JP2015511119A - 抗lrp5抗体及び使用方法 - Google Patents
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Abstract
Description
本出願は2012年1月18日に出願された米国仮出願番号61/588,100の35 USC 119(e)に基づく利益を主張し、その内容は参照により本明細書に援用される。
本発明は、抗LRP5抗体及びそれを使用する方法に関する。
現在では、血管新生は、様々な障害の病因に対する重要な寄与因子であることが十分に確立されている。これらには、固形腫瘍及び転移、網膜症などの眼内新生血管疾患、例えば、糖尿病性網膜症、網膜静脈閉塞症(RVO)、滲出型加齢黄斑変性症(AMD)、血管新生緑内障、移植角膜組織及び他の組織の免疫拒絶、関節リウマチが含まれる。Duda et al. J. Clin. Oncology 25(26): 4033-42 (2007); Kesisis et al. Curr. Pharm. Des. 13: 2795-809 (2007); Zhang & Ma Prog. Ret. & Eye Res. 26: 1-37 (2007)。
本発明は、特に血管新生に関連する状態および疾患の治療において、抗LRP5抗体とその作製及び使用方法を提供する。
I.定義
本明細書における目的のための「アクセプターヒトフレームワーク」とは、下記に定義されるように、ヒト免疫グロブリンフレームワーク又はヒトコンセンサスフレームワークから得られる軽鎖可変ドメイン(VL)フレームワーク又は重鎖可変ドメイン(VH)フレームワークのアミノ酸配列を含有するフレームワークである。ヒト免疫グロブリンのフレームワーク又はヒトコンセンサスフレームワーク「に由来する」アクセプターヒトフレームワークは、その同一のアミノ酸配列を含んでもよく、又はそれはアミノ酸配列の改変を含み得る。幾つかの実施態様において、アミノ酸変化の数は、10以下、9以下、8以下、7以下、6以下、5以下、4以下、3以下、又は2以下である。幾つかの実施態様において、VLアクセプターヒトフレームワークは、Vはヒト免疫グロブリンのフレームワーク配列又はヒトコンセンサスフレームワーク配列に、配列が同一である。
抗体の「クラス」は、その重鎖が保有する定常ドメイン又は定常領域のタイプを指す。抗体の5つの主要なクラスがあり:IgA、IgD、IgE、IgG及びIgM、及びこれらのいくつかは、さらにサブクラス(アイソタイプ)、例えば、IgG1、IgG2に、IgG3、IgG4、IGA1、及びIgA2に分けることができる。免疫グロブリンの異なるクラスに対応する重鎖定常ドメインは、それぞれα、δ、ε、γ、及びμと呼ばれる。
分率X/Yの100倍。
ここで、Xは配列アラインメントプログラムALIGN−2により、AとBのそのプログラムのアラインメントにおいて同一と一致したスコアのアミノ酸残基の数であり、YはBの全アミノ酸残基数である。アミノ酸配列Aの長さがアミノ酸配列Bの長さと異なる場合、AのBに対する%アミノ酸配列同一性は、BのAに対する%アミノ酸配列同一性とは異なることは理解されるであろう。特に断らない限り、本明細書で使用されるすべての%アミノ酸配列同一性値が、ALIGN−2コンピュータプログラムを使用し、直前の段落で説明したように得られる。
MEAAPPGPPWPLLLLLLLLLALCGCPAPAAASPLLLFANRRDVRLVDAGGVKLESTIVVSGLEDAAAVDFQFSKGAVYWTDVSEEAIKQTYLNQTGAAVQNVVISGLVSPDGLACDWVGKKLYWTDSETNRIEVANLNGTSRKVLFWQDLDQPRAIALDPAHGYMYWTDWGETPRIERAGMDGSTRKIIVDSDIYWPNGLTIDLEEQKLYWADAKLSFIHRANLDGSFRQKVVEGSLTHPFALTLSGDTLYWTDWQTRSIHACNKRTGGKRKEILSALYSPMDIQVLSQERQPFFHTRCEEDNGGCSHLCLLSPSEPFYTCACPTGVQLQDNGRTCKAGAEEVLLLARRTDLRRISLDTPDFTDIVLQVDDIRHAIAIDYDPLEGYVYWTDDEVRAIRRAYLDGSGAQTLVNTEINDPDGIAVDWVARNLYWTDTGTDRIEVTRLNGTSRKILVSEDLDEPRAIALHPVMGLMYWTDWGENPKIECANLDGQERRVLVNASLGWPNGLALDLQEGKLYWGDAKTDKIEVINVDGTKRRTLLEDKLPHIFGFTLLGDFIYWTDWQRRSIERVHKVKASRDVIIDQLPDLMGLKAVNVAKVVGTNPCADRNGGCSHLCFFTPHATRCGCPIGLELLSDMKTCIVPEAFLVFTSRAAIHRISLETNNNDVAIPLTGVKEASALDFDVSNNHIYWTDVSLKTISRAFMNGSSVEHVVEFGLDYPEGMAVDWMGKNLYWADTGTNRIEVARLDGQFRQVLVWRDLDNPRSLALDPTKGYIYWTEWGGKPRIVRAFMDGTNCMTLVDKVGRANDLTIDYADQRLYWTDLDTNMIESSNMLGQERVVIADDLPHPFGLTQYSDYIYWTDWNLHSIERADKTSGRNRTLIQGHLDFVMDILVFHSSRQDGLNDCMHNNGQCGQLCLAIPGGHRCGCASHYTLDPSSRNCSPPTTFLLFSQKSAISRMIPDDQHSPDLILPLHGLRNVKAIDYDPLDKFIYWVDGRQNIKRAKDDGTQPFVLTSLSQGQNPDRQPHDLSIDIYSRTLFWTCEATNTINVHRLSGEAMGVVLRGDRDKPRAIVVNAERGYLYFTNMQDRAAKIERAALDGTEREVLFTTGLIRPVALVVDNTLGKLFWVDADLKRIESCDLSGANRLTLEDANIVQPLGLTILGKHLYWIDRQQQMIERVEKTTGDKRTRIQGRVAHLTGIHAVEEVSLEEFSAHPCARDNGGCSHICIAKGDGTPRCSCPVHLVLLQNLLTCGEPPTCSPDQFACATGEIDCIPGAWRCDGFPECDDQSDEEGCPVCSAAQFPCARGQCVDLRLRCDGEADCQDRSDEADCDAICLPNQFRCASGQCVLIKQQCDSFPDCIDGSDELMCEITKPPSDDSPAHSSAIGPVIGIILSLFVMGGVYFVCQRVVCQRYAGANGPFPHEYVSGTPHVPLNFIAPGGSQHGPFTGIACGKSMMSSVSLMGGRGGVPLYDRNHVTGASSSSSSSTKATLYPPILNPPPSPATDPSLYNMDMFYSSNIPATARPYRPYIIRGMAPPTTPCSTDVCDSDYSASRWKASKYYLDLNSDSDPYPPPPTPHSQYLSAEDSCPPSPATERSYFHLFPPPPSPCTDSS
(配列番号42)。
一態様において、本発明は、ノリン及び/又はノリン/Frizzled4シグナル伝達を増強する抗体の発見に部分的に基づいている。所定の実施態様において、LRP5に結合する抗体が提供される。本発明の抗体は、増殖性糖尿病性網膜症、CNV、AMD、糖尿病及び他の虚血関連網膜症、DME、病的近視、フォン・ヒッペル・リンドウ病、眼のヒストプラスマ症、CRVO、BRVO、角膜血管新生、網膜血管新生、ROP、FEVR、コーツ病、ノリエ病、OPPG(骨粗鬆症・偽神経膠腫症候群)、結膜下出血、又は高血圧網膜症を含む網膜症の診断又は治療のために有用である。
一態様において、本発明は、LRP5に結合する単離された抗体を提供する。幾つかの実施態様において、抗LRP5抗体は、ノリン活性及び/又はノリン/Fzd4シグナル伝達を増強する。
所定の実施態様において、本明細書において与えられる抗体は、解離定数(Kd)が、≦1μM、≦100nM、≦10nM、≦1nM、≦0.1nM、≦0.01nM、又は≦0.001nM(例えば、10−8M以下、例えば、10−8Mから10−13M、例えば、10−9Mから10−13M)。
ある実施態様において、本明細書で提供される抗体は、抗体断片である。抗体断片は、限定されないが、Fab、Fab’、Fab’−SH、F(ab’)2、Fv,及びscFv断片、及び下記の他の断片を含む。所定の抗体断片の総説については、 Hudson et al. Nat. Med. 9:129-134 (2003)を参照。scFv断片の総説については、例えば、Pluckthun, in The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg and Moore eds., (Springer-Verlag, New York), pp. 269-315 (1994)を参照;また、国際公開第93/16185号;及び米国特許第5,571,894号及び第5,587,458号も参照。サルベージ受容体結合エピトープ残基を含み、かつインビボ半減期を増加させたFab及びF(ab’)2断片の議論については、米国特許第5869046号を参照のこと。
ある実施態様において、本明細書で提供される抗体は、キメラ抗体である。所定のキメラ抗体は、例えば、米国特許第4,816,567号、及びMorrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:6851-6855 (1984))に記載されている。一例において、キメラ抗体は、非ヒト可変領域(例えば、マウス、ラット、ハムスター、ウサギ、又はサル等の非ヒト霊長類由来の可変領域)及びヒト定常領域を含む。更なる例において、キメラ抗体は、クラスまたはサブクラスが親抗体のものから変更された「クラススイッチ」抗体である。キメラ抗体は、その抗原結合断片を含む。
ある実施態様において、本明細書で提供される抗体は、ヒト抗体である。ヒト抗体は、当技術分野で公知の様々な技術を用いて生産することができる。ヒト抗体は一般的にvan Dijk and van de Winkel, Curr. Opin. Pharmacol. 5: 368-74 (2001) 及びLonberg, Curr. Opin. Immunol. 20:450-459 (2008)に記載されている。
本発明の抗体は、所望の活性または活性(複数)を有する抗体についてコンビナトリアルライブラリーをスクリーニングすることによって単離することができる。例えば、様々な方法が、ファージディスプレイライブラリーを生成し、所望の結合特性を有する抗体についてのライブラリーをスクリーニングするために、当該技術分野で知られている。そのような方法は、例えば、Hoogenboom et al. in Methods in Molecular Biology 178:1-37 (O'Brien et al., ed., Human Press, Totowa, NJ, 2001)に総説され、更に、例えば、McCafferty et al., Nature 348:552-554; Clackson et al., Nature 352: 624-628 (1991); Marks et al., J. Mol. Biol. 222: 581-597 (1992); Marks and Bradbury, in Methods in Molecular Biology 248:161-175 (Lo, ed., Human Press, Totowa, NJ, 2003); Sidhu et al., J. Mol. Biol. 338(2): 299-310 (2004); Lee et al., J. Mol. Biol. 340(5): 1073-1093 (2004); Fellouse, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101(34): 12467-12472 (2004);及びLee et al., J. Immunol. Methods 284(1-2): 119-132(2004)に記載されている。
ある実施態様において、本明細書で提供される抗体は、多重特異性抗体、例えば二重特異性抗体である。多重特異性抗体は、少なくとも二つの異なる部位に対して結合特異性を有するモノクローナル抗体である。ある実施態様において、結合特異性の一つはLRP5に対してであり、他は、任意の他の抗原に対してである。ある実施態様において、他の結合特異性は血管内皮増殖因子(VEGF)に対してである。ある実施態様において、二重特異性抗体は、LRP5の2つの異なるエピトープに結合することができる。二重特異性抗体はまたLRP5を発現する細胞に細胞傷害性薬物を局所化するために用いることができる。二重特異性抗体は、全長抗体又は抗体断片として調製することができる。
ある実施態様において、本明細書で提供される抗体のアミノ酸配列変異体が企図される。例えば、抗体の結合親和性及び/又は他の生物学的特性を改善することが望まれ得る。抗体のアミノ酸配列変異体は、抗体をコードするヌクレオチド配列に適切な改変を導入することにより、又はペプチド合成によって調製することができる。このような改変は、例えば、抗体のアミノ酸配列内における、残基の欠失、及び/又は挿入及び/又は置換を含む。最終コンストラクトが所望の特性、例えば、抗原結合を有していることを条件として、欠失、挿入、及び置換の任意の組み合わせが、最終コンストラクトに到達させるために作成され得る。
ある実施態様において、一つ以上のアミノ酸置換を有する抗体変異体が提供される。置換型変異誘発の対象となる部位は、HVRとFRを含む。保存的置換は、表1の「保存的置換」の見出しの下に示されている。より実質的な変更が、表1の「典型的な置換」の見出しの下に与えられ、アミノ酸側鎖のクラスを参照して以下に更に説明される。アミノ酸置換は、目的の抗体に導入することができ、その産物は、所望の活性、例えば、抗原結合の保持/改善、免疫原性の減少、又はADCC又はCDCの改善についてスクリーニングされる。
(1)疎水性:ノルロイシン、Met、Ala、Val、Leu、Ile;
(2)中性の親水性:Cys、Ser、Thr、Asn、Gln;
(3)酸性:Asp、Glu;
(4)塩基性:His、Lys、Arg;
(5)鎖配向に影響する残基:Gly、Pro;
(6)芳香族:Trp、Tyr、Phe。
所定の実施態様において、本明細書で提供される抗体は、抗体がグリコシル化される程度を増加または減少させるように改変される。抗体へのグリコシル化部位の付加または欠失は、一以上のグリコシル化部位が作成または削除されるようにアミノ酸配列を変えることによって簡便に達成することができる。
ある実施態様において、1つまたは複数のアミノ酸改変を、本明細書で提供される抗体のFc領域に導入することができ、それによってFc領域変異体を生成する。Fc領域の変異体は、1つまたは複数のアミノ酸位置においてアミノ酸修飾(例えば置換)を含むヒトFc領域の配列(例えば、ヒトIgG1、IgG2、IgG3又はIgG4のFc領域)を含んでもよい。
ある実施態様において、抗体の1つ以上の残基がシステイン残基で置換されている、システイン操作抗体、例えば、「thioMAb(複数)」を作成することが望まれ得る。特定の実施態様において、置換される残基は、抗体のアクセス可能な部位で生じる。それらの残基をシステインで置換することにより、反応性チオール基は、それによって抗体のアクセス可能な部位に配置され、本明細書中でさらに記載されるように、イムノコンジュゲーを作成するために、例えば薬物部分またはリンカー−薬剤部分などの他の部分に抗体をコンジュゲートするために使用することができる。ある実施態様において、一以上の以下の残基がシステインで置換され得る:軽鎖のV205(Kabatの番号付け);重鎖のA118(EU番号付け);及び重鎖Fc領域のS400(EU番号付け)。システイン改変抗体は、例えば、米国特許第7521541号に記載のように生成され得る。
ある実施態様において、本明細書で提供される抗体は、当技術分野で知られ、容易に入手される追加の非タンパク質部分を含むように更に改変することができる。抗体の誘導体化に適した部分としては、限定されないが、水溶性ポリマーを含む。水溶性ポリマーの非限定的な例は、限定されないが、ポリエチレングリコール(PEG)、エチレングリコール/プロピレングリコールの共重合体、カルボキシメチルセルロース、デキストラン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、ポリ−1,3−ジオキソラン、ポリ−1,3,6−トリオキソラン、エチレン/無水マレイン酸共重合体、ポリアミノ酸(単独重合体又はランダム共重合体の何れか)及びデキストラン又はポリ(n−ビニルピロリドン)ポリエチレングリコール、プロピレングリコール単独重合体、プロピレンオキシド/エチレンオキシド共重合体、ポリオキシエチル化ポリオール(例えばグリセロール)、ポリビニルアルコール及びこれらの混合物を包含する。ポリエチレングリコールプロピオンアルデヒドはその水中での安定性のために製造上の利点を有し得る。ポリマーは何れかの分子量のものであってよく、そして分枝鎖又は未分枝鎖であってよい。抗体に結合するポリマーの数は変動してよく、そして、一以上の重合体が結合する場合は、それらは同じか又は異なる分子であってよい。一般的に、誘導体化に使用するポリマーの数及び/又は種類は、限定されないが、向上させるべき抗体の特定の特性又は機能、抗体誘導体が限定された条件下で治療に使用されるのか等を含む検討事項に基づいて決定することができる。
抗体は、例えば米国特許第4,816,567号で説明したように、組換えの方法および組成物を用いて製造することができる。一実施態様において、本明細書に記載される抗LRP5抗体をコードする単離された核酸が提供される。このような核酸は、抗体のVLを含むアミノ酸配列、及び/又は抗体のVHを含むアミノ酸配列(例えば、抗体の軽鎖及び/又は重鎖)をコードし得る。更なる実施態様において、そのような核酸を含む1つ以上のベクター(例えば、発現ベクター)が提供される。更なる実施態様において、そのような核酸を含む宿主細胞が提供される。一実施態様において、宿主細胞は以下を含む(例えば、以下で形質転換される):(1)抗体のVLを含むアミノ酸配列、及び抗体のVHを含むアミノ酸配列をコードする核酸を含むベクター、又は(2)抗体のVLを含むアミノ酸配列をコードする核酸を含む第一ベクター、及び抗体のVHを含むアミノ酸配列をコードする核酸を含む第二ベクター。一実施態様において、宿主細胞は、真核生物、例えばチャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞、またはリンパ系細胞(例えば、Y0、NS0、Sp20細胞)である。一実施態様において、抗ETBR抗体を作る方法が提供され、その方法は、上記のように、抗体の発現に適した条件下で、抗体をコードする核酸を含む宿主細胞を培養することを含み、および必要に応じて、宿主細胞(または宿主細胞培養培地)から抗体を回収することを含む。
本明細書で提供される抗LRP5抗体は、同定され、当技術分野で公知の様々なアッセイによってその物理的/化学的性質及び/又は生物学的活性についてスクリーニングされ、または特徴づけることができる。
一態様において、本発明の抗体は、例えばELISA、ウエスタンブロット法など公知の方法により、その抗原結合活性について試験される。
一態様において、アッセイは、生物学的活性を有するその抗LRP5抗体を同定するために与えられる。生物学的活性は、例えば、LRP5との結合、ノリン活性の増強、又はノリン/Fzd4シグナル伝達の増強を含み得る。インビボ及び/又はインビトロでこのような生物学的活性を有する抗体もまた提供される。
本発明はまた、化学療法剤又は薬物、成長抑制剤、毒素(例えば、タンパク質毒素、細菌、真菌、植物、または動物起源の酵素活性毒素、又はそれらの断片)、又は放射性同位元素など、1つ以上の細胞傷害性薬物にコンジュゲートした本明細書中の抗LRP5抗体を含むイムノコンジュゲートを提供する。
所定の実施態様において、本明細書で提供される抗LRP5抗体の何れかは、生物学的サンプル中のLRP5の存在を検出するのに有用である。本明細書で使用する「検出」という用語は、定量的または定性的検出を包含する。所定の実施態様において、生物学的サンプルは、網膜組織を含む眼組織などの細胞又は組織を含む。
本明細書に記載の抗LRP5抗体の薬学的処方物は、所望の程度の純度を有するその抗体と任意の薬学的に許容される担体(Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed.: Williams and Wilkins PA, USA (1980))とを、凍結乾燥製剤または水性溶液の形態で混合することによって調製される。薬学的に許容される担体は、使用される投薬量および濃度でレシピエントに毒性でなく、そしてこれには、限定しないが、リン酸塩、クエン酸塩および他の有機酸のような緩衝液;アスコルビン酸およびメチオニンを含む抗酸化剤;防腐剤(例えば、オクタデシルジメチオルベンジルアンモニウムクロライド;ヘキサメトニウムクロライド;塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム、フェノール、ブチルまたはベンジルアルコール;アルキルパラベン、例えば、メチルまたはプロピルパラベン;カテコール;レゾルシノール;シクロヘキサノール;3−ペンタノール;およびm−クレゾール);低分子量(約10残基未満)ポリペプチド;タンパク質、例えば、血清アルブミン、ゼラチン、または免疫グロブリン;親水性ポリマー、例えば、ポリビニルピロリドン;アミノ酸、例えば、グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニンまたはリジン;マンノサッカライド、ジサッカライド、およびグルコース、マンノースまたはデキストリンを含む他の炭水化物;キレート剤、例えば、EDTA;糖、例えば、スクロース、マンニトール、トレハロースまたはソルビトール;塩形成対イオン、例えば、ナトリウム;金属錯体(例えば、Zn−タンパク質錯体);及び/又はポリエチレングリコール(PEG)等の非イオン性界面活性剤が挙げられる。本明細書における典型的な薬学的に許容される担体は、介在性薬物分散剤、例えば、水溶性の中性アクティブヒアルロニダーゼ糖タンパク質(sHASEGP)、例えば、rHuPH20(HYLENEX(登録商標)、Baxter International, Inc.)などのヒト可溶性PH−20ヒアルロニダーゼ糖タンパク質を更に含む。所定の典型的なsHASEGP及び使用法は、rHuPH20を含み、米国特許出願公開第2005/0260186号及び第2006/0104968に開示されている。一態様において、sHASEGPは、コンドロイチナーゼなどの1つまたは複数の追加のグルコサミノグリカンと組み合わされる。
本明細書で提供される抗LRP5抗体のいずれかを、治療方法で使用することができる。
本発明の他の実施態様において、上述した障害の治療、予防、及び/又は診断に有用な物質を含む製造品が提供される。製造品は、容器とラベルまたは容器上にある又は容器に付属するパッケージ挿入物を含む。好適な容器は、例としてボトル、バイアル、シリンジ、IV輸液バッグ等を含む。容器はガラス又はプラスチックなどの様々な物質から形成されうる。容器は、疾患の治療、予防、及び/又は診断に有効である、それ自体か、又はその他の組成物と併用される化合物を収容し、無菌のアクセスポートを有し得る(例えば、容器は皮下注射針による穴あきストッパーを有する静脈内溶液バッグ又はバイアルであってよい)。組成物中の少なくとも一の活性剤は本発明の抗体である。ラベルまたはパッケージ挿入物は、組成物が特定の症状の治療のために使用されることを示している。更に、製造品は、(a)組成物が本発明の抗体を包含する組成物を含む第一の容器;および(b)組成物が更なる細胞障害性又はその他の治療的薬剤を包含する組成物を含む第2の容器を含み得る。本発明の本実施態様における製造品は、組成物が特定の疾患を治療することに用いることができることを示すパッケージ挿入物をさらに含んでいてもよい。別法として、または加えて、製造品は、薬学的に許容される緩衝液、例えば注射用静菌水(BWFI)、リン酸緩衝化生理食塩水、リンガー溶液およびデキストロース溶液を含む第二(または第三)の容器をさらに含んでもよい。これは、他の緩衝液、希釈剤、フィルター、針、およびシリンジを含む、商業的およびユーザーの立場から望まれる他の物質をさらに含んでもよい。
以下は本発明の方法および組成物の例である。上記提供される一般的な説明を前提として、他の様々な実施態様が実施され得ることが理解される。
抗LRP5−E3/E4抗体を同定するためのライブラリ選別とスクリーニング
我々は、細胞外ドメインの全領域、4つの全βプロペラドメインE1−4、各βプロペラドメイン単独、及びE3−E4をコードするものを含む複数のLRP5発現構築物を生成し、E3−E4ドメインをコードするクローンのみが有意な量の可用性発現タンパク質を生産することを見いだした。従って、我々は、社内で生成されたビオチン化LRP5ドメインE3−E4(配列番号42のE644−Q1263)をライブラリ選別のための抗原として用いた。Nunc96ウェルMaxisorp(登録商標)はイムノプレートはニュートラアビジン(NeutrAvidin)(登録商標) (Fisher Scientific, #89890, 10μg/ml)又はストレプトアビジン(Fisher Scientific, #21125, 10μg/ml)と4℃で一晩コーティングし、ファージブロッキング緩衝液PBST(リン酸緩衝生理食塩水(PBS)及び1%(w/v)ウシ血清アルブミン(BSA)及び0.05%(v/v)のTween20)により室温にて1時間ブロックした。ビオチン化LRP5−E3/E4(10μg/ml)は、次いで、ニュートラアビジン(登録商標)/ストレプトアビジンによって室温で1時間プレート上に捕捉した。ヒト抗体の合成ファージライブラリ(例えばLee et al., J. Immunol. Meth. 284:119-132, 2004, Liang et al., J. Molec. Biol. 366: 815-829, 2007を参照)を別々抗原プレートに添加し、室温で一晩インキュベートした。翌日、抗原被覆プレートをPBT(0.05%のTween20を含むPBS)で10回洗浄し、結合したファージを30分間50mMのHCl及び500mMのNaClで溶出させ、同容量の1Mのトリス塩基(pH7.5)で中和した。回収されたファージを、大腸菌XL−1 Blue細胞中で増幅した。続く選択ラウンドの間、抗原がコーティングされたプレートとの抗体ファージのインキュベーションを2ー3時間に減らし、プレート洗浄のストリンジェンシーは徐々に増加させた。
有望な細胞ベースのアッセイの活性を示した各クローン、YW629.42とYW629.51について、CDR L34停止コドン(TAA)を含有し、M13バクテリオファージの表面上に一価のFabを呈するファージミドを生成した。これらのファージミドは親和性成熟ライブラリーの構築のためのクンケル変異誘発のための鋳型としての役割を果たした。親和性成熟については、変異原性DNAが、選択された位置に約50%の変異率を得るために野生型ヌクレオチドを好む塩基の70−10−10−10混合物を用いて合成されるソフトランダム化戦略を使用した(Gallop et al., Journal of Medicinal Chemistry 37:1233-1251 (1994))。CDRループ、H1/L3、H2/L3、H3/L3、及びL1/L2/L3の4つの異なる組み合わせをランダム化のために選択した。
コロニーがスクリーニングのために第6ラウンドのパニングから採取された。コロニーを96ウェルプレート(Falcon)中で50μg/mlのカルベニシリンと1x1010/mlのM13KO7を含む2YT培地の150μl/ウェル中で、37℃で一晩増殖させた。同じプレートから、XL−1に感染した親のファージのコロニーをコントロールとして取り上げた。96ウェルNuncマキシソープ(登録商標)プレートを一晩4℃で、PBS中のLRP5E3/E4(0.5μg/ml)を100μl/ウェルでコーティングした。プレートは1時間、PBS中に0.05%のTween20及び1%のBSAを含む150μlでブロックした。
抗LRP5E3/E4 IgGの結合親和性は、ビアコアTM−T100装置を使用して表面プラズモン共鳴(SRP)によって測定した。抗LRP5E3/E4ヒトIgGは、CM5バイオセンサーチップ上にコーティングされたマウス抗ヒトFc抗体(GE Healthcareカタログ# BR-1008-39)によって捕捉され、約200応答単位(RU)を達成した。速度論測定のため、ヒトLRP5E3/E4(GNE)の2倍連続希釈(500nMから0.245nM)が25℃で流速30μl/分でHBS−P緩衝液(10mMのHEPES、pH7.4、0.15MのNaCl、0.005%界面活性剤P20)に注入された。会合速度(kon)及び解離速度(koff)は単純な一対一のラングミュア結合モデルを用いて計算した(BIAcore評価用ソフトウェアのバージョン2.0.2)。平衡解離定数(KD)はkoff/konの比として算出した。図4及び5の抗体についてこの解析の結果は以下の表2に示される。
ノリンは、LRP5、Frizzled4(FZD4)及びテトラスパニン12(TSPAN12)を含む膜複合体を介してシグナル伝達する。シグナル伝達の欠陥を示す、ノリン(例えばノリン−C95R)、FZD4(例えば、FZD4−M157V)及びTSPAN12(例えば、TSPAN12−G188R)の各々において変異体が同定されている。私たちは、ノリン媒介性シグナル伝達に影響を与える様々なLRP5抗体の能力を試験した。
我々は抗LRP5抗体がノリン経路及びその他の構成要素に作用するメカニズムを理解するために実験を行った。24ウェルプレート中で、1.6x105細胞/ウェルを、TOPFlash、pRL−CMV、及びpCan−myc−lef−1、LRP5、FZD−4を含むDNA、及び指定されたリガンド(ノリン、又はWnt7b、又はWnt3a)をコードするcDNAの混合物でトランスフェクトした。トランスフェクションの16時間後に、P6C.61.51抗体が10μg/ml加えられた。37℃で更に16時間インキュベーション後、細胞を溶解し、ホタル及びウミシイタケルシフェラーゼの発現がプロメガDual−Glo(登録商標)試薬を使用して測定された。ホタルルシフェラーゼの値は、ウミシイタケの発現に対して正規化した。図8Aは、ノリンは、リガンド無しに比較してレポーター遺伝子発現を約6倍活性化し、かつP6C.51.61を10μg/ml添加するとノリン単独に比較して約3倍ノリンの活性を増強することを示している。図7Bは、Wnt7bは、抗体が無い場合に約20倍ルシフェラーゼ発現を活性化すること、及びP6C.51.61によるWnt7bを超える2倍の増強を実証する実験を示す。図7Cは、Wnt3aの存在は抗体の非存在下でルシフェラーゼ活性を約40倍活性化するが、この活性はP6C.51.61の存在下で著しく拮抗されることを示す。まとめると、これらのデータは、P6C.51.61はノリン及びWnt7bシグナル伝達を増強するが、Wnt3aシグナル伝達に拮抗することを示している。
Claims (28)
- 抗体がノリン活性及び/又はノリン/Fzd4シグナル伝達を増強する、低密度リポタンパク質受容体関連タンパク質5(LRP5)に結合する単離された抗体。
- モノクローナル抗体である、請求項1に記載の抗体。
- ヒト、ヒト化、又はキメラ抗体である、請求項1に記載の抗体。
- LRP5に結合する抗体断片である、請求項1に記載の抗体。
- 抗体は、(a)アミノ酸配列YYRYAPYRSLGMDV(配列番号23)又はWIPQSYPFX1SYKSGFDY(ここでX1はA又はRである)(配列番号24)を含むHVR−H3、(b)アミノ酸配列QQYYX1YPFT(ここでX1はL又はSである)(配列番号25)を含むHVR−L3、及び(c)アミノ酸配列GX1ISX2X3GX4STYYADSVKG(ここでX1はA又はG、X2はA又はS、X3はP又はS、X4はS又はWである)(配列番号26)、又はSRISSNGGSTYYADSVKG(配列番号27)を含むHVR−H2を含む、請求項1に記載の抗体。
- 抗体は、(a)アミノ酸配列GFTFSSYAMX1(ここでX1はH又はSである)(配列番号28)を含むHVR−H1、(b)アミノ酸配列GX1ISX2X3GX4STYYADSVKG(ここでX1はA又はG、X2はA又はS、X3はP又はS、X4はS又はWである)(配列番号26)、又はSRISSNGGSTYYADSVKG(配列番号27)を含むHVR−H2及び(c)アミノ酸配列YYRYAPYRSLGMDV(配列番号23)又はWIPQSYPFX1SYKSGFDY(ここでX1はA又はRである)(配列番号24)を含むHVR−H3を含む、請求項1に記載の抗体。
- (a)アミノ酸配列RASQGISSYLA(配列番号29)又はRASQX1X2X3X4YLA(ここでX1はA、G、S又はV、X2はI又はM、X3はF、G、S又はY、及びX4はG、S又はYである)(配列番号30)を含むHVR−L1;(b)アミノ酸配列AASSLQS(配列番号31)又はDASX1X2ES(ここでX1はS又はT及びX2はL又はRである)(配列番号32)を含むHVR−L2;及び(c)アミノ酸配列QQYYX1YPFT(ここでX1はL又はSである)(配列番号33)を含むHVR−L3を更に含む、請求項6に記載の抗体。
- (a)アミノ酸配列RASQGISSYLA(配列番号29)又はRASQX1X2X3X4YLA(ここでX1はA、G、S又はV、X2はI又はM、X3はG、F、Y又はS、及びX4はG、Y又はSである)(配列番号30)を含むHVR−L1;(b)アミノ酸配列AASSLQS(配列番号31)又はDASX1X2ES(ここでX1はS又はT及びX2はL又はRである)(配列番号32)を含むHVR−L2;及び(c)アミノ酸配列QQYYX1YPFT(ここでX1はL又はSである)(配列番号33)を含むHVR−L3を含む、請求項1に記載の抗体。
- 配列番号34−37からなる群から選択される一以上の重鎖可変ドメインフレームワーク配列を更に含む、請求項6に記載の抗体。
- (a)配列番号1から11のうちの一のアミノ酸配列に少なくとも95%の配列同一性を有するVH配列;(b)配列番号12から22のうちの一のアミノ酸配列に少なくとも95%の配列同一性を有するVL配列;又は(c)(a)のVH配列及び(b)のVL配列を含む、請求項1に記載の抗体。
- 配列番号1から11のうちの一のVH配列を含む、請求項10に記載の抗体。
- 配列番号12から22のうちの一のVL配列を含む、請求項10に記載の抗体。
- 配列番号1から11のうちの一のVH配列、及び配列番号12から22のうちの一のVL配列を含む抗体。
- 完全長IgG1抗体である、請求項1に記載の抗体。
- 請求項1に記載の抗体をコードする単離された核酸。
- 請求項15に記載の核酸を含む宿主細胞。
- 請求項16に記載の宿主細胞を抗体が産生されるように培養することを含む、抗体を産生する方法。
- 請求項1に記載の抗体及び細胞傷害性薬物を含むイムノコンジュゲート。
- 請求項1に記載の抗体及び薬学的に許容される担体を含む薬学的製剤。
- 医薬としての使用のための、請求項1に記載の抗体。
- 増殖性糖尿病性網膜症、CNV、AMD、糖尿病及び他の虚血関連網膜症、DME、病的近視、フォン・ヒッペル・リンドウ病、眼のヒストプラスマ症、CRVO、BRVO、角膜血管新生、網膜血管新生、ROP、FEVR、コーツ病、ノリエ病、OPPG(骨粗鬆症・偽神経膠腫症候群)、結膜下出血、又は高血圧網膜症を含む網膜症の治療において使用のための、請求項1に記載の抗体。
- ノリン活性及び/又はノリン/Fzd4シグナル伝達の増強において使用のための、請求項1に記載の抗体。
- 医薬の製造における、請求項1に記載の抗体の使用。
- 医薬は、増殖性糖尿病性網膜症、CNV、AMD、糖尿病及び他の虚血関連網膜症、DME、病的近視、フォン・ヒッペル・リンドウ病、眼のヒストプラスマ症、CRVO、BRVO、角膜血管新生、網膜血管新生、ROP、FEVR、コーツ病、ノリエ病、OPPG(骨粗鬆症・偽神経膠腫症候群)、結膜下出血、又は高血圧網膜症を含む網膜症の治療のためである、請求項23の使用。
- 医薬は、ノリン活性及び/又はノリン/Fzd4シグナル伝達を増強するためである、請求項23の使用。
- 請求項1に記載の抗体の有効量を個体に投与することを含む、増殖性糖尿病性網膜症、CNV、AMD、糖尿病及び他の虚血関連網膜症、DME、病的近視、フォン・ヒッペル・リンドウ病、眼のヒストプラスマ症、CRVO、BRVO、角膜血管新生、網膜血管新生、ROP、FEVR、コーツ病、ノリエ病、OPPG(骨粗鬆症・偽神経膠腫症候群)、結膜下出血、又は高血圧網膜症を含む網膜症を有する個体を治療する方法。
- ノリン活性及び/又はノリン/Fzd4シグナル伝達を増強するための請求項1に記載の抗体の有効量を個体に投与することを含む、個体におけるノリン活性及び/又はノリン/Fzd4シグナル伝達を増強する方法。
- 請求項1に記載の抗体を投与することを含む、ノリン及び/又はFzd4における変異により生じる、個体中のシグナル伝達欠損をレスキューする方法。
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