，通过多种方法(例如，易错PCR、链改组或寡核苷酸定向诱变)的任一种，将多样性引入所选择用于成熟的可变基因中。随后产生次级文库。随后筛选该文库以鉴定具有所需亲和力的任何抗体变体。另一种引入多样性的方法涉及HVR指导的方案，其中将几种HVR残基(例如，一次4-6个残基)随机分组。可以特别地鉴定参与抗原结合的HVR残基，例如，使用丙氨酸扫描法诱变或建模。特别地经常靶向CDR-H3和CDR-L3。
在某些实施方案中，置换、插入或缺失可以在一个或多个HVR内部出现，只要这类改变不实质降低抗体结合抗原的能力。例如，可以在HVR中做出不实质降低结合亲和力的保守性改变(例如，如本文中提供的保守性置换)。这类改变可以例如在HVR中接触抗原的残基之外作出。在上文提供的变体VH和VL序列的某些实施方案中，每个HVR不予改变或含有不多于一个、两个或三个氨基酸置换。
一种用于鉴定可以被靶向以便诱变的抗体残基或区域的有用方法称作“丙氨酸扫描法诱变法”，如Cunningham和Wells(1989)Science,244:1081-1085所述。在这种方法中，鉴定一个残基或靶残基组(例如，带电荷残基如arg、asp、his、lys和glu)并且用中性或带负电荷的氨基酸(例如，丙氨酸或聚丙氨酸)替换以确定该抗体与抗原的相互作用是否受影响。可以在对于初始置换显示功能敏感的氨基酸位置处引入其他置换。备选地或额外地，测定抗原-抗体复合物的晶体结构以鉴定抗体和抗原之间的接触点。可以将这类接触残基和邻近残基作为置换候选物打靶或消除。可以筛选变体以确定它们是否含有所需的特性。
氨基酸序列插入包括长度从1个残基至含有成百个或更多个残基的多肽间变动的氨基端和/或羧基端融合，以及单个或多个氨基酸残基的序列内插入。末端插入的例子包括具有N末端甲硫氨酰基残基的抗体。抗体分子的其他插入性变体包括抗体的N末端或C末端与酶(例如针对ADEPT的酶)或增加该抗体血清半寿期的多肽融合。
b)糖基化变体
在某些实施方案中，改变本文提供的抗体以增加或减少抗体被糖基化的程度。可以通过改变氨基酸序列使得产生或除去一个或多个糖基化位点来方便地实现对抗体的糖基化位点的添加或删除。
当抗体包含Fc区时，可以改变与其连接的糖。由哺乳动物细胞产生的天然抗体通常包含分支的双触角寡糖，其通常通过N连接与Fc区CH2结构域的Asn297连接。参见例如Wright等人TIBTECH 15:26-32(1997)。该寡糖可以包括多种糖，例如甘露糖、N-乙酰葡糖胺(GlcNAc)、半乳糖和唾液酸，以及连接到双触角寡糖结构的“茎”中的GlcNAc的岩藻糖。在一些实施方案中，可以在本发明的抗体中进行寡糖修饰以产生具有某些改进性质的抗体变体。
在一个实施方案中，提供具有糖结构的抗体变体，其缺乏与Fc区(直接或间接)连接的岩藻糖或具有降低的岩藻糖基化。需要坚固和稳定地产生具有固定质量的完全非岩藻糖化治疗性抗体用于开发治疗性抗体，因为非岩藻糖化治疗性抗体分子的高水平ADCC功效通过岩藻糖基化的对应物经由竞争结合靶细胞上的抗原而在体内降低(参见例如Yamane-Ohnuki等人,(2009)Mabs.1(3):230-236,Mori等人,(2007)Cytotechnology.55(2-3):109-114)。本发明利用可以稳定地产生完全非岩藻糖化抗体的哺乳动物宿主细胞系，并且这些抗体具有下文实施例1-4中详述的有益特征。在多个方面，本发明还涉及产生具有受控的岩藻糖基化的抗体。
在具体实施方案中，例如，此抗体中岩藻糖的量可以为0％至1％、0％至2％、1％至80％、1％至65％、5％至65％或20％到40％。岩藻糖的量通过计算相对于连接至Asn 297的所有糖结构的总和(例如复合的、杂合的和高甘露糖结构)而言糖链中Asn297处的岩藻糖平均量来确定，这例如如WO 2008/077546所述通过MALDI-TOF质谱法测定。Asn297是指位于Fc区的约297位的天冬酰胺残基(Fc区残基的Eu编号)；但是，由于抗体中较小的序列变异，Asn297也可以位于297位上游或下游的约±3个氨基酸之间，即位置294和300之间。此类岩藻糖基化变体可具有改善的ADCC功能。参见例如美国专利公开号US2003/0157108(Presta,L.)；US 2004/0093621(Kyowa Hakko Kogyo Co.,Ltd)。与“脱岩藻糖基化”或“岩藻糖缺乏的”抗体变体相关的出版物的实例包括：US2003/0157108；WO 2000/61739；WO 2001/29246；US 2003/0115614；US2002/0164328；US 2004/0093621；US 2004/0132140；US 2004/0110704；US2004/0110282；US 2004/0109865；WO 2003/085119；WO 2003/084570；WO2005/035586；WO 2005/035778；WO2005/053742；WO2002/031140；Okazaki等人J.Mol.Biol.336:1239-1249(2004)；Yamane-Ohnuki等人Biotech.Bioeng.87:614(2004)。能够产生脱岩藻糖基化(或非岩藻糖基化)抗体的细胞系的实例包括缺乏蛋白质岩藻糖基化的Lec13CHO细胞(Ripka等人Arch.Biochem.Biophys.249:533-545(1986)；美国专利申请号US 2003/0157108A1，Presta,L；和WO 2004/056312A1,Adams等人,尤其在实施例11中)和敲除细胞系，如α-1,6-岩藻糖基转移酶基因FUT8敲除的CHO细胞(参见例如Yamane-Ohnuki等人Biotech.Bioeng.87:614(2004)；Kanda,Y.等人,Biotechnol.Bioeng.,94(4):680-688(2006)；和WO2003/085107)。
还提供了抗体变体，其具有二部分的寡糖(bisected oligosaccharides)，例如其中与抗体Fc区连接的双触角寡糖被GlcNAc分成二部分。这样的抗体变体可以具有降低的岩藻糖基化和/或改善的ADCC功能。此类抗体变体的实例描述于例如WO 2003/011878(Jean-Mairet等人)；美国专利号6,602,684(Umana等人)；和US 2005/0123546(Umana等人)。还提供了与Fc区连接的寡糖中具有至少一个半乳糖残基的抗体变体。这样的抗体变体可以具有改善的CDC功能。这样的抗体变体描述于例如WO 1997/30087(Patel等人)；WO1998/58964(Raju,S.)；和WO 1999/22764(Raju,S.)中。
c)Fc区变体
在某些实施方案中，可以将一个或多个氨基酸修饰引入本文提供的抗体的Fc区，从而产生Fc区变体。Fc区变体可以包含在一个或多个氨基酸位置处包含氨基酸修饰(例如置换)的人Fc区序列(例如人IgG1，IgG2，IgG3或IgG4Fc区)。
在某些实施方案中，本发明考虑了具有一些但不是全部效应子功能的抗体变体，这使得该抗体变体是下述应用所希望的候选物，在所述应用中抗体的体内半寿期重要但某些效应子功能(如补体和ADCC)是不必要的或有害的。可以进行体外和/或体内细胞毒性测定以确认CDC和/或ADCC活性的减少/消耗。例如，可以进行Fc受体(FcR)结合测定以确保抗体缺乏FcγR结合(因此可能缺乏ADCC活性)，但保留FcRn结合能力。介导ADCC的主要细胞NK细胞仅表达FcγRIII，而单核细胞表达FcγRI、FcγRII和FcγRIII。Ravetch和Kinet,Annu.Rev.Immunol.9:457-492在第464页的表3中总结了造血细胞上的FcR表达。评估目的分子的ADCC活性的体外测定法的非限制性实例描述于美国专利号5,500,362(参见例如Hellstrom,I.等人Proc.Nat’l Acad.Sci.USA83:7059-7063(1986))和Hellstrom,I等人,Proc.Nat’l Acad.Sci.USA82:1499-1502(1985)；5,821,337(参见Bruggemann,M.等人,J.Exp.Med.166:1351-1361(1987))。备选地，可以使用非放射性测定法(参见例如ACTITM非放射性细胞毒性测定法用于流式细胞术(CellTechnology,Inc.Mountain View,CA；和CytoTox非放射性细胞毒性测定法(Promega,Madison,WI)。用于这类测定法的有用的效应细胞包括外周血单个核细胞(PBMC)和天然杀伤(NK)细胞。备选地或额外地，可以在体内评估目的分子的ADCC活性，例如在动物模型中，例如Clynes等人Proc.Nat’lAcad.Sci.USA 95:652-656(1998)中所公开。还可以实施C1q结合测定法以确认抗体不能结合C1q，因此缺乏CDC活性。参见例如WO 2006/029879和WO 2005/100402中的C1q和C3c结合ELISA。为了评估补体激活，可以实施CDC测定法(参见例如Gazzano-Santoro等人,J.Immunol.Methods 202:163(1996)；Cragg,M.S.等人,Blood 101:1045-1052(2003)；和Cragg,M.S.和M.J.Glennie,Blood103:2738-2743(2004))。也可以使用本领域已知的方法实施FcRn结合和体内清除/半寿期测定(参见例如Petkova,S.B.等人,Int’l.Immunol.18(12):1759-1769(2006))。
具有降低的效应子功能的抗体包括具有Fc区残基238,265,269,270,297,327和329中的一个或多个被置换的抗体(美国专利号6,737,056)。这类Fc突变体包括在氨基酸位置265、269、270、297和327中的两个或多个氨基酸位置具有置换的Fc突变体，包括将残基265和297置换为丙氨酸的所谓“DANA”Fc突变体(美国专利号7,332,581)。
描述了具有改善或减弱的FcR结合的某些抗体变体。(参见例如美国专利号6,737,056；WO 2004/056312,和Shields等人,J.Biol.Chem.9(2):6591-6604(2001)。)
在某些实施方案中，抗体变体包含具有改善ADCC的一个或多个氨基酸置换的Fc区，例如Fc区的位置298、333和/或334位的置换(EU编号的残基)。
在一些实施方案中，在Fc区进行改变，所述改变导致改变的(即，改善的或减弱的)C1q结合和/或补体依赖的细胞毒性(CDC)，例如美国专利号6,194,551,WO 99/51642,和Idusogie等人J.Immunol.164:4178-4184(2000)中的描述。
具有增加的半寿期和改善的新生儿Fc受体(FcRn)结合的抗体负责将母体IgG转移到胎儿(Guyer等人,J.Immunol.117:587(1976)和Kim等人,J.Immunol.24:249(1994))，所述抗体描述于US2005/0014934A1(Hinton等人)。那些抗体包含具有一个或多个置换的Fc区，所述置换改善Fc区与FcRn的结合。此类Fc变体包括具有在一个或多个Fc区残基处：238,256,265,272,286,303,305,307,311,312,317,340,356,360,362,376,378,380,382,413,424或434的置换，例如Fc区残基434的置换(美国专利号7,371,826)的那些Fc变体。
也参见涉及Fc区变体的其它实例的Duncan&Winter,Nature 322:738-40(1988)；美国专利号5,648,260；美国专利号5,624,821；和WO 94/29351。
d)半胱氨酸工程化抗体变体
在某些实施方案中，可能想要产生半胱氨酸工程化的抗体，例如，“硫代MAb”，其中抗体的一个或多个残基用半胱氨酸残基置换。在具体的实施方案中，置换的残基出现在抗体的可及位点处。通过用半胱氨酸置换这些残基，因而将反应性巯基安置在抗体的可及位点处并且可以用来使抗体缀合至其他部分，如药物部分或接头-药物部分以产生免疫缀合物，如本文中进一步所述。在某些实施方案中，可以用半胱氨酸置换以下残基的任何一个或多个：轻链的V205(Kabat编号)、重链的A118(EU编号)和重链Fc区的S400(EU编号)。可以如美国专利号7,521,541中所述那样产生半胱氨酸工程化的抗体。
e)抗体衍生物
在某些实施方案中，可以进一步修饰本文提供的抗体以含有本领域已知并轻易可获得的额外的非蛋白质部分。适于衍生抗体的部分包括但不限于水溶性聚合物。水溶性聚合物的非限制性例子包括但不限于聚乙二醇(PEG)、乙二醇/丙二醇的共聚物、羧甲基纤维素、葡聚糖、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、聚1,3-二氧戊环、聚1,3,6-三烷、亚乙基/马来酐共聚物、聚氨基酸(均聚物或无规共聚物)和葡聚糖或聚(n-乙烯基吡咯烷酮)聚乙二醇、丙二醇均聚物、聚环氧丙烷/环氧乙烷共聚物、聚氧乙基化多元醇(例如，丙三醇)、聚乙烯醇和它们的混合物。聚乙二醇丙醛可以具有制造方面的优点，原因在于其在水中的稳定性。这种聚合物可以具有任何分子量，并可以是分枝或不分枝的。与抗体连接的聚合物的数目可以变动，并且如果连接多于一个聚合物，它们可以是相同或不同的分子。通常，用于衍生化的聚合物的数目和/或类型可以基于以下考虑事项确定，包括但不限于待改善的抗体特定特性或功能、抗体衍生物是否将用于限定情况下的疗法中等等。
在另一个实施方案中，提供了抗体和可以通过暴露于辐射而选择性加热的非蛋白质部分的缀合物。在一个实施方案中，非蛋白质部分是碳纳米管(Kam等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 102:11600-11605(2005))。辐射可以具有任何波长，并包括，但不限于这样的波长，所述波长不伤害普通细胞，但是使非蛋白质部加热至杀伤临近于抗体-非蛋白质部分的细胞的温度。
B.重组方法和组合物
可以使用重组方法和组合物产生抗体，例如如美国专利号4,816,567中所述。在一个实施方案中，提供了编码本文所述的抗埃博拉病毒糖蛋白抗体的分离的核酸。这样的核酸可以编码包含抗体的VL氨基酸序列和/或包含抗体的VH氨基酸序列的氨基酸序列(例如抗体的轻链和/或重链)。在另一个实施方案中，提供了一种或多种包含该核酸的载体(例如，表达载体)。在另一个实施方案中，提供了包含这种核酸的宿主细胞。在一个这样的实施方案中，宿主细胞包含(例如，宿主细胞已经用以下转化)：(1)载体，所述载体包含编码含有抗体VL的氨基酸序列和含有抗体VH的氨基酸序列的核酸，或(2)包含编码含有抗体VL的氨基酸序列的核酸的第一载体和包含编码含有抗体VH的氨基酸序列的核酸的第二载体。在一个实施方案中，宿主细胞是真核生物细胞，例如中国仓鼠卵巢(CHO)细胞或淋巴样细胞(例如Y0、NS0、Sp20细胞)。在一个实施方案中，宿主细胞是植物细胞，例如烟草植物细胞(例如，烟草BY-2细胞，参见例如Nagata等人,(1992)Inter.Rev.Cyto 132:1-30,Kirchhoff等人,(2012)Plant Biotechnol.J.10.8:936-944)。在其他实施方案中，宿主细胞是能够产生脱岩藻糖基化(或非岩藻糖基化)抗体的细胞，例如缺乏蛋白质岩藻糖基化的Lec13CHO细胞(Ripka等人Arch.Biochem.Biophys.249:533-545(1986)；美国专利申请号US 2003/0157108A1,Presta,L；和WO 2004/056312A1,Adams等人,尤其在实施例11中)和敲除细胞系，如α-1,6-岩藻糖基转移酶基因FUT8敲除的CHO细胞(参见例如Yamane-Ohnuki等人Biotech.Bioeng.87:614(2004)；Kanda,Y.等人,Biotechnol.Bioeng.,94(4):680-688(2006)；和WO2003/085107)。在一个实施方案中，提供了制备抗埃博拉病毒糖蛋白抗体的方法，其中所述方法包括在适于表达所述抗体的条件下培养包含编码该抗体的核酸的宿主细胞，如上所述，和任选地从所述宿主细胞(或宿主细胞培养基)回收抗体。
为了重组生产抗埃博拉病毒糖蛋白抗体，分离编码如上所述的抗体的核酸，并将其插入一个或多个载体中用于进一步克隆和/或在宿主细胞中表达。可以使用常规方法(例如，通过使用能够特异性结合编码抗体的重链和轻链的基因的寡核苷酸探针)容易地分离和测序此种核酸。
用于克隆或表达编码抗体的载体的合适宿主细胞包括本文所述的原核或真核细胞。例如，可以在细菌中产生抗体，特别是当不需要糖基化和Fc效应子功能时可以在细菌中产生抗体。对于在细菌中表达抗体片段和多肽，参见例如美国专利号5,648,237,5,789,199,和5,840,523(也参见Charlton,Methods in Molecular Biology,Vol.248(B.K.C.Lo编著,Humana Press,Totowa,NJ,2003),pp.245-254，其描述了在大肠杆菌中表达抗体片段)。抗体表达后，可以从可溶性级分中的细菌细胞糊中分离抗体，并可进一步纯化。
除原核生物之外，真核微生物如丝状真菌或酵母是编码抗体的载体的合适克隆宿主或表达宿主，包括其糖基化途径已经“人源化”的真菌和酵母菌株，导致产生具有部分或完全人类糖基化模式的抗体。见Gerngross,Nat Biotech 22,1409-1414(2004)和Li等人,Nat Biotech 24,210-215(2006)。
用于表达(糖基化)抗体的合适宿主细胞还源自多细胞生物(无脊椎动物和脊椎动物)。无脊椎动物细胞的例子包括植物细胞和昆虫细胞。已经鉴定了可以与昆虫细胞一起使用、尤其用于转染草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda)细胞的众多杆状病毒毒株。
也可以利用植物细胞培养物作为宿主。见，例如美国专利号5,959,177、6,040,498、6,420,548、7,125,978和6,417,429(描述在转基因植物中产生抗体的PLANTIBODIESTM技术)；Fischer等人,(2003)Vaccine 21:820-825(描述在植物中产生抗体)。
也可以使用脊椎动物细胞作为宿主。例如，适应于悬浮培育的哺乳动物细胞系可以是有用的。有用的哺乳动物宿主细胞系的其他例子是由SV40转化的猴肾CV1系(COS-7)；人胚肾系(293或293T细胞，如Graham等人,J Gen Virol36,59(1977)中所述那样)、幼仓鼠肾细胞(BHK)、小鼠支持细胞(如在例如Mather,Biol Reprod 23,243-251(1980)中所述的TM4细胞)、猴肾细胞(CV1)、非洲绿猴肾细胞(VERO-76)、人宫颈癌细胞(HELA)、犬肾细胞(MDCK)、布法罗大鼠肝脏细胞(BRL 3A)、人肺细胞(W138)、人肝脏细胞(Hep G2)、小鼠乳腺瘤细胞(MMT060562)、TRI细胞(如在例如Mather等人,Annals N.Y.Acad Sci 383,44-68(1982中所述那样))、MRC5细胞和FS4细胞。其他有用的哺乳动物宿主细胞系包括中国仓鼠卵巢(CHO)细胞，包括DHFR-CHO细胞(Urlaub等人,Proc Natl Acad Sci USA 77,4216(1980))；和骨髓瘤细胞系如Y0、NS0和Sp2/0。其他有用的哺乳动物宿主细胞系也包括缺乏蛋白质岩藻糖基化的Lec13CHO细胞(Ripka等人Arch.Biochem.Biophys.249:533-545(1986)；美国专利申请号US 2003/0157108A1,Presta,L；和WO 2004/056312A1,Adams等人,尤其在实施例11中)和敲除细胞系，如α-1,6-岩藻糖基转移酶基因FUT8敲除的CHO细胞(参见例如Yamane-Ohnuki等人Biotech.Bioeng.87:614(2004)；Kanda,Y.等人,Biotechnol.Bioeng.,94(4):680-688(2006)；和WO2003/085107)。对于适用于抗体生产的某些哺乳动物宿主细胞系的综述，参见例如Yazaki和Wu,Methods in Molecular Biology,Vol.248(B.K.C.Lo编著,Humana Press,Totowa,NJ),pp.255-268(2003)。
C.测定法
可以通过本领域已知的多种测定法，鉴定、筛选或表征本文提供的抗埃博拉病毒糖蛋白抗体的物理/化学特性和/或生物学活性。
1.结合测定法和其他测定法
在一个方面，例如，通过已知的方法如ELISA、蛋白质印迹法等，对本发明的抗体测试其抗原结合活性。
在另一个方面，竞争测定法可以用来鉴定与具有表1-3中所列的VH和VL序列或者具有重链和轻链序列的一种或多种人源化抗埃博拉抗体竞争结合于埃博拉病毒糖蛋白的抗体。在某些实施方案中，这种竞争性抗体与具有表1-3中所列的VH和VL序列或者具有重链和轻链序列的一种或多种人源化抗埃博拉抗体结合的相同表位(例如线性表位或构象表位)结合。用于定位与抗体结合的表位的详细示例性方法在Morris(1996)“EpitopeMapping Protocols(表位定位法)”,引自Methods in Molecular Biology第66卷(HumanaPress,Totowa,NJ)中提供。
在一个示例性竞争测定法中，将固定的埃博拉病毒糖蛋白在包含结合埃博拉病毒糖蛋白的第一标记抗体(例如，具有表1-3中所列的VH和VL序列或者具有重链和轻链序列的一种或多种人源化抗埃博拉抗体)和第二未标记抗体的溶液中温育，其中测试第二未标记抗体与第一抗体竞争结合埃博拉病毒糖蛋白的能力。第二抗体可存在于杂交瘤上清液中。作为对照，将固定的埃博拉病毒糖蛋白在包含第一标记抗体但不含第二未标记抗体的溶液中温育。在允许第一抗体与埃博拉病毒糖蛋白结合的条件下温育后，除去过量未结合的抗体，并测量与固定的埃博拉病毒糖蛋白缔合的标记量。如果测试样品与对照样品相比，与固定的埃博拉病毒糖蛋白缔合的标记量实质地降低，则表明第二抗体与第一抗体竞争结合埃博拉病毒糖蛋白。参见Harlow和Lane(1988)Antibodies:A Laboratory Manual ch.14(Cold Spring Harbor Laboratory,Cold Spring Harbor,NY)。
2.活性测定法
在一个方面，提供了用于鉴定具有生物学活性的抗埃博拉病毒糖蛋白抗体的测定法。生物学活性可包括例如抑制埃博拉病毒的蚀斑形成、保护免受感染和/或感染后延长的存活。
在某些实施方案中，通过例如体外蚀斑减少中和测定法来测试本发明抗体的这种生物学活性。蚀斑测定法可以例如使用汇合的Vero-E6细胞进行。为了评估埃博拉病毒中和抗体的存在，可以将抗体稀释液与100pfu小鼠适应的埃博拉病毒在37℃混合1小时，并用于感染Vero E6细胞。然后用琼脂糖上层(overlay)覆盖细胞(Moe,J.等人(1981)J.Clin.Microbiol.13:791-793)，并在6天后加入在PBS或琼脂糖中含有5％中性红溶液的第二上层。翌日计数蚀斑。确定终点滴度为抗体的最后稀释度，其减少了80％对照孔的蚀斑数。关于体外蚀斑减少中和测定法的更多细节参见例如WO 2010/016183。
在其它实施方案中，还可以对本发明抗体测试体内生物学活性(例如，保护免受感染和/或感染后延长的存活)。例如，为了确定本发明的抗埃博拉病毒糖蛋白抗体的预防和/或治疗益处，可以在用小鼠适应的埃博拉扎伊尔病毒攻击之前24小时和/或在用小鼠适应的埃博拉扎伊尔病毒攻击后1、2或3天将纯化的抗体或抗体组合腹膜内注射入BALB/c或C57BL/6小鼠。小鼠中的埃博拉病毒感染可以通过腹膜内接种10pfu小鼠适应的埃博拉扎伊尔1976病毒进行。然后在感染后监测动物的发病率和死亡率28天，使用和不使用抗埃博拉病毒糖蛋白抗体治疗(关于小鼠研究的进一步细节，参见例如WO 2010/016183)。对于灵长类动物和豚鼠的额外的体内生物学测定，参见例如Qiu等人，(2014)Nature 514:47-53,U.S.P.N.8,513,391。
D.免疫缀合物
本发明也提供了包含与一种或多种细胞毒性剂如化疗剂或药物、生长抑制剂、毒素(例如，细菌源、真菌源、植物源或动物源的蛋白质毒素、酶活性毒素)或放射性同位素缀合的本文抗埃博拉病毒糖蛋白抗体的免疫缀合物。
在一个实施方案中，免疫缀合物是抗体-药物缀合物(ADC)，其中抗体与一种或多种药物缀合，所述药物包括但不限于类美登素(maytansinoid)(见美国专利号5,208,020，5,416,064和欧洲专利EP0 425 235B1)；澳瑞司他汀如单甲基澳瑞司他汀药物部分DE和DF(MMAE和MMAF)(见美国专利号5,635,483和5,780,588和7,498,298)；海兔毒素(dolastatin)；刺孢霉素或其衍生物(见美国专利号5,712,374,5,714,586,5,739,116,5,767,285,5,770,701,5,770,710,5,773,001和5,877,296；Hinman等人,Cancer Res.53:3336-3342(1993)；和Lode等人,Cancer Res.58:2925-2928(1998))；蒽环类如柔红霉素或多柔比星(见Kratz等人,Current Med.Chem.13:477-523(2006)；Jeffrey等人,Bioorganic&Med.Chem.Letters 16:358-362(2006)；Torgov等人,Bioconj.Chem.16:717-721(2005)；Nagy等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 97:829-834(2000)；Dubowchik等人,Bioorg.&Med.Chem.Letters 12:1529-1532(2002)；King等人,J.Med.Chem.45:4336-4343(2002)；和美国专利号6,630,579)；甲氨蝶呤；长春地辛；紫杉烷如多西紫杉醇、紫杉醇、larotaxel、tesetaxel和ortataxel；单端孢霉烯族化合物；和CC1065。
在另一个实施方案中，免疫缀合物包含与酶活性毒素或其片段缀合的如本文所述的抗体，所述酶活性毒素或其片段包括但不限于白喉毒素A链、白喉毒素的无结合活性片段、外毒素A链(来自铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa))、蓖麻毒蛋白A链、相思豆毒蛋白A链、蒴莲根毒蛋白A链、α-帚曲菌素、油桐(Aleurites fordii)蛋白、香石竹毒蛋白、垂序商陆(Phytolaca americana)蛋白(PAPI、PAPII和PAP-5)、苦瓜(momordica charantia)抑制蛋白、麻疯树毒蛋白、巴豆毒蛋白、肥皂草(sapaonaria officinalis)抑制蛋白、多花白树毒蛋白、丝林霉素(mitogellin)、局限曲菌素、酚霉素、伊诺霉素和单端孢霉烯族类化合物。
在另一个实施方案中，免疫缀合物包含与放射性原子缀合以形成放射缀合物的如本文所述的抗体。多种放射性同位素可用于产生放射缀合物。例子包括At211、I131、I125、Y90、Re186、Re188、Sm153、Bi212、P32、Pb212和Lu的放射性同位素。当放射缀合物用于检测时，它可以包含用于闪烁法研究的放射性原子，例如tc99m或I123，或核磁共振(NMR)成像的自旋标记物(也称作磁共振成像，mri)，再次如碘-123、碘-131、铟-111、氟-19、碳-13、氮-15、氧-17、钆、锰或铁。
可以使用多种双官能蛋白质偶联剂产生抗体和细胞毒性剂的缀合物，所述双官能蛋白质偶联剂如N-琥珀酰亚胺基-3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酯(SPDP)、4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸琥珀酰亚胺酯(SMCC)、亚氨基硫烷(IT)、亚氨酯的双官能衍生物(如己二亚氨盐酸二甲酯)、活性酯(如辛二酸二琥珀酰亚胺酯)、醛(如戊二醛)、双-叠氮化合物(如双(对-重氮盐苯甲酰基)己二胺)、双-重氮盐衍生物(如双-(对-重氮盐苯甲酰基)-乙二胺)、二异氰酸酯(如2,6-二异氰酸甲苯酯)和双活性氟化合物(如1,5-二氟-2,4-二硝基苯)。例如，可以如Vitetta等人,Science 238:1098(1987)中所述那样制备蓖麻毒蛋白免疫毒素。碳-14-标记的1-异硫氰酸根合苄基-3-甲基二乙三胺五乙酸(MX-DTPA)是用于放射性核素与抗体缀合的示例性螯合剂。见WO94/11026。接头可以是促进细胞毒性剂在细胞中释放的“可切割接头”。例如，可以使用酸不稳定接头、肽酶敏感的接头、光不稳定接头、二甲基接头或含有二硫键的接头(Chari等人,Cancer Res.52:127-131(1992)；美国专利号5,208,020)。
免疫缀合物或ADC在本文中明确地构思，但不限于采用交联剂试剂制备的这类缀合物，所述交联剂试剂包括但不限于BMPS、EMCS、GMBS、HBVS、LC-SMCC、MBS、MPBH、SBAP、SIA、SIAB、SMCC、SMPB、SMPH、磺基-EMCS、磺基-GMBS、磺基-KMUS、磺基-MBS、磺基-SIAB、磺基-SMCC、和磺基-SMPB、和可商业获得的SVSB(琥珀酰亚胺基-(4-乙烯砜)苯甲酸酯)(例如，获自PPierce Biotechnology,Inc.，Rockford，伊利诺伊州，美国)。
E.用于诊断和检测的方法和组合物
在某些实施方案中，本文提供的任一抗埃博拉病毒糖蛋白抗体可用于检测埃博拉病毒糖蛋白在生物样品中的存在。如本文所用，术语“检测”涵盖定量或定性检测。在某些实施方案中，生物样品包括例如EDTA中的全血、血清、鼻液或口腔拭子。
在一个实施方案中，提供了在诊断或检测方法中使用的抗埃博拉病毒糖蛋白抗体。在又一个方面，提供一种检测埃博拉病毒糖蛋白在生物样品中存在的方法。在某些实施方案中，该方法包括使生物样品与如本文所述的抗埃博拉病毒糖蛋白抗体在允许抗埃博拉病毒糖蛋白抗体与埃博拉病毒糖蛋白结合的条件下接触并且检测复合物是否在抗埃博拉病毒糖蛋白抗体和埃博拉病毒糖蛋白之间形成。这种方法可以是体外或体内方法。在一个实施方案中，将抗埃博拉病毒糖蛋白抗体用来选择对采用抗埃博拉病毒糖蛋白抗体的疗法敏感的受试者，例如其中埃博拉病毒糖蛋白是用于选择患者的生物标记物。
其他诊断或检测方法包括：(a)基本血液检查：感染的早期阶段的特征在于：血小板减少症、白细胞减少症和明显的淋巴细胞减少症。几天后进展为中性白细胞增多症，天冬氨酸转氨酶和丙氨酸转氨酶升高。胆红素可能正常或略高。随着无尿症的发病，血液尿素氮和血清肌酸酐增加。终末期病人可能会进展为代谢性酸中毒，这可能有助于观察这些患者经常有呼吸急促，这可能是补偿性过度换气的尝试；(b)分离病毒的研究：确定的诊断依赖于通过组织培养或逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)测试法分离病毒。在组织培养中分离埃博拉病毒是一种高风险程序，只能在世界上一些高风险控制的实验室中安全实施；(c)抗体和抗原的血清学测试：间接荧光抗体测试(IFAT)与假阳性结果相关。对该测试的敏感性和实用性的关注已经导致确认性血清学测试的发展。在存活长的足以产生免疫应答的受感染患者中，免疫球蛋白M(IgM)和免疫球蛋白G(IgG)酶联免疫吸附测定法(ELISA)测试可用于诊断埃博拉病毒感染。已经显示这两种ELISA测试是敏感的和特异性的。IgM捕获ELISA使用在Vero E6细胞中生长的扎伊尔埃博拉病毒抗原来检测针对该毒株的IgM抗体。感染后6天内，实验用灵长类动物中结果变为阳性，但不长时间保持阳性。这些性质表明IgM测试可用于记录急性埃博拉病毒感染。IgG捕获ELISA使用去污剂提取的病毒抗原来检测IgG抗埃博拉抗体。它比IFAT更特异，且它长期保持阳性。可以使用抗原检测ELISA测试来鉴定埃博拉病毒抗原。用于证实埃博拉病毒感染的诊断的其他方法包括在取自死于埃博拉出血热的患者的经福尔马林固定的死后皮肤上进行的免疫组织化学测试。
可以使用本发明抗体诊断的示例性病症包括埃博拉病毒疾病和埃博拉病毒感染。
在某些实施方案中，提供了标记的抗埃博拉病毒糖蛋白抗体。标记物包括但不限于，直接检测到的标记物或部分(如荧光、发色、电子致密、化学发光和放射性的标记物)，以及间接检测到(例如借助酶促反应或分子相互作用)的部分，如酶或配体。示例性标记物包括但不限于放射性同位素32P、14C、125I、3H和131I、荧光团如稀土元素螯合物或荧光素及其衍生物、罗丹明及其衍生物、丹磺酰、伞形酮、萤光素酶例如萤火虫萤光素酶和细菌萤光素酶(美国专利号4,737,456)、萤光素、2,3-二氢二氮杂萘二酮、辣根过氧化物酶(HRP)、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶、葡糖淀粉酶、溶菌酶、糖氧化酶例如葡萄糖氧化酶、半乳糖氧化酶和葡萄糖-6-磷酸脱氢酶、杂环氧化酶如尿酸酶和黄嘌呤氧化酶，其与利用过氧化氢来氧化染料前体的酶如HRP、乳过氧化物酶或微过氧化物酶偶联，生物素/亲和素、自旋标记物、噬菌体标记物、稳定的自由基等。
F.药物制剂
通过以下方式制备冻干制剂或水溶液剂形式的如本文所述的抗埃博拉病毒糖蛋白抗体的药物制剂：将具有所需纯度的这种抗体与一种或多种任选的可药用载体混合(Remington's Pharmaceutical Sciences第16版,Osol,A.编著(1980))。可药用载体总体上在所用的剂量和浓度对接受者无毒，并且包括但不限于：缓冲剂如磷酸盐、柠檬酸和其他有机酸；抗氧化剂(包括抗坏血酸和甲硫氨酸)；防腐剂(如十八烷基苄基二甲基氯化铵；六甲氯铵；苯扎氯铵、苯扎溴铵；苯酚、丁醇或苄醇；烷基尼泊金酯如尼泊金甲酯或丙酯；儿茶酚；雷琐辛；环己醇；3-戊醇和间甲酚)；低分子量(少于约10个残基)多肽；蛋白质，如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水聚合物如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、精氨酸或赖氨酸；单糖、二糖和其他糖类包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂如EDTA；糖如蔗糖、甘露糖、海藻糖或山梨糖；形成盐的反荷离子如钠；金属复合物(例如Zn-蛋白质复合物)和/或非离子表面活性剂如聚乙二醇(PEG)。本文中的示例性可药用载体还包括间质药物分散剂如可溶性中性活性透明质酸酶糖蛋白(sHASEGP)，例如，人可溶性PH-20透明质酸酶糖蛋白，如rHuPH20(Baxter International,Inc.)。在美国专利公开号2005/0260186和2006/0104968中描述了某些示例性sHASEGP和使用方法，包括rHuPH20。在一个方面，sHASEGP与一种或多种额外的糖胺聚糖酶如软骨素酶组合。
示例性冻干抗体制剂在美国专利号6,267,958中描述。水质抗体制剂包括在美国专利号6,171,586和WO2006/044908中描述的那些制剂，后一类制剂包含组氨酸-乙酸盐缓冲剂。
本文中的制剂也可以根据正在治疗的特定适应症的需要而含有多于一种有效成分，优选地是具有不相互不利影响的互补活性的那些有效成分。例如，可能希望进一步提供例如另一种抗埃博拉病毒抗体(例如5D2、5E6、6D3、6D8、7C9、7G4、1H3、10C8、12B5或13F6)、抗病毒剂(例如，金刚烷类抗病毒剂、抗病毒干扰素、趋化因子受体拮抗剂、整合酶链转移抑制剂、神经氨酸酶抑制剂、NNRTI、蛋白酶抑制剂、嘌呤核苷或核苷逆转录酶抑制剂)等。这类有效成分以有效用于预期目的的量适当地组合存在。
有效成分可以包埋于例如分别通过凝聚技术或界面聚合制备的微胶囊(例如，羟甲基纤维素微胶囊或明胶微胶囊和聚(甲基丙烯酸甲酯)微胶囊)、胶态药物递送系统(例如，脂质体、白蛋白微球体、微乳液、纳米粒子和纳米胶囊)或乳浊液中。此类技术在Remington's Pharmaceutical Sciences第16版,Osol,A.编著(1980)中公开。
可以制备持续释放制品。持续释放制品的合适例子包括含有抗体的固态疏水性聚合物半通透性基质，所述基质处于成型制品(例如薄膜或微胶囊)形式。
待用于体内施用的制剂通常是无菌的。可以例如通过借助无菌滤膜过滤轻易地实现无菌性。
E.治疗方法和组合物
本文提供的任何抗埃博拉病毒糖蛋白抗体可用于治疗方法中。
一方面，提供了用作药物的抗埃博拉病毒糖蛋白抗体。在进一步的方面，提供了用于治疗埃博拉病毒疾病或感染的抗埃博拉病毒糖蛋白抗体。在某些实施方案中，提供了用于治疗方法的抗埃博拉病毒糖蛋白抗体。在某些实施方案中，本发明提供了用于治疗患有埃博拉病毒疾病或感染的个体的方法中的抗埃博拉病毒糖蛋白抗体，所述方法包括向个体施用有效量的一种或多种抗埃博拉病毒糖蛋白抗体。在一个这样的实施方案中，所述方法包括向个体施用有效量的表1所述的抗埃博拉病毒糖蛋白抗体(h13C6a、h13C6b、h13C6c、h13C6d、h13C6e、h13C6f、h13C6g、h13C6h、h13C6i、h13C6j、h13C6k或h13C6l)。在另一个这样的实施方案中，所述方法包括向个体施用有效量的表2所述的抗埃博拉病毒糖蛋白抗体(h2G4a、h2G4b、h2G4c、h2G4d、h2G4e、h2G4f、h2G4g、h2G4h、h2G4i、h2G4j、h2G4k、h2G4l、h2G4m、h2G4n、h2G4o、h2G4p、h2G4q、h2G4r、h2G4s或h2G4t)。在另一个这样的实施方案中，所述方法包括向个体施用有效量的表3所述的抗埃博拉病毒糖蛋白抗体(h4G7b、h4G7c、h4G7d、h4G7e、h4G7f、h4G7g、h4G7h、h4G7i、h4G7j、h4G7k、h4G7l、h4G7m、h4G7n、h4G7o或h4G7p)。又在其他实施方案中，所述方法包括向个体施用有效量的表1中所述的抗埃博拉病毒糖蛋白抗体、有效量的表2中所述的抗埃博拉病毒糖蛋白抗体和有效量的表3中所述的抗埃博拉病毒糖蛋白抗体。在具体的实施方案中，所述方法包括向个体施用有效量的抗埃博拉病毒糖蛋白抗体h13C6i、有效量的抗埃博拉病毒糖蛋白抗体h2G4n和有效量的抗埃博拉病毒糖蛋白抗体h4G7b。在另一个这样的实施方案中，所述方法还包括向个体施用有效量的至少一种额外的治疗剂，例如如下文所述。根据任一上述实施方案的“个体”优选地是人。
在进一步的方面，本发明提供了包含本文提供的任何抗埃博拉病毒糖蛋白抗体的药物制剂，例如用于任何上述治疗方法中。在一个实施方案中，药物制剂包含本文提供的任何抗埃博拉病毒糖蛋白抗体和药学上可接受的载体。在另一个实施方案中，药物制剂包含本文提供的任何抗埃博拉病毒糖蛋白抗体和至少一种额外的治疗剂，例如如下文所述。
本发明的抗体可以单独使用或与其它药剂组合用于治疗。例如，本发明的抗体可以与至少一种额外的治疗剂共施用。在某些实施方案中，额外的治疗剂包括但不限于：cAd3-EBOZ、rVSV-EBOV、VRC-EBODNA023-00-VP、VRC-MARDNA025-00-VP、TKM-埃博拉、BCX4430、磷酸二酰胺吗啉代寡聚物、法匹拉韦(favipiravir)和brincidofovir。在其他实施方案中，预防性治疗和/或治疗性治疗可以包括除了施用本发明的抗体和额外的治疗剂之外的支持护理。支持护理的例子包括但不限于：防止血管内容量消耗、纠正严重的电解质异常、避免休克并发症、液体和电解质替代、呼吸支持、输血、施用解热剂、镇痛剂来对付疼痛、施用止吐药物来控制恶心和呕吐、施用抗运动药物来控制腹泻、透析或全肾替代治疗。
上文所示的这类联合疗法涵盖联合施用(其中在相同或独立的制剂中包含两种或更多种治疗剂)，和独立施用，在这种情况下，本发明抗体的施用可以在施用额外的一种或多种治疗剂之前、同时和/或之后进行。在一个实施方案中，抗埃博拉病毒糖蛋白抗体的施用和额外的治疗剂的施用是彼此在约一个月内，或在约一、二或三周内或在约一、二、三、四、五或六天内施用。
本发明的抗体(和任何额外的治疗剂)可以通过任何合适的手段施用，所述的合适手段包括肠胃外、肺内和鼻内以及(如果局部治疗需要)病灶内施用。肠胃外输注包括肌内、静脉内、动脉内、腹内或皮下施用。给药可以通过任何合适的途径进行，例如通过注射，如静脉内或皮下注射，这部分地取决于施用是否为短暂或长期。本文中构思了各种给药方案，包括但不限于单次或在各种时间点多次施用、快速浓注施用和脉冲输注。
本发明的抗体将以符合良好医学实践的方式配制、定剂量和施用。在这种情况下考虑的因素包括正在治疗的具体病症、正在治疗的具体哺乳动物、个体患者的临床状况、病症原因、送递药物的部位、施用方法、施用计划和医疗执业者已知的其他因素。抗体不需要与目前用来预防或治疗所讨论病症的一种或多种药物一起配制，但是任选地与它们一起配制。这类其他药物的有效量取决于该制剂中存在的抗体的量、疾病类型或疗法和上文讨论的其他因素。这些药物通常以与本文所述相同的剂量并且采用与本文所述相同的施用途径使用，或以约1％至99％的本文所述剂量使用，或以经验地/临床上确定适宜的任何剂量和任何途径使用。
对于预防或治疗疾病，本发明抗体的适宜剂量(当单独或与一种或多种其他额外治疗剂组合使用时)将取决于待治疗疾病的类型、抗体的类型、疾病的严重性和过程，抗体是否出于预防或治疗目的施用，先前疗法、患者的临床史和对抗体的应答以及主治医师的决定。将抗体适当地按一次或经过一系列治疗施用至患者。取决于疾病的类型和严重性，约1μg/kg至约45mg/kg(例如约1.0mg/kg至约15mg/kg)抗体可以是向患者施用的起始候选剂量，无论是否例如通过一个或多个单独施用或通过连续输注来施用。取决于上文提到的因素，一个常见的每日剂量可能是从约1μg/kg至约100-150mg/kg或更多的范围内。对于几天或更长时间的重复给药，取决于病症，通常将持续治疗，直到疾病症状出现所需的抑制。抗体的示例性剂量为从约1.0mg/kg至约150mg/kg，从约1.0mg/kg至约125mg/kg，从约1.0mg/kg至约100mg/kg，从约1.0mg/kg至约75mg/kg，从约1.0mg/kg至约45mg/kg，从约1.0mg/kg至约30mg/kg，从约1.0mg/kg至约15mg/kg，从约1.0mg/kg至约10mg/kg，或从约1.0mg/kg至约5mg/kg的范围内。因此，可以施与患者一个或多个约1.0mg/kg，2.5mg/kg，5.0mg/kg，10mg/kg，15mg/kg，30mg/kg，45mg/kg，75mg/kg，100mg/kg，125mg/kg或150mg/kg(或其任何组合)的剂量。这样的剂量可以间歇地施用，例如每天，每两天，每三天等等。可以施用较高的初始负荷剂量，随后是一个或多个较低剂量。剂量还可以是固定剂量，例如200mg，400mg，600mg，800mg，1000mg，1200mg，1400mg，1500mg，1600mg，1800mg，2000mg，2200mg，2400mg，2500mg，2600mg，2800mg，3000mg，3200mg，3400mg，3600mg，5000mg，6400mg，8400mg，10400mg等。这种疗法的进展很容易通过常规技术和测定法进行监测。
可以理解，前述任一种制剂或治疗方法可以使用本发明的免疫缀合物替代本发明的抗埃博拉病毒糖蛋白抗体来实施，或者可以除了使用本发明的抗埃博拉病毒糖蛋白抗体之外还使用本发明的免疫缀合物来实施。
H.制造物
在本发明的另一个方面，提供了一种制造物，所述制造物含有上文描述的可用于治疗、预防和/或诊断病症的物质。该制造物包括容器和在该容器上或与之结合的标签或包装插页。合适的容器包括例如瓶、小药瓶、注射器、静脉内输液袋等。容器可以从多种材料如玻璃或塑料形成。该容器容纳了本身或与另一种组合物组合时有效治疗、预防和/或诊断病症的组合物并且可以具有无菌接入口(例如该容器可以是静脉内输液袋或是具有皮下注射针头可穿透的瓶塞的小药瓶)。组合物中的至少一种活性物质是本发明的抗体。标签或包装插页说明该组合物用于治疗选择的病状。而且，制造物可以包含(a)其中含有组合物的第一容器，其中所述组合物包含本发明的抗体；和(b)其中含有组合物的第二容器，其中所述组合物包含其他细胞毒性剂或治疗剂。在本发明的这个实施方案中制造物还可以包含指示组合物可以用来治疗特定病状的包装插页。备选地或额外地，该制造物可以还包含第二(或第三)容器，其包含可药用缓冲剂，如抑菌注射用水(BWFI)、磷酸盐缓冲盐水、林格液和葡萄糖溶液。它可以还包括从商业和用户观点看受欢迎的其他材料，包括其他缓冲剂、稀释剂、滤器、针头和注射器。
可以理解，前述任一制造物可以包括替代本发明的抗埃博拉病毒糖蛋白抗体的本发明免疫缀合物，或可以在本发明的抗埃博拉病毒糖蛋白抗体之外还包括本发明的免疫缀合物。
III.实施例
以下是本发明的方法和组合物的例子。应当理解，鉴于上文提供的一般性描述，可以实施多种其他实施方案。
试剂
在烟草植物中产生的ZMapp嵌合单克隆抗体c13C6、c2G4和c4G7由Larry Zeitlin(Mapp Biopharmaceutical,San Diego,CA)提供。
实施例1：抗EBOV嵌合单克隆抗体c13C6、c2G4和c4G7的人源化
如下所述将三种嵌合单克隆抗EBOV抗体c13C6、c2G4和c4G7中的每一种抗体进行人源化。将13C6人源化为κ1/VH2，将2G4人源化为κ1/VH3，和将4G7人源化为κ1/VH1。嵌合的抗EBOV抗体c13C6、c2G4和c4G7中的每一种抗体的可变区氨基酸序列(获自美国专利号8,513,391和美国专利号7,335,356)与最接近的人种系序列比对重链和轻链。将高变区工程化入轻链和重链接纳体构架以产生人源化CDR移植物以及包括一个或多个小鼠游标位置的多种组合的额外变体。使用本领域技术人员可用的且已知的标准基因合成方法，将对应于三种抗EBOV单克隆抗体的多种人源化形式的氨基酸序列的人源化核酸构建体通过基因合成产生。
实施例2：人源化抗EBOV h13C6单克隆抗体
使用上面实施例1中所述的方法设计了单克隆抗体13C6的12个人源化变体。单克隆抗体13C6的人源化变体及它们的相关名称连同VH和VL序列如上表1所示，并且也示于下表5中。
表5.人源化13C6抗体变体
游标位置 K1 K1+43 K1+43,87
VH2 h13C6a h13C6e h13C6i
VH2+2,24,37 h13C6d h13C6h h13C6l
VH2+2,24,37,73,75 h13C6c h13C6g h13C6k
VH2+2,24,37,66,68,73,75 h13C6b h13C6f h13C6j
为了比较表达、亲和力、活性和FcγRIIIa结合，将单克隆抗体13C6的12个人源化变体中的每一个在293T细胞、CHO细胞和FUT8KO CHO细胞中表达为Fab片段和表达为全长IgG(FL)抗体。FUT8KO CHO细胞在FUT8基因中含有缺失，这导致表达的蛋白质无岩藻糖添加(即，无岩藻糖基化蛋白质)。对每种单克隆抗体变体进行小规模(30ml)表达实验。
使用MabSelect SuRe(GE Healthcare,17-5438)通过亲和层析纯化每种表达的单克隆抗体。将洗脱的物质缓冲交换到含有10mM组氨酸、240mM蔗糖和0.01％吐温20的缓冲液中。
单克隆抗体13C6的人源化变体表达良好，平均产量为约1.3mg/30ml培养物，且通过分析型HPLC-SEC测得的单体为97.2％。
根据先前公开的方法(Hotzel等人(2012)MAbs.4:753–760)，通过ELISA检测了在293T细胞、CHO细胞或FUT8KO CHO细胞中产生的单克隆抗体13C6的每一种人源化变体(Fab或FL)与杆状病毒粒子的非特异性结合。在该测定法中，单克隆抗体13C6的所有人源化变体显示与杆状病毒粒子非常低的非特异性结合。
如下使用Biacore T200仪器确定单克隆抗体13C6的每种人源化变体对EBOV抗原的结合亲和力。将重组EBOV GPdTM(重组EBOV GPdTM,IBT Bioservices,目录号0501-015,批次:1411003)以低密度(200RU)、中等密度(600RU)和高密度(2000RU)固定在BiacoreSeries S CM5传感器芯片(GE Healthcare)上。使浓度系列4.11-333nM的抗EBOV单克隆抗体流过芯片。通过具有最小再生的单循环动力学分析每种人源化抗EBOV单克隆抗体变体的相互作用，以保持固定化抗原的完整性。对于该测定法的每个循环，使用30μl/分钟的流速和5分钟的解离。同时拟合kon和koff的1:1朗谬尔结合模型用于动力学分析。确定FUT8KO中表达的变体的初始亲和力。表6提供了人源化13C6抗体变体的初始表征和对FUT8KO中表达的抗体变体的Biacore亲和力总结。
表6
如上所述，通过Biacore重新测定了具有最高亲和力的抗体变体(即，h13C6a、h13C6e和h13C6i)，比较了抗体变体与来自IBT Bioservices的商业嵌合c13C6的亲和力。表7和表8提供了分别在CHO或FUT8KO中表达的h13C6a、h13C6e和h13C6i对低密度重组EBOV GP和高密度重组EBOV GP的Biacore亲和力。
表7
低密度重组EBOV GP包被(200RU)
表8
高密度重组EBOV GP包被(2000RU)
mAb变体 Kon Koff KD(nM) RU max
CHO(h13C6a) 1.96e4 4.5e-4 23 221
CHO(h13C6e) 1.49e4 6.27e-4 42 112
CHO(h13C6i) 1.74e4 3.31e-4 19 165
FKO(h13C6a) 1.78e4 3.11e-4 17 240
FKO(h13C6e) 1.71e4 3.29e-4 19 225
FKO(h13C6i) 1.58e4 1.96e-4 13 141
c13C6(IBT) 1.47e4 1.48e-4 10 306
鉴定了人源化13C6变体h13C6i和人源化变体h13C6a为好的结合物。进行了额外的Biacore结合分析以评估与重组FcγRIIIa(R&D Systems,目录号4325-FC-050)的结合。如表9所示，与CHO细胞表达物相比，FUT8KO细胞中的表达改善了FcγRIIIa(V158)的结合约3倍。
表9
表10中总结了对人源化变体h13C6i的额外体外分析。
表10
实施例3：人源化抗EBOV h2G4单克隆抗体
设计了单克隆抗体2G4的20种人源化变体，并使用上面实施例1中所述的方法制备了16种人源化变体。单克隆抗体2G4的人源化变体及它们的相关名称连同VH和VL的序列在上面的表2中显示，并且也示于下表11中。
表11.人源化2G4抗体变体
游标位置 K1 K1+43 K1+48 K1+43,48 K1+43,48,71
VH3 h2G4a h2G4e h2G4i hu2G4q* hu2G4n
VH3+49 h2G4b h2G4f h2G4j hu2G4r* hu2G4o
VH3+78 h2G4c h2G4g h2G4k hu2G4s* hu2G4t*
VH3+49,78 h2G4d h2G4h h2G4l hu2G4m hu2G4p
*还没有制备变体
将16种人源化2G4变体抗体在293T细胞中以小规模30ml表达为全长IgG来测试抗原结合。如上文对人源化13C6变体抗体所述，使用Biacore T200仪器进行初始亲和力测量。对于人源化2G4变体抗体，基于所报道的处于200-500nM范围的嵌合2G4形式的亲和力，需要比13C6所述的更高浓度系列来确定Kd亲和力。所应用的浓度范围在1.8μM-22.2nM之间。表12中提供了初始亲和力测量的结果。
表12
从所有人源化2G4变体抗体中鉴定出人源化候选物h2G4n，所述人源化2G4变体抗体基于具有最高亲和力和最清洁BV ELISA评分进行测试。该候选物h2G4n以较大的规模表达，并使用了额外的纯化步骤，和重新测定了与重组抗原的结合。进行结合分析，比较烟草植物中产生的嵌合物。对于烟草产生的嵌合2G4抗体，由于与空白流动池高的非特异性结合，可能是嵌合制备物中高聚集物含量的结果，因此没有确定到有意义的动力学数据。在表12和13中包括了嵌合2G4抗体的已公开亲和力值，用于比较。表13提供了结合测定法的结果。如表13所示，对于2G4，小规模的机构内嵌合体(293T)比已公开的亲和力好约3.4倍。小规模的人源化2G4N(293T)具有相似的亲和力。大规模的合并物PUR 78032是约7倍，且SEC池是约9倍好于公开的亲和力。
表13.
实施例4：人源化抗EBOV h4G7单克隆抗体
设计了单克隆抗体4G7的15种人源化变体，并使用上面实施例1中所述的方法制备。单克隆抗体4G7的人源化变体及它们的相关名称连同VH和VL的序列在上面的表3中显示，并且也示于下表14中。
表14.人源化4G7抗体变体
游标位置 K1 K1+43 K1+43,48 K1+43,48,87 K1+48
VH1 h4G7b h4G7e h4G7h h4G7k h4G7n
VH1+67,69,71 h4G7c h4G7f h4G7i h4G7l h4G7o
VH1+71 h4G7d h4G7g h4G7j h4G7m h4G7p
将15种人源化4G7变体抗体在293T细胞中以小规模30ml表达为全长IgG来测试抗原结合。如上文对人源化13C6变体抗体所述，使用Biacore T200仪器进行初始亲和力测量。对于人源化4G7变体抗体，基于所报道的处于200-500nM范围的嵌合4G7形式的亲和力，需要比13C6所述的更高浓度系列来确定Kd亲和力。所应用的浓度范围在1.8μM-22.2nM之间。表15中提供了初始亲和力测量的结果。
表15.
从所有人源化4G7变体抗体中鉴定出人源化候选物h4G7b，所述人源化4G7变体抗体基于具有最高亲和力和最清洁BV ELISA评分进行测试。该候选物h4G7b以较大的规模表达，并使用了额外的纯化步骤，和重新测定了与重组抗原的结合。进行结合分析，比较烟草植物中产生的嵌合物。对于烟草产生的嵌合4G7抗体，由于与空白流动池高的非特异性结合，可能是嵌合制备物中高聚集物含量的结果，因此没有确定到有意义的动力学数据。在表15和16中包括了嵌合4G7抗体的已公开亲和力值，用于比较。表16提供了结合测定法的结果。如表13所示，对于4G7，小规模的机构内嵌合体(293T)比已公开的亲和力在一定程度上似乎更好。小规模的人源化4G7b(293T)具有相似的亲和力。大规模的合并物4G7b PUR78032是约1.5倍更好。
表16.
尽管为了清楚理解的目的，通过阐述和举例的方式在一定程度上详细描述了上述发明，但是说明书和实施例不应构成对本发明范围的限制。本文引用的所有专利和科学文献的公开明确地以它们的全文并入作为参考。

Claims (54)

1.分离的人源化抗体，其结合至埃博拉病毒糖蛋白。
2.权利要求1的抗体，其中所述抗体结合至包含氨基酸序列SEQ ID NO:91的表位。
3.权利要求1的抗体，其中所述抗体结合至包含氨基酸序列SEQ ID NO:92的表位。
4.权利要求1的抗体，其中所述抗体包含(a)含有氨基酸序列SEQ ID NO:22的HVR-H1；(b)含有氨基酸序列SEQ ID NO:23的HVR-H2；和(c)含有氨基酸序列SEQ ID NO:24的HVR-H3。
5.权利要求1的抗体，其中所述抗体包含(a)含有氨基酸序列SEQ ID NO:9的HVR-L1；(b)含有氨基酸序列SEQ ID NO:10的HVR-L2；和(c)含有氨基酸序列SEQ ID NO:11的HVR-L3。
6.权利要求1的抗体，其中所述抗体包含(a)含有氨基酸序列SEQ ID NO:22的HVR-H1；(b)含有氨基酸序列SEQ ID NO:23的HVR-H2；(c)含有氨基酸序列SEQ ID NO:24的HVR-H3；(d)含有氨基酸序列SEQ ID NO:9的HVR-L1；(e)含有氨基酸序列SEQ ID NO:10的HVR-L2；和(f)含有氨基酸序列SEQ ID NO:11的HVR-L3。
7.权利要求1的抗体，其中所述抗体包含重链可变区，其中所述重链可变区包含选自SEQ ID NO:14、16、18和20的氨基酸序列。
8.权利要求1的抗体，其中所述抗体包含轻链可变区，其中所述轻链可变区包含选自SEQ ID NO:3、5和7的氨基酸序列。
9.权利要求1的抗体，其中所述抗体包含重链可变区和轻链可变区,其中所述重链可变区包含选自SEQ ID NO:14、16、18和20的氨基酸序列，和其中轻链可变区包含选自SEQ IDNO:3、5和7的氨基酸序列。
10.权利要求1的抗体，其中所述抗体包含重链，其中所述重链包含选自SEQ ID NO:15、17、19和21的氨基酸序列。
11.权利要求1的抗体，其中所述抗体包含轻链，其中所述轻链包含选自SEQ ID NO:4、6和8的氨基酸序列。
12.权利要求1的抗体，其中所述抗体包含重链和轻链，其中所述重链包含选自SEQ IDNO:15、17、19和21的氨基酸序列，和其中所述轻链包含选自SEQ ID NO:4、6和8的氨基酸序列。
13.权利要求1的抗体，其中所述抗体包含(a)含有氨基酸序列SEQ ID NO:50的HVR-H1；(b)含有氨基酸序列SEQ ID NO:51的HVR-H2；和(c)含有氨基酸序列SEQ ID NO:52的HVR-H3。
14.权利要求1的抗体，其中所述抗体包含(a)含有氨基酸序列SEQ ID NO:37的HVR-L1；(b)含有氨基酸序列SEQ ID NO:38的HVR-L2；和(c)含有氨基酸序列SEQ ID NO:39的HVR-L3。
15.权利要求1的抗体，其中所述抗体包含(a)含有氨基酸序列SEQ ID NO:50的HVR-H1；(b)含有氨基酸序列SEQ ID NO:51的HVR-H2；(c)含有氨基酸序列SEQ ID NO:52的HVR-H3；(d)含有氨基酸序列SEQ ID NO:37的HVR-L1；(e)含有氨基酸序列SEQ ID NO:38的HVR-L2；和(f)含有氨基酸序列SEQ ID NO:39的HVR-L3。
16.权利要求1的抗体，其中所述抗体包含重链可变区，其中所述重链可变区包含选自SEQ ID NO:42、44、46和48的氨基酸序列。
17.权利要求1的抗体，其中所述抗体包含轻链可变区,其中所述轻链可变区包含选自SEQ ID NO:27、29、31、33和35的氨基酸序列。
18.权利要求1的抗体，其中所述抗体包含重链可变区和轻链可变区,其中所述重链可变区包含选自SEQ ID NO:42、44、46和48的氨基酸序列,和其中所述轻链可变区包含选自SEQ ID NO:27、29、31、33和35的氨基酸序列。
19.权利要求1的抗体，其中所述抗体包含重链,其中所述重链包含选自SEQ ID NO:43、45、47和49的氨基酸序列。
20.权利要求1的抗体，其中所述抗体包含轻链,其中所述轻链包含选自SEQ ID NO:28、30、32、34和36的氨基酸序列。
21.权利要求1的抗体，其中所述抗体包含重链和轻链,其中所述重链包含选自SEQ IDNO:43、45、47和49的氨基酸序列,和其中所述轻链包含选自SEQ ID NO:28、30、32、34和36的氨基酸序列。
22.权利要求1的抗体，其中所述抗体包含(a)含有氨基酸序列SEQ ID NO:76的HVR-H1；(b)含有氨基酸序列SEQ ID NO:77的HVR-H2；和(c)含有氨基酸序列SEQ ID NO:78的HVR-H3。
23.权利要求1的抗体，其中所述抗体包含(a)含有氨基酸序列SEQ ID NO:65的HVR-L1；(b)含有氨基酸序列SEQ ID NO:66的HVR-L2；和(c)含有氨基酸序列SEQ ID NO:67的HVR-L3。
24.权利要求1的抗体，其中所述抗体包含(a)含有氨基酸序列SEQ ID NO:76的HVR-H1；(b)含有氨基酸序列SEQ ID NO:77的HVR-H2；(c)含有氨基酸序列SEQ ID NO:78的HVR-H3；(d)含有氨基酸序列SEQ ID NO:65的HVR-L1；(e)含有氨基酸序列SEQ ID NO:66的HVR-L2；和(f)含有氨基酸序列SEQ ID NO:67的HVR-L3。
25.权利要求1的抗体，其中所述抗体包含重链可变区,其中所述重链可变区包含选自SEQ ID NO:70、72和74的氨基酸序列。
26.权利要求1的抗体，其中所述抗体包含轻链可变区,其中所述轻链可变区包含选自SEQ ID NO:55、57、59、61和63的氨基酸序列。
27.权利要求1的抗体，其中所述抗体包含重链可变区和轻链可变区,其中所述重链可变区包含选自SEQ ID NO:70、72和74的氨基酸序列,和其中所述轻链可变区包含选自SEQID NO:55、57、59、61和63的氨基酸序列。
28.权利要求1的抗体，其中所述抗体包含重链,其中所述重链包含选自SEQ ID NO:71、73和75的氨基酸序列。
29.权利要求1的抗体，其中所述抗体包含轻链,其中所述轻链包含选自SEQ ID NO:56、58、60、62和64的氨基酸序列。
30.权利要求1的抗体，其中所述抗体包含重链和轻链,其中所述重链包含选自SEQ IDNO:71、73和75的氨基酸序列,和其中所述轻链包含选自SEQ ID NO:56、58、60、62和64的氨基酸序列。
31.权利要求1的抗体，其中所述抗体包含(a)与SEQ ID NO:14的氨基酸序列具有至少90％氨基酸序列同一性的重链可变区氨基酸序列，(b)与SEQ ID NO:7的氨基酸序列具有至少90％氨基酸序列同一性的轻链可变区氨基酸序列，或(c)如(a)中的重链可变区氨基酸序列区和如(b)中的轻链可变区氨基酸序列。
32.权利要求1的抗体，其中所述抗体包含(a)与SEQ ID NO:42的氨基酸序列具有至少90％氨基酸序列同一性的重链可变区氨基酸序列，(b)与SEQ ID NO:35的氨基酸序列具有至少90％氨基酸序列同一性的轻链可变区氨基酸序列，或(c)如(a)中的重链可变区氨基酸序列区和如(b)中的轻链可变区氨基酸序列。
33.权利要求1的抗体，其中所述抗体包含(a)与SEQ ID NO:70的氨基酸序列具有至少90％氨基酸序列同一性的重链可变区氨基酸序列，(b)与SEQ ID NO:55的氨基酸序列具有至少90％氨基酸序列同一性的轻链可变区氨基酸序列，或(c)如(a)中的重链可变区氨基酸序列区和如(b)中的轻链可变区氨基酸序列。
34.权利要求1的抗体，其中所述抗体结合至包含选自SEQ ID NO:79-90的序列的埃博拉病毒糖蛋白。
35.权利要求1-34中任一项所述的抗体，其是抗体片段。
36.权利要求1-34中任一项所述的抗体，其是全长IgG抗体。
37.权利要求1-34中任一项所述的抗体，其中所述抗体是非岩藻糖基化的抗体。
38.分离的核酸分子，其编码权利要求1-34中任一项所述的抗体。
39.宿主细胞，其包含权利要求38的核酸分子。
40.权利要求39的宿主细胞，其中所述宿主细胞是能够产生非岩藻糖基化抗体的宿主细胞。
41.权利要求39的宿主细胞，其中所述宿主细胞是能够产生非岩藻糖基化抗体的哺乳动物宿主细胞。
42.权利要求40的宿主细胞，其中所述宿主细胞是具有FUT8基因中的缺失的哺乳动物宿主细胞，其导致减少的或无岩藻糖添加至表达的蛋白质。
43.生产抗体的方法，包括培养权利要求39、40、41或42的宿主细胞。
44.权利要求43的方法，其中所述方法相对于在不产生非岩藻糖基化抗体的宿主细胞中产生抗体而言，导致减少的抗体聚集。
45.免疫缀合物，其包含权利要求1-37中任一项所述的抗体和细胞毒性剂。
46.药物制剂，其包含权利要求1-37中任一项所述的抗体和/或权利要求45的免疫缀合物以及可药用载体或稀释剂。
47.权利要求46的药物制剂，其还包含额外的治疗剂。
48.权利要求47的药物制剂，其中所述额外的治疗剂是另一抗埃博拉病毒抗体、抗病毒剂或抗埃博拉疫苗。
49.权利要求1-37中任一项所述的抗体，用作药物。
50.权利要求1-37中任一项所述的抗体，用于治疗埃博拉病毒感染。
51.权利要求1-37中任一项所述的抗体的用途，用于制备治疗埃博拉病毒感染的药物。
52.治疗患有埃博拉病毒感染的个体的方法，包括对个体施用有效量的权利要求1-37中任一项所述的抗体或权利要求45的免疫缀合物。
53.权利要求52的方法，其还包括对个体施用额外的治疗剂。
54.权利要求53的方法，其中所述额外的治疗剂是另一抗埃博拉病毒抗体、抗病毒剂或抗埃博拉疫苗。
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