CN104066449B

CN104066449B - 抗lrp5抗体及使用方法

Info

Publication number: CN104066449B
Application number: CN201380006007.8A
Authority: CN
Inventors: 叶蔚蓝; 杰里米·布赖恩特·伯顿; 吴岩; 塞西莉亚·秋
Original assignee: F Hoffmann La Roche AG
Current assignee: F Hoffmann La Roche AG
Priority date: 2012-01-18
Filing date: 2013-01-18
Publication date: 2018-04-27
Anticipated expiration: 2033-01-18
Also published as: NZ626520A; CO7000747A2; AR089752A1; MX2014008157A; CL2014001888A1; US10035854B2; TW201335187A; BR112014017518A8; HK1197187A1; CA2862422A1; IN2014DN05885A; KR20140116490A; JP6242813B2; JP2015511119A; CN104066449A; US20130183320A1; EA028202B1; AU2013209707A1; EA201491357A1; MA35898B1

Abstract

本发明提供抗LRP5抗体及其制造和使用方法。

Description

抗LRP5抗体及使用方法

相关申请的交叉引用

本申请根据35 USC 119(e)要求于2012年1月18日提交的美国临时申请号61/588,100的权益，其内容通过引用结合于此。

发明领域

本发明涉及抗LRP5抗体及其使用方法。

背景

现在充分确定的是，血管发生是多种病症的发病的重要促成因素。这些包括实体瘤和转移，眼内新生血管疾病如视网膜病变，例如糖尿病性视网膜病变(diabeticretinopathy)、视网膜静脉阻塞(retinal vein occlusion)(RVO)、湿性老年性黄斑变性(wet age-related macular degeneration)(AMD)、新生血管性青光眼(neovascularglaucoma)、移植的角膜组织和其他组织的免疫排斥、和类风湿性关节炎(rheumatoidarthritis)。Duda等人，J.Clin.Oncology25(26)：4033-42(2007)；Kesisis等人，Curr.Pharm.Des.13：2795-809(2007)；Zhang&Ma Prog.Ret.&Eye Res.26：1-37(2007)。

视网膜接收其来自供应视网膜内部的视网膜血管和供应外部的脉络膜血管的血液供应。视网膜血管的损伤发生在多种疾病过程中，包括糖尿病性视网膜病变(diabeticretinopathy)、早产儿视网膜病变(retinopathy of prematurity)、和中心性和分支性视网膜静脉阻塞(central and branched retinal vein occlusions)(缺血性视网膜病变(ischemic retinopathies))。由这种损伤造成的视网膜缺血导致不希望的新血管形成。脉络膜新血管形成发生在许多其他疾病过程中，包括AMD。相比之下，视网膜的不完全血管化是患有某些遗传疾病的病人的标志，这些疾病例如家族性渗出性玻璃体视网膜病变(familial exudative vitreoretinopathy，FEVR)、外层渗出性视网膜病变(Coats’disease)、以及由Wnt受体Frizzled4(Fzd4)、共受体LRP5或分泌的配体Norrin的突变导致的诺里病(Norrie disease)(Berger等人，Nature Genet.1：199-203(1992)；Chen等人，Nature Genet.1：204-208(1992)；Robitaille等人，Nature Genet.32：326-30(2002)；Toomes等人，Am.J.Hum.Genet.74：721-30(2004))。另一种蛋白质TSPAN12已经显示出涉及Norrin信号传导(Junge等人，Cell(细胞)139：299-311(2009)和WO 2010/030813)。还报道了Tspan12基因中的突变导致FEVR(Poulter等人，Invest Ophthalmol Vis Sci.14；53(6)：2873-9(2012)；Yang等人，Molecular Vision(分子视力)17：1128-1135(2011)；Poulter等人，The American Journal of Human Genetics(美国人类遗传学期刊)86，248-253(2010))。用于这些遗传疾病的模型可以用于敲除了相应同源基因的小鼠中。

尽管在眼部血管发生的领域中有许多进展，仍然需要确定靶点并且开发可以补充或增强现有疗法功效的手段。

概述

本发明提供抗LRP5抗体及其制造和使用方法，尤其是在与血管发生相关的病况和疾病的治疗中。

在一方面中，本发明提供分离的抗体，所述分离的抗体结合低密度脂蛋白受体相关蛋白5(LRP5)，其中所述抗体增强Norrin活性和/或Norrin/Fzd4信号传导。在一些实施方案中，所述抗体是单克隆抗体。在一些实施方案中，所述抗体是人抗体、人源化抗体或嵌合抗体。在一些实施方案中，所述抗体是结合LRP5的抗体片段。

在一些实施方案中，所述抗体包含(a)HVR-H3，所述HVR-H3包含氨基酸序列YYRYAPYRSLGMDV(SEQ ID NO：23)或者WIPQSYPFX₁SYKSGFDY，其中X₁是A或R(SEQ ID NO：24)，(b)HVR-L3，所述HVR-L3包含氨基酸序列QQYYX₁YPFT，其中X₁是L或S(SEQ ID NO：25)，以及(c)HVR-H2，所述HVR-H2包含氨基酸序列GX_iISX₂X₃GX₄STYYADSVKG，其中X₁是A或G，X₂是A或S，X₃是P或S，X₄是S或W(SEQ ID NO：26)，或者SRISSNGGSTYYADSVKG(SEQ ID NO：27)。在一些实施方案中，所述抗体包含(a)HVR-H1，所述HVR-H1包含氨基酸序列GFTFSSYAMX₁，其中X₁是H或S(SEQ ID NO：28)，(b)HVR-H2，所述HVR-H2包含氨基酸序列GX₁ISX₂X₃GX₄STYYADSVKG，其中X₁是A或G，X₂是A或S，X₃是P或S，X₄是S或W(SEQ ID NO：26)，或者SRISSNGGSTYYADSVKG(SEQ IDNO：27)，以及(c)HVR-H3，所述HVR-H3包含氨基酸序列YYRYAPYRSLGMDV(SEQ ID NO：23)或者WIPQSYPFX₁SYKSGFDY，其中X₁是A或R(SEQ ID NO：24)。在一些实施方案中，所述抗体还包含(a)HVR-L1，所述HVR-L1包含氨基酸序列RASQGISSYLA(SEQ ID NO：29)或者RASQX₁X₂X₃X₄YLA，其中X₁是A、G、S或V，X₂是I或M，X₃是F、G、S或Y，并且X₄是G、S或Y(SEQ ID NO：30)；(b)HVR-L2，所述HVR-L2包含氨基酸序列AASSLQS(SEQ ID NO：31)或者DASX₁X₂ES，其中X₁是S或T并且X₂是L或R(SEQ ID NO：32)；以及(c)HVR-L3，所述HVR-L3包含氨基酸序列QQYYX₁YPFT，其中X₁是L或S(SEQ ID NO：33)。在一些实施方案中，所述抗体包含(a)HVR-L1，所述HVR-L1包含氨基酸序列RASQGISSYLA(SEQ ID NO：29)或者RASQX₁X₂X₃X₄YLA，其中X₁是A、G、S或V，X₂是I或M，X₃是G、F、Y或S，并且X₄是G、Y或S(SEQ ID NO：30)；(b)HVR-L2，所述HVR-L2包含氨基酸序列AASSLQS(SEQ ID NO：31)或者DASX₁X₂ES，其中X₁是S或T并且X₂是L或R(SEQID NO：32)；以及(c)HVR-L3，所述HVR-L3包含氨基酸序列QQYYX₁YPFT，其中X₁是L或S(SEQ IDNO：33)。在一些实施方案中，所述抗体包含选自由SEQ ID NO：34-37组成的组的一种或多种重链可变结构域构架序列。在一些实施方案中，所述抗体包含(a)VH序列，所述VH序列与SEQID NO：1至11中的一个氨基酸序列具有至少95％的序列同一性；(b)VL序列，所述VL序列与SEQ ID NO：12至22中的一个氨基酸序列具有至少95％的序列同一性；或(c)如在(a)中的VH序列和如在(b)中的VL序列。在一些实施方案中，所述抗体包含SEQ ID NO：1至11中的一个的VH序列。在一些实施方案中，所述抗体包含SEQ ID NO：12至22中的一个的VL序列。在一些实施方案中，所述抗体包含包含SEQ ID NO：1至11中的一个的VH序列和SEQ ID NO：12至22中的一个的VL序列。在一些实施方案中，所述抗体包含图4和5中所示的抗体的VH和VL序列。在一些实施方案中，所述抗体是全长IgG1抗体。

在另一方面中，本发明提供分离的核酸，所述分离的核酸编码本发明的抗体。在一些实施方案中，本发明提供宿主细胞，所述宿主细胞包含本发明的核酸。在一些实施方案中，本发明提供制备抗体的方法，所述方法包括培养本发明的宿主细胞从而制备所述抗体。在一些实施方案中，所述方法还包括从所述宿主细胞回收抗体。

在一些实施方案中，本发明提供免疫缀合物，所述免疫缀合物包含本发明的抗体和细胞毒性剂。在一些实施方案中，本发明提供药物制剂，所述药物制剂包含本发明的抗体和药用载体。在一些实施方案中，所述药物制剂还包含另外的治疗剂，例如VEGF拮抗剂(包括，例如，抗VEGF抗体或抗体片段，例如雷珠单抗(ranibizumab)，可溶性VEGF受体，例如阿柏西普(aflibercept)，或适体，例如培加他尼(pegaptanib))、TSPAN12激动剂、纤维蛋白溶酶、纤维蛋白溶酶原、组织纤维蛋白溶酶原活化剂、TNF-α抑制剂、和/或类固醇，例如曲安西龙(triamcinolone)或地塞米松(dexamethasone)。

在一些实施方案中，本发明提供本发明的抗体，所述抗体用作药物。在一些实施方案中，本发明提供本发明的抗体，所述抗体用于治疗视网膜病变，包括增生性糖尿病性视网膜病变(proliferative diabetic retinopathy)，CNV，AMD，糖尿病性和其他缺血相关的视网膜病变，DME，病理性近视(pathological myopia)，希佩尔-林道病(von Hippel-Lindaudisease)，眼睛的组织胞浆菌病(histoplasmosis)，CRVO，BRVO，角膜新血管形成，视网膜新血管形成，ROP，FEVR，外层渗出性视网膜病变(Coats’disease)，诺里病(Norrie Disease)，OPPG(骨质疏松-假神经胶质瘤综合征(Osteporosis-Pseudoglioma Syndrome))，结膜下出血(subconjunctival hemorrhage)，或高血压性视网膜病变(hypertensiveretinopathy)。在一些实施方案中，本发明提供本发明的抗体，所述抗体用于增强Norrin活性和/或Norrin/Fzd4信号传导。在一些实施方案中，本发明提供本发明的抗体，所述抗体用于药物的制备。在一些实施方案中，所述药物用于下列疾病的治疗：视网膜病变，包括增生性糖尿病性视网膜病变(proliferative diabetic retinopathy)，CNV，AMD，糖尿病性和其他缺血相关的视网膜病变，DME，病理性近视(pathological myopia)，希佩尔-林道病(vonHippel-Lindau disease)，眼睛的组织胞浆菌病(histoplasmosis)，CRVO，BRVO，角膜新血管形成，视网膜新血管形成，ROP，FEVR，外层渗出性视网膜病变(Coats’disease)，诺里病(Norrie Disease)，OPPG(骨质疏松-假神经胶质瘤综合征(Osteporosis-PseudogliomaSyndrome))，结膜下出血(subconjunctival hemorrhage)，或高血压性视网膜病变(hypertensive retinopathy)。在一些实施方案中，所述药物用于增强Norrin活性和/或Norrin/Fzd4信号传导。

在一些实施方案中，本发明提供治疗患有下列疾病的个体的方法：视网膜病变，包括增生性糖尿病性视网膜病变(proliferative diabetic retinopathy)，CNV，AMD，糖尿病性和其他缺血相关的视网膜病变，DME，病理性近视(pathological myopia)，希佩尔-林道病(von Hippel-Lindau disease)，眼睛的组织胞浆菌病(histoplasmosis)，CRVO，BRVO，角膜新血管形成，视网膜新血管形成，ROP，FEVR，外层渗出性视网膜病变(Coats’disease)，诺里病(Norrie Disease)，OPPG(骨质疏松-假神经胶质瘤综合征(Osteporosis-Pseudoglioma Syndrome))，结膜下出血(subconjunctival hemorrhage)，或高血压性视网膜病变(hypertensive retinopathy)，所述方法包括向个体施用有效量的本发明的抗体。在一些实施方案中，所述方法还包括向个体施用有效量的另外的治疗剂，例如VEGF拮抗剂(包括，例如，抗VEGF抗体或抗体片段，例如雷珠单抗(ranibizumab)，可溶性VEGF受体，例如阿柏西普(aflibercept)，或适体，例如培加他尼(pegaptanib))、重组NORRIN蛋白、TSPAN12激动剂、纤维蛋白溶酶、纤维蛋白溶酶原、组织纤维蛋白溶酶原活化剂、TNF-α抑制剂、和/或类固醇，例如曲安西龙(triamcinolone)或地塞米松(dexamethasone)。在一些实施方案中，本发明提供增强个体中Norrin活性和/或Norrin/Fzd4信号传导的方法，所述方法包括向个体施用有效量的本发明的抗体以增强Norrin活性和/或Norrin/Fzd4信号传导。在一些实施方案中，本发明提供挽救由Norrin和/或Fzd4突变导致的个体中的信号传导缺陷的方法，所述方法包括施用权利要求1所述的抗体。

附图简述

图1A和1B显示，抗LRP5抗体增强Norrin/Fzd4介导的信号传导并且挽救Fzd4_M157V突变。在此图中，使用前缀“P6C”，而在说明书的其他地方，交互使用“YW629”。

图2A和2B显示，抗LRP5抗体增强Norrin活性并且挽救人类视网膜内皮微血管细胞(HREMVC)中Tspan12的缺失。在此图中，使用前缀“P6C”，而在说明书的其他地方，交互使用“YW629”。

图3A和3B显示，抗LRP5抗体部分地挽救Tspan12敲除的小鼠中的血管缺陷。在此图中，使用前缀“P6C”，而在说明书的其他地方，交互使用“YW629”。

图4A和4B显示多种抗LRP5抗体的重链可变区序列，其中加框的是CDR-H1、CDR-H2、和CDR-H3。这些序列对应的SEQ ID NO：如下：YW629.42(SEQ ID NO：1)、YW629.42.57(SEQID NO：2)、YW629.42.58(SEQ ID NO：3)、YW629.42.65(SEQ ID NO：4)、YW629.51(SEQ IDNO：5)、YW629.51.13(SEQ ID NO：6)、YW629.51.61(SEQ ID NO：7)、YW629.51.63(SEQ IDNO：8)、YW629.51.77(SEQ ID NO：9)、YW629.51.78(SEQ ID NO：10)、和YW629.51.80(SEQ IDNO：11)。

图5A和5B显示多种抗LRP5抗体的轻链可变区序列，其中加框的是CDR-L1、CDR-L2、和CDR-L3。这些序列对应的SEQ ID NO：如下：YW629.42(SEQ ID NO：12)、YW629.42.57(SEQID NO：13)、YW629.42.58(SEQ ID NO：14)、YW629.42.65(SEQ ID NO：15)、YW629.51(SEQ IDNO：16)、YW629.51.13(SEQ ID NO：17)、YW629.51.61(SEQ ID NO：18)、YW629.51.63(SEQ IDNO：19)、YW629.51.77(SEQ ID NO：20)、YW629.51.78(SEQ ID NO：21)、和YW629.51.80(SEQID NO：22)。

图6A和6B显示，抗LRP5抗体部分地挽救与Tspan12敲除有关的视网膜血管缺陷。

图7A-7C显示，抗LRP5抗体在血管视网膜疾病的氧气诱导的视网膜病变模型中促进血管再生长并且减少病理性血管发生。

图8A-8C显示，抗LRP5抗体增强Norrin和Wnt7b信号传导，但同时拮抗Wnt3a信号传导。

图9A和9B显示，抗LRP5抗体挽救配体或受体组分中减少受体聚集的突变的信号传导缺陷。

图10A和10B显示，对于抗LRP5抗体介导的Norrin信号传导的增强抗体二价是必需的，而Wnt3a信号传导的抑制则不是。

发明实施方案详述

I.定义

用于本文目的的“接纳体人构架”是包含衍生白人免疫球蛋白构架或如下所定义的人共有构架的轻链可变结构域(VL)构架或重链可变结构域(VH)构架的氨基酸序列的构架。“衍生白”人免疫球蛋白构架或人共有构架的接纳体人构架可以包含其相同的氨基酸序列，或其可以包含氨基酸序列的变化。在一些实施方案中，氨基酸变化的数目为10以下，9以下，8以下，7以下，6以下，5以下，4以下，3以下，或2以下。在一些实施方案中，VL接纳体人构架的序列与VL人免疫球蛋白构架序列或人共有构架序列相同。

“亲和力”是指分子(例如抗体)的单一结合位点与其结合配偶体(例如抗原)之间全部非共价相互作用总和的强度。除非另有说明，在用于本文时，“结合亲和力”指反映结合对的成员(例如抗体与抗原)之间1∶1相互作用的内在结合亲和力。分子X对其配偶体Y的亲和力通常可用解离常数(Kd)来表述。亲和力可通过本领域知道的常用方法来测量，包括本文中所描述的那些。用于测量结合亲和力的具体说明性和示例性实施方案描述于以下。

“亲和力成熟的”抗体指这样的抗体，在该抗体的一个或多个高变区(HVR)中具有一处或多处改变，导致该抗体对抗原的亲和力与没有这些改变的亲本抗体相比有提高。

术语“抗LRP5抗体”和“结合LRP5的抗体”是指这样的抗体，所述抗体能够以足够的亲和力结合LRP5抗体以致所述抗体可以用作靶向LRP5中的诊断剂和/或治疗剂。在一个实施方案中，抗LRP5抗体与不相关的、非LRP5蛋白结合的程度低于所述抗体与LRP5结合的约10％，如例如通过放射性免疫测定(RIA)测量的。在某些实施方案中，结合LRP5的抗体的解离常数(Kd)≤1μM，≤100nM，≤10nM，≤1nM，≤0.1nM，≤0.01nM，或≤0.001nM(例如10^-8M以下，例如10^-8M至10^-13M，例如10^-9M至10^-13M)。在某些实施方案中，抗LRP5抗体结合在来自不同物种的LRP5中保守的LRP5表位。

术语″抗体″在本文中以最广义使用，并且包括不同抗体结构，包括但不限于单克隆抗体，多克隆抗体，多特异性抗体(例如，双特异性抗体)，和抗体片段，只要它们显示所需的抗原结合活性。

“抗体片段”是指不同于完整抗体的分子，其包含完整抗体的部分，所述部分结合完整抗体结合的抗原。抗体片段的实例包括但不限于Fv，Fab，Fab’，Fab'-SH，F(ab')₂；双抗体；线性抗体；单链抗体分子(例如scFv)；和由抗体片段形成的多特异性抗体。

与参照抗体“结合相同表位的抗体”是指这样的抗体，其在竞争测定中阻断50％以上的所述参照抗体与其抗原的结合，反之，参照抗体在竞争测定中阻断50％以上的该抗体与其抗原的结合。本文中提供一个示例性竞争测定。

术语“嵌合”抗体是指这样的抗体，其中一部分重链和/或轻链来源于特定来源或物种，而剩余的重链和/或轻链来源于不同来源或物种。

抗体的“类别”是指其重链具有的恒定结构域或恒定区的类型。有五个主要类别的抗体：IgA，IgD，IgE，IgG和IgM，并且这些中的数个可以进一步被划分为亚类(同种型)，例如，IgG₁，IgG₂，IgG₃，IgG₄，IgA₁和IgA₂。对应于不同类别的免疫球蛋白的重链恒定结构域分别被称为α，δ，ε，γ和μ。

术语“细胞毒性剂”用在本发明中指抑制或防止细胞功能和/或引起细胞死亡或破坏的物质。细胞毒性剂包括但不限于：放射性同位素(例如，At²¹¹，I¹³¹，I¹²⁵，Y⁹⁰，Re¹⁸⁶，Re¹⁸⁸，Sm¹⁵³，Bi²¹²，P³²，Pb²¹²和Lu的放射性同位素)；化疗剂或药物(例如，甲氨蝶呤(methotrexate)，阿霉素(adriamicin)，长春花生物碱(vinca alkaloids)(长春新碱(vincristine)，长春碱(vinblastine)，依托泊苷(etoposide))，多柔比星(doxorubicin)，美法仑(melphalan)，丝裂霉素(mitomycin)C，苯丁酸氮芥(chlorambucil)，柔红霉素(daunorubicin)或其它嵌入剂)；生长抑制剂；酶及其片段如核酸水解酶；抗生素；毒素如小分子毒素或细菌、真菌、植物或动物起源的酶促活性毒素，包括其片段和/或变体；和下面公开的各种抗肿瘤或抗癌剂。

“效应子功能”指那些可归于抗体Fc区且随抗体同种型而变化的生物学活性。抗体效应子功能的实例包括：C1q结合和补体依赖性细胞毒性(CDC)；Fc受体结合；抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)；吞噬作用；细胞表面受体(例如B细胞受体)下调；和B细胞活化。

试剂例如药物制剂的“有效量”是指在需要的剂量和时间阶段有效获得所需的治疗或预防结果的量。

术语“Fc区”在本文中用于定义免疫球蛋白重链的C端区域，所述区域包含至少一部分的恒定区。该术语包括天然序列Fc区和变体Fc区。在一个实施方案中，人IgG重链Fc区从Cys226或Pro230延伸至重链的羰基端。然而，Fc区的C端赖氨酸(Lys447)可以存在或者可以不存在。除非另外说明，Fc区或恒定区中的氨基酸残基的编号是根据EU编号系统，其也被称为EU索引，如在Kabat等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest(免疫学感兴趣的蛋白质的序列)，5th Ed.Public Health Service，National Institutes ofHealth，Bethesda，MD，1991中所述。

“构架”或“FR”是指除高变区(HVR)残基之外的可变结构域残基。可变结构域的FR通常由四个FR结构域组成：FR1，FR2，FR3和FR4。因此，HVR和FR序列通常出现在VH(或VL)的以下序列中：FRi-H1(L1)-FR2-H2(L2)-FR3-H3(L3)-FR4。

术语“全长抗体”、“完整的抗体”和“完整抗体”在本文被可交换地用于指结构与天然抗体结构基本相似或具有包含如本文所定义的Fc区的重链的抗体。

术语“宿主细胞”、“宿主细胞系”和“宿主细胞培养物”被可交换地使用并且是指其中引入外源核酸的细胞，包括这种细胞的后代。宿主细胞包括“转化体”和“转化的细胞”，其包括初级转化的细胞和来源于其的后代，而不考虑传代的数目。后代在核酸含量上可能与亲本细胞不完全相同，而是可以包含突变。本文中包括与在最初转化的细胞中筛选或选择的具有相同功能或生物学活性的突变体后代。

“人抗体”指具有这样的氨基酸序列的抗体，所述氨基酸序列对应于这样抗体的氨基酸序列，所述抗体由人或人细胞生成或来源于非人来源，其利用人抗体库或其它人抗体编码序列。人抗体的这种定义明确排除包含非人抗原结合残基的人源化抗体。

“人共有构架”是指这样的构架，即在选择人免疫球蛋白VL或VH构架序列中，其代表最常出现的氨基酸残基。一般而言，对人免疫球蛋白VL或VH序列的选择是从可变结构域序列的亚型中选择。一般而言，该序列的亚型是如Kabat等人，Sequences of Proteins ofImmunological Interest(免疫学感兴趣的蛋白质的序列)，第五版，NIH Publication91-3242，Bethesda MD(1991)，1-3卷中的亚型。在一个实施方案中，对于VL，该亚型是如Kabat等(见上文)中的亚型κI。在一个实施方案中，对于VH，该亚型是如Kabat等(见上文)中的亚型III。

“人源化”抗体是指包含来自非人HVR的氨基酸残基和来自人FR的氨基酸残基的嵌合抗体。在某些实施方案中，人源化抗体将包含基本上所有的至少一个、通常两个可变结构域，其中所有或基本上所有的HVR(例如，CDR)对应于非人抗体的那些，并且所有或基本上所有的FR对应于人抗体的那些。人源化抗体任选可以包含至少一部分的来源于人抗体的抗体恒定区。抗体(例如非人抗体)的“人源化形式”是指已经进行了人源化的抗体。

术语“高变区”或“HVR”当在本文中使用时，是指抗体可变结构域的每个区域，其序列高可变和/或形成结构上限定的环（“高变环”)。通常，天然四链抗体包含六个HVR；三个在VH(H1，H2，H3)中，三个在VL(L1，L2，L3)中。HVR通常包含来自高变环和/或“互补决定区”(CDR)的氨基酸残基，后者具有最高序列可变性和/或涉及抗原识别。示例性高变环出现在氨基酸残基26-32(L1)、50-52(L2)、91-96(L3)、26-32(H1)、53-55(H2)、和96-101(H3)。(Chothia和Lesk，J.Mol.Biol.196：901-917(1987))。示例性CDR(CDR-L1，CDR-L2，CDR-L3，CDR-H1，CDR-H2，和CDR-H3)发生在以下氨基酸残基：L1的24-34，L2的50-56，L3的89-97，H1的31-35B，H2的50-65，和H3的95-102。(Kabat等人，Sequences of Proteins ofImmunological Interest(免疫学感兴趣的蛋白质的序列)，5th Ed.Public HealthService，National Institutes of Health，Bethesda，MD(1991))。除了VH中的CDR1，CDR通常包含形成高变环的氨基酸残基。CDR还包含“特异性决定残基”或“SDR”，其是与抗原接触的残基。SDR包含在被称为缩短的(abbreviated)-CDR或a-CDR的CDR区域中。示例性a-CDR(a-CDR-L1，a-CDR-L2，a-CDR-L3，a-CDR-H1，a-CDR-H2，和a-CDR-H3)发生在氨基酸残基L1的31-34，L2的50-55，L3的89-96，H1的31-35B，H2的50-58，和H3的95-102。(见Almagro和Fransson，Front.Biosci.13：1619-1633(2008))。除非另外说明，可变结构域中的HVR残基和其他残基(例如，FR残基)在本文中根据Kabat等(见上文)编号。

“免疫缀合物”是与一个或多个异源分子(包括但不限于细胞毒性剂)缀合的抗体。

“个体”或“受试者”是哺乳动物。哺乳动物包括但不限于，家养动物(例如，牛，羊，猫，狗和马)，灵长类动物（例如，人和非人灵长类动物如猴)，兔，以及啮齿类动物(例如，小鼠和大鼠)。在某些实施方案中，个体或受试者是人。

“分离的”抗体是这样的抗体，其已经与其天然环境的组分分离。在一些实施方案中，将抗体纯化至超过95％或99％纯度，如通过例如电泳(例如，SDS-PAGE，等电聚焦(IEF)，毛细管电泳)或层析(例如，离子交换或反相HPLC)确定的。对于用于评估抗体纯度的方法的综述，参见，例如，Flatman等人，J.Chromatogr.B848：79-87(2007)。

“分离的”核酸是指这样的核酸分子，其已经与其天然环境的组分分离。分离的核酸包括包含在通常包含该核酸分子的细胞中的核酸分子，但是该核酸分子存在于染色体外或在不同于其天然染色体位置的染色体位置处。

“分离的编码抗LRP5抗体的核酸”是指一个或多个核酸分子，其编码抗体重和轻链(或其片段)，包括在单一载体或分开的载体中的这样的核酸分子，以及存在于宿主细胞中的一个或多个位置处的这样的核酸分子。

术语“单克隆抗体”在用于本文时指从一群基本上同质的抗体中获得的抗体，即除了可能的变体抗体(该变体抗体例如含有天然存在的突变或在产生单克隆抗体制剂的过程中出现，此类变体通常少量存在)外，构成群体的个体抗体是相同的和/或结合相同的表位。相比于通常包括针对不同决定簇(表位)的不同抗体的多克隆抗体制剂，单克隆抗体制剂中的每个单克隆抗体针对抗原上的单一决定簇。因此，修饰语“单克隆”表明抗体从基本上同质的抗体群获得的特征，不应解释为要求通过任何特定方法来产生抗体。例如，将根据本发明使用的单克隆抗体可通过多种技术来生成，包括但不限于杂交瘤法，重组DNA法，噬菌体展示法，和利用包含所有或部分的人免疫球蛋白基因座的转基因动物的方法，这样的方法和用于制备单克隆抗体的其他示例性方法描述于本文中。

“裸抗体”是指没有缀合异源部分(如细胞毒性部分)或放射性标记的抗体。裸抗体可以存在于药物制剂中。

“天然抗体”是指天然存在的具有变化的结构的免疫球蛋白分子。例如，天然IgG抗体是约150,000道尔顿的异源四聚体糖蛋白，其由两个相同的轻链和两个相同的重链组成，所述链通过二硫键结合。从N末端至C末端，每个重链具有可变区(VH)，其也被称为可变重结构域或重链可变结构域，其后是三个恒定结构域(CH1，CH2和CH3)。类似地，从N末端到C末端，每个轻链具有可变区(VL)，其也被称为可变轻结构域或轻链可变结构域，其后是恒定轻(CL)结构域。基于其恒定结构域的氨基酸序列，抗体的轻链可以被分配给被称为kappa(κ)和lambda(λ)的两个类型中的一个。

术语“包装说明书”用于指通常包括在治疗产品的商品包装中的使用说明，其包含关于适应征、用法、剂量、给药、组合疗法、禁忌症的信息和/或关于使用这样的治疗产品的警告。

相对于参比多肽序列的“百分比(％)氨基酸序列同一性”定义为在将所述序列进行比对(并在必要时导入空位)以获取最大百分比序列同一性，且不将任何保守置换视为序列同一性的部分之后，候选序列中的氨基酸残基与参比多肽序列中的氨基酸残基相同的百分数。可使用本领域各种方法进行序列比对以便测定百分比氨基酸序列同一性，例如，使用公众可得到的计算机软件如BLAST、BLAST-2、ALIGN或Megalign(DNASTAR)软件。本领域技术人员可以决定测量比对的适宜参数，包括对所比较的序列全长获得最大比对所需的任何算法。然而，为此目的，％氨基酸序列同一性值使用序列比较计算机程序ALIGN-2产生。ALIGN-2序列比较计算机程序的作者是Genentech，Inc，并且源代码已经随用户文档提交至美国版权局(Washington D.C.，20559)，其美国版权注册登记号为TXU510087。公众可通过Genentech，Inc.(South San Francisco，California)得到ALIGN-2程序，或者可以从源代码编译。ALIGN-2程序应当为在UNIX操作系统、包括数字UNIXV4.0D上使用而进行编译。ALIGN-2程序设定了所有序列比对参数并且不变。

在ALIGN-2应用于氨基酸序列比较的情况中，给定氨基酸序列A相对于(to)、与(with)、或针对(against)给定氨基酸序列B的％氨基酸序列同一性(或者这样说：给定氨基酸序列A具有或含有相对于、与或针对给定氨基酸序列B的某一％氨基酸序列同一性)如下计算：

100乘以X/Y比值

其中X是用序列比对程序ALIGN-2在该程序的A和B比对中评分为相同匹配的氨基酸残基数，且其中Y是B中的氨基酸残基总数。可以理解，当氨基酸序列A与氨基酸序列B的长度不相等时，A相对于B的％氨基酸序列同一性将不等于B相对于A的％氨基酸序列同一性。除非另外具体说明，在本文用的所有％氨基酸序列同一性的值都是用ALIGN-2计算机程序如前段所描述的那样得到的。

术语“药物制剂”指这样的制剂，其以允许包含在其中的活性成分的生物学活性有效的形式存在，并且不包含对施用所述制剂的受试者具有不可接受的毒性的另外的成分。

“药用载体”是指药物制剂中不同于活性成分的成分，其对受试者是无毒的。药用载体包括但不限于缓冲剂、赋形剂、稳定剂或防腐剂。

除非另外说明，术语“低密度脂蛋白受体相关蛋白5(Low-density lipoproteinreceptor-related protein5)”、或“LRP5”当用于本文中时是指来自任何脊椎动物来源(包括哺乳动物如灵长类动物(例如人)和啮齿类动物(例如，小鼠和大鼠))的任何天然LRP5，除非另有说明。该术语涵盖“全长”未加工的LRP5以及由细胞内加工产生的任何形式的LRP5。该术语还包括天然存在的LRP5的变体，例如，剪接变体或等位变体。示例性人LRP5的氨基酸序列如下：

MEAAPPGPPWPLLLLLLLLLALCGCPAPAAASPLLLFANRRDVRLVDAGGVKLESTIVVSGLEDAAAVDFQFSKGAVYWTDVSEEAIKQTYLNQTGAAVQNVVISGLVSPDGLACDWVGKKLYWTDSETNRIEVANLNGTSRKVLFWQDLDQPRAIALDPAHGYMYWTDWGETPRIERAGMDGSTRKIIVDSDIYWPNGLTIDLEEQKLYWADAKLSFIHRANLDGSFRQKVVEGSLTHPFALTLSGDTLYWTDWQTRSIHACNKRTGGKRKEILSALYSPMDIQVLSQERQPFFHTRCEEDNGGCSHLCLLSPSEPFYTCACPTGVQLQDNGRTCKAGAEEVLLLARRTDLRRISLDTPDFTDIVLQVDDIRHAIAIDYDPLEGYVYWTDDEVRAIRRAYLDGSGAQTLVNTEINDPDGIAVDWVARNLYWTDTGTDRIEVTRLNGTSRKILVSEDLDEPRAIALHPVMGLMYWTDWGENPKIECANLDGQERRVLVNASLGWPNGLALDLQEGKLYWGDAKTDKIEVINVDGTKRRTLLEDKLPHIFGFTLLGDFIYWTDWQRRSIERVHKVKASRDVIIDQLPDLMGLKAVNVAKVVGTNPCADRNGGCSHLCFFTPHATRCGCPIGLELLSDMKTCIVPEAFLVFTSRAAIHRISLETNNNDVAIPLTGVKEASALDFDVSNNHIYWTDVSLKTISRAFMNGSSVEHVVEFGLDYPEGMAVDWMGKNLYWADTGTNRIEVARLDGQFRQVLVWRDLDNPRSLALDPTKGYIYWTEWGGKPRIVRAFMDGTNCMTLVDKVGRANDLTIDYADQRLYWTDLDTNMIESSNMLGQERVVIADDLPHPFGLTQYSDYIYWTDWNLHSIERADKTSGRNRTLIQGHLDFVMDILVFHSSRQDGLNDCMHNNGQCGQICLAIPGGHRCGCASHYTLDPSSRNCSPPTTFLLFSQKSAISRMIPDDQHSPDLILPLHGLRNVKAIDYDPLDKFIYWVDGRQNIKRAKDDGTQPFVLTSLSQGQNPDRQPHDLSIDIYSRTLFWTCEATNTINVHRLSGEAMGVVLRGDRDKPRAIVVNAERGYLYFTNMQDRAAKIERAALDGTEREVLFTTGLIRPVALVVDNTLGKLFWVDADLKRIESCDLSGANRLTLEDANIVQPLGLTILGKHLYWIDRQQQMIERVEKTTGDKRTRIQGRVAHLTGIHAVEEVSLEEFSAHPCARDNGGCSHICIAKGDGTPRCSCPVHLVLLQNLLTCGEPPTCSPDQFACATGEIDCIPGAWRCDGFPECDDQSDEEGCPVCSAAQFPCARGQCVDLRLRCDGEADCQDRSDEADCDAICLPNQFRCASGQCVLIKQQCDSFPDCIDGSDELMCEITKPPSDDSPAHSSAIGPVIGIILSLFVMGGVYFVCQRVVCQRYAGANGPFPHEYVSGTPHVPLNFIAPGGSQHGPFTGIACGKSMMSSVSLMGGRGGVPLYDRNHVTGASSSSSSSTKATLYPPILNPPPSPATDPSLYNMDMFYSSNIPATARPYRPYIIRGMAPPTTPCSTDVCDSDYSASRWKASKYYLDLNSDSDPYPPPPTPHSQYLSAEDSCPPSPATERSYFHLFPPPPSPCTDSS

(SEQ ID NO：42)。

用于本文时，“治疗(treatment)”(及其语法变化如“治疗(treat)”或“治疗(treating)”)指在尝试改变待治疗的个体的天然进程中的临床干预，并且可以为了预防或在临床病理学的进程中进行。治疗的理想效果包括但不限于防止疾病发生或复发，缓和症状，消除疾病的任何直接或间接病理学后果，预防转移，减少疾病进展速率，改善或减轻疾病状态，和症状缓解或改善的预后。在一些实施方案中，将本发明的抗体用于延缓疾病的发生或减缓疾病的进展。

术语“可变区”或“可变结构域”是指参与抗体与抗原结合的抗体重或轻链的结构域。天然抗体的重链和轻链(VH和VL，分别地)的可变结构域通常具有相似的结构，其中每个结构域包含四个保守的构架区(FR)和三个高变区(HVR)。(参见，例如，Kindt等KubyImmunology，6^th ed.，W.H.Freeman and Co.91页(2007))。单个VH或VL结构域可以足以给予抗原结合特异性。此外，可以使用来自与特定抗原结合的抗体的VH或VL结构域来分离结合所述抗原的抗体，以分别筛选互补VL或VH结构域的文库。参见，例如，Portolano等人，J.Immunol.150：880-887(1993)；Clarkson等人，Nature352：624-628(1991)。

术语″载体″当在本文中使用时是指能够增殖与其相连的另一个核酸的核酸分子。该术语包括作为自我复制核酸结构的载体以及结合到已经引入其的宿主细胞的基因组中的载体。一些载体能够指导与其可操作相连的核酸的表达。这样的载体在本文中被称为″表达载体″。

II.组合物和方法

在一方面中，本发明部分基于增强Norrin和/或Norrin/Frizzled4信号传导的抗体的发现。在一些实施方案中，提供结合人LRP5的抗体。本发明的抗体是有用的，例如，用于下列疾病的诊断或治疗：视网膜病变，包括增生性糖尿病性视网膜病变(proliferativediabetic retinopathy)，CNV，AMD，糖尿病性和其他缺血相关的视网膜病变，DME，病理性近视(pathological myopia)，希佩尔-林道病(von Hippel-Lindau disease)，眼睛的组织胞浆菌病(histoplasmosis)，CRVO，BRVO，角膜新血管形成，视网膜新血管形成，ROP，FEVR，外层渗出性视网膜病变(Coats’disease)，诺里病(Norrie Disease)，OPPG(骨质疏松-假神经胶质瘤综合征(Osteoporosis-Pseudoglioma Syndrome))，结膜下出血(subconjunctivalhemorrhage)，和高血压性视网膜病变(hypertensive retinopathy)。

A.示例性的抗LRP5抗体

在一方面中，本发明提供结合LRP5的分离的抗体。在某些实施方案中，抗LRP5抗体增强Norrin活性和/或Norrin/Fzd4信号传导。

在一方面中，本发明提供包含选自以下各项的至少一种、两种、三种、四种、五种、或六种HVR的抗PRO抗体：(a)HVR-H1，所述HVR-H1包含SEQ ID NO：28的氨基酸序列；(b)HVR-H2，所述HVR-H2包含SEQ ID NO：26或27的氨基酸序列；(c)HVR-H3，所述HVR-H3包含SEQ IDNO：23或24的氨基酸序列；(d)HVR-L1，所述HVR-L1包含SEQ ID NO：29或30的氨基酸序列；(e)HVR-L2，所述HVR-L2包含SEQ ID NO：31或32的氨基酸序列；和(f)HVR-L3，所述HVR-L3包含SEQ ID NO：33的氨基酸序列。

在一方面中，本发明提供包含选自以下各项的至少一种、至少两种、或全部三种VHHVR序列的抗体：(a)HVR-H1，所述HVR-H1包含SEQ ID NO：28的氨基酸序列；(b)HVR-H2，所述HVR-H2包含SEQ ID NO：26或27的氨基酸序列；和(c)HVR-H3，所述HVR-H3包含SEQ ID NO：23或24的氨基酸序列。在一个实施方案中，抗体包含HVR-H3，所述HVR-H3包含SEQ ID NO：23或24的氨基酸序列。在另一个实施方案中，抗体包含HVR-H3和HVR-L3，所述HVR-H3包含SEQ IDNO：23或24的氨基酸序列，所述HVR-L3包含SEQ ID NO：33的氨基酸序列。在进一步的实施方案中，抗体包含：包含SEQ ID NO：23或24的氨基酸序列的HVR-H3、包含SEQ ID NO：33的氨基酸序列的HVR-L3、和包含SEQ ID NO：26或27的氨基酸序列的HVR-H2。在进一步的实施方案中，抗体包含(a)HVR-H1，所述HVR-H1包含SEQ ID NO：28的氨基酸序列；(b)HVR-H2，所述HVR-H2包含SEQ ID NO：26或27的氨基酸序列；和(c)HVR-H3，所述HVR-H3包含SEQ ID NO：23或24的氨基酸序列。

在另一方面中，本发明提供包含选自以下各项的至少一种、至少两种、或全部三种VL HVR序列的抗体：(a)HVR-L1，所述HVR-L1包含SEQ ID NO：29或30的氨基酸序列；(b)HVR-L2，所述HVR-L2包含SEQ ID NO：31或32的氨基酸序列；和(c)HVR-L3，所述HVR-L3包含SEQID NO：33的氨基酸序列。在一个实施方案中，抗体包含(a)HVR-L1，所述HVR-L1包含SEQ IDNO：29或30的氨基酸序列；(b)HVR-L2，所述HVR-L2包含SEQ ID NO：31或32的氨基酸序列；和(c)HVR-L3，所述HVR-L3包含SEQ ID NO：33的氨基酸序列。

在另一方面中，本发明的抗体包含(a)包含选自以下各项的至少一种、至少两种、或全部三种VH HVR序列的VH结构域：(i)HVR-H1，所述HVR-H1包含SEQ ID NO：28的氨基酸序列，(ii)HVR-H2，所述HVR-H2包含SEQ ID NO：26或27的氨基酸序列，和(iii)HVR-H3，所述HVR-H3包含选自SEQ ID NO：23或24的氨基酸序列；和(b)包含选自以下各项的至少一种、至少两种、或全部三种VL HVR序列的VL结构域：(i)HVR-L1，所述HVR-L1包含SEQ ID NO：29或30的氨基酸序列，(ii)HVR-L2，所述HVR-L2包含SEQ ID NO：31或32的氨基酸序列，和(c)HVR-L3，所述HVR-L3包含SEQ ID NO：33的氨基酸序列。

在另一方面中，本发明提供抗体，所述抗体包含(a)HVR-H1，所述HVR-H1包含SEQID NO：28的氨基酸序列；(b)HVR-H2，所述HVR-H2包含SEQ ID NO：26或27的氨基酸序列；(c)HVR-H3，所述HVR-H3包含SEQ ID NO：23或24的氨基酸序列；(d)HVR-L1，所述HVR-L1包含SEQID NO：29或30的氨基酸序列；(e)HVR-L2，所述HVR-L2包含SEQ ID NO：31或32的氨基酸序列；和(f)HVR-L3，所述HVR-L3包含选自SEQ ID NO：33的氨基酸序列。

在任何以上的实施方案中，抗LRP5抗体都可以是人源化的。在一个实施方案中，抗LRP5抗体包含如在任何以上实施方案中的HVR，并且还包含接纳体人框架，例如，人免疫球蛋白框架或人共有框架。在另一个实施方案中，抗LRP5抗体包含如在任何以上实施方案中的HVR，并且还包含含有FR序列的VH或VL，其中FR序列如下。对于重链来说，FR1包含序列EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAAS(SEQ ID NO：34)，FR2包含序列WVRQAPGKGLEWV(SEQ ID NO：35)，FR3包含序列RFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAR(SEQ ID NO：36)，FR4包含序列WGQ(SEQ ID NO：37)。对于轻链来说，FR1包含序列DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITC(SEQ ID NO：38)，FR2包含序列WYQQKPGKAPKLLIY(SEQ ID NO：39)，FR3包含序列GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYC(SEQ ID NO：40)，FR4包含序列FGQGTKVEIKR(SEQ IDNO：41)。

在另一个方面中，抗LRP5抗体包含重链可变结构域(VH)序列，其与SEQ ID NO：1-11中任一个的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、或100％序列同一性。在某些实施方案中，具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、或99％同一性的VH序列包含相对于参照序列的置换(例如保守性置换)，插入或缺失，但是包含该序列的抗LRP5抗体保持与LRP5结合的能力。在某些实施方案中，在SEQ ID NO：1-11中的任一个，总计1至10个氨基酸被置换、插入和/或缺失。在某些实施方案中，置换、插入或缺失发生在HVR外的区域(即，在FR中)。任选地，抗LRP5抗体包含SEQID NO：1-11中的任一个的VH序列，包括所述序列的翻译后修饰。在具体的实施方案中，VH包含选自以下各项的一种、两种或三种HVR：(a)HVR-H1，所述HVR-H1包含SEQ ID NO：28的氨基酸序列，(b)HVR-H2，所述HVR-H2包含SEQ ID NO：26或27的氨基酸序列，和(c)HVR-H3，所述HVR-H3包含SEQ ID NO：23或24的氨基酸序列。

在另一个方面中，提供抗LRP5抗体，其中所述抗LRP5抗体包含轻链可变结构域(VL)，其与SEQ ID NO：12-22的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、或100％序列同一性。在某些实施方案中，具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、或99％同一性的VL序列包含相对于参照序列的置换(例如保守性置换)，插入或缺失，但是包含该序列的抗PRO抗体保持与PRO结合的能力。在某些实施方案中，在SEQ ID NO：12-22中，总计1至10个氨基酸被置换、插入和/或缺失。在某些实施方案中，置换，插入或缺失发生在HVR外的区域(即，在FR中)。任选地，抗LRP5抗体包含SEQ ID NO：12-22中的VL序列，包括所述序列的翻译后修饰。在具体的实施方案中，VL包含选自以下各项的一种、两种或三种HVR(a)HVR-L1，所述HVR-L1包含SEQ ID NO：29或30的氨基酸序列；(b)HVR-L2，所述HVR-L2包含SEQ ID NO：31或32的氨基酸序列；和(c)HVR-L3，所述HVR-L3包含SEQ ID NO：33的氨基酸序列。

在另一方面中，提供抗LRP5抗体，其中所述抗体包含如在任何以上提供的实施方案中的VH，和如在任何以上提供的实施方案中的VL。在一个实施方案中，抗体包含分别在SEQ ID NO：1-11和SEQ ID NO：12-22中的任一个的VH和VL序列，包括那些序列的翻译后修饰。在一些实施方案中，所述抗体包含如下的VH和VL序列：SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：4和SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：6和SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：7和SEQ IDNO：18、SEQ ID NO：8和SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：9和SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：10和SEQID NO：21、或者SEQ ID NO：11和SEQ ID NO：22。

在进一步的方面中，本发明提供抗体，所述抗体结合与本文提供的抗LRP5抗体相同的表位。例如，在某些实施方案中，提供这样的抗体，所述抗体结合与包含SEQ ID NO：1的VH序列和SEQ ID NO：12的VL序列、或者包含SEQ ID NO：5的VH序列和SEQ ID NO：16的VL序列的抗LRP5抗体相同的表位。

在本发明的另一个方面中，根据任何以上实施方案的抗LRP5抗体是单克隆抗体，包括嵌合抗体、人源化抗体或人抗体。在一个实施方案中，抗LRP5抗体是抗体片段，例如，Fv，Fab，Fab’，scFv，双抗体或F(ab’)₂片段。在另一个实施方案中，抗体是全长抗体，例如，完整IgG1抗体或如本文所定义的其他抗体类别或同种型。

在另一方面中，根据任何以上实施方案的抗LRP5抗体可以结合如在以下部分1-7中所述的任何特征(单独地或组合地)：

1.抗体亲和力

在某些实施方案中，本文提供的抗体具有的解离常数(Kd)≤1μM，≤100nM，≤10nM，≤1nM，≤0.1nM，≤0.01nM，或≤0.001nM(例如10^-8M以下，例如10^-8M至10^-13M，例如，10^-9M至10^-13M)。

在一个实施方案中，Kd通过用目的抗体的Fab形式及其抗原进行的放射性标记的抗原结合测定法(RIA)测量，如由以下测定所述的。Fab对抗原的溶液结合亲和力通过在存在未标记抗原的滴定系列的情况下，用最小浓度的(¹²⁵I)-标记的抗原平衡Fab，接着用抗-Fab抗体-包被的板捕获结合的抗原来测量(参见，例如，Chen等人，J.Mol.Biol.293：865-881(1999))。为了确定测定的条件，将多孔板(Thermo Scientific)用5μg/ml的在50mM碳酸钠(pH9.6)中的捕获抗-Fab抗体(Cappel Labs)包被过夜，并随后用PBS中的2％(w/v)牛血清白蛋白在室温(约23℃)封闭2-5小时。在非吸附板(Nunc#269620)中，将100pM或26pM[¹²⁵I]-抗原与目的Fab的系列稀释物混合(与在Presta等人，癌症研究(Cancer Res).57：4593-4599(1997)中的抗-VEGF抗体，Fab-12的评估一致)。接着，将目的Fab温育过夜；然而温育可以持续更长的阶段(例如65小时)从而确保达到平衡。随后，将混合物转移到捕获板中以在室温进行温育(例如1小时)。接着，去除溶液，并将所述板用在PBS中的0.1％聚山梨醇酯20()洗涤8次。当所述板已经干燥时，加入150μl/孔的闪烁剂(MICROSCINT-20^TM；Packard)，并将所述板在TOPCOUNT^TMγ计数器(Packard)上计数10分钟。选择提供少于或等于20％的最大结合的每种Fab的浓度用在竞争性结合测定中。

根据另一个实施方案，Kd是通过表面等离子共振测定法使用-2000或-3000仪器(BIAcore，Inc.，Piscataway，NJ)在25℃使用固定化抗原CM5芯片在～10个应答单位(RU)测量的。简而言之，依照供应商的说明书用盐酸N-乙基-N'-(3-二甲基氨基丙基)-碳化二亚胺(EDC)和N-羟基-琥珀酰亚胺(NHS)活化羧甲基化右旋糖苷生物传感器芯片(CM5，BIACORE Inc.)。用10mM乙酸钠pH4.8将抗原稀释至5μg/ml(～0.2μM)，然后以5μl/分钟的流速注入至获得约10个应答单位(RU)的偶联蛋白质。注入抗原后，注入1M乙醇胺以封闭未反应基团。为了进行动力学测量，在25℃以约25μl/分钟的流速注入在含0.05％聚山梨醇酯20(TWEEN-20^TM)表面活性剂的PBS(PBST)中的两倍连续稀释的Fab(0.78nM至500nM)。使用简单一对一朗格缪尔(Langmuir)结合模型( Evaluation Software version3.2)通过同时拟合结合和解离传感图计算结合速率(k_on)和解离速率(k_off)。平衡解离常数(Kd)以比率k_off/k_on计算。参见例如Chen等人，J.Mol.Biol.(分子生物学杂志)293：865-881(1999)。如果根据上文表面等离子共振测定法，结合速率超过10⁶M^-1s^-1，那么结合速率可使用荧光淬灭技术来测定，即根据分光计诸如配备了断流装置的分光光度计(Aviv Instruments)或8000系列SLM-AMINCO^TM分光光度计(ThermoSpectronic)中用搅拌比色杯(stirred cuvette)的测量，在存在浓度渐增的抗原的条件下，测量PBS，pH7.2中的20nM抗-抗原抗体(Fab形式)在25℃的荧光发射强度(激发＝295nm；发射＝340nm，16nm带通)的升高或降低。

2.抗体片段

在某些实施方案中，本文提供的抗体是抗体片段。抗体片段包括但不限于，Fab，Fab’，Fab'-SH，F(ab')₂，Fv，和scFv片段，以及以下描述的其他片段。对于特定抗体片段的综述，请参见Hudson等Nat.Med.9：129-134(2003)。对于scFv片段的综述，请参见，例如，Pluckthün，The Pharmacology of Monoclonal Antibodies(单克隆抗体的药理学)，卷113，Rosenburg和Moore编辑，(Springer-Verlag，New York)，269-315页(1994)；还请参见WO 93/16185；和美国专利号5,571,894和5,587,458。对于包含拯救受体(salvagereceptor)结合表位残基和具有提高的体内半衰期的Fab和F(ab’)₂片段的讨论，参见美国专利号5,869,046。

双抗体是具有两个抗原结合位点的抗体片段，其可以是二价或双特异性的。参见，例如，EP 404,097；WO 1993/01161；Hudson等人，Nat.Med.9：129-134(2003)；和Hollinger等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA90：6444-6448(1993)。三抗体和四抗体也描述于Hudson等人，Nat.Med.9：129-134(2003)中。

单一结构域抗体是包含抗体的全部或部分重链可变结构域或全部或部分轻链可变结构域的抗体片段。在某些实施方案中，单一结构域抗体是人单一结构域抗体(Domantis，Inc.，Waltham，MA；参见，例如，美国专利号6,248,516 B1)。

抗体片段可以通过不同技术制备，包括但不限于完整抗体的蛋白水解消化以及通过重组宿主细胞(例如大肠杆菌或噬菌体)产生，如本文所述。

3.嵌合和人源化抗体

在某些实施方案中，本文中所提供的抗体是嵌合抗体。某些嵌合抗体于例如美国专利第4,816,567号；及Morrison等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，81：6851-6855(1984)中描述。在一个实例中，嵌合抗体包含非人类可变区(例如源自小鼠、大鼠、仓鼠、兔或例如猴的非人类灵长类动物的可变区)及人类恒定区。在另一实例中，嵌合抗体是种类或亚类已经自亲本抗体的种类或亚类发生变化的“种类转变”抗体。嵌合抗体包括其抗原结合片段。

在某些实施方案中，嵌合抗体是人源化抗体。通常，非人类抗体经人源化以降低对人类的免疫原性，同时保持亲本非人类抗体的特异性及亲和力。一般而言，人源化抗体包含一个或多个可变结构域，其中HVRs，例如CDRs(或其部分)源自非人类抗体，且FRs(或其部分)是源自人类抗体序列。人源化抗体任选地也将包含人类恒定区的至少一部分。在一些实施方案中，人源化抗体中的一些FR残基经来自非人类抗体(例如HVR残基所源自的抗体)的相应残基置换，例如以恢复或提高抗体特异性或亲和力。

人源化抗体及其制备方法于例如Almagro和Fransson，Front.Biosci.13：1619-1633(2008)中评述，且进一步于例如Riechmann等人，Nature(自然)332：323-329(1988)；Queen等人，Proc.Nat’l.Acad.Sci.USA86：10029-10033(1989)；美国专利第5,821,337号、第7,527,791号、第6,982,321号和第7,087,409号；Kashmiri等人，Methods(方法）36：25-34(2005)(描述SDR(a-CDR)移植)Padlan，Mol.Immunol.(分子免疫学)28：489-498(1991)(描述“表面重整”)；Dall'Acqua等人，Methods36：43-60(2005)(描述“FR重组(shuffling)”)；及Osboum等人，Methods(方法)36：61-68(2005)和Klimka等人，Br.J.Cancer(英国癌症杂志)，83：252-260(2000)(描述FR重组(shuffling)的“导向选择”方法)中描述。

可用于人源化的人类构架区包括，但不限于，使用“最佳拟合”法选择的构架区(参见例如Sims等人，J.Immunol.(免疫学杂志)151：2296(1993))；源自特定亚群的轻链或重链可变区的人类抗体共同序列的构架区(参见例如Carter等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，89：4285(1992)；及Presta等人，J.Immunol.(免疫学杂志)，151：2623(1993))；人类成熟(体细胞突变)构架区或人类生殖系构架区(参见例如Almagro及Fransson，Front.Biosci.13：1619-1633(2008))；及源自筛选FR文库的构架区(参见例如Baca等人，J.Biol.Chem.(生物化学杂志)272：10678-10684(1997)及Rosok等人，J.Biol.Chem.(生物化学杂志)271：22611-22618(1996))。

4.人抗体

在某些实施方案中，本文中所提供的抗体是人抗体。可使用本领域中已知的各种技术来制备人抗体。人抗体一般描述于van Dijk和van de Winkel，Curr.Opin.Pharmacol.(当前药学观点)5：368-74(2001)以及Lonberg，Curr.Opin.Immunol.(当前免疫学观点)20：450-459(2008)。

可通过向已经经过修饰因而对于抗原攻击刺激产生完整人抗体或具有人类可变区的完整抗体的转基因动物施用免疫原，来制备人抗体。这些动物通常含有全部或一部分人类免疫球蛋白基因座，其替代了内源免疫球蛋白基因座，或存在于染色体外或随机整合于动物染色体内。在这些转基因小鼠中，内源免疫球蛋白基因座一般已经失活。关于从转基因动物获得人抗体的方法的综述，参见Lonberg，Nat.Biotech.(自然生物技术)23：1117-1125(2005)。也参见例如描述XENOMOUSE^TM技术的美国专利第6,075,181号及第6,150,584号；描述技术的美国专利第5,770,429号；描述K-M 技术的美国专利第7,041,870号，及描述技术的美国专利申请公开号US 2007/0061900。这些动物产生的完整抗体的人类可变区可进一步修饰，例如通过与不同人类恒定区组合。

人抗体也可通过基于杂交瘤的方法制得。用于产生人单克隆抗体的人骨髓瘤及小鼠-人融合骨髓瘤细胞系已经描述。(参见例如Kozbor J.Immunol.(免疫学杂志)，133：3001(1984)；Brodeur等人，Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications(单克隆抗体产生技术及应用)，第51-63页(Marcel Dekker，Inc.，New York，1987)；并且Boerner等人，J. Immunol.(免疫学杂志)，147：86(1991)。)通过人类B细胞杂交瘤技术产生的人抗体也在Li等人，Proc.Natl.Acad.Sci..USA，103：3557-3562(2006)中描述。其他方法包括例如美国专利第7,189,826号(描述由杂交瘤细胞系产生单克隆人类IgM抗体)及Ni，Xiandai Mianyixue，26(4)：265-268(2006)(描述人-人杂交瘤)中所述的那些方法。人杂交瘤技术(Trioma技术)也于Vollmers和Brandlein，Histology and Histopathology(组织学和组织病理学)，20(3)：927-937(2005)，及Vollmers和Brandlein，Methods and Findingsin Experimental and Clinical Pharmacology(实验和临床药学方法和发现)，27(3)：185-91(2005)中描述。

也可通过分离选自源自人噬菌体展示文库的Fv克隆可变结构域序列产生人抗体。随后可将这些可变结构域序列与所需人恒定结构域组合。下文描述自抗体文库选择人抗体的技术。

5.源自文库的抗体

可通过在组合文库中筛选具有所需活性的抗体来分离本发明抗体。举例来说，本领域中已知多种用于产生噬菌体展示文库并且在这些文库中筛选具有所需结合特征的抗体的方法。这些方法于例如Hoogenboom等人，Methods in Molecular Biology(分子生物学方法)178：1-37(O'Brien等人编，Human Press，Totowa，NJ，2001)中评述，并且进一步于例如McCafferty等人，Nature(自然)348：552-554；Clackson等人，Nature(自然)352：624-628(1991)；Marks等人，J.Mol.Biol.(分子生物学杂志)222：581-597(1992)；Marks及Bradbury，Methods in Molecular Biology(分子生物学方法)248：161-175(Lo编，HumanPress，Totowa，NJ，2003)；Sidhu等人，J.Mol.Biol.(分子生物学杂志)338(2)：299-310(2004)；Lee等人，J.Mol.Biol.(分子生物学杂志)340(5)：1073-1093(2004)；Fellouse，Proc.Natl.Acad.Sci.USA101(34)：12467-12472(2004)；并且Lee等人，J.Immunol.Methods(免疫学方法杂志)284(1-2)：119-132(2004)中描述。

在某些噬菌体展示方法中，VH及VL基因库(repertoire)是通过聚合酶链式反应(PCR)分别克隆并且随机重组于噬菌体文库中，随后可如Winter等人，Ann.Rev.Immunol.(免疫学年度综述)，12：433-455(1994)中所述在其中筛选抗原结合噬菌体。噬菌体通常呈现单链Fv(scFv)片段或Fab片段形式的抗体片段。来自免疫来源的文库无需构建杂交瘤即可提供免疫原的高亲和力抗体。或者，天然库可经克隆(例如自人)以在无任何免疫的情况下提供针对多种非自体抗原以及自体抗原的抗体单一来源，如Griffiths等人，EMBO J，12：725-734(1993)所述。最后，也可以通过从干细胞克隆未重排的V基因区段，并且使用含有随机序列的PCR引物来编码高变性CDR3区，并且实现体外重排来合成制得天然文库，如Hoogenboom及Winter，J.Mol.Biol.(分子生物学杂志)，227：381-388(1992)所述。描述人抗体噬菌体文库的专利公开物包括例如：美国专利第5,750,373号，及美国专利公开第2005/0079574号、第2005/0119455号、第2005/0266000号、第2007/0117126号、第2007/0160598号、第2007/0237764号、第2007/0292936号和第2009/0002360号。

从人抗体文库分离的抗体或抗体片段被视为本文的人抗体或人抗体片段。

6.多特异性抗体

在某些实施方案中，本文中所提供的抗体是多特异性抗体，例如双特异性抗体。多特异性抗体是对至少两个不同位点具有结合特异性的单克隆抗体。在某些实施方案中，一种结合特异性是针对LRP5而另一种是针对任何其他抗原。在某些实施方案中，其他结合特异性是针对血管内皮生长因素(VEGF)。在某些实施方案中，双特异性抗体可结合至LRP5的两个不同表位。双特异性抗体也可用于将细胞毒性剂定位于表达LRP5的细胞。双特异性抗体可制成全长抗体或抗体片段形式。

制造多特异性抗体的技术包括，但不限于，具有不同特异性的两个免疫球蛋白重链-轻链对的重组共表达(参见Milstein及Cuello，Nature(自然)305：537(1983))；WO 93/08829；及Traunecker等人，EMBO J.10：3655(1991))，及“凸起-入-孔洞(knob-in-hole)”工程改造(参见例如美国专利第5,731,168号)。也可通过以下方法制得多特异性抗体：工程改造用于制备抗体Fc-异二聚体的静电导引作用(WO 2009/089004A1)；将两种或两种以上抗体或片段交联(参见例如美国专利第4,676,980号，及Brennan等人Science(科学)，229：81(1985))；使用亮氨酸拉链来产生双特异性抗体(参见例如Kostelny等人，J.Immunol.(免疫学杂志)，148(5)：1547-1553(1992))；使用“双抗体”技术来制得双特异性抗体片段(参见例如Hollinger等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，90：6444-6448(1993))；及使用单链Fv(sFv)二聚体(参见例如Gruber等人，J.Immunol.(免疫学杂志)，152：5368(1994))；及如例如Tutt等人，J.Immunol.(免疫学杂志)147：60(1991)中所述制备三特异性抗体。

本文中也包括具有三个或三个以上功能性抗原结合位点的经工程改造抗体，包括“章鱼抗体(Octopus antibodies)”(参见例如US 2006/0025576A1)。

本文中的抗体或片段也包括包含结合至LRP5以及另一不同抗原的抗原结合位点的“双重作用FAb或“DAF'”(例如参见US 2008/0069820)。

7.抗体变体

在某些实施方案中，涵盖本文中所提供抗体的氨基酸序列变体。举例来说，可能需要其来提高抗体的结合亲和力和/或其他生物特性。可通过在编码抗体的核苷酸序列中引入适当修饰或通过肽合成来制备抗体的氨基酸序列变体。这些修饰包括例如抗体氨基酸序列内的残基缺失和/或插入其中和/或对其进行置换。可进行缺失、插入和置换的任何组合以获得最终构建体，其限制条件是最终构建体具有所需特征，例如抗原结合。

a)置换、插入和缺失变体

在某些实施方案中，提供具有一个或多个氨基酸置换的抗体变体。用于置换性诱变的相关位点包括HVRs和FRs。保守性置换显示在表1中在“保守性置换”的标题下。更多实质性变化于表1中的“示例性置换”的标题下提供且如下文关于氨基酸侧链种类进一步描述。可将氨基酸置换引入相关抗体中并筛选具有所需活性，例如保持/提高的抗原结合、降低的免疫原性、或提高的ADCC或CDC的产物。

表1

可根据常见侧链特性将氨基酸分组：

(1)疏水性：正亮氨酸、Met、Ala、Val、Leu、Ile；

(2)中性亲水性：Cys、Ser、Thr、Asn、Gln；

(3)酸性：Asp、Glu；

(4)碱性：His、Lys、Arg；

(5)影响链取向的残基：Gly、Pro；

(6)芳香性：Trp、Tyr、Phe。

非保守性置换将需要将一种这些种类中的成员换成另一种类。

一种类型的置换变体涉及置换亲本抗体(例如人源化抗体或人抗体)的一个或多个高变区残基。一般而言，选择用于进一步研究的所得变体的某些生物学特性相对于亲本抗体改变(例如提高)(例如亲和力增加、免疫原性降低)和/或将实质上保持亲本抗体的某些生物学特性。示例性置换变体是亲和力成熟抗体，其可例如使用基于噬菌体展示的亲和力成熟技术，例如本文中所述的那些，方便地产生。简言之，一个或多个HVR残基被突变，且变异抗体呈现于噬菌体上，并针对特定生物活性(例如结合亲和力)对其进行筛选。

可在HVR中进行改变(例如置换)，例如以提高抗体亲和力。这些改变可于HVR“热点”也即由在体细胞成熟过程中经历高频率突变的密码子编码的残基中进行(参见例如Chowdhury，Methods Mol.Biol.(分子生物学方法)207：179-196(2008))；并且/或于SDRs(a-CDRs)，其中测试所得变异VH或VL的结合亲和力。通过构建并且自第二文库重新选择而获得的亲和力成熟已于例如Hoogenboom等人，Methods in Molecular Biology(分子生物学方法)178：1-37(O'Brien等人编Human Press，Totowa，NJ，(2001))中描述。在亲和力成熟的一些实施方案中，通过多种方法(例如易错PCR(error-prone PCR)、链重组(shuffling)或寡核苷酸定向诱变)中任一种将多样性引入经选择以供成熟的可变基因中。随后产生第二文库。随后筛选该文库以鉴别具有所需亲和力的任何抗体变体。另一引入多样性的方法涉及HVR定向方法，其中随机选择数个HVR残基(例如每次4-6个残基)。可例如使用丙氨酸扫描诱变或模型化特定地鉴别抗原结合中所涉及的HVR残基。特定地，通常靶向CDR-H3及CDR-L3。

在某些实施方案中，置换、插入或缺失可在一个或多个HVR内进行，只要这些改变不实质上降低抗体结合抗原的能力即可。举例来说，可在HVR中进行不实质上降低结合亲和力的保守性改变(例如如本文中所提供的保守性置换)。这些改变可在HVR“热点”或SDR外部。在上文提供的变异VH及VL序列的某些实施方案中，各HVR未经改变，或含有不超过一个、两个或三个氨基酸置换。

适用于鉴别可靶向以供诱变的抗体的残基或区域的方法称作“丙氨酸扫描诱变”如Cunningham及Wells(1989)Science(科学)，244：1081-1085所述。在此方法中，残基或靶残基的群(例如诸如arg、asp、his、lys和glu的带电残基)经鉴别且由中性或带负电氨基酸(例如丙氨酸或聚丙氨酸)置换以确定是否影响抗体与抗原的相互作用。可在对初始置换显示功能敏感性的氨基酸位置处引入其他置换。备选地或另外地，抗原-抗体复合物的晶体结构用于鉴别抗体与抗原之间的接触点。这些接触残基及邻近残基可以作为置换候选物被靶向或消除。可以筛选变体以确定其是否含有所需特性。

氨基酸序列插入物包括长度在一个残基至含有一百个或一百个以上残基的多肽范围内的氨基端和/或羧基端融合体，以及单个或多个氨基酸残基的序列内插入物。末端插入物的实例包括具有N端甲硫胺酰基残基的抗体。抗体分子的其他插入变体包括抗体的N端或C端与酶(例如对于ADEPT而言)或增加抗体的血清半衰期的多肽的融合体。

b)糖基化变体

在某些实施方案中，本文中所提供的抗体经改变以增加或降低抗体经糖基化的程度。对抗体的糖基化位点的添加或缺失可通过改变氨基酸序列以便产生或移除一或多个糖基化位点而方便地实现。

若抗体包含Fc区，则与其连接的糖类可以被改变。由哺乳动物细胞产生的天然抗体通常包含一般通过N-连接与Fc区CH2结构域的Asn297连接的分支链双触角寡糖。参见例如Wright等人，TIBTECH15：26-32(1997)。寡糖可包括多种糖类，例如甘露糖、N-乙酰葡糖胺(GlcNAc)、半乳糖及唾液酸，以及与双触角寡糖结构的“主干”中的GlcNAc连接的岩藻糖。在一些实施方案中，可对本发明抗体中的寡糖进行修饰以产生具有某些改良特性的抗体变体。

在一实施方案中，提供具有缺乏与Fc区连接(直接或间接)的岩藻糖的糖结构的抗体变体。举例来说，该抗体中岩藻糖的量可以是1％至80％、1％至65％、5％至65％或20％至40％。通过相对于根据MALDI-TOF质谱法所测量的所有与Asn297连接的糖结构(例如复合型、杂合型及高甘露糖型结构)的总和，计算糖链内Asn297处岩藻糖的平均量来测定岩藻糖的量，例如如WO 2008/077546中所述。Asn297是指位于Fc区中约位置297处(Fc区残基的Eu编号)的天冬酰胺残基；然而，由于抗体中的微小序列变化，Asn297也可能位于位置297上游或下游约±3个氨基酸处，也即介于位置294与300之间。这些岩藻糖基化变体可具有提高的ADCC功能。参见例如美国专利公开号US 2003/0157108(Presta，L.)；US 2004/0093621(Kyowa Hakko Kogyo Co.，Ltd)。与“去岩藻糖基”或“岩藻糖缺乏”抗体变体有关的公开文本的实例包括US 2003/0157108；WO 2000/61739；WO 2001/29246；US 2003/0115614；US2002/0164328；US 2004/0093621；US 2004/0132140；US 2004/0110704；US 2004/0110282；US 2004/0109865；WO 2003/085119；WO 2003/084570；WO 2005/035586；WO 2005/035778；WO 2005/053742；WO 2002/031140；Okazaki等人，J.Mol.Biol.(分子生物学杂志)336：1239-1249(2004)；Yamane-Ohnuki等人，Biotech.Bioeng.(生物技术和生物工程)87：614(2004)。能够产生脱除岩藻糖基的抗体的细胞系的实例包括蛋白质岩藻糖基化缺乏的Lec13CHO细胞(Ripka等人Arch.Biochem.Biophys.249：533-545(1986)；美国专利申请号US2003/0157108 A1，Presta，L；及WO 2004/056312 A1，Adams等人，尤其实施例11)；及基因敲除细胞系，例如α-1，6-岩藻糖基转移酶基因、FUT8、基因敲除CHO细胞(参见例如Yamane-Ohnuki等人，Biotech.Bioeng.(生物技术和生物工程)87：614(2004)；Kanda，Y等人，Biotechnol.Bioeng.(生物技术和生物工程)，94(4)：680-688(2006)；及WO 2003/085107)。

进一步提供具有平分型寡糖(bisected oligosaccharide)的抗体变体，例如其中与抗体的Fc区连接的双触角寡糖经GlcNAc平分。这些抗体变体可具有降低的岩藻糖基化和/或提高的ADCC功能。这些抗体变体的实例例如于WO 2003/011878(Jean-Mairet等人)；美国专利第6,602,684号(Umana等人)；及US 2005/0123546(Umana等人)中描述。也提供在与Fc区连接的寡糖中具有至少一个半乳糖残基的抗体变体。这些抗体变体可具有提高的CDC功能。这些抗体变体于例如WO 1997/30087(Patel等人)；WO 1998/58964(Raju，S.)；及WO 1999/22764(Raju，S.)中描述。

c)Fc区变体

在某些实施方案中，可在本文中所提供抗体的Fc区中引入一个或多个氨基酸修饰，以此产生Fc区变体，以便增强例如抗体治疗涉及异常血管发生和/或血管通透性或渗漏的疾病或病症的有效性。Fc区变体可包含在一或多个氨基酸位置处包含氨基酸修饰(例如置换)的人Fc区序列(例如人IgG1、IgG2、IgG3或IgG4Fc区)。

在某些实施方案中，本发明涵盖具有一些但非所有效应子功能的抗体变体，这使其成为某些应用的理想候选物，在所述应用中抗体的活体内半衰期是重要的，但某些效应子功能(例如补体及ADCC)是不必要或有害的。可进行体外和/或体内细胞毒性测定以确认CDC和/或ADCC活性的降低/衰竭。举例来说，可进行Fc受体(FcR)结合测定以确保抗体缺乏FcγR结合(因此可能缺乏ADCC活性)，但保持FcRn结合能力。介导ADCC的初级细胞、NK细胞仅表达FcγRIII，而单核细胞表达FcγRI、FcγRII及FcγRIII。FcR在造血细胞上的表达于Ravetch及Kinet，Annu.Rev.Immunol.(免疫学年度综述)9：457-492(1991)的第464页上的表3中总结。评定相关分子的ADCC活性的体外测定的非限制性实例于美国专利5,500,362(参见例如Hellstrom，I.等人，Proc.Nat’l.Acad.Sci.USA83：7059-7063(1986))及Hellstrom，I等人，Proc.Nat’l.Acad.Sci.USA82：1499-1502(1985)；5,821,337(参见Bruggemann，M.等人，J.Exp.Med.(实验医学杂志)166：1351-1361(1987))中描述。或者，可采用非放射性测定方法(参见例如用于流式细胞术的ACTI^TM非放射性细胞毒性测定(CellTechnology，Inc.Mountain View，CA)及非放射性细胞毒性测定(Promega，Madison，WI))。适用于这些测定的效应细胞包括外周血单核细胞(PBMC)及自然杀伤(NK)细胞。备选地或另外地，相关分子的ADCC活性可于体内评定，例如在例如Clynes等人，Proc.Nat’l.Acad.Sci.USA 95：652-656(1998)中所揭示的动物模型中评定。也可进行Clq结合测定以证明抗体无法结合Clq且因此缺乏CDC活性。参见例如WO 2006/029879及WO2005/100402中的Clq及C3c结合ELISA。为评定补体活化，可进行CDC测定(参见例如Gazzano-Santoro等人，J.Immunol.Methods(免疫学方法杂志)202：163(1996)；Cragg，M.S.等人，Blood(血液)101：1045-1052(2003)；及Cragg，M.S.及M.J.Glennie，Blood103：2738-2743(2004))。也可使用本领域中已知的方法进行FcRn结合及活体内清除/半衰期测定(参见例如Petkova，S.B.等人，Int’l.Immunol.(国际免疫学)18(12)：1759-1769(2006))。

效应子功能降低的抗体包括Fc区残基238、265、269、270、297、327及329中一个或多个置换的那些抗体(美国专利6,737,056)。这些Fc突变体包括在氨基酸位置265、269、270、297和327的两个或两个以上位置处具有置换的Fc突变体，包括残基265和297置换为丙氨酸的所谓的“DANA”Fc突变体(美国专利号7,332,581)。

描述某些与FcRs的结合提高或减少的抗体变体。(参见例如美国专利号6,737,056；WO 2004/056312，及Shields等人，J.Biol.Chem.(生物化学杂志)9(2)：6591-6604(2001))。

在某些实施方案中，抗体变体包含具有一个或多个提高ADCC的氨基酸置换的Fc区，例如在Fc区的位置298、333和/或334(残基的EU编号)处置换。

在一些实施方案中，在Fc区中进行改变，其导致Clq结合和/或补体依赖性细胞毒性(CDC)改变(也即，通过提高或降低)，例如如美国专利第6,194,551号、WO 99/51642和Idusogie等人，J.Immunol.(免疫学杂志)164：4178-4184(2000)中所述。

US2005/0014934A1(Hinto等人)中描述具有增加的半衰期及提高的与新生儿Fc受体(FcRn)的结合的抗体，其中FcRn负责将母体IgG转移至胎儿(Guyer等人J.Immunol.(免疫学杂志)117：587(1976)及Kim等人，J.Immunol.(免疫学杂志)24：249(1994))。那些抗体包含具有一或多个置换的Fc区，所述置换提高Fc区与FcRn的结合。这些Fc变体包括在Fc区残基238、256、265、272、286、303、305、307、311、312、317、340、356、360、362、376、378、380、382、413、424或434中的一或多者处具有置换(例如置换Fc区残基434)的那些Fc变体(美国专利第7,371,826号)。

关于Fc区变体的其他实例，也参见Duncan及Winter，Nature(自然)322：738-40(1988)；美国专利第5,648,260号；美国专利第5,624,821号；及WO 94/29351。

d)经半胱氨酸工程改造的抗体变体

在某些实施方案中，可能需要产生经半胱氨酸工程改造的抗体，例如“硫代MAb”，其中抗体的一或多个残基经半胱氨酸残基置换。在特定实施方案中，经置换的残基出现在抗体的可接近位点处。通过用半胱氨酸置换那些残基，反应性硫醇基团通过定位于抗体的可接近位点处且可用于将抗体结合至其他部分，例如药物部分或接头-药物部分，以产生如本文中进一步描述的免疫缀合物。在某些实施方案中，任一或多个以下残基可经半胱氨酸置换：轻链的V205(Kabat编号)；重链的A118(EU编号)；及重链Fc区的S400(EU编号)。可如例如美国专利第7,521,541号中所述，产生经半胱氨酸工程改造的抗体。

e)抗体衍生物

在某些实施方案中，本文中所提供的抗体可进一步经修饰为含有本领域中已知且轻易获得的其他非蛋白质部分。适合抗体衍生作用的部分包括，但不限于，水溶性聚合物。水溶性聚合物的非限制性实例包括，但不限于，聚乙二醇(PEG)、乙二醇/丙二醇共聚物、羧甲基纤维素、葡聚糖、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、聚-1，3-二烷、聚-1，3，6-三烷、乙烯/马来酸酐共聚物、聚氨基酸(均聚物或无规共聚物)、及葡聚糖或聚(n-乙烯基吡咯烷酮)聚乙二醇、丙二醇均聚物、聚环氧丙烷/氧化乙烯共聚物、聚氧乙基化多元醇(例如甘油)、聚乙烯醇、及其混合物。聚乙二醇丙醛因其在水中的稳定性可能具有制造优势。聚合物可具有任何分子量，且可有分支或无分支。与抗体连接的聚合物的数目可以变化，且若连接一种以上聚合物，则其可以是相同或不同分子。一般而言，用于衍生作用的聚合物数目和/或类型可以基于包括，但不限于，以下的考虑因素来确定：要提高的抗体的特定特性或功能、抗体衍生物是否将用于指定条件下的疗法等。

在另一实施方案中，提供抗体与可通过暴露于辐射来选择性加热的非蛋白质部分的缀合物。在一个实施方案中，非蛋白质部分是碳纳米管(Kam等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(美国科学院学报)102：11600-11605(2005))。该辐射可具有任何波长，且包括但不限于，不损伤普通细胞但能将非蛋白质部分加热至可杀死抗体-非蛋白质部分附近的细胞的温度的波长。

B.重组方法和组合物

抗体可以使用例如在美国专利号4,816,567中描述的重组方法和组合物产生。在一个实施方案中，提供了编码本文描述的抗LRP5抗体的分离的核酸。此类核酸可编码包含抗体VL的氨基酸序列和/或包含其VH的氨基酸序列(例如抗体的轻链和/或重链)。在又一个实施方案中，提供了包含此类核酸的一个或多个载体(例如表达载体)。在又一个实施方案中，提供了包含此类核酸的宿主细胞。在一个此类实施方案中，宿主细胞包含(例如，用下述各项转化)：(1)包含核酸的载体，所述核酸编码包含抗体的VL的氨基酸序列和包含抗体的VH的氨基酸序列，或(2)包含核酸的第一载体，所述核酸编码包含抗体的VL的氨基酸序列，和包含核酸的第二载体，所述核酸编码包含抗体的VH的氨基酸序列。在一个实施方案中，宿主细胞是真核的，例如中国仓鼠卵巢(CHO)细胞或淋巴样细胞(例如，Y0，NS0，Sp20细胞)。在一个实施方案中，提供了制备抗LRP5抗体的方法，其中所述方法包括，在适合抗体表达的条件下，培养包含编码所述抗体的核酸的宿主细胞，如上文所提供的，和任选地从所述宿主细胞(或宿主细胞培养基)回收所述抗体。

为了重组产生抗LRP5抗体，分离编码抗体(例如上文所描述的抗体)的核酸，并插入一个或多个载体，用于在宿主细胞中进一步克隆和/或表达。此类核酸易于使用常规规程分离和测序(例如通过使用能够与编码抗体重链和轻链的基因特异性结合的寡核苷酸探针进行)。

用于克隆或表达编码抗体的载体的适当宿主细胞包括本文描述的原核或真核细胞。例如，抗体可在细菌中产生，特别当不需要糖基化和Fc效应子功能时。对于抗体片段和多肽在细菌中的表达，见，例如，美国专利号5,648,237，5,789,199和5,840,523。(还见Charlton，分子生物学中的方法(Methods in Molecular Biology)，卷248(B.K.C.Lo，编辑，Humana Press，Totowa，NJ，2003)，第245-254页，描述抗体片段在大肠杆菌中的表达)。在表达后，抗体可以从可溶级分中的细菌细胞糊状物分离，并且可以进一步纯化。

除了原核生物以外，真核微生物诸如丝状真菌或酵母也是关于编码抗体的载体的合适克隆或表达宿主，包括真菌和酵母菌株，其糖基化途径已经进行“人源化”，导致产生具有部分或完全人糖基化模式的抗体。参见Gerngross，Nat.Biotech.(自然生物技术)22：1409-1414(2004)，和Li等人，Nat.Biotech.(自然生物技术)24：210-215(2006)。

适于表达糖基化抗体的宿主细胞也衍生自多细胞生物体(无脊椎动物和脊椎动物)。无脊椎动物细胞的实例包括植物和昆虫细胞。已经鉴定了许多杆状病毒株，其可与昆虫细胞联合使用，特别是用于转染草地夜蛾(Spodoptera frugiperda)细胞。

还可利用植物细胞培养物作为宿主。见，例如，美国专利号5,959,177，6,040,498，6,420,548，7,125,978和6,417,429(其描述了在转基因植物中产生抗体的PLANTIBODIES^TM技术)。

也可以将脊椎动物细胞用作宿主。例如，可以使用被改造以适合于悬浮生长的哺乳动物细胞系。有用哺乳动物宿主细胞系的其它实例是用SV40转化的猴肾CV1系(COS-7)；人胚肾系(293或293细胞，如例如Graham等人，遗传病毒学杂志(J.Gen Virol.)36：59(1977)中所描述的)；幼仓鼠肾细胞(BHK)；小鼠塞托利(sertoli)细胞(TM4细胞，如例如在Mather，Biol.Reprod.23：243-251(1980)中描述的)；猴肾细胞(CV1)；非洲绿猴肾细胞(VERO-76)；人宫颈癌细胞(HELA)；犬肾细胞(MDCK)；布法罗大鼠(buffalo rat)肝细胞(BRL3A)；人肺细胞(W138)；人肝细胞(Hep G2)；小鼠乳瘤(MMT060562)；TRI细胞，如例如Mather等人，Annals N.Y.Acad.Sci.383：44-68(1982)中所描述的；MRC5细胞；和FS4细胞。其它有用的哺乳动物宿主细胞系包括中国仓鼠卵巢(CHO)细胞，包括DHFR^-CHO细胞(Urlaub等人，美国国家科学院学报(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)77：4216(1980))；并且骨髓瘤细胞系如Y0，NS0和Sp2/0。关于适合产生抗体的某些哺乳动物宿主细胞系的综述见例如Yazaki和Wu，在分子生物学中的方法(Methods in Molecular Biology)，卷248(B.K.C.Lo，ed.，Humana Press，Totowa，NJ)，第255-268页(2003)。

C.测定

本文中提供的抗LRP5抗体可以对其物理/化学特性和/或生物活性，通过本领域中已知的不同测定来识别、筛选或表征。

1.结合测定和其他测定

在一方面中，测试本发明的抗体的抗原结合活性，例如，通过已知方法如ELISA、蛋白印迹等。

在另一方面中，竞争测定可以被用于鉴定与YW629.42或YW629.51竞争结合LRP5的抗体。在某些实施方案中，这样的竞争性抗体结合与YW629.42或YW629.51结合的表位相同的表位(例如，线性或构象表位)。用于定位与抗体结合的表位的详细的示例性方法提供在Methods in Molecular Biology(分子生物学中的方法)vo1.66(Humana Press，Totowa，NJ)中的Morris(1996)“Epitope Mapping Protocols(表位定位实验方法)”中。

在示例性竞争测定中，在溶液中温育固定的LRP5，所述溶液包含与LRP5结合的第一标记抗体(例如，YW629.42或YW629.51)和被测试其与所述第一抗体竞争结合LRP5的能力的第二未标记抗体。所述第二抗体可以存在于杂交瘤上清液中。作为对照，在这样的溶液中温育固定的LRP5，所述溶液包含第一标记抗体但是不包含第二未标记抗体。在允许所述第一抗体与LRP5结合的条件下温育后，除去过量的未结合的抗体，并且测量与固定的LRP5结合的标记的量。如果相对于对照样品在测试样品中与固定的LRP5结合的标记的量显著降低，则说明所述第二抗体与所述第一抗体竞争结合LRP5。参见Harlow和Lane(1988)Antibodies：A LaboratoryManual(抗体：实验室手册)ch.14(Cold Spring HarborLaboratory，Cold Spring Harbor，NY)。

2.活性测定

在一方面中，提供用于鉴别具有生物学活性的抗LRP5抗体的测定。生物活性可以包括，例如，结合LRP5、Norrin活性的增强、或者Norrin/Fzd4信号传导的增强。还提供在体内和/或体外具有这样的生物学活性的抗体。

在某些实施方案中，测试本发明的抗体的这种生物活性。在示例性Wnt/Norrin活化测定中，用293T细胞中的Topflash荧光素酶报告蛋白质粒瞬时表达LRP5和Fzd4蛋白、或相关变体(即Fzd4_M157V)。表达这些蛋白质的细胞暴露于Norrin或Wnt配体，并且在37℃温育16小时之后，通过测量来自荧光素酶的发光的量来确定活化水平。如果发光的量由于在LRP5抗体的存在下的配体加入而显著增加，则表明抗体增强Fzd4/Norrin信号传导。当使用在Norrin的存在下已降低了信号传导的Fzd4_M157V时，在LRP5抗体的存在下的发光的增加被认为是挽救Fzd4信号传导中的缺陷。

在另外的Wnt/Norrin活化测定中，可以将培养的人类视网膜内皮细胞在LRP5抗体或对照抗体的存在下暴露于Norrin或Wnt配体24-48小时，并且可以通过定量RT-PCR确定已知的Wnt报告蛋白基因(即Axin-2或PV-1)的水平。在对照抗体的情况中，与没有配体加入相比，在加入Norrin和Wm配体之后，Axin-2RNA的量将会增加，而PV-1RNA的量将会减少。如果存在LRP5抗体，Norrin信号传导的增强将会造成Axin-2的进一步增加，以及相反地PV-1减少。这种测定还可以在用siRNA治疗以降低Tspan12表达的细胞中完成。在Tspan12表达降低的细胞中，在Norrin的存在下，没有Axin-2的变化。如果LRP5抗体，而非对照抗体，能够在不存在Tspan12表达的情况下引起Axin-2的增加，则此抗体被认为是挽救由Tspan12的缺失造成的Fzd4/Norrin信号传导中的缺陷。

D.免疫缀合物

本发明也提供包含本文中的抗LRP5抗体与一或多种细胞毒性剂，例如化疗剂或药物、生长抑制剂、毒素(例如蛋白质毒素、细菌、真菌、植物或动物来源的酶促活性毒素，或其片段))或放射性同位素缀合的免疫缀合物。

在一实施方案中，免疫缀合物是抗体-药物缀合物(ADC)，其中抗体与一种或多种药物缀合，所述药物包括，但不限于，美坦生类化合物(参见美国专利第5,208,020号、第5,416,064号及欧洲专利EP 0 425 235 B1)；奥利司他汀(auristatin)，如单甲基奥利司他汀药物(monomethylauristatin)部分DE及DF(MMAE及MMAF)(参见美国专利第5,635,483号及第5,780,588号，及第7,498,298号)；多拉司他汀(dolastatin)；加利车霉素(calicheamicin)或其衍生物(参见美国专利第5,712,374号、第5,714,586号、第5,739,116号、第5,767,285号、第5,770,701号、第5,770,710号、第5,773,001号及第5,877,296号；Hinman等人，Cancer Res.(癌症研究)53：3336-3342(1993)；及Lode等人，Cancer Res.(癌症研究)58：2925-2928(1998))；蒽环类抗生素(anthracycline)如道诺霉素(daunomycin)或多柔比星(参见Kratz等人Current Med.Chem.13：477-523(2006)；Jeffrey等人，Bioorganic&Med.Chem.Letters16：358-362(2006)；Torgov等人，Bioconj.Chem.16：717-721(2005)；Nagy等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(美国科学院学报)97：829-834(2000)；Dubowchik等人，Bioorg.&Med.Chem.Letters12：1529-1532(2002)；King等人，J.Mead.Chem.45：4336-4343(2002)；及美国专利第6,630,579号)；甲氨喋呤(methotrexate)；长春地辛(vindesine)；紫杉烷(taxane)如多西他赛(docetaxel)、紫杉醇(paclitaxel)、拉洛紫杉醇(larotaxel)、特赛紫杉醇(tesetaxel)及奥他紫杉醇(ortataxel)；单端孢霉烯族化合物(trichothecene)；及CC1065。

在另一实施方案中，免疫缀合物包含如本文中所述的抗体与酶促活性毒素或其片段缀合，酶促活性毒素或其片段包括，但不限于，白喉(diphtheria)A链、白喉毒素的非结合活性片段、外毒素A链(来自铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa))、蓖麻毒蛋白(ricin)A链、相思豆毒蛋白(abrin)A链、蒴莲根毒蛋白(modeccin)A链、α-帚曲霉素(sarcin)、油桐(Aleutites fordii)蛋白、香石竹毒蛋白(dianthin protein)、美洲商陆(Phytolaca americana)蛋白(PAPI、PAPII和PAP-S)、苦瓜(Momordica charantia)抑制剂、麻疯树毒蛋白(curcin)、巴豆毒蛋白(crotin)、肥皂草(sapaonaria officinalis)抑制剂、白树毒蛋白(gelonin)、丝林霉素(mitogellin)、局限曲菌素(restrictocin)、酚霉素(phenomycin)、依诺霉素(enomycin)和单端孢霉烯族化合物(trichothecenes)。

在另一实施方案中，免疫缀合物包含如本文中所述的抗体与放射性原子缀合形成放射性缀合物。多种放射性同位素可用于制备放射性缀合物。实例包括At²¹¹、I¹³¹、I¹²⁵、Y⁹⁰、Re¹⁸⁶、Re¹⁸⁸、Sm¹⁵³、Bi²¹²、P³²、Pb²¹²及Lu的放射性同位素。当使用放射性缀合物进行检测时，其可包含用于闪烁摄影研究的放射性原子，例如tc^99m或I¹²³或用于核磁共振(NMR)成像(也称为磁共振成像，mri)的自旋标记物，如碘-123及碘-131、铟-111、氟-19、碳-13、氮-15、氧-17、钆、锰或铁。

抗体与细胞毒性剂的缀合物可使用多种双功能蛋白质偶合剂制得，例如N-琥珀酰亚胺基-3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酯(SPDP)、琥珀酰亚胺基-4-(N-马来酰亚氨甲基)环己烷-1-羧酸酯(SMCC)、亚氨基硫烷(IT)、亚氨酸酯(诸如盐酸二甲基己二亚酰胺化物)、活性酯类(诸如辛二酸二琥珀酰亚胺基酯)、醛类(诸如戊二醛)、双叠氮化合物(诸如双(对-叠氮苯甲酰基)己二胺)、双重氮衍生物(诸如双(对-重氮苯甲酰基)己二胺)、二异氰酸酯(诸如甲苯2，6-二异氰酸酯)、和双活性氟化合物(诸如1，5-二氟-2，4-二硝基苯)的双功能衍生物。举例来说，蓖麻毒蛋白免疫毒素可如Vitetta等人，Science(科学)238：1098(1987)中所述来制备。碳-14标记的1-异硫氰酸苯甲基-3-甲基二亚乙基三胺五乙酸(MX-DTPA)是用于使放射性核苷酸与抗体结合的示例性螯合剂。参见WO94/11026。接头可以是促进细胞毒性药物在细胞中释放的“可裂解接头”。举例来说，可使用酸不稳定接头、肽酶敏感性接头、光不稳定接头、二甲基接头或含二硫化物的接头(Chari等人，Cancer Res.(癌症研究)52：127-131(1992)；美国专利第5,208,020号)。

本文中的免疫缀合物或ADCs明确涵盖，但不限于，用交联剂试剂制备的这些缀合物，该等交联剂试剂包括，但不限于：BMPS、EMCS、GMBS、HBVS、LC-SMCC、MBS、MPBH、SBAP、SIA、SIAB、SMCC、SMPB、SMPH、硫代-EMCS、硫代-GMBS、硫代-KMUS、硫代-MBS、硫代-SIAB、硫代-SMCC及硫代-SMPB及SVSB(琥珀酰亚胺基-(4-乙烯基砜)苯甲酸酯)，交联剂试剂可商购获得(例如购自Pierce Biotechnology，Inc.，Rockford，IL.，U.S.A)。

E.用于诊断和检测的方法和组合物

在某些实施方案中，本文中提供的任何抗LRP5抗体可以用于检测LRP5在生物样品中的存在。术语“检测”用于本文中时，包括定量或定性检测。在某些实施方案中，生物样品包含细胞或组织，如眼部组织，包括视网膜组织。

在一个实施方案中，提供用于诊断或检测方法的抗LRP5抗体。在另一个方面中，提供检测LRP5在生物样品中的存在的方法。在某些实施方案中，所述方法包括将生物样品与如本文所述的抗LRP5抗体在允许抗LRP5抗体与LRP5结合的条件下接触，并检测在抗LRP5抗体和LRP5之间是否形成复合物。该方法可以是体外或体内方法。在一个实施方案中，抗LRP5抗体被用于选择适合利用抗LRP5抗体的治疗的受试者，例如其中LRP5是用于选择患者的生物标记物。

可以使用本发明的抗体诊断的示例性病症包括，视网膜病变，包括增生性糖尿病性视网膜病变(proliferative diabetic retinopathy)，CNV，AMD，糖尿病性和其他缺血相关的视网膜病变，DME，病理性近视(pathological myopia)，希佩尔-林道病(von Hippel-Lindau disease)，眼睛的组织胞浆菌病(histoplasmosis)，CRVO，BRVO，角膜新血管形成，视网膜新血管形成，ROP，FEVR，外层渗出性视网膜病变(Coats’disease)，诺里病(NorrieDisease)，OPPG(骨质疏松-假神经胶质瘤综合征(Osteoporosis-PseudogliomaSyndrome))，结膜下出血(subconjunctival hemorrhage)，和高血压性视网膜病变(hypertensive retinopathy)。

在某些实施方案中，提供标记的抗LRP5抗体。标记包括但不限于，被直接检测的标记或部分(如荧光标记，发色团标记，电子致密标记，化学发光标记，和放射性标记)，以及被间接检测的部分，如酶或配体，例如，通过酶促反应或分子相互作用。示例性标记包括但不限于，放射性同位素³²P，¹⁴C，¹²⁵I，³H，和¹³¹I，荧光团如稀土螯合物或荧光素及其衍生物，罗丹明及其衍生物，丹酰(dansyl)，伞形酮(umbelliferone)，荧光素酶(luceriferase)，例如，萤火虫荧光素酶和细菌荧光素酶(美国专利号4,737,456)，荧光素(luciferin)，2，3-二氢酞嗪二酮，辣根过氧化物酶(HR)，碱性磷酸酶，β-半乳糖苷酶，葡糖淀粉酶，溶解酶，糖类氧化酶，例如，葡萄糖氧化酶，半乳糖氧化酶，和葡萄糖-6-磷酸脱氢酶，杂环氧化酶如尿酸酶和黄嘌呤氧化酶，加上利用过氧化氢氧化染料前体的酶如HRP，乳过氧化物酶，或微过氧化物酶(microperoxidase)，生物素/亲和素，自旋标记，噬菌体标记，稳定的自由基，等等。

F.药物制剂

如本文所述的抗LRP5抗体的药物制剂通过将具有所需纯度的所述抗体与一种或多种任选的药用载体(Remmgton’s Pharmaceutical Sciences(雷明顿药物科学)，第16版，Osol，A.编(1980))混合来制备，以冻干制剂或水溶液的形式。药用载体通常在所用剂量及浓度对接受者无毒，并且包括但不限于：缓冲剂，如磷酸盐、柠檬酸盐及其他有机酸；抗氧化剂，包括抗坏血酸及甲硫氨酸；防腐剂(如氯化十八烷基二甲基苄铵、氯化六羟季铵、氯苄烷铵、苄索氯铵；苯酚、丁醇或苄醇；对羟基苯甲酸烷酯，如对羟基苯甲酸甲酯或对羟基苯甲酸丙酯；儿茶酚；间苯二酚；环己醇；3-戊醇；及间甲酚)；低分子量(少于约10个残基)多肽；蛋白质，如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水性聚合物，如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、精氨酸或赖氨酸；单糖、二糖和其他糖类，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂，如EDTA；糖类，例如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨醇；成盐平衡离子，如钠；金属复合体(例如Zn-蛋白质复合体)；和/或非离子表面活性剂，如聚乙二醇(PEG)。本文中的示例性药用载体还包括药物间质分散剂，如可溶性中性-活性透明质酸酶糖蛋白(sHASEGP)，例如人可溶性PH-20透明质酸酶糖蛋白，如rHuPH20( BaxterInternational，Inc.)。某些示例性sHASEGPs及使用方法，包括rHuPH20，描述于美国专利公开号2005/0260186及2006/0104968中。在一方面中，sHASEGP与一种或多种其他葡糖胺聚糖酶例如软骨素酶组合。

示例性的冻干抗体制剂描述于美国专利号6,267,958。水性抗体制剂包括美国专利号6,171,586和WO2006/044908中所述的那些，后一种制剂包括组氨酸-乙酸盐缓冲剂。

本文的制剂还可以包含超过一种活性成分，所述活性成分是被治疗的特定适应证所需的，优选具有不会不利地影响彼此的互补活性的那些活性成分。例如，可能需要进一步提供VEGF拮抗剂(包括，例如，抗VEGF抗体或抗体片段，例如雷珠单抗(ranibizumab)，可溶性VEGF受体或其片段，例如阿柏西普(aflibercept)，或适体，例如培加他尼(pegaptanib))、TSPAN12激动剂、纤维蛋白溶酶、纤维蛋白溶酶原、组织纤维蛋白溶酶原活化剂、曲安西龙(triamcinolone)、TNF-α抑制剂、和/或地塞米松(dexamethasone)。这种活性成分以对于目的用途有效的量合适地组合存在。

可以将活性成分截留于例如通过凝聚技术或通过界面聚合所制备的微囊，例如，分别是羟甲基纤维素或明胶微囊及聚-(甲基丙烯酸甲酯)微囊中、胶状药物传递系统(例如脂质体、白蛋白微球体、微乳液、纳米颗粒及纳米胶囊)中或粗滴乳状液中。这些技术披露于Remington’s Pharmaceutical Sciences(雷明顿药物科学)，第16版，Osol，A.编(1980)中。

可制备持续释放制剂。持续释放制剂的合适实例包括含有抗体的固体疏水聚合物的半渗透基质，所述基质呈成形物品，例如薄膜或微囊形式。

欲用于体内施用的制剂通常是无菌的。无菌可以例如借助通过无菌过滤膜的过滤而轻易地实现。

G.治疗方法和组合物

任何本文提供的抗LRP5抗体可以用于治疗方法。

在一方面中，提供用作药物的抗LRP5抗体。在进一步的方面中，提供用于治疗下列疾病的抗LRP5抗体：视网膜病变，包括增生性糖尿病性视网膜病变(proliferativediabetic retinopathy)，CNV，AMD，糖尿病性和其他缺血相关的视网膜病变，DME，病理性近视(pathological myopia)，希佩尔-林道病(von Hippel-Lindau disease)，眼睛的组织胞浆菌病(histoplasmosis)，CRVO，BRVO，角膜新血管形成，视网膜新血管形成，ROP，FEVR，外层渗出性视网膜病变(Coats’disease)，诺里病(Norrie Disease)，OPPG(骨质疏松-假神经胶质瘤综合征(Osteoporosis-Pseudoglioma Syndrome))，结膜下出血(subconjunctivalhemorrhage)，和高血压性视网膜病变(hypertensive retinopathy)。在某些实施方案中，提供用于治疗方法中的抗LRP5抗体。在某些实施方案中，本发明提供在治疗患有下列疾病的个体的方法中使用的抗LRP5抗体：视网膜病变，包括增生性糖尿病性视网膜病变(proliferative diabetic retinopathy)，CNV，AMD，糖尿病性和其他缺血相关的视网膜病变，DME，病理性近视(pathological myopia)，希佩尔-林道病(von Hippel-Lindaudisease)，眼睛的组织胞浆菌病(histoplasmosis)，CRVO，BRVO，角膜新血管形成，视网膜新血管形成，ROP，FEVR，外层渗出性视网膜病变(Coats’disease)，诺里病(Norrie Disease)，OPPG(骨质疏松-假神经胶质瘤综合征(Osteoporosis-Pseudoglioma Syndrome))，结膜下出血(subconj unctival hemorrhage)，或高血压性视网膜病变(hypertensiveretinopathy)，所述方法包括向个体施用有效量的抗LRP5抗体。在一个这种实施方案中，所述方法还包括向所述个体施用有效量的至少一种另外的治疗剂，例如，如以下所述的。在进一步的实施方案中，本发明提供用于增强Norrin活性和/或增强Norrin/Fzd4信号传导的抗LRP5抗体。在某些实施方案中，本发明提供抗LRP5抗体，所述抗LRP5抗体用于在个体中增强Norrin活性和/或增强Norrin/Fzd4信号传导的方法，所述方法包括向个体施用有效的抗LRP5抗体以增强Norrin活性和/或增强Norrin/Fzd4信号传导。根据任何以上实施方案的“个体”优选是人。

在其他方面中，本发明提供抗LRP5抗体在生产或制备药物中的用途。在一个实施方案中，所述药物用于下列疾病的治疗：视网膜病变，包括增生性糖尿病性视网膜病变(proliferative diabetic retinopathy)，CNV，AMD，糖尿病性和其他缺血相关的视网膜病变，DME，病理性近视(pathological myopia)，希佩尔-林道病(von Hippel-Lindaudisease)，眼睛的组织胞浆菌病(histoplasmosis)，CRVO，BRVO，角膜新血管形成，视网膜新血管形成，ROP，FEVR，外层渗出性视网膜病变(Coats’disease)，诺里病(Norrie Disease)，OPPG(骨质疏松-假神经胶质瘤综合征(Osteoporosis-Pseudoglioma Syndrome))，结膜下出血(subconjunctival hemorrhage)，或高血压性视网膜病变(hypertensiveretinopathy)。在进一步的实施方案中，所述药物用于治疗下列的方法：视网膜病变，包括增生性糖尿病性视网膜病变(proliferative diabetic retinopathy)，CNV，AMD，糖尿病性和其他缺血相关的视网膜病变，DME，病理性近视(pathological myopia)，希佩尔-林道病(von Hippel-Lindau disease)，眼睛的组织胞浆菌病(histoplasmosis)，CRVO，BRVO，角膜新血管形成，视网膜新血管形成，ROP，FEVR，外层渗出性视网膜病变(Coats’disease)，诺里病(Norrie Disease)，OPPG(骨质疏松-假神经胶质瘤综合征(Osteoporosis-PseudogliomaSyndrome))，结膜下出血(subconj unctival hemorrhage)，或高血压性视网膜病变(hypertensive retinopathy)，所述方法包括向患有下列疾病的个体施用有效量的药物：视网膜病变，包括增生性糖尿病性视网膜病变(proliferative diabetic retinopathy)，CNV，AMD，糖尿病性和其他缺血相关的视网膜病变，DME，病理性近视(pathologicalmyopia)，希佩尔-林道病(von Hippel-Lindau disease)，眼睛的组织胞浆菌病(histoplasmosis)，CRVO，BRVO，角膜新血管形成，视网膜新血管形成，ROP，FEVR，外层渗出性视网膜病变(Coats’disease)，诺里病(Norrie Disease)，OPPG(骨质疏松-假神经胶质瘤综合征(Osteoporosis-Pseudoglioma Syndrome))，结膜下出血(subconjunctivalhemorrhage)，或高血压性视网膜病变(hypertensive retinopathy)。在一个这种实施方案中，所述方法还包括向所述个体施用有效量的至少一种另外的治疗剂，例如，如以下所述的。在进一步的实施方案中，所述药物用于增强Norrin活性和/或增强Norrin/Fzd4信号传导。在进一步的实施方案中，所述药物用于在个体中增强Norrin活性和/或增强Norrin/Fzd4信号传导的方法，所述方法包括向个体施用有效量的药物以增强Norrin活性和/或增强Norrin/Fzd4信号传导。根据任何以上实施方案的“个体”可以是人。

在进一步的方面中，本发明提供用于治疗下列疾病的方法：视网膜病变，包括增生性糖尿病性视网膜病变(proliferative diabetic retinopathy)，CNV，AMD，糖尿病性和其他缺血相关的视网膜病变，DME，病理性近视(pathological myopia)，希佩尔-林道病(vonHippel-Lindau disease)，眼睛的组织胞浆菌病(histoplasmosis)，CRVO，BRVO，角膜新血管形成，视网膜新血管形成，ROP，FEVR，外层渗出性视网膜病变(Coats’disease)，诺里病(Norrie Disease)，OPPG(骨质疏松-假神经胶质瘤综合征(Osteoporosis-PseudogliomaSyndrome))，结膜下出血(subconjunctival hemorrhage)，或高血压性视网膜病变(hypertensive retinopathy)。在一个实施方案中，所述方法包括向患有下列疾病的个体施用有效量的抗LRP5抗体：视网膜病变，包括增生性糖尿病性视网膜病变(proliferativediabetic retinopathy)，CNV，AMD，糖尿病性和其他缺血相关的视网膜病变，DME，病理性近视(pathological myopia)，希佩尔-林道病(von Hippel-Lindau disease)，眼睛的组织胞浆菌病(histoplasmosis)，CRVO，BRVO，角膜新血管形成，视网膜新血管形成，ROP，FEVR，外层渗出性视网膜病变(Coats’disease)，诺里病(Norrie Disease)，OPPG(骨质疏松-假神经胶质瘤综合征(Osteoporosis-Pseudoglioma Syndrome))，结膜下出血(subconjunctivalhemorrhage)，或高血压性视网膜病变(hypertensive retinopathy)。在一个这种实施方案中，所述方法还包括向所述个体施用有效量的至少一种另外的治疗剂，如以下所述的。根据任何以上实施方案的“个体”可以是人。

在进一步的方面中，本发明提供用于在个体中增强Norrin活性和/或增强Norrin/Fzd4信号传导的方法。在一个实施方案中，所述方法包括向所述个体施用有效量的抗LRP5抗体以增强Norrin活性和/或增强Norrin/Fzd4信号传导。在一个实施方案中，“个体”是人。

在另一方面中，本发明提供药物制剂，所述药物制剂包含任何本文提供的抗LRP5抗体，例如，用于任何以上的治疗方法。在一个实施方案中，所述药物制剂包含任何本文提供的抗LRP5抗体和药用载体。在另一个实施方案中，所述药物制剂包含任何本文提供的抗LRP5抗体和至少一种另外的治疗剂，例如，如以下所描述的。

在治疗中，本发明的抗体可以单独使用或与其他试剂组合使用。例如，本发明的抗体可以与至少一种另外的治疗剂一起共同给药。在某些实施方案中，另外的治疗剂是VEGF拮抗剂(包括，例如，抗VEGF抗体或抗体片段，例如雷珠单抗(ranibizumab)，可溶性VEGF受体或其片段，例如阿柏西普(aflibercept)，或适体，例如培加他尼(pegaptanib))、TSPAN12激动剂、纤维蛋白溶酶、纤维蛋白溶酶原、组织纤维蛋白溶酶原活化剂、曲安西龙(triamcinolone)、TNF-α抑制剂、和/或地塞米松(dexamethasone)。

这样的以上所述的组合疗法包括组合给药(其中两种以上治疗剂被包含在相同或分开的制剂中)，和分别给药，其中，本发明的抗体的给药可以发生在另外的治疗剂和/或佐剂的给药前、同时和/或之后。

本发明的抗体(以及任何另外的治疗剂)可以通过任何合适的方法给药，包括肠胃外给药，肺内给药和鼻内给药，并且，如果局部治疗需要，眼内给药(例如玻璃体内给药)。肠胃外输注包括肌肉内、静脉内、动脉内、腹膜内或皮下给药。在一定程度上根据用药是短期或长期性而定，可通过任何适合途径给药，例如通过注射，如玻璃体内。本文中涵盖各种用药时程，包括，但不限于，单次给药或在多个时间点多次给药、推注给药及脉冲输注。

本发明的抗体将以与良好医疗实践相一致的方式配制、给药和施用。在该背景下考虑的因素包括待治疗的具体病症、待治疗的具体哺乳动物、个体患者的临床状态、病症的原因、递送试剂的位点、施药方法、施药时间安排、和医疗从业者已知的其他因素。所述抗体不需要，但任选地，与目前用于预防或治疗待讨论病症的一种或多种试剂一起配制。所述其他试剂的有效量取决于制剂中存在的抗体的量、病症或治疗的类型、和以上讨论的其他因素。这些一般以相同剂量，并使用如本文中所述的施药途径，或以本文中所述的剂量的约1-99％，或以通过经验/临床确定合适的任意剂量和任何途径来使用。

为了预防或治疗疾病，本发明的抗体的合适剂量(当单独或与一种或多种其他另外的治疗剂组合使用时)将取决于待治疗疾病的类型、抗体的类型、疾病的严重性和进程、所述抗体是以预防目的施用还是以治疗目的施用、以前的治疗、患者的临床病史和对所述抗体的应答，和主治医师的判断力。所述抗体以一次治疗或经过一系列治疗合适地施用于患者。根据疾病的类型和严重性，约1μg/kg-15mg/kg(例如0.1mg/kg-10mg/kg)的抗体可以是用于向患者施用的最初候选剂量，无论，例如，通过一次或多次分别施药，或通过连续输注。一个典型的每日剂量可以在约1μg/kg-100mg/kg或更多的范围内，其取决于上文提及的因素。为了重复施用数日或更长，根据病症，通常将持续治疗直至出现疾病症状的理想抑制。所述抗体的一个示范性剂量应该在约0.05mg/kg-约10mg/kg范围内。因此，约0.5mg/kg、2.0mg/kg、4.0mg/kg或10mg/kg(或其任意组合)的一个或多个剂量可以施用于患者。这样的剂量可以间隔地，例如每周或每三周施用(例如以使得患者接受约2-约20或例如约6剂量的所述抗体)。可以施用最初较高的负荷剂量，随后是一个或多个较低的剂量。然而，其它剂量方案可能会是有用的。可以通过常规技术和测定容易地监测这种疗法的进展。

要理解，任何以上制剂或治疗方法可以使用本发明的免疫缀合物进行以代替抗LRP5抗体或作为抗LRP5抗体的补充。

H.制品

在本发明的另一方面中，提供一种制品，所述制品包含可用于治疗、预防和/或诊断上述病症的材料。该制品包括容器和在容器上或与容器一起的标签或包装说明书(package insert)。适合的容器包括，例如，瓶子、小瓶、注射器、IV溶液包等。所述容器可以由各种材料诸如玻璃或塑料制成。容器装有组合物，所述组合物是单独地或与可有效用于治疗、预防和/或诊断所述病症的另一种组合物结合，对于所述疾患的治疗有效的组合物，并且可以具有无菌的存取口(例如，所述容器可以是具有可被皮下注射针刺穿的塞子的静脉内溶液袋或小瓶)。组合物中至少一种活性试剂是本发明的抗体。标签或包装说明书标明该组合物是用于治疗特定的病症。此外，所述制品可以包含(a)其中包含组合物的第一容器，其中所述组合物包含本发明的抗体；和(b)其中包含组合物的第二容器，其中所述组合物包含另一种细胞毒性剂或其他的治疗剂。本发明的该实施方案中的制品还可以包括包装说明书，所述包装说明书指明所述组合物可以用于治疗特定病症。备选地，或另外地，所述制品还可以包括第二(或第三)容器，所述第二(或第三)容器包含药用缓冲剂，如抑菌注射用水(BWFI)，磷酸盐缓冲盐水，Ringer溶液和葡萄糖溶液。从商业和用户立场，它还可以包括所需的其他材料，包括其他缓冲剂、稀释剂、滤膜、针头和注射器。

要理解，任何以上制品可以包括本发明的免疫缀合物以代替抗LRP5抗体或作为抗LRP5抗体的补充。

III.实施例

以下是本发明的方法和组合物的实施例。要理解，根据以上提供的一般性描述，可以实施多种其他实施方案。

实施例1：抗LRP5抗体的生成

文库分选和筛选以确定抗LRP5-E3/E4抗体

我们生成了多种LRP5表达构建体，包括编码整个细胞外区域、全部四个β推进器(β-propeller)结构域E1-4、每个单独的β推进器结构域、和E3-E4的那些构建体，并且发现只有编码E3-E4结构域的克隆产生大量的可溶性表达蛋白。因此，我们使用内部生成的生物素化的人类LRP5结构域E3-E4(SEQ ID NO：42的E644-Q1263)作为用于文库分选的抗原。Nunc96孔免疫板在4℃用(Fisher Scientific，#89890，10μg/ml)或链霉亲和素(streptravidin)(Fisher Scientific，#21125，10μg/ml)包被过夜，并用噬菌体封闭缓冲液PBST(磷酸盐缓冲盐水(PBS)和1％(w/v)牛血清白蛋白(BSA)和0.05％(v/v)tween-20)在室温封闭1小时。之后通过/链霉亲和素在室温下将生物素化LRP5-E3/E4(10μg/ml)捕获至板上持续1小时。人抗体的合成噬菌体文库(参见，例如，Lee等人，J.Immunol.Meth.(免疫学方法杂志)284：119-132，2004，Liang等人，J.Molec.Biol.366：815-829，2007)单独添加至抗原平板并在室温下温育过夜。之后一天，用PBT(具有0.05％20的PBS)将抗原包被的平板洗涤十次，并且用50mM HCl和500mM NaCl将结合的噬菌体洗脱30分钟并用等体积的1M Tris碱(pH7.5)中和。回收的噬菌体在大肠杆菌(E.coli)XL-1Blue细胞中扩增。在随后的选择轮次中，抗体噬菌体与抗原包被的平板的温育降至2-3小时，板洗涤的严格性逐渐升高。

在6轮淘洗(panning)之后，观察到明显的富集。从文库轨迹中各自挑取96个克隆，以确定它们是否特异性地结合人LRP5E3/E4。对这些克隆的可变区进行PCR测序以鉴别独特序列克隆。

在100μl总体积中，将噬菌体上清液在ELISA(酶偶联免疫吸附测定)缓冲液(具有0.5％BSA、0.05％20的PBS)中以1：5稀释，并且转移至包被靶蛋白的平板(直接包被1μg/ml LRP5E3/E4过夜)或包被中性亲和素/链霉亲和素的平板(每种蛋白5μg/ml)。将平板轻微振荡1小时，以使得噬菌体能够结合蛋白包被的平板。用PBS-0.05％20将平板洗涤十次。通过在ELISA缓冲液(1：5000)中加入辣根过氧化物酶(HR)缀合的抗M13抗体，并在室温下温育30分钟来量化结合。用PBS-0.05％20将平板洗涤十次。接下来，将100ul/孔的1：1比率的3，3’，5，5’-四甲基联苯胺(TMB)过氧化物酶底物和过氧化物酶溶液B(H₂O₂)(Kirkegaard-Perry Laboratories(Gaithersburg，MD))添加到所述孔中，并且在室温下温育5分钟。通过向每孔加入100μl0.1M磷酸(H₃PO₄)并允许在室温下温育5分钟来终止反应。使用标准ELISA平板读数器在450nm测定每个孔中黄颜色的OD(光密度)。通过以下方程式计算OD降低(％)：

OD_450nm下降(％)＝[(含有竞争物的孔的OD_450nm)/(不含竞争物的孔的OD_450nm)]*100。

挑取对LRP5E3/E4的OD_450nm比背景高至少5倍的克隆，并且通过将个体克隆中的V_L和V_H区分别克隆为LPG3和LPG4载体，将其转型为全长人类IgG1。随后将这些克隆在哺乳动物CHO细胞中瞬时表达，并且用蛋白A柱纯化。

构建体文库和用于源自合成噬菌体文库的克隆的亲和力提高的淘洗策略

对于显示出有希望的基于细胞的测定活性的每个克隆YW629.42和YW629.51，生成在CDR L3中含有4个终止密码子(TAA)并且在M13噬菌体表面上呈现单价Fab的噬菌粒。这些噬菌粒充当Kunkel诱变的模板，以构建亲和力成熟文库。软性随机化策略用于亲和力成熟，其中用有利于野生型核苷酸的碱基的70-10-10-10混合物合成诱变的DNA，以在选定位置获得近似50％的突变率(Gallop等，Journal of Medicinal Chemistry(药物化学期刊)37：1233-1251(1994))。选择CDR环的四种不同组合，H1/L3、H2/L3、H3/L3、和L1/L2/L3，以进行随机化。

对于亲和力提高选择来说，首先在限制性试剂条件下将内部生成的LRP5E3/E4生物素化。以逐渐增加的严格性对噬菌体文库进行六轮溶液分选。对于第一轮溶液分选，将在1％BSA和0.05％20中的3O.D./ml的噬菌体输入在3小时内温育为预包被有LRP5E3/E4的平板。用PBS-0.05％20将孔洗涤十次。用150μl/孔50mM HCl、500mMKCl洗脱结合的噬菌体30分钟，并且随后通过50μl/孔的1M Tris pH8中和，滴定，并且繁殖以用于下一轮。在随后几轮中，在溶液相中完成噬菌体文库的淘洗，其中用在100μlSuperBlock缓冲液(浓度基于亲本克隆噬菌体IC50值)中的100nM的初始浓度的生物素化靶蛋白(Pierce Biotechnology)将噬菌体文库在室温下温育2小时。用Superblock将混合物进一步稀释10X，并且在轻微振荡的情况下，将100μl/孔在在室温下30分钟内涂覆至包被的孔(10μg/ml)。为了确定背景结合，在中性亲和素包被的平板上捕获含有噬菌体的对照孔。之后将结合的噬菌体按照第一轮所描述的洗涤、洗脱并且繁殖。以逐渐增加的选择严格性再进行五轮溶液分选。前两轮通过将生物素化的靶标蛋白质浓度从100nM降至0.5nM进行结合速率(on-rate)选择，后两轮通过在室温加入过量的未生物素化的靶标蛋白质(300至1000倍以上)以竞争掉较弱的结合物来进行解离速率(off-rate)选择。

高通量亲和力筛选ELISA(单点竞争)

从第五轮用于筛选的淘洗中挑取菌落。使菌落在37℃下在1ml/孔的含有50ug/ml羧苄青霉素和1x10¹⁰/ml M13KO7的2YT培养基中在96孔板(Falcon)中过夜生长。包括从相同的平板中挑取XL-1感染的亲本噬菌体的菌落作为对照。将96孔Nunc 平板在PBS中在4℃下用100μl/孔的LRP5E3/E4(0.5μg/ml)包被过夜。用150μl的1％BSA和0.05％20在PBS20中将平板封闭一小时。

用75μl含有或不含有5nM LRP5E3/4的ELISA(酶偶联免疫吸附测定)缓冲液(具有0.5％BSA、0.05％20的PBS)稀释35μl的噬菌体上清液，并且在F平板(NUNC)中在室温下温育1小时。将95μl的混合物并排转移至抗原包被的平板。将平板轻微振荡15分钟，并且用PBS-0.05％20洗涤十次。通过在ELISA缓冲液(1∶2500)中加入辣根过氧化物酶(HRP)缀合的抗M13抗体，并在室温下温育30分钟来量化结合。用PBS-0.05％20将平板洗涤十次。接下来，将100μl/孔的过氧化物酶底物加入至孔中，并且在室温下温育5分钟。通过向每孔加入100μl0.1M磷酸(H₃PO₄)并允许在室温下温育5分钟来终止反应。使用标准ELISA平板读数器在450nm测定每个孔中的O.D.(光密度)。与亲本噬菌体的孔(100％)的OD_450nm下降(％)相比，挑取具有低于50％的OD_450nm下降(％)的克隆用于序列分析。通过与亲本克隆的比较，选择独特克隆用于噬菌体制备以确定针对靶抗原LRP5E3/E4的结合亲和力(噬菌体IC50)。将显示出最大的亲和力提高的克隆转型为人IgG1，其用于抗体产生，以及进一步的BIAcore^TM结合动力学分析和其他体外或体内测定。图4和5示出了通过这种方法鉴别的某些抗体的可变结构域序列。在本说明书中，可以交互地使用前缀“YW629”和“P6C”。因此，例如，描述为YW629.51.61的抗体与P6C.51.61相同。

抗LRP5抗体的特征描述(BIAcore)

抗LRP5E3/E4IgG的结合亲和力通过表面等离振子共振(Surface PlasmonResonance，SPR)使用BIAcore^TM-T100仪器测量。抗LRP5E3/E4人IgG由包被在CM5生物传感器芯片上从而获得近似200个应答单位(RU)的小鼠抗人Fc抗体(GE Healthcare，cat#BR-1008-39)来捕获。为了进行动力学测量，在25℃下以30μl/分钟的流量将人LRP5E3/E4(GNE)的两倍连续稀释液(500nM至0.245nM)注射在HBS-P缓冲液(10mM HEPES，pH7.4，0.15MNaCl，0.005％表面活性剂P20)中。使用简单一对一朗格缪尔结合模型(BIAcore评价软件版本2.0.2)计算结合速率(k_on)和解离速率(k_off)。以比值k_off/k_on计算平衡解离常数(K_D)。以下表2中示出了对图4和5中抗体的这种分析的结果。

表2.抗LRP5抗体的BIAcore分析

配体	ka(1/Ms)	kd(1/s)	KD(M)
				YW629.42	2.26x10⁴	1.16x10^-3	5.16x10^-8
YW629.42.57	3.01x10⁴	1.63x10^-4	5.42x10^-9
				YW629.42.58	3.13x10⁴	8.69x10^-5	2.78x10^-9
YW629.42.65	3.79x10⁴	9.63x10^-5	2.54x10^-9
				YW629.51	2.37x10⁵	3.09x10^-3	1.30x10^-8
YW629.51.13	3.27x10⁵	3.69x10^-4	1.13x10^-9
				YW629.51.61	2.44x10⁵	1.15x10^-4	4.70x10^-10
YW629.51.63	3.37x10⁵	1.99x10^-4	5.92x10^-10
				YW629.51.77	3.76x10⁵	1.65x10^-4	4.38x10^-10
YW629.51.78	3.78x10⁵	7.24x10^-5	1.92x10^-10
				YW629.51.80	3.87x10⁵	1.04x10^-4	2.68x10^-10

实施例2：具有Norrin途径增强活性的抗体的鉴别

Norrin通过包含LRP5、Frizzled4(FZD4)和四跨膜蛋白12(Tetraspanin12，TSPAN12)的膜复合物传递信号。在Norrin(例如Norrin-C95R)、FZD4(例如FZD4-M157V)和TSPAN12(例如TSPAN12-G188R)中的每一个中已经鉴别了表现出信号传导缺陷的突变。我们测试了多种LRP5抗体影响Norrin介导的信号传导的能力。

在24孔板中，用DNA混合物转染1.6x10⁵个细胞/孔，所述DNA混合物含有b-连环蛋白报告蛋白混合物(TOPFlash、pRL-CMV、和pCan-myc-lef-1)、LRP5、和Fzd4或Fzd4-M157V。转染二十四小时后，加入指定量的每种LRP5抗体。一小时后，按照指示将125ng/ml的重组Norrin加入至孔中。在37℃额外温育16小时后，将细胞裂解，并且使用Promega试剂测量萤火虫和海肾(Renilla)荧光素酶表达。将萤火虫荧光素酶值标准化为海肾表达。Norrin将报告蛋白基因表达活化为相对于没有配体情况下的约5倍。在所有被测试的抗体中，在0.1-1μg/ml，逐渐增加的量的抗体的加入将Norrin活性增强至约10倍(图1A)。当在转染中用Fzd4-M157V代替Fzd4时，Norrin活化降低至仅1/2。LRP5抗体的加入将有缺陷的信号传导挽救至反映野生型Fzd4的水平(图1B)。这些数据表明，抗LRP5抗体增强Norrin/Fzd4信号传导并且挽救Fzd4-M157V突变。

在6孔培养皿上接种3x10⁵个人类视网膜内皮微血管细胞(HREMVC)。次日，加入10μg/ml的指定抗体，接着一小时后加入1.25μg/ml Norrin。在额外24小时后，分离RNA，以用于Norrin靶基因、PV-1(由Norrin下调)和Axin-2(由Norrin上调)的Q-PCR分析。相对于没有配体的情况，Norrin的加入将Axin-2表达上调约1.6倍，并且将PV-1下调约0.7倍。指定的LRP5抗体的加入将Axin-2进一步上调至约2倍，并且将PV-1下调至约0.5倍(图2A)。在6孔培养皿上接种3X10⁵个HREMVC。一旦细胞附着(约4小时)，使用转染试剂，用100nM对照或Tspan12siRNA将其转染。次日，将细胞接种至24孔板中，并且用指定的抗体和配体(如上)处理。如通过测量Axin-2基因表达所表明的，Tspan12的敲低防止Norrin活化。10μg/ml的指定LRP-5抗体的加入部分地挽救这种有缺陷的Norrin信号传导(图2B)。这些数据表明，LRP5抗体增强Norrin活性并且挽救Tspan12的缺失。

接下来我们在体内测试抗LRP5抗体的活性。从P3至P14，每天用25mg/kg抗gD(阴性对照抗体)或抗LRP5抗体(YW629.42)处理Tspan12敲除的(KO)和野生型的同窝出生仔畜。在P15时，将眼睛摘除并且收集视网膜，以利用生物素化凝集素(isolectin)B4进行血管染色。将视网膜用链霉亲和素-AF488染色，整体固定，并且使用共聚焦显微镜成像。根据经由每个视网膜的厚度捕获的1.6微米堆叠，编译XY和Z投影。如预期的，Tspan12KO视网膜血管停止在表层血管丛(superficial vascular plexus)中，并且形成刚好在神经节细胞层以下的小型病理性血管簇。利用P6C.42而非对照抗体抗gD的处理，通过促进深层血管化和减少异常的血管聚集，部分地挽救Tspan12KO血管缺陷(图3A)。在P15，Tspan12KO小鼠无法形成野生型小鼠中典型的内丛状(inner plexiform，IPL)血管床。与抗gD处理的小鼠中的类似区域相比，利用YW629.42的处理部分地恢复了IPL脉管系统。(n＝3只动物/处理组；图3B)。这些数据说明，抗LRP5抗体在体内部分地挽救Tspan12敲除的小鼠中的血管缺陷。

还用25mg/kg抗gD或抗LRP5抗体(P6C.51.61)处理Tspan12KO和杂合的同窝出生仔畜。对于图6A中所示的数据来说，从P6至P15每天处理小鼠，并且在P16时处死(6只小鼠/处理组)。将眼睛摘除并且收集视网膜，以利用生物素化凝集素(isolectin)B4进行血管染色。将视网膜用链霉亲和素-AF488染色，整体固定，并且使用共聚焦显微镜成像。根据经由每个视网膜的厚度捕获的1.6微米堆叠，编译XY和Z投影。Tspan12+/-小鼠显示出由三个不同的血管层组成的正常视网膜脉管系统(图6A，左图，比例尺100μm)。如预期的，来自Tspan12-/-小鼠的、用对照抗体抗gD处理的视网膜血管，停止在表层血管丛(superficial vascularplexus)中，并且形成在神经节细胞层以下的小型病理性血管簇(图6A，中图)。利用P6C.51.61的处理，通过促进深层血管化和减少异常的血管聚集，部分地挽救Tspan12血管缺陷(图6A，右图)。对于图6B中所示的数据来说，从P3至P15每天处理小鼠，接着从P15至P30每隔一天处理小鼠(8只小鼠/处理组)。在P31，将眼睛摘除并且，按照上所述收集并处理视网膜。通过共聚焦显微镜使内丛状层(IPL)中的血管成像。Tspan12+/-小鼠的IPL含有典型的健康的毛细血管网(图6B，左图，比例尺50μm)，而用抗gD对照抗体处理的Tspan12-/-无法形成毛细血管网并且在IPL中发展为异常的血管片段(图6B，中图)。利用P6C.51.61的处理部分地恢复IPL中毛细血管网的形成(图6B，右图)。

接下来我们测试氧气诱发的视网膜病变(OIR)模型中的抗LRP5抗体，其再现了成人视网膜血管病症的某些病理性特征，如视网膜静脉阻塞(retinal vein occlusion)和糖尿病性视网膜病变(diabetic retinopathy)中的毛细血管渗漏(capillary dropout)和病理性血管发生。所述模型由2个阶段组成：出生后7-12天(P7-P12)、造成中央视网膜中血管闭塞的高氧阶段，以及从P12至P17、导致病理性血管发生的相对低氧阶段。简而言之，在阶段1期间，将P7新生小鼠置于由75％氧气组成的高氧室中5天。在此阶段期间，现存的视网膜脉管系统退化，造成在中央的视觉神经头部周围血管闭塞。在第二阶段期间，在由20％氧气组成的室内空气中喂养P12小鼠。中央血管闭塞引起低氧反应，其导致病理性血管发生。对于图7A中所示的数据来说，对C57B16/N小鼠进行如上所述的OIR过程。从P12至P17，每天用25mg/kg的抗gD(阴性对照抗体)或抗LRP5抗体(PC6.51.61)处理小鼠。在P17时，将眼睛摘除，并且收集视网膜并按照前面所描述的用凝集素B4染色。使用Fiji成像软件测量总视网膜面积、血管闭塞的面积(在中央概示)、以及病理性脉管系统。图7B示出了数据的分析，并且尽管处理组之间的视网膜的总面积不存在显著差异，用P6C.51.61处理的小鼠具有比抗gD处理的同窝出生仔畜明显更大的血管闭塞内的血管再生长。图7C显示，P6C.51.61处理的动物中增强的血管再生长伴随着相对于抗gD处理的群体降低的病理性血管形成的趋势。n＝5只动物/处理组。

实施例3：抗LRP5抗体的Norrin途径增强活性的分析

我们进行了实验，从而理解了我们的抗LRP5抗体作用于Norrin途径及其其他组分的机制。在24孔板中，用DNA的混合物转染1.6x10⁵个细胞/孔，所述DNA的混合物含有TOPFlash、pRL-CMV、和pCan-myc-lef-1，以及LRP5、FZD-4、和编码指定配体(Norrin、或Wnt7b、或Wnt3a)的cDNA。转染十六小时之后，加入10μg/ml的P6C.61.51抗体。在37℃额外温育16小时后，将细胞裂解，并且使用Promega 试剂测量萤火虫和海肾荧光素酶表达。将萤火虫荧光素酶值标准化为海肾表达。图8A显示，Norrin将报告蛋白基因表达活化为相对于没有配体的情况下的约6倍，并且10μg/ml的P6C.51.61的加入将Norrin活性增强为相对于单独Norrin的情况下的3倍。图7B示出了几个实验，所述实验表明Wnt7b将荧光素酶表达活化为不存在抗体的情况下的约20倍，以及P6C.51.61比Wnt7b提高2倍。图7C显示，Wnt3a的存在将荧光素酶表达活化为不存在抗体情况下的＞40倍，但是在P6C.51.61的存在下此活性明显地被拮抗。总之，这些数据显示，P6C.51.61增强Norrin和Wnt7b信号传导，但是拮抗Wnt3a信号传导。

Fzd4_M157V和Norrin_C95R是在患有FEVR谱系病症(FEVR spectrum disorders)的病人中发生的突变，并且这些突变导致Fzd4/LRP5/Norrin受体复合物中聚集减少(Junge等人，Cell(细胞)139：299-311(2009))。Junge等人证实，TSPAN12的过度表达可以挽救与Fzd4_M157V和Norrin_C95R有关的聚集缺陷，并且将信号传导恢复至野生型水平。我们测试P6C.51.61是否可以使受体复合物聚集并且类似地挽救这些突变。在24孔板中，用DNA的混合物转染1.6x10⁵个细胞/孔，所述DNA的混合物含有TOPFlash、pRL-CMV、pCan-myc-lef-1、LRP5、Fzd4或FZD4M157V、和Norrin或Norrin_C95R。转染十六小时之后，按照指示加入10μg/ml的P6C.61.51抗体。在37℃额外温育16小时后，将细胞裂解，并且使用Promega 试剂测量萤火虫和海肾荧光素酶表达。将萤火虫荧光素酶值标准化为海肾表达。图8A显示，Norrin将报告蛋白基因表达活化为相对于在存在野生型Fzd4并且没有配体的情况下的约6倍。在这些情况下，10μg/ml的P6C.51.61的加入将Norrin活性增强为相对于单独Norrin的情况下的3倍。当在转染中用Fzd4_M157V代替Fzd4时，Norrin活化降低至相对于没有配体的情况下的约1/2。P6C.51.61的加入将有缺陷的Fzd4_M157V信号传导挽救至反映野生型Fzd4的水平(虚线)。图8B显示，在不存在抗体的情况下，用Norrin_C95R代替Norrin导致途径活化的明显的降低，但是在P6C.51.61的存在下，Norrin_C95R活性恢复至与野生型Norrin有关的水平(虚线)。这些结果表明，P6C.51.61挽救受体组分中减少受体聚集的突变。

接下来我们测试活性的抗体效价的影响。我们发现，对于Norrin信号传导的抗LRP5增强二价结合是必需的，而Wnt3a信号传导的抑制则否。在24孔板中，用DNA的混合物转染1.6x10⁵个细胞/孔，所述DNA的混合物含有TOPFlash、pRL-CMV和pCan-myc-lef-1，LRP5，以及FZD-4。转染二十四小时后，加入指定量的每种LRP5抗体。一小时后，按照指示加入125ng/ml的重组Norrin或200ng/ml的Wnt3a。在37℃额外温育16小时后，将细胞裂解，并且使用Promega 试剂测量萤火虫和海肾(Renilla)荧光素酶表达。将萤火虫荧光素酶值标准化为海肾表达。图10A显示，Norrin将报告蛋白基因表达活化为相对于不含配体的对照的情况下的约8倍。10μg/ml的二价LRP5抗体(P6C.51)的加入将Norrin活性增强＞2倍，但是10μg/ml的单价(Fab)LRP5抗体的加入无法增强Norrin信号传导。图10B显示，在10μg/ml的二价或单价LRP5之一存在下，抗LRP5抗体拮抗Wnt3a信号传导。这些数据暗示，对于受体复合物的聚集(其已知是Norrin信号传导所必需的)来说，抗LRP5MAb的二价的性质是必需的。

虽然为了清楚的理解，已经借助于附图和实例详细描述了上述发明，但是描述和实例不应当解释为限制本发明的范围。本文中引用的所有专利和科学文献的公开内容通过引用完整地清楚结合。

Claims

1.分离的抗体，所述分离的抗体结合低密度脂蛋白受体相关蛋白5(LRP5)，其中所述抗体包含SEQ ID NO:1的VH序列和SEQ ID NO:12的VL序列。

2.分离的抗体，所述分离的抗体结合低密度脂蛋白受体相关蛋白5(LRP5)，其中所述抗体包含SEQ ID NO:2的VH序列和SEQ ID NO:13的VL序列。

3.分离的抗体，所述分离的抗体结合低密度脂蛋白受体相关蛋白5(LRP5)，其中所述抗体包含SEQ ID NO:3的VH序列和SEQ ID NO:14的VL序列。

4.分离的抗体，所述分离的抗体结合低密度脂蛋白受体相关蛋白5(LRP5)，其中所述抗体包含SEQ ID NO:4的VH序列和SEQ ID NO:15的VL序列。

5.分离的抗体，所述分离的抗体结合低密度脂蛋白受体相关蛋白5(LRP5)，其中所述抗体包含SEQ ID NO:5的VH序列和SEQ ID NO:16的VL序列。

6.分离的抗体，所述分离的抗体结合低密度脂蛋白受体相关蛋白5(LRP5)，其中所述抗体包含SEQ ID NO:6的VH序列和SEQ ID NO:17的VL序列。

7.分离的抗体，所述分离的抗体结合低密度脂蛋白受体相关蛋白5(LRP5)，其中所述抗体包含SEQ ID NO:7的VH序列和SEQ ID NO:18的VL序列。

8.分离的抗体，所述分离的抗体结合低密度脂蛋白受体相关蛋白5(LRP5)，其中所述抗体包含SEQ ID NO:8的VH序列和SEQ ID NO:19的VL序列。

9.分离的抗体，所述分离的抗体结合低密度脂蛋白受体相关蛋白5(LRP5)，其中所述抗体包含SEQ ID NO:9的VH序列和SEQ ID NO:20的VL序列。

10.分离的抗体，所述分离的抗体结合低密度脂蛋白受体相关蛋白5(LRP5)，其中所述抗体包含SEQ ID NO:10的VH序列和SEQ ID NO:21的VL序列。

11.分离的抗体，所述分离的抗体结合低密度脂蛋白受体相关蛋白5(LRP5)，其中所述抗体包含SEQ ID NO:11的VH序列和SEQ ID NO:22的VL序列。

12.分离的抗体，所述分离的抗体结合低密度脂蛋白受体相关蛋白5(LRP5)，所述抗体包含(a)HVR-H1，所述HVR-H1由以下氨基酸序列组成：GFTFSSYAMH，即SEQ ID NO:43，(b)HVR-H2，所述HVR-H2由以下氨基酸序列组成：SRISSNGGSTYYADSVKG，即SEQ ID NO:27，(c)HVR-H3，所述HVR-H3由以下氨基酸序列组成：WIPQSYPFASYKSGFDY，即SEQ ID NO:44，(d)HVR-L1，所述HVR-L1由以下氨基酸序列组成：RASQVMGYYLA，即SEQ ID NO:45，(e)HVR-L2，所述HVR-L2由以下氨基酸序列组成：DASSLES，即SEQ ID NO:46，以及(f)HVR-L3，所述HVR-L3由以下氨基酸序列组成：QQYYSYPFT，即SEQ ID NO:47。

13.分离的抗体，所述分离的抗体结合低密度脂蛋白受体相关蛋白5(LRP5)，所述抗体包含(a)HVR-H1，所述HVR-H1由以下氨基酸序列组成：GFTFSSYAMS，即SEQ ID NO:48，(b)HVR-H2，所述HVR-H2由以下氨基酸序列组成：GAISSSGSSTYYADSVKG，即SEQ ID NO:49，(c)HVR-H3，所述HVR-H3由以下氨基酸序列组成：YYRYAPYRSLGMDV，即SEQ ID NO:23，(d)HVR-L1，所述HVR-L1由以下氨基酸序列组成：RASQGISSYLA，即SEQ ID NO:29，(e)HVR-L2，所述HVR-L2由以下氨基酸序列组成：AASSLQS，即SEQ ID NO:31，以及(f)HVR-L3，所述HVR-L3由以下氨基酸序列组成：QQYYSYPFT，即SEQ ID NO:47。

14.分离的抗体，所述分离的抗体结合低密度脂蛋白受体相关蛋白5(LRP5)，所述抗体包含(a)HVR-H1，所述HVR-H1由以下氨基酸序列组成：GFTFSSYAMS，即SEQ ID NO:48，(b)HVR-H2，所述HVR-H2由以下氨基酸序列组成：GAISAPGSSTYYADSVKG，即SEQ ID NO:50，(c)HVR-H3，所述HVR-H3由以下氨基酸序列组成：YYRYAPYRSLGMDV，即SEQ ID NO:23，(d)HVR-L1，所述HVR-L1由以下氨基酸序列组成：RASQGISSYLA，即SEQ ID NO:29，(e)HVR-L2，所述HVR-L2由以下氨基酸序列组成：AASSLQS，即SEQ ID NO:31，以及(f)HVR-L3，所述HVR-L3由以下氨基酸序列组成：QQYYSYPFT，即SEQ ID NO:47。

15.分离的抗体，所述分离的抗体结合低密度脂蛋白受体相关蛋白5(LRP5)，所述抗体包含(a)HVR-H1，所述HVR-H1由以下氨基酸序列组成：GFTFSSYAMS，即SEQ ID NO:48，(b)HVR-H2，所述HVR-H2由以下氨基酸序列组成：GAISSPGWSTYYADSVKG，即SEQ ID NO:51，(c)HVR-H3，所述HVR-H3由以下氨基酸序列组成：YYRYAPYRSLGMDV，即SEQ ID NO:23，(d)HVR-L1，所述HVR-L1由以下氨基酸序列组成：RASQGISSYLA，即SEQ ID NO:29，(e)HVR-L2，所述HVR-L2由以下氨基酸序列组成：AASSLQS，即SEQ ID NO:31，以及(f)HVR-L3，所述HVR-L3由以下氨基酸序列组成：QQYYSYPFT，即SEQ ID NO:47。

16.分离的抗体，所述分离的抗体结合低密度脂蛋白受体相关蛋白5(LRP5)，所述抗体包含(a)HVR-H1，所述HVR-H1由以下氨基酸序列组成：GFTFSSYAMS，即SEQ ID NO:48，(b)HVR-H2，所述HVR-H2由以下氨基酸序列组成：GGISSPGSSTYYADSVKG，即SEQ ID NO:52，(c)HVR-H3，所述HVR-H3由以下氨基酸序列组成：YYRYAPYRSLGMDV，即SEQ ID NO:23，(d)HVR-L1，所述HVR-L1由以下氨基酸序列组成：RASQGISSYLA，即SEQ ID NO:29，(e)HVR-L2，所述HVR-L2由以下氨基酸序列组成：AASSLQS，即SEQ ID NO:31，以及(f)HVR-L3，所述HVR-L3由以下氨基酸序列组成：QQYYLYPFT，即SEQ ID NO:53。

17.分离的抗体，所述分离的抗体结合低密度脂蛋白受体相关蛋白5(LRP5)，所述抗体包含(a)HVR-H1，所述HVR-H1由以下氨基酸序列组成：GFTFSSYAMH，即SEQ ID NO:43，(b)HVR-H2，所述HVR-H2由以下氨基酸序列组成：SRISSNGGSTYYADSVKG，即SEQ ID NO:27，(c)HVR-H3，所述HVR-H3由以下氨基酸序列组成：WIPQSYPFASYKSGFDY，即SEQ ID NO:44，(d)HVR-L1，所述HVR-L1由以下氨基酸序列组成：RASQGISSYLA，即SEQ ID NO:29，(e)HVR-L2，所述HVR-L2由以下氨基酸序列组成：DASSLES，即SEQ ID NO:46，以及(f)HVR-L3，所述HVR-L3由以下氨基酸序列组成：QQYYSYPFT，即SEQ ID NO:47。

18.分离的抗体，所述分离的抗体结合低密度脂蛋白受体相关蛋白5(LRP5)，所述抗体包含(a)HVR-H1，所述HVR-H1由以下氨基酸序列组成：GFTFSSYAMH，即SEQ ID NO:43，(b)HVR-H2，所述HVR-H2由以下氨基酸序列组成：SRISSNGGSTYYADSVKG，即SEQ ID NO:27，(c)HVR-H3，所述HVR-H3由以下氨基酸序列组成：WIPQSYPFRSYKSGFDY，即SEQ ID NO:54，(d)HVR-L1，所述HVR-L1由以下氨基酸序列组成：RASQGISSYLA，即SEQ ID NO:29，(e)HVR-L2，所述HVR-L2由以下氨基酸序列组成：DASSLES，即SEQ ID NO:46，以及(f)HVR-L3，所述HVR-L3由以下氨基酸序列组成：QQYYSYPFT，即SEQ ID NO:47。

19.分离的抗体，所述分离的抗体结合低密度脂蛋白受体相关蛋白5(LRP5)，所述抗体包含(a)HVR-H1，所述HVR-H1由以下氨基酸序列组成：GFTFSSYAMH，即SEQ ID NO:43，(b)HVR-H2，所述HVR-H2由以下氨基酸序列组成：SRISSNGGSTYYADSVKG，即SEQ ID NO:27，(c)HVR-H3，所述HVR-H3由以下氨基酸序列组成：WIPQSYPFASYKSGFDY，即SEQ ID NO:44，(d)HVR-L1，所述HVR-L1由以下氨基酸序列组成：RASQSIYYYLA，即SEQ ID NO:55，(e)HVR-L2，所述HVR-L2由以下氨基酸序列组成：DASSLES，即SEQ ID NO:46，以及(f)HVR-L3，所述HVR-L3由以下氨基酸序列组成：QQYYSYPFT，即SEQ ID NO:47。

20.分离的抗体，所述分离的抗体结合低密度脂蛋白受体相关蛋白5(LRP5)，所述抗体包含(a)HVR-H1，所述HVR-H1由以下氨基酸序列组成：GFTFSSYAMH，即SEQ ID NO:43，(b)HVR-H2，所述HVR-H2由以下氨基酸序列组成：SRISSNGGSTYYADSVKG，即SEQ ID NO:27，(c)HVR-H3，所述HVR-H3由以下氨基酸序列组成：WIPQSYPFASYKSGFDY，即SEQ ID NO:44，(d)HVR-L1，所述HVR-L1由以下氨基酸序列组成：RASQVIYGYLA，即SEQ ID NO:56，(e)HVR-L2，所述HVR-L2由以下氨基酸序列组成：DASTRES，即SEQ ID NO:57，以及(f)HVR-L3，所述HVR-L3由以下氨基酸序列组成：QQYYSYPFT，即SEQ ID NO:47。

21.分离的抗体，所述分离的抗体结合低密度脂蛋白受体相关蛋白5(LRP5)，所述抗体包含(a)HVR-H1，所述HVR-H1由以下氨基酸序列组成：GFTFSSYAMH，即SEQ ID NO:43，(b)HVR-H2，所述HVR-H2由以下氨基酸序列组成：SRISSNGGSTYYADSVKG，即SEQ ID NO:27，(c)HVR-H3，所述HVR-H3由以下氨基酸序列组成：WIPQSYPFASYKSGFDY，即SEQ ID NO:44，(d)HVR-L1，所述HVR-L1由以下氨基酸序列组成：RASQGIFYYLA，即SEQ ID NO:58，(e)HVR-L2，所述HVR-L2由以下氨基酸序列组成：DASTLES，即SEQ ID NO:59，以及(f)HVR-L3，所述HVR-L3由以下氨基酸序列组成：QQYYSYPFT，即SEQ ID NO:47。

22.分离的抗体，所述分离的抗体结合低密度脂蛋白受体相关蛋白5(LRP5)，所述抗体包含(a)HVR-H1，所述HVR-H1由以下氨基酸序列组成：GFTFSSYAMH，即SEQ ID NO:43，(b)HVR-H2，所述HVR-H2由以下氨基酸序列组成：SRISSNGGSTYYADSVKG，即SEQ ID NO:27，(c)HVR-H3，所述HVR-H3由以下氨基酸序列组成：WIPQSYPFASYKSGFDY，即SEQ ID NO:44，(d)HVR-L1，所述HVR-L1由以下氨基酸序列组成：RASQAIYSYLA，即SEQ ID NO:60，(e)HVR-L2，所述HVR-L2由以下氨基酸序列组成：DASSLES，即SEQ ID NO:46，以及(f)HVR-L3，所述HVR-L3由以下氨基酸序列组成：QQYYSYPFT，即SEQ ID NO:47。

23.权利要求1-22中任一项所述的抗体，所述抗体是单克隆抗体。

24.权利要求1-22中任一项所述的抗体，所述抗体是人抗体或嵌合抗体。

25.权利要求1-22中任一项所述的抗体，所述抗体是人源化抗体。

26.权利要求1-22中任一项所述的抗体，所述抗体是结合LRP5的抗体片段。

27.权利要求1-22中任一项所述的抗体，所述抗体还包含选自由SEQ ID NO:34-37组成的组的一种或多种重链可变结构域构架序列。

28.权利要求1-22中任一项所述的抗体，所述抗体是全长IgG1抗体。

29.分离的核酸，所述分离的核酸编码权利要求1-28中任一项所述的抗体。

30.宿主细胞，所述宿主细胞包含权利要求29所述的核酸。

31.制备抗体的方法，所述方法包括培养权利要求30所述的宿主细胞从而制备所述抗体。

32.免疫缀合物，所述免疫缀合物包含权利要求1-28中任一项所述的抗体和细胞毒性剂。

33.药物制剂，所述药物制剂包含权利要求1-28中任一项所述的抗体和药用载体。

34.权利要求1-28中任一项所述的抗体在制备药物中的用途。

35.权利要求34所述的用途，其中所述药物用于治疗视网膜病变。

36.权利要求34所述的用途，其中所述药物用于治疗增生性糖尿病性视网膜病变，CNV，AMD，缺血相关的视网膜病变，DME，病理性近视，希佩尔-林道病，眼睛的组织胞浆菌病，CRVO，BRVO，角膜新血管形成，视网膜新血管形成，ROP，FEVR，诺里病，骨质疏松-假神经胶质瘤综合征，结膜下出血，或高血压性视网膜病变。

37.权利要求34所述的用途，其中所述药物用于治疗糖尿病性视网膜病变或外层渗出性视网膜病变。

38.权利要求34所述的用途，其中所述药物用于增强Norrin活性和/或Norrin/Fzd4信号传导。

39.权利要求34所述的用途，其中所述药物用于挽救由Norrin和/或Fzd4突变导致的个体中的信号传导缺陷。